Uso de N-acetilcisteína para proteger a los peces de la intoxicación por Cilindrospermopsina

ES 2 402 477 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 402 477 Número de solicitud: 201101162 51 Int. CI.: A61K 31/198 (2006.01) A23K 1/18 (2006.01) A23K 1/16 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: USO DE N-ACETILCISTEÍNA PARA PROTEGER A LOS PECES DE LA INTOXICACIÓN POR CILINDROSPERMOPSINA. 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (50.0%) OTRI-PABELLÓN DE BRASIL, PASEO DE LAS DELICIAS S/N 41012 SEVILLA (Sevilla) ES y UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA (50.0%) 72 Inventor/es: CAMEÁN FERNÁNDEZ, Ana María; GUTIÉRREZ PRAENA, Daniel; JOS GALLEGO, Ángeles Mencía; PICHARDO SÁNCHEZ, Silvia; MORENO NAVARRO, Isabel; PRIETO ORTEGA, Ana Isabel; PUERTO RODRÍGUEZ, María; GUZMÁN GUILLÉN, Remedios; MOYANO SALVAGO, Mª Rosario y BLANCO RODRÍGUEZ, Alfonso 74 Agente/Representante: GONZÁLEZ CARVAJAL, Ramón 22 Fecha de presentación: 20.10.2011 43 Fecha de publicación de la solicitud: 06.05.2013 Fecha de la concesión: 04.03.2014 45 Fecha de publicación de la concesión: 11.03.2014 57 Resumen: La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende N-acetilcisteína (NAC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: Uso de N-acetilcisteína para proteger a los peces de la intoxicación por Cilindrospermopsina 5 1O La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende Nacetilcisteína (NAC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR 15 La NAC, derivado acetilado del aminoácido antioxidante que contiene grupos tiol. L-cisteína, es un conocido 20 25 Las aplicaciones de la NAC se basan en que puede actuar frente al estrés oxidativo por diferentes caminos. Es un precursor de la síntesis de GSH actuando como proveedor de cisteína y estimulando la actividad de las enzimas citosólicas involucradas en el ciclo del GSH, tales como Glutatión reductasa (GR), que aumenta la tasa de regeneración de GSH. Por otro lado, in vivo e in vitro actúa directamente, a través de su grupo tiol, sobre diferentes especies reactivas de oxígeno (ROS) tales como ácido hipocloroso, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno (Aruoma 0.1. et al. (1989) Free Rad. Biol. Med. 6:593-597). 30 35 Se ha descrito que la inyección de NAC mejora el estado redox de GSH en el hígado de anguilas (A. anguil/a) intoxicadas con organofosforados (diclorvos), incrementando su tolerancia al estrés oxidativo y la necrosis provocadas por ingest~ de pesticidas, particularmente en el caso de organofosforados o piretroides (ES2249167 A1). En el campo de las cianotoxinas, su uso queda restringido a su actividad protectora frente al estrés oxidativo y la reversión de las lesiones histopatológicas inducidas por microcistinas (MCs) en peces (W02010061018 -A1, Caméan Fernández A, et al., 201 O) ES 2 402 477 A1  2 ES 2 402 477 B1 DESCRIPCIÓN 5 10 15 20 25 30 35 Por otro lado, la CYN es una toxina producida por cianobacterias tóxicas presentes en aguas superficiales, pertenecientes al menos a seis géneros, siendo las especies identificadas en los momentos actuales Cylindrospermopsis raciborskii, Anabaena bergii, Aphanizomenon ova/isporun, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia natans, y Raphidiopsis curvata, entre otras. CYN se aisló por primer vez de un cultivo de Cylindrospermopsis raciborskii, obtenido de los reservorios de agua de bebida que surtían a la población de Palm lsland, Queensland, Australia (Ohtani l. et al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 144:7941-7942), Se ha comprobado su acumulación en peces y crustáceos, afectando a la calidad y seguridad de este tipo de alimentos y suponiendo un riesgo potencial para el consumidor. En comparación con los mamíferos, los estudios sobre efectos tóxicos de CYN en peces son muy escasos, destacando que puede afectar no sólo al hígado sino también al riñón, corazón, branquias, y tracto gastrointestinal. Las cianobacterias constituyen parte de la dieta de diversos ciprinídos y cíclidos, como es el caso, por ejemplo, de las Tilapias (Orechromis, sp.). La Tilapia (Oreochromis sp.) es uno de los pescados que más rápidamente se ha introducido en acuicultura, por la facilidad que presenta su manejo, gran capacidad de adaptación a condiciones adversas y fácil reproducción; sus distintas variedades son filtradoras y consumidoras de cianobacterias y en Europa se está despertando un gran interés por su cultivo. Como mecanismo de acción tóxica más aceptado, la CYN está considerada un citotoxina general que bloquea la síntesis de proteínas en células eucariotas de mamíferos y plantas (Terao K., et al, (1994) Toxican 32:833843; Runnegar M.T. et al. (1995) Biochem. Pharmacol. 49:219-225) y disminuye los contenidos de Glutation (GSH). La disminución de GSH no parece conllevar a un incremento del estrés oxidativo en la célula, sugiriéndose que no es un mecanismo primario de la toxicidad de CYN. Sin embargo, recientemente, se ha comprobado la participación directa del estrés oxidativo en la patogénesis de CYN en peces (Gutierrez-Praena D. et al. (2011) Aquat. Tox. 105:100-106; Puerto M. et al., (2011) Ecotoxicology, aceptado, en prensa), detectándose un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), lipoperoxidación (LPO) y oxidación de P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  3 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 proteínas, así como cambios en la actividad de diversas enzimas antioxidantes en peces. Los escasos estudios toxicológicos realizados hasta la actualidad han conducido al establecimiento de una lngesta Diaria Tolerable (IDT) provisional de 0,03 ¡Jg/Kg/día de CYN, y la propuesta de un valor guía provisional de 1 ¡Jg/L de CYN en aguas de bebida. Actualmente no existe un tratamiento antidótico específico en casos de intoxicación por CYN y sus epímeros procedentes de cianobacterias. Hasta la fecha no se conoce ningún tratamiento capaz de recuperar a los humanos, mamíferos y peces intoxicados con CYN. Teniendo en cuenta la ubicuidad de esta toxina, se hace necesario recuperar peces que presenten alteraciones histopatológicas con diferentes niveles de afección, que pueden impedir el ciclo de vida normal de los peces afectados. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende NAC para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. En tilapias (Oreochromis sp.) expuestas a dosis únicas y repetidas de CYN se inducen estrés oxidativo y alteraciones patológicas. En concreto, se han comprobado variaciones dosis-dependiente en la actividad de diversas enzimas antioxidantes, disminución de los niveles de Glutatión (GSH), aumento de los niveles de lipoperoxidación (LPO), de oxidación de proteínas y del ADN, en diferentes órganos (hígado, riñón), y múltiples alteraciones histopatológicas en órganos diversos como hígado, riñón, corazón, tracto gastrointestinal y branquias. La NAC administrada en esta invención se muestra efectiva manteniendo el estado de salud del pez, previniendo daños causados por la toxina y/o mejorando los efectos tóxicos inducidos por CYN en diversos órganos de tilapias intoxicadas. Además, el uso de NAC como aditivo alimentario no sólo mejora los niveles de GSH en hígado y riñón, sino que por su propia actividad antioxidante es P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  4 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 capaz de disminuir la lipoperoxidación (LPO) (hígado, riñón), la oxidación de proteínas en riñón inducida por CYN, y recuperar las lesiones histopatológicas inducidas en múltiples órganos como hígado, riñón, corazón, tracto gastrointestinal y branquias. En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende NAC para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. NAC es el derivado N-acetil del aminoácido L-cisteína. La NAC es el precursor del glutatión. El glutatión tiene un grupo tiol (sulfidrilo) que le confiere efectos antioxidantes por medio de la reducción de radicales libres. La composición de la presente invención comprende, al menos, NAC. El medicamento está compuesto, al menos, por la composición anterior. La NAC, sus sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) NAC. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc. El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención supone combatir los efectos tóxicos para estabilizar el estado de toxicidad de los individuos. El medicamento se emplea también para la prevención de los efectos tóxicos ocasionados a los peces expuestos a CYN. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  5 ES 2 402 477 B1 efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. En este caso, previamente a la intoxicación por CYN, los peces están protegidos por un aumento de las defensas antioxidantes producido por la acción de la NAC. El medicamento también se emplea para la recuperación de los efectos tóxicos ocasionados en 5 peces expuestos a CYN. El término "efectos tóxicos" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a la consecuencia derivada de la exposición del pez a la CYN, es decir, la aparición de diversos efectos adversos, como por ejemplo, un daño 1 O celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos, lo que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular. La CYN es una toxina de naturaleza alcaloide, en cuya estructura interviene un grupo tricíclico guanidinio unido a hidroximetiluracilo. Es producida por al menos 15 seis géneros de cianobacterias, que se encuentran ampliamente distribuida en aguas tropicales y subtropicales. Pueden existir dos posibles epímeros de forma natural, cilindrospermopsina (CYN) y 7-epicilindrospermopsina, ambos tóxicos; la completa pérdida del grupo uracilo elimina la toxicidad de CYN. En reservas naturales de agua se ha descrito otra variante, la 7 -desoxicilindrospermopsina, 20 cuya toxicidad apenas está establecida, siendo menos tóxica en ratón que CYN. Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de una composición que comprende N-acetilcisteína para la elaboración de un medicamento útil en la recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. El término 25 "recuperación" hace referencia a la desaparición de los efectos tóxicos causados por la intoxicación con CYN. Esta recuperación supone la reversión total de los daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta forma las funciones normales de los órganos afectados. 30 En una realización preferida de la presente invención, los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. El término "alteraciones histopatológicas" tal como se entiende en la presente invención son daños producidos en los tejidos biológicos del pez. Estos daños son detectados por medio del análisis a nivel microscópico de las estructuras patológicas de las diferentes muestras 35 obtenidas, sin excluir otras técnicas de detección. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  6 ES 2 402 477 B1 Una realización aún más preferida de la invención, es el uso donde las alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. Tal como se ha mencionado anteriormente, la CYN puede 5 acumularse en el tejido hepático y también puede llegar a otros órganos utilizando la sangre como medio de dispersión, de esta forma, la toxina puede causar efectos tóxicos y/o alteraciones histopatológicas en los citados órganos. La recuperación de los tejidos afectados por las alteraciones histopatológicas es un aspecto destacable de la presente invención ya que puede suponer la 1O curación de los peces cultivados, peces seleccionados por diversas características para la cría, peces de especies en peligro de extinción o cualquier otro tipo de pez que presente alteraciones histopatológicas en un grado reversible. 15 En otra realización más preferida de la presente invención, la NAC se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg por Kg de peso del pez. Esta administración se lleva a cabo durante al menos una semana. Preferiblemente la cantidad diaria incorporada a los peces es de entre 400 y 880 mg por Kg de peso (equivalentes a 22 y 45mgNAC/Kg/día). 20 Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, intramuscularmente o de forma subcutánea. Más preferiblemente se administra de forma oral o intraperitoneal. En otra realización más preferida 25 la composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral o intraperitoneal. Los peces intoxicados están expuestos a más de 10 ¡Jg CYN/L agua por día durante 14 días (intoxicación subcrónica). Preferiblemente los peces están 30 expuestos a más de 200 ¡Jg CYN/ kg de pez en exposición única. Otra realización preferida de la presente invención, comprende el uso de la compos1c1on anteriormente descrita que además incluye excipientes farmacológicamente aceptables. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  7 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la sustancia activa (en la presente invención, NAC), estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. El término "excipiente farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. En una realización más preferida de la invención, la composición comprende además otra sustancia activa. En cada caso la composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz. Otras realizaciones preferidas son el uso para la fabricación de un alimento funcional, el uso para la fabricación de un complemento vitamínico y otra más es el uso para la fabricación de un complemento nutricional. La NAC puede formar parte de un alimento funcional, complemento vitamínico, complemento nutricional o cualquiera de sus combinaciones. Tal como se entiende en la presente invención, un alimento funcional cumple una función específica como puede ser la de mejorar la salud de los peces. Para ello al alimento funcional se le puede agregar un complemento vitamínico y/o complemento nutricional. El alimento funcional, los complementos descritos o P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  8 ES 2 402 477 B1 cualquiera de sus combinaciones pueden administrarse junto con un pienso, formar parte de la composición del pienso o pueden administrarse de forma independiente. 5 En una realización preferida, de la presente invención, los peces son cultivados. Se entiende por "peces cultivados" aquellos peces criados en piscifactorías, charcas o cualquier contenedor de agua de cualquier tamaño que permita la cría de peces y/o el engorde. Los peces cultivados pueden ser, sin limitar, peces 1o destinados a la alimentación o a la cría de peces ornamentales. En otra realización preferida, de la presente invención, los peces pertenecen al género Oreochromis sp. 15 Los peces pertenecientes a este género se conocen como Tilapias. Las Tilapias crecen en aguas cálidas dulces o saladas y tienen pocas exigencias respiratorias, rápido crecimiento y facilidad para la puesta. Los peces se pueden seleccionar, sin limitarse, a la lista que comprende O. amphimelas, O. andersonii, O. angolensis, O. aureus, O. chungruruensis , O. esculentus, 20 O. hunteri, O. ismailiaensis, O. jipe, O. karomo, O. karongae, O. korogwe, O. Jepidurus, O. Jeucostictus, O. /ido/e, O. macrochir, O. malagarasi, O. mortimeri, O. mossambicus, O. mweruensis, O. niloticus (Nile tilapia), O. Pantani, O. pangani girigan, O. pangani pantani, O. p/acidus, O. placidus placidus, O. placidus ruvumae, O. rukwaensis, O. saka, O. salinicola, O. 25 schwebischi, O. shiranus, O. shiranus chilwae, O. shiranus shiranus, O. spi/urus, O. spi/urus niger, O. spilurus percivali, O. spi/urus spilurus, O. squamipinnis, O. tanganicae, O. upembae, O. urolepis, O. urolepis homorum, O. urolepis urolepis u O. variabilis. Más preferiblemente los peces pertenecen a la especie O. niloticus (Nile tilapia). 30 A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la 35 descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  9 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 En los peces a los que se les administró CYN junto con 45 mg NAC/pez/día se observó estructuralmente y ultraestructuralmente una morfología del parénquima renal totalmente normal (FIG. 5 G, H). A, 8: Riñón de los peces control. C, D: Histología de peces tratados con CYN. C. Detalle de parénquima renal con glomérulos atróficos (círculo) y dilatación de la capsula de 8owman (estrella). D. Microvellosidades de los túbulos contorneados proximales tumefactos y pérdida de dichas microvellosidades (flecha). E, F: Tilapias expuestas sólo a NAC (45 mg NAC/pez/día). E. Parénquima renal con glomérulo renal aparentemente normal. F. Detalle del túbulo contorneado proximal aparentemente normal. G, H: Histología del riñón de peces tratados con CYN+ NAC (45 mg NAC/pez/día) G. Glomérulos y túbulos con apariencia normal. H Membrana basal aparentemente normal. Ejemplo 4. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en corazón. El estudio histopatológico realizado sobre peces tratados con CYN mostraron estructuralmente a nivel de corazón un proceso de miofibrolisis, con pérdida de miofibrillas, presencia de edemas y hemorragias. Ultraestructuralmente se apreció claramente esta miofibrolisis de la fibra cardiaca, caracterizada por una pérdida de las miofibrillas (FIG. 6 C, D). El corazón de los peces del lote control presentó una estructura aparentemente normal (FIG. 6 A, 8). Los peces tratados solo con NAC (22 y 45 mg NAC/pez/dia) presentan una morfología de las fibras cardiacas similares a las del grupo control (FIG. 6 E, F). Los procesos degenerativos en corazón que se observaron en los peces tratados con CYN fueron mucho más leves en aquellos peces tratados con suplemento de NAC a la dosis más baja (22 mg NAC/pez/dia), observándose cierta pérdida de miofibrillas y ligeras hemorragias aisladas, de escaso interés (FIG. 6 G, H). No se observaron lesiones en los tratados con la dosis más elevada (45 mg NAC/pez/día) (FIG. 6 1, J). A, 8: Corazón de peces control. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  16 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 C, D: Histología del corazón de peces tratados con CYN. C. Miofibrolisis, pérdida de miofibrillas (círculo), ciertos edemas (estrella). D. Pérdida y desintegración de las miofibrillas (círculo). E, F: Corazón de peces tratados con NAC (dosis 45 mg NAC/pez/día) E. Detalle de corazón con fibras musculares aparentemente normal. F. Estructura de las miofibrillas prácticamente normal. G, H: Histología del corazón de peces tratados con CYN+NAC (22 mg NAC/pez/día) G. Detalle de miocardio con fibras musculares aparentemente normales pero con ciertas hemorragias (círculo). H. Detalle de miofibrillas con escasa pérdida de material contráctil (círculo). 1, J: Histología del corazón de peces tratados con CYN+NAC (45 mg NAC/pez/dia) l. Detalle de corazón con fibras musculares aparentemente normal. J. Detalle de miofibrillas aparentemente normal. Ejemplo 5. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en intestino. A nivel de intestino en los peces tratados con CYN se observaron lesiones, frente al lote control (FIG. 7 A, B), caracterizadas por un proceso de enteritis con necrosis de enterocitos, al microscopio óptico (FIG. 7C), y al microscopio electrónico, por una pérdida de microvellosidades muy manifiesta (FIG. 7D). Tras la administración de las dos dosis de NAC (22 y 45 mg NAC/pez/día, equivalentes a 400, 880 mg/kg) solo se observó una actividad manifiesta de las células caliciformes, sin interés patológico (FIG. 7 E, F). Los peces a los que se les administró NAC junto con la toxina CYN mostraron una protección con ambas dosis, con una estructura aparentemente normal cuando fueron observadas tanto al microscopio óptico como electrónico (FIG. 7 G, H). A, B: Intestino de peces control. A Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales. B. Enterocitos con abundantes microvellosidades aparentemente normales y células caliciformes. C, D: Histología de intestino de tilapias tratadas con CYN. C. Detalle de vellosidades intestinales con enterocitos necrosados (círculo) D. Alteración de los enterocitos con pérdida parcial de las microvellosidades (círculo). P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  17 ES 2 402 477 B1 5 E, F: Intestino de peces tratados con NAC (dosis 45 mg NAC/pez/día) E. Vellosidades aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). F. Enterocitos con abundantes microvellosidades (círculo). G, H: Intestino de Tilapias tratadas con CYN + NAC (45 mg NAC/pez/día) G. Detalle de vellosidades intestinales normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). J. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo) y células caliciformes aparentemente normales (flecha). 1o Ejemplo 6. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas branquias. en 15 Al microscopio óptico las branquias de los peces tratados con CYN presentaron, a nivel de las laminillas primarias y secundarias, procesos de hiperemia y pérdida de las prolongaciones !amelares (FIG. 8B). Estas lesiones no fueron observadas en el lote control, que presentó una morfología aparentemente normal (FIG. 8A). 20 En los lotes de peces tratados con CYN y ambas dosis de NAC se demuestra una recuperación de las lesiones provocadas (FIG. 8C). 25 Al microscopio electrónico de barrido (SEM) se observó una alteración de la morfología con pérdida de continuidad del arco branquial, y presencia de un infiltrado celular (FIG. 9C), y al microscopio de transmisión electrónica (TEM) se detectó una fuerte hiperemia de los capilares con presencia de células de infiltrado inflamatorio (FIG. 9D). Los peces del grupo control (FIG. 9 A, B) no presentaron anomalías. 30 Los peces tratados con CYN y ambas dosis de NAC (22 y 45 mg NAC/pez/dia, equivalentes a 400 y 800 mglkg de NAC, respectivamente) mostraron recuperación de las lesiones provocadas por la toxina, presentándose filamentos branquiales y arcos branquiales aparentemente normales (FIG 9 E, F). 35 FIG. 8 (Microscopia óptica) A: Branquias de peces control. B: Branquias de peces tratados con CYN. Detalle de filamento branquial con presencia de hiperemia en laminillas secundarias (circulo). P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  18 ES 2 402 477 B1 C: Branquias de peces tratados con NAC (45 mg NAC/pez/día). Detalle de filamento branquial aparentemente normal. D: Histología de branquias de peces tratados con CYN+NAC (22 y 45 mg NAC/pez/día) . Detalle de filamento branquial aparentemente normal. 5 FIG. 9 A, B: peces control. C, D: Branquias de peces tratados con CYN pura. C. Arco branquial con pérdida de continuidad, erosionado y presencia de un infiltrado celular (círculo). D. Detalle de laminilla con hiperemia de capilares (círculo). 1 O E, F: Branquias de peces tratados con CYN+NAC (45 mg NAC/pez/día, equivalente a 800 mg NAC/kg pez). E. Filamento branquial aparentemente normal. F. Arco branquial aparentemente normal. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  19 ES 2 402 477 B1 5 10 15 20 25 30 35 REIVINDICACIONES 1. Uso de una composición que comprende N-acetilcisteína para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de efectos tóxicos en peces expuestos a cilindrospermopsina. 2. Uso de una composición que comprende N-acetilcisteína para la elaboración de un medicamento útil en la recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a cilindrospermopsina. 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. 4. Uso según la reivindicación 3, donde las alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la N-acetilcisteína se administra en una cantidad diaria de entre 22 y 45 mg NAC/pez/día (equivalentes a 400 y 880 mg por Kg de peso del pez, respectivamente). 6. Uso según la reivindicación 5, donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral o intraperitoneal. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composición incluye excipientes farmacológicamente aceptables. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición comprende además otra sustancia activa. 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un alimento funcional. 1 O. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un complemento vitamínico. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  20 ES 2 402 477 B1 5 11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 O para la fabricación de un complemento nutricional. 12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde los peces son cultivados. 13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde los peces pertenecen al género Orechromis sp. P201101162 25-10-2011 ES 2 402 477 A1  21 ES 2 402 477 B1  ES 2 402 477 B1 22  ES 2 402 477 B1 23  ES 2 402 477 B1 24  ES 2 402 477 B1 25 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 201101162 CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K31/198 (2006.01) A23K1/18 (2006.01) A23K1/16 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A61K, A23K Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, INTERNET, BIOSIS, HCAPLUS Informe del Estado de la Técnica Página 2/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201101162 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 01.10.2012 Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-13 SI Reivindicaciones NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-13 SI Reivindicaciones NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Informe del Estado de la Técnica Página 3/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201101162 1. Documentos considerados.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 GUTIÉRREZ-PRAENA, D. et al. 2011 D02 GUTIÉRREZ-PRAENA, D. et al. 2011 D03 ES 2249167 A1 (CONSEJO SUPERIOR INVESTIGACION) 16.03.2006 D04 ES 2340012 A1 (UNIV SEVILLA) 27.05.2010 D05 RUNNEGAR, M. et al. 1995 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La invención se refiere, según las dos primeras reivindicaciones, al uso de una composición que comprende Nacetilcisteína (NAC) para la elaboración de un medicamento útil en la prevención, el tratamiento y la recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a cilindroespermopsina (CYN). Las reivindicaciones dependientes caracterizan la composición y los efectos tóxicos a los que se refieren las dos primeras reivindicaciones. Novedad y actividad inventiva (art. 6 y 8 de la ley de patentes) Los documentos D1 y D2 tratan de los efectos tóxicos que producen la cilindroespemopsina en peces. Los peces intoxicados con CYN presentan síntomas de estrés oxidativo como demuestran los biomarcadores estudiados: descenso en los niveles de glutatión (GSH), aumento de oxidación lipídica y protéica, aumento en los niveles de NADPH oxidasa, etc. También se detectan alteraciones histopatológicas en el hígado y en el riñón producidas por la exposición a CYN. En los documentos D3 y D4 se describe la utilización de composiciones que contienen NAC tanto para el tratamiento de peces que presentan estrés oxidativo como para aumentar la detoxificación celular de contaminantes como ciertos plaguicidas organofosforados y las microcistinas. La NAC es capaz de eliminar el estés oxidativo en am bos casos así como de recuperar las alteraciones histopatológicas de producidas por las microcistinas . La actuación de la NAC se realiza por diferentes caminos: por una lado funciona como antioxidante a través de su grupo tiol, pero además es un precursor de la síntesis de GSH como proveedor de cisteína y está involucrada en el ciclo del glutatión ya que activa la glutatión reductasa, responsable de la regeneración del GSH y la glutatión transferasa, involucrada en la detoxificación de gran número de contaminantes a través de la conjugación del tóxico con el GSH. El documento D5 estudia el efecto de La CYN en hepatocitos de rata. Según este documento, el descenso de GSH que se observa en los hepatocitos tratados con CYN se debe no tanto a su utilización del GSH en los hepatocitos (en la detoxificación con glutatión transferasa o en la oxidación del GSH a GSSG) como a la inhibición en su síntesis. De hecho, el aporte de NAC, no impide la caída de GSH ni los efectos tóxicos producidos por la CYN. Por tanto, s e considera que, si bien el estrés oxidativo ha sido tratado con composiciones que contienen NAC (documentos D3 yD4) y sería, por tanto, uno de las posibles medicamentos, disponibles para tratar el estrés oxidativo producido por CYN, no sería obvio para un experto en la materia, que dichas composiciones fuesen a eliminar o a prevenir el estrés oxidativo producido por la CNY. El único documento que describe el empleo de composiciones con NAC en intoxicación de hepatocitos de rata con CYN (D5) no logra evitar los efectos tóxicos que la CYN produce. En consecuencia, se considera que ningún documento describe ni sugiere el uso de una composición que contiene NAC para tratar ni prevenir los efectos tóxicos que producen la cilindroespermopsina (CYN) por lo que se considera que todas las reivindicaciones de la solicitud cumplen el requisito de novedad y de actividad inventiva. Informe del Estado de la Técnica Página 4/4