Estudio de lípidos aislados de microalgas y polifenoles en modelos inflamatorios de piel.
Abstract
La piel es el principal órgano que actúa como defensa frente a agresiones externas, protegiendo al organismo de sustancias tóxicas, daño físico, e invasión por patógenos o radiaciones, suponiendo una pieza indispensable del sistema inmunológico. En este sentido, la perturbación de su estructura o función podría estar causada tanto por factores externos, como sustancias tóxicas o radiación ultravioleta (UV), o por factores internos, como pueden ser la predisposición genética, desórdenes inmunitarios u hormonales, o estrés. Como resultado de estas alteraciones, se puede desencadenar una respuesta inflamatoria, una disminución de la respuesta inmune o un daño oxidativo, entre otros. La exposición crónica de la piel a la luz UV induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como una respuesta inflamatoria, la cual juega un papel importante en el fotoenvejecimiento, en el desarrollo de lesiones pre-cancerosas, como la queratosis actínica, y en el cáncer de piel. Por otro lado, las enfermedades inflamatorias de la piel tienen un alto impacto en la calidad de vida de los pacientes; una de ellas es la psoriasis, enfermedad crónica mediada por el sistema inmune, de afectación predominantemente cutánea, cuya patogénesis no está clara aún. Hoy en día, las estrategias para la protección de la piel se centran en el uso de compuestos naturales para contrarrestar el estrés oxidativo y la inflamación. En los últimos años, las microalgas han emergido como fuente de compuestos bioactivos, incluyendo lípidos, proteínas, polisacáridos y carotenoides. Estos compuestos han atraído el interés de la industria farmacéutica y cosmética en base a sus actividades como antioxidantes, anti-inflamatorios y anti-carcinogénicos. En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de ciertos glicolípidos y el carotenoide fucoxantina, aislados de la especie Isochrysis galbana, así como del polifenol ácido rosmarínico, en diferentes modelos inflamatorios de piel tanto in vitro como in vivo, los cuales están desarrollados en los siguientes párrafos. En primer lugar, hemos evaluado la actividad citotóxica, antioxidante y fotoprotectora de diferentes glicolípidos aislados de la microalga Isochrysis galbana, empleando un modelo in vitro de queratinocitos humanos HaCaT irradiados con UVB. El pre-tratamiento de los queratinocitos con compuestos puros con estructuras de monogalactosil-monoacilgliceroles (MGMGs) y digalactosildiacildigliceroles (DGDGs), así como las fracciones ricas en monogalactosil-diasilgliceroles (MGDGs) o DGDGs redujeron significativamente el daño celular inducido por UVB, mediante la disminución de la liberación de LDH, ROS y la producción de IL-6. Este estudio preliminar nos permitió la selección de los compuestos más activos, que fueron la fracción de glicolípidos MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, para su estudio posterior en modelos in vivo(Capítulo 1). En el primer modelo in vivo, se estudiaron la fracción MGDG y el glicolípido puro MGMG-A, en un modelo de hiperplasia epidérmica inducida TPA en ratones Swiss CD-1. Son numerosas las evidencias que muestran que la exposición de la piel a un activador de la proteína kinasa C, como es el 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), induce una respuesta pleiotrópica en el tejido, dando lugar al desarrollo de lesiones macroscópicas como descamación y eritema, lo cual se asemeja al fenotipo aparente de la psoriasis. En primer lugar, examinamos los efectos anti-inflamatorios de la aplicación tópica de MGDG y MGMG-A, disueltos en acetona (10 μg/μL, 200 μg por zona), comparándolos con la Dex como compuesto de referencia. Los tratamientos se aplicaron en un área delimitada de 1 cm2 en el dorso de los ratones y después de 30 minutos, se aplicó tópicamente el TPA (disuelto en acetona a 2 nmol por zona), en las mismas áreas durante 3 días. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con los glicolípidos disminuyó el edema, el espesor de la epidermis y la producción de las citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17. Sin embargo, es sabido que la aplicación tópica de compuestos requiere una adecuada incorporación de las moléculas bioactivas en una fórmula que ofrezca estabilidad, que permita la permeación y que permanezca el suficiente tiempo en la piel. En este sentido, desarrollamos diferentes estudios de permeación in vitro, ex vivo e in vivo, para comparar el perfil de tres formulaciones diferentes (gel, pomada y crema). Los estudios in vitro y ex vivo se desarrollaron en células de Franz y se completaron con un estudio de permeabilidad in vivo, usando gel, pomada y crema con rodamina, lo que permitió evaluar la estabilidad de las formulaciones y las propiedades de permeación de las mismas a través de las capas de la piel. Los estudios de permeabilidad mostraron que la crema era la formulación con el mejor perfil de permeación. Por tanto, estos resultados nos llevaron a evaluar una crema que contenía la fracción MGDG (MGDG-crema) (0.2 % p/p), en el modelo de hiperplasia en ratón, comenzando esta vez el tratamiento 2 días antes de la primera aplicación de TPA. En concordancia con la actividad anti-inflamatoria demostrada in vitro con esta fracción, la aplicación de la crema disminuyó el edema provocado por el TPA, mejoró los daños histopatológicos y redujo el infiltrado celular. Cabe destacar que estos resultados fueron más significativos con la aplicación de la crema que con la fracción disuelta en acetona. Además, esta formulación inhibió la expresión epidérmica de COX-2 de manera similar, alcanzando niveles similares a la Dex. Por tanto, nuestros datos muestran por primera vez el efecto preventivo de los glicolípidos en patologías inflamatorias de la piel como la psoriasis y sugieren que la fracción formulada en crema podría ser una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de esta patología (Capítulo 2). El siguiente estudio nos condujo a la evaluación del efecto anti-inflamatorio, antioxidante y fotoprotector del carotenoide fucoxantina (FX) aislado de Isochrysis galbana en modelos tanto in vitro como in vivo. En primer lugar, la actividad anti-inflamatoria fue evaluada en macrófagos THP-1 estimulados con LPS y en queratinocitos HaCaT estimulados con TNF-α y la actividad antioxidante en queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (50 mJ/cm2). Nuestros resultados mostraron una disminución de las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-6, así como un efecto protector de la FX, debido a la reducción de la producción intracelular de ROS y LDH. Estos datos nos llevaron a evaluar el posible efecto preventivo de la FX en dos modelos in vivo: un modelo de hiperplasia epidérmica inducida por TPA en ratones Swiss CD-1, y un modelo de eritema agudo inducido por UVB en ratones sin pelo SKH-1, expuestos a una irradiación de 360 mJ/cm2. Con el objeto de evitar los efectos negativos derivados del uso de disolventes como la acetona y de aumentar la permeabilidad de la FX a través de la piel, se formuló una crema que contenía el carotenoide (FX-crema) para su aplicación a los animales (0.2 % p/p). Los resultados del modelo de TPA mostraron que el pre-tratamiento con la FX-crema efectivamente mejoraba la hiperplasia en ratón inducida por TPA, reduciendo significativamente el edema de la piel, el espesor de la epidermis y la actividad de la MPO, así como la expresión epidérmica de los niveles de COX-2. Por otro lado, los datos obtenidos del modelo de exposición a UVB demostraron que la FX-crema reducía el eritema inducido por UVB en ratón, así como el edema y la actividad MPO. Además, la crema con el carotenoide inhibió la expresión de COX-2 en la piel expuesta a UVB, así como aumentó la expresión de la proteína antioxidante HO-1, a través de la regulación de la vía del Nrf2.Los resultados obtenidos en todos los estudios realizados con la FX sugieren que este carotenoide, vehiculizado en una formulación tópica para mejorar su permeación, podría suponer una estrategia novedosa para prevenir las exacerbaciones asociadas a la psoriasis y proteger a la piel de la radiación UV(Capítulo 3). En relación a los estudios con compuestos naturales, las plantas siguen siendo hoy en día uno de los campos más prometedores para el descubrimiento de nuevos compuestos que pueden conducir al desarrollo de fármacos. En este sentido, los polifenoles son uno de los grupos más estudiados; estos compuestos son metabolitos secundarios de las plantas y generalmente, participan en los mecanismos de defensa de éstas contra agresiones externas. Con más de 8.000 estructuras diferentes conocidas, tienen como base común la presencia de uno o más grupos fenólicos. La actividad anti radicales libres de esta familia de compuestos ha sido ampliamente descrita, de hecho son los antioxidantes más potentes que consumimos en nuestra dieta. Sin embargo, la investigación en torno a ciertas propiedades todavía continúa en desarrollo. En este sentido, la actividad antiinflamatoria es una de las más importantes. Por lo tanto, en nuestro siguiente estudio evaluamos el efecto de un compuesto polifenólico, el ácido rosmarínico (RA) en un modelo de psoriasis inducida por Imiquimod (IMQ). El IMQ es un agonista de los receptores Toll-like 7 y 8, cuya aplicación tópica en el dorso de ratones Balb/c durante 6 días, induce una inflamación acompañada de alteraciones típicas de la psoriasis. Debido a que la efectividad del RA aplicado por vía tópica puede ser limitada por su baja liposolubilidad y estabilidad, así como su facilidad para oxidarse o degradarse con la luz, hemos usado nanoliposomas (NL) para encapsular dicho polifenol. El pre-tratamiento tópico con RA en gel y RA encapsulado en NL disueltos en gel (ambos a 0.2 % p/p) 30 minutos antes de la aplicación del IMQ (62.5 mg por zona durante 6 días consecutivos) inhibió el daño macroscópico y el peso del punch obtenido de la piel afectada, sugiriendo la reducción del edema de la piel, la infiltración neutrofílica, la actividad de la MPO y la expresión de citocinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-17. El RA en gel mostró mejores resultados que el RA encapsulado en NL, esto podría ser debido a que la constante de disociación (pka) del RA a pH fisiológico afecta a la liberación de este compuesto desde los NL al medio celular, y consecuentemente, reduce su actividad biológica. En este sentido, al confirmar que la estructura química del RA influye en la actividad final de la formulación, sería necesaria una encapsulación específica para este tipo de compuestos. Contribuyendo con estos resultados al uso de estos sistemas en la industria farmacéutica, puesto que suponen una esperanzadora herramienta como sistemas de liberación de fármacos vía tópica, debido a su efectividad para favorecer la permeación y llevar el fármaco hasta ciertas zonas de la piel (Capítulo 4). Por último, evaluamos un posible sinergismo entre los principales compuestos empleados en esta tesis, FX y RA. Para ello, se ensayaron en un modelo de queratinocitos HaCaT irradiados con UVB (100 mJ/cm2) con el objetivo de elucidar su mecanismo de acción y determinar si una mezcla de los mismos (5 μM de FX + 5 μM de RA) podría mejorar sus actividades biológicas. En este estudio se determinó la viabilidad celular, el ciclo celular, y la inducción de apoptosis, así como se evaluaron mediadores implicados en la activación del inflamasoma. La mezcla de estos compuestos demostró un mejor efecto fotoprotector y antioxidante que los compuestos por separado, disminuyendo la muerte celular, con el consecuente aumento de la viabilidad celular, y reduciendo la apoptosis y los niveles de ROS inducidos por la acción del UVB. Además, la mezcla moduló la respuesta inflamatoria disminuyendo la expresión de los componentes del inflamasoma como son el NLRP3 y ASC, y aumentando la expresión de los niveles de la proteína antioxidante HO-1, mediante la regulación de la vía del Nrf2(Capítulo 5). En conclusión, nuestros estudios in vitro e in vivo han demostrado los efectos beneficiosos de varios productos naturales, entre los que destaca la FX y el RA, en enfermedades de base inflamatoria, asociadas tanto a la exposición UVB como a patologías mediadas por el sistema inmune como la psoriasis. Sus mecanismos de acción podrían estar envueltos en la prevención del estrés oxidativo a través de la activación de la vía Nrf2 y la reducción de la inflamación mediante la regulación del inflamasoma y otras citocinas relacionadas con la vía del NF-κB. Por esta razón, estos compuestos podrían suponer moléculas prometedoras para su posible incorporación en productos para el cuidado de la piel como por ejemplo protectores solares, cremas anti-edad o regeneradoras, o formulaciones tópicas para el tratamiento de patologías inflamatorias como la psoriasis.
Full text
Uni e sidad de Se illa
Facul ad de a macia
Depa amen o de a macología
Es udio de lípidos aislados de
mic oalgas y poli enoles en
modelos in lama o ios de piel
Tesis doc o al, Se illa 2017
Azaha a ma ía od íguez luna
Di igida po :
Cu iculum
cien í ico
Licenciada en Fa macia, es udian e de Doc o ado y miemb o de la
Comisión de Jó enes Fa macólogos de la Sociedad Española de
Fa macología.
Fecha de nacimien o: 12 Ab il 1990
Nacionalidad: Española
Da os de con ac o
Di ección: C/Cas ella 58D, 2D, 41003 Se illa, España.
Telé ono: +34 661372978
e-mail: [email p o ec ed]
Ocupación ac ual/es udios: Desde Oc ub e de 2014, es udian e de
Doc o ado en Fa macología, en la Facul ad de Fa macia (Uni e sidad
de Se illa) desa ollando la Tesis Doc o al i ulada “Es udio de
lípidos aislados de mic oalgas y poli enoles en modelos
in lama o ios de piel” bajo la di ección de la D a. Vi ginia
Mo il a Sánchez, la D a. Elena Tale o Ba ien os y el D . Ja ie
Á ila Román.
- Más e O icial en Especialización P o esional en Fa macia.
Especialidad en Ges ión y Calidad asis encial en la O icina de
Fa macia. Facul ad de Fa macia (US) 2013-2014. No a media: 9,13.
Mención a mejo expedien e cu so 2013-2014.
- Licenciado en Fa macia, (US) 2008-2013. No a media: 7,1
- P o ección y Expe imen ación Animal. Función A, B y C en
Roedo es, Lagomo os, Peces y An ibios 2017.
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L
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LPS
Lipopolisacá ido
M
MAPK
Map kinasas
MCP-1
P o eína quimioa ayen e de monoci os ipo 1
MGDGs
Monogalac osyldiacylglyce ols
MGMGs
Monogalac osil-monoacilglice ol
MMP
Me alop o einasa
MPO
Mielope oxidasa
MTX
Me o exa o
N
NF-κB
Fac o nuclea po enciado de las cadenas lige as
kappa de las células B ac i adas
NL
Nanoliposomas
NMSC
Non-melanoma skin cance
NO
Óxido ní ico
N 2
Fac o nuclea e i oide 2
NRLP3
NOD-LRR-and py in domain-con aining 3
P
PASI
Pso iasis A ea Se e i y Index
PdI
Polidispe si y index
PGA
Physician Global Assessmen
PGs
P os aglandinas
pKa
Cons an e de ionización
PKC
P o eína kinasa C
Poli(I:C)
Poliinosínico-polici idílico
PRRs
Recep o es de econocimien o de pa ones
PUVA
Pso aleno o al y adiación de la zona a ec ada con
luz UVA
Q
QA
Que a osis ac ínica
R
RA
Ácido osma ínico
RMS
Roo mean squa e
RNS
Especies eac i as de ni ógeno
ROS
Especies eac i as de oxígeno
S
SC
S a um co neum
SDC
Sodium deoxychola e
SOD
Supe óxido dismu asa
SQAGs
Sul oquino osil-diacilglice oles
SRB
Sul o hodamine B
STAT
Señal de ac i ación y aducción
T
TFG-β
Fac o de c ecimien o ans o man e be a
Th1
Células T helpe 1
TLR
Recep o es Toll like
TNF-α
Fac o de nec osis umo al α
TPA
12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e
U
UV
Ul a iole a
V
VEGF
Vascula endo helial g ow h ac o
Índice de ablas y
igu as
ix
Figu a 1: Co e ans e sal de piel y ejido subcu áneo
19
Figu a 2: La epide mis, epi elio escamoso es a i icado
21
Figu a 3: Imagen de una lesión en placa, o ma más común de
pso iasis
25
Figu a 4: Cambios his ológicos obse ados en la piel de un a ón
con hipe plasia epidé mica en e a la de un a ón sano.
26
Figu a 5: Esquema esumido de la inmunopa ogénesis de la
pso iasis
28
Figu a 6: Esquema esumen de células y ci ocinas implicadas en
la inmunopa ogénesis de la pso iasis
32
Figu a 7: Esquema de los di e en es a amien os empleados en la
pso iasis según la se e idad del pacien e
34
Figu a 8: E ec os de la adiación sola en la piel según la
longi ud de onda (nm)
37
Figu a 9: Esquema esumen de cómo a ec a la exposición sola a
lo la go del iempo
38
Figu a 10: Esquema de ac i ación del complejo N 2
41
Figu a 11: Esquema de ac i ación del in lamasoma
42
Figu a 12: Esquema de ac i ación del p oceso de apop osis
43
Figu a 13: Ciclo celula y apop osis
44
Figu a 14: Imágenes de di e en es lesiones de Que a osis
ac ínica
45
Figu a 15: P incipales compues os ob enidos de las mic oalgas
48
Figu a 16: Es uc u as de los glicolípido MGDG, DGDG, SQDG.
49
Figu a 17: Fó mula es uc u al plana del β-ca o eno
55
Figu a 18: Es uc u a química de la ucoxan ina
56
Figu a 19: Esquema adap ado de la o mación del RA
59
Figu e 1: E ec o galac olipids 1-13 on TNF-α p oduc ion in
LPS-s imula ed THP-1 mac ophages
85
x
Figu e 2: E ec o glycolipids om mic oalgae on UVB-induced
LDH leakage in human HaCaT ke a inocy es
86
Figu e 3: E ec o glycolipids om mic oalgae on UVB-induced
ROS p oduc ion in human HaCaT ke a inocy es
87
Figu e 4: E ec s o glycolipids on UVB-induced p oduc ion o
IL-6 in human HaCaT ke a inocy es
88
Figu e 1: Topical applica ion o ace one-dissol ed glycolipids
om I. galbana inhibi s skin in lamma ion and hype plasia on
he mu ine 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)-induced
model
111
Figu e 2: E ec o he glycolipid MGMG-A and he ac ion MGDG
om I. galbana on he p oduc ion o cy okines in skin
homogena es in he mu ine 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e
(TPA)-induced hype plasia model
112
Figu e 3: E ec o he ehicle composi ion and physicochemical
p ope ies o he d ug on he pe mea ion cha ac e is ics
114
Figu e 4: Topical p e- ea men wi h c eam con aining he
glycolipid ac ion MGDG om I. galbana dec eases skin
in lamma ion and hype plasia on he mu ine 12-O-
e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)-induced model
116
Figu e 5: Topical p e- ea men wi h c eam con aining he
glycolipid ac ion MGDG om I. galbana a enua es 12-O-
e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)-induced COX-2 exp ession
in mouse skin
117
Figu e 1: Expe imen al se ing o he TPA-induced epide mal
hype plasia model in mice and ea men g oups
139
Figu e 2: Expe imen al se ing o he o UVB-induced acu e
e y hema model in hai less mice and ea men g oups
140
Figu e 3: E ec s o Fucoxan hin (FX) om I. galbana on p o-
in lamma o y cy okines p oduc ion in THP-1 mac ophages and HaCaT
ke a inocy es
143
Figu e 4: Pe mea ion p o iles
146
Figu e 5: Fucoxan hin (FX) amelio a es skin hype plasia and
in lamma ion induced by 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e
(TPA) in mice
148
xi
Figu e 6: P o ec i e e ec o Fucoxan hin (FX) on UVB-induced
damage in HaCaT cells
150
Figu e 7: Fucoxan hin (FX) has pho op o ec i e e ec s in UVB-
induced e y hema model in hai less mice
152
Figu e 8: An i-in lamma o y and an ioxidan e ec s o
Fucoxan hin (FX) in UVB-induced e y hema model in hai less mice
153
Figu e 1: In i o elease p o iles o Rosma inic acid (RA) in
nanoliposomes (RA-NL), Dexame hasone (Dex) in nanoliposomes
(Dex-NL) and ee d ug solu ion (RA solu ion and Dex solu ion)
177
Figu e 2: Rosma inic acid (RA) amelio a es skin in lamma ion on
he mu ine IMQ-induced pso iasis-like model
179
Figu e 1: Selec ion o UVB-dose and e alua ion o cell iabili y
and ROS p oduc ion in UVB-i adia ed HaCaT cell
199
Figu e 2: E ec o RA, F and combina ions in cell cycle and
apop osis s udied by low cy ome y
201
Figu e 3: P e- ea men wi h RA, F and M2 modula es in lammasome
ac i a ion on UVB-i adia ed HaCaT cells
202
Figu e 4: E ec o RA, F and M2 on up- egula ion o N 2 and
HO-1 p o ein exp ession in UVB-exposed ke a inocy es
203
Table 1. Chemical s uc u es o he MGMGs isola ed om he
biomass o he mic oalgae M. pusillum (1-4) and I. galbana (4,
and 11-13)
83
Table 2. Chemical s uc u es o he DGDGs 5-10 isola ed om he
biomass o M. pusillum
84
Table 1. E ec s o glycolipids om I. galbana on IL-6 and IL-8
p oduc ion in TNF-α-s imula ed HaCaT human ke a inocy es
109
Table 1: To al pe cen age pe mea ed ac oss a ificial lipophilic
memb ane o β-Ca o om di e en opical o mula ions, and
lux a e
145
Table 1. Cha ac e iza ion pa ame e s o he di e en ba ches
176
esumen
x
Tí ulo: “Es udio de lípidos aislados de mic oalgas y poli enoles en
modelos in lama o ios de piel"
Au o a: Azaha a M Rod íguez Luna
Resumen:
La piel es el p incipal ó gano que ac úa como de ensa en e a
ag esiones ex e nas, p o egiendo al o ganismo de sus ancias óxicas,
daño ísico, e in asión po pa ógenos o adiaciones, suponiendo una
pieza indispensable del sis ema inmunológico. En es e sen ido, la
pe u bación de su es uc u a o unción pod ía es a causada an o po
ac o es ex e nos, como sus ancias óxicas o adiación ul a iole a
(UV), o po ac o es in e nos, como pueden se la p edisposición
gené ica, desó denes inmuni a ios u ho monales, o es és. Como
esul ado de es as al e aciones, se puede desencadena una espues a
in lama o ia, una disminución de la espues a inmune o un daño
oxida i o, en e o os.
La exposición c ónica de la piel a la luz UV induce la
p oducción de especies eac i as de oxígeno (ROS), así como una
espues a in lama o ia, la cual juega un papel impo an e en el
o oen ejecimien o, en el desa ollo de lesiones p e-cance osas, como
la que a osis ac ínica, y en el cánce de piel. Po o o lado, las
en e medades in lama o ias de la piel ienen un al o impac o en la
calidad de ida de los pacien es; una de ellas es la pso iasis,
en e medad c ónica mediada po el sis ema inmune, de a ec ación
p edominan emen e cu ánea, cuya pa ogénesis no es á cla a aún. Hoy en
día, las es a egias pa a la p o ección de la piel se cen an en el
uso de compues os na u ales pa a con a es a el es és oxida i o y
la in lamación. En los úl imos años, las mic oalgas han eme gido como
uen e de compues os bioac i os, incluyendo lípidos, p o eínas,
polisacá idos y ca o enoides. Es os compues os han a aído el in e és
de la indus ia a macéu ica y cosmé ica en base a sus ac i idades
como an ioxidan es, an i-in lama o ios y an i-ca cinogénicos.
En es e es udio, hemos e aluado la ac i idad biológica de
cie os glicolípidos y el ca o enoide ucoxan ina, aislados de la
especie Isoch ysis galbana, así como del poli enol ácido osma ínico,
en di e en es modelos in lama o ios de piel an o in i o como in
i o, los cuales es án desa ollados en los siguien es pá a os.
En p ime luga , hemos e aluado la ac i idad ci o óxica,
an ioxidan e y o op o ec o a de di e en es glicolípidos aislados de
x i
la mic oalga Isoch ysis galbana, empleando un modelo in i o de
que a inoci os humanos HaCaT i adiados con UVB. El p e- a amien o de
los que a inoci os con compues os pu os con es uc u as de
monogalac osil-monoacilglice oles (MGMGs) y digalac osil-
diacildiglice oles (DGDGs), así como las acciones icas en
monogalac osil-diasilglice oles (MGDGs) o DGDGs eduje on
signi ica i amen e el daño celula inducido po UVB, median e la
disminución de la libe ación de LDH, ROS y la p oducción de IL-6. Es e
es udio p elimina nos pe mi ió la selección de los compues os más
ac i os, que ue on la acción de glicolípidos MGDG y el glicolípido
pu o MGMG-A, pa a su es udio pos e io en modelos in i o(Capí ulo 1).
En el p ime modelo in i o, se es udia on la acción MGDG y el
glicolípido pu o MGMG-A, en un modelo de hipe plasia epidé mica
inducida TPA en a ones Swiss CD-1. Son nume osas las e idencias que
mues an que la exposición de la piel a un ac i ado de la p o eína
kinasa C, como es el 12-O- e adecanoil o bol-13-ace a o (TPA), induce
una espues a pleio ópica en el ejido, dando luga al desa ollo de
lesiones mac oscópicas como descamación y e i ema, lo cual se asemeja
al eno ipo apa en e de la pso iasis. En p ime luga , examinamos los
e ec os an i-in lama o ios de la aplicación ópica de MGDG y MGMG-A,
disuel os en ace ona (10 µg/µL, 200 µg po zona), compa ándolos con la
Dex como compues o de e e encia. Los a amien os se aplica on en un
á ea delimi ada de 1 cm2 en el do so de los a ones y después de 30
minu os, se aplicó ópicamen e el TPA (disuel o en ace ona a 2 nmol
po zona), en las mismas á eas du an e 3 días. Nues os esul ados
mos a on que el a amien o con los glicolípidos disminuyó el edema,
el espeso de la epide mis y la p oducción de las ci ocinas p o-
in lama o ias TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-17.
Sin emba go, es sabido que la aplicación ópica de compues os
equie e una adecuada inco po ación de las moléculas bioac i as en una
ó mula que o ezca es abilidad, que pe mi a la pe meación y que
pe manezca el su icien e iempo en la piel. En es e sen ido,
desa ollamos di e en es es udios de pe meación in i o, ex i o e in
i o, pa a compa a el pe il de es o mulaciones di e en es (gel,
pomada y c ema). Los es udios in i o y ex i o se desa olla on en
células de F anz y se comple a on con un es udio de pe meabilidad in
i o, usando gel, pomada y c ema con odamina, lo que pe mi ió e alua
la es abilidad de las o mulaciones y las p opiedades de pe meación de
las mismas a a és de las capas de la piel. Los es udios de
pe meabilidad mos a on que la c ema e a la o mulación con el mejo
x ii
pe il de pe meación. Po an o, es os esul ados nos lle a on a
e alua una c ema que con enía la acción MGDG (MGDG-c ema) (0.2 %
p/p), en el modelo de hipe plasia en a ón, comenzando es a ez el
a amien o 2 días an es de la p ime a aplicación de TPA. En
conco dancia con la ac i idad an i-in lama o ia demos ada in i o
con es a acción, la aplicación de la c ema disminuyó el edema
p o ocado po el TPA, mejo ó los daños his opa ológicos y edujo el
in il ado celula . Cabe des aca que es os esul ados ue on más
signi ica i os con la aplicación de la c ema que con la acción
disuel a en ace ona. Además, es a o mulación inhibió la exp esión
epidé mica de COX-2 de mane a simila , alcanzando ni eles simila es a
la Dex. Po an o, nues os da os mues an po p ime a ez el e ec o
p e en i o de los glicolípidos en pa ologías in lama o ias de la piel
como la pso iasis y sugie en que la acción o mulada en c ema pod ía
se una in e esan e es a egia e apéu ica pa a el a amien o de es a
pa ología (Capí ulo 2).
El siguien e es udio nos condujo a la e aluación del e ec o
an i-in lama o io, an ioxidan e y o op o ec o del ca o enoide
ucoxan ina (FX) aislado de Isoch ysis galbana en modelos an o in
i o como in i o. En p ime luga , la ac i idad an i-in lama o ia
ue e aluada en mac ó agos THP-1 es imulados con LPS y en
que a inoci os HaCaT es imulados con TNF-α y la ac i idad an ioxidan e
en que a inoci os HaCaT i adiados con UVB (50 mJ/cm2). Nues os
esul ados mos a on una disminución de las ci ocinas p o-
in lama o ias TNF-α e IL-6, así como un e ec o p o ec o de la FX,
debido a la educción de la p oducción in acelula de ROS y LDH.
Es os da os nos lle a on a e alua el posible e ec o p e en i o de la
FX en dos modelos in i o: un modelo de hipe plasia epidé mica
inducida po TPA en a ones Swiss CD-1, y un modelo de e i ema agudo
inducido po UVB en a ones sin pelo SKH-1, expues os a una
i adiación de 360 mJ/cm2. Con el obje o de e i a los e ec os
nega i os de i ados del uso de disol en es como la ace ona y de
aumen a la pe meabilidad de la FX a a és de la piel, se o muló una
c ema que con enía el ca o enoide (FX-c ema) pa a su aplicación a los
animales (0.2 % p/p). Los esul ados del modelo de TPA mos a on que
el p e- a amien o con la FX-c ema e ec i amen e mejo aba la
hipe plasia en a ón inducida po TPA, educiendo signi ica i amen e
el edema de la piel, el espeso de la epide mis y la ac i idad de la
MPO, así como la exp esión epidé mica de los ni eles de COX-2. Po
o o lado, los da os ob enidos del modelo de exposición a UVB
xx i
like ecep o 7 and 8 agonis , which, opically applied o he back o
he Balb/c emale mice, induces skin in lamma ion accompanied by
s uc u al ea u es ypical o pso iasis. Since he e ec i eness o
opical applica ion o RA can be limi ed by i s low liposolubili y,
s abili y, pho o-oxida ion o pho o-deg ada ion, we used nano-
liposomes o encapsula e his polyphenol. Topical ea men wi h RA-
gel and RA-loaded nanoliposomes in gel (0.2 % w/w) 30 min p io o IMQ
applica ion (62.5 mg pe si e o 6 consecu i e days) inhibi ed
mac oscopic damage and he skin punch weigh , sugges ing an inhibi ion
o skin edema, neu ophilic in il a ion, MPO ac i i y and he
exp ession o p o-in lamma o y cy okines as TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-
17. RA-gel showed be e esul s han RA-loaded nanoliposomes in gel.
This could be due o ha he dissocia ion cons an (pKa) o RA a
physiologic pH a ec ed he libe a ion o his compound om
nanoliposome o cell medium and, consequen ly, educed i s biological
ac ion. In s a ing ha he chemis y s uc u e o RA a ec s he
o mula ion ac i i y, would be necessa y a speci ic NL elabo a ion o
his kind o molecules. Con ibu ing wi h hese esul s o use o
hese sys ems in he pha maceu ical indus y, since suppose hope ul
ehicles o opical d ug deli e y sys ems due o hei e ec i eness
o enhancing skin pe mea ion and o deli e ing d ug in skin speci ic
a eas(Chap e 4).
Finally, we e alua ed a possible syne gism be ween he main
compounds assayed in his hesis, FX and RA. Fo ha pu pose, hese
p oduc s we e es ed in an UVB-i adia ed HaCaT human ke a inocy es
model a he dose o 5 µM, s udying hei mechanism o ac ion and
e alua ing i a mix u e o hese compounds (5 µM o FX + 5 µM o RA)
may imp o e he indi idual biological ac i i y. Cell iabili y, cell
cycle a es , apop osis induc ion and in lammasome media o s ha e been
assessed in his s udy. The mix u e has shown a be e pho o-
p o ec i e and an ioxidan e ec han he indi idual compounds, by
educing cell dea h and he consequen inc ease o cell iabili y
diminishing apop osis and ROS p oduc ion induced by UVB exposi ion in
p e- ea ed cells. Fu he mo e, he mix u e modula ed in lamma o y
esponse by diminishing he exp ession o in lammasome componen s as
NLRP3 and ASC, in addi ion o inc ease he exp ession o he
an ioxidan HO-1 p o ein le els h ough N -2 signalling pa hway
(Chap e 5).
In conclusion, ou in i o and in i o s udies ha e
demons a ed he bene icial e ec s o some na u al p oduc s,
xx ii
specially ucoxan hin and osma inic acid in in lamma ion, associa ed
wi h UVB exposu e and pso iasis. Thei mechanisms o ac ion could be
ela ed wi h he p e en ion o oxida i e s ess h ough o ac i a ion
o N 2 pa hways as well as wi h he educ ion o in lamma ion ia
educ ion o in lammasome componen s and o he cy okines in ol ed in
NF-κB pa hway. Fo his eason, hese compounds could be p omising
molecules o hei inco po a ion in many skin ca e p oduc s such as
sun p o ec o s and an i-aging c eams, as well as o he ea men o
in lamma o y skin pa hologies as pso iasis.
S udy o cy o oxic, an ioxidan and p o ec i e
ac i i ies o di e en glycolipids and ca o e-
noids ob ained om Isoch ysis galbana, emplo-
ying an UVB-i adia ed HaCaT human ke a inocy es
in i o model The ac ion o glycolipids MGDG and he pu e
glycolipid MGMG-A, was selec ed o hei e a-
lua ion on TPA-induced skin hype plasia model
in Swiss CD-1 mice
The an i-in lamma o y and pho o-p o ec i e e ec o he ca o enoid ucoxan hin (FX) bo h in i o and
in i o models. Fi s ly, he an i-in lamma o y ac i i y was s udied in LPS-s imula ed THP-1 mac ophages
(50 mJ/cm2)
E alua ion o he p e en i e e ec s o
FX-c eam on UVB-induced acu e e y hema model
in hai less SKH-1 mice (360 mJ/cm2)
E alua ion o he p e en i e e ec s o
FX-c eam on TPA-induced epide mal hype plasia
in Swiss CD-1 mice
The an i-in lamma o y ac i i y o glycolipids
(MGDG and MGMG-A) was s udied in LPS-s imula ed
ke a inocy es
Fu he mo e, we s udied he opical e ec o
RA-loaded liposomes in he mu ine Imiqui-
mod-induced pso iasis-like skin in lamma ion
model
Finally, he main compounds employed in his
hesis as FX and RA we e e alua ed in an
UVB-i adia ed HaCaT human ke a inocy es in
i o model o elucida e hei mechanism o
ac ion and e alua e i a mix u e o hese com-
pounds migh imp o e hei biological ac i i ies
INTRODUCCIÓN
3
BLOQUE A: PIEL, INFLAMACIÓN Y PATOLOGÍAS
1. PIEL
Ana omía
La piel es un ó gano complejo in eg ado po células, ejidos y
elemen os de la ma iz ex acelula que median una impo an e unción
de ba e a con a agen es pa ógenos, ag esiones mecánicas o químicas,
cambios de empe a u a, o adiación ul a iole a (UV). Cabe des aca
su unción egulado a de los luidos co po ales, modulando la pé dida
anscu ánea de agua, el man enimien o del equilib io é mico y la
ansmisión de in o mación ex e na que accede al o ganismo po el
ac o, la p esión, la empe a u a y los ecep o es del dolo . Se a a
del ó gano de mayo amaño, siendo su supe icie media de 2 m2, según
el peso y la al u a del indi iduo. Tiene un espeso medio de 2 mm y
ep esen a el 6 % del peso co po al. Es uc u almen e, la piel se
encuen a di idida en es capas de ejido. Desde el ex e io hacia el
in e io , se encuen an (I) la epide mis, (II) la de mis y (III) la
hipode mis o ejido subcu áneo (Figu a 1). Mien as que la epide mis,
y su capa más ex e na, el es a o có neo, cons i uyen una g an pa e
de la ba e a ísica que p opo ciona la piel, la de mis y la
hipode mis son las esponsables de la in eg idad es uc u al de la
piel como un odo.
1.1.1. Epide mis
Figu a 1: Co e ans e sal de piel y ejido subcu áneo. Imagen adap ada de
(To o a and De ickson, 2013)
4
La epide mis se ca ac e iza po se un epi elio plano
polies a i icado y que a inizado que cub e la o alidad de la
supe icie co po al. Se a a de una es uc u a que se enue a
con inuamen e y que da o igen a es uc u as de i adas denominadas
apéndices (unidades pilosebáceas, uñas y glándulas sudo ípa as). Es la
capa que p esen a mayo núme o de células, eniendo un espeso
a iable, de 0,1 - 2 mm según la zona del cue po. La mayo pa e de
las células en la epide mis son que a inoci os que es án o ganizados
en cua o es a os o capas, que desde el ex e io al in e io
co esponde ían con: (I) es a o có neo (s a um co neum), (II)
g anuloso (s a um g anulosum), (III) espinoso (s a um spinosum) y
(IV) basal (s a um basale). En las zonas en la que la epide mis
p esen a un mayo g oso , cuen a con cinco capas al apa ece el
es a o lúcido (s a um lucidum), el cual se encuen a si uado en e
la capa có nea y la g anula .
La mayo pa e de células que componen la epide mis son
que a inoci os, células capaces de sin e iza que a ina, una p o eína
es uc u al, insoluble en agua y que p esen a g an esis encia en e
a cambios de pH y empe a u a. Los que a inoci os se an di e enciando
p og esi amen e a pa i de células basales p oli e a i as, adhe idas
a la memb ana basal epidé mica, has a que e minan su di e enciación
o mando ya pa e del es a o có neo que a inizado, el cual es la capa
más ex e na de la piel. En e es os que a inoci os, se encuen an
in e calados o os ipos celula es como son los melanoci os (sis ema
pigmen a io), células de Lange hans (sis ema inmune) y células de
Me kel (sis ema ne ioso). O as células como los lin oci os, no
suelen apa ece en la piel sana y, cuando apa ecen, lo hacen de o ma
ansi o ia debido a que ac úan en p esencia de an ígenos
desencadenando la espues a inmune cuando es necesa io.
Es a o basal
Los que a inoci os cons i uyen el 80 % del o al de las células
de la piel. El p oceso de di e enciación de un que a inoci o o
que a inización, cons a de modi icaciones mo ológicas y e en os
me abólicos p og amados gené icamen e, cuyo in es un que a inoci o
mue o e minalmen e di e enciado (co neoci o). En la capa basal es
donde se localizan p incipalmen e las células mi ó icamen e ac i as de
la epide mis, las cuales ocupa án el espacio de las células
e osionadas de la capa có nea.
5
Es a o espinoso
La o ma, es uc u a
y p opiedades molecula es
de las células espinosas
es án elacionadas con su
posición den o de la
epide mis. A medida que se
an di e enciando, se an
desplazando hacia la
epide mis supe io y se
uel en p og esi amen e
más aplanadas,
desa ollando g ánulos
lamina es. Las células
espinosas e ienen las que a inas es ables que se p oducen en la capa
basal, pe o no sin e izan nue o ARN mensaje o (ARNm) que dé luga a
es as p o eínas, excep o en as o nos hipe p oli e a i os. En
pa ologías como la pso iasis, la que a osis ac ínica (QA) o la
epa ación de he idas, se p oduce una disminución del ARNm de las
p o eínas de que a inas es ables, iéndose a o ecida la sín esis de
que a inas p opias de que a inoci os hipe p oli e a i os, lo cual
p o oca una discon inuidad en la di e enciación no mal de las
siguien es capas epidé micas, g anulosa y es a i icada.
Es a o g anuloso
Se denomina así po los g ánulos que a ohialinos basó ilos,
p ecu so es de la que a ina que se acumula en el ci oplasma en o ma
de g ánulos, adqui iendo la mo ología ípica de es a capa y siendo
aquí donde se comienza a o ma la en ol u a de las células
que a inizadas. La e apa inal de la di e enciación de las células
g anulosas incluye la des ucción de las mismas, ans o mándose en
co neoci os di e enciados.
Es a o có neo
La comple a di e enciación celula de las células g anulosas da
luga a capas apiladas de células sin núcleo, que a inizadas y
aplanadas que o man el es a o có neo. Es a capa apo a a la piel la
p o ección mecánica y ac úa como ba e a en e a la pé dida de agua y
a la in asión de sus ancias. El es a o lúcido y el es a o có neo
es án compues os de células mue as, es echamen e empaque adas y
Figu a 2: La epide mis consis e en un
epi elio escamoso es a i icado. Imagen
adap ada de (To o a and De ickson, 2013)
6
odeadas de lípidos. Es as capas p o egen las más in e nas y son
inalmen e eliminadas po descamación con o me nue os que a inoci os
las an eemplazando. En condiciones isiológicas, es a p og esión
iene una du ación de 28 días y a acompañada de cambios
undamen almen e en el con enido celula , que dan luga a las
di e en es capas isibles al mic oscopio (Figu a 2).
Debido a que el ciclo celula ípico de un que a inoci o iene
una du ación ap oximada de 6 días, no odas las células de la capa
basal es án ac i as a la ez. Sin emba go, en de e minadas condiciones
pa ológicas, como la pso iasis (Pe e a e al., 2012) o algunos ipos
de Cánce de Piel No Melanocí ico (CPNM) como puede se el Ca cinoma
Epide moide Cu áneo (CEC), se p oduce una hipe p oli e ación de
que a inoci os no males y a ípicos que ompen la memb ana basal e
in aden la de mis subyacen e o mando islo es o co dones de células
a ípicas, con una endencia a iable a la que a inización (Xiang e
al., 2017).
1.1.2. De mis
La de mis es un sis ema complejo y ascula izado que si e de
sopo e y alimen o a la epide mis. Se encuen a o mada p incipalmen e
po ejido conec i o ib oelás ico, en el que se localizan las edes
ascula es y ne iosas. Mien as que las células de la epide mis son
nume osas e ín imamen e asociadas, las de la de mis es án sepa adas
po un complejo conglome ado de ma e ial ex acelula como el
colágeno, la elas ina y o as ib as ex acelula es que do an de
ue za es uc u al y lexibilidad a la piel. Las células p incipales
de la de mis son los ib oblas os, pe o ambién exis en células del
sis ema inmune, e minaciones ne iosas y asos sanguíneos enca gados
de i iga an o la de mis como la epide mis (Figu a 1).
His ológicamen e, la de mis se di ide en dos capas: la papila
(s a um papilla e) y la e icula (s a um e icula e). Es a
es uc u a es la que p opo ciona a la piel la elas icidad y capacidad
de adap a se a mo imien os y cambios de olumen. Además, la de mis
in e ac úa con la epide mis pa a man ene la unión en e ambas capas,
e in e iene en la epa ación y emodelación de la piel después de
su i he idas.
1.1.3. Hipode mis
El lími e en e la de mis e icula p o unda y la hipode mis es
la ansición de un ejido conjun i o dé mico p edominan emen e
7
ib oso a un ejido subcu áneo undamen almen e adiposo. Aunque
ana ómicamen e son di e en es, es uc u al y uncionalmen e se
encuen an in eg ados median e ne ios, asos y apéndices epidé micos.
Los olículos pilosos en c ecimien o ac i o, se ex ienden hacia la
g asa subcu ánea, encon ándose ambién a es a p o undidad las
glándulas sudo ípa as. La masa p incipal de la hipode mis se encuen a
o mada po adipoci os o ganizados en lóbulos de inidos po abiques
de ejido conjun i o ib oso. El ejido subcu áneo o hipode mis ac úa
como ese o io de ene gía, aislan e é mico y p o ec o mecánico
en e a golpes (Co de o, 1996; Wol , e al., 2009).
2. INFLAMACIÓN
El p oceso in lama o io o in lamación es un concep o an iguo,
acuñado po p ime a ez en el siglo I po Co nelius Celso, que
desc ibe es e p oceso como la conjunción de cua o pun os ca dinales:
en ojecimien o, hinchazón, calo y dolo . Así, el desa ollo de una
en e medad in lama o ia se de inía como un desequilib io de es os
cua o pun os (Majno, 1975)(Majno, G, Jo is I, 2004). Pos e io men e,
se añadió a la de inición la pé dida de unción. Ac ualmen e, el
p oceso in lama o io agudo se conside a una espues a que iene luga
en los ejidos ascula izados pa a de ende al hospedado y man ene
la homeos asis isula , conside ándose un p oceso ac i o y al amen e
egulado que conlle a una esolución p og amada del mismo.
T adicionalmen e, se ha conside ado que el p oceso in lama o io
puede elimina se median e el ca abolismo de los mediado es p o-
in lama o ios. Sin emba go, és a es sólo una ase del p oceso de
esolución de la in lamación, ya que, una ez las células inmunes o
polimo onuclea es (PMNs) han cumplido su misión, deben elimina se de
o ma con olada y e ec i a, debido a que pueden ocasiona daños si
pe manecie an in il adas en el ejido. Pa a la esolución comple a de
la in lamación, es as células in lama o ias deben se de uel as
nue amen e al o en e sanguíneo (p oceso no bien conocido has a el
momen o) o bien se p oduce una mue e local de és as, pa a se
e i adas, median e agoci osis, po los mac ó agos. T as es a
agoci osis, pa e de es os mac ó agos sald ían de la zona in lamada
ía lin á ica y o os mo i ían po apop osis (Se han e al., 2007). Si
es os acon ecimien os anscu en de es a o ma, la in lamación aguda
se esol e á sin causa excesi os daños isula es, impidiendo que la
in lamación pe sis a p o ocando las consecuen es complicaciones, como
una in lamación c ónica o ib osis del ejido.
8
Pueden se di e sos los es ímulos que causen una lesión isula ,
bien de ipo exógeno o endógeno, dando luga al desa ollo de un
p oceso in lama o io, po lo que el ipo y el g ado de espues a
in lama o ia depende án an o de la na u aleza del agen e que la
p o oque, como de la pe sis encia del mismo. En es e sen ido se pueden
desa olla o exace ba di e en es pa ologías in lama o ias, de ipo
inmune, como la pso iasis o las ocasionadas po un agen e ex e no como
es el e i ema cu áneo po exposición al sol, el cual puede degene a
en lesiones p ecance osas y cánce de piel.
Pso iasis
La pso iasis es una en e medad in lama o ia c ónica de la piel,
de ca ác e au oinmune, cuyas mani es aciones clínicas son e i ema,
aumen o del espeso de la piel y descamación cu ánea. Las a ec aciones
cu áneas suelen apa ece en o ma de placas e i ema osas que
ecuen emen e cu san con p u i o e incluso dolo . Aunque puede
a ec a a cualquie egión co po al, las zonas más a ec adas son los
codos y las odillas, además de la zona sac a, el cue o cabelludo o
las uñas (Pe e a e al., 2012) (Figu a 4). Clínicamen e, es a
en e medad se puede clasi ica en lesiones pus ulosas y no pus ulosas.
Exis en a ios ipos de pso iasis, pe o las más comunes se encuen an
den o de las no-pus ulosas, como son la pso iasis en go a, la
a i is pso iásica y la pso iasis ulga is, que es el eno ipo más
común, cons i uyendo el 80-90 % de los pacien es pso iásicos (Sa ac G,
Koca T T, 2016).
La pso iasis es una pa ología c ónica que a ec a al 2-4 % de la
población mundial, p esen ando ca ác e ecu en e, con pe iodos
in e mi en es de exace bación y emisión. Ac ualmen e, su e iología es
desconocida, pe o se conoce su ca ác e mul i ac o ial donde se
combinan ac o es an o gené icos (he edi a ios), como ambien ales
(alcohol, abaco, in ecciones, es és, á macos) que pueden a o ece
su apa ición, así como su desa ollo y exace bación. El p onós ico de
los pacien es con pso iasis no suele a ec a a la salud gene al del
pacien e, es sólo en las mani es aciones más g a es en las que se
equie en a amien os sis émicos. Sin emba go, esul a de g an
impo ancia el impac o en la calidad de ida de los mismos, ya que al
a a se de una en e medad que puede esul a isualmen e impac an e,
en muchos casos puede llega a condiciona la ida socio-p o esional y
emocional del pacien e (Sala e al., 2016).
2.1.1. Feno ipo y ca ac e ís icas his opa ológicas de la pso iasis
15
COX-2, siendo és e ca ac e ís ico en lesiones pso iásicas (Schi me e
al., 2010).
O a ci ocina p o-in lama o ia p esen e de o ma cons i u i a en
la piel sana es la IL-6, cuyos ni eles se encuen an aumen ados an o
en las biopsias como en el plasma de pacien es con pso iasis (Lowes e
al., 2014). Es una de las p ime as ci ocinas de la inmunidad inna a
cuya sín esis aumen a jun o a la IL-1β y el TNF-α y, su impo ancia
adica en su capacidad de inicia la di e enciación de células T a
Th17 y bloquea las unciones de las células T (Kupe sky e al.,
2013). La IL-8 es un miemb o de la amilia de las quimiocinas (CXC)
que es imula la quimio axis y desg anulación de los neu ó ilos,
induce la angiogénesis y eje ce g an in luencia sob e la unción de
los que a inoci os (Pie zak e al., 2008). La IL-8 se sin e iza po
una g an can idad de células implicadas en el p oceso in lama o io,
como los monoci os, las células endo eliales y con un papel
des acado, los que a inoci os (Ozawa e al., 2005). Su p incipal papel
lo lle a a cabo ac i ando a los neu ó ilos, los cuales es án
in oluc ados en la ac i ación de las células T y en la p oli e ación
de los que a inoci os (Li e al., 2003). En pso iasis, los neu ó ilos
se encuen an p incipalmen e en la epide mis y, cuando se ac i an po
di e en es CXC, aumen an los ni eles de ci ocinas p o-in lama o ias
como la IL-17 (Figu a 6) (Mahil e al., 2016). Además, es a
acumulación de neu ó ilos a acompañada de la libe ación de g andes
can idades de IL-8, lo que se elaciona con el desa ollo de
pa ologías in lama o ias c ónicas, ales como la pso iasis (Tuschil e
al., 1992). Se ha obse ado que en modelos animales de in lamación
aguda, an icue pos neu alizan es de la IL-8 educen conside ablemen e
la unción de los neu ó ilos y esuel en la in lamación. Po lo
an o, la neu alización de la ac i idad de la IL-8 ep esen a una
es a egia e apéu ica pa a en e medades in lama o ias c ónicas
(Pie zak e al., 2008; Wu e al., 2017).
16
Figu a 6: Esquema esumen de células y ci ocinas implicadas en la
inmunopa ogénesis de la pso iasis. Ab e ia u as: MHC, complejo mayo de
his ocompa ibilidad; TCR, ecep o de células T; IL, in e leucina; IFN-γ,
in e e ón gamma; TFG-β, ac o de c ecimien o ans o man e be a; TNF, ac o
de nec osis umo al. Adap ado de (Pe e a e al., 2012).
2.1.4. Fa maco e apia
En la ac ualidad, no se dispone de ningún a amien o cu a i o
pa a la pso iasis, po lo an o, el in de los a amien os asignados
pa a es a pa ología es palia los sín omas y disminui la g a edad y
ex ensión de las lesiones. Exis en una g an a iedad de e apias que
incluyen los a amien os ópicos o o o e apia, seguidos de los
a amien os sis émicos y los á macos biológicos en las o mas más
se e as. La elección del a amien o se ealiza u ilizando
he amien as de medida alidadas como el g ado y la ex ensión de las
lesiones (Pso iasis A ea Se e i y Index (PASI)), la alo ación global
po pa e del médico (Physician Global Assessmen (PGA)) y el índice
de calidad de ida de ma ológica (De ma ology Li e Quali y Index
(DLQI)). Debido a la na u aleza c ónica de es os a amien os,
apa ecen incon enien es como el cos e ele ado, las eacciones ad e sas
o las como bilidades que pueden limi a su elección y/o uso de la gos
pe iodos de iempo (Sala e al., 2016). En es e sen ido, el p ime
escalón e apéu ico empleado es el a amien o ópico, que se basa en
el uso de co icoides, que a olí icos, an alinas (di anol),
alqui anes y de i ados de la i amina D (calcipo iol) o de la
i amina A ( e inoides), algunos de los cuales pueden combina se con
17
o o e apia con luz UVA o UVB (Almu awa e al., 2015) (Wa en e al.,
2016).
Ac ualmen e, la p ime a línea de a amien o son los co icoides
(Figu a 7), an o en mono e apia como en a amien o complemen a io en
la e apia sis émica. Tienen p opiedades an i-in lama o ias,
an imi ó icas, apop ó icas, asocons ic o as e inmunomodulado as. Se
clasi ican en 4 clases según su po encia an i-in lama o ia: (I) le e,
(II) mode adamen e po en e, (III) po en e, y (IV) muy po en e, siendo
imp escindible el conocimien o de su clasi icación pa a su
aplicabilidad (U a e al., 2012). Se sabe que los co icoes e oides
ienen una ole abilidad a o able cuando se usan en di e en es angos
e apéu icos, pe o la con inua exposición a los mismos es á asociada a
p oblemas an o cu áneos (a o ia y acla amien o de la piel o
de ma i is) como sis émicos (sup esión del eje hipo álamo-hipo isa io,
o iginando insu iciencia sup a enal), los cuales se elacionan de
o ma di ec a con la po encia del co icoide (Gas aldello e al.,
2017). Po odo ello, y eniendo en cuen a el ca ác e c ónico de los
a amien os, su aplicación conlle a una implicación impo an e po
pa e del pacien e, en é minos de segu idad y/o e icacia (Queille-
Roussel e al., 2015).
En elación a la o o e apia, que consis e en la exposición de
la piel a longi udes de onda de luz UV bajo supe isión médica, la más
empleada es la PUVA. És a esul a de la combinación de un Pso aleno
o al (me oxaleno) y la adiación de la zona a ec ada con luz UVA
(Hemne e al., 2017). Aunque es muy común ecomenda la exposición
sola na u al de o ma con olada, la exposición a luz UVB bajo
supe isión médica y di igida ha sido desa ollada pa a e i a la
exposición de la piel sin lesiones. Es e ipo de e apia pe mi e
aplica mayo es dosis de UVB sob e las lesiones, lo que mejo a
conside ablemen e el acla amien o de las placas pso iásicas (Almu awa
e al., 2015).
18
Figu a 7: Esquema de los di e en es a amien os empleados en la pso iasis
según la se e idad del pacien e. La elección del a amien o se ealiza
u ilizando he amien as de medida alidadas como el g ado y la ex ensión de
las lesiones (Pso iasis A ea Se e i y Index (PASI)), la alo ación global po
pa e del médico (Physician Global Assessmen (PGA)) y el índice de calidad de
ida de ma ológica (De ma ology Li e Quali y Index (DLQI)). Ab e ia u as: UV,
ul a iole a; MTX, Me o exa o.
Si acasan los a amien os an e io men e ci ados, se ecu e a
la e apia po ía sis émica, siendo nume osos los á macos empleados.
Los inmunosup eso es, como el me o exa o o la ciclospo ina A, e an
las p incipales elecciones en las o mas más se e as, sin emba go, se
han ido sus i uyendo debido a su ele ada oxicidad y e icacia
mode ada, que comp ome ía, en g an medida, la ida de los pacien es
más g a es (Visse and an de Heijde, 2009; Delyon e al., 2015; Fink
e al., 2017).
En los úl imos años, hemos sido es igos de una au én ica
e olución en la a maco e apia de la pso iasis espec o al uso de
agen es biológicos, que han pe mi ido el a amien o e ec i o de las
o mas más se e as de la en e medad. En la ac ualidad, disponemos de
sie e agen es biológicos ap obados; Ale acep (An i-CD2), E ane cep ,
In liximab y Adalimumab (An i-TNF-α), Us ekinumab (An i-IL-12/IL-23),
B odalumab e Ixekizumab (An i-IL-17A) (Kazemi e al., 2017). Además,
hay o os á macos que se encuen an en las ases más a anzadas de los
ensayos clínicos como son: Secukinumab (an i-IL-17A), B iakinumab
(an i IL-12/IL-23), Guselkumab o Tild akizumab (An i-IL-23) (Dong and
19
Goldenbe g, 2017) (Hanley and Yiu, 2017). Sin emba go, la mayo ía de
los pacien es no se bene icia án de es os nue os a amien os, al
menos a co o plazo; el ele ado cos e de las e apias biológicas, la
ía de adminis ación pa en e al, y el iesgo de apa ición de
eacciones ad e sas g a es, limi a el uso de es e ipo de agen es en
los casos le es-mode ados, que suponen el 90 % de los pacien es
diagnos icados (Feldman e al., 2016). Po lo que, pese a los g andes
a ances log ados en las e apias sis émicas, los a amien os ópicos
empleados u ina iamen e han pe manecido in a iables du an e los
úl imos 20 años.
2.1.4.1. Nue os ho izon es
La búsqueda de nue as moléculas sencillas, ap as pa a el
a amien o de las o mas menos ag esi as de la en e medad, supone un
á ea de especial in e és den o de la ac ual a maco e apia de la
pso iasis. Du an e el desa ollo de es a esis, nos cen a emos en la
búsqueda de nue os agen es e apéu icos de o igen na u al, con los que
elabo a emos di e en es ó mulas galénicas pa a su aplicación ía
ópica.
En es e sen ido, la apa ición de nue os sis emas de
adminis ación de á macos ab e nue as pue as al a amien o de
en e medades de ma ológicas. En los úl imos años, se ha inc emen ado
el in e és po la u ilización de las esículas lipídicas pa a el
desa ollo de o mulaciones basadas en liposomas y es uc u as
coloidales como sis emas po ado es de á macos ac i os. La u ilidad
undamen al de es os ehículos adica en consegui o mulaciones
e icaces y segu as que mejo en la calidad de ida del pacien e,
basándose en una mejo a en la pene ación a a és de la piel y la
acumulación de á maco en los di e en es es a os. La capacidad
hid a an e de las esículas lipídicas y sus in e acciones con los
lípidos de la piel, son la posible azón de la mejo a en el anspo e
cu áneo de los á macos. El desa ollo de nue os sis emas de
libe ación basados en sis emas lipídicos se p esen a como una
al e na i a capaz de eje ce un con ol sob e el compo amien o
isicoquímico, en gene al, y bio a macéu ico, en pa icula , de los
compues os (Gonzalez-Rod iguez e al., 2007) (González-Rod íguez and
Rabasco, 2011). O a en aja adicional de es os sis emas es iba en su
capacidad pa a encapsula moléculas an o de na u aleza lipó ila como
hid ó ila (Maes elli e al., 2005). Es os sis emas han sido
ampliamen e e aluados como po enciales sis emas po ado es de á macos
20
pa a su uso en e apéu ica, po su capacidad de al e a las
p opiedades a macociné icas y educi la oxicidad de los á macos
que se inco po an en ellos (Maes elli e al., 2006). La aplicación de
o mulaciones de liposomas po ía ópica ha sido p opues a como una
de las más ele an es y con mayo e icacia en el a amien o de
as o nos de ma ológicos. Es as o mas de adminis ación, g acias a
los os olípidos que con ienen como componen es mayo i a ios, así como
a sus ca ac e ís icas es uc u ales, han pe mi ido encapsula
nume osos poli enoles en liposomas, con aplicaciones en el a amien o
del cánce de piel o in ecciones aginales (Jø aholmen e al., 2015).
En es a línea, la adminis ación de á macos a a és de liposomas o
simila es po ía ópica pa a palia los sín omas de la pso iasis, ya
es á siendo in es igada (Zhang e al., 2014; Moghddam e al., 2016;
Kuma e al., 2016; Doppalapudi e al., 2017).
E ec os de la adiación UV en la piel
2.2.1. Radiación ul a iole a
La luz sola es un elemen o i al pa a los se es humanos, pe o a
la ez es uen e de adiaciones que dañan la piel, p oceso conocido
como o odaño. La exposición al sol de o ma excesi a a lo la go del
iempo p edispone, po acción acumula i a, a la apa ición de
a ecciones de ma ológicas de ipo es é icas y de poca g a edad como el
o oen ejecimien o, la hipe pigmen ación o las a ugas, además de da
luga a o as consecuencias más se e as como el cánce de piel.
El espec o sola es á in eg ado p incipalmen e po la adiación
UV, que se di ide en UVC (100-280 nm), UVB (280-315 nm) y UVA (315-
400nm), así como la luz isible (400-770 nm) y los ayos in a ojos
(> 700 nm). De odas ellas, la luz UVC es bloqueada po la capa de
ozono, mien as que la UVB y UVA son las que a a iesan las di e en es
capas de la a mós e a y en an en con ac o con la piel (Figu a 8)
(Rass and Reich a h, 2008).
21
Figu a 8: E ec os de la adiación sola en la piel según la longi ud de onda
(nm). Ab e ia u as: IR, in a ojo; UV, ul a iole a.
Los e ec os noci os de la adiación UV sob e la piel son
ampliamen e conocidos, aunque su mecanismo de acción no lo es an o
(Figu a 9). Los UVA co esponden al 95 % de la adiación UV y la piel
ecibe 1000 eces más UVA que UVB, ya que es án p esen es odo el día.
Es as adiaciones pene an has a la de mis p o unda, p oducen
b onceado de co a du ación, o oen ejecimien o, cánce de piel,
eacciones po o osensibilidad medicamen osa y daño en la e ina
(Ma sumu a and Anan haswamy, 2004). Sin emba go, aunque de la
adiación UVB llega sólo un 10 % a la piel, es más ene gé ica que la
UVA y se concen a a las ho as con más in ensidad sola , en e las 10
y 16 ho as. El UVB pene a desde las capas más supe iciales de la
piel has a la capa basal de la epide mis, donde gene a ROS y de
ni ógeno (RNS) noci as. Es la p incipal esponsable de la quemadu a
sola y el b onceado p olongado; ambién a o ecen el en ejecimien o
cu áneo, la in lamación, la inmunosup esión cu ánea y el cánce de
piel (Duncan e al., 2009).
La adiación UVC es abso bida po la capa de ozono y son muy
pelig osos en cuan o a su acción e i ema ógena y cance ígena. En los
úl imos años, en los que cada ez son más palpables los e ec os del
cambio climá ico, se ha no ado una g an disminución de la capa de
ozono, lo que ha pe mi ido un inc emen o de la in il ación de ayos
UVC hacia la supe icie e es e a ec ando, en e o os aspec os, al
iesgo de su i lesiones cance ígenas (Schuch and Menck, 2010; Lucas
e al., 2015).
22
Es impo an e des aca que los da os más ecien es an o
epidemiológicos, clínicos, como los es udios en modelos animales,
apun an a la adiación UV sola como elemen o cla e induc o de
in lamación. Es a condición, es ablecida de mane a pe manen e, pe o de
bajo ni el, de al mane a que no p o oca mani es aciones clínicas
ala man es, a o ece la apa ición de lesiones como la QA, inc emen a
el en ejecimien o celula y acili a el desa ollo de cánce de piel
(Zhan e al., 2016).
Figu a 9: Esquema esumen de cómo a ec a la exposición sola a lo la go del
iempo. Ab e ia u as: ROS, especies eac i as de oxígeno; CPNM, Cánce de piel
no melanocí ico; CBC, Ca cinoma Basocelula ; CEC, Ca cinoma espinocelula .
2.2.2. Es és oxida i o e in lamación
Es sabido que el es és oxida i o iene una g an implicación en
en e medades c ónicas con base in lama o ia ales como las
en e medades ca dio ascula es (Mahmoud e al., 2017), la diabe es
(Yang e al., 2017), las en e medades de la piel (Caddeo e al.,
2016a) o el cánce (Saha e al., 2017). En e los mecanismos
molecula es que pod ían explica cómo un p oceso in lama o io
pe manen e a ec a a los ejidos, des aca el es és oxida i o man enido
en el iempo. Es a si uación gene a una sob ep oducción de ROS, que se
aduce en un desajus e de la espues a in lama o ia, p o ocando un
daño isula . En el caso de en e medades cu áneas, la exposición a luz
23
UV puede causa un aumen o de ROS, lo que acili a ía el desa ollo de
un p oceso in lama o io en la zona a ec ada.
Las ROS, o ambién llamadas adicales lib es de oxígeno, son una
amilia de moléculas gene adas, ans o madas y consumidas en el
o ganismo como consecuencia de la ida ae obia y se p oducen
p incipalmen e a pa i de las eacciones me abólicas. Las p incipales
ROS que pa icipan en es as eacciones son el anión supe óxido ([O2].-
), el pe óxido de hid ógeno (H2O2), el ácido hipoclo oso (HOCl), el
singule e de oxígeno (1O2), el adical hid oxilo ([OH].), y di e en es
hid ope óxidos (ROOH). La p incipal uen e de O2- es la mi ocond ia o
el e ículo endoplasmá ico, seguidos de o os o gánulos como
pe oxisomas y agosomas, los cuales median eacciones ca abólicas de
oxidación pa a ob ene la ene gía pa a el o ganismo a a és de
eacciones de oxidación- educción ( edox) (Be gendi e al.,
1999)(Chang, 2012).
En condiciones isiológicas exis e un delicado equilib io en e
la p oducción de ROS y su eliminación median e los sis emas de de ensa
an ioxidan es de las p opias células (equilib io edox). Si es e
equilib io es al e ado hacia el aumen o de ROS, se p oduce lo
denominado como es és oxida i o. Es o puede debe se a a ias causas
(Lushchak, 2014):
- Inc emen o en los ni eles endógenos de ROS, o de compues os
exógenos que en an en au o-oxidación acoplada a la p oducción de
ROS.
- Inac i ación de la p oducción de enzimas an ioxidan es y
disminución de an ioxidan es in acelula es de bajo peso molecula
como el ácido ascóbico (Vi amina), oco e ol ( i amina E),
ca o enoides, e c.
En condiciones isiológicas, los ni eles de ROS se encuen an
den o de unos pa áme os es ables. Sin emba go, es os ni eles pueden
aumen a ue emen e, de modo que si los sis emas an ioxidan es son
capaces de elimina el exceso de ROS y ol e a las condiciones
homeos ásicas, se a a ía de una si uación de “es és oxida i o
agudo”. Po el con a io, si el sis ema an ioxidan e no es capaz de
con a es a es os ni eles, el aumen o en la concen ación de ROS
pod ía ende a se más es able en el iempo y modi ica cie os
componen es celula es, po lo que es a ía dis o sionando la
homeos asis, dando luga a un “es és oxida i o c ónico”, si uación
24
que ocu e en las pa ologías como la pso iasis o la que a osis
ac ínica (Figu a 9).
En cuan o a la adiación UV, se sabe que la exposición a la
misma induce la espues a in lama o ia con ac i ación de células del
sis ema inmuni a io con capacidad de gene a ROS, como los neu ó ilos
(Wöl le e al., 2014). Es as ROS son ambién p oducidas po e ec o
di ec o de la adiación, pe o en cualquie caso, desencadenan una
se ie de acon ecimien os especialmen e dañinos pa a la piel,
incluyendo la p oducción de pe óxidos lipídicos que a o ecen la
des ucción de la po ción hid o óbica de la memb ana, y la gene ación
de hid ope óxidos cíclicos al amen e óxicos po su implicación en la
dis unción de la mi ocond ia y la a ec ación de ó ganos como el
hígado.
Ac ualmen e, se abaja en dilucida los mecanismos molecula es
capaces de explica cómo un es ado in lama o io pe manen e a ec a a
los ejidos. Además del daño oxida i o, el componen e in lama o io
supone la ac i ación de a ias ías de señalización in acelula
eguladas po cinasas, como el ac i ado mi ógeno de p o eína quinasa
(MAPK) (Choi e al., 2017), la janus quinasa (JAK), y la señal de
ac i ación y aducción (STAT). Consecuen emen e, se p oduce la
ac i ación de ac o es de ansc ipción como el NF-κB (Bosch e al.,
2015), coo dinándose así la p oducción de nume osos mediado es
in lama o ios, incluyendo ci ocinas y quimiocinas (TNF-α, IL-1, IL-6,
IL-8, IL-10)(Te ui and Tagami, 2000), PGs p oducidas po la ac i idad
enzimá ica coo dinada de la COX y de la p os aglandina sin e asa de
memb ana (mPGES-1)(Tang e al., 2017), así como óxido ní ico (NO),
sin e izado po la enzima iNOS (Wu e al., 2017). Además, se p oduce
la ac i ación de ac o es de ansc ipción, que egulan la exp esión
de genes an ioxidan es, como el ac o nuclea e i oide 2 (N 2),
en e o os.
2.2.3. Vías de señalización
2.2.3.1. Respues a an ioxidan e
Como se ha comen ado an e io men e, el o ganismo dispone de
moléculas y enzimas an ioxidan es cuya sín esis se encuen a egulada
po el ac o N 2, el cual de e mina la señal de la espues a
an ioxidan e (Fu ue e al., 2017).
31
(Caddeo e al., 2016b), la axi olina (Kim e al., 2015), o el ácido
osma ínico (Fe nando e al., 2016), han ecibido especial a ención
po sus e ec os bene iciosos pa a la salud humana, debido a sus
p opiedades an ioxidan es, an i-in lama o ias y an i umo ales
(Chinembi i e al., 2014; Działo e al., 2016; Cos a e al., 2016).
BLOQUE B. MOLECULAS EN ESTUDIO
3. MICROALGAS COMO FUENTE DE MOLÉCULAS BIOACTIVAS
En base a la necesidad de nue as al e na i as e apéu icas pa a
p ocesos in lama o ios, la quimiop e ención con compues os na u ales
es á en auge en es os iempos. La quimiop e ención es un iejo
concep o que consis e en el uso de medicamen os, i aminas, o
alimen os uncionales pa a educi el iesgo de desa olla una
en e medad (Spo n, 2011). En es e sen ido, al e na i as de in e és
su gen sob e la idea de que en cánce la p e ención de la in lamación
se ía de máximo p o echo (Singh e al., 2014). Del mismo modo,
compues os an i-in lama o ios capaces de e asa el
o oen ejecimien o de la piel se ían excelen es es a egias
al e na i as o complemen a ias a la e apéu ica ac ual.
T adicionalmen e, los compues os bioac i os p oceden es de
plan as han sido es udiados ex ensamen e en el desa ollo de
sus ancias con ac i idades e apéu icas (C agg e al., 2014). Sin
emba go, en los úl imos años, la necesidad de nue as moléculas ha
p opo cionado nume osos es udios con compues os p oceden es de
in e eb ados o de mic oo ganismos ma inos. El mundo de las mic oalgas
es á poblado po so p enden es especies que modulan sus capacidades
me abólicas pa a adap a se a un en o no en cons an e cambio. Las
mic oalgas son o ganismos p imigenios o mados po una memb ana
lipídica que p o ege, con una se ie de es uc u as, a unas moléculas
más o menos complejas, y a una maquina ia que les si e pa a
sob e i i y pe pe ua se. Tal y como comen ábamos an e io men e, la
in es igación en la úl ima década, ha lle ado al descub imien o de
nue os e in e esan es compues os de o igen ma ino, acuñándose el
é mino “p oduc os na u ales ma inos”. En es e sen ido, las mic oalgas
son las que cen an g an pa e de la ac i idad de nues o abajo
debido al al o y a iado con enido en moléculas bioac i as, en e las
que se incluyen ácidos g asos poli-insa u ados de cadena la ga
(PUFAs), polisacá idos, glicolípidos, o ca o enoides. Las mic oalgas
32
han demos ado se una uen e al e na i a a sus homólogos e es es
de p oduc os con uso a macológico. Sus singula es ca ac e ís icas las
hacen idóneas pa a ob ene di e en es p oduc os que han demos ado
ene po en e ac i idad biológica (Tale o e al., 2015).
Se ha demos ado que muchas de es as es uc u as molecula es
pueden se po encialmen e usadas como á macos en el a amien o de
en e medades como el cánce , la in lamación c ónica, in ecciones y
desó denes neu ológicos (G anado-Lo encio and He nández-Al a ez, 2016;
Ruiz-To es e al., 2017; Valca cel e al., 2017). En la Figu a 15 se
ecogen los p incipales componen es de las mic oalgas, los cuales
des acan po su ac i idad an ioxidan e y algunos en su mayo ía an -
in lama o ia y an icance ígena (Tale o e al., 2015).
Figu a 15: P incipales compues os ob enidos de las mic oalgas.
En la p esen e Tesis Doc o al se han es udiado a ios compues os
que se encuen an den o del g upo de los glicolípidos, así como se ha
p o undizado en la ac i idad biológica de un ca o enoide aislado de
mic oalgas como es la ucoxan ina.
Glicolípidos
Resul an de la unión de un lípido y un hid a o de ca bono, y se
ca ac e izan po o ma pa e de las memb anas ilacoidales de los
o gánulos o osin é icos de plan as, algas euca io as y cianobac e ias
(Nakamu a and Li-Beisson, 2016).
3.1.1. Es uc u a
33
Los glice olglucolípidos es án o mados po un azúca y un
glicé ido, no malmen e PUFAs ω-3, unidos median e enlace glucosídico,
siendo los p incipales los galac olípidos y sul olípidos (Dominguez,
2013). Den o de los galac olípidos, en los que el hid a o de ca bono
es la galac osa unida al glicé ido po enlace ipo-β, se di e encian
los monogalac osil-diacilglice oles (MGDGs) y digalac osil-
diacilglice oles (DGDGs). Los sul olípidos son simila es, pe o
p esen an un g upo uncional de azu e en el hid a o de ca bono, se
unen al glicé ido po enlace ipo-α y se nomb an como sul oquino osil-
diacilglice oles (SQAGs)(Figu a 16) (Colombo e al., 2013).
Figu a 16: Es uc u as de los glicolípido MGDG, DGDG, SQDG. Ab e ia u as:
MGDG, monogalac osil-diacilglice oles; DGDG, digalac osil-diacilglice oles;
SQAG, sul oquino osil-diacilglice oles (Plougue mé e al., 2014).
3.1.2. Ac i idad biológica
Debido a su al o po cen aje lipídico, la p incipal aplicación de
las mic oalgas es la ob ención de bio uel, es ableciéndose como una
uen e con al o po encial pa a supone una al e na i a a las uen es
ac uales (Yamane e al., 2013; Paniagua-Michel e al., 2014; Na a o
López e al., 2016). Sin emba go, en los úl imos años, han supues o
una e olución inno ado a como uen e de ing edien es uncionales en
alimen ación, debido a su al o con enido en lípidos, p o eínas e
hid a os de ca bono. Debido a su al a asa de gene ación y
eque imien os nu icionales simples, las mic oalgas pueden se
cul i adas a g an escala, bien en condiciones na u ales o a i iciales
median e el uso de o o eac o es, suponiendo en los úl imos años,
mic oo ganismos de g an in e és pa a la explo ación bio ecnológica en
las indus ias química, alimen a ia y a macéu ica.
En elación a la ac i idad biológica que desempeñan, los
glicolípidos han des acado p incipalmen e po su unción como
an i umo ales y an i-in lama o ios. Pa a los p ime os es udios con
34
glicolípidos de mic oalgas se u ilizó Gymnodinium mikimo oi, mic oalga
pe enecien e al géne o de las Dino lageladas, especie que des acó po
su con enido en MGDG y DGDG, y po su ac i idad hemolí ica, la cual
ue asociada con la ac i idad ci o óxica que se p oducía en cie as
especies de peces al inge i dicha mic oalga (Pa ish e al., 1998).
Sin emba go, es os compues os se dis inguen po su ac i idad
an icance ígena, la cual ha sido ampliamen e demos ada en es os años.
En es e sen ido, de e minados glicolípidos con es uc u a
monogalac osil-monoacilglice ol (MGMG), MGDG, DGDG y SQDG han
des acado po su capacidad de inhibi a la ADN-polime asa y la
opoisome asa II, po lo cual se les ha a ibuido el papel de
inmunosup eso es y agen es an i umo ales (Ma sumo o e al., 2000;
Maeda e al., 2005). Nume osos es udios han demos ado su e ec o an i-
umo al en di e en es líneas celula es, des acando su selec i idad po
células umo ales, sin a ec a a las células sanas, sugi iendo que
es e ipo de es uc u as molecula es pod ían ene g an po encial como
agen es an i- umo ales (Ma sui e al., 2009). Es udios ealizados en
di e en es líneas umo ales, incluyendo ejidos gás icos (Mu akami e
al., 2003; Mizushina e al., 2003; Ku iyama e al., 2005), melanoma
(Maeda e al., 2005), colon (Hossain e al., 2005) y cé ix (Maeda e
al., 2007a)(Maeda e al., 2007b), si ie on como p eceden e pa a
ealiza ensayos con animales a los que se les adminis a on
p epa ados con MGDG po ía o al pa a es udia la p og esión de
umo es en colon. Se obse ó el papel an i umo al, debido a la
inhibición de la angiogénesis y a la acción an i-p oli e a i a de
células umo ales po un aumen o de la apop osis (Maeda e al., 2008;
Maeda e al., 2013).
Los glicolípidos de mic oalgas comienzan a ene un papel
impo an e pa a su aplicación en pa ologías in lama o ias g acias a
los es udios de Bansko a e al. 2013b, en los que demos a on su
capacidad de in e e i en los mecanismos de acción del óxido ní ico
(NO). En es e sen ido, ex ac os de Te aselmis chui y Palma ia
palma a mos a on un e ec o inhibi o io de la p oducción del NO
inducida po LPS en mac ó agos RAW254.7, así como una disminución de
la ac i idad de la enzima iNOS, en el caso de P. palma a (A jun H.
Bansko a e al., 2013; Bansko a e al., 2014).
3.1.3. Es udios con glicolípidos en piel
Los e ec os de los glicolípidos aislados de mic oalgas en e a
in lamación y cánce de piel, así como sus mecanismos de acción, han
35
sido ampliamen e es udiados, empleando an o modelos in i o como
expe imen os con animales. En es e sen ido, Colombo e al. 2000
in es iga on a ios glicoglice olípidos sin é icos con el in de
alo a su ac i idad en e a la incidencia de umo es de piel. Pa a
ello, u iliza on un modelo en el que el umo se inició con
dime ilbenz[a]an aceno (DMBA) y se con inuó con TPA du an e 20
semanas, obse ándose p og esi amen e el aumen o en la incidencia de
papilomas. El a amien o ópico con es e ipo de compues os, edujo
an o la incidencia (núme o de a ones que exp esa on umo es), así
como la mul iplicidad (núme o de umo es po animal), en compa ación
con el g upo con ol sin a amien o. Se ía más adelan e, cuando
e alua ían el mecanismo de acción de dichos compues os con
expe imen os en ib oblas os es imulados con el agen e p omo o de
umo es TPA, con i mando la disminución de la aslocación de la
p o eína kinasa C (PKC) (Colombo e al., 2011), p o eína elacionada
con p ocesos de c ecimien o celula e implicada en la señalización de
mecanismos inculados a la ca cinogénesis (Fos e e al., 2012).
Pos e io men e, es os au o es a anza on en su in es igación
sin e izando nue os glicolípidos con el in de busca es uc u as que
p esen asen una mejo espues a en los modelos umo ales de piel
es udiados (Colombo e al., 2013).
En elación con la ac i idad an i-in lama o ia, se han
desa ollado modelos de in lamación en o eja y pa a de a ón, en los
que di e en es compues os MGDG y DGDG ue on aplicados po ía ópica
disuel os en e anol. La ac i idad an i-in lama o ia de un compues o
MGDG aislado de un alga azul, Pho midium sp ETS-05, des acó en
compa ación con los agen es usados de e e encia, be ame asona, en el
caso del modelo de in lamación en o eja, e indome acina, empleado en
el modelo en pa a de a ón, plan eando el posible mecanismo de acción
del mismo po su ac uación sob e la COX-2 e iNOS (B uno e al., 2005).
Con espec o a la in lamación inducida po UVB, exis en pocos abajos
que hayan e aluado la ac i idad de es os compues os en es e ipo de
modelos. Se ha con i mado la ac i idad an i-in lama o ia de una
acción aislada del alga pa da Sa gassum ul ellum, po su sup esión
de enzimas como la COX-2, iNOS o PGE2, cuya sín esis es inducida as
la exposición a UVB, an o en modelos in i o con que a inoci os
humanos inmo aizados HaCaT como en modelos con animales empleando
a ones Balb/c (Lee e al., 2013).
Ca o enoides
36
Los ca o enoides son pigmen os na u ales biosin e izados po
odos los o ganismos o osin é icos y algunos hongos y bac e ias no
o osin é icas. Es os pigmen os se encuen an ampliamen e epa idos
en e los se es i os, es imándose una p oducción anual de más de
100,000.000 oneladas, des acando la ucoxan ina, p oceden e de
di e sas especies de mic oalgas, seguida de los es ca o enoides
p esen es en las hojas e des como son la lu eína, iolaxan ina y
neoxan ina. El epa o de los ca o enoides en las plan as no p esen a
un pa ón único; así, en e du as se concen an en mayo p opo ción
lu eína, β-ca o eno, iolaxan ina y neoxan ina, mien as que en u os
encon amos en mayo medida xan o ilas, aunque hay excepciones como el
oma e en el que el licopeno es el ca o enoide mayo i a io (Meléndez-
Ma ínez e al., 2004). Respec o al eino animal, son incapaces de
sin e iza ca o enoides, po lo que deben inclui los en su die a. En
el caso de los animales, es os ca o enoides son los esponsables del
colo ca ac e ís ico de cie as especies (como es el caso del salmón,
cang ejo o gamba). Sin emba go, los humanos los inco po amos a nues a
die a y son ú iles, en nues o o ganismo, po su unción como
p ecu so es de compues os esenciales, como la i amina A. Los
ca o enoides que encon amos en mayo p opo ción en nues o o ganismo
son el β-ca o eno y α-ca o eno, licopeno, lu eína, zeaxan ina y α- y
β-c ip oxan ina, los cuales, as se inge idos, son anspo ados
has a la piel y acumulados en las capas de la epide mis. La can idad
de los pigmen os en el o ganismo a ia á en unción del apo e
die é ico de cada indi iduo, así como de la biodisponibilidad de los
mismos en los alimen os (Fe nández-Ga cía, 2014). En e las nume osas
uen es de ca o enoides, las mic oalgas son conside adas uno de los
p incipales ese o ios. Po es a azón, las mic oalgas no sólo se
emplean pa a aisla compues os pu os, sino que se posicionan como un
po encial ing edien e pa a su inco po ación en alimen os uncionales
debido a sus múl iples ac i idades biológicas desc i as (Ma os e al.,
2017).
3.2.1. Es uc u a
Los ca o enoides son compues os con es uc u a isop enoide, que
con ienen una se ie de dobles enlaces conjugados, lo que con o ma el
g upo c omó o o. La p esencia de es e g upo, además de se el
esponsable de los colo es ama illos, na anjas o ojos, les
p opo ciona la capacidad de cap a la ene gía luminosa, en el caso de
o ganismos o osin é icos, pa a ans e i la a las clo o ilas de los
sis emas o osin é icos donde se ans o ma, du an e la o osín esis,
37
en ene gía química (Meléndez-Ma ínez e al., 2007). Es os compues os
se pueden clasi ica en dos subg upos a endiendo a su composición
química: los ca o enos y las xan o ilas.
Los ca o enos son hid oca bu os lineales o cíclicos en uno o
ambos lados de la cadena. Los más impo an es son α- y β-ca o eno y
licopeno, des acando po su papel en la sín esis de i amina A,
esencial pa a de e minadas unciones biológicas. Respec o a las
xan o ilas, son de i ados oxigenados, y des acan la as axan ina,
lu eína o ucoxan ina, cuya aplicabilidad es undamen almen e como
an ioxidan es y colo an es.
3.2.2. Ac i idad biológica
Nume osas e idencias indican los e ec os bene iciosos de los
ca o enoides pa a la salud humana. Si bien se conocen po su papel
an ioxidan e y an i-in lama o io, sus acciones se elacionan con su
capacidad pa a modula la exp esión de di e en es genes. Los e ec os
de algunos ca o enoides se elacionan con su ac i idad p o i amina A
(β-ca o eno y β-c ip oxan ina); sin emba go, o os ca o enoides, que
no p esen an es a ac i idad, ambién p esen an cla os e ec os
bene iciosos sob e la salud. Son nume osas las p opiedades biológicas
que se les han a ibuido a es os compues os debido al e ec o que
eje cen en pa ologías c ónicas como la a e oescle osis (Howa d and
Thu nham, 2017), as o nos me abólicos (dislipemias) (Deng e al.,
2017), en e medades ca dio ascula es (Chung e al., 2017), diabe es
melli us (Roohbakhsh e al., 2017), pa ologías neu odegene a i as (Kim
e al., 2017), y pa ologías ocula es como la degene ación macula
asociada a la edad (Be ns ein e al., 2016). Además, p esen an una
impo an e ac i idad an i- umo al, siendo nume osos los es udios que
la a alan en di e en es líneas celula es, ecien emen e e isados en
Hoshya and Mollaei 2017.
3.2.3. Es udios con ca o enoides en piel
Los ca o enoides siemp e han des acado po su papel an i-
oxidan e debido a su es uc u a, lo cual se ha elacionado con el
papel o op o ec o en e al daño sola (S ahl and Sies, 2012b).
Nume osos es udios, an o in i o como in i o, a ibuyen a los
ca o enoides un papel o op o ec o , plan eando di e en es mecanismos
de acción. Yoshihisa e al. 2014, obse a on que la as axan ina
disminuyó la exp esión de COX-2 e iNOS, los ni eles de ci ocinas p o-
in lama o ias IL-1β y TNF-α, y cie os ma cado es apop ó icos, en
38
que a inoci os HaCaT i adiados con UVB. O os au o es u iliza on
que a inoci os humanos p ima ios i adiados y obse a on que la
as axan ina a enuaba la p oducción de ansglu aminasa, un ac o que
egula la que a inización de la piel, in e i iendo en di e en es ías
que con luyen en la ac i ación de NF-κB (Te azawa e al., 2015). De
mane a simila , la lu eína, en células HaCaT i adiadas con luz UV,
edujo la ac i idad de la me alop o einasa MMP-9 y los ni eles de TNF-
α, con i mándose así la ac i idad an i-in lama o ia y sugi iéndola
como un po en e emedio pa a pa ologías in lama o ias de la piel (Oh
e al., 2013).
Po o o lado, la lu eína y la zeaxan ina, inco po adas a la
die a de a ones SKH-1 sin pelo y somen idos a i adiación UVB,
mos a on un descenso signi ica i o en la espues a cu ánea edema osa,
en e o os pa áme os, demos ando su capacidad de gene a una
espues a an i-in lama o ia y an ip oli e a i a an e la exposición a
es a adiación (González e al., 2003). Más ecien emen e, modelos in
i o con as axan ina, han pues o de mani ies o su papel an i-
in lama o io, educiendo la sín esis de ci ocinas p o-in lama o ias
ca ac e ís icas de un modelo de de ma i is en a ón (Yoshihisa e al.,
2016). La as axan ina ambién des aca po su papel o op o ec o ,
a enuando a ios pa áme os asociados al o odaño como son la pé dida
de agua ansepide mal o la apa ición de a ugas, en un modelo de
a ones SKH-1 i adiados con UVA, a los que se adminis aba en la
die a, as axan ina ob enida de la mic oalga Haema ococcus plu ialis
(Koma su e al., 2017). Siguiendo es a línea, Coope s one e al. 2017,
e alua on el e ec o p o ec o de una die a con oma e en e a o a
lib e del mismo, en un modelo de umo es de piel inducidos po UVB.
Los esul ados mos a on que los animales que consumían oma e, con
al o con enido en licopeno seguido de i oeno, p esen aban meno
núme o de umo es en compa ación con los que enían una die a exen a
de oma e.
Po es as azones, los ca o enoides, p incipalmen e licopeno, β-
ca o eno y lu eína son conside ados compues os de in e és po su
aplicabilidad en la indus ia cosmé ica, de modo que son inco po ados
en o mulaciones o op o ec o as debido a su demos ada ac i idad
biológica (Co inaldesi e al., 2017).
β- ca o eno
El β-ca o eno es el ca o enoide más conocido y consumido po los
humanos ya que se encuen a en nume osas u as y e du as. En
39
elación a las uen es ma inas, se halla p incipalmen e en especies de
mic oalgas pe enecien es a los géne os Dunaliella y Haema ococcus. El
β-ca o eno se con ie e en el p incipal p ecu so de la i amina A, ya
que su es uc u a simé ica (Figu a 17) es capaz de di idi se en dos
moléculas de ans- e inol, con i iéndose así en una impo an e
uen e de es a i amina A (G une e al., 2010).
Figu a 17: Fó mula es uc u al plana del β-ca o eno (Meléndez-Ma ínez e al.,
2004).
Algunos de sus e ec os an ioxidan es y an icance ígenos se
asocian a es a ans o mación en e inol, molécula que in e iene y
con ola nume osos p ocesos como emb iogénesis, c ecimien o,
p oli e ación celula , apop osis, isión ocula , o mación de huesos,
me abolismo y p ocesos inmuni a ios (Chels owska e al., 2016; Mo eb
e al., 2017; Milani e al., 2017). Los p ime os es udios in i o
analiza on su po encial an ioxidan e, mos ando que educía la
inac i ación inducida po UV de enzimas an ioxidan es como la ca alasa
y la SOD. Es e pigmen o, en e o as de sus unciones, ha demos ado
p e eni la exp esión de HO-1 en ib oblas os i adiados con UVA,
e i ándose así mecanismos que desencadenan la espues a oxidan e
(T ekli e al., 2003). En es a línea, es udios en ib oblas os p e-
a ados con un ex ac o ico en β-ca o eno, y pos e io men e
es esados con H2O2, mos a on un inc emen o en la iabilidad celula ,
así como una signi ica i a educción de la can idad de ROS, la
pe oxidación lipídica y el daño en el ADN, lo cual se acompañó de una
mejo a en la uncionalidad de la mi ocond ia, aumen ando la capacidad
egene a i a de las células as la exposición al es ímulo p o-
oxidan e (Giampie i e al., 2014).
La ac i idad an i-in lama o ia y an ioxidan e del β-ca o eno
ambién se ha pues o de mani ies o en modelos in i o. En es e
sen ido, los e ec os de es e pigmen o han sido e aluados en modelos de
in lamación en o eja, mos ando una educción del edema, así como de
la ac i idad de la enzima MPO (Ho á h e al., 2015b). La capacidad
p o ec o a de es e compues o ambién se demos ó en un modelo de
in lamación en piel de a ón inducida po ozono, educiendo mediado es
p o-in lama o ios ales como TNF-α, COX-2, e iNOS, así como ma cado es
40
de es és oxida i o como HO-1 (Valacchi e al. 2009). Además, se han
lle ado a cabo es udios en humanos que e lejan que la suplemen ación
con es e ca o enoide p e iene el edema inducido po UVB, debido al
e ec o que eje ce sob e la pe oxidación lipídica (Lee e al., 2000).
En es a línea, un es udio en muje es de más de 50 años demos ó que la
inges a dia ia de β-ca o eno mejo ó la p esencia de a ugas,
elas icidad y daño en el ADN inducido po la adiación UVB, lo que
sugie e que es e compues o p e iene y epa a las al e aciones
asociadas al o odaño (Cho e al., 2010). En es udios elacionados con
CPNM, se ha desc i o que pacien es con ni eles educidos de es e
pigmen o en sue o, debido a que su inges a die é ica es meno ,
p esen an una mayo incidencia de desa olla umo es de ipo no
melanoma (Kune e al., 1992). En es e sen ido, se de e minó que la
aplicación de es e compues o po ía ópica e i ó la disminución de
los ni eles o ales de ca o enoides en piel as la exposición a
adiación in a oja, eje ciendo un e ec o p o ec o en olun a ios
sanos i adiados, en compa ación con los suje os a ados solo con el
ehículo (Da in e al., 2011).
Fucoxan ina
La ucoxan ina es uno de los ca o enoides más abundan es,
cons i uyendo más del 10 % de la p oducción o al de es os pigmen os
en la na u aleza. Se ca ac e iza po su colo na anja, se encuen a
p incipalmen e en algas pa das, mac o y mic oalgas y dia omeas, y
pe enece al g upo de las xan o ilas (Chuyen and Eun, 2017). Respec o
a su es uc u a, incluye un enlace aleno, inusual en ca o enoides, y
g upos uncionales oxigenados como epóxido, hid oxilo, ca bonilo y
ca boxilo (Figu a 18), esponsables de su ac i idad an ioxidan e (Peng
e al., 2011).
Figu a 18: Es uc u a química de la ucoxan ina (Zhang e al., 2015).
Debido a su ca ác e an ioxidan e, se le han a ibuido
ac i idades elacionadas con el secues o de adicales lib es ( adical
sca enging) (Sachind a e al., 2007), e ec os an i-in lama o ios (Kim
e al., 2010), an i-obesidad (Beppu e al., 2013), p o ec o en
47
son su baja liposolubilidad, al a bio ans o mación (Baba e al.,
2004), o educida es abilidad po su ápida oxidación, ocasionada po
la luz o el calo , di icul ando, po an o, su aplicación (Nunes e
al., 2015). En es e sen ido, cada ez son más los au o es que plan ean
al e na i as pa a ehiculiza es os compues os con el obje i o de
p o ege su es uc u a y/o aumen a su pe meabilidad a a és de la
piel (S elmakienė e al., 2015)(Ezza e al., 2016).
OBJETIVOS
51
En base a la necesidad de encon a nue as al e na i as
e apéu icas en el a amien o de la pso iasis, la que a osis ac ínica
o el cánce de piel, la quimiop e ención con compues os na u ales es á
omando un impo an e papel en los úl imos años. Así, compues os an i-
in lama o ios capaces de educi las mani es aciones clínicas de la
pso iasis o de impedi el desa ollo ecuen e de ecidi as son
excelen es al e na i as complemen a ias a la e apéu ica ac ual. Del
mismo modo, la búsqueda de es a egias encaminadas a e asa el
o oen ejecimien o de la piel pa a p e eni el desa ollo de lesiones
p e-cance osas p esen a un g an in e és en la ac ualidad. En los
úl imos años, las mic oalgas han eme gido como uen e de compues os
bioac i os, incluyendo lípidos, p o eínas, polisacá idos y
ca o enoides. Es os compues os han a aído el in e és de la indus ia
a macéu ica y cosmé ica en base a sus ac i idades como an ioxidan es,
an i-in lama o ios y an i-ca cinogénicos.
Po odo ello, el obje i o gene al de es a Tesis Doc o al es
alo a la po encial ac i idad biológica (an ioxidan e, an i-
in lama o ia y o op o ec o a) de compues os lipídicos aislados de las
mic oalgas Isoch ysis galbana y Mic ac inium pusillum (glicolípidos y
ca o enoides p incipalmen e) y del poli enol ácido osma ínico (RA),
así como e alua su uso pa a el a amien o de di e sas pa ologías de
la piel con base in lama o ia, en di e sos modelos expe imen ales.
Los obje i os especí icos plan eados pa a es a Tesis Doc o al ue on
los siguien es:
1. E alua la ac i idad an i-in lama o ia, an i-oxidan e y o o-
p o ec o a de una se ie de glicolípidos aislados de las
mic oalgas I. galbana y M. pusillum, en un modelo in i o de
que a inoci os humanos HaCaT i adiados con UVB.
2. Desa olla , en colabo ación con el Depa amen o de Fa macia y
Tecnología Fa macéu ica de la Facul ad de Fa macia de la US,
ó mulas a macéu icas óp imas pa a la aplicación ópica de una
acción de glicolípidos (MGDG), ucoxan ina (FX) y ácido
osma ínico (RA).
3. Es udia el e ec o p e en i o de un glicolípido pu o (MGMG-A),
así como de una acción en iquecida en glicolípidos (MGDG) de
I. galbana, an o disuel a en ace ona como o mulada en c ema,
en un modelo expe imen al de hipe plasia epidé mica inducida po
TPA en a ones.
52
4. E alua las p opiedades a macológicas de la FX, aislada de I.
galbana, inco po ada a una o mulación en c ema, en el modelo de
hipe plasia epidé mica inducida con TPA en a ón, así como en un
modelo de e i ema cu áneo inducido po una exposición aguda a
adiación UVB en a ón.
5. Es udia los e ec os an i-in lama o ios del RA en un modelo
expe imen al de pso iasis inducida po imiquimod en a ón,
empleando una o mulación basada en nanoliposomas.
6. E alua los posibles mecanismos de acción an i-in lama o ia y
an i-oxidan e de la FX y del RA, así como una posible sine gia
en e ambos, en que a inoci os humanos HaCaT i adiados con luz
UVB.
OBJECTIVES
55
Gi en he necessi y o ind new he apeu ics al e na i es o
pso iasis ea men , ac inic ke a osis o skin cance , he
chemop e en ion wi h na u al p oduc s is playing an impo an ole in
las yea s. Thus, an i-in lamma o y compounds ha educe clinical
mani es a ions o pso iasis o p e en he ecu ences a e excellen
al e na i es o complemen he cu en ea men s. Mo eo e , he use
o he apeu ic s a egies o delaying he pho oaging and p e en ing
he de elopmen o p e-cance ous lesions is cu en ly being
in es iga ed. In las yea s, he mic oalgae ha e eme ged as sou ce o
bioac i e compounds including, lipids, p o eins, polysaccha ides and
ca o enoids. These compounds ha e a ac ed he in e es o pha macy
and cosme ic indus y due o hei an ioxidan , an i-in lamma o y and
an i-ca cinogenic ac i i ies.
Fo hese easons, he o e all objec i e o his Doc o al Thesis
is o assess he po en ial biological ac i i y (an ioxidan , an i-
in lamma o y and pho op o ec i e) o lipid compounds isola ed om he
mic oalgae Isoch ysis galbana and Mic ac inium pusillum (glycolipids
and ca o enoids) and he polyphenol osma inic acid (RA), as well as
o e alua e hei use o he ea men o in lamma o y skin
pa hologies, in di e en expe imen al models.
This wo k has been ocused on he ollowing speci ic objec i es:
1. To e alua e he an i-in lamma o y, an ioxidan and
pho op o ec i e e ec s om a a ie y o galac olipids isola ed
om he mic oalgae M. pusillum and I. galbana, using an in
i o model o UVB-i adia ed HaCaT human ke a inocy es.
2. To de elop, in collabo a ion wi h he Depa men o Pha macy
and Pha maceu ical Technology o Facul y o Pha macy o
Se ille, pha maceu ical o mula ions o imp o e he opical
applica ion o a ac ion o glycolipids (MGDG), ucoxan hin
(FX) and osma inic acid (RA).
3. To s udy he p e en i e e ec o a pu e glycolipid (MGMG-A),
and an en iched ac ion o glycolipids (MGDG) om I. galbana,
such dissol ed in ace one as o mula ed in c eam, on he 12-O-
e adecanoylpho bol 13-ace a e (TPA)-induced epide mal
hype plasia in mice.
56
4. To e alua e he pha macological p ope ies o a FX, om
I.galbana, loaded in a c eam o mula ion, on he TPA-induced
hype plasia model in mice, as well as on he UVB-induced
e y hema model in hai less mice.
5. To s udy he an i-in lamma o y e ec o RA on an imiquimod-
induced pso iasis-like model in mice, employing a o mula ion
elabo a ed wi h nanoliposomes.
6. To e alua e he po en ial an i-in lamma o y and an ioxidan
ac ion mechanisms o FX and RA, as well as a possible syne gy
be ween hem, on UVB-exposed HaCaT human ke a inocy es.
CAPÍ ulo I
59
aAzaha a Rod íguez-Luna, aJa ie Á ila-Román, aElena Tale o, bCa olina
de los Reyes, bMa ía J. O ega, bE a Zubía, aVi ginia Mo il a
a Depa men o Pha macology, Facul y o Pha macy, Uni e si y o Se ille,
Se ille 41012, Spain
b Depa men o O ganic Chemis y, Facul y o Ma ine and En i onmen al
Sciences, Uni e si y o Cádiz, Pue o Real 11510, Cádiz, Spain
Abs ac
Ch onic exposu e o he skin o ul a iole B (UVB) adia ion
induces eac i e oxygen species (ROS) p oduc ion and in lamma o y
esponses, which play a c ucial ole in ac inic ke a osis and skin
cance . Nowadays, s a egies o skin p o ec ion comp ise he use o
na u al compounds o coun e ac oxida i e s ess and in lamma ion. In
his line, galac olipids ha e shown an i-in lamma o y and an i- umo
p ope ies in di e en skin models. This s udy was aimed o e alua e
he an i-in lamma o y e ec s on mac ophages THP-1 and he p o ec i e
mechanisms agains UVB-induced cell damage in HaCaT human ke a inocy es
o a a ie y o glycolipids isola ed om he mic oalgae Mic ac inium
pusillum and Isoch ysis galbana. The s uc u es o he isola ed
monogalac osylmonoacylglyce ols (MGMG), and digalac osyldiacylglyce ols
(DGDG) we e de ined by spec oscopic analyses (NMR, HRMS, and MS/MS).
TNF-α p oduc ion was e alua ed on LPS-s imula ed THP-1 mac ophages. LDH
enzyme ac i i y, in acellula ROS le els and IL-6 p oduc ion we e
measu ed on UVB-i adia ed HaCaT cells. Se en MGMGs and six DGDGs
displaying a a ie y o C16 and C18 acyl chains we e ob ained om he
mic oalgae and subjec ed o bioac i i y assays. Mos o hese compounds
signi ican ly educed TNF-α le els in LPS-s imula ed THP-1 cells. P e-
ea men o HaCaT ke a inocy es wi h pu e MGMGs and DGDGs and ac ions
con aining MGDGs o DGDGs ma kedly a enua ed UVB-induced cell damage
h ough educ ion o LDH elease, ROS le els and IL-6 p oduc ion. The
p esen s udy con i ms he an i-in lamma o y p ope ies o a a ie y o
glycolipids in mac ophages and epo s o he i s ime he
pho op o ec i e ac i i y o hese compounds in HaCaT ke a inocy es,
sugges ing hei po en ial use as no el agen s o he p e en ion o sun
exposu e-induced skin damage.
Keywo ds: mic oalgae; HaCaT; UVB; glycolipids; MGMG; DGDG.
60
Abb e ia ions: MGMG, monogalac osylmonoacylglyce ol; MGDG,
monogalac osyldiacylglyce ol DGDG, digalac osyldiacylglyce ol; SQDG,
sul oquino osyldiacylglyce ol; UV, ul a iole adia ion; LDH, lac a e
dehyd ogenase; ROS, eac i e oxygen species; TNF-α, umo nec osis
ac o alpha; LPS lipopolysaccha ide; PMA, Pho bol 12-my is a e 13-
ace a e; IL-6, In e leukin 6; DCF-DA, dichlo o luo escein diace a e.
In oduc ion
Skin is conside ed he la ges o gan in he body and ep esen s
he i s ba ie ha p o ec s us om he dele e ious e ec s o sola
ul a iole (UV) adia ion, which is he main cause o skin cance
(Ramos-e-Sil a and Jacques, 2012)). De elopmen o skin cance depends
on he cumula i e amoun and o m o he UV adia ion, as well as on he
skin ype o he indi idual exposed. Sola UV adia ion consis s o UVC
(100–280 nm), UVB (280–315 nm) and UVA (315–400 nm). Compa ed wi h UVA,
UVB is less abundan bu is mo e ene ge ic causing de mal change besides
a ec ing epide mal unc ion (Rass and Reich a h, 2008). Di ec
abso p ion o UVB o he epide mis may induce damage in epide mal
ke a inocy es by he p oduc ion o p o-in lamma o y cy okines,
chemokines, p os aglandins and eac i e oxygen species (ROS) (Di ya e
al., 2015). An imbalance be ween he cellula p oduc ion o ROS and
an ioxidan de ence mechanisms may be de ined as oxida i e s ess (Kim,
2016). Oxida i e s ess p oduces oxida i e damage o DNA, p o eins and
lipids, con ibu ing o pho oaging and many degene a i e p ocesses as
ac inic ke a osis (AK). AK is a common skin lesion associa ed wi h long-
e m exposu e o UV adia ion, which is cha ac e ized by dysplas ic
ke a inocy e lesions con ined o he basal epide mal laye o he skin.
I un ea ed, up o 10% o AKs can unde go malignan ans o ma ion and
p og ess o squamous cell ca cinoma (SCC) (Goldenbe g and Pe l, 2014).
Since sunsc eens can p o ide an insu icien pho op o ec ion, he use
o an ioxidan and an i-in lamma o y compounds inco po a ed o sunsc een
o mula ions may be a use ul s a egy o a highe p e en ion o skin
pho odamage (Kuo e al., 2015). Ne e heless, nowadays he composi ion
o sunsc eens and cosme ic p oduc s is highly egula ed due o he ala m
gene a ed by he en i onmen al isk o o ganic UV il e s (Sobek e al.,
2013). The high consump ion wo ldwide o UV il e s is leading o hei
ele a ed de ec ion in a ious en i onmen al places as sea wa e ,
was ewa e , ap wa e , sedimen s and bio a, among o he s (Li e al.,
2007; Kameda e al., 2011; Li e al., 2017).
Ma ine algae ha e been epo ed o be an in e es ing na u al sou ce
o bioac i e compounds, including a y acids, ca o enoids, p o eins,
67
4 (Rho e al., 1996), 11 (Hi aga e al., 2008), and 13 (Kwon e al.,
1998) ma ched hose desc ibed in he li e a u e. To he bes o ou
knowledge, his is he i s epo o he isola ion and spec oscopic
da a (supplemen a y ma e ial) o he MGMGs 3 and 12. The s uc u es
de e mined o he DGDGs 5-10 isola ed om M. pusillum a e shown in
Table 2. The isola ed DGDGs con ain C16 and C18 acyl chains. The
spec oscopic da a ob ained om compounds 5 (Mo imo o e al., 1995), 8
(Mo imo o e al., 1995) and 9 (Reshe e al., 1997) ma ched hose
desc ibed in he li e a u e. To he bes o ou knowledge, his is he
i s epo o he isola ion and spec oscopic da a (supplemen a y
ma e ial) o he MGMGs 6/7 and 10. The ac ions I-MGDG and I-DGDG we e
mix u es o MGDGs and DGDGs, espec i ely, displaying C14, C16, and C18
acyl chains as p e iously desc ibed (De los Reyes e al., 2016).
Table 1. Chemical s uc u es o he MGMGs isola ed om he biomass o he
mic oalgae M. pusillum (1-4) and I. galbana (4, and 11-13).
MGMG
R
1
2
3
4
11
12
13
68
Table 2. Chemical s uc u es o he DGDGs 5-10 isola ed om he biomass o M.
pusillum.
E ec o glycolipids on cell iabili y
The e ec o glycolipids on THP-1 mac ophages and HaCaT cells
iabili y was measu ed by using he SRB assay. Resul s om cy o oxici y
s udy showed ha none o he es ed concen a ions o he pu e compounds
(10 µM o 100 µM) and ac ions (10 µg/mL o 100 µg/mL) a ec ed cell
iabili y. The inhibi o y concen a ion 50 (IC50) (hal maximal
inhibi o y concen a ion) was abo e 100 µM (compounds) o 100 µg/mL
( ac ions) a 24, 48 and 72 h a e ea men (da a no shown).
DGDG
R1
R2
5
6
7
8
9
10
69
E ec o glycolipids on TNF-α p oduc ion
We ha e s udied he ac i i y o compounds 1-13 as inhibi o s o
he p o-in lamma o y cy okine TNF-α Assays we e pe o med on human THP-
1 mac ophages using LPS o s imula e he p oduc ion o TNF-α. As shown
in Fig. 1, LPS s imula ion signi ican ly inc eased TNF-α le els in THP-
1 mac ophages in compa ison wi h uns imula ed con ol cells (P < 0.001).
In pa icula , p e ea men o cells wi h he MGMGs 2, 4, 11 and 12 a
50 μM signi ican ly dec eased LPS-induced TNF-α p oduc ion by 40%, 47%,
57% and 45%, espec i ely, upon compa ison wi h LPS-s imula ed un ea ed
THP-1 cells (Fig. 1A). Pu e DGDGs 5, 6/7, 8, 9 and 10 we e mo e ac i e,
causing a 50 µM inhibi ion o his cy okine le els by 60%, 55%, 59%,
63% and 59%, espec i ely (P < 0.001) (Fig. 1B). In addi ion, he
ac ion I-SQDG a 50 µg/mL educed signi ican ly he LPS-induced TNF-α
p oduc ion (Fig. 1C).
Figu e 1. E ec o galac olipids 1-13 on TNF-α p oduc ion in LPS-s imula ed
THP-1 mac ophages. Cells we e p e ea ed wi h monogalac osylmonoacylglyce ols
(MGMGs) 1-4 and 11-13 and digalac osyldiacylglyce ols (DGDG) 5-10 a 10, 30 and
h, TNF-α le els we e measu ed using ELISA assay. Dexame hasone (Dex) was used
as posi i e e e ence compound a 1 µM. Da a a e means ± SEM om ou independen
expe imen s. ***P < 0.001 s. un ea ed cells; + P < 0.05, ++ P < 0.01 and +++
P < 0.001 s. LPS-s imula ed con ol.
E ec o glycolipids on in acellula LDH ac i i y
70
The e ec o glycolipids on in acellula enzyma ic ac i i y was
examined by measu ing he LDH enzyme ac i i y in esh cell lysa es and
supe na an s 24 h a e exposu e o he cell cul u es o UVB adia ion.
As expec ed, UVB i adia ion o 50 mJ/cm2 signi ican ly inc eased LDH
ac i i y in HaCaT ke a inocy es compa ed o uni adia ed con ol (P
<0.001) (Fig. 2A). P e ea men o cells wi h MGMGs 1-4 and 11-13 1 h
p io o UVB exposu e signi ican ly dec eased UVB-induced mo ali y,
p ese ing cell memb ane in eg i y, a all concen a ions es ed (10,
30 and 50 μM, P <0.001) (Fig. 2A). Simila esul s we e exhibi ed wi h
ke a inocy es p e ea ed wi h DGDGs 5-10 o 1 h (Fig. 2B). The s udy
wi h ac ions con aining MGDGs, DGDGs, and SQDGs also showed a
signi ican educ ion on LDH enzyme ac i i y (P <0.001) (Fig. 2C).
Figu e 2. E ec o glycolipids om mic oalgae on UVB-induced LDH leakage in
human HaCaT ke a inocy es. Cells we e p e ea ed wi h
monogalac osylmonoacylglyce ols (MGMGs) 1-4, and 11-13 (10, 30 and 50 µM) (A),
digalac osyldiacylglyce ols (DGDGs) 5-10 (10, 30 and 50 µM) (B) and glycolipid-
con aining ac ions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (12.5, 25 and 50 µg/mL) (C) o
1 h, and hen exposed o UVB ligh (50 mJ/cm2). A e incuba ion o 24 h, cell
iabili y was assessed by using LDH assay. Resul s a e exp essed as pe cen age
espec o un ea ed con ol cells and ba s ep esen s mean ± SEM o ou
independen expe imen s (n = 4). *** P < 0.001 s. un ea ed cells; + P < 0.05,
++ P < 0.01 and +++ P < 0.001 s. UVB-i adia ed cells.
E ec o glycolipids on UVB-induced ROS p oduc ion
71
We cul u ed HaCaT cells wi h he compounds o 1 h ollowed by UVB
exposu e and e alua ed in acellula ROS le els based on he DCF-DA assay
(Fig. 3). A signi ican inc ease in ROS con en was obse ed in UVB-
i adia ed cells in ela ion o un ea ed con ol cells (wi hou UVB
i adia ion) (P < 0.001). The MGMGs 1, 2 and 4 ma kedly educed ROS
le els by 42%, 34% and 37%, espec i ely, a he highes concen a ion
es ed (P < 0.001) (Fig. 3A). A he same concen a ion, compounds 3
and 11 we e less ac i e, causing 19% and 22%, espec i ely, o dec ease
o ROS p oduc ion. As ega ds DGDGs, p e- ea men wi h 5, 6/7 and 9 a
he concen a ion o 50 µM led o 25%, 22% and 18% o inhibi ion o ROS
accumula ion, espec i ely, in UVB-i adia ed cells (P <0.001, P <0.01,
P <0.05, espec i ely) (Fig. 3B). Howe e , only he ac ion I-MGDG was
able o educe in acellula ROS p oduc ion by 26% (P <0.05) (Fig. 3C).
Figu e 3. E ec o glycolipids om mic oalgae on UVB-induced ROS p oduc ion
in human HaCaT ke a inocy es. HaCaT cells we e p e ea ed wi h
monogalac osylmonoacylglyce ol (MGMGs) 1-4 and 11-13 (50 µM) (A),
digalac osyldiacylglyce ola (DGDG) 5-10 (50 µM) (B) and glycolipid-con aining
ac ions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (50 µg/mL) (C) o 1 h, and hen i adia ed
wi h UVB (50 mJ/cm2). ROS le els we e es ima ed indi ec ly by measu ing he
luo escence emi ed by dichlo o luo esceine o med in p opo ion o he
in acellula ROS, 30 min a e UVB i adia ion. Resul s a e exp essed as
pe cen age espec o un ea ed con ol cells and ba s ep esen s mean ± SEM o
ou independen expe imen s (n = 4). ** P < 0.01 s. un ea ed cells; + P <
0.05 and ++ P < 0.01 s. UVB-i adia ed cells.
E ec o glycolipids on IL-6 p oduc ion
72
UVB exposu e induces abno mally inc eased cy okine elease om
ke a inocy es leading o in lamma o y skin diso de s. To e alua e he
e ec s o he isola ed glycolipids on he UVB-induced p oduc ion o he
p o-in lamma o y cy okine IL-6, HaCaT cells we e p e- ea ed wi h pu e
compounds and ac ions o 1 h, and hen we e exposed o UVB (50 mJ/cm2).
UVB-i adia ed HaCaT cells mani es ed high IL-6 le els in compa ison
wi h uni adia ed con ol (P <0.001) (Fig. 4A). P e- ea men wi h he
MGMGs 11, 12 and 13 subs an ially inhibi ed his cy okine le els by 86%,
85% and 66% a 50 μM, espec i ely. A his concen a ion, he compounds
1 and 2 exhibi ed less ac i i y, causing 61% and 54% o inhibi ion,
espec i ely (Fig. 4A). In ela ion o DGDGs, IL-6 p oduc ion was only
educed a e ea men wi h 8, 9 and 10 a all he concen a ions
es ed. I is wo h men ioning ha compound 10 was he mos ac i e,
educing his cy okine le els by 66%, 88% and 88%, a 10, 30 and 50 μM,
espec i ely (Fig. 4B). As ega ds ac ions, I-MGDG caused he g ea es
inhibi ion o IL-6 p oduc ion, which was dec eased by 70%, 90%, and 99%,
a 10, 30 and 50 µg/mL, espec i ely. F ac ion I-DGDG also showed
signi ican ac i i y a he h ee concen a ions es ed, educing IL-6
le els by 55%, 56% and 58%, espec i ely (Fig. 4C).
Figu e 4. E ec s o glycolipids on UVB-induced p oduc ion o IL-6 in human
HaCaT ke a inocy es. HaCaT cells we e p e ea ed wi h
monogalac osylmonoacylglyce ols (MGMGs) 1-4, and 11-13 (10, 30 and 50 µM) (A),
digalac osyldiacylglyce ols (DGDGs) 5-10 (10, 30 and 50 µM) (B) and glycolipid-
con aining ac ions I-MGDG, I-DGDG, and I-SQDG (10, 30 and 50 µg/mL) (C) o 1
h, and hen i adia ed wi h UVB (50 mJ/cm2). A e incuba ion o 24 h, IL-6
le els we e measu ed by ELISA ki . Da a a e means ± SEM om ou independen
73
expe imen s (n = 4). *** P < 0.001 s. un ea ed cells; + P < 0.05, ++ P < 0.01
and +++ P < 0.001 s. UVB-i adia ed cells.
Discussion
The skin is he main o gan ha pa icipa es in empe a u e
main enance o he body and o e s p o ec ion om chemicals,
mic oo ganisms and UV adia ion. Sola adia ion has posi i e e ec s
as media o o i amin D in he skin, imp o emen o endo phins and
educ ion o blood p essu e (Pé ez-Sánchez e al., 2016). Howe e , an
excessi e UV exposi ion can lead o se e al skin pa hological diso de s,
including e y hema, sunbu n, hype pigmen a ion, immunosupp ession,
edema, p ema u e aging and non-melanoma skin cance (Li e al., 2016).
P e ious pape s ha e epo ed he pho op o ec i e p ope ies o
di e en molecules om na u al o igin h ough an ioxidan and an i-
in lamma o y mechanisms (El-mahdy e al., 2009; Radice e al., 2016),.
The e o e, ea men o he skin wi h o al o opical o mula ions
con aining hese na u al compounds may be a use ul s a egy o
p e en ing UV-induced skin damage and ul ima ely skin cance (Hu e al.,
2016). Mo eo e , he use o na u al p oduc s is ad an ageous since may
be an al e na i e o educing he pollu ion o ma ine wa e s (Sánchez-
Quiles and To a -Sánchez, 2015).
Mic oalgae ha e been shown o be a ich sou ce o bioac i e
molecules, including pola lipids such as he galac olipids. Lipid
ex ac s and pu e galac olipids om mic oalgae ha e p e iously
demons a ed an i-in lamma o y (Bansko a e al., 2014; Robe son e al.,
2015), and an i umo p omo ing (Mo imo o e al., 1995) p ope ies, which
make hem sui able candida es o u he in es iga ion. In ou s udy,
we ha e demons a ed ha a a ie y o glycolipids o he MGMG, MGDG and
DGDG classes can p o ec HaCaT ke a inocy es agains acu e UVB adia ion
due o he inhibi ion o ROS gene a ion and he dec ease o he
p oduc ion o he p o-in lamma o y cy okine IL-6, sugges ing ha hese
molecules could play an impo an ole in p o ec ing he skin exposed
o UVB.
In a i s expe imen , we ied o con i m he an i-in lamma o y
po en ial o he compounds unde s udy in he in i o model o LPS-
s imula ed human THP-1 mac ophages and TNF-α p oduc ion. TNF-α is a
po en p o-in lamma o y cy okine whose dys egula ion is associa ed wi h
a a ie y o ch onic in lamma o y and au oimmune diseases, such as
pso ia ic a h i is, ac inic ke a osis, a opic de ma i is and skin
cance (Udomme hapo n e al., 2016). We ha e ecen ly demons a ed ha
74
ac ions con aining MGDGs o DGDGs and pu e DGDGs signi ican ly
inhibi ed TNF-α p oduc ion in he LPS/THP-1 model (De los Reyes e al.,
2016). Consis en wi h hose esul s, in he p esen s udy we ha e
con i med he an i-in lamma o y po en ial o he MGMGs 2, 4, 11 and 12
and o he DGDGs 5-10, which caused a ma ked educ ion o TNF-α le els
in LPS-s imula ed THP-1 cells. Ou esul s a e also in line wi h a
p e ious pape ha showed ha he MGDG con aining wo linolenoyl acyl
chains isola ed om Rose hip (Rosa canina) down egula ed he exp ession
o p o-in lamma o y cy okines in mac ophages and pe iphe al blood
leukocy es and inhibi ed he in lamma o y p ocess in p ima y
chond ocy es by educing ma ix me allop o einases le els (Schwage e
al., 2011). Mo eo e , in ecen yea s se e al mic oalgal galac olipids,
including MGMGs, MGDGs, and DGDGS wi h C14, C16, C18, and C20 acyl
chains, ha e been shown o dec ease he p oduc ion o he in lamma o y
media o NO in RAW264.7 mac ophages (Bansko a e al., 2014). In ela ion
o in i o s udies, B uno e al. (2015) demons a ed ha ac ions
con aining MGDGs, DGDGs, o SQDGs ob ained om a blue g een alga educed
he in lamma ion in c o on-oil-induced ea edema and ca ageenan-induced
paw edema models.
Nex , we aimed o s udy he possible p o ec i e e ec s o
glycolipids in HaCaT ke a inocy es, a well-es ablished in i o model
o in es iga ions on UV adia ion-induced cell damage. UVB exposu e
p omo es cell cy o oxici y by loss o cellula memb ane in eg i y, which
leads o libe a ion o LDH enzyme om cy osol o he cul u e medium.
The cell memb ane damage upon UVB exposu e is co ela ed wi h inc eased
ROS p oduc ion. I has been epo ed ha excessi e gene a ion o ROS
esul s in oxida i e s ess in skin cells and plays an essen ial ole
in he ini ia ion, p omo ion and p og ession o skin aging,
ca cinogenesis and many in lamma o y diso de s (Fehé e al., 2016). In
he p esen s udy, p e- ea men o HaCaT ke a inocy es wi h pu e MGMGs
and DGDGs and wi h ac ions con aining MGDGs o DGDGs signi ican ly
a enua ed UVB-induced skin damage by inc easing cell iabili y, as
demons a ed by educed LDH elease, and inhibi ing ROS le els. These
esul s a e in line wi h a p e ious epo ha showed ha glycolipid
ex ac s om spinach, wi h a high con en in MGDGs and DGDGs, a enua ed
he PMA-induced ROS p oduc ion in Caco-2 cells, he inhibi o y e ec
o DGDG being much po en han ha o MGDG (Shio a e al., 2010). In a
simila way, wo bac e ial MGDGs exhibi ed p o ec i e ac i i y agains
oxida i e s ess induced by alkyl pe oxyl adicals (Ma su uji e al.,
2000b), exogenous H2O2 o hea (Ma su uji e al., 2000a). In addi ion, a
c ude sul oglycolipidic ac ion om he mic oalga Po phy idium
75
c uen um, ich in long-chain PUFAs, inhibi ed supe oxide anion
gene a ion in p imed neu ophils (Be gé e al., 2002).
UVB i adia ion o he skin also induces a obus in lamma o y
esponse, cha ac e ized by he p oduc ion o nume ous in lamma o y
media o s, such as chemokines and cy okines in epide mis, which in u n
u he ele a e ROS p oduc ion and inc ease oxida i e s ess (Decean e
al., 2013). Excessi e p oduc ion o hese ac o s leads o
hype pigmen a ion, e y hema, pho o-aging as well as ch onic
in lamma ion, which in u n could aise he isk o skin ca cinogenesis
(Aoki-Yoshida e al., 2013). I has been p e iously epo ed an up-
egula ion o he p o-in lamma o y cy okine IL-6 in human and a skin
(Dawes e al., 2014), and human HaCaT ke a inocy es a e UVB-induced
in lamma ion (Bo land e al., 2011). Ou esul s showed ha glycolipids
p esen ed in his s udy inhibi ed IL-6 p oduc ion in UVB-i adia ed HaCaT
cells. In a simila way, ea men o human a icula chond ocy es wi h
he MGDG ac ion o he mic oalga Pho midium sp. ETS-05 supp essed his
cy okine exp ession induced by IL-1α and TNF-α (Uli i e al., 2011).
In summa y, ou indings con i m he an i-in lamma o y p ope ies
o a a ie y o glycolipids o he MGMG and DGDG classes in mac ophages
and epo o he i s ime he p o ec i e ac i i y o hese compounds
agains UVB-caused damage o HaCaT ke a inocy es. These ac ions seem o
be media ed by hei an ioxidan and an i-in lamma o y p ope ies.
Fu u e s udies a e needed o expand he ision o he e ec s and
mechanisms by which hese glycolipids exe hei pho op o ec i e
ac i i y. These in es iga ions will suppo he po en ial use o hese
p oduc s as no el agen s o he p e en ion o sun exposu e-induced skin
damage including cance de elopmen .
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El-mahdy, M.A., Zhu, Q., Wang, Q., Wani, G., Pa naik, S., Zhao, Q., A a a, E.,
84
c eam applica ion a enua ed TPA-induced skin edema, imp o ed
his opa hological ea u es and showed a educ ion o he in lamma o y
cell in il a e. In addi ion, his o mula ion inhibi ed epide mal
exp ession o COX-2 on a simila way han dexame hasone. Ou esul s
sugges ha a MGDG-con aining c eam could be an eme ging he apeu ic
s a egy o he ea men o in lamma o y skin pa hologies as pso iasis.
Abb e ia ions: CLSM, Con ocal Lase Scanning Mic oscopy; Dex,
Dexame hasone; IL, In e leukin; I. galbana, Isoch ysis galbana; MGDG,
monogalac osyldiacylglyce ol; MPO, myelope oxidase; RMS, oo mean
squa e; SC, s a um co neum; TNF-α, umo nec osis ac o alpha; TPA,
12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e.
Keywo ds: glycolipids, MGDG, skin, in lamma ion, epide mal hype plasia,
mic oalgae, Isoch ysis galbana.
In oduc ion
Inflamma o y skin diseases ha e a significan impac on he quali y-
o -li e o pa ien s; one o hem is pso iasis, conside ed as a common
immune-media ed inflamma o y skin diso de . I is es ima ed ha 2-4 %
o he popula ion su e s pso iasis (An e al., 2016). Al hough he
exac mechanism o his pa hology is no comple ely unde s ood, i is
known ha bo h gene ic p edisposi ion and en i onmen al ac o s as
s ess, in ec ion, auma and d ugs ha e an impo an ole in i s
e iology (A asa e al., 2014). This disease is associa ed wi h se e al
como bidi ies as ca dio ascula diseases, me abolic synd ome, and
psychia ic diso de s.
Accumula ing e idence has demons a ed ha exposu e o skin o he
p o ein kinase C ac i a o 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)
induces a pleio ophic issue esponse and p omo es mac oscopic lesions
as peeling and e y hema, mimicking an appa en pso iasis pheno ype.
Fu he mo e, i has been obse ed an inc ease o hickness o epide mis
esul ing om hype p oli e a ion and abe an di e en ia ion o
ke a inocy es as well as in il a ion o in lamma o y leukocy es in o
he epide mis and de mis (Liu e al., 2015). The ac i a ed leukocy es
cause uncon olled p oduc ion o eac i e oxygen species (ROS), leading
o pe oxida i e damage o skin memb anes and con ibu ing o he
exace ba ion o lesions. Mo eo e , hese immune cells elease g ow h
ac o s, chemokines and p o-in lamma o y cy okines such as umou
nec osis ac o (TNF)-α and in e leukin (IL)-6, IL-1β and IL-17, which
in e ac as a ne wo k in he pa hogenesis o pso iasis (Lowes e al.,
2007). The inducible enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) has also been
85
demons a ed o play a cen al ole in skin p oli e a i e diso de s
h ough o e p oduc ion o p o-in lamma o y p os aglandins as PGE2
(Zul aka e al., 2016). Cu en ly, ea men o pso iasis include
opical agen s (co icoids, i amin D de i a i es, e inoids and
calcineu in inhibi o s), pho o-chemo- he apy, as well as sys emic
ea men s (immunosupp essan s and biological d ugs) (Gue a e al.,
2016). Howe e , many pa ien s, especially hose wi h mode a e- o-se e e
gene alized pso iasis, a e no adequa ely ea ed wi h e ec i e, long-
e m he apies, and mos o hem ha e a ious deg ees o side e ec s.
Thus, he de elopmen o well- ole a ed immune-modula o y agen s can
o e an al e na i e op ion o he ea men o pso ia ic pa ien s.
Mic oalgae ha e eme ged as a sou ce o bioac i e compounds,
including lipids, p o eins, polysaccha ides and ca o enoids, which ha e
a ac ed he in e es o he pha maceu ical indus y based on hei
an i-oxidan , an i-in lamma o y o an i-ca cinogenic ac i i ies in
di e en skin in lamma o y models ( e iewed in Tale o e al., 2015)
(Tale o e al., 2015). The opical applica ion equi es a sui able
inco po a ion o hese bio-compounds in o a ca ie ha o e s
s abili y, pe mea ion enhance p ope ies, and emaining ime on o he
skin. The o mula ion o hese subs ances in ol es he selec ion o
app op ia e combina ions o ing edien s in he o mula wi h he aim o
exe he desi able local o sys emic e ec . Recen ly, mic oalgae
de i a i es a e being used as cosmeceu icals, h ough hei
inco po a ion in many ace and skin ca e p oduc s (e.g., an i-aging
c eam, egene a ing ca e p oduc s, emollien and an i-i i an in
peele s), sun p o ec o s and hai ca e p oduc s (Ma ins e al., 2014).
We ha e p e iously epo ed ha galac osylglyce ides isola ed om he
ma ine mic oalga Isoch ysis galbana (I. galbana) inhibi he p oduc ion
o he p o-in lamma o y cy okine TNF-α in lipopolysaccha ide-s imula ed
human THP-1 mac ophages (De los Reyes e al., 2016). Gi en he
in e es ing an i-in lamma o y p ope ies elici ed by hese compounds,
he aim o he p esen s udy was o e alua e he p e en i e e ec s o
galac osylglyce ides om I. galbana on a mu ine model o TPA-induced
epide mal hype plasia in emale Swiss mice. To es his possibili y,
we ha e analysed he e ec s o opical applica ion o ace one-dissol ed
glycolipids. Howe e , i is known ha ace one-dissol ed glycolipids o
u he applica ion on o he mice skin exhibi se e al d awbacks, such
as amoun o his o ganic sol en emaining in con ac o he skin,
sp eading o he o mula ion and loss o sample, he e ogenei y o he
dose con ac ing wi h he skin and di icul y o applying he sample.
The use o pha maceu ical ca ie s able o load he ac i e molecule may
86
sol e he abo e limi a ions o glycolipid solu ions. Among hem, opical
o mula ions o di e en na u e a e used, including oin men , c eam,
o hyd ophilic gel, in which he ac i e compound is suspended o
dissol ed.
Ma e ials and Me hods
Glycolipids
The monogalac osylmonoacylglyce ide (2S)-1-O-[(6Z,9Z,12Z,15Z)-
oc adeca-6,9,12,15- e aenoyl]-3-O-β-D-galac opy anosylglyce ol (MGMG-
A) was isola ed om he mic oalga I. galbana, as p e iously desc ibed
in Rod íguez-Luna e al., (submi ed). The ac ion o
monogalac osyldiacylglyce ides (MGDG) was ob ained om he mic oalga
I. galbana, as p e iously desc ibed in (De los Reyes e al., 2016).
Cell cul u e
HaCaT human ke a inocy es we e ob ained om he Ame ican Type
Cul u e Collec ion and main ained in high glucose Dulbecco’s modi ied
Eagle’s medium (DMEM, GIBCO, G and Island, NY) supplemen ed wi h 10 %
e al bo ine se um, 2 mM L-glu amine, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL
s ep omycin in an a mosphe e o 5 % CO2 a 37 ºC.
Cell iabili y assay
Viabili y o HaCaT cells upon exposu e o glycolipid compounds was
de e mined by he sul o hodamine B (SRB) assay (Skehan e al., 1990).
B ie ly, he cells we e seeded in o 96-well pla es a 1x104 cells/well.
A e 24 h, cells we e incuba ed wi h compounds a he inal
concen a ions ange o 10-100 µM o 10-100 μg/mL (100 µL/well) ha
we e p epa ed by dilu ion o s ocks solu ions (10 mM) in DMSO in esh
medium. A e 24, 48, and 72 h, cells we e ixed wi h 50 μL o
ichlo oace ic acid (TCA 50 % / ), a 4 ºC o 1 h and p ocessed as
desc ibed in he li e a u e.
De e mina ion o IL-6 and IL-8 p oduc ion
HaCaT cells we e seeded in 6-well pla es (2 mL/well) a 5x105
cells/well. A e 24 h, he cells we e ea ed wi h di e en
concen a ions o MGMG-A (10, 30 and 50 μM) and MGDG (10, 30 and 50
μg/mL) and dexame hasone (Dex) (1 μM) o 1 h, and hen we e s imula ed
wi h TNF-α (10 ng/mL) o 24 h. Then, supe na an luids we e collec ed
and s o ed a -80 °C un il IL-6 and IL-8 measu emen s. Con ols con ained
medium wi h equi alen amoun s o sol en compa ed o ea men s, and
87
we e incuba ed wi h and wi hou TNF-α. Comme cial enzyme-linked
immunoso ben assay (ELISA) ki s (Diaclone GEN-PROBE, F ance) we e used
o quan i y cy okines acco ding o he manu ac u e ’s p o ocol. The
abso bance a 450 nm was ead by a mic opla e eade .
Skin opical o mula ions
- Hyd ophilic gel. Ca bopol® 934P was selec ed as a gelling agen a 1
% (w/ ) due o i s widesp ead use in pha maceu ical o mula ions and
as dispe sion in wa e . Rhodamine 6G solu ion in e hanol absolu e (10
µg/µL) was g adually added o he polyme dispe sion unde magne ic
s i ing. The dispe sion was neu alized wi h ie hanolamine o ob ain
an adequa e consis ency sui able o opical applica ion.
- C eam. This O/W emulsion was p epa ed by g adually adding hodamine
(10 µg/µL), MGDG (10 mg/mL) o Dex (10 µg/µL) solu ion in e hanol
absolu e o a cold mix excipien composed o Cap ylic/Cap ic
T iglyce ides, Glycol S ea a e, PEG-3 Glyce yl Cocoa e and S ea e h-7
p e iously hea ed o imp o e he d ug in e posi ion. The inal
o mula ions con ained 0.2 % (w/w) MGDG.
- Lipophilic oin men . This o mula ion was ob ained using mel
emulsi ica ion combined wi h s i ing. B ie ly, B ij® 72 (5 % w/w) and
whi e so pa a in (77.3 % w/w) we e blended unde gen le s i ing in
a wa e ba h a 70 °C o o m he lipid phase. Successi ely, liquid
pa a in (5 % w/w) and α- ocophe ol (0.002 % w/w) we e added in o he
lipid phase un il comple e in e posi ion a 60 °C. Then, hodamine
dissol ed in p opylene glycol (10 µg/µL) was added o he mix u e.
Meanwhile, wo solu ions o EDTA (0.0065 % w/w) and disodium phospha e
dihyd a e (0.026 % w/w) we e p epa ed wi h dis illed wa e a 60 °C and
added d opwise o he lipid phase, wi h mode a e magne ic s i ing a
150 pm o 20 min. Finally, hodamine-loaded oin men was main ained
a oom empe a u e o u he use.
Animals
Fo he p esen s udy, 8-week-old emale Swiss CD-1 mice (25–30 g)
we e supplied by Jan ie -Labs (Le Genes S Isle, F ance). Mice we e
main ained in ou Animal Labo a o y unde s anda d condi ions
( empe a u e o 24–25 °C, humidi y o 70–75 % and 12 h ligh –12 h da k
cycle). Mice we e allowed ee access o a s anda d die (Panlab) and
wa e ad libi um. Do sal egion o he mice was sha ed by using an
elec ic clippe and ea ed wi h depila o y c eam skin (Deliplus,
Ba celona, Spain) wi hou sc a ching o damaging he su ace in o de
88
o main ain he in eg i y o he skin. All s udies we e pe o med in
acco dance wi h he ecommenda ions o he Eu opean Union ega ding
animal expe imen a ion (Di ec i e o he Eu opean Council 2010/63/EU).
The expe imen s ollowed a p o ocol app o ed by he Animal E hics
Commi ee o he Uni e si y o Se ille.
In i o skin dep h pe mea ion by Con ocal Lase Scanning Mic oscopy
(CLSM)
CLSM s udies we e pe o med in o de o in es iga e he skin
pene a ion abili y o he di e en o mula ions h ough he skin laye s
(Ál a ez-Roman e al., 2004). Towa ds his aim, Ca bopol® hyd ogel, c eam
and oin men we e p epa ed by adding a hyd ophobic luo escen p obe,
i.e. hodamine 6G, in he lipid o in he wa e -e hanol phase, acco ding
o he composi ion o o mula ions. Rhodamine 6G was selec ed as an
equi alen ma ke o MGDG o Dex due o hei compa able lipophilic
p ope ies. App op ia e samples o hese o mula ions we e aken and
placed on s a um co neum (SC) o mice and we e main ained in con ac
wi h he skin o 24 h. A he end o he expe imen , he emaining
p epa a ion was ca e ully washed wi h pu i ied wa e om he skin
su ace. Then, do sal skin was excised and insed wi h pH 7.4 phospha e
bu e solu ion, apidly ozen by liquid ni ogen and hen s o ed a -
80 ºC. Sec ions o skin (50 µm hickness) we e hen pe pendicula ly cu
wi h a c yomic o ome and examined o in es iga e he luo escen ma ke
dis ibu ion in he di e en skin laye s.
Analysis was ca ied ou using a Leica TCS SP II Con ocal Lase
Scanning Imaging Sys em (Leica, Heidelbe g, Ge many) equipped wi h a K –
A –He–Ne ion lase and a Leica DM IRE 2 mic oscope endowed wi h HCPL
Fluo a Leica X10 and X20 d y objec i es and HCXPLAN APO Leica X40 mul i-
imme sion objec i e (nume ic ape u e 0.85). Fo exci a ion o he
luo escen label he 488nm wa eleng h was used and he luo escence
emission was de ec ed a 520 nm.
F om he con ocal images, a ma hema ical ea men was ca ied ou in
o de o e alua e he in ensi y o luo escence in he samples, as
appea ed in he his og am cu e p o ided om Leica so wa e. S a is ical
calcula ions we e as ollows:
A i hme ical mean alue: μ(I)=1
Npixel ∙∑Ii
A e age image ene gy: 𝐼𝑚𝑒𝑎𝑛
2=1
𝑁𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙 ∙∑𝐼𝑖2
𝑝𝑖𝑥𝑒𝑙
Roo mean squa e alue: Imean
2=√1
Npixel∑Ii2
pixel
89
Skewness o he dis ibu ion: Skew(I)=1
N∑[Ii−μ(I)
√VAR(I)]3
i
Whe e I is he ene gy in ensi y, Npixel is he numbe o pixels o he
image and VAR is he a iance.
Ex- i o pe mea ion s udies
Ex- i o di usion s udies we e ca ied ou using a F anz di usion
cell appa a us (SES-Gmgh Analyses sys em, Ge many) wi h an e ec i e
di usional a ea o 3.14 cm2. Excised mice skin was used as memb ane.
Animals we e sac i iced and ull hickness do sal skin was excised. A
speci ic po ion o he skin was cu and used o he pe mea ion s udy
a e washing i wi h dis illed wa e . S udy was ca ied ou ollowing
he me hodology p e iously epo ed (López-Pin o e al., 2005). Animal
skin was inse ed be ween he dono and ecei ing compa men s and
adjus ed by means o a pinch clamp. The ecei ing chambe was illed
wi h 14.5 mL o degassed e hanol absolu e and was he mos a ed by means
o a wa e ba h ci cula o and a jacke su ounding he cell, main aining
32 ºC in he skin su ace. The ecei ing medium was con inuously s i ed
o a oid di usion laye e ec .
Once selec ed he c eam ca ie om he p e ious s udy, MGDG-c eam (0.2
% w/w), MGDG con ol solu ion (0.2 % w/w) and Dex-c eam (0.2 % w/w) we e
accu a ely measu ed and placed on SC in he dono compa men and sealed
wi h pa a ilm. Aliquo s o 0.5 mL we e wi hd awn om he ecei ing
medium a p ede e mined ime in e als (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24
h) acco ding o in e na ional guidelines and he same olume was eplaced
wi h esh e hanol absolu e a he same empe a u e. These samples we e
quan i ied by HPLC (Hi achi Eli e LaCh om) o MGDG quan i ica ion and
spec opho ome y UV- isible (Agilen 8453) was used o Dex
quan i ica ion.
The HPLC sys em is equipped wi h an L-2130 isoc a ic pump, a diode
a ay de ec o L-2455 and L-2200 au osample . The ch oma og aphic
sepa a ion was pe o med on a e e se phase Lich oCART® C18 column (5
μm, 4.6 mm ID × 150 mm) using as mobile phase ace oni ile (ACN, solu ion
A): o mic acid solu ion (0.1 % / ), solu ion B) adjus ed o pH 2.67
in he ollowing g adien ( / ): 0–6 min, 90 % A, 10 % B, lux 1 mL/min;
6-15 min, 100 % A. The injec ion olume was 30 µL.
Cumula i e amoun o d ug in ecep o chambe o he h ee o mula ions
(MGDG-c eam, MGDG con ol solu ion and Dex con ol solu ion) was plo ed
as a unc ion o ime ( , h). The cumula i e amoun (%) o d ug pe mea ed
90
h ough he skin (P %) was de e mined as pe he ollowing equa ion (Li
Z, Liu M, Wang H, 2016):
𝑃%=𝐶𝑛∙𝑉+∑𝐶𝑖∙𝑉𝑖
𝑛−1
𝑖=1
𝑀∙100
Whe e Cn is he d ug concen a ion o he n h sampling poin (mg/mL), Ci
is he d ug concen a ion o he i h sample poin (mg/mL), V is he o al
olume (14.5 mL) o liquid in ecei ing pool, Vi is he olume (0.5 mL)
o he i h sampling poin s and M is he mass o d ug (MGDG o Dex).
TPA-induced epide mal hype plasia model and ea men s
We e alua ed he e ec o glycolipids om I. galbana on TPA-
induced hype plasia in mu ine skin by using wo expe imen al p o ocols.
B ie ly, do sal skin o emale Swiss mice was sha ed and 24 h la e ,
animals ha displayed no e idence o hai eg ow h o inju y we e
assigned o he di e en g oups.
In he i s p o ocol, MGMG-A and MGDG dissol ed in ace one (10
µg/µL, 200 µg pe si e), he e e ence agen Dex dissol ed in ace one
(10 µg/µL, 200 µg pe si e), o ehicle (ace one) we e opically
adminis e ed o he skin su ace o he backs in an a ea o 1 cm2 by
using a mic opipe e ( o al olume o 20 µL). A e 30 min, TPA (2 nmol
pe si e, dissol ed in ace one) was opically applied o he same a eas
(day 1). A e e ence con ol g oup was included o compa ison wi h he
TPA-induced g oup: sham g oup ecei ed ace one, ins ead TPA solu ion,
in a compa able olume. This p ocedu e was epea ed du ing wo
consecu i e days (A asa e al., 2014).
In he second p o ocol, MGDG-c eam o mula ion (100 mg pe si e,
con aining 200 µg o MGDG dissol ed in e hanol a 10 µg/µL), Dex (100mg
pe si e, equi alen a 200 µg o compound dissol ed in e hanol) o
ehicle (c eam wi h a compa able olume o e hanol) we e applied on he
do sal skin in an a ea o 1 cm2 by using a sy inge, and s a ing 2 days
be o e he hype plasia induc ion. Twen y- ou hou s a e he second
c eam adminis a ion, TPA (2 nmol pe si e, dissol ed in e hanol) was
opically applied o he same a eas (day 1). A e 1 h, MGDG-c eam, Dex
o ehicle we e adminis e ed ollowing he men ioned p o ocol. This
p ocedu e was epea ed du ing wo consecu i e days.
91
Fo he wo expe imen al p o ocols, 3 days a e he i s TPA
applica ion (day 4), mice we e sac i iced by ce ical disloca ion and
punch biopsies we e collec ed om he ea ed do sal skin and weighed
o e alua e edema. One issue piece pe animal was ixed in 4% bu e ed
pa a o maldehyde. O he pieces we e ozen in liquid ni ogen o
measu emen o biochemical pa ame e s.
His ological s udy
Tissue samples om he do sal skin o ou animals we e ixed in
42 % bu e ed pa a o maldehyde, dehyd a ed by inc easing concen a ions
o e hanol and embedded in pa a in. Tissue sec ions we e cu a 7 μm
on a o a y mic o ome (Leica Mic osys ems, Ge many), we e moun ed on
slides, depa a inized wi h xylene, ehyd a ed h ough g aded alcohols
and s ained wi h haema oxylin and eosin, acco ding o s anda d p o ocols.
All issue sec ions we e examined unde an Olympus BH-2 mic oscope (GMI
Inc., MIN, USA) o de e mina ion o his opa hological changes.
Epide mal hickness was measu ed using Scien i ic Imaging Sys ems
(Biopho onics ImageJ Analysis So wa e; Na ional Ins i u es o Heal h,
USA).
MPO ac i i y
Myelope oxidase (MPO) ac i i y was assayed as a ma ke o
neu ophil in il a ion acco ding o he me hod o G isham e al.
(G isham e al., 1990). The issue was hawed, weighed and homogenised
in en olumes o 50 mM-PBS (pH 7.4). The homogena e was cen i uged a
20,000 g o 20 min a 4 °C. The pelle was again homogenized in en
olumes o 50 mM-PBS (pH 6) con aining hexadecyl ime hylammonium
b omide (0.5%) and 10 mM-EDTA. This homogena e was subjec ed o one
cycle o eezing/ hawing and a b ie pe iod o sonica ion. A sample o
he homogena e (50 µL) was added o a 96-well mic opla e and incuba ed
a 37 °C o 3 min wi h a mix u e con aining o-dianisidine
dihyd ochlo ide (0.067 %), hexadecyl ime hyl-ammonium b omide (0.5 %)
and 0.3 mM-H2O2. Changes in abso bance a 450 nm we e measu ed wi h a
mic opla e eade (Labysys em Mul iskan EX, The mo Scien i ic, NY, USA).
One uni o MPO ac i i y was de ined as he amoun o enzyme p esen
ha p oduced a change in abso bance o 1.0u ni /min a 37 °C in he
inal eac ion olume con aining he ace a e. Resul s a e exp essed as
uni s/mg issue.
Measu emen o cy okines in skin homogena es
92
F ozen skin biopsies we e homogenised in h ee olumes o ice-cold
issue lysis bu e con aining PBS (pH 7.2) wi h 0.1 M o EDTA, 1 mg/mL
o leupep in, 1 mg/mL o peps a in, 1 mg/mL o ap o inin and 1 mM
phenylme hylsul onyl luo ide. Homogena es we e cen i uged a 12,000 g
o 10 min a 4 °C. Supe na an s luids we e s o ed a -80 °C un il
measu emen s. Le els o TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 and IL-10 we e measu ed
by quan i a i e Enzyme-Linked ImmunoSo ben Assay ki s (ELISA)
(Pep o ech, Ge many), acco ding o he manu ac u e ’s ins uc ions. Da a
a e epo ed as pg/mg issue.
Immunohis ochemical analysis
S aining o COX-2 was pe o med using a s ep a idin-bio in-
pe oxidase me hod (Tale o e al., 2011). Pa a in-embedded do sal skin
sec ions (7 µm) we e moun ed on slides, depa a inized wi h xylene and
ehyd a ed h ough g aded alcohols. These sec ions we e boiled (10 mM
ci a e bu e , pH 6.0 o 3 min) o an igen e ie al, ollowed by
cooling a oom empe a u e o 20 min. Endogenous pe oxidase was
quenched wi h 0.3 % ( / ) hyd ogen pe oxide o 20 min. Sec ions we e
insed wi h PBS o 10 min. Nonspeci ic adso p ion was minimized by
incuba ing sec ions in no mal ho se se um (Vec as ain Ki ; Vec o
Labo a o ies, Bu lingame, CA) o 20 min. Subsequen ly, slides we e
incuba ed wi h abbi polyclonal an i-COX-2 an ibody (Cayman Chemical,
MICH, USA) (1:300) o e nigh a 4 ºC. Then, slides we e ea ed wi h
an i-mouse IgG an ibody o 30 min and incuba ed wi h he s ep a idin–
pe oxidase complex o 30 min, a oom empe a u e (Vec as ain Ki ;
Vec o Labo a o ies, CA, USA). The enzyma ic ac i i ies we e de eloped
wi h 3,3´-diaminobenzidine (DAB), and he sec ions we e coun e s ained
wi h hema oxylin. Nega i e con ol sec ions we e ea ed in he same
way, omi ing he p ima y an ibody (Tale o e al., 2012). COX-2
immuno eac i i y was examined on all sec ions using a mic oscope Olympus
BX61 (Olympus Op ical Co. L d. Tokyo, Japan) The quan i ica ion o
immunohis ochemical da a was done by coun ing he numbe o immuno-
s ained cells as pe cen o o al epide mal cells om en mic oscopic
ields o immunos ained issues pe animal.
S a is ical Analysis
All alues in he igu es and ex a e exp essed as a i hme ic
means ± SEM. Da a we e e alua ed wi h G aphPad P ism e sion 5.00
so wa e (G aphPad So wa e, Inc., San Diego, CA, USA). In all cases,
he Shapi o-Wilk es was used o e i y he no mali y o he da a. The
Mann-Whi ney U- es was chosen o non-pa ame ic alues. The pa ame ic
93
alues g oups we e analyzed by one-way analysis o a iance (ANOVA)
ollowed by Bon e oni’s Mul iple Compa ison Tes . P alues < 0.05 we e
conside ed s a is ically signi ican . In he his ological expe imen ,
esul s shown a e ep esen a i e o a leas ou independen expe imen s
pe o med on di e en days.
Resul s
E ec s o glycolipids on IL-6 and IL-8 p oduc ion in TNF-α-s imula ed
HaCaT human ke a inocy es
To in es iga e he e ec o he glycolipid MGMG-A and he ac ion
MGDG on he p oduc ion o he p o-in lamma o y cy okines IL-6 and IL-8,
HaCaT cells we e p e ea ed wi h non-cy o oxic concen a ions o
glycolipids (10, 30, and 50 µM o pu e compound and µg/mL o ac ion)
o 1 h, and hen, we e s imula ed wi h TNF-α (10 ng/mL) o 24 h. TNF-
α-s imula ed HaCaT cells mani es ed high IL-6 and IL-8 le els in
compa ison wi h uns imula ed con ol cells (P < 0.001) (Table 1). P e-
ea men wi h he compound and ac ion signi ican ly inhibi ed IL-6
and IL-8 p oduc ion a he di e en es ed concen a ions.
MGMG-A
(µM)
MGDG
(µg/mL)
Con ol
TNF-α
Dex
10
30
50
10
30
50
IL-6
(pg/ml)
8.738 ±
2.5
123.2 ±
10.8
***
27.9 ±
10.7
++
36.6 ±
16.2 +
34.6 ±
14.8 +
32.5 ±
13.9 +
44.5 ±
13.5 +
45.3 ±
8.8 +
45.9 ±
8.9 +
IL-8
(pg/ml)
5473 ±
971.1
55505 ±
7148
***
20848 ±
2848 +++
28822
± 3938
++
26727
± 4170
++
25205 ±
3610 ++
31838 ±
5851 +
30601 ±
6962 +
27979
± 6116
++
Table 1. E ec s o glycolipids om I. galbana on IL-6 and IL-8 p oduc ion in
TNF-α-s imula ed HaCaT human ke a inocy es. IL-6 le els and IL-8 le els in TNF-
α-s imula ed HaCaT human ke a inocy es. Cells we e p e-incuba ed wi h he
glycolipid MGMG-A (10, 30, 50 µM) and he ac ion MGDG (10, 30, 50 µg/mL), and
hen s imula ed wi h TNF-α (10 ng/mL) o 24 h. Dexame hasone (Dex) was used as
posi i e e e ence compound a 1 µM. A e 24 h, he p oduc ion o cy okines in
he supe na an s was measu ed by ELISA assay. Resul s a e ep esen a i e o six
independen expe imen s (n=6). Values a e means wi h s anda d e o s ep esen ed
by e ical ba s. Mean alue was signi ican ly di e en compa ed wi h he
con ol g oup (*** P < 0.001; S uden es ). Mean alue was signi ican ly
100
Figu e 4. Topical p e- ea men wi h c eam con aining he glycolipid ac ion
MGDG om I. galbana dec eases skin in lamma ion and hype plasia on he mu ine
12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)-induced model. Glycolipid c eam
o mula ion (100 mg pe si e con aining 200 µg o MGDG), Dexame hasone (Dex)
(100 mg pe si e, equi alen a 200 µg o compound) o ehicle (c eam wi h a
compa able olume o e hanol) we e opically adminis e ed om 2 days be o e
hype plasia induc ion and 30 min a e each TPA applica ion (2 nmol pe zone o
h ee consecu i e days). Dex was used as posi i e e e ence compound. (a)
Rep esen a i e images o mac oscopic appea ance o he do sal skin. (b)
De e mina ion o skin edema as punch biopsy weigh . (c) His ological appea ance
o mouse do sal skin a e haema oxylin/eosin (H&E)-s aining; Ba = 100 µm.
101
O iginal magni ica ion 100X. (d) Epide mal hickness assessmen in H&E-s ained
skin slides. (e) Myelope oxidase (MPO) ac i i y. Values a e means wi h s anda d
e o s ep esen ed by e ical ba s. Da a a e means ± SEM (n=6-8 mice/g oup).
Mean alue was signi ican ly di e en compa ed wi h he sham g oup (***P <
0.001; S uden es ). Mean alue was signi ican ly di e en compa ed wi h
c eam-TPA g oup (+P < 0.05, +++P < 0.001; one-way ANOVA ollowed by Bon e oni’s
Mul iple Compa ison es ).
Figu e 5. Topical p e- ea men wi h c eam con aining he glycolipid ac ion
MGDG om I. galbana a enua es 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e (TPA)-
induced COX-2 exp ession in mouse skin. (a) Rep esen a i e pho og aphs o
epide mal COX-2 dis ibu ion by immunohis ochemical de ec ion; Ba = 200 µm.
O iginal magni ica ion 200X. (b) Posi i e COX-2 epide mal laye was assessed by
coun ing he COX-2 posi i e cells e sus o al cells in di e en immunos ainned
do sal skin sec ions pe animal; pho og aphs a e ep esen a i e om one ou o
h ee mice in es iga ed. Values a e means wi h s anda d e o s ep esen ed by
e ical ba s. Da a a e means ± SEM (n=6). Mean alue was signi ican ly di e en
compa ed wi h he sham g oup (***P < 0.001; S uden es ). Mean alue was
signi ican ly di e en compa ed wi h c eam-TPA g oup (+++P < 0.001; one-way
ANOVA ollowed by Bon e oni’s Mul iple Compa ison es ).
Discussion
In lamma o y skin diseases ha e a signi ican impac in socie y,
being a opic de ma i is, acne, sunbu n and pso iasis he mos common
mani es a ions. Pso iasis is a ch onic, au oimmune and mul isys em
102
in lamma o y disease ha a ec s a 2-4 % o popula ion (Anand e al.,
2017). Cu en ly, con en ional ea men s o his disease a e based on
he deg ee o se e i y and include om opical he apy and sys emic
agen s h ough o pho o he apy o combina ions o hose. Howe e , many
o hese he apies a e no ecommended o a as majo i y o pa ien s
a lic ed o mild o ms o pso iasis because o hei po en ial isk
(Mala es inic e al., 2017). The e o e, o he app oaches o mild
pso iasis ea men ha equi e opical he apy only a e s ill needed.
In his ega ds, na u al p oduc s p o ides some op ions o inc easing
sa e y and e icacy in he managemen o his pa hology (He man e al.,
2016). Mic oalgae species a e a p omising sou ce o a a ie y o
bioac i e molecules, including pola lipids such as glycolipids. Lipid
en iched ex ac s o pu e glycolipids ha e p e iously demons a ed hei
in i o an i-in lamma o y (Bansko a e al., 2014; Robe son e al.,
2015), and an i umo p omo ing p ope ies (Hossain e al., 2005), which
make hem sui able candida es o u he in es iga ion. Howe e , he
use o galac osylglyce ides o p e en skin pa hologies such as pso iasis
has no been p e iously e idenced. In his sense, we ha e ecen ly
obse ed ha his kind o me aboli es, p o ec human ke a inocy es HaCaT
agains UVB adia ion h ough inhibi ion o ROS gene a ion and dec ease
o he p oduc ion o he p o-in lamma o y cy okine IL-6 (Rod íguez-Luna,
e al., submi ed). These indings sugges ha his ype o molecules
could play a main ole no only in p o ec ing he skin agains UVB
exposi ion bu also in p e en ing he skin in lamma o y p ocess. In his
con ex , we aimed o e alua e he an i-in lamma o y e ec s o he
glycolipid MGMG-A and, he ac ion MGDG in an expe imen al TPA-induced
hype plasia model in mice. Mo eo e , we used di e en semisolid
o mula ions in which he glycolipid was loaded in o de o acili a e
i s opical applica ion and o enhance he pe mea ion mechanism compa ed
o con en ional liquid p epa a ions.
Fi s ly, we ied o demons a e he an i-in lamma o y po en ial
o he compounds unde s udy in he in i o model o TNF-α-s imula ed
HaCaT ke a inocy es. This cy okine plays a c ucial ole in he
pa hogenesis o skin in lamma o y diseases as pso iasis (Paya e al.,
2007). We p o ed ha p e- ea men wi h he compound MGMG-A o he
ac ion MGDG signi ican ly educed he p oduc ion o he p o-
in lamma o y cy okines IL-6 and IL-8 in s imula ed HaCaT ke a inocy es.
These esul s led us o e alua e he possible p e en i e e ec s o
hese p oduc s on TPA-induced hype plasia in mu ine skin by using wo
expe imen al app oaches. In he i s in i o expe imen , glycolipids,
103
dissol ed in ace one, we e opically adminis e ed o do sal skin 30 min
be o e TPA adminis a ion. Ou da a showed ha TPA clea ly caused
peeling, e y hema, and a s ong in lamma o y eac ion, p oduced by a
ma ked in lux o mononuclea and polymo phonuclea leukocy es in
epide mis and de mis. T ea men o mice wi h he compound MGMG-A o he
ac ion MGDG om I. galbana educed he hype plasia mani es a ions and
he in lamma ion g ade, p esumably due o an inhibi ion o in lamma o y
cells in il a ion, as e ealed MPO s udy. These indings a e in e es ing
since he cellula in il a e has pa hogenic oles in pso iasis and
hus, i s con ol is ex emely impo an o he a enua ion o his
disease (Yazici e al., 2016). Mic oscopic analysis o he do sal skin
was in acco dance wi h mac oscopic s udy e lec ing he a enua ion o
he ke a inocy es hype p oli e a ion in he epide mis a e he
ea men wi h he ace one-dissol ed glycolipids. Ou esul s a e in
line wi h a p e ious epo ha showed ha opical p e- ea men wi h
he glycoglyce olipids MGDG, DGDG, o SQDG, ob ained om a blue g een
alga, educed he in lamma ion in c o on-oil-induced ea edema, and in
ca ageenan-induced paw edema models (B uno e al., 2005).
The ole o TNF-α, IL-17, and IL-1β in pso iasis pa hogenesis has
been well documen ed (Mahil e al., 2016), as s a egies o block hese
cy okines showed o be pa icula ly e ec i e in he ea men o his
disease (Campa e al., 2016). In he p esen s udy, do sal skin samples
om TPA g oup showed inc eased le els o he p o-in lamma o y cy okines
TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17, which we e dec eased in skin samples om
mice ea ed wi h MGMG-A o MGDG ac ion. On he o he hand, IL-10 is
conside ed an an i-in lamma o y cy okine because i inhibi s he T cells
and mac ophages p o-in lamma o y cy okine p oduc ion (Gegina e al.,
2016). Ou da a showed no lowe signi ican le els o IL-10 in mice
ea ed wi h he ace one-dissol ed glycolipids in compa ison wi h ha
in TPA g oup, sugges ing a lowe ole o his cy okine in he immune
esponse by MGMG-A o MGDG.
A e examining he p e en i e e ec s o he compound MGMG-A and
ac ion MGDG ob ained om I. galbana, we aimed o op imize he
pe mea ion beha iou o hese subs ances wi h espec o p e iously
ace one-dissol ed p epa a ions. In he skin diseases, such as pso iasis,
local opical deli e y can be imp o ed by ollowing wo main app oaches.
Fi s ly, he adequa e choice o o mula ion can op imize he local
a ge ing. Secondly, he physicochemical pa ame e s o he d ug i sel ,
such as lipophilici y, can a ec he deg ee o deli e y as well.
104
Conce ning o he adequa e choice o ca ie composi ion, di e en
o mula ions, including hyd ophilic gel, c eam and oin men we e
p epa ed and analyzed. Fo hese s udies, a luo escen hyd ophobic
ma ke such as hodamine 6G, wi h an oil/wa e pa i ion coe icien o
2.62 was added, as a model d ug (Wang e al., 2012). The in i o CLSM
s udy de ined he c eam as he bes ehicle o dig deepe in he skin
p ese ing he en i y o di e en issue laye s. This may be assigned
o he ac ha he su ac an -like p ope ies o his he e ogeneous
dispe se sys em could enhance he amoun pe mea ed o hodamine 6G. On
he o he hand, con ol solu ion using e hanol as sol en and
hyd oalcoholic Ca bopol® gels, exhibi ed also high d ug pe mea ion. This
could be also a ibu ed o he p esence o e hanol in he o mula ion,
which was used as solubilize and pe mea ion enhance . On he con a y,
he deposi ion o he luo opho e om lipid oin men on o he skin was
e y low. This would be asc ibed o he hyd ophobic na u e o he
ehicle, being insoluble, which did no pene a e h ough he skin and
emained on o he skin su ace, as isualized in igu e 3.
Usually, he pe mea ion pa hway ac oss he SC esides in he
in e cellula lipid domains. Con e sely, a he iable epide mis le el,
he luo opho e is no es ic ed o he cell memb anes only, bu also
accumula es in he cy osol. In his s udy, a ela ionship be ween
lipophilici y o he applied o mula ion on he accumula ion o he
luo opho e in SC and iable epide mis was obse ed. Al hough he
luo escen label was applied on o he SC o mice, only low ela i e
accumula ion in he deepe laye s o he skin was obse ed o he mos
lipophilic ehicle, he oin men . This can be explained since he lipid
lamellae cons i u e only a small egion o he SC compa ed o he
co neocy es. Howe e , he adjacen iable epide mis is much mo e b igh ly
s ained han SC in samples om he hodamine-loaded c eam and hyd ogel
o mula ions, because in his laye he label can dis ibu e h oughou
he en i e epide mis, which esul s in a b igh e appea ance (Agga wal
e al., 2012).
Once selec ed he c eam o u he s udies, an ex i o pe mea ion
p ocess was planned o compa ison MGDG-loaded c eam wi h MGDG e e ence
solu ion and Dex c eam. This co icoid was selec ed o being he mos
used d ug in he pso iasis ea men . In his s udy, he pe mea ion
h ough mice excised skin was de e mined using F anz di usion appa a us
and degassed absolu e e hanol. Since he goal o his s udy was o ind
he expe imen al condi ions ha allowed a as and accu a e me hod o
e alua e he pe meabili y p ope ies o di e en o mula ions ac oss
he skin, we decided o use e hanol as sol en o ming he ecei ing
105
compa men because he assayed molecules (MGDG and Dex) a e eely
soluble in his medium. This sol en has been used o analyzing he
skin di usion kine ic o o he molecules, such as α- ocophe ol ace a e
(Mahamongkol e al., 2005). Howe e , he use o his sol en has he
po en ial o ex ac lipids om he SC and o a i icially inc ease he
skin pe meabili y. Since all he o mula ions es ed in hese expe imen s
had e hanol as pene a ion enhance in e ac ing wi h skin cons i uen s
o inc ease d ug flux, his would no a ec he ela i e esul s.
MGDG and Dex om he h ee o mula ions we e de ec ed in he ecei e
medium in a ime-dependen and cumula i e amoun pe mea ed cu es we e
plo ed. Conce ning MGDG c eam espec o MGDG e hanolic solu ion, he
di e ence in he pe meabili y pe cen age may be a ibu ed o he
su ac an -like p ope ies o emulsion componen s and hei a ini y o
he phospholipids o he skin memb ane (Williams and Ba y, 2012). A
common mechanism o ac ion o su ac an s as pene a ion enhance s
in ol es i s ly a “push” e ec o inc ease he d ug solubili y and
hence o c ea e a high concen a ion g adien . Secondly, a “pull” e ec
is ela ed o he lux o he pe mea ion enhance h ough he skin,
which can induce skin s uc u al ans o ma ions (Puglia and Bonina,
2008).
On he o he hand, indings om ou s udy indica e ha he c eam
exe ed he bes e ec in inc easing skin pe mea ion o MGDG compa ed
o Dex, in which he pe mea ed amoun was lowe (15 % ± 3.1). In
acco dance o ano he s udies (Wang e al., 2004), his beha iou can
be a ibu ed o lowe pa i ion coe icien o his molecule (logP
1.83) wi h espec o MGDG (Ma échal e al., 1994). The in e ac ion o
he d ug be ween wa e and oil phase can de e mine he ex en o lowe ing
o he he modynamic ac i i y in ex e nal phase, which is in con ac
wi h he skin. Pa i ioning o he d ug in o in e nal oily phase (highe
logP) is due o hyd ophobic cha ac e is ic o he d ug. Being bo h
molecules highly lipophilic subs ances, he ex emely slow pe mea ion
o Dex om he emulsion h ough he mice skin can be explained by he
ac ha di usion o d ug h ough oily phase is he limi ing s ep o
d ug pe mea ion (G ams e al., 2003).
An impo an conside a ion in pso iasis is he skin condi ion.
Topical o mula ions may be applied ei he o opened lesions ha ha e
los SC ba ie p ope ies o o hickened lesions ha ep esen an
addi ional ba ie o abso p ion (Ga nie T, 2002). Thus, ou indings
sugges ha a hyd ophilic ehicle (c eam) could be an in e es ing
al e na i e o imp o ed opical deli e y o MGDG in bo h condi ions.
106
Based on he esul s abo e, we selec ed he ac ion MGDG om I.
galbana, and elabo a ed a c eam wi h MGDG o e alua e i s e ec s on a
second TPA-induced hype plasia model in mice. In his expe imen al model,
TPA was applied 1 h be o e he adminis a ion o MGDG-con aining c eam
o ensu e he co ec abso p ion o he p oduc as well as inc ease i s
pe mea ion and p o ec he lipid in eg i y. Ou da a showed ha do sal
applica ion o TPA caused simila mani es a ions o hose de ec ed in
he p e ious model. Consis en ly wi h he an i-in lamma o y ac i i y o
glycolipids, p e- ea men wi h MGDG-c eam amelio a ed mac oscopic
cu aneous lesions induced by epe i i e applica ion o TPA, which was
co ela ed wi h he his ological no maliza ion o epide mal.
In e es ingly, he educ ion o skin edema and MPO ac i i y we e highe
wi h MGDG-c eam han hose de ec ed in he compound dissol ed in ace one,
eaching simila le els o hose o he e e ence co icos e oid Dex.
I has been shown ha opical applica ion o TPA ac i a es
in acellula ansduc ion signals, enhancing abe an exp ession o
COX-2 in mouse skin (Kundu e al., 2009; Passos e al., 2013). To u he
elucida e he mechanisms o he an i-in lamma o y ole o MGDG-c eam
in damaged skin, we de ec ed his p o ein exp ession by
immunohis ochemis y. The esul s e idenced ha p e- ea men wi h
MGDG-c eam ma kedly a enua ed COX-2 exp ession in TPA-s imula ed mouse
skin, eaching simila le els o Dex. These indings, a leas pa ly,
sugges ha supp ession o COX-2 exp ession may be in ol ed in he
p e en i e e ec o his glycolipid ac ion on TPA-induced epide mal
hype plasia.
In conclusion, ou s udy demons a es o he i s ime he
p e en i e e ec s o opical adminis a ion o he glycolipid MGMG-A
o a ac ion MGDG om I. galbana, in he in lamma o y model o TPA-
induced skin hype plasia. These ac ions may be associa ed wi h a
educ ion o edema, leucocy e in il a ion, p oin lamma o y cy okines
p oduc ion and COX-2 exp ession in skin mouse. Topical applica ion o
MGDG-c eam enhanced he sample pe meabili y and consequen ly
signi ican ly inc eased he p e en i e e ec s o his p oduc . Fu u e
s udies a e needed o expand he ision o he mechanisms by which hese
lipid p oduc s imp o e skin in lamma ion and will suppo hei po en ial
use in he de elopmen o e ec i e he apeu ic s a egies o skin
pa hologies as pso iasis.
Con lic s o in e es
The au ho s ha e no con lic o in e es o decla e.
107
Acknowledgmen
This s udy was suppo ed by g an s om Minis e io de Economía y
Compe i i idad MICIIN INNPACTO-IPT-2012-1370-060000 and Conseje ía de
Inno ación, Ciencia y Emp esa-Jun a de Andalucía POLFANAT-P12-AGR-430.
The au ho s hank “Cen o de In es igación, Tecnología e Inno ación” o
he Uni e si y o Se ille o p o iding echnical assis ance.
The au ho s’ con ibu ions a e ollows: MC. T., E.T., V. M. and J. A-R
designed he s udy p o ocol; C. DLR., pe o med chemical
cha ac e iza ion o glycolipids om I. galbana; A. R-L., J. A-R. and
E. T., conduc ed he in i o and his ological expe imen s and analysed
he da a; A. R-L. and ML. G-R execu ed echnologic expe imen s; A. R-
L., E. T., J. A-R., V. M. and ML. G-R w o e he d a o he manusc ip .
All he au ho s c i ically e iewed and app o ed he inal e sion o
he manusc ip . None o he au ho s has any con lic s o in e es o
decla e.
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e adecanoylpho bol 13-ace a e (TPA)-induced hype plasia model in mice,
which mimics pso ia ic pa ame e s in do sal mu ine skin, and in he UVB-
induced e y hema model in hai less mice, which ep oduces he
consequences expec ed in humans ecei ing acu e UVB adia ion. He ein,
we epo ed he in i o an i-in lamma o y and pho op o ec i e e ec s
o FX. In addi ion, he p e- ea men wi h he FX-loaded galenic
p epa a ion e ec i ely amelio a ed TPA-induced hype plasia by
dec easing skin edema, epide mal hickness, MPO ac i i y and COX-2
exp ession le els. Mo eo e , we showed ha FX educed UVB-induced
e y hema in mice ho ough down- egula ion o COX-2 and iNOS p o ein
exp essions as well as up- egula ion o he an i-oxidan heme oxygenase
1 (HO-1) p o ein le els h ough nuclea ac o E2- ela ed ac o 2 (N -
2) signalling pa hway.
MATERIALS AND METHODS
Ma e ials
D ied biomass de i ed om cul u e o he mic oalgae I. galbana
was p o ided by he Depa men o Bio echnology o he Ins i u o
Tecnológico de Cana ias (35119 San a Lucía, G an Cana ia, Cana y Islands,
Spain). The ex ac ion o he d ied biomass o I. galbana and s uc u al
de e mina ion o FX was de eloped by he Depa men o O ganic Chemis y
o he Cadiz Uni e si y.
Cell cul u e
The THP-1 human monocy ic leukemia cell line and HaCaT human
ke a inocy es we e ob ained om he Ame ican Type Cul u e Collec ion
(ATCC, USA). THP-1 cells we e cul u ed in RPMI 1640 medium (GIBCO, G and
Island, NY) con aining 10% hea -inac i a ed e al bo ine se um (FBS),
100 U/mL penicillin and 100 μg/mL s ep omycin. HaCaT human ke a inocy es
we e main ained in high glucose Dulbecco’s modi ied Eagle’s medium (DMEM,
GIBCO, G and Island, NY) wi h he same p opo ion o compounds (Aoki-
119
Yoshida e al., 2013). Bo h cell lines we e g own in a humidi ied
a mosphe e con aining 5% CO2 a 37 ºC.
Cell iabili y assay
Sul o hodamine B (SRB) assay was used o de e mining he iabili y
o THP-1 mac ophages and HaCaT cells upon exposu e o FX (Skehan e al.,
1990). Fi s ly, o di e en ia ion in o mac ophages, THP-1 cells (104
cells/well) we e incuba ed wi h pho bol 12-my is a e 13-ace a e (PMA,
Sigma-Ald ich, S . Louis, MO) (0.2 µM) o 72 h in 96-well pla es and
HaCaT cells we e seeded in o 96-well pla es in he g ow h medium (104
cells/well) o 24 h o ensu e he adhe ence. A e ha , cells we e
ea ed wi h FX a inal concen a ions ange o 10-100 µM in DMSO 0.1%
( / ) and he cy o oxici y was measu ed a e 24, 48 and 72 h o
incuba ion. The abso bance was de e mined a 492 nm in a mic opla e
spec opho ome e (Sine gy HT, Bio ek®, Bad F ied ichshall, Ge many).
De e mina ion o TNF-α p oduc ion
THP-1 monocy es we e di e en ia ed in o mac ophages in 96-well
pla es (104 cells/well). Then, cells we e incuba ed o 1 h wi h FX (10,
30 and 50 µM). The posi i e e e ence compound used was dexame hasone
(Dex) (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO) (1 µM). In lamma o y esponse was
induced by addi ion o lipopolysaccha ide (LPS, 1 μg/mL) excep o
con ol g oup. A e 24 h, comme cial enzyme-linked immunoso ben assay
(ELISA) ki (Diaclone GEN-PROBE, F ance) was used o quan i y TNF-α
acco ding o he manu ac u e ’s p o ocol.
De e mina ion o IL-6 and IL-8 p oduc ion
HaCaT cells we e seeded in 6-well pla es (5x105 cells/well). A e
24 h, cells we e washed wice (PBS, 4 ºC) and medium was added con aining
FX (10, 30 and 50 μM) o Dex (1 μM) as e e ence compound, o 1 h.
Then, cells we e s imula ed wi h TNF-α (10 ng/mL) excep o con ol
g oup. A e 24 h, comme cial enzyme-linked immunoso ben assay (ELISA)
ki (Diaclone GEN-PROBE, F ance) was used o quan i y IL-6 and IL-8
acco ding o he manu ac u e ’s p o ocol.
UVB i adia ion o HaCaT Ke a inocy es
Human ke a inocy es we e exposed o UVB adia ion as p e iously
desc ibed (Huang e al., 2010). B ie ly, he cells we e g own o
con luence and we e ea ed wi h di e en concen a ions o FX (10, 30
and 50 µM) o 1 h. Then, medium was emo ed and a hin laye o PBS was
120
added. Cells we e exposed o a single dose o UVB adia ion (50 mJ/cm2)
o 1 min. The UVB sou ce was a CL-1000M UV C osslinke (UVP, Upland,
CA, USA), which was used o deli e an ene gy spec um o UVB ligh
(280-315 nm; peak in ensi y, 302 nm). A e UVB i adia ion, he cells
we e supplied wi h esh comple e medium and incuba ed o 24 h.
Analysis o in acellula LDH ac i i y
The measu e o cy osolic enzyme lac a e dehyd ogenase (LDH) is one
o he commonly used me hods o assessing loss o cellula memb ane
in eg i y. Assay is based on he con e sion o lac a e o py u a e in
he p esence o LDH wi h he consequence oxida ion o NADH as p e iously
desc ibed (Ve huls e al., 1998). HaCaT cells we e seeded in 6-well
pla es (5x105 cells/well). A e 24 h, cells we e ea ed wi h FX (10,
30 and 50 μM) o 1 h and hen, we e i adia ed wi h UVB. A e 24 h,
ee-cells supe na an s and cell lysa es we e mixed in a 96-well pla e
and he abso bance was ead by using a mic opla e eade sys em (Sine gy
HT, Bio ek®, Bad F ied ichshall, Ge many). LDH leakage was es ima ed
calcula ing he LDH ac i i y in he cell- ee medium and LDH ac i i y
in lysa es a io. Resul s we e ep esen ed as he pe cen age (%) o
change in ac i i y compa ed wi h he con ol cells.
In acellula ROS sca enging ac i i y
Fo quan i ica ion o ROS in HaCaT cells, he dichlo o luo escein
diace a e (DCF-DA) assay was employed (Wang and Joseph, 1999). HaCaT
cells we e seeded in 96-well pla es (104 cells/well). Non-i adia ed
cells we e used as nega i e con ol. A e 24 h, cells we e ea ed wi h
FX (10, 30 and 50 µM) o 1h and hen, we e exposed o UVB. Pos
i adia ion, cells we e incuba ed wi h 2’,7’-dichlo odihyd o luo escein
diace a e (DCFH-DA) solu ion (5 mg/mL) in PBS o 30 min. The
luo escence o he 2’,7’-dichlo o luo escein (DCF) p oduc was
de e mined using a luo escence pla e eade (Sine gy HT, Bio ek®, Bad
F ied ichshall, Ge many) a 485 nm o exci a ion and 535 nm o
emission.
De e mina ion o IL-6 p oduc ion in UVB-exposed HaCaT ke a inocy es
HaCaT cells (5x105 cells/well) we e seeded in 6-well pla es and
allowed o a ach . A e 24 h, cells we e ea ed wi h FX (10, 20 and
50 μM) o 1 h and hen, we e exposed o UVB. A e 24 h, supe na an
luids we e collec ed and ELISA ki (Diaclone GEN-PROBE, F ance) was
employed o quan i y IL-6 acco ding o he manu ac u e ’s p o ocol. The
121
abso bance a 450 nm was ead by a mic opla e eade (Labysys em
Mul iskan EX, The mo Scien i ic, NY, USA).
P epa a ion o opical o mula ions
Topical c eams con aining 3 mg/g o d ug (be a-ca o ene (β-Ca o ),
FX o Dex) we e p epa ed using a e y simple p epa a ion me hod o
Oil/Wa e (O/W) emulsion. β-Ca o was employed as e e ence compound
because o i s s uc u al simila i y wi h FX. The d ug was dissol ed in
absolu e e hanol (10 mg/mL) and hen was added o an excipien cold
mix u e composed o Cap ylic/Cap ic T iglyce ides, Glycol S ea a e,
Polye hylene glycol (PEG)-3 Glyce yl Cocoa e and S ea e h-7, which was
p e iously hea ed up o 50ºC o imp o e he d ug in e posi ion. The
p epa a ion was hen mixed and s i ed un il o ob ain a homogeneous
semisolid o mula ion.
Lipophilic oin men was p epa ed using a adi ional p epa a ion
me hod o semisolid o mula ions combining bo h he mel emulsi ica ion
and s i ing. In b ie , a i s po ion o he oily phase, consis ing
o B ij® 72 (5 % w/w) and whi e so pa a in (77.3 % w/w) we e blended
unde gen le s i ing in a wa e ba h a 70 °C ollowing he addi ion
o liquid pa a in (5 % w/w) and α- ocophe ol (0.002 % w/w) un il
comple e in e posi ion a 60 °C. Then, β-Ca o dissol ed in e hanol (10
mg/mL) was added o he mix u e. The aqueous phase was p epa ed by adding
wo solu ions o EDTA (0.0065 % w/w) and disodium phospha e dihyd a e
(0.026 % w/w) p epa ed wi h dis illed wa e a 60 °C d opwise o he
lipid phase, wi h mode a e magne ic s i ing a 150 pm o 20 minu es
un il a homogeneous semisolid o mula ion was ob ained.
Fo p epa ing he hyd ophilic gel, Ca bopol 934P (1% w/ ) was soaked in
wa e o 2 h and hen dispe sed by s i ing a 500 pm (IKA) o ob ain
a smoo h dispe sion. A e he dispe sion was allowed o s and, β-Ca o
solu ion in e hanol absolu e (10 mg/mL) was g adually added o he
polyme dispe sion unde magne ic s i ing. A his s age,
ie hanolamine was added o he p epa a ion wi h slow- a e s i ing.
The p esence o e hanol in he p epa a ion makes ha no addi ional
p ese a i e is equi ed. The o mula ions we e kep in acuum o e nigh
in o de o escape any en apped ai in he gel base.
In i o pe mea ion s udies om opical o mula ions
In i o d ug pe mea ion s udies om he opical o mula ions
we e pe o med using a F anz di usion cell appa a us (SES-Gmgh Analyses
sys em, Ge many), wi h 14,5 mL ecep o olume and 3,14 cm2 di usion
a ea.
122
An app op ia ely condi ioned egene a ed cellulose ni a e
memb ane (Tu yn®; Pall Co po a ion, Po Washing on, NY, USA)
imp egna ed wi h lau yl alcohol (memb ane weigh inc ease 90–110%) was
used as a ificial lipophilic memb ane simula ing he epide mal ba ie
(Mu a e al., 1993; Maes elli e al., 2005). The memb ane was placed
in he di usion cell sandwiching he dono and ecep o compa men s.
The ecei e solu ion con ained absolu e e hanol and he dono chambe
was filled wi h 1 g o o mula ion (c eam, oin men o hyd ogel). The
whole di usion cell was he mos a ed main aining he empe a u e a
32ºC. The amoun o all he o mula ions was equi alen o 3 g o β-
Ca o , FX o Dex. Aliquo s o 0,5 mL we e wi hd awn om he ecep o
chambe a e 0.5, 1, 1.5, 2 and 3 h and eplaced by esh e hanol. The
concen a ions o β-Ca o and Dex we e spec ome ically assayed a 454
nm and 254 nm (UV/ is 1601 Shimadzu), espec i ely. The FX con en in
he e hanol solu ions was analyzed by using HPLC me hod. The co ec ion
o he cumula i e dilu ion was calcula ed. FX analysis was pe o med
on a Hi achi Eli e Lach on HPLC sys em equipped wi h a L-2130 isoc a ic
pump, a diode a ay de ec o L-2455 and a L-2200 au osample . Sepa a ion
was ca ied ou wi hin a ch oma og aphic C18 column (Me ck, RP-18
Lich oCART® 150 mm × 4 mm, 5 µm). Fo d ug analysis, he injec ion olume
was 10 mL, and he flow a e and column empe a u e was se a 1.0 mL/min
and 25 ºC, espec i ely. The mobile phase consis ed o A ( o mic acid
0.1%) and B (ace oni ile). The elu ion p og am was: 6 min isoc a ic a
90% B, ollowed by a g adien o 100% B a 10 min. A e wa ds, he column
was e-equilib a ed du ing 5 min a 90% B.
The cumula i e amoun s o pe mea ed d ug pe uni a ea in he
ecei e chambe (µg/cm2) we e plo ed as a unc ion o ime (h). The
slope o he linea po ion o he plo was p esen ed as s eady s a e
flux (Jss, µg/cm2/h). F om he pe mea ion p o iles, he AUC (a ea unde
he d ug pe mea ion cu e) was calcula ed using he apezoidal ule as
a quan i a i e pa ame e o s udying he pe mea ion magni ude (Ci i
e al., 2015).
Animals
Female Swiss CD-1 mice (25-30 g) we e pu chased om Jan ie -Labs
(Le Genes S Isle, F ance) and emale SKH-1 hai less mice (18-20 g)
om Cha les Ri e Labo a o ies (F ance). Mice we e main ained on a
s anda d condi ions ( empe a u e o 24–25°C, humidi y o 70-75% and 12
h ligh -12 h da k cycle) and we e allowed ee access o a s anda d die
(Panlab) and wa e ad libi um. All s udies we e pe o med in acco dance
123
wi h he ecommenda ions o he Eu opean Union ega ding animal
expe imen a ion (Di ec i e o he Eu opean Council 2010/63/EU). The
expe imen s ollowed p o ocols app o ed by he Animal E hics Commi ee
o he Uni e si y o Se ille.
TPA-induced epide mal hype plasia model and ea men s
Female Swiss CD-1 mice (n = 10 pe g oup) we e used o s udy he
e ec o FX om I. galbana on TPA-induced hype plasia in do sal mice
skin (And és e al., 2013). B ie ly, he do sal hai o animals was
emo ed wi h an elec ic clippe and ea ed wi h depila o y c eam
(Deliplus, Ba celona, Spain) and 24 h la e , he animals we e assigned
o he di e en g oups: Sham (100 mg o c eam wi h 0.2% o e hanol),
TPA (20 µl o e hanol con aining 2 nmol o TPA pe si e), TPA-C eam (100
mg o c eam and 2 nmol o TPA, dissol ed in 20 µl o e hanol), Dex (100
mg pe si e, equi alen a 200 µg o compound dissol ed in e hanol) and
FX-c eam o mula ion (100 mg pe si e, con aining 200 µg o FX dissol ed
in e hanol a 10 µg/µl) we e applied on he do sal skin in an a ea o 1
cm2 by using a sy inge, du ing 2 days be o e he hype plasia induc ion.
Day 4, TPA was opically applied o he same a eas. A e 1 h, FX-c eam,
Dex o ehicle we e adminis e ed ollowing he men ioned p o ocol. This
p ocedu e was epea ed du ing wo consecu i e days (Fig. 1).
A e 24 h o he las TPA do sal applica ion (day 7), mice we e
sac i ied by ce ical disloca ion. Edema was assessed by punch biopsies
om he ea ed do sal skin. Skin pieces we e ixed in 4 % bu e ed
pa a o maldehyde o his ological s udies. O he pieces we e ozen in
liquid ni ogen o measu emen o biochemical pa ame e s.
Figu e 1: Expe imen al se ing o he TPA-induced epide mal hype plasia model
in mice and ea men g oups. TPA, 12-O- e adecanoylpho bol-13-ace a e; Dex,
dexame hasone; FX, Fucoxan hin; E OH, e hanol.
UVB-induced e y hema in hai less mice
124
Female SKH-1 hai less mice (n = 8 pe g oup) we e used o s udy
he e ec o FX om I. galbana on UVB-induced e y hema. Animals we e
p e- ea ed wi h β-ca o ene-c eam (100 mg pe si e, con aining 200 µg
o β-ca o ene dissol ed in e hanol a 10 µg/µl) as e e ence con ol and
FX-c eam o mula ion (100 mg pe si e, con aining 200 µg o FX dissol ed
in e hanol a 10 µg/µl) o ehicle (c eam wi h a compa able olume o
e hanol) (Fig. 2). Sham con ol mice we e ea ed opically wi h c eam
ehicle. The o mula ions we e applied on he do sal skin (1 cm2/a ea)
by using a sy inge, and s a ing 2 days be o e i adia ion. On day 3,
30 min a e applica ion o he subs ances, mice we e exposed o an
acu e UVB dose (360 mJ/cm2) as p e iously desc ibed (Si e ol e al.,
2015). 48 h a e UVB exposu e, mice we e mac oscopically e alua ed and
sac i iced. A his end-poin ime, a p onounced UVB-induced cu aneous
in lamma ion was shown (J Duncan, 2009).
Figu e 2: Expe imen al se ing o he o UVB-induced acu e e y hema model in
hai less mice and ea men g oups. β-ca o , βe a-ca o ene; FX, Fucoxan hin;
E OH, e hanol; UVB, ul a iole B.
De ma oscope measu es
Do sal skin was mac oscopically examined e e y day by using a
mul i-de ma oscope (De ma oscope MDS 800, Mic ocaya, Bilbao, Spain).
Co neome e ® was used o de e mina e he hyd a ion in he s a um co neum
h ough elec ical capaci ance o he skin su ace (Ha u a-Ono e al.,
2012). Cu ome e ® p obe was used as suc ion me hod o analyse he eal
elas ici y o skin (Nishimo i Y., Edwa ds C., Pea se A., Ma sumo o K.,
Kawai M., 2001). In he las s ep, Mexame e ® was employed o analyse
he edness skin by melanin index (Wang e al., 2001). E e y day, do sal
skin mice was assessed wice and inally he esul s we e exp essed in
a bi a y uni s (a. u.) o by a melanin index scale (1-36).
125
His ological s udy
The samples we e ixed in pa a o maldehyde, dehyd a ed by
inc easing concen a ions o e hanol and embedded in pa a in. Fo
haema oxylin and eosin s ains, issue sec ions we e cu a 7 μm on a
o a y mic o ome (Leica Mic osys ems, Ge many), moun ed on slides,
depa a inized wi h xylene, ehyd a ed h ough g aded alcohols and
s ained acco ding o s anda d p o ocols. All issue sec ions we e
examined unde an Olympus BH-2 mic oscope (GMI Inc., MIN, USA) o
de e mina ion o his opa hological changes. Epide mal hickness was
measu ed by using Scien i ic Imaging Sys ems (Biopho onics ImageJ
Analysis So wa e; Na ional Ins i u es o Heal h, USA).
MPO ac i i y
Fo acu e in lamma o y models, he measu emen o myelope oxidase
(MPO) ac i i y was used as a ma ke o neu ophil in il a ion (G isham
e al., 1990). The issue was hawed, weighed and homogenised in en
olumes o 50 mM-PBS (pH 7.4). Then, he homogena e was cen i uged a
20,000 g o 20 min a 4 °C and he pelle was again homogenized in en
olumes o 50 mM-PBS (pH 6) con aining hexadecyl ime hylammonium
b omide (0.5 %) and 10 mM-EDTA. This homogena e was subjec ed o one
cycle o eezing/ hawing and sonica ed. The homogena e samples (50 µl)
we e added o 96-well mic opla e and incuba ed a 37 °C o 3 min wi h
a measu emen mix (o-dianisidine dihyd ochlo ide (0.067 %), hexadecyl
ime hyl-ammonium b omide (0.5 %) and 0.3 mM-H2O2). The changes in
abso bance we e moni o ized a 450 nm wi h a mic opla e eade
(Labysys em Mul iskan EX, The mo Scien i ic, NY, USA). MPO ac i i y uni
was de ined as he amoun o enzyme p esen ha p oduced a change in
abso bance o 1.0 uni /min a 37 °C in he inal eac ion olume
con aining ace a e. Resul s a e exp essed as uni s/mg issue.
Immunohis ochemical analysis
COX-2 was measu ed by immunohis ochemical analysis by using a
s ep a idin-bio in-pe oxidase me hod (Tale o e al., 2011). Pa a in-
embedded do sal skin sec ions (7 µm) we e moun ed on slides,
depa a inized wi h xylene and ehyd a ed h ough g aded alcohols. These
sec ions we e boiled (10 mM ci a e bu e (pH 6.0) o 3 min) o
an igen e ie al, ollowed by cooling a oom empe a u e o 20 min.
Endogenous pe oxidase was quenched wi h 0.3 % ( / ) hyd ogen pe oxide
o 20 min and he sec ions we e washed (PBS, 10 min). To minimize he
non-speci ic adso p ion he sec ions we e incuba ed in no mal ho se se um
(Vec as ain Ki ; Vec o Labo a o ies, Bu lingame, CA) o 20 min.
126
A e wa ds, slides we e incuba ed wi h abbi polyclonal an i-COX-2
an ibody (Cayman Chemical, MICH, USA) (1:300) o e nigh a 4 ºC. Then,
he samples we e ea ed wi h an i-mouse IgG an ibody. A e 30 min he
cells we e incuba ed wi h he s ep a idin–pe oxidase complex o 30
min, a oom empe a u e (Vec as ain Ki ; Vec o Labo a o ies, CA, USA).
The enzyma ic ac i i ies we e de eloped wi h 3,3´-diaminobenzidine
(DAB), and he sec ions we e coun e s ained wi h hema oxylin. Nega i e
con ol sec ions we e ea ed in he same way, omi ing he p ima y
an ibody. To examine COX-2 immuno eac i i y, he mic oscope Olympus BX61
was used (Olympus Op ical Co. L d. Tokyo, Japan). The quan i ica ion o
immunohis ochemical da a was done by coun ing he numbe o immunos ained
cells as pe cen o o al epide mal cells om en mic oscopic ields
o immunos ained issues pe animal.
Wes e n Blo Assay
F ozen do sal skin issues om UVB-induced e y hema model we e
andomly selec ed (6 pe g oup), weighed and homogenized in ice-cold
bu e (50 mM T is-HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl2, 5 mM e hylene glycol bis (2-
aminoe hyl e he )-N,N,N’,N’- e a ace ic acid, 0.5 mM EDTA, 0.01 mg/mL
leupep in, 0.01 mg/mL peps a in, 0.01 mg/mL ap o inin, 1 mM
phenylme hylsul onyl luo ide, and 250 mM NaCl). The homogena es we e
cen i uged (12,000 g, 15 min, 4ºC), and he supe na an s we e collec ed
and s o ed a -80ºC. To de e mina e he p o ein concen a ion o he
homogena es was used he B ad o d colo ime ic me hod (B ad o d, 1976).
Samples o he supe na an s wi h equal amoun s o p o ein (25 μg) we e
sepa a ed on 10 % ac ylamide gel by sodium dodecyl sul a e polyac ylamide
gel elec opho esis. Then, he p o eins we e elec opho e ically
ans e ed on o a ni ocellulose memb ane and incuba ed wi h speci ic
p ima y an ibodies: abbi an i-iNOS (1:1000; S essgen-Enzo Li e
Sciences, Fa mingdale, USA); abbi an i-COX-2 (1:3000; Cayman Chemical,
Michigan, USA); abbi an i-N 2, abbi an i-HO-1 (1:1000Cell
Signaling, Dan e s, MA, USA) o e nigh a 4ºC. A e ising, he
memb anes we e incuba ed wi h he ho se adish pe oxidase-linked (HRP)
seconda y an ibody an i- abbi (Cayman Chemical®, Ann A bo , MI, USA)
(1:1000) o an i-mouse (Dako®, A lan a, GA, USA) (1:1000) con aining
blocking solu ion o 1 h a oom empe a u e. To p o e equal loading,
he blo s we e analyzed o β-ac in exp ession using an an i-β-ac in
an ibody (Sigma Ald ich®, MO, USA). Immunode ec ion was pe o med using
an enhanced chemiluminescence ligh -de ec ing ki (Supe Signal Wes Pico
Chemiluminescen Subs a e, Pie ce, IL, USA). Then, he immunosignals
we e moni o ized by using LAS-3000 Imaging Sys em (Fuji ilm Image Reade ,
127
USA) and densi ome ic da a we e s udied a e no maliza ion o he
con ol (housekeeping gene). The signals we e analyzed and quan i ied
wi h a Scien i ic Imaging Sys ems (Biopho onics ImageJ Analysis
So wa e, Na ional Ins i u e o Men al Heal h, Be hesda, MD, USA) and
exp essed as pe cen age espec o sham con ol g oup.
S a is ical Analysis
All alues in he igu es and ex a e exp essed as a i hme ic
means ± SEM. Da a we e e alua ed wi h G aphPad P ism e sion 5.00
so wa e (G aphPad So wa e, Inc., San Diego, CA, USA). In all cases,
he Shapi o-Wilk es was used o e i y he no mali y o he da a. The
Mann-Whi ney U- es was chosen o non-pa ame ic alues. The pa ame ic
alues g oups we e analyzed by one-way analysis o a iance (ANOVA)
ollowed by Bon e oni’s Mul iple Compa ison Tes . P alues < 0.05 we e
conside ed s a is ically signi ican .
RESULTS
E ec s o FX on TNF-α p oduc ion in LPS-s imula ed THP-1 mac ophages
and IL-6 and IL-8 p oduc ion in TNF-α-s imula ed HaCaT human
ke a inocy es.
The an i-in lamma o y e ec o FX was assayed in bo h THP-1
mac ophages and human ke a inocy es. As shown in igu e 1, all
concen a ions es ed signi ican ly educed he p oduc ion o
in lamma o y cy okines in bo h cell models. In e es ingly, he p e-
ea men wi h he ca o enoid a 50 µM showed a signi ican educ ion
o he TNF-α p oduc ion in LPS-s imula ed THP-1 mac ophages, eaching
alues simila o Dex (P < 0.001) (Fig. 3a). In ela ion o IL-6 and IL-
8 p oduc ion in HaCaT ke a inocy es, simila esul s we e exhibi ed in
cells p e ea ed wi h he highes dose o FX (P < 0.001) (Fig. 3b-c).
Figu e 3. E ec s o Fucoxan hin (FX) om I. galbana on p o-in lamma o y
cy okines p oduc ion in THP-1 mac ophages and HaCaT ke a inocy es. (a) Tumo
nec osis ac o alpha (TNF-α) in LPS-s imula ed THP-1 mac ophages. (b)