Recuperación de la actividad de disparo en neuronas axotomizadas mediante implante de tejido nervioso embrionario

20 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 24 ORIGINAL Recupe ación de la ac i idad de dispa o en neu onas axo omizadas median e implan e de ejido ne ioso emb iona io Reco e y o he discha ge ac i i y o axo omized neu ons by he implan o emb yonic ne ous issue Depa amen o de Fisiología y Biología Animal Bení ez-Temiño B. Facul ad de Biología Pas o Lo o A. M. Se illa Rod íguez de la C uz R. M.ª RESUMEN El obje i o undamen al del p esen e abajo ha sido de- e mina si las al e aciones del dispa o p oducidas po una lesión neu onal, como la axo omía, pueden e e i as la eine ación de una nue a diana, p o is a median e implan e de ejido ne ioso emb iona io. Pa a ello, se seccionó el as- cículo longi udinal medial en ga os adul os, lo que p odujo la axo omía de las neu onas in e nuclea es del núcleo del mo- o ocula ex e no, y se p ocedió a implan a p imo dio ce- ebeloso en el si io de lesión. Median e écnicas mo ológicas y isiológicas ob u imos los siguien es esul ados: i) el im- plan e se in eg ó en el oncoencé alo adul o y se desa olló como un ce ebelo no mal, con lóbulos, es capas en la co - eza y los ipos celula es ap opiados; ii) los axones secciona- dos de las neu onas in e nuclea es in adie on el implan e, ami icándose y es ableciendo con ac os sináp icos en las es capas del ce ebelo implan ado; iii) las al e aciones elec o i- siológicas p oducidas po la axo omía en las neu onas in e - nuclea es (como disminución de la ecuencia de dispa o y pé dida de las señales oculomo o as) e i ie on hacia la no - malidad. Po an o, es os da os indican que el implan e de e- jido ne ioso emb iona io consigue esca a uncionalmen- e a las neu onas axo omizadas del huésped, p obablemen e como esul ado del es ablecimien o de conexiones sináp i- cas con es a nue a diana. Palab as cla e: T ansplan e neu onal, axo omía, núcleo del mo- o ocula ex e no, egis o eléc ico uni a io, inmunoci oquí- mica, mic oscopía elec ónica. Bení ez-Temiño B, Pas o Lo o A M, Rod íguez de la C uz R M.ª Recupe ación de la ac i idad de dispa o en neu onas axo omizadas median e implan e de ejido ne ioso emb iona io Map e Medicina, 2002; 13: 20-29 Co espondencia: Rosa Rod íguez de la C uz Depa amen o de Fisiología y Biología Animal Facul ad de Biología A da. Reina Me cedes, 6 41012-Se illa E-mail: [email p o ec ed] ABSTRACT The p esen wo k has been aimed a de e mining whe - he he i ing al e a ions induced by a neu onal inju y, such as axo omy, can be e e ed by he einne a ion o a new a ge , p o ided by he implan o emb yonic ne ous issue. Fo his pu pose, we sec ioned he medial longi udinal asci- cle in adul ca s o axo omize he abducens in e nuclea neu- ons, and hen implan ed p imo dium o emb yonic ce ebe- llum a he lesion si e. By mo phological and physiological echniques we ob ained he ollowing esul s: i) he implan in eg a ed and de eloped in he adul b ains em as a no mal ce ebellum, wi h lobes, h ee laye s in he co ex and he ap- p op ia e cellula ypes; ii) he sec ioned axons o abducens in e nuclea neu ons in aded he implan , whe e hey ami- ied and es ablished synap ic con ac s in he h ee laye s o he implan ed ce ebellum; iii) he elec ophysiological al e- a ions p oduced by axo omy in abducens in e nuclea neu- ons (such as a educ ion in i ing a e and a loss o eye- e- la ed signals) eco e ed owa d no mali y. The e o e, hese da a indica e ha he implan o emb yonic ne ous issue is able o unc ionally escue he axo omized neu ons o he hos , p obably as a esul o he ees ablishmen o synap ic connec ions wi h his new a ge . Key wo ds: Neu onal ansplan , axo omy, abducens nucleus, single-uni eco dings, immunocy ochemis y, elec on mic os- copy. Bení ez-Temiño B, Pas o Lo o A M, Rod íguez de la C uz R M.ª Reco e y o he discha ge ac i i y o axo omized neu ons by he implan o emb yonic ne ous issue Map e Medicina, 2002; 13: 20-29 Fecha de ecepción: 10 de ene o de 2001 INTRODUCCIÓN La eo ía ó ica de las conexiones neu onales pos ula que las neu onas dependen del con ac o con sus células pos sináp icas (o células diana) pa- a su supe i encia así como pa a la exp esión adecuada de sus p opiedades mo o uncionales (1). La dependencia de las neu onas po su diana es máxima en los es adios emb iona io y pos na- al emp ano, de mane a que cualquie manipu- lación expe imen al que in e umpa la conexión de una neu ona con su diana se aduce en mue - e celula e óg ada (1-4). Pa ece que son señales molecula es, los llamados ac o es neu o ó icos, los mediado es de es a in luencia e óg ada (1, 5, 6). Los ac o es neu o ó icos son p o eínas p o- ducidas po las células pos sináp icas; as su unión a ecep o es especí icos en los e minales de la célula p esináp ica, es as moléculas iajan e óg adamen e a lo la go del axón has a llega al soma, donde ponen en ma cha odo un p o- g ama gené ico que, en de ini i a, supone la ex- p esión del eno ipo no mal de la neu ona p esi- náp ica (7, 8). Sin emba go, en el sis ema ne ioso adul o la si uación es algo di e en e. Así, en mamí e os adul os se ha comp obado que la ablación de las células diana no conlle a mue e celula e óg a- da, aunque p oduce al e aciones es uc u ales y uncionales que indican que la dependencia ó i- ca aún es á p esen e (9-12). Po ejemplo, las neu- onas sep ales p esen an una disminución del a- maño somá ico y de la sín esis de enzimas elacionados con la neu o ansmisión as la des- ucción de su diana hipocampal (12). Neu onas p emo o as del sis ema oculomo o su en una e- ducción de la ecuencia de dispa o de po encia- les de acción y una pé dida de las señales de po- sición y elocidad ocula as la pé dida de la conexión con sus mo oneu onas diana, ealizada bien po eliminación selec i a de las mo oneu o- nas (9, 10), o bien po la sección de sus axones, es o es, po axo omía (13). El obje i o del p esen e abajo ha sido de e - mina si neu onas axo omizadas pueden ecupe- a sus p opiedades de dispa o cuando se les a- cili a la eine ación de una nue a diana. Pa a ello se p e ende p o ee de diana a los axones sec- cionados de neu onas del sis ema ne ioso cen- al median e el implan e de ejido ne ioso em- b iona io, ya que se a a de un sus a o a o able pa a el c ecimien o axonal y una uen e impo - an e de ac o es neu o ó icos (14). El modelo ex- pe imen al que se u ilizó ue el sis ema oculomo- o del ga o, del que se conoce bas an e bien su ana omía y isiología (15-17). En conc e o, se u i- lizó la p oyección de las neu onas in e nuclea es del núcleo del mo o ocula ex e no (NMOE) so- b e las mo oneu onas del ec o in e no si uadas en el núcleo del mo o ocula común (NMOC). Los axones de es as neu onas cu san po el ascículo longi udinal medial (FLM) con ala e al hacia su diana en el NMOC. Po an o, se ealizó la axo o- mía de las neu onas in e nuclea es del NMOE me- dian e la sección del FLM y se implan ó ejido em- b iona io (ex aído del p imo dio ce ebeloso) en el si io de la lesión pa a a e igua si es as neu o- nas son suscep ibles de egene a cuando el sus- a o de c ecimien o es adecuado y de ecupe a sus p opiedades de dispa o as la eine ación. MATERIAL Y MÉTODOS Se u iliza on es ga os adul os de 2-3 kg de pe- so. Todos los p ocedimien os expe imen ales se ealiza on de acue do con las di ec i as de la Unión Eu opea (86/609/EU) y a la legislación es- pañola ac ual que egula el uso y cuidado de los animales de labo a o io (BOE 67/8509-12, 1988). Axo omía e implan e de ejido emb iona io Bajo anes esia gene al (pen oba bi al sódico, 35 mg/kg, i.p.), se colocó al animal en un apa a o es e eo áxico. T as ab i una en ana de 6x6 mm en el hueso occipi al, se seccionó el FLM bila e- almen e u ilizando una mic ocuchilla de 3 mm de ancho. La sección de ambos ascículos se ealizó a ni el del ce o es e eo áxico, jus o caudal al nú- cleo oclea , 5 mm os al al NMOE (18). A con i- nuación se p ocedió a implan a el ejido emb io- na io en el si io de la lesión u ilizando una je inga Hamil on (Figu a 1). El implan e consis ió en 1,5 µl de p imo dio ce ebeloso que ue on inyec ados en cada ascículo. Los emb iones de 15 días (E15) se ex aje on median e cesá ea y se man u ie on en medio HBSS (Hank’s Balanced Sal Solu ion). Bajo mi- c oscopía en campana de lujo lamina se aisla on y disocia on mecánicamen e los p imo dios ce e- belosos. P epa ación de los animales pa a el egis o c ónico T as la semana de ecupe ación, los animales se p epa a on pa a el egis o c ónico de la ac i i- Recupe ación de neu onas axo omizadas median e asplan e 25 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 21 dad eléc ica uni a ia en el NMOE y de los mo i- mien os ocula es. El p ocedimien o expe imen al se ha desc i o de alladamen e en abajos p e ios (10). B e emen e, bajo anes esia gene al (pen o- ba bi al sódico, 35 mg/kg, i.p.) los animales se im- plan a on con elec odos bipola es de es imula- ción en el sex o pa c aneal de ambos lados y en el FLM de echo a ni el del NMOC, pa a la iden i- icación median e ac i ación an id ómica de las mo oneu onas y neu onas in e nuclea es del NMOE (Figu a 1). Dos bobinas de ace o inoxida- ble se su u a on a las escle ó icas de ambos ojos pa a el egis o de los mo imien os ocula es, de acue do con la écnica del seguimien o elec o- magné ico de la posición ocula (19). Po úl imo, se cons uyó una cáma a de egis o con cemen- o den al al ededo del o i icio abie o en el hue- so occipi al. T as una semana de ecupe ación se inicia on las sesiones de egis o. La du amad e se eliminó y la cáma a de egis o se p o egió des- pués de cada sesión con silicona es é il y ce a de hueso a i icial. Du an e odo el pe íodo expe i- men al se u iliza on salino isiológico y an ibió i- cos pa a man ene la es e ilidad de la cáma a. Regis o ex acelula en el animal ale a Los animales, inmo ilizados median e enda- je, se ija on a la mesa de egis o en el cen o del campo elec omagné ico u ilizado pa a medi los mo imien os ocula es. Como elec odos de e- gis o se u iliza on mic opipe as de id io llenas de una solución de ClNa 2M. Con ayuda de un mic omanipulado , el elec odo se di igió hacia el NMOE, donde se ealiza on los egis os uni a ios en simul aneidad con el egis o de los mo imien- os ocula es (espon áneos e inducidos es ibula - men e median e o ación de la mesa al ededo del eje e ical). La ac i idad eléc ica neu onal, el mo imien o de la mesa y el de ambos ojos se almacena on en un o denado pa a su pos e io análisis. La e- cuencia de dispa o (FD) de es as neu onas co e- laciona con la posición (P) y la elocidad (V) ocu- la según la ecuación FD = F0+ k·P+ ·V, donde k y ep esen an la sensibilidad neu onal a la posi- ción y a la elocidad ocula , espec i amen e, y F0 es la ecuencia de dispa o en la posición ce o (mi- ada cen al) (16). Pa a el cálculo de es os pa á- me os se u ilizó el mé odo de la eg esión lineal múl iple en e la ecuencia de dispa o neu onal y la posición y elocidad ocula . Los da os ob eni- dos se compa a on es adís icamen e con da os de animales con oles y axo omizados de expe i- men os p e ios (13) ( es ANOVA). Ma caje an e óg ado con bioci ina y p ocesado pa a mic oscopía elec ónica T as inaliza las sesiones de egis o ( es me- ses), los animales se p epa a on pa a el ma caje an e óg ado de los axones seccionados de las neu onas in e nuclea es del NMOE, con el obje o de comp oba el g ado de c ecimien o axonal y de eine ación den o del asplan e. Pa a ello se B. Bení ez-Temiño, A. M. Pas o , R. M.ª Rod íguez de la C uz 22 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 26 Figu a 1. Diag ama expe imen al. En ojo se mues a la p oyección obje o de es udio: las neu onas in e nuclea es del núcleo del mo o ocula ex e no (NMOE) p oyec an a a és del ascículo longi udinal medial (FLM) con ala e al hacia el núcleo del mo o ocula común (NMOC), donde conec an con las mo oneu onas que ine an el músculo ec o in e no (RI). Es as neu onas se axo omiza on po sec- ción del FLM y en el si io de lesión se inyec ó el asplan- e de ce ebelo emb iona io. El diag ama ilus a ambién las mo oneu onas del NMOE cuyos axones o man el sex o pa c aneal (N. VI) e ine an el músculo ec o ex e no (RE). El e ce pa c aneal se indica como N. III. inyec ó bioci ina (al 3% en ampón T is-HCl 0,05 M, pH 7,6, y ClNa 0,05 M) como azado an e ó- g ado en ambos NMOEs (9, 20). El ma cado se inyec ó ion o o é icamen e aplicando pulsos po- si i os de 7 µA de co ien e du an e 30 minu os a a és de una mic opipe a de id io. T as 24 ho- as se p ocedió a pe undi ansca dialmen e al animal bajo anes esia p o unda (pen oba bi al só- dico, 50 mg/kg, i.p.), con salino isiológico segui- do de ijado compues o de 3% de pa a o mal- dehído y 1,25% de glu a aldehído en 0,1 M de ampón os a o, pH 7,4. El oncoencé alo se seccionó en co es sagi- ales con ayuda de un ib a omo. La bioci ina se e eló u ilizando el complejo A idina-Bio ina-Pe o- xidasa (Vec o Labs) seguido de una solución con diaminobenzidina al 0,05% y H2O2al 0,01%. T as el e elado, algunas secciones se p ocesa on pa a mic oscopía elec ónica. Así, as una pos ijación en e óxido de osmio al 1%, se iñe on en bloque con ace a o de u anilo al 2%, se deshid a a on y se incluye on en plano en esina. Los co es se analiza on, dibuja on y o og a ia on, as lo cual se ealiza on las secciones ul a inas pa a su pos- e io obse ación en un mic oscopio elec ónico. Técnica inmunoci oquímica Algunos co es se ese a on pa a el p ocesa- do con écnicas inmunoci oquímicas con a cal- bindina, una p o eína amponado a de calcio que ma ca las células de Pu kinje ce ebelosas (21). T as 45 minu os en una solución de bloqueo (sue- o no mal de cab a al 7% diluido en ampón T is- HCl 0,05 M, pH 7,4, con T i on X-100 al 0,1%), los co es se incuba on 12 ho as en el an icue po p i- ma io, un policlonal an i-calbindina de conejo di- luido 1:6000. T as a ios la ados, se man u ie on en el an icue po secunda io (inmunoglobulina G bio inilada de cab a con a conejo) du an e 90 mi- nu os. T as es e pe íodo se e ela on siguiendo un p ocedimien o simila al u ilizado en el caso de la bioci ina. Una ez inalizada la inción, los co - es se mon a on, deshid a a on y se cub ie on con esina de mon aje. RESULTADOS Axo omía de las neu onas in e nuclea es del NMOE La sección de los axones de las neu onas in- e nuclea es del NMOE se comp obó de es ma- ne as di e en es. En p ime luga , se obse a on los dé ici s oculomo o es ípicos de la o almople- jía in e nuclea an e io , un sínd ome que a ec a p incipalmen e a los mo imien os ho izon ales conjugados p o ocando incapacidad de adduc- ción (22, 23). En segundo luga , la ausencia de ac- i ación an id ómica en los egis os del NMOE as la es imulación eléc ica desde el elec odo si- uado en el FLM p óximo al NMOC ue una p ue- ba elec o isiológica de la in e upción del ascí- culo. En e ce luga , en los co es sagi ales de oncoencé alo se obse ó la sección comple a del FLM. Desa ollo del asplan e El examen his ológico mos ó que el ejido emb iona io se implan ó con éxi o en el luga de la lesión, alcanzando un olumen de unos 6 µl. El implan e se dis inguió ácilmen e del ejido ci - cundan e g acias a la es uc u a ce ebelosa que desa olló, a pesa de se un asplan e he e o ó- pico, es deci , si uado ue a de su localización na- u al. La inción inmunoci oquímica con a calbindi- na ma có especí icamen e las células de Pu kinje del ce ebelo asplan ado, lo que pe mi ió ca ac- e iza la es uc u a in ínseca del asplan e. Así, se comp obó que el ce ebelo asplan ado mos- ó una ana omía simila a la de un ce ebelo adul- o con la p esencia de lóbulos (co eza ce ebelo- sa) y una sus ancia blanca p o unda (Figu a 2A). Las células de Pu kinje mos a on la o denación de sus somas en una única capa, y se dis inguie- on las es capas ca ac e ís icas de un ce ebelo adul o: capa molecula , capa de las células de Pu - kinje y capa de las células de los g anos (Figu a 2A, C). La Figu a 2B ilus a el aspec o ípico de un ce ebelo con ol eñido inmunoci oquímicamen e con a calbindina; así se obse a el ma caje se- lec i o de las células de Pu kinje, la o denación de sus somas y la disposición plana de sus á boles dend í icos en la capa molecula . La Figu a 2C mues a el mismo ipo de inción ealizada en el asplan e, comp obándose el al o g ado de simi- li ud con la si uación con ol. Los axones de las cé- lulas de Pu kinje discu ie on po la sus ancia blanca del asplan e (Figu a 2C). Po úl imo, se dis inguie on células de g an amaño calbindina- inmunonega i as, odeadas de e minales calbin- dina-inmunoposi i os (posiblemen e p oceden es de las células de Pu kinje) y ag upadas en una de- e minada zona del implan e. Dichas células se ca- ac e iza on como neu onas de los núcleos p o- undos del ce ebelo. Recupe ación de neu onas axo omizadas median e asplan e 27 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 23 C ecimien o axonal y eine ación del asplan e El ma caje an e óg ado con bioci ina se u ilizó pa a e alua el g ado de ine ación del asplan- e. Los axones ma cados con bioci ina pene a on en el ce ebelo asplan ado, donde se ami ica on p o usamen e emi iendo amas cola e ales. En la Figu a 3A se ilus a una de es as ami icaciones e minales o mada a pa i del cabo dis al de un axón seccionado; en es e caso, el axón se ami i- có en la capa molecula y en la capa de las célu- las de Pu kinje. Es os eb o es axonales se ca ac- e iza on po la p esencia de eng osamien os a modo de bo ones sináp icos. Hubo ami icaciones axonales en las es capas del ce ebelo asplan- ado, aunque mayo i a iamen e se dis ibuye on en la capa de las células de los g anos y en la mo- lecula , con escasos e minales en la capa de las células de Pu kinje. Se obse ó que los axones que pene a on en el asplan e cu sa on, en ge- ne al, po la sus ancia blanca in ínseca al as- plan e, desde donde in adie on la capa de las cé- lulas de los g anos. Desde aquí, algunos axones con inua on hacia la capa molecula . No se ob- se ó ningún axón que pene a a di ec amen e en la capa molecula , o que as a a esa la ol ie a a la capa de las células de los g anos. Median e mic oscopia elec ónica se comp o- bó que es os eng osamien os e ec i amen e co- espondían a bo ones sináp icos. Se obse a on bo ones ma cados an o en la capa de las células de los g anos (Figu a 3B) como en la capa mole- cula (Figu a 3C). Es os bo ones es ablecie on si- napsis p e e en emen e del ipo axodend í ico con las neu onas del ansplan e. En ningún caso los axones ma cados o ma on ib as musgosas (con B. Bení ez-Temiño, A. M. Pas o , R. M.ª Rod íguez de la C uz 24 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 28 Figu a 2. Fo omic og a ías ilus ando secciones del ce e- belo implan ado e inmuno eñidas con a calbindina. El an- icue po ma ca especí icamen e las células de Pu kinje. Nó ese en (A) la p esencia de lóbulos y la delimi ación de co eza y sus ancia blanca, indicando que el ce ebelo im- plan ado desa olló una ci oa qui ec u a no mal. Las o o- mic og a ías en (B) y (C) mues an dos imágenes de co - eza ce ebelosa ob enidas de un ce ebelo con ol (B) y del implan e (C). Puede obse a se como el ce ebelo implan- ado desa olló las es capas ípicas de un ce ebelo adul- o: capa molecula (cM), capa de las células de Pu kinje (cCP) y capa de las células de los g anos (cG). SB indica sus ancia blanca. Figu a 3. C ecimien o axonal y eine ación del implan e. (A) Recons ucción a cáma a lúcida de una ama axónica e minal p oceden e de una neu ona in e nuclea del NMOE ma cada an e óg adamen e con bioci ina. Nó ese como as la axo omía, los cabos p oximales de los axo- nes c ecie on y se ami ica on den o del implan e. Los pe - iles de las células de Pu kinje se indican en el dibujo. Do sal y os al se indican como d y , espec i amen e. (B, C) Mic og a ías elec ónicas ilus ando dos bo ones ma - cados con bioci ina y localizados en la capa de la célula de los g anos (B) y en la capa molecula (C) del implan e. Las ba as de calib ación co esponden a 30 mm (A), 3 mm (B) y 1 mm (C). los ca ac e ís icos glomé ulos) ni ib as epado- as, que son las dos en adas ípicas al ce ebelo (24), sino que desa olla on una mo ología simi- la a la de la p oyección o iginal, es deci , sob e las mo oneu onas del NMOC (25). P opiedades de dispa o de las neu onas in e nuclea es del NMOE as el implan e Los egis os comenza on dos semanas des- pués de la ci ugía (axo omía e implan e) y se p o- longa on du an e es meses. Se egis ó la ac i- idad de dispa o de las neu onas in e nuclea es du an e mo imien os ocula es espon áneos e in- ducidos es ibula men e. En la si uación con ol, las neu onas in e nu- clea es p esen an una ecuencia de dispa o que co elaciona es echamen e con los mo imien os ocula es en el plano ho izon al (Figu a 4A). Como se ha desc i o p e iamen e (10, 16), es as neu o- nas son ónico- ásicas. Así, p esen an un desca - ga ónica p opo cional a la posición, con una asa de dispa o que inc emen a con sucesi as posi- ciones del ojo homola e al al si io de egis o en la di ección empo al, y dec emen a en la di ec- ción opues a. Igualmen e, p esen an una señal de elocidad: du an e mo imien os ocula es ápidos (sacádicos) en la di ección de ac i ación dispa an un b o e de po enciales de acción de al a ecuen- cia (Figu a 4A; línea e ical a azos), mien as que cesan el dispa o du an e sacádicos en la di ección de inac i ación (Figu a 4A; línea pun eada). La axo omía p oduce cambios no ables en el pa ón de dispa o de es as neu onas (13). La asa de dispa o de una neu ona axo omizada descien- de po debajo de los ni eles no males pa a cual- quie posición y elocidad del ojo (Figu a 4B). Además, hay una pé dida de las señales de posi- ción y elocidad ocula , de modo que las neu o- nas modulan menos en elación al mo imien o ocula . Po ejemplo, du an e los sacádicos en la di ección de ac i ación no apa ecen b o es de po- enciales de acción de al a ecuencia, sino an sólo un pequeño inc emen o en la ecuencia de dispa o (Figu a 4B; as e isco). Sin emba go, el im- plan e, que signi ica la p o isión de una nue a diana, supuso la ecupe ación de las p opiedades de dispa o. Así, las neu onas in e nuclea es e- gis adas en los expe imen os de axo omía e im- plan e p esen a on un pa ón de dispa o ónico- ásico simila al con ol, ol iendo a mos a una ue e modulación del dispa o en elación a los mo imien os ocula es (Figu a 4C). Se ecupe ó cla amen e la señal ásica pa a el mo imien o, con b o es ab up os (Figu a 4C; línea e ical a azos) y pausas (Figu a 4C; línea pun eada) según la di- ección del mo imien o, así como la asa de dis- pa o ónica p opia de cada posición. Pa a cuan i ica es os cambios, se calculó la sensibilidad neu onal a la posición (pa áme o k) y a la elocidad ocula (pa áme o ) en las dis in- as si uaciones: con ol, axo omía y axo omía más Recupe ación de neu onas axo omizadas median e asplan e 29 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 25 Figu a 4. Ac i idad de dispa o de es neu onas in e nu- clea es egis adas en el NMOE izquie do en la si uación con ol (A), 5 días as la axo omía (B) y 11 días as la axo- omía más implan e (C). Cada panel con iene, de a iba abajo, la posición ho izon al del ojo izquie do (HI), la del ojo de echo (HD) y la ecuencia de dispa o de la neu ona (FD). La FD de la neu ona con ol c eció p opo cionalmen- e con o me el ojo se si uó hacia la izquie da (I; di ección de ac i ación) y dec eció hacia la de echa (D). También mos ó una señal ásica, en o ma de b o es de po encia- les de acción de al a ecuencia du an e los mo imien os sacádicos en la di ección de ac i ación (línea e ical a a- zos) y una pausa pa a aquéllos en la di ección de inac i a- ción (línea pun eada). T as la axo omía (B) hubo una dis- minución gene al en la FD, desapa ecie on los b o es y, en su luga , sólo se obse ó un débil inc emen o en la FD (as- e isco). Sin emba go, el pa ón de dispa o se es ableció as p o ee a las neu onas axo omizadas de una nue a diana median e el implan e (C). Nó ese el aumen o gene- al de la FD y el es ablecimien o de los b o es (línea e i- cal a azos) y las pausas (línea pun eada) du an e los mo- imien os sacádicos. B. Bení ez-Temiño, A. M. Pas o , R. M.ª Rod íguez de la C uz 26 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 30 implan e. Es os pa áme os se ob u ie on, pa a cada neu ona, como los coe icien es de la eg e- sión lineal múl iple calculada en e la ecuencia de dispa o y la posición y la elocidad ocula ( e ecuación en Mé odos). Se compu a on es os pa- áme os an o du an e mo imien os ocula es es- pon áneos (pa áme os ksy s) como du an e aquellos inducidos es ibula men e, es deci , du- an e el e lejo es ibula (pa áme os k y ); los amaños de mues a a ia on en e 23 y 28. Du- an e mo imien os ocula es espon áneos, las neu- onas con oles mos a on un alo medio de ks de 6,4 ± 1,5 po enciales de acción/segundo/g ado (media ± des iación ípica) y un alo medio de s de 1,5 ± 0,5 po enciales de acción/segundo/g a- do/segundo (Tabla I). Es os alo es se eduje on en un 60% as la axo omía, siendo la di e encia signi ica i a espec o del con ol (p< 0,05; es ANOVA). Sin emba go, en el g upo de neu onas egis adas as el implan e se ob u ie on alo es de ksy s simila es a los con oles (Tabla I). Res- pec o del pa áme o F0( ecuencia de dispa o en la posición cen al) se ob u ie on esul ados simi- la es. Así, mien as en las neu onas con oles el alo medio de F0 ue de 62,2 ± 20,8 po enciales de acción/segundo, la axo omía p odujo una e- ducción signi ica i a (p< 0,05; es ANOVA) de es- e pa áme o, que e o nó a alo es no males as el implan e. Du an e el e lejo es íbulo-ocula , las neu onas axo omizadas mos a on al e aciones simila es a las desc i as du an e mo imien os ocu- la es espon áneos. Dichas al e aciones ambién se ecupe a on as el implan e (Tabla I). DISCUSIÓN Los expe imen os p esen es demues an que las p opiedades de dispa o de neu onas del sis- ema ne ioso cen al, al e adas como consecuen- cia de la axo omía, e ie en cuando se p omue- e la eine ación de una nue a diana median e implan e de ejido ne ioso emb iona io. En pa - icula , el asplan e de ce ebelo emb iona io u i- lizado mos ó un al o g ado de in eg ación y de- sa ollo den o del oncoencé alo del huésped, siendo in adido po los axones seccionados del ascículo, que con ac a on con las neu onas ans- plan adas. Po an o, es os da os sugie en que el es ablecimien o de conexiones sináp icas con una nue a diana desempeña un papel undamen al en la ecupe ación de las p opiedades de dispa o de neu onas axo omizadas, aun cuando la diana es dis in a a la o iginal. Di e enciación del asplan e Los implan es c ecie on ap oximadamen e al doble de su olumen o iginal, desa ollándose de o ma simila a un ce ebelo: lobulación de una co eza ce ebelosa con sus ancia blanca sepa an- do los lóbulos y un á ea al ma gen de es os ló- bulos que con iene células de g an amaño, que se iden i ica on como células de los núcleos p o- undos del ce ebelo. Además, la co eza desa o- lló la ípica es uc u a ilamina : capa de las célu- las de los g anos, capa de las células de Pu kinje y capa molecula (24). Las células de Pu kinje (iden i icadas po el ma caje inmunoci oquímico con a calbindina) se dispusie on en monocapa y con un á bol dend í ico plana . Todas es as ob- se aciones demues an el al o g ado de c eci- mien o y desa ollo alcanzado po el p imo dio ce- ebeloso asplan ado incluso ec ópicamen e. Es os da os e ue zan la idea de que el sis ema ne ioso cen al lesionado iene una al a capaci- dad de in eg a elemen os celula es a ípicos, co- mo han indicado abajos p e ios (14, 26). Po TABLA I. Va iaciones en la sensibilidad neu onal a los mo imien os ocula es as la axo omía y ecupe ación as la adición de una nue a diana G upo expe imen al Mo imien os espon áneos Re lejo es íbulo-ocula Sensibilidad a Sensibilidad a Sensibilidad a Sensibilidad a la posición (ks)la elocidad ( s)la posición (ks)la elocidad ( s) Con ol 6,4 ± 1,5*1,5 ± 0,5*19,4 ± 2,7*1,9 ± 1,0* Axo omía 2,6 ± 1,4* 0,6 ± 0,2* 14,5 ± 2,2* 0,9 ± 0,4* Axo omía + implan e 6,7 ± 0,9*1,7 ± 0,5*11,1 ± 5,6*2,5 ± 2,2* Los núme os co esponden al alo medio ± la des iación ípica. El núme o de neu onas analizadas en ca- da caso a ió en e 23 y 28. Los as e iscos indican di e encias signi ica i as con espec o al g upo con ol (p< 0,05; es ANOVA). ejemplo, se ha demos ado que cuando se as- plan a ce ebelo emb iona io en el ce ebelo del a- ón mu an e pcd (ca en e de sus células de Pu kin- je), se p oduce una mig ación selec i a de las células de Pu kinje desde el asplan e hacia el do- minio p opio en la co eza ce ebelosa del hués- ped, y además es as células de Pu kinje eciben a e encias de las ib as epado as del huésped, es ableciéndose sinapsis uncionales (27). Además del ce ebelo, o as es uc u as de ejido ne ioso emb iona io han sido ambién asplan adas con éxi o, como la médula espinal (28), el álamo (29), el hipocampo (30) o el es iado (31). C ecimien o de los axones en el implan e A di e encia del sis ema ne ioso pe i é ico, los axones seccionados en el sis ema ne ioso cen- al no mues an egene ación espon ánea. Se ha comp obado que, al menos en pa e, es a es- pues a di e encial se debe a la dis in a in luencia de las células gliales. Así, mien as que las células de Schwann del sis ema ne ioso pe i é ico p o- mue en el c ecimien o axonal as una lesión (32), las células gliales del sis ema ne ioso cen al (oli- godend oci os, as oci os y mic oglía) cons i uyen un sus a o inhibi o io pa a la egene ación (33). En el sis ema oculomo o se ha obse ado que los axones de las neu onas in e nuclea es del NMOE no a a iesan la cica iz glial o mada po as oci os y mic oglía en el si io de lesión (34). Sin emba go, en p esencia del implan e, es os axo- nes ue on capaces de egene a a a és de la le- sión, in adi el ejido asplan ado y c ece den o ami icándose en o ma de b o es axonales. P o- bablemen e, ac o es ó icos libe ados po el im- plan e ue on capaces de educi el e ec o inhibi- o io de la glía. De igual mane a, en una amplia a iedad de sis emas neu onales se ha comp o- bado que los implan es de ejido ne ioso em- b iona io es imulan el c ecimien o de los axones lesionados del huésped (28-31). También se comp obó que los axones que pe- ne a on el implan e emi ie on bo ones sináp icos que con ac a on con neu onas del ce ebelo as- plan ado. Las sinapsis ue on mayo i a iamen e axodend í icas y se dis ibuye on, en p opo ción simila , en la capa de las células de los g anos y en la molecula . Ninguno de los bo ones ma ca- dos apa eció o mando un glomé ulo, que es la o ma ípica en que acaban los e minales sináp- icos a e en es a la capa de las células de los g a- nos, y que se ca ac e izan po su g an amaño y po con ac a con múl iples elemen os pos sináp- icos (24). Po el con a io, los bo ones ma cados p esen a on una mo ología simila a la de los bo- ones que las neu onas in e nuclea es o man no - malmen e sob e las mo oneu onas del NMOC (25). O os au o es han encon ado, sin emba go, que la diana pos sináp ica in luencia sus ancialmen- e la o ma de los bo ones a e en es, en expe imen- os en que se induce la o mación de conexiones a ípicas (35). Aun en es os casos, de e minadas p opiedades de los bo ones pe sis en como in- ínsecas al elemen o p esináp ico (35, 36). Po ello, suge imos que el eno ipo sináp ico es á de- e minado po ac o es an o p esináp icos como pos sináp icos, y que dependiendo de cada cone- xión en pa icula , la in luencia p e- o pos sináp i- ca puede desempeña un papel p incipal. Recupe ación del dispa o neu onal El pa ón de dispa o, al e ado en las neu onas in e nuclea es del NMOE como consecuencia de la axo omía, ol ió a mos a ca ac e ís icas no - males cuando es as células, as su axo omía, con- siguie on es ablece conexiones sináp icas con una nue a diana. Las al e aciones de la ac i idad de dispa o desc i as as la axo omía e lejan, al menos en pa e, la e i ada de e minales sináp i- cos a e en es sob e las neu onas axo omizadas (34). Se ha mos ado p e iamen e que es a e i- ada de e minales a e en es se debe a la al a de ac o es neu o ó icos p oceden es de la diana como consecuencia de la in e upción del axón. Así, la adminis ación exógena de ac o de c eci- mien o ne ioso e ie e la dep esión en la ans- misión sináp ica y la pé dida de bo ones sináp i- cos que la axo omía p oduce en neu onas del ganglio ce ical supe io (37) y en mo oneu onas espinales (38). Po an o, la ecupe ación del pa- ón de dispa o (y, po an o, de las en adas si- náp icas) obse ada en las neu onas del NMOE as la eine ación del implan e posiblemen e se deba a la disponibilidad de ac o es neu o ó icos p oceden es de es a nue a diana. O o esul ado in e esan e se e ie e al hecho de que la ecupe ación del pa ón de dispa o se p odujo incluso cuando las neu onas axo omi- zadas eine a on una diana no na u al, es o es, ejido ce ebeloso en luga de mo oneu onas ocu- lomo o as. Es os da os indican ausencia de ees- peci icación en las p opiedades de dispa o po la nue a diana. De o ma simila , o os au o es han encon ado que mo oneu onas del hipogloso o - zadas a eine a el músculo o bicula is oculi en el modelo de anas omosis hipogloso- acial no ea- dap an su dispa o as la conexión con es a nue- a diana (39). También se ha comp obado que las Recupe ación de neu onas axo omizadas median e asplan e 31 MAPFRE MEDICINA, 2002; ol. 13, n.° 1 27 p opiedades eléc icas de mo oneu onas espina- les se ecupe an del es ado de axo omía as la e- gene ación de los axones mo o es en la piel (40). Sin emba go, o os au o es han encon ado e i- dencias de eespeci icación de las p opiedades eléc icas dependiendo de la diana pos sináp ica. Así, expe imen os de ine ación c uzada de un músculo len o po un ne io mo o ásico mues- an cambios en las p opiedades elec o isiológicas de la mo oneu ona (como elocidad de conduc- ción axonal, esis encia de en ada y ca ac e ís icas de la pos hipe pola ización) que indican in luen- cia po el músculo ine ado (41). En conjun o, o- dos es os da os hacen di ícil gene aliza ace ca del papel egulado de la diana sob e las p opiedades de dispa o de las neu onas a e en es. De nue o, pa ece que hay de e minados sis emas en los que la nue a diana es capaz de modi ica e óg ada- men e p opiedades elec o isiológicas, mien as que en o os sis emas no ocu e al eespeci ica- ción. Es a espues a di e encial pod ía explica se en unción de si los ac o es neu o ó icos (u o as señales molecula es) sin e izados po la nue a diana son simila es o no a los de la diana o iginal y, po an o, ienen la capacidad o no de modi i- ca la exp esión no mal de los canales iónicos en la memb ana de la neu ona ine an e. Ag adecimien os Es e abajo ha sido posible g acias a la inan- ciación ecibida po la Fundación MAPFRE Medi- cina. Los au o es ambién desean ag adece al Se icio de Mic oscopía Elec ónica de la Uni e - sidad de Se illa po el uso de sus ins alaciones. BIBLIOGRAFÍA 11. PURVES D. Body and B ain. A ophic heo y o neu- al connec ions. Camb idge: Ha a d Uni e si y P ess, 1990; 1.ª ed. 12. CLARKE P G H. Neu on dea h in he de eloping a ian is hmo-op ic nucleus, and i s ela ion o he es ablish- men o unc ional ci cui y. J Neu obiol, 1992; 23: 1140-1158. 13. KUAN C-Y, ROTH K A, FLAVELL R A, RAKIC P. Mecha- nims o p og ammed cell dea h in he de eloping b ain. T ends Neu osci, 2000; 23: 291-297. 14. OPPENHEIM R W. Cell dea h du ing de elopmen o he ne ous sys em. Annu Re Neu osci, 1991; 14: 453-501. 15. BARDE Y-A. T ophic ac o s and neu onal su i al. Neu on, 1989; 2: 1525-1534. 16. LEVI-MONTALCINI R. De elopmen al neu obiology and he na u al his o y o ne e g ow h ac o . 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