Fundamentos de la Biología Sintética

1 Universidad de Sevilla Grado en Física Trabajo de Fin de Grado “Fundamentos de la Biología Sintética” Alumno: Pablo Salguero Quirós Tutora: María del Carmen Lemos Fernández Departamento: Física de la Materia Condensada Curso 2018 – 2019 Fundamentos de la Biología Sintética ÍNDICE Resumen ...................................................................................................................... 1 Abstract ....................................................................................................................... 1 Introducción ................................................................................................................. 2 La Biología Sintética .................................................................................................... 3 Reacciones bioquímicas ............................................................................................... 6 Cinética química ................................................................................................................... 6 Ley de acción de masas ...................................................................................................................7 Constante de reacción ....................................................................................................................7 Catálisis enzimática .............................................................................................................. 8 Michaelis – Menten ...................................................................................................................... 10 Aproximación de equilibrio ....................................................................................................... 10 Aproximación cuasiestática ....................................................................................................... 11 Ciclo de activación – desactivación de una proteína ................................................................... 13 Redes genéticas sintéticas ......................................................................................... 14 Regulación génica ............................................................................................................... 16 La doble hélice del ADN ................................................................................................................ 17 Tipos principales de ARN ............................................................................................................... 18 Dogma central de la biología molecular ......................................................................................... 19 Ecuación de Hill .................................................................................................................. 21 Cooperatividad positiva: 𝑛>1 ..................................................................................................... 22 Cooperatividad negativa: 𝑛<1 .................................................................................................... 23 Cooperatividad nula: 𝑛=1 ........................................................................................................... 24 Interruptor genético “Toggle – Switch” .............................................................................. 25 Modelo matemático ..................................................................................................................... 25 Estudio de la estabilidad ............................................................................................................... 26 Experimento de Timothy S. Gardner, Charles R. Cantor y James J. Collins [3] ................................. 30 Estabilidad a largo plazo ............................................................................................................ 32 Sistema Represilador .......................................................................................................... 33 Modelo matemático ..................................................................................................................... 33 Estudio de la estabilidad y oscilaciones.......................................................................................... 35 Estudio paramétrico .................................................................................................................. 41 Percepción de quórum: “Quorum sensing” ........................................................................ 43 Modelo matemático ..................................................................................................................... 44 Actualidad.................................................................................................................. 47 Conclusiones .............................................................................................................. 48 Bibliografía ................................................................................................................ 49 Apéndice A. Códigos Matlab ...................................................................................... 51 Fundamentos de la Biología Sintética Reacciones bioquímicas ...................................................................................................... 51 Figura 1......................................................................................................................................... 51 Figura 2......................................................................................................................................... 51 Regulación génica ............................................................................................................... 52 Figuras 3, 4 y 5 .............................................................................................................................. 52 Redes genéticas sintéticas .................................................................................................. 53 Figura 6......................................................................................................................................... 53 Figura 7......................................................................................................................................... 55 Figura 8......................................................................................................................................... 56 Figuras 9, 10 y 11 .......................................................................................................................... 57 Figuras 12 y 13 .............................................................................................................................. 59 Apéndice B. Ruido estocástico: aplicación en el sistema Represilador....................... 61 Apéndice C. Bacteria E. coli ........................................................................................ 65 Apéndice D. Agradecimientos .................................................................................... 66 Fundamentos de la Biología Sintética 1 RESUMEN El presente trabajo de fin de grado, sustentado principalmente en una revisión bibliográfica, versa acerca de las bases y características fundamentales de la Biología Sintética y su relación con la Física en terrenos como la Genética y la Bioquímica. Hemos estudiado las reacciones bioquímicas desde el siglo XIX y la regulación génica partiendo de los nucleótidos para alcanzar las redes genéticas sintéticas del presente siglo XXI. La bacteria Escherichia coli (E. coli) es el organismo que dota de material genético al trabajo y será protagonista en los sistemas estudiados Toggle – Switch y Represilador, los cuales marcaron el comienzo de la Biología Sintética en el año 2000. Ambos sistemas están caracterizados por reacciones bioquímicas modeladas por redes genéticas sintéticas, las cuales, a su vez, pueden ser representadas por medio de sistemas de ecuaciones diferenciales no lineales acopladas. A partir del análisis de estabilidad es posible predecir el estado del sistema usando para ello los métodos numéricos. En el trabajo hemos estudiado los modelos matemáticos de los sistemas Toggle – Switch y Represilador y hemos hecho simulaciones en código Matlab: planos de fase, evoluciones temporales y transformadas de Fourier. En el último apartado se acopla la percepción de quórum o “quorum sensing” al sistema Represilador, dotándolo de una mayor complejidad. Finalmente hemos añadido algunos detalles sobre la actualidad de la Biología Sintética. ABSTRACT This final degree project, which is based on a bibliographic study, deals with fundaments and main features of Synthetic Biology, as well as its connection with Physics in the field of Genetics and Biochemistry. We have studied biochemical reactions from XIX century and gen regulation starting from nucleotides to get synthetic genetic networks of this century. Escherichia coli (E.coli) bacterium is the organism which gives genetic material to this work and it will be essential to the systems Toggle – Switch and Repressilator. These ones were the beginning of the Synthetic Biology in 2000. Both systems are characterized by biochemical reactions that are modelled on synthetic genetic networks and these networks can be written by nonlinear coupled differential equation systems. From stability analysis is possible to predict the system state by using numerical methods. Moreover, in the current study we have analyzed mathematical models of Toggle – Switch and Repressilator systems and we have created Matlab numerical simulations: phase planes, temporal evolutions and Fourier transforms. In the last section quorum sensing is coupled to Repressilator system by giving it a greater complexity. Finally, we have added some details about the current situation of Synthetic Biology. Fundamentos de la Biología Sintética 2 INTRODUCCIÓN El ser humano ha estado modificando las características genéticas de las plantas y los animales durante milenios controlando la reproducción de especies para seleccionar ciertos rasgos o características y para reducir o eliminar otros. El descubrimiento de la estructura del ADN en 1953, el reconocimiento de su importancia como portador de información genética hereditaria, seguido del desarrollo de la tecnología del ADN recombinante dos décadas más tarde, allanó el camino para que las tecnologías más novedosas manipulen los genes directamente de tal manera que el genotipo y el fenotipo de un organismo puedan alterarse con la mayor precisión en una sola generación [1]. Aunque el proyecto Genoma Humano se completó en 2003, no fue hasta 2016 cuando se conoció en detalle la secuencia completa del genoma humano: entre 20.000 y 25.000 genes identificados, frente a los 4000 genes de la bacteria E. coli. En el ser humano, alrededor de 3200 millones de pares de bases forman genes, repartidos entre los 23 pares de cromosomas. Sólo un 5 % del genoma codifica proteínas y el 25% del genoma humano está casi desierto, existiendo largos espacios libres entre un gen y otro. Se calcula que existen entre 250 000 y 300 000 proteínas distintas, por lo que cada gen podría estar implicado por término medio en la síntesis de unas diez proteínas. Algo más del 35% del genoma contiene secuencias repetidas, lo que se conoce como ADN basura. A pesar de todo lo conocido, el ser humano desconoce muchos detalles sobre como interactúan. Los genes interactúan entre sí en circuitos bioquímicos y la Biología de Sistemas se encarga de darles significado y de relacionar la genética con el metabolismo y la fisiología de un organismo. La Biología Sintética es un campo multidisciplinar en el que se crean sistemas biológicos completamente nuevos. A menudo, esto implica la inserción de cadenas de ADN recombinante en líneas celulares existentes que luego expresan novedosas funcionalidades, como por ejemplo expresar una nueva molécula o un circuito metabólico completamente nuevo. Las células sintéticas pueden ser muy útiles para el desarrollo de modelos en Biología de Sistemas. Los dos pioneros, el interruptor genético Toggle – Switch y el Sistema Represilador, forman parte de este trabajo. Fundamentos de la Biología Sintética 3 LA BIOLOGÍA SINTÉTICA La Biología Sintética tiene como objetivo modificar las células vivas de tal manera que puedan llevar a cabo tareas precisas. Las posibles aplicaciones van desde la producción de biocombustibles, la síntesis de fármacos, la detección de células cancerosas y la eliminación de contaminantes ambientales. Los principales ingredientes de la Biología Sintética son los circuitos de ADN, donde las secuencias de ADN interactúan intercambiando proteínas o moléculas de ARN. La implementación de uno de estos circuitos genéticos en el laboratorio debe estar basada en modelos matemáticos. La Biología Sintética se fundó como una disciplina de la Biofísica [2] que buscaba explicaciones sobre los orígenes de la vida a partir de los principios fundamentales de la Física y la Química. La Biología Sintética moderna se ha reinventado como una disciplina de ingeniería para diseñar nuevos organismos, así como para comprender mejor los mecanismos biológicos fundamentales. Sin embargo, el éxito es todavía muy limitado en la actualidad, ya que se trata de una disciplina recién nacida. La Biología Sintética es una disciplina joven cuyo nacimiento se remonta al año 2000 con la publicación en Nature de los dos primeros circuitos genéticos sintéticos: el interruptor genético Toggle Switch [3] y el sistema Represilador [4]. El objetivo de la Biología Sintética es convertir la Biología en una ciencia de la ingeniería, es decir, establecer una metodología para el diseño basado en modelos y la implementación de circuitos de ADN [5]. Los circuitos genéticos sintéticos proporcionan a las células huésped nuevas características y funciones, diferentes de las naturales. Al tratar con circuitos, a pesar de estar hechos de ADN, ARN, proteínas y sustancias químicas, se toma la ingeniería eléctrica como una ciencia de referencia. En particular, se tomaron prestados tres conceptos principales de la electrónica para establecer los fundamentos de la Biología Sintética. Estos son: 1. Componentes estándares. 2. Jerarquía de la abstracción. 3. Capacidad de composición. En ingeniería eléctrica, los componentes estándares son resistencias, condensadores, solenoides, baterías, etc. Se ensamblan en dispositivos, como diodos y transistores, que realizan una función específica. Los dispositivos a su vez se juntan en circuitos que realizan operaciones complejas. Los componentes y dispositivos electrónicos básicos están conectados entre sí porque comparten una señal de entrada – salida única: la corriente eléctrica. En Biología Sintética, los componentes básicos de los circuitos genéticos bacterianos son secuencias de ADN caracterizadas por funciones precisas como la transcripción o la traducción. La transcripción es el proceso en el que un segmento particular de ADN se Fundamentos de la Biología Sintética 4 copia en el ARN en el núcleo celular mediante la enzima ARN polimerasa. Tras ella, la traducción es el proceso en el cual los ribosomas, en el retículo endoplasmático situado en el citoplasma, sintetizan proteínas. La totalidad de este proceso se denomina expresión génica. En la traducción, el ARN mensajero (ARNm) se decodifica en el centro de descodificación del ribosoma para producir una cadena de aminoácidos específica llamada polipéptido. El polipéptido luego se pliega en una proteína activa y realiza sus funciones en la célula. De acuerdo con el Registro MIT de Partes Biológicas Estándares (http://parts.igem.org), se dividen en cuatro categorías: promotores, sitios de unión a ribosomas (RBS), secuencias de codificación para proteínas (CDS) y pequeños ARNs, y terminadores. 1) Los promotores son secuencias de ADN en las que las ARN polimerasas se unen y comienzan la transcripción del ADN en ARNm. 2) Los RBS son una secuencia de nucleótidos del codón de inicio, el cual es una secuencia de ARN de tres nucleótidos que indica a la maquinaria celular el lugar de la cadena donde comienza la traducción del ARNm. En los RBS se unen los ribosomas para iniciar la síntesis de proteínas. 3) Las secuencias de codificación para proteínas CDS son secuencias genéticas de ADN o ARN que codifican una proteína. 4) Los terminadores son señales genéticas, a lo largo del ADN, para que las ARN polimerasas detengan la transcripción y dejen la doble cadena. ILUSTRACIÓN 1. CONCEPTOS DE ELECTRÓNICA. A) CONCEPTOS PRINCIPALES DE LA ELECTRÓNICA, B) DEFINICIÓN DEL AMPERIO COMO UNIDAD DE CORRIENTE ELÉCTRICA. FUENTE: [5]. Las partes biológicas estándares a su vez se pueden ensamblar en dispositivos biológicos. Un ejemplo de bio-dispositivo es una unidad de transcripción que produce una proteína informadora. Esta construcción se realiza mediante la fusión de un promotor con un RBS, el gen de la proteína fluorescente y un terminador. 2 1 Introduction Basic components Devices Circuits Abstraction Hierarchy A = dQ/dt A Belectrical wire Fig. 1.1 Concepts from electronics. (a) Abstraction hierarchy. Standard components (symbols, from top to bottom: resistors, batteries, capacitors, solenoids) are composed into devices (symbols: diode – top, transistor – bottom) that in their turn are used to build up circuits. (b)Definitionof the Ampere (A), the unit of the electrical current, as the time derivative of the charge (Q) i.e. the number of electrons (orange circles) that go through a wire section (faded rectangle) per unit of time (second) •standardcomponents, •abstractionhierarchy, •composability. In electrical engineering standard components are resistors, capacitors, solenoids, batteries, etc. They are assembled into devices, such as diodes and transistors, that perform aspecificfunction.Devicesarethenputtogetherintocircuitsthatcarryoutcomplex operations. Electronic basic components and devices are connected to each other because they share a unique input/output signal i.e. the electrical current. This flux of electrons is quantified (in Ampere) as the electric charge (measured in Coulomb) that goes through a section of a wire in one second (Ampere = Coulomb/s – see Fig. 1.1). In Synthetic Biology, basic components for bacterial genetic circuits are DNA traits characterized by precise functions either in transcription or translation. According to the MIT Registry of Standard Biological Parts (http://parts.igem.org), they are divided into categories such as promoters, ribosome binding sites (RBS), coding sequences (CDS) for proteins and small RNAs, and terminators. Promoters are DNA sequences where RNA polymerases bind and start DNA transcription into mRNA; RBSs are the place, on the mRNA, where ribosomes bind and initiate protein synthesis; coding sequences correspond to genes or encode for small RNAs; terminators are signals, along the DNA, for RNA polymerases to stop transcription and leave the double chain. Standard Biological Parts can be assembled into biological devices. An instance of bio-device is a transcription unit Fundamentos de la Biología Sintética 5 Si el promotor está regulado por factores de transcripción, este dispositivo se puede usar como un componente de un bio-circuito donde otras unidades de transcripción sintetizan las proteínas reguladoras del promotor. Lo que hace que las partes biológicas estándar tengan capacidad de composición es el flujo de dos moléculas diferentes, el ARN polimerasa y el ribosoma, que son los principales protagonistas en la transcripción y la traducción, respectivamente. Las ARN polimerasas escanean todas las partes biológicas a lo largo de una unidad de transcripción, mientras que los ribosomas van a lo largo del ARNm a través de las partes que se han transcrito. Las ARN polimerasas y los ribosomas se denominan portadores de señales comunes y representan el equivalente biológico de los electrones. Sus flujos pueden considerarse como corrientes biológicas y se conocen como PoPS (Polimerasas por segundo) y RiPS (Ribosomas por segundo). En analogía con la electrónica, PoPS (RiPS) se define como el número de ARN polimerasas (ribosomas) que atraviesan una sección de ADN (ARNm) por segundo. ILUSTRACIÓN 2. COMPONENTES BIOLÓGICOS Y CIRCUITOS. A) SÍMBOLOS DE LAS PARTES BIOLÓGICAS ESTÁNDARES. B) TRES BIO – DISPOSITIVOS. D3 ES LA SALIDA DEL CIRCUITO, UNA PROTEÍNA FLUORESCENTE. D1 Y D2 REGULAN LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA FLUORESCENTE DE FORMA REPRESORA: CUANDO D1 Y D2 NO ESTÁN CONECTADOS SE CONSIGUE LA MÁXIMA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA. FUENTE: [5]. ILUSTRACIÓN 3. ESQUEMA BÁSICO DE BIO CORRIENTES. FUENTE: [5]. 1.1 What Is Synthetic Biology? 3 Promoter RBS Coding sequence Terminator A B R1 R2 Reporte r D1 D2 D3 Fig. 1.2 Biological components and circuits. (a) Symbols of Standard Biological Parts according to the SBOL (Synthetic Biology Open Language) representation [20]. (b) Three bio-devices (D1, D2, and D3) corresponding to as many transcription units (colored boxes) are arranged into a gene circuit. D1 and D2 encodes for two different repressors (R1 and R2) able to bind and repress D3 promoter (red lines ending with a bar). D3 produces the circuit output, a fluorescent protein (a line ending with a circle symbolizes translation). D3 alone gives the maximal fluorescence level. When D1 and/or D2 are added to the circuit, reporter protein expression is down-regulated with a consequent decrease in the circuit fluorescence level that produces a reporter protein. This construct is realized by merging a promoter with an RBS, the fluorescent protein gene, and a terminator. If the promoter is regulated by transcription factors, this device can be used as a component of a bio-circuit where other transcription units synthesize the promoter regulatory proteins (see Fig. 1.2). What makes Standard Biological Parts composable is the flux of two different molecules i.e. RNA polymerase and ribosome that are the main actors in transcription and translation, respectively. RNA polymerases scan all the biological parts along a transcription unit, whereas ribosomes goes – along the mRNA – through the parts that have been transcribed. RNA polymerases and ribosomes are referred to as common signal carriers [15]andrepresentbiologicalcounterpartsoftheelectrons.Theirfluxescanbeconsidered as bio-currents and are referred to as PoPS (Polymerases Per Second) and RiPS (Ribosomes Per Second – see Fig. 1.3). In analogy to electronics, PoPS (RiPS) is defined as the number of RNA polymerases (ribosomes) that cross a section of DNA (mRNA) per second. In electronics, circuit implementation is preceded by computational design, analysis, and simulations. Indeed, the dynamics of electrical circuits can be faithfully predicted by applying the physical laws of electromagnetism. In order to affirm Synthetic Biology as a proper engineering science, gene parts and devices should be accompanied by rigorous mathematical models too. This would allow a reliable prediction of the dynamics of complex gene networks and drive their wet-lab implementation. Up to now, however, nothing 4 1 Introduction PoPS PoPS PoPS RiPS RNAp anchor point RNAp exit point Ribosome anchor point Ribosome exit point Fig. 1.3 Bio-currents. RNA polymerases (RNAp) molecules enter a transcription unit at the promoter and flow, as PoPS, through all the DNA parts until they meet a terminator and leave the DNA. Ribosomes bind the mRNA at the RBS and move, as RiPS, into a coding sequence. They leave the mRNA after recognizing a STOP codon comparable to the electromagnetism laws exists in biology. Several modeling techniques, which are presented in this book, have been proposed and proved to be able to reproduce, under precise assumptions, experimental data. Nevertheless, a theoretical/computational framework that provides accurate predictions about the output of synthetic gene circuits and help their practical implementation is still to come and its establishment represents a major challenge in Synthetic Biology. 1.2 Parts, Pools, and Visual Gene Circuit Design Amoredetailedgenecircuitrepresentationregardsthreemoremoleculesascommon signal carriers because of the role they play in transcription and translation regulation [33]. They are transcription factor proteins, small antisense RNAs (sRNAs), and chemicals. Transcription factors bind promoters by either competing with RNA polymerases (repressors) or recruiting RNA polymerases to the DNA (activators); small RNAs bind complementary sequences on the mRNA and either form (more frequently) or remove hairpin structures that hinder the ribosome flux along the mRNA chain; chemicals (also referred to as environmental signals) carry out a control both on transcription and translation. The former is achieved by binding and activating or de-activating transcription factor proteins, the latter by docking at mRNA structures such as riboswitches and ribozymes. Each new signal carrier corresponds to a new bio-current. They are termed FaPS (Factors Per Second), RNAPS (RNAs Per Second), and SiPS (Signals Per Second), respectively. In this enlarged picture all five signal carriers are associated with new entities called Pools.Theyrepresenttheplace,inthecell,wherefreemoleculesofsignalcarriersare stored. Therefore, the contents of pools are biological potentials on which circuit dynamics depends. To make an analogy with electronics, pools can be seen as bio-batteries. Fundamentos de la Biología Sintética 6 En Electrónica, la implementación del circuito está precedida por el diseño computacional, el análisis y las simulaciones. De hecho, la dinámica de los circuitos eléctricos se puede predecir fielmente aplicando las leyes físicas del electromagnetismo. Para afirmar la Biología Sintética como una ciencia de ingeniería adecuada, las partes y dispositivos de los genes también deben ir acompañados de modelos matemáticos rigurosos. Esto permitiría una predicción fiable de la dinámica de las redes genéticas complejas e impulsaría su implementación en el laboratorio en vivo. Sin embargo, hasta ahora, no hay leyes en biología comparables a la del electromagnetismo a pesar de que varias técnicas de modelado han sido propuestas y se ha demostrado que son capaces de reproducir datos experimentales bajo ciertas suposiciones. Un marco teórico computacional que proporcione predicciones precisas sobre la salida de los circuitos genéticos sintéticos y que ayude a su implementación práctica aún está por llegar y su establecimiento representa un desafío importante para la Biología Sintética. REACCIONES BIOQUÍMICAS Innumerables experimentos demuestran actualmente que todos los fenómenos biológicos se deben a la interacción de moléculas inanimadas que siguen las leyes físicas estándares de Gravitación, el Electromagnetismo, la Teoría Cuántica de Campos, la Termodinámica, etc. La complejidad puede evolucionar rápidamente incluso a partir de simples reacciones químicas inorgánicas. Las reacciones químicas caóticas oscilatorias fueron muy importantes para el establecimiento de la Química Física cuando se descubrieron en la década de 1960, ya que estas reacciones no convergían a un estado de equilibrio simple. Por ejemplo, la reacción oscilante de Briggs-Rauscher y la reacción de Belousov- Zhabotinsky [6]. CINÉTICA QUÍMICA En una formulación determinista, las reacciones moleculares están descritas por ecuaciones diferenciales que definen la variación temporal en las concentraciones moleculares [7]. Estas se miden en mol por litro generalmente y los valores típicos en el interior de una célula van de los 0.1nM a los 1µM . Fundamentos de la Biología Sintética 13 FIGURA 1. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL SISTEMA 1: CONCENTRACIONES DEL SUSTRATO, ENZIMA, PRODUCTO Y COMPLEJO EN UNA REACCIÓN SEGÚN LA CINÉTICA DE MICHAELIS – MENTEN. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. CICLO DE ACTIVACIÓN – DESACTIVACIÓN DE UNA PROTEÍNA 𝑋∗v[w,y[ z ⎯ ⎯ ⎯ | vZ,yZ } ⎯ ⎯ ~ 𝑋 (28) 𝑋∗+𝑋=1. (29) Suponiendo que la activación y la desactivación dependen de enzimas y que la enzima de activación es una variable dinámica, la cinética de Michaelis – Menten del sistema viene dada por 𝑑[𝑋] 𝑑𝑡 =− 𝑉,[𝑋] 𝐾,+[𝑋]+𝑉/[𝐸](1−[𝑋]) 𝐾/+(1−[𝑋])>. (30) Igualando las constantes de reacción y resolviendo el sistema en el equilibrio definiendo la variable 𝑓=𝑉/ [ 𝐸 ] 𝑉, ⁄ 𝑑[𝑋] 𝑑𝑡 =− 𝑉,[𝑋] 𝐾+[𝑋]+𝑓𝑉,(1−[𝑋]) 𝐾+(1−[𝑋]) (31) 𝐾=𝐾,=𝐾/ (32) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Tiempo t (s) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Concentraciones M (L/mol) Sustrato Enzima Producto Complejo Fundamentos de la Biología Sintética 14 𝑑[𝑋] 𝑑𝑡 =0→ [𝑋] 𝐾+[𝑋]=𝑓 (1−[𝑋]) 𝐾+(1−[𝑋]) (33) se observa cómo el sistema se comporta como un amplificador analógico o un interruptor digital dependiendo del valor de 𝐾 , diferenciando la respuesta tipo cinética de Michaelis – Menten de una respuesta tipo ultrasensible (ver figura 2). FIGURA 2. CONTRASTE ENTRE LA RESPUESTA EN LA CINÉTICA DE MICHAELIS – MENTEN (EN ROJO) Y LA RESPUESTA ULTRASENSIBLE (EN AZUL). FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. La ultrasensibilidad juega un papel muy importante en los procesos del ciclo celular, donde una serie de interruptores bioquímicos controlan las transiciones durante y entre las distintas fases. REDES GENÉTICAS SINTÉTICAS Una vez que se establecen los conceptos teóricos para comprender las reacciones químicas simples, es posible un análisis más sofisticado de las reacciones bioquímicas. Por lo tanto, se puede estudiar la cinética enzimática y también se pueden desarrollar fenómenos no lineales basados en su dinámica ( [10], [11] y [12] ). Las redes genéticas sintéticas son sistemas dinámicos complejos que describen las interacciones de la expresión génica de células vivas [13]. En las redes genéticas sintéticas sencillas además de predecir el comportamiento de los valores de los niveles de proteínas también se induce en la célula una dinámica impuesta por las interacciones genéticas mediante la tecnología del ADN recombinante. Con ella, es posible concatenar 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 f 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 [X] K = 0.001 K = 1000 Fundamentos de la Biología Sintética 15 una serie de genes en organismos diversos que de forma natural no interaccionarían entre sí, regulando de esta manera los niveles de transcripción de proteínas según un patrón sintético ( [14], [15], [16] y [17] ). ILUSTRACIÓN 6. RED DE REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN GÉNICA DE LA LEVADURA. FUENTE: [13] En estas redes, los nodos están constituidos por los genes y las conexiones entre nodos las forman los factores de transcripción. Una red como la de la ilustración 6 muestra que los enlaces son flechas que apuntan en una dirección. Si un gen A produce una proteína que controla la tasa de transcripción del gen B, esto se reproduce como 𝐴→𝐵 (34) En la biología sintética, la definición de un modelo exige definir las especies y las reacciones bioquímicas que sean esenciales para una estimación adecuada del funcionamiento de un circuito genético. La forma en que las especies interactúan está determinada por una cinética. La cinética de acción masas se adopta para derivar un modelo mecanicista que apunta a una reconstrucción completa de las interacciones que tienen lugar dentro de un circuito. Un modelo fenomenológico, en contraste, trata de reproducir patrones a partir de datos experimentales y para ello, las cinéticas basadas en funciones de Hill son muy empleadas. En las redes genéticas, las funciones de Hill son particularmente útiles para describir la activación y represión de mecanismos fundamentales como la transcripción de ADN. 28 Temas de Física REF Octubre 2007 http://www.rsef.org interacción regula así sus tasas de producción. A este tipo de proteínas, de vital importancia en el funcionamiento de la célula, se les conoce como factores de transcripción. Tales factores determinan la capacidad de los genes para producir determinadas proteínas, las cuales a su vez, pueden actuar como factores de transcripción de otros genes. Se puede imaginar una red o un grafo donde los nodos fundamentales son genes con un enlace que los une si la proteína producida por un gen actúa como factor de transcripción del otro. Antes de describir tales redes, conviene hacer una breve revisión del proceso de biosíntesis de proteínas. Un gen es información. Al igual que un texto escrito sobre un papel, conteniendo un mensaje, esta información (texto) contenida en el ADN (papel) codifica la secuencia específica de aminoácidos necesaria para generar una proteína con actividad biológica en la célula (mensaje). El mecanismo de biosíntesis de proteínas incluye los procesos de transcripción y traducción. Cada gen está definido por un fragmento de ADN. La doble hélice del ADN está compuesta por un esqueleto carbonado y cuatro bases distintas entre sí: Adenina, Guanina, Citosina y Timina. La combinación de estas bases entre sí de forma lineal define una secuencia ordenada. Esta información en forma de secuencia ordenada de bases forma un mensaje específico que permite obtener una proteína determinada. Cada mensaje, cada gen, codifica así para una proteína distinta. Mediante el proceso de transcripción, una molécula llamada RNA polimerasa copia el mensaje contenido en el gen a otra molécula, el RNA mensajero (mRNA). Una vez transcrito el mRNA, éste interacciona con los ribosomas que son los que realizan la traducción. De esta interacción se produce finalmente la síntesis de una proteína cuya secuencia de aminoácidos está codificada en la secuencia del gen. Figura 1. Transcripción génica: papel de la RNA polimerasa y de las proteínas activadoras y represoras. a) La RNA polimerasa se une al promotor y transcribe (copia) la información genética mediante síntesis de un RNA mensajero. b) Un activador se une a la RNA polimerasa y potencia la producción de mRNA. c) Una proteína represora se une al promotor y bloquea la transcripción al impedir que la RNA polimerasa interaccione con el promotor. La tasa o velocidad a la que un gen se transcribe está regulada por el promotor y por un número de proteínas que colaboran en la unión de la RNA polimerasa al mismo. El promotor es un tramo de la secuencia de ADN que suele preceder al gen, y representa el sitio donde la RNA polimerasa debe anclarse antes de empezar el proceso de transcripción. Sin embargo, la capacidad de la RNA polimerasa para unirse al promotor está condicionada por su interacción con los factores de transcripción, los cuales son proteínas codificadas por otros genes. Los factores de transcripción, junto con la RNA polimerasa, se unen también al promotor e influyen positiva o negativamente en la tasa de transcripción. Por ello, hay que hacer la distinción entre activadores, o proteínas que aumentan la tasa de transcripción, y represores, las proteínas que, por el contrario, disminuyen o bloquean la transcripción. La Fig. 1 muestra esquemáticamente el proceso de transcripción (a) así como las diferencias en la actuación del activador (b) y del represor (c). Figura 2. Red de la regulación de la transcripción génica de la levadura. Imagen obtenida de [6]. Basándonos en estos fenómenos, diseñamos nuestra red de regulación genética de modo que los nodos estén constituidos por los propios genes y los factores de transcripción definan las conexiones entre dichos nodos. La red obtenida está dirigida, es decir, los enlaces son en realidad flechas que apuntan en una dirección: Si el gen A produce una proteína que controla la tasa de transcripción del gen B, obtendremos una conexión del tipo A ® B. En la Fig. 2 podemos ver un ejemplo de una red obtenida mediante la proyección de la red de transcripción genética de la levadura [6]. Numerosos trabajos se han centrado en el estudio de las redes genéticas constituidas a través de las interacciones entre genes y proteínas. Los resultados revelan que son redes muy heterogéneas, que incluyen tanto nodos muy poco conectados como otros con gran número de enlaces [7,8]. Es interesante resaltar que se trata de redes muy alejadas de sus equivalentes aleatorias ya que muestran diferencias en su Fundamentos de la Biología Sintética 16 REGULACIÓN GÉNICA Los ácidos nucleicos son el material genético celular y están compuestos por monómeros llamados nucleótidos. Cada nucleótido está formado a su vez por un azúcar pentosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada [18]. ILUSTRACIÓN 7. ESQUEMA DE UN NUCLEÓTIDO. FUENTE: [18] Existen dos tipos de ácidos nucleicos presentes en las células: el ADN o ácido desoxirribonucleico y el ARN o ácido ribonucleico. Sus diferencias están en el número de hebras presentes, la composición de las bases nitrogenadas y el tipo de azúcar pentosa. ILUSTRACIÓN 8. DIFERENCIAS ENTRE EL ADN Y EL ARN: AZÚCAR PENTOSA Y DISTINTA COMPOSICIÓN DE BASES NITROGENADAS. FUENTE: [18] Fundamentos de la Biología Sintética 17 ILUSTRACIÓN 9. DIFERENCIAS ENTRE EL ADN Y EL ARN: DISTINTO NÚMERO DE HEBRAS Y DISTINTAS BASES NITROGENADAS. FUENTE: [18] LA DOBLE HÉLICE DEL ADN La estructura de doble hélice del ADN está compuesta de dos cadenas separadas. El fosfato y el azúcar permanecen siempre iguales pero hay cuatro bases diferentes: A, G, C y T (Adenina, Guanina, Citosina y Timina). El fosfato y el azúcar se unen para formar el esqueleto de cada hebra de ADN, mientras que las bases decoran el esqueleto y proporcionan variabilidad. Es la secuencia de estos nucleótidos la que proporciona la base de la información genética codificada en el ADN [19]. Una característica clave del ADN que conduce a la estructura de doble hélice es cómo interactúan las dos cadenas. Cada una de las cuatro bases solo puede emparejarse con una de las otras bases. A solo puede emparejarse con T, mientras que G solo con C. Esta complementariedad significa que la secuencia de una cadena define la secuencia de la otra: una G en una cierta posición de una cadena significa que la otra cadena siempre tendrá una C en esa posición y así. La consecuencia de esto, desde la perspectiva de la célula, es que siempre tendrá dos copias de la información codificada por la secuencia de ADN. Esto es importante porque si una hebra está dañada, la otra puede dirigir la reparación y no se pierde información. La complementariedad surge a través de las interacciones de los enlaces de Hidrógeno entre las bases. Hay 2 enlaces de hidrógeno entre A y T, y 3 enlaces de Hidrógeno entre G y C. Esto significa que los pares de bases GC son más estables y, por lo tanto, más difíciles de separar. Fundamentos de la Biología Sintética 18 Cuando dos cadenas complementarias de ADN se unen, los pares de bases interactuarán entre sí para formar enlaces de Hidrógeno. Debido a la estructura plana de las bases aromáticas las bases tienden a apilarse una encima de la otra, cada fosfato en la columna vertebral tiene una carga negativa y, por lo tanto, se repelen entre sí, mientras que el azúcar proporciona un grupo de enlace con una longitud fija. La atracción de las bases de apilamiento en cada hebra se equilibra por la repulsión de los fosfatos dentro del límite del enlace. El resultado es que cada base está desplazada alrededor de 34° con respecto a la anterior y las dos cadenas se tuercen formando una doble hélice. ILUSTRACIÓN 10. ESTRUCTURA DEL ADN INCLUYENDO LOS PUENTES DE HIDRÓGENO. FUENTE: [18] TIPOS PRINCIPALES DE ARN La función del ARN es transferir instrucciones genéticas del núcleo al citoplasma, donde la información es descifrada. Hay tres tipos fundamentales de ARN que cooperan para realizar dicha función y están implicados en la síntesis de proteínas: 1. ARN mensajero (ARNm): son copias de transcripción de un gen que codifica un polipéptido específico. 2. ARN de transferencia (ARNt): lleva las subunidades de los polipéptidos, los aminoácidos, a los ribosomas que son los orgánulos celulares responsables de la síntesis. 3. ARN ribosómico (ARNr): componente primario de los ribosomas responsable de su actividad catalítica. Además de estas tres clases, existen también, por un lado, distintos tipos de ARN complementarios de regiones específicas del ARNm y del ADN que regulan la expresión Fundamentos de la Biología Sintética 19 génica, y, por otro lado, existen también distintos tipos de ARN que pueden actuar como biocatalizadores. ILUSTRACIÓN 11. LAS TRES CLASES PRINCIPALES DE ARN. FUENTE: [18] DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR El Dogma Central de la Biología Molecular explica el flujo de información genética en el interior de una célula. El ADN codifica ARN a partir del proceso de transcripción el cual ocurre en el interior celular, y el ARN codifica proteínas a partir del proceso de traducción, el cual ocurre en los ribosomas. El flujo de información ha estado siempre considerado en el mismo sentido, sin embargo en 1970 [20] se descubrió que los retrovirus podrían copiar ADN a partir de una secuencia de ARN, produciéndose el sentido inverso del flujo de información. Estos virus poseen una enzima que hacen posible el proceso de transcripción inverso. ILUSTRACIÓN 12. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR INCLUYENDO LA TRANSCRIPCIÓN INVERSA. FUENTE: [18] Fundamentos de la Biología Sintética 20 Los genes son información contenida en el ADN que codifica la secuencia específica de aminoácidos necesaria para generar una proteína. Mediante el proceso de transcripción, la molécula de ARN polimerasa (ARNp) copia el mensaje contenido en el gen a otra molécula llamada ARN mensajero (ARNm). Las ARN polimerasas son un conjunto de proteínas con carácter enzimático capaces de emplear los nucleótidos para sintetizar ARN a partir de una secuencia de ADN que sirve como patrón o molde. Una vez transcrito el ARNm, este interacciona con los ribosomas que son los que realizan la traducción para crear la proteína. Los factores de transcripción son proteínas con la habilidad de afectar la velocidad de transcripción de otras proteínas, interaccionando con el ADN de los genes responsables de su producción. Estos fenómenos dan lugar en la naturaleza a redes de proteínas que auto-regulan su producción, actuando como activadores o como represores entre ellas. La velocidad a la que un gen transcribe está regulada por el promotor y por los factores de transcripción, que colaboran en la unión del ARN polimerasa con el promotor. Los promotores son tramos en la secuencia de ADN que suele preceder al gen y representa el sitio donde el ARN polimerasa debe anclarse antes de empezar el proceso de transcripción. Dicha capacidad de unión está condicionada por su interacción con los factores de transcripción, los cuales se unen también al promotor junto con el ARN polimerasa influyendo positiva o negativamente en la tasa de transcripción. ILUSTRACIÓN 13. TRANSCRIPCIÓN GÉNICA: ACCIÓN DEL ARN Y LAS PROTEÍNAS ACTIVADORAS Y REPRESORAS. A) EL ARN POLIMERASA SE UNE AL PROMOTOR Y COPIA LA INFORMACIÓN GENÉTICA MEDIANTE LA SÍNTESIS DE ARN MENSAJERO. B) UN ACTIVADOR SE UNE AL ARN POLIMERASA Y POTENCIA LA PRODUCCIÓN DE ARN MENSAJERO. C) UNA PROTEÍNA REPRESORA SE UNE AL PROMOTOR Y BLOQUEA LA TRANSCRIPCIÓN AL IMPEDIR QUE EL ARN POLIMERASA INTERACCIONE CON EL PROMOTOR. FUENTE: [13] 28 Temas de Física REF Octubre 2007 http://www.rsef.org interacción regula así sus tasas de producción. A este tipo de proteínas, de vital importancia en el funcionamiento de la célula, se les conoce como factores de transcripción. Tales factores determinan la capacidad de los genes para producir determinadas proteínas, las cuales a su vez, pueden actuar como factores de transcripción de otros genes. Se puede imaginar una red o un grafo donde los nodos fundamentales son genes con un enlace que los une si la proteína producida por un gen actúa como factor de transcripción del otro. Antes de describir tales redes, conviene hacer una breve revisión del proceso de biosíntesis de proteínas. Un gen es información. Al igual que un texto escrito sobre un papel, conteniendo un mensaje, esta información (texto) contenida en el ADN (papel) codifica la secuencia específica de aminoácidos necesaria para generar una proteína con actividad biológica en la célula (mensaje). El mecanismo de biosíntesis de proteínas incluye los procesos de transcripción y traducción. Cada gen está definido por un fragmento de ADN. La doble hélice del ADN está compuesta por un esqueleto carbonado y cuatro bases distintas entre sí: Adenina, Guanina, Citosina y Timina. La combinación de estas bases entre sí de forma lineal define una secuencia ordenada. Esta información en forma de secuencia ordenada de bases forma un mensaje específico que permite obtener una proteína determinada. Cada mensaje, cada gen, codifica así para una proteína distinta. Mediante el proceso de transcripción, una molécula llamada RNA polimerasa copia el mensaje contenido en el gen a otra molécula, el RNA mensajero (mRNA). Una vez transcrito el mRNA, éste interacciona con los ribosomas que son los que realizan la traducción. De esta interacción se produce finalmente la síntesis de una proteína cuya secuencia de aminoácidos está codificada en la secuencia del gen. Figura 1. Transcripción génica: papel de la RNA polimerasa y de las proteínas activadoras y represoras. a) La RNA polimerasa se une al promotor y transcribe (copia) la información genética mediante síntesis de un RNA mensajero. b) Un activador se une a la RNA polimerasa y potencia la producción de mRNA. c) Una proteína represora se une al promotor y bloquea la transcripción al impedir que la RNA polimerasa interaccione con el promotor. La tasa o velocidad a la que un gen se transcribe está regulada por el promotor y por un número de proteínas que colaboran en la unión de la RNA polimerasa al mismo. El promotor es un tramo de la secuencia de ADN que suele preceder al gen, y representa el sitio donde la RNA polimerasa debe anclarse antes de empezar el proceso de transcripción. Sin embargo, la capacidad de la RNA polimerasa para unirse al promotor está condicionada por su interacción con los factores de transcripción, los cuales son proteínas codificadas por otros genes. Los factores de transcripción, junto con la RNA polimerasa, se unen también al promotor e influyen positiva o negativamente en la tasa de transcripción. Por ello, hay que hacer la distinción entre activadores, o proteínas que aumentan la tasa de transcripción, y represores, las proteínas que, por el contrario, disminuyen o bloquean la transcripción. La Fig. 1 muestra esquemáticamente el proceso de transcripción (a) así como las diferencias en la actuación del activador (b) y del represor (c). Figura 2. Red de la regulación de la transcripción génica de la levadura. Imagen obtenida de [6]. Basándonos en estos fenómenos, diseñamos nuestra red de regulación genética de modo que los nodos estén constituidos por los propios genes y los factores de transcripción definan las conexiones entre dichos nodos. La red obtenida está dirigida, es decir, los enlaces son en realidad flechas que apuntan en una dirección: Si el gen A produce una proteína que controla la tasa de transcripción del gen B, obtendremos una conexión del tipo A ® B. En la Fig. 2 podemos ver un ejemplo de una red obtenida mediante la proyección de la red de transcripción genética de la levadura [6]. Numerosos trabajos se han centrado en el estudio de las redes genéticas constituidas a través de las interacciones entre genes y proteínas. Los resultados revelan que son redes muy heterogéneas, que incluyen tanto nodos muy poco conectados como otros con gran número de enlaces [7,8]. Es interesante resaltar que se trata de redes muy alejadas de sus equivalentes aleatorias ya que muestran diferencias en su Fundamentos de la Biología Sintética 21 ECUACIÓN DE HILL Un modelo matemático de un circuito genético sintético debe ser predictivo, es decir, debe ser capaz de prever cómo cambia la dinámica del circuito variando las condiciones iniciales (concentraciones de especies y valores de parámetros cinéticos) del circuito [21]. Las ecuaciones diferenciales ordinarias que describen cómo cambian las concentraciones de las especies con el tiempo están conectadas a los flujos de las reacciones bioquímicas. La cinética de acción de masas permite la definición de modelos muy detallados (mecánicos). Sin embargo, exige el conocimiento de muchos parámetros cinéticos que no son fáciles de medir. Las funciones de Hill simplifican la representación de ciertas interacciones, como la activación y la represión de promotores. Se caracterizan esencialmente por dos parámetros: el coeficiente de Hill o de cooperatividad y la constante de Hill. Ambos pueden estimarse con bastante facilidad a partir de datos experimentales. La cinética de Michaelis-Menten se corresponde con una función de Hill en ausencia de cooperatividad. Un problema con la ecuación de Michaelis – Menten es la lenta respuesta de la variación en la concentración del sustrato comparada con la respuesta que se ve en experimentos reales. Este problema es abordado mediante la ecuación de Hill. La ecuación de Hill se puede deducir de un modelo donde un factor de transcripción 𝑆 puede unirse a una proteína de ARN polimerasa 𝑃 en múltiples n – sitios. Usando la cinética de acción de masas 𝑃+𝑛𝑆2Z → 2[ ←𝑃𝑆•. (35) A partir de la ley de acción de masas la constante de disociación para el complejo 𝑃𝑆• en el equilibrio viene dada por 𝐾h=𝑘/ 𝑘,=[𝑃][𝑆]• [𝑃𝑆•]. (36) La tasa de recepción de la proteína de ARN polimerasa 𝑃 es la ecuación de Hill y viene dada por 𝜃=𝑅𝑒𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟>𝑜𝑐𝑢𝑝𝑎𝑑𝑜 𝑅𝑒𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟>𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 =[𝑃𝑆•] [𝑃]+[𝑃𝑆•]=[𝑃][𝑆]• 𝐾h [𝑃]+[𝑃][𝑆]• 𝐾h=[𝑆]• 𝐾h+[𝑆]• =[𝑆]• (𝐾ˆ)•+[𝑆]•=1 ‰𝐾ˆ [𝑆]Š•+1 (37) Fundamentos de la Biología Sintética 22 donde 𝐾ˆ , denominada la constante de disociación microscópica, es la concentración del factor de transcripción 𝑆 para la cual la tasa de recepción de la proteína equivale a 12 ⁄ y 𝑛 es el coeficiente de Hill o de cooperatividad que, según su valor, pueden darse tres casos: cooperatividad positiva, negativa, o nula. Debido al carácter enzimático de la ARNp [𝑃]+[𝑃𝑆•]=[𝑃g]=𝑐𝑡𝑒 (38) por lo que [ 𝑃𝑆• ] se puede expresar como [𝑃𝑆•]=𝑃g𝜃=𝑃g1 ‰𝐾ˆ [𝑆]Š•+1 (39) COOPERATIVIDAD POSITIVA: ( 𝑛>1 ) En el caso de que 𝑆 sea activador y active la transcripción de 𝑋 , la ecuación de Hill toma la forma 𝑃+𝑛𝑆2Z → 2[ ←𝑃𝑆•2\ →𝑋+𝑃. (40) 𝑑𝑋 𝑑𝑡=𝑘f[𝑃g][𝑆]• (𝐾ˆ)•+[𝑆]•=𝑉klm [𝑆]• (𝐾ˆ)•+[𝑆]• (41) donde 𝑉klm es el nivel máximo de la proteína 𝑋 que se puede obtener, lo cual ocurre cuando el factor de transcripción 𝑆 activador se encuentra en concentraciones muy altas. A esta tasa de producción se le puede añadir el decrecimiento 𝛿𝑋 debido a la degradación de la proteína 𝑋 por motivo de su vida limitada 𝑑𝑋 𝑑𝑡=𝑉klm [𝑆]• (𝐾ˆ)•+[𝑆]•−𝛿𝑋 (42) donde 𝛿 es la denominada tasa de degradación. El parámetro 𝐾ˆ se denomina coeficiente de activación o constante de Hill, y se corresponde con el nivel del factor de transcripción necesario para obtener la mitad del valor máximo de la proteína 𝑋 , y el parámetro 𝑛 es el denominado coeficiente de Hill, que regula la transición entre tasas de transcripción altas y bajas, dando una medida de la ultrasensibilidad de la curva. Fundamentos de la Biología Sintética 29 Con estas condiciones la ecuación se transforma en 𝛽𝛾𝛼/H’‘𝛼,’=1. (74) Usando de nuevo logaritmos 𝑙𝑛𝛼,≈𝛽𝑙𝑛𝛼/. (75) Las nuliclinas del sistema intersectan tres veces: dos puntos estables y uno inestable, creando biestabilidad debido a la forma sigmoide proporcionada por los coeficientes de Hill 𝛽 y 𝛾 , que deben ser mayores que la unidad. Para que se produzca biestabilidad las velocidades de síntesis de ambos represores deben igualarse [24]. Si no existe dicho equilibrio las nuliclinas intersectan solo una vez produciendo monoestabilidad. FIGURA 6. IZQUIERDA: NULICLINAS DEL SISTEMA TOGGLE – SWITCH MOSTRANDO BIESTABILIDAD CON LOS PARÁMETROS 𝜶𝟏= 𝟒 , 𝜷=𝟑 Y 𝜶𝟐=𝟒 , 𝜸=𝟑 . EN VERDE LOS PUNTOS DE EQUILIBRIO ESTABLES Y EN ROJO EL INESTABLE. DERECHA: NULICLINAS DEL SISTEMA TOGGLE – SWITCH MOSTRANDO MONOESTABILIDAD CON LOS PARÁMETROS 𝜶𝟏=𝟑 , 𝜷=𝟏 Y 𝜶𝟐=𝟑 , 𝜸=𝟐 . EN VERDE EL PUNTO DE EQUILIBRIO ESTABLE. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. En el caso biestable, un interruptor con condición inicial por encima de la línea separatriz tenderá a situarse en el estado estable situado cerca del eje de ordenadas, mientras que un interruptor con condición inicial por debajo de la línea separatriz tenderá a situarse en el estado estable situado cerca del eje de abscisas. La región biestable es directamente proporcional al valor de los coeficientes de Hill (ver figura 7). Valores altos de ambos coeficientes proporcionan robustez al sistema, haciendo que promotores más débiles o con mayor cooperatividad negativa alcancen la biestabilidad en regiones más amplias. Fundamentos de la Biología Sintética 39 Con estas condiciones la ecuación se transforma en ªºV/H∫πV,∫= 1. (100) Usando de nuevo logaritmos ≥!V,≈ª≥!V/. (101) Las nuliclinas del sistema intersectan tres veces: dos puntos estables y uno inestable, creando biestabilidad debido a la forma sigmoide proporcionada por los coeficientes de Hill ª y º, que deben ser mayores que la unidad. Para que se produzca biestabilidad las velocidades de síntesis de ambos represores deben igualarse [33]. Si no existe dicho equilibrio las nuliclinas intersectan solo una vez produciendo monoestabilidad. FIGURA 6. NULICLINAS DEL SISTEMA TOGGLE – SWITCH MOSTRANDO BIESTABILIDAD CON LOS PARÁMETROS ’÷= ◊, ÿ = Ÿ Y ’⁄= ◊, € = Ÿ. EN VERDE LOS PUNTOS DE EQUILIBRIO ESTABLES Y EN ROJO EL INESTABLE. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. 0 1 2 3 4 5 Transcripción de u 0 1 2 3 4 5 Transcripción de v Separatriz dv/dt = 0 du/dt = 0 0 1 2 3 4 5 Transcripción de u 0 1 2 3 4 5 Transcripción de v dv/dt = 0 du/dt = 0 Fundamentos de la Biología Sintética 39 Con estas condiciones la ecuación se transforma en ªºV/H∫πV,∫= 1. (100) Usando de nuevo logaritmos ≥!V,≈ª≥!V/. (101) Las nuliclinas del sistema intersectan tres veces: dos puntos estables y uno inestable, creando biestabilidad debido a la forma sigmoide proporcionada por los coeficientes de Hill ª y º, que deben ser mayores que la unidad. Para que se produzca biestabilidad las velocidades de síntesis de ambos represores deben igualarse [33]. Si no existe dicho equilibrio las nuliclinas intersectan solo una vez produciendo monoestabilidad. FIGURA 6. NULICLINAS DEL SISTEMA TOGGLE – SWITCH MOSTRANDO BIESTABILIDAD CON LOS PARÁMETROS ’÷= ◊, ÿ = Ÿ Y ’⁄= ◊, € = Ÿ. EN VERDE LOS PUNTOS DE EQUILIBRIO ESTABLES Y EN ROJO EL INESTABLE. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. 012345 Transcripción de u 0 1 2 3 4 5 Transcripción de v Separatriz dv/dt = 0 du/dt = 0 012345 Transcripción de u 0 1 2 3 4 5 Transcripción de v dv/dt = 0 du/dt = 0 Fundamentos de la Biología Sintética 30 FIGURA 7. EL ÁREA ENTRE LAS LÍNEAS QUE COMPARTEN CONSTANTES DEL MISMO VALOR MUESTRA LAS REGIONES DONDE EL SISTEMA EXHIBE BIESTABILIDAD. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. EXPERIMENTO DE TIMOTHY S. GARDNER, CHARLES R. CANTOR Y JAMES J. COLLINS [3] Los plásmidos (Joshua Lederberg 1952 [25] ) son moléculas de ADN extracromosómico generalmente circulares que se replican y transmiten independientemente del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y, en algunas ocasiones, en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 3000 a 10000 pares de bases. Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética debido a su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal y porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas en ellos. ILUSTRACIÓN 15. ESQUEMA DEL ADN Y LOS PLÁSMIDOS EN EL INTERIOR DE UNA BACTERIA. FUENTE: IMAGEN DE USO LIBRE. El interruptor genético Toggle – Switch se compone de un plásmido. En el experimento, se construyeron dos tipos de plásmidos: el pTAK y el pIKE. Para uno de los pares promotor – represor ambos tipos usaron el represor LacI extaído de la bacteria E. coli junto con el promotor Ptrc-2. Para el otro par represor – promotor (P1 y R1: ver ilustración 16, derecha arriba) el pTAK usó el promotor PLs1 con el represor CI-ts del 0 2 4 6 ln 2 0 1 2 3 4 5 6 ln 1 = = 3 = = 3 = = 2 = = 2 = = 1.1 = = 1.1 Fundamentos de la Biología Sintética 31 fago l y sensible a la temperatura, y el pIKE usó el promotor PLtetO-1 con el represor TetR del transposón Tn10. El plásmido pTAK exhibe su biestabilidad cambiando de un estado a otro mediante un pulso de IPTG (Isopropil-ß-D-tiogalactósido) o un pulso térmico y el plásmido pIKE exhibe su biestabilidad cambiando de un estado a otro mediante un pulso de IPTG o un pulso de aTc (anhidrotetraciclina). En ambos plásmidos, la transcripción del Ptrc-2 que resulta en la represión del promotor P1, da lugar a la expresión del gen gfpmut3 que produce la proteína marcadora GFP anteriormente nombrada. A este estado del plásmido se le denomina “high state” y al estado en el que la transcripción de P1 reprime a Ptrc-2 se le denomina “low state”. Para investigar las condiciones de biestabilidad, en el experimento se crean 6 tipos de plásmidos: cuatro plásmidos pTAK y dos plásmidos pIKE. Estos fueron construidos insertando secuencias RBS de distintas características en el sitio del plásmido RBS1 del interruptor genético (ver ilustración 16, derecha arriba). También se incluyen diversos plásmidos de control, que ayudan a garantizar que el fenómeno observado en el experimento esté específicamente asociado con la variable independiente usada y no con algún otro factor no deseado. En los resultados, los 4 plásmidos pTAK exhiben biestabilidad mientras que solo uno de los plásmidos pIKE, el pIKE107 lo hace. En el experimento los interruptores genéticos Toggle – Switch y los plásmidos de control se introducen en la cepa JM2.300 de la bacteria E. coli y duró un total de 23.5 horas. 1) Primeras 6 horas Las células crecen con 2>𝑚𝑀 de IPTG produciéndose la expresión de la GFP en todos los interruptores genéticos y en el plásmido de control pTAK102 inducible por IPTG. 2) De 6 a 11 horas Las células crecen sin IPTG: a 42 𝐶 ∘ crecen los pTAK y en presencia de 500>𝑛𝑔>𝑚𝑙H, crecen los pIKE. Los 5 interruptores biestables, los cuales han cambiado al “high state” continúan expresando la GFP en ausencia de inductor IPTG, mientras que el plásmido de control pTAK102 y el plásmido pIKE105 monoestable vuelven al “low state”. 3) De 11 a 18 horas Tras 7 horas de crecimiento la expresión de la GFP se anula en todos los interruptores genéticos mientras que en el plásmido de control pTAK106 Fundamentos de la Biología Sintética 32 inducido por calor y en el plásmido de control pIKE108 inducido por aTc la expresión de la GFP se activa. 4) De 18 a 23.5 horas Tras 5.5 horas los interruptores genéticos biestables regresan al “low state” mientras que los plásmidos de control pTAK106 y pIKE108 vuelven a su estado de no inducción. ESTABILIDAD A LARGO PLAZO Un cultivo celular con el plásmido pTAK117 inicialmente en el “low state” se divide en dos cultivos. El primer grupo crece en un medio sin inducción mientras que el segundo crece en un medio con 2>𝑚𝑀 de IPTG alcanzando el “high state”. Tras 6 horas de crecimiento, ambos cultivos se colocan en un medio sin inductores. Los dos grupos siguen creciendo durante 22 horas más en las que permanecen estables en sus respectivos estados. ILUSTRACIÓN 16. IZQUIERDA. EL SOMBREADO GRIS INDICA LOS PERÍODOS DE INDUCCIÓN: (a) PLÁSMIDOS pTAK Y DE CONTROL. (b) PLÁSMIDOS pIKE Y DE CONTROL. (c) PLÁSMIDO pTAK117. DEMOSTRACIÓN DE LA BIESTABILIDAD A LARGO PLAZO. EL MODELO VARÍA ENTRE LOS ESTADOS POR UN PULSO DE IPTG. DERECHA ARRIBA: PLÁSMIDO DEL INTERRUPTOR GENÉTICO TOGGLE SWITCH.T1 Y T2 SON LOS TERMINADORES. DERECHA ABAJO. PLÁSMIDO pTAK117. (a y b) FRACCIÓN DE LAS CÉLULAS QUE ESTÁN EN EL “HIGH STATE” EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE INDUCCIÓN. ENTRE 3 Y 4 HORAS TARDA EL SISTEMA EN EMPEZAR A OSCILAR. (c) CÉLULAS VARIANDO POR INDUCCIÓN DE IPTG DEL “LOW STATE” AL “HIGH STATE” MARCADAS CON GFP. Fundamentos de la Biología Sintética 43 ILUSTRACIÓN 17. DEMOSTRACIÓN DE LA BIESTABILIDAD A LARGO PLAZO DE LOS ESTADOS. EL SOMBREADO GRIS INDICA LOS PERÍODOS DE INDUCCIÓN TÉRMICA. EL MODELO VARÍA ENTRE LOS ESTADOS POR UN PULSO DE IPTG. FUENTE: [3] ILUSTRACIÓN 18. EL PLÁSMIDO PTAK117 VARIANDO CON EL TIEMPO. (a y b): FRACCIÓN DE CÉLULAS EN UNO DE LOS PUNTOS ESTABLES RESPECTO AL TIEMPO DE INDUCCIÓN. ENTRE 3 Y 4 HORAS TARDA EL SISTEMA DEL EXPERIMENTO EN EMPEZAR A OSCILAR (c): CÉ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También se añade un plásmido cuya función es informar del estado del sistema, donde el nivel de la molécula marcadora GFP es inhibido por una de las proteínas del plásmido principal: TetR. La ausencia de fluorescencia queda asociada a concentraciones altas de TetR. ILUSTRACIÓN 17. ESQUEMA DEL SISTEMA REPRESILADOR. FUENTE: [13] MODELO MATEMÁTICO La velocidad de producción de ARNm se puede expresar como la suma de la tasa proporcionada por inhibidores y la tasa proporcionada por activadores 𝑑𝑚 𝑑𝑡=𝛼<•»1 1+•𝑝𝐾ž•+𝛼l¼½ •𝑝𝐾ž• •𝑝𝐾ž•+1>. (76) En este caso, el sistema Represilador está compuesto por genes en represión mutua, por lo que solo se usa la parte inhibidora a la que hay que añadir la tasa del nivel basal 𝛼g (45) y la tasa de degradación celular 𝜇𝑚 (42) 𝑑𝑚 𝑑𝑡=𝛼<•»1 1+ • 𝑝𝐾 ž •+𝛼g−𝜇𝑚 ( 77 ) El Sistema Represilador viene dado por seis ecuaciones diferenciales acopladas 𝑆𝑖𝑠𝑡𝑒𝑚𝑎>5> ⎩ ⎪ ⎨ ⎪ ⎧ 𝑑𝑚< 𝑑𝑡 =𝛼<1 1+ • 𝑝= 𝐾 ž •+𝛼g−𝜇𝑚< 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛾𝑚<−𝜆𝑝< 𝑖,𝑗=1,2,3>>>>𝑖≠𝑗 Redes genéticas sintéticas: de lo simple a lo complejo 31 http://www.rsef.org REF Octubre 2007 cargo de la RNA polimerasa, como el proceso de traducción del mRNA para dar lugar a la formación de la cadena polipeptídica correspondiente. Finalmente los parámetros a y g son los coeficientes de Hill que cuantifican la capacidad de represión de ambas proteínas inhibidoras, de manera que cuanto mayores sean sus valores, mayor es la represión de los factores de transcripción. Figura 5. Espacio de fases del modelo del “toggle switch”. En azul claro tenemos la nulclina correspondiente al nivel de proteína A. La nulclina verde corresponde al nivel de proteína B. Las intersecciones de estas dos nulclinas corresponden a los puntos de equilibrio del sistema. Un análisis de la estabilidad del sistema nos permite distinguir entre dos estados que serán estables (puntos en verde) y uno inestable (punto en rojo). En los dos estados estables domina la actividad de uno de los genes, mientras el otro permanece silenciado. Una vez obtenido el modelo es posible predecir cual será el comportamiento del nivel de proteínas y si una de ellas dominará sobre la otra o viceversa. En la Fig. 5 podemos observar las nulclinas de la Ecs. 3-(a) y 3-(b), obtenidas al igualar ambas derivadas a 0, o lo que es lo mismo, imponiendo en las ecuaciones que el nivel de ambas proteínas se mantenga constante. Podemos observar que ambas nulclinas se cortan en tres puntos, que nos darán los tres estados en los que ambos niveles de proteínas no varían y por lo tanto los puntos donde el sistema se mantiene en un mismo estado. De los tres puntos, uno de ellos es inestable, por lo que solamente existen dos estados posibles en el sistema. En el primero de ellos, la proteína A se mantiene en un nivel alto, mientras que la concentración de B es prácticamente nula. El segundo estado posible es idéntico al anterior pero con los niveles de proteínas intercambiados. El estudio analítico, que se puede desarrollar en mayor profundidad estudiando por ejemplo la influencia de los parámetros b1, b2, a y g, nos dice que los dos estados estables son posibles y por lo tanto se mantienen en el tiempo. De esta manera podemos considerar la red genética no solo como un interruptor (ON/OFF) sino también como una unidad binaria de memoria. Así sería posible desarrollar tanto interruptores biológicos que sean capaces de controlar funciones celulares, como memorias biológicas para almacenar información dentro de la célula. Por lo tanto, el desarrollo de este tipo de redes genéticas nos depara grandes expectativas a desarrollar en un futuro no muy lejano. Se ha descrito otro tipo de red genética sintética, similar a la anterior, pero en este caso capaz de realizar una función totalmente distinta. En el mismo número de la revista Nature donde se publicaron los resultados del primer interruptor genético, Elowitz y Leibler [1] presentan el diseño de una red genética sintética formada por tres genes en represión mutua y que se conoce como represilador. Al igual que Gardner et al., modifican genéticamente la bacteria E. coli con un ADN sintético que en este caso incluye tres genes que codifican factores de transcripción que, en cada caso, inhiben al gen que se encuentra a continuación en la cadena. La Fig. 6 muestra esquemáticamente la estructura del ADN sintético con los tres genes represores. También se incluye un plásmido cuya función es informar del estado del sistema, donde el nivel de GFP está en este caso inhibido por una de las proteínas (TetR) del plásmido principal. De esta manera, niveles bajos de fluorescencia indicarán la existencia de una alta concentración de la proteína TetR. Figura 6. Esquema simplificado de la red genética formada por el “represilador”. En esta red cada gen esta controlado por su predecesor, o dicho de otro modo el producto de cada gen inhibe la transcripción del gen siguiente. Esta inhibición en cadena cerrada produce una oscilación de las proteínas de cada gen, obteniendo un desfase de 2p/3 radianes entre cada una de las proteínas. Al igual que en el caso anterior, es posible obtener un modelo matemático del represilador. En este caso las variables de nuestro sistema de ecuaciones diferenciales serán la concentración del RNA mensajero mi, es decir el producto de la transcripción de un determinado gen, y la concentración de la proteína correspondiente pi después del proceso de traducción. De esta manera obtenemos dos ecuaciones para cada uno de los genes, y por lo tanto un total de seis ecuaciones diferenciales ordinarias. Nótese que en el caso del interruptor genético, la distinción entre el mRNA y la proteína correspondiente se simplificó, al no ser necesaria para describir la dinámica del sistema. Los tres pares de ecuaciones serán por lo tanto: [Ec. 4-(a)] [Ec. 4-(b)] Donde i,j=1..3, siendo los subíndices i y j dos genes sucesivos en la cadena de ADN circular. El factor b corresponde con la tasa de promoción en ausencia de represor, mientras que b0, de valor cercano a cero, representa la tasa de transcripción cuando la proteína inhibidora se haya en saturación1. 1 Es posible que aún en presencia de niveles elevados del factor de transcripción inhibidor, el gen presente todavía niveles detectables de transcripción del mRNA. dt dm mp1 i j 0 =-+++ bb a dt dp p m i i i =-+- c _ i dt dp p m i i i =-+- c _ i Fundamentos de la Biología Sintética 34 donde 𝛼< equivale a 𝛼<•» , 𝑝< y 𝑚< son las proteínas y sus respectivos ARNm cuyos subíndices 𝑖=1,2,3 representan los 3 genes que participan en el sistema (LacI extraído de la bacteria E.coli, TetR del transposón Tn10 y Cl del fago 𝜆 ) y 𝑗=3,1,2 es un subíndice para acoplar el sistema. Tomando 𝜇=1 , igualando 𝛾=𝜆 y haciendo que el resto de constantes sean iguales para las distintas proteínas y ARNm se obtiene el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales acopladas, en el cual el tiempo ha sido reescalado en unidades del tiempo de vida del ARNm, la concentración de las proteínas ha sido reescalada en unidades de la constante 𝐾 y la concentración de los ARNm ha sido reescalada en la eficiencia de traducción, es decir, el número medio de proteínas producidas por molécula de ARNm. 𝑆𝑖𝑠𝑡𝑒𝑚𝑎>6> ⎩ ⎪ ⎨ ⎪ ⎧ 𝑑𝑚< 𝑑𝑡 =𝛼 1 1+𝑝=•+𝛼g−𝑚< 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛽(𝑚<−𝑝<) 𝑖,𝑗=1,2,3>>>>𝑖≠𝑗 donde 𝛼 representa la máxima producción o velocidad de transcripción del ARNm en ausencia de represión y 𝛽 es una constante que da la proporción entre las velocidades de decaimiento o degradación de las proteínas y las del ARNm. En este modelo no se tiene en cuenta la unión de los factores de transcripción con los promotores, suponiendo que ocurren en un tiempo suficientemente rápido como para no ser incluido explícitamente. ILUSTRACIÓN 18. ARRIBA IZQUIERDA: (a) y (b): INSTANTÁNEAS DEL CRECIMIENTO DE UNA COLONIA DE E. COLI CON EL PLÁSMIDO REPRESILADOR. LA ESCALA ES DE 𝟒>𝝁𝒎 (a) MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. (b) MICROSCOPIO ÓPTICO. (c) PICOS DE GFP A LO LARGO DEL TIEMPO EN EL EXPERIMENTO. ARRIBA DERECHA: ESQUEMA GENÉTICO DEL PLÁSMIDO REPRESILADOR Y ESQUEMA DEL PLÁSMIDO REPORTERO GFP. FUENTE: [4]. ABAJO DERECHA: ESQUEMA TIPO CICLO DEL SISTEMA REPRESILADOR. FUENTE: [26] Fundamentos de la Biología Sintética 45 reescalada en la eficiencia de traducción, es decir, el número medio de proteínas producidas por molécula de ARNm. -`+K|zy(5( ⎩ ⎪ ⎨ ⎪ ⎧ Jz< JK =V 1 1+7=o+Vv−z< J7< JK =ª(z<−7<) `,fi=1,2,3((((`≠fi donde V representa la máxima producción o velocidad de transcripción del ARNm en ausencia de represión y ª es una constante que da la proporción entre las velocidades de decaimiento o degradación de las proteínas y las del ARNm. En este modelo no se tiene en cuenta la unión de los factores de transcripción con los promotores, suponiendo que ocurren en un tiempo suficientemente rápido como para no ser incluido explícitamente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`8 5D8 >:6798> :E J695645@:3> @3 5D8 78N78>>@=45:7 43A :5D87 A8>@C38A 3851:7G>2 ^3 N475@96=47I =:3C87 8VN87@;835> N87E:7;8A 63A87 9D8;:>545@9 9:3F A@5@:3> >D:6=A 834R=8 ;:78 9:;N=858 >545@>5@94= 9D4749587@`45@:3 :E Tet R LacI λ cI Repressilator Reporter Tet R GFP a PLlac01 PLtet01 PLtet01 pSC101 origin ColE1 tetR-lite gfp-aav lacI-lite λ cI-lite ampR kanR λPR !"#$%& ' !"#$%&'(%)"#* +,$)-# .#+ $)/'0.%)"# "1 %2, &,3&,$$)0.%"&4 (* 52, &,3&,$$)0.%"& #,%6"&74 52, &,3&,$$)0.%"& )$ . 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Verdugo DOI: 10.4236/ajcm.2018.82011 139 American Journal of Computational Mathematics Figure 1. Repressilator network diagram. The first protein, 1 p , represses production of the second protein, 2 p , the second represses production of the third, 3 p , and the third represses production of the first. These repressions occur at the transcriptional level, where mRNA i m is repressed by protein i j p for 1, 2, 3i= and i j defined as 1 3j= , 2 1j= , and 32j= . The feedback loop is characterized by nonlinear transcriptional interactions and the six-dimensional ODE model associated to the network is given in Equations (1) and (2). Here the arrow ( ↑ ) represents production and the perpendicular symbol ( ⊥ ) represents repression. theoretical work by studying the direction and stability of the periodic solutions of the model. In this work we study the periodic solutions of the repressilator by means of a bifurcation analysis. In Section 2 we compute the steady state solutions and show that these undergo a transition from stable to unstable giving rise to a limit-cycle born in a Hopf bifurcation. In Section 3 we present a nonlinear analysis of the equations, which involves a center manifold reduction on the six-dimensional system. The latter yields closed form expressions for the steady state, frequency, and amplitude of the oscillation, all of which are analyzed through a parameter study in Section 5 and confirmed in a numerical continuation analysis in Section 6. In Section 7 we present our conclusions and discuss the biological significance of our results. 2. Linear Stability Analysis of the Equilibrium Solution We start our analysis by showing that Equations (1)-(2) have at least one biologically significant equilibrium solution. The equilibria are found by setting dd0 dd ii pm tt == . This gives () * 0 * 0 1 in j m p αα =− + + + (3) Fundamentos de la Biología Sintética 35 ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD Y OSCILACIONES Para estudiar el carácter oscilatorio del sistema primeramente se reduce la dimensión suponiendo que la dinámica del ARNm está en cuasi-equilibrio 𝑚<=𝛼 1 1+𝑝=•+𝛼g. ( 78 ) Prescindiendo del nivel basal 𝛼g suponiendo que este es suficientemente pequeño se tiene 𝑚<=𝛼 1 1+𝑝=•. (79) Sustituyendo (79) en la dinámica de las proteínas y haciendo 𝛽=1 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛼 1 1+𝑝=•−𝑝<. (80) Las nuliclinas del sistema tienen la forma 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛼 1 1+𝑝=•−𝑝<=0 (81) Como los tres genes comparten las mismas constantes 𝑝=𝑝<=𝑝,=𝑝/=𝑝f=𝛼 1 1+𝑝•. (82) Como se hizo en la sección anterior del interruptor biológico Toggle – Switch se halla la matriz Jacobiana y su polinomio característico 𝐴=Ã−1 0 𝑋 𝑋 −1 0 0 𝑋 −1Ä (83) 𝑋=−𝛼𝑛𝑝•H, (1+𝑝•)/ (84) 𝐷𝑒𝑡(𝐴−𝜆𝐼)=−(1+𝜆)f+𝑋f=0. (85) Fundamentos de la Biología Sintética 36 El resultado es un autovalor real y dos autovalores complejos conjugados 𝜆,=𝑋−1 (86) 𝜆/=−‰1+12𝑋Š+𝑖√3 2𝑋 (87) 𝜆f=−‰1+12𝑋Š−𝑖√3 2𝑋. (88) Para que el punto crítico sea estable la parte real de los autovalores debe ser negativa 𝑋−1<0→𝑋<1 (89) −‰1+12𝑋Š<0→𝑋>−2. (90) La condición de estabilidad queda como −2<𝑋<1 ( 91 ) y como por definición 𝑋 es siempre negativo 𝛼𝑛𝑝•H, (1+𝑝•)/<2. ( 92 ) Según Kutnezov y Buse [27] , todas las trayectorias son absorbidas por un cubo, es decir, existe una región finita del espacio fásico 𝐶 que atrae todas las trayectorias. Cuando 𝑝<=0 , la tasa de la proteína es positiva 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛼<1 1+𝑝=•>0. (93) Cuando 𝑝<=𝛼 , la tasa de la proteína es negativa 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=𝛼< P 1 1+𝑝=•−1 T <0. ( 94 ) Si 𝑝<>𝛼 la derivada no llegará a ser mayor que un cierto valor 𝜀 Fundamentos de la Biología Sintética 37 𝑑𝑝 𝑑𝑡≤𝜀<0. (95) Como resultado de ello, la proteína 𝑝< queda atrapada en el intervalo ( 0,𝛼 ) y por tanto el cubo es formado por las tres proteínas que forman el sistema Represilador. Si se introducen en el sistema distintas constantes 𝛼< , la región sería un paralelogramo de lados 𝛼,,𝛼/,𝛼f en lugar de un cubo. Las nuliclinas vienen expresadas por ( [27] y [28] ) 𝑆𝑖𝑠𝑡𝑒𝑚𝑎>7> ⎩ ⎪ ⎨ ⎪ ⎧ 𝑁m= È 𝛼 1+𝑦•=𝑥 ËÌ 𝐶 𝑁Í= « 𝛼 1+𝑧•=𝑦 ÏÌ 𝐶 𝑁Ð= « 𝛼 1+𝑥•=𝑧 ÏÌ 𝐶 FIGURA 8. LA INTERSECCIÓN DE LAS NULICLINAS DEL SISTEMA 7 ES UN PUNTO DE COLOR ROSA EN EL CENTRO DE LA FIGURA, LA CUAL SE HA OBTENIDO CON LOS PARÁMETROS 𝜶=𝟒 Y 𝒏=𝟑 . FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. La mejor demostración de la existencia de esta región absorbente es la dominación de la degradación frente a la síntesis para altas concentraciones de los componentes: la síntesis, representada por el término no lineal, siempre se mantiene por debajo de 𝛼 mientras que la degradación puede crecer sin saturación. El único estado de equilibrio del sistema es inestable para valores grandes de 𝛼< . La simetría del sistema obliga al equilibrio a pertenecer a la diagonal Ò 𝑁m=𝑁Í=𝑁Ð Ó. Entonces, la ubicación del estado de equilibrio es ( 𝑟,𝑟,𝑟 ) donde 𝑟 viene dado por 𝑟= 𝛼 1+𝑟•. (96) Fundamentos de la Biología Sintética 38 A partir de (96) se obtiene 𝑟•²,+𝑟−𝛼=0. (97) El sistema linealizado en equilibrio queda como 𝑑𝑝< 𝑑𝑡=−𝑛𝑟•𝑝< 1+𝑟•−𝑝<=−𝑝<‰𝑛𝑟• 1+𝑟•+1Š (98) A partir de la matriz Jacobiana se halla su polinomio característico 𝐴=Ã𝑌 0 0 0 𝑌 0 0 0 𝑌Ä (99) 𝑌=−‰𝑛𝑟• 1+𝑟•+1Š (100) det(𝐴−𝜆𝐼)=−‰𝑛𝑟• 1+𝑟•+1+𝜆Šf=0 (101) Se obtiene un autovalor real y dos autovalores complejos conjugados 𝜆,=− 𝑛𝑟• 1+𝑟•−1 (102) 𝜆/,f=Ö𝑐𝑜𝑠•𝜋3ž±𝑖𝑠𝑒𝑛•±𝜋3žØ𝑛𝑟• 1+𝑟•−1 =‰𝑛2𝑟• 1+𝑟•−1Š±𝑖P√3𝑛 2𝑟• 1+𝑟•T. (103) El valor del autovalor 𝜆, es siempre negativo mientras que la parte real de 𝜆/,f está contenida entre dos valores: −1 y ( 𝑛2 ⁄) −1 . Particularmente 𝑅𝑒(𝜆/,f)<0 para 𝑛≤2. ( 104 ) Para 𝑛>2 existe un valor 𝑟=𝑟g= Ù 2(𝑛−2) ⁄ Ú para el cual 𝑅𝑒(𝜆/,f)<0 si 𝑟<𝑟g y 𝑅𝑒(𝜆/,f)>0 si 𝑟>𝑟g . Por tanto, la estabilidad del estado de equilibrio depende de 𝛼 . Fundamentos de la Biología Sintética 45 proteína CI. Teniendo en cuenta también la degradación intracelular del AI y su difusión hacia o desde el espacio intercelular, la dinámica de 𝑆2 viene dada por la expresión anterior 𝑑𝑆2 𝑑𝑡=−𝑘ëg𝑆2+𝑘ë,𝑝f,2−𝜂(𝑆2−𝑆í) (120) donde el coeficiente de difusión que viene dado por 𝜂=𝜎𝐴 𝑉¼=𝛿 𝑉¼ (121) depende de la permeabilidad de la membrana representada por 𝜎 , siendo 𝐴 el área de la membrana y 𝑉¼ el volumen por célula; 𝑘ëg y 𝑘ë, son las constantes cinéticas de degradación y síntesis respectivamente. La concentración de las moléculas extracelulares de AI viene dada por 𝑆í , cuya dinámica es 𝑑𝑆í 𝑑𝑡=−𝑘ëí𝑆í+𝜂ím½ó(𝑆2−𝑆í) 1 2S, =−𝑘ëí𝑆í+𝑘h<@(𝑆ô−𝑆í) (122) donde el coeficiente de difusión viene dado en este caso por 𝑘h<@=𝜂ím½𝑁 y la constante cinética de degradación es 𝑘ëí . Debido a la rápida difusión de las moléculas extracelulares AI en comparación con el período del Represilador es posible aplicar a la dinámica de las moléculas externas AI la aproximación del cuasi estado de equilibrio quedando su concentración como 𝑆í=𝑄𝑆ô=𝑄1 𝑁ó𝑆< 1 <S, =𝑘h<@ 𝑘h<@+𝑘ëí𝑆ô (123) donde 𝑄 es el denominado parámetro de acoplamiento, el cual depende de la densidad celular 𝑁(𝑉¼+𝑉ím½)≈𝑁𝑉ím½ ⁄⁄ y viene dado por 𝑄= (𝛿𝑁𝑉ím½ ⁄) (𝑘ëí+𝛿𝑁𝑉ím½ ⁄) (124) donde 𝑁 es el número de células, 𝑉ím½ es el volumen total extracelular, 𝑘ëí es la constante cinética de degradación de las AI extracelulares y 𝛿 es el producto del área con la permeabilidad de la membrana. Fundamentos de la Biología Sintética 46 El parámetro de acoplamiento 𝑄 depende de manera lineal y proporcional de la densidad celular suponiendo que esta es mucho más pequeña que el coeficiente de degradación 𝑘ëí . El parámetro de acoplamiento 𝑄 toma valores en el intervalo ( 0,1 ), es proporcional a la densidad celular y puede ser controlado en experimentos variando el volumen total de la colonia. En experimentos de simulación se convierte en un parámetro variable para estudiar el acoplamiento celular en distintas condiciones externas. En el hipotético caso en el que 𝑄=0 se tiene una disolución infinita: el volumen extracelular tiende a infinito lim vùúû→ü𝑄= lim vùúû→ü>(𝛿𝑁𝑉ím½ ⁄) (𝑘ëí+𝛿𝑁𝑉ím½ ⁄)=0 (125) Cada célula individual se comporta como un Represilador con un grado más de libertad añadido al espacio de las fases original de seis dimensiones para representar la dinámica de las AI intracelulares. Las oscilaciones en este caso no varían significativamente respecto a las oscilaciones de un sistema Represilador sin “quorum sensing”: el perfil de la onda no cambia, solo lo hace su amplitud. En las ecuaciones del Represilador y de la dinámica intracelular de los autoinductores el parámetro que afecta de manera más relevante a la frecuencia de las oscilaciones es el coeficiente de tiempo de vida 𝛽 . El cambio en la población celular se ha modelado considerando que 𝛽 es una cantidad no uniformemente distribuida entre los Represiladores y que sigue una distribución Gaussiana con desviación estándar ∆𝛽 . FIGURA 12. EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LA CONCENTRACIÓN DE LA PROTEÍNA ASOCIADA AL GEN Lacl del SISTEMA REPRESILADOR ACOPLADO A UN MECANISMO DE QUORUM SENSING PARA 10 CÉLULAS CON ∆𝜷=𝟎.𝟎𝟓> Y PARÁMETROS DE ACOPLAMIENTO 𝑸=𝟎.𝟏 , 𝑸=𝟎.𝟓 y 𝑸=𝟏 RESPECTIVAMENTE DE ARRIBA A ABAJO. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Tiempo 0 100 200 p1k 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Tiempo 0 100 200 p1k 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Tiempo 0 100 200 p1k Fundamentos de la Biología Sintética 47 FIGURA 13. TRANSFORMADA DE FOURIER DE LA CONCENTRACIÓN DE LA PROTEÍNA ASOCIADA AL GEN Lacl del SISTEMA REPRESILADOR ACOPLADO A UN MECANISMO DE QUORUM SENSING PARA 10 CÉLULAS CON ∆𝜷=𝟎.𝟎𝟓> Y PARÁMETROS DE ACOPLAMIENTO 𝑸=𝟎.𝟏 , 𝑸=𝟎.𝟓 y 𝑸=𝟏 RESPECTIVAMENTE DE ARRIBA A ABAJO. FUENTE: CÓDIGO MATLAB EN APÉNDICE A. ACTUALIDAD Aunque la Biología Sintética fue fundada originalmente como una disciplina de la Biofísica, en los últimos años ha crecido abarcando una gran comunidad interdisciplinaria. Es un campo en rápida evolución y hay muchas áreas interesantes y novedosas de investigación como sistemas reconstituidos in vitro, ecosistemas microbianos sintéticos y simulación computacional de células completas. Circuitos sintéticos que explotan el control de lo estocástico también se incluye entre las nuevas fronteras de la ingeniería. La Biología Sintética representa una gran esperanza al ofrecer posibles soluciones a muchos de los problemas más importantes del mundo, desde el hambre y la cura de enfermedades mortales hasta el desarrollo sostenible. Sin embargo, también existen posibilidades de uso en armas biológicas y diversos temas de bioseguridad. En el siglo XXI habrá muchos retos científicos y sociales relacionados directamente con la Biología Sintética [39]. Para poder abordarlos con éxito es clave la comprensión de cómo los sistemas sintéticos cooperan con los sistemas vivos de la naturaleza y la constante divulgación científica para evitar un uso inadecuado para la vida del ser humano en la Tierra. 0 10 20 30 40 50 60 70 Frecuencia 0 2 4 6 [p1( )] 104 0 10 20 30 40 50 60 70 Frecuencia 0 2 4 6 [p1( )] 104 0 10 20 30 40 50 60 70 Frecuencia 0 2 4 6 [p1( )] 104 Fundamentos de la Biología Sintética 48 CONCLUSIONES En este proyecto de fin de grado hemos presentado los modelos matemáticos de los sistemas Toggle – Switch y Represilador, ambos compuestos por sistemas de ecuaciones diferenciales acopladas no lineales, los cuales supusieron el comienzo de la Biología Sintética en el año 2000. Hemos demostrado y estudiado los términos no lineales provenientes de modelar reacciones bioquímicas que aparecen en los sistemas y se ha realizado un análisis matemático de estabilidad junto con simulaciones en código Matlab para obtener las soluciones numéricas. Al sistema Represilador se le ha dotado de “quorum sensing”, presentando el modelo matemático y haciendo un estudio de simulación en Matlab para 10 células. Entre los resultados numéricos hay planos de fase, evoluciones temporales y transformadas de Fourier, los cuales muestran las propiedades de las oscilaciones que caracterizan a los distintos sistemas estudiados. En este trabajo, basándonos en una revisión bibliográfica, también se han plasmado las características fundamentales de las reacciones bioquímicas y de la Regulación Génica partiendo de los nucleótidos: el Dogma Central de la Biología Molecular supone la base para entender la finalidad de los sistemas Toggle – Switch y Represilador. Finalmente, se ha descrito a la Biología Sintética como una disciplina que abordará muchos retos del ser humano en el siglo XXI. Fundamentos de la Biología Sintética 49 BIBLIOGRAFÍA [1] E. R Choffnes, D. A Relman, y R. Leslie Pray, «The Science and Applications of Synthetic and Systems Biology: Workshop Summary». Washington (DC): National Academies Press (US), 2015. [2] B. A. Bartley, K. Kim, J. K. Medley, y H. M. Sauro, «Synthetic Biology: Engineering Living Systems from Biophysical Principles», Biophys. J., vol. 112, pp. 1050-1058, 2017. [3] J. J. Collins, T. S. Gardner, y C. R. Cantor, «Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli», Nature, vol. 403, pp. 339-342, 2000. [4] M. B. Elowitz y S. Leibier, «A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators», Nature, vol. 403, pp. 335-338, 2000. [5] M. A. Marchisio, «Introduction in Synthetic Biology: About Modeling, Computation, and Circuit Design». 2018. [6] C. R. Gray y P. 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CÓDIGOS MATLAB % Pablo Salguero Quiros % Trabajo de Fin de Grado: Fundamentos de la Biologia Sintetica REACCIONES BIOQUÍMICAS FIGURA 1 function [ f ] = Michaelis( t,x ) % Dinámica de las ecuaciones de Michaelis – Menten. % La figura se obtiene usando ODE45. % Sustrato, enzima, producto y complejo. s = x(1); e = x(2); p = x(3); se = x(4); % Constantes de reacción y cantidad inicial de la enzima. k1 = 1; k2 = 1; k3 = 1; Eo = 1; % Sistema dinámico. dsdt = -k1*e*s+k2*(Eo-e) dedt = -k1*e*s+k2*(Eo-e)+k3*(Eo-e) dpdt = k3*(Eo-e) dsde = k1*s*e-k2*(Eo-e)-k3*(Eo-e); f = [dsdt;dedt;dpdt;dsde]; end FIGURA 2 % Ciclo de Activacion - Desactivacion de una proteina %% Para K chico K = 0.001; X = [0:0.001:1]; Fundamentos de la Biología Sintética 52 f = @(X) (X./(K+X)).*((K+(1-X))./(1-X)); f = f(X); plot(f,X) hold on %% Para K grande K = 1000; X = [0:0.001:1]; f = @(X) (X./(K+X)).*((K+(1-X))./(1-X)); f = f(X); plot(f,X) hold off REGULACIÓN GÉNICA FIGURAS 3, 4 Y 5 % Pablo Salguero Quiros % Trabajo de Fin de Grado: Fundamentos de la Biologia Sintetica % Funciones de Hill %% Promotor: figura 3 K = 1; Vmax = 1; S = [0:0.001:2]; n = 8; % Variar el coeficiente de Hill dPdt = @(S) Vmax*((S.^n)./((K.^n)+S.^n)); dPdt = dPdt(S); plot(S,dPdt) %% Represor: figura 4 K = 1; Vmax = 1; S = [0:0.001:2]; n = 8; % Variar el coeficiente de Hill dPdt = @(S) Vmax*(K./((K+S.^n))); dPdt = dPdt(S); plot(S,dPdt) Fundamentos de la Biología Sintética 53 % Figura 5: para n = 1 se obtiene la cinetica de Michaelis – Menten usando la dinámica de promotor. REDES GENÉTICAS SINTÉTICAS FIGURA 6 function [ f ] = Toggle( t,x,z ) % Parametros Alfa1 = z(1); n1 = z(2); Alfa2 = z(3); n2 = z(4); % Variables u = x(1); v = x(2); % Dinamica del Sistema Toggle - Switch dudt = (Alfa1./(1+v.^n1))-u; dvdt = (Alfa2./(1+u.^n2))-v; f = [dudt;dvdt]; end %% Toggle Switch: nuliclinas con biestabilidad Alfa1 = 4; Alfa2 = 4; n1 = 3; n2 = 3; [x,y] = meshgrid(0:0.2:5,0:0.2:5); dudt = (Alfa1./(1+y.^n1))-x; dvdt = (Alfa2./(1+x.^n2))-y; figure quiver(x,y,dudt,dvdt) hold on %% Curva 1 Alfa1 = 4; n1 = 3; v = [0:0.001:5]; Fundamentos de la Biología Sintética 54 u = @(v) (Alfa1./(1+v.^n1)); u = u(v); plot(v,u) %% Curva 2 Alfa2 = 4; n2 = 3; u = [0:0.001:5]; v = @(u) (Alfa2./(1+u.^n2)); v = v(u); plot(v,u) %% Linea separatriz x = [0:0.001:5]; y = @(x) x; y = y(x); hold on plot(x,y,'--') %% Toggle Switch: nuliclinas con monoestabilidad Alfa1 = 3; Alfa2 = 3; n1 = 1; n2 = 2; [x,y] = meshgrid(0:0.2:5,0:0.2:5); dudt = (Alfa1./(1+y.^n1))-x; dvdt = (Alfa2./(1+x.^n2))-y; figure quiver(x,y,dudt,dvdt) hold on %% Curva 1 Alfa1 = 3; n1 = 1; v = [0:0.001:5]; Fundamentos de la Biología Sintética 61 APÉNDICE B. RUIDO ESTOCÁSTICO: APLICACIÓN EN EL SISTEMA REPRESILADOR Un modelo determinista proporciona siempre las mismas predicciones si las condiciones iniciales del sistema (valores de los parámetros y concentraciones iniciales de las especies) no cambian. Este marco funciona bien para un sistema donde el ruido es insignificante, es decir, donde el sistema está aislado de cualquier posible fuente de perturbaciones. Esto puede considerarse verdadero si se estudia el movimiento de un cuerpo sólido, como una piedra, que cae desde diferentes alturas. Sin embargo, si en lugar de una piedra se usa un trozo de papel y el lugar donde realiza los experimentos está sujeto a frecuentes cambios en la velocidad y dirección del viento, cada vez que se deje caer el papel (desde la misma altura), trazará un camino diferente en el aire, en diferentes tiempos, en un lugar diverso en el suelo. Dicho movimiento se denomina estocástico, es decir, la trayectoria diseñada por el papel se debe a varios eventos que suceden aleatoriamente. Por lo tanto, incluso si sus ecuaciones deterministas toman en cuenta el efecto de la fricción del aire, no podrán predecir correctamente la dinámica del sistema y se tendrá que confiar en algunas leyes de probabilidad que pueden decir solo dónde es probable que el papel esté en cada instante de su caída. Los procesos estocásticos son comunes en biología (por ejemplo, el movimiento térmico de las moléculas). La expresión génica, base de los circuitos genéticos sintéticos, también muestra fluctuaciones aleatorias. En general, se distingue entre dos tipos de ruido: intrínseco (debido al propio sistema) y extrínseco (debido a procesos aleatorios que actúan sobre el sistema). La transcripción es estocástica, ya que inicialmente puede tener éxito o ser abortada, las ARN polimerasas se mueven de forma discontinua a lo largo de la cadena de ADN e incluso se detienen, etc…, a su vez, por una expresión estocástica. En general, el rendimiento del circuito muestra una clara variación de célula a célula dentro de una población de células rediseñadas. El ruido global en el sistema se cuantifica con el coeficiente de variación 𝐶v 𝐶v=𝜎(𝑥) 〈𝑥〉 (126) donde 𝑥 es la cantidad medida en el laboratorio (por ejemplo, la fluorescencia) y 𝜎(𝑥) es la desviación estándar de 𝑥 𝜎(𝑥)="1 𝑁ó(𝑥<−〈𝑥〉)/ 1 <S, . (127) Fundamentos de la Biología Sintética 62 Elowitz [4] usó la notación 𝜂½ã½ para el coeficiente de variación en la ecuación, es decir, el ruido total en un sistema. Para cuantificar el componente intrínseco 𝜂<•½ y el componente extrínseco 𝜂ím½ de 𝜂½ã½ , se insertaron en las células de E. coli dos genes prácticamente idénticos. ILUSTRACIÓN 21. ESQUEMA DE CIRCUITO PARA MEDICIÓN DE RUÍDO. FUENTE: [5] ILUSTRACIÓN 22. RUÍDO INTRÍNSECO Y EXTRÍNSECO EN UNA POBLAIÓN DE CÉLULAS. FUENTE: [5] Uno expresa el alelo cian (CFP) de la proteína fluorescente GFP y el otro el alelo amarillo (YFP) de la misma. Los dos genes fueron transcritos por el mismo tipo de promotor (regulado por LacI). El coeficiente 𝜂<•½ se midió como la diferencia relativa media de la intensidad de fluorescencia de CFP e YFP dentro de la misma célula 𝜂<•½=1 𝑁ó|𝐶𝐹<−𝑌𝐹<| 1 <S, . (128) Dado que se cumple 𝜂½ã½/=𝜂<•½/+𝜂ím½/. ( 129 ) 42 4 Stochastic Modeling Fig. 4.2 Circuit scheme for noise measurement in [14] CFP YFP Intrinsic noise due to CFP expression Intrinsic noise due to YFP expression Extrinsic noise Fig. 4.3 Intrinsic and extrinsic noise over a cell population CFP intensity YFP intensity Intrinsic noise Extrinsic noise Total noise One expressed the cyan (CFP) allele of the green fluorescent protein (GFP), the other gene expressed the yellow (YFP) allele (see Fig. 4.2). The two genes were transcribed by the same kind of promoter (regulated by LacI). ηint was measured as the mean relative difference in fluorescence intensity of CFP and YFP within the same cell.3Since it holds that η2 tot =η2 int +η2 ext , the extrinsic noise was calculated as ηext =!C2 V−η2 int (see Fig. 4.3). In the absence of ηint, the expression of the two fluorescent proteins would be fully correlated (showing the same fluctuations to ηext )andthecellswouldlookyellow at the microscope, whereas ηint >0, corresponding to differences in the intensity of CFP and YFP, would cause the cells to have diverse colors from red to green. 3If we call CFiand YF ithe cyan and yellow fluorescence measured from the ith cell over a population of Nsamples, the average intrinsic noise corresponds to ηint =1 N N " i=1|CFi−YF i|. 42 4 Stochastic Modeling Fig. 4.2 Circuit scheme for noise measurement in [14] CFP YFP Intrinsic noise due to CFP expression Intrinsic noise due to YFP expression Extrinsic noise Fig. 4.3 Intrinsic and extrinsic noise over a cell population CFP intensity YFP intensity Intrinsic noise Extrinsic noise Total noise One expressed the cyan (CFP) allele of the green fluorescent protein (GFP), the other gene expressed the yellow (YFP) allele (see Fig. 4.2). The two genes were transcribed by the same kind of promoter (regulated by LacI). ηint was measured as the mean relative difference in fluorescence intensity of CFP and YFP within the same cell.3Since it holds that η2 tot =η2 int +η2 ext , the extrinsic noise was calculated as ηext =!C2 V−η2 int (see Fig. 4.3). In the absence of ηint, the expression of the two fluorescent proteins would be fully correlated (showing the same fluctuations to ηext )andthecellswouldlookyellow at the microscope, whereas ηint >0, corresponding to differences in the intensity of CFP and YFP, would cause the cells to have diverse colors from red to green. 3If we call CFiand YF ithe cyan and yellow fluorescence measured from the ith cell over a population of Nsamples, the average intrinsic noise corresponds to ηint =1 N N " i=1|CFi−YF i|. Fundamentos de la Biología Sintética 63 El ruido extrínseco fue obtenido como 𝜂ím½=%𝐶v/−𝜂<•½/. (130) En ausencia de 𝜂<•½ la expresión de las dos proteínas estaría enteramente correlacionada mostrando las mismas fluctuaciones para 𝜂ím½ y las células podrían verse amarillas en el microscopio. Si por el contrario 𝜂<•½>0 entonces se observarían células de diferentes colores entre el rojo y el verde [40] y [41]. ILUSTRACIÓN 23. MEDIDA DEL RUIDO INTRÍNSECO Y EXTRÍNSECO EN UNA POBLACIÓN DE BACTERIAS E. COLI. EL RUÍDO INTRÍNSECO Y EL RUIDO EXTRÍNSECO SE DIFERENCIAN MIDIENDO LA ACTIVIDAD DE DOS ALELOS DE GFP BAJO EL CONTROL DEL MISMO PROMOTOR: YFP (EN ROJO) Y CFP (EN VERDE). (a) AUSENCIA DE RUÍDO INTRÍNSECO. (b) EXISTENCIA DE RUÍDO INTRÍNSECO. FUENTE: [40] ILUSTRACIÓN 24. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA EN POBLACIONES DE BACTERIAS E. COLI DE DISTINTA CEPA: YFP (EN ROJO) Y CFP (EN VERDE). SE DEMUESTRA QUE EL SISTEMA REPRESILADOR ES UNA RED GENÉTICA OSCILATORIA QUE AMPLIFICA EL RUIDO INTRÍNSECO (VER F). FUENTE: [41] Meyer and Roeder Stochasticity in plant cellular development FIGURE 1 | Schematic model of the importance of stochasticity in promoting regular plant development. (A) During early tissue development, cell start out as being morphologically equivalent (all white cells). (B) Equivalent cells exhibit initial differences from one another through stochastic fluctuations in gene expression (variation of blue cells). (C) Differences between cells will be stabilized by regulatory mechanisms such as genetic or mechanical feedback loops (blue cells with diamonds). (D) As the cell’s fate is stabilized, it triggers non-random patterning mechanisms (e.g., lateral inhibition) (E) Patterning mechanisms promote regular tissue development (orange cells). process. The second approach is to test experimentally for differences in the behaviors of two identical systems due to stochastic noise. The difficulty with this approach is to be sure that the systems are truly identical. Therefore, this approach has been used primarily to study stochasticity of gene expression in single cells. For instance, Elowitz et al. (2002) tested how stochastic gene expression influences cellular variability in Escherichia coli. To do this, Elowitz et al. constructed a strain of E. coli in which two fluorescent alleles (cyan and yellow) are integrated into equivalent chromosomal loci under the control of the same promoter (Figure 2). Elowitz et al. subsequently analyzed fluorescent intensities of these reporters using fluorescence microscopy and computerized image analysis. Using these analyses, they found differences in expression between the cyan and yellow alleles within a single cell, indicating the presence of intrinsic noise, noise caused by the inherent randomness in transcription and translation of a particular gene (Figure 2B). Furthermore, they found variation in the overall fluorescent intensity between cells, suggesting the presence of extrinsic noise, noise attributed to fluctuations in environment (Figure 2A). The results from these experiments suggest that both intrinsic and extrinsic noise in gene expression have a significant impact on FIGURE 2 | Measuring intrinsic and extrinsic noise in E. coli.Intrinsic noise can be differentiated from extrinsic noise by measuring the activity of two allelic GFP variants, YFP (shown in red) and CFP (shown in green), under control of the same promoter. (A) When intrinsic noise is absent within a single cell, the fluorescence intensity of YFP and CFP should be identical (represented by yellow cells). Extrinsic noise will cause different cells within the population to exhibit variations in overall fluorescent intensity. (B) Intrinsic noise within a single cell will cause the fluorescence intensity of YFP and CFP to differ, resulting in some green and some red tinted cells. Reproduced from Elowitz et al. (2002). Reprinted with permission from AAAS. promoting phenotypic diversity. For example, in Bacillus subtilis noise in the genetic network allows a few cells to stochastically and transiently become competent to take up extracellular DNA in response to stress while most other cells sporulate (Süel et al., 2006). By creating a diversity of cellular responses the survival of the population is optimized. Many have used this dual reporter system to demonstrate how stochastic gene expression influences phenotypic diversity in single-cell systems (Elowitz et al., 2002; Ozbudak et al., 2002; Rao et al., 2002; Blake et al., 2003; Raser and O’Shea, 2004; Pedraza and van Oudenaarden, 2005; Raser, 2005; Rosenfeld, 2005; Bar-Even et al., 2006; Newman et al., 2006). Multicellular organisms may utilize stochastic mechanisms similar to those seen in unicellular organisms. However, the biological techniques necessary to assess how stochasticity contributes to cell behavior within a multicellular system are limited. Inventing new techniques to biologically assess and manipulate stochasticity will be important to advance our understanding of the role of randomness in biology in the future. STOCHASTICITY IN PLANT CELL GROWTH AND DIVISION Plants undergo continuous development throughout their lifespan and thus have specialized mechanisms to carefully control organ size and structure even when exposed to extreme environmental conditions. However, despite the regularity observed on an organ level, plant cells exhibit a high degree of variability in growth and division, suggesting that stochasticity is present and even maintained in tissues. Elsner et al. (2012) have found considerable variability in the growth rate of individual cells in the Arabidopsis thaliana Frontiers in Plant Science |PlantEvolutionandDevelopment September 2014 | Volume 5 | Article 420 |2 is that remaining part of the total noise arising from the discrete nature of the biochemical process of gene expression. No matter how accurately the levels of regulatory proteins are controlled, intrinsic noise fundamentally limits the precision of gene regulation. Operationally, intrinsic noise for a given gene may be defined as the extent to which the activities of two identical copies of that gene, in the same intracellular environment, fail to correlate (Fig. 1, A and B). Therefore, we built strains of Escherichia coli, incorporating the distinguishable cyan (cfp ) and yellow (yfp ) alleles of green fluorescent protein in the chromosome. In each strain, the two reporter genes were controlled by identical promoters. To avoid systematic differences in copy number, we integrated the genes at loci equidistant from, and on opposite sides of, the origin of replication (fig. S1). The two fluorescent proteins exhibited statistically equivalent intensity distributions and thus displayed the necessary independence and equivalence to detect noise (7). For measurement, cells were grown in LB medium and photographed through cfp and yfp fluorescence filter sets and in phase contrast (Fig. 2) (7). A computerized image analysis system identified cells and quantified their mean fluorescent intensities. Both intrinsic and extrinsic noise could be determined from plots of CFP versus YFP fluorescence intensity in individual cells (Fig. 3A) (7). The value of ! int indicates the mean relative difference in fluorescence intensity of the two reporter proteins in the same cell; for instance, if ! int "0.25, then the two colors typically differ by about 25%. Because ! int and ! ext make orthogonal contributions to the total noise, ! tot ,thethree noise values satisfy the relation ! int 2 #! ext 2 " ! tot 2 (7, 8). Measurements of these variables for various strains and conditions are presented in Table 1. To determine the importance of noise in vivo, we began with the least noisy gene expression conditions obtainable without feedback: strong constitutive promoters driving the expression of stable proteins. Specifically, we constructed strains incorporating artificial lacrepressible promoters (9)inlac – strain backgrounds, in which the lac repressor gene, lacI,is deleted. We obtained low noise levels (! int $ 0.05) and low cell-cell variation overall (! tot $ 0.08) in these strains (Fig. 2E). We obtained similar results in another strain incorporating two copies of the somewhat stronger promoter %P R (Table 1). These results indicate (i) that constitutive gene expression can be remarkably uniform under some conditions, and (ii) that this low noise state does not strictly depend on aparticularpromotersequence. Few natural E. coli genes are transcribed as strongly as these phage-derived promoters (10). To see how much noise there is at lower rates of transcription, we moved the reporters into several wild-type (lacI # )E. coli strains, where they produced only 3 to 6% as much protein. Under these conditions, both intrinsic and extrinsic noise increased by a factor of &5 (Fig. 2, A and D, and Table 1). The effect was reversible: Addition of saturating amounts of isopropyl '-D-thiogalactopyranoside (IPTG), which binds and inactivates the lac repressor, restored noise (both ! int and ! ext )and amounts of fluorescent protein expression to their approximate values in lac – strains (Fig. 2B). Thus, the noise increase found in wild-type strains can be attributed directly to the activity of LacI and the corresponding reduction of transcription rate. LacI affects extrinsic noise as well, increasing it by a factor of &5, to &0.3. This change indicates the presence of cell-cell variation in LacI expression (8, 11). Models of stochastic gene expression predict that intrinsic noise should increase as the amount of transcript decreases (8, 12). To more effectively repress the reporter genes, we introduced a plasmid constitutively expressing the lac repressor (7)intostrainsotherwisedeleted for lacI.WeaddeddifferentamountsofIPTG to growing cultures (Fig. 3, B and C). Intrinsic Fig. 1. Intrinsic and extrinsic noise can be measured and distinguished with two genes (cfp, shown in green; yfp, shown in red) controlled by identical regulatory sequences. Cells with the same amount of each protein appear yellow, whereas cells expressing more of one fluorescent protein than the other appear red or green. (A) In the absence of intrinsic noise, the two fluorescent proteins fluctuate in a correlated fashion over time in a single cell (left). Thus, in a population, each cell will have the same amount of both proteins, although that amount will differ from cell to cell because of extrinsic noise (right). (B) Expression of the two genes may become uncorrelated in individual cells because of intrinsic noise (left), giving rise to a population in which some cells express more of one fluorescent protein than the other. Fig. 2. Noise in E. coli.CFPandYFPfluorescenceimageswerecombinedinthegreenandredchannels, respectively. (A)InstrainRP22,withpromotersrepressedbythewild-typelacI gene, red and green indicate significant amounts of intrinsic noise. (B)RP22growninthepresenceoflacinducer,2mMIPTG. Both fluorescent proteins are expressed at higher levels and the cells exhibit less noise. (C)Asin(B), except the recA gene has been deleted, increasing intrinsic noise. (D)Anotherwild-typestrain,MG22, shows noise characteristics similar to those of RP22. (E)ExpressionlevelsandnoiseinunrepressedlacI – strain M22 are similar to those in lacI # strains induced with IPTG (B). (F)M22cellsregulatedbythe Repressilator (16), an oscillatory network that amplifies intrinsic noise. REPORTS 16 AUGUST 2002 VOL 297 SCIENCE www.sciencemag.org1184 on March 4, 2013www.sciencemag.orgDownloaded from Fundamentos de la Biología Sintética 64 Los promotores que lideran la expresión de las dos proteínas fluorescentes fueron regulados a la baja por el represor LacI. La intensidad de la represión transcripcional se moduló utilizando varias concentraciones de IPTG, un químico que se une a LacI y evita que se una al ADN. Esto permitió estudiar cómo variaba el ruido en función de la tasa de inicio de la transcripción del promotor. Elowitz mostró que 𝜂<•½ se vuelve mucho más alto cuando la tasa de transcripción se reduce, es decir, cuando hay menos proteínas fluorescentes en el sistema. Esto significa que las variaciones pesan más cuando un sistema está formado por una pequeña cantidad de moléculas. Además, la regulación de la transcripción a través del represor LacI también contribuyó claramente al ruido extrínseco, lo que subraya el hecho de que las células de la población producían una cantidad diversa de LacI. Finalmente, se realizó una variante particular de este sistema al expresar LacI a través de un circuito Represilador. Esta configuración permitió registrar los valores más altos para 𝜂½ã½ y poner en evidencia cómo en un circuito genético el ruido es mayor durante una fase transitoria en lugar de en un estado estacionario estable. Fundamentos de la Biología Sintética 65 APÉNDICE C. BACTERIA E. COLI La E. coli es un organismo modelo utilizado frecuentemente en el laboratorio por su velocidad de crecimiento y pocos requerimientos nutricionales. Además, la bacteria E. coli es muy popular en experimentos de genética y biología molecular debido a que la estructura de su genoma es altamente flexible, permitiendo la movilidad de material genético por medio de transposones, secuencias de inserción, bacteriófagos y plásmidos. ILUSTRACIÓN 25. CONSTANTES, DATOS Y NÚMEROS CLAVE PARA TRABAJAR CON LA BACTERIA E. COLI. FUENTE: [42] Click on a number to see full description and reference www.BioNumbers.org Concentration Concentration of 1 nM in: 13. E. coli is ≈1 molecule/cell; Hela ≈1,000 molecules/cell Characteristic concentration for 14. a signaling protein ≈10 nM-1mM Water content: ≈15. 70% by mass; General elemental composition (dry weight) of E. coli: ≈C4H7O2N1; Yeast ≈C6H10O3N1 Composition of 16. E. coli (dry weight): ≈55% protein, 20% RNA, 10% lipids, 15% others Protein conc. ≈100 mg/ml=17. 3 mM. 106-107 per E. coli (depending on growth rate); Total metabolites (MW<1kD) ≈300mM Energetics Membrane potential 18. ≈70-200 mV à 2-6 kBT per electron (kBT≡thermal energy) Free energy19. (DG) of ATP hydrolysis under physiological conditions ≈40-60 kJ/mole à ≈20kBT/molecule ATP; ATP molecules required to make an E. coli cell ≈10-50×109 D20. G0 resulting in order of magnitude ratio between products and reactants concentrations: ≈6 kJ/mol ≈60 meV ≈2 kBT Cell size Bacteria 1. (E. coli): ≈0.7-1.4 mm diameter, ≈2-4 mm length, ≈0.5-5 mm3 in volume; 108-109 cell/ml for culture with OD600≈1 Yeast 2. (S. cerevisiae): ≈3-6 mm diameter, ≈20-160 mm3 in volume Mammalian cell volume: 3. 100-10000 mm3; Hela: 500-5000 mm3 (adherent on slide ≈15-30 mm diameter) Length Scales Inside Cells Nucleus volume ≈4. 10% of cell volume Cell membrane thickness ≈5. 4-10 nm “Average” protein diameter ≈6. 3-6 nm Base pair: 7. 2 nm (D) x 0.34 nm (H) Water molecule diameter ≈8. 0.3 nm Division, Replication, Transcription, Translation & Degradation Rates at 37°C with a temperature dependence Q10 of ≈2-3 Cell cycle time (exponential growth in rich 9. media): E. coli ≈20-40 min; yeast 70-140 min; human cell line (Hela): 15-30 hours Rate of replication by DNA polymerase 10. E. coli ≈200-1000 bases/s; human ≈40 bases/s. Transcription by RNA polymerase 10-100 bases/s Translation rate by ribosome 11. 10-20 aa/s Degradation rates (proliferating cells): 12. mRNA half life < cell cycle time; protein half life ≳ cell cycle time Useful biological numbers extracted from the literature. Numbers and ranges should only serve as “rule of thumb” values. References are in the online annotated version at the BioNumbers website. Consult website and original references to learn about the details of the system under study including growth conditions, method of measurement, etc. Diffusion and Catalysis Rate Diffusion coefficient for an “average” 21. protein: in cytoplasm D≈5-15 mm2/s à ≈10 millisec to traverse an E. coli à≈10 s to traverse a mammalian (Hela) cell; small metabolite in water D≈500 mm2/s Diffusion limited on-rate for characteristic 22. protein ≈108-109 s-1M-1 à for a protein substrate of concentration ≈1mM the diffusion limited on-rate is ≈100-1000 s-1 thus limiting the catalytic rate kcat Genome sizes & Error Rates Genome size: 23. E. coli ≈5 Mbp; S. cerevisiae (yeast) ≈12 Mbp; C. elegans (nematode) ≈100 Mbp; D. melanogaster (fruit fly) ≈120 Mbp; A. thaliana (arabidopsis) ≈120 Mbp; M. musculus (mouse) ≈2.5 Gbp; H. sapiens (human) ≈2.9 Gbp; T. aestivum (wheat) ≈16 Gbp Number of protein-coding genes: 24. E. coli ≈4,000; S. cerevisiae ≈6,000; C. elegans, A. thaliana, M. musculus, H. sapiens ≈20,000 Mutation rate in DNA replication 25. ≈10-8-10-10 per bp Misincorporation rate: 26. transcription ≈10-4 per nucleotide; translation ≈10-3-10-4 per amino-acid Fundamentos de la Biología Sintética 66 APÉNDICE D. AGRADECIMIENTOS A María del Carmen Lemos Fernández, por abrirme las puertas a un trabajo tan maravilloso y actual. A mis padres Marilo y Fran, por su paciencia y apoyo. A mi hermana Elena, por sus aportaciones “matemágicas”. A mi familia y amigos, por estar ahí siempre. A María, con amor, por darme todo su apoyo cuando lo escribía a su lado.