Comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales como contaminantes emergentes de suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora

UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA Comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales como contaminantes emergentes de suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora Marina Arenas Molina Sevilla, 2025 TESIS DOCTORAL “Comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales como contaminantes emergentes de suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora” Trabajo presentado para aspirar al grado de Doctor El Director: Fdo.: D. Esteban Alonso Álvarez Catedrático de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla La Directora: Fdo.: Dña. Irene Aparicio Gómez Catedrática de Universidad Departamento de Química Analítica Universidad de Sevilla Fdo.: Dña Marina Arenas Molina Graduada en Química Universidad de Sevilla Escuela Politécnica Superior Departamento de Química Analítica C/ Virgen de África, 7 41011 Sevilla (España) Dr. Esteban Alonso Álvarez, Catedrático de Universidad del Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Sevilla, y Dra. Irene Aparicio Gómez, Catedrática de Universidad del Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que Dña. Marina Arenas Molina, Graduada en Química por la Universidad de Granada, ha realizado en el Departamento de Química Analítica de la Escuela Politécnica Superior de la Universidad de Sevilla, bajo nuestra dirección, el trabajo de investigación “Comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales como contaminantes emergentes de suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora”, que reúne las condiciones necesarias para ser presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Fdo.: D. Esteban Alonso Álvarez Fdo.: Dña. Irene Aparicio Gómez Agradecimientos En primer lugar, quiero agradecer a mis Directores, D. Esteban Alonso Álvarez y Dña. Irene Aparicio Gómez, por guiarme a lo largo de mi Tesis Doctoral, por su apoyo y dedicación, por su conocimiento y experiencia que siempre han sabido resolver mis dudas y por el tiempo que han dedicado a revisar y mejorar mi trabajo. Esteban, gracias por haberme dado tu confianza y la oportunidad de ser parte de ANQUIMED, soy consciente de la suerte que he tenido de hacer la Tesis en un grupo como el nuestro. Y como todo buen grupo necesita un buen líder, gracias por escucharme y aconsejarme, por saber siempre qué es lo mejor y por motivarme a seguir con mi desarrollo académico. Irene, gracias por tu grandísima ayuda en los artículos en los que hemos trabajado mano a mano, por ser tan metódica (nunca mejor dicho) y enseñarme que, con esfuerzo y trabajo, se puede alcanzar la perfección. Y, por supuesto, Juan Luis y Julia, gracias por vuestra cercanía, por estar siempre dispuestos a echarme una mano y por todo lo que he aprendido de vosotros, no solo de cromatografía. Me siento muy afortunada de haber contado con vuestro apoyo durante esta etapa. También quiero expresar mi agradecimiento: Al Departamento de Química Analítica de la Universidad de Sevilla, por recibirme e integrarme, por haberme permitido realizar mi Tesis Doctoral y también por enseñarme a ser docente. En particular, gracias a D. Fernando de Pablos Pons y D. Esteban Alonso Álvarez por su labor como Directores del Departamento durante el desarrollo de mi Tesis. Al Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades por su financiación a través de un contrato predoctoral y por la concesión de una ayuda para la realización de estancias de investigación en el extranjero. A la Consejería de Economía y Conocimiento de la Junta de Andalucía y a la Unión Europea, ya que este trabajo se ha desarrollado en el marco del proyecto de I+D+i: “Comportamiento enantioselectivo de contaminantes emergentes en la reutilización agrícola de aguas residuales y lodos de depuradora” (US 1254283). Al centro de investigación MARE (Marine and Environmental Sciences Centre) de la Universidad de Lisboa, por permitirme realizar allí una estancia de investigación internacional. En especial, quiero agradecer a los profesores Bernardo Duarte y Vanessa Fonseca, por abrirme las puertas de su grupo y darme la oportunidad aprender sobre nuevos campos. Esta experiencia no solo ha sido fundamental para el desarrollo de mi Tesis, también ha sido una formación muy valiosa para mi futuro como investigadora. Thanks to MARE - Marine and Environmental Sciences Centre - of the University of Lisbon, for allowing me to do an international research stay there. I would especially like to thank professors Bernardo Duarte and Vanessa Fonseca for welcoming me into their group and giving me the opportunity to learn about new fields. This experience has not only been fundamental for the development of my PhD, it has also been a very valuable formation for my future as a researcher. A Aguas de Cádiz, Aguas de Huelva, Aljarafesa, Emasagra y Giahsa por su colaboración en la toma de las muestras utilizadas en la presente Tesis Doctoral. Siendo sincera, nunca me había planteado hacer un doctorado. Vine a Sevilla para hacer el máster, a vivir la experiencia de estar un año fuera de casa y la verdad es que no sabía qué me iba a deparar el futuro. No sé si fue casualidad estar en el sitio y el momento oportunos para que se dieran las circunstancias, o si ha sido el destino el que ha hecho que aquí esté, 6 años después, convirtiéndome en Doctora. Hacer una tesis es recorrer un largo camino que te enseña muchas cosas, pero en el que te encuentras muchos obstáculos (precariedad, agobios por ensayos que no salen, por artículos rechazados, por todas las veces que no llegas a tiempo, por verte de repente en una clase de electroquímica pero resulta que tú eres la profesora, el RAPI, la burocracia, la incertidumbre de no saber qué vendrá después…). Siendo justa, también hay muchos momentos buenos cuando haces una tesis: el día a día en el laboratorio, los congresos, la satisfacción cuando las cosas salen bien, ese artículo por fin publicado y sobre todo… cuando la terminas. Por eso, quiero agradecer a todas las personas que me han acompañado en este camino, haciéndolo mucho más fácil. Sin vosotros no habría podido. A mis compañeras, porque no he podido tener mejores acompañantes en esta etapa, gracias por todos los momentos que hemos vivido dentro y fuera del laboratorio. Carmen, empezamos juntas y juntas hemos estado siempre en lo bueno y en lo malo, compartiendo las alegrías y los agobios. Eres la persona más trabajadora que conozco, siempre dispuesta a ayudarme, gracias por haber sido un referente al que mirar, te admiro mucho y sé que vas a conseguir todo lo que te propongas. Noelia, no cambies nunca esa curiosidad por saber el porqué de las cosas, ni la forma de ser que tienes, siendo como un libro abierto, diciendo que sí a todo. Nunca pensé que iba a encontrar a una persona tan parecida a mí, tenerte en mi vida es un verdadero tesoro. Laura, la segunda granaína, menos mal que viniste porque me estaba ya volviendo loca entre tantos sevillanos, gracias por tus consejos, los de alguien que nos entiende porque ya ha pasado por aquí, eres la pieza que nos faltaba. ANQUIMED sois vosotras. La presente Tesis Doctoral aborda una revisión del estado del arte sobre los contaminantes emergentes quirales y una investigación del comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales como contaminantes de suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora. La estructura se encuentra dividida en cinco capítulos: En el primer capítulo se establecen los antecedentes, a través de una revisión crítica del estado del arte, que proporcionan un marco teórico sólido para los contenidos desarrollados a lo largo de la Tesis Doctoral. Este capítulo está compuesto por tres artículos científicos de revisión bibliográfica, que profundizan en el comportamiento enantioselectivo de contaminantes quirales en el medioambiente (Artículo Nº 1), las metodologías analíticas existentes para su determinación en muestras ambientales (Artículo Nº 2) y su distribución y evaluación del riesgo ecológico (Artículo Nº 3). Artículo Nº 1: Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2022). Enantioselective behavior of environmental chiral pollutants: A comprehensive review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 52(17), 2995–3034. Artículo Nº 2: Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2021). An overview of analytical methods for enantiomeric determination of chiral pollutants in environmental samples and biota. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 143, 116370. Artículo Nº 3: Mejías, C., Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2022). A systematic review on distribution and ecological risk assessment for chiral pharmaceuticals in environmental compartments. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 260(1). El segundo capítulo describe el objetivo principal y los objetivos específicos de la Tesis Doctoral, así como el Plan de Trabajo establecido para alcanzar los objetivos propuestos, secuenciado en distintas etapas. En el tercer capítulo se proponen, a través de dos artículos científicos, dos nuevas metodologías analíticas desarrolladas para la determinación enantioselectiva de los fármacos quirales seleccionados, pertenecientes a los grupos terapéuticos de β-bloqueantes, antidepresivos y algunos de sus metabolitos, en diferentes tipos de matrices ambientales: matrices sólidas (suelo, lodo de depuradora y compost) y matrices líquidas (aguas residuales influentes y efluentes). Ambos métodos emplean la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem, utilizando una columna quiral para lograr la separación enantiomérica. La metodología para la determinación de los analitos en suelo, lodo y compost se basa en una extracción asistida por ultrasonidos seguida de una limpieza mediante extracción en fase sólida dispersiva (Artículo Nº 4), mientras que para la determinación en aguas residuales se ha desarrollado un método automatizado basado en extracción en fase sólida online (Artículo Nº 5). Artículo Nº 4: Arenas, M., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. (2023). Enantioselective LC-MS/MS determination of antidepressants, βblockers and metabolites in agricultural soil, compost and digested sewage sludge. Analytica Chimica Acta, 1261, 341224. Artículo Nº 5: Arenas, M., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. Automatised online SPE-LC-MS/MS method for the enantioselective determination of chiral β-blockers and antidepressants in wastewater. Analytica Chimica Acta, 1361, 344152. En el cuarto capítulo de la Tesis Doctoral, constituido por un capítulo de libro y dos artículos científicos, se profundiza en el estudio de los fármacos quirales como contaminantes emergentes a través de tres aplicaciones de interés medioambiental. En el capítulo de libro, se estudia la dinámica de degradación de fármacos quirales β-bloqueantes en suelos tratados con lodo digerido, compost y agua residual. En el estudio, se monitoriza la disipación de cada enantiómero, aplicando modelos cinéticos para explicar la cinética de degradación y determinando los efectos que tienen las enmiendas orgánicas y el riego con agua residual. La segunda aplicación consiste en un ensayo de toxicidad enantioespecífica del β-bloqueante propranolol (Artículo Nº 6), empleando microalgas diatomeas como organismo modelo para evaluar los efectos de cada enantiómero en el crecimiento, el metabolismo energético y el daño oxidativo. La última aplicación es una evaluación del uso de la arcilla montmorillonita para la adsorción de fármacos y metabolitos quirales en aguas residuales, como posible solución para su eliminación (Artículo Nº 7). Capítulo Nº 1: Arenas, M., Mejías, C., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. (2025). Environmental fate of chiral β-blockers in soils: Effects of compost and digested sludge amendments and wastewater irrigation. Comprehensive Analytical Chemistry, Vol 111 Analysis of Chiral Pollutants in the Environment: Fundamentals, Techniques and Applications. Elsevier. Artículo Nº 6: Arenas, M., Feijão, E., Duarte, I. A., Fonseca, V. F., Aparicio, I., Alonso, E. & Duarte, B. (2025) Enantioselective toxicity of propranolol on marine diatoms: assesing growth, energy metabolism and oxidative damage in Phaeodactylum tricornutum. Marine Pollution Bulletin, 214, 117751. Artículo Nº 7: Hacıosmanoğlu, G. G., Arenas, M., Mejías, C., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. Assessing the stereoselectivity in adsorption of chiral pharmaceuticals onto montmorillonite clay (en preparación). El quinto capítulo recoge las conclusiones de la Tesis Doctoral que muestran, a grandes rasgos, la necesidad de profundizar en la presencia y el comportamiento enantioselectivo de contaminantes emergentes quirales en el medioambiente, la adecuación de las metodologías analíticas propuestas, la presencia de los fármacos seleccionados en muestras ambientales tratadas y la existencia de enriquecimientos enantioméricos, la importancia de considerar las diferencias entre enantiómeros en los procesos de degradación en suelos y en sus efectos toxicológicos, y la eficacia de la montmorillonita como adsorbente para su eliminación de las aguas residuales. Abstract In recent years, there has been a growing awareness of the presence of polluting substances in the environment and their impact on ecosystems and human health. In this context, and due to the advances in analytical chemistry, new pollutants of emerging concern have been identified in the different environmental compartments. Among them, pharmaceuticals have been of particular concern as their consumption is increasing and they are designed to be biologically active even at low concentrations. More than half of the pharmaceutical products currently in use are chiral, meaning that they have two enantiomers that are optical isomers with similar physico-chemical properties, but in chiral environments they may undergo different biodegradation, transformation and accumulation patterns. Although most of them are commercially available in their racemic form, their enantiomeric composition may be altered after metabolisation, in biological treatments in sewage treatment plants and in other enantioselective processes that may occur in receiving environmental media and biota. Enantiomers may exhibit different pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, producing distinct effects on both target and non-target organisms once released into the environment. Despite the importance of considering the chirality of environmental pollutants for a proper risk assessment, most of the studies focused on their presence, distribution and ecotoxicological effects have not included this aspect, overlooking the possible differences between their enantiomers. This PhD dissertation addresses a review of the state of the art on chiral emerging contaminants and an investigation about the enantioselective behaviour of chiral pharmaceuticals as contaminants of soils treated with wastewater or sewage sludge. The structure is divided into five chapters: In the first chapter the background is established, through a critical review of the state of the art, which provides a solid theoretical framework for the contents described in the PhD dissertation. This chapter has resulted in the publication of three review articles on the enantioselective behaviour of chiral pollutants in the environment (Article Nº 1), the available analytical methodologies for their determination in environmental samples (Article Nº 2) and their distribution and ecological risk assessment (Article Nº 3). Article Nº 1: Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2022). Enantioselective behavior of environmental chiral pollutants: A comprehensive review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 52(17), 2995–3034. Article Nº 2: Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2021). An overview of analytical methods for enantiomeric determination of chiral pollutants in environmental samples and biota. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 143, 116370. Article Nº 3: Mejías, C., Arenas, M., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2022). A systematic review on distribution and ecological risk assessment for chiral pharmaceuticals in environmental compartments. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 260(1). In the second chapter the main objective and the specific objectives of the PhD dissertation are described, as well as the Work Plan established to achieve the proposed objectives, sequenced in different stages. In the third chapter, two new analytical methodologies are proposed by means of two scientific articles for the enantioselective determination of selected chiral pharmaceuticals, belonging to the therapeutic groups of βblockers, antidepressants and some of their metabolites, in different types of environmental matrices: solid matrices (soil, sewage sludge and compost) and liquid matrices (influent and effluent wastewater). Both methods employ liquid chromatography-tandem mass spectrometry, using a chiral column to achieve the enantiomeric separation. The methodology for the determination of the analytes in soil, sludge and compost is based on ultrasound-assisted extraction followed by a clean-up by dispersive solid phase extraction (Article Nº 4), while for their determination in wastewater an automated method based on online solid phase extraction has been developed (Article Nº 5). Article Nº 4: Arenas, M., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. (2023). Enantioselective LC-MS/MS determination of antidepressants, β-blockers and metabolites in agricultural soil, compost and digested sewage sludge. Analytica Chimica Acta, 1261, 341224. Article Nº 5: Arenas, M., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. Automatised online SPE-LC-MS/MS method for the enantioselective determination of chiral β-blockers and antidepressants in wastewater. Analytica Chimica Acta, 1361, 344152. In the fourth chapter of the PhD dissertation, comprised of a book chapter and two scientific articles, the study of chiral pharmaceuticals as emerging pollutants is explored through three applications of environmental relevance. In the book chapter, the degradation dynamics of chiral β-blockers in soils treated with digested sludge, compost and wastewater are studied. In the study, the dissipation of each enantiomer is monitored, applying kinetic models to explain the degradation kinetics and determining the effect of organic amendments and irrigation with wastewater. The second application is an enantiospecific toxicity test of the β-blocker propranolol (Article Nº 6). Diatom microalgae are used as model organisms to assess the effects of each enantiomer on growth, energy metabolism and oxidative damage. The last application is an evaluation of the use of montmorillonite clay for the adsorption of pharmaceuticals and chiral metabolites in wastewater, as a potential solution for their removal (Article Nº 7). Chapter Nº 1: Arenas, M., Mejías, C., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. (2025). Environmental fate of chiral β-blockers in soils: Effects of compost and digested sludge amendments and wastewater irrigation. Comprehensive Analytical Chemistry, Vol 111 Analysis of Chiral Pollutants in the Environment: Fundamentals, Techniques and Applications. Elsevier. Article Nº 6: Arenas, M., Feijão, E., Duarte, I. A., Fonseca, V. F., Aparicio, I., Alonso, E. & Duarte, B. (2025). Enantioselective toxicity of propranolol on marine diatoms: assesing growth, energy metabolism and oxidative damage in Phaeodactylum tricornutum. Marine Pollution Bulletin, 214, 117751. Article Nº 7: Hacıosmanoğlu, G. G., Arenas, M., Mejías, C., Santos, J. L., Martín, J., Aparicio, I. & Alonso, E. Assessing the stereoselectivity in adsorption of chiral pharmaceuticals onto montmorillonite clay (in preparation). The fifth chapter contains the conclusions of the PhD dissertation, which show, in broad terms, the need to further study the presence and enantioselective behaviour of emerging chiral pollutants in the environment, the suitability of the analytical methodologies proposed, the presence of the selected pharmaceuticals in environmental samples and the existence of enantiomeric enrichments, the importance of considering the differences between enantiomers in the degradation processes in soils and their toxicological effects, and the efficacy of montmorillonite as an adsorbent for their removal from wastewater. Índice Índice 25 Índice Índice ...................................................................................................................... 25 Capítulo 1. Antecedentes ................................................................................. 29 1.1 Introducción al concepto de quiralidad y su relevancia en la evaluación del impacto ambiental de contaminantes emergentes ......................................................................................................... 29 1.2 Comportamiento enantioselectivo de contaminantes quirales en el medioambiente....................................................................................... 35 1.3 Metodologías analíticas para la determinación de contaminantes quirales en muestras medioambientales ................ 39 1.4 Distribución y evaluación del riesgo ecológico de fármacos quirales en los compartimentos ambientales ....................................... 59 1.5 Adenda ................................................................................................................. 91 1.6 Referencias ........................................................................................................ 96 Capítulo 2. Objetivos y Plan de Trabajo ................................................... 107 2.1 Objetivos ...........................................................................................................107 2.2 Plan de Trabajo ..............................................................................................109 Capítulo 3. Metodologías analíticas para la determinación de fármacos quirales en muestras ambientales ......................................... 117 3.1 Determinación enantioselectiva de fármacos y metabolitos en suelos agrícolas, compost y lodo de depuradora ..............................119 3.2 Determinación enantioselectiva de fármacos y metabolitos en aguas residuales ..............................................................................................139 Capítulo 4. Aplicaciones de interés medioambiental .......................... 161 4.1 Dinámica de degradación de fármacos quirales en suelos tratados con aguas residuales y lodos de depuradora ....................163 4.2 Ensayos de toxicidad enantioespecífica de fármacos quirales ..169 4.3 Evaluación del uso de materiales adsorbentes para la eliminación de fármacos quirales de las aguas residuales .....................................185 Capítulo 5. Conclusiones ................................................................................ 193 Capítulo 1. Antecedentes 32 en matrices ambientales acuosas. En la actualidad y después de varias actualizaciones, la Lista de Observación vigente es la publicada en la Decisión de Ejecución 2022/1307/UE, que cuenta con 26 contaminantes emergentes pertenecientes a distintas familias de compuestos tales como fármacos y metabolitos (clindamicina, fluconazol, metformina y su metabolito guanilurea, ofloxacino, sulfametoxazol, trimetoprim, venlafaxina y su metabolito O-desmetilvenlafaxina.), pesticidas (10 compuestos azólicos, dimoxistrobin, azoxistrobin, famoxadona, diflufenican y fipronil) y protectores solares (benzofenona-3, butil-metoxidibenzoilmetano y octocrileno). Los contaminantes emergentes provienen de actividades antropogénicas como la fabricación, la aplicación de pesticidas y la eliminación de residuos no tratados (Tavengwa et al., 2022). Su presencia en el medioambiente se atribuye principalmente al vertido de aguas efluentes procedentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) (Petrie et al., 2015), ya que los tratamientos convencionales que reciben no están diseñados específicamente para eliminar los contaminantes emergentes, que permanecen en las aguas efluentes o se acumulan en los lodos de depuradora (Arenas et al., 2024). Posteriormente, son reintroducidos en el medioambiente tras el vertido de las aguas residuales tratadas a cauces naturales, su uso para regadío o la aplicación de lodos de depuradora como enmienda orgánica en suelos de cultivo. Los tratamientos convencionales de las EDARs consisten, de modo resumido, en un tratamiento primario dirigido a eliminar sólidos flotantes, grasas y aceites a través de procesos físicos como la sedimentación; un tratamiento secundario destinado a reducir el contenido de materia orgánica a través de procesos biológicos y, en algunos casos, un tratamiento terciario avanzado para eliminar contaminantes concretos como fósforo, nitrógeno, minerales, metales pesados y agentes patógenos, con el objetivo de mejorar la calidad del agua tratada hasta un nivel seguro para su descarga en el medio ambiente o para usos específicos como riego agrícola. Capítulo 1. Antecedentes 33 En los últimos años, tras la aparición de los nuevos contaminantes emergentes, se plantea la realización de un tratamiento adicional o tratamiento cuaternario para eliminar compuestos como los contaminantes orgánicos persistentes, productos farmacológicamente activos y microplásticos. Recientemente, la Directiva Europea 2024/3019/EU sobre el tratamiento de aguas residuales urbanas ha incluido una lista de 13 compuestos cuya presencia sirva como indicador de la necesidad de un tratamiento cuaternario para eliminar los microcontaminantes en las EDARs. Entre los indicadores se encuentran los fármacos amisulprid, carmabazepina, candesartán, citalopram, claritromicina, diclofenaco, hidroclorotiazida, irbesartán, metoprolol y venlafaxina y los inhibidores de corrosión benzotriazol, 4-metil-benzotriazol y 5-metil-benzotriazol. Muchos de los contaminantes emergentes son compuestos quirales, suministrados mayoritariamente en su forma racémica. Sin embargo, la composición enantiomérica puede verse alterada durante procesos enantioselectivos, como los que tienen lugar durante el tratamiento biológico en las EDARs. La quiralidad de los contaminantes en el medioambiente tiene un papel fundamental ya que, aunque los procesos fisicoquímicos afecten a los enantiómeros de la misma manera, en ambientes quirales pueden sufrir diferente degradación, transformación y acumulación. Del mismo modo, la interacción con otras moléculas quirales (proteínas, enzimas o receptores) puede ser enantioselectiva, dando lugar a distintos comportamientos biológicos y toxicológicos (Hühnerfuss y Shah., 2009). Por tanto, para llevar a cabo una evaluación adecuada del impacto ambiental de los contaminantes es fundamental considerar su quiralidad. Para ello, es preciso profundizar en el comportamiento enantioselectivo de los contaminantes quirales en el medioambiente, desarrollar metodologías analíticas que permitan la determinación de los enantiómeros y llevar a cabo estudios de toxicidad enantioespecíficos Capítulo 1. Antecedentes 35 1.2 Comportamiento enantioselectivo de contaminantes quirales en el medioambiente Artículo Nº 1 Título: Enantioselective behaviour of environmental chiral pollutants: A comprehensive review Marina Arenas, Julia Martín, Juan Luis Santos, Irene Aparicio, Esteban Alonso Departamento de Química Analítica, Escuela Politécnica Superior, Universidad de Sevilla, C/ Virgen de África, 7, E-41011, Seville, Spain. DOI: doi.org/10.1080/10643389.2021.1900764 Revista: Critical Reviews in Environmental Science and Technology Editor: Lena Q. Ma Editorial: Taylor & Francis Año de Publicación: 2022 ISSN: 1547-6537 (Online) 1064-3389 (Impreso) Categoría: Environmental Science (SCIE) Posición de la revista en la categoría: 15/275 Factor de impacto (2022): 12.6 Factor de impacto (5 años): 14.3 Cuartil: Q1 Decil: D1 Capítulo 1. Antecedentes 37 Resumen Artículo Nº 1 En esta primera revisión bibliográfica se aborda la problemática de los contaminantes quirales y su destino en el medioambiente. Se revisan estudios acerca del comportamiento enantioselectivo de compuestos quirales que pertenecen a los principales grupos de contaminantes emergentes: fármacos, productos de cuidado personal, compuestos perfluorados, retardantes de llama bromados, pesticidas y bifenilos policlorados, así como sus principales metabolitos. Se pone de manifiesto la importancia de estudiar del perfil enantiomérico de estos contaminantes emergentes, ya que, a pesar de presentar propiedades fisicoquímicas similares, los enantiómeros de un mismo compuesto pueden experimentar diferente transformación, acumulación o biodegradación cuando se encuentran en ambientes quirales. Además, su interacción con enzimas, receptores y otras moléculas quirales también puede ser estereoselectiva, dando lugar a diferentes respuestas biológicas y efectos en los seres vivos. En consecuencia, es fundamental considerar las posibles diferencias en el comportamiento de los enantiómeros de los contaminantes quirales para hacer una evaluación del riesgo adecuada del riesgo ambiental y sanitario. A lo largo de la revisión, se describen los distintos grupos de contaminantes emergentes y los principales compuestos quirales que los conforman. Se estudia la presencia y la proporción entre los enantiómeros de estos contaminantes en múltiples matrices ambientales, como aguas residuales y superficiales, lodos de depuradora, sedimentos, suelos, aire y organismos vivos a lo largo de la cadena trófica. Aunque la mayoría de los compuestos quirales se comercializan en su forma racémica, tras su descarga en el medioambiente pueden experimentar alteraciones en su fracción enantiomérica. El análisis de esta fracción ofrece la capacidad de distinguir entre fuentes de contaminación primarias Capítulo 1. Antecedentes 38 (racémicas, recién liberadas o protegidas del ataque microbiano) y secundarias (no racémicas, alteradas por microbios). La revisión bibliográfica revela que no se puede predecir cuál de los dos enantiómeros de un contaminante quiral se ve preferentemente enriquecido o degradado, ya que dependerá de las propiedades del compuesto, la matriz, los procesos enantioselectivos de degradación microbiana, biotransformación y, en menor medida, degradación abiótica durante la adsorción en suelos y lodos. Se requiere, por tanto, una investigación más profunda y específica del comportamiento enantioselectivo de los contaminantes quirales en el medioambiente, incluyendo los posibles efectos de sus metabolitos y el impacto en los organismos vivos, para una evaluación integral de los riesgos que entrañan. Capítulo 1. Antecedentes 39 1.3 Metodologías analíticas para la determinación de contaminantes quirales en muestras medioambientales Artículo Nº 2 Título: An overview of analytical methods for enantiomeric determination of chiral pollutants in environmental samples and biota Marina Arenas, Julia Martín, Juan Luis Santos, Irene Aparicio, Esteban Alonso Departamento de Química Analítica, Escuela Politécnica Superior, Universidad de Sevilla, C/ Virgen de África, 7, E-41011, Seville, Spain. Revista: Trends in Analytical Chemistry Editor: Janusz Pawliszyn Editorial: Elsevier Año de Publicación: 2021 ISSN: 1879-3142 (Online) 0165-9936 (Impreso) Categoría: Chemistry, Analytical (SCIE) Posición de la revista en la categoría: 1/87 Factor de impacto (2021): 14.9 Factor de impacto (5 años): 13.4 Cuartil: Q1 Decil: D1 Capítulo 1. Antecedentes 41 Resumen Artículo Nº 2 En este segundo artículo se ha revisado el estado del arte sobre los métodos analíticos existentes para la determinación de contaminantes ambientales quirales. Se incluyen metodologías para el análisis de fármacos, pesticidas, almizcles policíclicos, compuestos perfluorados, retardantes de llama bromados y bifenilos policlorados, en muestras ambientales y biota. A pesar del interés creciente en los últimos años sobre la presencia y la distribución de compuestos quirales en el medioambiente, la mayoría de los métodos desarrollados para el análisis de estos contaminantes no tienen en cuenta su composición enantiomérica. La separación y el análisis de enantiómeros supone un reto analítico significativo, ya que sus propiedades fisicoquímicas idénticas complican su determinación individual. En la primera parte de esta revisión se estudian las principales técnicas analíticas empleadas para la determinación de contaminantes quirales, siendo las más relevantes la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases acopladas a espectrometría de masas y la cromatografía de fluidos supercríticos. En estas técnicas, la separación de los enantiómeros se consigue utilizando un selector quiral, que puede añadirse a la fase móvil o a la fase estacionaria, en los llamados métodos directos, o también pueden realizarse empleando reactivos derivatizantes enantioméricamente puros, que se añaden a la muestra de manera previa a su determinación cromatográfica, en métodos indirectos. Para cada una de estas técnicas, se examinan los selectores quirales y las condiciones cromatográficas más frecuentemente utilizadas en la determinación de contaminantes ambientales, así como sus ventajas e inconvenientes. En segundo lugar, se incluye una recopilación de los métodos analíticos descritos para cada grupo de contaminantes quirales y revisiones bibliográficas recientes para su determinación en matrices ambientales, tales como aguas residuales influentes y efluentes, aguas superficiales, suelo, Capítulo 1. Antecedentes 48 Capítulo 1. Antecedentes 49 Capítulo 1. Antecedentes 50 Capítulo 1. Antecedentes 51 Capítulo 1. Antecedentes 52 Capítulo 1. Antecedentes 53 Capítulo 1. Antecedentes 54 Capítulo 1. Antecedentes 55 Capítulo 1. Antecedentes 56 Capítulo 1. Antecedentes 57 Capítulo 1. Antecedentes 64 Capítulo 1. Antecedentes 65 Capítulo 1. Antecedentes 66 Capítulo 1. Antecedentes 67 Capítulo 1. Antecedentes 68 Capítulo 1. Antecedentes 69 Capítulo 1. Antecedentes 70 Capítulo 1. Antecedentes 71 Capítulo 1. Antecedentes 72 Capítulo 1. Antecedentes 73 Capítulo 1. Antecedentes 80 Capítulo 1. Antecedentes 81 Capítulo 1. Antecedentes 82 Capítulo 1. Antecedentes 83 Capítulo 1. Antecedentes 84 Capítulo 1. Antecedentes 85 Capítulo 1. Antecedentes 86 Capítulo 1. Antecedentes 87 Capítulo 1. Antecedentes 88 Capítulo 1. Antecedentes 89 Capítulo 1. Antecedentes 96 enantioselectivas que degradaron el citalopram a concentraciones altas no son las mismas que a concentraciones bajas. Miranda et al. (2024) exploraron el uso de un carbón óseo para la adsorción de fármacos quirales en aguas residuales salinas; el análisis de la fracción enantiomérica mostró que no se produjo una adsorción preferente de un enantiómero sobre otro. Pun et al. (2025) emplearon un biofiltro electroactivo para la eliminación de fármacos y herbicidas quirales del agua residual, resultando una eliminación enantioselectiva más significativa para los herbicidas. 1.6 Referencias Amariei, G., Jiménez-Jiménez, S., García, M. Á., Marina, M. L. & Boltes, K. (2022). First eco-toxicological evidence of ivabradine effect on the marine bacterium Vibrio fischeri: A chiral view. 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Antecedentes 97 Chen, C., Zhao, T., Liu, J., Zheng, S., Zeng, W., Zhang, X., Cui, Y. & Zhong, R. (2023). Effect of HHCB and Cd on phytotoxicity, accumulation, subcellular distribution and stereoselectivity of chiral HHCB in soil-plant systems. Plant Physiology and Biochemistry, 198(38), 107699. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2023.107699 De Cesaris, M. G., D’Orazio, G., Fanali, C., Gentili, A. & Fanali, S. (2024). Exploring the performance of cellulose tris-3,5dichlorophenylcarbamate as a stationary phase for the chiral electrochromatographic separation of azole antifungals. Journal of Chromatography Open, 5, 100126. https://doi.org/10.1016/j.jcoa.2024.100126 Di, S., Diao, Z., Cang, T., Wang, Z., Xu, L., Qi, P., Zhao, H., Liu, Z. & Wang, X. (2024). Enantioselective fate and risk assessment of chiral fungicide pydiflumetofen in rice-fish and wheat farming systems. Science of the Total Environment, 912. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.169262 European Comission. (2022). Commission Implementing Decision (EU) 2022/1307 of 22 July 2022 establishing a watch list of substances for Union-wide monitoring in the field of water policy pursuant to Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union, 65(L197), 117. https://eurlex.europa.eu/legalcontent/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32022D1307&qid=1658824912292 European Commission. (2015). European Commission, 2015. Commission Implementing Decision (EU) 2015/495 of 20 March 2015 establishing a watch list of substances for Union-wide monitoring in the field of water policy pursuant to Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of t. Official Journal of European Union L 78, 2015, 40–42. Capítulo 1. Antecedentes 98 Gu, Z., Luo, Y., Zhang, X., Zhu, Z., Wang, Y., Tang, T., Zhang, S. & Zhang, W. (2024). Preparation and applications of metal–organic frameworks in chiral chromatographic separation. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 179, 117864. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117864 Guo, P., An, X., Chen, W., Pan, X., Li, R., Xu, J., Wu, X., Zheng, Y. & Dong, F. (2022). Separation and determination of fluindapyr enantiomers in cucumber and tomato and by supercritical fluid chromatography tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 395, 133571. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133571 Hacıosmanoğlu, G. G., Arenas, M., Mejías, C., Martín, J., Santos, J. L., Aparicio, I. & Alonso, E. (2023). Adsorption of Fluoroquinolone Antibiotics from Water and Wastewater by Colemanite. International Journal of Environmental Research and Public Health, 20(3). https://doi.org/10.3390/ijerph20032646 Huang, C., Zeng, Y., Jiang, Y., Zhang, Y., Lu, Q., Liu, Y. E., Guo, J., Wang, S., Luo, X. & Mai, B. (2024). Comprehensive exploration of the anaerobic biotransformation of polychlorinated biphenyls in Dehalococcoides mccartyi CG1: Kinetics, enantioselectivity, and isotope fractionation. 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Exploring expert perceptions towards emerging pollutants and their impacts in reused wastewater and agriculture. Agricultural Water Management, 304. https://doi.org/10.1016/j.agwat.2024.109098 Langa, I. M., Lado Ribeiro, A. R., Ratola, N., Gonçalves, V. M. F., Tiritan, M. E. & Ribeiro, C. (2024). Amphetamine-like substances and synthetic cathinones in Portuguese wastewater influents: Enantiomeric profiling and role of suspended particulate matter. Forensic Science International, 361(June), 1–12. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2024.112128 Li, R., Zhang, Y., Li, Y., Chen, Z., Wang, Z. & Wang, M. (2022). An Innovative Chiral UPLC-MS/MS Method for Enantioselective Determination and Dissipation in Soil of Fenpropidin Enantiomers. Molecules, 27(19). https://doi.org/10.3390/molecules27196530 Liang, C., Wei, Z. & Bester, K. (2024). 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L., Esteve-Núñez, A. & Boltes, K. (2025). Enhanced removal of chiral emerging contaminants by an electroactive biofilter. Environmental Science and Ecotechnology , 23. https://doi.org/10.1016/j.ese.2024.100500 Qiu, H., Zhu, B., Zhu, J., Chen, S., Ma, C., Xiang, H. & Tong, S. (2024). Recent advances in application of cyclodextrin-based chiral materials for enantioseparation. TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 175, 117708. https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117708 Ribeiro, O., Félix, L., Ribeiro, C., Castro, B., Tiritan, M. E., Monteiro, S. M. & Carrola, J. S. (2022). Enantioselective Ecotoxicity of Venlafaxine in Aquatic Organisms: Daphnia and Zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry, 41(8), 1851–1864. https://doi.org/10.1002/etc.5338 Sanganyado, E., Lu, Z., Fu, Q., Schlenk, D. & Gan, J. (2017). Chiral pharmaceuticals: A review on their environmental occurrence and fate processes. Water Research, 124, 527–542. https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.08.003 Tavengwa, N. 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Medicating the coast in a metropolitan city: Enantiomeric profiles and joint probabilistic risk assessment of antidepressants and antihistamines. Environment International, 184, 108434. https://doi.org/10.1016/j.envint.2024.108434 Wu, T., Li, X., Zheng, Z., Liu, Z., Yang, M., Zhang, N., Cui, J. & Zhang, B. (2023). Hexabromocyclododecanes in surface soil-maize system around Baiyangdian Lake in North China: Distribution, enantiomer-specific accumulation, transport, temporal trend and dietary risk. Journal of Hazardous Materials, 451(26), 131180. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131180 Zeng, Q., Huang, Z., Li, D. & Li, L. (2024). Preparation of a bis-triazolyl bridged β-cyclodextrin stationary phase and its application for enantioseparation of chiral compounds by HPLC. Chirality, 36(2), 1–16. https://doi.org/10.1002/chir.23644 Zheng, Q., Xu, Y., Cao, Z., Zhao, S., Bing, H., Li, J., Luo, C. & Zhang, G. (2023). Spatial redistribution and enantiomeric signatures of Capítulo 1. Antecedentes 103 hexachlorocyclohexanes in Chinese forest soils: Implications to environmental behavior and influencing factors. Science of the Total Environment, 894, 165024. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.165024 Zhong, J., Liu, X., Chen, L., Li, K., Hu, Q., Wu, K., Zhou, J., Shi, Y. & Fan, H. (2023). Simultaneous separation and determination of several chiral antidepressants and their enantiomers in wastewater by online heartcutting two-dimensional liquid chromatography. Ecotoxicology and Environmental Safety, 263. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115302 Capítulo 2 Objetivos y Plan de Trabajo Capítulo 2. Objetivos y Plan de Trabajo 112 2.2.5 Ensayos de persistencia y biodisponibilidad Se llevará a cabo un estudio del comportamiento enantioselectivo de fármacos quirales en suelos regados con aguas residuales urbanas y tratados con lodos de depuradora. Se realizará mediante ensayos de seguimiento, durante un periodo de 120 días, de las concentraciones de los compuestos propuestos en los suelos con unas condiciones climáticas determinadas (temperatura, humedad, radiación). Los resultados permitirán determinar la evolución en el tiempo de las fracciones enantioméricas de los contaminantes, evaluar los procesos de inversión quiral, y conocer la biodisponibilidad enantioselectiva de los fármacos. 2.3.6. Evaluación de riesgos para el medioambiente La evaluación de riesgos para el medioambiente de fármacos quirales se realizará en colaboración con el centro MARE-Marine and Environment Science Centre (Universidad de Lisboa), mediante ensayos enantioselectivos de ecotoxicidad, empleando como modelo, aprovechando la experiencia del grupo receptor, productores marinos primarios (microalga Phaeodactylum tricornutum). Durante los ensayos, se estudiarán: biomarcadores morfológicos, como la tasa de inhibición del crecimiento; metabólicos, como la actividad fotosintética y moleculares como los daños en el ADN; y la oxidación lipídica. Ello permitirá una estimación del riesgo para los ecosistemas marinos de cada uno de los enantiómeros de los fármacos estudiados. 2.3.7. Evaluación del empleo de nuevos materiales adsorbentes Como posible solución a la problemática existente por la incorporación de los contaminantes seleccionados a los suelos, se evaluará la eficacia de nuevos materiales adsorbentes en la eliminación de éstos de las Capítulo 2. Objetivos y Plan de Trabajo 113 aguas residuales urbanas, en colaboración con la Universidad de Mármara, Estambul. En una primera etapa se realizará la síntesis y caracterización del adsorbente mediante técnicas de difracción de rayos X, potencial Z, superficie específica, termogravimetría, microscopía electrónica de barrido y espectroscopía infrarroja. Posteriormente, se determinarán las condiciones óptimas para la eliminación de los enantiómeros mediante la realización de ensayos repetidos de puesta en contacto del material adsorbente con disoluciones acuosas de los contaminantes y con agua residual dopada. Capítulo 3 Metodologías analíticas para la determinación de fármacos quirales en muestras ambientales Capítulo 3. Metodologías analíticas 117 Capítulo 3. Metodologías analíticas para la determinación de fármacos quirales en muestras ambientales En este capítulo se describen las dos metodologías analíticas desarrolladas durante la Tesis Doctoral para la determinación enantioselectiva de un grupo de principios activos farmacológicos en muestras ambientales. Los analitos seleccionados fueron fármacos y metabolitos quirales pertenecientes a los grupos terapéuticos de β-bloqueantes y antidepresivos. Concretamente, tres β-bloqueantes: atenolol, metoprolol y propranolol y cinco antidepresivos y dos de sus metabolitos: citalopram, duloxetina, fluoxetina y su metabolito norfluoxetina, sertralina, venlafaxina y su metabolito O-desmetilvenlafaxina. La técnica para la determinación analítica empleada en ambas metodologías fue la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), haciendo uso de una columna quiral para lograr la separación enantiomérica. La primera metodología se optimizó y validó para el análisis de los compuestos seleccionados en matrices ambientales sólidas (suelo, compost y lodo digerido), mediante un tratamiento basado en una extracción asistida por ultrasonidos y una limpieza mediante d-SPE. La segunda metodología consistió en un procedimiento automatizado basado en la SPE online para la determinación de los analitos en aguas residuales. Capítulo 3. Metodologías analíticas 119 3.1 Determinación enantioselectiva de fármacos y metabolitos en suelos agrícolas, compost y lodo de depuradora Artículo Nº 4 Título: Enantioselective LC-MS/MS determination of antidepressants, β-blockers and metabolites in agricultural soil, compost and digested sewage sludge Marina Arenas, Julia Martín, Juan Luis Santos, Irene Aparicio, Esteban Alonso Departamento de Química Analítica, Escuela Politécnica Superior, Universidad de Sevilla, C/ Virgen de África, 7, E-41011, Seville, Spain. Revista: Analytica Chimica Acta Editor: Xiu-Ping Yan Editorial: Elsevier Año de Publicación: 2023 ISSN: 1873-4324 (Online) 0003-2670 (Impreso) Categoría: Chemistry, Analytical (SCIE) Posición de la revista en la categoría: 11/106 Factor de impacto (2023): 5.7 Factor de impacto (5 años): 5.5 Cuartil: Q1 Decil: D1 Capítulo 3. Metodologías analíticas 121 Resumen Artículo Nº 4 Esta primera propuesta consiste en un nuevo método analítico para la determinación enantioselectiva de los fármacos y metabolitos quirales seleccionados en suelos agrícolas, compost y lodo digerido de depuradora digerido anaeróbicamente. Estas matrices tienen especial interés medioambiental, dado que el compost y el lodo son dos de las principales fuentes de contaminantes emergentes en suelos y en los productos agrícolas cultivados en estos, al ser aplicados comúnmente como enmienda orgánica. La determinación enantioselectiva de los contaminantes quirales es fundamental para una evaluación adecuada de su riesgo medioambiental, ya que sus enantiómeros pueden presentar una ecotoxicidad diferente. Aunque la mayoría de los compuestos quirales se comercializan en su forma racémica, la fracción enantiomérica puede verse alterada en el medioambiente por procesos de adsorción y degradación enantioselectivos. No obstante, hasta la fecha, la mayoría de los estudios realizados sobre la presencia y los riesgos ambientales de productos farmacéuticos quirales en lodos de depuradora y suelos agrícolas no han considerado su quiralidad, probablemente debido al reto analítico que supone la separación de los enantiómeros, especialmente en matrices sólidas complejas. Para el desarrollo de la metodología, inicialmente se optimizó la determinación analítica mediante LC-MS/MS. La separación de los enantiómeros se consiguió empleando una columna quiral Chirobiotic V. Se evaluaron diferentes composiciones y valores de pH para la fase móvil, determinándose que las condiciones óptimas consisten en una elución isocrática con una mezcla de una solución acuosa de acetato de amonio 10 mM (ajustada a pH 4 con ácido fórmico) y metanol, en proporción (2:98, v/v). También se optimizó el flujo de la fase móvil, concluyendo que 0,4 mL min-1 es el valor más adecuado. Como resultado, se obtuvo un método cromatográfico multirresiduo, capaz de separar y determinar todos los enantiómeros de los analitos en 40 minutos. Capítulo 3. Metodologías analíticas 128 Capítulo 3. Metodologías analíticas 129 Capítulo 3. Metodologías analíticas 130 Capítulo 3. Metodologías analíticas 131 Capítulo 3. Metodologías analíticas 132 Capítulo 3. Metodologías analíticas 133 Capítulo 3. Metodologías analíticas 134 Capítulo 3. Metodologías analíticas 135 Capítulo 3. Metodologías analíticas 136 Capítulo 3. Metodologías analíticas 137 Capítulo 3. Metodologías analíticas 144 Capítulo 3. Metodologías analíticas 145 Capítulo 3. Metodologías analíticas 146 Capítulo 3. Metodologías analíticas 147 Capítulo 3. Metodologías analíticas 148 Capítulo 3. Metodologías analíticas 149 Capítulo 3. Metodologías analíticas 150 Capítulo 3. Metodologías analíticas 151 Capítulo 3. Metodologías analíticas 152 Capítulo 3. Metodologías analíticas 153