Protección frente a estreses abióticos extremos mediante la sobreexpresión ectópica combinada de HAHSFA9 y HAHSFA4A

Protección frente a estreses abióticos extremos mediante la sobreexpresión ectópica combinada de HaHSFA9 y HaHSFA4a José María Personat Gálvez Departamento de Biotecnología Vegetal, Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNASE) Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Sevilla, Abril de 2014 TESIS DOCTORAL Protección frente a estreses abióticos extremos mediante la sobreexpresión ectópica combinada de HaHSFA9 y HaHSFA4a TESIS DOCTORAL Memoria presentada por José María Personat Gálvez para optar al título de Doctor en Biotecnología. Abril de 2014. iii Protección frente a estreses abióticos extremos mediante la sobreexpresión ectópica combinada de HaHSFA9 y HaHSFA4a Visado en Sevilla, a …….. de ………..…….. de 2014. Los Directores: El Tutor: Dr. Francisco Javier Cejudo Fernández Catedrático de la Universidad de Sevilla Dr. Juan Jordano Fraga Profesor de Investigación del CSIC Dra. Concepción Almoguera Antolínez Científica Titular del CSIC v El presente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto BIO2008-00634 del Plan Nacional de I+D+i, dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador. vii DOCTOR D. D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Protección frente a estreses abióticos extremos mediante la sobreexpresión ectópica combinada de HaHSFA9 y HaHSFA4a”, presentada por D. José María Personat Gálvez para optar al grado de Doctor en Biotecnología, ha sido realizada en el Departamento de Biotecnología Vegetal, bajo la dirección de los Drs. D. Juan Jordano Fraga y Dña. Concepción Almoguera Antolínez, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a ……. de ….................... de 2014 Índice 4 6. El estrés oxidativo y el daño del aparato fotosintético…………………………………………. 40 7. La senescencia en plantas………………………………………………….…………………………………. 42 Objetivos 45 Materiales y métodos 49 1. Material biológico…………………………………………………………………………..……………………. 51 1.1. Plantas transgénicas de tabaco…………………………………………………………………. 51 1.1.1. Plántulas transgénicas…………………………………………………………………… 51 1.1.2. Semillas transgénicas…………………………………………………………………….. 52 1.1.3. Cultivo in vitro……………………………………………………………………………….. 53 1.1.4. Cultivo en tierra…………………………………………………………………………….. 54 1.2. Bacterias…………………………………………………………………………………………………... 55 1.2.1. Escherichia coli………………………………………………………………………………. 55 1.2.2. Agrobacterium tumefaciens…………………………………………………………… 55 2. Análisis y tratamientos de ADN……………………………………………………………………………. 55 2.1. Purificación de ADN plasmídico………………………………………………………………… 55 2.2. Cuantificación de ADN………………………………………………………………………………. 56 2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa……………………………………………….. 56 2.4. Extracción de fragmentos de ADN de geles de agarosa…………………………….. 56 2.5. Reacciones enzimáticas de ADN………………………………………………………………… 56 Índice 5 2.5.1. Digestión de ADN con enzimas de restricción………………………………… 56 2.5.2. Ligación de fragmentos de ADN…………………………………………………….. 57 2.5.3. Reacción de secuenciación……………………………………………………………. 57 3. Transformación de bacterias………………………………………………………………………………… 57 3.1. Transformación de Escherichia coli…………………………………………………………… 57 3.2. Transformación de Agrobacterium tumefaciens……………………………………….. 58 4. Obtención de plantas transgénicas de tabaco………………………………………………………. 59 4.1. Construcción del vector binario 35S:A4a…………………………………………………… 59 4.2. Transformación de discos de hoja de tabaco…………………………………………….. 60 4.3. Selección de transformantes y enraizamiento…………………………………………… 61 4.4. Obtención de plantas transgénicas homocigóticas……………………………………. 61 5. Análisis y tratamientos de ARN…………………………………………………………………………….. 62 5.1. Extracción de ARN vegetal………………………………………………………………………… 62 5.2. Cuantificación de ARN………………………………………………………………………………. 62 5.3. Electroforesis desnaturalizante de ARN…………………………………………………….. 62 5.4. Purificación de ARN…………………………………………………………………………………… 63 5.5. Síntesis de ADNc……………………………………………………………………………………….. 63 6. Obtención de la genoteca por hibridación sustractiva………………………………………….. 63 6.1. Hibridación sustractiva……………………………………………………………………………… 64 6.2. Clonación y análisis de la genoteca…………………………………………………………… 66 Índice 6 7. Análisis transcripcional por RT-qPCR………………………………………………………………..…… 66 7.1. Diseño de los oligonucleótidos………………………………………………………………….. 67 7.2. Condiciones de la reacción de RT-qPCR…………………………………………………….. 67 8. Extracción y análisis de Proteínas…………………………………………………………………………. 69 8.1. Extracción de proteínas…………………………………………………………………………….. 69 8.1.1. Extracción de proteínas con tampón Laemmli……………………………….. 69 8.1.2. Extracción de proteínas con tampón fenol…………………………………….. 70 8.2. Aislamiento de membranas tilacoidales……………………………………………………. 70 8.3. Cuantificación de proteínas………………………………………………………………………. 71 8.3.1. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford………………… 71 8.3.2. Cuantificación de proteínas por el método de Lowry…………………….. 71 8.4. Electroforesis de proteínas……………………………………………………………………….. 71 8.4.1. Electroforesis SDS-PAGE………………………………………………………………… 71 8.4.2. Electroforesis 2D-PAGE………………………………………………………………….. 72 8.4.3. Electroforesis en geles Blue Native………………………………………………… 73 8.5. Tinción de proteínas con azul coloidal de Coomassie………………………………… 74 8.6. Detección de proteínas por western blot………………………………………………….. 74 8.6.1. Transferencia de proteínas a membranas de PVDF……………………….. 75 8.6.2. Inmunodetección………………………………………………………………………….. 75 8.7. Cuantificación de señales de western blot………………………………………………… 76 Índice 7 8.8. Solubilización de proteínas de las membranas tilacoidales……………………….. 76 9. Cuantificación de pigmentos fotosintéticos………………………………………………………….. 77 10. Fluorescencia de la clorofila…………………………………………………………………………………. 78 11. Tratamientos de estrés abiótico…………………………………………………………………………… 78 11.1. Tratamientos de deshidratación severa DT2…………………………………………… 79 11.2. Tratamientos de estrés oxidativo con H2O2…………………………………………….. 80 11.3. Tratamientos de inducción de la senescencia vegetativa………………………… 80 11.3.1. Inducción de la senescencia en la oscuridad………………………………….. 80 11.3.2. Inducción de la senescencia por falta de nutrientes a la luz…………… 81 11.4. Tratamiento de aclimatación al calor………………………………………………………. 81 11.5. Ensayos de termotolerancia……………………………………………………………………. 82 12. Cuantificación de la pérdida de electrolitos………………………………………………………….. 82 13. Análisis estadístico……………………………………………………………………………………………….. 82 Resultados 85 A. Protección del aparato fotosintético mediada por el programa genético activado por el factor HaHSFA9…………………………………………………………………… 87 1. Acumulación reducida de sHSP-CI en las raíces de las plántulas 35S:A9……………….. 87 2. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 incluye la expresión de genes shsp-P...……………………………………………………………………………………………………… 88 2.1. Acumulación de proteínas sHSP-P inducida por el factor HaHSFA9…………... 89 2.2. Asociación de las proteínas sHSP-P a las membranas tilacoidales en las plántulas 35S:A9 en condiciones normales de cultivo……………………………………… 91 Índice 8 3. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 mejora la estabilidad de las membranas celulares en las plántulas 35S:A9………………………………………………………. 94 4. Efectos positivos del programa genético activado por el factor HaHSFA9 sobre la maquinaria fotosintética de las plántulas 35S:A9 en condiciones normales de cultivo………………………………………………………………………………………………………………….. 94 5. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 protege al aparato fotosintético frente a deshidratación severa en las plántulas 35S:A9…………………… 97 6. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 protege al aparato fotosintético frente a estrés oxidativo severo………………………………………………………. 100 7. La aclimatación al calor no confiere resistencia a estrés oxidativo extremo a las plántulas no transgénicas…………………………………………………………………………………….. 104 8. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA9 retarda la senescencia vegetativa en las plántulas 35S:A9…………………………………………………………………………………………. 106 B. Estudio de la interacción funcional entre los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a en plantas transgénicas de tabaco……………………………………………………………… 110 1. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA4a en plántulas de tabaco no confiere ninguno de los fenotipos descritos para la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9………………………………………………………………………………………………………………. 110 1.1. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA4a no induce la acumulación de proteínas HSP en las plántulas 35S:A4a a temperaturas normales de crecimiento………………………………………………………………………….. 1. 111 1.2. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA4a no confiere termotolerancia en las plántulas 35S:A4a…………………………………………………. 112 1.3. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA4a no confiere tolerancia a condiciones extremas de deshidratación ni de estrés oxidativo en las plántulas 35S:A4a……………………………………………………………………………………… 114 2. La sobreexpresión ectópica conjunta de los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas de tabaco mejora los fenotipos previamente descritos para la sobreexpresión de HaHSFA9………………………………………………………………………………… 115 Índice 9 2.1. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 aumenta la acumulación de determinadas isoformas HSP a temperaturas normales de crecimiento en las plántulas 35S:A9/A4a………………………………………………….. 117 2.2. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la estabilidad de las membranas celulares en las plántulas 35S:A9/A4a……….. 121 2.3. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 en las plántulas 35S:A9/A4a no tiene efectos adicionales sobre la maquinaria fotosintética en condiciones normales de cultivo……………………………………… 122 2.4. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la tolerancia frente a deshidratación severa en las plántulas 35S:A9/A4a…….. 124 2.5. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la tolerancia a estrés oxidativo severo en las plántulas 35S:A9/A4a……………… 124 2.6. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la tolerancia a tratamientos que inducen la senescencia vegetativa en las plántulas 35S:A9/A4a……………………………………………………………………………….. 126 C. Identificación de otros genes activados por el factor HaHSFA9…………………… 130 1. Obtención de la genoteca por hibridación sustractiva………………………………………….. 130 2. Análisis y selección de clones……………………………………………………………………………….. 130 3. Comprobación de la inducción de los genes candidatos en las plántulas 35S:A9….. 132 Discusión 137 El programa genético activado por HSFA9 incluye proteínas sHSP-P…………………………. 140 El programa genético activado por HaHSFA9 protege la maquinaria fotosintética y confiere tolerancia a las plántulas 35S:A9 frente al daño producido por condiciones drásticas de deshidratación o estrés oxidativo………………………………………………………….. 143 El programa genético activado por HaHSFA9 retarda la senescencia vegetativa en las plántulas 35S:A9………………………………………………………………………………………………….. 145 Índice 10 El programa genético activado por HaHSFA9 incluye la expresión de otros genes distintos a los genes hsp……………………………………………………………………………………………. 145 El factor HaHSFA4a co-activa junto a HaHSFA9 el programa genético implicado en la tolerancia a estreses abióticos extremos…………………………………………………………………… 150 Conclusiones 155 Bibliografía 159 Anexo I. Clasificación de los genes posiblemente inducidos en las plántulas 35S:A9. 185 Anexo II. Publicaciones derivadas del trabajo de esta Tesis. 201 Almoguera C., Prieto-Dapena P., Personat J.M., Tejedor-Cano J., Lindahl M., Diaz- Espejo A. and Jordano J. (2012) Protection of the photosynthetic apparatus from extreme dehydration and oxidative stress in seedlings of transgenic tobacco. PLoS One, 7, e51443. Tejedor-Cano J., Carranco R., Personat J.M., Prieto-Dapena P., Almoguera C., Espinosa J.M. and Jordano J. (2014) A passive repression mechanism that hinders synergic transcriptional activation by heat shock factors involved in sunflower seed longevity. Molecular Plant, 7, 256-259. Personat J.M., Tejedor-Cano J., Prieto-Dapena P., Almoguera C. and Jordano J. (2014) Co-overexpression of two Heat Shock Factors results in enhanced seed longevity and in synergistic effects on seedling tolerance to severe dehydration and oxidative stress. BMC Plant Biology, 14, 56. Introducción Introducción 13 1. Biología molecular de la respuesta a choque térmico. Como organismos sésiles, las plantas se han especializado en el crecimiento y propagación bajo distintas condiciones de estrés, como bajas o altas temperaturas, estrés por alta salinidad, alta concentración de metales pesados, o estrés por deficiencia de agua. Para la supervivencia de la planta bajo estas condiciones, se requiere de una red interconectada de sistemas de respuestas a estrés. La respuesta a choque térmico es un mecanismo de defensa celular presente en todos los organismos, altamente conservado y que se activa por una gran variedad de estímulos citotóxicos como elevadas temperaturas u otros estreses abióticos. Esta respuesta se caracteriza por una rápida reprogramación de la expresión genética, dirigida a la acumulación transitoria de proteínas de choque térmico (HSP, Heat Shock Proteins), la mayoría de las cuales actúan como chaperonas moleculares, protegiendo frente al daño producido por el estrés (Nover, 1991; Cherry, 1994; Baniwal et al., 2004; Scharf et al., 2012). En los últimos 50 años, las investigaciones en este campo de la biología molecular han permitido descubrir un sistema celular central de respuesta, sensible a cambios en la homeostasis de las proteínas, es decir, sensible al equilibrio entre síntesis, plegamiento, señalización intracelular, función biológica y degradación de las proteínas (Figura i1). Las HSP, inducidas por la respuesta a estrés o expresadas constitutivamente, actúan como chaperonas y son esenciales para el mantenimiento y la restauración de la homeostasis de las proteínas (Boston et al., 1996; Bukau et al., 2006; Nakamoto & Vigh, 2007; Scharf et al., 2012). En condiciones normales, existe un equilibrio entre proteínas en estado nativo y proteínas parcialmente desnaturalizadas unidas a chaperonas. Tras un estrés ambiental, aumenta la proporción de proteínas parcialmente desnaturalizadas, produciéndose la disminución de chaperonas libres en la célula, que tiene como resultado la desnaturalización de las proteínas y problemas en el procesamiento de las proteínas de nueva síntesis durante el estrés. Esta respuesta a estrés requiere la transcripción de genes hsp bajo el control de factores de transcripción de choque térmico (HSF, Heat Shock Factors), que están presentes en el citoplasma en su forma inactiva. El estrés provoca la activación de los HSF y su transporte al núcleo, donde se unen a las secuencias dianas HSE en los promotores de los genes inducidos por estrés (Figura i1, pasos 1 y 2 del ciclo HSF). La síntesis de novo de proteínas HSP tiene como función restablecer Introducción 20 3. Factores de transcripción de Choque térmico en plantas. Las plantas terrestres están altamente adaptadas a crecer y sobrevivir bajo gran variedad de situaciones de estrés. Esto se correlaciona con la existencia de gran multiplicidad de HSF en plantas con flor (en el rango de 20-50 miembros; Scharf et al., 2012). Los HSF son los componentes terminales de la cadena de transducción de señal que activa a los genes de respuesta, tanto a estrés por calor como a otra gran variedad de estreses químicos. La familia de HSF en plantas se caracteriza por la conservación de patrones de estructura y la diversificación funcional entre los distintos HSF (Morimoto, 1998; Shöffl et al., 1998; Baniwal et al., 2004). Estructura de los HSF. Al igual que otras proteínas que regulan la actividad genética, los HSF tienen una estructura modular. Su estructura básica y el modo en que reconocen al promotor están conservados en todos los organismos eucariotas, aunque existe una gran variabilidad en cuanto a tamaño y secuencia. En la Figura i4 se muestran 5 ejemplos de HSF de tomate (Solanum lycopersicum), que presentan las características típicas de la estructura de los HSF vegetales, las cuales se resumen a continuación (Nover et al., 2001; Baniwal et al., 2004; Scharf et al., 2012). Cerca del extremo N-terminal de todos los HSF, se localiza el dominio de unión a ADN (DBD, DNA Binding Domain). Este dominio está altamente estructurado, y presenta gran conservación evolutiva. Su núcleo hidrofóbico asegura el posicionamiento preciso y la interacción altamente selectiva del dominio DBD con los elementos de estrés térmico HSE (Heat Stress Elements), localizados en los promotores de los genes activados por dichos HSF. El dominio de oligomerización OD (Oligomerization Domain) o región HR-A/B está conectado con el dominio DBD por un enlace flexible de longitud variable (15-80 aminoácidos). El OD está formado por dos regiones con repeticiones de residuos hidrofóbicos (HR-A/B), en las que se repite un patrón de siete residuos de aminoácidos hidrofóbicos. Basándonos en el OD, podemos diferenciar 3 clases de HSF en plantas: clases A, B y C. Los HSF de clase B poseen una región HR-A/B compacta, similar las de otros HSF de especies no vegetales, mientras que en los HSF de clases A y C esta región es más extensa, debido a la inserción de 21 (clase A) o 7 (clase C) residuos de aminoácidos entre las partes A y B. El dominio OD confiere diferentes patrones de especificidad para la heterooligomerización. La señal de localización nuclear NLS (Nuclear Localization Signal), localizada tras la región C-terminal del OD, está compuesta por una o dos agrupaciones de residuos de Introducción 21 Figura i4. Estructura básica de los HSF. Ejemplos de la estructura básica de 5 HSF de tomate, alineados con respecto al inicio del dominio de unión al ADN (DBD): OD, dominio de oligomerización (región HR-A/B); NLS, señal de localización nuclear; NES, señal de exportación nuclear; AHA, motivos de activación; RD, motivos de tetrapéptidos -LFGV- del dominio represor. Ver detalles en el texto. (Adaptado de Scharf et al., 2012) aminoácidos básicos. Estos motivos, con carga positiva, favorecen el ensamblaje del complejo de importación nuclear. Dependiendo del balance entre la importación y exportación nuclear, la distribución celular de los HSF entre el núcleo y el citoplasma cambia dinámicamente. En el extremo C-terminal de algunos HSF de clase A, existe una señal hidrofóbica de exportación nuclear NES (Nuclear Export Signal). Esta región, frecuentemente rica en leucinas, es necesaria para la exportación nuclear mediada por el receptor NES. Junto con los módulos de activación adyacentes (motivos AHA), NES forma parte de una marca de señalización específica en la región C-terminal de los HSF de clase A. La región C-terminal es la menos conservada entre los HSF y en ella se encuentra el dominio de activación. Los HSF de clase A presentan regiones peptídicas de activación con corta longitud (motivos AHA), localizadas en los dominios C-terminales. Estos motivos se caracterizan por la presencia de residuos de aminoácidos aromáticos (W, F, Y), hidrofóbicos (L, I, V) y ácidos (E, D). En los HSF de tipo A3, el dominio C-terminal no contiene motivos AHA, pero conservan un patrón característico de residuos de triptófano (W), con función activadora. Estas regiones representan sitios esenciales para el contacto con las subunidades del complejo basal de transcripción. El dominio C-terminal de los HSF vegetales de clase B y C tiene carga positiva o neutra, y carece de motivos AHA. Esto se correlaciona con la falta de actividad transcripcional en ensayos funcionales in vivo (Boscheinen et al., 1997). Además los HSF de clase B y C de Arabidopsis no son capaces de interaccionar con la maquinaria Introducción 22 basal de transcripción (Kotak et al., 2004). Todos los HSF de clase B, excepto el HSFB5, se caracterizan por la presencia del tetrapéptido -LFGV- en el extremo C-terminal, conectado a la señal NLS. Este dominio interacciona con un co-represor desconocido en la maquinaria de transcripción (Scharf et al., 2012). Diversidad funcional de los HSF de plantas. La familia de los HSF presenta una gran complejidad en plantas, con numerosos miembros y un alto grado de especialización funcional (Koskull-Döring et al., 2007). Esto contrasta con la situación en otros organismos eucariotas: en levaduras o Drosophila sólo se conoce un único HSF. La secuenciación del genoma de Arabidopsis permitió identificar 21 miembros pertenecientes a esta familia (Nover et al., 2001). En otras especies vegetales como soja se han identificado 34 HSF, 23 en arroz, más de 16 en tomate, y al menos 19 en Medicago truncatula (Baniwal et al., 2004; Kotak et al., 2004; Benedito et al., 2008). El conocimiento actual de los mecanismos moleculares del funcionamiento de los HSF, está basado principalmente en los análisis de los HSF de tomate y Arabidopsis (Baniwal et al., 2004; Miller & Mittler, 2006; von Koskull-Döring et al., 2007; y Kotak et al., 2007b). En tomate (Lycopersicon peruvianum), los factores LpHSFA1a, LpHSFA2 y LpHSFB1 conforman la red de regulación responsable de la expresión de los genes que responden a choque térmico (Baniwal et al., 2004). El factor LpHSFA1a se expresa constitutivamente y regula la expresión inducida por calor de LpHSFA2 y LpHSFB1. LpHSFA1a es el “regulador maestro” de la respuesta a calor, y no puede ser reemplazado en esta función por ningún otro HSF, al menos in planta (Mishra et al., 2002). Los ensayos de ganancia de función, mediante la sobreexpresión de este factor en plantas transgénicas, resultan en un incremento de la termotolerancia basal. Por el contrario, cuando se silencia la expresión de LpHSFA1a, se incrementa la sensibilidad de la planta a altas temperaturas, sugiriendo que la función de LpHSFA1a no puede compensarse con otros HSF. Sin embargo en Arabidopsis thaliana no se ha encontrado un factor funcionalmente equivalente a LpHSFA1a, en cuanto a su papel irremplazable como regulador de la respuesta a choque térmico. De este modo, mutantes knockout simples de AtHSFA1a, AtHSF1b, AtHSF1d o AtHSF1e, así como mutantes knockout dobles o triples, no mostraron efectos en la respuesta a choque térmico, ni en los niveles de termotolerancia basal (Lohmann et al., 2004; Nishizawa- Yokoi et al., 2011). Sin embargo, el estudio de un mutante knockout cuádruple, con pérdida de Introducción 23 función de las cuatro formas AtHSFA1, dio como resultado la pérdida de respuesta a choque térmico y termotolerancia adquirida, así como defectos en el desarrollo (Liu et al., 2011). El factor HSFA2 es similar al HSFA1 tanto estructural como funcionalmente, aunque sólo se expresa en plantas estresadas (von Koskull-Doring et al., 2000). HSFA2 es la proteína con mayor activación transcripcional en tomate, Arabidopsis y arroz, acumulándose a niveles altos en plantas expuestas a ciclos repetidos de choque térmico y recuperación (Scharf et al., 1998b; Mishra et al., 2002; Schramm et al., 2006; Charng et al., 2007; Nishizawa-Yokoi et al., 2009). En tomate, la síntesis de LpHSFA2 está controlada por la activación tras el choque térmico de LpHSFA1a (Mishra et al., 2002). Debido a su potente señal de exportación NES, LpHSFA2 no se localiza en el núcleo a menos que se co-exprese junto a LpHSFA1a, con el que interacciona físicamente (Scharf et al., 1998b). En plantas estresadas, LpHSFA1 y LpHSFA2 heterooligomerízan formando un complejo super-activador para los genes hsp, cuya actividad es mucho mayor que la observada en los dos HSF individualmente (Scharf et al., 1998b; Chan- Schaminet et al., 2009). En Arabidopsis, mutantes knockout para AtHSFA2 mostraron sensibilidad a choque térmico, alta luminosidad, estrés oxidativo y anoxia, mientras que plantas con alta expresión de AtHSFA2 mostraron mayores niveles de termotolerancia, así como mayor resistencia a estrés salino/osmótico (Ogawa et al., 2007; Yokotani et al., 2008), estrés oxidativo (Zhang et al., 2009) y anoxia (Banti et al., 2010). El factor HSFA2 puede considerarse como uno de los reguladores maestros de la respuesta a estrés en plantas, protegiendo contra el daño oxidativo de los orgánulos y consecuente muerte celular (Zhang et al., 2009). A diferencia de lo que ocurre con los HSF de clase A, un gran número de HSF de clase B y C son inactivos a nivel transcripcional por sí mismos, ya que carecen de los motivos AHA, necesarios para interaccionar con la maquinaria basal de transcripción (Bharti et al., 2004; Kotak et al., 2004). Sin embargo, bajo ciertas condiciones, el HSF inducido por choque térmico LpHSFB1 puede actuar como co-activador, cooperando con los HSF de clase A, como el factor LpHSFA1a. Los dos HSF ensamblan un complejo que activa la transcripción de forma sinérgica. Además, LpHSFB1 también coopera de forma similar con otras proteínas activadoras de la transcripción, que controlan la expresión de genes de mantenimiento. De esta forma, LpHSFB1 ayuda a restaurar la expresión de dichos genes de mantenimiento, y se consigue reprogramar a la célula para la recuperación tras el choque térmico (Bharti et al., 2004). Introducción 24 La estructura y función del factor HSFA3 es similar a la de HSFA1a y HSFA2, excepto en la parte C-terminal del dominio de activación, que aparece más difuso con un patrón conservado de residuos de triptófano (Bharti et al., 2000; Tripp et al., 2009). La expresión inducida por estrés hídrico y por calor de AtHSFA3 en Arabidopsis, depende del factor de transcripción DREB2A (Dehydration-Responsive Element Binding Protein). Lo mismo ocurre con los genes hsp18.1-CI, hsp26.5-MII y hsp70 (Sakuma et al., 2006; Schramm et al., 2008). La sobreexpresión de DREB2A o DREB2C provoca la inducción de HSFA3, y consecuentemente la de otros genes relacionados con la respuesta a choque térmico. Esta observación se correlaciona con una mayor termotolerancia basal, mientras que en los mutantes knockout para dreb2A dicha tolerancia disminuye. Se han obtenido resultados similares al sobreexpresar el factor DREB2A de maíz (Zea mays) en Arabidopsis (Qin et al., 2007). Los ensayos de ganancia o pérdida de función in planta para AtHSFA3, indican que dicho factor tiene una función importante en la adquisición de termotolerancia vegetativa (Yoshida et al., 2008; Schramm et al., 2008). Aunque el análisis funcional detallado se limita a pocos ejemplos, el análisis alternativo de los patrones de expresión genética mediante microarrays ha permitido la elaboración de la base datos AtGenExpress, que proporciona información muy completa la expresión de los HSF en el transcriptoma de Arabidopsis durante el desarrollo y durante la respuesta tanto a estrés biótico como estrés abiótico (Schmid et al., 2005; Miller & Mittler, 2006; Kilian et al., 2007; von koskull- Doring et al., 2007; Scharf et al., 2012). Obviamente, los niveles de ARNm no permiten sacar conclusiones inmediatas sobre los niveles de acumulación de proteína. En Arabidopsis, sólo existen datos correspondientes a acumulación a nivel proteico para HSFA2 y HSFA9 (Schramm et al., 2006; Kotak et al., 2007a). Desafortunadamente, no existen bases de datos comparables para otras plantas. Sin embargo, se han descrito cambios complejos en los niveles de ARNm de HSF de arroz durante el desarrollo, así como en respuesta a estrés por calor, frío y estrés oxidativo (Wang et al., 2009; Mittal et al., 2009; Narsai et al., 2010). 4. El factor HSFA9, un HSF esencial para la expresión de HSP durante el desarrollo embrionario en plantas. Durante la maduración de la semilla, se activan diferentes programas de expresión genética que promueven mecanismos de protección y reparación del daño producido por la desecación Introducción 25 severa y, al mismo tiempo, prolongan la supervivencia de las semillas maduras secas (Rajjou & Debeaujon, 2008; Chen et al., 2012; Chatelain et al., 2013). Tras la germinación, sólo las plantas de resurrección pueden tolerar niveles tan drásticos de deshidratación u otros estreses abióticos (Cushman & Oliver, 2011; Gechev et al., 2012). En plantas de resurrección, aparecen activos en tejidos vegetativos los mismos programas genéticos expresados durante el desarrollo embrionario (Illing et al., 2005; Farrant & Moore, 2011). En girasol (Helianthus annuus L.), uno de estos programas, el cual ha sido extensamente estudiado en nuestro laboratorio, está bajo el control transcripcional de factores HSF, entre los que se incluye el factor específico de semillas HaHSFA9 (Almoguera et al., 2002; Tejedor-Cano et al., 2010). El papel único de HaHSFA9 durante el desarrollo de la semilla puede considerarse el ejemplo más claro de diversificación funcional entre los HSF de plantas. Nuestro grupo caracterizó el factor HaHSFA9 como el primer HSF expresado específicamente durante la embriogénesis y maduración de la semilla (Almoguera et al., 2002). La actividad de HaHSFA9 está regulada por auxinas, ya que la proteína Aux/IAA HaIAA27, reprime la expresión de HaHSFA9 en embriones de girasol (Carranco et al., 2010). Posteriormente, se ha identificado el factor homólogo AtHSFA9 en Arabidopsis, que al igual que HaHSFA9, se expresa exclusivamente durante el desarrollo embrionario, y no se induce en tejido vegetativo en respuesta a ningún tipo de estrés. La expresión de AtHSFA9 está controlada por el factor de transcripción específico de semillas ABI3 (Abcisic Acid-Insensitive 3). Además, los transcritos de los genes homólogos a HSFA9 en tomate y café sólo se detectan en semillas, y no en tejido vegetativo (Kotak et al., 2007a). El factor HaHSFA9 induce la acumulación de proteínas HSP y aumenta la longevidad en semillas. En nuestro laboratorio (Prieto-Dapena et al., 2006), se estudiaron los efectos de la sobreexpresión de HaHSFA9 en semillas de tabaco (Nicotiana tabacum), bajo el control del promotor HaDS10G1 (en las semillas DS10:A9). Este promotor pertenece a un gen tipo LEA (Late Embryogenesis Abundant) que se expresa en semillas de girasol durante su maduración. La sobreexpresión específica en semillas de HaHSFA9 resultó en un aumento en la acumulación de proteínas HSP101, sHSP-CI y sHSP-CII (Figura i5A). Entre las HSP inducidas por HaHSFA9 en semillas se incluye una isoforma sHSP-CI específica de semillas, que no se induce durante Introducción 26 Figura i5. Efectos de la sobreexpresión del factor HaHSFA9 en las semillas transgénicas de tabaco DS10:A9. (A) Detección de la acumulación de proteínas HSP101, sHSP-CI y sHSP-CII en semillas maduras DS10:A9 por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Se analizaron dos líneas de semillas transgénicas de tabaco DS10:A9 (A91 y A92), y sus hermanas no transgénicas (NT1 y NT2). Se compara la acumulación en semillas maduras con la observada en plántulas NT en condiciones normales de cultivo (C) y tras un tratamiento de aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC (AC). (B) Detección de la acumulación de sHSP-CI en semillas transgénicas de tabaco DS10:A9 (A91), y su correspondiente hermana NT (NT1), por western blot tras electroforesis 2D-PAGE. Se compara la acumulación en semillas maduras con la observada en plántulas NT tras un tratamiento de aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC (AC). En la parte inferior, se indica el rango de pH (pH 5,0-7,0). (C) Resistencia a tratamientos de deterioro controlado CDT (envejecimiento artificial) de las semillas DS10:A9. Porcentaje de germinación a varios tiempos tras el tratamiento CDT, observado con semillas de 2 líneas transgénicas DS10:A9 (A91 y A92) y sus hermanas no transgénicas (NT1 y NT2). A la derecha se muestran fotografías representativas de la germinación después de 16 días tras el tratamiento CDT de una línea DS10:A9 y su correspondiente hermana NT. Las barras de escala equivalen a 1cm. Las flechas indican el polipéptido sHSP-CI específico de semillas. El asterisco indica el polipéptido sHSP-CI específico de aclimatación al calor, no detectable en semillas. A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). A la derecha, se indica el anticuerpo específico usado para la detección de cada proteína. Adaptado de Prieto-Dapena et al. (2006). Introducción 27 aclimatación al calor (Figura i5B). Sin embargo, la sobreexpresión de HaHSFA9 no afectó a la expresión de otros programas genéticos relacionados con la tolerancia a la desecación embrionaria, como los que determinan la acumulación en semillas de proteínas LEA, sacarosa y distintos oligosacáridos de tipo rafinosa. Este aumento de proteínas HSP se correlaciona con la mejora de la longevidad de las semillas DS10:A9 (Figura i5C). Los tratamientos de deterioro controlado CDT (Controlled Deterioration Treatment) permiten evaluar de forma rápida la longevidad de semillas. Las semillas DS10:A9 aumentaron la tasa de germinación con respecto a sus hermanas no transgénicas, tras ensayos CDT, lo cual implica una mejora en la longevidad de las semillas (Figura i5C; Prieto-Dapena et al., 2006). Posteriormente, estos resultados se confirmaron en semillas de tabaco con pérdida de función del factor HSFA9 endógeno, mediante la sobreexpresión de diferentes formas modificadas de HaHSFA9 (Tejedor-Cano et al., 2010). Significativamente, sólo la sobreexpresión en semillas de una forma represora activa de HaHSFA9 (en las semillas DS10:A9M3), y no así la sobreexpresión de formas inactivas, produjeron la disminución de la longevidad de las semillas (Figura i6A). Tejedor-Cano et al., 2010). Además, las semillas DS10:A9M3 también mostraron una notable reducción en la acumulación de sHSP-CI, sHSP-CII y HSP101, con respecto a sus hermanas no transgénicas (Figura i6B, Tejedor-Cano et al., 2010). La sobreexpresión en semillas de formas estabilizadas de HaIAA27 también redujo la longevidad de las semillas a niveles similares a los observados en las semillas DS10:A9M3 (Carranco et al., 2010). Estos resultados indican que el programa genético activado por HSFA9 requiere otros HSF adicionales (en número desconocido, al menos otro factor). Estos factores, al igual que HaHSFA9, serían HSF de clase A, se reprimirían por HaIAA27 y formarían hetero-oligómeros junto con HaHSFA9. Interacción funcional entre los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a. En nuestro laboratorio se ha aislado y caracterizado el factor HSFA4a de girasol (HaHSFA4a) (Figura i7; Tejedor-Cano et al., 2014). Este HSF se clonó por interacción con HaHSFA9 mediante ensayos de doble híbrido en levaduras, a partir de una genoteca de ADNc de embriones inmaduros de girasol. La expresión de HaHSFA4a en hojas de Nicotiana benthamiana, ha mostrado que HaHSFA4a posee localización tanto citosólica como nuclear. Sin embargo, la interacción entre HaHSFA4a y HaHSFA9 tiene lugar en el núcleo. Mediante ensayos de coexpresión se ha observado que, en presencia de HaHSFA9, se produce la retención de HaHSFA4a Introducción 28 Figura i6. Pérdida de función en las semillas transgénicas de tabaco DS10:A9M3. (A) Resistencia a tratamientos de deterioro controlado CDT (envejecimiento artificial) de las semillas DS10:A9M3. Porcentaje de germinación a varios tiempos tras el tratamiento CDT, observado con semillas de 4 líneas transgénicas DS10:A9M3 (A9M3) y sus hermanas no transgénicas (NT). A la derecha se muestran fotografías representativas de la germinación después de 15 días tras el tratamiento CDT de una línea DS10:A9M3 y su correspondiente hermana NT. Las barras de escala equivalen a 1cm. (B) Detección de la acumulación de proteínas HSP101, sHSP-CI y sHSP-CII en semillas maduras DS10:A9M3 por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Se analizaron 4 líneas de semillas transgénicas de tabaco DS10:A9M3 (A9M31-A9M34), y sus hermanas no transgénicas (NT1-NT4). La flecha indica el polipéptido sHSP-CI específico de semillas. A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). A la derecha, se indica el anticuerpo específico usado para la detección de cada proteína. Adaptado de Tejedor-Cano et al. (2010). Introducción 29 en el núcleo, al igual que ocurre la expresar una forma de HaHSFA4a con un dominio de exportación nuclear NES no funcional (Figura i7A). Además, los ensayos de expresión transitoria mediante co-bombardeo han demostrado que juntos, HaHSFA4a y HaHSFA9 pueden co-activar sinérgicamente la transcripción a partir de los promotores de genes hsp dianas de HaHSFA9. Sin embargo, el factor HaHSFA4a en solitario no es capaz de activar dichos promotores (Figura i7B; Tejedor-Cano et al., 2014). Figura i7. Interacción funcional entre los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a. (A) Ensayos de localización mediante la expresión en hojas de Nicotiana benthamiana de: el factor HaHSFA4a (HaHSFA4a:GFP); un mutante del factor HaHSFA4a con el dominio NES no funcional, HaHSFA4a(NESmut) (HaHSFA4a(NESmut):GFP), y la co-expresión de los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a (HaHSFA4a:GFP). Las barras de escala equivalen a 100 mm. (B) Ensayos de co-combardeo de los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a en hojas de girasol. Entre paréntesis se indica el número de medidas para cada valor promedio. Adaptado de Tejedor-Cano et al. (2014). Por otro lado, los ensayos de BiFC han demostrado que, al igual que ocurre con HaHSFA9, el factor HaHSFA4a interacciona con HaIAA27, in planta. Esta interacción tiene lugar tanto en el núcleo como en el citosol, mientras que la interacción entre HaHSFA9 y HaIAA27 ocurre sólo en el núcleo. Además, al co-expresar junto a HaHSFA4a y HaHSFA9 una forma estabilizada de HaIAA27 (HaIAA27mIIab), se ha observado una reducción sustancial de la interacción entre los dos HSF. Tanto la hetero-oligomerización entre HaHSFA4a y HaHSFA9, como la interacción de HaIAA27 con HaHSFA9 se llevan a cabo mediante el dominio OD del HSF (Carranco et al., 2010; Scharf et al., 2012). Así, se ha observado que HaIAA27 reprime la co-activación sinérgica mediada por HaHSFA9 y HaHSFA4a, al co-expresarlos en embriones inmaduros de girasol (Tejedor-Cano et al., 2014). Estos resultados apuntan a que el factor HaHSFA4a podría ser uno Introducción 36 PsaH, PsaI, PsaL y PsaO componen el dominio de interacción con el LHCII. La función de PsaP se desconoce actualmente. La subunidad PsaN se ha identificado como una subunidad localizada exclusivamente en la cara luminal del PSI, aunque la función de PsaN no está clara (Amunts et al., 2007; Amunts & Nelson, 2008). El complejo LHCI está compuesto por productos de genes nucleares (Lhca1-Lhca4), ensamblados formando dos dímeros, unidos a clorofilas y carotenos, que se organizan alrededor del RC del PSI por la cara opuesta a la subunidad PsaH (Figura i10). Cada monómero del LHCI consiste en 3 hélices transmembrana, las cuales se unen a 14-15 moléculas de clorofila. La unión del LHCI al RC del PSI es asimétrica. La subunidad Lhca1 se une fuertemente al RC a través de la subunidad PsaG. Además, Lhca1 actúa como punto de anclaje para facilitar la unión de las otras subunidades del LHCI. Las otras subunidades del LHCI interaccionan con el RC mediante pequeñas uniones en la superficie de las regiones estromales expuestas. Lhca4 se une a PsaF y Lhca2 se asocia con PsaJ (Amunts et al., 2008, Amunts & Nelson, 2009). Estructura y composición del Fotosistema II. Un monómero del PSII está compuesto por 17 subunidades proteicas transmembrana y 3 proteínas extrínsecas, asociadas a 35 clorofilas, 11 carotenoides, 14 lípidos, 2 grupos hemos, 1 grupo férrico no-hemo, y un grupo Mn4Ca (Figura i11). El núcleo del RC está compuesto por dos proteínas homólogas, denominadas D1 (psbA) y D2 (psbD), compuestas por cinco α-hélices transmembrana. Estas proteínas se unen a cofactores que facilitan la separación primaria de cargas (Barber, 1987; Nixon et al., 2005; Fromme & Grotjohann, 2008). Las proteínas D1 y D2 están asociadas con dos proteínas de unión a clorofilas CP (Chlorophyll containing proteins), denominadas CP43 (psbC) y CP47 (psbB). El RC del PSII de plantas y cianobacterias tiene una estructura dimérica (Barber, 2006). La subunidad CP47 se localiza cerca del dominio de dimerización, mientras que CP43 se localiza en la periferia del dímero formado por dos monómeros del PSII (Fromme & Grotjohann, 2008). Además, existen 13 subunidades de bajo peso molecular (PsbE, PsbF, PsbH, PsbI, PsbJ, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc, PsbX, PsbY, PsbZ y Ycf12), normalmente con una única α-hélice transmembrana (salvo PsbZ, que posee 2 α-hélice transmembrana), de las cuales sólo se han caracterizado las subunidades PsbE y PsbF. Estas 2 subunidades proporcionan ligandos de histidina para el grupo hemo del citocromo b559 (Shen et al., 2008). El RC del PSII tiene además 4 proteínas extrínsecas unidas a su cara luminal, cuya Introducción 37 naturaleza varía en función del tipo de organismo. En plantas y algas verdes, estas 4 proteínas extrínsecas, PsbO, PsbP, PsbQ y PsbR se unen a la región extra-membrana de las proteínas D1, D2, CP47 y CP43, y al grupo Mn4Ca para constituir el complejo de escisión de oxígeno (OEC, Oxygen-evolving complex) (Allahverdiyeva et al., 2013). Figura i11. Estructura dimérica del Fotosistema II. Vista del PSII perpendicular a la membrana. Las α-hélices se representan mediante cilindros. Las distintas subunidades se representan con distinto color: D1 (amarillo), D2 (naranja), CP47 (rojo), CP43 (verde), PsbL, PsbM y PsbT (azul intermedio), y PsbH, PsbI, PsbJ, PsbK, PsbX, PsbZ y PsbN en azul claro; las proteínas extrínsecas PsbO (azul oscuro), PsbU (magenta) y PsbV (cian). Las clorofilas del RC unidas al dímero D1/D2 aparecen en verde claro, las feofitinas en azul, las clorofilas de los complejos antena en verde oscuro, y los β-carotenos en naranja. Adaptado de Barber (2006). En las membranas de las granas tilacoidales de plantas y algas verdes se han encontrado un número variable de proteínas de la superfamilia LHC (Light Harvesting Complex) asociadas a dímeros del PSII, formando los denominados supercomplejos PSII-LHCII (Dekker & Boekema, 2008). Estos sistemas periféricos de captación de luz consisten en cuatro miembros homólogos, denominados LHCII, CP29, CP26 y CP24. El complejo LHCII es el más abundante en los cloroplastos, mientras los otros 3 sistemas de captación son denominados proteínas de unión a clorofila (CP), debido a su baja abundancia. Cada monómero LHCII consiste en 3 hélices transmembrana, y puede unirse a 13-15 moléculas de Chl a y Chl b y 3-4 carotenoides (Fromme & Grotjohann, 2008; Liu & Chang, 2008). Generalmente, el complejo LHCII puede existir en forma de homo o hetero-trímeros en las membranas tilacoidales, formado por el producto de 3 genes nucleares homólogos, Lhcb1, Lhcb2 y Lhcb3. Este estado trimérico mejora la estabilidad de Introducción 38 la proteína y la eficiencia de la captación de luz, y optimiza el control de la disipación de energía (Liu & Chang, 2008). Los tres complejos antena minoritarios CP29 (Lhcb4), CP26 (Lhcb5) y CP24 (Lhcb6) están presentes como monómeros, y unen al LHCII con el RC del PSII, formando los supercomplejos PSII-LHCII (Pan et al., 2013). La cadena de transporte de electrones. A continuación describiremos brevemente el flujo de electrones en la fotosíntesis, desde la separación de cargas y rotura de la molécula de agua hasta la formación de NADPH (Figura i12). Los electrones necesarios para las reacciones de transferencia electrónica son aportados por el PSII mediante la fragmentación de una molécula de agua. Cuando un fotón incide sobre las clorofilas P680 del RC, el donador primario del PSII, éstas se excitan y se produce la separación de cargas, perdiendo un electrón, que es transferido a través de la membrana. Las clorofilas P680 vuelven a su estado inicial aceptando un electrón del complejo OEC, a través de un dador electrónico inmediato, un residuo de Tyr (Tyrz) de la subunidad D1 del RC del PSII. El OEC contiene un grupo metálico formado por cuatro átomos de manganeso y un ion calcio. En cada evento de separación de carga, se extrae un electrón del grupo Mn4Ca. Tras cuatro separaciones de cargas consecutivas, el grupo Mn4Ca es capaz de quitar cuatro electrones a dos moléculas de agua, formándose una molécula de oxígeno. Durante el proceso, se liberan al lumen cuatro protones (H+), que contribuyen a la creación de un gradiente de protones entre ambos lados de la membrana (Fromme & Grotjohann, 2008; Shen et al., 2008). El electrón proveniente de las clorofilas P680 se transfiere a una clorofila accesoria (ChlD1), que lo cede a una feofitina (Pheo), y posteriormente a una filoquinona de unión fuerte (QA), que lo cede a una filoquinona móvil (QB). Tras dos eventos sucesivos de separación de cargas, QB se encuentra totalmente reducida (PQH2) y abandona el PSII a través de un canal de membrana hasta el citocromo b6f. Un electrón se transfiere directamente al grupo 2Fe2S, que lo transfiere al citocromo f, localizado en un dominio extrínseco a la membrana luminal del complejo b6f. La subunidad citocromo f contiene un sitio de unión para la plastocianina, el cual transfiere el electrón al PSI. El segundo electrón sigue la vía cíclica (o ciclo Q). Tras completar este ciclo, el electrón se transfiere al grupo FeS para reducir una segunda molécula de plastocianina (Fromme & Grotjohann, 2008). Introducción 39 Figura i12. La cadena de transporte de electrones fotosintética. (A) Modelo estructural de los componentes proteicos de la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa en el orden en que aparecen en la cadena de transporte de electrones. (B) Componentes funcionales de la cadena de transporte de electrones. A través de las flechas puede seguirse la ruta que sigue el electrón a lo largo de la cadena. Las flechas moradas representan el transporte directo del electrón, mientras que las flechas verdes indican el transporte de un electrón junto a un protón, en forma de plastoquinona reducida. Para más detalles consultar el texto. Adaptado de Fromme & Grotjohann, (2008). El PSI cataliza la transferencia electrónica desde la plastocianina, en la cara luminal de la membrana, hasta la ferredoxina, en la cara estromal. Cuando un fotón incide sobre las clorofilas P700, éstas se excitan y tiene lugar la separación de cargas. Las clorofilas P700 ceden un electrón a un aceptor primario (A0), una Chl a, y este aceptor lo cede a una molécula de filoquinona (A1) y tres grupos 4Fe4S (Fx, FA y FB). Finalmente, el electrón se transfiere desde el grupo FB hasta la ferredoxina, una proteína ferro-sulfurada asociada débilmente a la cara estromal de la membrana tilacoidal. Dos ferredoxinas transfieren sus electrones a la ferredoxina:NADP+ Introducción 40 reductasa (FNR) para la reducción de NADP+ hasta NADPH, el producto final de la cadena de transporte de electrones. Las clorofilas P700 vuelven a su estado original aceptando un electrón de la plastocianina (Fromme & Grotjohann, 2008; Krauss 2008). 6. El estrés oxidativo y el daño del aparato fotosintético. En los cloroplastos, se generan continuamente ROS, principalmente por la transferencia directa de la energía de excitación desde la clorofila o por la reducción incompleta del oxígeno en el PSI. Estos ROS incluyen oxígenos moleculares singlete (1O2), radicales aniónicos superóxido (O2•-), radicales hidroxilo (HO-) y peróxido de hidrógeno (H2O2). La toxicidad del H2O2 no se debe a su reactividad per se, sino que requiere de la presencia de un metal redundante para formar un grupo hidroxilo altamente reactivo, el cual reacciona potencialmente con todas las moléculas biológicas. Así, los metales de transición, como los iones de hierro y cobre, pueden reaccionar con el H2O2 por catálisis enzimática durante condiciones de estrés para producir radicales hidroxilos altamente reactivos (reacción de Fenton), los cuales oxidan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. El aumento de la fotorrespiración y la actividad NADPH durante el estrés contribuyen al incremento en la acumulación de H2O2, que inactiva enzimas por la oxidación de los grupos tiol (Bartels & Sunkar, 2005). In vivo, la amplitud del daño bajo cualquier tipo de estrés depende del equilibrio entre los procesos de daño y reparación. El aparato fotosintético es muy sensible a daños, y debe conservarse o repararse rápidamente tras un estrés. Se han descrito, al menos, tres puntos sensibles a estrés en la maquinaria fotosintética: los fotosistemas, principalmente el PSII, la síntesis de ATP, y los procesos de asimilación del carbono. Existen dos formas principales de deficiencia inducida por estrés en la fotosíntesis: el daño directo inducido por el factor estresante, y la inhibición de la síntesis de proteínas por los ROS. Estreses como la limitación de CO2, deshidratación, frío o alta salinidad pueden catalogarse como estreses oxidativos que inhiben la reparación del PSII y/o del PSI (Allakhverdiev et al., 2008). El PSII es un sitio crítico de daño durante condiciones de estrés como deshidratación, calor, alta luminosidad, y luz UV-B (Allakhverdiev et al., 2008). El estrés hídrico normalmente provoca el daño del complejo OEC y del RC del PSII (Georgieva et al., 2009). Entre los componentes intrínsecos del PSII, la proteína D1 es particularmente vulnerable al daño producido por los ROS (Aro et al., 1993. 2005; Nixon et al., 2010). Cuando el OEC se daña, se interrumpe el suministro Introducción 41 de electrones desde el agua a las clorofilas P680 oxidadas. Bajo estas condiciones, la absorción de luz visible por las clorofilas y la transferencia de energía de excitación siguen ocurriendo, produciéndose una fuerte oxidación que daña a la proteína D1. Alternativamente, la disrupción del OEC permite el acceso de las moléculas de O2 a las clorofilas P680, generándose ROS que pueden dañar el RC del PSII (Nishiyama et al., 2011). Las proteínas extrínsecas y los cofactores parecen contrarrestan la acción negativa de los ROS sobre el PSII (Allakhverdiev et al., 2008). Cuando las células fotosintéticas se exponen a la luz, tienen lugar dos fenómenos distintos, el daño sobre el PSII producido por la luz, y la reparación del PSII. Los organismos fotosintéticos son capaces de vencer el daño producido por la luz en el PSII mediante la rápida y eficiente reparación de los componentes dañados, lo cual requiere la síntesis de novo de proteínas. Cuando la tasa de daño del PSII se excede a la de reparación, la luz se convierte en un problema para la planta, en términos de capacidad fotosintética, produciendose la fotoinhibición del PSII (Aro et al., 1993; Nishiyama et al., 2011). Numerosos estudios sugieren que las proteínas D2 y PsbH también sufren daños ocasionalmente por la luz. La reparación del daño en el PSII producido por la luz requiere la sustitución rápida de la proteína D1 dañada, mediante la síntesis de novo (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). La síntesis de novo de proteína D1, así como de otras proteínas, se reprime por elevadas concentraciones intracelulares de ROS (Nishiyama et al., 2011). El PSI, en comparación con el PSII, se considera resistente a estrés (Sonoike, 2011). En particular, la desecación en oscuridad puede producir daños en el PSI de plantas normales, pero no en plantas de resurrección (Deng et al., 2003; Georgieva et al., 2009). Durante el proceso de fotoinhibición, disminuye la tasa de fotosíntesis como consecuencia del exceso de luz (Sonoike, 2011). Existen varios estudios que demuestran la fotoinhibición del PSI, aunque sólo un par de especies vegetales han mostrado fotoinhibición selectiva del PSI in vivo, con pequeños efectos en el PSII. Para muchas de las otras especies vegetales, el alcance de la fotoinhibición del PSI es igual o menor a la observada en el PSII. La fotoinhibición del PSI puede ser más peligrosa que la del PSII, debido a la lenta tasa de recuperación del PSI. La fotoinhibición del PSI no sólo es irreversible, sino que es la causa potencial de multitud de daños secundarios, por lo que parece lógico que el PSI esté bien protegido contra la fotoinhibición in vivo en muchas especies vegetales y bajo determinadas condiciones ambientales. Durante la fotoinhibición del PSI se produce la degradación de las subunidades del RC del PSI. Se ha descrito la fragmentación de las subunidades PsaA y PsaB, así como la fragmentación de otras subunidades pequeñas del PSI. La Introducción 42 tasa de reposición de subunidades del PSI no es tan alta como la observada para la proteína D1, por lo que la recuperación del PSI tras la fotoinhibición es muy lenta, en comparación con la recuperación del PSII. Además, la mayoría de los complejos RC del PSI fotoinhibido no se reparan, sino que se degradan tras la fotoinhibición junto con las clorofilas unidas a ellos (Sonoike, 2011). EL PSII puede causar la fotoinhibición del PSI in vivo. El flujo de electrones desde el PSII es esencial para la fotoinhibición del PSI. Los electrones suministrados por el PSII reducen las moléculas de oxígeno en el sitio aceptor del PSI, resultando en la formación de radicales aniónicos superóxido y la reducción del grupo 4Fe4S que sirve como aceptor de electrones del PSI. El peróxido de hidrógeno producido por la dismutación de los radicales superóxidos, reaccionan con los centros Fe o FeS reducidos, produciendo radicales hidroxilo, que inmediatamente destruyen los centros 4Fe4S (Sonoike, 2011). Así, cualquier inhibición en la actividad del PSII puede proteger al PSI de la fotoinhibición. La fotoinhibición del PSII puede actuar como un mecanismo protector del PSI. La regulación negativa de la actividad del PSII puede ser esencial para la supervivencia bajo condiciones de estrés (Tikkanen et al., 2014). Los ROS producidos en las clorofilas antenas pueden causar la fotoinhibición del PSI en ausencia de actividad del PSII (Sonoike, 2011). Además, la fotoinhibición del PSI puede causar la fotoinhibición del PSII. Una vez que se induce la fotoinhibición del PSI, se bloquea la transferencia de electrones al PSI, produciéndose la sobre-reducción de las plastoquinonas en presencia de un PSII activo. Además, el bloqueo de la transferencia de electrones al PSI puede también causar el colapso de la síntesis de ATP. La síntesis de proteína D1 para la reparación del PSII, necesita el suministro continuo de energía. La disminución de la síntesis de ATP puede afectar a la reparación del PSII, provocando la fotoinhibición del PSII (Sonoike, 2011). 7. La senescencia en plantas. La senescencia es un proceso de cambios degenerativos controlado endógenamente, que lleva a la muerte de un órgano o un organismo (Noodén, 2013). La senescencia de la hoja está regulada por factores endógenos, como el desarrollo reproductivo, hormonas y ROS, y por Introducción 43 factores ambientales, como estreses tanto abióticos como bióticos. El proceso de senescencia, al igual que otros tipos de muertes celulares programadas y la respuesta a estrés abiótico, está asociada con la sobreproducción de ROS, los cuales oxidan proteínas, lípidos y ADN, rompiendo la homeostasis celular y el balance entre las múltiples rutas que tienen lugar en los distintos compartimentos celulares, y provocando la peroxidación de lípidos, daños celulares, y finalmente la muerte celular (Khann-Chopra et al., 2013). Sin embargo, aunque la senescencia puede desencadenarse a partir de señales exógenas, es un proceso activo controlado internamente, donde partes de un organismo controla a otras. Por ejemplo, las hojas jóvenes en crecimiento pueden causar la senescencia de hojas más viejas, o los frutos y semillas en proceso de maduración pueden inducir la senescencia de la planta completa. Así, existen diferentes patrones de senescencia, con diferentes funciones: de la hoja, de la flor, del fruto o la senescencia de plantas monocárpicas (Noodén, 2013). La senescencia de la hoja causa generalmente una disminución programada de varios procesos celulares, incluida la fotosíntesis. Durante este proceso se incrementa la actividad proteolítica, acompañada por la remobilización de nutrientes dentro de la planta (Khann-Chopra et al., 2013). Los cloroplastos contienen más del 50% del nitrógeno de la hoja, principalmente en forma de proteínas (Sabater & Martín, 2013). Hasta el 70% del nitrógeno de los cloroplastos se encuentra en la enzima Rubisco, aunque también existe gran cantidad de nitrógeno en los complejos LHC de las membranas tilacoidales. Durante la senescencia, los componentes del aparato fotosintético se degradan para reutilizar el nitrógeno en los nuevos órganos en formación (Krupinska et al., 2013). En este proceso se moviliza el nitrógeno desde los órganos viejos hasta las estructuras jóvenes y en desarrollo, mediante su conversión en formas exportables, como asparagina o glutamina (Sabater & Martín, 2013). La degradación de las proteínas plastidiales durante la senescencia sigue diferentes rutas en la que participan proteasas plastidiales y sistemas proteolóticos extraplastidiales (Krupinska et al., 2013). La degradación de los cloroplastos es uno de los primeros eventos que tienen lugar durante la senescencia aunque se mantienen hasta las últimas etapas del proceso de senescencia, precediendo cambios morfológicos en el núcleo y las mitocondrias (Mulisch & Krupinska, 2013; Krupinska et al., 2013). Durante la senescencia de la hoja, los cloroplastos se transforman en gerontoplastos, mediante cambios estructurales que afectan a la organización del sistema de membranas tilacoidales, las cuales son progresivamente degradadas. Debido a que la senescencia puede estar afectada por diversos factores ambientales, las plantas pueden usar Introducción 44 diferentes estrategias para desmantelar los cloroplastos (Mulisch & Krupinska, 2013). La desorganización estructural de los tilacoides se acompaña por una disminución en las reacciones fotoquímicas y en la eficiencia las enzimas del ciclo de Calvin-Benson, incluida la enzima Rubisco (Krupinska et al., 2013). Durante el proceso de senescencia, los cloroplastos están en situación de dilema. Por un lado, son necesarios para la producción de energía mediante la fotosíntesis, y al mismo tiempo deben ser degradados para la obtención de nutrientes. Para coordinar la fotosíntesis con el desmantelamiento de la organela es necesaria una elevada coordinación entre los plástidos y el núcleo (Krupinska et al., 2013). Los ROS participan en la comunicación entre los cloroplastos y el núcleo, y juegan un papel importante en el desarrollo del proceso de senescencia. Muchos de los genes implicados en el desensamblaje de los cloroplastos y la senescencia de la hoja están localizados en el núcleo, aunque codifican proteínas con función en los cloroplastos o las vacuolas, en las cuales se completa el proceso de degradación, lo cual sugiere que la senescencia está controlada inicialmente a nivel nuclear (Sabater & Martín, 2013). Objetivos Materiales y métodos 52 Líneas 35S:A4a. Las plántulas transgénicas 35S:A4a sobreexpresan ectópicamente el factor HaHSFA4a bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S. Estas líneas se obtuvieron por transformación a partir de plantas de tabaco silvestre (Nicotiana tabacum var. Xanthi), tal como se detalla en la Sección 4. Las 3 líneas 35S:A4a usadas, presentan diferentes eventos de integración simple del transgén 35S:HaHSFA4a en homocigosis: A4a1 (35S:A4a1), A4a2 (35S:A4a2) y A4a3 (35S:A4a3). Las correspondientes líneas hermanas no transgénicas se obtuvieron mediante segregación: NT1, NT2 y NT3. Líneas 35S:A9/A4a. Las plántulas dobles transgénicas 35S:A9/A4a sobreexpresan ectópicamente los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a bajo el control del promotor constitutivo CaMV 35S. Estas líneas se obtuvieron por transformación a partir de plantas transgénicas de tabaco de las líneas 35S:A9, tal como se detalla en la Sección 4. Las 4 líneas 35S:A9/A4a usadas, presentan diferentes eventos de integración simple del transgén 35S:HaHSFA4a en homocigosis, integrados en 3 fondos genéticos 35S:A9 diferentes: A91/A4a1 (35S:A91/A4a1), A91/A4a2 (35S:A91/A4a2), A92/A4a (35S:A92/A4a) y A93/A4a (35S:A93/A4a). Las correspondientes líneas hermanas transgénicas simples se obtuvieron mediante segregación: A91, A92 y A93. 1.1.2. Semillas transgénicas. Para el estudio de la inducción de la acumulación de proteínas sHSP-P mediado por el programa genético activado por el factor HSFA9 (ver Figuras r2 y r3) se emplearon semillas transgénicas maduras de tabaco. Estas semillas transgénicas expresan en correspondiente factor HSF bajo el control del promotor específico de semillas HaDS10G1 (Rousselin et al., 2002). Líneas DS10:A9 Las semillas transgénicas DS10:A9, descritas por Prieto-Dapena et al. (2006), sobreexpresan el factor HaHSFA9 bajo el control del promotor específico de semillas HaDS10G1. Las 4 líneas DS10:A9 usadas, presentan diferentes eventos de integración simple del transgén DS10:HaHSFA9 en homocigosis: A91 (DS10:A9 #6-7); A92 (DS10:A9 #14-5) y A93 (DS10:A9 #19-4) y Materiales y métodos 53 A94 (DS10:A9 #22-11). Las correspondientes líneas hermanas no transgénicas se obtuvieron mediante segregación: NT1 (DS10:A9 #6-5); NT2 (DS10:A9 #14-6); NT3 (DS10:A9 #19-10) y NT4 (DS10:A9 #22-7). Líneas DS10:A9M3 Las semillas transgénicas DS10:A9M3, descritas por Tejedor-Cano et al. (2010), sobreexpresan una forma represora activa de HaHSFA9 (A9M3) bajo el control del promotor específico de semillas HaDS10G1. Las 4 líneas DS10:A9M3 usadas, presentan diferentes eventos de integración simple del transgén DS10:A9M3 en homocigosis: A9M31 (DS10:A9M3 #5 T); A9M32 (DS10:A9M3 #9 T); A9M33 (DS10:A9M3 #30 T) y A9M34 (DS10:A9M3 #34 T). Las correspondientes líneas hermanas no transgénicas se obtuvieron mediante segregación: NT1 (DS10:A9M3 #5 NT); NT2 (DS10:A9M3 #9 NT); NT3 (DS10:A9M3 #30 NT) y NT4 (DS10:A9M3 #34 NT). 1.1.3. Cultivo in vitro. El cultivo in vitro de las plantas se empleó principalmente para la propagación de las diferentes líneas transgénicas de tabaco, dirigida a la obtención de plántulas de 3-4 semanas tras la germinación, que posteriormente fueron usadas en los respectivos ensayos experimentales. Además, también se empleó el cultivo in vitro para la obtención de las líneas transgénicas 35S:A4a y dobles transgénicas 35S:A9/A4a: en los sucesivos pasos de transformación de las plantas mediante A. tumefaciens, selección de transformantes positivos, propagación vegetativa y regeneración de la planta, y obtención de las correspondientes líneas hermanas singénicas, y para el estudio de segregación (ver Sección 4.). Esterilización de la semilla y cultivo in vitro. Antes de la germinación, la superficie de las semillas de tabaco se esterilizó con 5 % hipoclorito sódico (p/v) durante 20 min, seguido por 4 lavados son agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas se sembraron en placas Petri (9 cm de diámetro) con medio sólido MS (Murashige & Skoog, 1962). Para la obtención de las plántulas de 3-4 semanas usadas en los Materiales y métodos 54 ensayos experimentales, las semillas se sembraron en el medio MS, sobre papel de filtro (50 g m- 2) esterilizado mediante autoclave. Durante el proceso de obtención de las plantas transgénicas 35S:A4a y 35S:A9/A4a, el medio sólido MS, en placas Petri o en contenedores MagentaTM (Sigma-Aldrich), se suplementó con diferentes hormonas y antibióticos, tal como se detalla en el correspondiente apartado de la Sección 5. Medio MS: 4,4 g/l MS (Duchefa Biochemie) 30 g/l sacarosa, pH 5,8. Para la preparación de medio sólido se añadió 8 g/l Plant Agar (Duchefa Biochemie). Las placas Petri con las semillas, se incubaron en cámaras de cultivo con iluminación y temperatura controladas: 16 h de luz, a 25 oC, y 8 h de oscuridad, a 20 oC; y una intensidad de luz de 100 µmol m-2 s-1. Manipulación del material vegetal La manipulación del material vegetal se realizó en condiciones de esterilidad, en una cabina de flujo laminar. Los medios de cultivo, el material de vidrio y las distintas soluciones empleadas se esterilizaron mediante autoclave a 120 oC y 1 atmósfera de sobrepresión durante 20 min. Los antibióticos se añadieron al medio de cultivo una vez enfriado a 50-55 oC. Los útiles empleados para la manipulación del material vegetal se esterilizaron por calor. 1.1.4. Cultivo en tierra. Para la obtención de semillas, las plantas de tabaco se cultivaron en tierra, en cámaras con luz, temperatura y humedad controladas. Las plantas e cultivaron en macetas en una mezcla 4:1 de turba y perlita. Se sometieron a un régimen de 16 h de luz a 25 oC y 8 h de oscuridad a 20 oC, con una humedad relativa constante del 80 %. Materiales y métodos 55 1.2. Bacterias. 1.2.1. Escherichia coli. En este trabajo, hemos utilizado células competentes de E. coli XL1-BLUE, con genotipo recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17 supE44 relA1 lac {F’ proAB lacIq ZDM15Tn10 (tetR)} (Bullock et al., 1987). Esta estirpe se usó para la transformación y la propagación de plásmidos. Las bacterias se cultivaron en medio LB o YEP a 37 oC. Para la selección de bacterias portadoras de plásmidos, el medio se suplementó con 50 µg/ml de ampicilina o 50 µg/ml de kanamicina. Medio LB: 10 g/l bactotriptona, 5 g/l extracto de levadura y 10 g/l NaCl pH 7,0. Medio YEP: 10 g/l bactotriptona, 10 g/l extracto de levadura y 5 g/l NaCl pH 7,0. Para preparar medio sólido se añadieron 15 g/l de agar bacteriológico. 1.2.2. Agrobacterium tumefaciens. En este trabajo, hemos utilizado células competentes de A. tumefaciens LBA4404. Esta estirpe llevaba el plásmido Cr (críptico) pAL4404 en el fondo cromosómico C58-C9 (Hoekema et al., 1983). La estirpe de A. tumefaciens LBA4404 se ha empleado para la transformación de discos de hojas de tabaco, para la obtención de plantas transgénicas (ver Sección 4.). Esta estirpe se cultivó a 28 oC en medio YEP suplementado con 50 µg/ml de estreptomicina. Las bacterias transformantes se seleccionaron en medio YEP suplementado con 50 µg/ml de kanamicina. 2. Análisis y tratamientos de ADN. 2.1. Purificación de ADN plasmídico. Para la extracción de ADN plasmídico se empleó el Kit NucleoSpin® Plasmid (Macherey- Nagel), siguiendo las indicaciones descritas por el fabricante. Materiales y métodos 56 2.2. Cuantificación de ADN. La concentración de DNA se cuantificó mediante un espectrofotómetro NanoDrop® ND- 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc.). Para verificar la concentración de ADN, la muestra se comparó con muestras de ADN de concentración conocida, por electroforesis en gel de agarosa. 2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. Para la electroforesis de ADN se usaron geles 1-1,6 % agarosa (p/v) en tampón TBE. La electroforesis se realizó a 70-100 V, usando como tampón de corrida tampón TAE suplementado con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. Tampón TBE: 89 mM Tris, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8,3. 2.4. Extracción de fragmentos de ADN de geles de agarosa. Para la extracción de ADN de geles de agarosa se utilizó el kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel) siguiendo las indicaciones descritas por el fabricante. 2.5. Reacciones enzimáticas de ADN. En general se han seguido los protocolos descritos por Sambrook et al. (1989). 2.5.1. Digestión de ADN con enzimas de restricción. Las digestiones de ADN con enzimas de restricción se realizaron usando los tampones y las condiciones recomendadas por el fabricante. Para 1 µg de ADN se usó, al menos, 1 U de enzima de restricción. Para las subsecuentes manipulaciones, el ADN producto de la digestión se separó por electroforesis (ver Sección 2.3.) y el fragmento de ADN de interés se aisló mediante el kit descrito en la Sección 2.4. Materiales y métodos 57 2.5.2. Ligación de fragmentos de ADN. Para la ligación de los fragmentos de ADN se usó la enzima ADN ligasa del bacteriófago T4 (Invitrogen), siguiendo las indicaciones descrita por el fabricante. Para la ligación de ADN con extremos romos, la incubación se realizó a 14 oC durante toda la noche, y para la ligación de extremos cohesivos, la incubación se hizo a temperatura ambiente durante 1-2 h. El producto de la ligación se usó para la transformación de bacterias (ver Sección 3.). 2.5.3. Reacción de secuenciación. La secuenciación del ADN se realizó a través del Servicio Secugen (Madrid, España). Para cada reacción de secuenciación, se usaron 15 µl de ADN a una concentración 10 ng/µl. Los oligonucleótidos específicos se usaron a una concentración de 5 µM. 3. Transformación de bacterias. El último paso en la clonación de plásmidos consistió en la transformación de un cultivo de células bacterianas con la mezcla resultante de la ligación (ver Sección 2.5.2.). De esta forma se clonaron plásmidos individuales, que posteriormente fueron analizados y seleccionados. La introducción de ADN en bacterias requiere un tratamiento previo para hacer competentes a la célula bacteriana. Posteriormente, las células competentes se ponen en contacto con la solución de plásmidos, y las células transformantes se seleccionan en el medio apropiado. 3.1. Transformación de Escherichia coli. Para la trasformación de Escherichia coli XL1-Blue, se siguieron principalmente los protocolos descritos por Inoue et al. (1990) para la obtención de células competentes por el método de baja temperatura, y posterior transformación. Las células competentes se congelaron en N2 líquido en alícuotas de 100 µl, y se guardaron a -80 oC hasta su uso. Para la transformación, Materiales y métodos 58 se usaron 10 ng de ADN, en un volumen menor a 20 µl. Para la transformación de las células competentes, volúmenes descritos por Inoue et al. (1990) se ajustaron para un volumen inicial de 10 µl de células competentes. Tras la transformación, se seleccionaron las células transformadas en medio LB suplementado con el correspondiente antibiótico de selección del plásmido: 50 µg/ml de ampicilina o 50 µg/ml de kanamicina. Las células se incubaron durante toda la noche a 37 oC. Selección de transformantes mediante actividad β-galactosidasa. Esta técnica se basa el viraje de color, de blanco a azul, de las colonias que expresan el gen lacZ. Este gen codifica la enzima β-galactosidasa, la cual hidroliza X-gal, generando 5,5’-dibromo- 4,4’-dicloro-índigo, un compuesto de color azul. El vector pGEM®-T Easy (Promega), usado en la trasformación del ADN resultante de la hibridación sustractiva (ver Sección 6.2.) tiene la región polylinker dentro del gen lacZ. De modo que la inserción de un fragmento de ADN en el polylinker impide la expresión del gen. Este hecho nos permite diferenciar, en presencia de X-Gal e IPTG (un inductor de la β-galactosidasa) las colonias que contienen un vector con inserto y las que contienen un vector vacío, las cuales presentaran un color azulado. Para la selección de las colonias que han incorporado el vector con inserto, las colonias se sembraron en placas Petri con medio LB suplementado con 50 µg/ml amplicilina, sobre el que se extendieron 40 µl de X-gal (20 mg/ml) y 4 µl de IPTG (200 mg/ml). Las placas se incubaron a 37 oC durante 24 h. Posteriormente, se seleccionaron las colonias positivas (colonias blancas). 3.2. Transformación de Agrobacterium tumefaciens. Para la preparación de células competentes de A. tumefaciens LBA4404, se siguió el protocolo descrito por Holsters et al. (1978). Finalmente, las células se congelaron en N2 líquido en alícuotas de 100 µl, y se guardaron a -80 oC hasta su uso. Para la transformación, se añadió 1 µg de ADN plasmídico, en un volumen menor a 10 µl, a 100 µl de células competentes A. tumefaciens LBA4404, y se congeló en N2 líquido. A continuación, se descongelaron a 37 oC durante 5 min, se añadió 1ml de medio YEP, y se incubó a 28 oC con agitación suave durante 3 h. Materiales y métodos 59 Tras la transformación, se seleccionaron las células transformadas en medio YEP suplementado con antibióticos: 50 µg/ml de estreptomicina (para la selección de células de A. tumefaciens) y 50 µg/ml de kanamicina (para la selección del plásmido). Las células se incubaron a 28 oC durante 2-3 días. 4. Obtención de plantas transgénicas de tabaco. Para la obtención de las plantas transgénicas de tabaco 35S:A4a y dobles transgénicas 35S:A9/A4a (ver Sección 1.1.1.), se insertó el transgén 35S:HaHSFA4a en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi) silvestres o transgénicas 35S:A9, respectivamente, por transformación con A. tumefaciens. Para ello, se transformó A. tumefaciens con el vector binario 35S:A4a, y se infectaron con estas células discos de hoja de plantas de tabaco, para la integración del transgén 35S:HaHSFA4a dentro del ADN genómico de la planta. Posteriormente, los discos de hoja se trataron con hormonas de crecimiento y antibióticos, para la obtención de plantas transgénicas completas. Se seleccionaron aquellas que poseían una única integración del transgén, y a partir de éstas, se obtuvieron las correspondientes líneas transgénicas homocigóticas para el transgén 35S:HaHSFA4a, así como sus respectivas hermanas singénicas. 4.1. Construcción del vector binario 35S:A4a. Para la construcción del vector binario 35S:A4a, se integró una fusión transcripcional del gen HaHSFA4a unida al tag 3xHA dentro del vector binario pBIB-Hyg (Becker, 1990): El ADN de HaHSFA4a se obtuvo mediante amplificación por PCR a partir del vector binario pBI221:HaHSFA4a (Tejedor-Cano et al., 2014). Para la reacción de PCR se usó la enzima de alta fidelidad Pwo DNA Polimerase (Roche), siguiendo las indicaciones descritas por el fabricante. En este paso, se introdujeron un sitio de restricción XbaI (localizado 3 pb antes del codón ATG de inicio de la traducción) y un sitio SalI (localizado 5pb detrás del codón de STOP), mediante los oligonucleótidos 5’-GTTGTTGGTATATCTAGATCAATGATGAATGATGTTCATGG-3’ y 5’-GTAAATTTA- GACAGTCGACCATTATCAACTTCTCTCTA-CTG-3’ (con una Tm de 67 oC). Materiales y métodos 60 El ADN amplificado (1215 pb) se digirió con las enzimas de restricción XbaI y SalI (ver Sección 2.5.), y el fragmento resultante (1178 pb) se insertó en el vector pUC19-35S:HA, entre los sitios de restricción XbaI y SalI del (Tejedor-Cano et al., 2010), generándose el vector pUC- 35S:3xHA:HaHSFA4a. Este paso permitió la inserción del gen HaHSFA4a entre la región promotora CaMV 35S y la etiqueta 3-HA (Hemaglutinina), fusionada en el N-terminal del gen, en el mismo marco de lectura. El vector 35S:3xHA:HaHSFA4a se digirió con las enzimas de restricción HindIII y KpnI, y el fragmento resultante (2284 pb) se insertó entre los sitios de restricción HindIII y KpnI del vector binario pBIB-Hyg (Becker, 1990), obteniéndose el vector binario 35S:A4a. 4.2. Transformación de discos de hoja de tabaco. Para la transformación de plantas de tabaco con A. tumefaciens se siguió principalmente el protocolo descrito por Horsch et al. (1985). La cepa de A. tumefaciens portadora del vector binario 35S:A4a (ver Sección 3.2.) se sembraron en césped en placas Petri con medio YEP (ver Sección 1.2.1.) suplementado con 50 µg/ml de kanamicina y 50 µg/ml de estreptomicina, y se cultivaron a 28 oC durante 48 h. Posteriormente, las células resuspendieron en medio MS (ver sección 1.1.3.) suplementado con hormonas de crecimiento (0,1 mg/l NAA y 1 mg/l 6BA). Para la transformación con A. tumefaciens, se usaron plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi), silvestres o transgénicas 35S:A9, cultivadas in vitro en contenedores Magenta (Sigma), en condiciones de esterilidad. Se seleccionaron hojas totalmente expandidas de plantas jóvenes (5-6 semanas) y se cortaron en trozos de aproximadamente 1 cm2, eliminando el nervio central. Los discos de hojas se sumergieron en el cultivo de A. tumefaciens en medio MS durante 5 min. Posteriormente, los discos de hoja se colocaron, con el haz hacia arriba, en placas Petri con medio MS suplementado con hormonas de crecimiento y se incubaron en cámaras de cultivo in vitro, con luz tenue. Transcurridos 5 días de incubación, los discos de hoja se traspasaron a medio MS con las hormonas de crecimiento y antibióticos: 250 µg/ml de cefotaxina (para eliminar A. tumefaciens) y 45 µg/ml de higromicina (para seleccionar brotes transgénicos). Transcurridos 15-20 días de cultivo in vitro, empezaron a formarse callos, en los discos de hoja, a partir de los cuales proliferaron los brotes de plantas transgénicas. Materiales y métodos 61 4.3. Selección de transformantes y enraizamiento. Los brotes obtenidos de los discos de hoja se separaron del callo y se traspasaron a contenedores MagentaTM (Sigma-Alrich) con medio MS suplementado con hormonas de crecimiento (0,1 mg/l NAA y 1 mg/l 6BA) y antibióticos (45 µg/ml higromicina y 250 µg/ml cefotaxina). En este medio, se seleccionaron los transformantes positivos, los cuales fueron capaces de enraizar en el medio suplementado con higromicina. Las plantas se mantuvieron en cultivo in vitro hasta que alcanzaron una altura de 5-8cm. Posteriormente, se traspasaron a macetas con tierra (ver Sección 1.1.4.). Para aclimatarlas al cambio de humedad las plantas se cubrieron con bolsas de plástico durante unos días. 4.4. Obtención de plantas transgénicas homocigóticas. Las plantas transgénicas obtenidas tras la transformación, se cultivaron en tierra hasta la obtención de semillas, y se seleccionaron las plantas que presentaban una integración simple del transgén 35S:HaHSFA4a. Para ello, las semillas se sembraron en medio MS suplementado con 45 µg/ml higromicina, y se seleccionaron las líneas que presentaban una segregación mendeliana 3:1 para el transgén (aproximadamente 1 de cada 4 plantas no sobrevivía en presencia de higromicina). Una vez seleccionadas las líneas con integración simple del transgén, se seleccionaron aquellas líneas que mejor expresaban el transgén 35S:HaHSFA4a en heterocigosis. Se analizó la acumulación del tag HA en estas líneas por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDSPAGE (ver Sección 8.), y se seleccionaron las líneas con mayor acumulación del tag. A partir de estas líneas, obtuvimos líneas homocigóticas para el transgén 35S:HaHSFA4a. Las plantas de las líneas heterocigóticas se cultivaron en tierra hasta la obtención de semillas. Posteriormente, se seleccionaron las plantas cuyas semillas presentan presentaban un 100 % de supervivencia en presencia de higromicina. Finalmente, se seleccionaron las líneas transgénicas que mejor expresaban el transgén 35S:HaHSFA4a en homocigosis. Se analizó la acumulación del tag HA en las plántulas por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (ver Sección 8.), y se seleccionaron las líneas con mayor acumulación del tag. Materiales y métodos 68 Tabla m1. Oligonucleótidos usados para el análisis de la inducción mediante RT-qPCR. Oligonucleótidos escritos en sentido 5’-3’. Genes Oligonucleótidos Forward Reverse CP47 (PsbB) GCTTCGTTTGCTTTGCTCTT TGCCTGTCTTTTTGTAGTTGGA PsbI TGACGCTTTCCCTTCCAGT TTGACACCAAGCAATGAAGC PsbH AGAGAATGGGTCTGTCATCTTGA CCGGACACGAGGTCTGAATA PSbO1 GGGAACTGGAACTGCTAACC CGTGAATGATGTGGGCTCTA PsbP GCAGAAGTGGGAGGGAAAC TTTACTGTGGCTGTGACCAA PsbR TTTGTGCGGTGATGAGTTC ATGGCTTGTCGGTCTTGAT PsbX TTGCCAGTGAATCCATCAAA GGAACCACCATTGAAGCTGT CP29 ATGGGAGATGGGCTATGTTG ATGGAGAATGGGAGTGGTTG PetM CATTGAAAACCCCATCACAA CAACAGCAACTCCAACGAGA Ycf3 CCTATTACAGAGATGGGATGTCG CATTACTTGTGTGGATAAGCCCTA PsaG GGAGTGAGCCATTTTGAAGC AGCCCCAAGCAAGAACATC PsaH GCTCCATTACCGGAACAAAA CCCAAATCCTCCAAGTCAAA PsaN ACCGCTGCTTCCTCCAAC GCCAACCTCTTCTTGTCATTC PsaO TTGGTTTGATTGGATGGTTG TGGGGAAATGAGAGAGTTCAG AtpB GCAGAAACAATTCGAGGATTTC AGTTCATAGCCTTCGCGGTA AtpD CGCGTGGAGCTAATCAAAG CTGCGATTCCAATTTCACAA AtpE TTACCAAATCACGCCCCTAT AGCAAAACCACCCATCAGAG AtpG CCCTCGCATCAAATCTCAAG GGAAAAGGAACTCAGCCATT sHSP-P TCTTGATGTCTCCCCTTTCG ATTTCCCCTACTGCTGATGA POR-1 GACAGGAAAATGGCATGTGA TATCGACAAACTGGCGAACA Tiamina Sintetasa AGCAGGGTCAAGCATTCATC ATTTCTCGCAACCACAAACC Tiorredoxina m CTCTCCGCCCTTGAAAATC ACCCCGTCATTGGTGAACT PEPC CTTCAGGTTGCTGGGCATAA GGCAAACATTGAGGGTGGTA Ribulosa-fostato Epimerasa AAGTTGACGGTGGTGTTGGT CCTTTTGCTTGTCTTGATTCCT Rubredoxina (similar) GCAGCAGGAGGAGGAGAAAT GCAAACCAGGAGGAATGG bHLH61 TCGGATGCTAGGGTTTCTTG GCTTTGGCTCCAGTTCCTTA LRR quinasa GCACTCGCATATCTTCACCA ATCCAGCAAGGGAAGGAACT SAP1/SAP5 (similar) TCCTCATAAATTCGCCAACA CGGTGAAACGCTCTCCTTTA MYB1 AAAAGGGGACTGGAGGAACA GCTGTCTCTGGTAGTATTTCTGAGC NDPK AAAGAGGACTTGTTGGGGAGA GGGGAAGAATGGTTTGGACT Materiales y métodos 69 8. Extracción y análisis de Proteínas. 8.1. Extracción de proteínas. 8.1.1. Extracción de proteínas con tampón Laemmli. Para la separación de proteínas por electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (ver Sección 8.4.1.), se usaron generalmente muestras proteicas extraídas mediante tampón Laemmli: El material vegetal, se congeló y se redujo a polvo usando N2 líquido en un mortero frío. Después, se homogeneizaron 150 mg de material vegetal en 150 µl de tampón Laemmli 2x, mediante la ayuda de un homogeneizador. El extracto se hirvió durante 10 min, y se centrifugó a 12.000 g durante 5 min. Se recogió la fracción soluble, se cuantificó por el método de Bradford (ver Sección 8.3.1.) y se conservó a -20 oC. Alternativamente, para la preparación de extractos de proteínas procedentes de raíces, donde existe un alto contenido en agua, se sustituyó el tampón Laemmli 2x por tampón Laemmli 4x, para obtener muestras de proteínas más concentradas. Se homogeneizaron 150 mg de material vegetal procedente de raíces en 75 µl de tampón Laemmli 4x. Tampón Laemmli: 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10 % glicerol (p/v), 2,5 % βmercaptoetanol (v/v), 1 % SDS (p/v). Tabla m2. Oligonucleótidos usados como controles internos para el análisis de la inducción mediante RT-qPCR. Oligonucleótidos descritos por Schmidt & Delaney (2010). Oligonucleótidos escritos en sentido 5’-3’. Genes Oligonucleótidos Forward Reverse Factor de elongación EF-1a TGAGATGCACCACGAAGCTC CCAACATTGTCACCAGGAAGTG Proteína ribosomal L25 CCCCTCACCACAGAGTCTGC AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT Ubiquitina E2 (Ntubc2) CTGGACAGCAGACTGACATC CAGGATAATTTGCTGTAACAGATTA Materiales y métodos 70 8.1.2. Extracción de proteínas con tampón fenol. Para la separación de proteínas por electroforesis 2D-PAGE, se usaron generalmente muestras proteicas extraídas mediante el método del tampón fenol, descrito por Lehmann et al. (1995). Los volúmenes se ajustaron para 150 mg de material vegetal inicial. La resuspensión final de las proteínas se hizo en 160 µl de tampón de muestra 2D (ver Sección 8.4.2.). El extracto de proteínas se cuantificó mediante el método de Bradford (ver Sección 8.3.1.) y se conservó a -20 oC. Con este método, se consiguieron extractos proteicos libres de impurezas, los cuales pudieron ser usados para la resolución de proteínas mediante isoelectroenfoque, en el primer paso de la electroforesis 2D-PAGE (ver Sección 8.4.2.). 8.2. Aislamiento de membranas tilacoidales. Las membranas tilacoidales se aislaron esencialmente tal como fue descrito por Lepistö et al. (2009). El material vegetal se congeló y se redujo a polvo usando N2 líquido en un mortero frío. Después, bajo un ambiente de luz tenue, se homogeneizó con tampón de aislamiento frío, suplementado con 1mM del inhibidor de proteasas Pefabloc® (Roche). Se usó 1 ml de tampón por cada 200 mg de material vegetal. Los extractos se pararon a través de un filtro de Miracloth (Calbiochem). El extracto filtrado se centrifugó a 6.000 g a 4 oC durante 5 min. La fracción no soluble, la cual contenía las membranas, se resuspendió en tampón de lavado, y se volvieron a centrifugar en las mismas condiciones. Finalmente, las membranas se resuspendieron en tampón de aislamiento suplementado con Pefabloc®. Se usó 1 µl de tampón por mg de material de partida. Las muestras se conservaron a -80 oC en alícuotas de 50 µl. Alternativamente, para los extractos de proteína total usados como control en la Figura r4A, el material vegetal, una vez reducido a polvo, se homogeneizó bajo un ambiente de luz tenue, con tampón de aislamiento frío suplementado con Pefabloc®, y se conservó a -80oC. Tampón de aislamiento: 330 mM sacarosa, 25 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 10 mM NaF. Tampón de lavado: 25 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 10 mM NaF. Materiales y métodos 71 La concentración de proteínas en los extractos de membranas tilacoidales de cuantificó por el método de Lowry (ver Sección 8.3.2.). La concentración de clorofila se cuantificó tal como se describe en Sección 9. 8.3. Cuantificación de proteínas. 8.3.1. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Para la cuantificación de proteínas se usó el reactivo Protein Assay (Bio-Rad), basado en el método de Bradford. Se siguieron las indicaciones descritas por el fabricante. 8.3.2. Cuantificación de proteínas por el método de Lowry. El contenido de proteínas de los extractos de membranas tilacoidales se cuantificó usando una modificación del método de Lowry, descrita por Markwell et al. (1978). 8.4. Electroforesis de proteínas. 8.4.1. Electroforesis SDS-PAGE. Una vez obtenidos los extractos de proteínas, fueron analizados en minigeles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Para ello se usó una unidad de electroforesis vertical Hoefer Mighty. La separación de proteínas se hizo en un sistema discontinuo: con un gel de empaquetamiento y un gel de separación. Las muestras se diluyeron en tampón Laemmli 2x (ver Sección 8.1.1.) con 0,1 % azul de bromofenol, y se hirvieron durante 5 min inmediatamente antes ser cargadas. Generalmente, se usaron 15 µg de proteína para extractos de plántulas, y 25 µg para extractos de semillas. Como marcadores de peso molecular se usó la mezcla de proteínas pre-teñidas Precision Plus ProteinTM Standars (Bio-Rad). La electroforesis se realizó a voltaje constante (100 V) hasta que el azul de bromofrenol alcanzó el borde del gel. Gel de empaquetamiento: 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 % SDS (p/v), 5 % Acrilamida/Bis 37:5:1 (40%) (Bio-Rad), 0,05 % APS (p/v), 0,1 % TEMED (v/v). Materiales y métodos 72 Gel de separación: 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 % SDS (p/v), 10-15 % Acrilamida/Bis 37:5:1 (40%) (Bio-Rad), 0,05 % APS (p/v), 0,05 % TEMED (v/v). Tampón de electroforesis SDS-PAGE: 25mM Tris, 194mM glicina, 0,1% SDS (p/v). 8.4.2. Electroforesis 2D-PAGE. Las muestras de proteínas extraídas mediante tampón fenol (ver Sección 8.1.2.) se resolvieron por electroforesis 2D-PAGE, mediante una primera resolución de las proteínas en función de su punto isoeléctrico (pI) por isolectroenfoque, y una segunda resolución mediante electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Isolectroenfoque. El isoelectroenfoque se realizó usando un sistema Protean® IEF cell system (Bio-Rad). Para la resolución de las proteínas, se usaron geles de gradiente de pH ReadyStripTM IPG Strip (Bio-Rad), de 7 cm de longitud y con un rango de pH 5,0 y pH 8,0. En un primer paso, los geles se rehidrataron las tiras por rehidratación pasiva con 160 µl de tampón de rehidratación durante 15 h a 20 oC. A la muestra de proteínas se añadieron 80 µl de tampón de muestra 2D, 0,8 µl de Bio-Lyte® pH 3-10 (Bio-Rad) y 1 µl de azul de bromofenol. Para muestras procedentes de plántulas, se usaron 140 µg de proteínas, y para muestras de semillas se usaron 300 µg de proteínas. Posteriormente, las muestras de proteínas se cargaron sobre los geles de gradiente de pH usando pocillos de plástico fijados en el extremo positivo de la tira rehidratada. Las proteínas se enfocaron en función del pI mediante el siguiente programa: 15 min a 250 V, seguido de un aumento suave del voltaje hasta 4.000 V durante 2 h, y un tercer paso de aumento del voltaje hasta 20.000 V. Tras terminar el isoelectroenfoque, las tiras se conservaron a -80 oC. Tampón de rehidratación: 8 M Urea, 2 % CHAPS (p/v), 50 mM DTT. Tampón de muestra 2D: 9 M Urea, 2 % CHAPS (p/v), 65 mM DTT. Materiales y métodos 73 Equilibrado de las muestras para electroforesis SDS-PAGE. Tras la resolución por isoelectroenfoque, las proteínas se separaron en función de su peso molecular por electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida, para lo cual fue necesario un paso intermedio de equilibrado las muestras en los geles de gradiente de pH. Las muestras procedentes del isoelectroenfoque se incubaron con 2,5 ml de tampón de equilibrado I durante 10 min en agitación suave, seguido de una incubación con 2,5 ml de tampón de equilibrado II durante 10 min. Posteriormente, las muestras se lavaron con tampón de electroforesis SDSPAGE (ver Sección 8.4.1.) y se colocaron directamente sobre el gel de separación SDS-PAGE. La electroforesis SDS-PAGE se realizó tal como se indica en la Sección 8.4.1. Tampón de equilibrado I: 6M Urea, 0,375 M Tris-HCl (pH 8,8), 2 % SDS (p/v), 130 mM DTT. Tampón de equilibrado II: 6M Urea, 0,375 M Tris-HCl (pH 8,8), 2 % SDS (p/v), 2,5 % iodoacetamida (p/v). 8.4.3. Electroforesis en geles Blue Native. La electroforesis en estado nativo mediante geles Blue Native se realizó según fue descrito por Cline & Mori (2001), con ligeras modificaciones. Las muestras de membranas tilacoidales (100 µg de proteína total), se lavaron por centrifugación a 6.000 g a 4 oC durante 3 min, y resuspensión en 100 µl de solución 0,33 M Sorbitol, 50 mM BisTris-HCl (pH 7,0). Posteriormente, se centrifugaron a 6.000 g a 4 oC durante 3min, y se resuspendieron en 10 µl de solución 25 mM BisTris-HCl (pH 7,0), 20 % glicerol (p/v). A las muestras se añadieron 10 µl de tampón de solubilización y se incubaron durante 30 min a 4 oC. y. Se recogió el material soluble tras centrifugar a 16.000 g y 4 oC durante 15 min y se añadieron 2 µl de tampón de muestra BN. Tampón de solubilización: 25 mM BisTris-HCl, 20 % glicerol (p/v), 2 % β-dodecil-n- maltósido (p/v), pH 7,0. Tampón de muestra BN: 100 mM BisTris-HCl, 1 M ácido 6-amino-caproico, 30 % sacarosa (p/v), 0,05 % Serva G (p/v), pH 7,0. Las muestras se cargaron en un gel con gradiente de acrilamida entre el 5 y el 13,5 %. Para la obtención del gel de gradiente, se mezclaron dos soluciones 0 % y 13,5 % acrilamida, usando Materiales y métodos 74 un creador de gradientes. Los geles se corrieron durante 4-5 h a 150 V en una unidad de electroforesis vertical Hoefer Mighty, en una habitación con temperatura controlada entre 4 y 8 oC. El tampón del cátodo, inicialmente con colorante (0,1 % Serva G (p/v)), se sustituyó por tampón del cátodo sin colorante, tras 2 h de electroforesis. La electroforesis se detuvo cuando la mayor parte del frente con tinción había salido del gel. Gel de empaquetamiento: 50 mM BisTris-HCl (pH 7,0), 0,5 M ácido 6-amino- caproico, 4 % Tris-acrilamida (p/v), 0,24 % Bis-acrilamida (p/v), 0,05 % APS (p/v), 0,002% TEMED (v/v). Solución 0% acrilamida: 50 mM BisTris-HCl (pH 7,0), 0,5 M ácido 6-amino-caproico, 20 % glicerol (p/v), 13,5 % Tris-acrilamida (p/v), 0,8 % Bis-acrilamida (p/v), 0,025 % APS (p/v), 0,0001 % TEMED (v/v). Solución 13,5% acrilamida: 50 mM BisTris-HCl (pH 7,0), 0,5 M ácido 6-amino- caproico, 20 % glicerol (p/v), 13,5 % Tris-acrilamida (p/v), 0,8 % Bis-acrilamida (p/v), 0,025% APS (p/v), 0,0001 % TEMED (p/v). Tampón del cátodo: 50 mM Tricina, 15 mM BisTris-HCl. Tampón del ánodo: 50 mM BisTris-HCl, pH 7,0. Tras la electroforesis, se fotografiaron los geles, se tiñeron con azul coloidal de Coomassie (ver Sección 8.5.) o se transfirieron a membranas de PVDF para el análisis de proteínas por western blot (ver Sección 8.6.). 8.5. Tinción de proteínas con azul coloidal de Coomassie. Los geles Blue-Native se tiñeron con azul coloidal de Coomassie G-250, para detectar los complejos proteicos, siguiendo el protocolo descrito por Neuhoff et al., (1988). 8.6. Detección de proteínas por western blot. La detección de proteínas por western blot fue descrita inicialmente por Towbin et al. (1979) y se basa en la especificidad de unión antígeno-anticuerpo. Este método permite la detección de proteínas mediante el uso de anticuerpos específicos frente a la proteína de interés. Materiales y métodos 75 8.6.1. Transferencia de proteínas a membranas de PVDF. Las proteínas, previamente resueltas mediante electroforesis (ver Sección 8.4.), se transfirieron a una membrana de PVDF Amersham HybondTM-P (GE Healthcare), por la aplicación de corriente eléctrica, usando un sistema de transferencia de transferencia húmeda Mini Trans- Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad). Se siguieron las indicaciones descritas por los fabricantes. Como tampón de transferencia se usó 10 mM CAPS (pH 11,0). La transferencia se hizo a voltaje constante (100 V) durante 1 h y 15 min. 8.6.2. Inmunodetección. Tras la transferencia, la membrana se bloqueó en una solución de tampón TBS-T (0,1 % Tween-20) con 5 % de leche en polvo (p/v), durante 2 h en agitación suave. A continuación, se hibridaron las membranas con el correspondiente anticuerpo específico (anticuerpo primario; ver Tabla m3) frente a la proteína de interés, diluido en una solución de tampón TBS-T (0,1 % Tween-20) con 5 % de leche en polvo (p/v). La hibridación con el anticuerpo primario se hizo durante toda la noche a 4 oC y en agitación suave. Alternativamente, para los western blot tras geles Blue-Native (ver Sección 8.4.3.), el bloqueo se hizo durante toda la noche a 4 oC, para facilitar la eliminación del colorante Serva G de las membranas. La hibridación con el anticuerpo primario se realizó durante 4 h a temperatura ambiente. Tabla m3. Anticuerpos primarios usados para la detección de proteínas por western blot. Anticuerpos Dilución Anti-sHSP CI (Coca et al., 1994) 1/1.000 Anti-sHSP CII (Coca et al., 1994) 1/1.000 Anti-HSP101/ClpB N-terminal (AS07 253, Agrisera) 1/30.000 Anti-HSP21 (AS08 285, Agrisera) 1/3.000 Anti-HSP70B ( AS06 175, Agrisera) 1/10.000 Anti-PsbA C-terminal (AS05 084, Agrisera) 1/10.000 Anti-PsbP (AS06 167, Agrisera) 1/3.000 Anti-PsaB C-terminal (AS10 695, Agrisera) 1/1.000 Anti-HA-peroxidase (high affinity 3F10) (Roche) 1/10.000 Materiales y métodos 76 Tras la incubación con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron 4 veces con tampón TBS-T (0,25 % Tween-20) por ciclos repetidos de 15 min en agitación suave. Tras los lavados, todos los anticuerpos usados, exceptuando el anticuerpo frente a la proteína HA (Anti- HA-peroxidase), necesitaron la hibridación con el anticuerpo secundario anti-IgG-peroxidase de conejo (NA934, GE Healthcare), para poder ser detectados posteriormente. Las membranas se hibridaron con el anticuerpo secundario a una dilución 1/20.000 en una solución de tampón TBS-T (0,1 % Tween-20) con 5% de leche en polvo (p/v), durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la hibridación con el anticuerpo secundario, las membranas se lavaron 4 veces con tampón TBS-T (0,25 % Tween-20) por ciclos repetidos de 15 min en agitación suave. Tampón TBS-T (: 20mM Tris, 137mM NaCl 137mM, (pH 7,6). A continuación, se procedió a la detección usando el sistema ECLTM Prime (GE Healthcare), siguiendo las instrucciones descritas por el fabricante. Se hicieron exposiciones a distintos tiempos, usando películas de autorradiografía Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare). 8.7. Cuantificación de señales de western blot. Para la comparación de la acumulación de proteínas en las distintas muestras, se cuantificó la intensidad de señal obtenida en los ensayos de western blot, usando el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). 8.8. Solubilización de proteínas de las membranas tilacoidales. Para eliminar contaminación con proteínas estromales, antes del tratamiento de solubilización, los extractos de membranas tilacoidales se lavaron 4 veces adicionales con tampón de lavado (ver Sección 8.2.), mediante ciclos repetidos de centrifugación a 6.000 g a 4 oC durante 5 min y resuspensión. Para la solubilización de las proteínas sHSP-P y PsbP se usaron aproximadamente 15 µl de extractos de membranas tilacoidales (correspondiente a 5 µg de clorofila). Se añadieron 150 µl de la correspondiente solución de solubilización: 10 mM MES (pH 6,8) 0,25 M NaCl; 10 mM MES (pH 6,8) 1 M NaCl; o 0,8 M Tris-HCl, pH 8,4. Como tratamiento control, las muestras se trataron con tampón de lavado (ver Sección 8.2.). Las muestras se incubaron durante 1 h a 25 oC en Materiales y métodos 77 agitación vigorosa. Tras el tratamiento, las muestras se centrifugaron a 6.000 g a 4 oC durante 5 min. La fracción insoluble, que contenía la proteína no solubilizada unida a las membranas tilacoidales, se resuspendió directamente en tampón Laemmli 2x (ver Sección 8.1.1.). La fracción soluble, que contenía la proteína solubilizada, se precipitó durante toda la noche con 10 volumenes de 10 % TCA (ácido tricloroacético) (p/v) en acetona a -20 oC. Se añadió BSA (20 µg por muestra) como proteína carrier para la precipitación. La proteína precipitada se lavó dos veces con acetona fría, se secó a temperatura ambiente, y se resuspendió en tampón Laemmli 2x. Ambas fracciones de proteínas se analizaron por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (ver Sección 8.6.), usando la cantidad de proteína correspondiente a 0,2 µg de clorofila inicial. 9. Cuantificación de pigmentos fotosintéticos. Para la extracción de pigmentos fotosintéticos, las plántulas se incubaron en 80 % acetona en agua (v/v) durante toda la noche a temperatura ambiente y en agitación suave en oscuridad. A partir de la misma muestra, se cuantificaron los pigmentos fotosintéticos (Chl a, Chl b y Car) mediante espectrofotometría, aplicando las ecuaciones, longitudes de onda y coeficientes de absorbancia específicos para cada solvente descritos por Lichtenthaler & Buschmann (2001). Chl a (µg/ml) = 12,25 A663,2nm – 2,79 A646,8nm Chl b (µg/ml) = 21,50 A646,8nm – 5,10 A663,2nm Car (µg/ml) = (1000 A470nm – 1,82 Chl a – 85,02 Chl b)/198 Calculamos la cantidad de clorofila total como la suma de Chl a y Chl b. Materiales y métodos 84 Resultados Resultados 87 A. Protección del aparato fotosintético mediada por el programa genético activado por el factor HaHSFA9. El trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que la sobreexpresión ectópica en plántulas de tabaco del factor de transcripción HaHSFA9, bajo el promotor constitutivo CaMV 35S (líneas 35S:A9), inducía la acumulación de proteínas HSP (HSP101, sHSP-CI y sHSP-CII). Esta acumulación de HSP iba acompañada de la adquisición de tolerancia a tratamientos de deshidratación severa en las plántulas 35S:A9, las cuales sobrevivían a pérdidas de hasta el 98 % del contenido inicial de agua. Esta supervivencia estaba limitada por las raíces, observándose una mayor tolerancia de la parte aérea de la plántula (Prieto-Dapena et al., 2008). La protección y estabilización de las membranas celulares es esencial para la tolerancia de las plantas a la desecación (Hoekstra et al., 2001). Además, la actividad fotosintética está considerada como la función celular más sensible a estrés (Allakhverdiev et al., 2008). Así, durante la deshidratación se produce un incremento de ROS (Bartels & Sunkar, 2005), que puede causar daños críticos en los fotosistemas, principalmente en el fotosistema II (PSII) (Aro et al., 1993; Nixon et al., 2010). En este apartado, estudiamos si la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 en plántulas de tabaco mejora y protege la estabilidad de las membranas celulares, especialmente las membranas tilacoidales, cuya actividad es esencial para la supervivencia de la planta. Esta estabilización podría ayudar a explicar la tolerancia a deshidratación severa descrita en las plántulas 35S:A9. 1. Acumulación reducida de sHSP-CI en las raíces de las plántulas 35S:A9. La supervivencia limitada de las raíces, observada en las líneas 35S:A9 tras ensayos de deshidratación severa (Prieto-Dapena et al., 2008), nos llevó a estudiar en primer lugar, la posible limitación de la acumulación de proteínas sHSP en las raíces de las plántulas 35S:A9, a temperaturas normales de crecimiento. Para ello, caracterizamos por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE la acumulación de las proteínas sHSP-CI en la parte aérea y las raíces de las plántulas de las líneas transgénicas de tabaco 35S:A9, descritas previamente por Prieto-Dapena et al. (2008) (Figura r1). Estas líneas 35S:A9 presentaban diferentes eventos de integración simple del transgén 35S:HaHSFA9 en homocigosis. En la parte aérea, el patrón de acumulación de sHSP-CI fue similar al observado en las muestras Resultados 88 correspondientes a plántulas completas. Sin embargo, en las raíces no se observó la presencia de la banda correspondiente a la sHSP-CI de menor peso molecular. Esta banda, con peso molecular aparente de aproximadamente 15 KDa, se corresponde con un polipéptido sHSP-CI caracterizado como específico de semillas (Prieto-Dapena et al., 2006). La falta de acumulación ectópica en raíces de algunas de las isoformas sHSP-CI específicas de semillas podría correlacionarse con la falta de tolerancia a deshidratación severa observada en las raíces de las plántulas 35S:A9. Figura r1. Acumulación de sHSP-CI en la parte aérea y las raíces de las plántulas 35S:A9. Detección de la acumulación de proteínas sHSP-CI en la parte aérea (P. aérea) y las raíces (Raíz) de las plántulas 35S:A9, mediante western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Se comparan los resultados con la acumulación de sHSP-CI en extractos de plántulas enteras (Total). Se analizaron muestras de plántulas de 3-4 semanas correspondientes a 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93). Se muestran resultados representativos correspondientes a 2 líneas 35S:A9 (A91 y A93). A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). 2. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 incluye la expresión de genes shsp-P. Los precedentes en la literatura muestran que las proteínas sHSP Plastidiales (sHSP-P) de las plantas superiores pueden proteger las membranas fotosintéticas y sus componentes frente a determinadas condiciones de estrés (Heckathorn et al., 2002; Barua et al., 2003; Neta-Sharir et al., 2005; Guo et al., 2007). Estos precedentes nos indujeron a estudiar la posible expresión de genes shsp-P mediada por el programa genético activado por HaHSFA9. La acumulación de proteínas sHSP-P en las plántulas 35S:A9, en condiciones normales de crecimiento, podría contribuir a la mayor supervivencia observada en los órganos fotosintéticos tras ensayos de deshidratación severa. Resultados 89 2.1. Acumulación de proteínas sHSP-P inducida por el factor HaHSFA9. En primer lugar, analizamos la posible acumulación de proteínas sHSP-P, siguiendo la estrategia descrita previamente para el estudio de la acumulación de proteínas sHSP-CI y sHSP- CII (Prieto-Dapena et al., 2006; Prieto-Dapena et al., 2008; Tejedor-Cano et al., 2010) (Figura r2). Usamos un anticuerpo comercial específico frente a la proteína HSP21, una sHSP-P de Arabidopsis thaliana. Analizamos por western blot, tras electroforesis desnaturalizante SDSPAGE, la acumulación de sHSP-P en plántulas de las líneas transgénicas 35S:A9 y sus correspondientes hermanas no transgénicas (NT), en condiciones normales de cultivo (Figura r2A). Así, observamos la acumulación de sHSP-P en las plántulas 35S:A9, que contrasta con la ausencia de dichas proteínas en las plántulas NT bajo condiciones normales de cultivo. Además, esta acumulación de proteínas sHSP-P en las líneas 35S:A9 fue considerablemente superior a la observada en las plántulas NT tras un tratamiento aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC (Figura r2A, AC). Para confirmar que la activación de genes shsp-P forma parte de programa genético embrionario activado por el factor HaHSFA9, analizamos la acumulación de proteínas sHSP-P en semillas transgénicas de tabaco con sobreexpresión del factor HaHSFA9 (líneas DS10:A9; Figura r2B) o con pérdida de función del factor HSFA9 endógeno (líneas DS10:A9M3; Figura r2C). Estas líneas presentan diferentes eventos de integración simple del correspondiente transgén (DS10:HaHSFA9 o DS10:A9M3) en homocigosis, y han sido descritas previamente por Prieto-Dapena et al. (2006) y Tejedor-Cano et al. (2010), respectivamente. Comparamos cada línea transgénica con su correspondiente línea hermana NT. Las semillas maduras de las líneas DS10:A9, con ganancia de función del programa genético activado por HaHSFA9, mostraron consistentemente mayores niveles de acumulación de proteínas sHSP-P que sus hermanas NT (Figura r2B). Por el contrario, las semillas de las líneas DS10:A9M3, con pérdida de función del programa genético activado por el factor HSFA9 endógeno, redujeron considerablemente la acumulación de sHSP-P, en comparación con sus hermanas NT (Figura r2C). Estos resultados indican que durante la maduración de la semilla se activan genes shsp-P como parte del programa genético activado por el factor HSFA9. A continuación, comparamos por western blot tras electroforesis bidimensional (2D-PAGE) la acumulación de las distintas isoformas de los polipéptidos sHSP-P inducidos por el programa genético activado por HaHSFA9, comparándolo con el patrón de acumulación de proteínas sHSP- P inducidas durante la aclimatación al calor. Así, se detectaron principalmente dos polipéptidos sHSP-P, con pesos moleculares aparentes próximos a 22 KDa y puntos isoeléctricos ácidos Resultados 90 Figura r2. Efectos de la ganancia y pérdida de función de HSFA9 sobre la acumulación de proteínas sHSP-P en semillas y plántulas. Detección de la acumulación de proteínas de choque térmico sHSP- P, mediante western blot en electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. (A) Acumulación de sHSP-P en plántulas de 3-4 semanas con ganancia de función de HaHSFA9 (35S:A9). Se analizaron 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91-A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1-NT3), así como una línea NT sometida a un tratamiento previo de aclimatación al calor durante 3h a 40oC (AC). (B) Acumulación de sHSP-P en semillas con ganancia de función de HaHSFA9 (DS10:A9). Se analizaron 4 líneas homocigóticas independientes DS10:A9 (A91-A94) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1-NT4). (C) Acumulación de sHSP-P en semillas con pérdida de función del factor HSFA9 endógeno (DS10:A9M3). Se analizaron 4 líneas homocigóticas independientes DS10:A9M3 (A9M31-A9M34) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1-NT4). A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). (pI≈5,6 y 5,8) (Figura r3). En las semillas NT (Figura r3A), sólo detectamos la presencia de la isoforma de punto isoeléctrico menos ácido (pI≈5,8). Sin embargo, en las semillas DS10:A9 se observó también la acumulación de la isoforma más ácida (pI≈5,6) (Figura r3B). En las plántulas 35S:A9, bajo condiciones normales de cultivo, ambas isoformas se acumularon ectópicamente, predominando la isoforma menos ácida (pI≈5,8) (Figura r3C). En las plántulas NT aclimatadas al calor durante 3 h a 40 oC, predominó la acumulación de la isoforma menos ácida (pI≈5,8), aunque a niveles mucho más bajos que en las plántulas 35S:A9 (Figura r3D). Así, para obtener intensidades similares de este polipéptido en las plántulas NT aclimatadas al calor, se tuvieron que usar 10 veces más proteína total que la usada para la detección en las líneas 35S:A9. Además, se detectó la acumulación de un polipéptido de menor peso molecular aparente (≈21 KDa) que se acumuló sólo en respuesta a tratamientos de aclimatación al calor (Figura r3D). Podemos concluir que las plántulas 35S:A9, en condiciones normales de cultivo, acumulan altos Resultados 91 niveles de las isoformas de polipéptidos sHSP-P presentes en semillas. Las sHSP-P que se inducen por calor difieren de las inducidas en semillas principalmente en abundancia, acumulándose a menores niveles y con distinto patrón de expresión al observado en las plántulas 35S:A9. Figura r3. Acumulación de polipéptidos sHSP-P en semillas y plántulas transgénicas de tabaco con sobreexpresión de HaHSFA9. Comparación de la acumulación de proteínas de choque térmico sHSP-P mediante western blot tras electroforesis 2D-PAGE entre líneas que sobreexpresan HaHSFA9 y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas. (A) Acumulación de sHSP-P en semillas no transgénicas. (B) Acumulación de sHSP-P en semillas DS10:A9. (C) Acumulación de sHSP-P en plántulas de 3-4 semanas 35S:A9. (D) Acumulación de sHSP-P en plántulas no transgénicas sometidas a un tratamiento previo de aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC. Se muestran resultados representativos obtenidos con, al menos, 2 líneas independientes. Se indican las isoformas específicas de la sobreexpresión de HaHSFA9 (*) y de aclimatación al calor (§). A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). En la parte inferior, se indica el rango de pH (pH 5,0-7,0). 2.2. Asociación de las proteínas sHSP-P a las membranas tilacoidales en las plántulas 35S:A9 en condiciones normales de cultivo. Una parte de las sHSP-P inducidas por calor en tejido vegetativo se encuentran asociadas a las membranas tilacoidales (Adamska & Kloppstech, 1991; Heckathorn et al., 2002; Neta-Sharir et al., 2005). Basándonos en estos precedentes, buscamos indicios de asociación a las membranas tilacoidales de las proteínas sHSP-P detectadas en las plántulas 35S:A9 bajo Resultados 92 condiciones normales de cultivo. Así, estudiamos por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE la presencia de sHSP-P en extractos de membranas tilacoidades (Figura r4). Para controlar la posible contaminación con proteínas del estroma, detectamos los niveles de acumulación de la proteína HSP70B. Observamos acumulación de la proteína HSP70B en las muestras correspondientes a extractos totales, mientras que no se detectó acumulación de HSP70B en las muestras de membranas tilacoidales (Figura r4A). De este modo se puede suponer una eliminación casi completa de las proteínas no asociadas a membrana, en los extractos de membranas tilacoidales. Sin embargo, la acumulación de proteínas sHSP-P se mantuvo constante durante los sucesivos lavados en las muestras correspondientes a membranas tilacoidales, y supuso un 27,40 ± 3,12 % de la proteína sHSP-P presente en los extractos totales (Figura r4A). Estos resultados nos sugieren que aproximadamente el 25-30 % de las proteínas sHSP-P presentes en las plántulas 35S:A9 se encuentran asociadas a membranas tilacoidales bajo condiciones normales de cultivo. La incubación de las membranas tilacoidales con diferentes soluciones salinas produce la liberación de algunas o todas las proteínas extrínsecas de membrana (Adamska & Kloppstech, 1991). Con el propósito de analizar la estabilidad de unión de las sHSP-P a las membranas tilacoidales, tratamos los extractos de membranas tilacoidales con soluciones salinas con diferente capacidad de solubilización, de menor a mayor: 0,25-1 M NaCl o 0,8 M Tris-HCl (pH 8,4) (Figura r4B). Como control, las membranas tilacoidales se trataron con el tampón de lavado (WB), usado para la preparación de los extractos (ver Materiales y métodos). Posteriormente, separamos por centrifugación la proteína solubilizada del resto de membrana tilacoidal, y detectamos por western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE el reparto de sHSP-P entre la fracción soluble (correspondiente a la proteína solubilizada) y la fracción no soluble (proteína asociada a la membrana tilacoidal). La solubilización de las sHSP-P se comparó con la observada para la proteína PsbP, una proteína del PSII con asociación luminal extrínseca. Las proteínas sHSP-P no se solubilizaron con NaCl, independientemente de la concentración usada. Sin embargo, la solubilización de la proteína PsbP aumentó con la concentración de NaCl. Tras tratamientos con 0,25 M NaCl no se solubilizaron ninguna de las dos proteínas. Mientras que aproximadamente el 80 % de la proteína PsbP unida a la membrana tilacoidal se solubilizó tras tratamientos con 1 M NaCl o 0,8 M Tris-HCl (pH 8,4). Por el contrario, tras el tratamiento con 1 M NaCl sólo se solubilizó aproximadamente un 5 % de las sHSP-P unidas a las membranas tilacoidales. Las proteínas sHSP-P sólo se solubilizaron tras tratamientos con 0,8 M Tris-HCl (pH Resultados 93 8,4), con una solubilización similar a la observada para la proteína PsbP para estas condiciones de solubilización. Estos resultados nos permiten deducir que las sHSP-P inducidas por el factor HaHSFA9 en las plántulas 35S:A9 muestran, bajo condiciones normales de crecimiento, una unión a membranas tilacoidales de fuerza similar, aunque de naturaleza menos electroestática que la observada para la proteína PsbP. Figura r4. Asociación de sHSP-P a las membranas tilacoidales en las plántulas 35S:A9 bajo condiciones normales de cultivo. Detección de las proteínas sHSP-P, PsbP y HSP70B en membranas tilacoidales mediante western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Se analizaron plántulas de 3-4 semanas de 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). (A) Comparación de la acumulación de sHSP-P y HSP70B en extractos de proteínas de plántulas enteras (total) y en preparaciones de tilacoides tras un lavado (1 lav) o cuatro lavados (4 lav), en las plántulas 35S:A9. Se muestran resultados representativos correspondientes a 2 líneas 35S:A9 (A91 y A92) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1 y NT2). (B) Comparación de la acumulación de sHSP-P y PsbP entre la fracción soluble (S) y la fracción no soluble (P) tras tratamientos con 0,25 M NaCl, 1 M NaCl o 0,8 M Tris-HCl, pH 8,4, durante 60 min a 25 oC. Se muestran resultados representativos obtenidos con, al menos, 2 líneas independientes 35S:A9. Cantidades de proteínas correspondientes a 2 mg de clorofila por carril. A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). A la derecha se indica el anticuerpo específico usado para la detección de cada proteína. Resultados 100 usada en los ensayos de deshidratación, impediría el desmantelamiento inmediato de los complejos dañados en las líneas NT. Estos resultados indican que la sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA9 en plántulas de tabaco protege la integridad del PSII frente al daño producido por la deshidratación severa. 6. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 protege al aparato fotosintético frente a estrés oxidativo severo. Los resultados anteriores mostraron la protección del aparato fotosintético en las plántulas 35S:A9 frente a tratamientos de deshidratación severa. Los precedentes en la literatura muestran que el daño producido por la deshidratación provoca el desmantelamiento de las membranas y la oxidación de los componentes celulares por ROS, como el peróxido de hidrógeno (H2O2), los radicales hidroxilos y los radicales superóxidos (Dinakar et al., 2012). El aparato fotosintético, en especial el PSII, es muy sensible a daños por estrés oxidativo (Allakhverdiev et al., 2008). Entre los componentes intrínsecos del PSII, la proteína D1, es particularmente vulnerable al daño producido por ROS (Aro et al., 1993; Nixon et al., 2010). Esto nos llevó a estudiar la posible tolerancia de las plántulas 35S:A9 a tratamientos de estrés oxidativo usando altas concentraciones de H2O2, así como la posible protección del aparato fotosintético frente al daño oxidativo causado por dichos tratamientos. En primer lugar, realizamos experimentos exploratorios con distintas concentraciones de H2O2, para encontrar la concentración óptima de estudio. Para ello, tratamos las plántulas 35S:A9 y NT con concentraciones entre 50 y 500 mM H2O2 durante 24 h en oscuridad. Posteriormente, analizamos la tolerancia a los tratamientos mediante la medida de Fv/Fm (Figura r8). Observamos que los tratamientos con 50 mM H2O2 fueron demasiado leves, y no afectaron al valor de Fv/Fm en las líneas 35S:A9 (Fv/Fm=0,699 ± 0,009), mientras que en las plántulas NT se redujo ligeramente con respecto a las medidas en los tratamientos control (Fv/Fm=0,440 ± 0,024). Por el contrario, los tratamientos con 500 mM H2O2 afectaron drásticamente tanto a las plántulas 35S:A9 (Fv/Fm=0,296 ± 0,019) como a las NT (Fv/Fm=0,052 ± 0,007), en las cuales se redujo prácticamente a cero el valor de Fv/Fm. Sin embargo, tratamientos intermedios con 200 mM H2O2, permitieron observar mejor las diferencias entre las líneas 35S:A9 y NT (Fv/Fm=0,502 ± 0,014 y 0,187 ± 0,028, respectivamente). De este modo, seleccionamos los tratamientos con 200 Resultados 101 mM H2O2 para estudiar la tolerancia de las líneas 35S:A9 a condiciones extremas de estrés oxidativo. Figura r8. Efectos del H2O2 sobre el rendimiento cuántico máximo del PSII en las plántulas 35S:A9. Comparación del rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm) entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A9 (A9) y sus hermanas no transgénicas (NT), tras tratamientos con distintas concentraciones de H2O2, entre 0 y 500mM: 0mM (n=42); 50mM (n=24); 200mM (n=30) y 500mM (n=42). Datos correspondientes a 2 experimentos independientes y 1-2 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Las plántulas 35S:A9, así como sus respectivas hermanas NT, se trataron con 200 mM H2O2, durante 24 h en oscuridad. Tras el tratamiento, se eliminó completamente el H2O2, y se dejaron recuperar las plántulas durante un periodo máximo de 7 días (Figura r9). Inmediatamente tras los tratamientos con 200 mM H2O2, se analizó la integridad del PSII mediante la medida de Fv/Fm (Figura r9A). Las plántulas 35S:A9 mostraron mayor Fv/Fm que sus hermanas NT (Fv/Fm=0,470 ± 0,012 y 0,229 ± 0,015, respectivamente). Si comparamos estos valores con los obtenidos en los tratamientos control, observamos que tras los tratamientos con 200 mM H2O2, Fv/Fm se redujo en las plántulas 35S:A9 al 67,72 % del valor en condiciones control, mientras que en las plántulas NT se redujo al 39,61 % del valor de Fv/Fm en condiciones control. Esta diferencia es estadísticamente significativa (F=265,58; P=0,0001), y demuestra que el PSII mantiene mayor Resultados 102 integridad en las plántulas 35S:A9 tras la deshidratación que en las líneas NT. Además, analizamos la supervivencia de las plántulas después de 7 días de recuperación tras el tratamiento con H2O2 (Figura r9B). Prácticamente la totalidad de las plántulas 35S:A9 sobrevivieron tras el tratamiento con 200 mM H2O2, mientras que las plántulas NT murieron en su totalidad. Las plántulas 35S:A9 supervivientes conservaron vivos los órganos fotosintéticos (hojas y tallo), excepto los cotiledones, mientras que las plántulas NT se despigmentaron y no sobrevivieron (Figura r9B). Estos resultados muestran la protección de los órganos vegetativos y la integridad del aparato fotosintético en las plantas 35S:A9, frente a condiciones muy severas de estrés oxidativo. Para confirmar la integridad del aparato fotosintético tras los tratamientos de estrés oxidativo severo, analizamos por electroforesis de proteínas en estado nativo los complejos tilacoidales proteína-clorofila del PSII (Figura r9C). Las membranas tilacoidales se solubilizaron con β-dodecil-n-maltósido y se separaron los complejos proteína-clorofila en geles Blue-Native. Así, observamos que los tratamientos con 200 mM H2O2 destruyeron los complejos proteínaclorofila del PSII en las plántulas NT, mientras que en las plántulas 35S:A9 resistieron algunos de estos complejos. La desaparición de los complejos del PSII tras los tratamientos con H2O2 fue más drástica que la observada para los tratamientos de deshidratación DT2 (ver Figura r7B, muestra DT 1h). En ambos casos, se observó mayor protección de los complejos del PSII en las plántulas 35S:A9, principalmente de los supercomplejos PSII-LHC. Además, estudiamos la integridad del PSII y el PSI tras los tratamiento con 200 mM H2O2 mediante el análisis por western blot en geles Blue-Native, usando anticuerpos específicos frente a las proteínas D1 y PsaB, componentes del RC del PSII y el PSI, respectivamente (Figura r9D y E). Al igual que en el caso de los tratamientos de deshidratación DT2 (ver Figura r7C) la proteína D1 nos permitió detectar los dímeros, supercomplejos y complejos parcialmente ensamblados CV y CVII del PSII (Figura r9D). De igual modo, con el anticuerpo frente la proteína PsaB detectamos el PSI en forma de monómeros y del supercomplejo PSI-LHCI (Figura r9E). Bajo tratamientos control, la detección de los complejos del PSII y el PSI fue similar entre las líneas 35S:A9 y NT (Figura r9D y E, muestras C). Tras tratamientos con 200 mM H2O2, se destruyeron la mayoría de los complejos del PSII y el PSI en las líneas NT, y sólo resistieron parte de los monómeros del PSI y los complejos CVII del PSII. En las líneas 35S:A9, sin embargo, los complejos totalmente ensamblados del PSII y el supercomplejo PSI-LHCI resistieron a los tratamientos con 200 mM H2O2 (Figura r9D y E, muestras H2O2). Además, también se observó que los complejos parcialmente ensamblados del PSII, principalmente el complejo CVII, se acumularon a mayores Resultados 103 Figura r9. Protección del PSII y el PSI frente al daño oxidativo en las plántulas 35S:A9. Comparación de la estabilidad del PSII y el PSI entre las plántulas 35S:A9 (A9) y sus hermanas no transgénicas (NT), tras un tratamiento con 200 mM H2O2 (H2O2) o H2O (C), durante 24 h en oscuridad. (A) Rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm), inmediatamente tras el tratamiento. Datos correspondientes a 10 experimentos independientes y 1-2 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa entre A9 y NT tras los tratamientos con H2O2 (F=265,58; P=0,0001). (B) Resultados representativos de la supervivencia de las plántulas tras los tratamientos con 200 mM H2O2. Fotografías tomadas después de 7 días de recuperación tras los tratamientos. La barra de escala equivale a 1 cm. (C) Visualización de los complejos proteicos de membrana del PSII mediante geles Blue-Native. (D) Detección mediante western blot en geles Blue-Native de la proteína D1 del PSII. El punto (•) y el corchete (}) indican la posición de los dímeros del PSII y los supercomplejos PSII-LHC, respectivamente. El guión doble (--) indica el monómero CVII del PSII. (E) Detección mediante western blot en geles Blue-Native de la proteína PsaB del PSI. El punto (•) indica la posición del supercomplejo PSI-LHCI. El asterisco (*) indica el monómero del PSI. Se muestran resultados representativos obtenidos con, al menos, 2 líneas independientes 35S:A9 y sus correspondientes líneas hermanas NT. Resultados 104 niveles en las plantas 35S:A9 que en las NT tras el estrés. Estos resultados, demuestran que la sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA9 en plántulas de tabaco protege la integridad estructural tanto del PSII como del PSI frente a a condiciones muy drásticas de estrés oxidativo. 7. La aclimatación al calor no confiere resistencia a estrés oxidativo extremo a las plántulas no transgénicas. El programa genético activado por el factor HaHSFA9 induce la acumulación ectópica de distintas proteínas HSP. Algunas de estas HSP también se acumulan en plántulas no transgénicas (NT) tras una aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC (Prieto-Dapena et al., 2008). En trabajos previos de nuestro laboratorio (Prieto-Dapena et al., 2008), se demostró que la aclimatación al calor no confería tolerancia a deshidratación severa. Así, las plántulas NT previamente aclimatadas al calor, sobrevivían a tratamientos con altas temperaturas de 2,5 h a 50 oC, pero no eran capaces de sobrevivir a tratamientos de deshidratación severa. Por el contrario, las plántulas 35S:A9, capaces de tolerar los tratamientos de deshidratación severa, no sobrevivían a tratamientos con altas temperaturas de 2,5 h a 50 oC, a menos que se les sometiera previamente a tratamientos de aclimatación al calor, durante 3 h a 40 oC (Prieto-Dapena et al., 2008). Estos precedentes nos llevaron a estudiar si estas mismas observaciones son aplicables a la tolerancia frente a los tratamientos de estrés oxidativo severo usados en nuestro estudio. Con este propósito, las plántulas 35S:A9 y NT, con o sin aclimatación al calor previa durante 3 h a 40 oC, se trataron con 200mM H2O2 durante 24h en oscuridad. Tras los tratamientos con H2O2, se compararon los efectos sobre la supervivencia y la integridad del PSII entre las plántulas aclimatadas y no aclimatadas previamente al calor. (Figura r10). Así, observamos que la aclimatación al calor no impide la disminución de Fv/Fm observada en las plántulas NT tras tratamientos con H2O2 (F=1,94; P=0,16), ni mejora la protección frente al tratamiento en las plántulas 35S:A9 (F=3,32; P=0,07) (Figura r10A). Además, las plántulas NT previamente aclimatadas al calor tampoco sobrevivieron a los tratamientos con 200 mM H2O2 (Figura r10B). Por el contrario, las plántulas 35S:A9 sobrevivieron a los tratamientos con 200 mM H2O2, tanto aclimatadas como sin aclimatar (Figura r10C y D, respectivamente). Estos resultados nos permiten inferir que el programa genético activado en tejido vegetativo por calor no es suficiente para conferir resistencia a las condiciones de estrés oxidativo severo usadas en nuestro trabajo. Sin embargo, estas condiciones de estrés oxidativo severo sí son toleradas por Resultados 105 las plántulas 35S:A9, las cuales sobreexpresan ectópicamente el programa genético activado por HaHSFA9. Figura r10. La aclimatación al calor no protege a las plántulas no transgénicas frente al daño oxidativo producido por tratamientos con alta concentración de H2O2. Comparación del efecto de tratamientos con 200 mM H2O2 (H2O2), entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A9 (A9) y sus hermanas no transgénicas (NT), bajo condiciones normales de cultivo (C) o tras un tratamiento previo de aclimatación al calor durante 3 h a 40 oC (AC). (A) Rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm), inmediatamente tras el tratamiento. Datos correspondientes a 2 experimentos independientes y 2-3 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. (B) Fotografía representativa de la falta de supervivencia de las plántulas NT tras tratamientos con H2O2 con aclimatación al calor previa. (C) Fotografía representativa de la falta de supervivencia de las plántulas 35S:A9 tras tratamientos con H2O2, sin aclimatación al calor previa. (D) Fotografía representativa de la supervivencia de las plántulas 35S:A9 tras tratamientos con H2O2 con aclimatación al calor previa. Las fotografías se tomaron después de 7 días de recuperación tras los tratamientos. Resultados 106 8. La sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA9 retarda la senescencia vegetativa en las plántulas 35S:A9. El proceso de senescencia de la hoja está asociado con el estrés oxidativo y la sobreproducción de ROS (Khanna-Chopra et al., 2013). La protección frente a estrés oxidativo, tanto del PSII como del PSI, observada en las plántulas 35S:A9 podría, por tanto, retrasar el proceso de senescencia en estas plántulas. El proceso de senescencia natural de la planta puede acelerarse mediante el cultivo bajo condiciones de oscuridad continua y falta de nutrientes (ver por ejemplo Carrión et al., 2013; Zhao et al., 2008). Para inducir la senescencia, las plántulas de se incubaron sobre papeles humedecidos con H2O desionizada y oscuridad continua, durante un periodo máximo de 5 semanas. La pérdida de clorofila es la característica más prominente del síndrome de senescencia en hojas y otros tejidos fotosintéticos (Noodén, 1988). Para analizar el desarrollo del proceso de senescencia, cuantificamos la pérdida de pigmentos fotosintéticos y el rendimiento cuántico máximo del PSII después de 1, 3 y 5 semanas de tratamiento en oscuridad (Figura r11). Tras una semana de tratamiento, las plántulas NT redujeron prácticamente a la mitad la cantidad de clorofila (53,24 ± 1,78 %), mientras las plántulas 35S:A9 conservaron el 61,91 ± 2,29 %. Esta diferencia es estadísticamente significativa (t=-2,99; P=0,009). Sin embargo, a partir de la primera semana de tratamiento, esta diferencia se redujo, hasta llegar a igualarse tras 5 semanas de tratamiento en la oscuridad. Así, tras 3 semanas de tratamiento en la oscuridad, las plántulas NT sólo mantuvieron el 30,95 ± 2,08 % de la clorofila inicial, mientras que las plántulas 35S:A9 mantuvieron el 40,19 ± 5,95 %. Esta diferencia entre las plántulas 35S:A9 y NT se anuló a las 5 semanas de tratamiento en la oscuridad (Figura r11A). De igual modo, tras 1 semana en oscuridad, las plántulas 35S:A9 mostraron mayor valor de Fv/Fm que las plántulas NT (Fv/Fm = 0,601 ± 0,017 y 0,326 ± 0,022, respectivamente). Esta diferencia es estadísticamente significativa (t=-7,54; P=0,0001). Comparando estos valores con los obtenidos antes del tratamiento, observamos que tras una semana en la oscuridad el valor de Fv/Fm se redujo al 77,27 % en las plántulas 35S:A9, mientras que en las plántulas NT se redujo al 47,91 % del valor de Fv/Fm inicial. A las 3 semanas de tratamiento, la diferencia de Fv/Fm entre las plántulas 35S:A9 y NT se redujo, observándose una reducción al 30,26 % y 24,60 % del valor inicial, respectivamente (Fv/Fm = 0,235 ± 0,012 y 0,168 ± 0,013, en las plántulas 35S:A9 y NT, respectivamente). Esta diferencia se anuló completamente tras 5 semanas de tratamiento en la oscuridad (Figura r11B). Además, después de 7 días de recuperación tras 3 semanas de tratamiento en la oscuridad, sólo las plántulas 35S:A9 sobrevivieron, mientras que las plántulas Resultados 107 Figura r11. Retardo de la senescencia vegetativa inducida por la oscuridad continua en las plántulas 35S:A9. Comparación de la aparición de la senescencia entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A9 (A9) y sus hermanas no transgénicas (NT), tras tratamientos de inducción de la senescencia por falta de nutrientes en la oscuridad. (A) Reducción de pigmentos fotosintéticos en las plántulas durante el tratamiento de senescencia en la oscuridad. Valores correspondientes al porcentaje de pigmentos medidos tras 1, 3 o 5 semanas de tratamiento, en relación a la cantidad de pigmento inicial. (B) Rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm). Valores tomados antes del tratamiento, o tras 1, 3 o 5 semanas de tratamiento en la oscuridad. (C) Fotografía representativa tomada a los de 7 días de recuperación tras 3 semanas de tratamiento en la oscuridad. Datos correspondientes a 5 experimentos independientes y 1-2 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas: P=0,01 (*) y P=0,0001 (**). Resultados 108 Figura r12. Retardo de la senescencia vegetativa inducida por falta de nutrientes en las plántulas 35S:A9 bajo condiciones de cultivo con fotoperiodo. Comparación de la aparición de la senescencia entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A9 (A9) y sus correspondientes hermanas no transgénicas (NT), tras tratamientos de inducción de la senescencia por falta de nutrientes bajo fotoperiodo. (A) Fotografía representativa tomada inmediatamente tras el tratamiento de inducción de la senescencia. (B) Porcentaje de supervivencia de las plántulas tras el tratamiento. (C) Porcentaje de pigmentos fotosintéticos en las plántulas tras el tratamiento de inducción de la senescencia. Datos correspondientes a 2 experimentos independientes y 2-3 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A9 (A91, A92 y A93) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Porcentajes calculados en relación a los valores iniciales de pigmentos. Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas: P=0,01 (*) y P=0,0001 (**). Resultados 109 NT se despigmentaron y murieron en su totalidad (Figura r11C). Estos resultados indican un retardo en el proceso de senescencia vegetativa en las plántulas 35S:A9. Para comprobar este retardo en la senescencia, realizamos ensayos de inducción de senescencia por falta de nutrientes bajo fotoperiodo (ver por ejemplo, Thomas & de Villiers, 1996). Las plántulas 35S:A9 y NT, se transfirieron sobre papel humedecido con H2O desionizada, y se cultivaron durante 6 días a una intensidad lumínica de 300 µmol m-2 s-1 en ciclo de luz 16h día/8h noche (Figura r12). Durante el tratamiento, observamos la despigmentación progresiva de las plántulas. Al final del tratamiento, el 93,41 ± 2,06 % de las plántulas 35S:A9 sobrevivieron, frente al 61,54 ± 5,51 % de supervivencia observado en las plántulas NT (Figura r12A y B). Esta diferencia es estadísticamente significativa (F=29,36; P=0,0001). Además, las plántulas 35S:A9 conservaron mejor los pigmentos fotosintéticos que las plántulas NT, tras el tratamiento (Figura r12C). Así, las plántulas 35S:A9 mantuvieron el 40,38 ± 3,74 % de la clorofila inicial, mientras que las plántulas NT mantuvieron el 26,83 ± 3,36 %. Esta diferencia es estadísticamente significativa (F=7,71; P=0,0105), y se debe al aumento en la conservación tanto de la clorofila a, como de clorofila b. Las plántulas 35S:A9 también conservaron mayor cantidad de carotenos tras el tratamiento de inducción de senescencia por falta de nutrientes. Las plántulas 35S:A9, conservaron el 73,29 ± 4,53 % de los carotenoides iniciales, mientras que las plántulas NT sólo conservaron el 47,87 ± 4,65 %. Esta diferencia es estadísticamente significativa (F=15,33; P=0,00065). Estos resultados indican que el programa genético activado por el factor HaHSFA9 en plántulas de tabaco retarda el proceso de senescencia de la hoja. Resultados 116 Figura r16. La sobreexpresión ectópica de HaHSFA4a no confiere tolerancia frente a estrés oxidativo severo a las plántulas 35S:A4a. Comparación entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A4a (A4a) y sus correspondientes hermanas no transgénicas (NT), tras un tratamiento con 200 mM H2O2 (H2O2) o H2O (C), durante 24 h en oscuridad. (A) Efectos sobre el rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm), inmediatamente tras el tratamiento. (B) Porcentaje de supervivencia de plántulas completas (Plántulas) o de plántulas con al menos una hoja viva (Hojas). Resultados cuantificados después de 7 días de recuperación tras el tratamiento con 200 mM H2O2. (C) Fotografía representativa de la supervivencia tras el tratamiento con 200 mM H2O2, correspondiente a una línea 35S:A4 (A4a3) y su línea hermana no transgénica (NT3). Las fotografías se tomaron después de 7 días de recuperación tras el tratamiento. Datos correspondientes a 3 experimentos independientes y 2 repeticiones por experimento, con 3 líneas homocigóticas independientes 35S:A4a (A4a1, A4a2 y A4a3) y sus correspondientes líneas hermanas no transgénicas (NT1, NT2 y NT3). Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. Resultados 117 homocigosis el factor HaHSFA4a bajo el promotor constitutivo CaMV 35S, conjuntamente a la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 (líneas 35S:A9/A4a). Obtuvimos transformantes independientes con una única integración del transgén 35S:HaHSFA4a. Se seleccionaron las 4 líneas dobles transgénicas que mejor expresaban el transgén 35S:HaHSFA4a, en función de la acumulación del tag HA, fusionado a HaHSFA4a, detectado por western blot en electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE. Las 4 líneas 35S:A9/A4a seleccionadas, presentaban diferentes eventos de integración simple del transgén 35S:HaHSFA4a en homocigosis, integrados en 3 fondos genéticos 35S:A9 diferentes (líneas A91/A4a1, A91/A4a2, A92/A4a y A93/A4a). Sus correspondientes líneas hermanas transgénicas simples para HaHSFA9 se obtuvieron por segregación (líneas A91, A92 y A93, respectivamente). Las plántulas de 3-4 semanas de estas líneas, se utilizaron para analizar los efectos de la sobreexpresión conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a sobre la acumulación de las proteínas HSP codificadas por genes activados por HaHSFA9, así como la posible mejora de los fenotipos descritos previamente para las plántulas 35S:A9. Para ello, seguimos los procedimientos descritos previamente para el análisis de dichas líneas 35S:A9. 2.1. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 aumenta la acumulación de determinadas isoformas HSP a temperaturas normales de crecimiento en las plántulas 35S:A9/A4a. En primer lugar, caracterizamos el efecto sobre la acumulación de proteínas HSP, al sobreexpresar conjuntamente HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas de tabaco. Para ello, comparamos por western blot en electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE la acumulación de HSP, entre las plántulas 35S:A9/A4a (A9/A4a) y 35S:A9 (A9), en condiciones normales de crecimiento, usando anticuerpos específicos frente al tag HA, y las proteínas HSP101, sHSP-CI, sHSP-CII y sHSP-P (Figura r17). No observamos diferencias de acumulación de ninguna de las proteínas HSP analizadas, entre las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9. Sin embargo, la detección con el anticuerpo frente al tag HA mostró la expresión del transgén 35S:HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a. Los niveles de acumulación del tag HA en las plántulas 35S:A9/A4a fueron del mismo orden de magnitud que los observados en las plántulas 35S:A4a, indicándonos que la expresión del transgén 35S:HaHSFA4a fue similar en las plántulas transgénicas 35S:A4a y en las plántulas dobles transgénicas 35S:A9/A4a (Figura r18). Estos resultados nos indican que la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 no induce cambios sustanciales en la Resultados 118 acumulación de proteínas HSP en las plántulas 35S:A9/A4a, en comparación con las plántulas 35S:A9. Figura r17. Efecto de la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a sobre la acumulación de proteínas HSP bajo condiciones normales de crecimiento. Detección de la acumulación de proteínas HSP, mediante western blot tras electroforesis desnaturalizante SDSPAGE, en plántulas de 3-4 semanas dobles transgénicas 35S:A9/A4a y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9. Se usaron anticuerpos específicos frente a las proteínas: HA, tag de hemaglutinina unido a HaHSFA4a; HSP-101; sHSP-P; sHSP-CI, y sHSP-CII. Se muestran resultados representativos de 2 líneas dobles transgénicas homocigóticas independientes 35S:A9/A4a (A91/A4a1 y A93/A4a) y sus correspondientes hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A91 y A93). A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). A la derecha se indica el anticuerpo específico usado para la detección de cada proteína. Figura r18. Acumulación del factor de transcripción HaHSFA4a en las plántulas transgénicas 35S:A4a y dobles transgénicas 35S:A9/A4a. Comparación mediante western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PGE de la acumulación de la proteína HaHSFA4a en las plántulas de 3-4 semanas 35S:A4a y 35S:A9/A4a, detectada con el anticuerpo específico frente al tag HA (hemaglutinina) unido a HaHSFA4a. Se muestran resultados representativos correspondientes a 2 líneas dobles transgénicas homocigóticas independientes 35S:A9/A4a (A91/A4a1 y A93/A4a) y sus líneas hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A91 y A93), y 2 líneas transgénicas homocigóticas independientes 35S:A4a (A4a2 y A4a4) y sus hermanas no transgénicas (NT2 y NT4) A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). Resultados 119 Aunque la acumulación de cada uno de los tipos de HSP analizados no se vio alterada en los western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE mono-dimensional, realizamos un estudio más exhaustivo para las proteínas sHSP-CI, sHSP-CII y sHSP-P mediante western blot tras electroforesis bi-dimensional (2D-PAGE) (Figura r19). Así, pudimos observar pequeños aumentos en la acumulación de determinados polipéptidos de sHSP-CI y sHSP-CII en las plántulas 35S:A9/A4a, con respecto a las plántulas 35S:A9. Se observaron ligeros aumentos de acumulación del polipéptido sHSP-CI de mayor peso molecular aparente (≈19KDa), así como del polipéptido de peso molecular más bajo (≈15KDa) (Figura r19A, asteriscos). Además, observamos ligeros aumentos en la acumulación del polipéptido de pI más ácido perteneciente a las sHSP-CII, así como del polipéptido de peso molecular más alto correspondiente al grupo de polipéptidos de pI menos ácido (Figura r19B, asteriscos). Por el contrario, no se encontraron diferencias de acumulación en los polipéptidos correspondientes a sHSP-P, entre las líneas 35S:A9/A4a y 35S:A9 (Figura r19C). Estos resultados demuestran que la sobreexpresión ectópica conjunta de los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a incrementa ligeramente la acumulación de algunas isoformas de las proteínas sHSP-CI y sHSP-CII, en comparación a lo observado para la sobreexpresión única del factor HaHSFA9. El polipéptido sHSP-CI de peso molecular próximo a 15KDa, acumulado a mayor nivel en las plántulas 35S:A9/A4a, está caracterizado como específico de semillas (Prieto-Dapena et al., 2006). Además, este polipéptido no se acumuló en las raíces de las plántulas que sobreexpresan ectópicamente el factor HaHSFA9 (ver Figura r1). Esto nos llevó a estudiar si la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas modificaba el patrón de acumulación de sHSP-CI en las raíces. De este modo, comparamos la acumulación de las proteínas sHSP-CI en la parte aérea y las raíces de las plántulas 35S:A9/A4a y sus hermanas 35S:A9, mediante western blot en electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (Figura r20). No se observaron diferencias en el patrón de acumulación de sHSP-CI entre las raíces de las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9. La banda correspondiente a las sHSP-CI de aproximadamente 15KDa se detectó en las muestras correspondientes a la parte aérea, sin embargo, no se detectó acumulación de esta proteína en raíces, tanto en las plántulas 35S:A9 como en las plántulas 35S:A9/A4a. Estos resultados nos indican que la sobreexpresión conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas de tabaco no incrementa la acumulación en raíces del polipéptido sHSP-CI de peso molecular próximo a 15KDa caracterizado como específico de semillas. Resultados 120 Figura r19. Acumulación de polipéptidos sHSP en las plántulas 35S:A9/A4a. Comparación de la acumulación de proteínas sHSP mediante western blot tras electroforesis 2D-PAGE entre plántulas de 3-4 semanas dobles transgénicas 35S:A9/A4a (A9/A4a), y sus correspondientes hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A9). (A) Acumulación de sHSP-CI. (B) Acumulación de sHSP-CII. (C) Acumulación de sHSP-P. Se muestran resultados representativos obtenidos con, al menos, 2 líneas independientes 35S:A9/A4a y sus correspondientes líneas hermanas 35S:A9. Los asteriscos (*) indican los polipéptidos inducidos diferencialmente entre las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9. A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). En la parte inferior, se indica el rango de pH (pH 5,0-7,0). Resultados 121 Figura r20. Acumulación de sHSP-CI en la parte aérea y las raíces de las plántulas 35S:A9/A4a. Detección mediante western blot tras electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE de la acumulación de proteínas de choque térmico sHSP-CI en la parte aérea (P. aérea) y las raíces (Raíz) de las plántulas dobles transgénicas 35S:A9/A4a y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9. Se muestran datos representativos correspondientes a dos líneas dobles transgénicas 35S:A9/A4a (A91/A4a1 y A93/A4a) y sus líneas hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A91 y A93). A la izquierda, se indican los marcadores de peso molecular (KDa). 2.2. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la estabilidad de las membranas celulares en las plántulas 35S:A9/A4a. Las plántulas que sobreexpresan ectópicamente el factor HaHSFA9 mostraron una mejora de la estabilidad de las membranas celulares (ver Figura r5). La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a podría conllevar una mejora de la estabilidad de las membranas celulares, con respecto a la observada en las plántulas 35S:A9. Esto nos llevó a estudiar la pérdida de electrolitos en plántulas de 4 líneas 35S:A9/A4a y sus correspondientes líneas hermanas transgénicas simples 35S:A9 (Figura r21). Tras 1 h de tratamiento, las plántulas 35S:A9/A4a mostraron menor pérdida de electrolitos que las plántulas 35S:A9 (32,23 ± 1,08 % y 35,56 ± 1,33 %, respectivamente). Esta diferencia se mantuvo constante durante todo el tratamiento. Así, al final del tratamiento, las plántulas 35S:A9/A4a mostraron una pérdida de electrolitos del 50,42 ± 0,47 %, mientras que en las plántulas 35S:A9 la pérdida fue del 52,85 ± 0,56 %. Esta diferencia en la pérdida de electrolitos es estadísticamente significativa (F=11,10; P=0,002) y muestra una mejora en la estabilidad de las membranas celulares en las plántulas 35S:A9/A4a, en comparación con la observada en las plántulas 35S:A9. Resultados 122 Figura r21. Menor pérdida de electrolitos en las plántulas 35S:A9/A4a. Comparación de la pérdida de electrolitos entre las plántulas de 3-4 semanas transgénicas dobles 35S:A9/A4a (A9/A4a) y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A9), en condiciones normales de crecimiento. Se representan los porcentajes promedio de pérdida de electrolitos en agua desionizada (MiliQ) a diferentes tiempos entre 1 y 24h: 1 h (n=17); 4 h (n=17); 8 h (n=17) y 24 h (n=17). Datos correspondientes a 2 experimentos independientes y 2-3 repeticiones por experimento, con 4 dobles transgénicas independientes 35S:A9/A4a (A91/A4a1, A91/A4a2, A92/A4a y A93/A4a) y sus correspondientes hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A91, A92, A93). 2.3. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 en las plántulas 35S:A9/A4a no tiene efectos adicionales sobre la maquinaria fotosintética en condiciones normales de cultivo. Las plántulas que sobreexpresan ectópicamente el factor HaHSFA9 mostraron distintos efectos positivos sobre la maquinaria fotosintética bajo condiciones normales de cultivo (ver Figura r6). Esto nos llevó a estudiar el posible efecto de la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a sobre la maquinaria fotosintética bajo dichas condiciones (Figura r22). En primer lugar, cuantificamos la acumulación de pigmentos fotosintéticos en las plántulas dobles transgénicas 35S:A9/A4a y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9, bajo condiciones normales de crecimiento (Figura r22A). No se observaron diferencias en la acumulación de los pigmentos fotosintéticos entre las plántulas 35S:A9/A4a y sus hermanas 35S:A9. Así, las Resultados 123 Figura r22. La sobreexpresión conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a no afecta adicionalmente a la maquinaria fotosintética en condiciones normales de cultivo. Comparación entre las plántulas de 3-4 semanas dobles transgénicas 35S:A9/A4a (A9/A4a) y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A9) bajo condiciones normales de cultivo. (A) Cuantificación del contenido en pigmentos fotosintéticos: clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), clorofila total (Chl total) y carotenos (Car). Se representa el contenido en pigmentos fotosintéticos (µg) en relación al peso fresco (g). (B) Rendimiento cuántico máximo del PSII (Fv/Fm). Datos correspondientes a 2-3 experimentos, con 4 líneas homocigóticas independientes 35S:A9/A4a (A91/A4a1, A91/A4a2, A92/A4a y A93/A4a) y sus líneas hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A91, A92, A93). Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. plántulas mostraron una acumulación similar de clorofila total (870,71 ± 29,25 y 931,27 ± 17,63 µg Chl/g P. fresco en 35S:A9/A4a y 35S:A9, respectivamente; F=3,15; P=0,08). Tampoco se observaron diferencias en la acumulación de carotenos entre las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9 (132,99 ± 5,26 y 149,11 ± 9,15µg car/g P. fresco en 35S:A9/A4a y 35S:A9, respectivamente; F=2,33; P=0,14). Además, analizamos la integridad del PSII de las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9 mediante la medida de Fv/Fm en condiciones normales de crecimiento (Figura r22B). Tampoco se observaron diferencias en los valores de Fv/Fm entre las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9 (Fv/Fm=0,801 ± 0,004 y 0,808 ± 0,003, respectivamente; F=2,01; P=0,163). Estos resultados nos indican que la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 en las plántulas 35S:A9/A4a no afecta a la maquinaria fotosintética bajo condiciones normales de cultivo, más allá de lo observado con la sobreexpresión individual de HaHSFA9. Resultados 124 2.4. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la tolerancia frente a deshidratación severa en las plántulas 35S:A9/A4a. La sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 en las plántulas 35S:A9 confirió tolerancia a tratamientos de deshidratación severa (Prieto-Dapena et al., 2008). A continuación, estudiamos el efecto de la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a sobre la tolerancia a deshidratación severa. Para poder estudiar esta posible mejora, tuvimos que forzar las condiciones de deshidratación hasta niveles en los que murieran la mayor parte de las plántulas 35S:A9. Para ello, sometimos a las plántulas dobles transgénicas 35S:A9/A4a, así como a sus hermanas transgénicas simples 35S:A9, a tratamientos de deshidratación severa DT2 (Prieto-Dapena et al., 2008) en los que obtuvimos pérdidas superiores al 97 % del contenido inicial de agua de la plántula (correspondientes a potenciales hídricos inferiores a ɸ ≤ -30 MPa). Inmediatamente tras los tratamientos, las plántulas se rehidrataron durante un periodo de recuperación de 7 días (Figura r23). Observamos que el 82,53 ± 1,84 % de las plántulas 35S:A9/A4a conservaron al menos una hoja viva, en comparación con el 68,15 ± 2,34 % observado en las plántulas 35S:A9. Este aumento de la supervivencia de la parte aérea en las plántulas 35S:A9/A4a con respecto a las 35S:A9 es estadísticamente significativo (t=-4,8245; P=0,0001). Además, el 12,47 ± 1,13 % de las plántulas 35S:A9/A4a sobrevivieron a los tratamientos de deshidratación severa, frente al 5,49 ± 1,05 % de supervivencia de las plántulas 35S:A9. Esta diferencia también es estadísticamente significativa (t=-3,5908; P=0,00039), y supuso un aumento de 2 veces la supervivencia de la plántula completa en las líneas 35S:A9/A4a, con respecto sus líneas hermanas 35S:A9. Estos resultados demuestran que la sobreexpresión conjunta de los factores HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas de tabaco mejora el fenotipo de tolerancia a deshidratación severa previamente descrito para la sobreexpresión de HaHSFA9 (Prieto-Dapena et al., 2008). 2.5. La sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA4a y HaHSFA9 mejora la tolerancia a estrés oxidativo severo en las plántulas 35S:A9/A4a. Las plántulas que sobreexpresan ectópicamente el factor HaHSFA9 mostraron tolerancia a tratamientos de estrés oxidativo severo (ver Figura r9). A continuación, estudiamos el efecto de la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a sobre la tolerancia dicho estrés. Para ello, sometimos a las plántulas 35S:A9/A4a, así como a sus respectivas hermanas 35S:A9, a tratamientos con altas concentraciones de H2O2 (200 o 300 mM Resultados 125 Figura r23. La sobreexpresión conjunta HaHSFA9 y HaHSFA4a en las plántulas 35S:A9/A4a mejora la tolerancia frente a deshidratación severa observada en las plántulas 35S:A9. Comparación de la supervivencia frente a tratamientos de deshidratación DT2 entre plántulas de 3-4 semanas dobles transgénicas 35S:A9/A4a (A9/A4a) y sus hermanas transgénicas simples 35S:A9 (A9). Datos correspondientes a 13 experimentos independientes y 3-4 repeticiones por experimento, con 4 líneas 35S:A9/A4a (A91/A4a1, A91/A4a2, A92/A4a y A93/A4a) y sus correspondientes líneas hermanas 35S:A9 (A91, A92, A93). (A) Porcentaje de supervivencia de plántulas completas (Supervivencia Plántulas) o de plántulas con al menos una hoja viva (Supervivencia Hojas). Resultados cuantificados después de 7 días de recuperación tras los tratamientos de deshidratación. Entre paréntesis se indica el número de medidas correspondiente a cada valor promedio. (B) Fotografía representativa de la supervivencia tras los tratamientos DT2, correspondiente a una línea doble transgénica 35S:A9/A4a (A93/A4a) y su correspondiente línea hermana transgénica simple (A93). Las fotografías se tomaron después de 7 días de recuperación tras el tratamiento. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas P<0,001. H2O2) durante 24 horas en oscuridad. Tras el tratamiento, se eliminó completamente el H2O2, y se dejaron recuperar las plántulas durante un periodo de 7 días. Analizamos la integridad del PSII mediante la medida de Fv/Fm inmediatamente tras el tratamiento, así como la supervivencia de las plántulas después de 7 días de recuperación tras el tratamiento (Figura r24). Los tratamientos con 200 mM H2O2 redujeron por igual el valor de Fv/Fm en las plántulas 35S:A9/A4a y 35S:A9 (Fv/Fm=0,477 ± 0,012 y 0,487 ± 0,010, respectivamente; F=0,236; P=0,6278). Además, prácticamente el 100 % de las plántulas sobrevivieron a los tratamientos con 200 mM H2O2. Tras tratamientos con 300 mM H2O2, las plántulas 35S:A9/A4a mostraron mayor Fv/Fm que sus hermanas 35S:A9 (Fv/Fm=0,455 ± 0,008 y 0,403 ± 0,008, respectivamente). Si comparamos estos resultados con los valores obtenidos en los tratamientos control, observamos que, tras los Resultados 132 ontología genética usando como referencia la base de datos online para Arabidopsis TAIR (The Arabidopsis Information Resource). Establecimos dos clasificaciones, basándonos en la localización celular o en el proceso biológico en el que participan los productos génicos (Figura r26, la clasificación detallada se muestra en el Anexo I). Atendiendo al componente celular, un 34,8 % de los genes se identificaron como productos génicos localizados en los cloroplastos, y un 16,9 % como productos génicos con localización nuclear (Figura r26A). En función del proceso biológico en el que participan, un 16,9 % de los genes se caracterizaron como genes implicados en el transporte de electrones o rutas energéticas, un 15,7 % se clasificaron como genes relacionados con respuesta a estímulos abióticos o bióticos, y un 10,1 % se correspondían con genes implicados en el metabolismo de proteínas (Figura r26B). Cabe destacar que, todos los genes clasificados como genes implicados en el transporte de electrones y rutas energéticas compartían localización plastidial, entre los que se encuentraban mayoritariamente componentes del PSI y el PSII, así como subunidades de la ATP sintasa y el citocromo b6f. Además, los componentes relacionados con la respuesta a estrés se localizaban principalmente en el cloroplasto y las membranas celulares. Estos resultados son consistentes con la mejora de la estabilidad de las membranas celulares, así como con la mejora de la maquinaria fotosintética observada en condiciones normales de cultivo en las plántulas 35S:A9. 3. Comprobación de la inducción de los genes candidatos en las plántulas 35S:A9. Atendiendo a los resultados anteriores, comprobamos por RT-qPCR la inducción de 30 de los genes clonados y caracterizados a partir de la genoteca de sustracción, centrando nuestra atención principalmente en los genes relacionados con la fotosíntesis, que podrían ayudar a comprender mejor los fenotipos descritos previamente para las plántulas 35S:A9 (Tabla r1). Además, añadimos como control el gen psbA, correspondiente a la proteína D1 del PSII, la cual se acumula a mayores niveles en las plántulas 35S:A9 bajo condiciones normales de cultivo (ver Figura 6C). Para cada uno de los 30 genes seleccionados, diseñamos la pareja correspondiente de oligonucleótidos específicos. Los resultados de la RT-qPCR se normalizaron usando 3 genes como referencia interna: el factor de elongación EF-1a, la proteína ribosomal L25 y la enzima de conjugación de la ubiquitina E2 (Ntubc2). Para cada uno de los 3 controles internos se usó la correspondiente pareja de oligonucleótidos específicos descrita previamente por Schmidt & Delaney (2010). Se comprobó la especificidad de los oligonucleótidos mediante una curva de Resultados 133 Tabla r1. Genes analizados por RT-qPCR. Selección de los genes aislados por SSH para el análisis de la inducción en las plántulas 35S:A9 mediante RT-qPCR. Se resaltan los genes con inducción superior a 1,5 (sombreado rojo) y 2,0 veces (sombreado azul), en las plántulas 35S:A9. Genes F. inducción Descripción ** CP47 (PsbB) 1,4 ± 0,2 Proteína de unión a clorofilas (CP), componente del RC del PSII. Implicado en el ensamblaje del PSII. PsbI 0,8 ± 0,1 Subunidad del PSII codificada por el genoma plastidial. Implicada en la biogénesis del PSII. PsbH 1,3 ± 0,2 Subunidad del PSII codificada por el genoma plastidial. Posiblemente implicado en la reparación del PSII tras la fotoinhibición. PsbO1 1,4 ± 0,1 Subunidad extrínseca del PSII, componente estructural del complejo OEC. PsbP 1,8 ± 0,2 Subunidad extrínseca del PSII, componente estructural del complejo OEC. Necesaria para el ensamblaje y estabilización del PSII. PsbR 14,3 ± 2,2 Subunidad extrínseca del PSII, componente estructural del complejo OEC. Necesaria para el ensamblaje del PSII. PsbX 1,3 ± 0,2 Subunidad de bajo peso molecular del PSII. Importante para la acumulación de PSII funcional. CP29 1,6 ± 0,2 Proteína de unión a clorofila a/b. Componente minoritario del LHCII. PetM 1,5 ± 0,2 Subunidad del citocromo b6f. Implicada en la transferencia de electrones desde el PSII al PSI. Ycf3 1,1 ± 0,1 Proteína implicada en el ensamblaje del PSI. PsaG 2,4 ± 0,4 Componente del RC del PSI. Permite el anclaje del complejo LHCI al PSI. PsaH 2,1 ± 0,4 Componente del RC del PSI. Implicado en la interacción del PSI con el complejo LHCII. PsaN 2,2 ± 0,4 Componente del RC del PSI. Posiblemente implicada en la unión de la plastocianina al PSI. PsaO 2,0 ± 0,2 Componente del RC del PSI. Implicado en la interacción del PSI con el complejo LHCII. AtpB 1,3 ± 0,2 Subunidad CF1-β de la ATP sintasa cloroplástica. AtpD 1,4 ± 0,2 Subunidad δ de la ATP sintasa cloroplástica. Codificada por el genoma plastidial. AtpE 1,3 ± 0,2 Subunidad CF1-ε de la ATP sintasa cloroplástica. Codificada por el genoma plastidial. AtpG 1,5 ± 0,2 Subunidad CF0-II de la ATP sintasa cloroplástica. sHSP-P 338 ± 57 Proteína de choque térmico sHSP de localización plastidial. POR-1 6,2 ± 1,7 NADPH-protoclorofilida oxidoreductasa 1. Enzima implicada en la ruta de biosíntesis de la clorofila. Tiamina Sintetasa 1,7 ± 0,3 Enzima implicada en la síntesis de tiamina o vitamina B1. Se ha sugerido que el metabolismo de la tiamina esté implicado en la protección contra diversos estreses. Tiorredoxina m 1,2 ± 0,1 Tiorredoxina cloroplástica con actividad dependiente de la luz. Reduce puentes disulfuros de proteínas dianas. Se ha sugerido su función chaperona frente a estrés oxidativo. PEPC 1,2 ± 0,1 Fosfo-enol-piruvato carboxilasa. Enzima implicada en la fijación de CO2. Ribulosa-fostato Epimerasa 1,3 ± 0,2 Enzima implicada en el ciclo de Calvin. Rubredoxina (similar) 1,2 ± 0,2 Proteína similar a la rubredoxina. Se ha sugerido que las rubredoxinas específicas de los tilacoides son necesarias para la actividad normal del PSII. bHLH61 2,1 ± 0,1 Factor de transcripción perteneciente a la familia de factores MYC R, esenciales para la diferenciación y el desarrollo de la planta. LRR quinasa 1,2 ± 0,2 Proteína quinasa de los receptores LRR. Posiblemente implicada en la ruta de transducción de señal de respuesta frente a estrés osmótico en plantas. SAP1/SAP5 (similar) 1,1 ± 0,1 Proteína similar a las proteínas asociadas a estrés SAP1 y SAP5. Las proteínas SAP confieren tolerancia a estrés en plantas. MYB1 1,3 ± 0,1 Factor de transcripción MYB. Regula el metabolismo de la lignina. Posiblemente relacionado con la respuesta a estrés abiótico. NDPK II 1,2 ± 0,2 Nucleosido difosfato quinasa. En plantas, implicadas en la embriogénesis y desarrollo de la semilla, así como en la respuesta a luz azul y alta fuerza iónica. ** Para más detalles, ver Anexo I. Resultados 134 disociación (60-95 oC), observándose para cada pareja de oligonucleótidos un único amplicón con una única curva de disociación. La inducción de cada gen se comprobó mediante RT-qPCR, analizando 3 réplicas biológicas, con 2-3 repeticiones técnicas por réplica biológica, correspondientes a los ADNc de plántulas de una línea 35S:A9 (A91) y su correspondiente línea hermana NT (NT1). Posteriormente, los valores correspondientes a la expresión de cada gen se normalizaron en función de cada uno de los 3 genes de referencia interna. Calculamos el factor de inducción de cada gen en las muestras 35S:A9 como la relación entre la abundancia del ADNc correspondiente en las muestras 35S:A9 y NT (Figura r27; valores de inducción en Tabla r1). Considerando como umbral un factor de inducción igual o superior a 1,5 (es decir, una inducción del gen de al menos 1,5 veces en las muestras 35S:A9 con respecto a las NT), 13 de los 30 genes analizados mostraron inducción en las plántulas 35S:A9 (Figura r27, línea roja). En 8 de estos 13 genes, la inducción fue mayor a 2 veces (Figura r27, línea azul). Entre estos genes inducidos en las plántulas 35S:A9 se encontraron componentes de los cuatro complejos proteicos encargados de catalizar la transferencia de electrones y la transducción de energía fotosintética (PSII, citocromo b6f, PSI y ATP sintasa). Así, encontramos inducidos genes codificantes de componentes de los fotosistemas, como las subunidades del PSI: PsaG, PsaH, PsaN y PsaO, las subunidades del PSII: PsbP y PsbR, la proteína LHC del PSII: CP29, la subunidad PetM del citocromo b6f y la subunidad CF0-II de la ATP sintasa cloroplástica. La inducción observada a nivel de ARNm de la proteína PsbP, componente del complejo OEC del PSII, es consistente con el aumento observado a nivel de proteínas mediante western blot en las plántulas 35S:A9 (ver Figura r6). Sin embargo, no se observó inducción a nivel ARNm del gen codificante de la proteína D1 (PsbA, factor de inducción = 1,1 ± 0,2). Por otro lado, confirmamos la inducción a nivel de ARNm en las plántulas 35S:A9 del gen shsp-P, estudiado anteriormente a nivel de acumulación de proteína (ver Figura r2). Además, encontramos inducción del factor de transcripción bHLH61. Los bHLH constituyen una amplia familia de factores de transcripción esenciales para la diferenciación y desarrollo de la planta (ver por ejemplo Li et al., 2006, Carretero-Paulet et al., 2010). También observamos la inducción en las plántulas 35S:A9 de las enzimas tiamina sintetasa y POR-1. Ambas enzimas están localizadas en los cloroplastos. La NADH:protochlorophyllide oxidoreductase (POR-1) es una enzima esencial para la biosíntesis de clorofila dependiente de luz (Buhr et al., 2008). Estos resultados confirman que la sobreexpresión ectópica del programa genético activado por el factor HaHSFA9 en plántulas de tabaco induce la expresión de genes distintos a los hsp, Resultados 135 entre los que se encuentran componentes de los fotosistemas, así como genes implicados en el desarrollo de la maquinaria fotosintética. La inducción de estos genes podría contribuir a los fenotipos de tolerancia frente a estreses abióticos extremos observados en plántulas 35S:A9. Figura r27. Aumento de la acumulación de ARNm en las plántulas 35S:A9. Comparación mediante RT-qPCR de los niveles de inducción de genes aislados a partir de la genoteca de sustracción SSH, entre las plántulas de 3-4 semanas 35S:A9 y sus hermanas NT. Se representa el factor de inducción en las líneas 35S:A9, calculado como el cociente entre la acumulación de ARNm de cada gen en las plántulas 35S:A9 y NT. Estudios realizados a partir de los ARNm de plántulas de una línea homocigótica 35S:A9 (A91) y su correspondiente línea hermana no transgénica (NT1). Datos correspondientes a los valores promedio obtenidos con 3 réplicas biológicas por línea y 2-3 repeticiones técnicas por cada réplica biológica, en función de 3 genes de referencia interna. Las líneas roja y azul indican los umbrales de inducción por encima de 1,5 y 2,0 veces, respectivamente. Resultados 136 Discusión Introducción 139 En trabajos previos de nuestro laboratorio se caracterizó un programa genético activado en semillas por factores HSF, en el que juega un papel importante el factor HaHSFA9, y que incluye la expresión de genes hsp. Este programa genético, al que denominamos “programa activado por HSFA9”, está conservado en semillas de plantas como girasol (Almoguera et al., 2002; Prieto- Dapena et al., 2006) y Arabidopsis (Kotak et al., 2007). Antes de nuestro trabajo se describieron indicios de que otros factores HSF de clase A pudieran participar junto a HaHSFA9 en la activación de dicho programa genético en semillas de girasol (Tejedor-Cano et al., 2010; Carranco et al., 2010). Aunque el número de estos HSF adicionales se desconoce actualmente, otros resultados de nuestro laboratorio indicaron que el factor HaHSFA4a podría ser uno de dichos HSF (Tejedor-Cano et al., 2014). El programa genético activado por HSFA9 opera sólo durante el desarrollo de la semilla, antes de las últimas etapas de la embriogénesis cigótica. Sin embargo, la activación ectópica de este programa en tejidos vegetativos, mediante la sobreexpresión de HaHSFA9 en plántulas transgénicas de tabaco, confirió fenotipos de tolerancia a deshidratación severa (Prieto-Dapena et al., 2008). Con nuestro trabajo, hemos extendido nuestro conocimiento sobre el programa genético activado por HSFA9. Hemos demostrado que la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 en plántulas de tabaco mejora la estabilidad de las membranas celulares (ver Figura r5), confiere tolerancia a estreses abióticos extremos mediante la protección del aparato fotosintético (ver Figuras r7 y r9), y retarda el proceso natural de senescencia de la hoja (ver Figuras r11 y r12). Además, hemos confirmado al factor HaHSFA4a como uno de los posibles HSF de clase A que, junto a HaHSFA9, co-activan el programa genético implicado en la tolerancia frente a estreses abióticos extremos. Así, hemos demostrado que la sobreexpresión ectópica conjunta de HaHSFA9 y HaHSFA4a en plántulas transgénicas de tabaco mejora los fenotipos previamente descritos para la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 (ver por ejemplo Figura r23 y r24). Estos fenotipos se correlacionan con la acumulación de proteínas HSP, como las sHSP-P, especialmente analizadas en nuestro estudio. Asimismo, en este trabajo, hemos identificado otros genes, distintos a los genes hsp, cuya expresión se induce al sobreexpresar ectópicamente HaHSFA9 en plántulas de tabaco (ver Figura r27). La inclusión tentativa de estos genes como parte del programa genético activado por HaHSFA9 nos permite comprender mejor la gran complejidad de efectos fenotípicos derivados de la sobreexpresión ectópica de dicho programa Discusión 140 en tejido vegetativo. Nuestro trabajo ha permitido adicionalmente encontrar y entender nuevos fenotipos (como el retardo de la senescencia vegetativa), y predecir que la sobreexpresión ectópica de HaHSFA9 causaría un efecto fotomorfogénico. El programa genético activado por HSFA9 es específico de semillas, por lo que nuestros resultados (obtenidos mediante sobreexpresión ectópica en plántulas) permiten inferir por analogía que dicho programa genético contribuye a la protección del aparato fotosintético embrionario durante la embriogénesis cigótica (dentro de las semillas). Esta propuesta se basa en la protección observada en las plántulas 35S:A9 bajo las condiciones de deshidratación (y estrés oxidativo) severas usadas en nuestro estudio, las cuales son similares a las que ocurren durante el proceso de desecación embrionaria. Nuestros resultados sugieren que el programa genético activado por HSFA9 en semillas participa en la protección de las membranas celulares, así como de los plástidos no fotosintéticos y otros plástidos, especialmente los proplástidos que se transforman en cloroplastos (plástidos fotosintéticos) tras sobrevivir a la desecación embrionaria en la semilla (Jarvis & López-Juez, 2013). Dicha protección podría contribuir a mantener funciones esenciales para la supervivencia, tanto durante la embriogénesis como en las primeras etapas de la germinación, como la síntesis de aminoácidos, ácidos grasos, lípidos polares y carbohidratos, especialmente en los plástidos El efecto protector del aparato fotosintético en desarrollo (en los proplástidos) se complementaría con otros efectos sobre la biogénesis de los cloroplastos causados por nuevos genes activados por HaHSFA9 identificados tentativamente en nuestro trabajo. Ambos efectos serían complementarios y facilitarían que se reanudase la diferenciación de los cloroplastos funcionales durante la germinación de la plántula, a partir de los plástidos parcialmente ensamblados que resisten la desecación embrionaria en las semillas Jarvis & López-Juez, (2013). El programa genético activado por HSFA9 incluye genes que codifican proteínas sHSP-P. En estudios anteriores de nuestro laboratorio se observó que la sobreexpresión ectópica del factor HaHSFA9 en plántulas transgénicas de tabaco confería tolerancia a deshidratación severa, especialmente observada en la supervivencia de la parte aérea de la plántula. Esto se correlacionó con la acumulación de proteínas HSP en las plántulas 35S:A9, entre las que se incluían las proteínas HSP101, sHSP-CI, y sHSP-CII (Prieto-Dapena et al., 2008). La comparación Introducción 141 de los patrones de acumulación de proteínas sHSP, indicó que existía un solapamiento parcial y diferencias cruciales entre los genes hsp activados ectópicamente HaHSFA9 y los activados por aclimatación al calor. Así, la sobreexpresión ectópica de genes hsp activados por HaHSFA9 caracterizados como específicos de semillas permitió explicar parcialmente la tolerancia a los tratamientos de deshidratación severa observada en las plántulas 35S:A9. Esto contrasta con lo observado con plántulas no transgénicas aclimatadas al calor, que ni expresan dichos genes hsp ni resisten la deshidratación severa (Prieto-Dapena et al., 2008). Los resultados de nuestro estudio incorporan al programa genético activado por HSFA9 la expresión de proteínas sHSP-P. La inducción de sHSP-P se ha confirmado tanto a nivel de acumulación de proteínas (ver Figuras r2 y r3) como a nivel de acumulación de ARNm (ver Figura r27). Los patrones de acumulación de proteínas sHSP-P inducidas por el programa activado por HaHSFA9 difieren de los observados por aclimatación al calor, aunque existe un solapamiento parcial entre ambos programas genéticos (ver Figura r3). Además, una parte de estas sHSP-P acumuladas en las plántulas 35S:A9 se encuentran fuertemente asociadas a las membranas tilacoidales bajo condiciones normales de cultivo (ver Figura r4). Así, la expresión ectópica de los diferentes genes hsp específicos de semillas, incluyendo las sHSP-P, podrían ayudar a explicar parcialmente la tolerancia observada en las plántulas 35S:A9 frente a estreses abióticos extremos, como la deshidratación severa o condiciones drásticas de estrés oxidativo. Sin embargo, creemos que la protección conferida por el programa genético activado por el factor HSFA9 no puede atribuirse únicamente a la expresión de genes hsp. Todas las sHSP actúan como chaperonas (Sun & MacRae, 2005), incluyendo tanto a las sHSP-P como a las sHSP-CI y sHSP-CII (Sundby et al., 2005; Basha et al., 2010). No obstante, las funciones antioxidantes descritas para las proteínas sHSP en plantas superiores sólo permiten explicar en parte la protección observada en las plántulas 35S:A9 (Härndahl et al., 1999; Barua et al., 2003; Neta- Sharir et al., 2005; Guo et al., 2007). La sobreexpresión de la proteína plastidial HSP21 en Arabidopsis, bajo el promotor CaMV 35S, provocó la acumulación de esta proteína en hojas, bajo condiciones normales de cultivo, a niveles mayores a los observados durante aclimatación al calor (Osteryoung & Vierling, 1992). Esto es similar a lo que nosotros observamos para las proteínas sHSP-P inducidas por HaHSFA9 (ver Figura r2). Sin embargo, la sobreexpresión de HSP21 sólo confirió una protección muy moderada frente al daño producido por estrés oxidativo, combinado con estrés por calor o alta luminosidad (Härndahl et al., 1999). Por lo tanto, la sobreexpresión única de proteínas sHSP-P, no sería suficiente para la compleja