Mecanismos de activación transcripcional durante la diferenciación de los heterocistos en la cianobacteria modelo anabaena sp. Pcc 7120

Índice I ÍNDICE ÍNDICE I ÍNDICE DE FIGURAS VI ÍNDICE DE TABLAS X ABREVIATURAS XI 1.In oducción 3 1.1. Regulación del inicio de la ansc ipción en bac e ias 3 1.1.1 RNAP bac e iana 4 1.1.1.1 Subunidad sigma 6 1.1.2. P omo o es de E. coli 7 1.1.2.1 P omo o es basales 7 1.1.2.2 P omo o es egulados 8 1.1.3. Regulado es ansc ipcionales de la amilia CRP de E. coli 10 1.1.3.1 P omo o es dependien es de CRP de clase I 10 1.1.3.2 P omo o es dependien es de CRP de clase II 11 1.2. Las cianobac e ias 13 1.2.1. Gene alidades 13 1.2.2. Asimilación del ni ógeno 17 1.2.2.1. Fijación de ni ógeno 17 1.2.2.2. Con ol po ni ógeno en cianobac e ias 19 1.2.2.3. El egulado ansc ipcional N cA 22 1.2.3. El He e ocis o 24 1.2.3.1. Es uc u a del he e ocis o 24 1.2.3.2. Me abolismo del he e ocis o 26 1.2.3.3. Di e enciación de los he e ocis os 28 1.2.4. Aspec os especí icos de la ansc ipción en cianobac e ias. 30 1.2.4.1. RNA polime asa de cianobac e ias 30 1.2.4.2. P omo o es cianobac e ianos 31 1.2.5. Regulación de la exp esión génica du an e la di e enciación de los he e ocis os 32 1.2.5.1. El egulado He R 34 1.2.5.2. Relaciones en e N cA y He R 37 Se gio Cama go Be nal II 1.2.5.3. P omo o es de genes de la di e enciación de he e ocis os 38 1.2.5.4. Papel de PipX du an e la di e enciación de he e ocis os 40 1.3. Obje i os de es a esis 41 2. MATERIALES Y MÉTODOS 4 2.1. O ganismos y condiciones de cul i o 45 2.1.1. Cianobac e ias 45 2.1.1.1. Es i pes de cianobac e ias u ilizadas 45 2.1.1.2. Medios y condiciones de cul i o 46 2.1.1.3. Mé odo de ecogida y la ado de células 48 2.1.1.4. De e minación de la can idad de clo o ila 48 2.1.2. Esche ichia coli 49 2.1.2.1. Es i pes empleadas 49 2.1.2.2. Medios y condiciones de cul i o 49 2.2. Mé odos de manipulación y análisis de DNA 50 2.2.1. Plásmidos u ilizados 50 2.2.2. T ans e encia de DNA 53 2.2.2.1. T ans e encia de DNA a E. coli median e ans o mación 53 2.2.2.2. T ans e encia de DNA a Anabaena sp. median e conjugación 54 2.2.3. Aislamien o de DNA 55 2.2.3.1 Aislamien o de DNA plasmídico de E. coli 55 2.2.3.2. Aislamien o de DNA o al de cianobac e ias 55 2.2.4. De e minación de la concen ación de DNA 56 2.2.5. Sepa ación de agmen os de DNA en geles de aga osa y pu i icación 56 2.2.6. Ampli icación de DNA median e la eacción en cadena de la DNA polime asa (PCR) 57 2.2.7. Secuenciación del DNA 60 2.2.8. T a amien os enzimá icos el DNA 61 2.2.8.1. Res icción del DNA 61 2.2.8.2. Des os o ilación del DNA 62 2.2.8.3. Relleno de ex emos 3’ ecesi os 62 2.2.8.4. Ligación del DNA 62 2.2.8.5. Ma caje adiac i o de agmen os de DNA 62 2.3. Mé odos de manipulación y análisis de RNA 64 2.3.1. Aislamien o de RNA 64 2.3.2. Elec o o esis de RNA en geles de aga osa 65 Índice III 2.3.3. De ección de secuencias de RNA median e hib idación en il o con sonda adiac i a (Análisis de no he n) 65 2.3.4. Ensayo de ex ensión de cebado 66 2.3.5. Ampli icación ápida de ex emos 5’ de cDNA ( 5’-RACE) 67 2.4. Mé odos de pu i icación y análisis de p o eínas 69 2.4.1. P epa ación de ex ac os lib es de células 69 2.4.2. Pu i icación de N cA ecombinan e median e c oma og á ia de a inidad po hepa ina 70 2.4.3. Pu i icación de N cA-His, He R-His y PipX-His median e c oma og a ía de a inidad po níquel 70 2.4.4. P epa aciones de RNAP de Anabaena ecombinan e 72 2.4.4.1. Pu i icación de las dis in as subunidades 72 2.4.4.2. Recons i ución y pu i icación del complejo RNAP-SigA. 74 2.4.5. Cuan i icación de p o eínas 76 2.4.6. Elec o o esis analí ica de p o eínas en geles de SDS-Poliac ilamida 77 2.5. Ensayos de ansc ipción in i o 78 2.6 Análisis de la in e acción P o eína-DNA 79 2.6.1. Ensayos de e a do de la mo ilidad elec o o é ica (EMSA) 79 2.6.2. Ensayos de esonancia de plasmones supe iciales (SPR) 80 2.6.2.1. P incipios básicos 80 2.6.2.2. Análisis SPR de la in e acción P o eína-DNA 82 2.6.3. Ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I (Foo p in ing) 84 2.7. Mic oscopia láse con ocal 85 2.8. Análisis in o má ico de secuencias de DNA y p o eínas 86 3. RESULTADOS 42 3.1. Gene ación de mu an es del gen he R 89 3.2. Análisis de la ac i ación ansc ipcional del ope ón de BCA. Papel de los egulado es N cA Y He R. 94 3.2.1. Ensayos de ex ensión de cebado en la egión p omo o a del gen de B 94 3.2.2. Análisis del pa ón espacio- empo al de la exp esión de los dis in os p omo o es del gen de B 96 3.2.3. Análisis in i o de la ac i idad ansc ipcional de la egión p omo o a del gen de B. E ec o de N cA y He R. 100 3.2.3.1. Ensayos de ansc ipción in i o 100 3.2.3.2. EMSA de la unión de N cA al DNA en la egión comp endida Se gio Cama go Be nal IV en e los TSPs del gen de B 102 3.2.3.3. Ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I 104 3.2.3.4. E ec o del egulado He R en la unión de N cA al p omo o p oximal del gen de B 106 3.3. Análisis de la ac i ación ansc ipcional de o as egiones p omo o as complejas de Anabaena 108 3.3.1. Ac i ación ansc ipcional en la egión p omo o a del gen he C 108 3.3.2. Ac i ación ansc ipcional en la egión p omo o a del gen n cA 111 3.3.2.1. E ec o de N cA y He R 112 3.3.3. Ac i ación ansc ipcional en la egión p omo o a del gen he R 114 3.4. E ec o de PipX en la ac i ación de p omo o es dependien es de N cA 118 3.4.1. E ec o de PipX sob e la exp esión del gen n A in i o 118 3.4.2. E ec o de PipX en la unión de N cA al DNA en las egiones p omo o as de los genes n A y de B 119 3.4.2.1. Ensayos de e a do en gel 120 3.4.2.2. Análisis SPR 121 3.4.3. E ec o de PipX en la ansc ipción in i o en p omo o es dependien es de N cA 123 3.4.4. E ec o de N cA y PipX en la unión de la RNAP al p omo o dis al del ope ón de BCA in i o 126 3.5. De e minación y ca ac e ización de la egión p omo o a del ope ón al 2729-cox3 128 3.5.1. De e minación de los inicios de ansc ipción del ope ón cox3 128 3.5.1.1. Ensayos de ex ensión de cebado 128 3.5.1.2. Análisis 5’ RACE 129 3.5.2. Es udio de la unión de N cA a la egion p omo o a del ope ón cox3 131 3.5.2.1. Ensayos de e a do en gel 131 3.5.2.1. Ensayos de p o ección po N cA en e a la deg adación po DNasa I 131 3.6. Es udio de la exp esión del ac o sigma ege a i o SigA du an e la di e enciación de he e ocis os en Anabaena 134 3.6.1. Ánalisis de la exp esión de sigA median e usión con g p 135 3.6.2. Es udio de la unión del egulado N cA a la egión p omo o a del gen sigA 144 4. DISCUSIÓN 85 4.1. Papel de N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional de genes especi ícos del p oceso de di e enciación de he e ocis os. 149 Índice V 4.1.1. Papel de N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional del ag upamien o génico de BCA y el gen he C 151 4.1.2. Papel de N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional en o as egiones p omo o as complejas 155 4.2. Papel de PipX en la ac i ación ansc ipcional de p omo o es dependien es de N cA du an e la di e enciación de he e ocis os. 159 4.3. Ca ac e ización de la egión p omo o a del ope ón cox3 162 4.4. Es udio de la localización espacio- empo al de la exp esión de SigA du an e la di e enciación. 163 5. CONCLUSIONES 141 6. BIBLIOGRAFÍA 169 Se gio Cama go Be nal XII Nm Neomicina ORF Open Reading F ame (pau a de lec u a abie a) p/p elación peso/peso p/ elación peso/ olumen pb Pa de núcleo idos (bases) PCC Colección de cul i os ipo del Ins i u o Pas eu PMSF Fluo u o de enilme ilsul onilo RNA Ácido ibonucleico RNasa Ribonucleasa pm Re oluciones po minu o SDS Lau ilsul a o sódico Sm Es ep omicina Sp Espec inomicina TEMED N, N, N’, N’- e a-me ile ilendiamida TES Ácido N- is(hid oxime il)me il-2-aminoe anosul ónico T icina N- is(hid oxime il)me ilglicina T is T is(hid oxime il)aminoe ano TSP T ansc ip ion s a poin (si io de inicio de la ansc ipción) U Unidad de ac i idad enzimá ica / elación olumen/ olumen X-gal 5-b omo-4-clo o-indolil-"-D-galac opi anósido Bases ni ogenadas A adenosina C ci osina G guanina T imina Aminoácidos A Ala alanina L Leu leucina R A g a ginina K Lys lisina N Asn aspa agina M Me me ionina D Asp ácido aspá ico F Phe enilalanina C Cys cis eína P P o p olina E Glu ácido glu ámico S Se se ina Q Gln glu amina T Th eonina G Gly glicina W T p ip ó ano H His his idina Y Ty i osina I Ile isoleucina V Val alina 1.INTRODUCCIÓN In oducción 3 1.1. REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN EN BACTERIAS Las bac e ias poseen una g an capacidad de adap ación o espues a an e los cambios que se p oducen en el medio ambien e donde és as i en. Es a g an capacidad de adap ación es el esul ado de un p eciso y ápido con ol de la exp esión génica en es os mic oo ganismos. El con ol sob e la exp esión génica puede se eje cido en dis in os ni eles de es e p oceso: a ni el ansc ipcional, de la es abilidad del mRNA, aduccional y pos - aduccional. En las bac e ias, el con ol de la exp esión génica se ealiza undamen almen e a ni el ansc ipcional, ya que es el más económico pa a la célula en é minos ene gé icos. Conc e amen e es en el inicio de es e p oceso donde eside el pun o p incipal de con ol. La ansc ipción del DNA la lle a a cabo la enzima RNA polime asa dependien e de DNA (RNAP), que ca aliza la sín esis de una molécula de RNA, siguiendo la secuencia de una cadena molde de DNA y u ilizando ibonucleó idos i os a o como sus a o, que son unidos median e la o mación de enlaces 5’-3’ os odies e . Es e p oceso comienza en secuencias especí icas de DNA denominadas p omo o es, que indican dónde iene que si ua se la RNAP pa a comenza a ansc ibi . La ansc ipción es un p oceso cíclico que puede di idi se en es e apas undamen ales: Unión de la RNAP al DNA e inicio de la sín esis de la cadena de RNA; elongación de la cadena de RNA y e minación del p oceso. De o ma simpli icada, el p oceso comienza con la in e acción de la RNAP con el p omo o dando luga al complejo ce ado de ansc ipción (RPc, closed RNAP-P omo e complex). A con inuación, iene luga la sepa ación de la doble cadena del DNA, mediada po cambios con o macionales en la enzima RNAP, o mándose el denominado complejo abie o de ansc ipción (RPo, open RNAP-P omo e complex). T as la disociación de la enzima del p omo o , se o ma el complejo e na io de elongación (RNAP-DNA-RNA) que con inua con la elongación del RNA has a que se encuen a con secuencias e minado as en el DNA, que p o ocan la disociación del complejo e na io y la e minación del p oceso de ansc ipción. Se gio Cama go Be nal 4 1.1.1 RNAP bac e iana E. coli cons i uye el modelo más u ilizado pa a el es udio de los p ocesos ansc ipcionales en bac e ias. La RNAP bac e iana cons a de dos componen es: un núcleo (en inglés “co e”) que ca aliza la polime ización y sín esis del RNA y los ac o es sigma que le con ie en a la enzima especi icidad po de e minadas secuencias p omo o as. La es uc u a o mada po el núcleo y el ac o sigma se denomina holoenzima (E#). El núcleo, de ap oximadamen e 400 kDa, es á cons i uido po cua os subunidades dis in as denominadas !, ", "’ y $, con una es equiome ia 2:1:1:1 (Bu guess, 1969). Aunque el núcleo posee oda la maquina ia ca alí ica eque ida pa a sin e iza RNA, sólo la holoenzima puede inicia la ansc ipción en si ios especí icos, ya que el núcleo po sí mismo es incapaz de econoce los p omo o es. La secuencia, es uc u a y unción del núcleo es án conse adas e olu i amen e desde las bac e ias has a el homb e (Swee se e al., 1987; Eb igh , 2000; Da s , 2001; Bo ukho y Nudle , 2003). La RNAP de Esche ichia coli es la mejo ca ac e izada has a la echa, an o gené ica como bioquímicamen e; sin emba go, su es uc u a, de e minada median e mic oscopía c ioelec ónica, ha sido esuel a a una esolución ela i amen e baja, de 15Å (Da s e al., 2002). Las es uc u as c is alinas del núcleo de las RNAP de The mus aqua icus (Taq) y The mus he mophilus (T h) si se han podido esol e con una esolución a ómica de 3.3 Å y 2,6 Å, espec i amen e (Zhang e al., 1999; Vassylye e al., 2002). No obs an e, debido a la g an simili ud en e las RNAP de es os mic oo ganismos, los da os ob enidos de es as es uc u as pueden aplica se a la enzima de E. coli. De acue do con los da os es uc u ales disponibles, las RNAP de Taq y T h compa en una es uc u a gene al con o ma de “pinza de cang ejo” (Fig. 1.1), donde las pinzas supe io e in e io es a ían cons i uidas po las subunidades " y "’, espec i amen e. Cada subunidad ! es á cons i uida po dos dominios, un dominio N- e minal (!-NTD) y un dominio C- e minal (!-CTD) que se unen median e una secuencia de es uc u a lexible (Bla e e al., 1994). Las subunidades " y "’ se unen en su pa e pos e io a los dominios !-NTD del díme o de subunidades !, jugando es os dominios un impo an e papel en el ensamblaje de " y "’ en el co e. Los dominios !-CTD in e accionan con un amplio ango de egulado es ansc ipcionales que pueden uni se a secuencias especí icas de DNA en la egión p omo o a (Haugen e al., 2008). En es a es uc u a, la subunidad $ se dispone odeando la pa e C- e minal de la In oducción 5 subunidad "’. $ es un polipép ido de 91 aminoácidos que no iene un papel di ec o en la ansc ipción y pa ece unciona como una chape ona que asis e al plegamien o de la subunidad "’. En odas las es uc u as es udiadas has a la echa, el espacio in e no dispues o en e las subunidades " y "’ delimi a es canales. Un canal p incipal de 20-27 Å, que acomoda la doble cadena de DNA y la cadena híb ida DNA-RNA, y dos canales meno es de unos 10-12 Å, que se bi u can a pa i del canal p incipal, uno de los cuales unciona como canal de salida pa a la molécula de RNA ecién sin e izada, “canal de salida del RNA” y o o como si io de en ada pa a los NTPs hacia el si io ac i o de la enzima, “canal secunda io”. El cen o ac i o de la enzima, que se localiza en la pa e pos e io del canal p incipal, es á compues o po una iada ca alí ica de esiduos de Asp de la subunidad "’, que es ablecen in e acciones con dos iones Mg2+, que son esenciales al in e eni en la eacción de sín esis de RNA (Zhang e al., 1999; Vassylye e al., 2002; Mu amaki e al., 2002; C ame e al., 2001) (Fig. 1.1). En las holoenzimas de Taq y T h, la subunidad # iene o ma de V y es á pa cialmen e encajada en e las pinzas supe io e in e io en la pa e delan e a (Vassylie e al., 2002; Mu akami e al., 2002). Figu a 1.1. Es uc u a de la RNAP de The mus aqua icus. En la pa e izquie da de la igu a se mues a el co e de la RNAP, y se señalan las dis in as subunidades que lo componen: Subunidades ! (magen a y azul), " (ma ón), "’ ( e de) y $ (g is). También se señalan el canal p incipal de en ada del DNA, en cuya pa e pos e io se puede obse a un ión Mg2+ ( ep esen ado po una es e a oja) cons i uyen e del cen o ca alí ico. A la de echa se mues a cómo se dispone la subunidad # en el co e pa a o ma la holoenzima. Figu a adap ada de Mu akami e al., 2002. ! !' "1 "2 # $ Canal p incipal Cen o ca alí ico Co e Holoenzima (E$70) Se gio Cama go Be nal 6 1.1.1.1 Subunidad sigma La subunidad # iene es unciones p incipales: i) Reconoce secuencias especí icas del p omo o , ii) posiciona co ec amen e la RNAP en el p omo o y iii) acili a la sepa ación de las cadenas de DNA ce ca del si io de inicio de ansc ipción (Wos en, 1998). Los ac o es sigma se pueden clasi ica en dos g andes amilias: ac o es de la amilia #70 y ac o es de la amilia #54. La amilia #70 es á subdi idida en dis in os g upos o sub amilias en base a sus elaciones ilogené icas (Lone o e al., 1992). Así, se puede di e encia en e ac o es sigma de los g upos I, II, III y IV. El g upo I incluye los ac o es sigma p ima ios o ege a i os que es án muy conse ados en secuencia y son esenciales pa a el c ecimien o celula . El g upo II incluye ac o es sigma que son bas an e simila es en secuencia y es uc u a a los del g upo I pe o que no son esenciales. Al g upo III pe enecen los ac o es sigma al e na i os, que no se pa ecen ni en secuencia ni en es uc u a a los ac o es sigma an e io es, econociendo p omo o es con es uc u a di e en e, que ecuen emen e es án elacionados con p ocesos especí icos, como son las espues as gene ales a es és, mo ilidad, choque é mico y espo ulación. Po úl imo, los ac o es sigma del g upo IV, an e io men e conocidos como ECF (ex acy oplasmic unc ion), se encuen an ampliamen e ep esen ados en muchas bac e ias y cons i uyen las subunidades sigma más pequeñas encon adas has a la echa. En E. coli se pueden exp esa has a sie e ac o es sigma di e en es. La holoenzima asociada al ac o sigma ege a i o o p ima io, #70, (E#70) ansc ibe la mayo ía de los genes pa a el man enimien o de la célula du an e la ase de c ecimien o exponencial. El es o de ac o es sigma se unen al núcleo en si uaciones especiales o conc e as, pa a o ma dis in as holoenzimas que econocen dis in os ipos de p omo o es (Lone o e al., 1992; Wos en, 1998) que an a di igi la exp esión de cie os genes que deben se exp esados en ci cuns ancias conc e as. Los miemb os de la amilia #70 del g upo I son homólogos al ac o sigma p incipal de E. coli y B. sub ilis y p esen an cua o dominios helicoidales muy conse ados (#1.1, #2, #3 y #4) conec ados po egiones de unión lexibles (Malho a e al., 1996; Campbell e al., 2002; Mu akami e al., 2002). Es os dominios p esen an, a su ez, egiones al amen e conse adas, denominadas: egiones 1.1, 1.2-2.4, 3.0-3.1, y 4.1-4.2, siendo la egión 3.2 la que conec a los dominios #3 y #4 (G ube y G oss, 2003). La egión 1.1, que oda ía no se ha podido c is aliza , pa ece que in e iene en el In oducción 7 p oceso de au oinhibición del econocimien o del p omo o po la subunidad sigma en es ado lib e, jugando ambién un papel impo an e en la o mación del complejo abie o (Mu akami e al., 2002). La egión 2.4 pa icipa en el econocimien o de una de las secuencias conse adas en el p omo o , el hexáme o -10. La egión 2.3 juega un papel undamen al en la sepa ación de la doble hélice de DNA y en la es abilización de la bu buja ansc ipcional al inicio del p oceso de ansc ipción (Aiya e al., 1994), mien as que la egión 4.2 in e acciona con el de e minan e o hexáme o -35 del p omo o . 1.1.2. P omo o es de E. coli Un p omo o es una egión de DNA que de e mina el inicio de ansc ipción de un gen de e minado, que iene luga median e la in e acción de la RNAP con de e minan es o secuencias especí icas de dichas egiones. En e los p omo o es dependien es de E#70 se puede di e encia en e p omo o es basales y p omo o es egulados. 1.1.2.1 P omo o es basales El inicio de la ansc ipción desde es e ipo de p omo o es sólo equie e la in e acción de la RNAP con el DNA de la egión p omo o a, sin que sea necesa ia la pa icipación de ninguna o a p o eína egulado a. En la secuencia de DNA de es e ipo de p omo o es se han iden i icado cua o elemen os di e en es. Los dos elemen os p incipales son dos hexáme os muy conse ados denominados cajas -10 y -35. El hexáme o o caja -10 posee una secuencia consenso y una posición conc e a con espec o al si io de inicio de la ansc ipción o TSP (del inglés, T ansc ip ional S a poin ) -12TATAAT-7, mien as que el consenso y posición del hexáme o -35 es -35TTGACA-30, donde los nucleó idos TTG es án conse ados en un 90% de los casos en es e de e minan e (Hawley y McClu e, 1983; Ha ley y Reynols, 1987) . El espaciamien o en e es os dos hexáme os ambién es á muy conse ado, y consis e en una secuencia no especí ica que oscila en e 16-18 pb (pa es de bases), siendo 17 pb la dis ancia óp ima. En la mayo ía de los p omo o es es udiados, la ansc ipción comienza en una pu ina localizada 7-8 pb po de ás de la caja -10 (Hawley y McClu e, 1983; Ha ley y Reynols, 1987). El elemen o -10 es econocido po la egión 2.4 de la subunidad # de la RNAP, mien as que el de e mina e -35 es econocido po la egión 4.2 de # (Fig. 1.2). Además de es os dos elemen os undamen ales, en algunos p omo o es basales ambién exis en Se gio Cama go Be nal 8 o os dos elemen os complemen a ios, denominados egión -10 ex endida y elemen o UP. La egión -10 ex endida consis e en un dinucleó ido 5’-TG-3’, que p ecede al hexáme o -10, en las posiciones -14 y -15, y es econocido po la egión 3.0 de la subunidad # (Fig. 1.2) (Keil y y Rosenbe g, 1987; Kuma e al., 1993). Los p omo o es que po an una caja -10 ex endida ecuen emen e ca ecen de un elemen o -35 disce nible, de mane a que hay una in e acción de la RNAP con el dinucleó ido TG (Ba ne e al., 1997). Algunos p omo o es de E. coli ambién poseen, delan e del de e minan e -35, un elemen o UP, que es una secuencia ica en nucleó idos AT que se dispone en e las posiciones -40 y -60 y acili a con ac os ex as con los dominios !-CTD de las subunidades ! (Fig. 1.2), pudiendo aumen a la e icacia de la ansc ipción en dos o denes de magni ud (Ross e al., 1993; Es em e al., 1998). La ocu encia de es os elemen os en las egiones p omo o as, así como la a iabilidad con espec o al consenso es ablecido pa a es os elemen os, de e mina po sí misma una egulación in ínseca de la e icacia de los dis in os p omo o es. Figu a 1.2. Esquema de las in e acciones de la RNAP en p omo o es basales. El modelo ep esen ado se basa en los di e en es es udios c is alog á icos de la holoenzima RNAP asociada con el DNA. Los dominios !-NTD y !-CTD se conec an a a és de un dominio de unión o b azo lexible. En la subunidad # se señalan los cua o dominios. Se ep esen a la in e acción de los dominios de # con las secuencias consenso de los de e minan es -35 (TTGACA), caja -10 ex endida (TGn) y caja -10 (TATAAT), así como la de los dominios !-CTD de las subunidades ! con el elemen o UP. Figu a adap ada de B owning y Busby, 2004. 1.1.2.2 P omo o es egulados Un gen cuya egión p omo o a posea elemen os que ep oduzcan ielmen e las secuencias consenso an e io men e desc i as end ía una exp esión ele ada en odo momen o. La ealidad es que la mayo ía de los genes poseen de e minan es o elemen os impe ec os o alejados de la secuencia consenso, exp esándose po debajo de su ni el !’ "4 "3 "2 "1 #-NTD #-CTD -10 -35 TATAAT TGn TTGACA Elemen o UP +1 ! In oducción 9 óp imo y a eces equi iendo la pa icipación de egulado es ansc ipcionales. Los p omo o es egulados poseen un si io de unión pa a la RNAP y uno o mas si ios pa a la unión de egulado es ansc ipcionales, que pueden ac ua ac i ando o ep imiendo el inicio del p oceso de ansc ipción. En la mayo ía de los casos es udiados, los ac i ado es ansc ipcionales se unen al DNA en una posición p óxima al hexáme o -35, pudiendo con ac a con la(s) subunidad(es) ! y/o # de la RNAP. También se pueden uni en posiciones más alejadas del de e minan e -35, ya que la egión lexible que conec a los dominios !-NTD y !-CTD pe mi en el con ac o de la RNAP con el egulado en es as posiciones más alejadas (Mu akami e al., 1997). También se han encon ado ac i ado es ansc ipcionales que pueden uni se en posiciones lo su icien emen e alejadas del hexáme o -35 como pa a que la subunidad ! no pueda es ablece con ac os con los mismos. En es e caso se equie e de la in e ención de una segunda p o eína que medie el con ac o en e el ac i ado y la RNAP. El si io de unión del ac i ado nunca coincide con el de e minan e -10, ya que es o impedi ía la o mación del complejo abie o (Collado-Vides e al., 1991). La mayo ía de los p omo o es que p esen an un si io de unión pa a un ac i ado mues an una caja -35 muy poco conse ada con espec o al consenso, de o ma que en ausencia del ac i ado no iene luga la ansc ipción, o iene luga a un ni el muy bajo. Los ep eso es ansc ipcionales ienen un e ec o nega i o sob e la ansc ipción, impidiendo la o mación del complejo ce ado, la del complejo abie o, o bien di icul ando las p ime as e apas de la elongación. Pa a ello, el ep eso se une al DNA en un si io si uado no malmen e en e los de e minan es -35 y -10 o, en algunas ocasiones, en posiciones más alejadas del si io de unión de la RNAP (Collado-Vides e al., 1991). En muchas ocasiones un mismo egulado ansc ipcional puede ac ua como ac i ado o ep eso de la ansc ipción, dependiendo de la posición en la que és e se una al p omo o (B owning y Busby, 2004; Pe ez-Rueda y Collado-Vides, 2000). Se gio Cama go Be nal 16 Es udios ilogené icos ealizados median e la compa ación de secuencias de los RNA 16S de las es i pes más ep esen a i as de es os g upos axonómicos indica on que sólo las Secciones II (compa en la isión múl iple) y las secciones IV y V conjun amen e (exhiben p ocesos de di e enciación celula ) son g upos ilogené icamen e cohe en es, mien as que las secciones I y III ag upan mo o ipos con di e en es posiciones ilogené icas (Gio annoni e al., 1988). A pesa de la u ilidad de es a clasi icación adicional, aún igen e, los es udios de ilogenia molecula más ecien es mues an que quizás ninguna de es as secciones cons i uyan g upos mono ilé icos (Gio annoni e al., 1988; Gugge y Ho mann, 2004), y que du an e la his o ia e olu i a del g upo se han p oducido dis in as ansiciones en e la unicelula idad y la mul icelula idad (Schi meis e e al., 2011). Debido a que en los es udios ilogené icos an e io es las es i pes unicelula es de la sección I es aban más ep esen adas que las de o as secciones, ecien emen e se han incluido 54 genomas de es i pes que cub ían las cinco secciones (Shih e al., 2013). En es os es udios se clasi ica a las cianobac e ias en 7 clados p incipales, poniéndose de mani ies o que la capacidad de o ma ilamen os y la di isión celula en a ios planos apa ecen en múl iples momen os e independien emen e a lo la go de la e olución del g upo. Además el clado B1, que comp ende a las cianobac e ias o mado as de he e ocis os (secciones IV y V), pa ece cons i ui un e dade o g upo mono ilé ico, compa iendo sus miemb os la posesión de un g upo de p o eínas especí icas del p oceso de di e enciación de he e ocis os (Shi e al., 2013). En con as e con su di e sidad mo ológica, las cianobac e ias cons i uyen un g upo muy homogéneo desde el pun o de is a me abólico. La g an mayo ía de las es i pes conocidas son o oau ó o as ae óbicas (Ze h e al., 2008), ealizando la o osín esis oxigénica y sólo algunas como Oscilla o ia limne ica, en de e minadas condiciones, ealizan una o osín esis anoxigénica oxidando SH2 y libe ando S. La ijación del ca bono la ealizan median e la ía educ i a de las pen osas os a o o ciclo de Cal in-Benson. Pa e del CO2 ijado se acumula en o ma de glucógeno, que se u iliza como ma e ial de ese a y se deg ada en condiciones de oscu idad, cuando no se ealiza la o osín esis. Pa a el me abolismo espi a o io, que se ealiza p incipalmen e en condiciones de oscu idad, u ilizan la ía oxida i a de las pen osas os a o. Dado que ca ecen de la enzima 2-oxoglu a a o deshid ogenasa (S anie y Cohen-Bazi e, 1977), el ciclo de K ebs iene una unción anabólica, suminis ando el 2-OG necesa io pa a la In oducción 17 inco po ación del ni ógeno ino gánico en esquele os ca bonados, la sín esis de aminoácidos de la amilia del glu ama o y la sín esis de %-aminole ulina o, que es un p ecu so inmedia o pa a la sín esis de po i inas, icobilinas y clo o ila (Beale, 1994). Algunas cianobac e ias son capaces ambién de asimila de e minados azúca es como la saca osa, glucosa o uc osa, necesi ando o no iluminación pa a ello, po lo que pueden clasi ica se como o ohe e ó o as o he e ó o as acul a i as, espec i amen e. Es a capacidad depende, al menos en pa e, de la exis encia de pe measas especí icas que acili an la en ada de los azúca es en la célula. La cianobac e ia en la que se ha cen ado es e abajo es la es i pe ilamen osa Anabaena sp. PCC 7120, pe enecien e a la sección IV de la clasi icación de Rippka e al., (1979). 1.2.2. Asimilación del ni ógeno 1.2.2.1. Fijación de ni ógeno La ijación biológica del ni ógeno consis e en la educción de una molécula de dini ógeno (N2) a dos moléculas de amoniaco (NH3) según la siguien e eacción: Es a eacción es muy ende gónica, necesi ándose un minimo de 16 moles de ATP po mol de N2 educido y consumiendo pode educ o (8e- po cada mol de N2 ijado), es ando ca alizada po el complejo enzimá ico de la ni ogenasa. El complejo enzimá ico de la ni ogenasa es á o mado po dos componen es p o eicos: la dini ogenasa (p o eína que con iene Fe y Mo) y la dini ogenasa educ asa (p o eína que con iene Fe). La dini ogenasa es un he e o e áme o compues o po dos subunidades ! y dos subunidades " de e minadas po los genes ni D y ni K, espec i amen e, y iene un peso molecula de unos 220-240 kDa; con iene cua o cen os [4Fe-4S] o ganizados como dos “ag upamien os P” (Dean e al., 1993) y dos co ac o es Fe-Mo-Co. La dini ogenasa educ asa es un díme o compues o po dos subunidades idén icas, de e minadas po el gen ni H, con una masa molecula ap oximada de 60-70 kDa y un cen o [4Fe-4S] (Rubio y Ludden, 2008). La dini ogenasa educ asa media la ans e encia, dependien e de ATP, de elec ones !"#$%&$#$#%'(#$)*#+,-###########################"!&.#$#&"#$#)*#+/-#)*#-0# !"#$%&'!()(* Se gio Cama go Be nal 18 p oceden es de donado es isiológicos ex e nos como la e edoxina o la la odoxina a los cen os sul o é icos de la dini ogenasa, que une N2 median e el co ac o Fe-Mo-Co y ca aliza su educción a NH3. La ijación del N2 a siemp e acompañada po una educción de p o ones (H+) y la consiguien e o mación de H2 (Fay, 1992). Pa e de la ene gía y el pode educ o empleados en la educción de H+ se ecupe an median e la acción de hid ogenasas. Una de es as hid ogenasas, denominada hid ogenasa de consumo, de e minada po los genes hupL y hupS (Tamagnini e al., 2002), ca aliza la eacción de oxidación de H2 a H+, di igiendo los elec ones esul an es a las cadenas de anspo e de elec ones espi a o ia y o osin é ica pe mi iendo gene a ATP y pode educ o . Los genes de la ijación del ni ógeno, genes ni , no malmen e es án ag upados en el c omosoma bac e iano. Los genes ni es uc u ales, ni H, ni D y ni K es án conse ados en odas las especies de mic oo ganismos ijado es es udiados. Además de los genes es uc u ales, exis en o os genes ni que p esen an mayo a iabilidad en e los dis in os mic oo ganismos, eniendo la g an mayo ía de ellos una unción egulado a, o bien pa icipando en la sín esis de los dis in os co ac o es de la ni ogenasa. En Anabaena sp. PCC 7120 y Synechococcus sp. RF-1 se han ca ac e iazado 15 genes que es án localizados en un solo ag upamien o y o ganizados en 6 unidades ansc ipcionales: ni B- dxN-ni S-ni U, ni HDK, ni EN, ni X-o 2, ni W-hesA-hesB y dxH (He e o e al., 2001; Haselko n y Buikema, 1992; Huang e al., 1999). En Anabaena sp. PCC 7120 se han encon ado además, en o as posiciones del c omosoma, los genes ni V, ni Z y ni T (Böhme, 1998). La ni ogenasa es una enzima ex emadamen e sensible al oxígeno; de hecho, sus dos componen es se inac i an ápidamen e cuando se ex aen de las células en p esencia de O2 (Robson y Pos ga e, 1980). Debido a es a sensibilidad al O2, los dis in os mic oo ganismos capaces de ija ni ógeno a mos é ico han desa ollado mecanismos pa a p o ege es e complejo enzimá ico. Aunque el mecanismo y la maquina ia de ijación de N2 es común en casi odos los mic oo ganismos ijado es, los mecanismos de p o ección en e al O2 sí a ían en e los dis in os ijado es de N2, siendo las cianobac e ias las que despliegan o mues an un epe o io de mecanismos de p o ección más complejo y egulado, debido a que necesi an p o ege se no solo del O2 ex e no, sino ambién del que se libe a en el p oceso de o osín esis. La es a egia más común en las cianobac e ias no o mado as de he e ocis os consis e en una sepa ación empo al de ambos p ocesos, exp esando la ac i idad ni ogenasa cuando es án en In oducción 19 oscu idad y desa ollando o osín esis oxígenica cuando se exponen a la luz (Fay, 1992). La o a g an línea es a égica, seguida po cianobac e ias ilamen osas o mado as de he e ocis os, como la de los géne os Nos oc y Anabaena, consis e en sepa a espacialmen e ambos p ocesos implicando mul icelula idad y di e enciación celula . 1.2.2.2. Con ol po ni ógeno en cianobac e ias El ni ógeno cons i uye uno de los bioelemen os cuan i a i a y cuali a i amen e más impo an es, que se inco po a a la Bios e a median e dis in os p ocesos asimila o ios lle ados a cabo po mic oo ganismos y plan as. En los mic oo ganismos que asimilan dis in as uen es de ni ógeno se p oduce un enómeno ampliamen e obse ado denominado con ol po ni ógeno, que consis e en la ep esión de las ías de asimilación de algunas uen es de ni ógeno cuando o as, más ácilmen e asimilables, es án disponibles pa a las células (Me ick y Edwa ds, 1995). En cianobac e ias, las uen es de ni ógeno más comúnmen e u ilizadas son el amonio, el ni a o, la u ea y el dini ógeno (Flo es y He e o, 1994), siendo el amonio el nu ien e ni ogenado p e e ido (He e o e al., 2001). También algunas cianobac e ias pueden u iliza como uen e de ni ógeno algunos aminoácidos como la glu amina y la a ginina pa a cub i sus necesidades me abólicas (Flo es y He e o, 1994). La asimilación de es as sus ancias exige su inco po ación al in e i o celula y su pos e io me abolización pa a gene a amonio, que es el compues o ni ogenado ino gánico que se inco po a a esquele os ca bonados pa a da luga a compues os o gánicos ni ogenados. La inco po ación del amonio a esquele os ca bonados se ealiza undamen almen e median e el ciclo de la glu amina sin e asa-glu ama o sin asa, GS-GOGAT (Wolk e al., 1976; Meeks e al., 1978; Flo es y He e o, 1994), el cual cons i uye la conexión en e el me abolismo del ca bono y el ni ógeno (Figu a 1.5). En es e ciclo, el p ime paso lo ealiza la enzima GS, que ca aliza la inco po ación dependien e de ATP de amonio a una molécula de glu ama o pa a gene a glu amina, mien as que el segundo lo lle a a cabo la GOGAT, que ca aliza la ans e encia del g upo amido de la Gln a una mólecula de 2-OG p oduciendose dos moléculas de glu ama o, en una eacción que equie e pode educ o (Van den Heu el e al., 2004). En cianobac e ias, la asimilación de ni ógeno es á egulada en unción de la uen e de ni ógeno disponible y en unción del Ci (ca bono ino gánico) disponible. Debido a la Se gio Cama go Be nal 20 al a de 2-OG deshid ogenasa, la sín esis de 2-OG ep esen a el paso inal de es a ama oxida i a del ciclo de K ebs, siendo el ciclo GS-GOGAT la p incipal ía de u ilización de es e compues o. De es a o ma, los ni eles de 2-OG dependen del lujo de asimilación de ni ógeno y de ca bono (He e o e al., 2001), siendo el 2-OG un me aboli o senso de los ni eles C/N en la célula (Fo chhamme , 1999; 2004; He e o e al., 2004; Luque y Fo chhamme , 2008) (Fig. 1.5). Figu a 1.5. Esquema de las p incipales ías de asimilación del ni ógeno en las cianobac e ias y su conexión con el me abolismo del ca bono a a es del ciclo GS-GOGAT. Las dis in as uen es de ni ógeno se inco po an a la célula en algunos casos a a és de pe measas, y son me abolizadas pa a gene a amonio, que se inco po a a esquele os ca bonodos a a és del ciclo GS-GOGAT. En Anabaena sp. PCC 7120 la ni ogenasa sólo es á p esen e en los he e ocis os, donde iene luga la ijación de dini ógeno (Figu a adap ada de Flo es y He e o, 2005). N P, anspo ado monocomponen e de ni a o/ni i o; N , anspo ado de ipo ABC de ni a o/ni í o; Cyn, anspo ado de ipo ABC de ciana o/ni i o; U , anspo ado de ipo ABC de u ea; Am , pe measa de amonio; N-I, anspo ado de ipo ABC de aminoácidos neu os e hid o óbicos; Bg , anspo ado de ipo ABC de aminoácidos básicos; N-II, anspo ado de aminoácidos ácidos y neu os pola es; Na , ni a o educ asa; Ni , ni i o educ asa; GS, glu amina sin e asa; GOGAT, glu ama o sin asa; 2-OG, 2 oxoglu a a o. En cianobac e ias el con ol po ni ógeno se ealiza undamen almen e a a és de dos p o einas senso as del 2-OG, el egulado ansc ipcional denominado N cA ( e apa ado 1.2.2.1) y una p o eína ipo PII, GlnB. Así, la p ime a espues a de las cianobac e ias al de ici de ni ógeno (pe cibido en p ime a ins ancia como un inc emen o de los ni eles de 2-OG) es ac i a genes dependien es del egulado N cA que es an implicados en la asimilación de o as uen es de ni ógeno, como los genes del ope ón ni (p o eínas de asimilación de ni a o) y genes am ( aspo ado es de amonio). !"#$% !"&$% !"#$% !"&$% !"&$% !"#$ '()*% !%&'$ !(#$ )#*"+"$ !,$ !-.#/0*1"+"$ !#.$ !#.2$ 341$ )#.$ 56.$!%&'$ 56(1/78(9/+$ !:-$!:--$;0.$ +,-% +,.% 3(8</$$$$$$$ =>:=?=5@$ =>$ 3(8</$9*$ 3"<A(1$ ,:?=$ =<1$ =<B$ 3?,$ =?=5@$ In oducción 21 Además, en cianobac e ias ilamen osas o mado as de he e ocis os, N cA in e iene en el p oceso de di e enciación de he e ocis os (aspec o que se á a ado en el apa ado 1.2.5.1). Las p o einas de ipo PII cons i uyen una de las amilias de p o eínas ansduc o as de señales más ampliamen e dis ibuida en la na u aleza, encon ándose ep esen ada en bac e ias, a cheas y plan as y juegando un papel muy impo an e en la moni o ización del es ado ni ogenado y del balance C/N celula (Fo chhamme , 2004). La p o eína PII se iden i icó en Synechococcus sp. PCC 6301 y sus p incipales p opiedades bioquímicas se de e mina on en Synechococcus sp. PCC 7942. PII es un homo íme o compues o po subunidades cuyo peso molecula oscila en e 12 y 13 kDa, y cada subunidad posee un si io de unión pa a una molécula de ATP o ADP y o o si io de unión pa a una molécula de 2-OG. ATP y ADP compi en po el mismo si io, eniendo el ATP mayo a inidad po el úl imo (Fokina e al., 2010). La unión de ATP y 2-OG es siné gica (Fo chhamme e al., 1997). Además, en cianobac e ias es a p o eína ambién se egula po os o ilación (Fo chhamme e al., 2004 y 2008). PII ac úa in e accionando con dis in as dianas p o eicas, ac i ando o ep imiendo algunos p ocesos en unción del es ado ni ogenado celula . En cianobac e ias se han iden i icado es p ocesos en los que PII ac ua ía como egulado : el anspo e de ni a o y ni i o, la biosín esis de a ginina y la exp esión de genes dependien es de N cA (Luque y Fo chhamme , 2008). Exis en in e acciones egulado as complejas en e PII y N cA. En Synechococcus, N cA egula los ni eles ansc ipcionales y pos - aduccionales de PII (Lee e al., 1999; Saue e al., 1999). Además, PII se equie e pa a es imula la ac i idad de N cA bajo condiciones de limi ación de ni ógeno (Aldehni e al., 2003; Paz-Yepes e al., 2003). Además, en Synechococcus sp. PCC 7942 se ha desc i o una p o eína pequeña que in e acciona ísicamen e con PII, denominada PipX (PII in e ac ion p o ein X). Median e ensayos de doble híb ido y “Su ace Plasmon Resonance” se ha desc i o que PipX in e acciona ambién con N cA (Espinosa e al., 2006). En base a es o y a una cie a disminución de los ni eles de exp esión de algunos genes egulados po N cA en mu an es pipX, se había p opues o que la p o eína PipX se ía un coac i ado de N cA (Espinosa e al., 2006). P II se une a PipX en su es ado des os o ilado. Du an e la ealización de es e abajo se han publicado dos es uc u as c is alog á icas de los complejos PipX-PII y PipX-N cA (Lláce e al., 2010; Zhao e al., 2010). Se gio Cama go Be nal 22 1.2.2.3. El egulado ansc ipcional N cA N cA (del inglés Ni ogen Con ol) es una p o eína de unos 222 aminoácidos con una dis ibución uni e sal en cianobac e ias (F ías e al., 1993) que pe enece a la amilia de egulado es ansc ipcionales CRP. El gen n cA se clonó po p ime a ez de Synechococcus sp. PCC 7942 y, al igual que o os egulado es de la amilia CRP, N cA p esen a un dominio HTH de unión al DNA en su ex emo ca boxilo e minal (Vega- Palas e al., 1990; He e o e al., 2001) y se compo a como un díme o en disolución (Wisén e al., 1999). N cA eje ce su acción sob e la exp esión de los genes a los que egula median e in e acción con la egión p omo o a de los mismos, uniéndose al DNA en si ios de secuencia especí ica que con ienen el consenso GTAN8TAC (Luque e al., 1994). Es a secuencia palind ómica es á muy conse ada, siendo los dos nucleó idos ex e nos de cada iple e (sub ayados) los más impo an es (Luque e al., 1994; Ramasub amanian e al., 1994; Vázquez-Be múdez e al., 2002a). Se ha de e minado además que la p esencia de los nucleó idos C y A si uados espec i amen e en las posiciones segunda y e ce a as el iple e GTA, así como la p esencia de Ts o As lanqueando la secuencia consenso, a o ecen la unión de N cA (He e o e al., 2001). En ensayos ealizados in i o se ha obse ado que la unión de N cA a sus secuencias diana en el DNA aumen a po la in e acción con el 2-OG, si bien N cA puede uni se a es as secuencias con meno a inidad en ausencia de es e me aboli o (Vázquez-Be múdez e al., 2002b; Tanigawa e al., 2002). Du an e la ealización de es e abajo se ha esuel o la es uc u a c is alog á ica de N cA de Anabaena sp. PCC 7120 en p esencia o ausencia de 2-OG en (Zhao e al., 2010) (Fig. 1.6). Al igual que CRP, N cA unciona como un díme o, en el que cada monóme o posee una egión N- e minal con un dominio EBD (E ec o Binding Domain) o dominio de unión a e ec o y una egión C- e minal con un dominio HTH de unión a DNA conec ados po una g an hélice (hélice C o !3) (Luque e al., 1994; Zhao e al., 2010). El 2-OG se une en una egión con o ma de bolsillo del dominio EBD, esul ando en una cambio de con o mación en el díme o, de o ma que las dos helices C (una de cada monóme o) se ap oximan, adqui iendo una con o mación coiled-coil. Es e ap oximación de las hélices C p o oca un cambio con o macional, de mane a que la es uc u a del díme o se uel e más compac a y los dos dominios HTH de unión al DNA se disponen más p óximos y adop an una o ien ación que a o ece la in e acción con el su co mayo del DNA (Zhao e al., 2010). A di e encia de CRP, que no es capaz In oducción 23 de uni se al DNA en ausencia de AMPc (su e ec o ), la es uc u a apo-N cA (sin uni 2-OG) es más pe misi a con la unión al DNA (Zhao e al., 2010), con i mando los esul ados an e io men e ob enidos median e ensayos de unión in i o (Olmedo-Ve d e al., 2008). El es udio compa a i o de los p omo o es de genes di ec amen e ac i ados po N cA ha pe mi ido de e mina una es uc u a consenso pa a los mismos, que se ha denominado p omo o canónico ac i ado po N cA. És e se compone de un si io de unión de N cA cen ado ap oximadamen e en la posición -41.5 con espec o al si io de inicio de la ansc ipción, sepa ado po unos 22 nucleó idos de una caja o de e minan e -10 de secuencia consenso TAN3T, secuencia muy simila a la econocida po la RNAP unida al ac o #70 en E. coli. Po an o, es a es uc u a de p omo o se ajus a a la de los p omo o es bac e ianos egulados de clase II, en los que el si io de unión del ac i ado se encuen a solapando con, o eemplazando, al de e minan e -35 (He e o e al., 2001; B owning y Busby, 2004). N cA ambién puede ac ua como ep eso de la exp esión de de e minados genes. En es os casos el si io de unión de N cA bloquea la unión de la RNAP, solapando en onces con la caja -10 o con el TSP, o encon ándose después del TSP (He e o e al., 2001). Figu a 1.6. Es uc u a del homodíme o de N cA en su o ma apo-N cA y N cA-2OG. En la pa e izquie da se ep esen a la es uc u a de apo-N cA, con sus dos subunidades en colo es na anja y iole a. Se señalan con lechas las helices-C y hélices-F de los dominios hélice- uel a-hélice. La unión de dos moleculas de 2-OG al homodíme o p oduce un cambio con o macional, de mane a que en el complejo N cA-2OG, las subunidades, ep esen adas en colo cian y osa, se disponen en una es uc u a más compac a (pa e de echa), que se une con mayo a inidad al DNA. Figu a adap ada de Zhao e al., 2010. N cA no sólo eje ce el con ol po ni ógeno en cianobac e ias, sino que ambién egula o os genes que in e ienen en el me abolismo del ca bono, la o osín esis y !"#$% Apo-N cA N cA-2-OG Helices F Helices C Se gio Cama go Be nal 24 espues as a es és (He e o e al., 2001), conside ándose ac ualmen e como un egulado global de cianobac e iano (Picossi e al., 2014). 1.2.3. El He e ocis o Los he e ocis os son células e minalmen e di e enciadas, al amen e especializadas en la ijación de ni ógeno a mos é ico bajo condiciones óxicas, en las que se albe ga el sis ema de ijación de ni ógeno, p o egido an o del oxígeno a mos é ico como del gene ado po la p opia cianobac e ia median e el p oceso de o osín esis oxigénica. Du an e el p oceso de di e enciación de he e ocis os, las células pie den la capacidad de di isión y se p oducen una se ie de cambios an o a ni el mo ológico y es uc u al como a ni el me abólico, que an a dis ingui al he e ocis o de la célula ege a i a de la que p ocede (Haselko n, 1978; Wolk e al., 1994; He e o e al., 2004). A di e encia de o os ipos de células di e enciadas como las espo as y los akine os que pe mi en la supe i encia de la célula en condiciones des a o ables a a és de una disminución de su me abolismo o es ado de la encia, los he e ocis os p esen an un me abolismo muy ac i o, cuya unción p incipal es p opo ciona ni ógeno combinado al es o de células del ilamen o (Wolk e al., 1994). La elación que se es ablece en e los he e ocis os y las células ege a i as es mu ualis a, de o ma que los he e ocis os p opo cionan ni ógeno ijado a es ás, mien as que las células ege a i as lle an a cabo la ijación o osin é ica del CO2 y p opo cionan a los he e ocis os compues os educidos de ca bono. 1.2.3.1. Es uc u a del he e ocis o En e las adap aciones es uc u ales que p esen a el he e ocis o des acan la o mación de una g uesa en uel a que se deposi a sob e la pa ed celula G am nega i a que poseen las cianobac e ias. Es a en uel a di icul a la di usión de gases, disminuyendo la en ada del oxígeno ex acelula (Mu y y Wolk, 1989). La en uel a de los he e ocis os es á o mada po dos capas (Figu a 1.7 b). La capa más in e na, o capa laminada, es á o mada undamen almen e po glicolípidos especí icos de es e ipo celula , que consis en en de i ados de hexosas con la gas cadenas de polihid oxialcoholes (Winkenbach e al., 1972; Fay, 1992). Es a capa, que odea al he e ocis o excep o po las zonas de unión con las células ege a i as, In oducción 25 cons i uye una ba e a en e a la di usión de gases. La capa ex e na, o capa homogénea, es a o mada po polisacá idos especí icos, cuya unción es p o ege de daños ísicos a los glicolípidos de la capa in e na (Ca demil y Wolk, 1979; Mu y y Wolk, 1989). Se ha demos ado que la en uel a que p esen an los he e ocis os, especialmen e la capa de glicolípidos, puede a ia en g oso dependiendo de la concen ación de oxígeno ex acelula (Kanga ha alingam e al., 1992). Pa a educi la di usión de oxígeno en e las células ege a i as y los he e ocis os, el con ac o en e los dos ipos celula es es mínimo, p oduciéndose a a és de un sep o muy es echo y di e enciado, en el que la en uel a da luga a una especie de canal (Lang y Fay, 1971; Giddings y S aehelin, 1978, 1981) (Figu a 1.7 a). Dada la g an simili ud en e las moléculas de O2 y N2, la en uel a del he e ocis o debe p opo ciona el g ado de pe meabilidad adecuado pa a asegu a que la concen ación de N2 en el ci oplama sea su icien e pa a el p oceso de ijación, pe o que la can idad de O2 que en e sea lo su icien emen e baja como pa a pode se consumida po la ac i idad espi a o ia, de o ma que su ni el in acelula sea mínimo (Walsby, 1985). Al e na i amen e, se ha p opues o que la pa ed del he e ocis o pod ía se muy impe meable a odos los gases en gene al, y que el ni ógeno molecula pod ía en a desde las células ege a i as adyacen es, exclusi amen e a a es de los sep os, median e un mecanismo egulado (Walsby, 2007). O a adap ación es uc u al impo an e del he e ocis o es la eo ganización de las memb anas in aci oplasmá icas. La dis ibución concén ica y pe i é ica, ípica de las memb anas ilacoidales de las células ege a i as desapa ece pa a da paso a un sis ema de memb anas más e iculado que se localiza p óximo al sep o (Wildon y Me ce , 1963; Lang, 1965; Lang y Fay, 1971; Fay, 1992) (Figu a 1.7 a), cons i uyendo la egión denominada “honeycomb” (en panal) (Lang y Fay, 1971), que posee una al a concen ación de enzimas espi a o ias (Mu y e al., 1981). Los he e ocis os p esen an dos g ánulos pola es isibles al mic oscopio óp ico, localizados p óximos a los sep os de unión con las células ege a i as, que es án cons i uidos po ciano icina (She man e al., 2000). La ciano icina es un políme o de al o peso molecula y de sín esis no ibosómica o mado po can idades equimola es de Asp y A g. Debido a su conspicua p esencia en los polos del he e ocis o, se ha suge ido que es e políme o pod ía ac ua como una ese a dinámica de ni ógeno (Ca , 1988; Macke as e al., 1990). Se gio Cama go Be nal 32 del p omo o . También se conse a un esiduo de eonina que en E.coli in e acciona con la secuencia -10 (B ahamsha y Haselko n, 1991). A pesa de la g an simili ud en e la RNAP de cianobac e ias y la de E. coli, deben de exis i di e encias en cuan o a la especi icad en el econocimien o de p omo o es, ya que los p omo o es cianobac e ianos son u ilizados más e icazmen e po la RNAP cianobac e iana que po la enzima de E. coli (Schneide e al., 1991). Al compa a dis in os p omo o es ege a i os de cianobac e ias, se puede obse a que és os se des ían algo del consenso en los de e minan es -10 y -35. Además, como se a a á más adelan e en el apa ado 1.2.5.3, algunos p omo o es que di igen la exp esión de genes especí icos del p oceso de di e enciación de he e ocis os no poseen el de e minan e -35, y sólo p esen an un de e minan e -10, cuya secuencia a eces se des ía bas an e del consenso es ablecido pa a E. coli. Todo ello pe mi e pensa en la exis encia de exclusi os mecanismos de egulación de la ansc ipción du an e es e p oceso. 1.2.5. Regulación de la exp esión génica du an e la di e enciación de los he e ocis os Desde hace iempo se había obse ado que cie as p o eínas se exp esan exclusi amen e en he e ocis os, o as sólo se exp esan en células ege a i as, mien as que o as se exp esaban en ambos ipos celula es (Fleming y Haselko n, 1974). Pos e io men e se obse ó que cie os genes sólo se exp esaban en de e minados ipos celula es. De es a o ma, algunos como los del ope ón ni HDK, sólo se exp esan en he e ocis os madu os (Elhai y Wolk, 1990), o os como los del ope ón bcXLS sólo se exp esan ac i amen e en células ege a i as (Elhai y Wolk, 1990), mien as que o os como el gen glnA se exp esan en ambos ipos celula es (Schneide e al., 1987; F ías e al., 1994; Vallada es e al., 2004). Todo ello lle ó a la idea de que la egulación de la exp esión génica du an e es e p oceso de di e enciación de los he e ocis os, ocu ía p incipalmen e a ni el ansc ipcional (Wolk e al., 1994). En Anabaena sp. PCC 7120 se han ealizado es udios globales a ni el genómico, median e análisis de mic oa ays, de la abundancia de ansc i os a las 3, 8 y 24 ho as as elimina el ni a o del medio donde se cul i aban las células. Es os es udios han mos ado que al menos 495 genes inc emen an signi ica i amen e su exp esión y 196 genes disminuyen su exp esión du an e el p oceso de di e enciación In oducción 33 (Ehi a y Ohmo i, 2003). En es e es udio ambién se ha obse ado que al impone condiciones de ca encia de ni ógeno combinado, aumen an en p ime luga la exp esión de genes elacionados con el ap o echamien o de cualquie aza de ni ógeno combinado que pudie a exis i en el medio, como los genes que de e minan anspo ado es pa a la inco po ación de nu ien es (Ehi a y Ohmo i, 2003). Cuando el dé ici de ni ógeno pe sis e, a con inuación se ac i a la exp esión de los genes especí icos de la di e enciación de los he e ocis os (Flo es y He e o, 2010). Du an e es e p oceso, la inducción o ep esión de genes no se p oduce al unísono, sino que los cambios ansc ipcionales es án egulados empo almen e, de mane a que la sín esis y el e ec o de un de e minado p oduc o génico sólo ocu e en un momen o de e minado del desa ollo, eniendo a eces un e ec o ansi o io, que llega a se impe cep ible o nulo en o o es adio de la di e enciación (Kuma e al., 2010; He e o e al., 2013). Es a egulación empo al en el p oceso de di e enciación de he e ocis os implica una secuencia empo al de e en os de ac i ación génica. A g andes asgos, se pueden es ablece es e apas de ac i ación génica o ca ego ías de genes (Fig. 1.8). En e los denominados genes emp anos, se encuen an dis in os egulado es an o posi i os como nega i os de es e p oceso, como he R, n A, pa A, he C, he P, he F, que de e minan egulado es posi i os, y el gen pa S, que como se comen ó an e io men e de e mina un egulado nega i o de la di e enciación. Du an e la e apa in e media o de madu ación iene luga la ac i ación de los llamados genes in e medios, y es cuando se an a p oduci los g andes cambios mo ológicos en las células que se es án di e enciando. Así, en e las 4 y 10 h de de iciencia de ni ógeno se p oduce la inducción de los genes que in e ienen en la o mación y deposición de la en uel a ca ac e ís ica de los he e ocis os, como los genes hep (hepA, hepB y hepC) implicados en la o mación de la capa de polisacá idos, y los genes de R y he K, que de e minan un sis ema de egulación de dos componen es de es e p oceso. La o mación de la cap de glicolípidos de la en uel a, se debe a la ac i ación de los genes hgl (he e ocys en elope glycolipids) hglB, hglC, hglD y hglE, que son los genes es uc u ales implicados en la biosín esis de glicolípidos. También ienen una impo ancia c ucial pa a la madu ación de la en uel a la ac i ación del ope ón de BCA y del gen hgdD, que de e minan un expo ado ipo ABC y una p o eína ipo Tol-C, espec i amen e, ambas implicadas en la expo ación de glicolípidos. Po úl imo se ac i an los denominados genes a díos, cuyos p oduc os p opo cionan uncionalidad al he e ocis o. En e las 18-24 h de dé ici de ni ógeno, se inducen los genes ni , genes de la ijación del ni ógeno, (Elhai y Wolk Se gio Cama go Be nal 34 1990; Golden e al., 1991), los genes cox, que de e minan oxidasas e minales espi a o ias, genes hupLS, que de e minan la hid ogenasa de consumo i e e sible, y algunos genes que in e ienen en la inco po ación del NH4+ en compues os o gánicos ni ogenados. Figu a 1.8. Regulación empo al de la ac i ación génica du an e la di e enciación de he e ocis os. La di e enciación de he e ocis os iene luga en espues a a la de iciencia de ni ógeno e implica la exp esión secuencial de una se ie de genes, an o egulado es como es uc u ales. A g andes asgos es e p oceso puede se di idido en es e apas ( e ex o). Dos egulado es ansc ipcionales juegan un papel cla e en los p ocesos de ac i ación génica du an e la di e enciación de he e ocis os. Uno de ellos es N cA, que no sólo se equie e al comienzo del p oceso de di e enciación, sino que es necesa io en e apas in e medias y a días del p oceso. El o o egulado cla e es He R, un egulado especí ico del p oceso de di e enciación de he e ocis os. 1.2.5.1. El egulado He R He R se equie e pa a la di e enciación de los he e ocis os (Buikema y Haselko n, 1991a; 1991b; Black e al., 1993; Khudyako y Golden, 2004). Mien as que los mu an es he R no o man he e ocis os, cuando se sob eexp esa he R (Buikema y Haselko n, 1991a; Buikema y Haselko n, 2001) los ilamen os p esen an una ecuencia inc emen ada de he e ocis os, p oduciéndose incluso la di e enciación de he e ocis os !"#$#%& '()*+($#,"& -*"$#,"& !"#$%&'(")!"!**$!& +,"$!"+,"-!& '(".%&'("/" .%/#0($1+#)%02&'(+$0.!"1(2)&3& '("4& 3/#$%/45#)%02&'560%.%7%8%& 1(20.$!"'517&& '("9& !:;<74& #=>?%&#=>@& 'A+B-& 56!$%&& 678$#7"$#(&)7& "#9+,:7"%& 37"70& 97;5+("%0& 37"70& #"97+;7)#%0& 37"70&9(+)4%0& In oducción 35 en condiciones ep eso as (con ni ógeno combinado), aunque és os no son uncionales (Buikema y Haselko n, 2001). he R es uno de los p ime os genes que se induce du an e la di e enciación de he e ocis os, p esen ando au o egulación posi i a (Black e al., 1993; Buikema y Haselko n, 2001). Su exp esión se inc emen a en odas las células del ilamen o an sólo 30 minu os después de habe impues o condiciones de de iciencia de ni ógeno combinado. T as 3,5 h, su exp esión ya es á con inada a cie as células que mues an un pa ón de espaciamien o simila al de los he e ocis os una ez di e enciados (Black e al., 1993). La p o eína He R se había desc i o como una p o easa ipo se ina dependien e de calcio inusual (Zhou e al., 1998a), que in i o e a capaz de au odeg ada se y de deg ada a una p o eína que une calcio, la p o eína Ccbp (Shi e al., 2006; Zhou e al., 1998a). Aunque has a la echa no se ha podido de e mina con exac i ud el papel del Ca2+ in acelula en el desa ollo de he e ocis os, se piensa que el aumen o de los ni eles de Ca2+ in acelula que iene luga du an e la di e enciación es a ía elacionado con la ac i idad p o eolí ica de algunas p o easas (Shi e al., 2006; Zhao e al., 2005). Po o a pa e, ambién se había desc i o que He R enía cie a capacidad de unión al DNA in i o, in e accionando con las egiones p omo o as de algunos genes de la di e enciación (Huang e al., 2004). En el caso de la egión p omo o a de he P, se de e minó la secuencia de DNA a la que se une He R, que consis e en una epe ición in e ida de 17 pb (Fig.1.9) (Higa y Callahan, 2010). También se ha de e minado la secuencia de DNA con la que in e acciona He R en la egión p omo o a de he Z (Fig.1.9) (Du e al., 2012). Al compa a ambas secuencias de in e acción de He R, se de ec a una secuencia común de 14 nucleó idos (Fig.1.9 b), que son esenciales pa a la in e acción de He R en la egión p omo o a de he Z. Sin emba go, no se han encon ado secuencias simila es en las egiones p omo o as de he R, pa S, hepA y pknE, con las que He R in e acciona ambién (Du e al., 2012). La capacidad de unión al DNA de He R pa ece depende de su capacidad de o ma homodíme os en solución, in e i iendo el pép ido Pa S con dicha unión (Huang e al., 2004). Conc e amen e, se ha comp obado que el pen apép ido Pa S-5, RGSGR, que ep esen a la secuencia C- e minal de Pa S inhibe la unión in i o de He R a algunas egiones p omo o as de genes egulados (Huang e al., 2004; Risse y Callahan, 2007; Feldman e al., 2012; Du e al., 2012), in e accionando di ec amen e con el homodíme o He R (Feldmann e al., 2011). Se gio Cama go Be nal 36 Figu a 1.9. Rep esen ación de la es uc u a idimensional del homodíme o He R y secuencia de unión al DNA p opues a pa a es e egulado . En la pa e supe io de la imagen se ep esen a la es uc u a idimensional del díme o de He R, con la unidad cen al de unión al DNA (azul) y los dominios lap y hood ( ojo y e de, espec i amen e). En la pa e in e io se mues a la compa ación de las secuencias de 51 pb que con ienen el si io de unión de He R en los p omo o es he Z y he P. Las bases coinciden es en ambas secuencias se señalan en neg i a y median e lechas la epe ición in e ida de 17 pb encon ada en el p omo o de he P. (Figu a adap ada de Kim e al., 2011 y Du e al., 2012). Recien emen e, se ha esuel o la es uc u a c is alina de He R de la cianobac e ia e mó ila de la sección V Fische ella, mos ando a es a p o eína como un homodíme o (Fig. 1.9) con una unidad cen al de unión al DNA cons i uida po las egiones N- e minales de las dos subunidades, cada una de las cuales apo a un mo i o HTH (Kim e al., 2011), y dos dominios globula es denominados lap, que se ex ienden hacia ambos lados de la es uc u a del díme o (Kim e al., 2011) y que pod ían se dominios de in e acción con o as p o eínas. También posee un dominio denominado hood, cons i uido po las egiones C- e minales de ambas subunidades, si uado sob e la egión cen al de unión al DNA. Se ha pos ulado que es a egión es la que pod ía es a implicada en la in e acción con Pa S (Feldman e al., 2011; 2012). Dominio Flap Dominio Flap Dominio Hood Mo i os HTH Región cen al de unión al DNA In oducción 37 1.2.5.2. Relaciones en e N cA y He R Como se ha indicado an es, N cA y He R son los egulado es p incipales de la di e enciación de los he e ocis os, y en los mu an es n cA o he R no se obse a ningún signo de di e enciación (F ías e al., 1994; Wei e al., 1994; Buikema y Haselko n, 1991). Ambos egulado es se equie en pa a que se inicie el p oceso (Buikema y Hasselko n, 1991; F ías e al., 1994; Wei e al., 1994; He e o e al., 2013). En Anabaena sp. PCC 7120 se ha obse ado que la ac i ación ansi o ia del gen he R al p incipio de la di e enciación (Black e al. 1993) equie e del egulado N cA (F ías e al., 1994). También se ha obse ado que la ac i ación de la exp esión de n cA depende del gen he R. Po an o, n cA y he R p esen an una dependencia mu ua pa a su ac i ación, p ecediendo la ac i ación de he R a la de n cA (Mu o-Pas o e al., 2002). El inc emen o de exp esión de los dos egulado es se p oduce p incipalmen e en las células que se es án di e enciando (Black e al., 1993; Olmedo-Ve d e al., 2006). Figu a 1.10. Ac i ación mu ua de genes de los egulado es N cA y He R du an e la di e enciación de he e ocis os. En el esquema se ep esen a un ilamen o de Anabaena cul i ado con una uen e de ni ógeno combinado, en el cual N cA y He R es án p esen es a bajo ni el. En espues a a la de iciencia de ni ógeno combinado, N cA se ac i a, p obablemen e po in e acción con su e ec o 2-OG. N cA en su o ma ac i a (N cA*) ac i a ía la exp esión de he R en algunas células, desencadenando un bucle de ampli icación en e N cA-He R, que incluye la au o egulación de n cA y he R ( e ex o), y cuyo esul ado se ía un aumen o de los ni eles celula es de ambas p o eínas necesa io pa a la ac i ación de o os genes de la di e enciación. De iciencia de ni ógeno N cA N cA* he R n cA N cA He R He R N cA* + + Genes especí icos de la di e enciación + N cA* + Se gio Cama go Be nal 38 Se ha p opues o un modelo en el cual los ni eles bajos de N cA ya p esen es en el ilamen o expues o a ni ógeno combinado se ac i a ían, posiblemen e en espues a a un inc emen o en los ni eles celula es de 2-OG, pa a ac i a la exp esión de he R. Cuando se alcanzase cie o ni el de la p o eína He R, p omocionado po el ca ác e de au o egulado posi i o de he R, és a ac i a ía la exp esión de n cA, ambién po enciada po au o egulación posi i a (He e o e al., 2004). La ac i ación mú ua po au o egulación de ambos esul a ía en un aumen o de la exp esión de los dos egulado es, que es c ucial pa a el es ablecimien o de los ni eles de exp esión eque idos pa a el p oceso de di e enciación de he e ocis os (Fig. 1.10) (Flo es y He e o, 2010; He e o e al., 2013). 1.2.5.3. P omo o es de genes de la di e enciación de he e ocis os Muchos de los genes especí icos del p oceso de di e enciación de he e ocis os poseen egiones p omo o as complejas que pe mi en el comienzo de la ansc ipción desde dis in os TSPs, pudiendo és os se di igidos po dis in os ipos de p omo o es, que mues an in i o dis in a especi icidad espacio- empo al en su exp esión. En es as egiones p omo o as complejas se pueden encon a p omo o es cons i u i os, ipo #70, con de e minan es -10 y -35, que asegu an cie o ni el de exp esión génica independien e del égimen de ni ógeno sopo ado po las células. O os p omo o es de genes de la di e enciación mues an una dependencia in i o del egulado N cA (Fig. 1.11). En e és os se incluyen p omo o es di ec amen e ac i ados po N cA uniéndose a un si io de unión consenso (ya e e idos en el apa ado 1.2.2.3), con una es uc u a que se ajus a a la de los p omo o es bac e ianos egulados de clase II, en los que el si io de unión del ac i ado se encuen a solapando con, o eemplazando, al de e minan e -35 (He e o e al., 2001; B owning y Busby, 2004). La exp esión in i o desde es e ipo de p omo o es es independien e del egulado He R. Como ejemplo de es os p omo o es se pueden menciona al p omo o P1 de glnA, P2 de de BCA, P2 de he C y el único p omo o de n A. La p esencia de RNAP, N cA y su e ec o el 2-OG son necesa ios y su icien es pa a que se p oduzca la ac i ación in i o de es e ipo de p omo o es, eniendo el egulado N cA y su e ec o 2-OG un e ec o posi i o en el eclu amien o de la RNAP y jugando un papel p incipal en la o mación del complejo abie o ansc ipcionalmen e ac i o (Vallada es e al., 2008). También exis e o o ipo de p omo o es dependien es del egulado N cA en los que el si io de unión de es e In oducción 39 egulado se si ua po delan e de la posición -41,5, ajusándose a la es uc u a de los p omo o es bac e ianos egulados de clase I ( e apa ado 1.1.3.1). Como ejemplo de es e ipo de p omo o es es án el p omo o P1 de n cA o el P1 del cphB1, que poseen si ios de unión de N cA cen ados en las posiciones -93,5 y -92,5, espec i amen e. Finalmen e, hay un ipo especial de p omo o es que depende in i o de N cA y He R pe o no mues an ningún si io de unión de N cA econocible, en los cuales an sólo se puede iden i ica en algunos casos, una posible caja o de e minan e -10. Ejemplos de es e ipo de p omo o son el P1 de he C, P1 de de B, P2 de he R y P3 de n cA. Figu a 1.11. Es uc u a de los dis in os ipos de p omo o es egulado de genes de la di e enciación de he e ocis os. A iba se ep esen a el p omo o canónico ac i ado po N cA, ep esen ando el de e minan e -10 po un cuad ado azul y el si io de unión de N cA consenso con un ec ángulo ojo. También se indica la dis ancia en e ambos de e minan es. En el cen o se ep esen a el p omo o que posee un si io de unión pa a N cA cen ado po delan e de la posición -41,5 y abajo el que no posee ningún si io econocible pa a el egulado N cA. !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&'(&/012(&33&&& !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&4&5(%6& TAN3T ! 22 pb !"#$%"#&' sp Gen egulado po N P2 he C P2 de BCA P1 glnA Pn A (-41,5) !"#$#%#"&'()(*'+(*%(&'(&,%-.&'(&/012(&3& P1 n cA (-94,5 y -54,5) P1 cphB1 (-92,5) > 22 pb Sin si ios econocibles pa a N cA P1 de BCA, P1 he C, P2 he R, , P3 n cA Se gio Cama go Be nal 40 1.2.5.4. Papel de PipX du an e la di e enciación de he e ocis os Como se ha mencionado an es, PipX es una p o eína pequeña que se descub ió en la cianobac e ia unicelula Synechococcus sp. PCC 7942 y que in e acciona con PII y N cA, eje ciendo un papel posi i o en la exp esión de genes elacionados con el me abolismo de dis in as uen es de ni ógeno combinado (Espinosa e al., 2006) (apa ado 1.2.2.2). En Anabaena sp. PCC 7120, la ORF as 0485 de e mina una p o eína homóloga a PipX. Es e gen se induce bajo condiciones de ausencia de ni ógeno combinado, obse ándose su exp esión p e e en emen e en p ohe e ocis os du an e el p oceso de di e enciación y en he e ocis os madu os (Vallada es e al., 2011). La ansc ipción de pipX en Anabaena iene luga desde una egión p omo o a compleja que incluye p omo o es egulados po N cA y He R (Vallada es e al., 2011). Los mu an es pipX p esen an un c ecimien o diazo ó ico alen izado y una meno ac i idad ni ogenasa espec o a la es i pe sil es e, esul ando pa icula men e a ec ados los ni eles de es a ac i idad bajo condiciones óxicas (Vallada es e al., 2011). Es e eno ipo es debido en pa e a una exp esión disminuida y/o e a dada de los genes es uc u ales de la ni ogenasa y los ag upamien os génicos, coxB2A2C2 y coxB3A3C3, que de e minan oxidasas espi a o ias e minales in oluc adas en la p o ección de la ni ogenasa en e al oxígeno (Vallada es e al., 2011). Po an o, pa ece que PipX juega un papel egulado impo an e du an e el p oceso de di e enciación de he e ocis os, pe mi iendo la exp esión óp ima de genes especí icos que se ac i an en una e apa in e medía- a día de es e p oceso (Vallada es e al., 2011). In oducción 41 1.3. OBJETIVOS DE ESTA TESIS El obje i o inicial que nos plan eamos en es e abajo de Tesis ue el de p o undiza en el conocimien o de los mecanismos de ac i ación ansc ipcional de los dis in os ipos de p omo o es que di igen la exp esión de genes especí icos del p oceso de di e enciación de he e ocis os. Pa a ello se plan ea on los siguien es obje i os especí icos: 1. Es udio del papel de los egulado es N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional del ope ón de BCA. 2. Es udio del papel de los egulado es N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional desde las egiones p omo o as complejas que di igen la exp esión de los genes he C, n cA y he R. 3. Es udio del posible papel de PipX en la ac i ación de la ansc ipción dependien e de N cA du an e la di e enciación de he e ocis os. 4. Es udio del pa ón espacio- empo al de exp esión del ac o sigma ege a i o SigA du an e el p oceso de di e enciación de he e ocis os. Pa e de los esul ados que se exponen en es e abajo han sido ya publicados: Cama go, S., Vallada es, A., Flo es, E. y He e o, A. (2012). T ansc ip ion ac i a ion by N cA in he absence o consensus N cA-Binding si es in an Anabaena he e ocys di e en ia ion gene p omo e . J. Bac e iol. 194: 2939-2948. Cama go, S., Vallada es, A., Fo chhamme , K. y He e o, A. (2014). E ec o PipX on N cA-dependen p omo e s and cha ac e iza ion o he cox3 p omo e egion in he he e ocys - o ming cyanobac e ium Anabaena sp. PCC 7120. FEBS Le . 588: 1787-1794. Se gio Cama go Be nal 48 2.1.1.3. Mé odo de ecogida y la ado de células Las cianobac e ias se ecogían median e cen i ugación a empe a u a ambien e en una cén i uga He aeus modelo “Mega uge 1.0” a 4,000 x g du an e 5-10 min, o bien median e cen i ugación a empe a u a ambien e o 4ºC en una cen i uga Beckman Coul e modelo “A an i J-25”, u ilizando el o o JLA 16.250 a 5,403 x g du an e 5 min ( olúmenes pequeños, 5-50 ml), o median e un sis ema Millipo e de il ación po acío a a és de il os Millipo e HA de 0,45 µm de diáme o de po o. Pa a el aislamien o de RNA, las células (50-100 ml de cul i o) se ecogían median e il ación po acío, se la aban en el mismo il o con 10 ml de ampón T50E100 (T is-HCl 50 mM, EDTA 100 mM [pH 8.0]), se esuspendían en el mismo ampón, y se ans e ían a ubos de mic ocen í uga, donde se cen i ugaban 1-2 min a 14,100 x g, desca ándose el sob enadan e y congelándolas con ni ógeno líquido. Cuando, po azones expe imen ales, se eque ía ans e i las células a un medio suplemen ado con una uen e de ni ógeno di e en e de la u ilizada pa a su cul i o, e a necesa io su la ado. Pa a ello, las células ecogidas po cen i ugación se esuspendían en medio BG110C, se cen i ugaban y se desca aba el sob enadan e, epi iéndose és e p oceso de la ado dos eces. Las células ecogidas median e il ación se la aban en el il o con medio BG110C. Pa a la di e enciación de he e ocis os, los ilamen os se cul i aban en medio líquido BG110-NH4+ has a alcanza una densidad celula de 3-6 µg Chl·ml-1, se ecogían, se la aban con BG110C y se einoculaban en un olumen de BG110C igual al del cul i o del que p ocedian, con inuándose la inducción en las mismas condiciones de cul i o. La mues a de =0 h se omaba en el momen o de ecoge las células cul i adas con NH4+. 2.1.1.4. De e minación de la can idad de clo o ila El con enido de clo o ila a (Chl) de las suspensiones celula es se de e minaba espec o o ome icamen e en ex ac os me anólicos (Mackinney, 1941). Un olumen de suspensión celula de 100 µl, con eniendo un máximo de 60 µg de Chl, se mezclaba con 900 µl de me anol en un ubo de mic ocen í uga y, as agi ación igo osa (en un agi ado ipo ó ex du an e 2 min), la suspensión esul an e se cen i ugaba a 13,000 x g du an e 2 min. La concen ación de clo o ila se es imaba en el sob enadan e en base a Ma e ial y mé odos 49 su abso bancia a 665 nm, u ilizándose un coe icien e de ex inción: E=74,46 (mg·ml)-1 cm-1. 2.1.2. Esche ichia coli 2.1.2.1. Es i pes empleadas Las es i pes de Esche ichia coli u ilizadas en es e abajo y las ca ac e ís icas más ele an es de su geno ipo se mues an en la abla 2.3. Tabla 2.3. Es i pes de E. coli u ilizadas en es e abajo Es i pe Geno ipo Re e encia DH5α F- supE44 hsdR17 ( K-mk+) ecA1 gi A96 (NAI ) endA1 hi-1 elA1 '(lacZYA-a gF) ((80lacZ'M15) U169. Hanahan, 1983 HB101 F- hsdS20 ( B-mB-) leu supE44 a a14 galK2 lacY1 p oA2 psL20 xyl-5 m l-1 ecA13 mc B. Boye y Roulland- Dussoix, 1969 BL21 (D3) F- ompT gal [dcm] [Ion] hsdSB ( B-mB-), una E. coli B) con DE3 (p o ago de ) po ado del gen de la RNApolime asa de T7). S udie e al., 1990 XL-1Blue F´::Tn10 p oA+B+lacIq '(lacZ)M15/ ecA1 endA1 gy A96 (NaI ) hi hsdR17 ( K-mK+) supE44 elA1 lac. Bullock e al., 1987 2.1.2.2. Medios y condiciones de cul i o Las es i pes de E. coli se cul i aban en el medio ico Lu ia-Be ani (LB) que se compone de NaCl 10 g·l-1, bac o ip ona 10 g·l-1 y ex ac o de le adu a 5 g·l-1 (Samb ook y Russel, 2001). Pa a la p epa ación de medio sólido se añadía aga a una concen ación inal de 1,5% (p/ ). El medio se es e ilizaba en au ocla e. Cuando se que ía educi la exp esión basal de las p o eínas que se que ían sob e-exp esa , las es i pes XL1-Blue y BL21 (D3) se cul i aban en medio LB suplemen ado con un 2% de glucosa. Pa a los cul i os en medio líquido se u ilizaban ubos de 10 ml de capacidad con 3 ml de medio (cul i os a pequeña escala) o ma aces E lenmeye de 1 l de capacidad con eniendo 250 ml de medio (cul i o a g an escala), que se incubaban en agi ado es o bi ales (200 pm) a 37ºC. Los cul i os en medio sólido se ealizaban en cajas de Pe i Se gio Cama go Be nal 50 y se incubaban a 30 ó 37ºC. Cuando e a necesa io, los cul i os se suplemen aban con an ibió icos a las siguien es concen aciones inales: ampicilina (Ap) 50 µg·ml-1, kanamicina (km) 50 µg·ml-1, clo an enicol (Cm) 30 µg·ml-1, es ep omicina (Sm) 25 µg·ml-1, epec inomicina (Sp) 100 µg·ml-1. Los an ibió icos se es e ilizaban po il ación. 2.2. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE DNA 2.2.1. PLÁSMIDOS UTILIZADOS Los plásmidos u ilizados du an e es e abajo, no cons uidos du an e la ealización del mismo, se elacionan en la Tabla 2.4, y los cons uidos en es e abajo en la Tabla 2.5. Tabla 2.4. Plásmidos u ilizados no cons uidos en es e abajo. Plásmido Resis encia a an ibió icos Ca ac e ís icas ele an es Re e encia pAN503 Ap F agmen o de 7,5 kb con eniendo el gen glnA de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en el plásmido pBR322. Fishe e al., 1981 pCSAM70 Ap Con iene el gen n cA de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en ase con el si io de inicio de la aducción, as el p omo o inducible po IPTG, en el ec o de exp esión pQE9. La p o eína N cA ecombinan e con iene una cola de His en el ex emo amino. Mu o-Pas o e al., 1999 pCSAM83 Ap F agmen o de 853 pb de he C de Anabaena sp. PCC 7120, co espondien e a las posiciones -693 a +160 ( espec o al inicio de aducción del gen), clonado en pGEM-T. Mu o-Pas o e al., 1999 pCSAM105 Ap Plásmido pT c99A que con iene el gen he R de Anabaena sp. PCC 7120 seguido de una secuencia codi ican e de 6 His. Cama go e al., 2012 pCSAM113b Ap Con iene un agmen o de 602 pb del gen n A de Anabaena sp. PCC 7120, co espondien e a las posiciones -488 a +104, clonado en el plásmido pGEM-T. Mu o-Pas o e al., 2006 Ma e ial y mé odos 51 Tabla 2.4. (Con inuación) Plásmido Resis encia a an ibió icos Ca ac e ís icas ele an es Re e encia pCSAM138 Sm Sp Fusión aduccional ni H-g p (con iene oda la egión p omo o a y p ime os codones de ni H de Anabaena sp. PCC 7120) en el plásmido pCSV3. A.M. Mu o-Pas o y E. Flo es (no publicado) pCSAM155 Ap F agmen o de 842 pb de de B de Anabaena sp. PCC 7120, co espondien e a las posiciones -825 a +17, clonado en pMBL-T. Mu o-Pas o e al., 2009 pCSAM211 Km Plásmido pDUCA7 que lle a clonado el gen g p-mu 2 p ecedido de su p opia secuencia Shine-Dalga no. Ionescu e al., 2010 pCSAV143 Ap F agmen o de 1.921 pb que con iene el gen poD (subunidad SigA de la RNA polime asa de Anabaena sp. PCC 7120) inse ado en pQE9. Vallada es e al., 2008 pCSAV155 Ap F agmen o de 3.527 pb que con iene el gen poB (subunidad " de la RNA polime asa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el ec o de exp esión pT c99A. Vallada es e al., 2008 pCSAV157 Ap F agmen o de 4.164 pb que con iene el gen poC2 (subunidad "’ de la RNA polime asa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el ec o pT c99A. Vallada es e al., 2008 pCSAV158 Ap F agmen o de 1.924 pb que con iene el gen poC1 (subunidad & de la RNA polime asa de Anabaena sp. PCC 7120) clonado en el ec o pT c99A. Vallada es e al., 2008 pCSE4b Ap Plásmido pIC20R con un agmen o de 2,2 kb de Anabaena sp. PCC 7120 (que incluye la egión p omo o a de n cA y la p ime a mi ad del gen n cA si ios has a el si io ClaI) clonado en e los si ios HindIII-ClaI. J.E. F ías y E. Flo es (no publicado) pCSEL21 Ap Plásmido pIC20R incluyendo una usión n cA-g p, usado pa a cons ui usiones aduccionales con el gen g p median e sus i ución del agmen o de n cA. Olmedo-Ve d e al., 2006 pCSV3 Sm Sp Plásmido de i ado de pRL500 en el que el gen de esis encia a Ap se ha escindido con D aI y eemplazado po la case e C.S3. Vallada es e al., 2011 pCSV25 Ap Gen poA (subunidad ! de la RNA polime asa de Anabaena sp. PCC 7120) inse ado en pQE9. Vallada es e al., 2008 pCSV31 Ap Gen pipX usionado en ase con una secuencia codi ican e de 6 His en el plásmido pQE9. Cama go e al., 2014 pIC20R Ap Vec o de clonación de i ado de pUC19. Ma sh e al., 1984 Se gio Cama go Be nal 52 Tabla 2.4. (Con inuación) Tabla 2.5. Plásmidos u ilizados cons uidos en es e abajo Plásmido Resis encia a an ibió icos Ca ac e ís icas ele an es Re e encia pMBL-T Ap Vec o empleado pa a la clonación de agmen os de DNA gene ados median e PCR. Dominion MBL pQE9 Ap Vec o de exp esión pa a la p oducción de p o eínas usionadas a un pép ido de 6 His. Qiagen pRL278 Km Vec o pa a la selección posi i a de dobles ecombinan es en Anabaena. Con iene el gen sacB de Bacillus sub ilis. Black e al., 1993 pRL443 Ap Tc Plásmido conjuga i o de amplio espec o, de i ado de RP4, capaz de mo iliza plásmidos de i ados de ColE1. Elhai y Wolk, 1988b pRL500 Ap Vec o pa a la selección posi i a de plásmidos ecombinan es. Elhai y Wolk, 1988a pRL623 Cm De i ado de ColK, po ado de mob y genes de me ilasas de si ios A aI, A aII y A aIII. Elhai y Wolk, 1997 pT7-7120 Ap Plásmido que con iene el gen npB de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en pUC19. Vioque, 1997 pT c99A Ap Vec o de exp esión que con iene el p omo o c inducible po IPTG. Pha macia pWB216S2.4 Km F agmen o de 2,4 kb que engloba an o la egión p omo o a como la ORF del gen he R de Anabaena sp. PCC 7120 clonado en el plásmido pDUCA7. Buikema y Hasselko n, 1991a Plásmido Resis encia a an ibió icos Ca ac e ís icas ele an es pCSSC7 Km Gen he R de Anabaena sp. PCC 7120 con una deleción de 0,5 kb inse ado en e las dianas de es icción BamHI y XhoI del pRL278 ( e apa ado 3.1). pCSSC8 Km De i ado del plásmido pCSSC7 en el que se ha inse ado la case e C.S3 en el si io NheI (in oducido con oligonucleó idos) si uado en e las dos egiones lanquean es del gen he R u ilizadas pa a p oduci su deleción ( e apa ado 3.1). Ma e ial y mé odos 53 Tabla 2.5. (Con inuación) 2.2.2. T ans e encia de DNA 2.2.2.1. T ans e encia de DNA a E. coli median e ans o mación Las células ans o mables, p epa adas según el mé odo de Hanahan (Hanahan, 1983), ue on p opo cionadas po el Se icio de Cul i os Biológicos del Cen o de In es igaciones Cien í icas Isla de la Ca uja (CICIC). Pa a la ans o mación se mezclaban 0,1 ml de suspensión de células ans o mables, p e iamen e descongeladas en hielo, con 10 µl de la p epa ación de DNA ans o man e (1 µl si se a aba de un plásmido pu i icado). La mezcla se incubaba en hielo du an e 15 min, as lo cual se some ía a un choche é mico median e incubación a 42ºC du an e 90 s. Después se man enía 2 min en hielo, se le añadía 1 ml de medio LB y se incubaba du an e 1 h a Plásmido Resis encia a an ibió icos Ca ac e ís icas ele an es pCSSC9 Ap Región p omo o a del gen glnA ampli icada con los oligonucleó idos GA-3 y GA-13 y clonada en el plásmido pMBL-T. pCSSC12 Ap Región p omo o a de gen poD (sigA) desde la posición -1498 has a la posición +24, ampli icada con los oligonucleó idos poD3 y poD-4 (que in oduce una diana EcoRV) y pos e io men e clonado en el ec o pMBL-T. pCSSC13 Ap F agmen o XhoI/EcoRV p oceden e de pCSSC12 inse ado en las mismas dianas de es icción del plásmido pCSEL21 p oduciéndose la usión aduccional sigA-g p. pCSSC14 Sm Sp F agmen o escindido de pCSSC13 median e diges ión con KpnI y pos e io inse ción en la misma diana del ec o pCSV3. pCSSC18 Nm Fusión ansc ipcional en la que un agmen o que incluye los dos p omo o es del gen de B di ige la exp esión del gen g p-mu 2 p ecedido de su p opia secuencia Shine-Dalga no inse ado en e los si ios ClaI/XhoI de pCSAM211 ( e apa ado 3.1.2.1.3). pCSSC19 Nm Fusión ansc ipcional en la que un agmen o que incluye solo el p omo o dis al del gen de B di ige la exp esión del gen g p-mu 2 p ecedido de su p opia secuencia Shine-Dalga no inse ado en los si ios ClaI/XhoI de pCSAM211 ( e apa ado 3.1.2.1.3). pCSSC20 Nm Fusión ansc ipcional en la que un agmen o que incluye solo el p omo o p oximal del gen de B di ige la exp esión del gen g p-mu 2 p ecedido de su p opia secuencia Shine-Dalga no. pCSSC35 Ap F agmen o de la egión p omo o a de al 2729 que cub e desde las posiciones -703 a +64 ( espec o al inicio de aducción del gen) clonado en el ec o pMBL-T. Se gio Cama go Be nal 54 37ºC. Po úl imo, las células se semb aban en cajas de Pe i que con enían medio LB sólido suplemen ado con los an ibió icos adecuados. Pa a iden i ica median e ensayos de “complemen ación !” ans o man es que hubie an inco po ado un plásmido con inse o, el medio sólido se suplemen aba con X-Gal 40 µg·ml-1 (Samb ook y Russell, 2001). Las colonias po ado as de plásmido con inse o e an de colo blanco, mien as que las que habían ecibido plásmido sin inse o e an de colo azul. 2.2.2.2. T ans e encia de DNA a Anabaena sp. median e conjugación La ans e encia de DNA a Anabaena sp. se ealizaba, según se desc ibe en Elhai y Wolk (1988a), median e conjugación con una es i pe de E. coli que con enía el plásmido a ans e i (plásmido ca go) además del plásmido auxilia pRL623 (Tabla 2.4). El plásmido pRL623 con iene genes que de e minan me ilasas de los si ios A aI, A aII y A aIII (Elhai e al., 1997). Las me ilaciones ca alizadas po es as enzimas p o egen al plásmido ca go en e a las endonucleasas de es icción de la cianobac e ia ecep o a. Los plásmidos e an mo ilizados median e el plásmido conjuga i o pRL443 (Tabla 2.4) (Elhai y Wolk, 1988a) apo ado po una segunda es i pe de E. coli. Pa a la conjugación, alícuo as de 0,25 ml de cul i os en ase es aciona ia de E. coli ED8654 (pRL443) y E. coli HB101 (pCSX, pRL623), donde pCSX ep esen a el plásmido a ans e i , se u ilizaban pa a inocula nue os cul i os de 10 ml de medio LB suplemen ado con los an ibió icos adecuados. Después de incuba a 37ºC con agi ación du an e 2,5 h, las células, en ase exponencial de c ecimien o, se ecogían median e cen i ugación, se la aban dos eces con 10 ml de LB (pa a elimina cualquie aza de an ibió ico) y se mezclaban en un olumen de 200-300 µl, incubándose en onces a empe a u a ambien e sin agi ación du an e 2h. A con inuación, dichas células se mezclaban con una suspensión de células de Anabaena sp. que con enía 10 µg de Chl (en un olumen de 200-300 µl), y la mezcla esul an e se ex endía sob e un il o de ni ocelulosa (Inmobion-NC, Millipo e) dispues o sob e una caja de Pe i con medio de cul i o de cianobac e ias pe misi o (sin an ibió icos) suplemen ado con LB al 5% ( / ). Las cajas se incubaban a 30ºC con luz de baja in ensidad du an e 2-6 h y, pos e io men e, en las condiciones habi uales de cul i o du an e 20-24 h. A con inuación, los il os se ans e ían a cajas con medio pe misi o sin LB, que se incubaban 24 h en condiciones de cul i o, as lo cual se pasaban a medio selec i o con Ma e ial y mé odos 55 an ibió icos. Las colonias esis en es apa ecían en es e úl imo medio as 10-15 días de incubación. 2.2.3. Aislamien o de DNA 2.2.3.1 Aislamien o de DNA plasmídico de E. coli Pa a el aislamien o de DNA plasmidico a pequeña escala se empleó el mé odo basado en la lisis alcalina de las células (Samb ook y Russel, 2001). Las células p oceden es de 3 ml de cul i o se ecogían median e cen i ugación (14,100 x g, 2 min) en ubos de mic ocen í uga y se esuspendían en 100 µl de disolución I (T is-HCl 25 mM, glucosa 50 mM, EDTA 10 mM [pH 8]). A con inuación, se añadían 200 µl de disolución II ecién p epa ada (NaOH 0,2 N, SDS 1% [p/ ]) y se agi aba b e emen e, p o ocando la lisis celula . Después se añadían 150 µl de disolución III (ace a o po ásico 5 M [pH 4,8]), se homogeneizaba agi ando sua emen e, se incubaba en hielo du an e 5 min y se cen i ugaba (14,100 x g, 5 min a 4ºC). El sob enadan e ob enido se ans e ía a un ubo limpio y se some ía a dos ex acciones sucesi as, una con enol:clo o o mo (1:1, [ / ]) y o a con clo o o mo, sepa ándose las ases median e cen i ugación (2 min a 14,100 x g). El DNA se p ecipi aba con 2,5 olúmenes de e anol absolu o ío (1 h, -20ºC). T as cen i uga las mues as (14,100 x g, 15-30 min a 4ºC), el p ecipi ado se la aba con e anol al 70% ( / ), se secaba al ai e y se esuspendía en 25 µl de agua desionizada de al a calidad o ampón TE (T is-HCl 10 mM, EDTA 1 mM [pH 8]). Pa a el aislamien o de DNA plasmídico de al a calidad, u ilizado en las eacciones de secuenciación, se empleaba el sis ema come cial “NucleoSpin Plasmid” (Mache ey Nagel) basado ambién en la lisis alcalina de las células. 2.2.3.2. Aislamien o de DNA o al de cianobac e ias El aislamien o de DNA o al de Anabaena sp. PCC 7120 se ealizaba siguiendo el mé odo desc i o po Cai y Wolk (1990). Las células p oceden es de 25-50 ml de cul i o se ecogían po cen i ugación y se esuspendían en 400 µl de ampón T1/10E (T is-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM [pH 8]). A la suspensión celula se le añadían 150 µl Se gio Cama go Be nal 56 de pe las de id io (0,25-0,30 mm de diáme o, p e iamen e la adas con ácido ní ico y agua des ilada, y es e ilizadas a 180ºC), 20 µl de SDS al 10% (p/ ) y 400 µl de una mezcla de enol:clo o o mo (1:1, [ / ]). La mezcla esul an e se some ía a cua o ciclos de agi ación con un agi ado ipo ó ex (1 min) e incubación en hielo (1 min). El lisado se cen i ugaba u ilizando una cen í uga Eppendo modelo 5415R (15 min a 16,100 x g, 4ºC), y el sob enadan e ob enido se some ía a sucesi as ex acciones con un olumen de enol (1 ez), un olumen de enol:clo o o mo (1:1 [ / ]) (2 eces), y un olumen de clo o o mo (1 ez). Los ácidos nucleicos p esen es en la ase acuosa inal se p ecipi aban median e la adición de 2,5 olúmenes de e anol absolu o ío y 0,1 olúmenes de ace a o po ásico 3 M (pH 5,2) (1 h, -20ºC). T as cen i uga las mues as (15 min a 16,100 x g, 4ºC), el p ecipi ado se la aba con e anol al 70% ( / ), se secaba al ai e y se esuspendía en 30 µl de agua desionizada de al a calidad o ampón T1/10E. 2.2.4. De e minación de la concen ación de DNA La concen ación de DNA de las mues as se de e minaba po compa ación con mues as de concen ación conocida. Pa a ello, alícuo as de las mues as p oblema o de és as diluidas se some ían a elec o o esis en gel de aga osa con b omu o de e idio o Gel RedTM (Bio ium) (apa ado 2.2.4), u ilizándose como pa ón de amaños y ca ga can idades conocidas de DNA del ago ) dige ido con ClaI o el ma cado de amaño come cial “DNA molecula Weigh Ma ke X” (Roche). En algunas ocasiones la concen ación de un agmen o de DNA ambién se de e mina espec o o omé icamen e, u ilizando un espec o o óme o NanoD op modelo ND-1000. 2.2.5. Sepa ación de agmen os de DNA en geles de aga osa y pu i icación La sepa ación de agmen os de DNA se ealizaba median e elec o o esis en geles de aga osa (Samb ook y Russell, 2001) de concen ación a iable 0,7-2% (p/ ) p epa ados en ampón TBE (T is-bo a o 90 mM, EDTA 2 mM [pH 8]). Las mues as que con enían RNA se a aban con RNasa A (concen ación inal 0,05 µg·ml-1) an es de se some idas a elec o o esis y se suplemen aban con 0,1 olúmenes de ampón de ca ga 10X (glice ol 50% [ / ], azul de b omo enol 0,4% [p/ ], xileno cianol FF 0,4% [p/ ]). Pa a la de ección del DNA se añadía b omu o de e idio a una concen ación de 1 Ma e ial y mé odos 57 µg·ml-1 o Gel RedTM siguiendo las ins ucciones del ab ican e. Las elec o o esis se lle aban a cabo en apa a os ho izon ales DNA Sub Cell (Bio-Rad). Pa a de e mina el amaño de los agmen os some idos a elec o o esis se empleaban como pa ón los agmen os de DNA del ago ) dige ido con ClaI, o los ma cado es de amaños come ciales “DNA Molecula Weigh Ma ke X” (Roche) o “KiloBaseTM DNA Ma ke ” (Ame sham). El DNA se isualizaba iluminando los geles con un ansiluminado de luz ul a iole a. Los agmen os de DNA p e iamen e sepa ados median e elec o o esis se ex aían de los geles de aga osa median e congelación y p esión. Es e p ocedimien o se basa en la congelación de la po ción de gel de aga osa que con iene el DNA, man eniéndolo a -20ºC en el in e io de una je inga du an e 1 h, y la ex acción de la ase líquida median e p esión. La ase líquida así ob enida se diluía en un olumen mayo de agua desionizada (pa a minimiza las pe didas de DNA en el p oceso de pu i icación) y se some ía después a una ex acción con enol:clo o o mo 1:1 ( / ), seguida de o a ex acción con clo o o mo. Pos e io men e, el DNA se p ecipi aba añadiendo a la mues a 0,1 olúmenes de ace a o sódico 3 M (pH 5,2) y 2 olúmenes de e anol absolu o, as lo cual la mues a se some ía a congelación con N2 líquido y cen i ugación a 16,100 x g du an e 30 min. El p ecipi ado se la aba con e anol al 70% y, as deja seca , se esuspendía en un olumen de 10-20 µl de agua ul apu a. Al e na i amen e, la pu i icación de agmen os de DNA en disolución o en geles de aga osa se ealizaba median e la unión especí ica del DNA a columnas come ciales con ma iz de ib a de id io “Illus aTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Pu i ica ion Ki ” (GE Heal hca e), siguiendo las ecomendaciones del ab ican e. 2.2.6. Ampli icación de DNA median e la eacción en cadena de la DNA polime asa (PCR) La ampli icación de DNA median e PCR se ealizaba en un e mociclado Wha man-Biome a modelo Tpe sonal en un olumen inal de 25 o 50 µl, de una mezcla que con enía: 1-5 ng de DNA molde, 0,2 mM de cada desoxi ibonucleo ido i os a o (dNTP), 25-50 pmol de cada cebado y la DNA polime asa en su ampón co espondien e ( e Tabla 2.6.). Como molde se u ilizaba DNA genómico aislado de cianobac e ias, DNA plasmídico aislado de E. coli o el DNA con enido en la biomasa Se gio Cama go Be nal 64 2.3. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE RNA 2.3.1. Aislamien o de RNA Se u ilizó el mé odo desc i o po Mohamed y Jansson (1989), que consis e básicamen e en una o u a del ex ac o celula con enol ácido (pH 4,5, Am esco) a 65ºC, con algunas modi icaciones. Las células de Anabaena sp. PCC 7120 con enidas en un olumen de 50-100 ml de cul i o se ecogían po il ación (apa ado 2.1.1.3), se la aban con 10 ml de T50E100 (T is-HCl 50 mM, EDTA 100 mM [pH 8]) y, as desca a el sob enadan e, las mues as se congelaban con ni ógeno líquido. El sedimen o se esuspendía en 300 µl de ampón de esuspensión (saca osa 0,3 M, ace a o sódico 10 mM [pH 4,5]), 400 µl de ampón de lisis (SDS 2%, ace a o sódico 10 mM [pH 4,5]) y 100 µl de Na2-EDTA 250 mM (pH 8,0). La mezcla de células esul an es se añadía a un olumen de 1 ml de enol ácido (p e iamen e calen ado a 65ºC) y se calen aban du an e 2,5 min a 65ºC y pos e io men e se agi aban median e ó ex du an e 30 s ( epi iéndose es e bucle de calen amien o-agi ación al menos 3 eces). Después se cen i ugaba 5 min a 16,100 x g a 4ºC y se ecogía la ase acuosa, de donde se ex aían las p o eínas con enol calien e dos eces más. Finalmen e, se ealizaba una ex acción con enol ácido:clo o o mo (1:1 [ / ]) a 65ºC y, po úl imo, una ex acción con clo o o mo sin calen a . El sob enadan e ecogido as las ex acciones an e io es se p ecipi aba con 1 olumen de isop opanol, sume giendo los ubos en ni ógeno líquido pa a acili a la p ecipi ación. Pos e io men e, los ácidos nucleicos se ecogían po cen i ugación a 16,100 x g du an e 30 min a 4ºC, se la aban con e anol al 70% ( / ) y se secaban al ai e, esuspendiéndose con 200 µl de H2O a ada con DEPC. El DNA con aminan e en es as p epa aciones se eliminaba a ando las mues as con DNasa Tu bo (lib e de RNasas) (Ambion), siguiendo las ins ucciones del ab ican e. T as una nue a ex acción con enol:clo o o mo (1:1 [ / ]), y o a con clo o o mo, el RNA se p ecipi aba con 0,2 olúmenes de LiCl y e anol absolu o ío, se la aba con e anol 70% ( / ) y, as deja seca las mues as, se esuspendía en un olumen inal de 30-50 µl con agua a ada con DEPC. El RNA con enido en las mues as se cuan i icaba median e el uso de un espec o o óme o NanoD op modelo ND-1000. Ma e ial y mé odos 65 2.3.2. Elec o o esis de RNA en geles de aga osa Los geles pa a la elec o o esis de RNA se p epa aban a una concen ación de aga osa del 1% (p/ ) en ampón MOPS 1x y o maldehído al 2% ( / ). El ampón MOPS 1x consis ía en: MOPS 40 mM, ace a o sódico 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,2). Las mues as, p epa adas en un olumen inal de 28 µl, con enían: 10-30 µg de RNA en un olumen de 7 µl, 1,4 µl de ampón MOPS 10x, 4,9 µl de o maldehído al 37% ( / ) y 14 µl de o mamida. T as una incubación a 95ºC du an e 3 min, las mues as se en iaban en hielo, se suplemen aban con 1/5 en olumen de ampón de ca ga (EDTA 1 mM [pH 8.0], azul de b omo enol 0,25% [p/ ], xilenocianol FF 0,25% [p/ ] y glice ol 50% [ / ]) y con 0,2 µl de b omu o de e idio, se ca gaban en el gel y some ían a elec o o esis a 5 V·cm-1. Pa a de e mina el amaño de los ansc i os some idos a análisis se empleaba el ma cado de amaños ssRNA Ladde (New England Biolabs) ca gado jun o a las mues as de RNA an e io men e ci adas. El RNA se isualizaba iluminando los geles con un ansiluminado de luz ul a iole a. 2.3.3. De ección de secuencias de RNA median e hib idación en il o con sonda adiac i a (Análisis de no he n) T as la elec o o esis de las mues as de RNA, el gel se some ía a es la ados con agua des ilada du an e 5 min cada uno pa a elimina el o maldehído y se equilib aba sume giéndolo du an e 10 min en SSPE 10x (p epa ado a pa i de un s ock 20x: NaCl 3 M, Na2HPO4 0,2 M [pH 7,4], EDTA 0,02 M). A con inuación, el RNA se ans e ía a un il o de nylon HybondTM-N+ (GE-Heal hca e), median e aplicación de acío du an e 1 h, u ilizando un apa a o T ansVac TE80 (Pha macia Bio ech). Como disolución de ans e encia se usaba NaOH 100 mM. Pos e io men e, el il o se dejaba eposa du an e 10 min sob e un papel Wha man humedecido con NaOH 100 mM, se sume gía b e emen e en SSPE2x y se secaba a 80ºC du an e 15-30 min. Pa a la hib idación con sondas adiac i as del RNA ijado a un il o de nylon, el il o se incubaba en un ho no de hib idación 2h a 65ºC (p ehib idación) con una disolución de K2HPO4 0,5 M, KH2PO4 0,6 M, SDS 7% y EDTA 1 mM (pH 8). Pos e io men e se añadía la sonda ma cada adiac i amen e (apa ado 2.2.8.5 A), que p e iamen e había sido desna u alizada calen ando a 100ºC du an e 5 min, y se incubaba du an e 12-15 h a 65ºC en un ho no de hib idación. T as la hib idación, el Se gio Cama go Be nal 66 il o se la aba es eces en el ho no a 65ºC. Los dos p ime os la ados se ealizaban con la disolución 2xSSC, SDS 10% (la ando 10 min cada ez), y el e ce la ado con la disolución 1xSSC, SDS 0,1% incubando du an e 15 min. La disolución SSC 20x, con iene: NaCl 3 M y ci a o sódico 0,3 M. Como con ol de la can idad de RNA ca gada en cada calle y de la ans e encia del RNA a la memb ana, és a se hib idaba con una sonda del gen npB de Anabaena sp. PCC 7120 que de e mina el RNA de la Ribonucleasa P y se exp esa cons i u i amen e (Vioque, 1997). El agmen o de DNA que se u ilizaba como sonda se ob enía median e PCR con la pa eja de oligonucleó idos M13-Uni e sal y M13-Re e so como cebado es y el plásmido pT7-7120 como molde (Vioque, 1997). Pa a pode eu iliza los il os después de la hib idación, la sonda unida al il o se eliminaba median e incubación del mismo a empe a u a ambien e du an e 1 h con agi ación mode ada en una disolución de SDS 0,5% (p/ ) que se añadía hi iendo, o bien hi iendo el il o du an e 10-30 min en una disolución con eniendo: T is-HCl 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM y 1% de SDS. La de ección y el análisis de las á eas adiac i as en los il os se ealizaban median e au o adiog a ía elec ónica con el sis ema Cyclone S o age Phospho Sys em y el p og ama de análisis de imágenes Op iquan (Packa d). 2.3.4. Ensayo de ex ensión de cebado Pa a la de e minación del ex emo 5’ de moléculas de RNAs se lle aban a cabo ensayos de ex ensión de un cebado . Pa a ello se u ilizaban oligonucleó idos ma cados en el ex emo 5’ con la enzima T4 polinucleó ido quinasa y [&-32P]dATP (3.000 Ci·mmol-1) (Pe kin Elme ), según se desc ibe en el apa ado 2.2.8.5 C. En p ime luga se p ocedía pa a que u ie a luga la unión o apa eamien o del cebado a las secuencias complemen a ías en el RNA. Pa a ello se p epa aba una mezcla con eniendo, en un olumen inal de 15 µl: T is-HCl 10 mM (pH 8), KCl 150 mM, EDTA 1 mM (pH 8), 15-25 µg de RNA o al y 2 pmol de oligonucleó ido ma cado adiac i amen e. Es a mezcla se incubaba a 85ºC du an e 10 min, con el in de desna u aliza el RNA, y después, a 50ºC du an e 1 h, pa a pe mi i el apa eamien o del cebado con el RNA. Pos e io men e, es a mezcla se u ilizaba pa a la eacción de ex ensión, que se ealizaba en un olumen inal de 45 µl y con enía: T is-HCl 50 mM (pH 8), KCl 75 mM, MgCl 3 mM, los cua o dNTPs a concen ación inal de 0,25 mM cada uno, DTT 10 mM y 200 U de ansc ip asa in e sa Supe Sc ip TM II (In i ogen). T as una incubación de 1 h a Ma e ial y mé odos 67 47ºC, la mezcla de eacción se suplemen aba con 100 µl de o a mezcla que con enía 0,04 µg de RNasa A lib e de DNasas (Roche) y 0,2 µg de DNA de espe ma de salmón (Roche), y se incuba 15 min a 37ºC. T as una ex acción enol:clo o o mo (1:1 [ / ]), el DNA monoca ena io sin e izado se p ecipi aba jun o con el DNA de espe ma de salmón (DNA “ anspo ado ”) con 0,1 olúmenes de ace a o sódico 3M (pH 5,2) y 2,5 olúmenes de e anol absolu o ío, y se esuspendía en un ampón que con enía: o mamida 97,5 % ( / ), xilenocianol FF 0,3 % (p/ ), azul de b omo enol 0,3 % (p/ ) y EDTA 10 mM (pH 8) (Samb ook y Russel, 2001). Es as mues as se esol ían en un gel de u ea-poliac ilamida (al 6 % de poliac ilamida) pa alelamen e a las mues as de secuenciación que se u ilizaban como ma cado de amaños (2.2.7). 2.3.5. Ampli icación ápida de ex emos 5’ de cDNA ( 5’-RACE) Pa a de e mina si los ex emos 5’ de RNAs de ec ado/s en ensayos de ex ensión del cebado se co espondían con si ios de inicio de ansc ipción (TSP) se u ilizó un p ocedimien o desa ollado po Bensing e al., (1996), basado en la ampli icación de mues as de RNA a cuyo ex emo 5’ se liga un oligo ibonucleó ido o adap ado de RNA. Básicamen e, es e p ocedimien o consis e en usa mues as duplicadas del RNA celula o al a adas y no a adas con la enzima pi o os a asa ácida de abaco (TAP). Es a enzima ca aliza la o u a de enlaces pi o os a o de moléculas de RNA con ex emos 5’ i os a o. Las mues as son ligadas pos e io men e a un adap ado de RNA de secuencia conocida, pe o la unión solo se p oduce en las moléculas de RNA con ex emos 5’ mono os a o. Después, se ealiza un paso de e o ansc ipción con un oligonucleó ido especi ico del gen obje o de es udio, u ilizándose a con inuación el cDNA ob enido pa a ampli icación po PCR u ilizando un oligonucleó ido especí io del gen obje o de es udio y un oligonucleó ido que in e acciona especí icamen e con la secuencia co espondien e al RNA adap ado . Los inicios de ansc ipción co esponden a los ex emos 5’ de ec ados sólo después del a amien o con TAP (Fig 2.1). El a amien o con TAP, se lle aba a cabo incubando 20 µg de RNA o al con 20 U de TAP (Epicen e) du an e 2 h a 37ºC en un olumen inal de 50 µl. La mezcla de eacción se some ía a una ex acción con enol:clo o o mo (1:1 [ / ]), y el RNA se p ecipi aba con e anol absolu o ío y ace a o sódico 3 M (pH 5,2) y se esuspendía con 10 µl de agua desionizada de al a calidad, añadiendo después 60 pmol de adap ado 5’RNA (Sigma P oligo), con la secuencia: Se gio Cama go Be nal 68 y 80 U de Ligasa de RNA del ago T4 (Ame sham) incubando du an e 16 h a 15ºC. La mezcla de eacción se some ía después a ex acciones con enol:clo o o mo (1:1 [ / ]) y clo o o mo, p ecipi ándose el RNA con e anol absolu o ío y ace a o sódico 3 M (pH 5,2). Finalmen e, El RNA se esuspendía en 20 µl agua desionizada de al a calidad. La eacción de e o ansc ipción se ealizaba con 6,5 µg de RNA ligado al adap ado y 10 pmol del oligonucleó ido especí ico del gen obje o de es udio en cada caso, u ilizándose 100 U de ansc ip asa in e sa Supe Sc ip TM II (In i ogen). Pa a las eacciones de PCR, se u ilizaba como molde 5 µl de la mezcla de e o ansc ipción (ap oximadamen e 1 µg de DNA), y los p oduc os de PCR del amaño espe ado se aislaban del gel de aga osa (apa ado 2.2.5), se clonaban en el ec o pMBL-T ( abla 2.4) y se secuenciaba. El p ime nucleó ido que p ecedía a la secuencia del adap ado se conside aba co epondía al TSP. Figu a 2.1. Esquema del p ocedimien o 5’RACE. En es e ejemplo se mues a el a amien o de dos especies dis in as de RNA. En e de se ep esen a un ansc i o con ex emo 5’ co espondien e a un TSP y en na anja un RNA p oduc o de p ocesamien o o de deg adación. (5’CUAGUACUCCGGUAUUGCGGUACCCUUGUACGCCUGUUUUAUA-3’) +TAP -TAP Ligasa de RNA Adap ado Bensing Re o ansc ipción cDNA PCR con los oligonucleó idos ap opiados T ansc i o con ex emo 5’ p ima io T ansc i o hid olizado !!- + !!+ + (T ansc i o p ocesado) (RNA o al) Ma e ial y mé odos 69 2.4. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 2.4.1. P epa ación de ex ac os lib es de células Pa a la pu i icación de la p o eína N cA ecombinan e de Anabaena sp. PCC 7120 se u ilizaban ex ac os c udos de la es i pe DH5! de E.coli (Tabla 2.3) con el plásmido pCSAM61, en el que n cA es á clonado en el ec o de exp esión pT c99A bajo el con ol del p omo o c (Tabla 2.4). Pa a la pu i icación de la p o eína N cA-His de Anabaena sp. PCC 7120 se u ilizó el plásmido pCSAM70 (Tabla 2.4). Es e plásmido e a man enido en células de la es i pe E.coli BL21 (DE3) ( abla 2.3) que po aba el plásmido pREP4 (Quiagen) y exp esaba al os ni eles del ep eso LacIq. Pa a He R-His de Anabaena sp. PCC 7120, se usó el plásmido pCSAM105 (que po a el gen he R seguido de una cola de his idinas en el plásmido pT c99A) en la es i pe XL1-Blue, y pa a la p o eína PipX-His de Anabaena sp. PCC 7120 se u iliza on ex ac os c udos de E. coli BL21 (DE3) con eniendo el plásmido pCSV31 (Tabla 2.4). Se pa ía de células de E.coli, cul i adas en medio LB suplemen ado con 50 µg·ml-1 de Ap y 2% de glucosa (p/ ) e incubadas a 37ºC du an e 10-12 h. Un olumen de 25 ml de cul i o se la aba con LB pa a elimina la glucosa y se inoculaban en 250 ml de LB con eniendo 50 µg·ml-1 Ap, incubándose a 37ºC con agi ación. Cuando los cul i os alcanzaban una densidad óp ica a 600 nm de 0,6, se le añadía IPTG a una concen ación inal de 1 mM. T as 3 h de incubación, las células se ecogían po cen i ugación (2.1.2.3), se la aban con ampón T is-HCl 10 mM (pH 8) y se congelaban a -20ºC. Pa a la ob ención de los ex ac os lib es de células, és as se esuspendían en ampón de lisis compues o po : ampón os a o sódico 20 mM (pH 7), NaCl 0,5 M, y glice ol 10% en el caso de N cA na i a, o en ampón T is-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 200 mM y 10% de glice ol pa a N cA-His, He R-His y PipX-His. A las células esuspendidas se les añadía luo u o de enilme ilsul onilo (PMSF) 1 mM a azón de 3 ml po g amo de células, y la suspensión esul an e se some ía a dos ciclos de o u a (20.000 psi) en una p ensa de F ench (SLM-AMINCO). El lisado celula se cen i ugaba 30 min a 18,500 x g a 4ºC en una cen i uga Beckman Coul e modelo A an i J-25 con un o o JA 25.50 pa a elimina las memb anas y es os celula es. La acción soluble esul an e se some ía di ec amen e a c oma og a ía. Se gio Cama go Be nal 70 2.4.2. Pu i icación de N cA ecombinan e median e c oma og á ia de a inidad po hepa ina La p o eína N cA se pu i icaba a pa i de la acción soluble del ex ac o lib e de células median e c oma og a ía de a inidad po hepa ina con una columna “HiT ap Hepa in HP 1 ml” (Ame sham) en un sis ema FPLC de Pha macia, según las ins ucciones del ab ican e. El mé odo u ilizado consis ía en el equilib ado de la columna con 25 ml de ampón A: ampón os a o sódico 20 mM (pH 7), NaCl 0,5 M, glice ol 10%, seguido de la inyección de la mues a y el la ado de la columna con el mismo ampón de equilib ado (100 ml). La elución de las p o eínas se ealizaba u ilizando un g adien e de NaCl de 0,5 a 1,5 M p epa ado en ampón os a o sódico 20 mM (pH 7) y glice ol 10%. Las acciones ecogidas se isualizaban median e elec o o esis desna u alizan e en geles de poliac ilamida al 12 % y inción con azul de Coomassie (apa ado 2.4.6) (Fig. 2.2). An es de su u ilización en ensayos de ansc ipción in i o las acciones esul an es de la c oma og a ía se dializaban en e a un olumen de 1 L de ampón os a o sódico 20 mM (pH 7), NaCl 250 mM y glice ol 30% du an e 4 h a 4ºC. Figu a. 2.2. Pu i icación de la p o eína N cA na i a. Análisis median e SDS-PAGE de mues as de la acción soluble del ex ac o lib e de células (EC), acción no e enida en la columna (NR), mues as de las acciones ob enidas median e c oma og a ía de a inidad po hepa ina con un g adien e de NaCl de 0,5 a 1,5 M (10-44). S, pa ón de amaños (en kDa). 2.4.3. Pu i icación de N cA-His, He R-His y PipX-His median e c oma og a ía de a inidad po níquel La p o eína N cA con una cola 6His, se pu i icó median e c oma og a ía de a inidad po níquel con una columna “1 ml HisT apTM HP column” (GE Heal hca e). El mé odo u ilizado consis ía en el equilib ado de la columna con 15 ml de ampón A !!!!EC S NR 10 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 36 50 64 98 148 N cA Ma e ial y mé odos 71 (T is-HCl 50 mM [pH 8], NaCl 400 mM y 20% de glice ol), seguido de la inyección de la mues a, a la que p e iamen e se le había añadido imidazol 30 mM. El la ado de la columna se ealizaba con el mismo ampón de equilib ado suplemen ado con 30 mM de imidazol. La elución de las p o eínas se ealizaba u ilizando un g adien e de imidazol de 90-500 mM p epa ado en ampón A. N cA eluía a una concen ación de imidazol de 200 mM, y las acciones esul an es se analizaban como en el apa ado an e io . An es de su u ilización en EMSA y ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I, la p epa ación de p o eína N cA se dializaba en e a un olumen de 1 L de un ampón (T is-HCl 50 mM (pH 8), 400 mM NaCl y 50% glice ol) a 4ºC y se suplemen aba con un 20% de glice ol. He R-6His se pu i icaba de mane a simila excep o que la columna se equilib aba con imidazol 6 mM, ambién añadido a esa concen ación a la mues a de p o eína, y la elución se ealizaba con un g adien e de 6-500 mM. He R-6His eluyó a una concen ación ap oximada de 200 mM de imidazol. Las acciones con p o eína pu i icada se dializaban en e a 1 L de ampón os a o sódico 20 mM (pH 7), 150 mM NaCl y 20% de glice ol. Pos e io men e, es as acciones se pu i ica on median e c oma og a ía de a inidad po hepa ina (2.4.2), con un g adien e de NaCl de 0 a 1 M. An es de su u ilización en ensayos TIV, EMSA y de p o ección en e a la deg adación po DNasa I las p epa aciones pu i icadas se dializaban en e a un olumen de 1 L de ampón os a o sódico 20 mM (pH 7), NaCl 250 mM y glice ol 30% du an e 4 h. Figu a. 2.3. Pu i icación de la p o eína He R-His. Análisis median e SDS-PAGE de alicuo as de la acción soluble del ex ac o c udo lib e de células (EC), acción no e enida en la columna (NR), mues as de las acciones ob enidas median e c oma og a ía de a inidad po níquel con un g adien e de imidazol 6-500 mM (4-41). S, pa ón de amaños en kDa. !!!!EC S NR 4 9 11 13 15 17 19 21 23 26 29 33 37 41 He R 64 36 50 98 148 22 Se gio Cama go Be nal 72 Pa a la pu i icación de la p o eína PipX-6His, la columna ue equilib ada ampón T is-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 300 mM y 10% de glice ol. Después de la a la columna con el mismo ampón suplemen ado con 10 mM de imidazol, se uso un g adien e lineal de 50 a 700 mM de imidazol pa a la elución de PipX. PipX eluyó a una concen ación de imidazol de 316,47 mM. Las acciones que con enían PipX ue on mezcladas y some idas a diálisis en e a 1 L de ampón T is-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 300 mM y 30% de glice ol du an e 4 ho as a 4ºC. Figu a. 2.4. P epa ación de p o eína PipX-6His pu i icada. En la igu a se mues an dos can idades dis in as de p o eína PipX as el paso de diálisis. El pa ón de amaños, (en kDa) se mues a en la p ime a calle del gel. 2.4.4. P epa aciones de RNAP de Anabaena ecombinan e 2.4.4.1. Pu i icación de las dis in as subunidades Tan o la subunidad ! como la subunidad sigma (SigA), po ando ambas una cola 6His, se ob enían de cul i os de E. coli (que po aban los plásmidos pCSV25 y pCSAV143, espec i amen e [Tabla 2.4]) a ados con IPTG en las mismas condiciones mencionadas an e io men e (2.4.1). Excep o que pa a la o u a de las células se esuspendían en un ampón de solubilización (T is-HCl 50 mM [pH 8.0], hid oclo u o de guanidina 6M, NaCl 300 mM y 10% de glice ol). T as la o u a de las células y ob ención de las acciones solubles de ambos cul i os (2.4.1), las p o eínas se pu i icaban median e c oma og a ía de a inidad po níquel, u ilizándose una columna de “1 ml HisT apTM HP column” (GE Heal hca e) pa a cada subunidad. El mé odo seguido pa a la pu i icación de ambas subunidades ue el siguien e: T as equilib a las columna con ampón A (T is-HCl 50 mM [pH 8.0], NaCl 300 mM, u ea 6 M y 10% de glice ol), se inyec aba la mues a suplemen ada con 20 mM de imidazol. T as la a la columna con 36 ml de ampón A suplemen ado con 20 mM de 75 25 11 17 PipX Ma e ial y mé odos 73 imidazol, y la elución se ealizaba con un g adien e de 20 a 400 mM de imidazol. Las acciones seleccionadas de cada pu i icación se mezclaban y, as aumen a la concen ación de glice ol al 50%, se gua daban a -20ºC (Fig. 2.5) Figu a. 2.5. Pu i icación de las subunidades !-His y SigA-His de RNAP median e c oma og a ía de a inidad po níquel. A) Pu i icación de la subunidad !. B) Pu i icación de la subunidad SigA. Se some ían a SDS-PAGE alícuo as de la acción no e enida en la columna (NR) y de las acciones ob enidas median e c oma og a ía de a inidad po níquel con un g adien e de imidazol de 0,002 a 0,4 M. A la izquie da se mues a el pa ón de amaños en (KDa). Las subunidades ", "’ y & se ob enían de cue pos de inclusión de cul i os de E. coli que po aban los plásmidos pCSAV155, pCSAV157 y pCSAV159, espec i amen e ( abla 2.4) as inducción con IPTG (2.4.1). T as ecoge las células po cen i ugación, se la aban con ampón T is-HCl 10 mM (pH 8) y se congelaban a -20ºC. Pa a la lisis celula y el aislamien o de los cue pos de inclusión de es as es i pes, las células se esuspendían en 5 ml de ampón de lisis (T is-HCl 50 mM [pH 8.0], hid oclo u o de guanidina 6M, NaCl 300 mM y 10% de glice ol) po g amo de células. T as una p ime a homogeneización, se añadía 1 mg lisozima y 10 mg de desoxicola o !!!! S NR 14 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 40 41 ! 36 50 64 98 148 !!!! S NR 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 SigA 36 50 64 98 148 A B Se gio Cama go Be nal 80 2.6.2. Ensayos de esonancia de plasmones supe iciales (SPR) 2.6.2.1. P incipios básicos En óp ica, el índice de e acción de un medio puede se de inido como el cocien e en e la elocidad de la luz en el acío y la elocidad de la luz en dicho medio. Cuando un ayo de luz pasa de un medio con un índice de e acción mayo (n1) a o o medio con un índice de e acción meno (n2), pa e de la luz es e lejada y pa e de la luz es e ac ada. Es e enómeno ocu e solo si el ángulo de incidencia de la luz es meno a cie o ángulo c í ico. Cuando un haz de luz incide con un ángulo supe io al c í ico se p oduce el enómeno conocido como e lexión o al in e na de la luz, en el que no se p oduce e acción y oda la luz es e lejada. Cuando los ayos de luz inciden con cie os ángulos sob e una lámina ina de me al (o o, pla a, plomo, e c.) se p oduce el enómeno de e lexión o al in e na, y es en es as condiciones cuando cie a acción de la ene gía de la luz inciden e puede in e ac ua con los elec ones deslocalizados de es as láminas me álicas (plasmones supe iciales), p oduciéndose una abso ción de ene gía po pa e de és os y pudiéndose de ec a una disminución de la in ensidad de la luz e lejada. El ángulo de incidencia de la luz que p oduce la esonancia de plasmones (ángulo SPR) se a ec a po di e sos ac o es, siendo uno de los p incipales el índice de e acción ce ca de la pa e pos e io de la lamina me álica. El sis ema Biaco e, u ilizando es e enómeno ísico, ha desa ollado dis in os biosenso es pa a medi in e acción en e biomoléculas. Es os biosenso es cons an de una lamina de o o si uada en la in e az en e un p isma de c is al y un mic o-conduc o po el que pasa líquido ( ampón) (Fig. 2.8). Es a lámina de o o o supe icie senso a, es á ecubie a po una capa de dex ano en la cual, as dis in os a amien os químicos, se pueden inmo iliza dis in as biomoléculas (ligandos). Cuando al pasa ampón con una molécula de e minada (anali o), se p oduce un cambio en el índice de e acción de la supe icie senso a, egis ado como un cambio en el ángulo SPR, se deduce que el anali o in e acciona con el ligando. Los cambios en el ángulo SPR, medidos como cambios en el índice de e acción, son p opo cionales a la masa inmo ilizada en la supe icie y se miden en unidades de esonancia (RU). La ep esen ación de es os cambios de esonancia a lo la go del iempo gene a un senso g ama. Ma e ial y mé odos 81 Figu a. 2.8. Resonancia de plasmones supe iciales. A, Esquema de un biosenso basado en el enómeno SPR ( e ex o). B, Un cambio en el ángulo SPR puede se de ec ado como una disminución de la ene gía de e lexión ( e ex o). C, Fo og a ía del sis ema Biosenso Biaco e X usado en es e abajo. En un ensayo es ánda de SPR se gene a un senso g ama en el que se pueden di e encia es ases p incipales: 1. Fase de equilib ado, du an e la cual la supe icie senso a del chip con el ligando unido es á expues a a un lujo de ampón que p o oca pequeñas a iaciones en la señal de esonancia has a que és a se es abiliza. 2. Fase de asociación, que comienza con la inyección del anali o en el sis ema. T as es a, si anali o y ligando in e accionan se egis a á un aumen o en las unidades de esonancia, has a que se llega a un es ado de equilib io. 3. Fase de disociación, as un la ado casi ins an áneo con ampón pa a elimina el anali o no unido, se p oduce la disociación de és e y el ligando, egis ada como una disminución de las unidades de esonancia. T as es e ciclo el sis ema puede se egene ado pa a se u ilizado de nue o eliminando cualquie in e acción exis en e y cualquie as o de anali o (Fig. 2.9). C n2>n1 Luz e lejada Supe icie senso a (lámina de o o) P isma de c is al (n2) Luz inciden e Tampón (n1) Ángulo (SPR) ! Re lexión 0% 100% Ángulo de incidencia de la luz Ángulo c í ico: Re lexión o al in e na Cambio en el ángulo SPR Disminución de la ene gía de e lexión. A B Se gio Cama go Be nal 82 Figu a. 2.9. Fases p incipales del senso g ama de un ensayo SPR. En la pa e izquie da de la igu a se ep esen a el egis o del senso g ama y en la pa e de echa la supe icie senso a del chip, mos ando el ligando en e de y el anali o en ojo. 2.6.2.2. Análisis SPR de la in e acción P o eína-DNA En es e abajo se ha u ilizado el análisis SPR pa a es udia el e ec o de PipX en la in e acción de N cA con el DNA, . Los expe imen os se ealiza on usando un sis ema BIAco e X biosenso sys em (Biaco e AB, Uppsala, Sweden). Se u iliza on es chip SA, con es ep a idina inmo ilizada co alen emen e en una ma iz de dex ano ca boxime ilada, que pe mi ían ija dis in os agmen os de DNA de doble cadena bio inilados. Pa a gene a la doble cadena de DNA de cada uno de los p omo o es analizados se u iliza on los oligonucleó idos, bio inilados o no, que se ecogen en la Tabla 2.9. En el sis ema BIAco e X biosenso sys em cada chip queda di idido en dos zonas o células independien es, de o ma que en una de las células, denominada FC2, se inmo iliza el dúplex de DNA obje o de es udio, mien as que en la o a célula, FC1, se inmo iliza el dúplex de DNA usado como con ol nega i o. Tiempo Tiempo Resonancia RU Tiempo Resonancia RU Resonancia RU Fase de equilib ado (Flujo de ampón) Fase de asociación (In e acción anali o/ligando) Fase de disociación (Disociación anali o/ligando) Ma e ial y mé odos 83 Pa a la gene ación de los agmen os de DNA de doble cadena u ilizados, 5 µM de la pa eja de oligonucleó idos bio inilado y no bio inilado co espondien e (Tabla 2.9), en un olumen de 100 µl de ampón T is-HCl (pH 7,4) 10 mM, EDTA 1 mM y NaCl 100 mM, se calen aba has a 95ºC y se iba en iando p og esi amen e has a 35ºC en un e mociclado . P e iamen e a la inmo ilización de cada agmen o de DNA, la supe icie del chip senso , se some ía a un la ado con ampón HBS (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 300 mM, EDTA 0,2 mM y 0,005% de nonide P-40) de 6 min con un lujo de 10 µl/min. T as es e la ado la supe icie se ac i aba con cua o inyecciones consecu i as de ampón de ac i ación (NaCl 1 M y NaOH 50 mM) a un lujo de 20 µl/min. T as la ac i ación, la supe icie senso a se ol ía a la a con ampón HBS has a que la señal de esonancia e a es able. Cada agmen o de DNA se diluía has a una concen ación inal de 0,25 µM en ampón HBS, inyec ándose 50 µl de es a disolución en el sis ema. La inyección de la mues a se ealizaba a un lujo de 10 µl/min has a que se alcanzaban 350-380 RU (después de ap oximadamen e 30 s), momen o en el cual se pa aba la inyección. Todos los ampones se il aban y desgaseaban an es de se usados. Todos los ensayos se lle a on a cabo a 25ºC. Las p o eínas se p epa aban en ampón HBS y se incubaban 20 min a 37ºC. 75 µl de dichas p epa aciones se inyec aban simul áneamen e en ambas células del chip (FC1 y FC2) a un lujo de 30 µl/min. Pa a cuan i ica la especi icidad de unión se egis aba la di e encia de esonancia en e FC2 y FC1 ('RU). Después de cada inyección, la supe icie del chip se egene aba con inyecciones de NaCl 2 M. Los da os ob enidos se p ocesaban u ilizando los p og amas BiaE alua ion 3.0 (Biaco e AB) y KaleidaG aph 4.0 (1896-2006 by Syne gy So wa e). Se gio Cama go Be nal 84 Tabla 2.9. Oligodesoxinucleó idos usados en la gene ación de dúplex de DNA pa a ensayos SPR. En neg i a se señalan los si ios de unión del egulado N cA. Median e sub ayado las posibles cajas -10, y esal ado en e de los TPPs. B n, bio ina. 2.6.3. Ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I (Foo p in ing) Los agmen os de DNA u ilizados en es os ensayos se ob enían median e ampli icación po PCR u ilizando un oligonucleó idos ma cado adiac i amen e con la enzima polinucleo ido quinasa del ago T4 (2.2.8.5 C). El p oduc o de PCR se some ía a ex acción con un olumen de enol:clo o o mo (1:1, [ / ]), sepa ándose las ases cen i ugando 2 min a 20238 x g. El DNA se p ecipi aba as la adición de ace a o amónico 2,5 M (pH 7,5), glucógeno 0,01 µg·µl-1 y 2,5 olúmenes de e anol absolu o ío a las mues as, que se congelaban en ni ógeno líquido. T as una nue a cen i ugación (15 min a 20,238 x g), el p ecipi ado esul an e se la aba con e anol al 70% ( / ), se secaba al ai e y se esuspendía con 50 µl de agua desionizada. Oligonucleó ido Secuencia (5’-3’) Posición/gen P2de B-F [B n]TCATTTGTACAGTCTGTTACCTTTACCTGAAACAGATGA ATGTAGAATTTATAAA -756 a -702 de B P2de B-R TTTATAAATTCTACATTCATCTGTTTCAGGTAAAGGTAACAGA CTGTACAAATGA -702 a -756 de B P1de B-F [B n]AAAACCTTTGATAGAACCTCTTCAAAAAAACAAATAAAG TCATCTAAGTTGCAGAAAA -541 a -484 de B P1de B-R TTTTCTGCAACTTAGATGACTTTATTTGTTTTTTTGAAGAGGT TCTATCAAAGGTTTT -484 a -541 de B n A-F [B n]GGCTAGAGTAACAAAGACTACAAAACCTTGGGCATGGG CTTGTTACTTTGAAATT -81 a -27 n A n A-R AATTTCAAAGTAACAAGCCCATGCCCAAGGTTTTGTAGTCTT TGTTACTCTAGCC -27 a -81 n A psbA-F [B n]CTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAGGTTTAGGATGAAAA CTAGAGGATCTCAATG -145 a -91 psbA psbA-R CATTGAGATCCTCTAGTTTTCATCCTAAACCTAAAGTGAATAG CTCACTTATCAG -91 a -145 psbA Ma e ial y mé odos 85 10 mol de los agmen os de DNA ma cados se incubaban con las p o eínas en un olumen inal de 13,5 µl de ampón T is-HCl 23 mM (pH 8.0), KCl 80 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 5 mM, DTT 2 mM, BSA 0,07 mg/ml, Poly (dI-dC) 0,07 mg/ml, du an e 30 min a 30ºC. T as es a incubación, se añadía 1,5 µl de una mezcla que con enía 1 U de DNasa I (Roche) en CaCl2 100 mM y MgCl2 100 mM y, as incubaciones muy co as a 30ºC (0-30 s), se pa aba la eacción con la adición de 4 µl de una disolución con eniendo 1,5 M de ace a o sódico (pH 5,2), 100 mM EDTA (pH 8), 1 mg/ml de DNA de espe ma de salmón y 2,5 mg/ml de glucógeno. El DNA se p ecipi aba añadiendo a las mues as 2,5 olúmenes de e anol absolu o ío y sume giendo los ubos en ni ógeno líquido. Pos e io men e, las mues as se cen i ugaban 15 min a 20,238 x g y el p ecipi ado esul an e se la aba con e anol al 70 % ( / ), se secaba al ai e y se esuspendía en 3 µl de una disolución que con enía: o mamida 97,5 % ( / ), xilenocianol FF 0,3 % (p/ ), azul de b omo enol 0,3 % (p/ ) y EDTA 10 mM (pH 8) (Samb ook y Russel, 2001). Las mues as se esol ían en un gel de poliac ilamida al 6% con 8 M de u ea (apa ado 2.2.7). Como pa ón de amaños se incluía en la elec o o esis eacciones de secuenciación lle adas a cabo con el mismo agmen o de DNA y el oligonucleó ido u ilizado pa a su ampli icación (apa ado 2.2.7). 2.7. MICROSCOPIA LÁSER CONFOCAL En es e abajo se ha u ilizado la p o eína es igo GFP-mu 2, una e sión modi icada de la p o eína e de luo escen e que p esen a un pico de exci ación a 481 nm y de emisión a 507 nm (Co mack e al., 1996). La luo escencia de la GFP se analizaba median e mic oscopía láse con ocal en un mic oscopio Leica TCS SP2 (Leica, We zla , Alemania) con un obje i o de inme sión en acei e HCX PLAN-APO 63X 1.4 NA. Exci ando con luz de una longi ud de onda de 488 nm p opo cionada po un láse de a gón. Se u iliza on en anas de cap ación de 500-538 nm pa a la luo escencia de la GFP, y de 630-700 nm pa a la au o luo escencia de las cianobac e ias. Todas las imágenes de un mismo expe imen o se adqui ían con los mismos pa áme os, de o ma que se podía es ablece una compa ación en e ellas. Se gio Cama go Be nal 86 2.8. ANÁLISIS INFORMATICO DE SECUENCIAS DE DNA Y PROTEÍNAS Pa a la búsqueda de pau as de lec u a abie as (ORFs), localización de si ios de es icción y aducción de secuencias nucleo ídicas a secuencias de aminoácidos, se u ilizaba el p og ama DNA-S ide diseñado po C. Ma k (Se ice de Biochimie, Cen e d’É udes Nucléai es de Saclay, F ancia). Pa a el diseño de los oligodesoxinucleó idos u ilizados como cebado es en eacciones de PCR se empleaba el p og ama Ampli y e sión 3.1.4 diseñado po B. Engels (Gene ics Depa men , Uni e si y o Wisconsin, EE.UU.). La secuencia del genoma comple o de Anabaena sp. PCC 7120 (Kaneko e al., 2001) és a disponible en “Cyanobase” (h p://bac e ia.kazusa.o .jp/cyanobase/). Se gio Cama go Be nal 3. RESULTADOS Resul ados 89 3.1. GENERACIÓN DE MUTANTES DEL GEN he R Pa a ealiza un es udio más exhaus i o del papel que el egulado He R iene en la ac i ación de algunos p omo o es de la di e enciación se gene a on dos nue os mu an es del gen he R. En uno de los mu an es se inac i ó el gen he R median e deleción de la mayo pa e de es a ORF y en el o o se inac i ó es e gen median e deleción e inse ción de una case e de esis encia a an ibió icos. Pa a la gene ación del mu an e de deleción del gen he R, se ampli ica on median e PCR dos agmen os de DNA. Un agmen o cub ía desde la posición -558 has a la posición +200 con espec o al comienzo del gen he R, y el o o agmen o cub ía desde la posición +714 has a la posición +1460, es e úl imo incluía las 184 pb del ex emo 3’ de he R y 562 pb sob epasando el inal del gen. Pa a la ampli icación de ambos agmen os se u ilizó DNA genómico p oceden e de Anabaena sp. PCC 7120 como molde. Pa a la ampli icación del p ime agmen o se u iliza on los oligonucleó idos al 2329-19 (que in oduce una diana BamHI) y al 2329-20 (que in oduce una diana NheI) pa a gene a un agmen o de 0,75 kb. Pa a la ampli icación del segundo agmen o se u ilizó la pa eja de oligonucleó idos al 2339-22 (que in oduce diana NheI) y al 2339-21 (que in oduce una diana XhoI) gene ándose un agmen o de 0,75 kb. Los dos agmen os se digi ie on con la endonucleasa NheI y se liga on, gene ándose un único agmen o de 1,5 kb. Es e agmen o esul an e se ampli icó po PCR usando los oligonucleó idos al 2339-19 y al 2339-21, pos e io men e se digi ió con las endonucleasas de es icción BamHI y XhoI y se clonó en el plásmido pRL278. pRL278 es un plásmido conjuga i o que pe mi e la selección de dobles ecombinan es, al posee un de e minan e de esis encia a Nm (NmR) y el gen sacB que con ie e sensibilidad a saca osa (Cai y Wolk, 1990). El plásmido esul an e ue denominado pCSSC7 (Fig. 3.1). Se gio Cama go Be nal 96 Como se puede ap ecia en la igu a 3.6B, el inc emen o en la abundancia de ansc i os o iginados en ambos TSPs que se obse aba en la es i pe sil es e as 6 ho as y, especialmen e, as 12 ho as de incubación en ausencia de ni ógeno combinado no se p oducía en la es i pe mu an e CSE2 (n cA). Po o a pa e, en ninguno de los dos mu an es he R se obse aba la acumulación máxima del ansc i o o iginado en el TSP p oximal (Fig. 3.6B pa a DR884a y Fig. 3.6C pa a CSSC2). En cambio, la ansc ipción desde el p omo o dis al pa ecía no es a a ec ada en los mu an es del gen he R. 3.2.2. Análisis del pa ón espacio- empo al de la exp esión de los dis in os p omo o es del gen de B Pa a es udia la localización celula de la exp esión génica desde cada p omo o de de B, así como desde la egión p omo o a comple a, y la in luencia de N cA y He R, se gene a on es i pes que exp esan el gen g p-mu 2 a pa i de di e en es agmen os de DNA que incluyen el p omo o dis al, p omo o p oximal o ambos p omo o es del gen de B. El análisis se ealizó en los ondos sil es e, mu an e n cA y mu an e he R. Pa a cons ui dichas es i pes se ampli ica on es agmen os de DNA de la egión p omo o a de de B u ilizando el plásmido pCSAM155 (con iene un agmen o de DNA que cub e desde la posición -825 has a +17 con espec o al inicio de la aducción del gen de B [Mu o-Pas o e al,. 2009]) como molde y las siguien es pa ejas de oligonucleó idos: al 3710-30/al 3710-35, al 3710-30/al 3710-32 y al 3710-33/al 3710- 31. Las es pa ejas de oligonucleó idos incluyen dianas pa a las endonucleasas de es icción ClaI y XhoI (Tabla 2.7). Los agmen os esul an es se clona on delan e del gen g p-mu 2, que a p ecedido po su p opia secuencia Shine-Dalga no, con enido en el plásmido pCSAM211 (Ionescu e al,. 2010), gene ándose los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20, espec i amen e. El plásmido pCSAM211 es á basado en el pDUCA7, el cual con iene una case e de esis encia a Nm e incluye el eplicón pDU1 (Buikema y Haselko n, 1991b), po lo que an o es e plásmido como sus de i ados pueden ans e i se a, y eplica se en, Anabena sp. PCC 7120 (Fig. 3.7). Los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20, así como el plásmido pCSAM211 usado como con ol de la luo escencia basal, se ans i ie on a las es i pes Anabaena sp. PCC 7120, CSE2 (n cA) y CSSC2 (he R) po conjugación ipa en al, seleccionándose clones esis en es a Nm. De es a o ma se gene a on 12 es i pes di e en es, cuya es uc u a gené ica se analizó median e PCR u ilizando DNA o al de los clones seleccionados como molde y las pa ejas de oligonucleó idos pDU1/g p-5, pa a de ec a la p esencia Resul ados 97 del plásmido ans e ido, y las pa ejas de oligonucleó idos pDU1/al 37310-16, pDU1/al 3710-15 y al 3710-34/g p-5, espec i amen e, pa a analiza si se había p oducido la in eg ación del plásmido co espondien e en la egión c omosómica del gen de B. El esul ado de es e análisis ue que odos los clones con enían de o ma lib e el plásmido que se les había ans e ido, excep uando los que po aban la cons ucción con ambos p omo o es di igiendo la exp esión de g p-mu 2 en los ondos sil es e y mu an e he R, que enían mayo i a iamen e el plásmido in eg ado en la egión c omosómica de B (da os no mos ados). Figu a 3.7. Rep esen ación esquemá ica de la cons ucción de los plásmidos con las cons ucciones Pde B-g p-mu 2. A, Se mues an la egión c omosómica de B y los dis in os agmen os del p omo o de B usados pa a lle a a cabo las usiones ansc ipcionales. Los iángulos neg os indican los dis in os oligonucleó idos usados pa a la ampli icación de los agmen os de DNA. El ec ángulo ojo ep esen a el si io de unión de N cA en el p omo o dis al. Se indican los TSPs (pun as de lechas neg as). B, Esquema del plásmido pCSAM211 mos ando sus p incipales de e minan es así como las dianas de es icción ele an es. pDU1 o iV np II (NmR) cos g p (Shine-Dalga no) SD BamHI XbaI SalI Ps I XhoI BglII ClaI EcoRI EcoRI pCSAM211 (pDUCA7) de B -454 -704 -454 -704 al 3710-35 (XhoI) al 3710-30 (ClaI) -704 al 3710-32 (XhoI) -454 al 3710-35 (XhoI) al 3710-33(ClaI) A B al 3710-30 (ClaI) Se gio Cama go Be nal 98 Se selecciona on clones que po aban los plásmidos pCSSC18, pCSSC19 y pCSSC20 en ondo sil es e, denominándose CSSC6, CSSC7 y CSSC8, espec i amen e. Los clones seleccionados en ondo mu an e n cA, se denomina on CSSC9, CSSC10 y CSSC11, espec i amen e; y CSSC12, CSSC13 y CSSC14 los del ondo mu an e he R. Los clones seleccionados que po aban el plásmido con ol pCSAM211 en ondo sil es e, mu an e n cA y mu an e he R , se denomina on CSSC15, CSSC16 y CSSC17, espec i amen e. Las es i pes así gene adas se cul i a on con agi ación en un medio BG110 + NH4+. Pos e io men e los ilamen os se incuba on en ausencia de ni ógeno combinado, omándose mues as a dis in os iempos pa a se es udiadas. El análisis de la luo escencia de la p o eína GFP se ealizó median e mic oscopía con ocal, según se desc ibe en Ma e iales y Mé odos (apa ado 2.7). T as la incubación en ausencia de ni ógeno combinado, las es i pes CSSC6, CSSC7 y CSSC8 (que exp esan el gen g p-mu 2 desde ambos p omo o es, solo el dis al y solo el p oximal, espec i amen e, en ondo sil es e) mos a on ni eles al os de luo escencia p incipalmen e en células que, po su mo ología y pé dida de au o luo escencia, se iden i ica on como p ohe e ocis os o he e ocis os (Fig. 3.8). No obs an e, en el caso de CSSC7 la exp esión e a ambién conside able en el es o de células del ilamen o. En las es i pes mu an es n cA, CSSC9 (p omo o comple o), CSSC10 (p omo o dis al) y CSSC11 (p omo o p oximal) no se de ec aba luo escencia de GFP po encima del ni el basal. En e las es i pes mu an es he R, CSSC12 y CSSC13 (ambos p omo o es y p omo o dis al, espec i amen e) mos aban un ni el de luo escencia al o en odas las células del ilamen o, mien as que en la es i pe CSSC14 (p omo o p oximal) la luo escencia e a inde ec able (Fig. 3.8). Resul ados 99 Figu a 3.8. Exp esión del gen g p-mu 2 di igido desde los p omo o es del gen de B en los ondos sil es e, mu an e n cA y mu an e he R. Se mues an las mic og a ías de luo escencia de la GFP (pa e supe io ) y campo cla o (pa e in e io ), de ilamen os cul i ados con gaseo en medio BG110-NH4 + e incubados 40 ho as en medio BG110. En la pa e de echa se mues a un esquema de la egión p omo o a que en cada caso di ige la exp esión del gen g p-mu 2. Las lechas blancas señalan (p o)he e ocis os. Ba a de escala, 10 µm. !"# !"#$% &'"(% CSSC6 CSSC9 CSSC12 CSSC7 CSSC10 CSSC13 CSSC8 CSSC11 CSSC14 g p -704 -454 $%&'(#)*'%'+'*,(# -704 g p #-*'%'+'*#./(+01# -454 g p #-*'%'+'*#)*'2/%01# Se gio Cama go Be nal 100 3.2.3. Análisis in i o de la ac i idad ansc ipcional de la egión p omo o a del gen de B. E ec o de N cA y He R. De los es udios ealizados in i o se pudo conclui que mien as que el p omo o dis al del ag upamien o génico de BCA depende exclusi amen e del egulado N cA, el p omo o p oximal depende an o de N cA como de He R. Dado que en e es os dos egulado es exis e una dependencia mu ua en su ac i ación, y que además la exp esión de o os egulado es que in e ienen du an e el p oceso de di e enciación depende de N cA y He R, e a di ícil disce ni median e ensayos in i o si N cA y He R juegan un papel di ec o en la ac i ación de p omo o es. Po ello, decidimos es udia el papel de N cA y He R in i o en sis emas bien de inidos. 3.2.3.1. Ensayos de ansc ipción in i o En abajos p e ios de nues o g upo se puso a pun o un sis ema TIV que incluye la RNAP de Anabaena sp. PCC 7120 econs i uida a pa i de sus subunidades clonadas y exp esadas en E. coli. U ilizando es e sis ema in i o se demos ó que la p esencia de N cA y 2-OG e a necesa ia y su icien e pa a que se p odujese ansc ipción desde el p omo o dis al de de B (Vallada es e al., 2008). Pa a ensaya el p omo o p oximal y la egión p omo o a comple a, se gene a on median e PCR dis in os agmen os de DNA, usando como molde el plásmido pCSAM155 (posiciones -825 has a +17 con espec o al pun o de inicio de la aducción del gen de B [Mu o-Pas o e al,. 2009]) y las pa ejas de oligonucleó idos al 3710-1/al 310-16 pa a la ampli icación del agmen o a, al 3710-17/al 3710-16 pa a el agmen o b y al 3710-18/al 3710-16 pa a el agmen o c (Fig. 3.9A). Cuando se u ilizaba en ensayos TIV el agmen o que incluye ambos p omo o es se p oducía un ansc i o de 411 nucleó idos (dis ancia desde el TSP -704 has a el inal del agmen o) siemp e que es u ie an p esen es N cA y 2-OG (Fig. 3.9, agmen o a). Cuando se u ilizaban los agmen os que incluyen sólo el p omo o p oximal, se p oducía un ansc i o de 161 nucleó idos (dis ancia en e el TSP -454 y el inal del agmen o), equi iéndose ambién la p esencia de N cA y 2-OG. (Fig. 3.9, agmen os b, c). Es e ansc i o p oceden e del p omo o p oximal se p oducía ambién desde el agmen o a, si bien se gene aba más e icazmen e en ausencia del p omo o dis al (Fig. 3.9B compa a calle 2 con las 5 y 7). Resul ados 101 En es os ensayos ambién se incluyó el egulado He R. Cuando se u ilizaba el agmen o que con enía ambos p omo o es, He R no pa ecía ene e ec o signi ica i o en la ansc ipción. Sin emba go, cuando se u ilizaban agmen os que sólo incluían al p omo o p oximal, He R enía un cie o e ec o posi i o en la p oducción de ansc i os. Aunque es e e ec o posi i o e a pequeño, se obse aba epe idamen e (Fig. 3.9B agmen o c). Po o a pa e, la ac i idad del p omo o dis al pa ecía ene un e ec o nega i o sob e la del p oximal, aunque la elación en e la ac i idad de ambos p omo o es puede se di e en e in i o dependiendo de las concen aciones de los ac o es egulado es implicados. Figu a 3.9. E ec o de N cA y He R en la ansc ipción in i o desde los p omo o es del gen de B. A, Esquema de los agmen os de DNA usados en TIV. Se indica la localización ap oximada de los TSPs -454 y -704, las posibles cajas -10 (azul) y el si io consenso de unión de N cA ( ojo). B, Ensayos TIV ealizado con los es agmen os ep esen ados en el panel A, p e iamen e incubados en p esencia o ausencia de N cA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) y He R (28 nM), según se indica, an es de se incubados con la RNAP (27 nM) suplemen ada con SigA (88 nM). Las lechas señalan los ansc i os gene ados desde cada TSP (indicados en e pa én esis). El ma cado de amaños (20 bp Molecula Rule DNA Size S anda , Bio-Rad) se p esen a a la izquie da de la igu a. -825/-293 (al 3710-1/al 3710-16) (a) -731/-293 (al 3710-17/al 3710-16) (b) -652/-293 (al 3710-18/al 3710-16) (c) N cA+2-OG - + + - + - + + He R - - + - - - - + !" #" !""#$# %&"#$# %'"#$# (""#$# '""#$# 161 n (-454) 411 n (-704) -10 box -10 box -704 -454 de B Si io de unión de N cA 1 2 3 4 5 6 7 8 Se gio Cama go Be nal 102 3.2.3.2. EMSA de la unión de N cA al DNA en la egión comp endida en e los TSPs del gen de B Dado que pa a que se p oduje a ansc ipción in i o desde el p omo o p oximal del gen de B se equie e de la p esencia de N cA y su e ec o 2-OG, y eniendo en cuen a que en es a egión no se había iden i icado ningún si io de unión de N cA, se decidió ensaya la unión in i o de es e egulado a la egión de DNA comp endida en e los dos TSPs. Se lle a on a cabo ensayos EMSA según se desc ibe en el apa ado 2.6.1 de Ma e iales y Mé odos, empleando la p o eína N cA pu i icada (apa ado 2.4.3) y un agmen o de DNA que incluía los TSPs de es a egión pe o no el si io de unión de N cA del p omo o dis al (Fig. 3.10A, agmen o d). Es e agmen o se ob u o median e PCR u ilizando los oligonucleó idos al 3710-17 y al 3710-19 y el plásmido pCSAM155 como molde. Como se puede ap ecia en la igu a 3.10B, al inc emen a la concen ación de N cA apa ecían una o dos bandas e asadas que iban aumen ando en p opo ción espec o a la del agmen o lib e. Es as dos bandas se ap eciaban bien u ilizando concen aciones de N cA de 10 ó 20 µM, equi iendo la más len a una mayo concen ación de N cA, además de exhibi una ue e dependencia de 2-OG. (Fig. 3.10C). Pa a comp oba la especi icidad de la unión, se lle a on a cabo ensayos EMSA en p esencia de un exceso de di e en es agmen os de DNA no ma cados adiac i amen e: el mismo agmen o u ilizado en el ensayo, un agmen o que incluía el si io de unión de N cA consenso del p omo o dis al de de B (Fig. 3.10A, agmen o e) y un agmen o que incluía el p omo o del gen psbA (posiciones -145 a +47) de Ama an hus hyb idus, al que N cA no se une. Pa a ampli ica el agmen o e se u iliza on los oligonucleó idos al 3710-1 y al 3710-2 y el plásmido pCSAM155 como molde, y pa a la ampli icación del agmen o del p omo o del gen psbA, los oligonucleó idos CK3-1 y CK3-2 y como molde el plásmido pRL278. En la igu a 3.10D se obse a que al añadi un exceso de DNA no ma cado ( agmen os d y e), se p oducía un descenso de la p opo ción de agmen o adiac i o (d) e asado, mien as que la adición de un exceso de un agmen o no adiac i o no elacionado (PpsbA) no enía ningún e ec o. Po an o, la unión de N cA a la egión de DNA en e los dos TSPs del gen de B es especí ica. Resul ados 103 Figu a 3.10. Ensayos de e a do en gel de la unión de N cA al DNA en e los dos TSPs del gen de B. A, Esquema de la egión p omo o a del gen de B en el que se mues an los agmen os u ilizados. B, C y D, 2 mol de agmen o (d) se incuba on, como se indica, con N cA pu i icada (en p esencia de 0,6 mM de 2-OG, excep o cuando es indicado en el panel C) an es de some e a elec o o esis. Las concen aciones de N cA en el panel B son las siguien es: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 y 10 µM. D, La concen ación de N cA e a de 0,6 µM; se u ilizó un exceso de DNA no ma cado (100x y 200x) de los agmen os d y e, y 100x, 200x y 300x del agmen o de PpsbA. Se indica el agmen o lib e ( iángulos blancos) y los agmen os unidos a N cA ( iángulos neg os). Los núme os en la pa e in e io de las igu as indican el po cen aje de agmen o e asado espec o al DNA o al en cada calle. !" N cA - 2-OG + - + - + - + - + N cA (µM) - 2 4 10 20 - 8 4 2 10 5 3 - 22 24 26 24 25 #" $" - - (d) (e) - (PpsbA) %" -10 box -10 box -731/-452 (al 3710-17/al 3710-19) (d) -825/-571 (al 3710-1/al 3710-2) (e) -704 -454 de B Si io de unión de N cA Se gio Cama go Be nal 104 3.2.3.3. Ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I Pa a de e mina las secuencias de DNA con que in e acciona N cA en la egión comp endida en e los dos TSPs de la egión p omo o a de B, se lle a on a cabo expe imen os de p o ección po N cA en e a la deg adación po DNasa I (apa ado 2.6.3, Ma e iales y Mé odos). Pa a ello se u iliza on agmen os que cub ían la misma egión que los u ilizados en los ensayos EMSA. Dependiendo de qué cadena de la doble hélice se quisie a analiza , se u ilizaba uno u o o de los dos oligonucleó idos ma cados adiac i amen e, al 3710-17 pa a la cadena supe io (cadena codi ican e) o al 3710-19 pa a la cadena in e io (cadena no codi ican e). Los agmen os ma cados se incubaban con dis in as concen aciones de la p o eína N cA pu i icada (apa ado 2.4.3), y pos e io men e se some ían a un a amien o con DNasa I. Finalmen e, los p oduc os gene ados po es a diges ión se esol ían en geles de u ea-poliac ilamida (apa ado 2.2.7, Ma e iales y Mé odos). Se pudo obse a que la p esencia de N cA p o ocaba cambios en el pa ón de diges ión en ambas cadenas. (Fig. 3.11A y B). Se de ec a on dos zonas p incipales de cambios, o en anas de p o ección, con algunas posiciones exhibiendo hipe sensibilidad a la diges ión. Cuando se u iliza on o os agmen os con los que se esol ían mejo de e minadas zonas de la egión de DNA es udiada, no se encon a on o os cambios signi ica i os y epe i i os ue a de es as dos zonas p incipales de p o ección (no mos ado). En la igu a 3.12 se ep esen a la egión de DNA es udiada y los esul ados ob enidos de es e análisis. Al examina la secuencia de las dos en anas de p o ección de N cA obse adas, se encuen a una secuencia GTCN8TGC, que ecue da al consenso de los si ios de unión pa a es e egulado (los nucleó idos que coinciden con el consenso se señalan en neg i a). Conjun amen e, los esul ados de los ensayos EMSA y de p o ección en e a la deg adación po DNasa I indican una in e acción especí ica de N cA con el DNA en e los dos TSPs del gen de B, posiblemen e en dos posiciones di e en es. Resul ados 105 Figu a 3.11. Análisis de p o ección po N cA en e a la diges ión po DNasa I en la egión de DNA si uada en e los dos TSPs del gen de B. Los ensayos se lle a on a cabo u ilizando dis in as concen aciones de la p o eína N cA, al como se indica, en p esencia de 0,6 mM de 2-OG. A) Ensayo de p o ección en la cadena supe io , u ilizando el agmen o ampli icado con la pa eja de oligonucleó idos al 3710-17 (ma cado)-al3710-26 (no ma cado). B) Ensayo de p o ección en la cadena in e io , u ilizando el agmen o ampli icado con los oligonucleó idos al 3710-17 (no ma cado) y al 3710-19 (ma cado). Como pa ón de amaños se u iliza on las eacciones de secuenciación ealizadas con el plásmido pCSAM155 y el oligonucleó ido al 3710-16 o al 3710-19, espec i amen e. Las líneas e icales delimi an zonas de p o ección po N cA, y en ellas los iángulos señalan posiciones de hipe sensibilidad a la deg adación. N cA (µM) - - 1.0 2.5 5.0 10 A C G T N cA (µM) - - 1.0 2.5 5.0 A G T C !" #" Cadena supe io Cadena in e io Se gio Cama go Be nal 112 Figu a 3.16. Región p omo o a del gen n cA en Anabaena sp. PCC 7120. A, Esquema de la egión p omo o a de n cA en el que se señalan con lechas los TSPs. También se ep esen an, median e ec ángulos ojos, los si ios de unión de N cA: cen ado en la posición -143,5 el “si io dis al” y cen ado en -103,5 el “si io p oximal”, y las posibles cajas -10 de los p omo o es P1 y P2 ( ec ángulos azules). B, Secuencia de nucleó idos de es a egión p omo o a, donde se indican en ojo los hemisi ios de unión del egulado N cA. Los posibles hexáme os -10 se indican en neg i a. El inicio del gen n cA , señalado en ojo, se indica como +1. 3.3.2.1. E ec o de N cA y He R Pa a es udia el e ec o de N cA y su e ec o el 2-OG en la ac i ación ansc ipcional de los dis in os p omo o es del gen n cA, se u iliza on dis in os agmen os de DNA de es a egión p omo o a en ensayos TIV. Uno de es os agmen os con enía la egión p omo o a comple a y se ampli icó u ilizando el plásmido pCSE4b como molde y los oligonucleó idos al 4392-13 y al 4392-43 (Fig. 3.17A, agmen o a). O o agmen o incluía odos los TSPs, pe o sólo 15 nucleó idos de la egión que p ecede al p omo o P3; pa a su ampli icación se u iliza on los oligonucleó idos al 4392-44 y al 4392-43 (Fig. 3.17A, agmen o b). En o o de los agmen os se excluyó el p omo o P3 y la egión comp endida en e las posiciones -180 y -143, que se había desc i o pod ía ene un papel nega i o en la exp esión de los p omo o es si uados de ás; es e agmen o se ampli icó con los oligonucleó idos al 4392-45 y al 4392-43 (Fig. 3.17A, agmen o c) y, po ul imo, un agmen o que con enía el p omo o P1 y del -180 -136 n cA -49 P3 P1 P2 !"#$%&' !"($%&' !"#$%&#$'()!"#$%&$$'() CCAGTCAGATTCAGCATAGAGATTTTTGTTGTCATTAATGTGATCGATTCATTTGTACAGCTTGACAGAAATC ACTACCCAGTAGAAGAGGTAATCAAGCTATGTTGGGAATTTTCTTGCTGTTTAACTCGAAAGAATGTCTAGGG GACAGGAGGAGAGCAAGAGAGGCAAGGTAGGCCAGGGAGGAAAGAGGTTCAGAATTTTTCTTTTCCCCCTTAC TCAAGAACAGCCTGCCTGAACCAAGATAGGACTTAGGCAATCTATACCCCTATACCCCTATACCCCTATACCC CTACACCCTTATCCAAACCCTTTATCTTTGTTTTATACATGGTTAGCAAAAATGATGATTATTAAGGGCGTTT TTTAGAATAAAATGTTTGTTATTTCTTAAGATATTTTCAAGATTACTTAATTTTTTCTGCAAAAAACCTGATG GTTAGAGAAAGTAGAAGTATCTATCAAGAACTGCTAGCTAAAAATAGCAAAAGTTGGGTATCATTATGAACAA ATAACCATAAAGTTGTACGTTTGAGTATAGGAAAGTACAGAAAGGTTAACGGTGCTTTATTGATTTTTCAGGT GTATTCTTAGGTAATTAGTTTTTAGTTTTTTGTTATTCCGGCATTGGGTAGGGGAAGGGAGATGATCGTGACA CAAGATAAGGCCCTAGCAAATGTTTTTCGTCAGATGGCAACCGGAGCTTTTCCTCCTGTTGTCGAA! *+,) *-&.) *-/0) 1-) $) 2) Resul ados 113 que se excluye on los dos si ios de unión del egulado N cA (Fig. 3.17A, agmen o d). Es os agmen os se u iliza on en ensayos TIV en p esencia de N cA y 2-OG. El amaño espe ado pa a los ansc i os p oceden es de cada p omo o e a: 125 nucleó idos (P1), 214 n (P2) y 239 n (P3). Figu a 3.17. E ec o de N cA y 2-OG en la ansc ipción in i o desde la egión p omo o a de n cA. A, Esquema de los agmen os de DNA u ilizados en los ensayos TIV. Los ensayos ue on ealizados con los agmen os a y b (panel B) y con los agmen os c y d (panel C) p e iamen e incubados en p esencia o ausencia de N cA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) an es de la adición de RNAP-SigA (27 nM) y SigA (88 nM). Los iángulos señalan los ansc i os gene ados. En C, se indica con un iangulo blanco un ansc i o p oducido desde el p omo o P1. El ma cado de amaños se mues a a la izquie da de las igu as. Cuando se u ilizó el agmen o comple o a o el agmen o b, se de ec ó un ansc i o de unos 214 nucleó idos, que se co esponde con el amaño espe ado pa a el que comenza a en P2, pe o no se pudo ap ecia ansc ipción desde P1 o P3. No se obse ó ningún e ec o de N cA y 2-OG (Fig. 3.17B). Con el agmen o b se de ec ó además una banda muy enue que co esponde ía a un ansc i o de unos 125 n , aún menos ep esen ado en p esencia de N cA (Fig. 3.17B). Cuando se u ilizó el agmen o c ambién se p odujo es e úl imo ansc i o, p incipalmen e en ausencia de N cA (Fig. 3.17C). -180 -136 n cA -49 P3 P1 P2 !"#$%&' !"($%&' !"#$%&#$'()!"#$%&$$'() -645/+77 (al 4392-13/al 4392-43) (a) -195/+77 (al 4392-44/al 4392-43) (b) -156/+77 (al 4392-45/al 4392-43) (c) -100/+77 (al 4392-46/al 4392-43) (d) $) )(('!' )#('!' ")('!' $(('!' 214 n 125 n )(('!' ")('!' "#('!' )#('!' 125 n N cA - + - + ''' N cA - + - + ''' *) ') Se gio Cama go Be nal 114 En p esencia de N cA se p oducía además un ansc i o algo mayo , de ap ox. 135 n , en de imen o del de ap ox. 125 n (Fig. 3.17C, agmen o c). Cuando se u ilizó un agmen o en el que se excluyía an o el si io de unión dis al como p oximal de N cA ( agmen o d), es e ansc i o no se de ec aba, de ec ándose sólo el ansc i o de 125 n , sin e ec o de N cA. Pa ece po an o que el ansc i o de ap ox. 135 n es el esul ado de la ope ación egulada po N cA de P1. También se p obó el e ec o de He R en TIV con los agmen os a y c. No obs an e, en ningún caso se obse ó un e ec o signi ica i o de la p esencia de és e. 3.3.3. Ac i ación ansc ipcional en la egión p omo o a del gen he R La egión p omo o a de he R incluye cua o p omo o es cuyos TSPs se localizan en las posiciones -728, -696, -271 y -184 ( espec o al inicio de aducción del gen he R) (Buikema y Haselko n, 2001). La ansc ipción desde el p omo o P1, o iginada desde la posición -184, es independien e del es ado ni ogenado (Buikema y Haselko n, 2001; Mu o-Pas o e al., 2002). La ansc ipción desde los p omo o es P4 y P3, o iginadas desde las posiciones -728 y -696 espec i amen e, se ac i a en ausencia de ni ógeno combinado (Buikema y Haselko n, 2001; Mu o-Pas o e al., 2002). In i o la exp esión desde P4 depende del egulado N cA (Mu o-Pas o e al., 2002), aunque se c ee que es a dependencia se eje ce de o ma indi ec a, a a és de N A, un egulado de espues a de la amilia OmpR (Ehi a y Ohmo i, 2006a; Ehi a y Ohmo i, 2006b). También se ha obse ado dependencia de N cA en la exp esión desde P2 (o iginada desde la posición -271). En ninguno de es os dos p omo o es se han iden i icado si ios de unión consenso pa a N cA, ni se ha podido de ec a unión de es e egulado in i o (Mu o-Pas o e al., 2002). Mien as que la exp esión desde P4 y P3 no depende del egulado He R, la exp esión desde P2 es o almen e dependien e de He R (Buikema y Haselko n, 2001; Mu o-Pas o e al., 2002) (Fig. 3.18). Pa a es udia posibles e ec os di ec os de los egulado es N cA y He R en la ac i ación ansc ipcional desde es a egión p omo o a, se u iliza on dis in os agmen os de DNA de la misma en ensayos TIV . Resul ados 115 Figu a 3.18. Región p omo o a del gen he R en Anabaena sp. PCC 7120. A, Esquema de la egión p omo o a de he R en el que se señalan los inicios de ansc ipción con pun as de lecha, y las posibles cajas -10 de los p omo o es P1, P2, P3 y P4 se ep esen an median e ec ángulos azules. B, Secuencia de nucleó idos de es a egión p omo o a, donde se des acan en neg i a los TSPs y los posibles hexáme os -10. El inicio del gen he R se indica como +1. Uno de los agmen os u ilizados con enía la egión p omo o a comple a, y se ampli icó u ilizando el plásmido pWB216S2.4 (Buikema y Haselko n, 1991) y los oligonucleó idos al 2339-12 y al 2339-7 (Fig. 3.19A, agmen o a). O o agmen o sólo incluía los dos p omo o es dis ales P3 y P4, y se ampli icó con los oligonucleó idos al 2339-12 y al 2339-15 (Fig. 3.19A, agmen o b). Po úl imo, se ampli icó, con los oligonucleó idos al 2339-32 y al 2339-33, un agmen o que incluía solo P2 (Fig. 3.19A, agmen o c). Es os agmen os se incuba on en p esencia o ausencia de N cA y 2-OG p e iamen e a su incubación con RNAP-SigA. Los amaños espe ados pa a los !" #" he R -184 P1 -271 P2 -696 P3 -728 P4 AACTCTGGACTTCTGGCTCAGTAGTCATAATGGCTTAATGTCAGCAAACCTTGATTTTTCCATGGA AAAACCATTGGTTATTCATCAATCCTGGAAATTTTTAGCAAAAGAAAAGTTAAGAGTAGATTAATT CATGCAATTTTAATAATATGACAGATAAATATAGAATATTATGTTGTGAGGAAATAAAAGGTATTG CTAAGTTGGAATTACCTGTCTTATTTAGCGTCTATAATTTTCCCTCCAGCCAACGACCTACACTGC CATAAGAGCAAAAAAATTGTCAGCATCTCGGCAGATAAGAACGCTCTATTGATTCAATGGGCGTTA GTGAGTTTGGCGTAGTCGGCAGGTGACTTTTTCAAAAAATCACTTCCTGTTATTTCTGGAAATAAT CGGTCAGCATCTGAGTAAAATTACTCAGGAATAGAGTATTCACCTCAAGGAGAGATTGTGCGATTA TAATCTCCCATTGTTGGCCGTTGTGTTGCTATCTCCTAAATCCGGGTGCAGCCCAAAAGTCTTAAA AATAGCAAATTTATTGACGCTATTAAAGAGCAGATAAGTTCCGGATAATAGGGAAAGTCCTTGTAG GTTACTTATTAGAACCATAAAGTTCGCCAGTAATTGACAAATGTTATAAATGAGGAAATTCTGGCA GTTATTTTGTGATTTTTCGGTAAGATACAAGCACGTCTAGTAACAACACTGTTGCTAGTTATATGC CATAAATTACGGAGGAATGAGCATCTTGACCATTAATCGACTTTTATTTAAAACATCATAAGCATT TTGGTGTCACAATCTCACCCCCCTATGGGTGTATACCAACTACTTTTTTTAGACTAATAAGCGTGC TATTCAACTATTTGTAATATG! $%&'" $()%" $)(&" $*+*" ,%" Se gio Cama go Be nal 116 ansc i os iniciados en P1, P2, P3 y P4 usando el agmen o a son: 139, 226, 651 y 683 n , espec i amen e. Como se puede ap ecia en la igu a 3.19B, al u iliza el p omo o comple o en ausencia de N cA y 2-OG se de ec a on dos ansc i os, uno de ellos con un amaño de ap oximadamen e 140 nucleó idos (que pod ía co esponde al gene ado desde el p omo o P1) y o o con un amaño supe io a los 500 nucleó idos, que pod ía co esponde a ansc i os gene ados desde los p omo o es P3 y/o P4. En p esencia de N cA y 2-OG aumen aba algo la p oducción de es os ansc i os de mayo amaño. Po el con a io, se inhibía la p oducción del de meno amaño, o iginándose uno nue o de unos 160 n . Pa a disce ni si la banda co espondien e a ansc i os de amaños mayo es podía esol e se en a ias, se u ilizó el agmen o de DNA que sólo incluía los p omo o es P3 y P4 ( agmen o b), esol iendo los ansc i os p oducidos median e una elec o o esis de mayo du ación. Así, se de ec a on dos ansc i os de amaños ap oximados a los espe ados pa a los p oducidos desde P3 y P4: 316 y 348 n , espec i amen e. Es os ansc i os se gene aban en ausencia de N cA y 2-OG. No obs an e, la adición de N cA y 2-OG enía un lige o e ec o posi i o sob e la p oducción del ansc i o o iginado desde el P4, y nega i o sob e el o iginado desde en P3, haciendo que se in i ie a la elación en e ambos (Fig. 3.19C). También se analizó median e ensayos TIV el posible papel di ec o de He R en la egión p omo o a del gen he R. Se u iliza on agmen os que incluían P4 y P3, P2 y P1, o la egión p omo o a comple a, pe o sólo se ob u o un e ec o ap eciable cuando se u ilizó el agmen o c, que sólo incluye P2. Cuando se incubó sólo en p esencia de He R, se de ec ó un ansc i o de unos 120 nucleó idos (el espe ado e a de 86 n ), que pod ía habe sido o iginado desde es e p omo o as una e minación de la ansc ipción imp ecisa, o desde un inicio de ansc ipción an e io a la posición -271. La p oducción de es e ansc i o se inhibía po N cA. Resul ados 117 Figu a 3.19. E ec o de N cA y He R en TIV desde la egión p omo o a de he R. A, Esquema de los agmen os de DNA u ilizados en los ensayos de ansc ipción in i o. B y C, Los ensayos TIV se ealiza on con los agmen os a y b incubados en p esencia o ausencia de N cA (130 nM) más 2-OG (0,6 mM) an es de se incubados con la RNAP (27 nM) y SigA (88 nM). D, Ensayo TIV con el agmen o c incubado en p esencia o ausencia de He R (28 nM) y N cA y 2-OG en las mismas condiciones que en B y C. Los iángulo indican los ansc i os gene ados En B se indica con un iángulo blanco la p oducción de un ansc i o dependien e de N cA. El ma cado de amaños se mues a a la izquie das de la igu as. -883/-45 (al 2339-12/al 2339-7) (a) -883/-380 (al 233912/al 2339-15) (b) !" he R -184 P1 -271 P2 -696 P3 -728 P4 -508/-186 (al 2339-32/al 2339-33) (c) N cA - + !!! #" "##!$! "%#!$! &##!$! '##!$! (%#!$! 139 n 651 n (P3) 683 n (P4) N cA - + !!!! 316 n (P3) $" &"#!$! '##!$! &##!$! &%#!$! %##!$! 348 n (P4) '##!$! "##!$! (##!$! ("#!$! ()#!$! *#!$! N cA - - + + !!! He R - + - + !!! %" 120 n Se gio Cama go Be nal 118 3.4. EFECTO DE PipX EN LA ACTIVACIÓN DE PROMOTORES DEPENDIENTES DE N cA Dado el papel esencial de N cA du an e la di e enciación de he e ocis os, cualquie ac o que in luya sob e su ac i idad pod ía juga ambién un papel ele an e en la egulación de es e p oceso. En es e con ex o, el ac o PipX se había desc i o como un coac i ado de N cA en Anabaena, e o zando la exp esión de algunos genes a díos du an e el p oceso de di e enciación de los he e ocis os (Vallada es e al., 2011). Pa a p o undiza en el conocimien o del mecanismo de acción de PipX se han ealizado es udios in i o e in i o, de la acción de es e ac o en dis in os ipos de p omo o es dependien es de N cA. 3.4.1. E ec o de PipX sob e la exp esión del gen n A in i o Se ha es udiado si PipX iene algún e ec o en la exp esión in i o de un p omo o que se ac i a en los es adios iniciales de la di e enciación de he e ocis os; el único p omo o , dependien e de N cA de clase II del gen n A, que de e mina un egulado de espues a de la amilia OmpR que pa ece in lui posi i amen e en la exp esión de he R (Ehi a y Ohmo i, 2006a; Ehi a y Ohmo i, 2006b). Se ealizó un análisis de no hen de la exp esión del gen n A an o en la es i pe sil es e Anabaena, como en la es i pe mu an e de pipX (CSV6; Vallada es e al., 2011). Como se puede ap ecia en la igu a 3.20, el ni el de ansc i os de n A en la es i pe CSV6 pa ece se meno en compa ación con el ni el de ansc i os de la es i pe sil es e. Las di e encias se ap ecian sob e odo as 3, 6 y 9 h de incubación en condiciones de de iciencia de ni ógeno combinado, mos ando en esos iempos la es i pe CSV6 una exp esión de 2,40; 2,41 y 4,6 eces meno que la es i pe sil es e. Sin emba go, el ni el de ansc i os pa ece ecupe a se as 12 o 24 h en condiciones de de iciencia. Resul ados 119 Figu a 3.20. Análisis de no hen de la exp esión del gen n A en el mu an e pipX (CSV6). Se u ilizó RNA (25 µg po calle) aislado de ilamen os de Anabaena sp. PCC 7120 y de la es i pe mu an e pipX (CSV6) cul i ados con amonio (0 h) e incubados en ausencia de ni ógeno combinado du an e los iempos indicados (en h). El il o se hib idó con una agmen o de DNA de 750 pb de la egión genómica de n A ob enido median e PCR u ilizando como molde el plásmido pCSAM115 (Mu o-Pas o e al., 2006) y los oligonucleó idos all4312-22 y all4312-23. Como con ol de ca ga y ans e encia, el il o se hib idó con una sonda del gen npB de Anabaena sp. PCC 7120 (apa ado 2.3.4.2 de Ma e iales y Mé odos). A la izquie da se indican las posiciones de un ma cado de amaños de RNA. El amaño de n A y su egion leade es de 0,79 kb. 3.4.2. E ec o de PipX en la unión de N cA al DNA en las egiones p omo o as de los genes n A y de B Se ha es udiado median e EMSA y SPR, si la p o eína PipX pu i icada iene algún e ec o en la unión de N cA a agmen os de DNA con eniendo dis in os ipos de p omo o es con si ios de unión de N cA. En conc e o, se han u ilizado los dos p omo o es del ope ón de BCA y el único p omo o del gen n A. Es e úl imo y el p omo o dis al de de BCA son ac i ables po N cA de clase II, mien as que el p omo o p oximal de de BCA p esen a dos egiones de in e acción con N cA, una de las cuales incluye una secuencia de unión de N cA degene ada ( e apa ado 3.2.3.2, Figu a 3.12). 0 3 6 9 12 24 0 3 6 9 12 24 PCC 7120 CSV6 !" #$%" &$%" #" npB n A Se gio Cama go Be nal 120 3.4.2.1. Ensayos de e a do en gel Los ensayos EMSA se ealiza on según se desc ibe en el apa ado 2.6.1 de Ma e iales y Mé odos, empleando la p o eína N cA pu i icada (apa ado 2.4.3), su e ec o 2-OG y la p o eína PipX pu i icada (apa ado 2.4.3). Los agmen os u ilizados se ampli ica on median e PCR, u ilizándose el plásmido pCSAM113b (Mu o-Pas o e al., 2006) como molde y los oligonucleó idos all4312-2 y all4312-1 pa a la ampli icación del único p omo o del gen n A; el plásmido pCSAM155 y los oligonucleó idos al 3710-1 y al 3710-2 pa a el p omo o dis al del gen de B (de BCA P2) y el mismo plásmido y la pa eja de oligonucleó idos al 3710-17 y al 3710-19 pa a la ampli icación del p omo o p oximal del gen de B (de BCA P 1). Como se puede obse a en la igu a 3.22 (paneles A y B), an o con el p omo o de BCA P2 como con el p omo o de n A, N cA p oduce una banda e asada, cuya p opo ción aumen a en p esencia de PipX, mien as que la adición de PipX sola no p oduce ningún e aso. En el caso de n A, sólo se pudo ap ecia una banda e asada, po lo que no queda cla o si PipX pe manece en el complejo N cA-DNA. En el caso de de BCA P 2, cuando se u iliza on al as concen aciones de PipX y un gel con la concen ación de ac ilamida es ánda , se de ec ó una banda de e aso bas an e amplia. Cuando se ealizó el mismo ensayo u ilizando un gel de mayo du eza (8% ac ilamida), se pudie on obse a dos bandas e asadas en p esencia de ambas p o eínas. Como es e agmen o sólo incluye un si io de unión pa a N cA, la banda más e asada pod ía co esponde al complejo e na io N cA-PipX-DNA. Po o a pa e, con el p omo o de BCA P1 sólo se obse aba una banda e asada p oducida po N cA (sólo se espe aba una con la concen ación de N cA usada en es e ensayo), inc emen ándose la p opo cion de es a banda en p esencia de PipX (Fig .3.21C). Resul ados 121 Figu a 3.21. E ec o de PipX en la unión de N cA a las egiones p omo o as de los genes n A y de B. Los agmen os de DNA de los p omo o es de BCA P2 (A), n A (B) y de BCA P1 (C) se incuba on con N cA y PipX a las concen aciones que se indica, en p esencia de 2-OG 0,6 mM. Los iángulos indican la posición de los complejos N cA-DNA. D, Secuencia de DNA de las egiones p omo o as ensayadas. Las pun as de lecha indican TSPs; en neg i a se señalan las posibles cajas -10, y los si ios de unión de N cA apa ecen sub ayados. 3.4.2.2. Análisis SPR El e ec o de PipX sob e la unión de N cA ambién se analizó median e SPR (apa ado 2.6.2.1 de Ma e iales y Mé odos). Es a écnica pe mi e la moni o ización en iempo eal de la in e acción en e dis in as moléculas, en nues o caso la in e acción de p o eínas con DNA. !" #" $" GCTAGAGTAACAAAGACTACAAAACCTTGGGCATGGGCTTGTTACTTTGAAATTCATCGA n A! TCATTTGTACAGTCTGTTACCTTTACCTGAAACAGATGAATGTAGAATTTATAAAACTA! de BCA P2! de BCA P1!AATAAAGTCATCTAAGTTGCAGAAAATCTTTAAAAGATTTGCCATAATGAAATCTATCTGCA! PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 N cA (µM) - 0,4 0,8 - - - PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 N cA (µM) - 0,4 0,8 - - - de BCA P1 n A PipX (µM) - - 3,2 N cA (µM) - 0,8 0,8 %" PipX (µM) - - 0,8 2,4 - 1,6 3,2 0,8 2,4 3,2 N cA (µM) - 0,4 0,8 - - - de BCA P2 de BCA P2 Se gio Cama go Be nal 128 N cA más 2-OG acili a la o mación del complejo abie o (Vallada es e al., 2008). La p esencia de PipX no a ec ó ap eciablemen e la p opo cion de es a banda adicional o complejos RNAP-N cA-DNA (Fig. 3.25, calles 7ª y 9ª). Po an o, aunque no se puede deduci un e ec o cla o de PipX en la o mación del complejo e na io RNAP-N cA- DNA, pod ía exis i cie o e ec o posi i o de PipX sob e la o mación de los complejos RNAP-DNA. No obs an e es a cues ión eque i ía es udios adicionales. 3.5. DETERMINACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA REGIÓN PROMOTORA DEL OPERÓN al 2729-cox3 En e los cambios que se p oducen du an e la di e enciación de los he e ocis os pa a man ene un ambien e mic oóxico des aca la exp esión de oxidasas espi a o ias e minales, como la de los complejos Cox2 y Cox3. El ag upamien o génico al 2729-cox3 de e mina la oxidasa Cox3 especí ica de he e ocis os. Es e ag upamien o se exp esa en una es adío a dío en las células que se es án di e enciando, dependiendo su exp esión de N cA y He R y es ando egulado posi i amen e po PipX (Vallada es e al., 2003; 2011). Pa a es udia el papel de N cA, He R y PipX en la egulación de la exp esión de es e ope ón (cox3), se p ocedió, en p ime luga , a una ca ac e ización de allada de su egión p omo o a. 3.5.1. De e minación de los inicios de ansc ipción del ope ón cox3 En el genoma de Anabaena sp. PCC 7120, las ORFs al 2729 y al 2730, con unción desconocida, p eceden a los genes coxB3-coxA3-coxC3, y los cinco se exp esan como un ope ón (Vallada es e al., 2003) ( e Fig. 3.27A). Pa a ca ac e iza expe imen almen e la egión p omo o a de es e ope ón se p ocedió a la de e minación de sus TPSs, así como su dependencia de los egulado es N cA y He R. 3.5.1.1. Ensayos de ex ensión de cebado Es os ensayos se ealiza on u ilizando RNA aislado de ilamen os de la es i pes Anabaena sp. PCC 7120, el mu an e n cA (CSE2), y los mu an es he R (CSSC2 y 216), cul i ados con amonio y pos e io men e incubados en ausencia de ni ógeno combinado. En la es i pe sil es e, u ilizando los oligonucleó idos al 2729-14 y Resul ados 129 al 2729-13 como cebado es pa a la ex ensión, se de ec a on es especies de RNA dis in as, cuya can idad aumen aba en ausencia de ni ógeno combinado. Los ex emos 5’ de es as es especies de RNA ue on localizados en las posiciones -166, -278 y -388 ( espec o del inicio de aducción del gen al 2729) (Fig. 3.26A). En las es i pes mu an es, el ni el de los ansc i os cuyo ex emo 5’ co espondía a las posiciones -388 o -278 e a mucho meno que en la es i pe sil es e en condiciones de de iciencia de ni ógeno, mien as que el ansc i o con ex emo 5’ en la posición -166 no se de ec aba (Fig. 3.26A). 3.5.1.2. Análisis 5’ RACE Pa a disce ni si las especies de RNA an es de ec adas se co espondían con ansc i os p ima ios, o si se o iginaban a pa i de ansc i os de mayo amaño, se ealizó un análisis 5’ RACE con mues as de RNA de la es i pe sil es e cul i ada con amonio y pos e io men e incubada en ausencia de ni ógeno combinado. Mues as duplicadas de RNA aislado as 0 h y 12 h de incubación en ausencia de ni ógeno combinado se a a on o no con la enzima TAP (apa ado 2.3.5 de Ma e iales y Mé odos). Las mues as a adas y no a adas se liga on a un adapa ado de RNA y después se usa on pa a e o ansc ipción con el oligonucleó ido al 2729-9. El ma e ial esul an e se u ilizó como molde pa a una eacción de PCR, con los oligonucleó idos al 2729-9 o al 2729-13 (especí icos del gen) jun o a un oligonucleó ido de la egión del RNA adap ado (apa ado 2.3.5 de Ma e iales y Mé odos). En la igu a 3.26B se mues a el esul ado de es e análisis. Sólo se de ec ó ampli icación de los agmen os de DNA con amaños co espondien es a la dis ancia desde el cebado u ilizado has a los ex emos 5’ de ansc i os iden i icados p e iamen e en las mues as a adas con TAP, y p incipalmen e después de la incubación en ausencia de ni ógeno combinado. Ello indica que los ex emos 5’ de las es especies de RNA iden i icadas an e io men e co esponden a inicios de ansc ipción, y que la ansc ipción desde es os es TSPs es á egulada po ni ógeno. Se gio Cama go Be nal 130 Figu a 3.26. De e minación de los TPSs del ope ón cox3. A, Ensayos de ex ensión de cebado ealizados con los oligonucleó idos al 2729-14 (panel supe io ) y al 2729-13 (panel in e io ) como cebado es y RNA aislado de las es i pes Anabaena sp. PCC 7120 (WT), CSE2 (n cA) y CSSC2 o 216 (he R) cul i adas con amonio (0) e incubados en ausencia de ni ógeno combinado du an e los iempos indicados (en h). Las posiciones de los ex emos 5’ de los RNA se indican median e iángulos neg os. Las eacciones de secuencia de la misma egión de DNA ambién se mues an en cada igu a. B, Análisis 5’ RACE con RNA de la es i pe sil es e cul i ada con amonio (0) e incubada en ausencia de ni ógeno combinado du an e 12 h (12), a adas (+) o no (-) con la enzima TAP, como se indica. Se usó el oligonucleó ido al 2729-9 pa a la e o ansc ipción, y los oligonucleó idos al 2729-13 (panel izquie do) y al 2729-9 (panel de echo) como cebado es especí icos en las PCRs. Se indica la posición 5’ co espondien e a algunos p oduc os de ampli icación. El ma cado de amaños de DNA, Ma ke X (Roche), se mues a en la pa e izquie da de cada panel. !" #" 0 0 12 12 -166 -278 !"#$ !%%$ &"'$ &&($ &()$ 0 0 12 12 -388 -166 !"#$ !%%$ &"'$ &&($ &()$ )*%$ )!%$ -388 WT CSSC2 CSE2 0 24 0 24 0 24 A C G T 0 12 24 0 12 24 0 12 24 WT CSE2 216 A C G T -166 -278 Resul ados 131 3.5.2. Es udio de la unión de N cA a la egion p omo o a del ope ón cox3 La in e acción del egulado N cA con el DNA de la egión p omo o a del ope ón cox3, así como el posible e ec o del egulado PipX se es udia on median e EMSA y Foo p in ing. 3.5.2.1. Ensayos de e a do en gel Pa a es os ensayos se u liza on dos agmen os de DNA, uno que incluía los es TSPs de es a egión an es de e minados, y o o que sólo incluía el localizado en la posición -166 (Fig. 3.27A agmen os a y b). Es os agmen os se ob u ie on median e ampli icación po PCR, u ilizando el plásmido pCSSC35 como molde y las pa ejas de oligonucleó idos al 2729-17/al 2729-18 pa a el agmen o a, y al 2729-12/al 2729-13 pa a el agmen o b. Cuando se u ilizó el agmen o a (que cub e desde la posición -98 has a la posición -563) en p esencia de concen aciones c ecien es de N cA, se pudie on de ec a has a es bandas e asadas, que pod ían co esponde a N cA unida a uno, dos y es si ios, espec i amen e (Fig. 3.27B). Aunque PipX no se unía po sí solo al agmen o de DNA usado (no mos ado), sí po enciaba la o mación de los complejos DNA-N cA de meno mo ilidad elec o o é ica (Fig. 3.27B compa a calle 9 con calles 10 y 11). Cuando se u ilizó el agmen o de DNA que cub ía desde la posición -8 has a la -272, se de ec aba una banda e asada en p esencia de N cA. Es e complejo DNA- N cA ambién se po enciaba po la p esencia de PipX (Fig. 3.27C). 3.5.2.1. Ensayos de p o ección po N cA en e a la deg adación po DNasa I Pa a iden i ica las egiones de DNA en las que in e accionaba la p o eína N cA en la egión p omo o a del ope ón cox3, y el e ec o de PipX, se lle a on a cabo ensayos de p o ección en e a la deg adación po DNasa I (apa ado 2.6.3, Ma e iales y Mé odos). Se u iliza on los mismos agmen os de DNA que en los ensayos EMSA, ma cando adiac i amen e con 32P los oligonucleó idos al 2729-17 y al 2729-12 y, además, o o agmen o ampli icado con los oligonucleó idos al 2729-17 (ma cado) y al 2729-2b (no ma cado). En la igu a 3.28 se mues an los esul ados del análisis de la cadena supe io o codi ican e de es os agmen os. Al u iliza dis in as concen aciones de N cA, se de ec a on es en anas de p o ección (Fig. 3.28), equi iendo el si io 2 Se gio Cama go Be nal 132 mayo es concen aciones de N cA que los si ios 1 y 3 (Fig. 3.28B y C). Además, se obse aba que PipX po encia la p o ección po N cA en los es si ios. Figu a 3.27. Unión de N cA a la egión p omo o a del ope ón cox3 y e ec o de PipX. A, Esquema de la egión p omo o a del ope ón cox3 en el que se señalan con pun as de lecha neg as los TSPs, y las posibles cajas -10 con ec ángulos azules. Se ep esen a la posición ap oximada de los agmen os usados en los ensayos EMSA y oo p in ing ( e Fig. 3.28). Mues as del agmen o a (B) y el agmen o b (C) se incuba on en p esencia de N cA y PipX an es de some e se a elec o o esis. Las concen aciones de N cA usadas se indican en las igu as. Las concen aciones de PipX apa ecen indicadas como múl iplos de las co espondien es concen aciones de N cA. Las pun as de lechas neg as señalan las posiciones de los complejos N cA-DNA. En la pa e in e io de las igu as se indica el nº de cada calle. al 2729 caja -10 -563/-98 (al 2729-17-al 2729-18) (a) -272/-8 (al 2729-12-al 2729-13) (b) al 2730 coxB3 coxA3 coxC3 -166 -278 -384 caja -10 caja -10 !" -563/-202 (al 2729-17-al 2729-2b) (c) PipX - - - - - - x2 x6 - x2 x6 N cA (nM) - 150 300 500 1000 150 500 #" 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N cA (nM) - 500 1000 2000 500 PipX - - - - - x2 x6 $" 1 2 3 4 5 6 7 Resul ados 133 Figu a 3.28. Ensayos de p o ección po N cA y PipX en e a la deg adación po DNasa I en la egión p omo o a del ope ón cox3. Los ensayos se lle a on a cabo en p esencia o ausencia de las p o eínas N cA y PipX, como se indica, u ilizando agmen os de DNA de la egión p omo o a de al 2729-cox3 ampli icados po PCR con los oligonucleó idos: al 2729-17 (ma cado con P32)-al 2729-2b (no ma cado) (A), al 2729-17 (ma cado con P32)-al 2729-18 (no ma cado) (B) y al 2729-12 (ma cado con P32)-al 2729-13 (no ma cado) (C). Concen aciones de N cA: 230 nM (1), 500 nM (2), 1000 nM (3), 2000 nM (4). Las concen aciones de PipX ue on 2 eces (x2) o 6 eces (x6) supe io es a la concen ación de N cA indicada en cada caso, o 3000 nM (5). Las líneas e icales delimi an zonas p o egidas po N cA, zona 1 ( e de), zona 2 (azul) y zona 3 (na anja). D) Secuencia de DNA de la egión p omo o a de al 2729-cox3, en la que se señalan las dis in as zonas p o egidas po N cA somb eadas con sus colo es co espondien es. También se señalan con pun as de lechas las posiciones de los TSPs, las posibles cajas -10 y -35 se esal an median e sub ayado, y los posibles si ios de unión de N cA se indican en neg i a. PipX - x2 x6 - x2 x6 5 - N cA 1 1 1 2 2 2 - - N cA - 2 3 4 - 2 2 2 - - PipX - - - - - - x2 x6 5 - !" N cA - 3 3 4 - #" $" #" $" !" #" $" %&'" %&'" %&'" %()" *" CAACATCTTTTCCTTTGTGCCTTTGTAGTAAAATACCAAGAAATTGTAACTACAAAGGTGCAA GGATATAGAAATTTAAGACATACATTTTAGATCCTTGCACAAATGATTTAGGTCTTAGATAAG ATTGAAGATACTAAATCAGTTTTTATTGATTAACTTTCCTATTTATTAAATATTGATGGTATT TTTAATTACAAATTAATAATCGATAGATGTTGCTATCGCACACTTAAACAATTCATATATGCA ATATAGTAAAATAGCTAGTAAAGATACATTGTAAAACGATTATTTTTGCTAGTCAGAATATTT TTATCAATTTGTTACAATTACTTTTGACAAGTACTAAAAAAATCCTTAAGCTAATAGATAGGA CTCACCAAATAGCCAGACAGCAGCAATTTTGTTAGATAAATTAAAATCGCTGTTGCAGCGTAT CAGCATGAACAAATAAATTAACCTCAATCATTGACTATAAATAATAGCCTCATCCAATTGGTT GATAACACGGCTGATACTGGCGTGATGGGAATTAGCCGTGTAAATCTGATCAACAAATTCTGG TCATGAGTGAATGCCTATTTCGATGTGAGTAATGTCAATCATTGAAGTTTAGCTGCGGTGCAG TAGATATGTCTAGGAGAGGACAATG Se gio Cama go Be nal 134 3.6. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL FACTOR SIGMA VEGETATIVO SigA DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE HETEROCISTOS EN ANABAENA En Anabaena sp. PCC 7120 se han iden i icado un ac o sigma p incipal, SigA (B ahamsha y Haselko n, 1991), y once genes que de e minan o os posibles ac o es sigma, encon ándose ep esen ados los g upos I, II, III y IV (apa ado 1.1.1.1). Se ha obse ado que algunos de ellos se exp esan ansi o iamen e du an e el p oceso de di e enciación de he e ocis os, especí icamen e en las células que se es án di e enciando (Aldea e al., 2007). Aunque pa a la mayo ía de es os ac o es sigma no se ha podido es ablece un papel especí ico, los mu an es de al 4249 (sigE) mues an una exp esión ano mal de algunos genes de di e enciación (Mella-He e a e al., 2011). Pa a que o o ac o sigma se asocie al núcleo de la RNAP, és e debe compe i con el ac o sigma p incipal, que no malmen e p esen a mayo a inidad po el mismo. En muchos casos, es o se consigue median e el secues o del ac o sigma p incipal po pa e de ac o es an i-sigma o median e una disminución ansi o ia de su exp esión. Una cues ión c ucial pa a en ende si la egulación de la ansc ipción du an e la di e enciación de he e ocis os es conoce la e olución de la exp esión del ac o p incipal SigA du an e es e p oceso. En es udios p e ios se había obse ado median e análisis de no he n blo , la p oducción de dos ansc i os del gen sigA de Anabaena (B ahamsha y Haselko n, 1991). Mien as que el ni el de uno de ellos pe manecía cons an e du an e la di e enciación, la abundancia del o o aumen aba as incubación en ausencia de ni ógeno combinado (B ahamsha y Haselko n, 1991). También en dicho abajo, median e es udios de ex ensión de cebado es, se habían de e minado cinco posibles TSPs de sigA: en las posiciones -328 espec o al inicio de aducción del gen (P1), -592 (P2), -605 (P3), -800 (P4) y -868 (P5). Mien as que el ansc i o con ex emo 5’ co espondien e a P 1 p esen aba la misma abundancia en p esencia y ausencia de ni ógeno combinado, los co espondien es a P2, P4 y P5 aumen aban en abundancia en condiciones de de iciencia de ni ógeno. No obs an e, algunos de es os p esun os TSPs pueden co esponde en ealidad a p oduc os de p ocesamien o. Po su pa e, el ansc i o o iginado en P3 sólo se de ec aba en condiciones de limi ación de ni ógeno. Resul ados 135 3.6.1. Ánalisis de la exp esión de sigA median e usión con g p Los es udios de exp esión con RNA aislado de ilamen os comple os no pe mi ían de e mina si el inc emen o de la can idad de ansc i os de sigA en espues a a la de iciencia de N enía luga en odo el ilamen o o en células conc e as. Pa a ob ene in o mación del pa ón de exp esión espacio- empo al del gen sigA en Anabaena, se gene ó una es i pe de i ada que exp esaba 24 pb del inicio de sigA usionadas al gen g p-mu 2 di igidos po la egión p omo o a de sigA (los 1500 pb que p eceden al gen). Pa a gene a la cons ucción sigA-g p, la egión p omo o a de sigA, PsigA comple a (desde la posición -1498 a la +24 espec o al si io de inicio de la aducción de sigA) se ampli icó u ilizando DNA genómico de Anabaena como molde y los oligonucleó idos poD-3 y poD-4 como cebado es (Tabla 2.7). El oligonucleó ido poD-4, co espondien e al ex emo 5’ del gen sigA, in oduce una diana EcoRV que pe mi e la usión aduccional con el gen es igo g p. El p oduc o de PCR se clonó en el ec o pMBL-T (Tabla 2.4), ob eniéndose el plásmido pCSSC12. La secuencia de es e plásmido se comp obó median e secuenciación (apa ado 2.2.7 de Ma e iales y Mé odos). El agmen o XhoI-EcoRV de pCSSC12, que con iene el p omo o de sigA, se in odujo en el ec o pCSEL21 (Olmedo-Ve d e al,. 2006) p e iamen e dige ido ambién con las enzimas XhoI-EcoRV, ob eniéndose la usión en e el p omo o de sigA, los es p ime os codones de SigA, dos nue os aminoácidos p oduc o de la usión, los codones 6, 7 y 8 de SigA, y el gen g p, en un nue o plásmido denominado pCSSC13. El agmen o KpnI de pCSSC13, que con iene el p oduc o de la usión se clonó en la diana KpnI del plásmido pCSV3 (Tabla 2.4), o iginándose el plásmido pCSSC14 (Fig. 3.29). El plásmido pCSSC14 se ans i ió median e conjugación ipa en al (apa ado 2.2.2.2 de Ma e iales y Mé odos), a las es i pes Anabaena sp. PCC 7120, al mu an e CSVT20 (pa S) y al mu an e CSSC2 (he R). Los exconjugan es se selecciona on en medio BG110 + NH4Cl, suplemen ado con 5 µg/ml de Sm y 5 µg/ml de Sp. La in eg ación de pCSSC14 median e ecombinación homóloga en la egión c omosómica de sigA da ía luga a una duplicación del p omo o sigA, de mane a que una copia del PsigA di igi ía la exp esión de sigA-g p y la o a di igi ía la exp esión del gen sigA sil es e (Fig. 3.30). Se gio Cama go Be nal 136 Figu a 3.29. Rep esen ación esquemá ica de la cons ucción de pCSSC14. La egión p omo o a de sigA (PsigA) con los 5 TSPs desc i os (pun as de lecha neg as) se ep esen a en g is. Se indican las dianas de es icción ele an es. Los oligonucleó idos u ilizados se ep esen an como iángulos neg os y ambién se indica, en e pa én esis, el plásmido del que de i a cada plásmido no cons uidos en es e abajo (Ve ex o). Se analizó median e PCR la es uc u a c omosómica de a ios clones esul an es de la ans e encia de pCSSC14 a cada una de las es i pes pa en ales. La in eg ación del gen sigA-g p se analizó con un oligonucleó ido co espondien e a la egión p omo o a de sigA que se man iene en el gen usionado (RpoD-5) y un oligonucleó ido especí ico del gen g p (g p-4). El amaño del agmen o de DNA espe ado pa a las es i pes que u ie an el gen sigA-g p in eg ado en su egión c omosómica e a de 1,6 kb. Además se analizó la seg egación de los c omosomas mu an es usando un oligonucleó ido de la egión p omo o a de sigA po delan e de la egión que in e iene en la usión ( poD-5) y un oligonucleó ido in e no del gen sigA ( poD-2). El amaño del XhoI (pMBL-T) EcoRV pCSSC12 ApR KpnI Clonación en pMBL-T -328 -868 -592 -605 -800 sigA poD-4 (EcoRV) poD-3 1,5 kb PCR Clonación del agmen o XhoI-EcoRV en pCSEL21 Clonación del agmen o KpnI en pCSV3 XhoI (pIC20R) EcoRV pCSEL21 g p PsigA XhoI (pIC20R) pCSSC13 KpnI EcoRV g p PsigA KpnI pCSV3 (pRL500) C.S3 C.S3 KpnI KpnI XhoI EcoRV pCSSC14 (pRL500) g p PsigA Resul ados 137 p oduc o de ampli icación poD-5/ poD-2 e a de 2,8 kb en la es i pe sil es e, mien as que no se espe aba ampli icación en las es i pes con la mu ación seg egada. Figu a 3.30. Rep esen ación esquemá ica de la gene ación de es i pes po ado as de la cons ucción sigA-g p. Rep esen ación esquemá ica de la egión c omosómica de sigA en la es i pe Anabaena sp. PCC 7120 (a iba) y la in eg ación del plásmido pCSSC14 po ecombinación homóloga. Abajo se ep esen a la egión sigA esul an e. Se especi ica la secuencia de nucleó idos donde se usionan los genes sigA y g p, esal ándose los codones de inicio de la aducción de ambos. El esul ado ob enido ue que odos los clones analizados po aban la cons ucción sigA-g p seg egada. Se seleccionó un clon p oceden e de cada pa en al, que se denomina on es i pe CSSC3 (sigA-g p en ondo sil es e), es i pe CSSC4 (sigA- g p en ondo pa S) y es i pe CSSC5 (sigA-g p en ondo he R) (Fig. 3.31). all5264 all5263 sigA PsigA all5264 all5263 g p C.S3 PsigA sigA PsigA KpnI XhoI EcoRV pCSSC14 (pRL500) g p C.S3 KpnI PsigA Es i pes po ado as de sigA-g p pCSSC14 Anabaena sp. PCC 7120 !!"!"###""#!!#$#$"##"!$#"$"!"##!$% !"#$% #&'% ()*$%&