Diseño y síntesis de derivados mono- y multivalentes de 1,4-iminociclitoles: estudio de sus propiedades como inhibidores de glicosidasas.

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA DISEÑO Y SÍNTESIS DE DERIVADOS MONO- Y MULTIVALENTES DE 1,4-IMINOCICLITOLES. ESTUDIO DE SUS PROPIEDADES COMO INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Macarena Martínez Bailén Sevilla, 2019 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA DISEÑO Y SÍNTESIS DE DERIVADOS MONO- Y MULTIVALENTES DE 1,4-IMINOCICLITOLES. ESTUDIO DE SUS PROPIEDADES COMO INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Memoria presentada por la Graduada Macarena Martínez Bailén para optar al grado de Doctora en Química Sevilla, 2019 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA DISEÑO Y SÍNTESIS DE DERIVADOS MONO- Y MULTIVALENTES DE 1,4-IMINOCICLITOLES. ESTUDIO DE SUS PROPIEDADES COMO INHIBIDORES DE GLICOSIDASAS Vº Bº de los Directores de la Tesis Fdo. Dra. Inmaculada Robina Ramírez Catedrática de Universidad Depto. Química Orgánica Universidad de Sevilla Fdo. Dra. Ana T. Carmona Asenjo Profesora Titular de Universidad Depto. Química Orgánica Universidad de Sevilla Fdo. Dr. Antonio J. Moreno Vargas Profesor Titular de Universidad Depto. Química Orgánica Universidad de Sevilla “He aquí mi secreto, que no puede ser más simple: Sólo con el corazón se puede ver bien, lo esencial es invisible a los ojos” El Principito, Antoine de Saint-Exupéry (1900-1944) AGRADECIMIENTOS Parece que fue ayer cuando empezó mi aventura en Sevilla. Me vine a hacer un Máster con la incertidumbre más absoluta, sin saber qué me depararía esa época, pero con una meta clara: hacer el Doctorado en Química. “El destino es el que baraja las cartas, pero nosotros somos los que las jugamos.” Y a mí me toco seguir en Sevilla para conseguir mi objetivo, el cual estoy a punto de completar. Lo cierto es que no ha sido un camino fácil, de serlo no se llamaría Tesis Doctoral, pero lo que sí es verdad es que he estado rodeada de personas que me han ayudado, algunas ya conocidas y otras que me he ido encontrando por el camino y han decidido acompañarme. A todos ellos quiero agradecerles hoy su cariño y apoyo. A mis directores de Tesis: la Prof. Inmaculada Robina Ramírez, porque sin apenas conocerme, me permitiste entrar a formar parte del grupo de investigación para desarrollar el Trabajo Fin de Máster, y gracias sobre todo por apostar por mí para continuar con el Doctorado. Gracias por valorarme y por todas las enseñanzas, consejos y ánimos. A la Prof. Ana T. Carmona Asenjo por ayudarme desde el primer día y por todos los consejos que me has dado durante todos estos años. Gracias por estar siempre disponible, por tu nobleza, por escucharme y comprenderme, sobre todo en los malos momentos, cuando ni yo misma me entendía. Al Prof. Antonio J. Moreno Vargas, por animarme durante esta etapa y por enseñarme que siempre existe alguna solución aunque esté escondida en algún resquicio. Me has enseñado que con filosofía las cosas se ven de otra manera, y que, si hoy no salen, mañana será otro día. He aprendido mucho de vosotros tres durante todos estos años, tanto personal como profesionalmente. El destino fue el que me trajo a llamar a la puerta de Inmaculada, y si ya lo supe desde el principio, hoy puedo confirmarlo: no pudo traerme a un lugar mejor. Gracias de corazón a los tres por confiar en mí. Al Ministerio de Economía y Competitividad (Proyectos CTQ2016-77270-R y CTQ2012-31427), a la Junta de Andalucía (FQM-345) y al 7º Programa Marco de la Unión Europea (Proyecto 256986) por la financiación prestada. Al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte, por la concesión de un Contrato Predoctoral para la Formación del Profesorado Universitario (FPU), y de dos ayudas de movilidad para la realización de dos estancias predoctorales durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral. 2 Índice general 1.3.3.2. Estructura cristalina del complejo 139:-GCasa 128 Capítulo 2: Preparación y evaluación biológica de inhibidores multivalentes derivados de dihidroxipirrolidinas 133 2.1. Antecedentes 135 2.2. Objetivos 157 2.3. Resultados y discusión 158 2.3.1. Síntesis y evaluación biológica de iminoazúcares tri-, tetra-, hexa- y nonavalentes 158 2.3.1.1. Síntesis de pirrolidín-azidas 160 2.3.1.2. Síntesis de alquinos multivalentes 162 2.3.1.3. Obtención de iminoazúcares multiméricos mediante reacciones de CuAAC 164 2.3.1.4. Síntesis de iminoazúcares monovalentes de referencia 171 2.3.1.5. Evaluación biológica frente a glicosidasas lisosomales 172 2.3.1.6. Estudios de estructura-actividad frente a las -glucosidasas A y B de Bacillus polymyxa 177 2.3.1.6.1. Evaluación biológica 178 2.3.1.6.2. Estudios cristalográficos de los complejos 239:BglA y 227:BglA 181 2.3.1.6.3. Estudios de los complejos 239:BglA, 227:BglA y 229:BglA mediante RMN 188 2.3.2. Síntesis y evaluación biológica de iminoglicopolímeros derivados de pirrolidinas 195 2.3.2.1. Estudio preliminar. Selección de la unidad monomérica 196 2.3.2.1.1. Síntesis 196 2.3.2.1.2. Evaluación biológica 200 2.3.2.2. Reacciones de polimerización y evaluación biológica 203 Índice general 3 CONCLUSIONES/CONCLUSIONS 209 EXPERIMENTAL SECTION 217 1. Materials and methods 219 2. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 227 ANEXO I: Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática 357 ANEXO II: Polimerización RAFT 369 ANEXO III: Espectros representativos 375 ABREVIATURAS Abreviaturas 7 ABREVIATURAS -Fuc-asa -Fucosidasa -Gal-asa -Galactosidasa -Glc-asa -Glucosidasa -Man-asa -Manosidasa -Gal-asa -Galactosidasa -GCasa/-GCase -Glucocerebrosidasa (del inglés, “  -glucocerebrosidase”) -Glc-asa -Glucosidasa -Hex-asa N-Acetil--hexosaminidasa δ Desplazamiento químico L Microlitro M Micromolar Å Ángstrom Ac Acetilo ACVA Ácido 4,4’-azobis(4-ciano)pentanoico AEMA Azidoetilmetacrilato AFM Microscopía de fuerza atómica (del inglés, “Atomic Force Microscopy”) ap. Apariencia aq. Acuoso (del inglés, “aqueous”) aromat. Aromático Asc Ascorbato ASSC Chaperonas específicas del sitio activo (del inglés, “Active-Site-Specific Chaperones”) BglA -Glucosidasa A de Bacillus polymyxa BglB -Glucosidasa B de Bacillus polymyxa 8 Abreviaturas br. Ancho (del inglés, “broad”) Bn Bencilo Boc terc-Butoxicarbonilo Bu Butilo tBu terc-Butilo Bz Benzoílo calc. Calculado cat. Catalítico CAZy Carbohydrate-Active enZymes Cbz Benciloxicarbonilo c.c.f. Cromatografía en capa fina CIMS Espectrometría de masas de ionización química (del inglés, “Chemical Ionization Mass Spectrometry”) cm Centímetro cols. Colaboradores COSY Espectroscopía de correlación (del inglés, “COrrelated SpectroscopY”) CPCB 2-Ciano-2-propil-4-cianobenzoditioato Cq Carbono cuaternario CRD Regiones de reconocimiento específicas de carbohidratos (del inglés, “Carbohydrate Recognition Domains”) CTA Agente de transferencia de cadena (del inglés, “Chain Transfer Agent”) CuAAC Cicloadición 1,3-dipolar azida-alquino catalizada por Cu(I) Cuant. Cuantitativo d Día/Doblete D Aspartato (código de los aminoácidos) DAB 1,4-Didesoxi-1,4-imino-D-arabinitol Abreviaturas 9 DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno dd Doble doblete ddd Doble doble doblete DEAD Azodicarboxilato de dietilo DEG Di(etilenglicol) DGJ 1-Desoxigalactonojirimicina dGMII -Manosidasa II de Golgi de Drosophila melanogaster DIA 1,4-Didesoxi-1,4-imino-L-alitol DIPEA N,N-Diisopropiletilamina DLS Dispersión dinámica de luz (del inglés, “Dynamic Light Scattering”) DMAEMA N,N-Dimetilaminoetilmetacrilato DMAP 4-(N,N-Dimetilamino)piridina DMDP 2,5-Didesoxi-2,5-imino-D-manitol DMF N,N-Dimetilformamida DMJ 1-Desoximanojirimicina DMP Dimetoxipropano DMSO Dimetilsulfóxido DNJ 1-Desoxinojirimicina DPPA Difenilfosforilazida dt Doble triplete E Glutamato (código de los aminoácidos) EC Enzyme Comission ELLA Ensayo competitivo enzima-lectina (del inglés, “Enzyme-Linked Lectin Assay”) EM Microscopía electrónica (del inglés, “Electron Microscopy”) EMA Agencia Europea del Medicamento (del inglés, “European Medicines Agency”) 10 Abreviaturas EMEM Medio esencial mínimo de Eagle (del inglés, “Eagle’s Minimum Essential Medium”) ent Enantiómero eq Equivalente ERT Terapia enzimática sustitutiva (del inglés, “Enzyme Replacement Therapy”) ESIMS Espectrometría de masas de ionización por electrospray (del inglés, “ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry”) Et Etilo F Fenilalanina (código de los aminoácidos) FCS Suero fetal bovino (del inglés, “Fetal Calf Serum”) g Gramo GH Glicosilhidrolasa GM--Man -Manosidasa de Golgi GPC Cromatografía por permeación de gel (del inglés, “Gel Permeation Chromatography”) h Hora H Histidina (código de los aminoácidos) HBTU Hexafluorofosfato de N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1- il)uronio HEMA 2-Hidroxietilmetacrilato HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico HexAB Hexosaminidasas A y B de origen humano HMBC Correlación heteronuclear a múltiples enlaces (del inglés, “Heteronuclear Multiple Bond Correlation”) HOBt 1-Hidroxibenzotriazol HRCIMS CIMS de alta resolución Abreviaturas 11 HRMS Espectrometría de masas de alta resolución (del inglés, “High Resolution Mass Spectrometry”) HSQC Correlación heteronuclear de nivel cuántico individual (del inglés, “Heteronuclear Single Quantum Correlation”) Hz Hercio (del inglés, “Hertz”) IC50 Concentración de inhibidor necesaria para inhibir la actividad enzimática en un 50% IgG Inmunoglobulina G IR Infrarrojo ITC Calorimetría de titulación isotérmica (del inglés, “Isothermal Titration Calorimetry”) IUBMB Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (del inglés, “International Union of Biochemistry and Molecular Biology”) J Constante de acoplamiento JB-Man -Manosidasa de guisantes de Jack (del inglés, “Jack Bean”) K Grado Kelvin kDa Kilodalton KHz Kilohercio Ki Constante de inhibición competitiva K’i Constante de inhibición incompetitiva KLrP KLotho-related Protein L Leucina (código de los aminoácidos) LAB 1,4-Didesoxi-1,4-L-arabinitol LM--Man -Manosidasa lisosomal LManII -Manosidasa lisosomal II de Drosophila melanogaster LSD Enfermedad de almacenamiento lisosomal (del inglés, “Lysosomal Storage Disorders”) 18 Relación de compuestos Capítulo 1 (continuación) Relación de compuestos 19 Capítulo 1 (continuación) 20 Relación de compuestos Capítulo 2 Relación de compuestos 21 Capítulo 2 (continuación) 22 Relación de compuestos Capítulo 2 (continuación) RESUMEN/SUMMARY Resumen 25 RESUMEN/SUMMARY En esta Tesis Doctoral se presenta el diseño, síntesis y evaluación biológica de nuevos inhibidores mono- y multivalentes de glicosidasas de interés biológico y farmacológico. En el primer capítulo se ha llevado a cabo la preparación y evaluación biológica de un conjunto de derivados de pirrolidinas hidroxiladas obtenidos a partir de distintos monosacáridos como fuente de quiralidad, y utilizando diversos tipos de reacciones “click” para la introducción de diversidad estructural en los correspondientes conjugados a través de distintos grupos funcionales (triazol, amida y tiourea). Los mejores resultados fueron los obtenidos para los 1,4-imino-C-metilentriazoles epiméricos con configuración (2S,3S,4R) y (2R,3S,4R), preparados mediante reacción de cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos catalizada por Cu(I) (CuAAC). Las pirrolidín-azidas precursoras fueron elegidas como cabezas de serie para la preparación de librerías químicas de conjugados mediante el uso de una metodología de síntesis en paralelo seguido de evaluación biológica in situ frente a glicosidasas comerciales. Este procedimiento ha permitido seleccionar de manera rápida y sencilla los mejores inhibidores, los cuales fueron estudiados posteriormente frente a la -glucocerebrosidasa y -galactosidasa lisosomales, enzimas con actividad deficiente en las enfermedades de Gaucher y Fabry, respectivamente. Con el objetivo de estudiar la influencia de modificaciones estructurales sobre el resto arilo en la inhibición de la -glucocerebrosidasa, se ha llevado a cabo la preparación de una pequeña librería química de derivados 26 Resumen diferentemente sustituidos en el anillo aromático y su posterior evaluación como chaperonas farmacológicas. El estudio del complejo enzima-inhibidor mediante difracción de rayos X ha permitido analizar el modo de interacción de este tipo de compuestos con la - glucocerebrosidasa. Con el fin de contribuir al estudio del efecto multivalente en la inhibición a glicosidasas, en el segundo capítulo se desarrolla la síntesis de estructuras multivalentes que incorporan pirrolidinas hidroxiladas como inhítopos. Para la preparación de estructuras multivalentes se han utilizado moldes que incorporan grupos alquino (tri-, tetra-, hexa- y nonavalentes) y pirrolidín-azidas de configuración (2S,3S,4R) y (2R,3S,4R), conteniendo además distintos espaciadores entre el anillo de pirrolidina y la función azida. La evaluación biológica de los derivados multiméricos preparados ha permitido analizar la influencia de la variabilidad estructural de los multímeros obtenidos (configuración, valencia y espaciador) en la inhibición de la - glucocerebrosidasa y la -galactosidasa A lisosomales, observándose por primera vez efecto multivalente en la inhibición a esta última. Algunos de los derivados multiméricos con configuración (2S,3S,4R) han mostrado actividad inhibidora en el rango micromolar bajo frente a la enzima -glucosidasa A de Bacillus polymyxa. El estudio de algunos complejos enzima-inhibidor en disolución mediante experimentos de STD RMN y en estado sólido mediante difracción de rayos X, ha permitido analizar las interacciones establecidas entre la enzima y el inhibidor, observándose una buena concordancia entre los resultados obtenidos por ambas técnicas. Por último, se ha abordado la preparación y evaluación biológica de un nuevo tipo de iminoglicopolímeros que incorporan derivados de dihidroxipirrolidina como unidad monomérica. Summary 27 In this PhD Thesis, the design, synthesis and biological evaluation of novel mono- and multivalent inhibitors of glycosidases with therapeutical interest is presented. The synthesis and glycosidase inhibition of a set of aromatic linked dihydroxypyrrolidines is presented in the first chapter. These compounds have been prepared using monosaccharides as starting materials and “click” reactions for the introduction of functional diversity (triazole, amide and thiourea moieties) in the iminosugar hybrids. The best results have been obtained for the epimeric 1,4-imino-C-methylenetriazoles with (2S,3S,4R) and (2R,3S,4R) configuration, which have been prepared by copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) reactions. The corresponding azidomethylpyrrolidine precursors have been used for the preparation of chemical libraries using a methodology based on parallel synthesis followed by in situ biological screening towards commercial glycosidases. This procedure has allowed us to select the best inhibitors, which were also evaluated towards lysosomal - glucocerebrosidase and -galactosidase A, enzymes with deficient activity in Gaucher and Fabry diseases, respectively. With the aim of studying the influence of structural modifications on the aromatic moiety on -glucocerebrosidase (-GCase) inhibition, a small library of pyrrolidine-triazole hybrid molecules with different substitution pattern in the phenyl ring has been prepared and evaluated as pharmacological chaperones. The co-crystal structure of -GCase in complex with one of the new inhibitors has allowed the analysis of the interaction of this type of compounds with the enzyme. 34 Introducción general 2. Glicosidasas Las glicosidasas pueden clasificarse en función del sustrato que hidrolizan: amilasas (amilosa), xilanasas (xilano), quitinasas (quitina), entre otras. Una clasificación más tradicional es la que responde al tipo de enlace hidrolizado y su estereoquímica (ej.: -D- galactosidasa, que hidroliza enlaces glicosídicos  de unidades de D-galactosa). Si se tiene en cuenta la especificidad del sustrato, la IUBMB Enzyme Commission clasifica las glicosidasas usando la codificación EC 3.2.1.x. 15 Por último, otro sistema de clasificación bastante extendido atiende a las similitudes en las secuencias proteicas entre glicosidasas, estableciéndose las distintas familias “GH.” Los miembros de una misma familia presentan además un plegamiento proteico similar y una estructura del sitio activo que implica un mecanismo de acción parecido en la reacción de hidrólisis. 16 Cuando varias familias muestran uniformidad en sus estructuras tridimensionales a pesar de no presentar secuencias semejantes, se dice que pertenecen al mismo clan. 17 De manera general, la reacción de hidrólisis que cataliza una glicosidasa es la que se muestra en el Esquema 1. Esquema 1. Reacción de hidrólisis de un enlace glicosídico 15 Webb, E. C. Enzyme Nomenclature 1992. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology in the Nomenclature and Classification of Enzymes, Academic Press, Londres, 1992. 16 Henrissat, B.; Davies, G. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol. 1997, 7, 637-644. 17 (a) Davies, G.; Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 1995, 3, 853-859. (b) Henrissat, B.; Callebaut, I.; Fabrega, S.; Lehn, P.; Mornon, J. –P.; Davies, G. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 7090-7094. Introducción general 35 Si se examinan los productos obtenidos de la reacción de hidrólisis de un amplio rango de oligo- y polisacáridos, se pueden encontrar dos tipos de glicosidasas: aquellas que hidrolizan el enlace glicosídico situado en la unidad del extremo no reductor (exoglicosidasas), y las que actúan sobre enlaces glicosídicos intermedios (endo-glicosidasas) (Esquema 2). Esquema 2. Mecanismo de acción de las exo- y endo-glicosidasas Independientemente del tipo de glicosidasa (exo- o endo-), la hidrólisis puede ocurrir con retención o inversión de la configuración del carbono anomérico (Esquema 3). Esquema 3. Tipos de glicosidasas En 1953, Koshland estableció los mecanismos de hidrólisis con glicosidasas de retención e inversión. 18 Los dos mecanismos de hidrólisis implican un estado de transición de tipo catión oxocarbenio y la intervención de dos grupos carboxílicos pertenecientes a determinados aminoácidos (glutámico o aspártico) del sitio activo. 19 La máxima actividad 18 Koshland, D. E., Jr. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Rev. 1953, 28, 416-436. 19 (a) Zechel, D. L.; Withers, S. G. Glycosidase mechanisms: anatomy of a finely tuned catalyst. Acc. Chem. Res. 2000, 33, 11-18. (b) Rye, C. S.; Withers, S. G. Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 573- 36 Introducción general enzimática ocurre en una región de pH en donde un grupo carboxílico está protonado, mientras que el otro está ionizado. 20 Glicosidasas de retención: los dos grupos carboxílicos se encuentran a una distancia de 5.5 Å entre sí, y la reacción consiste en un doble desplazamiento que implica un intermedio glicosil-enzima de tipo covalente. En el primer paso, uno de los ácidos carboxílicos que actúa como catalizador ácido (AH) protona el glicósido, generando un buen grupo saliente que al eliminarse da lugar al ion oxocarbenio. Seguidamente, un grupo carboxilato (B-) de dicha enzima estabiliza el estado de transición de tipo oxocarbenio mediante la formación de un enlace covalente con la enzima. Posteriormente, en el paso de hidrólisis, el ataque del agua al centro anomérico rompe la unión covalente. La doble inversión conduce a una retención neta de la configuración (Esquema 4). Esquema 4. Mecanismo de la reacción de hidrólisis catalizada por una glicosidasa de retención 580. (c) McCarter, J. D.; Withers, S. G. Mechanisms of enzymic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 1994, 4, 885-892. (d) Wang, Q.; Graham, R. W.; Trimbur, D.; Warren, R. A. J.; Withers, S. G. Changing enzymic reaction mechanisms by mutagenesis: conversion of a retaining glucosidase to an inverting enzyme. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 11594-11595. 20 Withers, S. G. Enzymic cleavage of glycosides: how does it happen? Pure. Appl. Chem. 1995, 67, 1673-1682. Introducción general 37 Glicosidasas de inversión: en este caso, los dos grupos carboxílicos se encuentran a una distancia de 10.5 Å permitiendo la inclusión del sustrato y una molécula de agua entre ellos. Este mecanismo implica un solo proceso de inversión, efectuando la molécula de agua el desplazamiento directo sobre el centro anomérico (Esquema 5). Esquema 5. Mecanismo de la reacción de hidrólisis catalizada por una glicosidasa de inversión Un área de investigación en actual desarrollo, en términos sintéticos y bioquímicos, es la inhibición de las glicosidasas implicadas en el procesado de carbohidratos, debido a su amplia aplicabilidad, englobando desde procesos industriales como la degradación de biomasa, hasta el desarrollo de fármacos. 3. Iminoazúcares y sus propiedades como inhibidores de glicosidasas Un tipo ideal de moléculas para explorar sus propiedades como posibles inhibidores de glicosidasas son los glicomiméticos, ya que son compuestos capaces de imitar la estructura del sustrato o del estado de transición correspondiente a la hidrólisis del enlace glicosídico. Los iminoazúcares, tanto sintéticos como naturales, son moléculas pequeñas que contienen un átomo de nitrógeno en lugar del oxígeno endocíclico de los carbohidratos. 21 Presentan un marcado carácter polar y constituyen el grupo más atractivo de miméticos de 21 (a) Compain, P.; Martin, O. R. Iminosugars: from synthesis to therapeutic applications, Wiley-VCH, Alemania, 2007. (b) Stütz, A. E. Iminosugars as glycosidase inhibitors: nojirimycin and beyond, Wiley-VCH, Alemania, 1999. 38 Introducción general carbohidratos, lo cual les confiere grandes ventajas para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Pueden presentar estructura monocíclica o bicíclica y clasificarse en varias familias, entre las que destacan las pirrolidinas (2,5-didesoxi-2,5-imino-D-glucitol 1 y 1,4- didesoxi-1,4-L-arabinitol, LAB 2), las piperidinas (nojirimicina 3, 1-desoxinojirimicina 4 e isofagomina 5) y los azepanos (6) como iminoazúcares monocíclicos. Como ejemplo de estructuras bicíclicas encontramos los nortropanos (calistegina A3 7 y calistegina B1 8), las pirrolizidinas (australina 9 y casuarina 10) y las indolizidinas (swansonina 11 y castanospermina 12) (Figura 2). 22 Figura 2. Clasificación de los iminoazúcares A pesar de que estos compuestos atrajeron la atención de la industria farmacéutica a partir de los años 80 como agentes anti-cáncer y anti-VIH, 23 posteriormente han mostrado actividad en otras áreas terapéuticas, como en el tratamiento de la diabetes, infecciones 22 Horne, G.; Wilson, F. X.; Tinsley, J.; Williams, D. H.; Storer, R. Iminosugars past, present and future: medicines for tomorrow. Drug Discovery Today 2011, 16, 107-118. 23 (a) Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J.; Carmona, A. T.; Vogel, P. Glycosidase Inhibitors as potential HIV Entry Inhibitors? Current Drug Metabolism, 2004, 5, 329-361. (b) Fleet, G. W. J.; Karpas, A.; Dwek, R. A.; Fellows, L. E.; Tyms, A. S.; Petursson, S.; Namgoong, S. K.; Ramsden, N. G.; Smith, P. W.; Son, J. C.; Wilson, F.; Witty, D. R.; Jacob, G. S.; Rademacher, T. W. Inhibition of HIV replication by amino-sugar derivatives. FEBS Lett. 1988, 237, 128-132. (c) Humphries, M. J.; Matsumoto, K.; White, S. L.; Olden, K. Oligosaccharide modification by swainsonine treatment inhibits pulmonary colonization by B16-F10 murine melanoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 1752-1756. Introducción general 39 virales o enfermedades de almacenamiento lisosomal. 24 , 25 Existen en el mercado medicamentos derivados de iminoazúcares que actúan como inhibidores enzimáticos, entre los que destacan el Miglitol (Glyset®, Diastabol®, [N-(2-hidroxietil)-desoxinojirimicina]), usado en el tratamiento de la diabetes de tipo II. Su mecanismo de acción consiste en la inhibición de la -1,4-glucosidasa intestinal disminuyendo la absorción de glucosa en el intestino en diabéticos no insulino-dependientes. 26 El Miglustat (Zavesca®, N- butildesoxinojirimicina), que fue aprobado por la Agencia Europea del Medicamento (EMA) en 2002 para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher y en 2009 como terapia para la enfermedad de Niemann-Pick (tipo C), presenta un mecanismo de acción que implica la inhibición de la enzima glicosilceramida-sintetasa, una glucosiltransferasa responsable de la síntesis de una gran variedad de glicoesfingolípidos. 27 Por último, el Migalastat (Galafold®, 1-desoxigalactonojirimicina, DGJ) ha sido aprobado en 2016 para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, actuando como chaperona farmacológica sobre la enzima - galactosidasa A de lisosoma humano (Figura 3). 28 Las enfermedades de Gaucher, Niemann- Pick y Fabry son enfermedades de almacenamiento lisosomal que implican la acumulación de glicoesfingolípidos no degradados debido a disfunciones en las enzimas asociadas a su degradación (ver apartado 4). 24 Butters, T. D.; Dwek, R. A.; Platt, F. M. Iminosugar inhibitors for treating the lysosomal glycosphingolipidoses. Glycobiology 2005, 15, 43R-52R. 25 (a) Moriyama, H.; Tsukida, T.; Inoue, Y.; Yokota, K.; Yoshino, K.; Kondo, H.; Miura, N.; Nishimura, S. Azasugar-based MMP/ADAM inhibitors as antipsoriatic agents. J. Med. Chem. 2004, 47, 1930-1938. (b) Liu, J.; Shikhman, A. R.; Lotz, M. K.; Wong, C. –H. Hexosaminidase inhibitors as new drug candidates for the therapy of osteoarthritis. Chem. Biol. 2001, 8, 701-711. 26 Scott, L. J.; Spencer, C. M. Miglitol: a review of its therapeutic potential in type 2 diabetes mellitus. Drugs 2000, 59, 521-549. 27 Venier, R. E.; Igdoura, S. A. Miglustat as a therapeutic agent: prospects and caveats. J. Med. Genet. 2012, 49, 591-597. 28 Markham, A. Migalastat: first global approval. Drugs 2016, 76, 1147-1152. 40 Introducción general Figura 3. Ejemplos de iminoazúcares usados como fármacos Gran parte de la habilidad de estos compuestos para actuar como inhibidores de glicosidasas se atribuye a su forma, basicidad y capacidad de unirse al sitio activo de la enzima. 29 Además, presentan varias propiedades intrínsecas que les confieren potencial terapéutico, como son su adecuada solubilidad en medio acuoso, su estabilidad química y metabólica y la facilidad de ser excretados en la orina. Una aproximación bastante común para el desarrollo de iminoazúcares como inhibidores de glicosidasas consiste en mimetizar el estado de transición que se postula durante el proceso de hidrólisis de un glicósido. Esto se debe a que a pH fisiológico el átomo de nitrógeno del iminoazúcar se encuentra protonado y su estructura se asemeja, en términos de carga y forma, a la estructura tipo catión oxocarbenio postulada en el estado de transición de la reacción catalizada por la glicosidasa (Figura 4). 29 (a) Asano, N.; Nash, R. J.; Molyneux, R. J.; Fleet, G. W. J. Sugar-mimic glycosidase inhibitors: natural occurrence, biological activity and prospects for therapeutic application. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 1645-1680. (b) Wong, C. –H. Mimics of complex carbohydrates recognized by receptors. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 376-385. Introducción general 41  Figura 4. Estado de transición de la reacción de hidrólisis y similitud con los iminoazúcares Con el objetivo de profundizar en el conocimiento del proceso de hidrólisis a nivel mecanístico, se han llevado a cabo estudios de complejos inhibidor-enzima y de enzimasustrato mediante cristalografía de rayos X y se han determinado los valores termodinámicos de afinidad (ΔHo, ΔSo) por calorimetría, estudios cinéticos y experimentos de mutagénesis. 30 El desarrollo de experimentos de RMN y “docking” de complejos inhibidor-enzima, también han sido útiles para optimizar el diseño de inhibidores de glicosidasas. 31 30 (a) Caines, M. E. C.; Hancock, S. M.; Tarling, C. A.; Wrodnigg, T. M.; Stick, R. V.; Stütz, A. E.; Vasella, A.; Withers, S. G.; Strynadka, N. C. J. The structural basis of glycosidase inhibition by five-membered iminocyclitols: the clan A glycoside hydrolase endoglycoceramidase as a model system. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4474-4476. (b) Fushinobu, S.; Hidaka, M.; Miyanaga, A.; Imamura, H. New structural insights on carbohydrate-active enzymes. J. Appl. Glycosci. 2007, 54, 95-102. (c) Whitworth, G. E.; Macauley, M. S.; Stubbs, K. A.; Dennis, R. J.; Taylor, E. J.; Davies, G. J.; Greig, I. R.; Vocadlo, D. J. Analysis of PUGNAc and NAG-thiazoline as transition state analogues for human O-GlcNAcase: mechanistic and structural insights into inhibitor selectivity and transition state poise. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 635-644. 31 (a) Ardvol, A.; Rovira, C. Reaction mechanisms in carbohydrate-active enzymes: glycoside hydrolases and glycosyltransferases. Insights from ab initio quantum mechanics/molecular mechanics dynamic simulations. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 7528-7547. (b) Calle, L.; Roldós, V.; Cañada, F. J.; Uhrig, M. L.; Cagnoni, A. J.; Manzano, V. E.; Varela, O.; Jiménez-Barbero, J. Escherichia coli β-galactosidase inhibitors through modifications at the aglyconic moiety: experimental evidence of conformational distortion in the molecular recognition process. Chem. Eur. J. 2013, 19, 4262-4270. (c) Sivertsen, A. C.; Gasior, M.; Bjerring, M.; Hansen, S. U.; López, O.; Nielsen, N. C.; Bols, M. Active site protonation of 1-azafagomine in glucosidases studied by solid-state NMR spectroscopy. Eur. J. Org. Chem. 2007, 1735-1742. 42 Introducción general 4. Enfermedades de almacenamiendo lisosomal (LSDs) Los lisosomas son orgánulos citoplasmáticos que se encargan de llevar a cabo la función degradativa en células eucariotas, con más de 50 hidrolasas implicadas en este proceso. 32 Cuando existe una mutación en un gen que codifica alguna de estas enzimas aparecen alteraciones en la conformación y estabilidad de las mismas, lo que se traduce en una actividad enzimática deficiente que se encuentra en el origen de las llamadas enfermedades de almacenamiento lisosomal (del inglés, “Lysosomal Storage Disorders” o LSDs). Estas patologías tienen en común un metabolismo anómalo de macromoléculas como glicoesfingolípidos, glucógeno, mucopolisacáridos y glicoproteínas, conduciendo a su acumulación en los lisosomas. 33 Se han identificado más de 70 trastornos causados por mutaciones en enzimas metabólicas o en los activadores requeridos para la degradación de estas sustancias. La mayoría de estas enfermedades son neuropáticas e implican cambios neurológicos y degenerativos de intensidad variable. 34 En la Tabla 1 se recogen algunos de estos trastornos. 32 de Duve, C.; Wattiaux, Robert. Functions of lysosomes. Annu. Rev. Physiol. 1966, 28, 435-492. 33 Winchester, B.; Vellodi, A.; Young, E. The molecular basis of lysosomal storage diseases and their treatment. Biochem. Soc. Trans. 2000, 28, 150-154. 34 Platt, F. M. Emptying the stores: lysosomal diseases and therapeutic strategies. Nat. Rev. Drug Discovery 2018, 17, 133-150. Introducción general 43 Tabla 1. Ejemplos de enfermedades de almacenamiento lisosomal Enfermedad Enzima defectuosa Sustancia acumulada Gangliosidosis GM1 -Galactosidasa (ácida) Gangliósido GM1 Morquio B -Galactosidasa (ácida) Queratán sulfato Pompe -Glucosidasa (ácida) Glucógeno Gaucher -Glucocerebrosidasa Glucosilceramida Fabry -Galactosidasa A Globotriaosilceramida Tay-Sachs -Hexosaminidasa A Gangliósido GM2 Sandhoff -Hexosaminidasa B Globósido Sialidosis Sialidasa Gangliósido GM3 Krabbe -Galactocerebrosidasa Galactosilceramida (galactosilesfingosina) Dos de las LSDs con mayor prevalencia son la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosomal más común y deriva de una mutación en el gen que codifica la - glucocerebrosidasa lisosomal. Esta enzima está implicada en la degradación de glucosilceramida, un intermedio natural del catabolismo de globósidos y gangliósidos. Como consecuencia de esta disfunción se produce una acumulación de glucosilceramida en los lisosomas, lo que origina manifestaciones clínicas como hepatoesplenomegalia, hiperesplenismo secundario, anemia, anomalías esqueléticas y disfunciones neurológicas. En función de la edad de aparición y de la extensión de los síntomas neurológicos, se pueden establecer tres fenotipos para esta enfermedad: tipo I (adulto, no implica síntomas neuropáticos), y los tipos II (infantil) y III (juvenil) que implican anomalías en el sistema nervioso central. El fenotipo I es el más común, mientras que los tipos II y III se presentan con menos frecuencia. 35 Se han identificado más de 300 mutaciones, siendo las más 35 Stirnemann, J.; Belmatoug, N.; Camou, F.; Serratrice, C.; Froissart, R.; Caillaud, C.; Levade, T.; Astudillo, L.; Serratrice, J.; Brassier, A.; Rose, C.; Billette de Villemeur, T.; Berger, M. G. A review of Gaucher Disease pathophysiology, clinical presentation and treatments. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 441/1-441/30. 50 Introducción general Aunque se podría pensar que para llevar a cabo una respuesta fisiológica selectiva es necesaria una alta afinidad en la interacción ligando-proteína, esto también puede conseguirse a través de múltiples interacciones entre el ligando y zonas de reconocimiento del receptor. El efecto multivalente se define como el incremento de la respuesta biológica observada para compuestos que poseen más de una unidad o ligando bioactivo anclado a una plataforma común, comparado con la suma de las contribuciones de cada unidad bioactiva por separado (Figura 7). Este efecto multivalente se puede cuantificar mediante un parámetro conocido como rp/n, que se define como la potencia de inhibición relativa (rp) por unidad monomérica, siendo n la valencia del multímero. Figura 7. Representación general de un derivado multivalente Existe en la bibliografía un amplio número de glicoconjugados multivalentes preparados a partir de carbohidratos, observándose valores de rp/n de hasta 106 en la interacción con lectinas. 60 El éxito obtenido en la aplicación del efecto multivalente ha estado prácticamente restringido al ámbito de las lectinas, siendo su extensión a otras proteínas y procesos celulares relativamente escasa. 61 60 (a) Müller, C.; Despras, G.; Lindhorst, T. K. Organizing multivalency in carbohydrate recognition. Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 3275-3302. (b) Lo Conte, M.; Staderini, S.; Chambery, A.; Berthet, N.; Dumy, P.; Renaudet, O.; Marra, A.; Dondoni, A. Glycoside and peptide clustering around the octasilsesquioxane scaffold via photoinduced free-radical thiol-ene coupling. The observation of a striking glycoside cluster effect. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 3269-3277. Introducción general 51 Las glicosidasas son enzimas de naturaleza generalmente monomérica, presentando la mayor parte de ellas un único sitio activo. Este hecho, unido a las normalmente complejas síntesis de derivados de iminoazúcares, justifica que el desarrollo de inhibidores para estas enzimas se haya centrado principalmente en compuestos monovalentes. Sin embargo, los trabajos llevados a cabo por distintos grupos de investigación durante la última década, 62 han puesto de manifiesto que el fenómeno de la multivalencia puede generar inhibidores de glicosidasas más potentes y selectivos, lo que se traduce en una minimización de efectos secundarios, aspecto crucial en el contexto de posibles aplicaciones clínicas. La 1-desoxinojirimicina (DNJ) y 1-desoximanojirimicina (DMJ) son dos de los iminoazúcares más estudiados en la preparación de derivados multivalentes como inhibidores de glicosidasas. La mayor parte de estos derivados se han sintetizado utilizando la reacción de cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos catalizada por Cu(I) (CuAAC) como método de anclaje de los iminoazúcares a las correspondientes plataformas multiméricas. (Figura 8). Figura 8. Iminoazúcares utilizados para la preparación de derivados multivalentes 61 (a) Silpe, J. E.; Sumit, M.; Thomas, T. P.; Huang, B.; Kotlyar, A.; van Dongen, M. A.; Banaszak Holl, M. M.; Orr, B. G.; Choi, S –K. Avidity modulation of folate-targeted multivalent dendrimers for evaluating biophysical models of cancer targeting nanoparticles. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 2063-2071. (b) Choi, S. –K. Synthetic multivalent molecules: concepts and biomedical applications. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, Nueva Jersey, 2004. (c) Boturyn, D.; Coll, J. –L.; Garanger, E.; Favrot, M. –C.; Dumy, P. Template assembled cyclopeptides as multimeric system for integrin targeting and endocytosis. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 5730-5739. (d) Lundquist, J. J.; Toone, E. J. The cluster glycoside effect. Chem. Rev. 2002, 102, 555-578. 62 Ver revisiones: (a) Zelli, R.; Longevial, J. –F.; Dumy, P.; Marra, A. Synthesis and biological properties of multivalent iminosugars. New. J. Chem. 2015, 39, 5050-5074. (b) Compain, P. Searching for glycomimetics that target protein misfolding in rare diseases: successes, failures, and unexpected progress made in organic synthesis. Synlett 2014, 25, 1215-1240. (c) Gouin, S. G. Multivalent inhibitors for carbohydrate-processing enzymes: beyond the “lock-and-key” concept. Chem. Eur. J. 2014, 20, 11616-11628. 52 Introducción general Para la síntesis de estructuras multiméricas se ha utilizado una gran variedad de plataformas con distintas arquitecturas como macrociclos, calixarenos, ciclodextrinas, fullerenos, polímeros y estructuras dendriméricas, entre otros (Figura 9). 63 Figura 9. Ejemplos de plataformas usadas en la preparación de estructuras multiméricas El estudio del efecto multivalente a nivel mecanístico es un proceso largo y complejo. Tomando como base los estudios existentes en el ámbito de las interacciones lectinas-carbohidratos 64 y por analogía a los mecanismos que operan en las proteínas con un único sitio activo, el efecto multivalente en glicosidasas puede explicarse en base a distintos mecanismos (Figura 10). En el efecto estadístico (Figura 10A), el aumento de actividad se debe a la alta concentración local de inhibidor en las proximidades del sitio activo. El efecto quelato (Figura 10B) surge cuando la enzima presenta más de un sitio activo. 63 Röckendorf, N.; Lindhorst, T. K. Glycodendrimers. Top. Curr. Chem. 2001, 217, 201-238. 64 (a) Wittmann, V.; Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 4492-4503. (b) Chabre, Y. M.; Roy, R. Multivalent glycoconjugate syntheses and applications using aromatic scaffolds Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 4657-4708. (c) Martínez, A.; Ortiz Mellet, C.; García Fernández, J. M. Cyclodextrin-based multivalent glycodisplays: covalent and supramolecular conjugates to assess carbohydrate-protein interactions. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 4746-4773. Introducción general 53 Adicionalmente, el efecto multivalente puede explicarse en base a interacciones secundarias adicionales con zonas no catalíticas (Figura 10C) o por oclusión del sitio activo en presencia de ligandos voluminosos (Figura 10D). El efecto clúster aparece cuando un derivado multivalente puede unirse a varias enzimas simultáneamente (Figura 10E). Por último, si la enzima posee naturaleza multimérica, pueden formarse sistemas entrecruzados (Figura 10F). 65 Figura 10.65 Mecanismos propuestos para explicar el efecto multivalente en la inhibición de glicosidasas El estudio del mecanismo que opera en la interacción inhibidor multivalente-enzima puede llevarse a cabo utilizando diversas técnicas entre las que se encuentran la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), microscopía de fuerza atómica (AFM), dispersión dinámica 65 Matassini, C.; Parmeggiani, C.; Cardona, F.; Goti, A. Are enzymes sensitive to the multivalent effect? Emerging evidence with glycosidases. Tetrahedron Lett. 2016, 57, 5407-5415. 54 Introducción general de la luz (DLS), ensayos competitivos enzima-lectina (ELLA), difracción de rayos X, microscopía de transmisión electrónica (TEM) y resonancia magnética nuclear (RMN). 66 Aunque el estudio del fenómeno de la multivalencia en la inhibición de glicosidasas ha experimentado un crecimiento exponencial en los últimos años, los ejemplos sobre glicosidasas de interés terapéutico y sus mecanismos de acción son aún escasos. La importancia del papel que desempeñan las glicosidasas en una gran diversidad de procesos biológicos hace por tanto necesario profundizar en el estudio de sus inhibidores a nivel monovalente y multivalente de cara al desarrollo de nuevas aproximaciones terapéuticas. 6. Reacciones de tipo “click”: “Click Chemistry” Las reacciones de tipo “click” son uno de los métodos más poderosos para llevar a cabo la unión irreversible de dos bloques moleculares de distinta naturaleza de una forma rápida y eficiente. Su alto grado de fiabilidad, su completa especificidad, la biocompatibilidad de los reactivos y los protocolos sencillos de purificación hacen de estas reacciones una metodología muy adecuada para la rápida generación de librerías químicas de conjugados, lo que es de gran interés para el establecimiento de relaciones estructuraactividad (SAR). 67 La química “click” es una estrategia sintética basada en los principios de la química combinatoria y fue introducido por el profesor Sharpless en 2001. 68 Esta metodología permite la síntesis de una variedad de estructuras complejas mediante la formación de 66 (a) Compain, P.; Bodlenner, A. The multivalent effect in glycosidase inhibition: a new, rapidly emerging topic in glycoscience. ChemBioChem 2014, 15, 1239-1251. (b) Mirabella, S.; D’Adamio, G.; Matassini, C.; Goti, A.; Delgado, S.; Gimeno, A.; Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J.; Šesták, S.; Jiménez-Barbero, J.; Cardona, F. Mechanistic insight into the binding of multivalent pyrrolidines to -mannosidases. Chem. Eur. J. 2017, 23, 14585-14596. 67 Thirumurugan, P.; Matosiuk, D.; Jozwiak, K. “Click” Chemistry for drug development and diverse chemicalbiology applications. Chem. Rev. 2013, 113, 4905-4979. 68 Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. “Click” chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021. Introducción general 55 enlaces C-heteroátomo de una forma eficaz. Para que una reacción se considere de tipo “click” se deben cumplir los siguientes requisitos: a) Es experimentalmente sencilla e implica el uso de reactivos fácilmente disponibles. b) Es tolerante a una amplia variedad de grupos funcionales y condiciones de reacción en varios tipos de interfases como sólido/líquido, líquido/líquido, o incluso sólido/sólido. c) Es altamente selectiva y regioespecífica. d) Da lugar a la formación del producto de reacción de forma cuantitativa. e) Es insensible al oxígeno o al agua. f) La etapa de aislamiento del producto final es sencilla sin necesidad de una purificación cromatográfica. A pesar de que existe una amplia gama de reacciones químicas que podrían encuadrarse dentro de la metodología “click”, existen cuatro tipos principales: 69 1. Reacciones de cicloadición 1,3-dipolares o cicloadiciones [4+2] como las hetero Diels-Alder. 2. Reacciones de adición a enlaces múltiples C-C, en particular las reacciones de oxidación tales como la epoxidación, dihidroxilación, aminohidroxilación, aziridación y adiciones de haluros de nitrosilo y sulfonilo. Por último, algunas reacciones tipo Michael también pueden considerarse dentro de este grupo. 3. Reacciones de sustitución nucleofílica/apertura de anillo, sobre todo de electrófilos heterocíclicos tales como epóxidos, aziridinas, sulfatos, iones aziridinio e iones episulfonio. 4. Reacciones del grupo carbonilo de tipo no aldólica, como la formación de éteres de oxima, hidrazonas y heterociclos aromáticos. 69 Tiwari, V. K.; Mishra, B. B.; Mishra, K. B.; Mishra, N.; Singh, A. S.; Chen, X. Cu-Catalyzed “click” reaction in carbohydrate chemistry. Chem. Rev. 2016, 116, 3086-3240. 56 Introducción general La reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre azidas y alquinos se ha establecido como la reacción prototipo dentro de la química “click” y fue descrita por primera vez por Huisgen en 1960, siendo la ruta más eficiente para sintetizar 1,2,3-triazoles. 70 Generalmente, este proceso requiere elevadas temperaturas y largos períodos de reacción, además de obtenerse una mezcla prácticamente equimolar de los dos regioisómeros posibles (1,4 y 1,5). 71 El auge de este tipo de reacciones tuvo lugar en el año 2002, después del descubrimiento del proceso catalizado por Cu (I), el cuál no sólo conducía a un aumento de la velocidad de reacción de hasta 107 veces, sino que además proporcionaba una regioselectividad absoluta hacia el isómero 1,4. 72 (Esquema 6). Esquema 6. Efecto de la catálisis con Cu en la reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre azidas y alquinos Existen tres estrategias generales para asegurar la presencia de iones Cu (I) en el medio de reacción. La elección de una u otra dependerá de las condiciones experimentales de la reacción. 70 Huisgen, R.; Szeimies, G.; Moebius, L. 1,3-Dipolar cycloadditions. XXXII. Kinetics of the addition of organic azides to carbon-carbon multiple bonds. Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507. 71 Huisgen, R. 1,3-Dipolar cycloadditions: introduction, survey, mechanism. En: 1,3-Dipolar cycloaddition chemistry, Padwa, A., Ed. Wiley, Nueva York, 1984, páginas 1-176. 72 (a) Tornøe, C. W.; Christensen, C.; Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064. (b) Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599. Introducción general 57 Reducción de sales de Cu (II). La reducción in situ de sales de Cu (II) posee la ventaja de no requerir atmósferas inertes a pesar de la inestabilidad del estado de oxidación +1 del cobre en presencia de oxígeno. 73 En disolución se utiliza tradicionalmente el sulfato de cobre y ascorbato sódico como agente reductor. 74 Oxidación de Cu metálico. La oxidación de cobre metálico (añadido en forma de alambre) en presencia de sales de Cu (II) proporciona otro método efectivo para la generación de una cantidad suficiente de iones Cu (I) como para activar la cicloadición entre alquinos y azidas. Sin embargo, este método requiere en general de tiempos de reacción mayores que otros métodos, así como una mayor cantidad de Cu (II). 75 Adición de sales de Cu (I). La adición directa de sales solubles de Cu (I) es también un método muy extendido para llevar a cabo la reacción en disolventes orgánicos. En este método se emplea un exceso molar de ciertas bases de nitrógeno como trietilamina, piridina o DIPEA que favorecen la reacción de cicloadición mediante la estabilización del estado de oxidación +1 del metal. 76 La reacción CuAAC (del inglés, “Copper(I)-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition”), comúnmente conocida como reacción “click”, es la herramienta más potente para la preparación de moléculas complejas de manera fácil y sencilla. El mecanismo de la reacción, estudiado a través de cálculos teóricos y experimentos cinéticos, implica 73 Díaz, D. D.; Punna, S.; Holzer, P.; McPherson, A. K.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V.; Finn, M. G. “Click” chemistry in materials synthesis. 1. Adhesive polymers from copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 2004, 42, 4392-4403. 74 Wu, P.; Feldman, A. K.; Nugent, A. K.; Hawker, C. J.; Scheel, A.; Voit, B.; Pyun, J.; Fréchet, J. M. J.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V. Efficiency and fidelity in a “click”-chemistry route to triazole dendrimers by the copper(I)-catalyzed ligation of azides and alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004, 43, 3928-3932. 75 Himo, F.; Lovell, T.; Hilgraf, R.; Rostovstev, V. V.; Noodleman, L.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V. Copper(I)- catalyzed synthesis of azoles. DFT Study predicts unprecedented reactivity and intermediates. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 210-216. 76 (a) Shao, C.; Wang, X.; Zhang, Q.; Luo, S.; Zhao, J.; Hu, Y. Acid-base jointly promoted copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. J. Org. Chem. 2011, 76, 6832-6836. (b) Shao, C.; Wang, X.; Xu, J.; Zhao, J.; Zhang, Q.; Hu, Y. Carboxylic acid-promoted copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. J. Org. Chem. 2010, 75, 7002-7005. 58 Introducción general varias etapas. 77 En la bibliografía se proponen dos posibles mecanismos (A y B) (Esquema 7). Esquema 7. Mecanismos propuestos para la reacción de CuAAC El ciclo catalítico que se propone para esta reacción se basa en los precedentes sobre la inserción de Cu (I) en alquinos terminales y la falta de reactividad de los alquinos internos en esta reacción. 78 77 (a) Straub, B. F. -Acetylide and -alkenylidene ligands in “click” triazole syntheses. Chem. Commun. 2007, 3868-3870. (b) Rodionov, V. O.; Fokin, V. V.; Finn, M. G. Mechanism of the ligand-free CuI-catalyzed azidealkyne cycloaddition reaction. Angew. Chem., Int. Ed. 2005, 44, 2210-2215. 78 Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599. Introducción general 59 Al inicio de la reacción, la especie de Cu (I) se compleja al alquino terminal para dar lugar a un agregado (IA ó IB), el cual en un medio prótico se desprotona para dar lugar a los acetiluros de cobre IIA y IIB. 79 La reacción de estas especies con una azida proporciona los complejos IIIA y IIIB, los cuales evolucionan mediante ataque nucleofílico del nitrógeno 3 al carbono 4 del acetiluro generando así los metalociclos IVA y IVB. 80 De esta forma, el par de electrones solitario del nitrógeno 1 ataca al carbono 5, favoreciendo la contracción transanular que genera la especie V. 81 Finalmente, este intermedio evoluciona por un proceso ácido-base para liberar el producto final de la reacción y el catalizador que puede iniciar un nuevo ciclo. Las propiedades físico-químicas y biológicas del bloque estructural 1,2,3-triazol lo hacen un mimético del enlace peptídico pero con la ventaja de no ser hidrolizado enzimáticamente. 82 Además, son resistentes a la oxidación y a la reducción. 83 La diferencia estructural más notable entre 1,2,3-triazoles y amidas radica en el aumento de la distancia entre los átomos de carbono conectados a las posiciones 1 y 4 del anillo del triazol en 1.1 Å respecto a la distancia existente en amidas (Figura 11). La capacidad de formar enlaces de hidrógeno a través de los átomos de nitrógeno 2 y 3 proporciona una considerable acidez al hidrógeno en la posición 5 que puede actuar como donador de puentes de hidrógeno, aumentando aún más su equivalencia a la función amida. 84 79 Jin, L.; Tolentino, D. R.; Melaimi, M.; Bertrand, G. Isolation of bis(copper) key intermediates in Cu-catalyzed azide-alkyne “click” reaction. Sci. Adv. 2015, 1, e1500304/1-e1500304/5. 80 (a) Zhou, Y.; Lecourt, T.; Micouin, L. Direct synthesis of 1,4-disubstituted-5-alumino-1,2,3-triazoles: Coppercatalyzed cycloaddition of organic azides and mixed aluminum acetylides. Angew. Chem., Int. Ed. 2010, 49, 2607-2610. (b) Ahlquist, M.; Fokin, V. V. Enhanced reactivity of dinuclear copper(I) acetylides in dipolar cycloadditions. Organometallics 2007, 26, 4389-4439. 81 Nolte, C.; Mayer, P.; Straub, B. F. Isolation of a copper(I)triazolide: a “click” intermediate. Angew. Chem., Int. Ed. 2007, 46, 2101-2103. 82 (a) Horne, W. S.; Yadav, M. K.; Stout, C. D.; Ghadiri, M. R. Heterocyclic peptide backbone modifications in an -helical coiled coil. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15366-15367. (b) Kolb, H. C.; Sharpless, K. B. The growing impact of “click” chemistry on drug discovery. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128-1137. 83 Dalvie, D. K.; Kalgutkar, A. S.; Khojasteh-Bakht, S. C.; Obach, R. S.; O’Donnell, J. P. Biotransformation reactions of five-membered aromatic heterocyclic rings. Chem. Res. Toxicol. 2002, 15, 269-299. 84 (a) Valverde, I. E.; Bauman, A.; Kluba, C. A.; Vomstein, S.; Walter, M. A.; Mindt, T. L. 1,2,3-Triazoles as amide bond mimics: triazole scan yields protease-resistant peptidomimetics for tumor targeting. Angew. Chem. 66 Objetivos generales Los objetivos expuestos se recogen en los siguientes capítulos: 1. Síntesis de híbridos dihidroxipirrolidina-triazol. Estudios de inhibición de glicosidasas. 2. Preparación y evaluación biológica de inhibidores multivalentes derivados de dihidroxipirrolidinas. CAPÍTULO 1 SÍNTESIS DE HÍBRIDOS DIHIDROXIPIRROLIDINA-TRIAZOL. ESTUDIOS DE INHIBICIÓN DE GLICOSIDASAS Antecedentes 69 CAPÍTULO 1: Síntesis de híbridos dihidroxipirrolidina-triazol. Estudios de inhibición de glicosidasas 1.1. ANTECEDENTES 1.1.1. Aril/alquil-pirrolidinas como inhibidores de glicosidasas Uno de los principales problemas de los iminoazúcares como inhibidores de glicosidasas es la falta de especificidad y permeabilidad celular, propiedades imprescindibles para el desarrollo de nuevos fármacos, siendo éste el motivo principal por el cual muchos iminoazúcares no prosperan en los ensayos clínicos. En los últimos años se han desarrollado diversas aproximaciones sintéticas con el objetivo de encontrar inhibidores de glicosidasas con mayor eficacia y selectividad. El artículo pionero de Withers 97 destaca la importancia de mimetizar no solamente el catión oxocarbenio generado durante el proceso de hidrólisis, sino también el aglicón. Los 1,4-iminociclitoles o pirrolidinas polihidroxiladas constituyen un amplio grupo de inhibidores enzimáticos que en ocasiones presentan una baja especificidad debido a su mayor flexibilidad conformacional si son comparados con sus análogos de tipo piperidina. La incorporación al iminoazúcar de un mimético del aglicón puede resolver este problema y proporcionar inhibidores de glicosidasas más potentes, además de selectivos. 98 Cálculos teóricos y estudios de RMN han puesto de manifiesto la importancia de las interacciones azúcar-resto aromático en el reconocimiento molecular de carbohidratos por 97 McCarter, J. D.; Yeung, W.; Chow, J.; Dolphin, D.; Withers, S. G. Design and synthesis of 2’-deoxy-2’- fluorodisaccharides as mechanism-based glycosidase inhibitors that exploit aglycon specificity. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 5792-5797. 98 Suzuki, K.; Nakahara, T.; Kanie, O. 3,4-Dihydroxypyrrolidine as glycosidase inhibitor. Curr. Top. Med. Chem. 2009, 9, 34-57. 70 Capítulo 1 lectinas y glicosidasas. 99 Estudios estructura-actividad han mostrado que la inserción de restos aromáticos/alifáticos contiguos a un iminoazúcar mejoran notablemente sus propiedades como inhibidores de glicosidasas gracias a interacciones alostéricas/secundarias con la enzima. 100 , 101 En este sentido, los resultados obtenidos en nuestro grupo de investigación en los últimos años en la búsqueda de inhibidores de glicosidasas corroboran esta apreciación. En nuestro grupo de investigación se han desarrollado varias aproximaciones encaminadas a mejorar las propiedades de iminoazúcares con estructura de pirrolidina como inhibidores de glicosidasas. De esta manera, la incorporación de un resto aromático en el C-2 de la meso-pirrolidina-3,4-diol (13), mejora notablemente las propiedades inhibidoras de este compuesto. Así, la incorporación en el C-2 del anillo de pirrolidina de un derivado de furano sustituido no sólo incrementa la actividad inhibidora, sino también la especificidad, dependiendo ésta drásticamente de la configuración del centro pseudo-anomérico C-2. Los derivados de tipo 14 con configuración R en C-2 son inhibidores potentes y selectivos de - fucosidasa de epidídimo bovino, mientras que los epímeros (15) presentan una inhibición específica a -galactosidasa de Aspergillus oryzae (Figura 12). 102 99 (a) Jiménez-Barbero, J.; Cañada, F. J.; Cuevas, G.; Asensio, J. L.; Aboitiz, N.; Canales, A.; Chávez, M. I.; Fernández-Alonso, M. C.; García-Herrero, A.; Mari, S.; Vidal, P. Protein-carbohydrate interactions: a combined theoretical and NMR experimental approach on carbohydrate-aromatic interactions and on pyranose ring distortion. ACS Symposium Series 2006, 930, 60-80. (b) Spiwok, V.; Lipovová, P.; Skálová, T.; Vondráčková, E.; Dohnálek, J.; Hašek, J.; Králová, B. Modelling of carbohydrate-aromatic interactions: ab initio energetics and force field performance. J. Computer-Aided Mol. Des. 2005, 19, 887-901. 100 Wu, C. –Y.; Chang, C. –F.; Chen, J. S. –Y.; Wong, C. –H.; Lin, C. –H. Rapid diversity-oriented synthesis in microtiter plates for in situ screening: discovery of potent and selective -fucosidase inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4661-4664. 101 Ho, C. –W.; Popat, S. D.; Liu, T. –W.; Tsai, K. –C.; Ho, M. –J.; Chen, W. –H.; Yang, A. –S.; Lin, C. –H. Development of GlcNAc-inspired iminocyclitols as potent and selective N-acetyl--hexosaminidase inhibitors. Chem. Biol. 2010, 5, 489-497. 102 (a) Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I.; Demange, R.; Vogel, P. Synthesis and glycosidase inhibitory activities of 5-(1’,4’-dideoxy-1’,4’-imino-D-erythrosyl)-2-methyl-3-furoic acid (5-[(3S,4R)-3,4-dihydroxypyrrolidine-2-yl]- 2-methylfuran-3-carboxylic acid) derivatives: new leads as selective -L-fucosidase and -galactosidase inhibitors. Helv. Chim. Acta 2003, 86, 1894-1913. (b) Moreno-Vargas, A. J.; Demange, R.; Fuentes, J.; Robina, I.; Vogel, P. Synthesis of [(2S,3S,4R)-3,4-dihydroxypyrrolidine-2-yl]-5-methylfuran-4-carboxylic acid derivatives: new leads as selective -galactosidase inhibitors Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2335-2339. (c) Robina, I.; Moreno-Vargas, A. J.; Fernández-Bolaños, J. G.; Fuentes, J.; Demange, R.; Vogel, P. New leads for Antecedentes 71 Figura 12. Efecto de la configuración de un centro estereogénico en la actividad inhibidora Los derivados de pirrolidina con un grupo metilo en C-5 presentan interesantes propiedades como inhibidores de -fucosidasas. Así, la diamina 16 es un inhibidor potente y selectivo de -fucosidasa de epidídimo bovino con una constante de inhibición (Ki) de 1.8 M. La incorporación de un resto aromático en los derivados 17 y 18 conduce a inhibidores más potentes de esta enzima, siendo este efecto más notable en el derivado 18 con una Ki de 0.08 M (Figura 13). 103 Figura 13. Efecto de la presencia de sustituyentes aromáticos en la inhibición a -fucosidasas selective inhibitors of -L-fucosidases. Synthesis and glycosidase inhibitory activities of [(2R,3S,4R)-3,4- dihydroxypyrrolidine-2-yl]furan derivatives. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2555-2559. 103 (a) Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A.T.; Vera-Ayoso, Y.; Moreno-Vargas, A.J.; Bello, C.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis of novel pyrrolidine 3,4-diol derivatives as inhibitors of -L-fucosidases. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 1192-1202. (b) Moreno-Vargas, A. J.; Carmona A. T.; Mora F.; Vogel, P.; Robina, I. Stereoselective synthesis of (2S,3S,4R,5S)-5-methylpyrrolidine-3,4-diol derivatives that are highly selective -L-fucosidase inhibitors. Chem. Commun. 2005, 4949-4951. 72 Capítulo 1 Los derivados de tipo 21 con configuración (2R,3R,4S) y cadenas laterales de arilaminoalquilo resultaron ser inhibidores selectivos y competitivos de -manosidasa de guisantes de Jack. La aminometilpirrolidina 19 es un inhibidor moderado de esta enzima que puede aumentar su potencia inhibidora mediante la incorporación de un resto aromático por aminación reductiva con el correspondiente aldehído para generar los derivados de tipo 21, destacando el derivado 21c con una unidad de indenilo (Ki = 2.3 M). La epimerización del C-2 para dar lugar a los compuestos 22a-c, no condujo a un cambio de la selectividad enzimática, obteniéndose valores de inhibición similares (Figura 14). 104 Figura 14. Derivados de arilaminometil-3,4-dihidroxipirrolidinas como inhibidores de -manosidasas En los compuestos tipo 21 y 22, un aumento de la distancia entre el anillo de pirrolidina y el sustituyente arilamino mediante la inserción de un grupo etilideno conduce a una pérdida de la actividad enzimática (derivados 23 y 24). Los correspondientes enantiómeros ent-23 y ent-24 de configuración (2S,3S,4R) y (2R,3S,4R) respectivamente, 104 (a) Popowycz, F.; Gerber-Lemaire, S.; Rodríguez-García, E.; Schütz, C.; Vogel, P. Synthesis and - mannosidase inhibitory evaluation of (2R,3R,4S)- and (2S,3R,4S)-2-(aminomethyl)pyrrolidine-3,4-diol derivatives. Helv. Chim. Acta 2003, 86, 1914-1948. (b) Carmona, A. T.; Popowycz, F.; Gerber-Lemaire, S.; Rodríguez-García, E.; Schütz, C.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis and glycosidase inhibitory activities of 2- (aminoalkyl)pyrrolidine-3,4-diol derivatives. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 4897-4911. (c) Popowycz, F.; Gerber-Lemaire, S.; Demange, R.; Rodríguez-García, E.; Carmona-Asenjo, A. T.; Robina, I.; Vogel, P. Derivatives of (2R,3R,4S)-2-aminomethylpyrrolidine-3,4-diol are selective -mannosidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2489-2493. Antecedentes 73 mostraron inhibición competitiva frente a la -glucosidasa de almendras en el rango micromolar bajo (Figura 15).104c Figura 15. Derivados de arilaminoetil-3,4-dihidroxipirrolidinas Los derivados 25 y 26 (Figura 16), que incluyen un anillo de fenilo y una unidad de bifenilo, respectivamente, mostraron inhibición frente a -manosidasas de guisantes de Jack y actividad in vivo frente a células de gliobastoma y melanoma. 105 , 106 Asimismo, en colaboración con el grupo de P. Vogel, hemos descrito el compuesto análogo 27, que presenta un grupo etilideno entre el anillo de la pirrolidina y la cadena lateral. Este compuesto ha mostrado actividad antiproliferativa en líneas celulares del cáncer de páncreas (Figura 16). 107 105 Fiaux, H.; Popowycz, F.; Favre, S.; Schütz, C.; Vogel, P.; Gerber-Lemaire, S.; Juillerat-Jeanneret, L. Functionalized pyrrolidines inhibit -mannosidase activity and growth of human glioblastoma and melanoma cells. J. Med. Chem. 2005, 48, 4237-4246. 106 Bello, C.; Cea, M.; Dal, G.; Garuti, A.; Rocco, I.; Cirmena, G.; Moran, E.; Nahimana, A.; Duchosal, M. A.; Fruscione, F.; Pronzato, P.; Grossi, F.; Patrone, F.; Ballestrero, A.; Dupuis, M.; Sordat, B.; Nencioni, A.; Vogel, P. Novel 2-[(benzylamino)methyl]pyrrolidine-3,4-diol derivatives as -mannosidase inhibitors and with antitumor activities against hematological and solid malignancies. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 3320-3334. 107 Steimer, F.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Caffa, I.; Cea, M.; Montecucco, F.; Nencioni, A.; Vogel, P.; Robina, I. Synthesis of pyrrolidine 3,4-diol derivatives with anticancer activity on pancreatic tumor cells. Heterocycles 2014, 88, 1445-1464. 74 Capítulo 1 Figura 16. Inhibidores de -manosidasas El compuesto 25 es un inhibidor moderado de la -manosidasa II de Golgi de Drosophila (dGMII). La sustitución del anillo de pirrolidina por uno de pirrolidinona conduce a inhibidores potentes de esta enzima (compuestos 28 y 29, Figura 17). Las coestructuras cristalinas de rayos X de estos compuestos con la dGMII ponen de manifiesto la existencia de interacciones por enlaces de hidrógeno adicionales del grupo carbonilo con aminoácidos del sitio activo de la enzima (asparagina 472 y tirosina 727) que refuerzan la inhibición. La mayor afinidad del compuesto 29 por la enzima se debe a que el grupo N-Me es capaz de entrar en el sitio activo reforzando aún más la inhibición. En el caso de la - manosidasa de guisantes de Jack la introducción del grupo carbonilo en C-5 no altera la actividad inhibidora de manera significativa. 108 108 Fiaux, H.; Kuntz, D. A.; Hoffman, D.; Janzer, R. C.; Gerber-Lemaire, S.; Rose, D. R.; Juillerat-Jeanneret, L. Functionalized pyrrolidine inhibitors of human type II -mannosidases as anti-cancer agents: Optimizing the fit to the active site. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 7337-7346. Antecedentes 75 Figura 17. Derivados de pirrolidinonas con potente actividad inhibidora Stütz y cols. han sintetizado análogos del 2,5-didesoxi-2,5-imino-D-manitol (DMDP, 30) que incorporan un sustituyente de tipo lipofílico. 109 Algunos de los inhibidores preparados (Figura 18) mostraron mejores propiedades inhibidoras frente a -glucosidasas (Agrobacterium sp.) que el compuesto natural DMDP. Estos autores ponen de manifiesto que la presencia de sistemas aromáticos voluminosos como las cumarinas, así como la inserción de sustituyentes de tipo alquilamino generalmente incrementa la actividad inhibidora. Además, la inserción de este tipo de sustituyentes en los inhibidores de glicosidasas les confiere ciertas propiedades estructurales que pueden ser explotadas con propósitos analíticos. Así, el derivado dansilado del DMDP (33) es un inhibidor en el rango nanomolar (Ki = 2.4 nM) de esta enzima. Las propiedades fluorescentes del derivado 33 han permitido estudiar la estabilidad del complejo inhibidor-enzima mediante experimentos de electroforesis. 110 109 (a) Caines, M. E. C.; Hancock, S. M.; Tarling, C. A.; Wrodnigg, T. M.; Stick, R. V.; Stütz, A. E.; Vasella, A.; Withers, S. G.; Strynadka, N, C. J. The structural basis of glycosidase inhibition by five-membered iminocyclitols: the clan a glycoside hydrolase endoglycoceramidase as a model system. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4474-4476. (b) Wrodnigg, T. M.; Diness, F.; Gruber, C.; Hausler, H.; Lundt, I.; Rupitz, K.; Steiner, A. J.; Stütz, A. E.; Tarling, C. A.; Withers, S. G.; Wolfler, H. Probing the aglycon binding site of a -glucosidase: a collection of C-1-modified 2,5-dideoxy-2,5-imino-D-mannitol derivatives and their structure-activity relationships as competitive inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 3485-3495. (c) Wrodnigg, T. M.; Withers, S. G.; Stütz, A. E. Novel, lipophilic derivatives of 2,5-dideoxy-2,5-imino-D-mannitol (DMDP) are powerful -glucosidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1063-1064. 110 Hermetter, A.; Scholze, H.; Stütz, A. E.; Withers, S. G.; Wrodnigg, T. M. Powerful probes for glycosidases: novel, fluorescently tagged glycosidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1339-1342. 82 Capítulo 1 Esquema 10. Síntesis de amidas derivadas de la 1-desoxinojirimicina como inhibidores de la -GCasa Este “screening” preliminar indicó que la estructura del ácido carboxílico tenía un efecto importante en la actividad inhibidora de la correspondiente amida, conteniendo los derivados más potentes un anillo de fenilo. El compuesto 51 con un valor de Ki de 71 nM fue el más activo. Experimentos de “docking” mostraron que este compuesto interacciona mediante enlaces de hidrógeno a través de los grupos hidroxilos con la -GCasa de manera similar a la N-nonildesoxinojirimicina (NN-DNJ, 52). Además, el modelo predice interacciones lipofílicas adicionales con la enzima, las cuales pueden explicar por qué 51 es mejor inhibidor que 52 (Figura 22). Figura 22. Derivado más activo (51) y comparación con el derivado usado como referencia (52) La N-nonildesoxinojirimicina (52) fue el primer derivado de iminoazúcar que mostró actividad como chaperona en fibroblastos de pacientes de Gaucher con la mutación N370S, mejorando la actividad de la enzima hasta 2 veces. El compuesto 51 mostró una actividad como chaperona semejante a la de la NN-DNJ en condiciones análogas. Antecedentes 83 Recientemente, estos autores 119 han preparado análogos del Migalastat con el objetivo de sintetizar inhibidores de la enzima recombinante -galactosidada A humana (rh- -Gal-asa A), mediante el acoplamiento de la piperidina 53 con un conjunto de 24 ácidos carboxílicos para generar las amidas de tipo 54 (Esquema 11). Esquema 11. Síntesis y evaluación in situ de amidas derivadas del Migalastat como inhibidores de la -Gal-asa A lisosomal Los derivados más potentes (Figura 23) fueron sintetizados a mayor escala, purificados y evaluados en linfocitos (mutación N215S) y fibroblastos (mutación W162X) de pacientes con la enfermedad de Fabry. A pesar de ser buenos inhibidores de la enzima (valores de IC50 en el rango micromolar bajo), sólo el derivado 56 fue capaz de mejorar la actividad de la rh--Gal A, observándose una mejora de 4.5 veces en linfocitos N215S y 7.3 veces en fibroblastos W162X en comparación con las células no tratadas. Posteriores modificaciones en los sustituyentes del anillo aromático de este compuesto condujeron a mejoras de actividad en los ensayos celulares. 119 Li, H. –Y.; Lee, J. –D.; Chen, C. –W.; Sun, Y. –C.; Cheng, W. –C. Synthesis of (3S,4S,5S)- trihydroxylpiperidine derivatives as enzyme stabilizers to improve therapeutic enzyme activity in Fabry patient cell lines. Eur. J. Med. Chem. 2018, 144, 626-634. 84 Capítulo 1 Figura 23. Inhibidores de -galactosidasa A evaluados como chaperonas para la enfermedad de Fabry El 1,4-iminociclitol 57 es un inhibidor potente de la N-acetil--hexosaminidasa de placenta humana. Estas enzimas son las encargadas de la degradación de los glicosaminoglicanos y se localizan principalmente en el líquido sinovial de los pacientes con osteoartritis. Con el objetivo de investigar el efecto del resto acilo sobre el nitrógeno endocíclico en la inhibición a esta enzima, Wong y cols. 120 describieron la preparación de una familia de amidas derivadas de la aminometilpirrolidina 58 (Esquema 12). Esquema 12. Síntesis de amidas para la búsqueda de inhibidores de N-acetil--hexosaminidasas Ninguna de las amidas evaluadas (aromáticas o alifáticas) mejoró la inhibición mostrada por el derivado 57, lo que indica que el grupo acetamido es crítico para mantener la actividad inhibidora frente a esta enzima. En este mismo trabajo, los autores prepararon una librería análoga a la presentada en el Esquema 12 pero conteniendo como espaciador un 120 Liu, J.; Numa, M. M. D.; Liu, H.; Huang, S. –J.; Sears, P.; Shikhman, A. R.; Wong, C. –H. Synthesis and high-throughput screening of N-acetyl--hexosaminidase inhibitor libraries targeting osteoarthritis. J. Org. Chem. 2004, 69, 6273-6283. Antecedentes 85 heterociclo de triazol. Sin embargo, ninguno de los pirrolidín-triazoles regioisoméricos evaluados mostró mejor actividad inhibidora que el derivado 57. Como continuación del trabajo realizado, estos autores 121 llevaron a cabo adicionalmente la síntesis paralela de una librería de pirrolidín-amidas seguido de evaluación in situ frente a -glucosidasa (Saccharomyces cerevisiae). De esta forma se identificaron los derivados 60 y 61 como los inhibidores más potentes de la serie (Figura 24). Figura 24. Pirrolidín-amidas inhibidoras de la -glucosidasa de Saccharomyces cerevisiae en el rango nanomolar El 1,4-didesoxi-1,4-imino-L-alitol (DIA, 62) es un potente inhibidor de la - galactosidasa lisosomal (IC50 = 0.75 M a pH 7.0). Recientemente, Cheng y cols. 122 han descrito la preparación de una librería de amidas obtenidas por reacción entre la amina 63 y 60 ácidos carboxílicos (Esquema 13). Ningún miembro de la librería mejoró la actividad inhibidora mostrada por el compuesto de referencia 62 frente a la -galactosidasa lisosomal. 121 Liang, P. –H.; Cheng, W. –C.; Lee, Y. –L.; Yu, H. –P.; Wu, Y. –T.; Lin, Y. –L.; Wong, C. –H. Novel fivemembered iminocyclitol derivatives as selective and potent glycosidase inhibitors: new structures for antivirals and osteoarthritis. ChemBioChem 2006, 7, 165-173. 122 Cheng, W. –C.; Wang, J. –H.; Yun, W. –Y.; Li, H. –Y.; Hu, J. –M. Rapid preparation of (3R,4S,5R) polyhydroxylated pyrrolidine-based libraries to discover a pharmacological chaperone for treatment of Fabry disease. Eur. J. Med. Chem. 2017, 126, 1-6. 86 Capítulo 1 Esquema 13. Librería de amidas sintetizada por Cheng y cols. La cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos catalizada por Cu (I) (CuAAC) es una reacción ampliamente utilizada gracias a su alta eficacia y compatibilidad con sistemas acuosos, ventajas que la hacen muy adecuada para ser utilizada para el “screening” in situ de librerías de compuestos obtenidos mediante síntesis paralela. 123 En este sentido, Delgado y cols. 124 pusieron a punto esta metodología para la búsqueda de inhibidores de la -glucocerebrosidasa lisosomal. Para ello, hicieron reaccionar el alquinil-aminociclitol 65 con 25 azidas en presencia de CuSO4 como fuente de cobre y ascorbato de sodio como reductor (Esquema 14). Esquema 14. Síntesis via CuAAC y posterior evaluación biológica in situ propuesta por Delgado y cols. 123 (a) Thirumurugan, P.; Matosiuk, D.; Jozwiak, K. “Click” Chemistry for drug development and diverse chemical-biology applications. Chem. Rev. 2013, 113, 4905-4979. (b) Aragão-Leoneti, V.; Campo, V. L.; Gomes, A. S.; Field, R. A.; Carvalho, I. Application of copper(I)-catalyzed azide/alkyne cycloaddition (CuAAC) “click chemistry” in carbohydrate drug and neoglycopolymer synthesis. Tetrahedron 2010, 66, 9475-9492. 124 Díaz, L.; Casas, J.; Bujons, J.; Llebaria, A.; Delgado, A. New glucocerebrosidase inhibitors by exploration of chemical diversity of N-substituted aminocyclitols using “click” chemistry and in situ screening. J. Med. Chem. 2011, 54, 2069-2079. Antecedentes 87 El inhibidor más potente resultó ser el derivado 67 con un resto aromático 3,5- disustituido. Este compuesto se sometió a estudios in vitro como chaperona, mostrando una estabilización de la -GCasa mayor a la mostrada por la N-nonildesoxinojirimicina (Figura 25). Figura 25. Derivado de aminociclitol N-sustituido más activo frente a -GCasa (67) y compuesto de referencia (52) Tomando estos resultados como punto de partida, Compain y cols. 125 publicaron años más tarde una extensión de esta metodología para la derivatización del iminoxilitol 68. La reacción de 68 y un set de 29 azidas condujo a los compuestos de tipo 69, que fueron evaluados in situ como inhibidores de la -GCasa (Esquema 15). Esquema 15. Derivatización del iminoxilitol 68 y evaluación in situ desarrollada por Compain y cols. 125 Serra-Vinardell, J.; Díaz, L.; Casas, J.; Grinberg, D.; Vilageliu, L.; Michelakakis, H.; Mavridou, I.; Aerts, J. M. F. G.; Decroocq, C.; Compain, P.; Delgado, A. Glucocerebrosidase enhancers for selected Gaucher disease genotypes by modification of -1-C-substituted imino-D-xylitols (DIXS) by “click” chemistry. ChemMedChem 2014, 9, 1744-1754. 88 Capítulo 1 Los mejores resultados se obtuvieron para los compuestos 70, 71 y 72, que presentaron unos valores de inhibición en el rango nanomolar (Figura 26). Figura 26. Derivados de -1-C-imino-D-xilitol más activos frente a -GCasa Estos compuestos fueron evaluados como chaperonas en distintos genotipos de la enfermedad de Gaucher. Los resultados más interesantes se obtuvieron para el iminoxilitol 72, capaz de promover una mejora de hasta 3 veces la actividad de la -GCasa a una concentración de 10 nM en los genotipos E y F, los cuales contienen la mutación G202R asociada a la variante neuropática de esta enfermedad. Por último, en nuestro grupo de investigación se ha llevado a cabo la síntesis paralela de una colección de pirrolidín-triazoles seguido de evaluación biológica in situ como inhibidores de -L-fucosidasas. 126 La inserción de restos aromáticos y alifáticos en un inhibidor de -fucosidasas previamente seleccionado se ha realizado mediante la reacción “click” de CuAAC entre el alquinil-iminociclitol 73 y una serie de azidas comerciales o sintéticas. La colección de 21 (pirrolidín-2-il)triazoles obtenida fue evaluada in situ frente a la -fucosidasa de riñón bovino, siendo 75 el derivado más potente con una constante de inhibición (Ki) de 4 nM. Este compuesto representa uno de los inhibidores de α-fucosidasa 126 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Robina, I. Rapid discovery of potent -fucosidase inhibitors by in situ screening of a library of (pyrrolidine-2-yl)-triazoles. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 5898-5904. Antecedentes 89 más potentes entre los descritos hasta la fecha derivado de pirrolidinas hidroxiladas (Esquema 16). Esquema 16. CuAAC y evaluación in situ para la búsqueda de inhibidores de -fucosidasas desarrollado en el grupo de investigación La reacción de CuAAC seguido de evaluación biológica in situ, se ha aplicado recientemente para la búsqueda de inhibidores de otras enzimas, como las glicosiltransferasas, proteasas, fosfatasas y quinasas. 127 127 Wang, X.; Huang, B.; Liu, X.; Zhan, P. Discovery of bioactive molecules from CuAAC “click”-chemistry- based combinatorial libraries. Drug Discovery Today 2016, 21, 118-132 y referencias contenidas. 90 Capítulo 1 1.2. OBJETIVOS En base a los resultados obtenidos en el grupo de investigación en relación a los inhibidores de -fucosidasas, en este capítulo se plantea la síntesis de aril-3,4- dihidroxipirrolidinas mediante la metodología de síntesis en paralelo y su posterior evaluación in situ como inhibidores de otras glicosidasas de interés biológico. Debido a la flexibilidad conformacional de los anillos de pirrolidina, es difícil preveer la selectividad en la inhibición de glicosidasas. Por ello es necesario llevar a cabo un estudio preliminar de actividad/selectividad con el objetivo de elegir el cabeza de serie más adecuado. Se evaluará el efecto de la configuración de los centros estereogénicos de la molécula y la presencia de distintos espaciadores (triazol, amida y tiourea) entre el anillo de iminoazúcar y el resto aromático en la inhibición enzimática. Una vez seleccionados los mejores candidatos, se aplicará la metodología de síntesis en paralelo seguido de evaluación biológica in situ. Este procedimiento permitirá la identificación de los mejores inhibidores de forma rápida y efectiva, los cuales se prepararán posteriormente a mayor escala para ser evaluados frente a glicosidasas de origen humano y llevar a cabo estudios estructuraactividad. Resultados y Discusión 91 1.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1.3.1. Estudio preliminar. Selección de los cabezas de serie 1.3.1.1. Síntesis En este apartado se pretende elegir el tipo de estrategia sintética más adecuada para el desarrollo de nuevos inhibidores de glicosidasas usando la metodología de “screening” consistente en síntesis mediante reacción de tipo “click” seguido de evaluación biológica in situ. En primer lugar, se hace necesario un análisis preliminar de una serie de derivados obtenidos de manera sencilla con reacciones de tipo “click” con el objetivo de evaluar el efecto en la inhibición a glicosidasas de la configuración de los diversos centros estereogénicos de la molécula y de la presencia de distintos espaciadores: triazol, amida, y tiourea (Figura 27). Figura 27. Estudio del efecto causado por diversos espaciadores en la actividad inhibidora De acuerdo a la estructura general mostrada en la Figura 27, los derivados sintetizados tendrán distintas configuraciones en los carbonos 2, 3 y 4 del anillo de pirrolidina, además de distintos espaciadores anclados en C-2. Todos los derivados presentarán un resto aromático unido al anillo de pirrolidina a través de distintos espaciadores, con la idea de incrementar la actividad inhibidora frente a glicosidasas, según 98 Capítulo 1 La síntesis del compuesto 101 se llevó a cabo de forma análoga a la descrita para el derivado 81 (Esquema 18). La oxidación del glicol 101 con NaIO4 condujo al aldehído ent- 82 con un rendimiento del 99%. El compuesto ent-85 (tipo I) se obtuvo mediante reacción de CuAAC sobre el alquino ent-83 (Esquema 23), siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el correspondiente enantiómero 85 (Esquema 19). El derivado ent-90 (tipo II) se preparó a partir de la azidometilpirrolidina ent-88 (Esquema 23), la cual se sintetizó de manera similar a su enantiómero 88 (Esquema 19). La reacción de CuAAC de ent-88 con fenilacetileno en tolueno utilizando CuI y DIPEA, originó el triazol 102. La desprotección ácida del grupo terc-butoxicarbonilo e isopropilideno de este compuesto condujo al imino-C-metilentriazol ent-90 con rendimiento cuantitativo. Esquema 23. Obtención de ent-85 y ent-90 La síntesis de los derivados ent-92 (tipo III) y ent-95 (tipo V) se llevó a cabo a partir de la aminometilpirrolidina ent-91 (Esquema 24) mediante un procedimiento análogo al descrito para sus enantiómeros 92 y 95 (Esquemas 20 y 21, respectivamente). Resultados y Discusión 99 Esquema 24. Síntesis de ent-92 y ent-95 La reacción de ent-91 con cloruro de benzoílo seguido de desprotección ácida, dio lugar a ent-92 con rendimiento global excelente. Por otra parte, la reacción de ent-91 con cloruro de bromoacetilo seguido de desplazamiento con azida sódica generó el compuesto ent-94. La posterior reacción de CuAAC con fenilacetileno y desprotección ácida condujo al compuesto ent-95. Los compuestos 110 y 115 (tipos I y II) de configuración (2R,3S,4R) se han preparado a partir de la hidroximetilpirrolidina 107 como intermedio clave, obtenida a partir de L-ribosa siguiendo la ruta sintética mostrada en el Esquema 25. La acetonación de la L- ribosa originó el compuesto 103, el cual por tratamiento con cloruro de terc-butildifenilsililo dio lugar al lactol 104. La reducción de 104 con borohidruro de sodio, seguido de mesilación y posterior desplazamiento nucleofílico con bencilamina, generó la N-bencilpirrolidina 105 con un rendimiento global del 56%, siguiendo un procedimiento descrito en bibliografía. 130 La eliminación del grupo protector terc-butildifenilsililo por reacción con TBAF, seguido de 130 Kim, D. –K.; Kim, G.; Kim, Y. –W. Preparation of optically active 3-substituted piperidines via ring expansion: synthesis of 4-amino- and 4-fluoro-1,4,5-trideoxy-1,5-imino-D-ribitol and 1,5-dideoxy-1,5-imino-D- ribitol. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1996, 8, 803-808. 100 Capítulo 1 hidrogenación catalítica en presencia de anhídrido de Boc condujo a la hidroximetilpirrolidina 107 con buen rendimiento. Esquema 25. Síntesis de derivados con configuración (2R,3S,4R) a partir de L-ribosa La oxidación de Swern de 107 (Esquema 26) dio lugar al aldehído 108, el cual tras reacción con el reactivo de Bestmann-Ohira proporcionó el alquinil-iminociclitol 109. La reacción de CuAAC de 109 con bencilazida y posterior desprotección ácida, condujo al imino-C-triazol 110. Esquema 26. Obtención del imino-C-triazol 110 Resultados y Discusión 101 La reacción del alcohol 107 con cloruro de tosilo en piridina no condujo al correspondiente derivado tosilado (Esquema 27), tal y como ocurría con las hidroximetilpirrolidinas 86 y ent-86 (Esquemas 19 y 23) con configuración trans en los carbonos 2 y 3 del anillo de pirrolidina, sino que se obtuvo como único producto el carbamato cíclico 111. La estructura de este derivado se confirmó en el espectro de 1H-RMN por la desaparición de las señales correspondientes al grupo tBu. De acuerdo con el artículo publicado por Murray y cols., 131 el carbamato cíclico 111 puede experimentar reacción de apertura en presencia de LiOH a reflujo para dar la correspondiente hidroximetilpirrolidina. De forma análoga, para obtener la azidometilpirrolidina de interés, se llevó a cabo la reacción de apertura de 111 usando azida de tetrabutilamonio a 100 oC en tubo sellado durante dos semanas. La posterior desprotección ácida condujo a la azidometilpirrolidina 112 con rendimiento global moderado (Esquema 27). La estructura de 112 se confirmó mediante el espectro de IR por la aparición de una banda a 2098 cm-1 y en el espectro de 13C-RMN por la ausencia de señal de C=O. Esquema 27. Síntesis de la azidometilpirrolidina 112 La obtención del carbamato cíclico 111 puede explicarse si se tiene en cuenta que en el medio básico de la reacción de tosilación llevada a cabo en piridina, puede producirse la abstracción de un hidrógeno en beta con respecto al átomo de oxígeno del grupo protector y el posterior desplazamiento del grupo saliente en C-1’, según está propuesto en la 131 El derivado 111, preparado por otro procedimiento sintético, está descrito en: Murray, A. J.; Parsons, P. J.; Hitchcock, P. The combined use of stereoelectronic control and ring closing metathesis for the synthesis of (-)-8- epi-swainsonine. Tetrahedron 2007, 63, 6485-6492. 102 Capítulo 1 bibliografía 132 (Esquema 28). Probablemente, la configuración 2,3-cis haga que la formación del sistema tricíclico esté favorecida frente a la formación del correspondiente derivado tosilado como ocurría en la tosilación de 86 y ent-86. Esquema 28. Mecanismo propuesto para la formación del carbamato cíclico 111 Debido a las dificultades encontradas para realizar la reacción de apertura de 111 a una escala mayor, se trabajó en la puesta a punto de una ruta sintética alternativa para la preparación de 112 (Esquema 29). Esquema 29. Preparación del derivado 115 (tipo II) 132 Agami, C.; Couty, F. The reactivity of the N-Boc protecting group: an underrated feature. Tetrahedron 2002, 58, 2701-2724. Resultados y Discusión 103 La aminación reductiva del aldehído 108 realizada mediante un procedimiento sintético en dos etapas “one-pot” condujo a la bencilamina 113, la cual mediante hidrogenación catalítica seguido de reacción de transferencia de grupo diazo usando como reactivo nonaflil azida (NfN3 = CF3(CF2)3SO2N3) condujo al derivado 114, que tras desprotección ácida proporcionó la azidometilpirrolidina deseada 112 con rendimiento excelente tras purificación cromatográfica usando la resina Dowex 50WX8. La reacción de CuAAC de 112 con fenilacetileno en presencia de CuSO4 y ascorbato de sodio originó el imino-C-metilentriazol 115 (tipo II), epímero en C-2 del compuesto 90 (Esquema 19). Por último, el homoanálogo 121 (tipo VI), se sintetizó a partir del precursor 119, cuya síntesis se llevó a cabo partiendo de D-arabinosa mediante las reacciones que se recogen en el Esquema 30. Esquema 30. Síntesis del homoanálogo 121 (tipo VI) 104 Capítulo 1 La síntesis del compuesto 116 se llevó a cabo de acuerdo con la metodología descrita por Robina y cols. 133 La azidometilpirrolidina 119 se preparó a partir del compuesto 116 siguiendo el procedimiento experimental descrito en nuestro grupo de investigación. 134 Así, la reacción de 116 con cloruro de benciloxicarbonilo originó el derivado protegido 117. La reducción de 117 con LiAlH4 en Et2O a -10 oC, proporcionó el derivado 118, cuya mesilación por tratamiento con MsCl en una mezcla de piridina y CH2Cl2, seguido de desplazamiento con azida sódica, generó la azidoetilpirrolidina 119 con un rendimiento del 58% en dos etapas. La reacción de 119 con fenilacetileno en presencia de CuI y DIPEA originó el triazol 120, cuya estructura se confirmó mediante 1H-RMN ( 7.82-7.32, 11H, H- 5’’, H-aromáticos) y 13C-RMN (136.4-125.9 C aromáticos de Cbz y Ph). La desprotección ácida del grupo isopropilideno de este compuesto, seguido de hidrogenación catalítica, dio lugar al derivado 121 con bajo rendimiento, lo que pudo deberse a problemas en el proceso de purificación (columna de intercambio iónico Dowex 50WX8). 1.3.1.2. Evaluación biológica Los compuestos 85, 90, 92, 93, 95, ent-85, ent-90, ent-92, ent-95, 110, 115 y 121 (Figura 29), fueron evaluados frente a un panel de 11 glicosidasas comerciales. Las medidas de inhibición enzimática fueron realizadas con las siguientes enzimas comerciales (Sigma- Aldrich): -fucosidasa (EC 3.2.1.51) de riñón de bovino, -galactosidasa (EC 3.2.1.22) de granos de café, -galactosidasa (EC 3.2.2.23) de Escherichia coli y Aspergillus oryzae, - glucosidasa (maltasas) de levadura de pan y de arroz, -amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger, -glucosidasa (EC 3.2.1.21) de almendras, -manosidasa (EC 3.2.1.24) de 133 Robina, I.; Gearing, R. P.; Buchanan, J. G.; Wightman, R. H. Diastereoselective conjugate addition of ammonia in the synthesis of chiral pyrrolidines. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1990, 2622-2624. 134 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carrión-Jiménez, S.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Caffa, I.; Montecucco, F.; Cea, M.; Nencioni, A.; Robina, I. Synthesis and cancer growth inhibitory activities of 2-fatty- alkylated pyrrolidine-3,4-diol derivatives. Arkivoc 2014, 197-214. Resultados y Discusión 105 guisantes de Jack, -manosidasa (EC 3.2.1.25) de caracol y -N-acetilglucosaminidasa (EC 3.2.1.23) de guisantes de Jack. Figura 29. Compuestos para evaluación como inhibidores de glicosidasas Los resultados más significativos se han obtenido para la -fucosidasa de riñón de bovino, -galactosidasa de granos de café, -galactosidasa de Escherichia coli y Aspergillus oryzae, -glucosidasa de almendras y -manosidasa de guisantes de Jack, y se recogen en la Tabla 2, donde se refleja el porcentaje de inhibición a una concentración 1 mM de inhibidor. La inhibición para el resto de enzimas es baja o nula en todos los casos estudiados. 106 Capítulo 1 Tabla 2. Porcentaje de inhibición a concentración 1 mM para los derivados de la Figura 29 (“-“ : % de inhibición < 50% a 1 mM de inhibidor) E Enzima Compuesto -Fuc-asa -Gal-asa -Gal-asa (E. coli) -Gal-asa (A. oryzae) -Glc-asa -Man-asa 1  71 - - - - - 2  - - - - 97 - 3  - - - - 79 71 4 - - - - 74 - 5  51 - - - - 71 6  - - - - - - 7  - - - - - 60 8  - - - - - - 9 - - - - - 64 10 84 - - - - - 11 - 95 - - 53 - 12 - 89 60 78 96 - Resultados y Discusión 107 De los resultados obtenidos de las pruebas de inhibición se pueden hacer varias observaciones. Los compuestos epiméricos 85 y 110 (Tabla 2, entradas 1 y 10) de tipo I, en los que el anillo de pirrolidina se une directamente al C-4 del anillo de triazol, han resultado ser inhibidores selectivos, aunque de actividad moderada frente a -fucosidasa. Por otro lado, los compuestos de 90, ent-90 y 115 (Tabla 2, entradas 2, 7 y 11) de tipo II, donde el anillo de pirrolidina se une a través de un puente metileno al N-1 del triazol, han mostrado actividad inhibidora frente a β-glucosidasa, -manosidasa y -galactosidasa, respectivamente. Si se compara la actividad inhibidora de los compuestos homoanálogos 115 y 121 (Tabla 2, entradas 11 y 12), se observa una pérdida de selectividad al aumentar la distancia entre el anillo de pirrolidina y el triazol, siendo el derivado 121 (tipo VI) inhibidor de - y - galactosidasas, y -glucosidasa. Al cambiar el espaciador triazol en el compuesto 90 por el espaciador amida en el compuesto 92 (Tabla 2, entradas 2 y 3), se observa una disminución en la actividad enzimática frente a -glucosidasa, mientras que la actividad inhibidora frente a - manosidasa aumenta considerablemente, pasando a ser del 71% en el derivado 92. Por otra parte, los derivados ent-90 y ent-92 (Tabla 2, entradas 7 y 8) resultaron ser prácticamente inactivos frente a las enzimas ensayadas. Únicamente el compuesto ent-90 mostró una débil inhibición a -manosidasas. La inserción de un espaciador tipo tiourea en el compuesto 93 (Tabla 2, entrada 4) y de un espaciador mixto amida-triazol en los compuestos 95 y ent-95 (Tabla 2, entradas 5 y 9), no mejora la inhibición enzimática presentada por estos derivados. Estos resultados preliminares parecen demostrar que los derivados tipo IIA podrían ser inhibidores potentes y selectivos de -glucosidasas mientras que los derivados epímeros en C-2 de tipo IIB constituirían modelos de interés para la búsqueda de inhibidores eficaces de -galactosidasas (Figura 30). 114 Capítulo 1 éste es uno de los pocos casos descritos hasta la fecha donde el patrón de inhibición hacia la -glucosidasa es inusual. Los resultados obtenidos muestran una correlación para la inhibición a la -glucosidasa de almendras y la -glucocerebrosidasa de origen humano. Un comportamiento similar se observó para el compuesto 89f, lo cual sugiere que el grupo trimetilsililo interacciona con la enzima de forma semejante al resto de fenilo del compuesto 89b. Tabla 4. Valor de IC50 (en M) para los derivados 89b,f y 112b,k,p,r frente a -Gal-asa y -Glc-asa de mamífero (“-“: % de inhibición < 50% a 1 mM de inhibidor) (“-a“: % de inhibición < 50% a 0.1 mM de inhibidor ) Enzima  -Glc-asa (hígado bovino) - - 240 -a 887 888 -GCasa (lisosoma humano) 11 19 28 19 31 187 -Gal-asa (lisosoma humano) - - 171 -a 185 159 -Gal-asa (hígado bovino) 458 151 173 42 338 268 glucocerebrosidase inhibitors and F508del-CFTR correctors. Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 8977-8996. (d) Castilla, J.; Rísquez, R.; Cruz, D.; Higaki, K.; Nanba, E.; Ohno, K.; Suzuki, Y.; Díaz, Y.; Ortiz Mellet, C.; García Fernández, J. M.; Castillón, S. Conformationally-locked N-glycosides with selective -glucosidase inhibitory activity: identification of a new non-iminosugar-type pharmacological chaperone for Gaucher disease. J. Med. Chem. 2012, 55, 6857-6865. Resultados y Discusión 115 La secuencia completa de la -glucosidasa de almendras no se conoce, pero se sabe que pertenece a la familia CAZy 136 GH1 por análisis de secuencias parciales. 137 La estructura de rayos X de la -glucocerebrosidasa de lisosoma humano está descrita en bibliografía y, por similitud de secuencias, esta enzima se ha clasificado en la familia GH30. 138 Ambas enzimas pertenecen al clan GH-A debido a semejanzas en su plegamiento. La -glucosidasa de hígado bovino pertenece a la misma familia que la -glucosidasa de almendras (GH1). Por tanto, estas tres enzimas comparten similitudes en su estructura tridimensional (pertenecen al clan GH-A), pero la -glucosidasa humana sólo comparte ciertas secuencias (por pertenecer a otra familia CAZy) con las -glucosidasas de almendras y de bovino. El nivel de selectividad detectado en la inhibición de estas enzimas por los compuestos 89b y 89f podría explicarse en base a interacciones alostéricas adicionales cercanas al sitio activo. Por su parte, los compuestos 112b,k,p,r resultaron ser menos selectivos que los correspondientes epímeros. En general, mostraron buena actividad inhibidora frente a la - galactosidasa de granos de café (IC50 = 14-17 M, Tabla 3), pero la potencia de inhibición frente a la -galactosidasa de lisosoma humano fue 10 veces menor (IC50 = 159-185 M, Tabla 4), a pesar de que ambas enzimas pertenecen a la misma familia CAZy (GH27).136 Sorprendentemente, la -glucocerebrosidasa humana no fue capaz de diferenciar entre los compuestos epiméricos en C-2 89b y 112b, los cuales mostraron actividad inhibidora en el mismo rango para esta enzima. El compuesto 112b resultó ser un inhibidor débil de otras glicosidasas de origen mamífero, como la -galactosidasa y la -glucosidasa de hígado bovino. 136 Cantarel, B. L.; Coutinho, P. M.; Rancurel, C.; Bernard, T.; Lombard, V.; Henrissat, B. The Carbohydrate- Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 2009, 37, D233- D238. 137 He, S.; Withers, S. G. Assignment of sweet almond -glucosidase as a family 1 glycosidase and identification of its active site nucleophile. J. Biol. Chem. 1997, 272, 24864-24867. 138 Dvir, H.; Harel, M.; McCarthy, A. A.; Toker, L.; Silman, I.; Futerman, A. H.; Sussman, J. L. X-Ray structure of human acid--glucosidase, the defective enzyme in Gaucher disease. EMBO Rep. 2003, 4, 704-709. 116 Capítulo 1 La presencia de un grupo voluminoso unido directamente al resto de triazol en el compuesto 112k, condujo a un incremento de la selectividad enzimática, destacando la inhibición observada frente a la -galactosidasa de granos de café (IC50 = 17 M, Tabla 3) y la -glucocerebrosidasa de lisosoma humano (IC50 = 19 M, Tabla 4). Otro efecto observado ha sido que la presencia de sustituyentes en el anillo aromático afecta a la inhibición de la -glucocerebrosidasa. Así, el compuesto 112p que presenta un grupo metoxi en la posición para del anillo aromático ha sido un buen inhibidor de esta enzima (IC50 = 31 M), mientras que, si se cambia el grupo metoxi por un grupo hidroximetilo en el compuesto 112r, el valor del IC50 para la -glucocerebrosidasa pasa a ser de 187 M. Estos valores parecen sugerir que el patrón de sustitución y la naturaleza del sustituyente sobre el anillo aromático ejercen un efecto notable en la actividad inhibidora de la -glucocerebrosidasa de lisosoma humano. A pesar de que los nuevos derivados no contienen el grupo hidroximetilo en el carbono 5 del anillo de pirrolidina presente en la mayoría de los inhibidores de glicosidasas derivados de pirrolidinas naturales y sintéticos, han mostrado actividad inhibidora frente a - glucosidasas y -galactosidasas. En este sentido, los compuestos 89b,f y 112b,k,p,r son los primeros ejemplos de inhibidores de la -glucocerebrosidasa lisosomal en el rango micromolar bajo derivados de una 3,4-dihidroxipirrolidina. La ausencia del grupo hidroximetilo y la incorporación de un resto hidrofóbico en estos compuestos podría mejorar la permeabilidad celular, aspecto importante para posibles aplicaciones farmacológicas. Por tanto, gracias a la aplicación de la metodología de síntesis en paralelo seguido de evaluación biológica in situ, se han podido identificar varios inhibidores de la -glucosidasa de almendras y la -galactosidasa de granos de café con valor de IC50 en el rango micromolar bajo, evitando la síntesis y purificación de cada compuesto individualmente. Este análisis preliminar ha permitido elegir varios inhibidores de estas glicosidasas como modelos para el desarrollo de derivados activos frente a la -glucocerebrosidasa lisosomal. Resultados y Discusión 117 1.3.3. Estudios estructura-actividad en la inhibición de -glucocerebrosidasa lisosomal Como se ha visto en el apartado anterior, los derivados 89b y 112b, que presentan un resto de fenilo unido directamente al anillo de triazol, resultaron ser buenos inhibidores de la -glucocerebrosidasa de lisosoma humano, con valores de IC50 en el orden micromolar (Figura 33). Figura 33. Derivados epímeros en C-2 con actividad inhibidora frente a -GCasa Con el objetivo de estudiar la influencia de diversas modificaciones estructurales sobre los arilimino-C-metilentriazoles preparados en la inhibición de las glicosidasas lisosomales, se ha llevado a cabo la síntesis de un conjunto de derivados con distintos sustituyentes en el anillo de fenilo y en el C-5 del resto de pirrolidina (Figura 34). Figura 34. Estructura general de los compuestos preparados 118 Capítulo 1 Se han sintetizado un total de 16 derivados epiméricos en C-2 mediante reacciones de CuAAC con fenilacetilenos diferentemente sustituidos. En estos casos, no se ha podido llevar a cabo la posterior evaluación biológica in situ ya que en el grupo no se disponía de las correspondientes glicosidasas lisosomales, por lo que se ha abordado la síntesis y evaluación biológica de forma convencional. La preparación de los derivados con configuración (2S,3S,4R) en el anillo de pirrolidina se muestra en el Esquema 34, mientras que la síntesis de los compuestos con configuración (2R,3S,4R) se recoge en el Esquema 36. Esquema 34. Síntesis de los derivados 123-131 La síntesis de los derivados 124-131 se llevó a cabo mediante reacción de CuAAC de la azidometilpirrolidina desprotegida 89 con diferentes acetilenos en presencia de CuSO4 y ascorbato sódico. Por otra parte, la reacción de CuAAC de la azidometilpirrolidina protegida 88 con el p-hidroxifenilacetileno (122) en presencia de CuI y DIPEA en tolueno a 50 oC, seguido de desprotección ácida, condujo al derivado 123 con buen rendimiento global. En este caso no fue posible llevar a cabo la reacción de CuAAC con la azida desprotegida 89 debido a que el alquino utilizado (p-hidroxifenilacetileno) en el medio acuoso de la reacción Resultados y Discusión 119 (tBuOH:H2O) evoluciona para dar la correspondiente metilcetona 132 (Esquema 35). Evidentemente, el grupo fenólico juega un importante papel anquimérico en la aceleración de la adición de agua. 139 Esquema 35. Reacción secundaria del alquino 122 en medio acuoso Todos los alquinos utilizados para la síntesis de estos derivados han sido obtenidos de diversas fuentes comerciales, a excepción de los alquinos que se muestran en la Figura 35, que han sido preparados de acuerdo a los procedimientos que están descritos en la bibliografía 140 y cuya síntesis se recoge en la parte experimental. Figura 35. Fenilacetilenos sintéticos 139 Tassano, E.; Alama, A.; Basso, A.; Dondo, G.; Galatini, A.; Riva, R.; Banfi, L. Conjugation of hydroxytyrosol with other natural phenolic fragments: from waste to antioxidants and antitumour compounds. Eur. J. Org. Chem. 2015, 6710-6726. 140 (a) Para el alquino 122, ver: Pirali, T.; Gatti, S.; Di Brisco, R.; Tacchi, S.; Zaninetti, R.; Brunelli, E.; Massarotti, A.; Sorba, G.; Canonico, P. L.; Moro, L.; Genazzani, A. A.; Tron, G. C.; Billington, R. A. Estrogenic analogues synthesized by “click” chemistry. ChemMedChem 2007, 2, 437-440. (b) Para el alquino 133, ver: Liu, Z.; Caner, J.; Kudo, A.; Naka, H.; Saito, S. Redox-selective generation of aldehydes and H2 from alcohols under visible light. Chem. Eur. J. 2013, 19, 9452-9456. (c) Para el alquino 134, ver: Molchanov, S.; Orzelski, W.; Gryff-Keller, A.; Potrzebowski, M. J. Magnetic shielding tensors of carbon nuclei in 3,5- dichlorophenylacetylene, a theoretical ab initio and experimental study. Molecular Physics 2002, 100, 273-286. (d) Para el alquino 135, ver: Constable, E. C.; Housecroft, C. E.; Neuburger, M.; Reymann, S.; Schaffner, S. 4- Substituted and 4,5-disubstituted 3,6-di(2-pyridyl)pyridazines: ligands for supramolecular assemblies. Eur. J. Org. Chem. 2008, 1597-1607; datos espectroscópicos en: Robinson, J. M. A.; Kariuki, B. M.; Harris, K. D. M.; Philp, D. Interchangeability of halogen and ethynyl substituents in the solid state structures of di- and trisubstituted benzenes. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1998, 2459-2469. 120 Capítulo 1 La síntesis de los derivados epiméricos en C-2 (136-142) se llevó a cabo de forma semejante, obteniéndose todos ellos con buenos rendimientos globales (Esquema 36). Esquema 36. Síntesis de los derivados 136-142 Con el objetivo de evaluar el efecto de la presencia de un sustituyente en C-5 en la inhibición enzimática, se prepararon derivados de pirrolidín-5-onas (compuestos 143 y 144) y el derivado 145, que presenta un grupo hidroximetilo en dicha posición (Figura 36). Figura 36. Derivados con un sustituyente en C-5 Para la síntesis de los derivados de pirrolidinonas se llevó a cabo en primer lugar la oxidación del C-5 de la azidometilpirrolidina 88 en presencia de RuO2 y NaIO4 en un Resultados y Discusión 121 sistema bifásico AcOEt/H2O. 141 Se obtuvo el compuesto 146 con buen rendimiento, cuya estructura quedó confirmada en el espectro de 1H-RMN por la desaparición de las señales correspondientes a H-5a y H-5b, y en el espectro de 13C-RMN por la aparición de la señal a 170.5 ppm correspondiente al grupo C=O. La posterior reacción de CuAAC del derivado 146 con fenilacetileno y 3,5-difluorofenilacetileno, respectivamente, seguido de desprotección ácida, condujo a los triazoles 143 y 144 con buenos rendimientos globales (Esquema 37). Esquema 37. Preparación de las pirrolidinonas 143 y 144 El derivado 145 con una unidad de hidroximetilo en C-5 tiene como precursor la diamina 152, cuya síntesis se muestra en el Esquema 38. La síntesis de la nitrona 150 se realizó de acuerdo al procedimiento descrito previamente en bibliografía. 142 La reacción de la 2,3,5-tri-O-bencil-D-ribofuranosa (147) con hidrocloruro de hidroxilamina, seguido de protección con cloruro de terc-butildifenilsililo y tratamiento con I2 en presencia de PPh3 e imidazol, en tolueno a reflujo proporcionó el compuesto 149. La desprotección del grupo TBDPS con TBAF y posterior desplazamiento nucleofílico intramolecular, originó la nitrona 150 con un rendimiento global del 21%. La adición de CN- a la nitrona 150 usando como reactivo cianuro de trimetilsililo en MeOH a 50 oC, permitió la obtención del derivado 151 con buen rendimiento. Se obtuvo principalmente el diastereoisómero 2,3-trans de acuerdo con lo descrito en la bibliografía. 143 La hidrogenación total del cianoderivado 151 condujo a 141 Qiu, X. –L.; Qing, F. –L. Synthesis of 3’-deoxy-3’-difluoromethyl azanucleosides from trans-4-hydroxy-L- proline. J. Org. Chem. 2005, 70, 3826-3837. 142 Tsou, E. –L.; Yeh, Y. –T.; Liang, P. –H.; Cheng, W. –C. A convenient approach toward the synthesis of enantiopure isomers of DMDP and ADMDP. Tetrahedron 2009, 65, 93-100. 143 Cheng, W. –C.; Wang, J. –H.; Li, H. –Y.; Lu, S. –J.; Hu, J. –M.; Yun, W. –Y.; Chiu, C. –H.; Yang, W. –B.; Chien, Y. –H.; Hwu, W. –L. Bioevaluation of sixteen ADMDP stereoisomers toward alpha-galactosidase A: 122 Capítulo 1 la amina 152 con rendimiento cuantitativo después de purificación cromatográfica con la resina Dowex 50WX8. Esquema 38. Preparación de la aminometilpirrolidina 152 En el Esquema 39 se detalla la síntesis del imino-C-metilentriazol 145. La reacción de la amina 152 con nonaflil azida dio lugar a la azidometilpirrolidina 153, que tras reacción de CuAAC con fenilacetileno condujo al compuesto deseado 145 con un rendimiento del 63%. Esquema 39. Obtención del imino-C-metilentriazol 145 Todos los nuevos derivados han sido evaluados frente a la -glucocerebrosidasa y la -galactosidasa de lisosoma humano. Los resultados obtenidos para los derivados que no presentan sustitución en C-5 se muestran en la Tabla 5. Development of a new pharmacological chaperone for the treatment of Fabry disease and potential enhancement of enzyme replacement therapy efficiency. Eur. J. Med. Chem. 2016, 123, 14-20. Resultados y Discusión 123 Tabla 5. Valor de IC50 (en M) para los derivados 89b, 112b,p,r, 123-131 y 136-142 frente a - glucocerebrosidasa y -galactosidasa lisosomales (“-“: % de inhibición < 50% a 1 mM de inhibidor)  -GCasa (lisosoma humano) -Gal-asa (lisosoma humano)  -GCasa (lisosoma humano) -Gal-asa (lisosoma humano) 89b R1 = H R2 = H 11 - 112b R1 = H R2 = H 28 171 123 R1 = H R2 = OH 27 - 136 R1 = H R2 = OH 34 251 124 R1 = H R2 = CH2OH 102 - 112r R1 = H R2 = CH2OH 187 159 125 R1 = H R2 = OMe 39 - 112p R1 = H R2 = OMe 31 185 126 R1 = H R2 = F 23 - 137 R1 = H R2 = F 24 388 127 R1 = F R2 = H 3.8 - 138 R1 = F R2 = H 5.7 618 128 R1 = Cl R2 = H 1.5 - 139 R1 = Cl R2 = H 1.3 360 129 R1 = Br R2 = H 0.83 - 140 R1 = Br R2 = H 1.4 387 130 R1 = CF3 R2 = H 0.95 - 141 R1 = CF3 R2 = H 1.6 - 131 R1 = OMe R2 = H 8.3 - 142 R1 = OMe R2 = H 7.3 352 De estos resultados pueden hacerse varias observaciones. La inhibición de la - glucocerebrosidasa lisosomal no se ve afectada por la configuración del carbono 2 del anillo de pirrolidina, sino que más bien parece estar gobernada por la sustitución del anillo aromático. Así, se puede comprobar que los derivados para-sustituidos tienen una menor potencia inhibidora si se comparan con el correspondiente derivado no sustituido (123-126 vs 89b y 136, 112r, 112p, 137 vs 112b), siendo este efecto especialmente notable cuando el sustituyente es un grupo -CH2OH (compuestos 124 y 112r). 130 Capítulo 1 Figura 40. Estructura obtenida para el complejo 139:-GCasa (en azul) superpuesta con las estructuras previamente publicadas para los complejos isofagomina:-GCasa (en amarillo) y JZ- 5029:-GCasa (en magenta) Como consecuencia de la disposición del “loop 1” y el “loop 2”, los residuos de tirosina 313 y serina 345 quedan orientados hacia el sitio catalítico. El nitrógeno pirrolidínico de 139 establece enlaces de hidrógeno con los glutamatos (E) 235 y 340 del sitio activo. El OH-4 está orientado hacia el bolsillo hidrofílico, y el OH-3 establece enlaces de hidrógeno con el aspartato (D) 127 y la asparagina (N) 396. El resto del inhibidor se extiende a través de un canal superficial hidrofóbico. El anillo de triazol establece interacciones de tipo “- stacking” con la cadena lateral de la tirosina (Y) 313 (4.4 Å), lo cual contribuye al fortalecimiento de la unión con la enzima (Figura 41A). Por otra parte, el anillo de fenilo se observa débilmente en la estructura (baja densidad electrónica, Figura 41B). Puesto que los estudios estructura-actividad recogidos en el apartado 1.3.3 sugieren que la presencia del anillo aromático y su patrón de sustitución afectan a la unión del inhibidor con la enzima, esta parte de la molécula debe contribuir a la energía de enlace y su débil resolución en la estructura podría deberse a una alta libertad conformacional. Resultados y Discusión 131 Figura 41. A) Interacciones del compuesto 139 con el sitio activo de la -GCasa. B) Mapa de densidad electrónica del complejo 139:-GCasa Con el objetivo de estudiar el modo de unión de los compuestos 129 y 130, que presentan diferente estereoquímica al compuesto 139, y cuyas estructuras cristalinas no han podido obtenerse, el derivado 130 se sometió a estudios de “docking” con la unidad cristalina inhibidor-enzima usando un servidor online (AutoDock). 148 La posición del compuesto 130 observada in silico se asemeja a la que presenta el derivado 139 en la estructura cristalina, pero la interacción entre el OH-3 con el aspartato (D) 127 se sustituye por la interacción entre el OH-4 con el triptófano (W) 179. El anillo de triazol y el anillo de fenilo se posicionan a lo largo del bolsillo hidrofóbico con un ángulo ligeramente diferente al compuesto 139, lo cual sugiere que en la enzima ocurren pequeños cambios conformacionales para dar lugar a las interacciones con la parte aromática de cada inhibidor (Figura 42). 148 Bikadi, Z.; Hazai, E. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock. J. Cheminform. 2009, 1, 15. 132 Capítulo 1 Figura 42. Interacciones observadas in silico para el complejo 130:-GCasa En líneas generales, la capacidad del bolsillo hidrofóbico de la -GCasa para unirse a los diferentes epímeros apoya la plasticidad del sitio activo para acomodar diversas moléculas mediante interacciones débiles. CAPÍTULO 2 PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE INHIBIDORES MULTIVALENTES DERIVADOS DE DIHIDROXIPIRROLIDINAS Antecedentes 135 CAPÍTULO 2: Preparación y evaluación biológica de inhibidores multivalentes derivados de dihidroxipirrolidinas 2.1. ANTECEDENTES El estudio del fenómeno de la multivalencia en la inhibición de glicosidasas (ver apartado 1.5: “Consideraciones generales sobre multivalencia,” página 49) ha experimentado un desarrollo importante en la última década. 149 Los primeros ejemplos de multímeros de iminoazúcares se desarrollaron entre los años 1998-2003. 150 Sin embargo, la escasa actividad mostrada por estos derivados hizo que esta área permaneciese inexplorada hasta el año 2009, cuando Aerts, Overkleeft y cols. publicaron la síntesis de iminoazúcares divalentes conteniendo una unidad de adamantano en el espaciador (compuestos 154 y 155, Figura 43). Sin embargo, a pesar de que estos derivados fueron capaces de inhibir a las enzimas implicadas en el metabolismo de la glucosilceramida (glucosilceramida sintasa, - glucosidasa 2 y -glucocerebrosidasa) no mejoraron la actividad mostrada por los correspondientes derivados monovalentes. 151 149 Ver revisiones: (a) Matassini, C.; Parmeggiani, C.; Cardona, F.; Goti, A. Are enzymes sensitive to the multivalent effect? Emerging evidence with glycosidases. Tetrahedron Lett. 2016, 57, 5407-5415. (b) Zelli, R.; Longevial, J. –F.; Dumy, P.; Marra, A. Synthesis and biological properties of multivalent iminosugars. New. J. Chem. 2015, 39, 5050-5074. (c) Compain, P. Searching for glycomimetics that target protein misfolding in rare diseases: successes, failures, and unexpected progress made in organic synthesis. Synlett 2014, 25, 1215-1240. (d) Gouin, S. G. Multivalent inhibitors for carbohydrate-processing enzymes: beyond the “lock-and-key” concept. Chem. Eur. J. 2014, 20, 11616-11628. 150 (a) McCort, I.; Sanière, M.; Le Merrer, Y. Synthesis and glycosidase inhibitory activity of pseudo-di-(or tri-) saccharides. Tetrahedron, 2003, 59, 2693-2700. (b) Lohse, A.; Jensen, K. B.; Lundgren, K.; Bols, M. Synthesis and deconvolution of the first combinatorial library of glycosidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1965- 1971. (c) Johns, B. A.; Johnson, C. R. Scaffolded bis-azasugars: a dual warhead approach to glycosidase inhibition. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 749-752. 151 Wennekes, T.; van den Berg, R. J. B. H. N.; Bonger, K. M.; Donker-Koopman, W. E.; Ghisaidoobe, A.; van der Marel, G. A.; Strijland, A.; Aerts, J. M. F. G.; Overkleeft, H. S. Synthesis and evaluation of dimeric lipophilic iminosugars as inhibitors of glucosylceramide metabolism. Tetrahedron: Asymmetry 2009, 20, 836-846. 136 Capítulo 2 Figura 43. Iminoazúcares divalentes desarrollados por Aerts, Overkleeft y cols. En ese mismo año, Gouin, Kovensky y cols. 152 utilizando la reacción de CuAAC, publicaron la síntesis de dos dímeros (156 y 157) y un trímero (158) derivados de la 1- desoxinojirimicina (DNJ, en azul) usando plataformas derivadas de etilenglicol, las cuales presentan propiedades hidrofílicas y además evitan la adsorción no específica de proteínas (Figura 44). 153 Figura 44. Multímeros derivados de la 1-desoxinojirimicina (DNJ) descritos por Gouin, Kovensky y cols. 152 Diot, J.; García-Moreno, M. I.; Gouin, S. G.; Ortiz Mellet, C.; Haupt, K.; Kovensky, J. Multivalent iminosugars to modulate affinity and selectivity for glycosidases. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 357-363. 153 Prime, K. L.; Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide): a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10714-10721. Antecedentes 137 El derivado 158 fue el primer ejemplo de multímero que mostró efecto multivalente hacia la -manosidasa de guisantes de Jack, con una potencia de inhibición relativa por unidad de iminoazúcar (rp/n) de 2.5. Desde entonces, se han publicado numerosos ejemplos de iminoazúcares multiméricos que presentan efecto multivalente hacia esta enzima. La -manosidasa de guisantes de Jack (del inglés, “Jack bean” o JB) ha sido la glicosidasa más estudiada en el campo de los iminoazúcares multivalentes debido a su disponibilidad comercial, su similitud estructural con la -manosidasa de Golgi (GM-Man) y la -manosidasa lisosomal (LM- Man) y por su naturaleza multimérica. La -manosidasa de guisantes de Jack es una metaloenzima de alto peso molecular (230 kDa) de naturaleza dimérica, formada por dos heterodímeros (LH)2 resultados de la asociación de monómeros de 49 (L) y 66 (H) kDa, respectivamente. Esta enzima presenta un bolsillo catalítico bastante accesible, lo cual facilita su interacción con estructuras multiméricas. De acuerdo con Gaikwad y Kumar, el sitio activo (situado en las subunidades tipo H) estaría formado por la asociación de estas dos subunidades, conectadas por puentes disulfuro. 154 Las características estructurales de las ciclodextrinas las hacen ser plataformas adecuadas para la preparación de iminoazúcares multivalentes con diversas valencias y orientaciones espaciales. De esta manera, Ortiz Mellet, Compain y cols. 155 publicaron la síntesis de derivados multivalentes de DNJ con valencia 7 y 14 a partir de ciclodextrinas convenientemente funcionalizadas. Los resultados más interesantes se obtuvieron para la ciclodextrina tetradecavalente 159, la cual mostró un valor de rp/n que oscilaba entre 610 y 662 en función del monómero elegido como referencia (Figura 45). 154 Kumar, A.; Gaikwad, S. M. Jack bean -mannosidase (Jb-man): tolerance to alkali, chelating and reducing agents and energetics of catalysis and inhibition. Int. J. Biol. Macromol. 2011, 49, 1066-1071. 155 Decroocq, C.; Rodríguez-Lucena, D.; Russo, V.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Compain, P. The multivalent effect in glycosidase inhibition: probing the influence of architectural parameters with cyclodextrinbased iminosugar “click” clusters. Chem. Eur. J. 2011, 17, 13825-13831. 138 Capítulo 2 Figura 45. Ejemplo de ciclodextrina tetradecavalente derivatizada con unidades de DNJ Tomando como base estos resultados, estos autores sintetizaron otra serie de ciclodextrinas funcionalizadas con el objetivo de investigar el efecto de la valencia, la configuración del iminoazúcar (1-desoxinojirimicina DNJ o 1-desoximanojirimicina DMJ, en rojo) y su disposición en la plataforma (anillo interno o externo) en la inhibición de la - manosidasa. 156 De los nuevos compuestos evaluados, las ciclodextrinas 160 y 161 (valencia 14) presentaron valores de rp/n más altos (Ki = 0.068-0.070 M, rp/n = 113-197) en comparación con los análogos heptavalentes (Ki = 0.36-0.73 M, rp/n = 22-81). Sin embargo, los compuestos 160 y 161 no mejoraron el resultado obtenido para el derivado 159, en el que las unidades de DNJ se disponen en los anillos interior y exterior de la ciclodextrina. Estos resultados ponen de manifiesto que además de la valencia, la configuración del iminoazúcar y su disposición en el molde tienen una marcada influencia en el efecto multivalente observado (Figura 46). 156 Decroocq, C.; Joosten, A.; Sergent, R.; Mena Barragán, T.; Ortiz Mellet, C.; Compain, P. The multivalent effect in glycosidase inhibition: probing the influence of valency, peripheral ligand structure, and topology with cyclodextrin-based iminosugar “click” clusters. ChemBioChem 2013, 14, 2038-2049. Antecedentes 139 Figura 46. Ciclodextrinas tetradecavalentes funcionalizadas con unidades de DNJ o DMJ En el año 2014, Compain y cols. 157 publicaron una segunda generación de este tipo de derivados utilizando iminoazúcares trivalentes dendriméricos. La reacción de CuAAC con una ciclodextrina funcionalizada en C-6 permitió obtener un iminoazúcar de valencia 21 (162), el cual resultó ser un potente inhibidor de -manosidasa con una constante de inhibición (Ki) de 19 nM y un valor de rp/n de 470 (Figura 47). 157 Joosten, A.; Schneider, J. P.; Lepage, M. L.; Tarnus, C.; Bodlenner, A.; Compain, P. A convergent strategy for the synthesis of second-generation iminosugar clusters using “clickable” trivalent dendrons. Eur. J. Org. Chem. 2014, 1866-1872. 242 Experimental section 2,3:5,6-Di-O-isopropylidene-D-gulono-γ-lactone (96) 213 To a solution of D-gulono-γ-lactone (6.0 g, 0.034 mol) in acetone (160 mL), 2,2- dimethoxypropane (32 mL, 0.25 mol) and PTSA (until pH = 3) was added. After stirring at r.t. for 1 d, the mixture was neutralized with Na2CO3, filtered and evaporated. The resulting residue was dissolved in EtOAc and washed with sat. aq. soln. of NaHCO3. The organic layers were dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give 96 (8.1 g, 0.031 mol, 91%) as a white solid. 2,3:5,6-Di-O-isopropylidene-D-gulitol (97)213 To a suspension of LiAlH4 (623 mg, 15.6 mmol) in THF:Et2O 8:1 (110 mL) cooled to 0 ºC, 96 (4.03 g, 15.6 mmol) was slowly added. After stirring at r.t. for 2 h, water (5 mL, dropwise) and brine were added. The aqueous phase was extracted twice with EtOAc and the organic layers were dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give 97 (3.93 g, 15.0 mmol, 96%) as a white solid. 213 Fleet, G. W. J.; Son, J. C. Polyhydroxylated pyrrolidines from sugar lactones: synthesis of 1,4-dideoxy-1,4- imino-D-glucitol from D-galactonolactone and syntheses of 1,4-dideoxy-1,4-imino-D-allitol, 1,4-dideoxy-1,4- imino-D-ribitol, and (2S,3R,4S)-3,4-dihydroxyproline from D-gulonolactone. Tetrahedron 1988, 44, 2637-2647. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 243 N-Benzyl-1,4-dideoxy-1,4-imino-2,3:5,6-di-O-isopropylidene-D-allitol (99)213 To a solution of 97 (3.93 g, 15.0 mmol) in anhydrous pyridine (25 mL), MeSO2Cl (4.7 mL, 61 mmol) and DMAP (365 mg, 2.96 mmol) were added and the mixture was stirred at r.t. for 2 h. Water (7 mL) was added and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in CH2Cl2 and washed with water and brine. The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give the dimesylated derivative 98. The resulting crude product was dissolved in benzylamine (13 mL) and stirred for 2 d at 60 oC. The solvent was removed under reduced pressure and the obtained residue was dissolved in brine and the solution extracted twice with CH2Cl2. The organic layers were washed with H2O, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (Et2O:cyclohexane 1:3) to give 99 (3.81 g, 11.4 mmol, 76%, 2 steps) as a pale yellow oil. N-Benzyl-1,4-dideoxy-1,4-imino-2,3-O-isopropylidene-D-allitol (100)213 A solution of 99 (3.81 g, 11.4 mmol) in AcOH (63 mL, 80% v/v solution) was stirred at 60 oC for 1.5 d. The solvent was evaporated under reduced pressure and the resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc) to give 100 (2.03 g, 6.92 mmol, 61%) as a pale yellow oil. 244 Experimental section N-tert-Butoxycarbonyl-1,4-dideoxy-1,4-imino-2,3-O-isopropylidene-D-allitol (101)213 To a solution of 100 (2.03 g, 6.92 mmol) in MeOH (50 mL), Boc2O (3.09 g, 13.88 mmol) and Pd/C (10%, cat.) were added and the reaction mixture was stirred under an atmosphere of hydrogen for 2 h. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (Et2O:cyclohexane 4:1) to give 101 (1.54 g, 5.08 mmol, 73%) as a white solid. (2S,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-formyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (ent-82) 214 To a solution of 101 (1.54 g, 5.08 mmol) in THF (20 mL) at 0 oC, a solution of NaIO4 (2.18 g, 10.2 mmol) in water (35 mL) was added. The reaction mixture was stirred at r.t. for 1 h. THF was removed under reduced pressure and the aqueous phase was extracted twice with CH2Cl2. The organic layers were washed with sat. aq. soln. of NaHCO3 and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give ent-82 (1.36 g, 5.01 mmol, 99%) as an oil. 214 Navarro, I.; Vogel, P. Synthesis of a new C(1→2)-linked iminodisaccharide starting from levoglucosenone. Helv. Chim. Acta 2002, 85, 152-160. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 245 (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-ethynyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (ent-83) To a solution of ent-82 (150 mg, 0.553 mmol) in anhydrous MeOH (8 mL) at 0 oC, K2CO3 (154 mg, 1.10 mmol) and Bestmann-Ohira reagent (94 µL, 0.61 mmol), were slowly added. The reaction mixture was stirred at r.t. for 7 h and then Et2O and sat. aq. soln. of NaHCO3 were added. The aqueous phase was extracted twice with CH2Cl2. The organic layers were dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:5) to give ent-83 (96 mg, 0.36 mmol, 65%) as an oil. [𝛼]𝐷 23 – 98.8 (c 0.51, CH2Cl2). HRCIMS m/z found 290.1364, calc. for C14H21NO4 [M+Na]+: 290.1363. IR and NMR data match with those of compound 83 (page 231). (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-[(1-benzyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]-3,4-O- isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (ent-84) CuAAC (General Procedure 1) using ent-83 (74 mg, 0.28 mmol), benzylazide (56 mg, 0.42 mmol), DIPEA (186 µL, 1.07 mmol) and CuI (16 mg, 0.082 mmol), in toluene (2.5 mL) at r.t. for 4 h, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2) afforded ent- 84 (92 mg, 0.23 mmol, 82%) as a white solid. 246 Experimental section [𝛼]𝐷 26 – 30.1 (c 0.67 CH2Cl2). HRCIMS m/z found 401.2182, calc. for C21H29N4O4 [M+H]+: 401.2189. IR and NMR data match with those of compound 84 (page 232). (2R,3R,4S)-2-[(1-Benzyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]-pyrrolidine-3,4-diol (ent-85) A solution of ent-84 (54 mg, 0.14 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 3.2 mL), was stirred at r.t. overnight. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 10%, yielded ent-85 (21 mg, 0.081 mmol, 58%) as a white solid. [𝛼]𝐷 23 + 47.3 (c 0.84, MeOH). IR (ν cm-1) 3285 (OH, NH), 1445, 1121, 814, 719. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.91 (s, 1H, H-5’), 7.35-7.34 (m, 5H, H-aromat.), 5.58 (s, 2H, -CH2Ph), 4.21-4.15 (m, 1H, H-4), 4.13-4.06 (m, 2H, H-3, H-2), 3.36 (dd, 1H, 2J5a,5b =12.0, J5a,4 = 5.4, H-5a), 2.91 (dd, 1H, J5b,4 = 3.3, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 149.0 (C-4’), 136.8 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.6 (C aromat.), 129.2 (C aromat.), 123.9 (C-5’), 78.8 (C-3), 72.3 (C-4), 59.1 (C-2), 54.9 (-CH2Ph), 52.8 (C-5). HRCIMS m/z found 261.1339, calc. for C13H17N4O2 [M+H]+: 261.1346. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 247 (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-hydroxymethyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine- 3,4-diol (ent-86) 215 To a suspension of NaBH4 (45 mg, 1.1 mmol) in ethanol (2 mL), a solution of ent-82 (307 mg, 1.13 mmol) in ethanol (3 mL) was added slowly and the reaction mixture was stirred at r.t. for 50 min. Sat. aq. soln. of NH4Cl was added and the aqueous phase was extracted twice with EtOAc. The organic layers were dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give ent- 86 (308 mg, 1.13 mmol, quantitative) as a white solid. (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-tosyloxymethyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine- 3,4-diol (ent-87) To a solution of ent-86 (790 mg, 2.89 mmol) in anhydrous pyridine (12 mL) at 0 oC, TsCl (2.79 g, 14.5 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at r.t. for 2 d. Water was added at 0 oC (2 mL) and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in CH2Cl2, washed with HCl 1M, sat. aq. soln. of. NaHCO3 and brine. The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (Et2O:cyclohexane 1:1) to give ent-87 (1.01 g, 2.36 mmol, 82%) as a white solid. 215 Chirke, S. S.; Rajender, A.; Lakshmi, J. K.; Rao, B. V. A divergent, short, and stereoselective approach to pyrrolidine iminosugars: synthesis of 1,4-dideoxy-1,4-imino-derivatives of D-allitol, D-ribitol, ethyl-erythritol, and (-)-2,3-trans-3-4-cis-dihydroxyproline. Tetrahedron Lett. 2015, 56, 1218-1221. 248 Experimental section [𝛼]𝐷 26 – 42.7 (c 1.10, CH2Cl2). HRCIMS m/z found 428.1746, calc. for C20H30NO7S [M+H]+: 428.17463. IR and NMR data match with those of compound 87 (page 234). (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-azidomethyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4- diol (ent-88) To a solution of ent-87 (1.01 g, 2.36 mmol) in DMF (20 mL), NaN3 (387 mg, 5.92 mmol) was added. After stirring at 70 oC for 2 h the solvent was removed under reduced pressure and the obtained residue was dissolved in CH2Cl2, washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (Et2O:cyclohexane 1:2) to give ent-88 (633 mg, 2.12 mmol, 90%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 – 37.5 (c 0.65, CH2Cl2). HRCIMS m/z found 299.1712, calc. for C13H23N4O4 [M+H]+: 299.1719. IR and NMR data match with those of compound 88 (page 235). (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-[(4’’-phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1’-yl)methyl)]-3,4-O- isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (102) CuAAC (General Procedure 1) using ent-88 (69 mg, 0.23 mmol), phenylacetylene (77 µL, 0.69 mmol), DIPEA (226 µL, 1.29 mmol) and CuI (20 mg, 0.10 mmol), in toluene (3 mL) at Synthetic procedures and characterization of the new compounds 249 50 oC for 2 d, followed by chromatographic purification (Et2O:cyclohexane 3:1) afforded 102 (87 mg, 0.22 mmol, 96%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 – 33.1 (c 1.00, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2983, 1679 (C=O), 1407, 1221, 1055, 855, 764. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm, J Hz) δ 8.40 (s, 1H, H-5’’), 7.85-7.81 (m, 2H, H-aromat.), 7.47-7.30 (m, 3H, H-aromat.), 4.74-4.68 (m, 2H, H-3, H-4), 4.61 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.8, J1’a,2 = 6.3, H-1’a), 4.46 (dd, 1H, J1’b,2 = 6.9, H-1’b), 4.35 (t, 1H, H-2), 3.71 (d, 1H, 2J5a,5b = 12.9, H-5a), 3.21 (dd, 1H, J5b,4 = 4.2, H-5b), 1.34-1.26 (m, 15H, -C(CH3)3, - C(CH3)2, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm, J Hz) δ 153.0 (C=O), 146.1 (C-4’’), 130.5 (Cq aromat.), 128.3 (C aromat.), 127.2 (C aromat.), 124.8 (C aromat.), 121.4 (C-5’’), 110.6 (-C(CH3)2), 81.7 (C-4), 78.7 (-C(CH3)3), 78.4 (C-3), 63.2 (C-2), 50.4 (C-5), 48.7 (C-1’), 27.4 (-C(CH3)3), 26.3 (-C(CH3)2), 24.5 (-C(CH3)2). HRCIMS m/z found 401.2198, calc. for C21H29N4O4 [M]+: 401.2189. (2R,3R,4S)-2-[(4’’-Phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1’-yl)methyl)]-pyrrolidine-3,4-diol hydrochloride (ent-90) A solution of 102 (39 mg, 0.097 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 2.4 mL) was stirred at r.t. overnight and evaporated to give ent-90 (34 mg, 0.097 mmol, quantitative) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 + 43.5 (c 0.52, MeOH). IR (ν cm-1) 3327, 3092 (OH, NH), 1580, 1373, 957, 769. 1H- NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.60 (s, 1H, H-5’), 7.85 (d, 2H, JH,H = 7.2, H- aromat.), 7.47 (ap. t, 2H, H-aromat.), 7.40 (ap. t, 2H, H-aromat.), 5.00-4.98 (m, 2H, H-1’), 4.32-4.29 (m, 1H, H-4), 4.20 (dd, 1H, J3,2 = 9.6, J3,4 = 3.3, H-3), 4.11-4.04 (m, 1H, H-2), 3.60 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.5, J5a,4 = 3.2, H-5a), 3.35 (ap. d, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, 250 Experimental section MeOD, δ ppm) δ 148.6 (C-4’’), 130.5 (Cq aromat.), 130.2 (C aromat.), 130.0 (C aromat.), 127.0 (C aromat.), 124.0 (C-5’’), 74.8 (C-3), 70.3 (C-4), 61.0 (C-2), 51.7 (C-5), 50.8 (C-1’). HRCIMS m/z found 261.1340, calc. for C13H17N4O2 [M]+: 261.1346. (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-aminomethyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine- 3,4-diol (ent-91) To a solution of ent-88 (633 mg, 2.12 mmol) in MeOH (15 mL), Pd/C (10%, cat.) was added and the reaction mixture was stirred under an atmosphere of hydrogen for 1.5 h. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH 40:1→30:1, 1% Et3N) to give ent-91 (508 mg, 1.87 mmol, 88%) as a colourless oil. [𝛼]𝐷 26 – 35.1 (c 0.59, CH2Cl2). HRESIMS m/z found 273.1810, calc. for C13H25N2O4 [M+H]+: 273.1809. IR and NMR data match with those of compound 91 (page 237). (2R,3R,4S)-2-Benzoylaminomethyl-pyrrolidine-3,4-diol (ent-92) To a solution of ent-91 (67 mg, 0.25 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (3 mL) at 0 oC, benzoyl chloride (58 L, 0.50 mmol) and Et3N (70 L, 0.49 mmol) were added and the mixture was stirred at r.t. for 2 h. The solution was washed with sat. aq. soln. of NaHCO3, water and brine and the organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue Synthetic procedures and characterization of the new compounds 251 was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:2→1:1) to give the corresponding protected pyrrolidine-amide (95 mg, 0.25 mmol, quantitative) as a colourless oil. A solution of this compound (56 mg, 0.15 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 3.6 mL), was stirred at r.t. for 3 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 25%, yielded ent-92 (33 mg, 0.14 mmol, 93%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 + 36.2 (c 0.74, MeOH). HRESIMS m/z found 237.1230, calc. for C12H17N2O3 [M+H]+: 237.1234. IR and NMR data match with those of compound 92 (page 238). (2R,3R,4S)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(2-azidoacetylaminomethyl)-3,4-O-isopropylidene- pyrrolidine-3,4-diol (ent-94) To a solution of ent-91 (198 mg, 0.727 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (7 mL) at 0 oC, bromoacetyl chloride (229 mg, 1.46 mmol) and Et3N (208 L, 1.46 mmol) were added and the mixture was stirred at r.t. for 2 h. The solution was washed with sat. aq. soln. of NaHCO3, water and brine and the organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1) to give the corresponding protected pyrrolidine-(bromo)amide (198 mg, 0.503 mmol, 69%) as an oil. To a solution of this compound (187 mg, 0.476 mmol) in DMF (4.5 mL), NaN3 (78 mg, 1.2 mmol) was added. After stirring at 70 oC for 2 h the solvent was removed under reduced pressure and the obtained residue was dissolved in CH2Cl2, washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The crude 258 Experimental section [𝛼]𝐷 25 + 104.3 (c 0.68, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 3220 (≡C-H), 2978, 2938, 2115 (≡C-C), 1696 (C=O), 1392, 1157, 881. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 4.76 (ap. t, 1H, H-4), 4.69 (d, 1H, J3,4 = 6.0, H-3), 4.60 (br. s, 1H, H-2), 3.86-3.79 (m, 1H, H-5a), 3.39 (dd, 1H, 2J5b,5a = 12.8, J5b,4 = 4.7, H-5b), 2.29 (d, 1H, J2’,2 = 2.4, H-2’), 1.47 (s, 9H, -C(CH3)3), 1.42 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.29 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3, δ ppm, mixture of rotamers) δ 154.4 (C=O), 112.2 (-C(CH3)2), 85.6, 85.1 (C-3), 80.6 (-C(CH3)3), 80.1 (C-1’), 79.7, 78.8 (C-4), 72.8 (C-2’), 55.0, 54.5 (C-2), 51.4, 50.9 (C-5), 28.5 (-C(CH3)3), 26.7 (- C(CH3)2), 25.0 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 290.1364, calc. for C14H21NO4 [M+Na]+: 290.1363. (2R,3S,4R)-2-[(1-Benzyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]-pyrrolidine-3,4-diol (110) CuAAC (General Procedure 1) using 109 (81 mg, 0.30 mmol), benzylazide (80 mg, 0.60 mmol), DIPEA (200 µL, 1.15 mmol) and CuI (18 mg, 0.093 mmol), in toluene (3 mL) at r.t. for 6 h, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2) afforded the corresponding protected pyrrolidine-triazole (116 mg, 0.290 mmol, 97%) as a white solid. A solution of this compound (72 mg, 0.18 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 4.4 mL), was stirred at r.t. for 3 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 25%, yielded 110 (43 mg, 0.17 mmol, 94%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 – 61.2 (c 0.62, MeOH). IR (ν cm-1) 3280, 3133 (OH, NH), 1441, 1128, 917, 720. 1H- NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.91 (s, 1H, H-5’), 7.40-7.30 (m, 5H, H-aromat.), 5.58 (s, 2H, -CH2Ph), 4.19 (td, 1H, J4,5a = J4,3 = 5.1, J4,5b = 3.2, H-4), 4.15 (d, 1H, J2,3 = 7.8, H-2), 4.09 (dd, 1H, H-3), 3.37 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.2, H-5a), 2.91 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR Synthetic procedures and characterization of the new compounds 259 (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 149.0 (C-4’), 136.8 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.6 (C aromat.), 129.2 (C aromat.), 123.9 (C-5’), 78.8 (C-3), 72.3 (C-4), 59.0 (C-2), 54.9 (-CH2Ph), 52.7 (C-5). HRESIMS m/z found 261.1347, calc. for C13H17N4O2 [M+H]+: 261.1346. (5S,6R,7S,7aR)-6,7-O-Isopropylidene-tetrahydropyrrolo[1,2-c]-oxazol-3-one-6,7-diol (111)219 To a solution of 107 (704 mg, 2.58 mmol) in anhydrous piridine (10 mL) at 0 ºC, TsCl (1.24 g, 6.44 mmol) was added. After stirring at 0 oC to r.t. overnight, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1→2:1) to give 111 (473 mg, 2.38 mmol, 92%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 – 19.8 (c 0.79, CH2Cl2). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 4.81 (dd, 1H, J = 5.1, J = 4.5), 4.59 (ap. t, 1H), 4.54 (dd, 1H, J = 8.7, J = 2.4), 4.41 (ap. t, 1H), 3.98 (d, 1H, J = 13.5), 3.86 (ap. ddd, 1H), 3.09 (dd, 1H, J = 13.5, J = 4.2), 1.44 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.31 (s, 3H, -C(CH3)2). (2R,3S,4R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-(N-benzyl)aminomethyl-3,4-O-isopropylidene- pyrrolidine-3,4-diol (113) 260 Experimental section To a solution of 108 (157 mg, 0.579 mmol) in 2,2,2-trifluoroethanol (2 mL), benzylamine (100 L, 0.906 mmol) was added. After stirring at 30 ºC for 30 min, NaBH4 (27 mg, 0.69 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at r.t. for 30 min. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc) to give 113 (157 mg, 0.433 mmol, 75%) as a colourless oil. [𝛼]𝐷 27 – 52.0 (c 1.04, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2979, 1692 (C=O), 1391, 1245, 1162, 1081, 859, 698. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 7.35-7.20 (m, 5H, H-aromat.), 4.79 (t, 1H, J3,2 = J3,4 = 6.6, H-3), 4.70 (td, 1H, J4,5a = 6.7, J4,5b = 3.9, H-4), 4.09-4.02 (m, 1H, H-2), 3.82- 3.74 (m, 3H, -CH2Ph, H-5a), 3.32 (dd, 1H, 2J5b,5a = 12.4, H-5b), 3.00-2.87 (m, 2H, H-1’), 2.06 (br. s, 1H, NH), 1.46 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.41 (s, 9H, -C(CH3)3), 1.33 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3, δ ppm) δ 154.5 (C=O), 140.7 (Cq aromat.), 128.5 (C aromat.), 128.2 (C aromat.), 126.9 (C aromat.), 112.9 (-C(CH3)2), 80.3 (C-3), 80.1 (-C(CH3)3), 78.0 (C-4), 59.5 (C-2), 54.1 (-CH2Ph), 50.8 (C-5), 49.0 (C-1’), 28.5 (-C(CH3)3), 26.5 (-C(CH3)2), 25.2 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 363.2276, calc. for C20H31N2O4 [M+H]+: 363.2278. (2R,3S,4R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-azidomethyl-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4- diol (114) To a solution of 113 (5.92 mg, 16.3 mmol) in MeOH (250 mL), Pd/C (10%, cat.) was added and the reaction mixture was stirred under an atmosphere of hydrogen overnight. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. To a solution of the resulting residue in MeOH (60 mL), H2O (22 mL), NaHCO3 (5.50 g, 65.4 Synthetic procedures and characterization of the new compounds 261 mmol), CF3(CF2)3SO2N3 (NfN3) 220 (10.6 g, 32.6 mmol) in Et2O (44 mL) and CuSO4·5H2O (408 mg, 1.63 mmol) were added. After stirring at r.t. for 6.5 h, the solvent was removed under reduced pressure and the obtained residue was dissolved in CH2Cl2, and washed with sat. aq. soln. of NaHCO3 (five times). The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:6) to give 114 (4.06 g, 13.6 mmol, 83%, 2 steps) as a white solid. [𝛼]𝐷 29 – 70.1 (c 0.99, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2992, 2096 (N3), 1690 (C=O), 1401, 1365, 1248, 1159, 1075, 865, 764. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm, J Hz) δ 4.83-4.75 (m, 2H, H-3, H-4), 3.97-3.90 (m, 1H, H-2), 3.70 (ap. dd, 1H, H-5a), 3.62-3.50 (m, 2H, H-1’), 3.24 (dd, 1H, 2J5b,5a =12.3, J5b,4 = 3.1, H-5b), 1.47 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.43 (s, 9H, -C(CH3)3), 1.32 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm) δ 153.4 (C=O), 111.6 (-C(CH3)2), 79.1 (-C(CH3)3), 78.7 (C-3), 76.9 (C-4), 58.2 (C-2), 50.5 (C-5), 48.8 (C- 1’), 27.6 (-C(CH3)3), 25.8 (-C(CH3)2), 24.4 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 321.1529, calc. for C13H22N4O4 [M+H]+: 321.1533. (2R,3S,4R)-2-Azidomethyl-pyrrolidine-3,4-diol (112) A solution of 114 (533 mg, 1.79 mmol) in HCl (1M):THF (1:1, 42 mL), was stirred at r.t. overnight. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 16.5%, yielded 112 (280 mg, 1.77 mmol, 99%) as a brown solid. 220 NfN3 has been prepared following the procedure described in: Trastoy, B.; Pérez-Ojeda, M. E.; Sastre, R.; Chiara, J. L. Octakis(3-azidopropyl)octasilsesquioxane: a versatile nanobuilding block for the efficient preparation of highly functionalized cube-octameric polyhedral oligosilsesquioxane frameworks through “click” assembly. Chem. Eur. J. 2010, 16, 3833-3841. 262 Experimental section [𝛼]𝐷 26 + 5.6 (c 1.33, MeOH). IR (ν cm-1) 3323 (OH, NH), 2098 (N3), 1267, 1121. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 4.18 (ap. td, 1H, H-4), 4.03 (t, 1H, J3,2 = J3,4 = 4.7, H-3), 3.62 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 12.2, J1’a,2 = 6.2, H-1’a), 3.36 (dd, 1H, H-1’b), 3.19 (ddd, 1H, J2,1’b = 7.4, H-2), 3.03 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.1, J5a,4 = 6.9, H-5a), 2.81 (dd, 1H, J5b,4 = 6.6, H-5b). 13C- NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 73.7 (C-4), 72.9 (C-3), 62.2 (C-2), 52.4 (C-1’), 51.2 (C- 5). HRESIMS m/z found 159.0875, calc. for C5H11N4O2 [M+H]+: 159.0877. (2R,3S,4R)-2-[(4-Phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (115) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (32 mg, 0.20 mmol), phenylacetylene (27 µL, 0.24 mmol), sodium ascorbate (9 mg, 0.05 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (8 mL) at r.t. for 1 d, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1) afforded 115 (45 mg, 0.17 mmol, 85%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 + 15.5 (c 0.68, MeOH). IR (ν cm-1) 3254, 3130 (OH, NH), 1467, 1318, 1224, 1091, 766, 689. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.33 (s, 1H, H-5’’), 7.83-7.79 (m, 2H, H-aromat.), 7.46-7.40 (m, 2H, H-aromat.), 7.33 (ap. tt, H-aromat.), 4.75 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.8, J1’a,2 = 5.7, H-1’a), 4.50 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.1, H-1’b), 4.21 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.6, J4,3 = 4.6, H-4), 4.08 (t, 1H, J3,2 = 4.7, H-3), 3.68-3.62 (m, 1H, H-2), 3.08 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.3, H-5a), 2.90 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 148.7 (C-4’’), 131.7 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.4 (C aromat.), 126.7 (C aromat.), 123.1 (C-5’’), 73.4 (C-4), 72.9 (C-3), 61.7 (C-2), 51.7 (C-1’), 51.0 (C-5). HRESIMS m/z found 261.1349, calc. for C13H17N4O2 [M+H]+: 261.1346. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 263 (2R,3S,4R)-N-Benzyloxycarbonyl-2-(2-azidoethyl)-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine- 3,4-diol (119) 221 To a solution of 116 222 (2.04 g, 8.90 mmol) in EtOH:H2O (1:1, 65 mL), NaHCO3 (749 mg, 8.89 mmol) and CbzCl (1.5 mL, 10 mmol) were added and the reaction was stirred at r.t. for 2 h. After this time, sat. aq. soln. of NaHCO3 (50 mL) was added and after stirring for 10 min, the mixture was extracted with EtOAc three times. The resulting organic phase was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:3) to give 117 (3.14 g, 8.65 mmol, 97%) as a colourless oil. To a suspension of LiAlH4 (66 mg, 1.7 mmol) in anhydrous Et2O (6 mL) at -10 oC, a solution of 117 (524 mg, 1.44 mmol) in anhydrous Et2O (10 mL) was added dropwise. After stirring at -10 oC for 10 min, sat. aq. soln. of Na2SO4 was added slowly, the mixture was diluted with H2O and extracted with EtOAc (four times). The combined organic phases were dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting 221 Elías-Rodríguez, P.; Moreno-Clavijo, E.; Carrión-Jiménez, S.; Carmona, A. T.; Moreno-Vargas, A. J.; Caffa, I.; Montecucco, F.; Cea, M.; Nencioni, A.; Robina, I. Synthesis and cancer growth inhibitory activities of 2-fatty- alkylated pyrrolidine-3,4-diol derivatives. Arkivoc 2014, 197-214. 222 Robina, I.; Gearing, R. P.; Buchanan, J. G.; Wightman, R. H. Diastereoselective conjugate addition of ammonia in the synthesis of chiral pyrrolidines. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1990, 2622-2624. 264 Experimental section residue was purified by chromatography column on silica gel (toluene:acetone 5:1) to give 118 (318 mg, 0.990 mmol, 69%) as a colourless oil. To a solution of this compound (150 mg, 0.47 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (3 mL) at 0 oC, a solution of MeSO2Cl (110 µL, 1.42 mmol) in anhydrous pyridine (2 mL) was added dropwise. After stirring at r.t. for 1.5 h, water (3 mL) was added and the solvent was evaporated. The obtained residue was dissolved in CH2Cl2 and washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give the corresponding mesylated derivative. To a solution of this compound in DMF (3.5 mL), NaN3 (92 mg, 1.4 mmol) was added. After stirring at 50 oC for 2 h the solvent was removed under reduced pressure and the crude product was dissolved in CH2Cl2, washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:4) to give 119 (94 mg, 0.27 mmol, 58%, 2 steps) as a colourless oil. (2R,3S,4R)-N-Benzyloxycarbonyl-2-[(4-phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)ethyl)]-3,4-O- isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (120) CuAAC (General Procedure 1) using 119 (94 mg, 0.27 mmol), phenylacetylene (122 µL, 1.09 mmol), DIPEA (180 µL, 1.03 mmol) and CuI (17 mg, 0.088 mmol), in toluene (2.5 mL) at 50 oC for 3.5 d, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2) afforded 120 (111 mg, 0.248 mmol, 92%) as a white solid. [𝛼]𝐷 24 – 38.3 (c 0.91, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 3079, 1698 (C=O), 1411, 1208, 1080, 855, 761. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 7.82-7.80 (m, 3H, H-5’’, H-aromat.), 7.45-7.32 (m, 8H, H-aromat.), 5.14 (d, 1H, 2JH,H = 12.3, CH2 of Cbz), 5.06 (d, 1H, CH2 of Cbz), 4.78- 4.70 (m, 2H, H-4, H-3), 4.64-4.44 (m, 2H, H-2’), 3.96-3.84 (m, 2H, H-2, H-5a), 3.44 (dd, Synthetic procedures and characterization of the new compounds 265 1H, 2J5b,5a = 12.5, J5b,4 = 3.2, H-5b), 2.49-2.32 (m, 2H, H-1’), 1.52 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.33 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3, δ ppm) δ 155.2 (C=O), 147.9 (C-4’’), 136.4 (Cq aromat.), 130.9 (Cq aromat.), 128.9 (C aromat.), 128.7 (C aromat.), 128.4 (C aromat.), 128.2 (C aromat.), 128.2 (C aromat.), 125.9 (C aromat.), 119.8 (C- 5’’), 113.2 (-C(CH3)2), 79.8, 77.9, (C-3, C-4), 67.4 (CH2 of Cbz), 57.6 (C-2), 50.9 (C-5), 47.9 (C-2’), 30.3 (C-1’), 26.7 (-C(CH3)2), 25.2 (-C(CH3)2). HRCIMS m/z found 449.2177, calc. for C25H29N4O4 [M+H]+: 449.2183. (2R,3S,4R)-2-[(4-Phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)ethyl)]-pyrrolidine-3,4-diol (121) A solution of 120 (75 mg, 0.17 mmol) in HCl (1M):THF (1:1, 6.8 mL) was stirred at r.t. for 2.5 h. After this time, the solvent was evaporated and the resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH, 50:1→20:1) to give the corresponding 3,4-O-deprotected derivative (43 mg, 0.11 mmol, 65%). This compound was dissolved in MeOH (2 mL), Pd/C (10%, cat.) and HCl (5M, 73 L) were added and the reaction mixture was stirred under an atmosphere of hydrogen for 2 h. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 10%→25%, to give 121 (7 mg, 0.03 mmol, 27%) as a white solid. [𝛼]𝐷 24 + 66.9 (c 0.65, MeOH). IR (ν cm-1) 3268 (OH, NH), 1426, 1219, 1044, 762, 690. 1H- NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.35 (s, 1H, H-5’’), 7.82 (ap. d, 2H, H-aromat.), 7.46-7.32 (m, 3H, H-aromat.), 4.56-4.54 (m, 2H, H-2’a, H-2’b), 4.25-4.19 (m, 1H, H-4), 3.99 (ap. t, 1H, H-3), 3.05 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.4, J5a,4 = 7.2, H-5a), 3.00-2.95 (m, 1H, H-2), 2.86 (dd, 1H, J5b,4 = 6.5, H-5b), 2.41-2.29 (m, 1H, H-1’a), 2.21-2.12 (m, 1H, H-1’b). 13C-NMR 266 Experimental section (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 148.9 (C-4’’), 131.7 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.4 (C aromat.), 126.7 (C aromat.), 122.3 (C-5’’), 73.8 (C-4), 73.1 (C-3), 59.6 (C-2), 51.4 (C-5), 49.3 (C-2’), 31.4 (C-1’). HRESIMS m/z found 275.1498, calc. for C14H19N4O2 [M+H]+: 275.1503. Set of alkynes (a-s)  Alkynes a, b, c, d, e, f, g, k, l, m, p and q are commercially available.  Alkynes h, i, j, n, r and s have been prepared following the procedures described in the literature. 223 223 (a) For alkynes h and i, see: Gill, H. S.; Tinianow, J. N.; Ogasawara, A.; Flores, J. E.; Vanderbilt, A. N.; Raab, H.; Scheer, J. M.; Vandlen, R.; Williams, S. –P.; Marik, J. A modular platform for the rapid site-specific radiolabeling of proteins with 18F exemplified by quantitative positron emission tomography of human epidermal growth factor receptor 2. J. Med. Chem. 2009, 52, 5816-5825. (b) For alkyne j, see: Cserép, G. B.; Baranyai, Z.; Komáromy, D.; Horváti, K.; Bösze, S.; Kele, P. Fluorogenic tagging of peptides via Cys residues using thiolspecific vinyl sulfone affinity tags. Tetrahedron 2014, 5961-5965. (c) For alkyne n, see: Nocentini, A.; Ferraroni, M.; Carta, F.; Ceruso, M.; Gratteri, P.; Lanzi, C.; Masini, E.; Supuran, C. T. Benzenesulfonamides incorporating flexible triazole moieties are highly effective carbonic anhydrase inhibitors: synthesis and kinetic, crystallographic, computational, and intraocular pressure lowering investigations. J. Med. Chem. 2016, 59, 10692-10704. (d) For alkyne r, see: Liu, Z.; Caner, J.; Kudo, A.; Naka, H.; Saito, S. Redox-selective generation of aldehydes and H2 from alcohols under visible light. Chem. Eur. J. 2013, 19, 9452-9456. (e) For alkyne s, see: Synthetic procedures and characterization of the new compounds 267  Alkyne o is a new compound. 3,6,9,12,15,18-Hexaoxahenicos-20-yn-1-ol (alkyne h)223a To a solution of hexaethylene glycol (750 mg, 2.90 mmol) in anhydrous THF (5 mL) at 0 ºC, NaH (72 mg, 2.9 mmol) was added slowly. After stirring 15 min at 0 oC, propargyl bromide (310 L, 2.78 mmol) was added dropwise and the mixture was stirred at r.t. for 5 h. After this time, the mixture was filtered through celite, washed with EtOAc and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH 40:1) to give alkyne h (412 mg, 1.29 mmol, 45%) as a yellow oil. 3,6,9,12,15,18-Hexaoxahenicos-20-yn-1-yl-p-toluenesulfonate (alkyne i)223a To a solution of alkyne h (818 mg, 2.55 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (23 mL) at 0 oC, Et3N (1.8 mL, 13 mmol), TsCl (1.46 g, 7.58 mmol) and DMAP (8 mg, 0.07 mmol) were added slowly and the reaction mixture was stirred at r.t. for 5 h. Water was added at 0 oC (2 mL) and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in acetone, filtered through celite and evaporated. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH 50:1→40:1) to give alkyne i (1.07 g, 2.26 mmol, 89%) as a yellow oil. Sinai, A.; Vangel, D.; Gáti, T.; Bombicz, P.; Novák, Z. Utilization of copper-catalyzed carboarylation-ring closure for the synthesis of new oxazoline derivatives. Org. Lett. 2015, 17, 4136-4139. 274 Experimental section s, 1H, OH), 4.75 (br. s, 1H, OH), 4.56 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.8, J1’a,2 = 4.8, H-1’a), 4.32 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.9, H-1’b), 4.03-3.93 (m, 2H, H-4, H-3), 3.88 (s, 3H, -OCH3), 3.54-3.47 (m, 1H, H-2), 3.32 (br. s, 1H, NH), 2.96 (dd, 1H, 2J5a,5b = 10.8, J5a,4 = 6.6, H-5a), 2.74 (dd, 1H, J5b,4 = 6.3, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 157.4 (Cq aromat.), 146.1 (C-4’’), 133.8 (Cq aromat.), 129.5 (C aromat.), 128.6 (Cq aromat.), 127.3 (C aromat.), 126.3 (Cq aromat.), 124.1 (C aromat.), 123.3 (C aromat.), 121.8 (C-5’’), 119.1 (C aromat.), 106.0 (C aromat.), 72.2 (C-4), 71.8 (C-3), 59.9 (C-2), 55.2 (-OCH3), 55.2 (C-1’), 50.4 (C-5). HRESIMS m/z found 341.1603, calc. for C18H21N4O3 [M+H]+: 341.1608. (2R,3S,4R)-2-[(4-(4-Methoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)]-pyrrolidine-3,4-diol (112p) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (31 mg, 0.20 mmol), 1-ethynyl-4- methoxybenzene (alkyne p) (31 L, 0.23 mmol), sodium ascorbate (9 mg, 0.05 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (7.7 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1) afforded 112p (50 mg, 0.17 mmol, 85%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 + 11.8 (c 0.82, MeOH). IR (ν cm-1) 3254, 2924, (OH, NH), 1558, 1496, 1245, 1028, 835, 799. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.22 (s, 1H, H-5’’), 7.75-7.70 (m, 2H, H-aromat.), 7.01-6.96 (m, 2H, H-aromat.), 4.73 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.8, J1’a,2 = 5.7, H-1’a), 4.49 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.3, H-1’b), 4.21 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.7, J4,3 = 4.5, H-4), 4.08 (t, 1H, J3,2 = 4.6, H-3), 3.83 (s, 3H, -OCH3), 3.69-3.62 (m, 1H, H-2), 3.08 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.3, H- Synthetic procedures and characterization of the new compounds 275 5a), 2.90 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 161.3 (Cq aromat.), 148.7 (C-4’’), 128.0 (C aromat.), 124.3 (Cq aromat.), 122.3 (C-5’’), 115.4 (C aromat.), 73.6 (C-4), 73.0 (C-3), 61.7 (C-2), 55.8 (-OCH3), 51.9 (C-1’), 51.2 (C-5). HRESIMS m/z found 291.1453, calc. for C14H19N4O3 [M+H]+: 291.1452. (2R,3S,4R)-2-[(4-(4-Hydroxymethylphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine- 3,4-diol (112r) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (30 mg, 0.19 mmol), (4-ethynylphenyl)methanol (alkyne r) (30 mg, 0.23 mmol), sodium ascorbate (8 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (7.6 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 5:1:0.1→4:1:0.1) afforded 112r (42 mg, 0.15 mmol, 79%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 + 17.8 (c 0.82, MeOH). IR (ν cm-1) 3408, 3245 (OH, NH), 2923, 1457, 1110, 1016, 972, 797. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.33 (s, 1H, H-5’’), 7.80 (d, 2H, JH,H = 8.4, H-aromat.), 7.43 (d, 2H, H-aromat.), 4.78 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 5.3, H-1’a), 4.63 (s, 2H, -CH2OH), 4.55 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.6, H-1’b), 4.24 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.7, J4,3 = 4.4, H-4), 4.11 (t, 1H, J3,4 = J3,2 = 4.5, H-3), 3.75-3.70 (m, 1H, H-2), 3.13 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.4, H-5a), 2.94 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 148.6 (C-4’’), 143.0 (Cq aromat.), 130.7 (Cq aromat.), 128.5 (C aromat.), 126.7 (C aromat.), 123.0 (C-5’’), 73.5 (C-4), 73.0 (C-3), 64.9 (-CH2OH), 61.7 (C-2), 51.7 (C-1’), 51.1 (C-5). HRESIMS m/z found 291.1454, calc. for C14H19N4O3 [M+H]+: 291.1452. 276 Experimental section Synthesis of alkynes 122, 134 and 135 225 4-Ethynylphenol (122)225a To a mixture of 4-iodophenol (256) (1.26 g, 5.67 mmol), PdCl2(PPh3)2 (121 mg, 0.169 mmol) and CuI (33 mg, 0.17 mmol) in Et3N (18 mL), trimethylsilylacetylene (1.3 mL, 9.0 mmol) was added and the mixture was stirred at 80 oC for 4.5 h. The mixture was filtered through celite and the solvent was removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:4→1:1) to give 259 (1.02 g, 5.36 mmol, 95%) as an orange solid. To a solution of 259 (764 mg, 4.02 mmol) in THF (13 mL), TBAF (4.4 mL, 4.4 mmol) was added. After stirring at r.t. for 30 min, the solvent was removed under reduced pressure and the crude product was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:3→EtOAc) to give 122 (350 mg, 2.96 mmol, 74%) as a red solid. 225 (a) For alkyne 122, see: Pirali, T.; Gatti, S.; Di Brisco, R.; Tacchi, S.; Zaninetti, R.; Brunelli, E.; Massarotti, A.; Sorba, G.; Canonico, P. L.; Moro, L.; Genazzani, A. A.; Tron, G. C.; Billington, R. A. Estrogenic analogues synthesized by “click” chemistry. ChemMedChem 2007, 2, 437-440. (b) For alkyne 134, see: Molchanov, S.; Orzelski, W.; Gryff-Keller, A.; Potrzebowski, M. J. Magnetic shielding tensors of carbon nuclei in 3,5- dichlorophenylacetylene, a theoretical ab initio and experimental study. Molecular Physics 2002, 100, 273-286. (c) For alkyne 135, see: Constable, E. C.; Housecroft, C. E.; Neuburger, M.; Reymann, S.; Schaffner, S. 4- Substituted and 4,5-disubstituted 3,6-di(2-pyridyl)pyridazines: ligands for supramolecular assemblies. Eur. J. Org. Chem. 2008, 1597-1607; spectral properties in: Robinson, J. M. A.; Kariuki, B. M.; Harris, K. D. M.; Philp, D. Interchangeability of halogen and ethynyl substituents in the solid state structures of di- and tri-substituted benzenes. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1998, 2459-2469. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 277 1,3-Dichloro-5-ethynylbenzene (134)225b To a mixture of 1,3-dichloro-5-iodobenzene (257) (343 mg, 1.23 mmol), PdCl2(PPh3)2 (176 mg, 0.246 mmol) and CuI (48 mg, 0.25 mmol) in Et3N (40 mL), trimethylsilylacetylene (230 L, 1.60 mmol) was added and the mixture was stirred at 60 oC overnight. After this time, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting solid was extracted with Et2O, filtered and evaporated. The obtained residue was purified by chromatography column on silica gel (pentane) to give 260 (264 mg, 1.09 mmol, 89%) as a colourless oil. To a solution of 260 (230 mg, 0.946 mmol) in THF (15 mL), NaOH (1 M, 40 mL) was added. After stirring at r.t. overnight, the mixture was extracted with CH2Cl2 three times and the combined organic phases were dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting white solid 134 (160 mg, 0.936 mmol, 99%) was used without further purification. 1,3-Dibromo-5-ethynylbenzene (135)225c To a mixture of 1,3-dibromo-5-iodobenzene (258) (332 mg, 0.899 mmol), PdCl2(PPh3)2 (129 mg, 0.180 mmol) and CuCl (18 mg, 0.18 mmol) in Et3N (32 mL), trimethylsilylacetylene (170 L, 1.18 mmol) was added and the mixture was stirred at 60 oC overnight. After this time, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting solid was extracted with cyclohexane, filtered and evaporated. The obtained residue was purified by chromatography column on silica gel (pentane) to give 261 (271 mg, 0.816 mmol, 91%) as a colourless oil. To a solution of 261 (262 mg, 0.789 mmol) in THF (20 mL), NaOH (1 M, 40 278 Experimental section mL) was added. After stirring at r.t. overnight, the mixture was extracted with CH2Cl2 three times and the combined organic phases were dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting white solid 135 (158 mg, 0.608 mmol, 77%) was used without further purification. (2S,3S,4R)-2-[(4-(4-Hydroxyphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol hydrochloride (123) CuAAC (General Procedure 1) using 88 (91 mg, 0.31 mmol), 4-ethynylphenol (122) (215 mg, 1.82 mmol), DIPEA (202 µL, 1.16 mmol) and CuI (18 mg, 0.093 mmol), in toluene:DMF (3:1, 4 mL) at 50 oC for 2 d, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:1) afforded the corresponding protected pyrrolidine-triazole (104 mg, 0.250 mmol, 81%) as a pale yellow solid. A solution of this compound (87 mg, 0.21 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 5 mL) was stirred at r.t. for 3 h and evaporated to give 123 (74 mg, 0.21 mmol, quantitative) as a purple solid. [𝛼]𝐷 25 – 45.3 (c 0.69, MeOH). IR (ν cm-1) 3129 (OH, NH), 2901, 1616, 1515, 1229, 833, 676. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.53 (s, 1H, H-5’’), 7.70-7.65 (m, 2H, H- aromat.), 6.92-6.87 (m, 2H, H-aromat.), 5.01-4.99 (m, 2H, H-1’), 4.30 (ap. t, 1H, H-4), 4.20 (dd, 1H, J3,2 = 9.6, J3,4 = 3.8, H-3), 4.11-4.03 (m, 1H, H-2), 3.59 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.7, J5a,4 = 3.7, H-5a), 3.35-3.32 (m, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 160.0 (Cq aromat.), 148.4 (C-4’’), 128.7 (C aromat.), 123.4 (C-5’’), 120.6 (Cq aromat.), 117.0 (C aromat.), 74.8 (C-3), 70.3 (C-4), 60.8 (C-2), 51.7 (C-5), 51.1 (C-1’). HRESIMS m/z found 277.1297, calc. for C13H17N4O3 [M]+: 277.1295. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 279 (2S,3S,4R)-2-[(4-(4-Hydroxymethylphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine- 3,4-diol (124) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (26 mg, 0.16 mmol), (4-ethynylphenyl)methanol (133) (26 mg, 0.20 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.5 mL) at r.t. for 1 d, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 5:1:0.1→3:1.3:0.5) afforded 124 (42 mg, 0.15 mmol, 94%) as a white solid. [𝛼]𝐷 26 – 26.9 (c 0.62, DMSO). IR (ν cm-1) 3277, 3172 (OH, NH), 2895, 1498, 1342, 1226, 1052, 815. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ ppm, J Hz) δ 8.48 (s, 1H, H-5’’), 7.80 (d, 2H, JH,H = 8.2, H-aromat.), 7.38 (d, 2H, H-aromat.), 5.20 (br. s, 1H, -CH2OH), 4.76 (br. s, 1H, OH-3), 4.56-4.47 (m, 4H, OH-4, -CH2OH, H-1’a), 4.28 (dd, 1H, 2J1’b,1’a = 13.7, J1’b,2 = 7.9, H-1’b), 3.86-3.81 (m, 1H, H-4), 3.59 (ap. t, 1H, H-3), 3.43-3.17 (m, 2H, NH, H-2), 2.94 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.2, J5a,4 = 5.0, H-5a), 2.68 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 146.0 (C-4’’), 142.1 (Cq aromat.), 129.4 (Cq aromat.), 126.9 (C aromat.), 124.9 (C aromat.), 121.7 (C-5’’), 74.6 (C-3), 70.8 (C-4), 62.7 (-CH2OH), 61.8 (C-2), 53.3 (C-1’), 51.4 (C-5). HRESIMS m/z found 291.1454, calc. for C14H19N4O3 [M+H]+: 291.1452. 280 Experimental section (2S,3S,4R)-2-[(4-(4-Methoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (125) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (25 mg, 0.16 mmol), 1-ethynyl-4-methoxybenzene (26 L, 0.20 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.1 mL) at r.t. for 1 d, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1) afforded 125 (39 mg, 0.13 mmol, 81%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 – 27.7 (c 0.60, MeOH). IR (ν cm-1) 3245, 3048 (OH, NH), 2912, 1616, 1560, 1251, 1031, 833, 637. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.24 (s, 1H, H-5’’), 7.76-7.71 (m, 2H, H-aromat.), 7.02-6.97 (m, 2H, H-aromat.), 4.67 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.1, H-1’a), 4.45 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.1, H-1’b), 4.04 (td, 1H, J4,3 = J4,5a = 4.9, J4,5b = 2.9, H-4), 3.83 (s, 3H, -OCH3), 3.77 (dd, 1H, J3,2 = 7.7, H-3), 3.51 (td, 1H, H-2), 3.15 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.1, H-5a), 2.87 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 161.3 (Cq aromat.), 148.8 (C-4’’), 128.0 (C aromat.), 124.3 (Cq aromat.), 122.1 (C-5’’), 115.4 (C aromat.), 76.2 (C-3), 72.3 (C-4), 62.7 (C-2), 55.8 (-OCH3), 54.1 (C-1’), 52.3 (C-5). HRESIMS m/z found 291.1453, calc. for C14H19N4O3 [M+H]+: 291.1452. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 281 (2S,3S,4R)-2-[(4-(4-Fluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (126) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (22 mg, 0.14 mmol), 1-ethynyl-4-fluorobenzene (19 L, 0.16 mmol), sodium ascorbate (3 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (0.8 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (4.5 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1→5:1:0.1) afforded 126 (34 mg, 0.12 mmol, 86%) as a white solid. [𝛼]𝐷 28 – 36.1 (c 0.52, MeOH). IR (ν cm-1) 3258, 3098 (OH, NH), 2926, 1611, 1560, 1497, 1232, 1110, 834, 669. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.33 (s, 1H, H-5’’), 7.86- 7.80 (m, 2H, H-aromat.), 7.20-7.13 (m, 2H, H-aromat.), 4.68 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.1, H-1’a), 4.46 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.1, H-1’b), 4.05 (td, 1H, J4,3 = J4,5a = 4.8, J4,5b = 2.9, H-4), 3.78 (t, 1H, J3,2 = 7.8, H-3), 3.51 (td, 1H, H-2), 3.15 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.1, H-5a), 2.87 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 164.1 (d, 1JC,F = 245.7, C-4’’’), 147.9 (C-4’’), 128.6 (d,3JC,F = 8.2, C-2’’’, C-6’’’), 128.2 (d, 4JC,F = 3.3, C-1’’’), 122.9 (C- 5’’), 116.8 (d, 2JC,F = 22.0, C-3’’’, C-5’’’), 76.2 (C-3), 72.3 (C-4), 62.7 (C-2), 54.1 (C-1’), 52.3 (C-5). HRESIMS m/z found 279.1253, calc. for C13H16FN4O2 [M+H]+: 279.1252. 282 Experimental section (2S,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Difluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (127) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (26 mg, 0.16 mmol), 1-ethynyl-3,5- difluorobenzene (24 L, 0.20 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.4 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1→5:1:0.1) afforded 127 (41 mg, 0.14 mmol, 88%) as a white solid. [𝛼]𝐷 23 – 34.1 (c 0.63, MeOH). IR (ν cm-1) 3450, 3288 (OH, NH), 2917, 1629, 1592, 1431, 1226, 1119, 847, 675. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.44 (s, 1H, H-5’’), 7.48- 7.40 (m, 2H, H-2’’’, H-6’’’), 6.92 (tt, 1H, JH,F = 9.1, JH,H = 2.4, H-4’’’), 4.68 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.2, H-1’a), 4.47 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.1, H-1’b), 4.05 (td, 1H, J4,3 = J4,5a = 4.9, J4,5b = 2.9, H-4), 3.78 (t, 1H, J3,2 = 7.8, H-3), 3.51 (td, 1H, H-2), 3.14 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.1, H-5a), 2.87 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 165.0 (dd, 1JC,F = 246.6, 3JC,F = 13.2, C-3’’’, C-5’’’), 146.7 (t, 4JC,F = 3.2, C-4’’), 135.4 (t, 3JC,F = 10.5, C-1’’’), 124.1 (C-5’’), 109.6-109.2 (m, C-2’’’, C-6’’’), 104.0 (t, 2JC,F = 26.0, C-4’’’), 76.3 (C-3), 72.3 (C-4), 62.7 (C-2), 54.2 (C-1’), 52.4 (C-5). HRESIMS m/z found 297.1156, calc. for C13H15F2N4O2 [M+H]+: 297.1158. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 283 (2S,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Dichlorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (128) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (25 mg, 0.16 mmol), 1,3-dichloro-5- ethynylbenzene (134) (33 mg, 0.19 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.4 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1) afforded 128 (46 mg, 0.14 mmol, 88%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 – 26.2 (c 0.57, MeOH). IR (ν cm-1) 3267, 3121 (OH, NH), 2923, 1602, 1567, 1409, 1116, 798, 675. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.45 (s, 1H, H-5’’), 7.79 (d, 2H, 4JH,H = 1.9, H-2’’’, H-6’’’), 7.39 (t, 1H, H-4’’’), 4.68 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.2, H- 1’a), 4.46 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.1, H-1’b), 4.05 (td, 1H, J4,3 = J4,5a = 4.9, J4,5b = 2.9, H-4), 3.78 (dd, 1H, J3,2 = 7.8, H-3), 3.50 (td, 1H, H-2), 3.14 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.1, H-5a), 2.87 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 146.1 (C-4’’), 136.7, 135.2 (C-1’’’, C-3’’’, C-5’’’), 128.7 (C-4’’’), 125.0 (C-2’’’, C-6’’’), 124.1 (C-5’’), 76.3 (C-3), 72.3 (C-4), 62.7 (C- 2), 54.3 (C-1’), 52.4 (C-5). HRESIMS m/z found 329.0566, calc. for C13H15Cl2N4O2 [M+H]+: 329.0567. 290 Experimental section (2R,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Dichlorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4- diol (139) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (26 mg, 0.16 mmol), 1,3-dichloro-5- ethynylbenzene (134) (34 mg, 0.20 mmol), sodium ascorbate (7 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (6.6 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1→5:1:0.1) afforded 139 (47 mg, 0.14 mmol, 88%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 + 25.9 (c 0.55, MeOH). IR (ν cm-1) 3272, 3127 (OH, NH), 2923, 1603, 1567, 1409, 1120, 852, 798, 673. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.43 (s, 1H, H-5’’), 7.80- 7.79 (m, H-2’’’, H-6’’’), 7.40-7.38 (m, 1H, H-4’’’), 4.75 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.5, H-1’a), 4.51 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.3, H-1’b), 4.21 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.6, J4,3 = 4.6, H-4), 4.08 (t, 1H, J3,2 = 4.7, H-3), 3.69-3.63 (m, 1H, H-2), 3.09 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.3, H-5a), 2.90 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 146.0 (C-4’’), 136.8, 135.2 (C-1’’’, C- 3’’’, C-5’’’), 128.7 (C-4’’’), 125.0 (C-2’’’, C-6’’’), 124.3 (C-5’’), 73.6 (C-4), 73.1 (C-3), 61.5 (C-2), 52.2 (C-1’), 51.3 (C-5). HRESIMS m/z found 329.0566, calc. for C13H15Cl2N4O2 [M+H]+: 329.0567. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 291 (2R,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Dibromophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4- diol (140) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (25 mg, 0.16 mmol), 1,3-dibromo-5- ethynylbenzene (135) (50 mg, 0.19 mmol), sodium ascorbate (7 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (6.3 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1) afforded 140 (52 mg, 0.12 mmol, 75%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 + 14.7 (c 0.62, MeOH). IR (ν cm-1) 3277 (OH, NH), 2927, 1602, 1557, 1409, 1229, 1103, 852, 742, 621. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.42 (s, 1H, H-5’’), 7.98 (d, 2H, 4JH,H = 1.7, H-2’’’, H-6’’’), 7.67 (t, 1H, H-4’’’), 4.74 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.6, H-1’a), 4.51 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.3, H-1’b), 4.21 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.6, J4,3 = 4.6, H-4), 4.08 (t, 1H, J3,2 = 4.7, H-3), 3.68-3.62 (m, 1H, H-2), 3.08 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.2, H-5a), 2.90 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 145.7 (C-4’’), 135.7, 124.5 (C-1’’’, C-3’’’, C-5’’’), 134.3 (C-4’’’), 128.3 (C-2’’’, C-6’’’), 124.2 (C-5’’), 73.5 (C-4), 73.1 (C-3), 61.5 (C-2), 52.2 (C-1’), 51.3 (C-5). HRESIMS m/z found 416.9554, calc. for C13H15Br2N4O2 [M+H]+: 416.9556. 292 Experimental section (2R,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Bis(trifluoromethyl)phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]- pyrrolidine-3,4-diol (141) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (26 mg, 0.16 mmol), 1-ethynyl-3,5- bis(trifluoromethyl)benzene (36 L, 0.20 mmol), sodium ascorbate (7 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (6.6 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 7:1:0.1→6:1:0.1) afforded 141 (54 mg, 0.14 mmol, 88%) as a white solid. [𝛼]𝐷 24 + 19.3 (c 0.55, MeOH). IR (ν cm-1) 3287, 3144 (OH, NH), 2935, 1657, 1465, 1277, 1127, 896, 700, 681. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.61 (s, 1H, H-5’’), 8.42 (br. s, 2H, H-2’’’, H-6’’’), 7.91 (br. s, 1H, H-4’’’), 4.78 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.6, H-1’a), 4.54 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.4, H-1’b), 4.22 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.5, J4,3 = 4.6, H-4), 4.10 (t, 1H, J3,2 = 4.7, H-3), 3.71-3.63 (m, 1H, H-2), 3.09 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.3, H-5a), 2.91 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 145.7 (C-4’’), 134.7 (C-1’’’), 133.5 (q, 2JC,F = 33.4, C-3’’’, C-5’’’), 126.7-126.7 (m, C-2’’’, C-6’’’), 124.8 (q, 1JC,F = 271.6, CF3), 124.7 (C-5’’), 122.4-122.2 (m, C-4’’’), 73.7 (C-4), 73.1 (C-3), 61.5 (C-2), 52.3 (C-1’), 51.4 (C-5). HRESIMS m/z found 397.1087, calc. for C15H15F6N4O2 [M+H]+: 397.1094. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 293 (2R,3S,4R)-2-[(4-(3,5-Dimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4- diol (142) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (26 mg, 0.16 mmol), 1-ethynyl-3,5- dimethoxybenzene (33 mg, 0.20 mmol), sodium ascorbate (7 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (6.6 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 7:1:0.1→6:1:0.1) afforded 142 (41 mg, 0.13 mmol, 81%) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 29 + 26.3 (c 0.58, DMSO). IR (ν cm-1) 3269, 3125, (OH, NH), 2916, 1595, 1474, 1203, 1154, 1065, 826, 684. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ ppm, J Hz) δ 8.53 (s, 1H, H-5’’), 7.02 (d, 2H, 4JH,H = 2.3, H-2’’’, H-6’’’), 6.45 (t, 1H, H-4’’’), 4.81-4.75 (m, 2H, OH-3, OH- 4), 4.52 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.6, J1’a,2 = 4.8, H-1’a), 4.28 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.9, H-1’b), 4.03- 3.91 (m, 2H, H-3, H-4), 3.79 (s, 6H, -OCH3), 3.52-3.45 (m, 1H, H-2), 3.28 (br. s, 1H, NH), 2.95 (dd, 1H, 2J5a,5b = 10.8, J5a,4 = 6.6, H-5a), 2.68 (dd, 1H, J5b,4 = 6.4, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 160.8 (C-3’’’, C-5’’’), 145.8 (C-4’’), 132.9 (C-1’’’), 122.4 (C- 5’’), 103.0 (C-2’’’, C-6’’’), 99.7 (C-4’’’), 72.2 (C-4), 71.8 (C-3), 59.8 (C-2), 55.3 (-OCH3), 51.3 (C-1’), 50.4 (C-5). HRESIMS m/z found 321.1554, calc. for C15H21N4O4 [M+H]+: 321.1557. 294 Experimental section (3S,4S,5S)-N-tert-Butoxycarbonyl-5-azidomethyl-3,4-O-isopropilidene-pyrrolidine-2- one-3,4-diol (146) A solution of 88 (128 mg, 0.429 mmol) in EtOAc (3.5 mL) was added to a solution of NaIO4 (277 mg, 1.28 mmol) and RuO2·xH2O (57 mg, 0.43 mmol) in water (3.5 mL). The mixture was vigorously stirred for 2 d and then, it was filtered through celite and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:4) to give 146 (108 mg, 0.346 mmol, 81%) as a colourless oil. [𝛼]𝐷 22 + 57.9 (c 0.52, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2109 (N3), 1716 (C=O), 1148, 1095, 977, 844, 640, 604. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 4.74 (d, 1H J3,4 = 5.5, H-3 or H-4), 4.43 (d, 1H, H-4 or H-3), 4.29-4.27 (m, 1H, H-5), 3.87 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 12.8, J1’a,5 = 3.7, H- 1’a), 3.63 (dd, 1H, J1’b,5 = 2.2, H-1’b), 1.55 (s, 9H, -C(CH3)3), 1.44 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.36 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, CDCl3, δ ppm) δ 170.5 (C=O), 150.0 (C=O, Boc), 112.6 (-C(CH3)2), 84.5 (-C(CH3)3), 77.7 (C-3), 75.4 (C-4), 59.6 (C-5), 51.9 (C-1’), 28.1 (- C(CH3)3), 27.2 (-C(CH3)2), 25.7 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 335.1323, calc. for C13H20O5N4 [M+H]+: 335.1326. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 295 (3S,4S,5S)-5-[(4-Phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-2-one-3,4-diol (143) 226 CuAAC (General Procedure 1) using 146 (53 mg, 0.17 mmol), phenylacetylene (37 L, 0.33 mmol), DIPEA (110 µL, 0.630 mmol) and CuI (10 mg, 0.052 mmol), in toluene (1.6 mL) at 50 oC for 1 d, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2) afforded the corresponding protected pyrrolidinone-triazole (59 mg, 0.14 mmol, 82%) as a white solid. A solution of this compound (79 mg, 0.19 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 5 mL), was stirred at r.t. for 3 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on silica gel (CH2Cl2:MeOH 10:1→5:1), yielded 143 (37 mg, 0.14 mmol, 74%) as a white solid. [𝛼]𝐷 23 + 150.2 (c 0.66, MeOH). IR (ν cm-1) 3359 (OH, NH), 1706 (C=O), 1452, 1140, 1050, 992, 772, 626. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.32 (s, 1H, H-5’’), 7.84-7.80 (m, 2H, H-aromat.), 7.47-7.41 (m, 2H, H-aromat.), 7.38-7.32 (m, 1H, H-aromat.), 4.64 (d, 2H, J1’,5 = 5.6, H-1’), 4.28 (dd, 1H, J4,3 = 5.3, J4,5 = 1.1, H-4), 3.95 (td, 1H, H-5), 3.86 (d, 1H, H-3). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 178.0 (C=O), 149.1 (C-4’’), 131.5 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.5 (C aromat.), 126.7 (C aromat.), 123.3 (C-5’’), 71.5 (C-3), 70.6 (C-4), 61.0 (C-5), 52.9 (C-1’). HRESIMS m/z found 275.1142, calc. for C13H15O3N4 [M+H]+: 275.1139. 226 Trabajo Fin de Grado “Síntesis de derivados de 3,4-dihidroxipirrolidinonas. Evaluación como inhibidores de glicosidasas” (Clara Vago López, Universidad de Sevilla, 2018). 296 Experimental section (3S,4S,5S)-5-[(4-(3,5-Difluorophenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-2-one- 3,4-diol (144)226 CuAAC (General Procedure 1) using 146 (61 mg, 0.20 mmol), 1-ethynyl-3,5- difluorobenzene (48 L, 0.39 mmol), DIPEA (127 µL, 0.727 mmol) and CuI (12 mg, 0.062 mmol), in toluene (1.5 mL) at 50 oC for 1 d, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2) afforded the corresponding protected pyrrolidinone-triazole (77 mg, 0.17 mmol, 85%) as a white solid. A solution of this compound (66 mg, 0.15 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 4 mL), was stirred at r.t. for 5 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on silica gel (CH2Cl2:MeOH 7:1→5:1), yielded 144 (34 mg, 0.11 mmol, 73%) as a white solid. [𝛼]𝐷 23 – 34.3 (c 0.56, MeOH). IR (ν cm-1) 3249 (OH, NH), 1696 (C=O), 1595, 1120, 986, 848. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.44 (s, 1H, H-5’’), 7.49-7.40 (m, 2H, H- 2’’’, H-6’’’), 6.93 (tt, 1H, JH,F = 9.1, JH,H = 2.3, H-4’’’), 4.65 (d, 2H, J1’,5 = 5.8, H-1’), 4.28 (dd, 1H, J4,3 = 5.3, J4,5 = 1.0, H-4), 3.96 (td, 1H, H-5), 3.91 (d, 1H, H-3). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 178.0 (C=O), 165.0 (dd, 1JC,F = 246.6, 3JC,F = 13.2, C-3’’’, C-5’’’), 147.0 (t, 4JC,F = 3.2, C-4’’), 135.2 (t, 3JC,F = 10.6, C-1’’’), 124.3 (C-5’’), 109.6-109.3 (m, C- 2’’’, C-6’’’), 104.2 (t, 2JC,F = 25.9, C-4’’’), 71.5 (C-3), 70.7 (C-4), 61.0 (C-5), 53.0 (C-1’). HRESIMS m/z found 333.0768, calc. for C13H12O3N4F2 [M+H]+: 333.0770. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 297 (2R,3R,4S)-3,4-Bis(benzyloxy)-2-(benzyloxymethyl)-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide) (150) 227 A solution of NH2OH·HCl (recrystallized from EtOH, 6.01 g, 86.5 mmol), NaOMe (4.92 g, 88.4 mmol) and 2,3,5-tri-O-benzyl--D-ribofuranose (147) (8.26 g, 19.6 mmol) in anhydrous MeOH (45 mL) over 3 Å molecular shieves were stirred at r. t. overnight. The reaction mixture was then filtered and evaporated. A solution of the resulting residue in CH2Cl2 was washed with H2O (three times). The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The oxime thus obtained was dissolved in anhydrous CH2Cl2 (25 mL) and imidazole (2.15 g, 31.4 mmol) and TBDPSCl (6.8 mL, 26 mmol) were added. After stirring at r.t. overnight, the reaction mixture was washed with H2O (three times) and brine. The organic phase was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The TBDPS-protected derivative 148 was dissolved in anhydrous toluene (40 mL) and I2 (7.49 g, 29.5 mmol), PPh3 (recrystallized from Et2O, 6.70 g, 25.5 mmol) and imidazole (4.03 g, 58.9 mmol) were added and the reaction mixture was refluxed for 1.5 h. After this time, 100 mL of a saturated aqueous solution of both NaHCO3 and Na2S2O3 was added and stirred for 10 min. The mixture was then extracted with CH2Cl2 (three times) and the combined organic phases were washed with brine. The final organic phase was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. 227 Tsou, E. –L.; Yeh, Y. –T.; Liang, P. –H.; Cheng, W. –C. A convenient approach toward the synthesis of enantiopure isomers of DMDP and ADMDP. Tetrahedron 2009, 65, 93-100. 298 Experimental section The resulting residue was purified by a short chromatography column on silica gel (EtOAc:hexane 1:20) to give the iodine derivative 149 as an oil. The iodine derivative was dissolved in anhydrous toluene (25 mL) and TBAF (21 mL, 21 mmol) was added. After stirring at r.t. overnight, the solvent was evaporated and the obtained residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:hexane 1:1→2:1) to give 150 (1.74 g, 4.17 mmol, 21%, 4 steps) as a pale yellow oil. (2S,3S,4R,5R)-3,4-Bis(benzyloxy)-5-(benzyloxymethyl)-2-carbonitrile-1- hydroxypyrrolidine (151) To a solution of 150 (545 mg, 1.31 mmol) in anhydrous MeOH (27 mL), TMSCN (360 L, 2.65 mmol) was added. After stirring at 50 oC for 8 h, the solvent was evaporated and the resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:hexane 1:5→1:4) to give 151 (481 mg, 1.08 mmol, 82%) as a white solid. [𝛼]𝐷 25 – 0.4 (c 0.73, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 3550 (OH), 2869, 2341, 2246 (C≡N), 1602, 1455, 1361, 1272, 1102, 1028. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 7.37-7.25 (m, 15H, H- aromat.), 6.06 (s, 1H, OH), 4.71-4.45 (m, 6H, -CH2Ph), 4.12-4.07 (m, 2H, H-2, H-3), 3.84 (t, 1H, J4,3 = J4,5 = 4.9, H-4), 3.56-3.50 (m, 2H, H-1’), 3.32 (ap. q, 1H, H-5). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3, δ ppm) δ 137.8 (Cq aromat.), 137.6 (Cq aromat.), 136.9 (Cq aromat.), 128.7 (C aromat.), 128.6 (C aromat.), 128.5 (C aromat.), 128.3 (C aromat.), 128.2 (2C aromat.), 128.1 (C aromat.), 128.0 (2C aromat.), 118.7 (C≡N), 77.5 (C-3), 75.3 (C-4), 73.5 (-CH2Ph), 72.9 (- CH2Ph), 72.3 (-CH2Ph), 72.2 (C-5), 68.2 (C-1’), 61.9 (C-2). HRESIMS m/z found 467.1935, calc. for C27H28N2O4Na [M+Na]+: 467.1941. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 299 (2S,3S,4R,5R)-2-(Aminomethyl)-5-(hydroxymethyl)-pyrrolidine-3,4-diol (152)227 To a solution of 151 (211 mg, 0.475 mmol) in MeOH (10 mL), Pd/C (10%, cat.) and HCl (37%, 240 L), were added and the reaction mixture was stirred under an atmosphere of hydrogen for 1 d. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography column on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 33% to give 152 (70 mg, 0.43 mmol, 91%) as a brown solid. (2S,3S,4R,5R)-2-Azidomethyl-5-hydroxymethyl-pyrrolidine-3,4-diol (153) To a solution of 152 (62 mg, 0.38 mmol) in H2O (1 mL), MeOH (1 mL), NaHCO3 (128 mg, 1.52 mmol), CF3(CF2)3SO2N3 (NfN3) 228 (185 mg, 0.569 mmol) in Et2O (1 mL) and CuSO4·5H2O (10 mg, 0.040 mmol) were added. After stirring at r.t. for 3.5 h, the solvent was removed under reduced pressure and the obtained residue was dissolved in MeOH and stirred with Quadrasil® MP for 1.5 h. After this time, the solids were filtered through celite and the solvent was evaporated. Treatment with HCl (1M) and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 33%, yielded 153 (45 mg, 0.24 mmol, 63%) as a pale yellow oil. 228 NfN3 has been prepared following the procedure described in: Trastoy, B.; Pérez-Ojeda, M. E.; Sastre, R.; Chiara, J. L. Octakis(3-azidopropyl)octasilsesquioxane: a versatile nanobuilding block for the efficient preparation of highly functionalized cube-octameric polyhedral oligosilsesquioxane frameworks through “click” assembly. Chem. Eur. J. 2010, 16, 3833-3841. 306 Experimental section 6.7, H-3’’’), 3.07 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.2, H-5a), 2.88 (dd, 1H, H-5b), 2.78 (t, 2H, JH,H = 7.5, H-1’’’), 1.99-1.89 (m, 2H, H-2’’’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 147.7 (C-4’’), 124.2 (C-5’’), 73.6 (C-4), 73.0 (C-3), 61.6 (C-2), 51.8 (C-1’), 51.7 (C-3’’’), 51.3 (C-5), 29.7 (C-2’’’), 23.4 (C-1’’’). HRESIMS m/z found 268.1519, calc. for C10H18N7O2 [M+H]+: 268.1516. (2S,3S,4R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-[(4-(4-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)phenyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl]-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (197) CuAAC (General Procedure 1) using 88 (925 mg, 3.10 mmol), alkyne 200 (1.68 g, 4.66 mmol), DIPEA (2.1 mL, 12 mmol) and CuI (181 mg, 0.931 mmol), in toluene (28 mL) at 50 oC for 30 h, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2→2:1) afforded the corresponding “click” derivative (1.93 g, 2.93 mmol, 95%) as a white solid. To a solution of this compound (1.93 g, 2.93 mmol) in DMF (25 mL), NaN3 (482 mg, 7.34 mmol) was added. After stirring at 60 oC for 3 h the solvent was removed under vacuum and the crude product was dissolved in CH2Cl2, washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1→2:1) to give 197 (1.52 g, 2.87 mmol, 98%) as a grey solid. [𝛼]𝐷 29 + 26.8 (c 0.85, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2981, 2935, 2100 (N3), 1688 (C=O), 1498, 1402, 1246, 1123, 1056, 909, 729. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm, J Hz) δ 8.29 (s, 1H, H-5’’), 7.77-7.72 (m, 2H, H-aromat.), 7.05-7.01 (m, 2H, H-aromat.), 4.73-4.67 (m, 2H, H-3, H-4), 4.59 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.8, J1’a,2 = 6.1, H-1’a), 4.44 (dd, 1H, J1’b,2 = 7.0, H-1’b), Synthetic procedures and characterization of the new compounds 307 4.36-4.32 (m, 1H, H-2), 4.18 (t, 2H, JH,H = 4.8, H-2IV), 3.82 (t, 2H, H-3IV), 3.73-3.69 (m, 3H, H-5a, H-5IV), 3.43 (t, 2H, JH,H = 5.0, H-6IV), 3.20 (dd, 1H, 2J5b,5a = 12.9, J5b,4 = 4.0, H-5b), 1.34 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.31 (s, 9H, -C(CH3)3), 1.26 (s, 3H, -C(CH3)2). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm) δ 158.0 (Cq aromat.), 153.1 (C=O, Boc), 146.0 (C-4’’), 126.2 (C aromat.), 123.4 (Cq aromat.), 120.6 (C-5’’), 114.7 (C aromat.), 110.6 (-C(CH3)2), 81.7 (C-3), 78.7 (-C(CH3)3), 78.4 (C-4), 68.9 (C-5IV), 68.6 (C-3IV), 67.2 (C-2IV), 63.1 (C-2), 50.4 (C-5), 49.9 (C-6IV), 48.6 (C-1’), 27.4 (-C(CH3)3), 26.3 (-C(CH3)2), 24.5 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 530.2715, calc. for C25H36N7O6 [M+H]+: 530.2722. (2R,3S,4R)-N-tert-Butoxycarbonyl-2-[(4-(4-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)phenyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)methyl]-3,4-O-isopropylidene-pyrrolidine-3,4-diol (198) CuAAC (General Procedure 1) using 114 (172 mg, 0.577 mmol), alkyne 200 (312 mg, 0.866 mmol), DIPEA (400 L, 2.29 mmol) and CuI (34 mg, 0.18 mmol), in toluene (5.3 mL) at 50 oC for 1 d, followed by chromatographic purification (EtOAc:cyclohexane 1:2→2:1) afforded the corresponding “click” derivative (262 mg, 0.398 mmol, 69%) as a yellow oil. To a solution of this compound (239 g, 0.363 mmol) in DMF (3.2 mL), NaN3 (60 mg, 0.91 mmol) was added. After stirring at 60 oC for 3 h the solvent was removed under vacuum and the crude product was dissolved in CH2Cl2, washed with water and brine, dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1→2:1) to give 198 (167 mg, 0.315 mmol, 87%) as a white solid. 308 Experimental section [𝛼]𝐷 24 – 19.1 (c 0.82, CH2Cl2). IR (ν cm-1) 2988, 2934, 2093 (N3), 1686 (C=O), 1503, 1401, 1215, 1172, 1082, 830. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm, J Hz) δ 8.24 (s, 1H, H-5’’), 7.76-7.71 (m, 2H, H-aromat.), 7.05-7.00 (m, 2H, H-aromat.), 4.86-4.79 (m, 2H, H-3, H-4), 4.69-4.54 (m, 2H, H-1’), 4.43-4.37 (m, 1H, H-2), 4.17 (t, 2H, JH,H = 4.8, H-2IV), 3.89- 3.81 (m, 3H, H-5a, H-3IV), 3.71 (t, 2H, JH,H = 5.1, H-5IV), 3.43 (t, 2H, H-6IV), 3.33 (dd, 1H, 2J5b,5a = 12.2, J5b,4 = 2.6, H-5b), 1.53 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.33 (s, 3H, -C(CH3)2), 1.29 (s, 9H, - C(CH3)3). 13C-NMR (75.4 MHz, DMSO-d6, 363 K, δ ppm) δ 157.9 (Cq aromat.), 153.1 (C=O, Boc), 145.6 (C-4’’), 126.1 (C aromat.), 123.6 (Cq aromat.), 120.6 (C-5’’), 114.7 (C aromat.), 112.1 (-C(CH3)2), 79.0 (-C(CH3)3), 78.5 (C-3), 77.1 (C-4), 68.9 (C-5IV), 68.6 (C- 3IV), 67.1 (C-2IV), 58.3 (C-2), 49.9 (C-6IV), 49.6 (C-5), 48.1 (C-1’), 27.4 (-C(CH3)3), 25.6 (- C(CH3)2), 24.4 (-C(CH3)2). HRESIMS m/z found 530.2715, calc. for C25H36N7O6 [M+H]+: 530.2722. N-(tert-Butoxycarbonyl)tris(hydroxymethyl)aminomethane (205) 233 A solution of Boc2O (2.39 g, 10.7 mmol) in tBuOH (10 mL) was added to a suspension of TRIS (1.01 g, 8.30 mmol) in tBuOH:H2O (1:1, 15 mL) and the reaction mixture was stirred at r.t. for 1 d. The solvent was removed under vacuum and the product was purified by precipitation with cold EtOAc. Compound 205 (1.72 g, 7.77 mmol, 94%) was obtained as a white solid. 233 Chabre, Y. M.; Contino-Pépin, C.; Placide, V.; Shiao, T. C.; Roy, R. Expeditive synthesis of glycodendrimer scaffolds based on versatile TRIS and mannoside derivatives. J. Org. Chem. 2008, 73, 5602-5605. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 309 N-(tert-Butoxycarbonyl)tris[(propargyloxy)methyl]aminomethane (206)233 To a solution of 205 (1.63 g, 7.37 mmol) in anhydrous DMF (20 mL) at 0 oC, propargyl bromide (4.8 mL, 45 mmol) and KOH (2.92 g, 44.2 mmol) were added (addition of KOH in portions during 15 min). The reaction mixture was stirred at 35 oC for 1 d. After this time, the mixture was diluted with EtOAc and washed with H2O (three times). The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:7→EtOAc) to give 206 (1.45 g, 4.32 mmol, 59%) as a yellow solid. Tris[(propargyloxy)methyl]aminomethane (207) To a solution of 206 (1.43 g, 4.26 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (17 mL) at 0 oC, TFA (7.0 mL, 94 mmol) was added slowly and the reaction mixture was stirred at r.t. for 2 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 17%, yielded 207 (809 mg, 3.44 mmol, 81%) as a yellow solid. IR (ν cm-1) 3366, 3282, 3250 (≡C-H, NH), 2923, 2103 (C≡C), 1590, 1440, 1359, 1265, 1090, 911, 727. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 4.15 (d, 6H, JH,H = 2.4, -OCH2CC≡H), 3.47 (s, 6H, H2NCCH2O), 2.42 (t, 3H, -OCH2CC≡H), 1.58 (br. s, 2H, -NH2). 13C-NMR (75.4 310 Experimental section MHz, CDCl3, δ ppm) δ 79.9 (-OCH2CC≡H), 74.5 (-OCH2CC≡H), 72.2 (H2NCCH2O), 58.8 (- OCH2CC≡H), 55.7 (H2NCCH2O). HRESIMS m/z found 236.1277, calc. for C13H18NO3 [M+H]+: 236.1281. Tetrakis[(propargyloxy)methyl]methane (208) 234 To a solution of pentaerythreitol (183 mg, 1.30 mmol) in anhydrous DMF (10 mL) at 0 oC, NaH (920 mg, 36.4 mmol) was added in portions and the mixture was stirred at 0 oC for 1 h. After this time, propargyl bromide (1.2 mL, 11 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at r.t. for 1 d. Then, MeOH and H2O were added and the solvent was removed under vacuum. The crude product was dissolved in H2O and extracted with EtOAc (three times). The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:7) to give 208 (172 mg, 0.597 mmol, 46%) as a pale yellow solid. Hexakis[(propargyloxy)methyl]-N,N-dimethyladipamide (209) A suspension of adipic acid (58 mg, 0.40 mmol) in SOCl2 (1 mL) was refluxed for 3 h under nitrogen atmosphere. After cooling to r.t., the solvent was evaporated and the crude adipoyl 234 Stuhr-Hansen, N.; Risinger, C.; Engholm, E.; Blixt, O. Synthesis of oligo-(alkyne-triplet)peptide constructs. Org. Lett. 2017, 19, 6522-6525. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 311 chloride was used directly for the next reaction without further purification. To a solution of 207 (242 mg, 1.03 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (2.5 mL), DIPEA (420 L, 2.40 mmol) was added. After cooling at 0 oC, a solution of adipoyl chloride (73 mg, 0.40 mmol) in anhydrous CH2Cl2 was added and the reaction was stirred at r.t. overnight. The mixture was washed with HCl (0.5 M) and water (three times). The organic phase was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1→2:1) to give 209 (147 mg, 0.253 mmol, 63%) as a white solid. IR (ν cm-1) 3314, 3270 (≡C-H, NH), 2952, 2117 (C≡C), 1667, 1642 (C=O), 1556, 1438, 1358, 1288, 1088, 958, 804. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ ppm, J Hz) δ 5.73 (br. s, 2H, - NH), 4.13 (d, 12H, JH,H = 2.4, -OCH2CC≡H), 3.82 (s, 12H, -NHCCH2O), 2.44 (t, 6H, - OCH2CC≡H), 2.17-2.13 (m, 4H, -CH2CH2C=O), 1.64-1.60 (m, 4H, -CH2CH2C=O). 13C- NMR (75.4 MHz, CDCl3, δ ppm) δ 173.1 (C=O), 79.7 (-OCH2CC≡H), 74.8 (-OCH2CC≡H), 68.7 (-NHCCH2O), 59.3 (-NHCCH2O), 58.8 (-OCH2CC≡H), 37.0 (-CH2CH2C=O), 25.0 (- CH2CH2C=O). HRESIMS m/z found 603.2667, calc. for C32H40N2O8Na [M+Na]+: 603.2677. Nonakis[(propargyloxy)methyl]-N,N,N-trimethyl-1,3,5-benzenetricarboxamide (210) 235 235 Rajakumar, P.; Anandhan, R.; Manoj, D.; Santhanalakshmi, J. Synthesis, H2PO4- and Pd2+ ion sensing and gold nanoparticle encapsulation of ferrocenyldendrimers by a green chemistry approach. RSC Adv. 2014, 4, 4413- 4419. 312 Experimental section A solution of 1,3,5-benzenetricarboxylic acid (313 mg, 1.45 mmol) in SOCl2 (2 mL) with 2 drops of DMF, was refluxed overnight. After cooling to r.t., the solvent was evaporated and the crude 1,3,5-benzenetricarboxylic acid chloride was used directly for the next reaction without further purification. To a solution of 207 (1.26 g, 5.36 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (6.7 mL), DIPEA (2.3 mL, 13 mmol) was added. After cooling at 0 oC, a solution of 1,3,5- benzenetricarboxylic acid chloride (385 mg, 1.45 mmol) in anhydrous CH2Cl2 was added and the reaction was stirred at r.t. overnight. The mixture was washed with HCl (0.5 M) and water (three times). The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated. The resulting residue was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:hexane 2:3→1:1) to give 210 (342 mg, 0.397 mmol, 27%) as a white solid. Polyhydroxylated trivalent iminosugar 211 CuAAC (General procedure 3) using 89 (49 mg, 0.31 mmol) and tripropargylated scaffold 207 (24 mg, 0.10 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, MeOH), 211 (39 mg, 0.055 mmol, 55%) as a pale yellow oil. [𝛼]𝐷 25 – 27.2 (c 0.60, H2O). IR (ν cm-1) 3284, 3145 (OH, NH), 2923, 1673, 1426, 1338, 1200, 1057, 830, 720. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 8.02 (s, 3H, H-5’’), 4.67 (dd, 3H, 2J1’a,1’b = 14.3, J1’a,2 = 4.5, H-1’a), 4.59 (s, 6H, -OCH2-triazole), 4.50 (dd, 3H, J1’b,2 = 8.5, H- 1’b), 4.15 (td, 3H, J4,5a = J4,3 = 4.9, J4,5b = 2.8, H-4), 3.91 (dd, 3H, J3,2 = 8.2, H-3), 3.53-3.48 (m, 9H, H2NCCH2O, H-2), 3.19 (dd, 3H, 2J5a,5b = 12.7, H-5a), 2.86 (dd, 3H, H-5b). 13C-NMR (50 MHz, D2O, δ ppm) δ 144.0 (C-4’’), 125.5 (C-5’’), 74.8 (C-3), 70.7 (C-4), 69.1 (-OCH2- Synthetic procedures and characterization of the new compounds 313 triazole), 63.7 (H2NCCH2O), 60.6 (C-2), 57.6 (H2NCCH2O), 52.3 (C-1’), 50.3 (C-5). HRESIMS m/z found 732.3500, calc. for C28H47N13O9Na [M+Na]+: 732.3512. Polyhydroxylated tetravalent iminosugar 212 CuAAC (General procedure 3) using 89 (53 mg, 0.34 mmol) and tetrapropargylated scaffold 208 (24 mg, 0.083 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, MeOH), 212 (48 mg, 0.052 mmol, 63%) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 18 – 50.1 (c 0.65, H2O). IR (ν cm-1) 3279, 3142 (OH, NH), 2924, 1644, 1550, 1429, 1338, 1221, 1053, 826, 786. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.97 (s, 4H, H-5’’), 4.61 (dd, 4H, 2J1’a,1’b = 14.2, J1’a,2 = 4.6, H-1’a), 4.49 (s, 8H, -OCH2-triazole), 4.43 (dd, 4H, J1’b,2 = 8.2, H-1’b), 4.11 (td, 4H, J4,5a = J4,3 = 5.0, J4,5b = 3.0, H-4), 3.85 (dd, 4H, J3,2 = 8.0, H-3), 3.43 (td, 4H, H-2), 3.36 (s, 8H, -CCH2O), 3.12 (dd, 4H, 2J5a,5b = 12.5, H-5a), 2.79 (dd, 4H, H-5b). 13C-NMR (50 MHz, D2O, δ ppm) δ 144.3 (C-4’’), 125.4 (C-5’’), 74.6 (C-3), 70.9 (C- 4), 68.5 (-CCH2O), 63.7 (-OCH2-triazole), 60.8 (C-2), 52.7 (C-1’), 50.3 (C-5), 44.6 (- CCH2O). HRESIMS m/z found 943.4461, calc. for C37H60N16O12Na [M+Na]+: 943.4469. 314 Experimental section Polyhydroxylated hexavalent iminosugar 213 CuAAC (General procedure 3) using 89 (43 mg, 0.27 mmol) and hexapropargylated scaffold 209 (26 mg, 0.045 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 213 (53 mg, 0.035 mmol, 78%) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 20 – 20.5 (c 0.55, H2O). IR (ν cm-1) 3277 (OH, NH), 2925, 1647 (C=O), 1547, 1423, 1339, 1225, 1054, 785. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.99 (s, 6H, H-5’’), 4.63 (dd, 6H, 2J1’a,1’b = 12.0, J1’a,2 = 4.0, H-1’a), 4.54 (s, 12H, -OCH2-triazole), 4.45 (dd, 6H, J1’b,2 = 8.0, H-1’b), 4.14-4.11 (m, 6H, H-4), 3.85 (dd, 6H, J3,2 = 7.8, J3,4 = 5.1, H-3), 3.66 (s, 12H, -NHCCH2O), 3.46-3.41 (m, 6H, H-2), 3.13 (dd, 6H, 2J5a,5b = 12.5, J5a,4 = 4.9, H-5a), 2.79 (dd, 6H, J5b,4 = 2.5, H-5b), 2.13 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O), 1.44 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O). 13C- NMR (50 MHz, D2O, δ ppm) δ 176.4 (C=O), 144.0 (C-4’’), 125.5 (C-5’’), 74.6 (C-3), 70.9 (C-4), 67.6 (-NHCCH2O), 63.6 (-OCH2-triazole), 60.7 (C-2), 59.7 (-NHCCH2O), 52.7 (C- 1’), 50.3 (C-5), 36.0 (-CH2CH2C=O), 24.7 (-CH2CH2C=O). HRESIMS m/z found 1551.7475, calc. for C62H100N26O20Na [M+Na]+: 1551.7499. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 315 Polyhydroxylated nonavalent iminosugar 214 CuAAC (General procedure 3) using 89 (45 mg, 0.29 mmol) and nonapropargylated scaffold 210 (26 mg, 0.030 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 214 (69 mg, 0.030 mmol, quantitative) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 19 – 26.1 (c 0.68, H2O). IR (ν cm-1) 3277, 3140 (OH, NH), 2929, 1656 (C=O), 1542, 1428, 1329, 1223, 1056, 788. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 8.00-7.98 (m, 12H, H-5’’, H-aromat.), 4.61 (br. s, 18H, -OCH2-triazole), 4.55 (dd, 9H, 2J1’a,1’b = 14.2, J1’a,2 = 4.4, H-1’a), 4.38 (dd, 9H, J1’b,2 = 8.2, H-1’b), 4.09-4.06 (m, 9H, H-4), 3.83-3.79 (m, 27H, - NHCCH2O, H-3), 3.43-3.32 (m, 9H, H-2), 3.09 (dd, 9H, 2J5a,5b = 12.0, J5a,4 = 4.4, H-5a), 2.76 (d, 9H, H-5b). 13C-NMR (100 MHz, D2O, δ ppm) δ 168.5 (C=O), 143.8 (C-4’’), 135.1 (Cq aromat.), 129.0 (C aromat.), 125.2 (C-5’’), 74.4 (C-3), 70.7 (C-4), 67.2 (-NHCCH2O), 63.4 (- OCH2-triazole), 60.6 (-NHCCH2O), 60.5 (C-2), 52.5 (C-1’), 50.1 (C-5). HRESIMS m/z found 2307.0574, calc. for C93H141N39O30Na [M+Na]+: 2307.0599. 322 Experimental section H-5V), 7.22 (d, 8H, JH,H = 8.2, H-aromat.), 6.46 (d, 8H, H-aromat.), 4.79-4.69 (m, 8H, H-1’), 4.27 (br. s, 12H, H-4, H-6IV), 4.14 (dd, 4H, J3,2 = 9.6, J3,4 = 3.8, H-3), 4.01 (br. s, 8H, -OCH2- triazole), 3.93-3.88 (m, 4H, H-2), 3.64 (br. s, 8H, H-5IV), 3.58 (br. s, 8H, H-2IV), 3.50 (dd, 4H, 2J5a,5b = 13.1, J5a,4 = 3.4, H-5a), 3.41 (br. s, 8H, H-3IV), 3.28 (d, 4H, H-5b), 2.91 (br. s, 8H, -CCH2O). 13C-NMR (100 MHz, D2O, δ ppm) δ 158.1 (Cq aromat.), 146.6 (C-4’’), 143.5 (C-4V), 126.7 (C aromat., C-5V), 125.0 (Cq aromat.), 121.6 (C-5’’), 114.6 (C aromat.), 72.7 (C-3), 68.6 (C-4), 68.5 (C-5IV), 68.4 (C-2IV), 68.0 (-CCH2O), 66.7 (C-3IV), 63.2 (-OCH2- triazole), 58.9 (C-2), 50.1 (C-6IV), 50.0 (C-5), 48.8 (C-1’), 44.4 (-CCH2O). HRESIMS m/z found 934.4274, calc. for ½(C85H113N28O20Na) [M+H+Na]2+: 934.4886. Polyhydroxylated hexavalent iminosugar 229 CuAAC (General procedure 3) using 197 (113 mg, 0.213 mmol) and hexapropargylated scaffold 209 (21 mg, 0.036 mmol), afforded after 3 h of reaction and chromatographic Synthetic procedures and characterization of the new compounds 323 purification (silica gel, EtOAc:MeOH:NH4OH 5:1:0.1), the corresponding protected hexavalent iminosugar (126 mg, 0.0335 mmol, 93%) as a colourless oil. A solution of this compound (57 mg, 0.015 mmol) in HCl (4M):THF (2:1, 2.1 mL) was stirred at r.t. for 4 h and evaporated to give 229 (55 mg, 0.015 mmol, quantitative) as a solid. [𝛼]𝐷 25 – 26.5 (c 0.53, H2O). IR (ν cm-1) 3328, 3140 (OH, NH), 2932, 1617 (C=O), 1511, 1257, 1186, 1106, 1053, 925, 837. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 8.07 (s, 6H, H- 5’’), 7.77 (s, 6H, H-5V), 7.29 (d, 12H, JH,H = 8.5, H-aromat.), 6.53 (d, 12H, H-aromat.), 4.79- 4.75 (m, 12H, H-1’), 4.35-4.29 (m, 18H, H-6IV, H-4), 4.20-4.16 (m, 18H, -OCH2-triazole, H- 3), 3.98-3.91 (m, 6H, H-2), 3.70-3.69 (m, 24H, H-5IV, H-2IV), 3.56-3.48 (m, 18H, H-5a, H- 3IV), 3.38-3.29 (m, 18H, -NHCCH2O, H-5b), 1.85 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O), 1.17 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O). 13C-NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 175.8 (C=O), 158.3 (Cq aromat.), 146.4 (C-4’’), 142.9 (C-4V), 126.9 (C aromat.), 125.5 (C-5V), 122.1 (C-5’’), 121.2 (Cq aromat.), 114.8 (C aromat.), 72.8 (C-3), 68.6 (C-4, C-3IV), 68.4 (C-5IV), 67.8 (-NHCCH2O), 66.9 (C-2IV), 62.9 (-OCH2-triazole), 59.5 (-NHCCH2O), 58.9 (C-2), 50.5 (C-6IV), 50.1 (C-5), 49.1 (C-1’), 35.7 (-CH2CH2C=O), 24.5 (-CH2CH2C=O). HRESIMS m/z found 1469.6808, calc. for ½(C134H179N44O32Na) [M+H+Na]2+: 1469.6809. 324 Experimental section Polyhydroxylated nonavalent iminosugar 230 CuAAC (General procedure 3) using 197 (107 mg, 0.202 mmol) and nonapropargylated scaffold 210 (19 mg, 0.022 mmol), afforded after 3 h of reaction and chromatographic purification (silica gel, EtOAc:MeOH:NH4OH 10:1:0.1→7:1:0.1), the corresponding protected nonavalent iminosugar (120 mg, 0.0213 mmol, 97%) as a colourless oil. A solution of this compound (62 mg, 0.011 mmol) in HCl (4M):THF (2:1, 1.8 mL) was stirred at r.t. for 4 h and evaporated to give 230 (58 mg, 0.011 mmol, quantitative) as a white solid. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 325 [𝛼]𝐷 29 – 26.3 (c 0.80, H2O). IR (ν cm-1) 3277, 3133 (OH, NH), 2925, 1658 (C=O), 1616, 1510, 1254, 1108, 1052, 924, 837. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 8.02 (s, 9H, H- 5’’), 7.83 (s, 3H, H-aromat.), 7.73 (s, 9H, H-5V), 7.23 (d, 18H, JH,H = 8.3, H-aromat.), 6.45 (d, 18H, H-aromat.), 4.79-4.73 (m, 18H, H-1’), 4.32-4.16 (m, 54H, H-4, H-6IV, -OCH2- triazole, H-3), 3.98-3.91 (m, 9H, H-2), 3.61-3.51 (m, 63H, H-5IV, H-2IV, H-3IV, H-5a), 3.38- 3.23 (m, 27H, -NHCCH2O, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 166.8 (C=O), 158.8 (Cq aromat.), 146.5 (C-4’’), 143.3 (C-4V), 134.6 (Cq aromat.), 128.8 (C aromat.), 126.8 (C aromat.), 125.2 (C-5V), 121.9 (C-5’’), 121.4 (Cq aromat.), 114.7 (C aromat.), 72.8 (C-3), 68.7 (C-4, -NHCCH2O), 68.4 (C-5IV), 67.7 (C-2IV), 66.8 (C-3IV), 63.2 (-OCH2-triazole), 60.5 (-NHCCH2O), 59.0 (C-2), 50.3 (C-6IV), 50.1 (C-5), 49.0 (C-1’). HRESIMS m/z found 1455.6709, calc. for ⅓(C201H261N66O48) [M+3H]3+: 1455.6665. Polyhydroxylated trivalent iminosugar 215 CuAAC (General procedure 3) using 112 (54 mg, 0.34 mmol) and tripropargylated scaffold 207 (27 mg, 0.12 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 215 (61 mg, 0.086 mmol, 72%) as a pale yellow oil. [𝛼]𝐷 23 + 6.3 (c 0.63, H2O). IR (ν cm-1) 3271, 3141 (OH, NH), 2927, 1611, 1416, 1226, 1055, 791. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.96 (s, 3H, H-5’’), 4.63 (dd, 3H, 2J1’a,1’b = 14.1, J1’a,2 = 5.7, H-1’a), 4.53 (s, 6H, -OCH2-triazole), 4.42 (dd, 3H, J1’b,2 = 8.6, H-1’b), 4.26 (td, 3H, J4,5a = J4,5b = 7.1, J4,3 = 4.7, H-4), 4.08 (t, 3H, J3,2 = 4.3, H-3), 3.65-3.60 (m, 3H, H- 2), 3.37 (s, 6H, H2NCCH2O), 3.08 (dd, 3H, 2J5a,5b = 11.4, H-5a), 2.76 (dd, 3H, H-5b). 13C- 326 Experimental section NMR (50 MHz, D2O, δ ppm) δ 144.0 (C-4’’), 125.5 (C-5’’), 72.0 (C-4), 71.6 (C-3), 70.9 (H2NCCH2O), 63.7 (-OCH2-triazole), 59.6 (C-2), 55.7 (H2NCCH2O), 50.5 (C-1’), 49.0 (C- 5). HRESIMS m/z found 710.3685, calc. for C28H48N13O9 [M+H]+: 710.3692. Polyhydroxylated tetravalent iminosugar 216 CuAAC (General procedure 3) using 112 (55 mg, 0.35 mmol) and tetrapropargylated scaffold 208 (25 mg, 0.087 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 216 (79 mg, 0.086 mmol, 99%) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 24 + 11.2 (c 0.53, H2O). IR (ν cm-1) 3276, 3140 (OH, NH), 2920, 1636, 1418, 1335, 1225, 1052, 788. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.92 (s, 4H, H-5’’), 4.62-4.60 (m, 4H, H-1’a), 4.45 (br. s, 12H, -OCH2-triazole, H-1’b), 4.26 (br. s, 4H, H-4), 4.07 (br. s, 4H, H-3), 3.62 (br. s, 4H, H-2), 3.33 (s, 8H, -CCH2O), 3.08 (br. s, 4H, H-5a), 2.76 (br. s, 4H, H-5b). 13C-NMR (100 MHz, D2O, δ ppm) δ 143.9 (C-4’’), 125.2 (C-5’’), 71.9 (C-4), 71.4 (C-3), 68.0 (-CCH2O), 63.4 (-OCH2-triazole), 59.4 (C-2), 50.4 (C-1’), 48.7 (C-5), 44.4 (-CCH2O). HRESIMS m/z found 943.4458, calc. for C37H60N16O12Na [M+Na]+: 943.4469. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 327 Polyhydroxylated hexavalent iminosugar 217 CuAAC (General procedure 3) using 112 (44 mg, 0.28 mmol) and hexapropargylated scaffold 209 (27 mg, 0.047 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 217 (69 mg, 0.045 mmol, 96%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 24 + 10.1 (c 0.64, H2O). IR (ν cm-1) 3288 (OH, NH), 2930, 1646 (C=O), 1548, 1428, 1335, 1226, 1054, 786. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.89 (s, 6H, H-5’’), 4.58 (dd, 6H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.6, H-1’a), 4.45 (s, 12H, -OCH2-triazole), 4.36 (dd, 6H, J1’b,2 = 8.0, H-1’b), 4.23-4.19 (m, 6H, H-4), 4.03-4.02 (m, 6H, H-3), 3.58 (s, 18H, -NHCCH2O, H- 2), 3.06-3.01 (m, 6H, H-5a), 2.73-2.69 (m, 6H, H-5b), 2.05 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O), 1.36 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O). 13C-NMR (100 MHz, D2O, δ ppm) δ 176.2 (C=O), 143.6 (C-4’’), 125.3 (C-5’’), 71.9 (C-4), 71.4 (C-3), 67.2 (-NHCCH2O), 63.3 (-OCH2-triazole), 59.5 (- NHCCH2O), 59.4 (C-2), 50.4 (C-1’), 48.7 (C-5), 35.8 (-CH2CH2C=O), 24.5 (-CH2CH2C=O). HRESIMS m/z found 1551.7475, calc. for C62H100N26O20Na [M+Na]+: 1551.7499. 328 Experimental section Polyhydroxylated nonavalent iminosugar 218 CuAAC (General procedure 3) using 112 (45 mg, 0.29 mmol) and nonapropargylated scaffold 210 (27 mg, 0.031 mmol), afforded after 45 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 218 (69 mg, 0.030 mmol, 97%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 22 + 12.8 (c 0.53, H2O). IR (ν cm-1) 3279, 3144 (OH, NH), 2928, 1658 (C=O), 1540, 1430, 1328, 1222, 1054, 787. 1H-NMR (400 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.94-7.91 (m, 12H, H-5’’, H-aromat.), 4.55-4.49 (m, 27H, -OCH2-triazole, H-1’a), 4.31 (dd, 9H, 2J1’b,1’a = 13.9, J1’b,2 = 8.6, H-1’b), 4.20-4.15 (m, 9H, H-4), 3.98 (t, 9H, J3,2 = J3,4 = 4.3, H-3), 3.78 (s, 18H, - NHCCH2O), 3.48-3.44 (m, 9H, H-2), 3.01 (dd, 9H, 2J5a,5b = 11.0, J5a,4 = 7.6, H-5a), 2.70 (dd, 9H, J5b,4 = 7.6, H-5b). 13C-NMR (50 MHz, D2O, δ ppm) δ 168.4 (C=O), 144.0 (C-4’’), 135.4 (Cq aromat.), 129.1 (C aromat.), 125.5 (C-5’’), 72.1 (C-4), 71.6 (C-3), 67.5 (-NHCCH2O), 63.6 (-OCH2-triazole), 60.8 (-NHCCH2O), 59.6 (C-2), 50.6 (C-1’), 49.1 (C-5). HRESIMS m/z found 1143.0422, calc. for ½(C93H143N39O30) [M+2H]2+: 1143.0422. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 329 Polyhydroxylated trivalent iminosugar 223 CuAAC (General procedure 3) using 196 (72 mg, 0.27 mmol) and tripropargylated scaffold 207 (21 mg, 0.089 mmol), afforded after 1.5 h of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 223 (84 mg, 0.081 mmol, 91%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 24 + 8.8 (c 0.81, H2O). IR (ν cm-1) 3255, 3135 (OH, NH), 2930, 1615, 1440, 1330, 1222, 1052, 812. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.92 (s, 3H, H-5IV), 7.73 (s, 3H, H-5’’), 4.69 (dd, 3H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.5, H-1’a), 4.58-4.47 (m, 9H, -OCH2-triazole, H-1’b), 4.40-4.36 (m, 9H, H-3’’’, H-4), 4.19-4.17 (m, 3H, H-3), 3.79-3.75 (m, 3H, H-2), 3.48 (s, 6H, H2NCCH2O), 3.28-3.22 (m, 3H, H-5a), 2.94 (dd, 3H, 2J5b,5a = 11.3, J5b,4 = 7.2, H-5b), 2.62 (t, 6H, JH,H = 7.0, H-1’’’), 2.24-2.16 (m, 6H, H-2’’’). 13C-NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 146.5 (C-4’’), 143.8 (C-4IV), 124.8 (C-5IV), 123.7 (C-5’’), 71.3 (C-4), 71.0 (C-3), 69.1 (H2NCCH2O), 63.5 (-OCH2-triazole), 59.8 (C-2), 57.1 (H2NCCH2O), 49.5 (C-3’’’), 49.3 (C- 1’), 48.4 (C-5), 28.7 (C-2’’’), 21.5 (C-1’’’). HRESIMS m/z found 1059.5418, calc. for C43H68N22O9Na [M+Na]+: 1059.5432. 330 Experimental section Polyhydroxylated tetravalent iminosugar 224 CuAAC (General procedure 3) using 196 (81 mg, 0.30 mmol) and tetrapropargylated scaffold 208 (21 mg, 0.073 mmol), afforded after 1.5 h of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 224 (86 mg, 0.063 mmol, 86%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 24 + 16.8 (c 0.89, H2O). IR (ν cm-1) 3275, 3137 (OH, NH), 2928, 1634, 1552, 1441, 1331, 1223, 1051, 816. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.87 (s, 4H, H-5IV), 7.72 (br. s, 4H, H-5’’), 4.71-4.67 (m, 4H, H-1’a), 4.52-4.33 (m, 24H, H-1’b, -OCH2-triazole, H-4, H- 3’’’), 4.18 (br. s, 4H, H-3), 3.78 (br. s, 4H, H-2), 3.33-3.18 (m, 12H, -CCH2O, H-5a), 2.95 (br. s, 4H, H-5b), 2.61-2.56 (m, 8H, H-1’’’), 2.19-2.14 (m, 8H, H-2’’’). 13C-NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 146.6 (C-4’’), 144.1 (C-4IV), 124.7 (C-5IV), 123.6 (C-5’’), 71.3 (C-4), 71.0 (C-3), 68.0 (-CCH2O), 63.4 (-OCH2-triazole), 59.8 (C-2), 49.5 (C-3’’’), 49.3 (C-1’), 48.4 (C-5), 44.5 (-CCH2O), 28.8 (C-2’’’), 21.5 (C-1’’’). HRESIMS m/z found 1379.7011, calc. for C57H88N28O12Na [M+Na]+: 1379.7029. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 331 Polyhydroxylated hexavalent iminosugar 225 CuAAC (General procedure 3) using 196 (61 mg, 0.23 mmol) and hexapropargylated scaffold 209 (21 mg, 0.036 mmol), afforded after 2 h and 15 min of reaction and chromatographic purification (Sephadex LH-20, H2O), 225 (66 mg, 0.030 mmol, 83%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 24 + 15.1 (c 0.92, H2O). IR (ν cm-1) 3283, 3136 (OH, NH), 2933, 1656 (C=O), 1550, 1436, 1334, 1218, 1053, 810. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 7.87 (s, 6H, H-5IV), 7.70 (s, 6H, H-5’’), 4.61 (dd, 6H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 4.6, H-1’a), 4.46-4.28 (m, 36H, - OCH2-triazole, H-1’b, H-3’’’, H-4), 4.11-4.09 (m, 6H, H-3), 3.63 (br. s, 18H, H-2, - NHCCH2O), 3.16-3.10 (m, 6H, H-5a), 2.85-2.79 (m, 6H, H-5b), 2.61-2.56 (t, 12H, JH,H = 6.9, H-1’’’), 2.21-2.08 (m, 16H, H-2’’’, -CH2CH2C=O), 1.40 (br. s, 4H, -CH2CH2C=O). 13C- NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 176.0 (C=O), 146.3 (C-4’’), 143.9 (C-4IV), 124.7 (C-5IV), 123.5 (C-5’’), 71.8 (C-4), 71.3 (C-3), 67.4 (-NHCCH2O), 63.4 (-OCH2-triazole), 59.7 (- NHCCH2O), 59.6 (C-2), 50.0 (C-1’), 49.5 (C-3’’’), 48.7 (C-5), 35.8 (-CH2CH2C=O), 28.8 (C-2’’’), 24.5 (-CH2CH2C=O), 21.5 (C-1’’’). HRESIMS m/z found 1092.5792, calc. for ½(C92H144N44O20) [M+2H]2+: 1092.5796. 338 Experimental section [𝛼]𝐷 25 + 17.5 (c 0.99, H2O). IR (ν cm-1) 3264, 3129 (OH, NH), 2930, 1655 (C=O), 1617, 1511, 1256, 1122, 1053, 914, 835. 1H-NMR (300 MHz, D2O, δ ppm, J Hz) δ 8.02 (s, 9H, H- 5’’), 7.86 (s, 3H, H-aromat.), 7.73 (s, 9H, H-5V), 7.28 (d, 18H, JH,H = 8.4, H-aromat.), 6.49 (d, 18H, H-aromat.), 4.84-4.79 (m, 9H, H-1’a), 4.74-4.66 (m, 9H, H-1’b), 4.48-4.26 (m, 54H, H-4, H-6IV, H-3, -OCH2-triazole), 4.13-4.07 (m, 9H, H-2), 3.64-3.47 (m, 63H, H-5IV, H-2IV, - NHCCH2O, H-5a), 3.41 (br. s, 18H, H-3IV), 3.24 (dd, 9H, 2J5b,5a = 12.1, J5b,4 = 7.3, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, D2O, δ ppm) δ 166.8 (C=O), 158.2 (Cq aromat.), 146.6 (C-4’’), 143.5 (C-4V), 134.6 (Cq aromat.), 128.8 (C aromat.), 126.8 (C aromat.), 125.1 (C-5V), 121.9 (C- 5’’), 121.6 (Cq aromat.), 114.7 (C aromat.), 70.1 (C-3), 69.8 (C-4), 68.6 (C-3IV), 68.5 (C- 5IV), 67.7 (-NHCCH2O), 66.8 (C-2IV), 63.3 (-OCH2-triazole), 60.5 (-NHCCH2O), 60.3 (C-2), 50.2 (C-6IV), 47.7 (C-5), 47.4 (C-1’). HRESIMS m/z found 1455.6679, calc. for ⅓(C201H261N66O48) [M+3H]3+: 1455.6665. (2S,3S,4R)-2-[(4-(Methoxymethyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (235) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (24 mg, 0.15 mmol), methyl propargyl ether (16 µL, 0.18 mmol), sodium ascorbate (3 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.1 mL) at r.t. for 1 d, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 5:1:0.1→4:1:0.1) afforded 235 (28 mg, 0.12 mmol, 80%) as a white solid. [𝛼]𝐷 27 – 45.1 (c 0.62, MeOH). IR (ν cm-1) 3464, 3257 (OH, NH), 2905, 1647, 1426, 1340, 1217, 1075, 896, 790. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.01 (s, 1H, H-5’’), 4.64 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.2, H-1’a), 4.54 (s, 2H, -CH2OCH3), 4.43 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.0, Synthetic procedures and characterization of the new compounds 339 H-1’b), 4.02 (td, 1H, J4,5a = J4,3 = 4.8, J4,5b = 2.9, H-4), 3.74 (dd, 1H, J3,2 = 7.8, H-3), 3.48 (td, 1H, H-2), 3.37 (s, 3H, -OCH3), 3.12 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.1, H-5a), 2.86 (dd, 1H, H-5b). 13C- NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 145.7 (C-4’’), 125.8 (C-5’’), 76.1 (C-3), 72.3 (C- 4), 66.3 (-CH2OCH3), 62.7 (C-2), 58.4 (-OCH3), 53.9 (C-1’), 52.3 (C-5). HRESIMS m/z found 229.1296, calc. for C9H17N4O3 [M+H]+: 229.1295. (2R,3S,4R)-2-[(4-(Methoxymethyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (236) CuAAC (General Procedure 2) using 112 (35 mg, 0.22 mmol), methyl propargyl ether (23 µL, 0.27 mmol), sodium ascorbate (10 mg, 0.05 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (8.7 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 5:1:0.1→4:1:0.1) afforded 236 (39 mg, 0.17 mmol, 77%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 24 + 13.9 (c 0.71, MeOH). IR (ν cm-1) 3303, 3143 (OH, NH), 2929, 1647, 1398, 1337, 1224, 1056, 903, 790. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.99 (s, 1H, H-5’’), 4.70 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.7, H-1’a), 4.53 (s, 2H, -CH2OMe), 4.46 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.2, H-1’b), 4.20 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.7, J4,3 = 4.5, H-4), 4.03 (t, 1H, J3,2 = 4.7, H-3), 3.64-3.58 (m, 1H, H-2), 3.37 (s, 3H, -OCH3), 3.07 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.2, H-5a), 2.88 (dd, 1H, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 145.6 (C-4’’), 125.8 (C-5’’), 73.6 (C-4), 73.0 (C-3), 66.3 (-CH2OMe), 61.6 (C-2), 58.4 (-OCH3), 51.9 (C-1’), 51.2 (C-5). HRESIMS m/z found 229.1296, calc. for C9H17N4O3 [M+H]+: 229.1295. 340 Experimental section (2S,3S,4R)-2-[(4-Propyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (237) CuAAC (General Procedure 2) using 89 (25 mg, 0.16 mmol), 1-pentyne (19 µL, 0.19 mmol), sodium ascorbate (4 mg, 0.02 mmol) and CuSO4 (1 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (5.4 mL) at r.t. for 1 d, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 5:1:0.1→4:1:0.1) afforded 237 (32 mg, 0.14 mmol, 88%) as a white solid. [𝛼]𝐷 28 – 52.2 (c 0.55, MeOH). IR (ν cm-1) 3419, 3283 (OH, NH), 2929, 1548, 1431, 1380, 1212, 1107, 979, 825. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.77 (s, 1H, H-5’’), 4.59 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.1, H-1’a), 4.38 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.0, H-1’b), 4.02 (td, 1H, J4,5a = J4,3 = 4.9, J4,5b = 3.0, H-4), 3.72 (dd, 1H, J3,2 = 7.7, H-3), 3.44 (td, 1H, H-2), 3.12 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.0, H-5a), 2.85 (dd, 1H, H-5b), 2.67 (t, 2H, JH,H = 7.5, -CH2CH2CH3), 1.69 (sext, 2H, JH,H = 7.4, -CH2CH2CH3), 0.97 (t, 3H, -CH2CH2CH3). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 149.0 (C-4’’), 123.9 (C-5’’), 76.1 (C-3), 72.3 (C-4), 62.7 (C-2), 53.9 (C-1’), 52.3 (C-5), 28.3 (-CH2CH2CH3), 23.7 (-CH2CH2CH3), 14.0 (-CH2CH2CH3). HRESIMS m/z found 227.1501, calc. for C10H19N4O2 [M+H]+: 227.1503. (2R,3S,4R)-2-[(4-Propyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (238) Synthetic procedures and characterization of the new compounds 341 CuAAC (General Procedure 2) using 112 (29 mg, 0.18 mmol), 1-pentyne (22 µL, 0.22 mmol), sodium ascorbate (8 mg, 0.04 mmol) and CuSO4 (2 mg, 0.01 mmol), in tBuOH:H2O 2:1 (7.2 mL) at r.t. overnight, followed by chromatographic purification (CH2Cl2:MeOH:NH4OH 6:1:0.1→4:1:0.1) afforded 238 (33 mg, 0.15 mmol, 83%) as a pale yellow solid. [𝛼]𝐷 24 + 13.5 (c 0.68, MeOH). IR (ν cm-1) 3322, 3122 (OH, NH), 2932, 1618, 1508, 1413, 1222, 1133, 1047, 810. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.76 (s, 1H, H-5’’), 4.66 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.9, J1’a,2 = 5.6, H-1’a), 4.43 (dd, 1H, J1’b,2 = 8.2, H-1’b), 4.20 (td, 1H, J4,5a = J4,5b = 6.8, J4,3 = 4.5, H-4), 4.03 (t, 1H, J3,2 = 4.6, H-3), 3.63-3.56 (m, 1H, H-2), 3.07 (dd, 1H, 2J5a,5b = 11.2, H-5a), 2.89 (dd, 1H, H-5b), 2.66 (t, 2H, JH,H = 7.5, -CH2CH2CH3), 1.69 (sext, 2H, JH,H = 7.4, -CH2CH2CH3), 0.97 (t, 3H, -CH2CH2CH3). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 148.9 (C-4’’), 124.0 (C-5’’), 73.6 (C-4), 73.0 (C-3), 61.7 (C-2), 51.7 (C-1’), 51.2 (C-5), 28.3 (-CH2CH2CH3), 23.8 (-CH2CH2CH3), 14.0 (-CH2CH2CH3). HRESIMS m/z found 227.1501, calc. for C10H19N4O2 [M+H]+: 227.1503. (2S,3S,4R)-2-[(4-(4-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)phenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]- pyrrolidine-3,4-diol hydrochloride (239) A solution of 197 (55 mg, 0.10 mmol) in HCl (1M):THF (1:1, 3.8 mL), was stirred at r.t. overnight. Evaporation of the solvent afforded 239 (47 mg, 0.10 mmol, quantitative) as a white solid. 342 Experimental section [𝛼]𝐷 25 – 42.7 (c 0.54, MeOH). IR (ν cm-1) 3323, 3099 (OH, NH), 2911, 2100 (N3), 1617, 1499, 1248, 1130, 1053, 828. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.65 (s, 1H, H- 5’’), 7.77 (d, 2H, JH,H = 8.7, H-aromat.), 7.08 (d, 2H, H-aromat.), 5.12-5.01 (m, 2H, H-1’), 4.32-4.30 (m, 1H, H-4), 4.25-4.18 (m, 3H, H-3, H-2IV), 4.13-4.06 (m, 1H, H-2), 3.89-3.86 (m, 2H, H-3IV), 3.75 (t, 2H, JH,H = 4.9, H-5IV), 3.62 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.6, J5a,4 = 3.5, H-5a), 3.41-3.32 (m, 3H, H-6IV, H-5b). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 161.4 (Cq aromat.), 147.7 (C-4’’), 128.7 (C aromat.), 124.1 (C-5’’), 121.6 (Cq aromat.), 116.4 (C aromat.), 74.8 (C-3), 71.3 (C-5IV), 70.6 (C-3IV), 70.3 (C-4), 68.9 (C-2IV), 60.7 (C-2), 51.8 (C-6IV), 51.7 (C- 5), 51.3 (C-1’). HRESIMS m/z found 390.1876, calc. for C17H24N7O4 [M]+: 390.1884. Pent-4-ynal (252) 236 To a solution of oxalyl chloride (2.1 mL, 24 mmol) in anhydrous CH2Cl2 (42 mL) at -78 oC, anhydrous DMSO (3.4 mL, 48 mmol) in CH2Cl2 (7.5 mL) was added and the mixture was stirred at -78 oC for 30 min. A solution of pent-4-yn-1-ol (1.5 mL, 16 mmol) in CH2Cl2 (12 mL) was added and the reaction mixture was stirred at -78 oC for 1 h. Finally, Et3N (12 mL, 86 mmol) was added and the mixture stirred at -78 oC for 30 min and allowed to reach r.t. The reaction was diluted with CH2Cl2 and washed with HCl 1M, sat. aq. soln. of NaHCO3 and brine. The organic layer was dried over Na2SO4, filtered and evaporated to give 252 (1.32 g, 15.7 mmol, quantitative) as a yellow liquid, that was used without further purification. 236 (a) Yan, Y.; Chen, J.; Zhang, L.; Zheng, Q.; Han, Y.; Zhang, H.; Zhang, D.; Awakawa, T.; Abe, I.; Liu, W. Multiplexing of combinatorial chemistry in antimycin biosynthesis: expansion of molecular diversity and utility. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 12308-12312. (b) Adams, T. C.; Dupont, A. C.; Carter, J. P.; Kachur, J.; Guzewska, M. E.; Rzeszotarski, W. J.; Farmer S. G.; Noronha-Blob, L.; Kaiser, K. Aminoalkynyldithianes. A new class of calcium channel blockers. J. Med. Chem. 1991, 34, 1585-1593. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 343 (2S,3S,4R)-2-Hydroxymethyl-1-(pent-4-yn-1-yl)-pyrrolidine-3,4-diol (246) A solution of 86 (313 mg, 1.15 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 28 mL), was stirred at r.t. for 3 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 25%, yielded the corresponding unprotected pyrrolidinealcohol 251 (153 mg, 1.15 mmol, quantitative) as a brown solid. To a solution of this compound (60 mg, 0.45 mmol) in anhydrous MeOH (5 mL) at 0 oC, NaBH3CN (75 mg, 1.1 mmol) and pent-4-ynal (252) (149 mg, 1.77 mmol) were added and the mixture was stirred at 0 oC for 3 h. The solvent was evaporated and the crude product was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:MeOH 7:1→5:1) to give 246 (45 mg, 0.23 mmol, 51%) as a yellow oil. [𝛼]𝐷 26 + 48.2 (c 0.81, MeOH). IR (ν cm-1) 3354, 3288 (OH, NH), 2939, 2828, 2117 (C≡C), 1645, 1432, 1334, 1076, 1025, 826. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 4.07-4.00 (m, 1H, H-4), 3.87 (ap. t, 1H, H-3), 3.57 (d, 2H, J1’,2 = 4.6, H-1’), 3.23 (dd, 1H, 2J5a,5b = 9.4, J5a,4 = 5.9, H-5a), 2.91 (dt, 1H, 2J1’’a,1’’b = 12.1, J1’’a, 2’’ = 8.1, H-1’’a), 2.57 (q, 1H, J2,3 = 4.5, H-2), 2.53-2.46 (m, 1H, H-1’’b), 2.41 (dd, 1H, J5b,4 = 7.1, H-5b), 2.25-2.19 (m, 3H, H-3’’, H-5’’), 1.72-1.63 (m, 1H, H-2’’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 84.7 (C-4’’), 74.2 (C-3), 72.8 (C-2), 71.1 (C-4), 69.8 (C-5’’), 62.8 (C-1’), 58.8 (C-5), 55.6 (C-1’’), 28.2 (C- 2’’), 16.8 (C-3’’). HRESIMS m/z found 200.1276, calc. for C10H18NO3 [M+H]+: 200.1281. 344 Experimental section (2S,3S,4R)-1-(Pent-4-yn-1-yl)-2-[(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine- 3,4-diol (247) To a solution of 90 (97 mg, 0.37 mmol) in anhydrous MeOH (3.7 mL) at 0 oC, NaBH3CN (37 mg, 0.56 mmol) and pent-4-ynal (252) (62 mg, 0.74 mmol) were added and the mixture was stirred at 0 oC for 2 h. The solvent was evaporated and the crude product was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH 30:1→15:1) to give 247 (109 mg, 0.334 mmol, 90%) as a colourless oil. [𝛼]𝐷 30 + 29.9 (c 0.91, MeOH). IR (ν cm-1) 3295 (OH), 2933, 2116 (C≡C), 1609, 1466, 1227, 1077, 764. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 8.33 (s, 1H, H-5’’), 7.82-7.79 (m, 2H, H-aromat.), 7.45-7.40 (m, 2H, H-aromat.), 7.36-7.31 (m, 1H, H-aromat.), 4.60 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.2, J1’a,2 = 4.3, H-1’a), 4.50 (dd, 1H, J1’b,2 = 5.0, H-1’b), 3.82-3.75 (m, 2H, H-3, H-4), 3.20-3.15 (m, 1H, H-5a), 3.02-2.98 (m, 1H, H-2), 2.92-2.83 (m, 1H, H-1’’’a), 2.55- 2.47 (m, 1H, H-1’’’b), 2.44-2.39 (m, 1H, H-5b), 2.26-2.20 (m, 3H, H-3’’’, H-5’’’), 1.72-1.63 (m, 2H, H-2’’’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 148.5 (C-4’’), 131.7 (Cq aromat.), 130.0 (C aromat.), 129.3 (C aromat.), 126.6 (C aromat.), 123.6 (C-5’’), 84.8 (C-4’’’), 74.5, 71.0 (C-3, C-4), 70.6 (C-2), 70.3 (C-5’’’), 58.2 (C-5), 54.8 (C-1’’’), 52.3 (C-1’), 28.1 (C- 2’’’), 16.6 (C-3’’’). HRESIMS m/z found 327.1813, calc. for C18H23N4O2 [M+H]+: 327.1816. Synthetic procedures and characterization of the new compounds 345 (2S,3S,4R)-2-Benzoylaminomethyl-1-(pent-4-yn-1-yl)-pyrrolidine-3,4-diol (248) To a solution of 92 (89 mg, 0.38 mmol) in anhydrous MeOH (3.7 mL) at 0 oC, NaBH3CN (38 mg, 0.58 mmol) and pent-4-ynal (252) (64 mg, 0.76 mmol) were added and the mixture was stirred at 0 oC for 2 h. The solvent was evaporated and the crude product was purified by chromatography column on silica gel (CH2Cl2:MeOH 30:1→10:1) to give 248 (57 mg, 0.19 mmol, 50%) as a colourless oil. [𝛼]𝐷 30 + 43.7 (c 0.59, MeOH). IR (ν cm-1) 3295 (OH, NH), 2930, 2360, 2110 (C≡C), 1637 (C=O), 1540, 1299, 1076, 713. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.84-7.80 (m, 2H, H-aromat.), 7.57-7.51 (m, 1H, H-aromat.), 7.48-7.43 (m, 2H, H-aromat.), 4.11-4.05 (m, 1H, H-4), 3.85 (t, 1H, J3,2 = J3,4 = 5.0, H-3), 3.69 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 13.7, J1’a,2 = 3.7, H-1’a), 3.36-3.32 (m, 1H, H-1’b), 3.30-3.27 (m, 1H, H-5a), 3.04-2.94 (m, 1H, H-1’’a), 2.79-2.73 (m, 1H, H-2), 2.57-2.49 (m, 1H, H-1’’b), 2.43 (dd, 1H, 2J5b,5a = 9.6, J5b,4 = 6.7, H-5b), 2.25 (td, 2H, J3’’,2’’ = 6.9, 4JH,H = 2.6, H-3’’), 2.19 (t, 1H, H-5’’), 1.77-1.67 (m, 2H, H-2’’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 170.3 (C=O), 135.7 (Cq aromat.), 132.7 (C aromat.), 129.6 (C aromat.), 128.2 (C aromat.), 84.6 (C-4’’), 75.3 (C-3), 70.9 (C-4), 70.3 (C-2), 70.0 (C-5’’), 58.9 (C-5), 55.2 (C-1’’), 42.1 (C-1’), 28.1 (C-2’’), 16.7 (C-3’’). HRESIMS m/z found 303.1702, calc. for C17H23N2O3 [M+H]+: 303.1703. 346 Experimental section (2S,3S,4R)-2-Ethynyl-pyrrolidine-3,4-diol (249) A solution of 83 (61 mg, 0.23 mmol) in TFA:H2O (4:1, 0.72 mL) was stirred at r.t. for 1 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 10%, yielded 249 (29 mg, 0.23 mmol, quantitative) as a brown oil. [𝛼]𝐷 23 – 67.8 (c 0.88, MeOH). IR (ν cm-1) 3279 (OH, NH), 2928, 2114 (C≡C), 1412, 1078, 647. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 4.16-4.11 (m, 1H, H-4), 3.95 (ap. t, 1H, H- 3), 3.64 (dd, 1H, J2,3 = 6.6, J2,2’ = 2.1, H-2), 3.24 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.0, J5a,4 = 5.7, H-5a), 2.78 (dd, 1H, J5b,4 = 3.9, H-5b), 2.75 (d, 1H, H-2’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 84.0 (C-1’), 79.3 (C-3), 73.9 (C-2’), 72.1 (C-4), 54.4 (C-2), 52.3 (C-5). HRESIMS m/z found 128.0706, calc. for C6H10NO2 [M+H]+: 128.0706. (2S,3S,4R)-2-[(4-(But-3-yn-1-yl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl]-pyrrolidine-3,4-diol (250) CuAAC (General Procedure 1) using 88 (225 mg, 0.754 mmol), pent-4-ynal (252) (127 mg, 1.51 mmol), DIPEA (500 L, 2.86 mmol) and CuI (88 mg, 0.45 mmol), in toluene (6.8 mL) at 50 oC in a sealed tube for 6 h, followed by chromatographic purification (EtOAc) afforded the corresponding “click” derivative (253) (239 mg, 0.628 mmol, 83%) as a brown oil. To a suspension of 4-acetamidobenzenosulfonyl azide (240 mg, 0.969 mmol) and K2CO3 (473 mg, 3.39 mmol) in anhydrous CH3CN (7.5 mL) at 0 oC, dimethyl 2-oxopropylphosphonate Synthetic procedures and characterization of the new compounds 347 (133 L, 0.914 mmol) was added. After stirring at r.t. for 6 h, a solution of 253 (230 mg, 0.605 mmol) in anhydrous MeOH (7.5 mL) was added and the mixture was stirred at r.t. overnight. The mixture was filtered through celite and the solvent removed under vacuum. The crude product was purified by chromatography column on silica gel (EtOAc:cyclohexane 1:1) to give the corresponding protected alkynyl-triazole (177 mg, 0.470 mmol, 78%) as a colourless oil. A solution of this compound (119 mg, 0.316 mmol) in HCl (4M):THF (1:1, 7.6 mL), was stirred at r.t. for 3 h. Evaporation of the solvent and chromatographic purification on Dowex 50WX8 eluting with MeOH, H2O and NH4OH 25%, yielded 250 (57 mg, 0.24 mmol, 76%) as a white solid. [𝛼]𝐷 30 – 51.1 (c 0.94, MeOH). IR (ν cm-1) 3427, 3284 (OH, NH), 2931, 2117 (C≡C), 1551, 1430, 1213, 1049, 980, 820. 1H-NMR (300 MHz, MeOD, δ ppm, J Hz) δ 7.87 (s, 1H, H-5’’), 4.60 (dd, 1H, 2J1’a,1’b = 14.0, J1’a,2 = 4.1, H-1’a), 4.38 (dd, 1H, J1’b,2 = 7.9, H-1’b), 4.00 (td, 1H, J4,3 = J4,5a = 4.9, J4,5b = 3.0, H-4), 3.71 (dd, 1H, J3,2 = 7.7, H-3), 3.43 (td, 1H, H-2), 3.11 (dd, 1H, 2J5a,5b = 12.0, H-5a), 2.91 (t, 2H, JH,H = 7.3, H-1’’’), 2.83 (dd, 1H, H-5b), 2.53 (td, 2H, 4JH,H = 2.6, H-2’’’), 2.26 (t, 1H, H-4’’’). 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD, δ ppm) δ 147.3 (C- 4’’), 124.4 (C-5’’), 83.9 (C-3’’’), 76.1 (C-3), 72.3 (C-4), 70.5 (C-4’’’), 62.7 (C-2), 53.9 (C- 1’), 52.3 (C-5), 25.9 (C-1’’’), 19.4 (C-2’’’). HRESIMS m/z found 237.1344, calc. for C11H17N4O2 [M+H]+: 237.1346. 3-Azidopropyl pivalate (245) 237 To a solution of 3-bromopropanol (1.0 mL, 11 mmol) and DMAP (135 mg, 1.11 mmol) in anhydrous pyridine (8 mL) at 0 oC, pivaloyl chloride (1.63 mL, 13.3 mmol) was added. After 237 Durka, M.; Buffet, K.; Iehl, J.; Holler, M.; Nierengarten, J. –F.; Taganna, J.; Bouckaert, J.; Vincent, S. P. The functional valency of dodecamannosylated fullerenes with Escherichia coli FimH-towards novel bacterial antiadhesives. Chem. Commun. 2011, 47, 1321-1323. 354 Experimental section pAEMA49%-random-pDMAEMA51% polymer To a solution of triphenylphosphine (8.32 g, 31.7 mmol) in dry THF (41 mL) at 0 ºC, a commercial 40% solution of diethylazodicarboxylate (DEAD) in toluene (13.8 mL, 31.7 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred for 5 min prior to the sequential dropwise addition of diphenylphosphoryl azide (DPPA) (6.5 mL, 30 mmol) and a solution of 4.36 g of pHEMA49%-random-pDMAEMA51% (14.9 mmol HEMA residues) in THF (45 mL). The reaction solution was stirred overnight at r.t. Tert-butyl methyl ether (MTBE, 500 mL) was added to the reaction solution, and the poly(2-azidoethyl methacrylate)-random- poly[(N,N-dimethylamino)ethyl methacrylate] (pAEMA-random-pDMAEMA) was isolated by precipitation. The precipitated polymer was washed several times with MTBE (total volume: 500 mL) and dried under vacuum. (Yield = 91%). GPC data: Mn = 19,900; Mw = 30,500; Mw/Mn = 1.5. Experimental copolymer composition (determined by 1H-NMR): pAEMA49%-random-pDMAEMA51%. IR (ν cm-1) 2952, 2104 (- N3), 1724 (C=O), 1234, 1146. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 4.13-4.01 (m, 2H, - COOCH2CH2, DMAEMA), 3.99-3.85 (m, 2H, -COOCH2CH2, AEMA), 2.65-2.52 (m, 2H, - COOCH2CH2, DMAEMA), 2.38-2.20 (br. m, 6H, -N(CH3)2, DMAEMA), 2.07-1.92 (m, 2H, -COOCH2CH2, AEMA), 1.34-1.16 (br. m, 10H, -CH2CCH3, DMAEMA, AEMA, - CH2CCH3, DMAEMA, AEMA). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 178.1 (C=O), 64.9 (-COOCH2CH2, -COOCH2CH2, DMAEMA), 61.3 (-COOCH2CH2, AEMA), 56.8 (- COOCH2CH2, AEMA and -N(CH3)2, DMAEMA), 18.5 (-CH2CCH3, DMAEMA and AEMA). Synthetic procedures and characterization of the new compounds 355 p(TEMA-249)49%-random-pDMAEMA51% polymer The polymer-azide (pAEMA49%-random-pDMAEMA51%, 300 mg, 0.982 mmol AEMA), CuBr (2 mg, 0.01 mmol), and DBU (15 L, 0.098 mmol) were added to a two-necked, round-bottom flask and dissolved in 10 mL of DMF. A DMF solution of the corresponding alkynyl derivative (249) (132 mg, 1.03 mmol, 0.7 mmol/mL) was added and the resulting suspension was degassed for 5 min prior to immersion in an oil bath set at 70 °C for 24 h. The reaction mixture was quenched by adding silica suspended in DMF and then was filtered off over a celite/silica bed. The solvent was removed under vacuum to produce a colored polymer (p(TEMA-249)49%-random-pDMAEMA51%, yield = 51%). Experimental copolymer composition (determined by 1H-NMR): p(TEMA-249)49%-random- pDMAEMA51%. IR (ν cm-1) 3259 (OH), 2925, 1703 (C=O), 1201. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 8.02 (s, 1H, H-5’), 5.44-5.23 (br. s, 2H, OH), 4.75-4.68 (br. m, 2H, - COOCH2CH2, TEMA-249), 4.68-4.61 (br. s, 2H, -COOCH2CH2, DMAEMA), 4.46-4.39 (br. m, 2H, -COOCH2CH2, TEMA-249), 4.34-4.30 (m, 1H, H-4), 4.29-4.27 (m, 1H, H-3), 4.27- 4.24 (m, 1H, H-2), 4.02-3.97 (br. s, 2H, -COOCH2CH2, DMAEMA), 3.55-3.51 (br. s, 2H, H- 5), 2.26-2.14 (m, 6H, -N(CH3)2, DMAEMA), 1.99-1.88 (m, 6H, -CH2CCH3, DMAEMA, TEMA-249). 356 Experimental section p(TEMA-250)49%-random-pDMAEMA51% polymer The polymer-azide (pAEMA49%-random-pDMAEMA51%, 100 mg, 0.327 mmol AEMA), CuBr (1 mg, 0.003 mmol), and DBU (5 L, 0.03 mmol) were added to a two-necked, roundbottom flask and dissolved in 10 mL of DMF. A DMF solution of the corresponding alkynyl derivative (250) (81 mg, 0.34 mmol, 0.7 mmol/mL) was added and the resulting suspension was degassed for 5 min prior to immersion in an oil bath set at 70 °C for 24 h. The reaction mixture was quenched by adding silica suspended in DMF and then was filtered off over a celite/silica bed. The solvent was removed under vacuum to produce a colored polymer (p(TEMA-250)49%-random-pDMAEMA51%, yield = 49%). Experimental copolymer composition (determined by 1H-NMR): p(TEMA-250)49%-random- pDMAEMA51%. IR (ν cm-1) 3285 (OH), 2925, 1709 (C=O), 1205. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm) δ 7.85 (br. s, 2H, H-5’’, H-5IV), 5.24-5.06 (br. m, 2H, -COOCH2CH2, TEMA-250), 5.04-4.92 (br. m, 2H, H-1’), 4.85-4.72 (br. s, 2H, -COOCH2CH2, DMAEMA), 4.62-4.51 (m, 2H, H-3, H-4), 4.51-4.43 (m, 2H, H-5), 4.39-4.27 (br. s, 2H, OH), 4.07-3.97 (m, 1H, H-2), 3.94-3.79 (br. m, 2H, -COOCH2CH2, TEMA-250), 3.69-3.49 (br. s, 2H, - COOCH2CH2, DMAEMA), 2.95-2-86 (m, 4H, H-1’’’, H-2’’’), 2.83-2.79 (m, 6H, -N(CH3)2, DMAEMA). ANEXO I Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática 359 ANEXO I: Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática La actividad catalítica de una enzima se obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza. La inhibición enzimática puede definirse como el bloqueo o la disminución de la actividad catalítica de la enzima como resultado de una modificación de las condiciones de reacción (pH, temperatura o concentración del sustrato) o de la presencia de sustancias químicas que interfieren en el proceso (inhibidores). 238 En una reacción enzimática simple en la que un sustrato S se transforma en un producto P, la velocidad inicial es directamente proporcional a la cantidad de enzima E presente en el medio. Para determinadas enzimas existe un fenómeno de saturación, es decir, para altas concentraciones de sustrato existe un valor límite de velocidad que se denomina velocidad máxima Vmáx. La concentración de sustrato que corresponde a Vmáx/2 se denomina KM, constante de Michaelis. Las enzimas que muestran este tipo de comportamiento siguen una cinética clásica de Michaelis-Menten y se ajustan por lo general al siguiente esquema: La ecuación de velocidad de la reacción es: 𝑣 = 𝑉𝑚á𝑥 ·[𝑆] [𝑆]+ 𝐾𝑚 siendo [S] la concentración de sustrato. Si se reordenan los términos en la ecuación anterior se obtiene: 238 Waldrop, G. L. A qualitative approach to enzyme inhibition. Biochemistry and Molecular Biology Education 2009, 37, 11-15. 360 Anexo I 1 𝑣=𝐾m 𝑉𝑚á𝑥 ·1 [𝑆] +1 𝑉𝑚á𝑥 Al representar 1/v frente a 1/[S] se obtiene una recta de pendiente Km/Vmáx que corta al eje de ordenadas en 1/Vmáx y extrapolando, al eje de abscisas en -1/Km. Éste es el denominado método de los dobles inversos o de Lineweaver-Burk. Existen dos tipos fundamentales de fenómenos de inhibición: la inhibición irreversible, donde el inhibidor se combina de forma covalente con la enzima modificando su estructura química, y la inhibición reversible, donde el inhibidor se une a la enzima de forma no covalente originando un equilibrio químico, modificando alguno de los parámetros cinéticos como Km o Vmáx. Los diversos modos de inhibición reversible difieren en los mecanismos por medio de los cuales se reduce la actividad enzimática y en la forma en que afectan a la cinética de la reacción, dependiendo de si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos. Se distinguen tres modos generales de inhibición reversible: inhibición competitiva, incompetitiva y mixta, que pueden ser fácilmente identificadas a partir de sus correspondientes representaciones de Lineweaver-Burk. Además existe un cuarto modo de Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática 361 inhibición reversible derivado de la inhibición mixta, denominado como inhibición no competitiva. 1. Inhibición competitiva: se caracteriza porque el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima, impidiendo la unión de éste y disminuyendo por tanto la velocidad de la reacción. Se establecen en el proceso los siguientes equilibrios: Se forma por tanto, un complejo enzima-inhibidor en el que se define la constante 𝐾𝑖=[𝐸] [𝐼] [𝐸𝐼], donde [E], [I] y [EI] son las concentraciones de enzima libre, de inhibidor y de complejo enzima-inhibidor, respectivamente. El valor de Ki (conocido como constante de inhibición) es indicativo de la afinidad de la enzima por el inhibidor: cuanto menor sea dicho valor, mayor es la eficacia del inhibidor sobre la enzima. Este tipo de inhibición se caracteriza porque las representaciones de Lineweaver- Burk para distintas concentraciones de inhibidor se cortan en el eje de ordenadas (Figura 93A). El valor de la constante de inhibición (Ki) se puede calcular a partir de las pendientes de las rectas obtenidas y del punto de corte entre ellas. Otro método para calcular el valor de Ki consiste en la utilización de una representación gráfica derivada de la representación de Lineweaver-Burk. Así, la representación de las pendientes o del inverso de las abscisas en origen de las rectas de la Figura 93A frente a la concentración de inhibidor [I], genera una recta cuya abscisa en origen proporciona, en valor absoluto, la constante de inhibición Ki (Figura 93B). 362 Anexo I Figura 93. Representación Lineweaver-Burk en una inhibición de tipo competitiva y cálculo de Ki 2. Inhibición incompetitiva o acompetitiva: se caracteriza porque el inhibidor se une al complejo enzima-sustrato pero no a la enzima libre. Para este tipo de inhibición las diferentes rectas de una representación Lineweaver-Burk son paralelas entre sí y cortan al eje de abscisas en su zona negativa (Figura 94A). La constante de inhibición para un inhibidor incompetitivo se denota en este caso como Ki’. Siguiendo la metodología del apartado anterior, la representación de las ordenadas o abscisas en origen de las rectas de la Figura 94A frente al valor de [I] proporciona el valor de Ki’ (Figura 94B). Figura 94. Representación Lineweaver-Burk en una inhibición de tipo incompetitiva y cálculo de Ki’ Conceptos básicos sobre la cinética de la inhibición enzimática 363 3. Inhibición mixta: consiste en la combinación de dos tipos reversibles de inhibición enzimática, la inhibición competitiva y la inhibición incompetitiva. El inhibidor puede unirse tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato, pero la afinidad por cada una de estas formas es distinta (Figura 95A). En este tipo de inhibición, las rectas obtenidas de la representación de Lineweaver-Burk se cruzan en el segundo cuadrante a la izquierda del eje de ordenadas. En este caso se pueden calcular dos constantes de inhibición, la correspondiente a la parte competitiva (Ki) y a la componente incompetitiva (Ki’) (Figuras 95B y 95C, respectivamente). Figura 95. Representación Lineweaver-Burk en una inhibición de tipo mixta y cálculo de Ki y Ki’ Polimerización RAFT 371 ANEXO II: Polimerización RAFT La polimerización por radicales libres es una de las técnicas de polimerización más utilizada con fines tanto académicos como industriales, siendo el 40-45% de los polímeros sintéticos obtenidos mediante este procedimiento. A pesar de sus numerosas ventajas, la polimerización por radicales libres no permite el control adecuado del peso molecular del polímero obtenido y, en consecuencia, de su polidispersidad (definida como la distribución de pesos moleculares poliméricos, cuyo valor debe ser próximo a la unidad). Estas desventajas pueden ser solventadas mediante el uso de agentes de transferencia de cadena (CTA, del inglés, “Chain Transfer Agent”) que dan lugar a la polimerización por adición, fragmentación y transferencia de cadena reversible (RAFT, del inglés, “Reversible Addition Fragmentation-chain Transfer”). RAFT es un tipo de polimerización radicalaria controlada que se basa en equilibrios dinámicos entre especies activas y durmientes (desactivadas). Las técnicas de polimerización radicalaria controlada han emergido en los últimos años como una herramienta muy útil para la síntesis de materiales poliméricos. Estas metodologías son compatibles con una amplia variedad de grupos funcionales en comparación con los métodos de polimerización iónica convencionales. Este tipo de polimerización es aplicable a una gran variedad de monómeros y presenta gran versatilidad debido a la posibilidad de utilizar varios procesos para la creación de radicales libres. 240 El mecanismo por el cual transcurre la polimerización RAFT consta de varias etapas, las cuales se recogen en la Figura 101. En la etapa de iniciación, la reacción comienza por una fuente de radicales libres (representado como I2 en la figura), siendo ésta un azocompuesto o un material de tipo peróxido. El iniciador se descompone en especies radicalarias de tipo I•, que pueden reaccionar con una molécula de monómero para generar un radical polimérico (P1•) susceptible de propagarse. Seguidamente tiene lugar la 240 Barsbay, M.; Güven, O. Nanostructuring of polymers by controlling of ionizing radiation-induced free radical polymerization, copolymerization, grafting and crosslinking by RAFT mechanism. Radiation Physics and Chemistry 2018, doi.org/10.1016/j.radphyschem.2018.04.009. 372 Anexo II transferencia en cadena, en la que los radicales propagadores se adicionan sobre el agente de transferencia de cadena (CTA) 262, generando las especies radicalarias intermedias de tipo 263, que resultan en especies poliméricas durmientes que contienen el CTA con la función tiocarboniltio (264). El agente CTA (262) debe contener un grupo R que tenga capacidad para liberarse homolíticamente con el objetivo de reiniciar nuevos procesos de polimerización, y un grupo Z capaz de modificar la reactividad del doble enlace tiocarbonílico, favoreciendo la adición del radical y asegurando la estabilidad de las especies radicalarias intermedias (263 y 265). El grupo saliente R• que se libera puede reiniciar nuevos radicales poliméricos (P1•) que generarán otras cadenas poliméricas. La rápida formación de los radicales R• permite el inicio de múltiples cadenas poliméricas simultáneamente, lo cual hace que los polímeros obtenidos tengan valores de polidispersidad bajos. En la etapa de propagación, la adición de monómeros a los radicales es rápida, dando lugar a cadenas oligoméricas radicalarias (P•n+1). Además de experimentar la elongación de la cadena polimérica, los radicales generados pueden reaccionar con la especie durmiente 264, estableciéndose un equilibrio de cadena entre las especies durmientes (264 y 266) y las especies radicalarias intermedias de tipo 265. Esta etapa es la más importante del mecanismo RAFT. En este equilibrio, se produce un intercambio entre los radicales presentes en el medio, y la fragmentación de las especies intermedias 265 resultará en la producción de especies poliméricas idénticas. Por último, en la etapa de terminación, las cadenas activas reaccionan mediante procesos de acoplamiento radicalario y desproporción, para generar cadenas estables que no sufrirán reacciones posteriores. El aducto de tipo 265 no experimenta reacciones de terminación dado su impedimento estérico. 241 241 (a) Lovestead, T. M.; Hart-Smith, G.; Davis, T. P.; Stenzel, M. H.; Barner-Kowollik, C. Electrospray ionization mass spectrometry investigation of reversible addition fragmentation chain transfer mediated acrylate polymerizations initiated via 60Co -irradiation: mapping reaction pathways. Macromolecules 2007, 40, 4142- 4153. (b) Barner-Kowollik, C.; Davis, T. P.; Heuts, J. P. A.; Stenzel, M. H.; Vana, P.; Whittaker, M. Highlight: RAFTing down under: tales of missing radicals, fancy architectures and mysterious holes. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2002, 41, 365-375. Polimerización RAFT 373 Figura 101 Aunque todavía se requieren experimentos para confirmar la naturaleza de este mecanismo, existen en bibliografía estudios que confirman algunas etapas de este proceso. 242 242 (a) Chernikova, E.; Morozov, A.; Leonova, E.; Garina, E.; Golubev, V.; Bui, C.; Charleux, B. Controlled freeradical polymerization of butyl acrylate by reversible addition-fragmentation chain transfer in the presence of tert-butyl dithiobenzoate. A kinetic study. Macromolecules 2004, 37, 6329-6339. (b) Adamy, M.; van Herk, A. M.; Destarac, M.; Monteiro, M. J. Influence of the chemical structure of MADIX agents on the RAFT polymerization of styrene. Macromolecules 2003, 36, 2293-2301. (c) Kwak, Y.; Goto, A.; Tsujii, Y.; Murata, Y.; Komatsu, K.; Fukuda, T. A kinetic study on the rate retardation in radical polymerization of styrene with addition-fragmentation chain transfer. Macromolecules 2002, 35, 3026-3029. (d) Müller, A. H. E.; Yan, D.; Litvinenko, G.; Zhuang, R.; Dong, H. Kinetic analysis of “living” polymerization processes exhibiting slow equilibria. 2. Molecular weight distribution for degenerative transfer (direct activity exchange between active and “dormant” species) at constant monomer concentration. Macromolecules 1995, 28, 7335-7338. 374 Anexo II La amplia tolerancia a diversos grupos funcionales de la polimerización RAFT hace que esta metodología pueda ser desarrollada en presencia de gran variedad de monómeros y condiciones de reacción, siendo compatible con medios próticos como el agua 243 y los alcoholes. 244 Otros medios de reacción empleados en la polimerización RAFT son el dióxido de carbono supercrítico, 245 líquidos iónicos 246 y emulsiones. 247 243 (a) Convertine, A. J.; Lokitz B. S.; Vasileva, Y.; Myrick, L. J.; Scales, C. W.; Lowe, A. B.; McCormick, C. L. Direct synthesis of thermally responsive DMA/NIPAM diblock and DMA/NIPAM/DMA triblock copolymers via aqueous, room temperature RAFT polymerization. Macromolecules 2006, 39, 1724-1730. (b) Mertoglu, M.; Laschewsky, A.; Skrabania, K.; Wieland, C. New water soluble agents for reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization and their application in aqueous solutions. Macromolecules 2005, 38, 3601-3614. 244 Albertin, L.; Stenzel, M. H.; Barner-Kowollik, C.; Foster, L. J. R.; Davis, T. P. Well-defined diblock glycopolymers from RAFT polymerization in homogeneous aqueous medium. Macromolecules 2005, 38, 9075- 9084. 245 (a) Arita, T.; Beuermann, S.; Buback, M.; Vana, P. RAFT polymerization of methyl acrylate in carbon dioxide. Macromol. Mater. Eng. 2005, 290, 283-293. (b) Ma, Z.; Lacroix-Desmazes, P. Synthesis of hydrophilic/CO2-philic poly(ethylene oxide)-b-poly(1,1,2,2-tetrahydroperfluorodecyl acrylate) block copolymers via controlled/living radical polymerizations and their properties in liquid and supercritical CO2. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 2004, 42, 2405-2415. 246 Perrier, S.; Davis, T. P.; Carmichael, A. J.; Haddleton, D. M. First report of reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization in room temperature ionic liquids. Chem. Commun. 2002, 19, 2226-2227. 247 (a) Hartmann, J.; Urbani, C.; Whittaker, M. R.; Monteiro, M. J. Effect of degassing on surfactant-free emulsion polymerizations of styrene mediated with RAFT. Macromolecules 2006, 39, 904-907. (b) McLeary, J. B.; Klumperman, B. RAFT mediated polymerization in heterogeneous media. Soft Matter 2006, 2, 45-53. ANEXO III Espectros representativos 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2.853 2.863 2.893 2.903 3.125 3.141 3.165 3.181 3.299 3.305 3.310 3.316 3.321 3.349 3.506 3.519 3.532 3.545 3.559 3.767 3.783 3.793 3.809 4.030 4.039 4.046 4.056 4.062 4.072 4.436 4.463 4.483 4.510 4.658 4.672 4.705 4.719 4.853 7.316 7.341 7.349 7.361 7.365 7.370 7.409 7.413 7.429 7.434 7.452 7.458 7.462 7.802 7.806 7.810 7.822 7.829 7.834 8.349 0.949 1.020 0.986 0.962 0.949 0.960 1.000 0.965 1.931 1.918 0.945 7.47.57.67.77.87.9 ppm 3.03.23.43.63.84.04.24.44.6 ppm H N OHHO NN N 90 1H-NMR (300 MHz, MeOD) 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ppm 48.148 48.432 48.716 49.000 49.283 49.567 49.850 52.252 53.687 62.537 72.087 76.059 123.016 126.689 129.372 129.978 131.683 148.842 H N OHHO NN N 90 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) 1H-NMR (300 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 89f SiMe3 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 48.147 48.431 48.715 49.000 49.281 49.565 49.848 51.170 51.866 55.769 61.655 73.005 73.574 115.352 122.247 124.283 128.022 148.661 161.333 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 112p OMe 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 2.914 2.935 2.951 2.973 3.095 3.118 3.133 3.156 3.299 3.304 3.310 3.315 3.321 3.349 3.696 3.713 3.724 3.729 3.741 3.758 4.095 4.110 4.125 4.210 4.225 4.232 4.247 4.255 4.269 4.513 4.542 4.560 4.588 4.633 4.743 4.761 4.790 4.807 4.856 7.416 7.444 7.783 7.811 8.328 0.974 1.014 1.000 0.978 1.029 1.043 2.160 1.106 2.148 2.143 1.027 7.57.67.77.87.9 ppm 3.23.43.63.84.04.24.44.6 ppm 1H-NMR (300 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 112r OH 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 48.148 48.432 48.716 49.000 49.284 49.567 49.851 51.057 51.743 61.648 64.857 72.950 73.449 123.027 126.667 128.532 130.676 143.018 148.574 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 112r OH 1H-NMR (300 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 129 Br Br 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 2.839 2.848 2.879 2.889 3.111 3.127 3.151 3.167 3.299 3.305 3.310 3.316 3.321 3.349 3.462 3.476 3.489 3.502 3.515 3.529 3.753 3.769 3.779 3.795 4.022 4.032 4.038 4.048 4.054 4.064 4.424 4.451 4.471 4.498 4.644 4.658 4.691 4.705 4.851 7.677 7.683 7.689 7.991 7.996 8.446 0.997 1.009 1.016 1.028 1.000 1.014 1.047 0.951 1.959 1.008 7.87.98.0 ppm 3.03.23.43.63.84.04.24.44.6 ppm 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 129 Br Br 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 48.148 48.431 48.715 49.000 49.282 49.565 49.850 52.370 54.275 62.654 72.321 76.269 124.110 124.471 128.315 134.290 135.674 145.823 1H-NMR (300 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 130 F3C CF3 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 2.845 2.855 2.886 2.895 3.120 3.136 3.160 3.177 3.299 3.305 3.310 3.316 3.321 3.483 3.497 3.509 3.523 3.535 3.550 3.772 3.788 3.798 3.814 4.031 4.041 4.047 4.057 4.064 4.073 4.460 4.487 4.506 4.533 4.678 4.692 4.724 4.739 4.849 7.918 8.425 8.631 1.000 1.002 1.010 1.016 1.000 1.008 1.024 0.992 1.992 0.997 3.03.23.43.63.84.04.24.44.6 ppm 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 130 F3C CF3 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 48.150 48.433 48.716 49.000 49.284 49.568 49.851 52.411 54.387 62.680 72.360 76.334 119.358 122.230 122.281 122.331 122.959 124.593 126.560 126.680 130.162 132.791 133.234 133.675 134.119 134.711 145.841 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 2.870 2.892 2.908 2.929 3.056 3.079 3.094 3.116 3.299 3.305 3.310 3.315 3.321 3.349 3.627 3.645 3.655 3.662 3.672 3.690 4.068 4.083 4.099 4.182 4.198 4.204 4.220 4.226 4.242 4.474 4.502 4.520 4.548 4.713 4.732 4.759 4.778 4.853 7.379 7.387 7.388 7.393 7.399 7.785 7.789 7.793 7.799 8.432 0.979 0.988 1.017 0.969 1.000 1.000 1.021 0.944 1.977 0.993 7.57.67.77.8 ppm 3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.8 ppm 1H-NMR (300 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 139 Cl Cl 13C-NMR (75.4 MHz, MeOD) H N OHHO NN N 139 Cl Cl 1H-NMR (300 MHz, D O) 2 231 HN OH OH NN N ON N N ·HCl 3 2