Estructura y estabilidad en plastocianinas de cianobacterias
Abstract
ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD EN PLASTOCIANINAS DE CIANOBACTERIAS La elucidación de los factores que determinan las diferencias en la termorresistencia en las proteínas de organismos termófilos respecto a sus homólogas de organismos mesófilos es un tema de elevado interés en relación a la ingeniería de proteínas. Cada familia proteica adopta mecanismos propios para adaptarse a las altas temperaturas. Las proteínas de cobre azul o cobre tipo-1 son de especial interés por la utilidad de las mismas en diversos procesos biotecnológicos. Entre ellas, la plastocianina constituye un modelo experimental excelente al estar constituida por un único dominio, que en las enzimas de interés industrial se encuentra duplicado o triplicado. En los últimos años se ha investigado en nuestro grupo las características estructurales que rigen la mayor estabilidad de la plastocianina de la cianobacteria termófila Phormidium laminosum respecto a su homóloga mesófila en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC6803, así como la distinta dependencia que los puntos de fusión que las dos proteínas muestran respecto al estado redox del metal. Análisis computacionales realizados indican que la región comprendida entre los residuos 39 y 65 determina las diferencias en la termoestabilidad entre ambas proteínas. Asimismo, sustituciones de aminoácidos en dicha región disminuyen la estabilidad de la proteína termorresistente y alteran la relación entre el estado redox del metal y el punto de fusión de la proteína. Sin embargo, se desconoce por qué los residuos situados en una región flexible (residuos 44 - 56) y distante del centro metálico modulan la estabilidad térmica. En el presente trabajo de Tesis se ha abordado la estabilización de la plastocianina de la cianobacteria mesofílica Synechocystis sp. PCC6803 mediante mutagénesis dirigida, con el fin de comprender cómo la región entre los residuos 39 y 65 modula la estabilidad de la proteína en sus distintos estados redox. Para ello se han aplicado criterios normalmente asumidos para optimizar la termoresistencia de proteínas. El análisis espectroscópico de las distintas proteínas recombinantes ha permitido detectar la existencia de intermediarios en la ruta de desplegamiento de la proteína de Synechocystis. Asimismo, tales análisis de distintas variantes indican una cooperatividad entre el centro cobre y la región flexible que comprende los residuos desde el 44 al 56. Los datos de difracción de rayos-X y los cálculos de dinámica molecular que se presentan indican que las mutaciones afectan a dicha cooperatividad a través del concierto entre los movimientos de las distintas regiones flexibles de la proteína, sin afectar a la estructura global de la misma.
Full text
Ins i u o de Bioquímica Vege al y Fo osín esis,
cicCa uja, Uni e sidad de Se illa – CSIC
ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD EN
PLASTOCIANINAS DE CIANOBACTERIAS
T abajo p esen ado po la Licenciada Dª. Es ella F u os Bel án
pa a op a al í ulo de Doc o en Bioquímica po la Uni e sidad de
Se illa.
Se illa, 2015
Di ec o es
D . D. Miguel Ángel
De la Rosa Acos a
Ca ed á ico de Bioquímica y
Biología Molecula
Uni e sidad de Se illa
D . D. An onio Jesús
Díaz Quin ana
P o eso Ti ula de Bioquímica
y Biología Molecula
Uni e sidad de Se illa
AGRADECIMIENTOS
El p esen e abajo ha sido inanciado po la Jun a de Andalucía (P06-
CVI-01713, BIO-198 y P011-CVI-7216) y po el Minis e io de
Economía y Compe i idad (BFU2009-07190).
En su mayo pa e, la in es igación desc i a en la p esen e memo ia
ha sido ealizada en el Ins i u o de Bioquímica Vege al y Fo osín esis,
Cen o de In es igaciones Cien í icas Isla de la Ca uja (cicCa uja),
cen o mix o en e la Uni e sidad de Se illa y el Consejo Supe io de
In es igaciones Cien í icas (CSIC) y co inanciado po la Conseje ía de
Economía, Inno ación Ciencia y Empleo de la Jun a de Andalucía.
Las es uc u as c is alog á icas de los mu an es de plas ocianina se
han esuel o a lo la go de dos es ancias de es meses en Diamond
Ligh Sou ce L d. (Reino Unido) bajo la supe isión del D . A min
Wagne , inanciadas po dicha ins i ución a a és de acue do con la
Uni e sidad de Se illa.
En es e ins an e, me gus a ía ag adece a mis di ec o es de esis,
Miguel Ángel De la Rosa y An onio Díaz, la opo unidad, la paciencia
y la dedicación du an e es os, a eces, muy la gos años. A A min
Wagne , po oda su a ención du an e mis es ancias y mi in oducción
en la he mosa ma e ia que es la c is alog a ía de p o eínas.
No puedo deja pasa es a opo unidad sin ag adece ambién a mis
compañe os del L1 y L5, a odos, po que g acias a ellos los buenos
momen os ue on mejo es, y los du os, más li ianos. A F ancisco
Muñoz, po in oduci me en odas las écnicas que pos e io men e se
con e i ían en u ina ias; A Jona han, po compa i es e camino
desde el p ime día, aunque al inal me acaba a sacando mucho
echo (qué al o pusis e el lis ón); A Ka iuska Gonález, po oda su
ayuda du an e mis úl imos meses; A Blas Mo eno, po oda su
p eocupación hacia mí (po in Blas, po in); A C is ina Alba án, a
quien debe ía habe hecho mucho más caso; A Pila Alcán a a,
po que sin ella el abajo se hubie a hecho aún más du o.
Ag adezco ambién a mis pad es, que me han mos ado con sus
acciones que lo peo de cae se es no in en a po odos los medios el
ol e se a le an a , y a Víc o , que ha sopo ado an os momen os de
desespe ación po mi pa e, a lo que ha espondido siemp e con su
incondicional apoyo y un ue e ab azo. A ellos les dedico es e abajo.
ÍNDICE
Índice
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS ........................................................................... 3
ÍNDICE ............................................................................................ 7
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................... 13
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................... 19
LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .................................... 21
1. INTRODUCCIÓN ............................................................... 27
1.1. Las p o eínas de cob e azul ............................................... 29
1.1.1. Las p o eínas de cob e ...................................................... 29
1.1.2. Las p o eínas de cob e azul ............................................... 35
1.1.2.1. El cen o de cob e ipo-1 .................................................... 36
1.1.2.2. El dominio de unión a cob e azul: ca ac e ís icas y
e olución............................................................................ 39
1.1.2.3. Cup edoxinas ..................................................................... 42
1.1.2.3.1. Plas ocianina ..................................................................... 42
1.2. Aplicaciones bio ecnológicas de las p o eínas de
cob e azul: biosenso es elec oquímicos ........................... 45
1.3. Te moes abilidad p o eica .................................................. 47
1.3.1. Te moes abilidad e modinámica y e moes abilidad
ciné ica .............................................................................. 47
1.3.2. O ganismos meso ílicos y e mo ílicos ............................... 49
1.3.3. Mecanismos de e moes abilización p o eica ..................... 50
1.3.4. Es abilidad é mica en cup edoxinas .................................. 61
1.3.4.1. Es abilidad é mica en plas ocianinas ................................ 63
1.3.4.1.1. Compa ación en e las plas ocianinas de
Synechocys is sp. PCC6803 y Pho midium
Laminosum ........................................................................ 64
Índice
2. OBJETIVOS ...................................................................... 71
3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................. 75
3.1. P og amas in o má icos ..................................................... 77
3.2. Diseño de los mu an es ..................................................... 77
3.2.1. CUPSAT (“Cologne Uni e si y P o ein S abili y
Analysis Tool”) ................................................................... 78
3.2.2. Dinámicas molecula es ...................................................... 78
3.2.2.1. Análisis de componen es p incipales ................................. 83
3.2.2.2. Análisis de con enidos coseno ........................................... 85
3.3. Análisis de la e moes abilidad de Syn – Pc median e
mu agénesis di igida .......................................................... 86
3.3.1. O ganismos y condiciones de cul i o ................................. 86
3.3.2. Ob ención de ADN de plas ocianinas mu an es ............... 86
3.3.3. Exp esión y pu i icación de plas ocianinas sil es es y
mu an es ............................................................................ 90
3.3.3.1. P oducción de las plas ocianinas ecombinan es ............... 90
3.3.3.2. Pu i icación de las plas ocianinas ecombian es ................ 91
3.3.3.3. Ob ención de las o mas apo de la plasc ocianina ............. 93
3.3.4. Ca ac e ización p o eica .................................................... 93
3.3.4.1. Espec oscopía de dic oísmo ci cula ................................ 93
3.3.4.2. Medidas po enciomé icas ................................................. 95
3.3.4.3. Espec o o ome ía ciné ica inducida po láse ................... 96
3.3.5. Medidas de es abilidad é mica .......................................... 98
3.3.5.1. Es udios de luo escencia .................................................. 98
3.3.5.1.1. Fluo ime ía Di e encial de ba ido (DSF; Di e en ial
Scanning Fluo yme y) ....................................................... 98
3.3.5.1.2. Espec oscopía de luo escencia ..................................... 100
Índice
3.3.5.2. Dic oísmo ci cula ............................................................ 102
3.3.5.3. Análisis de las ampas de empe a u a y ob ención de
la empe a u a de desna u alización ................................ 102
3.4. Ca ac e ización es uc u al de las plas ocianinas
mu an es median e di acción de ayos X......................... 104
3.4.1. C is alización ................................................................... 109
3.4.1.1. Syn–A44D/D49P/A62L..................................................... 109
3.4.1.2. Syn-V48I .......................................................................... 110
3.4.1.3. Pho-P49G/G50P .............................................................. 111
3.4.2. Colección de da os de di acción y e inamien o .............. 111
4. RESULTADOS................................................................. 113
4.1. Diseño de los mu an es de la plas ocianina de
Synechocys is sp. PCC6803 ............................................ 115
4.1.1. Mu aciones in oducidas en la zona de in e acción del
lazo L5 con el ba il: clus e hid o óbico ........................... 115
4.1.1.1. Sus i ución V48I. .............................................................. 117
4.1.1.2. Sus i uciones L56I, T52Y y T52I ...................................... 118
4.1.1.3. Mu an es en las heb as β5 y β6: G60A, K59S y V42I ....... 120
4.1.1.4. Sus i ución A3F ................................................................ 121
4.1.1.5. Mu an es múl iples. .......................................................... 122
4.1.2. Análisis de las mu aciones median e el p og ama
CUPSAT .......................................................................... 124
4.2. Simulaciones de dinámica molecula de co a
du ación ........................................................................... 125
4.3. Análisis de la e moes abilidad de Syn-Pc median e
mu agénesis di igida ........................................................ 128
4.3.1. Exp esión y pu i icación de plas ocianinas sil es es
y mu an es. ...................................................................... 128
Índice de igu as
Figu a 39. Apo aciones a la es abilidad de la ma iz y el cen o
de cob e pa a cada uno de los mu an es de Syn-Pc
espec o al sil es e. ........................................................ 155
Figu a 40. Tendencias en la Tm espec o a los alo es de
po enciales édox............................................................. 157
Figu a 41. Tendencias de la di e encia de Tm (ΔTm) en e las
di e en es o mas espec o a E0. ..................................... 159
Figu a 42. Des iaciones medias (RMSDs) a lo la go de las
ayec o ias de la ga du ación calculadas a (A) 298 y
(B) 498K. ......................................................................... 161
Figu a 43. Radio de gi o (Rg) a lo la go de las ayec o ias de
la ga du ación calculadas a (A) 298 y (B) 498K. .............. 163
Figu a 44. Fluc uaciones cuad á icas medias (RMSF) a lo la go
de las ayec o ias de la ga du ación calculadas a 298
K pa a las o mas holo de Syn-Pc y sus mu an es. .......... 166
Figu a 45. Fluc uaciones cuad á icas medias (RMSF) a lo la go
de las ayec o ias de la ga du ación calculadas a 298
K pa a las o mas apo de Syn-Pc y sus mu an es. ........... 168
Figu a 46. Fluc uaciones cuad á icas medias a 298 K. ..................... 169
Figu a 47. Fluc uaciones cuad á icas medias (RMSF) a lo la go
de las ayec o ias de la ga du ación calculadas a 498
K de las o mas holo y apo de Syn-Pc y sus mu an es.
172
Figu a 48. Fluc uaciones cuad á icas medias a 498 K. ..................... 173
Figu a 49. E olución de la es uc u a secunda ia de las o mas
holo a 298 K .................................................................... 175
Figu a 50. Cambios es uc u ales expe imen ados po las o mas
holo de Syn-Pc y sus mu an es V48I y
A44D/D49P/A62L a lo la go de la ayec o ia a 298K. ...... 176
Índice de igu as
Figu a 51. E olución de la es uc u a secunda ia de las o mas
apo a 298 K ..................................................................... 177
Figu a 52. Cambios es uc u ales expe imen ados po las
o mas apo de Syn-Pc y sus mu an es V48I y
A44D/D49P/A62L a lo la go de la ayec o ia a
298K. .......................................................................... 178
Figu a 53. E olución de la es uc u a secunda ia de las o mas
(A) holo y (B) apo a 498 K ................................................ 181
Figu a 54. Cambios es uc u ales expe imen ados po las o mas
holo de Syn-Pc y sus mu an es V48I y
A44D/D49P/A62L a lo la go de la ayec o ia a 498K. ...... 182
Figu a 55. Cambios es uc u ales expe imen ados po las o mas
apo de Syn-Pc y sus mu an es V48I y
A44D/D49P/A62L a lo la go de la ayec o ia a 498K. ...... 183
Figu a 56. Rep esen ación de los alo es p opios en e a sus
espec i os ec o es p opios. ........................................... 185
Figu a 57. Rep esen aciones g á icas de los mo imien os
conce ados a lo la go de los cinco p ime os ec o es
p opios pa a Syn-Pc, Syn-V48I y Syn-
A44D/D49P/A62L a 298K. ............................................... 188
Figu a 58. C is al ob enido pa a el mu an e Syn-V48I de la
plas ocianina. ................................................................... 190
Figu a 59. C is al ob enido pa a el mu an e Pho-P49G/G50P de
la plas ocianina. ............................................................... 191
Figu a 60. De alles de los lazos L1 y L5 de Syn-V48I ........................ 194
Figu a 61. De alle de la Ile48 y el cen o de cob e de Syn-V48I ........ 195
Figu a 62. Alineamien o de las es uc u as (A) y de los cen os
me álicos (B) de Syn-V48I y Syn_A44D/D49P/A62L. ....... 196
Índice de igu as
Figu a 63. De alle de la in e ase en e los lazos L5 y L7 de Syn-
Pc (A) y Syn-V48I (B). ..................................................... 198
Figu a TMS 1. Espec os de desna u alización de la o ma
educida de Syn-Pc median e DSF. ................................. 258
Figu a TMS 2. Cap u a de pan alla de los espec os de
desna u alización de la apo-Pc de Syn-Pc median e
DSF. ................................................................................ 258
Figu a TMS 3. Ejemplos del espec o de emisión de luo escencia
y de la cu a de desna u alización de la apo-Pc de
Syn-Pc median e espec oscopía de luo escencia. ......... 259
Figu a TMS 4. C is ales ob enidos pa a el iple mu an e Syn-
A44D/D49P/A62L de la plas ocianina. ............................. 260
Figu a TMS 5. Alineamien o de las es uc u as c is alog á icas
del mu an e Syn-A44D/D49P/A62L ya publicada
(1PCS.pdb,(Rome o e al., 1998)) y la ob enida en
es e abajo. ..................................................................... 260
Índice de ablas
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Valo es de Tm de di e en es cup edoxinas. .......................... 61
Tabla 2. Oligonucleó idos empleados pa a in oduci las
di e en es mu aciones di igidas en el gen pe E. ................ 88
Tabla 3. Valo es de ∆∆Gc calculadas median e CUPSAT pa a los
mu an es diseñados ........................................................ 124
Tabla 4. Rendimien os de p oducción de las dis in as
plas ocianinas usadas pa a es e abajo. ........................ 128
Tabla 5. Po cen aje de ecupe ación de p o eína en cada uno de
los p ocesos de pu i icación has a la ob ención de la
p o eína pu a. ................................................................. 129
Tabla 6. Cons an es bimolecula es de la eacción de educción
del PSI po las dis in as Pcs en condiciones es ánda
(k2). ................................................................................ 136
Tabla 7. Valo es de Tm de las o mas oxidada y educida de Syn-
Pc y sus mu an es, así como de Pho-Pc y su mu an e
Pho-P49G/G50P. ............................................................ 149
Tabla 8. Valo es de Tm de las apo-Pc de Syn-Pc y sus mu an es,
así como de Pho-Pc y su mu an e Pho-P49G/G50P. ...... 154
Tabla 9. In o mación es adís ica de i ada de los ajus es lineales
de los mos ados en la igu a 41. .................................... 158
Tabla 10. Valo es p omedios de los RMSDs pa a Syn-Pc y sus
mu an es. ........................................................................ 162
Tabla 11. RMSD en e la es uc u a inicial y la inal de cada una
de las ayec o ias. .......................................................... 179
Tabla 12. Con enido coseno de los cinco p ime os componen es
p incipales (CP) de Syn-Pc y sus mu an es Syn-V48I
y Syn-A44D/D49P/A62L a empe a u a ambien e. .......... 187
Índice de ablas
Tabla 13. Es adís icas co espondien es al p oceso de la
colección de da os y p ocesamien o ............................... 192
Tabla 14. Es adís icas co espondien es al p oceso de
e inamien o .................................................................... 193
Tabla 15. Compa ación de las longi udes de los enlaces en e el
cob e y sus ligandos en e Syn-V48I y Syn-
A44D/D49P/A62L. .......................................................... 196
Tabla 16. Valo es de Tm y longi ud del enlace Cu-Sγ,Cys en
dis in as plas ocianinas. .................................................. 197
Tabla TMS 1 .................................................................................... 261
Tabla TMS 2. Composiciones de las soluciones p ecipi an es
usadas en el es 1 de c is alización de Pho-
P49G/G50P. ................................................................... 263
Tabla TMS 3. Composiciones de las soluciones p ecipi an es
usadas en el es 2 de c is alización de Pho-
P49G/G50P.. .................................................................. 264
Tabla TMS 4 Composiciones de las soluciones p ecipi an es
usadas en el es 4 de c is alización de Pho-
P49G/G50P. ................................................................... 268
Tabla TMS 5. Composiciones de las soluciones p ecipi an es
usadas en el es 5 de c is alización de Pho-
P49G/G50P. ................................................................... 269
Tabla TMS 6. Composiciones de las soluciones p ecipi an es
usadas en el es 6 de c is alización de Pho-
P49G/G50P .................................................................... 270
LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
Lis ado de ab e ia u as y símbolos
LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
A
||
Cons an e de acoplamien o hipe ino
Am Amicianina
Apo Apop o eína
Apo-Pc Apop o eína de la plas ocianina
Az Azu ina
BCB Plegamien o ipo cup edoxina o de unión a cob e
azul
BCP P o eína de cob e azul
CD Ci cula Dich oism
ADN Ácido desoxi ibonucleico
ADNasa Desoxi ibonucleasa
DSC Calo ime ía di e encial de ba ido
Em Po encial edox
ε Coe icien e de abso ción en el isible
ε
s
Cons an e dieléc ica del agua
ε
p
Cons an e dieléc ica del in e io de una p o eína
ΔΔG
c
Di e encia en ene gía lib e de desplegamien o
en e la p o eína sil es e y la mu an e calculada
po CUPSAT
g Acele ación g a i a o ia e es e
Holo-Pc Holop o eína de la plas ocianina
LB Medio Lu ia-Be ani
MCBP P o eínas de mul icob e azul
Lis ado de ab e ia u as y símbolos
MCO Oxidasa mul icob e
NMR Nuclea magne ic esonance
p/p Relación peso-peso
p/ Relación peso- olumen
pBS Plásmido pBluesc ip II SK+
PDB P o ein da a bank
Pc Plas ocianina
PCA Análisis de componen es p incipales
PCR Polyme ase chain eac ion
Pho- Pc Plas ocianina sil es e de Pho midium laminosum
Pho-P49G/G50P Plas ocianina de Pho midium laminosum con la
doble mu ación
pBS-WT Plásmido pBluesc ip II SK (+) con el gen pe E
clonado bajo el p omo o lacZ
PSI Fo osis ema I
Rg Radio de gi o
RMSD Roo mean squa e de ia ion
RMSF Roo mean squa e luc ua ion
Rpm Re oluciones po minu o
Rc Rus icianina
RT-PCR Re e se ansc ip ion polyme ase chain eac ion
SDS Sodium dodecyl sulpha e
Syn- Pc Plas ocianina sil es e de Synechocys is sp. 6803
Lis ado de ab e ia u as y símbolos
Syn-A44D/D49P/A62L Plas ocianina de Synechocys is sp. 6803 con la
iple mu ación Syn-A44D/D49P/A62L
Syn-G60A Plas ocianina de Synechocys is sp. 6803 con la
mu ación G60A
Syn-V48I Plas ocianina de Synechocys is sp. 6803 con la
mu ación V48I
Syn-V48I/G60A Plas ocianina de Synechocys is sp. 6803 con la
dob e mu ación
T
m
Tempe a u a de desplegamien o o usión de la
p o eína
TOC Tempe a u a óp ima de c ecimien o
T is T is(hid oxime il)aminome ano
UV Luz ul a iole a
/ Relación olumen- olumen
Vis Luz isible
XANES X- ay abso p ion nea edge s uc u e
XAS X- ay abso p ion spec oscopy
In oducción
32
Figu a 1. Cen os de cob e ipo-1, ipo-2, ipo-3 y inuclea
Rep esen aciones g á icas de los cen os de cob e ipo-1 clases I (plas ocianina
de Synechocys is sp. PCC 6803; 1JXD.pdb; Be iniª e al., 2001), II (es elacianina
de Cucumis Sa i us; 1JER.pdb; Ha e al., 1996) y III (azu ina de Pseudomonas
Ae uginosa; 1AZU.pdb; Adman y Jensen, 1981); ipo-2 (Cu, Zn supe óxido
dismu asa de Bos Tau us; 2ZOW.pdb; I o e al., pendien e de publicación); ipo-
3 (hemocianina de Limulus Polyphemus; 2OXY.pdb; Ba is u a e al., 2007); y
cen o inuclea (bili ubina oxidasa de My o hecium Ve uca ia; 2XLL.pdb;
C acknell e al., 2011). El pa ón de colo es pa a los á omos es: azul se pa a el
ni ógeno, ojo pa a el oxígeno, ama illo pa a el azu e, y ma ón pa a el cob e.
In oducción
33
4. Cen os de cob e inuclea es, esul ado de la combinación de un
ipo-2 y un ipo-3. Los es á omos de cob e se encuen an ligados po
8 esiduos de his idina ( igu a 1).
En es e ipo de ag upación exclusi a de oxidasas mul icob e
[Augus ine e al., 2010], los cua o elec ones necesa ios pa a la
educción del oxígeno molecula a agua son ans e idos de uno en uno
desde un sus a o o gánico o me álico al cen o de cob e ipo-3 del cen o
inuclea ía un cen o de cob e ipo-1.
5. Cen os de cob e Cu
A
[Fa a e al., 1998; And ew e al., 1994]
( igu a 2):
• Dos á omos de cob e enlazados median e dos esiduos de
cis eína, ambos en una geome ía e ahéd ica. Uno de los
á omos de cob e se coo dina ambién po una his idina y una
me ionina, mien as que el o o lo hace po una his idina y el
oxígeno ca bonilo de un esiduo de glu ama o.
• Bandas a 480, 540, y 780 nm en el espec o de abso ción de la
N
2
O educ asa. En la ci oc omo oxidasa g an pa e del espec o
se encuen a ocul ado po la p esencia del g upo hemo,
de ec ándose únicamen e una amplia banda de abso ción en o no
a los 800 nm [ on Wachen eld e al, 1994].
• P esen a un espec o de EPR con sie e picos, así como un
ca ac e ís ico colo mo ado.
6. Cen os de cob e Cu
B
[Calhoun e al., 1993; Kim e al., 2004]
( igu a 2):
- Un á omo de cob e, coo dinado po es esiduos de his idina en
una geome ía igonal pi amidal.
- Ca ece de señal EPR debido a acoplamien o an i é ico con el
g upo hemo si uado en las p oximidades.
In oducción
34
Figu a 2. Cen os de cob e Cu
A
, Cu
B
y Cu
Z.
Rep esen aciones g á icas de los di e sos ipos de cen os de cob e Cu
A
(Cox2
de Rhodobac e Sphae oides; 1M56.pdb; S ensson-EK e al., 2002), Cu
B
(Cox1
de Rhodobac e sphae oides; 1M56.pdb; S ensson-EK e al., 2002); y Cu
Z
(N
2
O
educ asa; 2IWK.pdb; Pa aske opoulos e al., 2006). El pa ón de colo es pa a
los á omos es: azul se pa a el ni ógeno, ojo pa a el oxígeno, ama illo pa a el
azu e, mo ado pa a yodo, y ma ón pa a el cob e.
7. Cen os de cob e Cu
Z
[Dell'Acqua e al, 2011; Fa a e al, 1998]
( igu a 2):
- Cua o á omos de cob e coo dinados po sie e his idinas y
enlazados median e un ión de azu e ino gánico.
- Amplia banda de abso ción con un máximo a 640 nm, cuando el
cen o de cob e se encuen a educido.
- Espec o de EPR con cua o picos.
In oducción
35
Los cen os de cob e Cu
A
y Cu
B
o man pa e de los dominios
Cox2 y Cox1, espec i amen e, de la ci oc omo c oxidasa (COX). Los
cen os de cob e Cu
B
o man pa e de la supe amilia de las oxidasas
espi a o ias de hemo-cob e. La N
2
O educ asa cuen a en su es uc u a
con los cen os de cob e Cu
A
y Cu
Z
.
1.1.2. Las p o eínas de cob e azul
Las p o eínas de cob e azul (BCPs, del inglés “Blue Coppe
P o eins”) o de cob e ipo-1 [Ne sissian y Shipp, 2002; Nakamu a y Go,
2005; Kosman, 2010] cons i uyen un amplio g upo den o de las p o eínas
de cob e. Es a amilia p o eica se ca ac e iza po p esen a el cen o de
cob e ipo-1, además, del plegamien o conocido como ipo cup edoxina o
de unión a cob e azul (BCB, del inglés “Blue Coppe -Binding”) [Ne sissian
y Shipp, 2002], simila al de los dominios de las inmunoglobulinas.
Den o de es a clase se encuen an las cup edoxinas, [Adman,
1991; Dennison, 2005], consis en es en un único dominio con
plegamien o BCB. A ella pe enecen la plas ocianina (Pc), la azu ina
(Az), la pseudoazu ina, la us icianina (Rc), la amicianina (Am) o la
halocianina. También son miemb os de la amilia de las BCPs las
p o eínas azules de mul icob e o MCBPs (del inglés “Mul icoppe blue
p o eins”), las cuales descienden de las BCPs de dominio único po
duplicación génica de es os dominios BCB [Ryden, 1988; Ryden y Hun ,
1993; Mu phy e al., 1997; Nakamu a e al., 2003; S e ens, 2008; Ji y
Zhang, 2008]. Las MCBPs incluyen a la ni i o educ asa y a oxidasas
mul icob e (MCOs) como la lacasa, la asco ba o oxidasa, la
ce uloplasmina o la bili ubina oxidasa.
In oducción
36
1.1.2.1. El cen o de cob e ipo-1
Como ya se mencionó en el apa ado 1.1.1, el cen o de cob e
ipo-1 o de cob e azul se ca ac e iza po p esen a una se ie de
p opiedades espec oscópicas únicas de i adas de la coo dinación
pa icula que el cob e p esen a en la p o eína [Solomon e al., 2004]. De
hecho, en disolución acuosa y en p esencia de los ligandos adecuados,
el cob e o ma complejos en di e en es es ados de educción que di ie en
an o en geome ía como en núme o de ligandos. Sin emba go, en
sis emas biológicos, el cob e se ha encon ado sólo como cob e educido
Cu(I) y como oxidado Cu(II).
En las p o eínas de cob e azul, el plegamien o de la cadena
polipep ídica c ea una es e a de coo dinación inusual que, según la eo ía
“unión inducida po a mazón/ sopo e” [Malms öm y Vänngå d, 1960;
Lum y y Ey ing, 1954; Malms öm, 1994], es abiliza un complejo de cob e
o zado. Cuando no exis e impedimen o es é ico, las coo dinaciones
p e e en es pa a Cu(I) y Cu(II) son la e aéd ica egula y la plana
cuad ada, espec i amen e. Sin emba go, en los cen os de cob e ipo-1,
an o los ligandos como sus con o maciones adop an gene almen e,
aunque no siemp e, una disposición en e aed o dis o sionado,
in e media en e las coo dinaciones p edilec as pa a Cu(I) y Cu(II) [G ay
e al., 2000]. Es a con o mación pe mi e que la ene gía de eo ganización
se eduzca y, po lo an o, se acili e el in e cambio en e ambos es ados
de oxidación, imp escindible pa a la ca álisis dependien e de cob e [Guss
y F eeman, 1983; Ga e e al., 1984; Guss e al., 1986; Shepa d e al.,
1990; Ryde e al., 1996].
La es abilidad de los complejos me álicos depende de la
na u aleza y disposición de los ligandos y del es ado de oxidación del
me al. Según el concep o pesado-lige o, ácido-base de Pea son
[Pea son, 1963] el Cu(I) en las p o eínas p e ie e los á omos de azu e o
iones de los aminoácidos cis eína y me ionina. El Cu(II), sin emba go,
In oducción
37
puede encon a se coo dinado po á omos de oxígeno y ni ógeno o iones
de esiduos de i osina, eonina, his idina, anión hid oxilo y agua. Po
an o, pa a man ene es able el cen o de cob e dis o cionado de las
BCPs el me al se encuen a coo dinado an o po ligandos que a o ecen
al Cu(I) como po ligandos que a o ecen al Cu(II). De hecho, como ya
se mencionó en el apa ado 1.1.1, dos ni ógenos imidazoles de dos
esiduos de his idina y el iola o de un esiduo de cis eína se encuen an
siemp e ligando ue emen e al cob e en una coo dinación p ác icamen e
igonal plana ( igu a 1). El cua o ligando a ía en e dis in as BCPs,
pudiendo a a se o de un esiduo de glu amina (Tipo-1 clase II, igu a 1),
que ambién une al cob e ue emen e o bien del ioés e de un esiduo
de me ionina que une al cob e de una o ma más débil que los o os es
ligandos (Tipo-1 clase I, igu a 1) [Ha e al., 1996]. Po o a pa e,
mien as que la Az p esen a un segundo ligando axial consis en e en un
oxígeno ca bonilo del esquele o de la p o eína (Tipo-1 clase III, igu a 1)
[Bake , 1988; C ane e al., 2001; Na e al., 1991], o as BCPs o dominios
BCBs ca ecen de ligando axial [Duc os e al., 1998].
De los ligandos del cob e, una de las dos his idinas, la cis eína
y, en caso de exis i , el ligando axial se si úan en el lazo que une las dos
heb as β del ex emo C- e minal [Dennison, 2008] ( igu a 3). Pa e de es e
lazo es á expues o a la supe icie de la p o eína y con ibuye a la
o mación de un á ea no malmen e hid o óbica que odea a la his idina y
que es á implicada en la asociación con sus pa ejas [Du ley e al., 1993;
Díaz-Mo eno e al., 2005]. La longi ud, la secuencia y la es uc u a de
es e lazo a ían en e los di e en es dominios BCBs, sob e odo en
cup edoxinas, siendo la longi ud la que de ine su con o mación [Li e al.,
2007; Sa o e al., 2009]. Además, la es uc u a y dinámica de es e lazo
es uno de los ac o es que in luyen en el p oceso conocido como
ansición ácida [Li e al., 2007; Pal inie i e al., 2013], consis en e en la
p o onación de la his idina en la p o eína educida, con ango de pKa
In oducción
38
ap oximadamen e en e 5 y 7. Es e enómeno conduce a la disociación
e e sible de es e ligando del cob e y a la inac i ación biológica de la
cup edoxina debido a un d ás ico inc emen o del po encial de educción
[Ba is uzzi e al., 2002]. La ansición ácida se obse a en muchas de las
BCPs, como la Pc, la amicianina, la pseudoazu ina, y la es elacianina
[Guss e al., 1986; Zhu e al., 1998; Vakou a i e al., 1994; Me chan e
al., 1991].
Figu a 3. Es uc u a de Syn-Pc y de su cen o de cob e
(A) Es uc u a de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al. 2001) donde se
mues a en mo ado el lazo L4 y en celes e el L8, así como el cen o de cob e. El
lazo L8 une las dos heb as β del ex emo C- e minal y en él se encuen an es
de los ligandos del cob e: His86, Cys83 y Me 39. La His39, cua o ligando del
me al, se si úa en el lazo L4. En e de se mues an los puen es de hid ógeno en
los que pa icipan los ligandos del cob e. (B) Mayo de alle del cen o de cob e.
Los ligandos del me al se ep esen an como palos (“s ick”) y el cob e se colo ea
de ma ón. La nume ación de los ligandos del cob e se co esponde a la de la
misma Syn-Pc.
El cen o de cob e se encuen a es abilizado po una ex ensa ed
de puen es de hid ógeno ( igu a 3) esencial pa a man ene la in eg idad
In oducción
39
del si io ac i o [Dong e al., 1999; Li e al., 2004; Dennison, 2008], además
de eje ce una cla a in luencia sob e los po enciales edox [Bo uyan e al.,
1996; Li e al., 2004]. Un puen e de hid ógeno ca ac e ís ico de las BCPs,
es el que se o ma en e el á omo de azu e de la cis eína que liga al cob e
(L8) y el p o ón del g upo amida del esquele o pe enecien e a la Asn40,
esiduo inmedia amen e adyacen e al ligando his idina, si uado en el lazo
L4 [Musiani, 2004]. Es e enlace esul a undamen al pa a la es abilidad
del cen o me álico [Dong e al., 1999].
Mu aciones en los ligandos del cob e modi ican las p opiedades
espec oscópicas de la p o eína sin al e a su es uc u a global [Can e s
y Gila di, 1993]. Mien as que el esiduo de cis eína es el único ligando
esencial en el man enimien o de las ca ac e ís icas del cob e azul
[Mizoguchi e al., 1992; Lancas e e al., 2009], el ligando his idina más
ce cano al ex emo C- e minal esul a undamen al pa a las
ans e encias elec ónicas. Los es esiduos es an es, apa e de es a
implicados en la unión al cob e, man ienen la in eg idad del si io ac i o,
excluyen ligandos exógenos y modulan el po encial edox [Can e s y
Gila di, 1993; Hall ª e al., 1999].
1.1.2.2. El dominio de unión a cob e azul: ca ac e ís icas y
e olución
El dominio BCB o dominio cup edoxina consis e en un ba il β
o mado po en e 6 y 13 heb as β an ipa alelas o ganizadas en dos
láminas β y en un mo i o en g eca [Guss y F eeman, 1983; Ji y Zhang,
2008; Lindleyª, 2001] ( igu as 4 y 6). Sin emba go, el con enido en hélices
α es bajo o nulo. Los dominios BCB son pequeños, en e 90 y 150
aminoácidos, y su núme o a ía en e las di e sas BCPs: las
cup edoxinas p esen an uno, pe o las MCBPs con ienen dos (ni i o
educ asa), es (asco ba o oxidasa, lacasa) o seis (ce uloplasmina,
In oducción
40
bili ubina oxidasa) epe iciones de es os dominios BCB ensamblados en
una única cadena polipep ídica ( igu a 4). Aunque la homología en e los
di e sos dominios BCB exis en es en la na u aleza es de sólo el 10%
( igu a 5), la es uc u a idimensional del mismo se man iene al amen e
conse ada [Ne sissian y Shipp, 2002] ( igu a 4B).
Figu a 4. Conse ación de la es uc u a de los dominios BCB en e Syn-Pc
y la bili ubina oxidasa
(A) Es uc u a idimensional de la bili ubina oxidasa de My o hecium e uca ia
(código pdb: 2XLL; C acknell e al., 2011). Se mues a en di e en es colo es cada
uno de los es dominios BCB que o man la p o eína. Los á omos de cob e es án
colo eados en ma ón. (B) Supe posición de las es uc u as de Syn-Pc, en
magen a, (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001), y de uno de los dominios
BCBs de la bili ubina oxidasa, en azul. Los á omos de cob e se colo ean en
ma ón y en azul pa a Syn-Pc y pa a la bili ubina oxidasa, espec i amen e.
In oducción
41
Figu a 5. Alineamien o de las secuencias de aminoácidos de algunos
ep esen an es de la amilia de las p o eínas de cob e azul.
Pc-1: plas ocianina de álamo (P. nig a), Pc-2: plas ocianina de espinaca
(S.ole acea), Pc-3: plas ocianina de Pho midium laminosum (P. laminosum), Pc-
4: plas ocianina de Synechocys is sp.PCC6803, y Pc-5: plas ocianina de
Anabaena a iabilis (A. a iabilis), Az: Azu ina de Pseudomonas ae uginosa (P.
ae uginosa), Rc: us icianina de Thiobacillus e ooxidans (T. e ooxidans), y
BOX-D1: dominio 1 de la billi ubina oxidasa de My o hecium e uca ia (M.
e uca ia), y CP-D1: dominio 1 de la ce uloplasmina humana.
In oducción
48
como la calo ime ía di e encial de ba ido (DSC) o écnicas
espec oscópicas como el dic oísmo ci cula (CD) o la espec oscopía de
luo escencia. Mien as que po DSC se ob iene el cambio de en alpía de
desplegamien o (∆H
cal
), el CD o la espec oscopía de luo escencia
pe mi en la ob ención de la en alpía de an´ Ho (∆H
H
):
dlnKd1
⁄ =−∆H
⁄⁄
Ambos pa áme os son complemen a ios, de o ma que
∆H
cal
/∆H
Vh
≈ 1 apoya el modelo en dos es ados [P i alo , 1979].
Pa a la de e minación de ΔG
FU
pa a un p oceso de
desplegamien o é mico en dos es ados, se aplica la ecuación de Gibbs-
Helmhol z:
∆G
=∆H
1−T
⁄ −∆C
−T+TlnT
⁄
Siendo ∆H
m
el alo de ∆H a la empe a u a de desplegamien o
(T
m
) y ∆C
p
la capacidad calo í ica. T
m
es un pa áme o ampliamen e
usado pa a compa a las e moes abilidades de di e en es p o eínas. Se
de ine como la empe a u a a la que el 50% de la población p o eica se
encuen a en su es ado desplegado. Po an o, a es a empe a u a K
U
=1
y ΔG
FU
= 0.
Sin emba go, la mayo pa e de las p o eínas meso ílicas y
e mo ílicas se despliegan de un modo i e e sible, debido a que la o ma
desplegada de la p o eína puede su i p ocesos de p o eolisis o
ag egación [Sanchez-Ruiz, 2010]. Según el modelo de Lum y–Ey ing, la
p o eína acaba á cayendo en un es ado inal y no uncional: F↔U↔I,
donde I ep esen a dicho es ado inal e i e e sible.
La es abilidad ciné ica se basa en la exis encia de una ba e a
ene gé ica en e los es ados na i o y desplegado, necesa ia pa a que la
unción p o eica se man enga en una escala de iempo isiológicamen e
In oducción
49
ele an e. La e moes abilidad ciné ica se exp esa ecuen emen e con el
iempo de ida media (
1/2
) a una empe a u a de e minada.
Se conside a no malmen e que los pa áme os e modinámicos
no se pueden ob ene pa a las p o eínas que mues an un
desplegamien o i e e sible, siendo sólo posible la conside ación de
es abilidad ciné ica. Sin emba go, si se asume que el paso i e e sible es
mucho más len o que el p oceso e e sible inicial y que iene luga
p incipalmen e a una empe a u a muy supe io a la T
m
, se pueden
ob ene los pa áme os e modinámicos del paso e e sible [Sanchez-
Ruiz, 1992; Mila di e al., 1994].
1.3.2.
O ganismos meso ílicos y e mo ílicos
La impo ancia de en ende las bases molecula es esponsables
de la es abilidad é mica en p o eínas e mo ílicas en compa ación con
sus homólogas meso ílicas se ha con e ido en una de las a eas más
impo an es pa a la comunidad cien í ica, ya que pe mi e conoce cuáles
son los mecanismos usados po la na u aleza pa a es abiliza p o eínas
en gene al. Además, la adquisición de ales conocimien os esul a
esencial pa a el desa ollo de aplicaciones médicas o bio ecnológicas que
p ecisen del diseño de enzimas capaces de abaja a empe a u as
ele adas [Haki y Rakshi , 2003].
Según la empe a u a óp ima de c ecimien o (TOC), los
o ganismos ole an es al calo se sepa an ecuen emen e en dos clases:
e mó ilos (mode ados), con una TOC en e 45 y 80 ºC, e hipe e mó ilos
(o e mó ilos ex emos) con una TOC supe io a 80 ºC. Los o ganismos
meso ílicos se de inen como aquellos que mues an una TOC en e 15 y
45
ºC, y los psic ó ilos p esen an una TOC in e io a 15
º
C [Vieille y Zeikus,
2001; Li e al., 2005]. Los o ganismos hipe e mó ilos pe enecen
p incipalmen e al eino biológico A chea, aunque exis en dos géne os de
In oducción
50
Eubac e ias hipe e mó ilas: The mo oga [Zhaxybaye a e al., 2009] y
Aqui ex [Decke e al., 1998]. Los o ganismos e mó ilos se epa en
en e los einos Eubac e ia, A chea, y algunos hongos [Luke e al., 2007].
Las p o eínas e mo ílicas y sus homólogas meso ílicas
compa en una homología de secuencia en e el 40 y 85%. Igualmen e,
sus es uc u as idimensionales son supe ponibles y compa en el
plegamien o básico y ca ac e ís ico de la amilia p o eica a la que
pe enecen. Además, el pun o de máxima es abilidad pa a p o eínas
homólogas p o enien es de o ganismos psic ó ilos, meso ílicos y
e mó ilos se alcanza al ededo de los 20 ºC [Felle , 2010]. Sin emba go,
las p o eínas de los o ganismos e mó ilos e hipe e mó ilos p esen an
una mayo esis encia a la p o eolisis y a la desna u alización química,
además de una es abilidad in ínseca a empe a u as ele adas que les
pe mi e man ene su es uc u a y unción bajo es as condiciones. De
hecho, las enzimas e mo esis en es son no malmen e ac i as en e 60 y
80
ºC, dejando de unciona de o ma ap opiada a empe a u as in e io es
a 40
ºC.
1.3.3. Mecanismos de e moes abilización p o eica
En 1975 se publicó el p ime análisis de las posibles causas de
la mayo es abilidad de las p o eínas p o enien es de o ganismos
e mó ilos [Pe u z y Raid , 1975]. Desde en onces, muchos han sido los
es udios eó icos y expe imen ales que han enido como inalidad acla a
las bases que de e minan la e moes abilidad. Sin emba go, es a cues ión
sigue siendo una ma e ia comp endida pa cialmen e. Los dis is in os
es udios pueden clasi ica se en dos g upos: aquellos que examinan una
única p o eína e mo ílica, compa ando su es uc u a con la de uno o más
homólogos meso ílicos, y aquellos análisis compu acionales que u ilizan
da os de un g upo de p o eínas con la inalidad de ob ene conclusiones
In oducción
51
gene ales [G ea es y Wa wicke , 2007]. De odos ellos se concluye que
no exis en aminoácidos nue os, ni modi icaciones co alen es o mo i os
es uc u ales únicos en las p o eínas de o ganismos e mó ilos y
ex emó ilos que expliquen su al a es abilidad espec o a sus homólogas
meso ílicas. De hecho, la mayo es abilidad de las p o eínas e mo ílicas
se debe a la exis encia de su iles edis ibuciones de las mismas
in e acciones in amolecula es eque idas pa a la es abilización p o eica
a empe a u as mode adas.
Las di e en es amilias de p o eínas adop an dis in os
mecanismos pa a adap a se a las al as empe a u as. Es udios
compu acionales englobando g andes g upos de p o eínas
pe enecien es a di e sas amilias p o eicas indican que la única egla es
el inc emen o en el núme o de pa es iónicos al aumen a la empe a u a
de c ecimien o del o ganismo [Pack y Yoo, 2004; Szilagyi y Za odszky,
2000]. Es a a i mación con as a con un g an núme o de es udios
compa a i os en e una p o eína e mo ílica conc e a y su homóloga
meso ílica. De ellos se de i a que la e moes abilidad es una p opiedad
adqui ida po algunas p o eínas median e la combinación de a ias y muy
pequeñas modi icaciones es uc u ales esul ado de la sus i ución de
algunos aminoácidos po o os y po la modulación de las in e acciones
comunes a odas las p o eínas [Ma sumu a e al., 1989]. Las apa en es
con adicciones de ales conclusiones e leja el hecho de que los
di e en es mecanismos de es abilización adop ados po cada amilia se
compensan en e sí dando luga a una di e encia es adís icamen e no
signi ica i a cuando se conside a un g upo de p o eínas de di e sas
amilias [Pack y Yoo, 2004].
Los mecanismos implicados en la es abilización p o eica
engloban, en e o os a:
1. In e acciones hid o óbicas: El e ec o hid o óbico se conside a
como la p incipal con ibución al plegamien o y a la es abilidad p o eica
In oducción
52
[Yang e al., 2013]. La hid o obicidad de una p o eína se exp esa como la
azón en e la supe icie no pola en e ada y el o al de supe icie no pola
de la molécula [Goodenough y Jenkins, 1991].
Las p o eínas homólogas de o ganismos e mó ilos y mesó ilas
compa en una es abilidad basal o iginada po el núcleo p o eico
hid o óbico, no malmen e mucho más conse ado que las zonas
expues as al sol en e. Po an o, las in e acciones es abilizan es en
p o eínas e mo ílicas se localizan p incipalmen e en las zonas en
con ac o con el sol en e, menos conse adas [Vieille y Zeikus, 2001]. Sin
emba go, exis e una co elación di ec a en e la hid o obicidad o al de
una p o eína y su e moes abilidad. De hecho, cada g upo me ilo
adicional en e ado en el in e io de la molécula supone un inc emen o
medio es imado en es abilidad de 5,44 ± 2,09 kJ mol
-1
[Pace, 1992]. Es
po ello que el con enido en aminoácidos hid o óbicos es lige amen e
mayo en p o eínas e mo ílicas [Chak a a y y Va ada ajan, 2000].
2. In e acciones elec os á icas: Las ue zas elec os á icas son
p incipalmen e de es ipos: ca ga-ca ga, ca ga-dipolo y dipolo-dipolo.
Las ípicas in e acciones ca ga-ca ga en e esiduos de ca gas opues as
son conocidas como puen es salinos [Li e al., 2005].
La con ibución de los puen es salinos a la ene gía lib e de la
es abilidad p o eica es á suje a a con o e sia [Ge e al., 2008; Kuma y
Nussino , 1999; Ma qusee y Saue , 1994]. Po una pa e, exis en
es udios que apoyan la eo ía de que los puen es salinos expues os al
sol en e pa ecen ene poca pa icipación en la es abilización p o eica
[Sun e al., 1991], mien as que aquellos que se encuen an pa cial o
o almen e inaccesibles mues an una mayo capacidad de es abilización
[Kuma y Nussino , 1999; Ma qusee y Saue , 1994]. Po o o lado, en la
bibliog a ía se pueden encon a excepciones a es as a i maciones
[Makha adze e al., 2003; Waldbu ge e al., 1995]. De hecho, en la
supe icie de las p o eínas e mo ílicas e hipe e mo ílicas exis e una
In oducción
53
mayo p opo ción de esiduos ca gados en compa ación con sus
homólogas meso ílicas.
La exis encia de edes [Zhou, 2002; Ho o i z e al., 1990],
ambién es un impo an e ac o a la ho a de de ini el papel que los
puen es salinos ienen en la es abilidad p o eica. A empe a u a
ambien e, pa a un único pa iónico, el cos e de la desol a ación es
lige amen e mayo o igual que la ene gía lib e de la in e acción
elec os á ica [Zhou, 2002]. Po an o, el pa iónico soli a io deses abiliza
la es uc u a plegada, o no iene e ec o alguno. Sin emba go, cuando se
añade un segundo pa iónico, la ene gía de las in e acciones
elec os á icas supe a el cos e de desol a ación, y la ed de puen es
salinos es abiliza la es uc u a. Dichas edes de puen es salinos se han
obse ado con mayo ecuencia en las p o eínas e mo ílicas e
hipe e mo ílicas [P iyakuma e al., 2010] po que esul an
ene gé icamen e más a o ables que un núme o equi alen e de pa es
iónicos aislados [Yip e al., 1995].
Po an o, la mayo p opo ción de esiduos ca gados en la
supe icie de las p o eínas e mo ílicas e hipe e mo ílicas suele implica
una mayo o mación de edes, en compa ación con sus homólogas
meso ílicas [Jelesa o y Ka shiko , 2009; Alsop e al., 2003; Ka shiko y
Ladens ein, 2001; Szilagyi y Za odszky, 2000]. Se ha especulado que
ello se debe a la caída de la cons an e dieléc ica del agua (ε
s
) a al as
empe a u as. Dado que la cons an e dieléc ica de la p o eína (ε
p
)
pe manece cons an e [Ka shiko y Ladens ein, 2001], ello se aduce en
un meno cos e de desol a ación y un inc emen o de la ue za de las
in e acciones en e ca gas a empe a u as ele adas en compa ación con
a empe a u a ambien e [Sala i y Chong, 2012; P iyakuma e al., 2010;
Ge e al., 2008; Elcock, 1998]. Po o o lado, exis en ambién es udios
que de e minan que el inc emen o en in e acciones elec os á icas en la
supe icie de las p o eínas e mo ílicas c ea una ba e a en ópica pa a el
In oducción
54
desplegamien o, debido a una educción de la capacidad calo í ica de
desplegamien o (∆Cp) [Chan e al., 2011; Missime e al., 2007; Luke e
al., 2007; Zhou, 2002]. En el abajo ealizado po Zhou (2002) ambas
a i maciones son uni icadas.
Como ya se mencionó, las ue zas elec os á icas incluyen
ambién a las in e acciones dipolo-dipolo y ca ga-dipolo. Las hélices
p esen an un momen o dipola que iene dado po la suma de los
momen os dipola es mic oscópicos, μ
i
, de cada uno de los enlaces
pep ídicos que con iene [Hol e al., 1978]. Po an o, la magni ud del
dipolo de la hélice en acío es di ec amen e p opo cional al núme o de
enlaces pep ídicos que la o man. Las p o eínas e mo ílicas p esen an
hélices más la gas que con ibuyen a la cohesión de la ma iz p o eica
[Vieille y Zeikus, 2001].
De la misma o ma, la in oducción de esiduos con ca ga
nega i a ce ca del ex emo N- e minal de la hélice y de ca gas posi i as
ce ca del C- e minal es abilizan las hélices median e in e acciones
dipolo- ca ga [Vieille y Zeikus, 2001].
Las heb as β ambién p esen an un momen o dipola , con un
ex emo C- e minal pa cialmen e nega i o y un N- e minal pa cialmen e
posi i o. Un inc emen o del momen o dipola en es as es uc u as
secunda ias se puede consegui posicionando un esiduo ca gado
posi i amen e en el ex emo N- e minal y nega i amen e en el C- e minal,
con lo que se aumen a ía las in e acciones dipola es en e hojas β o en e
es as y hélices α [Fa zad a d e al., 2008].
3. Puen es de hid ógeno: Los puen es de hid ógeno clásicos se
o man en e un á omo de hid ógeno unido a un á omo elec onega i o
(donado de puen es de hid ógeno) y o o á omo elec onega i o (acep o
de puen es de hid ógeno). Se es ablecen an o en e cadenas la e ales
de la p o eína como en e es as y las moléculas de agua del sol en e, así
In oducción
55
como en e los g upos amino y ca bonilo del esquele o polipep ídico.
Es án no malmen e de inidos po una dis ancia in e io a 0,3 nm en e el
donado y el acep o , y po un ángulo donado -hid ógeno-acep o meno
a 90 ºC [Vieille y Zeikus, 2001].
El alo de la con ibución media de un puen e de hid ógeno
en e cadenas la e ales p o eicas se encuen a en o no a 2,09 ± 2,9 kJ
mol
-1
[Takano e al., 2003], mien as que los puen es de hid ógeno en el
esquele o de una hélice y de una heb a β con ibuyen espec i amen e
con 5,4 y 5,8 kJ mol
-1
[Fu e al., 2006; Gao y Kelly, 2008; Bowie, 2011].
La ue za de un puen e de hid ógeno depende del
mic oambien e en el que se encuen a [Gao e al., 2009; G omiha e al.,
2013], de o ma que su ene gía lib e puede e se inc emen ada has a en
5,0 kJ mol
-1
al pasa de es a expues o al sol en e a en e ado en un
ambien e hid o óbico [Gao e al., 2009].
Jun o con el e ec o hid o óbico, los puen es de hid ógeno son las
p incipales ue zas es abilizan es [Pace, 2009], de o ma que la
e moes abilidad de las p o eínas se co elaciona con el núme o de
puen es de hid ógeno [Vog e al., 1997]. De hecho, p o eínas e mo ílicas
p esen an un mayo núme o de puen es de hid ógeno que las meso ílicas
[G omiha e al., 2013]. Sin emba go, exis en es udios compu acionales
compa ados que disc epan, indicando que en e p o eínas meso ílicas y
e mo ílicas no hay di e encia en el núme o de puen es de hid ógenos,
sino que es el núme o de donado es y acep o es insa is echos lo que
disminuye lige amen e en p o eínas de o ganismos e mó ilos [Szilagyi y
Za odszky, 2000].
4. Puen es disul u o: La in oducción de un puen e disul u o en una
p o eína inc emen a la ene gía lib e del es ado desplegado, conduciendo
a un aumen o en la ene gía lib e de la p o eína haciéndola
con o macionalmen e más es able [T i edi e al., 2009]. Se ha p opues o
In oducción
56
que el e ec o es abilizado de los puen es disul u o se debe
p incipalmen e a un e ec o en ópico, de o ma que la eliminación de un
puen e disul u o po educción o po mu ación esul a en un inc emen o
de la en opía del es ado desplegado según la elación:
∆S=−2,1−3 2
⁄ lnn
donde n es el núme o de esiduos en e las dos Cys que o man el enlace
[Pace e al., 1988; Ma sumu a e al., 1989; T i edi e al., 2009].
El papel que los puen es disul u os juegan en la es abilización
de las p o eínas e mo ílicas se sus en a en la exis encia de una mayo
p opo ción de es os enlaces co alen es en p o eínas de o ganismos
e mó ilos [Beeby e al., 2005].
5. Unión de un me al: Los cen os me álicos apo an nue os enlaces,
con ene gía a iable, a la opología de la molécula y, po an o, es abilizan
las p o eínas. La eliminación del me al de la es uc u a p o eica conlle a
una disminución en la empe a u a de desplegamien o [Noye y Pu nam,
1981; Kea ing e al., 1988; Feio e al., 2004; Feio e al., 2006; A a u e
al., 2009; Teilum e al., 2009]. De hecho, p o eínas pe enecien es a la
amilia de p o eínas in ínsecamen e deso denadas se pliegan sólo
cuando se les une su co ac o [Pe myako , 2008]. Algunas enzimas
meso ílicas ca ecen de á omos me álicos p esen es en sus homólogas
e mo ílicas. Es os me ales no son necesa ios pa a eje ce su unción y
su eliminación supone una meno empe a u a de desplegamien o [Fujii
e al., 1997].
6. Mayo empaque amien o: El empaque amien o se conside a un
impo an e indicado de la es abilidad de una p o eína. Dicho
empaque amien o se e leja en la exis encia de espacios no ocupados
po ningún á omo de la p o eína ni po su adio a ómico [Ro he e al.,
2009; Coleman, 2010]. Es os espacios acíos pueden encon a se
ce ados en el in e io de la ma iz p o eica, cons i uyendo ca idades, o
In oducción
57
abie as al ex e io , o mando los denominados bolsillos [Liang y Dill,
2001].
Un mejo empaque amien o p o eico conlle a un inc emen o
an o las in e acciones hid o óbicas como las a acciones de an de
Waals en el núcleo de la p o eína. De la misma o ma, un mayo
empaque amien o se aduce ambién en una meno azón en e el á ea
accesible al sol en e (SAS) de la p o eína y el á ea accesible al sol en e
de una es e a con el mismo olumen que la p o eína [Que ol e al., 1996;
Vog y A gos, 1997; S e ne y Liebl, 2001; Pace, 2009].
En las p o eína e mo ílicas se ha obse ado que la mayo
compac ación en compa ación con sus homólogas meso ílicas se
consigue median e el aco amien o de uno o más lazos; inc emen ando
el núme o de á omos en e ados en el in e io de la molécula y, po lo
an o, inaccesibles pa a el sol en e; op imización del empaque amien o
de las cadenas la e ales en el in e io ; y eliminación de ca idades
innecesa ias [Sen y Nilsson, 2012].
7. Mayo igidez: La es abilidad de p o eínas e mo ílicas es án, po
lo gene al, ligada a una mayo igidez es uc u al a empe a u a ambien e
[Bonisch e al., 1996; Ge shenson e al., 2000; Manco e al., 2000;
Rades ock y Gohlke, 2008]. Dado que la unción de una p o eína equie e
cie a lexibilidad, dicha igidez a empe a u a ambien e explica po qué
las enzimas e mo ílicas se inac i an a bajas empe a u as. Sin emba go,
cuando la empe a u a ambien e se ace ca a la empe a u a a la que el
enzima mues a su mayo ac i idad, la p o eína es su icien emen e
lexible como pa a lle a a cabo su unción [Beaucamp e al., 1997]. Po
an o, es e inc emen o en la igidez es esencial pa a man ene su
es uc u a ca alí icamen e ac i a a al a empe a u a. El inc emen o en la
igidez se consigue median e la es abilización de las hélices α,
op imización de las in e acciones elec os á icas, educción de la ensión
con o macional, e c.
In oducción
64
aplicable a odas las cup edoxinas. Po an o, el p oceso de
desplegamien o é mico en condiciones ae óbicas se puede ajus a al
esquema gene al de Lum y-Ey ing, explicado ya p e iamen e en el
apa ado 2.1: F↔U↔I, donde F es la p o eína plegada, U es la p o eína
desplegada de o ma e e sible, y siendo I la p o eína desplegada de
o ma i e e sible.
1.3.4.1.1. Compa ación en e las plas ocianinas de
Synechocys is sp. PCC6803 y Pho midium
Laminosum
Pho-Pc mues a alo es de T
m
de 83,1 ºC y de 76,4 ºC pa a las
o mas oxidada y educida, espec i amen e, a pH 5,5 y en ae obiosis
[Feio e al., 2004]. De hecho, es a p o eína es más es able en su o ma
oxidada independien emen e del pH ensayado. Sin emba go, las
plas ocianinas de plan as supe io es y de cianobac e ias mesó ilas
p esen an alo es de T
m
pa a las o mas educidas supe io es a los de
las oxidadas (Tabla 1). Tal es el caso de Syn-Pc, con alo es de T
m
de
66,1 ºC pa a la especie oxidada y de 71,9 ºC pa a la educida a pH 5,5 y
en p esencia de oxígeno [Feio e al., 2006]. Es a endencia es ambién
independien e del pH.
Tal como sucede con o as me alop o eínas, el cob e iene g an
impo ancia en la es abilización de la con o mación na i a de es as Pcs.
La eliminación del me al conduce a una d ás ica caída de en e 20 y 25
ºC en los alo es de T
m
pa a ambas p o eínas. Pe o, aún así, la T
m
de la
apo-Pc de P. laminosum sigue siendo 8,5 ºC más es able que la de
Synechocys is [Feio e al., 2006]. Es e hecho indica el papel que o as
in e acciones ienen en la es abilización de la ma iz p o eica, de la misma
o ma que sucede en o as p o eínas e mo ílicas [Vieille y Zeikus, 2001;
Li e al., 2005].
In oducción
65
Figu a 9. Alineamien o de las secuencias de Pho-Pc y Syn-Pc.
Los as e iscos ojos ma can los ligandos del cob e. Los esiduos idén icos o
simila es se hallan encuad ados.
La es abilización de Pho-Pc pa ece se p incipalmen e
hid o óbica, mien as que en Syn-Pc las ue zas elec os á icas pa ecen
ene un mayo papel, al como se puede deduci po su di e en e
compo amien o en e a la p esencia de sal [Feio e al., 2006].
Al compa a la es uc u a de ambas Pc llama la a ención que no
se cumplan algunas de las eglas comunes en la es abilización de
p o eínas e mo ílicas. Exis e la endencia gene al al aco amien o de los
lazos en p o eínas e mo ílicas; sin emba go, Pho-Pc iene lazos más
la gos que Syn-Pc. De hecho, dos de ellos (L5 y L7) p esen an
inse ciones de secuencia (Figu as 9 y 10). En cuan o a la composición
en aminoácidos, sólo se obse a una di e encia ap eciable en los
aminoácidos a omá icos, co espondien e a la exis encia de dos esiduos
de enilalanina (Phe3 y Phe80) en Pho-Pc in oluc ados en dos
ag upaciones hid o óbicas dis in as. La Phe3 in e acciona con Val21 y la
In oducción
66
Val23 median e in e acciones de Van de Waals. En Syn-Pc, en luga de
la Phe3, hay un esiduo de alanina, disminuyéndose así la in e acción
en e las heb as β1 y β2. Además, no exis e una di e encia signi ica i a
en el núme o de enlaces de hid ógeno o puen es salinos cuando se
conside a la o alidad de ambas Pc. Sin emba go, es a azón cambia
cuando se conside a únicamen e la egión de la p o eína que engloba las
heb as β5
y β6, el lazo L5 y la hélice a (Figu a 11). Es a egión cons i uye
la conocida ca a es e en Pcs, implicada en la in e acción de es a p o eína
con sus pa ejas isiológicas. Las dos p o eínas p esen an una homología
de secuencia del 63%, llegando a se del 92% en el en o no del me al.
Po el con a io, se educe has a un 43% cuando sólo se iene en cuen a
la ca a es e [Muñoz-López
b
e al., 2010].
La mayo es abilidad de Pho-Pc con espec o a Syn-Pc, y su
di e en e dependencia con el es ado edox, se debe a di e encias en la
ca a es e y en el lazo L7, que o ma pa e del ba il de la Pc. De hecho,
cuando sólo se conside a la ca a es e se de ec a un inc emen o en las
in e acciones hid ó obas y puen es de hid ógeno y salinos, o o gando a
es a egión una impo ancia de e minan e en la es abilidad de las Pc.
Cabe esal a que uno de los esiduos de his idina que liga al cob e se
encuen a p ecisamen e al inicio de la heb a β5, mien as que el lazo L7
da paso a la heb a β en cuyo ex emo se si úa o o ligando del cob e: la
cis eína [Muñoz-López
b
e al., 2010]. La composición en es uc u a
secunda ia ambién se e a ec ada en di e en e medida en ambas Pcs.
Las heb as β1, β2, β5 y β6 de Pho-Pc mues an una mayo es abilidad
que las espec i as de Syn-Pc [Feio e al., 2006].
El diseño de mu an es siemp e ha sido una he amien a muy ú il
pa a analiza la medida en la que un esiduo en conc e o pod ía con ibui
a una p opiedad de e minada. Pa a el caso conc e o de Pho-Pc, se
diseña on di e sos mu an es: Pho-F3A, si uado en la heb a β1; Pho-
F80A, si uado en el lazo L7, y Pho-P49G/G50P, localizado en el lazo L5
In oducción
67
[Muñoz-Lópezª e al., 2010]. Dichos cambios deses abiliza on ambos
es ados edox, aunque de o ma más e iden e en la especie oxidada.
Además, el doble mu an e Pho-P49G/G50P mos ó una dependencia de
la T
m
espec o al es ado edox del cob e igual al exhibido po Syn-Pc, con
una T
m
a pH 6 de 72,5 ºC pa a la o ma educida y de 69 ºC pa a la
oxidada. La disminución en composición en heb as β y la pé dida de la
in e acción que se es ablece en Pho-Pc en e la P o49 y la Ty 85, si uada
es a úl ima en el lazo L7 se conside a on los mo i os de la disminución
en la e moes abilidad.
Figu a 10. Alineamien o de las es uc u as de Syn-Pc y de Pho-Pc.
La es uc u a de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001) se ep esen a
en magen a, y la de Pho-Pc (código pdb: 1BAW; Bond e al., 1999), en azul. Se
han señalado las ca as no e y es e, así como las heb as
β
1,
β
2,
β
5 y
β
6 y los
lazos L1, L2, L5 y L7.
In oducción
68
Figu a 11. Di e encias en las in e acciones in amolecula es de la ca a es e
de Syn-Pc y Pho-Pc.
A la izquie da de la igu a se ep esen a Syn-Pc y, a la de echa, Pho-Pc. (A)
Ag upación hid o óbica o mada en e el lazo L5 y el ba il
β
. (B) Puen es de
hid ógeno en e las heb as
β
5 y
β
6. (C) Puen es salinos es ablecidos en el lazo
L5. Figu a adap ada de Muñoz-López
b
e al
.
, 2010.
In oducción
69
Es a doble mu ación, aún encon ándose a 20 Å del cen o de
cob e, induce una al e ación en el mismo cen o me álico isible po
es udios de espec oscopía de abso ción de ayos X (XAS) [Muñoz-
López
b
e al., 2010; Chaboy e al., 2011]. Los espec os de las o mas
educidas de Syn-Pc, Pho-Pc y Pho-P49G/G50P no mues an di e encia
alguna. No ablemen e, las es Pcs mues an T
m
simila es pa a es a
o ma edox (al ededo de 73 ºC). Sin emba go cuando se conside an las
o mas oxidadas, el espec o de Pho-Pc mues a cla as di e encias con
los de Syn-Pc y Pho-P49G/G50P, los cuales esul an supe ponibles. En
el espec o de Pho-Pc, el umb al de la egión XANES (“X- ay abso ion
nea edge s uc u e”) se desplaza 0,6 eV hacia ene gías in e io es con
espec o al umb al de las o as dos Pcs [Muñoz-López
b
e al., 2010], lo
cual es indica i o de una di e encia en la dis ibución elec ónica del
cen o de cob e [Chaboy e al., 2009]. Es udios compu acionales ab ini io
de la egión XANES de las o mas oxidadas indica on que es la dis ancia
en e el á omo de cob e y el azu e iola o de la cis eína que lo liga el
de e minan e de las di e encias en e Syn-Pc y Pho-Pc en el espec o de
XAS [Chaboy e al., 2009]. Es o unido al hecho de que las o mas
oxidadas de Syn-Pc y Pho-P49G/G5P p esen an T
m
no ablemen e
in e io es (65,0 y 69,0 ºC, espec i amen e) que Pho-Pc (81,8 ºC), lle ó a
la hipó esis de que una meno T
m
de la o ma oxidada es á ligada a una
mayo longi ud de dicho enlace. De hecho, Syn-Pc mues a un alo de
0,225 nm pa a la longi ud de es e enlace [Rome o e al., 1998], mien as
que en Pho-Pc es e alo es de 0,210 nm [Bond e al., 1999].
2. OBJETIVOS
En los úl imos años se ha in es igado en nues o g upo las ca ac e ís icas
es uc u ales que igen la mayo es abilidad de la plas ocianina de la
cianobac e ia e mó ila Pho midium laminosum espec o a su homóloga
mesó ila en la cianobac e ia Synechocys is sp. PCC6803, así como la
dis in a dependencia que los pun os de usión de las dos p o eínas
mues an espec o al es ado edox del me al. Los análisis
compu acionales ealizados sugie en que la egión comp endida en e los
esiduos 39 y 65 de e mina las di e encias en la e moes abilidad en e
ambas p o eínas. Asimismo, sus i uciones de aminoácidos en dicha
egión disminuyen la es abilidad de la p o eína e mo esis en e y al e an
la elación en e el es ado edox del me al y el pun o de usión de la
p o eína. Sin emba go, se desconoce po qué los esiduos si uados en
una egión lexible ( esiduos 44 - 56) y dis an e del cen o me álico
modulan la es abilidad é mica.
Pa a con as a la hipó esis de que dicha egión es la que de e mina las
di e encias en e las dos p o eínas y comp ende el ínculo en e su
compo amien o y el del cen o me álico, se ha p ocedido a la
es abilización de la plas ocianina de Synechocys is sp. PCC6803
median e mu agénesis di igida. Los obje i os del p esen e abajo, en
conc e o, son los siguien es:
1. De e mina las di e encias en las u as de desna u alización é mica
en e las plas ocianinas cianobac e ianas mesó ila (Synechocys is sp
PCC6803) y e mó ila (Pho midium laminosum).
2. Comp ende cómo la egión comp endida en e los esiduos 39 y 65
modula las di e encias de es abilidad en e los es ados oxidado y
educido de la plas ocianina mesó ila.
3. Mejo a la es abilidad de la cup op o eina mesó ila median e
mu agénesis di igida aplicando c i e ios no malmen e asumidos pa a
la es abilización de p o eínas.
Ma e iales y Mé odos
80
Figu a 12. Rep esen ación del cen o de cob e de la o ma oxidada de Syn-
Pc.
Se de allan los alo es de ca ga a ómica pa a los á omos de la p ime a es e a
de ligandos del cob e según Muñoz-López
b
e al., 2010. El pa ón de colo usado
es: azul pa a ni ógeno, ama illo pa a azu e, ojo pa a oxígeno, y ma ón pa a
cob e.
La minimización de ene gía de las cadenas la e ales de las
p o eínas se ealizó en 1.500 ciclos, de los cuales 100 ue on del mé odo
de máxima pendien e (“s eepes descen ”), pa a ali ia al sis ema de
posibles colisiones, y el es o de g adien es conjugados (“conjuga e
g adien ”). El p oceso se p olongó has a que se alcanzó el c i e io de
con e gencia del sis ema (0,04 kJ mol
–1
nm
–1
). El sol en e se some ió a
un o al de 5.000 ciclos de minimización de ene gía, de los cuales 100
ue on del mé odo de máxima pendien e, seguido de un paso de dinámica
molecula en el colec i o isobá ico-iso é mico (NPT) usando un escalado
iso ópico de la posición molecula con un iempo de elajación bá ica de
Ma e iales y Mé odos
81
2 ps a 298 K, con olándose la empe a u a median e el algo i mo de
Be endsen [Be endsen e al., 1984]. Pos e io men e, se ealizó la
minimización de la ene gía de odo el sis ema en 5.000 ciclos, con 300
del mé odo de máxima pendien e. La empe a u a del sis ema se
inc emen ó g adualmen e de 200 a 298 K o a 498 K, según el caso,
man eniendo en odo momen o cons an e la p esión del sis ema.
Las simulaciones se lle a on a cabo en el colec i o
mic ocanónico (NVE) du an e 1 o 10 ns usando 1,5 s como iempo de
in eg ación. La empe a u a se man u o cons an e a 298K y, en el caso
de la las dinámicas de la ga du ación, ambién a 498 K. En los casos de
Syn-A44D/D49P/A62L y Syn-V48I/G60A a empe a u a ambien e ue
necesa io ala ga la du ación de la dinámica has a los 20ns. Los
o og amas se g aba on con una ecuencia de 2,5 ps. Pa a es ingi los
modos de ib ación de los enlaces de los á omos de hid ógeno
empleamos el algo i mo SHAKE [Rychae e al., 1977]. Minimización,
equilib ado y dinámicas ue on ealizadas con el módulo PMEMD de
AMBER.
Los a chi os de coo denadas se p ocesa on median e el módulo
PTRAJ de AMBER. Los a chi os de RMSD, RMSF y adio de gi o
gene ados se expo a on al p og ama O iginLab Ve sión 8.0 [May y
S e enson, 2009] pa a su análisis.
La des iación de la media cuad á ica o RMSD (del inglés “Roo
Mean Squa e De ia ion”) pe mi e conoce la simili ud en e dos
es uc u as p o eicas. Se de ine RMSD como:
!"#=$1
%&|(
)
−*
)
|
+
,
)-.
Siendo N el núme o de á omos, y x
i
e y
i
las coo denadas de cada
uno de los á omos co espondien es a cada es uc u a a compa a . El
Ma e iales y Mé odos
82
RMSD p esen a un alo igual a 0 pa a es uc u as idén icas y a
inc emen ando a medida que las dos es uc u as o con o maciones se
an di e enciando.
Cuando lo que se desea es conoce la es abilidad de una
de e minada p o eína a lo la go de una ayec o ia de dinámica molecula ,
se p ocede a la de e minación de los RMSDs de cada una de las
con o maciones p o eicas ob enidas du an e la simulación espec o a la
es uc u a inicial. Pa a mac omoléculas del amaño de la Pc, se conside a
que la con o mación p o eica en cues ión man iene un es ado plegado
cuando el RMSD iene un alo in e io a 0,22 nm, mien as que alo es
supe io es a 0,5 nm son indica i os de un es ado desplegado [Deng e
al., 2013].
Las luc uaciones cuad á icas medias o RMSF (del inglés (“Roo
Mean Squa e Fluc ua ion”) e lejan la mo ilidad in e na de la p o eína,
pe mi iendo la iden i icación de egiones con al a o baja mo ilidad. Se
de ine como la des iación en e la posición de los á omos a iempo y la
posición p omedio du an e la simulación:
!"/=$1
&|0
1
−0|
+
2
1-.
Siendo T el núme o de con o maciones moni o izadas,
el
ec o coo denada pa a el á omo i- a iempo y el ec o p omediado
en el iempo pa a ese mismo á omo.
El adio de gi o (Rg) pe mi e conoce el g ado de compac ación
de una es uc u a p o eica [Lobano e al., 2008]. Se de ine como la
dis ancia media al cuad ado de cada á omo de la p o eína hacia su cen o
de g a edad.
Ma e iales y Mé odos
83
3=$1
!& 4
)
|0
)
−|
+
,
)-.
Siendo N el núme o de á omos, M la masa de los á omos en la
p o eína, m
i
y
i
son la masa y las coo denadas pa a el á omo -i, y R las
coo denadas del cen o de masa.
3.2.2.1. Análisis de componen es p incipales
Pa a sepa a los mo imien os in e elacionados de las
luc uaciones locales a mónicas en la molécula p o eica, se lle ó a cabo
el análisis de componen es p incipales (PCA), ambién conocido como
dinámica esencial o análisis de co a ianza.
Median e PCA, los da os de coo denadas pa a cada pe íodo de
iempo, ob enidos a pa i de las ayec o ias de dinámica molecula se
ajus an median e mínimos cuad ados a una es uc u a de e e encia pa a
elimina los mo imien os anslacionales y o acionales. Pa a ello se
cons uye la ma ix de co a ianza de las luc uaciones a ómicas (C) de
los C
α
, incluyendo el á omo de cob e:
C
56
=〈8X
5
−X
5,:
;8X
6
−X
6,:
;〉
Donde X son las coo denadas x-, y- y z- de los á omos
luc uando al ededo de su posición p omedio (X
0
).
C es una ma ix simé ica 3N x 3N, donde N es el núme o de C
α
incluyendo el á omo de cob e. Es a ma ix puede se diagonalizada a
a és de una ma ix de ans o mación o ono mal, dando como
esul ado un conjun o de alo es y ec o es p opios:
C=TDT
>
Ma e iales y Mé odos
84
Siendo C la ma iz de co a ianza, D la ma iz diagonal o mada
po los alo es p opios (λ) de C, T la ma ix de base o ono mal cuyos
ec o es columna son ec o es p opios de C, y T
es la ma ix aspues a
de T.
El p oceso de diagonalización esul a, po an o, en un conjun o
de 3N alo es p opios o ampli udes con su espec i o g upo de 3N
ec o es p opios. Los alo es p opios ep esen an las RMSF del sis ema
a lo la go del co espondien e ec o p opio, y, po an o, con ienen la
con ibución de cada componen e p incipal a la luc uación o al. Al
o dena los ec o es p opios de mayo a meno alo p opio, el p ime o
en la lis a desc ibe el mo imien o co elacionado de mayo escala,
mien as que el úl imo se co esponde con ib aciones de pequeña
ampli ud [Haywa d y L. de G oo , 2008].
La p oyección de odas las con igu aciones o iginales de la
ayec o ia de dinámica molecula sob e un ec o p opio gene a una
nue a ayec o ia que e ela los desplazamien os co elacionados po la
componen e p incipal, es deci , los modos en que una pa e de la p o eína
iende a ac ua de una o ma conce ada con o a pa e.
p
5
=μ
5
8X
5
−X
5,:
;
Siendo p
i
las coo denadas p incipales y µ
i
el ec o p opio que
ocupa la columna núme o i de T.
Pa a el análisis de componen es p incipales se emplea on los
módulos PCAzip y PCZdump, englobados en el p og ama PCAsui e
(h p://mmb.pcb.ub.es/so wa e/ pcasui e). Median e el módulo PCAzip se
compu an la ma ix de co a ianza, los ec o es y alo es p opios, así
como las p oyecciones pa a las ayec o ias [Meye e al., 2006],
esul ando en un a chi o comp imido. Como es uc u a p omedio se eligió
la calculada po el módulo PTRAJ de AMBER a pa i de las coo denadas
de odos los á omos a lo la go de la ayec o ia, excluyéndose las
Ma e iales y Mé odos
85
moléculas de agua e iones de sodio. El es o de pa áme os usados
ue on los o o gados po de ec o po el p og ama.
Los ec o es y alo es p opios, p oyecciones y animaciones a lo
la go de cada ec o p opio son ex aídos del a chi o comp imido
o iginado po el módulo PCAzip median e la aplicación PCZdump.
3.2.2.2. Análisis de con enidos coseno
Los espec i os componen es o con enidos coseno (ci) de cada
ec o p opio (i) se ob ienen con la inalidad de de e mina la medida en
la que los p incipales modos esenciales del análisis de co a ianza siguen
un compo amien o es ocás ico, o si el mues eo es o no ep esen a i o
de un es ado.
c
5
=2
TBCcosi π p
)
d
J
:
K
+
BCp
5+
J
:
d K
L.
Donde pi( ) es la ampli ud del mo imien o a lo la go del ec o
p opio i a iempo . El con enido coseno puede oma alo es en e 0 (no
coseno) y 1 (coseno pe ec o). Un al o con enido coseno indica que la
ayec o ia no ha alcanzado la con e gencia, po lo que es ecomendable
ala ga su du ación [Hess, 2000; Hess, 2002]. Sin emba go, una al a de
con e gencia no implica necesa iamen e que las di ecciones de los
modos o componen es p incipales no es én cla amen e de inidos
[Haywa d y de G oo , 2008].
Ma e iales y Mé odos
86
3.3. Análisis de la e moes abilidad de Syn – Pc
median e mu agénesis di igida
3.3.1.
O ganismos y condiciones de cul i o
Tan o pa a los abajos de manipulación de ADN como pa a la
p oducción de p o eínas ecombinan es de Synechocys is se empleó la
cepa ans o mable DH5α de Esche ichia coli (E. coli; Hanahan, 1983;
Be hesda Resea ch Labo a o ies), mien as que pa a la exp esión de
Pho-Pc se eligió E. coli K12. Las células compe en es ue on p epa adas
po el Se icio Técnico de Cul i os del Cen o de In es igaciones
Cien í icas “Isla de la ca uja” siguiendo el p ocedimien o desc i o po
Hanahan, (1983).
El medio de c ecimien o habi ual pa a los cul i os líquidos o
sólidos de E. coli ue el de Lu ia-Be ani (LB; Samb ook e al., 1989),
suplemen ado con ampicilina (100 mg L
–1
) pa a la selección de plásmidos
con esis encia a es e an ibió ico, y sul a o de cob e (100 μM) como uen e
de cob e pa a la plas ocianina. Pa a p epa a medio sólido se añadió aga
has a una concen ación inal de 15 g L
–1
. La es e ilización de los medios
e ins umen al se lle ó a cabo po au ocla ado, a 1 a mós e a de
sob ep esión y 120 °C du an e 20 minu os.
Los cul i os en medio sólido se ealiza on en cajas de Pe i
incubadas a 37 °C. Los cul i os líquidos u ina ios se ealiza on en ubos
de ensayo y ma aces E lenmeye de 250 mL o 5 L, según uso.
3.3.2.
Ob ención de ADN de plas ocianinas
mu an es
Las mu aciones pun uales in oducidas en el gen pe E sil es e,
que codi ica pa a Syn-Pc, se lle a on a cabo median e eacciones de
Ma e iales y Mé odos
87
PCR (Polime ase Chain Reac ion) mu agénicas u ilizando el juego de
eac i os “Quick Change Si e-Di ec ed Mu agenesis Ki ” (S a agen Inc,
La Jolla, CA). Como ADN molde o pa en al de doble cadena se usó el
gen pe E clonado bajo el p omo o lacZ en el plásmido pBluesc ip II SK
(+), cons ucción denominada como pBS-WT a pa i de aho a. Pa a
ampli ica pBS-WT a la ez que se in oduce la mu ación deseada en el
gen ue on necesa ios pa es de oligonucleó idos o cebado es de ADN
complemen a ios a la doble cadena de ADN a excepción de aquéllas
bases a mu a (Tabla 2). Pa a el diseño de los cebado es nos ceñimos
en lo posible a las indicaciones del manual de ins ucciones del ki
(h p://se ie lab. e .co nell.edu/ esou ces/S a agene-Quikchange
Manual.pd ):
1. La longi ud de los cebado es depende del núme o de bases a
mu a , pe o debe encon a se en e los 25 y 45 nucleó idos.
2. Deben se complemen a ios e in e sos.
3. Ambos cebado es deben con ene las mu aciones deseadas,
es ando es as lo más cen adas posible en la secuencia.
4. La empe a u a de usión (T
m
) del pa de oligonucleó idos debe se
igual o supe io a 78 ºC. Pa a su cálculo se emplea la elación:
M
=81,5+0,41%GC−675 N−%M
⁄
Siendo N el núme o de bases del oligonucleó ido y %M el
po cen aje de bases desapa eadas.
5. E i a en lo posible la o mación de es uc u as secunda ias.
6. El con enido en G + C debe man ene se en e el 40 y el 60%. Los
ex emos deben con ene una o más G o C.
7. Deben es a os o ilados en su ex emo 5´.
Ma e iales y Mé odos
88
Pa a ob ene el mu an e doble Syn-V48I/G60A se empleó el
plásmido que con enía el gen mu an e Syn-V48I, y los cebado es a iba
mencionados pa a la mu ación Syn-G60A. Todos los oligonucleó idos se
adqui ie on a Sigma-Ald ich.
Pa a las eacciones de PCR se u ilizó la polime asa
e mo esis en e de Py ococcus u iosus (P u), po ado a de ac i idad
co ec o a 3´ 5´. El p og ama de ampli icación consis ió en un paso
inicial de 2 minu os a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 1 minu o de
desna u alización a 94 °C, 1 minu o de hib idación o de unión de los
cebado es, y 1 minu o a 72 °C pa a la ampli icación de dichos cebado es
en un e mociclado MJ-Mini (Bio ad). La empe a u a de hib idación
di ie e según la mu ación, ya que depende de la T
m
de los cebado es
usados. Po lo gene al, se eligie on empe a u as de en e 55 y 65 °C.
Tabla 2. Oligonucleó idos empleados pa a in oduci las di e en es
mu aciones di igidas en el gen pe E.
Se mues an los oligonucleó idos en sen ido 5´ 3´, así como sus empe a u as
de usión. En magen a se ma can las bases induc o as de las co espondien es
mu aciones.
A3F CGCTGCCAATTTTACAGTGAAAATGGG 71,70 ºC
G60A CTCTCCCACAAAGCCTTGGCCTTTGC 75,35 ºC
K59S GCTGCTAAGCTCTCCCACTCAGGCTTGG 78,30 ºC
L56I CACCGCTGCTAAGATCTCCCACAAAGG 75,55 ºC
T52I GTGGATGCTGACATCGCTGCTAAGCTC 75,55 ºC
T52Y GTGTGGATGCTGACTACGCTGCTAAGCTCTC 76,79 ºC
V42I CTCTCCCCTCATAACATTATTTTTGCCGCCGATGGTG
77,78 ºC
V48I GCCGATGGTATTGATGCTGACACC 79,92 ºC
Ma e iales y Mé odos
89
En e el p oduc o de las eacciones de ampli icación se
encuen a, po una pa e, ADN sin me ila de doble cadena idén ica al
molde sal o po las modi icaciones in oducidas y, po o a, ADN híb ido,
con una cadena pa en al no me ilada y o a me ilada con la mu ación. El
a amien o con la endonucleasa DpnI elimina el ADN me ilado y
hemime ilado median e co es en las secuencias GATC me iladas. El
p oduc o inal, lib e de cadenas pa en ales, se usó pa a ans o ma
células de E.coli DH5α median e choque é mico con el in de ampli ica
aquéllos plásmidos que no habían sido co ados po DpnI y que con enían
el gen con la mu ación deseada. El plásmido pBluesc ip II SK (+), y po
an o el pBS-WT y sus mu an es, p esen a el gen de esis encia a
ampicilina. Las colonias indi iduales que c ecie on as unas 16 ho as de
incubación a 37 °C en placas de Pe i con medio sólido LB suplemen ado
con ampicilina (100 mg L
–1
) se pica on y c ecie on en agi ación o e nigh
a 37 °C en ubos con 5 mL de LB líquido suplemen ado con ampicilina
(100 mg L
–1
). La pu i icación del ADN plasmídico se ealizó con la ayuda
de ki s come ciales basados en lisis alcalina (Fas plasmid Mini Ki , de
Eppendo ).
En odos los casos, pa a comp oba que las sus i uciones e an
co ec as y que las secuencias ca ecían de e o es, los esul ados de las
PCRs mu agénicas se secuencia on en el Se icio de Secuenciación del
Cen o Nacional de In es igaciones Oncológicas (CNIO).
El plásmido con el gen que codi ica el iple mu an e Syn-
A44D/D49P/A62L [Rome o e al., 1998] ue cedido po la doc o a Be a
de la Ce da Haynes, en onces miemb o del equipo de in es igación. Las
es sus i uciones, localizadas en los ex emos de las heb as quin a y
sex a, es ablecen esiduos conse ados en la mayo pa e de las Pc
sal o en Syn-Pc. Es e mu an e, a di e encia del sil es e, es capaz de
man ene se es able du an e días en su o ma oxidada, lo cual pe mi ió
ob ene una solución homogénea pa a su c is alización (pdb: 1PCS).
Ma e iales y Mé odos
96
a 597 y 600 nm se egis a on mien as se añadía de o ma g adual
e icianu o po ásico 50 mM. La a iación de la di e encia en e es as dos
medidas de abso bancia (A
600
- A
597
) se empleó pa a de e mina la
acción de p o eína oxidada a lo la go de la alo ación, la cual se
ep esen ó en e al po encial. El ajus e de la cu a ob enida a la ecuación
de Ne ns p opo ciona los alo es de po encial edox de cada una de las
p o eínas ensayadas:
W
M
=W
:
−
XF YXZ[ (]^_^_
Z[ 0`^a[]^_
Siendo E
m
el po encial de ec ado, E
0
el po encial en condiciones
es ánda , R la cons an e de los gases, T la empe a u a absolu a (Kel in),
n el núme o de elec ones que pa icipan en la eacción y F la cons an e
de Fa aday (96.485 C mol
–1
).
3.3.4.3. Espec o o ome ía ciné ica inducida po láse
La uncionalidad de las p o eínas modi icadas más ele an es se
analizó median e el seguimien o de los cambios de abso bancia
dependien e del es ado de óxido- educción del o osis ema I (PSI, a pa i
de aho a) a 820 nm, con un coe icien e de ex inción de 6,5 mM
-1
cm
-1
[Ma his y Sé i , 1981], po espec ome ía ciné ica inducida po láse , al
como se explica en He ás (1995), con algunas modi icaciones. El PSI
se exci ó con un pulso de luz a 532 nm de 4 ns de du ación gene ado po
un láse INDI-HG Nd:YAG (Spec a-Physics) (He ás y Na a o, 2011) y
a enuado con il os neu os has a jus o la in ensidad lumínica sa u an e
pa a e i a sob eexci a el PSI a lo la go del expe imen o. En onces el
PSI educe a un acep o exógeno, el me il iológeno, y ecibe un elec ón
Ma e iales y Mé odos
97
de la Pc, que uel e a se educida po el asco ba o p esen e en la mezcla
de eacción.
La luz de análisis p ocede de un láse con ínuo de diodo (modelo
LQN830-150C, de Newpo ). T as a a esa la cube a, su in ensidad se
midió con un o odiodo de sílice (Melles G io 13DSI009), p o egido de la
luz de ac i ación po un il o de id io con un máximo de ansmisión a
820 nm y una banda ancha de 9,4 nm.
La señal p oceden e del o odiodo se ampli icó en un
ampli icado de al a impedancia Melles G io 13AMP005 y se egis ó en
un osciloscopio digi al Nicole 450.
La mezcla de eacción con iene, en un olumen inal de 0,25 mL,
20 mM de ampón T icina-KOH pH 7,5,
β
-dodecilmal ósido 0,03%, una
can idad de PSI equi alen e a 0,35 mg de clo o ila mL
-1
, 0,1 mM
me il iológeno, 10 mM MgCl
2
y 1 mM asco ba o sódico. La concen ación
de plas ocianina se hizo a ia de 0 a 100 μM. Los expe imen os
ciné icos se hicie on en condiciones de pseudo-p ime -o den, al es a la
plas ocianina en exceso espec o al PSI.
Todos los expe imen os se ealiza on en una cube a con 0,1 cm
de paso de luz y a empe a u a ambien e. Pa a cada aza ciné ica se
p omedia on 6 medidas, espaciadas 30 segundos en e des ellos. Las
azas ciné icas se ajus a on a sumas de exponenciales pa a calcula las
cons an es de eacción, pa a lo cual se usó el mé odo Ma qua d con el
p og ama in o má ico diseñado y cedido po el D . P. Sé i (Saclay,
F ancia). El e o es imado en los alo es de las cons an es ciné icas de
pseudo-p ime -o den (k
obs
) de e minadas en la mayo ía de los
expe imen os es in e io al 10%, según la elación señal/ uido y la
epe i i idad de los da os.
El p oceso se ha ealizado en colabo ación con los doc o es
Manuel He ás Mo ón y José An onio Na a o Ca uesco.
Ma e iales y Mé odos
98
3.3.5. Medidas de es abilidad é mica
La moni o ización de la deses abilización é mica de las Pc pa a
la ob ención de las cu as de desplegamien o y sus alo es de T
m
se lle ó
a cabo median e es udios de luo escencia ( luo ime ía di e encial de
ba ido y espec oscopía de luo escencia), y de espec oscopía de CD
en el isible.
3.3.5.1. Es udios de luo escencia
El uso de la luo escencia pa a la moni o ización del
desplegamien o p o eico es á ampliamen e ex endido. Es o se debe a
que los luo ó o os usados son al amen e sensibles a los cambios de su
en o no du an e la desna u alización p o eica, y a la al a elación señal-
uido de la écnica.
Los luo ó o os ú iles en los es udios de luo escencia con
p o eínas pueden se in ínsecos ( esiduos a omá icos, coenzimas) o
ex ínsecos ( luo esceína, Syp o O ange, na anja de ac idina).
3.3.5.1.1. Fluo ime ía Di e encial de ba ido (DSF; Di e en ial
Scanning Fluo yme y)
En la écnica de luo ime ía di e encial de ba ido o DSF (del
inglés, “Di e en ial Scanning Fluo yme y”), el despliegue de la p o eína
se mani ies a con un inc emen o de la luo escencia de un luo ó o o cuyo
endimien o cuán ico se po encia en un ambien e hid o óbico. A medida
que una p o eína se a desplegando po e ec o del inc emen o de
empe a u a, el luo ó o o se a uniendo a las egiones hid o óbicas de la
misma, inc emen ando su luo escencia [Niesen e al., 2007].
Ma e iales y Mé odos
99
De los luo ó o os que pueden se empleados en es a écnica, el
Syp o O ange es el que p esen a mejo es p opiedades po su al a
elación señal- uido y po que la longi ud de onda necesa ia pa a su
exci ación (exac amen e a 492 nm) disminuye la p obabilidad de que
alguna molécula pequeña de la disolución pueda in e e i con las
p opiedades óp icas del mismo.
Es a écnica pe mi e ensaya múl iples condiciones a la ez en
poco iempo y p ecisa muy pequeñas can idades (1-15 µg) y
concen aciones de p o eína. Es po ello que ue empleada en es e
abajo pa a una de e minación p elimina de la T
m
de los di e sos
mu an es diseñados.
En los ensayos se emplea on placas de PCR de 96 pocillos, en
cada uno de los cuales se mezcla on 2,5 o 5 µg de plas ocianina oxidada
o educida en ampón os a o 10 mM pH 7,0 con una dilución de Syp o
O ange (In i ogen) 5X, en un olumen o al de 25 μl [Niesen e al., 2007].
En los ensayos iniciales, pa a man ene la p o eína en su es ado
o almen e educido u oxidado, se añadie on concen aciones
equimola es de asco ba o sódico o de e icianu o po ásico,
espec i amen e. En sucesi os in en os con la p o eína educida se sumó
un paso p e io de il ación en gel a a és de una columna PD-10
Sephadex G-25M pa a elimina el agen e educ o .
Pa a la de e minación de los alo es de T
m
de las o mas
oxidadas espec o a un g adien e de pH, se ecu e a ampón ci a o en
un in e alo de pH en e 4,5 y 7,5, al como se desc ibe en la bibliog a ía
[Feio e al, 2006].
Las medidas se egis a on en un sis ema RT-PCR (iQ5 Real
ime PCR de ec ion Sys em, Bio-Rad) p og amado pa a que la
empe a u a aumen a a g adualmen e a azón de 1 °C min
-1
desde los 20
has a los 95 °C. Los cambios en la in ensidad de la luo escencia del
Ma e iales y Mé odos
100
Syp o O ange se midie on exci ando las mues as a 492 nm y obse ando
la emisión de luo escencia a 575 nm. Los alo es de T
m
se calcula on a
pa i del p ime mínimo nega i o en la de i ada de las azas de
luo escencia egis adas, usando el p og ama Bio-Rad IQ5.
3.3.5.1.2. Espec oscopía de luo escencia
Los aminoácidos a omá icos ip ó ano, i osina y enilalanina,
son in ínsicamen e luo escen es. En e ellos, el ip ó ano p esen a un
mayo endimien o cuán ico y coe icien e de ex inción, unido a que los
esiduos de i osina y enilalanina le ansmi en po esonancia su
exci ación. Po ello, es e aminoácido es el más adecuado pa a segui el
desplegamien o de una p o eína [Roye , 2006].
Figu a 13. De alle del esiduo T p31 en la es uc u a idimensional de Syn-
Pc.
La es uc u a de Syn-Pc se co esponde con el código pdb: 1JXD [Be iniª e al.,
2001. El á omo de cob e se mues a en na anja y sus esiduos ligandos en g is.
Ma e iales y Mé odos
101
La in ensidad de la luo escencia emi ida po el luo ó o o es á
al amen e in luenciada po el en o no. El único esiduo de ip ó ano
p esen e en la molécula de Syn-Pc es el esiduo 31, localizado en el
núcleo de la p o eína ( igu a 13). En el es ado na i o, el máximo de
emisión se da a 320 nm cuando las mues as son exci adas a 275 nm. El
despliegue de la p o eína hace que el ip ó ano se exponga al sol en e,
po lo que se a enúa su emisión y el máximo se e desplazado a
al ededo de los 350 nm. G acias a ello se puede segui el
desplegamien o p o eico median e el inc emen o de luo escencia a 350
nm.
Pa a la ob ención de la cu a de deses abilización de las Pcs po
espec oscopía de luo escencia se siguió el p o ocolo p e iamen e
desc i o [Feio e al, 2004] con mínimas modi icaciones. Las medidas se
ealiza on en un luo íme o Ca y (Va ian) acoplado a un baño Polys a
cc2 (Hube ) pa a el con ol de la empe a u a. La empe a u a de la
mues a se egis ó u ilizando un sis ema Digi on 2008 do ado de un
e mopa lexible que se inse aba en el in e io de la cube a y en con ac o
con la mues a.
La solución de p o eína se encuen aba a una concen ación de
20 µM en ampón os a o 10 mM, pH 7. Pa a man ene la p o eína en un
único es ado edox a lo la go del expe imen o, se añadie on
concen aciones equimola es de asco ba o sódico o de e icianu o
po ásico. La empe a u a en la cube a se p og amó pa a que aumen a a
a azón de 1 °C min
-1
desde los 20 has a los 95 °C. La mues a es u o
some ida a agi ación con inua du an e odo el p oceso pa a la
homogeneización de la empe a u a. Las mues as se exci a on con luz
de longi ud de onda de 275 nm y se moni o izó la emisión de
luo escencia a 350 nm. Como con ol, an es y después de cada ampa
de empe a u a se ealizó un espec o de emisión desde 300 has a 600
nm, mien as se exci aba la mues a con luz ul a iole a a 275 nm de
Ma e iales y Mé odos
102
longi ud de onda. Los da os de luo escencia y empe a u a se egis a on
cada 30 segundos y se expo a on al p og ama O igin Ve sión 8.0 pa a
su análisis.
3.3.5.2. Dic oísmo ci cula
Tal como se expuso en el apa ado 3.3.4.1, la espec oscopía de
CD es una he amien a ex emadamen e ú il pa a la moni o ización de los
cambios es uc u ales causados du an e la desna u alización p o eica.
Pa a moni o iza los cambios de es uc u a secunda ia du an e
el desplegamien o se egis a on espec os de CD en el ul a iole a lejano
(190-240 nm) a la ez que se inc emen aba la empe a u a de los 25 a
los 95 °C a azón de 1 °C min
-1
. Se egis a on 3 espec os cada 5 °C con
una elocidad de ba ido de 200 nm min
-1
, siendo el espec o inal a cada
pun o el p omedio de dichas medidas. Las mues as con enían 15 μM de
p o eína en 10 mM de ampón os a o pH 7. La cu a de desplegamien o
ue ob enida siguiendo los alo es de dic oísmo ci cula a 219 nm.
3.3.5.3. Análisis de las ampas de empe a u a y ob ención de
la empe a u a de desna u alización
La ampa de desna u alización é mica se puede ob ene
ep esen ando en e a la empe a u a di ec amen e la p opiedad
obse ada expe imen almen e (en es e abajo elip icidad o emisión de
luo escencia) o bien la acción de p o eína desplegada (X
U
) o plegada
(X
F
), calculadas a su ez a pa i de dicha p opiedad.
En una eacción de desplegamien o F ↔ U, siendo F y U las
especies plegada y desplegada, espec i amen e, se de e mina la
acción de p o eína plegada:
Ma e iales y Mé odos
103
b
c
=dd+/
e =*
2
−*
*
c
−*
e ecuación 1
Y la desplegada:
b
=*
2
−*
c
*
−*
c
e ecuación 2
Donde [F] y [U] son espec i amen e las concen aciones de as
o mas plegadas y desplegadas, y
T
, y
F
y y
U
son, espec i amen e, la
p opiedad obse ada expe imen almen e (elip icidad o emisión de
luo escencia) a cualquie empe a u a T (Kel in), y las obse adas an es
y después de la ansición.
Pa a ob ene el alo de la T
m
se ealiza el ajus e de la cu a de
desna u alización a la ecuación esul an e de la adap ación ealizada po
Bolen y San o o (1988) a los p ocesos de desna u alización é mica
[Sinha e al, 2000], y en la que se asume que el alo de ΔCp en e las
o mas plegada y desplegada es ce o:
*
2
=
g
h
ig
j
k
l∆∆mnopq
lpqm
s
e
.ik
l∆∆mnopq
lpqm
s
e
ecuación 3
Aunque se in en ó en un inicio ajus a la dependencia de y
F
e y
U
con espec o a la empe a u a a una unción pa abólica [Sinha e al,
2000], el esul ado inal no se amoldó a los da os expe imen ales. Es o
se solucionó usando una dependencia lineal de y
F
e y
U
espec o a la
empe a u a.
De la misma o ma, si se ealiza la no malización de la cu a
espec o a la ecuación 1 y la cu a de desplegamien o consis e en la
Ma e iales y Mé odos
104
acción de p o eína desplegada en e a la empe a u a, el ajus e de la
ecuación se ealiza espec o a la misma ecuación 3. En es e caso, y
T
se
co esponde a la acción de p o eína desplegada a cualquie
empe a u a, y
F
e y
U
son, espec i amen e, la acción de plas ocianina
desplegada medida an es y después de la ansición.
Independien emen e de la escala usada, T
m
es la empe a u a
de desna u alización, de inida como la empe a u a a la cual la mi ad de
la población p o eica es á na i a y el o o 50% como desplegada; es deci
X
U
= 0,5. R es la cons an e uni e sal de los gases y ΔH
m
es ΔH
H
, el
cambio en la en alpía de an´ Ho a empe a u a igual a T
m
.
3.4. Ca ac e ización es uc u al de las
plas ocianinas mu an es median e di acción de
ayos X
Los ayos X aba can longi udes de onda desde los 0,1 y 10 Å,
es ando po an o en el mismo o den que la longi ud de los enlaces
molecula es (en e 0,8 y 1,8 Å). Es po ello que los ayos X se pueden
usa pa a la elucidación de es uc u as a ni el molecula .
La de e minación es uc u al de una molécula p o eica median e
di acción de ayos X se puede di idi en una se ie de e apas. La p ime a
de ellas consis e en la ob ención de c is ales a pa i de una mues a
soluble y pu a de p o eína.
Un c is al consis e en una ed idimensional, denominada ed
c is alina, en la que á omos y moléculas se o ganizan de o ma epe i i a
y pe iódica, con sol en e en e ellas. Es a ed c is alina se o ma a pa i
de la epe ición y anslación o denada de unidades más pequeñas
denominadas celdilla unidad. En un c is al p o eico, una celdilla unidad
con iene, de p omedio, una o más copias de la p o eína de in e és. Es la
Ma e iales y Mé odos
105
es uc u a de una celdilla unidad lo que se desea ob ene . Una celdilla
unidad se de ine po sus ejes (a, b, c) y sus ángulos (
α
,
β
,
γ
). A su ez,
la celdilla unidad se puede educi has a unidades asimé icas, que se
elacionan en e sí median e un elemen o de sime ía.
Todo lo an e io se localiza en el denominado espacio eal o
espacio di ec o.
Las condiciones en las que una p o eína c is aliza son muy
p ecisas, po lo que los expe imen os de c is alización implican el
esc u inio de mul i ud de condiciones.
Los mé odos de c is alización po di usión de apo son las
écnicas de c is alización más empleadas, en e las que se encuen an
las écnicas de go a colgan e (hanging d op) y go a sen ada (si ing d op).
En ellas, la solución de p o eína se mezcla con un ampón y una solución
p ecipi an e, y se coloca en una cáma a ce ada donde hay ambién un
ese o io de la solución p ecipi an e. Po equilib io de apo , el agua
pasa á de la go a al ese o io, esul ando en un g adual inc emen o de
la concen ación de solución p ecipi an e y p o eína en la go a. Como
esul ado, la solubilidad de la p o eína puede educi se y da luga a una
solución súpe sa u ada. Du an e dicho p oceso, se puede p oduci la
nucleación y pos e io c ecimien o de c is ales.
Una ez ob enido un c is al adecuado, és e se saca de la
solución de c is alización con ayuda de un lazo o loop de nylon y se
in oduce inmedia amen e en ni ógeno líquido si la solución mad e
dispone de su icien e c iop o ec o . En caso con a io, el c is al debe ía
pasa se b e emen e po un c iop o ec o y ápidamen e in oduci se en
ni ógeno líquido. Los c is ales deben pe manece ecubie os de la
solución mad e du an e el p oceso de mon aje y colección de da os pa a
e i a su secado y desin eg ación. El lazo de nylon con el c is al es
en onces mon ado di ec amen e en el di ac óme o y some ido a una
Ma e iales y Mé odos
112
Los da os de di acción ue on egis ados en la línea de haz
(beamline) I04 del sinc o ón, pe enecien e a la sección de c is alog a ía
mac omolecula , del Diamond Ligh Sou ce de Didco , (Ox o dshi e, UK).
Mien as que pa a el c is al del iple mu an e Syn-A44D/D49P/A62L se
usó sul a o amónico 1 M como c iop o ec o , en el caso del c is al del
mu an e simple Syn-V48I no ue necesa io c iop o ec o . El expe imen o
ue lle ado a cabo es ando en odo momen o los c is ales some idos a
una co ien e de ni ógeno gas a -170 ºC.
La in eg ación de las in ensidades de los pa ones de di acción
y la ob ención de los índices de Mille se ealiza on median e el paque e
in o má ico XDS [Kabsch, 2010]. Pa a esol e el p oblema de las ases
se ecu ió al mé odo de emplazamien o molecula , pa a lo cual las ases
iniciales ue on ex aídas de la es uc u a p e iamen e publicada del iple
mu an e Syn-A44D/D49P/A62L (código pdb: 1PCS; Rome o e al., 1998)
usando el p og ama Phase [McCoy e al., 2007].
Pa a e i a ob ene un modelo inal sesgado, odos los esiduos
de la es uc u a ue on sus i uidos po alanina como paso p e io al
e inamien o. Pa a el mu an e Syn-V48I ue necesa io, además, elimina
las secuencias en e los esiduos 7 y 11 y los esiduos 44 y 50.
Fue on necesa ios sucesi os pasos de e inamien o y modelado
manual de la molécula, ealizados con los p og amas PHENIX [Adams e
al., 2002; Adams e al., 2011] y COOT [Emsley e al., 2010]. Todas las
cadenas la e ales se añadie on y ajus a on siguiendo como guías los
mapas 2Fo-Fc y Fo-Fc. Las moléculas de agua se añadie on
manualmen e en las egiones donde el mapa Fo-Fc p esen aba máximos
de 3.0 σ.
4. RESULTADOS
Resul ados
115
4.1. Diseño de los mu an es de la plas ocianina de
Synechocys is sp. PCC6803
4.1.1. Mu aciones in oducidas en la zona de
in e acción del lazo L5 con el ba il: clus e
hid o óbico
Los lazos L1 y L5 son las zonas de mayo luc uación en odas
las Pc [Be iniª e al., 2001; A cangeli e al., 2001; Feio e al., 2006;
Muñoz-López
b
e al., 2010], inclusi es Syn-Pc y Pho-Pc. Po an o,
inc emen a las in e acciones hid o óbicas en e los lazos ecinos L5 y L7
puede da luga a la es abilización de Syn-Pc.
Figu a 14. Es uc u a idimensional de Syn-Pc y de alle de la in e ase
en e los lazos L5 y L7.
(A) Es uc u a idimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001)
mos ando en magen a los esiduos implicados en la o mación de la ag upación
hid o óbica en e el lazo L5 y el ba il, y, en na anja, el á omo de cob e. Las
moléculas de agua ue on in oducidas con el módulo “Sol a e” de Chime a. (B)
De alles de la in e ase en e los lazos L5 y L7 de Syn-Pc mos ando la ca idad
hid o óbica, calculada usando la aplicación “CASTp” [Binkowski e al., 2003].
Resul ados
116
Figu a 15. Es uc u a idimensional de Pho-Pc y de alle de la in e ase
en e los lazos L5 y L7.
(A) Es uc u a idimensional de Pho-Pc (código pdb: 1BAW; Bond e al., 1999)
donde se mues an en colo magen a los esiduos implicados en la o mación de
la ag upación hid o óbica en e el lazo L5 y el ba il. El á omo de cob e se
mues a en na anja. (B) De alles de la in e ase en e los lazos L5 y L7 de Pho-
Pc mos ando la ca idad hid o óbica calculada usando la aplicación “CASTp”
[Binkowski e al., 2003].
En el en o no del lazo L5 de Syn-Pc exis e una ca idad en la que
se in e calan dos moléculas de agua ( igu a 14) que pa icipan, jun o con
esiduos de los lazos L5 y L7 en la o mación de una ed de puen es de
hid ógeno. En su homóloga e mo esis en e, Pho-Pc, el lazo L5 p esen a
una inse ción de es esiduos que pe mi e la o mación de una
ag upación hid o óbica cons i uida po los esiduos de Phe80, Val48,
Ile55, P o81, P o49 y Ty 85 ( igu a 15). En Syn-Pc dicha ag upación se
educe a la Ty 79, la Val48 y la P o76 [Muñoz-López
b
e al., 2010]. La
impo ancia de es a egión en la es abilidad é mica de Pho-Pc se
demues a en mu an es en los que la Phe80 se cambia a alanina y la
Resul ados
117
P o49 se in e cambia con la Gly50, siguien e esiduo en la secuencia
[Muñoz-Lópezª e al., 2010].
4.1.1.1. Sus i ución V48I.
La alina 48 se localiza en el lazo L5, pa icipando en su
in e acción con el ba il ( igu a 16). Se espe a que la adición de un g upo
me ilo median e la sus i ución de es e esiduo po una isoleucina eduzca
el hueco en e el lazo L5 y el ba il, inc emen ando las in e acciones
hid o óbicas de la ag upación, disminuyendo la sol a ación, así como
e o zando las in e acciones de Van de Waals en e los esiduos de es e
á ea.
Figu a 16. Mu ación V48I en Syn-Pc.
(A) Es uc u a idimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001)
donde se ha mu ado el esiduo Val48 a Ile. (B) Rep esen ación a mayo escala
la in e ase en e los lazos L5 y L7 de la Pc mu ada.
El esiduo Ile48 se encuen a
colo eado en e de. Se mues an en magen a los esiduos que, jun o al 48,
o man la ag upación hid o óbica en Syn-Pc.
Resul ados
118
4.1.1.2. Sus i uciones L56I, T52Y y T52I
La Leu56 ( igu a 17) se localiza en el inicio de la hélice α de Syn-
Pc. Su eemplazo po un esiduo de isoleucina, más oluminoso,
p e ende inc emen a las in e acciones hid o óbicas de es a egión. Es e
esiduo ambién se encuen a en Pho-Pc (Ile55).
Figu a 17. Mu ación L56I.
(A) Es uc u a idimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001)
donde se ha mu ado el esiduo Leu56 a Ile. (B) Rep esen ación a mayo escala
la in e ase en e los lazos L5 y L7 de la Pc mu ada. El esiduo eemplazado se
colo ea en e de. Se mues a en magen a los esiduos que, jun o al 48, o man
la ag upación hid o óbica en Syn-Pc.
La eonina 52 se localiza en la zona in e media de la hélice α de
Syn-Pc ( igu a 18A). Pho-Pc p esen a en esa misma posición un esiduo
más oluminoso (Ile55), implicado en la o mación de la ag upación
hid o óbica ( igu a 15). Po an o, el cambio T52I se conside ó azonable
pa a es abiliza es a egión.
Resul ados
119
Figu a 18. Mu aciones T52I y T52Y.
Es uc u a idimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001)
donde se han mu ado el esiduo Th 52 a Ile (A) o a Ty (B). A la de echa de la
igu a se mues an a mayo escala la in e ase en e los lazos L5 y L7 de cada
uno de los mu an es. Los esiduos eemplazados se colo ean en e de. Se
mues an en magen a los esiduos que, jun o al 48, o man la ag upación
hid o óbica en Syn-Pc.
Las p o eínas e mo esis en es suelen usa los esiduos
a omá icos como pa e de sus ag upaciones po que su empaque amien o
Resul ados
120
da luga a egiones ela i amen e ígidas [Kannan, 2000]. De hecho, Pho-
Pc mues a un esiduo a omá ico (Phe80) en el lazo L7 que se encuen a
ausen e en Syn-Pc. El cambio T52Y ( igu a 18B) en el lazo L5 p e ende
ali ia en pa e es a al a c eando una in e acción de es e esiduo con
Ty 79.
4.1.1.3. Mu an es en las heb as β5 y β6: G60A, K59S y V42I
Syn-Pc y Pho-Pc di ie en en los pa ones de puen es de
hid ógeno en e las heb as β5 y β6 a empe a u a ambien e [Muñoz-
López
b
e al., 2010]. Es a desigualdad se debe posiblemen e a la
p esencia de una glicina en posición 60 en Syn-Pc en luga de un esiduo
de glu amina en la posición co espondien e de Pho-Pc ( igu a 11B).
Como ya se mencionó en la in oducción, los esiduos de glicina
p esen an una ele ada en opía con o macional y dan ambién luga a
olúmenes acíos o ca idades en el in e io de la es uc u a p o eica
[C eigh on, 1997], po lo que en p o eínas e mo ílicas suelen se
sus i uidos no malmen e po alanina ( igu a 19).
O a di e encia en la secuencia en e ambas p o eínas adica en
la lisina 59, que en Pho-Pc, es una se ina ( igu a 11). Po an o, se
in oduce el cambio K59S en Syn-Pc ( igu a 13).
La Val42 en Syn-Pc se co esponde con un esiduo de leucina
en la p o eína e mo ílica ( igu a 11). Aunque es e esiduo no pa ece se
el esponsable de la di e en e p opo ción de puen es de hid ógeno en e
ambas p o eínas, el p og ama CUPSAT [Pa hiban e al., 2006] indica que
la mu ación V42I se ía la más es abilizan e den o de la ca a es e. Según
es a aplicación, la mu ación V42I mues a un alo de ΔΔG
c
de 1,27 kJ
mol
-1
.
Resul ados
121
Figu a 19. Mu aciones V42I, K59S y G60A
Es uc u a idimensional de Syn-Pc (código pdb: 1JXD; Be iniª e al., 2001)
donde se ma can en e de las mu aciones V42I, G60A y K59S.
4.1.1.4. Sus i ución A3F
Cálculos p e ios de dinámica molecula ealizados po miemb os
del g upo mues an que las heb as β1 y β2 de Syn-Pc son menos es ables
que en Pho-Pc, lo que a su ez epe cu e en la es abilidad de la e ce a
heb a β. De hecho, la mo ilidad de oda es a egión en Syn-Pc es ele ada
[Feio e al., 2006]. Sin emba go, en Pho-Pc es a misma egión se mues a
más ígida en las simulaciones bajo idén icas condiciones.
Como ya se adelan ó en la in oducción, Pho-Pc iene un esiduo
de Phe en la posición 3 (heb a β1) que in e acciona median e con ac os
de Van de Waals con las Val21 y Val23 (Ile23 en Syn-Pc) (heb a β3). En
Syn-Pc hay una alanina en luga de Phe3 ( igu a 20). Cabe además
Resul ados
128
Ninguna de las mu aciones ha inc emen ado el RMSF
co espondien e al lazo L6 espec o a la o ma sil es e (máximo en el
esiduo 65).
4.3. Análisis de la e moes abilidad de Syn-Pc
median e mu agénesis di igida
4.3.1. Exp esión y pu i icación de plas ocianinas
sil es es y mu an es.
En la abla 4 se exponen los endimien os de p oducción (mg L
-
1
) en E.coli DH5a an o de la o ma sil es e como de los mu an es de
Syn-Pc es udiados en es e abajo. La asa de exp esión a ía en e 4,16
mg L
-1
de Syn-V48I y los 0,6 mg L
-1
de Syn-A3F, lo que supone 3,5 mg L
-
1
de di e encia.
Tabla 4. Rendimien os de p oducción de las dis in as plas ocianinas
usadas pa a es e abajo.
Los alo es se e ie en a la concen ación de Pc en los ex ac os de pe iplasma
ob enidos al como se comen a en el apa ado 3.3.3 de ma e iales y mé odos.
P o eína Rendimien o (mg
L
-1
)
P o eína Rendimien o
(mg L
-1
)
Syn-Pc 2,37 Syn-V42I 1,06
Syn-V48I 4,16 Syn-K59S 1,23
Syn-G60A 1,7 Syn-A3F 0,6
Syn-T52I 1,58 Syn-V48I/G60A 2,66
Syn-T52Y 1,21 Syn-
A44D/D49P/A62L
3,86
Syn-L56I 0,9
Resul ados
129
Tabla 5. Po cen aje de ecupe ación de p o eína en cada uno de los
p ocesos de pu i icación has a la ob ención de la p o eína pu a.
La pu i icación se lle ó de acue do al apa ado 3.3.3.2 de ma e iales y mé odos.
Pa a los cálculos se ienen en cuen a sólo las acciones ob enidas con una
azón de pu eza R in e io a 5, 3 y 2,5 pa a la c oma og a ía de in e cambio
aniónico, c oma oen oque y il ación en gel, espec i amen e. n.a. no se aplica.
P o eína
Po cen aje de ecupe ación Can idad
inal de
p o eína
(mg L
-1
)
In e cambio
aniónico
(R<5)
C oma o
en oque
(R<3)
Fil ación
en gel
(R<2,5)
Syn-Pc 82,0 72,0 55,5 1,3
Syn-V48I 81,5 73,0 59,5 2,5
Syn-G60A 94,0 51,0 49,3 0,8
Syn-T52I 76,0 61,0 46,9 0,7
Syn-T52Y 90,0 58,4 52,6 0,6
Syn-L56I 79,6 46,5 54,2 0,5
Syn-V42I 81,3 55,0 57,0 0,6
Syn-K59S 81,5 45,2 47,7 0,6
Syn-A3F 71,0 26,0 n.a. 0,2
Syn-V48I/G60A 90,0 45,0 53,2 1,4
Syn-A44D/D49P/A62L 82,7 53,5 44,7 1,7
La abla 5 mues a los endimien os (%) en los sucesi os pasos
de pu i icación. Los endimien os medios ue on del 82,7, 53,3 y 48,0%
pa a los pasos de c oma og a ía de in e cambio aniónico,
Resul ados
130
c oma oen oque y c oma og a ía de il ación en gel, espec i amen e. El
coe icien e de abso ción usado ue de 4,5 mM
–1
cm
–1
a 597 nm pa a la
o ma oxidada de la p o eína [He ás e al., 1993].
A di e encia del es o de mu an es, Syn-A3F se p oducía en baja
p opo ción. Además, p ecipi aba en los p ocesos de diálisis y pasos
sucesi os de pu i icación, llegándose a pe de has a la e ce a pa e de
la p oducción p o eica inicial. Debido a ello, se omi ió la e ce a ase de
pu i icación consis en e en la columna de il ación en gel. La alícuo a de
p o eína más pu a p esen aba una azón R de 2,5, su icien e pa a los
ensayos pa a los cuales se iba a emplea .
Figu a 24. Espec os de abso ción en el U / is de Syn-Pc, Syn-V48I, Syn-
G60A, Syn-V48I/G60A y Syn-A44D/D49P/A62L.
Espec os ob enidos a pa i de las p o eínas en es ado oxidado. Los espec os
se ob u ie on en ampón os a o 10 mM pH 7 y en p esencia de e icianu o
po ásico pa a oxida los cen os me álicos de las Pc.
Resul ados
131
Syn-A44DD49PA62L
M 10 µg 15 µg
Syn-V48I
M 10 µg 15 µg
Pho-P49G/G50P
M 10 µg 15 µg
Figu a 25. Gel de elec o o esis en ac ilamida y condiciones
desna u alizan es de Syn-V48I, Syn-A44D/D49P/A62L y Pho-P49G/G50P.
En cada gel se ca ga on 10 y 15 μg de plas ocianina con una R meno a 2,5 pa a
las Pc de Synechocys is y 3,0 pa a Pho-P49G/G50P. Los geles se iñie on con
azul de Comassie, según lo desc i o en ma e ial y mé odos.
Todos los mu an es p esen an espec os de abso ción en el
UV/Vis idén icos al de la o ma sil es e. En la igu a 24 se mues a la
supe posición de los espec os de abso ción medidos en e 200 y 750 nm
de los mu an es Syn-V48I, Syn-G60A, Syn-V48I/G60A y Syn-
A44D/D49P/A62L, así como de Syn-Pc, en sus o mas oxidadas. Las
mues as exhiben azones de pu eza (R) en e 2,5 y 2,8, lo que se e leja
Resul ados
132
en la di e encia en el pico a 278 nm. Los máximos a 278 y 597 nm son
debidos a la abso ción de los esiduos a omá icos de la p o eína,
mayo i a iamen e del ip ó ano en posición 31, y del cen o de cob e,
espec i amen e. El pico que apa ece a 421 nm co esponde a es os de
e icianu o po ásico usado pa a oxida las mues as.
En la igu a 25 se mues an las imágenes de los geles de
elec o o esis en ac ilamida y condiciones desna u alizan es de las
mues as de Syn-A44D/D49P/A62L, Syn-V48I y Pho-P49G/G50P que se
u iliza on pa a la ob ención de c is ales. Como se demues a en la igu a,
las p o eínas se pu i ica on a homogeneidad elec o o é ica.
4.3.2. Análisis uncional.
4.3.2.1. De e minación de la es uc u a secunda ia median e
dic oísmo ci cula .
En la igu a 26A se mues a la supe posición de los espec os de
dic oísmo ci cula en el UV lejano de Syn-Pc y de odos sus mu an es
diseñados y es udiados en es e abajo.
Todas las p o eínas ecombinan es es aban pe ec amen e
plegadas. Al supe pone los espec os se obse an lige as di e encias, lo
que indica alguna, muy le e, pe u bación de la es uc u a secunda ia.
Es a ap eciación se co obo a con los po cen ajes en es uc u a
secunda ia ob enidos con el p og ama CDp o ( igu a 26B). Todos los
mu an es, así como la o ma sil es e, y al como sucede con el es o de
plas ocianinas [Redinbo, e al. 1994], son p o eínas undamen almen e β,
con un con enido mínimo en hélice α.
Resul ados
133
Figu a 26. Espec os de CD en el UV-lejano (A) y con enido en es uc u a
secunda ia (B) de Syn-Pc y de los mu an es ensayados en es e abajo.
Todas las mues as con enían 3 μM de p o eína oxidada en ampón os a o 10
mM pH 7,0. Las medidas ue on ealizadas a 25 ºC, usando una cube a de
cua zo con un paso de luz de 0,1 cm. Cada uno de los espec os es el esul ado
de p omedia 20 espec os sencillos. El con enido en es uc u a secunda ia se
calculó usando el p og ama CDp o al y como se de alla en ma e iales y mé odos.
4.3.2.2. Medidas po enciomé icas.
En la igu a 27 se ep esen an las cu as de alo aciones edox
de Syn-Pc y de odos sus mu an es, a excepción de T52Y y T52I, cuyos
alo es de T
m
no mos a on di e encias signi ica i as con la del sil es e
según la écnica de DSF ( éase el apa ado 4.4.1). También se mues an,
como con oles, las alo aciones edox de Pho-Pc y su doble mu an e,
Pho-P49G/G50P.
Resul ados
134
Figu a 27. Valo aciones edox de Syn-Pc y de aquéllos de sus mu an es en
los que se obse ó un cambio conside able en la T
m
de la o ma oxidada
según la écnica de DSF.
Como con oles se mues an ambién las cu as ob enidas pa a Pho-Pc y Pho-
P49G/G50P. Los da os expe imen ales se mues an con símbolos ( iángulos
in e idos) y el ajus e a la ecuación de Ne ns median e línea con ínua. Pa a las
medidas se siguió el p o ocolo desc i o po O ega e al. (1988). Las mues as
con enían 10 μM de Pc en ampón os a o 50 mM, pH 7,0, asco ba o sódico 1
mM y 40 μM de cada uno de los mediado es diaminodu ol (E
m,7
= +240 mV), 1,4–
p– benzoquinona (E
m,7
= +293 mV) y menadiona (E
m,7
= +422 mV), en un
olumen inal de 3 mL.
Resul ados
135
Los po enciales edox es ánda apa en e a pH 7,0 de las
p o eínas mu adas de Syn-Pc no se a ec an en g an medida po los
cambios in oducidos, a excepción de Syn-A3F. Es e mu an e mos ó un
po encial casi 55 mV más educ o . Pa a Syn-Pc, Syn-A44D/D49P/A62L,
Pho-Pc y Pho-P49G/G50P los po enciales edox ob enidos se ajus an a
los desc i os en la bibliog a ía [He ás e al., 1993; Rome o e al., 1998;
Balme e al., 2001; Muñoz-López
a
e al., 2010], siendo espec i amen e
338,8, 351,3, 323,15 y 323,24 mV. En e el es o de modi icaciones, Syn-
L56I y Syn-K59S expe imen an una le e caída de su po encial edox,
has a ap oximadamen e los 325 mV, ace cándose a los de Pho–Pc y su
doble mu an e. Las es an es p o eínas mos a on un po encial
lige amen e más nega i o (Syn-G60A, 333,23 mV; Syn-V48I-G60A,
335,67 mV) o posi i o (Syn-V48I, 344,36 mV) que el de la o ma sil es e.
Es as a iaciones del po encial édox con las di e sas
mu aciones in oducidas pueden se indica i as de una al e ación del
cen o de cob e [Li e al., 2004; Si y Li, 2009].
4.3.2.3. Espec o o ome ía ciné ica inducida po láse .
Las mu aciones Syn-V48I, Syn-G60A, Syn-V48I/G60A y Pho-
P49G/G50P se encuen an localizadas odas ellas en la ca a es e de la
p o eína, egión implicada en las in e acciones elec os á icas que
in e ienen en la o mación de los complejos de las Pcs con sus dianas
isiológicas [Díaz-Mo eno e al., 2005]. A pesa de que los cambios a
es udia no supusie on modi icaciones de ca ga, se quiso comp oba si
a ec aban a la uncionalidad de la p o eína. Pa a ello, se moni o izó el
decaimien o mono ásico de la abso bancia a 820 nm del P700
+
del
PSI al
se educido po la Pc (no mos ado). La cons an e de pseudo-p ime
o den k
obs
pa a la educción del PSI depende linealmen e de la
concen ación de p o eína ( igu a 28).
Resul ados
136
Figu a 28. Dependencia de la cons an e obse ada (k
obs
) espec o a la
concen ación de Pc pa a la educción del PSI.
Tabla 6. Cons an es bimolecula es de la eacción de educción del PSI
po las dis in as Pcs en condiciones es ánda (k
2
).
P o eína K
2
x 10
-6
(M
-1
s
-1
)
Syn-Pc 5,7
Syn-V48I 6,4
Syn-G60A 5,7
Syn-V48I/G60A 8,4
Syn-A44D/D49P/A62L 4,7
Pho-Pc 6,5
Pho-P49G/G50P 6,1
Resul ados
137
En la abla 6 se mues an las cons an es de segundo o den (k
2
)
ex aídas a pa i de las ec as de eg esión de la igu a 28. Todos los
mu an es de Syn-Pc p esen an alo es de k
2
muy simila es al del
sil es e, a excepción del doble mu an e V48I/G60A, cuya cons an e
bimolecula iene un alo 1,5 eces supe io al de Syn-Pc. La doble
mu ación P49G/G50P no a ec a en ninguna medida a la in e acción de la
Pc de P. laminosum con el PSI.
La eacción en e el PSI y las plas ocianinas de Synechocys is y
de Pho midium, sil es es y mu an es, se ajus a a un mecanismo de
eacción limi ada po colisión o ien ada o ciné ica ipo I [He ás e al.,
1994; He ás e al., 1995; Schla b-Ridley e al., 2002].
4.3.2.4. De e minación de la es uc u a del cen o de cob e
median e dic oísmo ci cula .
Las a iaciones en el espec o de CD en la egión del isible se
co elacionan con di e encias en la es uc u a elec ónica del cen o de
cob e [Solomon e al., 1976; Solomon e al., 1980; Gewi h y Solomon,
1988; LaC oix e al., 1996]. En la igu a 29 se mues a el espec o de Syn-
Pc, donde se señalan las ansiciones elacionadas an o con las
ans e encias de ca ga que se dan en e el á omo de cob e y sus cua o
ligandos (λ< 600 nm), como con las ansiciones d-d del á omo de cob e
(λ>600 nm).
En las igu as 30 y 31 se mues an los espec os en el isible de
los mu an es de Syn-Pc que mos a on una T
m
supe io e in e io ,
espec i amen e, al sil es e, según DSF ( éase el apa ado 4.4.1). En
cada una de las g á icas se supe ponen los espec os de uno de los
mu an es con los de Pho-Pc y Syn-Pc. Tal como se obse a en la imagen,
los espec os son, en gene al, simila es, mos ando el pe il ípico pa a
Resul ados
144
pa a alo es iguales o in e io es a dicho pH, es os mu an es esul an más
es ables que la o ma sil es e. Es in e esan e señala que, aún cuando
no se obse e aumen o en la T
m
en los mu an es Syn-K59S y Syn-A3F, sí
pa ece habe un compo amien o di e en e espec o al pH. En el ejemplo
de Syn-K59S el cambio an b usco obse ado pod ía explica se po la
ecindad del esiduo mu ado con la His58, dada la apa ición de un pKa
al ededo de 6 en el mu an e.
4.4.2. Espec oscopía de luo escencia.
En las igu as 35 y 36 se han ep esen ado las cu as de
desplegamien o no malizadas ob enidas po espec oscopía de
luo escencia de las o mas oxidadas y educidas de Syn-Pc y de aquéllos
de sus mu an es que esul a on más es ables que el sil es e según la
écnica de DSF. Se indican los alo es de T
m
ob enidos a pa i del ajus e
pa a cada o ma edox, así como la di e encia en e los dos alo es de
T
m
. Resul a e iden e en odos los casos la ap oximación de ambas
cu as. Mien as que en Syn-V48I, Syn-V48I/G60A y Syn-
A44D/D49P/A62L es e esul ado es debido p incipalmen e a un
inc emen o de la es abilidad de la o ma oxidada, en Syn-G60A se debe
a la deses abilización de la educida, sin e se p ác icamen e a ec ada la
p o eína oxidada. Ya en Pho-Pc se obse ó una mayo a ec ación de la
es abilidad de la o ma oxidada que de la educida cuando se ealizaban
mu aciones pun uales, pe o en ningún caso se obse ó el e ec o con a io
[Muñoz-Lópezª e al., 2010].
Po an o, al compa a los con la o ma sil es e, las mu aciones
múl iples es abilizan el ba il en ambas o mas edox, mien as que en
Syn-V48I sólo se es abiliza en la o ma oxidada, sin al e a se en la
educida. Sin emba go, en Syn-G60A el ba il de la Pc educida se
deses abiliza, mien as que la o ma oxidada no se a ec a.
Resul ados
145
Figu a 34. Ejemplos del espec o de emisión de luo escencia y de la cu a
de desna u alización de Syn-Pc median e espec oscopía de luo escencia.
A) Espec o de emisión de luo escencia del mu an e Syn-V48I en su es ado
na i o (azul) y desplegado ( ojo). Las mues as ue on exci adas a 275 nm. B)
Cu a de desna u alización del mu an e Syn-V48I oxidado. Las mues as ue on
exci adas a 275 nm y el desplegamien o se moni o izó siguiendo el inc emen o
de luo escencia a 355 nm, al como se explica en ma e iales y mé odos.
De en e odos los mu an es, des aca, po una pa e, Syn-V48I.
Es e cambio supone una eno me capacidad es abilizado a. De hecho, no
sólo consigue casi sal a la di e encia en T
m
en e las o mas oxidadas y
educidas de Syn-Pc, sino que además e ie e el e ec o deses abilizado
de la mu ación Syn-G60A sob e el ba il de la p o eína educida. De
hecho, Syn-V48I/G60A mues a un alo de T
m
en su o ma educida
supe io al del p opio Syn-V48I, y una T
m
de la p o eína oxidada
in e media en e las de Syn-Pc o Syn-G60A y la de Syn-V48I. Po an o,
se necesi a del e ec o siné gico de ambas mu aciones pa a da luga a
una Pc de Synechocys is cuyo ba il sea más es able que el del sil es e
independien emen e del es ado edox.
Po o a pa e, el iple mu an e Syn-A44D/D49P/A62L no sólo
expe imen a una es abilización de ambas o mas edox, sino que, aún
con inuando siendo la o ma educida la de mayo T
m
, la p o eína oxidada
pa ece alcanza a una mayo empe a u a el es ado 100% desplegado.
Resul ados
146
Es o se debe a la deses abilización an g adual que su e la o ma
oxidada de es e mu an e, de o ma que p ecisa de un inc emen o en la
empe a u a de unos 30 ºC pa a alcanza el es ado o almen e
desplegado.
4.4.3. Dic oísmo ci cula
Como ya se adelan ó en el apa ado 4.3.2.1, los cambios en el
espec o de CD al inc emen a la empe a u a se puede usa pa a
de e mina los e ec os de una de e minada mu ación sob e la es abilidad
p o eica. Po ello, se miden los cambios en la elip icidad a 219 nm pa a
el seguimien o de la desna u alización é mica en p o eínas con un al o
con enido en heb as β [G een ield; 2006].
En las igu as 35 y 36 se han ep esen ado las cu as de
desplegamien o ajus adas ob enidas po CD de las o mas oxidadas
( e de), educidas (azul) y apo-Pc (magen a) de Syn-Pc y de aquéllos
mu an es que esul a on es abilizan es en los ensayos de DSF. Pa a
pode compa a con Pho-Pc y su doble mu an e Pho–P49G/G50P, se
ob u ie on ambién sus cu as de desplegamien o po CD ( igu a 37), no
ealizado con an e io idad a es e abajo. Las ablas 7 y 8 mues an los
alo es de T
m
ob enidos, espec i amen e, pa a las o mas oxidada y
educida, y pa a las apo-Pc.
Al igual que se obse aba en los ensayos de espec oscopía de
luo escencia, exis e una disminución en la di e encia de T
m
en e o mas
oxidadas y educidas de Syn-Pc y sus mu an es. Sin emba go, es a
di e encia es p ác icamen e igual pa a odos los mu an es (en o no a 6,5
o
C) cuando la es abilidad se moni o iza median e CD. Nue amen e es la
o ma oxidada la que expe imen a una mayo es abilización. Sin
emba go, en las o mas educidas se obse a una mayo a iabilidad,
Resul ados
147
llegando incluso a se le emen e deses abilizan e en el caso de Syn-
G60A.
Figu a 35. Cu as de desplegamien o no malizadas y ajus adas ob enidas
po espec oscopía de luo escencia y CD de las o mas oxidadas y
educidas de Syn–Pc y de aquéllos mu an es simples que esul a on
es abilizan es.
A la izquie da se mues an las cu as de desplegamien o ob enidas median e
espec oscopía de luo escencia, y, a la de echa, po CD. Las cu as
co espondien es a las o mas oxidadas se mues an en e de, las educidas, en
azul y las apo-Pc, en magen a. Acompañando a cada una de ellas y del mismo
colo se mues an los alo es de T
m
ob enidos del ajus e. En neg o se indican
las di e encias en e los alo es de T
m
. Los ensayos ue on ealizados a pH 7 al
como se explica en ma e iales y mé odos.
Resul ados
148
Figu a 36. Cu as de desplegamien o no malizadas y ajus adas ob enidas
po espec oscopía de luo escencia y CD de las o mas oxidadas y
educidas de los mu an es múl iples de Syn–Pc.
A la izquie da se mues an las cu as de desplegamien o ob enidas median e
espec oscopía de luo escencia, y, a la de echa, po CD. Las cu as
co espondien es a las o mas oxidadas se mues an en e de, las educidas, en
azul y las apo-Pc, en magen a. Acompañando a cada una de ellas y del mismo
colo se mues an los alo es de T
m
ob enidos del ajus e. En neg o se indican
las di e encias en e los alo es de T
m
. Los ensayos ue on ealizados a pH 7 al
como se explica en ma e iales y mé odos.
De o ma análoga a lo obse ado median e la écnica de
espec oscopía de luo escencia, median e CD se obse a ambén como
la mu ación V48I e ie e el e ec o deses abilizado de la G60A sob e la
p o eína educida. El doble mu an e Syn-V48I/G60A esul a, de hecho,
más es able pa a ambas o mas edox que la p opia Syn-V48I.
Los alo es de T
m
ob enidos po CD pa a Pho-Pc ( igu a 37A)
son muy ce canos a los de e minados po espec oscopía de
Resul ados
149
luo escencia en las mismas condiciones en es udios p e ios. Sin
emba go, las T
m
ob enidas pa a Pho-P49G/G50P ( igu a 37B) en el
p esen e abajo son lige amen e in e io es (3°C pa a ambas o mas
edox) que las ob enidas median e luo escencia [Muñoz-Lópezª e al.,
2010]. Es a a iación puede debe se a di e encias en el pH usado en los
dos abajos.
Tabla 7. Valo es de T
m
de las o mas oxidada y educida de Syn-Pc y sus
mu an es, así como de Pho-Pc y su mu an e Pho-P49G/G50P.
Los alo es de T
m
mos ados se ob u ie on a pa i del análisis de las cu as
esul an es de los ensayos de desna u alización é mica ealizados median e
espec oscopía de luo escencia y de CD ( igu as 35 a 37).
Espec oscopía de
luo escencia
Espec oscopía
de CD
P o eína
O
xidada
Reducida
Oxidada
Reducida
Syn-Pc 59,76 ± 0,14
68,53 ± 0,56
63,07 ± 0,12
72,01 ± 0,28
Syn-V48I 67,08 ± 0,03
68,71 ± 0,29
66,97 ± 0,74
73,83 ± 0,28
Syn-G60A 59,81 ± 0,45
62,83 ± 1,10
64,47 ± 0,57
71,34 ± 0,25
Syn-V48I/G60A 63,75 ± 0,24
70,31 ± 0,85
69,12 ± 0,41
75,53 ± 0,44
Syn- A44D/D49P/A62L
67,15 ± 0,28
70,01 ± 0,65
66,65 ± 0,27
73,12 ± 0,37
Pho-Pc 81,80 ± 0,40
75,70 ± 1,00
76,56 ± 0,52
73,88 ± 0,48
Pho-P49G/G50P 69,10 ± 1,00
72,30 ± 1,10
65,21 ± 0,40
69,41 ± 0,98
a
Los alo es de T
m
pa a Pho-Pc y Pho-P49G/G50P ob enidos po
espec oscopía de luo escencia no se ealiza on en es e abajo. Los alo es
mos ados han sido omados de la bibliog a ía [Muñoz-López e al., 2010;
Chaboy e al., 2011].
Resul ados
150
Figu a 37. Cu as de desplegamien o no malizadas y ajus adas ob enidas
po CD de las o mas oxidadas y educidas de Pho-Pc y de Pho-P49G/G50P.
Cu as de desplegamien o no malizadas CD de las o mas oxidadas ( e de),
educidas (azul) y apo-Pc (magen a) de Pho-Pc (A) y Pho-P49G/G50P (B).
Acompañando a cada una de ellas y del mismo colo se mues an los alo es de
T
m
ob enidos del ajus e. En neg o se indican las di e encias en e los alo es de
T
m
. Los ensayos ue on ealizados a pH 7 al como se explica en ma e iales y
mé odos.
4.4.4. Di e encias en e los esul ados de
espec oscopía de luo escencia y CD.
Como ya se ha mencionado, median e espec oscopía de
luo escencia se moni o iza la exposición del ip ó ano 31, si uado en el
núcleo hid o óbico del ba il de la Pc, a un ambien e acuoso [Roye ,
2006]. Sin emba go, median e dic oísmo ci cula en el UV a 219 nm se
sigue el cambio en con enido en heb a β de la p o eína al inc emen a la
empe a u a [G een ield, 2006], que no sólo a ec a al ba il, sino ambién
a las heb as β5 y β6, en la ca a es e de la Pc.
La exis encia de un in e media io en la u a de desplegamien o
se puede de ec a cuando las cu as ob enidas median e di e en es
écnicas espec oscópicas no pueden supe pone se. Es e es el caso de
las p o eínas es udiadas en es e abajo. En ningún caso, ya se
conside en indis in amen e las o mas oxidadas o educidas, las cu as
Resul ados
151
ob enidas po CD se pueden supe pone a las esul an es de la
espec oscopía de luo escencia. Es o indica, po an o, una u a de
desna u alización de, al menos, es es ados [Sancho, 2013], pa a Syn-
Pc y sus mu an es es udiados en es e abajo. Es e hecho di ie e de lo
p opues o en abajos an e io es [Feio e al., 2004; Feio e al., 2006;
Muñoz-Lópezª e al., 2010].
Los alo es de T
m
, así como la empe a u a a la que se alcanza
el 100% de p o eína desplegada, ob enidos po CD son, en la mayo ía de
los casos, supe io es a los ob enidos po luo escencia. Es e
compo amien o hace pensa que la p o eína su e en p ime luga una
expansión de la ma iz p o eica, pe mi iendo la en ada de moléculas de
agua en el in e io del ba il y la modi icación del en o no del ip ó ano,
mien as que la pé dida de es uc u a secunda ia se p oduce de una
o ma más g adual.
La excepción a lo an e io men e desc i o lo plan ean Syn-V48I y
Syn-A44D7D49P/A62L en sus o mas oxidadas. En es os dos casos,
an o po CD como po espec oscopía de luo escencia se ob ienen
alo es de T
m
p ác icamen e idén icos (en o no a 67 ºC pa a ambos). Sin
emba go, las cu as ob enidas po ambas écnicas dis an de se
supe ponibles ( igu a 38). Es o indica que, aunque sus alo es de T
m
sean
simila es, el g ado de coope a i idad y la en alpía del p oceso de
desplegamien o son di e en es.
En el caso de Syn-V48I la ampa de desplegamien o ob enida
po espec oscopía de luo escencia es muy ab up a, de o ma que en e
la p o eína o almen e plegada y la o almen e desplegada hay sólo 2 ºC
de di e encia (de 66 a 68 ºC). Es e hecho es indica i o de la exis encia de
un al o g ado de coope a i idad en el desplegamien o de las dis in as
egiones del ba il p o eico. Sin emba go, median e el seguimien o po
CD de la pé dida de heb a β, la si uación de p o eína o almen e
desplegada no se alcanza has a ap oximadamen e los 75 ºC.
Resul ados
152
Figu a 38. Cu as de desplegamien o no malizadas y ajus adas ob enidas
po espec oscopía de luo escencia y CD de las o mas oxidadas de Syn–
Pc, Syn–V48I y Syn–A44D/D49P/A62L.
Las cu as ob enidas po espec oscopía de luo escencia y CD se mues an en
ma ón y iole a, espec i amen e.
Syn-A44D/D49P/A62L, sin emba go, mues a pa a su o ma
oxidada una ampa de deplegamien o po espec oscopía de
luo escencia muy sua e, necesi ando que la empe a u a aumen e en 30
Resul ados
15
3
ºC (de ap oximadamen e 50 a 80 ºC) pa a pasa de o almen e plegada
a desplegada. En es e caso es amos an e un ejemplo de baja
coope a i ad en el desplegamien o p o eico. Median e CD el es ado
desplegado se alcanza a una empe a u a in e io (al ededo de los 74
ºC).
Po an o, en base a es os esul ados se puede suge i que a 68
ºC, el en o no del T p31 en Syn-V48I se encuen a o almen e expues o
a pesa de que la p o eína aún sigue man eniendo pa e de su es uc u a
secunda ia. En Syn-A44D/D49P/A62L, al con a io, la p o eína
desplegada ha pe dido g an pa e de sus elemen os de es uc u a
secunda ia a pesa de que man iene cie a compac ación de su nucleo
p o eico.
4.4.5. Análisis de la apo ación de la ma iz p o eica
y del cen o me álico a la es abilidad p o eica.
Pa a conoce has a qué pun o los inc emen os en la T
m
obse ados median e DSF, espec oscopía de luo escencia y CD se
debían a la es abilización de la ma iz p o eica o al cen o de cob e, se
ob u ie on ambién las cu as de desplegamien o po espec oscopía de
CD de las espec i as apo–Pc ( igu as 35 a 37). En la abla 8 se mues an
los alo es de T
m
ob enidos.
La apo ación de la ma iz p o eica end á dada po la T
m
de la
apo-Pc, mien as que la del cen o de cob e po la di e encia de T
m
en e
la o ma educida u oxidada y la de la p o eína sin el cob e. Las di e sas
mu aciones ensayadas a ec a án po una pa e a la ma iz p o eica,
induciendo una es abilización o una deses abilización. Pe o, a la ez,
pa e de los e ec os en la cadena polipep ídica pueden ansmi i una su il
ensión o al e ación en el cen o de Cu, a ec ando a su es abilidad. Po
an o, la es abilidad inal de las holop o eínas, oxidadas o educidas, se
Ma e ial Suplemen a io
256
8.1. Ma e ial Suplemen a io 1: Di usión de
esul ados y publicaciones
8.1.1.
Publicaciones en e is as
F u os-Bel án, E., J. Olloqui, M. Engel, A. Gue a-Cas ellano, J.J.
Cal en e, M. A. De la Rosa, R. And eu, A. Wagne , A. Díaz-Quin ana
(2015). In e play be ween he coppe si e and he emo e eas pa ch in
plas ocyanin. (en p epa ación).
Olloqui-Sa iego, J.L., F u os-Bel án, E., Roldán, E., Cal en e, J.J.,
Díaz-Quin ana, A., And eu R. (2012). Vol amme ic S udy o he Adso bed
The mophilic Plas ocyanin om Pho midium Laminosum. Elec ochem.
Commun., 19, 105-107. Doi: 10.1016/j.elecom.2012.03.012.
Muñoz-López, F.J., F u os Bel án, E., Díaz-Mo eno, S., Díaz-Mo eno,
I., Subías, G., De la Rosa, M.A. y Díaz-Quin ana, A. (2010) Modula ion
o coppe si e p ope ies by emo e esidues de e mines he s abili y o
plas ocyanins. FEBS Le . 584, 2346-2350.
doi:10.1016/j. ebsle .2010.04.013.
Díaz-Mo eno, I., Muñoz-López, F.J., F u os-Bel án, E., De la Rosa, M.A.
y Díaz-Quin ana, A. (2009). Elec os a ic S ain and Conce ed Mo ions in
he T ansien Complex be ween Plas ocyanin and Cy och ome om he
Cyanobac e ium Pho midium laminosum. Bioelec ochemis y 77, 43-52.
doi:10.1016/j.bioelechem.2009.06.003.
8.1.2. Comunicaciones a cong esos
F u os-Bel án, E., Muñoz López, F.J., De la Rosa, M.A. y Díaz Quin ana,
A. Mejo a de la Es abilidad Té mica de la Plas ocianina de Synechocys is
sp. PCC 6803. XXXII Cong eso de la SEBBM. O iedo, 2009
Ma e ial Suplemen a io
257
F u os-Bel án, E., Díaz-Mo eno, I., Muñoz-López, F.J., He ás, M.,
Na a o, J.A., De la Rosa, M.A. y Díaz Quin ana, A. Imp o emen o he
The mos abili y o Plas ocyanin om Synechocys is sp. PCC 6803 by Si e
Mu a ions. Wo kshop on Unde s anding T ansien In e ac ions in Biology.
Se illa, 2010.
F u os-Bel án, E., De la Rosa, M. A. y Díaz-Quin ana, A.The speci ic H-
bonding and packing a he in e ace be ween he -ba el and si e 2 a e
esponsible o he di e en s abili y o meso- and he mophilic
plas ocyanins. IV Spanish Po uguese Biophysical Cong ess. Za agoza,
2010.
F u os-Bel án, E., Díaz Mo eno, S., Chaboy Nalda, J., Wagne , A., Díaz
Mo eno, I., Muñoz López, F., Raugei, S., Ca loni, P., De la Rosa, M.A. &
Díaz Quin ana, A. Modula ion o a single coppe -ligand bond by emo e
esidues de e mines he s abili y o plas ocyanins. IV Spanish Po uguese
Biophysical Cong ess. Za agoza, 2010.
Díaz-Quin ana, A. Wagne , I. Díaz-Mo eno, E. F u os-Bel án, M. A. De la
Rosa, J. Chaboy y S. Díaz-Mo eno. Me al-p o ein in e play in p o ein
unc ion and s abili y. XXII Cong ess and Gene al Assembly o he
In e na ional Union o C ys allog aphy. IUC . Mad id, 2011.
Ma e ial Suplemen a io
258
8.2. Ma e ial Suplemen a io 2: Seguimien o del
desplegamien o p o eico de la Pc educida
median e DSF
Figu a TMS 1. Espec os de desna u alización de la o ma educida de
Syn-Pc median e DSF.
8.3. Ma e ial Suplemen a io 3: Seguimien o del
desplegamien o p o eico de la apo-Pc median e
DSF y espec oscopía de luo escencia
Figu a TMS 2. Cap u a de pan alla de los espec os de desna u alización
de la apo-Pc de Syn-Pc median e DSF.
Ma e ial Suplemen a io
259
Figu a TMS 3. Ejemplos del espec o de emisión de luo escencia y de la
cu a de desna u alización de la apo-Pc de Syn-Pc median e
espec oscopía de luo escencia.
A) Espec o de emisión de luo escencia de la apo-Pc de Syn-Pc en su es ado
na i o (azul) y desplegado ( ojo). Las mues as ue on exci adas a 275 nm. B)
Cu a de desna u alización de la apo-Pc de Syn-Pc. Las mues as ue on
exci adas a 275 nm y el desplegamien o se moni o izó siguiendo el inc emen o
de luo escencia a 355 nm, al como se explica en ma e iales y mé odos.
8.4. Ma e ial Suplemen a io 4: C is alización y
ob ención de la es uc u a c is alog á ica de
Syn-A44D/D49P/A62L
8.4.1. Ob ención de los c is ales
Los c is ales de Syn-A44D/D49P/A62L c ecie on as 24 ho as de
incubación a 19°C ( igu a TMS 4), independien emen e del mé odo de
di usión usado (go a colgan e o sen ada), mien as que a 4°C sólo se
obse ó p ecipi ación p o eica. De la misma o ma ampoco pa ecía in lui
en los esul ados el olumen de las go as.
Ma e ial Suplemen a io
260
go a colgan e go a sen ada
empe a u a ambien e empe a u a ambien e
Figu a TMS 4. C is ales ob enidos pa a el iple mu an e Syn-
A44D/D49P/A62L de la plas ocianina.
Los c is ales c ecie on an o en condiciones de go a colgan e (hanging d op)
como en go a sen ada (si ing d op) en p esencia de 3,2 M de sul a o amónico
en 0,1M de ampón os a o sódico pH 7 como solución p ecipi an e, y a una
empe a u a de incubación de 19°C. La concen ación de Pc usada ue de 10 mg
ml
-1
, en ampón T is-HCl 50 mM, pH 7.
8.4.2. Colección de da os de di acción y
p ocesamien o.
Figu a TMS 5. Alineamien o de las es uc u as c is alog á icas del
mu an e Syn-A44D/D49P/A62L ya publicada (1PCS.pdb,(Rome o e al.,
1998)) y la ob enida en es e abajo.
Ma e ial Suplemen a io
261
Tabla TMS 1
Pa áme o Valo
G upo espacial P3
2
21
Dimensiones de la celdilla unidad
a (Å); b (Å);c (Å)
α (º); β (º); γ (º)
34,10; 34,10; 110,46
90,00; 90,00, 120,00
Rango de esolución (Å) 1,513 – 29.531
(1.5821 -1.5132)
R
wo k
/R
ee
0,1498/0,1885
Nº de á omos
p o eína
sol en e
SO
4
800
124
5
Wilson B- ac o (Å
2
) 10,49
Residuos en Ramachand an plo
Fa o ables
Valo es a ípicos
72 (88,9%)
0 (0,0 %)
Ma e ial Suplemen a io
262
8.5. Ma e ial Suplemen a io 5: condiciones de
c is alización de Pho-P49G/G59P y go as
esul an es
Tes 1: Aunque las condiciones de c is alización de Pho-Pc y algunos de
sus mu an es desc i os en la bibliog a ía [Bond e al., 1999; C owley e
al., 2008] implicaban el uso de cacodila o sódico 0,1 M como ampón, la
no disposición del mismo lle ó el empleo de un ampón al e na i o. Se
decidió usa el mismo empleado en la bibliog a ía pa a el mu an e Syn-
A44D/D49P/A62L: os a o sódico po ásico 0,1 M, pH 6,5. Po ello, las
condiciones de pa ida ue on: go a con 1 μl p o eína oxidada 10 mg ml
-
1
en MES 0,1 M pH 6,5 mezclada con 1μl de solución p eci an e. En cada
pocillo se deposi ó 1 ml de solución p ecipi an e. En la abla TMS 1 se
de allan las composiciones de las di e en es soluciones p ecipi an es
usadas en es e es .
Tes 2: Condiciones expe imen ales de los ensayos de c is alización pa a
Pho-P49G/G50P co espondien es a condiciones del ki “C ys al sc een
HR2-110” de Hamp on Resea ch. Se eligie on aquellas condiciones que
o con u ie an cacodila o sódico como ampón o una composición simila
a los de allados en la bibliog a ía pa a la c is alización de Pho-Pc o alguno
de sus mu an es [Bond e al., 1999; C owley e al., 2008]. Sigiendo las
di ec ices del ab ican e se mezcla on 2 μl p o eína oxidada 10 mg ml
-1
l
en agua con 2 μl de solución p eci an e. En cada pocillo se deposi ó 1 ml
de solución p ecipi an e. En la abla TMS 2 se de allan las composiciones
de las di e en es soluciones p ecipi an es usadas en es e es .
Como e a de espe a , las mejo es condiciones esul a on se aquellas
que con enían Polien ilenglicol como solución p ecipi an e y cacodila o
sódico ihid a o pH 6,5 como ampón, al como indica la bibliog a ía pa a
o os mu an es y la o ma sil es e [Bond e al., 1999; C owley e al.,
2008].
Ma e ial Suplemen a io
263
Tabla TMS 2. Composiciones de las soluciones p ecipi an es usadas en el
es 1 de c is alización de Pho-P49G/G50P.
Sal Bu e P ecipi an e Go a
0,2 M Clo u o
de magnesio
0,1 M Fos a o de
So ense ,
pH 6,5
15% (p/ )
PEG
8,0
C is al de sal
(no se iñe con
azul de me ileno o
Izi )
0,2 M Ace a o
de zinc
0,1 M Fos a o de
So ense ,
pH 6,5
10% (p/ )
PEG
8,0
P ecipa ación de
p o eína y posible
c is al amo o
Tes 3: Basándonos en los esul ados del Tes 2 se decidió es a
di e en es concen aciones de polien ileglicol (PEG) 8000 (en e 8 y 18
%) y de pH.(en e 5,5 y 6,5). Las condiciones ue on: go a con 1 μl
p o eína oxidada 10 mg ml
-1
en MES 0,1 M pH 6,5 mezclada con 1μl de
solución p eci an e. En cada pocillo se deposi ó 1 ml de solución
p ecipi an e. No se ob u ie on esul ados concluyen es de es e es .
Ma e ial Suplemen a io
264
Tabla TMS 3. Composiciones de las soluciones p ecipi an es usadas en el
es 2 de c is alización de Pho-P49G/G50P. odas las condiciones
pe enecen al ki “C ys al sc een HR2-110” de Hamp on Resea ch.
Sal Bu e P ecipi an e Go a
Condición nº 7
0,1 M Cacodila o
sódico ihid a o,
pH 6,5
1,4 M, Ace a o
sódico
ihid a o
Cla a
Condición nº 8
0,2 M sodium
ci a e ibasico
dihid a o
0,1 M Cacodila o
sódico ihid a o,
pH 6,5
30% ( / )
2-p opanol
Cla a
Condición nº 15
0,2 M Sul a o
amónico
0,1 M Cacodila o
sódico ihid a o,
pH 6,5
30% (p/ )
PEG
8000
Buena p ecipi ación
p o eica
Condición nº 18
0,2 M Ace a o de
magnesio
e ahid a o
0,1 M Cacodila o
sódico ihid a o,
pH 6,5
20% (p/ )
PEG
l 8000
Buena p ecipi ación
p o eica
Ma e ial Suplemen a io
265
Sal Tampón P ecipi an e Go a
Condición nº 21
0,2 M ace a o
de magnesio
e ahid a o
0,1 M
cacodila o
sódico
ihid a o, pH
6,5
30% ( / ) (+/-)2-
Me il-2,4-
pen anodiol
Sepa ación de
ase
Condición nº 25
0,1 M Imidazol
pH 6,5
1,0 M ace a o
sódico ihid a o
Cla a
Condición nº 28
0,2 M ace a o
sódico ihid a o
0,1 M
cacodila o
sódico
ihid a o, pH
6,5
30% (p/ )
PEG
8000
Cla a
Condición nº 30
0,2 m sul a o
amónico
30%
PEG
8000
Mala p ecipi ación
p o eica
Una esis no se e mina, se abandona