Prevalencia de Escherichia Coli o25b: h4-st131 productor o no de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) en Sevilla

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL Prevalencia de Escherichia coli O25b:H4-ST131 productor o no de Betalactamasa de Espectro Extendido (BLEE) en el área de Sevilla. Trabajo realizado para alcanzar el grado de Doctor por, la Licenciada en Farmacia, Dña. María del Mar Bellido Barquero. Sevilla, mayo de 2017 Agradecimientos Me gustaría darle las gracias a todos y cada uno de los que han estado a mi lado durante este tiempo. Quizás no pueda escribir el nombre de todos los “contribuyentes”, pero ellos saben quiénes son. En primer lugar darle las gracias a mis dos directores. Al Dr. Álvaro Pascual por permitirme realizar este trabajo bajo su tutela, por sus sabios consejos y haberme permitido compaginar el desarrollo de este proyecto con mi formación como Especialista en Microbiología. A la Dra. Lorena López Cerero por haberme ayudado y por haber confiado en mí en esta última etapa del proyecto. Al Dr. Javier Aznar agradecerle haber sido mi tutor del Trabajo Fin de Máster y del Proyecto de Tesis Doctoral. También mostrar mi agradecimiento a todos los Facultativos del Servicio de Microbiología del H. U. V. Macarena: Anabel, Nínive, Encarna, Marina, Inma y Felipe. Gracias por haber dejado que invirtiera tiempo de la especialidad en idas y venidas a” la cátedra”. Gracias por vuestras palabras de aliento, en especial al Dr. Muñoz. Gracias, Enrique. Gracias por todos tus consejos y gracias por escucharme, aún a día de hoy. Gracias a los técnicos, en especial a Inma y Lola. Gracias a Candela y Pilar por las risas que nos hemos echado y nos seguimos echando. Agradecer a todos mis compañeros de “la cátedra” por compartir tantos buenos momentos y otros menos buenos; en definitiva, gracias por compartir. Gracias a Sofía, José Manuel, Isabel, Cármenes, Fernando, Rafa y, en especial, a “los niños”. Gracias, Alejandra, Eva, Fany, Paulita, Fran y sobre todo, a Lara. Gracias por todo lo que has hecho y por lo que eres, gracias por las risas que nos hemos echado y por todo lo que me has aguantado. Deciros que sois grandes trabajadores, pero mejores personas. Gracias a mis compañeros de residencia, en especial a mi “R2”, Meme, y a mi “R chico”, Jesús. Con la especialidad se ganan muchas cosas y, una de los mejores, los amigos. Gracias a mis padres, soy quien soy gracias a vosotros. Gracias por vuestro apoyo incondicional. Gracias a mi marido. Sin ti, no lo hubiera conseguido. Gracias por animarme a continuar y por hacerme el camino más fácil. Gracias a mi hija. Ella no lo sabe aún, pero me ha dado mucha fuerza para seguir adelante. Gracias a mis amigas de toda la vida y a las más recientes, pero no menos importantes. Gracias, Paula, María Rosa, Emma, María, Belén, Lucía y María. 6 7 1. Introducción Introducción 9 1.1. Generalidades de E. coli En 1885, Theodore von Escherich aisló Bacterium coli commune a partir de heces de neonatos y niños sanos (1). Pero hasta el año 1954 no es denominada Escherichia coli, en honor a su descubridor (2). Esta especie junto con otras cinco pertenecen al género Escherichia, el cual se engloba dentro de la familia Enterobacteriaceae. De todas las especies del género, E. coli es la más importante para el ser humano por formar parte de la microbiota intestinal de individuos sanos y otros mamíferos de sangre caliente, llegando a ser la bacteria anaerobia facultativa más abundante en el intestino grueso del ser humano. Y por otro lado, por agrupar cepas que pueden causar infecciones intestinales y extraintestinales, tanto en individuos sanos como inmunodeprimidos (3). Entre las infecciones más comunes producidas por E. coli se encuentran las infecciones del tracto urinario (8090%), seguidas de bacteriemias, meningitis y diarreas (4). 1.2. Patogenia La patogenia de E. coli es variable y, en función de ella, se pueden distinguir tres grupos principales: E. coli comensal, E. coli patógeno intestinal y E. coli patógeno extraintestinal. 1.2.1. E. coli comensal Las cepas comensales de E. coli constituyen gran parte de la microbiota del intestino del ser humano, mamíferos y aves. Son cepas perfectamente adaptadas a la coexistencia con su hospedador, el cual no desarrolla sintomatología, salvo en casos de inmunodepresión. 10 1.2.2. E. coli patógeno intestinal Las cepas patógenas intestinales de E. coli rara vez se encuentran formando parte de la flora fecal de individuos sanos, sino que son patógenos obligados. En la actualidad según la patogénesis y características epidemiológicas, se han definido 6 patotipos de E. coli: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteropatógena (EPEC). Los tres primeros son causantes de diarreas acuosas, mientras que los tres últimos producen diarreas sanguinolentas y/o invasivas. Los mecanismos de acción son diferentes según el patotipo: producción de toxinas (ETEC, EHEC, EAEC), factores de adherencia (EHEC, EPEC, EAEC, DAEC) e invasión del epitelio (EIEC). 1.2.3. E. coli Extraintestinal (ExPEC) Estas cepas son epidemiológica y filogenéticamente distintas de las comensales e intestinales. Son capaces de causar infecciones en los seres humanos y animales de sangre caliente, no son capaces de causar una infección entérica, pero sí de instaurarse de forma estable en el intestino del hospedador y llegar a colonizar el 20% de humanos sanos (5). En el ser humano estas cepas son la causa más importante de infección del tracto urinario (UTI), en cuyo caso reciben el nombre de cepas UPEC; seguida de bacteriemias adquiridas en la comunidad y sepsis (cepas SEC). Por otra parte, constituyen una de las causas principales de meningitis en los recién nacidos (cepas NMEC) que, a menudo, acaban en muerte (6)(7). Pueden causar infecciones intraabdominales y neumonías nosocomiales y, ocasionalmente, participan en otras infecciones extraintestinales, tales como la osteomielitis, celulitis e infecciones de heridas. En los animales es de especial relevancia las elevadas pérdidas económicas que padece la industria avícola debido a las cepas que causan infecciones respitatorias y sepsis (8,9). Los animales de compañía como los perros y gatos también sufren infecciones por cepas ExPEC que pueden compartir genes de virulencia con cepas causantes de infecciones en seres humanos (10,11). 1.2.3.1. Factores de virulencia Las cepas ExPEC están implicadas en un amplio espectro de enfermedades que se pueden asociar con la presencia de varios factores de virulencia, tales como diversas combinaciones de adhesinas, distintos sistemas de adquisición de hierro, producción de Introducción 11 toxinas y mecanismos de evasión del sistema de defensa del hospedador, entre otros. Sin embargo, aunque no se puede establecer una relación entre un factor de virulencia extraintestinal concreto y una patología específica, a partir del año 2000 surge el concepto de ExPEC, definiéndose como tal a aquellas cepas de E. coli con capacidad virulenta en un modelo animal o con determinados factores de virulencia que causan infecciones extraintestinales y que son distintos a los encontrados en las cepas intestinales (12,13). Cabe mencionar que en muchos estudios se engloba dentro del patotipo ExPEC a cualquier cepa de E. coli aislada de una infección extraintestinal, pero el criterio para discriminar las cepas ExPEC de las no-ExPEC se basa en la presencia de dos de los siguientes marcadores de virulencia: papC o papAH, sfa/foc, afa/dra, iutA y kpsM II (14). Las cepas ExPEC poseen distintos tipos de factores de virulencia que contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenia, por lo que se considera que su virulencia es un fenómeno multifactorial. A continuación, se describen los siguientes factores de virulencia: • Adhesinas Estas proteínas están implicadas en la unión de la bacteria a las células epiteliales del tracto urinario, tales como: o Fimbria común tipo 1 (fimH): presente en el genoma del 99% de los aislados de E. coli (15) e implicada en la adhesión e invasión de las células de la vejiga. o Fimbria tipo P (papG): presente en la mayor parte de las cepas causantes de pielonefritis y urosepsis. Se encarga de fijarse a los receptores y colonizar el epitelio (16). o Fimbria tipo S: asociada a cepas causantes de septicemias y meningitis. Muchas cepas expresan tanto la fimbria tipo S como tipo P simultáneamente (17). o Adhesina afa/Dr: implicada en la evasión de la respuesta humoral, facilitando la invasión de las células epiteliales. Se ha asociado con cepas causantes de infecciones urinarias y septicemias (18). En cuanto a la expresión de las fimbrias existe una regulación; de modo que en la primera fase de la infección que tiene lugar en la vejiga se expresan las de tipo 1, 12 pero en el riñón dejan de expresarse y comienzan a hacerlo las de tipo P y S. Esta regulación jerárquica parece ser esencial para el patógeno, ya que se asegura que sólo las fimbrias necesarias implicadas en la adherencia a un determinado tejido se expresan en un momento dado y, así, limitan su exposición al sistema inmune y eluden la respuesta de los anticuerpos (19). • Toxinas Actúan destruyendo las células del hospedador, para así continuar diseminándose por sus tejidos y adquirir nutrientes y otros factores necesarios durante la infección. o α-hemolisina (Hly): presente en las cepas causantes de infecciones urinarias y sepsis, entre otras. Contribuye al suministro de hierro a la bacteria (20). o Sat (Secreted Autotransporter Toxin): presente principalmente en cepas causantes de pielonefritis. Provoca efectos citopáticos sobre células del riñón y de la vejiga (21). o CDT (Cytolethal Distending Toxin): presenta actividad catalítica. Se conocen 5 variantes, de las cuales la CDT-I, CDT-II y CDT-IV se han identificado en cepas ExPEC (22). o CNF (Cytotoxic Necrotizing Factor): se conocen 3 tipos, de los cuales las cepas ExPEC causantes de infección urinaria y sepsis producen la variedad CNF1, junto con Hly (23,24). • Sideróforos Los sideróforos son sistemas de captación del hierro que las bacterias han desarrollado para poder crecer y sobrevivir, ya que al estar secuestrado en hemoproteínas o en proteínas transportadoras de hierro, puede llegar a convertirse en un factor limitante (25). Estos captadores de hierro se sintetizan en el citoplasma, posteriormente son secretados, captan el hierro gracias a la elevada afinidad que tienen por él, se internalizan y liberan el hierro en el citoplasma (26). • Proteínas involucradas en la resistencia al suero y a la fagocitosis Entre las proteínas involucradas en la resistencia al suero se encuentran las lipoproteínas Iss (Increased Serum Survival), que incrementan la supervivencia al suero Introducción 13 y las TraT, las cuales aumentan la resistencia de la bacteria a la acción del complemento, produciendo una disminución de la interacción de la membrana bacteriana con el complemento y, como consecuencia, reduciendo la fagocitosis (27). También la cápsula juega un papel protector contra la fagocitosis y la actividad bactericida del suero, principalmente debido a antígenos de los grupos II y III (28). Otro factor de virulencia que ayuda a la supervivencia de las bacterias y a la capacidad invasiva gracias a la formación de biopelículas es el IbeA (Invasion of Brain Endothelium) (29). La virulencia de las cepas ExPEC ha estado clásicamente inversamente relacionada con la resistencia a antimicrobianos, de modo que las cepas uropatógenas de E. coli resistentes a fluorquinolonas (FQ) presentan una disminución en la expresión de los factores de virulencia en comparación con las cepas sensibles, según han constatado varios estudios. Uno de ellos lo llevaron a cabo Drews y cols., quienes estudiaron la frecuencia de la beta(β)-hemólisis y de la expresión de papEF (adhesina) en una serie de aislados canadienses de E. coli tanto comunitarios como nosocomiales durante los años 2003-2004. Obtuvieron que la β-hemólisis y la expresión de papEF, tanto en comunitarios como en nosocomiales, eran significativamente menos frecuentes entre los aislados de E. coli resistentes a FQ que entre los sensibles (30). Por otro lado, Lavigne y cols. estudiaron en Francia otros factores de virulencia (papG allele II-variante de la adhesina P, kpsMTK1-variante de kpsM y hlyA-hemolisina) en aislados de E. coli procedentes de muestras hospitalarias, tras lo que obtuvieron que los aislados de E. coli sensibles a FQ estaban significativamente asociados con los factores de virulencia en comparación con los aislados resistentes a FQ (31). En otra serie europea de aislados de E. coli, procedentes de muestras hospitalarias recogidas durante los años 1998-1999 y 2002, Johnson y cols. estudiaron la presencia de 35 marcadores de virulencia, detectándose mayor número de estos entre los aislados sensibles a FQ que entre los resistentes, siendo estadísticamente significativa la diferencia en 3 de ellos, fyuA (sideróforo), kpsMT II y ompT (proteasa de la membrana externa (32). 1.3. Diversidad genética Como hemos comentado anteriormente, dentro de esta especie existen diferentes grupos, pero también se pueden distinguir distintos linajes o subgrupos. Para ello se utilizan las técnicas de tipado, entre las que se encuentran las anteriores a la era molecular y las posteriores a la misma. De modo que antes de disponer de información 14 a nivel molecular, el estudio de la diversidad de E. coli se llevó a cabo con cepas diferenciadas mediante serotipado y perfiles metabólicos (MLEE). 1.3.1. Serotipado Para diferenciar las cepas patógenas de las cepas comensales presentes en la flora microbiana normal, Kauffmann (33) desarrolló un esquema de serotipificación que actualmente tiene 174 antígenos somáticos (O1 a O181), 53 flagelares (H1 a H56) y 72 capsulares (K1 a K103). El antígeno “O” es el responsable del serogrupo; la determinación de los antígenos somático y flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se asocia con un cuadro clínico en particular. La serotipificación de E. coli requiere de un gran número de antisueros y es una técnica muy costosa, por lo que muchos laboratorios de rutina usan otros métodos de tipado. 1.3.2. MLEE (Multilocus Enzyme Electrophoresis) Este método analiza los patrones de movilidad electroforética de un grupo de enzimas metabólicas (de 15 a 30). Al haber aislados que presentan distinta movilidad enzimática, se considera que tienen diferentes versiones de la misma enzima, lo que se traduce en distintos alelos codificantes de esa enzima. Con la incorporación de las técnicas moleculares se van superando los inconvenientes anteriormente descritos, además de conseguir mayor reproducibilidad y poder de discriminación (34). Entre dichas técnicas se encuentran: perfil plasmídico, análisis del ADN cromosómico mediante enzimas de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism “RFPL” y Pulse-Field Gel Electrophoresis “PFGE”), ribotipado (análisis de los genes de ADN que codifican para ARNr 16S y 23S), técnicas de PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction, AP-PCR y Random-PCR) y secuenciación del ADN (MLST) (6,35–38). De todos ellos, cabe destacar el PFGE y el MLST por las ventajas comentadas a continuación. 1.3.3. PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Esta técnica se basa en la digestión del ADN cromosómico con una enzima de restricción de baja frecuencia, y la posterior separación de los 10-30 fragmentos de ADN que se generan mediante electroforesis en campo pulsado. Es altamente reproducible y tiene un elevado poder de discriminación (analiza gran parte del ADN cromosómico), por lo que es un método de referencia de tipado en estudios epidemiológicos locales en Introducción 15 los que interesa detectar cepas implicadas en brotes. Pero esta técnica también presenta ciertas limitaciones, como: no poder intercambiar información entre laboratorios por la necesidad de estandarización, su elevado coste, laboriosidad y tiempo para obtener y analizar resultados. 1.3.4. MLST (MultiLocus Sequence Typing) La técnica de MultiLocus Sequence Typing “MLST” está basada en el MLEE y determina la secuencia de nucleótidos de ciertos genes altamente conservados (housekeeping). La relación de los aislados mediante MLST se basa en los polimorfismos de los dichos genes; a cada secuencia genética se le asigna un número de alelo, generándose para cada cepa un perfil alélico al que le corresponde un secuenciotipo (ST) (39). Existen dos esquemas de MLST según los genes housekeeping seleccionados. Uno de ellos es el esquema de Achtman (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli), que utiliza la secuencia de 7 genes housekeeping: adk (adenilato kinasa), fumC (fumarato hidratasa), gyrB (ADN girasa), icd (isocitrato deshidrogenasa), mdh (malato deshidrogenasa), purA (adenilsuccinato sintetasa), y recA (motivo de unión ATP/GTP). El otro es el esquema de Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/EColi.html), el cual usa 8 genes housekeeping: dinB (DNA polimerasa), icdA (isocitrato deshidrogenasa), pabB (paminobenzoato sintasa), polB (polymerasa II [Pol II]), putP (prolin permeasa), trpA (subunidad A triptófano sintasa), trpB (subunidad B triptófano sintasa), y uidA (βglucuronidasa). Este método no tiene las desventajas que presenta el PFGE, ya que la información de las secuencias es comparable y transferible entre laboratorios y es altamente reproducible (40). Por el contrario, no tiene el poder discriminatorio para detectar cambios genéticos entre cepas implicadas en brotes (34) y puede ocurrir que dentro de un ST no exista homogeneidad en cuanto a las propiedades genéticas o comportamiento patotípico y que, al tiparlas, tanto aislados patogénicos como comensales o avirulentos presenten la misma combinación alélica. Los objetivos de estas técnicas de genotipado son distinguir los aislados patógenos de los inocuos y determinar si son aislados que pertenecen al mismo clon o a grupos clonales relacionados epidemiológicamente. Es decir, si aunque procedan de diferentes muestras, zonas geográficas y quizás diferentes fechas de aislamiento, tienen las mismas características fenotípicas y genotípicas, hace que la explicación más 22 Tabla 1. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos. Grupo Antibiótico Espectro de acción Penicilinas Bencilpenicilina Penicilina G. Espectro reducido. Fenoxialquilpenicilina Penicilina V o fenoximetilpenicilina. Espectro reducido. Isoxazolilpenicilinas Oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina. Activas frente a penicilinasas de Staphylococcus. Aminopenicilinas Ampicilina, amoxicilina,bacampicilina, pivampicilina. Activas frente a enterobacterias. Carboxipenicilinas Ticarcilina, carbenicilina. Activas frente a enterobacterias y Pseudomonas. Acilureidopenicilina Piperacilina. Activas frente a enterobacterias y Pseudomonas. Cefalosporinas 1ª generación Cefalotina, cefazolina, cefadroxilo, cefalexina, cefadrina. Activas frente a grampositivos y algunas enterobacterias. 2ª generación Cefuroxima, cefamandol, cefonicid, cefaclor. Mayor actividad frente a gramnegativos que grampositivos. Cefamicinas Cefoxitina, cefotetán, cefmetazol. Mayor resistencia a betalactamasas, incluidas las de espectro extendido. 3ª generación Cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima, cefixima, cefoperazona. Espectro ampliado frente a gramnegativos, incluido Pseudomonas. 4ª generación Cefepime, cefpiroma. Amplio espectro: gran actividad frente a grampositivos y gramnegativos. Carbapenemas Imipenem, ertapenem, meropenem, doripenem. Resistencia a betalactamasas, incluidas las de espectro extendido. Monobactamas Aztreonam, carumonam. Resistencia a betalactamasas, especialmente de Pseudomonas. Inhibidores de βlactamasas Ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam. Asociados con betalactámicos restauran su actividad. Introducción 23 1.5.1.2. Quinolonas Las quinolonas son antimicrobianos bactericidas cuya estructura química se basa en el anillo 4-oxo-quinoleína. Actúan inhibiendo a la ADN girasa y a la topoisomerasa IV, con lo cual impiden la síntesis del ADN. Sobre el anillo se han hecho múltiples modificaciones para obtener moléculas con un mayor espectro de acción y mejores características farmacocinéticas, siendo las más notables las adiciones de un átomo de flúor en la posición 6 y de un grupo piperacínico o metil-piperacínico en la posición 7. Los compuestos obtenidos se denominaron fluoroquinolonas, entre las que cabe destacar el ciprofloxacino. 1.5.1.3. Aminoglicósidos Estos antimicrobianos son agentes bactericidas cuya estructura química consta de un anillo aminociclitol (varía según el antimicrobiano) con dos o más azúcares. El mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de proteínas. Se pueden clasificar en naturales, dentro de las cuales se encuentran la tobramicina, estreptomicina y gentamicina, entre otros; y los semisintéticos, entre los que destaca la amikacina. 1.5.1.4. Cotrimoxazol Este antimicrobiano resulta de la asociación de trimetoprim-sulfametoxazol, lo que determina que se comporte como bactericida. Actúa bloqueando la síntesis del ácido fólico en dos etapas, lo que supone una potenciación de la acción. 1.5.1.5. Fosfomicina Este antimicrobiano se caracteriza por la presencia de un anillo epóxido y un grupo fosfórico. Se comporta como un análogo del fosfoenolpiruvato, impidiendo la formación del N-acetil-murámico y, con ello, la síntesis de la pared bacteriana. 24 1.6. Resistencia a antimicrobianos en E. coli En los últimos 15-20 años, el manejo terapeútico de las infecciones por E. coli se ha visto dificultado por el aumento de los mecanismos de resistencia que presenta el microorganismo. Concretamente, la resistencia a FQ y al trimetoprim-sulfametoxazol limita las opciones terapeúticas en los pacientes comunitarios, mientras que la resistencia a las cefalosporinas lo hace en el caso de los pacientes hospitalarios. Los aislados de E. coli pueden presentar resistencia a un antimicrobiano o a varios, lo cual conllevaría a un estado de multirresistencia. Por otro lado, la resistencia puede ser natural (intrínseca) o adquirida. La resistencia natural es propia de cada familia, especie o grupo bacteriano y esta situación no es variable. La resistencia adquirida sí es variable y puede originarse por la adquisición de determinantes de resistencia a través de elementos móviles, o por la aparición de mutaciones. A continuación, se explican los diferentes mecanismos de resistencia de E. coli a los principales grupos de antimicrobianos: β-lactámicos, aminoglucósidos y quinolonas. 1.6.1. Betalactámicos Existen numerosos mecanismos por los que las bacterias pueden desarrollar resistencia a los β-lactámicos, entre los que se encuentran: 1. Aquellos que impiden que el β-lactámico llegue a la diana, tales como alteraciones en la permeabilidad de la membrana externa y bombas de expulsión. 2. Aquellos en los que se modifican las dianas. Los cambios a nivel de las PBPs implican que los β-lactámicos pierdan afinidad por ellas, con la consiguiente disminución de su actividad. Aunque este mecanismo afecta fundamentalmente a grampositivos. 3. Aquellos en los que existe la inactivación enzimática por producción de βlactamasas. De todos estos mecanismos, el más importante, por su frecuencia y eficacia en aislados de E. coli, es la producción de β-lactamasas. Introducción 25 1.6.1.1. β-lactamasas Las β-lactamasas pueden ser cromosómicas o plasmídicas. En el primer caso pueden ser tanto constitutivas como inducibles; si bien, las enzimas plasmídicas sólo son constitutivas, cuyo grado de producción está en relación con el número de copias del plásmido (57,58). La resistencia que originan es intrínseca o adquirida (mutación) en el caso de β-lactamasas cromosómicas, y adquirida, si la β-lactamasa es plasmídica. 1.6.1.1.1. Mecanismos de acción Las β-lactamasas son enzimas que hidrolizan el anillo β-lactámico antes de que el antibiótico llegue al punto de unión con las PBP. Se unen a los β-lactámicos mediante un enlace no covalente, tras lo cual tiene lugar una acetilación entre el grupo éster del anillo βlactámico y el grupo hidroxilo libre del centro activo de la enzima. Finalmente, la enzima que se encuentra activa es liberada, y el antibiótico inactivo (59). 1.6.1.1.2. Clasificación Las β-lactamasas se han clasificado utilizando diferentes criterios, aunque principalmente se han basado en su estructura molecular (clasificación de Ambler) y en sus características enzimáticas (clasificación según Bush, Jacoby y Medeiros) (tabla 2): I. La clasificación molecular de Ambler (60) divide a las β-lactamasas en cuatro clases (A, B, C y D), atendiendo a la estructura de la proteína. Las enzimas de los grupos A, C y D son serin-β-lactamasas, que contienen una serina en su centro activo. Las del grupo B son metalo-β-lactamasas, enzimas que requieren para su acción la unión del Zn+2 a su centro activo. II. La clasificación funcional propuesta por Bush, Jacoby y Medeiros en 1995, y actualizada en 2009 (61,62), establece diferentes grupos según su sustrato y el perfil de inhibición por inhibidores de β-lactamasas: 26 El grupo 1 (clase C de Ambler o de tipo AmpC) incluye enzimas que pueden localizarse en el cromosoma o en plásmidos. Las cromosómicas (expresión inducible) hidrolizan cefalosporinas de 1ª y 2ª generación (incluidas las cefamicinas) y no son inhibidas por el ácido clavulánico o tazobactam, pero si hay una hiperproducción de dicha enzima, el espectro hidrolítico aumenta y llegan a afectar a las cefalosporinas de 3ª generación; aunque frente a cefepime son mucho menos activas y carecen de actividad frente a carbapenemas. Este perfil de actividad las hace indistinguibles de las AmpC plasmídicas (expresión constitutiva), hecho que dificulta su seguimiento epidemiológico. Se incluyen en este grupo las β-lactamasas cromosómicas inducibles de E. aerogenes, C freundii, Serratia spp., M. morganii, P. aeruginosa, y la cromosómica constitutiva de E. coli. También pertenecen a este grupo AmpC plasmídicas descritas en K. pneumoniae, K. oxytoca, S. enterica, E. coli, P. mirabilis, M. morganii y E. aerogenes. El grupo 2 (clases A y D de Ambler) se inhibe por el ácido clavulánico y está compuesto por 12 subgrupos, de los cuales cabe destacar el 2b (incluye β-lactamasas de amplio espectro) y el 2be (incluye las Beta-Lactamasas de Espectro Extendido “BLEE”). Las β-lactamasas de amplio espectro confieren resistencia a penicilinas y cefalosporinas de primera generación, y las BLEE a penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda generación (excepto cefamicinas), de tercera y cuarta (cefalosporinas de espectro extendido) y monobactámicos. Ambos grupos de enzimas se inhiben por el ácido clavulánico/tazobactam. Introducción 27 BushJacoby (2009) BushJacobyMedeiros (1995) Clase Molecular (subclase) Centro activo Sustrato preferencial Inhibida por Enzimas representativas CLA/TAZ EDTA 1 1 C Serina Cefalosporinas No No E. coli AmpC, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1 1e NI C Serina Cefalosporinas No No GC1, CMY-37 2a 2ª A Penicilinas Sí No PC1 2b 2b A Penicilinas, Cefalosporinas de 1ª G. Sí No TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be 2be A Serina Cefalosporinas Espectro Extendido (3ª y 4ª generación), monobactámicos Sí No TEM-3, SHV-2, CTXM-15, PER-1, VEB-1 2br 2br A Serina Penicilinas No No TEM-30, SHV-10 2ber NI A Serina Cefalosporinas Espectro Extendido (3ª y 4ª generación), monobactámicos No No TEM-50 2c 2c A Serina Carbenicilina Sí No PSE-1, CARB-3 2ce NI A Serina Carbenicilina, cefepime Sí No RTG-4 2df NI D Serina Carbapenemas Variable No OXA-23, OXA-48 2e 2e A Serina Cefalosporinas Espectro Extendido(3ª y 4ª generación) Sí No CepA 2f 2f A Serina Carbapenemas Variable No KPC-2, IMI-1, SME-1 3a 3 B (B1) Zinc Carbapenemas No Sí IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1 B (B3) Zinc L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1 3b 3 B (B2) Zinc Carbapenemas No Sí CphA, Sfh-1 NI 4 Desconoc ido Serina Enzima cromosómica de B. cepacia Tabla 2. Clasificación de las β-lactamasas según su grupo funcional (Bush, Jacoby y Medeiros) y clase molecular (Ambler). CLA: ácido clavulánico; TAZ: tazobactam. NI: No Incluido. 28 El grupo 3 (clase B de Ambler) incluye metalo-β-lactamasas. Estas enzimas se inhiben por agentes quelantes como el EDTA, pero no por el ácido clavulánico o tazobactam. El grupo 4, incluido en la clasificación inicial, no aparece en la actualización del año 2009. La mayoría de enzimas de este grupo no están completamente caracterizadas y podrían ser clasificadas en los grupos anteriores. Recientemente, Giske y han propuesto una clasificación para facilitar el control epidemiológico de las BLEE (Tabla 3), de modo que se establecen tres grupos con diferentes subclases cada uno, de acuerdo con sus características fenotípicas. El grupo BLEEA agrupa a las β-lactamasas de clase 2be, donde se encuentran las BLEE más prevalentes (TEM, SHV y CTX-M). El grupo BLEEM engloba a las AmpC plasmídicas y las BLEE tipo OXA, entre otras. El grupo BLEECARBA está compuesto por carbapenemasas (63). Betalactamasas con actividad hidrolítica frente a cefalosporinas de espectro extendido y carbapenemas BLEEA BLEEM BLEECARBA Tipos de betalactamasas BLEEA Alta prevalencia CTX-M, TEM, SHV, VEB, PER BLEEM-C (AmpC plasmídicas) CMY, FOX, MIR, MOX, DHA, LAT, BIL, ACT, ACC BLEECARBA-A KPC, GES-2, -4, -5, -6, -8, NMC, SME, IMI-1, -2 BLEEA Baja prevalencia GES-1,-3, -7, -9, SFO-1, BES-1, BEL-1, TLA, IBC, CMTa BLEEM-D (OXA-BLEE) Grupo OXA-10 Grupo OXA-13 Grupo OXA-2 OXA-18, OXA-45 BLEECARBA-B (MBL) IMP, VIM, SMP-1, GIM-1, SIM1, AIM-1 BLEECARBA-D (OXAcarbapenemasas) Grupo OXA-23, grupo OXA24, OXA-48b, Grupo OXA-58 Características Resistentes acefalosporinas de espectro extendido. Sinergia con ácido clavulánico. Resistentes a cefalosporinas de espectro extendido. Detección fenotípica(BLEEM-C) y genotípica (BLEEM-D) Resistentes a cefalosporinas de espectro extendido y al menos a una carbapenema. BLEECARBA detectadas con métodos fenotípicos y/o genotípicos. Tabla 3. Clasificación de BLEE propuesta por Giske y (Adaptado de Giske y 2009). a) Resistente a ácido clavulánico. b) Los aislados productores de OXA-48 pueden presentar sensibilidad in vitro a las cefalosporinas. Introducción 29 1.6.1.1.2.1. Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE) Las BLEE son enzimas que derivan de las β-lactamasas de amplio espectro que, tras sufrir mutaciones en el centro activo (el cambio de uno o más aminoácidos implica la apertura del sitio activo de la enzima y un mayor acoplamiento de la cadena lateral del βlactámico), incrementan su actividad, llegando a hidrolizar no sólo penicilinas y cefalosporinas de primera y segunda generación, sino también de tercera y cuarta (64). Estas dos últimas generaciones de cefalosporinas se introdujeron en la práctica clínica en los años 80 debido al incremento de microorganismos productores de β-lactamasas, pero debido a que presentaban menor nefrotoxicidad que otros antimicrobianos (aminoglucósidos y polimixinas), hubo un uso excesivo y esto, según algunos autores, hizo que aumentara la prevalencia de las BLEE (65). La mayoría de estas enzimas son producidas por bacilos gramnegativos, principalmente E. coli y K. pneumoniae, aunque también pueden identificarse en otras enterobacterias y bacilos gramnegativos no fermentadores. Las BLEE incluyen enzimas de la clase A de Ambler (grupo 2be de Bush) y enzimas de la familia OXA de la clase D (grupo 2de) (Tabla 2). El origen de estas enzimas es generalmente plasmídico, aunque se han encontrado formando parte del cromosoma bacteriano, como en el caso de CTX-M-9 y CTX-M-15 (66,67). Desde que se describiera la primera BLEE en 1983, el número de variantes ha ido aumentando hasta alcanzar hoy día aproximadamente 200, lo cual demuestra una rápida evolución (68). 1.6.1.1.2.1.1. BLEE grupo TEM Las BLEE del grupo TEM derivan de las β-lactamasas de amplio espectro, TEM-1 y TEM-2, tras modificaciones en la secuencia de aminoácidos que, como se ha comentado anteriormente, conlleva cambios en la estabilidad de la enzima y en el perfil hidrolítico (69). En 1987 se aisló la primera β-lactamasa con patrón fenotípico de BLEE, TEM-3 (denominada originalmente CTX-1 por su capacidad de hidrolizar la cefotaxima), la cual se originó a partir de TEM-2 tras dos sustituciones aminoacídicas (70). Aquellas sustituciones más destacables responsables del fenotipo BLEE, con mayor capacidad de hidrólisis de 30 ceftazidima que cefotaxima, se producen en las posiciones 104 y 240 (glutamato por lisina), en la 164 (arginina por serina o histidina) y en la 238 (glicina por serina). Algunas enzimas como TEM-7 y TEM-12 no cumplen el perfil hidrolítico rigurosamente, sino que las tasas de hidrólisis para ceftazidima son mucho más elevadas en comparación con TEM-1 y TEM-2 y, por tanto, su CMI también aumenta. De ahí, que se hayan considerado BLEE y estén clasificadas dentro del grupo 2be (61). Se han descrito más de 180 variantes de BLEE de la familia TEM, entre las que se incluyen las IRT (InhibitorResistant TEM), es decir, enzimas de amplio espectro resistentes a los inhibidores, pero sensibles a cefalosporinas de 3ª generación, y las CMT (Complex Mutant TEM), que combinan los perfiles de BLEE y de IRT. La mayoría de las enzimas de este grupo son ceftazidimasas y unas pocas son cefotaximasas. Son producidas principalmente por E. coli y K. pneumoniae, aunque también por E. aerogenes, M. morganii, P. mirabilis, etc. 1.6.1.1.2.1.2. BLEE grupo SHV Las enzimas BLEE del grupo SHV derivan de la β-lactamasa de amplio espectro SHV-1 (sulfhídrico variable), la cual fue identificada por primera vez en el cromosoma de K. pneumoniae (71). También pueden derivar de la variante alélica SHV-1-2ª (SHV-11), tras sustituciones en aminoácidos críticos del centro activo de la enzima que suponen una ampliación del espectro. En 1983 se detectó por primera vez una BLEE en un aislado de Klebsiella ozaenae con mayor actividad hidrolítica frente a cefotaxima que a ceftazidima (72); la enzima, denominada SHV-2, derivaba de SHV-1 tras la mutación Ser238Gly. Otra sustitución importante es la que tiene lugar en el aminoácido 240, como ocurre con las enzimas SHV-5 y SHV-12, cuyo cambio Glu240Lys incrementa la actividad hidrolítica frente a ceftazidima y aztreonam. Hasta la fecha existen más de 130 variantes de β-lactamasas SHV, la mayoría de espectro extendido (www.lahey.org/studies) y con mayor capacidad de hidrolizar la ceftazidima que la cefotaxima. Aunque se han aislado principalmente en especies de Klebsiella, también se han descrito en E. coli, C. diversus y P. aeruginosa (73). Introducción 31 1.6.1.1.2.1.3. BLEE grupo CTX-M Todas las enzimas de este grupo son BLEE y deben su nombre a la preferencia que muestran para hidrolizar cefotaxima y ceftriaxona frente a ceftazidima. En 1986 se describió en Japón un aislado de E. coli resistente a cefotaxima en las heces de un perro de laboratorio y productora de β-lactamasa FEC-1 y de codificación plasmídica (74). En el año 1989 se aisló por primera vez una enzima similar a FEC-1 en un aislado de E. coli procedente de un exudado ótico de un recién nacido y que fue denominada CTX-M-1, por su elevada actividad hidrolítica frente a la cefotaxima y por haberse aislado en Munich (75). Simultáneamente en Argentina se describió la enzima CTX-M-2 en cepas de Salmonella typhymurium (75). En 1994 se detectó el primer aislado de E. coli productor de CTX-M-9 en Francia, en 1996 el primer aislado productor de CTX-M8 en Brasil (76) y en 1999 el primer aislado de CTX-M-15 en la India (77). Las enzimas de esta familia se clasifican en 5 grupos (Tabla 4) en base a sus identidades aminoacídicas. Los miembros de un mismo grupo comparten más del 94% de dicha identidad y menos del 90% aquellos que pertenecen a distintos grupos (78). Estas enzimas están estrechamente relacionadas con las β-lactamasas cromosómicas de distintas especies del género Kluyvera, ya que existe una alta homología (>90%) entre los genes cromosómicos de Kluyvera y algunos genes blaCTX-M. De ahí, que se piense que estos genes hayan saltado del cromosoma para integrarse en plásmidos y diseminarse y que, por tanto, estas varias especies de este género sean el origen de las enzimas (78). El grupo CTX-M-1 deriva de β-lactamasas cromosómicas de K. ascorbata (79) y el grupo 2 de K. cryocescens, mientras que 8 y 9 lo hacen de β-lactamasas cromosómicas de Kluyvera georgiana (80). El origen del grupo CTX-M-25 no se conoce con precisión todavía, pero pudiera estar en otros miembros del género Kluyvera (80,81). 38 diferentes áreas del mundo y, cada vez con más frecuencia, enterobacterias resistentes a β-lactámicos y también a otros grupos de antibióticos relacionadas con infecciones comunitarias (125). Vamos a ver a continuación cómo era la situación antes del año 2000 y cómo cambió a partir de entonces. 1.7.1. Situación hasta el año 2000 Hasta finales de los años 90 K. pneumoniae era la principal enterobacteria implicada en la producción de estas enzimas, principalmente de los grupos TEM y SHV (96). También era la más involucrada en brotes nosocomiales, sobre todo en unidades de cuidados intensivos (UCI) y Pediatría. Dichos brotes se caracterizaban por estar producidos por cepas clonalmente relacionadas. El primer brote documentado fue descrito en Francia en 1986 debido a que varias cepas diseminaron desde las Unidades de Cuidados Intensivos hasta otras salas hospitalarias, llegando a infectar al 15,7% de los pacientes (126). En este mismo país se produjo durante los años 1987-89 la diseminación clonal de K. pneumoniae productor de SHV-4 en 14 hospitales franceses (127). Otra enterobacteria involucrada en brotes nosocomiales era E. aerogenes, de la cual hay descrito uno en el año 1993 debido a una cepa productora de TEM-24. Llegó a afectar a UCI, a otra sala del mismo hospital y a un geriátrico localizado dentro de la misma ciudad. Pero también se detectaron otras enterobacterias productoras de TEM-24, lo cual pudo ser debido a la diseminación plasmídica de BLEE desde E. aerogenes (128). De forma paralela a lo que estaba ocurriendo en Europa, se describieron varios brotes de enterobacterias productoras de diferentes tipos de BLEE en EEUU. Durante los años 1988-90 tuvo lugar un brote por K. pneumoniae y E. coli productores de TEM-26 en la unidad de oncología pediátrica de un Hospital de California (129). También en Chicago se produjo un brote durante los años 1990-1992 debido a dos cepas productoras de TEM-10; una cepa de K. pneumoniae, la cual se expandió en el ámbito hospitalario, y otra cepa de E. coli que lo hizo en residencias (130). A nivel nacional se describió a finales de los años 80 la primera epidemia, la cual tuvo lugar en un hospital de Madrid debido a varias enterobacterias productoras de SHV-2, de las cuales la más frecuente fue K. pneumoniae (131). A partir de entonces, se han comunicado diversos brotes hospitalarios, de los cuales uno de los más importantes descrito hasta el momento tuvo lugar entre los años 1993-1995 en el Hospital de Bellvitge. Este brote se debió a la diseminación clonal de una cepa de K. pneumoniae productora de Introducción 39 dos BLEE del grupo SHV y llegó a afectar a 150 pacientes, de los cuales el 70% estaba ingresado en UCI (132). 1.7.2. Situación a partir del año 2000 Pero a finales de los 90 y principios del año 2000 se produjo un cambio epidemiológico muy significativo. Emergió E. coli como principal especie productora de BLEE, llegando a superar a K. pneumoniae, lo cual estaba relacionado con el incremento de infecciones comunitarias por aislados de E. coli productores de BLEE del grupo CTX-M (133). Esta situación también la describieron Pitout y cols. al estudiar de manera prospectiva una serie de aislados de E. coli productores de BLEE durante 3 años y detectar que el 70% eran de origen comunitario y el 30% nosocomial. De todos los aislados, el 71% era productor de CTX-M (134). En España también se detectó este cambio epidemiológico. En el año 2001 se detectaron los primeros casos comunitarios causados por E. coli productor de CTX-M (135) pero después se produjo una diseminación comunitaria de cepas productoras de BLEE en todo el ámbito nacional. Según los resultados del proyecto del GEIH-2000, el 50% de los aislados de E. coli BLEE fueron comunitarios y el 66% eran muestras de origen urinario. En un trabajo posterior, se identificaron las BLEE del proyecto anterior y encontraron que las enzimas más prevalentes fueron CTX-M-9 (27,3%), SHV-12 (23,8%), CTX-M-14 (20,5%) y TEM (19%), pero ningún aislado fue productor de CTX-M-15 (136). Seis años más tarde, en el estudio del GEIH-BLEE 2006, el porcentaje de casos comunitarios aumentó hasta un 67,2% y las BLEE más prevalentes fueron CTX-M (72%), dentro del cual CTX-M-14 era tres veces más frecuente que CTX-M-15; seguido de SHV (26,8%) con SHV-12 como enzima predominante y, en último lugar, el grupo TEM (1,2%) (124). La situación en el área de Sevilla era similar a la ocurrida tanto a nivel mundial como nacional. En un estudio que se llevó a cabo en los años 2001-2002 en un hospital de la ciudad, se confirmó que la mitad de los casos de infección por E. coli productor de BLEE afecta a pacientes no hospitalizados (137). En cuanto al cambio epidemiológico de las BLEE, se detectó durante los años 1995-98 que los aislados de E. coli producían principalmente BLEE del grupo SHV, si bien a partir de 1999 producían cualquiera de los 3 tipos. Con el transcurso de los años destaca el notable aumento de aislados productores de CTX-M (aunque ninguna CTX-M-15) a costa de un descenso de SHV (108). 40 1.8. Dispersión de los genes bla. Elementos móviles Desde el punto de vista molecular, la diseminación de las BLEE se ha producido por un doble mecanismo: a través de clones epidémicos, como se verá posteriormente y, por otro lado, a través de elementos genéticos móviles, los cuales se han diseminado entre distintos clones de una especie e incluso entre distintas especies bacterianas. Estos elementos genéticos móviles, tales como plásmidos, secuencias de inserción (IS), transposones e integrones, pueden llevar además genes de resistencia a otros antimicrobianos como quinolonas, aminoglucósidos y sulfamidas. Las estructuras genéticas que albergan los genes bla pueden ser muy complejas, con distintos elementos móviles o parte de ellos integrados en otros (integrón dentro de transposón y todo ello dentro de un plásmido) y, además, pueden evolucionar con el tiempo a consecuencia de nuevos procesos de movilización, inserción, deleción, etc. De todos ellos, cabe destacar a los plásmidos por su papel en la diseminación no clonal de los genes bla. 1.8.1. Plásmidos Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal y autorreplicables, cuyo tamaño varía desde una a varios cientos de kilobases. El número de copias plasmídicas presentes en una célula también es variable, desde una copia hasta decenas. Contienen tanto genes esenciales para el inicio y control de la replicación como genes de resistencia antimicrobiana y virulencia (138). La unidad genética involucrada en la replicación se denomina replicón, el cual alberga genes que codifican las proteínas implicadas en el inicio de replicación (rep), así como otras proteínas (inc y cop) y elementos (ARN antisentido) que lo controlan, y secuencias específicas de unión de las proteínas que colaboran en el inicio de la replicación (139). Los plásmidos pueden ser no conjugativos o conjugativos, dentro de los cuales se incluyen los plásmidos portadores de los genes bla. Este tipo de plásmidos permite la diseminación de este mecanismo de resistencia no sólo entre distintas cepas de la misma especie sino también entre distintas especies bacterianas (140,141). Introducción 41 1.8.1.1. Clasificación de los plásmidos La clasificación de los plásmidos comienza a ser importante a final de los años 50, tras el descubrimiento de los plásmidos R o de resistencia y el reconocimiento de su extensión. Se conocen varios sistemas de clasificación, de los cuales el primero, desarrollado en los años 60, atendía a las características relacionadas con la capacidad de transferencia por conjugación y a la capacidad de inhibir la transferencia del plásmido F. Pero la existencia de plásmidos inclasificables según dichos criterios, dio lugar a sistemas posteriores que clasifican los plásmidos basándose en una propiedad universal a todos ellos y de carácter estable: “la incompatibilidad”. Mediante esta se definieron “incompatibles” aquellos plásmidos con el mismo control de replicación o replicones, y “compatibles” si era diferente. En 1971, Hedges y Datta propusieron un sistema de clasificación mediante la introducción de un plásmido en una célula portadora de otro plásmido cuyo grupo de incompatibilidad era conocido (plásmido residente). Si en la célula hija no persistía el plásmido, ambos eran clasificados en el mismo grupo de incompatibilidad. En el caso de que ambos coexistieran, eran clasificados en distintos grupos de incompatibilidad (142). Pero la incapacidad de ciertos plásmidos para transferirse, o el hecho de que alguno no tuviera marcadores seleccionables, fueron algunas de las complicaciones de este sistema. Además, la existencia de plásmidos multirreplicón dio lugar a la aparición de grupos de incompatibilidad que realmente no existían. Ya que si al introducir un plásmido con un replicón había coincidencia con alguno de los que contenía el multirreplicón residente, no era eliminado. Para evitar estos inconvenientes, se desarrollaron técnicas moleculares que partían del mismo concepto. En 1988 Couturier desarrolló un esquema de clasificación basado en el reconocimiento de los diferentes replicones mediante hibridación por Southern blot (139). Utilizó una colección de diecinueve sondas específicas que contenían al menos uno de los determinantes de incompatibilidad asociados a las funciones de replicación o partición (mantenimiento). Dichas sondas derivaban de diecisiete grupos de incompatibilidad: tres de ellas (repFIA, repFIB, repFIC) procedían de tres replicones de plásmidos IncFI y las dieciséis sondas restantes contenían los replicones FIIA, com9, I1, B/O, k, HI2, L/M, N, P, 42 Q, U, W, X e Y. Debido a la falta de especificidad por las reacciones cruzadas entre replicones altamente relacionados Carattoli y desarrollaron en 2005 un sistema, que es el que se utiliza en la actualidad, basado en la amplificación de los replicones mediante PCR de los 18 principales grupos mayoritarios de plásmidos en enterobacterias (HI2, HI1, I1-Iγ, X, L/M, N, FIA, FIB, FIC, W, Y, P, A/C, T, K, B/O, F y FIIAs (10). Cabe mencionar que recientemente se ha separado el grupo de incompatibilidad L/M, el cual fue erróneamente clasificado según el método anteriormente descrito (143). Los plásmidos IncF merecen una especial mención ya que están relacionados con blaCTX-M-15 y E. coli, como veremos más adelante. Están asociados a factores de virulencia y de resistencia en enterobacterias, lo que contribuye al fitness de la bacteria hospedadora (144). También codifican sistemas de adicción que contribuyen a la promoción del plásmido y a la adaptación al hospedador (145). Además, estos plásmidos tienen la peculiaridad de poseer una estructura mosaico y de poder tener más de un replicón (estado del multirreplicón), por lo que no todos los plásmidos tienen el mismo esqueleto; hay partes del mismo que se han podido adquirir o perder como consecuencia de la fusión de los replicones. De ahí que, en 2010, Villa y cols. elaboraran un esquema para subtiparlos basado en la amplificación y secuenciación de las regiones implicadas en la regulación de los replicones. En el caso del replicón FII es el gen copA y en el caso de FIA y FIB, repE y repB, respectivamente. Existen diferentes alelos para cada una de las regiones: 31 (F1F30) para FII, 3 (A1-A3) para FIA y 20 (B1-B19 y B23) para FIB. Según el alelo de cada replicón, se puede identificar el plásmido siguiendo la fórmula FAB (FII:FIA:FIB) (146). Respecto a la diseminación de las BLEE es destacable la asociación entre una BLEE determinada con plásmidos pertenecientes a un grupo concreto de incompatibilidad. En Madrid se han descrito aislados productores de CTX-M-9, cuyos genes bla se han vinculado principalmente con plásmidos de amplio rango, IncHI2, aunque también a otros de estrecho rango, como los del grupo IncP1 (147)En el caso de los genes blaCTX-M-15 parecen estar ligados a plásmidos IncFII, como se ha descrito en Canadá, Francia y Norte de África (148). Aunque también se ha relacionado con plásmidos IncFI (149) y con multirreplicones FIA-FIB, FIA-FIB-FII y FIB-FII (150). En el caso de SHV-12, se ha encontrado en el área de Sevilla que los genes bla estaban mayoritariamente vehiculizados por plásmidos pertenecientes al grupo de incompatibilidad IncI1 (151). Introducción 43 1.9. Clon ST131. Descubrimiento y características generales. Hasta el año 2008 el aumento en la diseminación de las BLEE había tenido lugar por parte de diferentes aislados de E. coli epidemiológicamente no relacionados. En este contexto epidemiológico, se describe la emergencia intercontinental de un clon productor de CTX-M-15, denominado O25:H4-ST131. Este hecho tuvo lugar tras comprobar que de 41 aislados procedentes de ocho países pertenecientes a tres continentes, 36 se aislaron en 7 países de ellos y presentaban características similares en cuanto a grupo filogenético, pulsotipo, resistencia antimicrobiana y virulencia. Aunque presentaban perfiles de restricción similares, los aislados de este grupo clonal se agruparon en varios clusters relacionados (152). Esta presencia de aislados clonales a nivel mundial también la describen en otro trabajo Coque y cols., quienes analizaron 43 aislados productores de CTX-M-15 procedentes de 7 países (entre ellos España) y correspondientes al período 2000-2006. También se incluyeron 6 plásmidos portadores de blaCTX-M-15 procedentes de la India. Se detectaron cepas del grupo clonal ST131 en todos los países, encontrándose en la mayoría de las cepas (37 de 43) el gen blaCTX-M-15 vehiculizado por plásmidos del grupo de incompatibilidad IncFII. Además, la mayoría de estos plásmidos portaban otros determinantes de resistencia como blaOXA-1, aac(6´)-Ib-cr, y blaTEM-1. Al analizar los perfiles de restricción plasmídica, se encontraron 3 plásmidos mayoritarios, de los cuales uno estaba presente únicamente en los aislados de ST131 expandidos a nivel mundia (67). 1.9.1. Características del clon ST131 Como ya se ha comentado en el trabajo de Chanoine, los aislados de E. coli pertenecientes al clon ST131, inicialmente detectados, presentaban las mismas características. Todos tenían la variante b de O25, pertenecían al serotipo O25b:H4, filogrupo B2 y secuenciotipo ST131. Además, compartían la característica de ser multirresistentes tanto a betalactámicos por producción de BLEE (CTX-M-15), como a otros antimicrobianos; y de poseer determinados genes de virulencia que los incluía como ExPEC, entre los que destacan: iha y fimH (codifica receptor adhesina-sideróforo y fimbria tipo I, respectivamente), sat (codifica toxina), kpsM (codifica proteína implicada en síntesis polisacárido capsular), fyuA e iutA (codifica sideróforos), usp (codifica proteína específica 44 uropatogénica), traT (codifica proteína de resistencia al suero), ompT (codifica proteasa de membrana externa), y malX (codifica marcador de isla de patogenia) en un elevado número de cepas. En menor proporción se encontraban tres genes: hlyF (codifica hemolisina), iss (codifica proteína para sobrevivir en suero) e iroN (codifica sideróforo) (152,153). Es de destacar que los genes implicados en la multirresistencia están vehiculizados mayoritariamente en plásmidos IncF y que al contrario de lo que sucede con otras cepas patógenas, en las que ya se comentó anteriormente que había una relación inversa entre resistencia y virulencia, los aislados de E. coli ST131 resistentes a quinolonas y a cefalosporinas de espectro extendido presentan genes de virulencia con más frecuencia que la población sensible (152). 1.9.2. Tipado de ST131 A pesar de que estamos hablando de un clon, existe cierta diversidad de linajes o subgrupos dentro de este grupo de microorganismos. Respecto al MLST, el tipo de secuencia ST131 fue originalmente identificado usando el esquema de Achtman (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli), el cual es utilizado por muchos investigadores para identificarlo de manera rutinaria. Según este esquema, los aislados de E. coli ST131 presentan secuencias uniformes de los genes conservados (tabla 5). También se puede utilizar el esquema de Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/EColi.html) (Tabla 6), el cual identifica diferentes ST a las obtenidas mediante el esquema de Achtman. Además, se ha encontrado mayor diversidad dentro del linaje de ST131 siguiendo el esquema francés que el de Achtman. Tabla 5. Combinación alélica de ST131 según el esquema de Achtman (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli). Gen dinB icdA pabB polB putB trpA trpB uidA Alelo 2 65 3 10 26 7 4 57 Tabla 6. Combinación alélica de ST131 según el esquema de Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/EColi.html). Gen adk fumC gyrB icd mdh purA recA Alelo 53 40 47 13 36 28 29 Introducción 45 Respecto al tipado mediante PFGE es de destacar que existen diferentes linajes dentro del clon ST131, lo cual ponen de manifiesto Nicolas-Chanoine y cols. con la primera descripción de este clon, cuando detectaron aislados con pulsotipos similares en zonas muy distantes y pulsotipos muy divergentes en áreas geográficas relacionadas (152). Esta distinción también la describen Johnson y cols. al estudiar una colección de aislados de E. coli ST131 recogidos durante el período 1967-2009 y procedentes de diferentes países. En esta vasta colección se identificaron linajes en todos los países, mientras que otros se circunscribían a una determinada zona (154). 1.9.3. Método de subtipado. Secuenciación de fimH En el caso de ST131, todos los aislados presentan el gen fimH, el cual codifica la fimbria tipo 1 que determina la unión de la manosa de la bacteria con la célula diana (155). Existen dos esquemas de tipado: uno basado en el análisis de los 424 pares de bases (pb) de la secuencia de fim (156) y otro en el de región de tipado (fim-HTR) de 489 pb (157). En base a la secuencia del gen fimH se diferencian varios subclones o linajes, 46 en el caso del primer esquema y 58 según el segundo. El esquema que ha tenido mayor éxito y al que hacen referencia en multitud de estudios es el de Weissman. Basándose en este, Johnson y analizaron la colección de referencia de aislados ST131 (1967-2011) y obtuvieron 7 subclones con distintos perfiles de resistencia a antibióticos: H15, H22, H27, H30, H35, H41, H94, siendo los más prevalentes fimH30, fimH22 y fimH41. Durante el primer período (1967-1999) encontraron aislados sensibles a FQ, entre los que predominaban los subclones H22 y H35. Los aislados resistentes a FQ se detectaron en el período 2000-2005 y se asociaron casi exclusivamente con el subclon H30 (70% de los aislados). La mayoría de los aislados del subclon H41 fueron sensibles a ciprofloxacino y se aislaron entre los años 2006-2011 (158). 1.9.4. Aislados de E. coli ST131 productores de CTX-M-15 La emergencia y la propagación a nivel mundial de CTX-M-15 ha cambiado la epidemiología de E. coli productor de BLEE y las enzimas prevalentes. Como hemos visto anteriormente, la diseminación del clon ST131 productor de CTX-M-15 es universal, aunque no es homogénea y llegan a observarse grandes diferencias entre áreas y países. Una de las regiones mejor estudiadas es Norteamérica, como se pone de manifiesto en los siguientes estudios. En Canadá, según un estudio de bacteriemias por E. coli, durante los 46 años 2000-2007, se produjo un aumento de los aislados que producían BLEE desde un 0,3% en el primer año hasta el 5% al final del período. CTX-M-15 se detectó por primera vez en el año 2002, pero sufrió un acusado aumento a partir del año 2005. Paralelamente a este incremento se producía un aumento de los aislados de E. coli ST131, de modo que el 24% de los aislados que se detectaron en el año 2005 ascendió hasta un 57% en el año 2007 (159). Cuando se describió este clon en EE.UU., la frecuencia de aislamiento era muy baja, pero recientemente se ha observado un incremento muy importante, hasta el punto de que este grupo ha sido descrito como el predominante en algunas áreas. En Pensilvania el 81% de los aislados de E. coli productores de BLEE analizados entre 2007 y 2008 producía BLEE del grupo CTX-M. Dentro de este grupo todos los aislados productores de CTX-M-15 (80%) pertenecían al clon ST131 (160). De forma similar a lo que estaba ocurriendo en los demás países, este clon se detectó como el responsable parcial del aumento de aislados productores de CTX-M-15 en el nuestro. En un estudio en el que se determinó la prevalencia y el tipo de BLEE producido por los aislados de E. coli durante los años 2006-2008, se obtuvo un aumento en la prevalencia de E. coli BLEE del 3,8% en el año 2006 a un 7,4% en el 2008. Las enzimas más frecuentemente encontradas fueron: CTX-M-14 (57,1%), CTX-M-15 (21,9%), SHV-12 (9,5%) y CTX-M-32 (6,7%). Todos los aislados productores de CTX-M-15 se englobaban en el clon ST131 (Blanco et al, 2009). En un estudio multicéntrico nacional realizado en 2004 las enzimas prevalentes fueron CTX-M-14 (45,7%), CTX-M-9 (20,6%) y SHV-12 (21,7%). Al igual que en el estudio del GEIH-BLEE-2000 de características similares, no se detectaron aislados productores de CTX-M-15 (107,161). Como ya comentamos anteriormente, los aislados de este clon que se describieron por primera vez eran productores de CTX-M-15, lo cual se describe en multitud de estudios. Uno de ellos es un estudio multicéntrico realizado en Canadá el cual analiza una serie de 209 aislados de E. coli productores de BLEE y detecta que el 46% fueron miembros del clon ST131, de los cuales el 91% era productor de CTX-M-15 (162). Por otra parte, Johnson y cols. encontraron la misma tasa de aislados ST131 entre aislados productores de BLEE procedentes de 15 centros estadounidenses durante el período 2000-2009, si bien la prevalencia de los que producían CTX-M-15 era algo menor (70%) (163). Según los primeros estudios que se llevan a cabo en Europa, este clon también resulta ser uno de los más prevalentes en la comunidad, aunque no producían CTX-M-15 con tanta frecuencia como en América. Cagnacci y cols. contaron con que el 23% de los Introducción 47 aislados de E. coli analizados durante el 2003 al 2006, procedentes de 32 centros y 8 países, eran ST131. El 8,1% de los aislados de E. coli producía BLEE, siendo la más común CTX-M-15 (164). En Francia, en un estudio realizado durante el 2006, se analizaron 72 aislados productores de BLEE, muchos de los cuales expresaban enzimas CTX-M; 40 (55,5%) aislados de E. coli eran productores de CTX-M-15, de los cuales 10 (25%) correspondían al clon ST131 (165). También cabe mencionar que existen zonas donde se han diseminado otras enzimas del grupo CTX-M con mayor frecuencia que CTX-M-15. En el caso de Reino Unido CTX-M-15 es la enzima prevalente, aunque también se ha detectado CTX-M-3. Durante los años 2003-04 se analizaron mediante PFGE 291 aislados de E. coli productores de BLEE procedentes de 42 centros del Reino Unido, distinguiéndose 5 cluster definidos como cepas A, B, C, D, E, los cuales englobaban desde 13 aislados (cepa B) hasta 110 aislados (cepa A) (166). Posteriormente se estudiaron los plásmidos de 3 aislados representativos de las cepas A, B y C, encontrándose que los plásmidos de la cepas A y B vehiculizaban blaCTX-M15 y el de la cepa C blaCTX-M-3 (145). Sin embargo, en otras zonas como Japón, es la menos frecuente o no llega a detectarse. En un trabajo donde se estudiaron 142 aislados de E. coli productores de BLEE procedentes de 200 hospitales durante el período 2002-2003, se halló que el 22% de los aislados pertenecía al clon ST131, de los cuales ninguno producía CTX-M-15. La enzima más frecuente fue CTX-M-14 (74%), seguida de CTX-M-35 (15%) y CTX-M-2 (11%) (167). En otro estudio realizado durante el período 2001-2012 con 1079 aislados de E. coli productores de BLEE procedentes de 10 hospitales se obtiene que el 43% correspondía a ST131. De estos, casi la mitad (49,6%) de los aislados producía CTX-M-27, un 33% producía CTX-M-14 y un 17% CTX-M-15 (168). Por otro lado, también hay que mencionar que se han detectado aislados que no producen BLEE, como queda constancia en un trabajo canadiense y otro español, en los que sólo el 6% y 7%, respectivamente, de los aislados clonales producían BLEE (153,169). Y también es de señalar que recientemente se han descrito varios casos de aislados de este clon productores de carbapenemasas relacionados tanto con ingreso hospitalario como con la atención comunitaria. En EEUU se detectó un aislado de ST131 productor de NDM en una muestra de un paciente con infección urinaria que había estado ingresado con anterioridad en un hospital de la India (170) y en Francia en una muestra de una paciente que había estado viviendo en la India, pero que nunca había sido hospitalizada Hipótesis y objetivos 55 2.1. Justificación del estudio e hipótesis de trabajo Los cambios epidemiológicos producidos en la última década respecto a E. coli ha conducido a la aparición de infecciones de origen comunitario causadas por aislados de multirresistente. Junto a estos cambios tiene lugar la emergencia de un clon detectado simultáneamente en diferentes zonas geográficas del mundo, que se caracteriza por pertenecer al serogrupo O25b, filogrupo B2, secuenciotipo ST131 y ser resistente a betalactámicos por producción de CTX-M-15 y a otros antimicrobianos, entre los que destaca el ciprofloxacino. Este clon presenta otras características microbiológicas diferentes a los clones de E. coli mayoritarios hasta el momento y un mecanismo de diseminación que se desconoce. Para poder diseñar medidas eficaces de control de esta expansión es necesario conocer la prevalencia del clon que existe en nuestra área, así como poder identificar sus vías de transmisión. Las hipótesis de este estudio son las siguientes: 1. El clon O25b:H4-ST131 de E. coli es prevalente en nuestra área. 2. La prevalencia de E. coli ST131 no se debe a la adquisición de BLEE. 3. La adquisición de plásmidos con geens codificantes de BLEE es específica de un subgrupo o linaje del clon. 4. La prevalencia del clon de E. coli ST131 en nuestro medio se debe a la introducción muy reciente de linajes de diseminación internacional. 5. Las mascotas pueden jugar un papel en la transmisión a humanos. 6. El clon ST131 está relacionado con la años recientes. 56 2.2. Objetivos de este estudio El objetivo general de este estudio se centra en determinar la prevalencia del clon ST131 y estudiar los posibles mecanismos implicados en su exitosa expansión. Para ello, se llevaron a cabo las siguientes líneas de trabajo: 1. Estudiar de forma prospectiva la frecuencia de las infecciones causadas por el clon de E. coli O25b:H4-ST131 en nuestra área sanitaria. 2. Comparar la distribución de los aislados de E. coli ST131 productores de BLEE y no productores de BLEE en nuestra área, así como los perfiles de resistencia. 3. Caracterizar los plásmidos de aislados de E. coli ST131 tanto productores como no productores de BLEE, en cuanto a grupo de incompatibilidad, subtipado de plásmidos IncF, co-determinantes de resistencia, factores de virulencia y sistemas de adicción. 4. Determinar la posible relación clonal entre aislados de origen humano y animal de compañía procedentes de dos zonas georgráficas, Lisboa y Sevilla. 5. Conocer cuál era la prevalencia de ST131 en años anteriores y determinar cómo ha evolucionado en nuestra área sanitaria. 57 3. Material y métodos Material y métodos 59 3.1. Material 3.1.1. Aislados clínicos y cepas bacterianas 3.1.1.1. Aislados clínicos 3.1.1.1.1. Colección de prevalencia Se recogieron todos los aislados consecutivos de E. coli procedentes de muestras remitidas a los Hospitales Universitarios Virgen del Rocío (HUVR) y Virgen Macarena (HUVM) durante el año 2010. Las muestras procedían de centros de atención primaria, consultas de especialidades y de ambos centros hospitalarios, lo cual supone la atención de aproximadamente 1.000.000 de habitantes. Todos los aislados recuperados de las muestras del HUVR se enviaron semanalmente al HUVM para su posterior análisis. Se rechazaron aquellos aislados sucesivos procedentes del mismo paciente, si el tiempo transcurrido entre ellos era inferior a dos semanas. Se categorizaron como “comunitarias” las muestras procedentes de atención primaria, consultas de especialidades y las de pacientes con ingreso hospitalario inferior a 48h, y como “nosocomiales” las que procedían de pacientes ingresados durante más de 48h. 3.1.1.1.2. Colección histórica Se incluyeron en el estudio los aislados del mes de Enero que habían sido previamente analizados durante los años comprendidos entre 2002 y 2009, ambos 60 incluidos. Dichos aislados corresponden a 3 colecciones independientes pertenecientes al HUVM: Colección de Enero Los aislados de esta colección proceden de muestras de cualquier origen, excepto hemocultivos. Se han incluido 206 aislados. Colección Bacteriemias Se han incluido en el estudio 91 aislados. Colección BLEE Los aislados productores de BLEE proceden de cualquier tipo de muestra clínica, salvo hemocultivos. Se han incluido 144 aislados. 3.1.1.1.3. Colección de Lisboa Fueron objeto de estudio 59 aislados de Lisboa, los cuales fueron cedidos por la Dra. Pomba. Estos aislados procedían de dos orígenes: • Animal: 31 aislados procedían de animales (perros y gatos) con ITU comunitaria. Las muestras se recogieron en el Hospital de Veterinaria de Lisboa entre los años 2004 y 2009. • Humano: 28 aislados procedían de muestras clínicas de personas que se recibieron en el hospital o en el laboratorio de diagnóstico comunitario, los cuales cubren un área de 365.000 habitantes. Las muestras se recogieron durante los años 2005-2006. 3.1.1.2. Colección de referencia de Johnson La colección de referencia consta de 579 aislados de E. coli ST131 procedentes de EEUU (N=446), Canadá (N=53) y otros 11 países internacionales (N=80), recogidos durante el período 1967-2009. Las fuentes son de origen humano, animales de compañía, animales destinados a comida y agua, entre otras. Material y métodos 61 Los aislados proceden de colecciones de investigadores o de centros de referencia seleccionados según fenotipo de resistencia, antígeno somático, origen geográfico y/o síndrome clínico de interés. Los 579 aislados se corresponden con 170 pulsotipos, de los cuales 105 son únicos y 65 múltiples, es decir, un pulsotipo corresponde a un aislado o a más de uno, respectivamente. Los pulsotipos múltiples suponen el 82% de los aislados, siendo la mitad de esta población representada por 12 pulsotipos con 6 o más aislados cada uno. Éstos reciben el nombre de pulsotipos de alta prevalencia, entre los cuales, los que presentan mayor número de aislados son el 968, con el 24% de la población, el 800 y el 812. Cabe destacar que existe una asociación entre los pulsotipos y el patrón de sensibilidad, siendo la producción de BLEE específica de los pulsotipos de alta prevalencia, excepto el 968. En el caso de la resistencia a quinolonas, hay relación con todos los pulsotipos múltiples. Respecto al año del aislamiento es importante mencionar que hay una distribución temporal, asociándose los pulsotipos de alta prevalencia con aislados de años más recientes. El Dr. Johnson nos cedió 13 aislados de esta colección para realizar el estudio de la relación genética de los aislados. 3.1.1.3. Cepas control Las características de las cepas bacterianas más destacables utilizadas en este trabajo se describen a continuación: Escherichia coli • Cepa control en la detección del serogrupo O25b, alelo pabB3 y grupo filogenético: E. coli 307. Cedida por la Dra. Egea. • Cepas control en la producción de BLEE: E. coli productor de BLEE del grupo CTX-M-1, cedida por la Dra. Egea. E. coli productor de BLEE del grupo CTX-M-9, cedida por el Dr. Hernández. E. coli productor de BLEE del grupo CTX-M-15, cedida por el Dr. Hernández. 62 Salmonella • Cepa control para la normalización de los pulsotipos, cedida por el Dr. Jorge Blanco del LREC (Lugo): S. braenderup H9812. 3.1.1.4. Cepa receptora en experimentos de transformación • E. coli DH10B (F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araΔ139(ara, leu)7697 galUgalKλ-rpsL (StrR) nupG) (Grant,1990.Genetics). 3.1.2. Medios de cultivo • Agar McConkey (McC, Oxoid): medio sólido utilizado para seleccionar los aislados de E. coli. • Agar McConkey con cefotaxima (2 mg/l): medio sólido utilizado para seleccionar los aislados de E. coli productores de BLEE. • Agar Mueller-Hinton (MHA, Difco): medio sólido para el estudio de la sensibilidad de los aislados de E. coli. • Agar Mueller-Hinton con ampicilina (100 mg/l). • Caldo Luria Bertani (Caldo LB, Difco): medio rico en nutrientes. • Caldo de triptona y soja (TSB, Difco) enriquecido con un 10% de glicerol (Panreac): medio líquido para la congelación de los microorganismos. • Medio SOC (Difco): medio sólido utilizado en el protocolo de transformación. Añadir 10ml de KCl 250 mM y enrasar hasta 1L. Tras autoclavar y, una vez frío, añadir 20 ml de glucosa 1M y 5 ml de MgCl2 2M. 3.1.3. Antibióticos 3.1.3.1. Suplementos de medios de cultivo • Ampicilina (AMP, Sigma-Aldrich). • Cefotaxima (CTX, Sigma-Aldrich). Material y métodos 63 • Ceftazidima (CAZ, Sigma-Aldrich). La preparación de los antimicrobianos se realizó siguiendo las normas del CLSI. Las soluciones se prepararon a una concentración de 4096 μg/ml y se conservaron a -70ºC hasta su utilización. Los solventes y diluyentes que se usaron en la preparación se muestran en la siguiente tabla: Antimicrobiano Solvente Diluyente Ampicilina Tampón fosfato, pH 8, 0.1M. Tampón fosfato, pH 6, 0.1M Cefotaxima Agua Agua Ceftazidima Carbonato sódico Agua Tabla 7. Solventes y diluyentes usados para la preparación de los antimicrobianos. 3.1.3.2. Discos para estudios de sensibilidad Betalactámicos • Ampicilina (Amp, 25 μg, Oxoid). • Amoxicilina/clavulánico (AMC, 30 μg, Oxoid). • Piperacilina/tazobactam (PT, 36 μg, Oxoid). • Cefuroxima (CFX, 30 μg, Oxoid). • Cefotaxima (CTX, 30 μg, Oxoid). • Ceftazidima (CAZ, 30 μg, Oxoid). • Cefotaxima/clavulánico (CTX/CLA, 30/10 μg, Oxoid). • Ceftazidima/clavulánico (CAZ/CLA, 30/10 μg, Oxoid). Aminoglucósidos • Gentamicina (GN, 10 μg, Oxoid).. • Tobramicina (TOB, 10μg, Oxoid). • Amikacina (AK, 30μg, Oxoid). 70 Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia chuA-1 ATGATCATCGCGGCGTGCTG 281 (47) chuA-2 AAACGCGCTCGCGCCTAAT yjaA-1 TGTTCGCGATCTTGAAAGCAAACGT 216 yjaA-2 ACCTGTGACAAACCGCCCTCA tspE4.C2-1 GCGGGTGAGACAGAAACGCG 152 tspE4.C2-2 TTGTCGTGAGTTGCGAACCCG gadA-1 GATGAAATGGCGTTGGCGCAAG 373 gadA-2 GGCGGAAGTCCCAGACGATATCC Tabla 11. Segundo set de cebadores utilizados en el estudio de filogrupos (Invitrogen). Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia CTX-M-1-F ATGGCGACGGCAACCGTCA 875 (205) CTX-M-1-R CAAACCGTTGGTGACGATTTTA CTX-M-9-F GTGACAAAGAGAGTGCAACGG 856 (205) CTX-M-9-R ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC SHV-1-F GGGTTATTCTTATTTGTC GC 930 (206) SHV-2-R TTAGCGTTGCCAGTGCTC Tabla 12. Cebadores específicos para cada grupo de BLEE (TIB Molbiol). Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia fimH-F CACTCAGGGAACCATTCAGGCA 975 (157) fimH-R CTTATTGATAAACAAAAGTCAC Tabla 13. Cebadores utilizados para la amplificación del gen fimH (TIB Molbiol). Material y métodos 71 Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia L/M FW GGATGAAAACTATCAGCATCTGAAG 785 (10) L/M RV CTGCAGGGGCGATTCTTTAGG N FW GTCTAACGAGCTTACCGAAG 559 N RV GTTTCAACTCTGCCAAGTTC X FW AACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGAT 376 X RV TGAGAGTCAATTTTTTATCTCATGTTTTAGC I1 FW CGAAAGCCGGACGGCAGAA 139 I1 RV TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT HI1 FW GGAGCGATGGATTACTTCAGTAC 471 HI1 RV TGCCGTTTCACCTCGTGAGTA HI2 FW TTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACAC 644 HI2 RV GGTCACTACCGTTGTCATCCT T FW TTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCAT 750 T RV CGTTGATTACACTTAGCTTTGGAC A/C FW GAGAACCAAAGACAAAGACCTGGA 465 A/C RV ACGACAAACCTGAATTGCCTCCTCCTT B/O FW GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC 159 B/O RV TCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA P FW CTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAA 534 P RV CACGCGCCAGGGCGCAGCC Y FW AATTCAAACAACACTGTGCAGCCTG 765 Y RV GCGAGAATGGACGATTACAAAACTTT W FW CCTAAGAACAACAAAGCCCCCG 242 W RV GGTGCGCGGCATAGAACCGT 72 Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia K FW GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC 160 K RV TCTTTCACGAGCCCGCCAAA F FW TGATCGTTTAAGGAATTTTG 270 F RV GAAGATCAGTCACACCATCC Tabla 14. Cebadores utilizados para la caracterización del grupo de incompatibilidad mediante PCRBased Replicon Typing (PBRT) (TIB Molbiol). Cebadores Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia FII FW CTGATCGTTTAAGGAATTTT 258-262 (10) FII RV CACACCATCCTGCACTTA FIA FW CCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTG 462 FIA RV GTATATCCTTACTGGCTTCCGCAG FIB FW TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC 683 FIB RV CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT *FIBs FW TGCTTTTATTCTTAAACTATCCAC 683 FIC FW GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG 262 FIC RV TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT Tabla 15. Cebadores utilizados para el subtipado de plásmidos pertenecientes al grupo de incompatibilidad IncF. *Usado en pareja con FIB RV (TIB Molbiol). Material y métodos 73 Cebadores Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia repI1 FW CGAAAGCCGGACGGCAGAA 142 (206) repI1 RV TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT ardA FW ATGTCTGTTGTTGCACCTGC 501 ardA RV TCACCGACGGAACACATGACC trbA FW CGACAAATGCTTCCGGGGT 507 trbA RW TCTTACAATCGACAGCCTGT sogS FW TTCCGGGGCGTAGACAATACT 291 sogS RV AACAGTGATATGCCGTCGC pilL FW CCATATGACCATCCAGTGCG 316 pilL RV AACCACTATCTCGCCAGCAG Tabla 16. Cebadores utilizados para el subtipado de plásmidos pertenecientes al grupo de incompatibilidad IncI1(TIB Molbiol). Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia Aac6´-Ib-cr-F ATGACTGAGCATGACCTT 528 (207) Aac6´-Ib-cr-R GAAGGGTTAGGCATCACT Aac3´-IIa-F TGCCTCACTTAAAGCGATTG 500 (208) Aac3´-IIa-R CAAGCATCGGCATCTCATAC TEM-F ATGAGTATTCAACATTTCCG 867 (206) TEM-R CTGACAGTTACCAATGCTTA OXA-F CAGCAGCGCCAGTGCATC 694 (208) OXA-R TCCTGTAAGTGCGGACAC Tabla 17. Cebadores utilizados para la amplificación de co-determinantes de resistencia (TIB Molbiol). 74 Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia IutA-F GGCTGGACATCATGGGAACTGG 300 (50) IutA-R CGTCGGGAACGGGTAGAATCG HlyA-F AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT 1177 HlyA-R ACAATATAAGCGGTCATTCCCGTCA Iss-F CAGCAACCCGAACCACTTGATG 323 (209) Iss-R TTCTGCCGCTCTGGCAATGCT Iron-F AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG 665 (210) Iron-R GACGCCGACATTAAGACGCAG Tabla 18. Cebadores utilizados para la amplificación de genes de virulencia (TIB Molbiol). Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia PemK-up AACGAGAATGGCTGGATGC 232 (211) PemK-low CCAACGACACCGCAAAGC CcdA-up AGGAAGGGATGGCTGAGGT 230 CcdB-low GGTAAAGTTCACGGGAGAC ParD-up ACGGACCAGCAGCACCAG 534 ParE-low AGCCCTTGAGCCTGTCGG VagC-up GGGACCTGGATTTTGATGG 210 VagD-low GAGCAGATGTTGGTGTCG Hok-up AGATAGCCCCGTAGTAAGTT 203 Sok-low GATTTTCGTGTCAGATAAGTG PndC-up TCAATCAACCAGGGCTCT 140 PndA-low CCTCACCATCCAGACAAAA Material y métodos 75 Cebador Secuencia (5´-3´) Tm esperado (pb) Referencia SrnB-up ACTGATTGTAGCCTCTTCTTT 171 SrnC-low CACCACTGTATTTCCCCTGT (211) RelE-up AAAAACCCGATGGCGACAG 370 RelE-low TGATAGACCAGGCGAAAAC Tabla 19. Cebadores utilizados para la amplificación de sistemas de adicción (TIB Molbiol). 3.1.7. Equipos • Cabina deseguridad BIO-II-A (Telstar). • Cámara de fotos digital Kodak DC290 (Eastman Kodak). • Cubetas de electroforesis Sub-Cell GT (Bio-Rad). • Equipo de electroforesis en campo pulsante CHEFMapper (Contour-clamped Homogeneus Electric Field) (Bio-Rad). • Equipo de documentación de imágenes Gel Doc XR (Bio-Rad). • Fuente de alimentación modelo 1000-500 (Bio-Rad, Hercules, Canadá). • Kit de purificación de ADN (Qiagen). • Microcentrífuga Biofuge Fresco (Heraeus). • Secuenciador ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). • Termociclador Gene Cycler (Bio-Rad). • Sistema semiautomatizado de identificación y antibiograma Wider® (Francisco Soria Melguizo) y Microscan WalkAway® (Siemens). • Hybrigene (Techne). • UVC500 Crosslinker (HoeferPharmaciaBiotech). 76 • Micro Pulser TM electroporator (Bio-Rad). 3.1.8. Software • Bio-Rad Canada QuantityOne® Software. • Fingerprinting II SW software (Biorad). • Sistema de análisis digitales Kodak 1D EDAS290 (Eastman Kodak). • Software de análisis de secuencias: - Chromas (http://www.technelysium.com.au/chromas.html). - BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). - Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/transeq/index.html). - ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). • SPSS software (version 17.0). 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Aislamiento e identificación de aislados Los aislados se obtuvieron tras el procesamiento de las muestras según los protocolos establecidos. 3.2.1.1. Colección prevalencia La identificación de los aislados se realizó mediante paneles comerciales según las condiciones del fabricante. En el HUVM se llevó a cabo con el sistema comercial Wider® (Francisco Soria Melguizo) y en el HUVR con el equipo de MicroScan WalkAway® (Siemens). Material y métodos 77 3.2.1.2. Colección histórica La identificación de los aislados se hizo mediante paneles comerciales Vitek® (Biomérieux) en el período 2001-2004 y Wider® (Farncisco Soria Melguizo) en el período 2005-2009. 3.2.2. Detección de marcadores moleculares mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) Mediante la técnica de la PCR se obtiene la amplificación (aproximadamente 106 copias) de un fragmento de ADN. Para su posterior estudio se visualizaron los productos en geles de agarosa y se secuenciaron, si procedía. En condiciones generales, la mezcla de los reactivos se hizo según se indica: Reactivo Volumen/ reacción Cebadores 2,5 µl/cebador MgCl2 2 µl dNTPs 4 µl Tampón Taq10X 5 µl Taq polimerasa (Invitrogen®) 0,2 µl H2O ultrapura grado MilliQ estéril c.s.p. 48 µl Tabla 20. Volúmenes y Concentración final de cada reactivo. El volumen final es de 48 µl, al cual se le adicionan 2 µl de la solución que contiene el ADN. Este puede obtenerse a partir de purificaciones o de colonias frescas crecidas en placa. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en termocicladoresThermalcycler 2720 (AppliedBiosystems), siguiendo el programa general que se muestra a continuación: 78 Temperatura Proceso Tiempo Nº ciclos 94 ºC Desnaturalización 5 min 1 95 ºC Desnaturalización 30 s 30 Según cebadores Hibridación 30 s 72 ºC Extensión 7 s 7 ºC Extensión final 5 min 1 Tabla 21. Condiciones generales de PCR. 3.2.3. Detección de ST131. Colección de prevalencia e histórica Se han descrito métodos rápidos y específicos para la detección de E. coli ST131, entre los que se incluyen la rep-PCR (212), el análisis SNP de mdh y gyrB junto con O25b rfb (153) y la PCR del alelo 3 del gen pabB (35), siendo esta última la que hemos elegido en nuestro estudio. Para detectar aislados pertenecientes al secuenciotipo ST131 nosotros utilizamos la siguiente combinación: 3.2.3.1. Detección del serogrupo O25b Las cepas de E. coli se pueden clasificar en base a los antígenos “O” (antígeno somático), “K” (antígeno capsular) y “H” (antígeno flagelar), lo cual da lugar a los distintos serogrupos y serotipos. La síntesis del antígeno somático “O” está regulada por un grupo de genes denominado rfb, siendo la variabilidad de su extremo 5´ la que diferencia los distintos serogrupos. Tanto los aislados de la colección de prevalencia, los cuales se recogían semanalmente, como los de la colección histórica, se sometieron a cribado mediante PCR de O25b con cebadores específicos para el antígeno “O” variante b (tabla 8), según lo descrito por Clermont (204). Material y métodos 79 3.2.3.2. Detección del alelo 3 del gen pabB La detección del alelo 3 del gen pabB, específico de los aislados del clon ST131, se realizó en todos aquellos aislados en los que detectamos la variante b del serogrupo O25. Se llevó a cabo mediante PCR con los cebadores que se indican en la tabla 9. 3.2.3.3. Análisis de filogrupo El análisis de filogrupo se realizó mediante PCR con cebadores específicos (Tabla 10) para los genes chuA, yjaA y el fragmento de ADN TspE4.C2. La interpretación de los resultados se llevó a cabo según lo descrito por Branger (tabla 22) (213); los aislados del secuenciotipo ST131 pertenecen al filogrupo B2 subgrupo B23, es decir, presentan los 3 genes marcadores. Debido a diferencias entre los resultados del serogrupo, filogrupo y perfil genético de algunos aislados, se repitió la PCR de filogrupo, comentada anteriormente en la introducción, con otro set de cebadores (Tabla 11), entre los que se incluyen los de un control interno. chuA yjaA TspE4.C2 Filogrupo - - - A0 - + - A1 + + - B22 + + + B23 + - - D1 + - + D2 Tabla 22. Interpretación del filogrupo según Branger (Branger, EID 2005). Los aislados con resultado positivo en la detección de O25b, pabB3, chuA, yjaA y TspE4.C2 se consideraron como pertenecientes al secuenciotipo ST131. 86 secuenciación, que otorga un ST o secuenciotipo. Los resultados se analizaron en la página web: http://pubmlst.org/plasmid/primers/incI1.shtml. 3.2.9.3. Co-determinantes de resistencia Los genes generalmente asociados a la región Multi-Drug-Resistant o MDR, la cual vehiculiza blaCTX-M-15, son blaOXA-1, blaTEM-1, aac(6´)-Ib-cr y aac(3)-II (148). Por lo que se determinó mediante amplificación por PCR con cebadores específicos la presencia de estos determinantes (Tabla 17). 3.2.9.4. Factores de virulencia La secuenciación completa de uno de los plásmidos de un aislado de E. coli ST131 reveló la presencia de los siguientes genes de virulencia: iutA, hlyA, iron e iss (Zhong, 2012). De ahí que fueran los que quisimos detectar en nuestra selección de aislados. Para ello, se realizó una amplificación por PCR con cebadores específicos (Tabla 18). 3.2.9.5. Sistemas de adicción Se han descrito varios sistemas de adicción en plásmidos que vehiculizan blaCTX-M-15 y cuyo papel es contribuir a la diseminación del plásmido y a la adaptación al hospedador (145,148). Se estudió mediante PCR con cebadores específicos (tabla 19) la presencia de los genes que codifican los sistemas toxina/antitoxina: PemK-PemI “plasmid emergency maintenance”, CcdA–CcdB “coupled cell division locus”, RelB–RelE “relaxed control of stable RNA synthesis”, ParD–ParE “partitoning system”, VagC–VagD “virulence-associated protein”; y los que están regulados por ARN antisentido: Hok–Sok “host-killing, PndA–PndC (promotion of nucleic acid degradation) y SrnB–SrnC “stable RNA”. 3.2.9.6. Restricción de ADN plasmídico • Digestión de plásmidos con EcoRI. Se añadió a 10 μg de ADN obtenido mediante el método Takahashi 4 μl de EcoRI, 3 μl de Buffer y 13 μl de agua. Se incubó durante 1 h en un baño a 37ºC. Material y métodos 87 • Se corrió en un gel al 0,8% y se utilizó como marcador de peso molecular E. coli 50192. 3.2.10. Métodos informáticos El análisis de los pulsotipos se llevó a cabo con el Fingerprinting II SW software (Biorad, Hercules, CA, USA). El sistema de análisis digitales Kodak 1D EDAS290 (Eastman Kodak) se utilizó para el estudio de las fotografías de los geles. Para el análisis comparativo de secuencias se utilizaron los siguientes softwares: 1. Chromas (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) 2. BLAST (Altschul SF., Gish W. y cols., 1990) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 3. Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/transeq/index.html) 3.2.11. Métodos estadísticos Los análisis estadísticos se realizaron con el SPSS software (version 17.0; SPSS, Chicago, Illinois, United States). La comparación de proporciones de datos no apareados se realizaron mediante el test de la Chi cuadrado (o Fisher si procede), y las continuas mediante el test de la U de Mann-Whitney, según procedió. 88 89 4. Resultados Resultados 91 4.1. Análisis de la prevalencia del clon ST131 en el área de Sevilla Durante el año 2010 se recogieron 1.617 (38%) aislados de E. coli en el HUVM y 2.691 (62%) aislados procedentes del HUVR, lo cual supone un total de 4.308 aislados de E. coli. En la figura se puede observar que de éstos, 3.499 (81%) aislados procedían de muestras de origen comunitario, 692 (16%) nosocomial, y de 117 (3%) se desconocía la procedencia (Figura 3). Figura 3. Representación del nº de aislados según el servicio peticionario. La mayoría de los aislados procedía de urocultivos (88,9%), seguida de exudados de heridas y abscesos (6%), hemocultivos (3,9%), muestras de origen respiratorio (1%) y de otra procedencia (0,2%), como se puede observar en la siguiente figura (Figura 4). 92 Figura 4. Distribución de las muestras. Se caracterizaron 541 (12,5%) aislados como O25b/pabB3/B23, por lo que podíamos decir que pertenecían al clon ST131. De estos, 38 (7%) eran aislados productores de BLEE, mientras que 503 (93%) no lo eran. En la figura 5 se puede observar que 436 (80,6%) aislados ST131 eran de origen comunitario, siendo 31 (7,1%) productores de BLEE; 93 (17,2%) procedían del ambiente hospitalario, de los cuales 6 (6,4%) producían BLEE, y 12 (2,2%) tenían origen desconocido. 0 100 200 300 400 500 Comunitario Nosocomial Desconocido Origen Nº de aislados ST131 ST131 BLEE Figura 5. Distribución de aislados ST131 y ST131 productores de BLEE en función del origen. Respecto al tipo de muestras, 468 (86,6%) eran de origen urinario, 32 (6%) procedían de muestras de exudados de heridas y abscesos, 13 (2,4%) de hemocultivos, 13 (2,4%) de muestras respiratorias y 14 (2,6%) de diversas fuentes. En la figura 6 podemos ver cómo quedan representados los aislados ST131 respecto a los no Resultados 93 ST131, según cada tipo de muestra. Podemos destacar que 467 (12,3%) urocultivos tenían un aislamiento de E. coli ST131. 0 1000 2000 3000 4000 5000 Nº de aislados Uroc. EH y A. Hemoc Resp. Tipo de muestra ST131 No ST131 Figura 6. Distribución de aislados ST131 y no ST131 según cada tipo de muestra. Uroc: Urocultivos; EH y A; Exudados de heridas y abscesos; Hemos: hemocultivos; Resp: muestras respiratorias. De los 295 aislados de E. coli productores de BLEE, 38 (13%) eran ST131. Respecto a la filogenia de todos los aislados productores de BLEE, se puede ver en la figura 7 que pertenecían principalmente a los subgrupos B23 (33,5%) y B1 (24,3%), lo cual correspondía al 57,8% del total. Los aislados de los filogrupos A1, D1, D2, A0 y B22 suponían el 18,9%, 8,6%, 7,1%, 6,5% y 0,01%, respectivamente. El 57,5% de los aislados de E. coli productores de BLEE del filogrupo B23 eran ST131. Si se tiene en cuenta el análisis por grupos en lugar de subgrupos, el más frecuente fue B2 (33,5%), seguido de A (25,4%), B1 (24,3%) y D (15,7%). 94 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ao A1 B1 B22 B23 D1 D2 Filogrupo % de aislados ST131 no ST131 Figura 7. Distribución de filogrupos en aislados de E. coli productores de BLEE. Al realizar la caracterización de 161 enzimas BLEE, se obtuvieron porcentajes muy similares entre los grupo CTX-M-1 (38,5%), CTX-M-9 (31,7%) y SHV (29,8%). En la figura 8 puede apreciarse que las enzimas predominantes fueron CTX-M-15 (31,1%), CTX-M-14 (27,3%) y SHV-12 (28,6%), respectivamente, lo que suponía el 87%. No obstante, también se detectaron en menor cuantía otras enzimas, como puede observarse en la tabla 24. Un total de 35 aislados (92,1%) ST131 eran productores de CTX-M-15; dos aislados eran productores de CTX-M-32 (5,3%) y uno (2,6%) de CTX-M-14. Figura 8. Distribución de los aislados en función del tipo de BLEE. Resultados 95 Tipo de BLEE Nº de aislados % Grupo CTX-M-1 62 38,5 CTX-M-15 50 31,1 CTX-M-1 7 4,3 CTX-M-32 5 3,1 Grupo CTX-M-9 51 31,7 CTX-M-14 44 27,3 CTX-M-9 5 3,1 CTX-M-27 2 1,2 Grupo SHV 48 29,8 SHV-12 46 28,6 SHV-28 1 0,6 SHV-2 1 0,6 Tabla 24. Frecuencia de las los aislados productores de BLEE por grupo. En la figura 9 se puede ver la distribución de los filogrupos según cada grupo de BLEE. En el caso del grupo CTX-M-1, se observa que los aislados productores de CTX-M15 (50 aislados) pertenecen de forma predominante al filogrupo B2, de los cuales el 70% (35 aislados) era ST131. Tanto en el grupo de CTX-M-9 como de SHV, las enzimas más frecuentes son CTX-M-14 y SHV-12, respectivamente. Aunque estas se encuentran en todos los filogrupos, pertenecen principalmente a los filogrupos A1 y B1. Todas las enzimas pertenecientes al filogrupo B2, a su vez, estaban clasificadas en el subgrupo B23, excepto una SHV-2 que pertenecía al subgrupo B22. 102 4.1.3. Subtipado (fimH) Los aislados fueron seleccionados entre los 23 pulsotipos diferentes, considerando que, aquellos aislados con menos de 3 bandas de diferencia, pertenecían al mismo pulsotipo. De los aislados ST131 se eligieron 8 aislados con pulsotipo único y 15 aislados con pulsotipo múltiple. En el caso de los aislados ST131 productores de BLEE, los elegidos fueron todos con pulsotipo múltiple y productores en su mayoría (13/14) de CTX-M-15. El aislado restante era productor de CTX-M-32. En la tabla 28 se detalla el número de aislados que se eligieron por cada tipo de pulsotipo. Pulsotipo ST131 no BLEE (n=23) ST131 BLEE (n=14) Único 8 0 Múltiple 2-5 aislados 11 9 Múltiple >5 aislados 4 5 Tabla 28. Distribución de los aislados seleccionados ST131 no productores y productores de BLEE según el pulsotipo. Tras realizar el análisis de fimH a los 37 aislados, obtuvimos 7 alelos: fimH30, fimH22, fimH27, fimH38, fimH54, fimH202 y fimH298. En los aislados productores de BLEE se identificaron 3 de ellos (fimH30, fimH22, fimH54), mientras que en los aislados ST131 no productores de BLEE hubo mayor diversidad alélica, tal y como se puede ver en la figura 11. Los dos linajes más frecuentes tanto en los aislados ST131 productores como no productores de BLEE fueron H30 y H22. Se hallaron diferencias significativas al comparar los linajes, de modo que H30 era significativamente más frecuente entre los aislados ST131 productores de BLEE que los no productores (85,8% vs. 26,1%; p=0,0015); mientras que el linaje H22 era más frecuente entre los aislados ST131 no productores de BLEE respecto a los que sí producían BLEE, aunque la diferencia no fue significativa (30,4% vs. 7,1%; p=0,20), Resultados 103 Figura 11. Distribución de los alelos de fimH en aislados ST131 no productores de BLEE y ST131 productores de BLEE. En la tabla 29 se puede observar que todos los aislados de los linajes H38, H202, H298 y la mayoría (94,5%) de H30 eran resistentes a FQ. En los linajes H22, H27 y H54 el 50% de los aislados era sensible y el otro 50% resistente a FQ. Alelo de fimH Total de aislados (%) Resistentes a FQ Sensibles a FQ FimH30 17 (94,5) 1 (5,5) FimH22 4 (50) 4 (50) FimH27 2 (50) 2 (50) FimH38 1 (100) 0 FimH54 1 (50) 1 (50) Fim202 1 (100) 0 Fim298 1 (100) 0 Null 0 2 (100) Tabla 29. Distribución de la resistencia a FQ según el alelo de fimH en todos los aislados de ST131. 104 En las figuras 12 y 13 quedan representadas las distribuciones de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 no productores de BLEE y de los aislados ST131 productores de BLEE, respectivamente. En el primer caso, se observa que todos los aislados de los linajes H30, H38, H202 y H298 eran resistentes a FQ, si bien el 43%, 50% y 100% de los aislados pertenecientes a los linajes de H22, H27 y H54, respectivamente, eran sensibles. En el caso de los aislados ST131 productores de BLEE, todos los aislados de los linajes H30 y H54 eran resistentes a FQ y el único aislado del subclon fimH22 era sensible. Figura 12. Distribución de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 no productores de BLEE en función de los linajes de fimH. Figura 13. Distribución de la sensibilidad a FQ de los aislados ST131 productores de BLEE en función de los linajes de fimH. Resultados 105 4.2. Animales de compañía 4.2.1. Estudio de la relación clonal de aislados portugueses y españoles En la siguiente tabla quedan recogidos los pulsotipos según el número de aislados por pulsotipo y el número de aislados que presenta cada uno de ellos según su muestra de origen. Se pueden contabilizar 72 pulsotipos únicos, de los cuales 46 procedían de aislados de personas y 21 de animales. Por otro lado, hallamos 21 pulsotipos múltiples, de los cuales 19 tenían 2-5 aislados y 2 incluían más de 5. Excepto 5 aislados que eran de animales, todos procedían de personas. Pulsotipo Nº de pulsotipos (N=93) Nº de aislados (N=146) Personas (N=115) Animales (N=31) Único 72 72 46 26 Múltiple 2-5 aislados 19 54 49 5 Múltiple con >5 aislados 2 20 20 0 Tabla 30. Distribución de los aislados según pulsotipo y muestra de origen. Como se puede ver en la figura 14, hubo más dispersión de los pulsotipos de los aislados procedentes de mascotas (el 84% de los pulsotipos de aislados de origen animal eran únicos), si bien en el caso de los pulsotipos de aislados de origen humano se observó mayor clonalidad (el 60% de los pulsotipos de aislados de origen humano eran múltiples). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Pulsotipos múltiples Pulsotipos únicos % de aislados Individuos Mascotas Figura 4. Frecuencia de aislados según el pulsotipo y origen de la muestra. Estudiamos la relación genética de los aislados de ambas zonas junto con 13 de la colección de referencia de Johnson. En la figura 15 pueden distinguirse 6 clusters cuyos 106 pulsotipos tienen un índice de similitud del 94%. Se observaron las siguientes relaciones entre los aislados: • 3 clusters incluían pulsotipos de aislados (5,5%) procedentes de ambas zonas geográficas, todos de origen humano, según indican la líneas rojas. • 2 clusters englobaban 8 pulsotipos de aislados de individuos y de referencia: dos aislados de España tenían un pulsotipo que coincidía con el internacional 800 y otro aislado con el 903 (líneas moradas); los pulsotipos de 3 aislados de Portugal y otro de España lo hacían con el pulsotipo 968 (línea azul). • Sólo hubo un cluster con un pulsotipo de aislado de origen humano y otro animal (1,3%), ambos portugueses. Está señalado por la línea verde. Figura 15. Dendograma obtenido mediante PFGE con XbaI de aislados ST131 de muestras clínicas de origen humano y de mascotas, procedentes de España y Portugal, y de aislados de la colección de referencia de Johnson 1774 1593 5825 1058 192 968 642 978 939 1302 800 2496 853 704 903 858 Nº de aislado Puls. referencia Portugal España Individuo Mascota Resultados 107 4.2.2. Sensibilidad a antimicrobianos 4.2.2.1. Comparación de aislados humanos portugueses y españoles con los aislados de animales de compañía. Cuando se compararon los patrones de resistencia a los antimicrobianos de los aislados de individuos de ambas regiones con los de mascotas (figura 16), se observó que los aislados de individuos eran más resistentes de forma muy significativa (p<0,001) a ciprofloxacino, tobramicina y trimetoprim-sulfametoxazol que los de mascotas; mientras que en el caso del ácido nalidíxico fueron diferencias significativas. También es de destacar que la frecuencia de aislados ST131 productores de BLEE fue mayor entre los aislados de personas (n=57, 49%) que entre los de mascotas (n=3, 10%; p <0,001). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS Antimicrobiano % de aislados resistentes Individuos Mascotas Figura 16. Distribución de aislados ST131 resistentes a los distintos antimicrobianos en función del origen de la muestra. AMC: amoxicilinaclavulánico, PT: piperacilina-tazobactam; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: ciprofloxacino; TMX: trimetoprimsulfametoxazol; FOS: fosfomicina. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias muy significativas. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias significativas. 108 4.2.2.2. Comparación de aislados de individuos con los aislados de animales de compañía, ambos portugueses. Al comparar los perfiles de resistencia de los aislados de individuos con los de mascotas pertenecientes a Lisboa (figura 17), se observó que los aislados de individuos fueron más resistentes de forma muy significativa (p<0,001) a ciprofloxacino, gentamicina, tobramicina y trimetoprim-sulfametoxazol y de manera significativa a amoxicilinaclavulánico (p=0,002), ácido nalidíxico (p=0,009) y fosfomicina (p=0,006). También es de destacar que la frecuencia de aislados de este clon productores de BLEE era mayor en aislados de individuos (n=20, 71 %) que de mascotas (n=3, 10%; p <0,001). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS Antimicrobiano % de aislados resistentes Individuos Mascotas Figura 17. Distribución de aislados ST131 resistentes a los distintos antimicrobianos en función del origen de la muestra pertenecientes a una misma región. AMC: amoxicilina-clavulánico, PT: piperacilina-tazobactam; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: ciprofloxacino; TMX: trimetoprim-sulfametoxazol; FOS: fosfomicina. Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias muy significativas. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias significativas. Resultados 109 4.2.2.3. Comparación de aislados de individuos españoles y portugueses Teniendo en cuenta los aislados de individuos tanto de Sevilla como de Lisboa, se hallaron diferencias muy significativas para la gentamicina (p<0,001), tobramicina (p<0,001), trimetoprim-sulfametoxazol (p<0,001) y fosfomicina (p<0,001), y significativas para el amoxicilina-clavulánico (p=0,004), obteniéndose mayor porcentaje de resistencia en el caso de los aislados de personas de Portugal. También se detectaron con más frecuencia aislados productores de BLEE procedentes de Lisboa (71%) respecto a los del área de Sevilla (42%) (p=0,009) (figura 18). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMC GEN TOB AMK NAL CPR TMX FOS Antimicrobiano % de aislados resistentes España Portugal Figura 18. Distribución de aislados ST131 resistentes de muestras de origen humano a los distintos antimicrobianos pertenecientes a distintas regiones. AMC: amoxicilina-clavulánico, PT: piperacilina-tazobactam; GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; AMK: amikacina; NA: ácido nalidíxico CIP: ciprofloxacino; TMX: trimetoprim-sulfametoxazol; FOS: fosfomicina. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias muy significativas. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias significativas. 4.2.3. Caracterización de plásmidos En total se caracterizaron los plásmidos de los 37 aislados seleccionados. Para la caracterización del los plásmidos de aislados ST131 productores de BLEE, se trabajó con 110 transformantes, los cuales se consiguieron en 13 de los 14 aislados. En el caso de los aislados ST131 no productores de BLEE no se consiguieron transformantes, por lo que la extracción plasmídica y los estudios consecutivos de caracterización se hicieron directamente del aislado clínico. Se procedió de igual manera con el aislado BLEE que no se pudo transformar. Como puede observarse en la figura 19, se hallaron 23 aislados (62,2%) con un solo plásmido, de los cuales 13 (56,5%) eran ST131 no productores de BLEE y 10 (43,5%) ST131 productores de BLEE (CTX-M-15). En 13 (35,1%) de los aislados se detectaron 2 plásmidos, siendo 9 (69,2%) aislados no productores de BLEE y 4 (30,8%) productores de BLEE (3 CTX-M-15, 1 CTX-M-32). Hubo un aislado no productor de BLEE (2,7%) en el que se detectaron 3 plásmidos. 0 5 10 15 20 25 1plásmido 2 plásmidos 3 plásmidos Nº de aislados ST131 BLEE ST131no BLEE Figura 19. Distribución del número de plásmidos en cada aislado. 4.2.3.1. Tipado de plásmidos. Grupos de incompatibilidad y replicones En la tabla 31 se observa que todos los aislados ST131 productores de BLEE (14; 100%) y la mayoría de los aislados no productores de BLEE (22; 96%) contenían al menos un plásmido del grupo de incompatibilidad IncF. El aislado restante (4%) tenía un plásmido perteneciente al grupo IncI. En todos los plásmidos se detectaron más de un replicón F, siendo las combinaciones más frecuentes FII+FIA y FII+FIB con un 43,2% (n=16) cada uno. Al analizar los resultados en función de la producción de BLEE, se obtuvo que en los aislados productores de BLEE los plásmidos presentan con mucha más frecuencia los replicones FII+FIA que en los no productores de BLEE (78,5% vs. 17,4%; p= 0,003). En Resultados 111 cambio, en los plásmidos de aislados no productores de BLEE la combinación FII+FIB fue más frecuente que en los productores de BLEE (60,8% vs.14,3%; p = 0,01). Nº de aislados (%) Grupo(s) Inc ST131 no BLEE (n=23)(%) ST131 BLEE (n=14) (%) Total (%) Replicon(es) Inc F FII+FIA 4 (17) 10 (71) 14 (38,8) Inc F FII+FIB 11 (48) 1 (7) 12 (33,3) Inc F FII+FIA+FIB 3 (13) 1 (7) 3 (8,3) Inc F, IncY FII+FIA+Y 0 1 (7) 1 (2,8) Inc F, IncN FII+FIB+N 0 1 (7) 1 (2,8) Inc F, IncI1 FII+FIB+I1 2 (8) 0 2 (5,6) Inc F, IncI1 FII+I1 1 (4) 0 1 (2,8) Inc F, IncP, IncK FII+FIB+P+K 1 (4) 0 1 (2,8) Inc I1 I1 1 (4) 0 1 (2,8) Total IncF 22 (96) 14 (100) 35 (97,2) Total FII+FIA 4 (17,4) 11 (78,5) 16 (43,2) Total FII+FIB 14 (60,8) 2 (14,3) 16 (43,2) Tabla 31.Distribución de los grupos de incompatibilidad plasmídica y replicones de plásmidos de aislados ST131 no productores de BLEE y ST131 productores de BLEE. 4.2.3.1.1. Subtipado de plásmidos IncF. Esquema FAB. En la figura 20 se puede observar que la fórmula FAB más frecuente en los plásmidos IncF de aislados ST131 productores de BLEE fue F2:A1:B- (57%), seguido de F4:A1:B- (14,2%). En la misma proporción (7,1%) se encontraron F2:A-:B1; F11:A1:B-; F29:A-:B1 y F31:A-:B1. Sin embargo, en los aislados ST131 no productores de BLEE se detectó mayor variabilidad en cuanto al subtipado plasmídico: 23 aislados presentaron 12 subtipos de plásmido diferentes. De éstos, los más frecuentes fueron F2:A-:B1 (17,4%) y 118 4.2.3.5. Relación genética Tras realizar la digestión con EcoRI de los plásmidos de 7 aislados ST131 productores de BLEE y 3 no productores, se obtuvieron los perfiles de restricción que muestra la figura 24. En el caso A se puede observar que aquellos plásmidos con la misma fórmula FAB (F2:A1:B-) y productores de CTX-M-15 presentaban perfiles de restricción muy similares (80% de similitud) o iguales (100%). El plásmido con una variación alélica del replicón FII (F4 en vez de F2) muestra un perfil con un 72% de similitud respecto a los anteriores. Si además se producen cambios en la secuencia del replicón FIA, el porcentaje de similitud disminuye aún más. En el caso B, los plásmidos de 3 aislados (dos no productores de BLEE y uno productor de CTX-M-32) con la misma fórmula FAB (F2:A-:B1) presentan perfiles de restricción con menos del 50% de similitud. Figura 24. Dendograma obtenido mediante PFGE conEcoRI de plásmidos de aislados ST131 no productores y productores de BLEE ST131. Resultados 119 4.2.4. Colección histórica 4.2.4.1. Prevalencia de ST131 4.2.4.1.1. Prevalencia total de ST131 De los 417 aislados correspondientes al período 2002-2009, 37 (8,8%) se caracterizaron como O25b/pabB3/B23 (ST131). 4.2.4.1.2. Prevalencia de ST131 según colección En la figura 25 se observa la distribución de los aislados ST131 según la colección de procedencia. Las colecciones de Enero, Bacteriemia y BLEE contaban con 182, 91 y 144 aislados cada una, de los cuales 18 (9,9%), 7 (7,7%) y 12 (8,3%) pertenecían al clon ST131, respectivamente. 050 100 150 200 Enero Bacteriemia BLEE Colección Nº de aislados ST131 No ST131 Figura 25. Distribución de los aislados ST131 según la colección de procedencia. 4.2.4.1.3. Prevalencia de aislados ST131 según año de aislamiento Tras analizar la distribución temporal del total de aislados (Figura 26.A), se detectó que los primeros aislados ST131 databan del año 2002, tras el cual dejaron de detectarse durante un año. A partir de 2004 encontramos aislados ST131 todos los años. En la figura 29.B podemos observar que el número de aislados ST131 tiende a ir aumentando con el 120 transcurso de los años. Al inicio del estudio el número de aislados ST131 es de 2 (4%), mientras que al final del período de estudio, año 2009, llegaron a contabilizarse 10 (14,5%) aislados ST131. Figura 26.A) Distribución temporal del total de aislados de E. coli. B) Distribución temporal de los aislados ST131. 4.2.4.1.4. Prevalencia de aislados ST131 según colección y año de aislamiento En la figura 27 podemos observar que aquella colección en la que se detectaron por primera vez aislados ST131 fue en la de Enero, en el año 2002. En los años sucesivos hubo aislamientos, excepto en el 2003. En la colección de Bacteriemias el primer aislado se identificó en 2004 y a partir del año 2005 se detectaron en los años alternos. En la colección BLEE el primer año de aislamiento fue en 2006 y, a partir de entonces, hubo aislamientos todos los años. A B Resultados 121 Figura 27. Distribución temporal de los aislados ST131 de las colecciones Enero, Bacteriemias y BLEE. 4.2.4.2. Filogrupos 4.2.4.2.1. Distribución de filogrupos de todos los aislados ST131 Respecto a la distribución de los filogrupos de todos los aislados analizados, observamos en la figura 28 que el grupo predominante fue B2 (38,8%), seguido de A (28,6%), D (21,3%) y, en último lugar, B1 (10,4%). 4.2.4.2.2. Distribución de filogrupos según colección Al tener en cuenta las colecciones de forma independiente, se puede distinguir en la figura 28 que el filogrupo predominante fue el B2 (53,8% y 42,9%) en el caso de las colecciones Enero y Bacteriemias, seguido de A (19,2% y 29,7%), D (17,6% y 20,9%) y B1 122 (8,8% y 3,3%), si bien en el caso de la colección BLEE el más frecuente fue el A (40,3%), seguido de D (25,7%), B1 (18,1%) y B2 (16%). Figura 28. Distribución de filogrupos: distribución global, colección Enero, colección Bacteriemias y colección BLEE. 4.2.4.2.3. Distribución de filogrupos según año de aislamiento Como podemos ver en la figura 29 el filogrupo más frecuente en todos los años fue B2 (Media anual = 20%), exceptuando 2002 y 2004, años en los que se detectan con más frecuencia aislados del filogrupo A (Media = 20%), seguido de B2 (Media = 13%). En los años 2005, 2007-2009, el segundo grupo más prevalente fue A (Media = 16,8%), si bien en 2003 y 2006 fue D (Media = 6,5%). Resultados 123 0% 20% 40% 60% 80% 100% 02 03 04 05 06 07 08 09 Año % de aislados ST131 A B1 D B2 Figura 29. Distribución temporal de filogrupos de todos los aislados de E. coli. 4.2.4.2.4. Distribución de filogrupos según colección y año de aislamiento Según la figura 30 el filogrupo B2 va aumentando de forma gradual su prevalencia a expensas del A. En la colección de Enero el filogrupo B2 es el más frecuente en casi todos los años, notándose un incremento gradual durante los años 2004-2007. En las colecciones de Bacteriemias y BLEE este aumento se produce desde el año 2004 hasta 2008. 124 Figura 30. Distribución temporal de los filogrupos de los aislados de la colección de Enero (A), colección Bacteriemias (B) y colección BLEE (C). 4.2.4.3. Sensibilidad a antimicrobianos 4.2.4.3.1. Comparación de todos los aislados ST131 y no ST131 Teniendo en cuenta el total de aislados analizados durante los 8 años de estudio, podemos observar en la figura 31 que los aislados que pertenecían al clon ST131 fueron más resistentes de manera muy significativa a tobramicina (29% vs. 10%; p<0,001) y de forma significativa a amikacina (12% vs. 4%; p<0,05), ácido nalidíxico (78% vs. 25%; p<0,05) y ciprofloxacino (61% vs. 25%;p<0,05), que aquellos no ST131. Resultados 125 Figura 31. Distribución de la sensibilidad frente a diversos antibióticos de todos los aislados analizados durante el período 2002-2009. GEN: gentamicina; TOB: tobramicina; AMK: amikacina; NAL: ácido nalidíxico CIP: ciprofloxacino. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias muy significativas. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias significativas. 4.2.4.3.2. Comparación de todos los aislados ST131 y no ST131 según año de aislamiento Los aislados ST131 detectados en los años 2006 fueron significativamente más resistentes a tobramicina (60% vs. 7%; p<0,05) y en el 2007 a ciprofloxacino, (88% vs. 42%; p <0,05), que los que no pertenecían al clon. Respecto a los otros años y demás antibióticos no hubo diferencias (figura 32). A B 126 Figura 32. Distribución de todos los aislados ST131 resistentes a Gentamicina (A), Tobramicina (B), Amikacina (C), Ácido nalidíxico (D) y Ciprofloxacino (E) en función del año de aislamiento. : Antimicrobianos para los que se hallaron diferencias significativas. 4.2.4.3.3. Comparación de los aislados ST131 y no ST131 según colección y año de aislamiento Aquellos aislados que pertenecían al clon ST131 de la colección de Enero fueron más resistentes a gentamicina y tobramicina durante los años 2006 y 2008 que los aislados no ST131 (50% vs. 4%; p<0,05) (figura 33). No hubo diferencias en cuanto a la amikacina. Durante los años 2006, 2007 y 2008, los aislados ST131 fueron más resistentes a ácido nalidíxico (75% vs. 22%; 100% vs. 18%; 67% vs.19%; p<0,05) que los no ST131. En el año 2007 los aislados ST131 fueron también más resistentes a ciprofloxacino (100% vs. 5%; p<0,05), que los aislados no ST131. C D E Resultados 127 En la colección de Bacteriemias (figura 34) no se detectó ningún aislado resistente a gentamicina ni diferencias en los perfiles de sensibilidad entre los aislados ST131 y no ST131 durante todo el período de estudio. Los aislados de la colección BLEE pertenecientes al clon ST131 fueron más resistentes a tobramicina (100% vs. 13%; p<0,05) y amikacina (100% vs. 6%; p<0,05) durante el año 2006 y a gentamicina (20% vs. 4%; p<0,05) y tobramicina (40% vs. 4%; p<0,05) en el año 2009 (figura 35). A B C D E Discusión 135 En el estudio de prevalencia que hemos realizado, observamos por primera vez que el clon ST131 era un clon prevalente en nuestra área sanitaria entre todos los aislados de E. coli, no sólo entre los multirresistentes o resistentes a FQ. Los aislados de este clon fueron mayoritariamente de origen comunitario y relacionados principalmente con infecciones del tracto urinario. De todos los aislados ST131, sólo una minoría era productor de BLEE, principalmente CTX-M-15, en proporción similar al resto de aislados de E. coli. Respecto a la resistencia a antimicrobianos, tanto los aislados ST131 productores como no productores de BLEE, fueron más resistentes que los aislados que no pertenecían al clon. Entre todas las resistencias antimicrobianas detectadas destacó la relación entre los aislados ST131 productores de BLEE y la resistencia a FQ. Hemos encontrado cierta homogeneidad a nivel de pulsotipo, siendo un pequeño número de pulsotipos múltiples los responsables de la diseminación del clon. También observamos que, a pesar de haber encontrado coincidencia con pulsotipos internacionales, la expansión del clon se debía principalmente a pulsotipos locales. Todos los aislados del clon productores de BLEE y la mayoría de los no productores contenían al menos un plásmido IncF. En el caso de aislados ST131 productores de BLEE la mayoría de los plásmidos presentaba los replicones FII+FIA, mientras que en los plásmidos de aislados no productores era FII+FIB. Sin embargo, encontramos más homogeneidad en cuanto al subtipado plasmídico y perfiles de restricción entre los aislados ST131 productores de BLEE que entre los no productores. Los plásmidos de aislados ST131 productores de BLEE presentaban con más frecuencia otros determinantes de resistencia, tales como aac(6´)-Ib-cr y blaOXA-1, mientras que en los no productores de BLEE fueron más prevalentes los factores de virulencia. En cuanto a los sistemas de adicción, la mayoría de los plásmidos portadores de genes bla con la fórmula F2:A1:Bcontenía la misma combinación de 5 sistemas de adicción (pemKI , ccdAB, parDE, vagCD, hok-sok). 136 En nuestra área la transmisión humano-animal de compañía no interviene en la diseminación del clon, ya que excepto una pareja de aislados, no encontramos coincidencias entre los pulsotipos. Cabe destacar que los aislados de individuos fueron más resistentes y producían BLEE con más frecuencia que los procedentes de animales de compañía. La prevalencia del clon ST131 obtenida en el año 2010 fue del 12,5%, cifra similar a dos estudios realizados en años anteriores (tabla 36). Uno de ellos fue llevado a cabo por Blanco y cols. en el año 2009, quienes tras estudiar 500 aislados de E. coli procedentes de 5 hospitales de España (entre ellos HUVM) obtuvieron una prevalencia del clon ST131 del 12% (169). El otro estudio realizado en Reino Unido analizaron 300 aislados de E. coli de origen urinario correspondientes a los años 2007 y 2009, de los cuales el 12% pertenecían al clon ST131 (216). Sin embargo, en EEUU el clon resultó ser más frecuente, tal y como describen los siguientes trabajos. En uno de ellos, Johnson y cols. analizaron una colección de 127 aislados de E. coli durante el año 2007, llegando a pertenecer al clon ST131 el 16,6% de los aislados (217). En el segundo estudio americano tras analizar 299 muestras en el año 2011, obtuvieron que el clon ST131 contaba con el 27% de los aislados (218). Dicho incremento podría deberse a la inclusión de todas las muestras tanto de pacientes hospitalizados como comunitarios o al tiempo transcurrido entre ambos estudios. En el estudio de Johnson se seleccionan los aislados según sean productores de BLEE y/o resistentes a quinolonas, lo que podría justificar que su prevalencia fuera superior a la nuestra. Sin embargo, no incluyeron los aislados de origen comunitario ni los urocultivos, por lo que puede ser que las diferencias geográficas sean la razón por la que las tasas de aislados de E. coli ST131 de los estudios americanos sean mayores que la nuestra. Nuestro estudio de prevalencia es el más extenso hasta día de hoy y en el que se han incluido todos los aislados de E. coli procedentes de cualquier tipo de muestra, sin llevar a cabo ninguna selección por producción de BLEE o resistencia a FQ. Discusión 137 País Año de estudio Criterio de selección de aislados Nº de aislados % de E. coli ST131 Referencia EEUU 2011 Ninguno. Se incluyeron todos. 299 27 (218) EEUU 2007 Producción de BLEE y/o resistencia a FQ. Pacientes hospitalizados. Todas las muestras, excepto urocultivos. 127 16,6 (217) España 2010 Ninguno. Se incluyeron todos. 4.308 12,5 Este estudio Reino Unido 2007 y 2009 Aislados de E. coli de pacientes con ITU. 300 12,3 (216) España 2009 Ninguno. Se incluyeron todos. 500 12 (169) Tabla 36. Prevalencia de aislados de E. coli ST131 respecto al total de aislados. Respecto al origen de las muestras, obtuvimos que el 80,6% de los aislados de E. coli ST131 eran de origen comunitario y el 17,2% de origen nosocomial. Estos resultados son similares a los del estudio de Blanco y cols., quienes encontraron que el 73% de los aislados de E. coli ST131 eran comunitarios y el 27% nosocomiales (169). Cabe mencionar que ha sido difícil comparar nuestros resultados con otros estudios por la diferencia en cuanto a la definición de comunitario y nosocomial. Gibreel y cols. definieron como aislados nosocomiales los que procedían de pacientes hospitalarios, y los de origen comunitario los de atención primaria y medicina general, hallando un 48% y 52%, respectivamente (216). En el trabajo de Banerjee y cols. los pacientes relacionados con cuidados sanitarios se incluyeron dentro de los nosocomiales, de modo que obtuvieron que el 34% de los aislados ST131 fueron comunitarios y el 66% nosocomiales (218). En cuanto al tipo de muestra, la mayoría de los aislados de E. coli (86,6%) era de origen urinario. De éstos, el 12,3% tenía un aislamiento de E. coli ST131. Nuestro resultado es inferior al obtenido a nivel europeo por Cagnacci, en el que el 23% de los aislados de E. coli causantes de infección del tracto urinario eran ST131 (164). Esta diferencia puede deberse a que en el estudio de Cagnacci se seleccionaron aquellos aislados de E. coli de origen comunitario y resistentes a ciprofloxacino. De hecho, si hubiéramos seleccionado nuestros aislados según los mismos criterios que en el estudio mencionado, habríamos obtenido un porcentaje similar al europeo (24% vs. 23%). Nuestros datos revelan que la mayoría de los aislados del clon ST131 no eran productores de BLEE. Encontramos que la tasa de los aislados ST131 productores de 138 BLEE (7%) fue inferior a la de otros estudios y similar a la de los aislados productores de BLEE no pertenecientes al clon. Johnson y cols., tras analizar una colección de 579 aislados de E. coli ST131, encontraron que el 47% eran productores de BLEE (154). En otro estudio español hallaron una tasa de aislados ST131 productores de BLEE del 10% (169). Por otra parte, nuestra tasa de aislados de E. coli ST131 productores de BLEE fue igual a la de los aislados productores de BLEE no pertenecientes al clon (7%), por lo que el clon ST131 productor de BLEE es el prevalente en nuestra área. La prevalencia de ST131 entre todos los aislados de BLEE es variable según la zona geográfica. En nuestro estudio el clon ST131 suponía el 12,5% de los aislados productores de BLEE, cifra muy inferior a la mayoría obtenida en estudios a nivel mundial, en los que el clon ST131 llega a suponer desde el 20% hasta el 81% de los aislados de E. coli productores de BLEE, tal y como se puede observar en la tabla 37. En España en un estudio multicéntrico del GEIH-BLEE-2006 el clon ST131 representaba el 19% de los aislados de E. coli BLEE (219). Respecto al Norte de América, en varios estudios canadienses ST131 supone desde un 31% hasta un 46% (35,194,195), mientras que en EEUU (Chicago) asciende hasta un 53% (222). En la India, República de África Central y Reino Unido el clon ST131 alberga desde la mitad hasta un 81% de los aislados de E. coli BLEE (35,159,166,212). En Europa y Asia, según varios estudios realizados en Lugo, Francia, Noruega, Taiwan, Camboya y Japón las tasas se encuentran en torno al 20-30% (35,165,167,194,223,192). Por otra parte, cabe señalar que también se han registrado tasas inferiores a la nuestra e incluso aislados ST31 no productores de BLEE en Filipinas, Tailandia, Francia y Madrid (35,193,224,225). En todos los estudios, salvo en los de Blanco y el nuestro, se seleccionan los aislados en función de la producción de BLEE. Esto podría ser una de las razones por las que la prevalencia en la mayoría de los países la prevalencia es mayor que en el nuestro. Otras explicaciones de estas diferencias pueden ser la selección de aislados no solo productores de BLEE, sino además de CTX-M, como en el caso de Reino Unido; el haber visitado una zona de alto riesgo de adquisición de una infección por aislado productor de BLEE, como la India; seleccionar las muestras solo de urocultivos de la comunidad, como Camboya y Francia o bacteriemias, como en Canadá, Países Bajos y Taiwan. Y en lo que respecta a las prevalencias de nuestro país, puede ser que la hallada en Lugo sea superior a la nuestra porque gran parte de los aislados procedían de residencias, el cual Discusión 139 puede ser un reservorio del clon (194); la de Madrid puede que fuera inferior por haberse realizado el estudio 6 años antes que el nuestro. Zona geográfica Año Origen Nº de E. coli BLEE % de ST131 Referencia UK 04-07 Colección laboratorio 103 81 (35) UK 03-04 Muestra clínicas 287 65 (166,212) India Infecciones asociadas a viajes 31 61 (221) Chicago 08 Muestras clínicas comunitarias 30 53 (222) Rep. África Central 04-06 Colección laboratorio 10 50 (35) Canadá 07 Muestra clínicas 209 46 (162) Canadá 04-06 Colección laboratorio 41 41 (35) Países bajos 08-09 Bacteriemias 41 34 (194) Calgary 00-07 Bacteriemias 67 31 (221) Pittsburgh 07-08 Muestra clínicas 70 30 (160) Taiwan 05-10 Bacteriemias 122 29 (223) Camboya 04-05 ITUs comunitarias 30 27 (35) Lugo 06-07 Mayoría ITU 105 22 (194) Lugo 07-08 Mayoría ITU 249 22 (194) Francia 06 ITU comunitaria 48 21 (194) Multinacional 04-06 Viajeros de retorno 84 19 (159) Japón 02-03 Colección laboratorio 142 19 (167) Sevilla 2010 Muestra clínicas 292 12,5 Presente estudio Madrid 04 ITU 91 9 (224) Brasil 08-09 Muestra clínicas 25 8 (226) Filipinas 07 Muestra clínicas 15 7 (225) Tailandia 1999 Colección laboratorio 5 0 (35) Francia 06 Voluntarios sanos 100 0 (193) Tabla 37. Distribución geográfica de aislados de E. coli ST131 productores de BLEE. Originariamente, como ya hemos comentado previamente en otras secciones, los aislados de ST131 se describieron entre aislados de E. coli productores de CTX-M-15. De todos los aislados de E. coli productores de CTX-M-15 procedentes de 8 países y 3 140 continentes, el 88% eran aislados del clon ST131 (152). En la tabla 38 podemos observar los diferentes estudios en los que se detalla la distribución de los aislados ST131 productores de CTX-M-15. En nuestro estudio, obtuvimos una tasa del 70%, similar a la de un estudio belga e inferior a la de un estudio nacional multicéntrico, ambos del año 2006, en los que el 72% y el 86% de los aislados productores de CTX-M-15 eran ST131 (177,227). Por otra parte, en otro estudio multinacional el clon ST131 contaba con menos de la mitad de los aislados productores de CTX-M-15 (67), lo cual puede deberse a que los aislados procedían sólo de muestras de pacientes hospitalizados, mientras que en los otros estudios se incluyeron tanto los comunitarios como los nosocomiales. Zona geográfica Año Origen Nº E. coli CTX-M-15 % ST131 Referencia Europa, Asia y Canadá NE Muestras clínicas y de laboratorio 41 88 (152) España 06 Muestras clínicas 37 86 (227) Sevilla 10 Muestras clínicas 50 70 Presente estudio Bélgica 06-07 Muestras clínicas 43 72 (177) Europa, Canadá y Oriente Medio 00-06 Colección laboratorio 43 42 (67) Tabla 38. Distribución geográfica de aislados de E. coli ST131 productores de CTX-M15. NE: no especificado. Del total de nuestros aislados ST131 productores de BLEE, la enzima más frecuente fue CTX-M-15 (92,1%). Únicamente dos aislados (5,3%) producían CTX-M-32 y uno (2,7%) CTX-M-14. Johnson encontró con más frecuencia aislados de ST131 productores de BLEE (47%) entre los aislados de la colección de referencia. Sin embargo, eran menos los aislados que producían CTX-M-15 (69%) (154). Nuestros resultados son similares a los de Blanco y col, quienes hallaron que el 96% de los aislados ST131 producía CTX-M-15 y el 4% CTX-M-14 (194), y a los de otros estudios de diferentes orígenes. Así, en Canadá durante los años 2000-2010 el 80% de los aislados ST131 producía CTX-M-15 y el 17% CTX-M-14 (228). En Francia y Portugal la prevalencia de CTX-M-15 en aislados ST131 se situaba por encima del 90% (229–231). Mientras que en el caso de Rumanía, la India y la República Central Africana era del 100% (232–234). Discusión 141 Una situación diferente ocurre en otras zonas donde CTX-M-14 se describe con más frecuencia e incluso llega a ser la predominante entre aislados de ST131. De modo que, en Australia y Nueva Zelanda, donde predominan los aislados ST131 productores de CTX-M-15 (60%), también son muy frecuentes los que producen CTX-M-14 (38%) y algunas coproducen ambas enzimas (235). En Japón, Camboya, Hong-Kong y en 11 provincias de 7 regiones de China la enzima más prevalente entre los aislados ST131 es CTX-M-14, contando con 47%, 61%, 73% y 67%, respectivamente (168,236–238). Si comparamos los resultados de los estudios comentados con anterioridad, podemos distinguir que en países de Occidente (EE.UU., Canadá y Europa) se ha expandido el clon ST131 productor de CTX-M-15, mientras que en países de Oriente lo ha hecho el clon productor de otra BLEE diferente a CTX-M-15. Esto puede sugerir que el clon se ha expandido y posteriormente ha adquirido los genes bla mediante transferencia horizontal (167) o bien que se ha producido la adquisición de los genes bla según la zona, lo cual ha contribuido a su diseminación. En nuestro estudio destaca la asociación, tanto en productores como no productores de BLEE, entre ST131 y la resistencia a amoxicilina-clavulánico, aminoglucósidos y ciprofloxacino. Hay una diferencia en cuanto a la resistencia a aminoglucósidos, según si producían o no de BLEE. En el caso de los aislados productores de BLEE, los ST131 son más resistentes a amikacina y tobramicina que los no ST131, mientras que entre los aislados no productores de BLEE hay mayor resistencia a los tres aminoglucósidos testados. Nuestros resultados coinciden con los de un estudio francés (239) y otro canadiense (221) en cuanto a la resistencia de todos los aislados ST131 a ciprofloxacino (tabla 39). Sin embargo, tal y como se puede observar en la tabla 40, hay diferencias con los aislados productores de BLEE, ya que en el caso de los aislados ST131 franceses eran más resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol y piperacilina-tazobactam y los canadienses a gentamicina y piperacilina-tazobactam que los no ST131. La resistencia a AMC puede deberse a la adquisición de OXA-1 o IRT, tal y como describen Oteo y cols. en un estudio multicéntrico en el que analizan una serie de aislados de E.coli resistentes a amoxicilina-clavulánico, resultando el clon ST131 el segundo clon más frecuente entre los aislados productores de OXA-1 y el más frecuente entre los productores de IRT (240). En nuestra área se ha detectado durante los años 2011 y 2012 un aumento de aislados productores de OXA-1 recogidos con sensibilidad disminuida a 142 amoxicilina-clavulánico debido a la diseminación de los clones ST88 y ST131, incluyéndose en este último tanto aislados productores como no productores de BLEE (241). Aunque también la resistencia a AMC también puede deberse a la adquisición de TEM-1 o a la hiperproducción de AmpC. En lo que respecta a la resistencia de los aislados de Lisboa en comparación con los nuestros, cabe mencionar que los portugueses eran más productores de BLEE y más resistentes a amoxicilina-clavulánico, gentamicina, tobramicina, trimetoprimsulfametoxazol y fosfomicina que los nuestros. Tabla 39. Sensibilidad de los aislados ST131 y no ST131 productores de BLEE. Aislados productores de BLEE Referencia Presente estudio Brisse, JCM 2012 Pitout, AAC 2009 % de resistencia % de resistencia % de resistencia Antimicrobiano No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p Amoxicilinaclavulánico 28,6 82,4 <0,001 89 93 Piperacilinatazobactam 6,2 16,7 0,055 44 67 0,015 30 81 0,0002 Gentamicina 21,5 3,3 0,014 38 31 48 86 0,004 Tobramicina 19,9 80 <0,001 63 86 0,09 Amikacina 1,3 28 <0,001 15 34 0,01 A. nalidíxico 94,4 100 0,377 68 96 <0,001 Ciprofloxacino 81,5 97,1 0,024 57 94 <0,001 85 100 0,004 Trimetoprimsulfametoxazol 49,4 64,7 0,094 77 43 <0,001 65 67 1 Fosfomicina 3,3 3,3 1 0 0 Discusión 143 Aislados NO productores de BLEE Presente estudio Brisse, JCM 2012 % de resistencia % de resistencia Antimicrobiano No ST131 ST131 p No ST131 ST131 p Amoxicilina-clavulánico 18 27,6 <0,001 22 33 Piperacilina-tazobactam 4,9 5,5 0,643 10 10 Gentamicina 7,7 17 <0,001 4 20 0,03 Tobramicina 7,9 20,2 <0,001 Amikacina 0,1 1,2 <0,001 1 0 A. nalidíxico 40,9 76,1 <0,001 24 73 <0,001 Ciprofloxacino 32,6 72,8 <0,001 13 67 <0,001 Trimetoprimsulfametoxazol 30,3 33,1 0,165 34 29 Fosfomicina 1,1 1,1 0,996 1 14 Tabla 40. Sensibilidad de los aislados ST131 y no ST131 no productores de BLEE. Además de la resistencia a las cefalosporinas de espectro extendido por la producción de BLEE, la resistencia a FQ es otro rasgo común de los primeros aislados descritos del clon ST131 (67,152). En nuestro estudio encontramos una asociación entre los aislados ST131 tanto productores como no productores de BLEE con la resistencia a FQ, obteniendo que el 97,1% y 72,8% de los aislados, respectivamente, fueron resistentes a FQ. Respecto al total de aislados de E. coli productores de BLEE y resistentes a FQ, nosotros obtuvimos que el 13,4% correspondía al clon ST131, lo cual es similar a lo que sucede en China, según un trabajo correspondiente a los años 1998-2000 (179). Sin embargo, es muy inferior a lo hallado en otros estudios, en los que desde un 30% hasta un 60% de los aislados de E. coli BLEE y resistentes a FQ pertenecían al clon ST131. Como podemos observar en la tabla 41, Cerquetti encontró en Roma en el año 2006 que el 61% de los aislados de bacteriemias e infecciones del tracto urinario con E. coli resistentes a FQ y BLEE eran ST131 (178). En otras zonas de Asia, Canadá y Australia, la prevalencia de ST131 entre aislados BLEE y resistentes a FQ estaba en torno al 25%- 35% (179,221,242,243). Puede ser que la tasa tan elevada de Cerquetti se deba a que la