Biosíntesis de carotenoides en hongos

280 15. biosÍntesis de carotenoides en Hongos Javier Ávalos y M. Carmen Limón biosíntesis de Carotenoides en hongos introducción Los hongos son organismos no fotosintéticos que forman un reino dentro de los eucariotas y que poseen una enorme versatilidad metabólica y capacidad de adaptación a ambientes ecológicos muy diversos. En muchos casos, su metabolismo incluye la capacidad de sintetizar carotenoides, objeto de este capítulo. Los hongos se dividen en varios grupos taxonómicos, entre los que figuran los ascomicetos, que deben su nombre a la formación de ascas, los basidiomicetos, que forman basidios, y los zigomicetos, que forman zigosporas. Con independencia del grupo taxonómico, los hongos pueden desarrollarse formando filamentos (hongos filamentosos) o células individuales (levaduras). Por sus facilidades de cultivo y manipulación en el laboratorio, los investigadores prefieren estudiar algunos hongos. Además, la diversidad de su metabolismo hace de ellos organismos de gran interés biotecnológico; algunas especies se han empleado como modelos de investigación en la síntesis de carotenoides. Capítulo 15 281 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos La síntesis de carotenoides en hongos se produce a partir del pirofosfato de geranilgeraniol (GGPP). El GGPP se sintetiza tras cuatro pasos consecutivos de condensación a partir de un precursor de cinco átomos de carbono, el pirofosfato de isopentenilo (iPP). Este compuesto se sintetiza en diferentes organismos mediante dos rutas biosintéticas diferentes. La primera deriva del hidroximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) a través del mevalonato, y la segunda, de la condensación de la hydroxietil-tiamina y el gliceraldehído 3-fosfato, con la D-1- deoxixilulosa 1-fosfato como intermediario (Rohmer et al., 1993). En los casos investigados, la síntesis de carotenoides en los hongos ocurre a través de la ruta del mevalonato. Todos los carotenoides tienen su origen en el fitoeno, un carotenoide incoloro de 40 átomos de carbono que se sintetiza por condensación de dos unidades de GGPP a través de un intermediario en conformación cis (figura 1). La introducción de dobles enlaces conjugados a esta molécula aporta a los subsiguientes carotenoides la capacidad de absorber luz visible, dándoles las características pigmentaciones amarilla, anaranjada o rojiza. La ruta difiere después en distintos hongos en función de las modificaciones químicas que se introducen, que normalmente incluyen la ciclación de uno o los dos extremos de la cadena lineal (anillos ε o β) o la introducción de grupos oxigenados. Aunque la capacidad de producir carotenoides es una característica frecuente en los hongos, no todos poseen esta ruta biosintética. Algunas especies muy empleadas en investigación, como Aspergillus nidulans o Saccharomyces cerevisae, carecen de los genes para esta ruta. En este capítulo se resume el conocimiento sobre los carotenoides producidos por hongos, prestando especial atención a aquellos en los que se ha profundizado más a nivel bioquímico y genético. figura 1. Biosíntesis del β-caroteno en hongos. La flecha discontinua resume los cuatro pasos consecutivos de desaturación, cuyos intermediarios son el fitoflueno, el z-caroteno y el neurosporeno (no mostrados). 282 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos de CarRA se separan como proteínas independientes (Torres- Martínez, Murillo y Cerdá-Olmedo, 1980), probablemente por digestión proteolítica (Arrach et al., 2001). Dicha separación física se ha demostrado recientemente en B. trispora mediante el reconocimiento con anticuerpos específicos para cada dominio proteico (Breitenbach, Fraser y Sandmann, 2012). La organización genética de los dos genes de la síntesis de β-caroteno es similar en las tres especies mucorales investigadas, con ambos genes transcritos de forma divergente a partir de una única secuencia reguladora. La ruta biosintética en estos organismos se ha contrastado sólidamente por estudios genéticos y bioquímicos, alcanzando su mayor detalle en P. blakesleeanus. Se conocen desde hace varias décadas los mutantes albinos del gen carB (que acumulan fitoeno) y los mutantes del gen carRA que pueden ser albinos (porque no acumulan ningún carotenoide) o rojos (porque acumulan licopeno) en función del dominio enzimático afectado (Cerdá-Olmedo, 1985; 1987). Dichos mutantes se obtuvieron posteriormente en M. circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Velayos et al., 1997) y en B. trispora (Mehta y Cerdá-Olmedo, 1995; Mehta, Obraztsova y Cerdá- Olmedo, 2003). El mismo resultado se obtuvo mediante el empleo de inhibidores químicos de estas enzimas, como la difenilamina para la desaturasa (Salgado, Bejarano y Cerdá- Olmedo, 1989) o el CFTA [2-(4-clorofenil)-tiotrietilamina • HCl] para la ciclasa (Goodwin, 1980). Los mutantes carB de P. blakesleeanus acumulan el isómero 15-cis del fitoeno (Goodwin, 1980), pero los intermediarios posteriores tienen configuración todo-cis. Este hecho, unido a que todos los mutantes que poseen fitoeno están afectados en el mismo gen carB (Ootaki et al., 1973) y que la desaturasa CarB es capaz de reconocer la forma cis del fitoeno (Fraser y Bramley, 1994), sugiere que la isomerización a la forma todo-trans la realiza Producción de β-caroteno El β-caroteno es uno de los carotenoides más extendidos en la naturaleza y su síntesis se lleva a cabo en diferentes hongos. La síntesis de β-caroteno a partir de fitoeno requiere cuatro pasos de desaturación, que dan como intermediario el licopeno y dos ciclaciones de tipo β (figura 1). A diferencia de otros organismos, las cuatro desaturaciones las lleva a cabo una misma desaturasa. Las dos ciclaciones las produce también una misma ciclasa. Síntesis de β-caroteno en mucorales En los zigomicetos, el β-caroteno parece ser el caroteno más frecuente, y se ha descrito su síntesis en varias especies del orden mucorales, como Phycomyces blakesleeanus (Cerdá-Olmedo, 1987), Blakeslea trispora (Navarro et al., 1995; Ávalos y Cerdá-Olmedo, 2004) y Mucor circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Fraser et al., 1996). El gen responsable de la desaturasa se ha estudiado en detalle en los tres mucorales mencionados, donde se denomina carB (Ruiz-Hidalgo et al., 1997; Velayos et al., 2000; Rodríguez-Saiz et al., 2004). A diferencia de las enzimas de la carotenogénesis de bacterias y organismos fotosintéticos, en los hongos la actividad ciclasa se encuentra en el extremo amino de una enzima bifuncional, cuya región del extremo carboxilo lleva a cabo la síntesis de fitoeno a partir del GGPP. Esta doble actividad se descubrió inicialmente en la levadura Xhantophyllomyces dendrorhous (Verdoes et al., 1999) y se confirmó posteriormente en los genes carRA de P. blakesleeanus (Arrach et al., 2001) y carRP de M. circinelloides (Velayos et al., 2000a; Sanz et al., 2011). Un gen similar se ha identificado también en B. trispora (Rodríguez-Saiz et al., 2004). En P. blakesleeanus se asume que los dos dominios proteicos 283 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos Producción de neurosPoraxantina en ascomicetos La neurosporaxantina es un apocarotenoide monocíclico de 35 átomos de carbono con un grupo carboxilo en el extremo lineal de la molécula (figura 2). Su nombre proviene de su descubrimiento en Neurospora crassa, donde se encontró junto con otros carotenoides (Zalokar, 1957). El análisis posterior de su estructura química reveló que se trata del ácido β-apo- 4’-carotenoico (Aasen y Jensen, 1965). La neurosporaxantina es producida también por los géneros Fusarium (Bindl, Lang y Rau, 1970; Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1986), Verticillium (Valadon y Mummery, 1969; Valadon et al., 1982) y Podospora (Strobel et al., 2009). En algunos hongos, la neurosporaxantina es objeto de modificaciones químicas secundarias, como la esterificación con un grupo metilo en Verticillium agaricinum (Valadon y Mummery, 1977) o con un grupo glucosilo en Fusarium sp. (Sakaki et al., 2002). El análisis de los carotenoides intermediarios detectados en Neurospora (Harding et al., 1969; Mitzka y Rau, 1977) y en Fusarium (Bindl, Lang y Rau, 1970; Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1987), sugieren rutas biosintéticas de neurosporaxantina muy parecidas en ambas especies, con cinco desaturaciones y un paso de ciclación, aunque con diferencias en el orden en que ocurren algunas de las reacciones (figura 2). Así, entre los carotenoides encontrados en N. crassa figura el 3,4-didehidrolicopeno, resultado de cinco desaturaciones en la molécula de fitoeno. Sin embargo, la ciclación puede producirse en pasos anteriores, como demuestra la detección de g-caroteno o β-zeacaroteno, procedentes de la ciclación del neurosporeno o el licopeno. Estos compuestos se encuentran también en Fusarium, mientras que el 3,4-didehidrolicopeno no ha sido aún descrito en este hongo (Bindl et al., 1970; Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1987). la propia desaturasa. Diferentes evidencias experimentales demuestran que en P. blakesleeanus, y posiblemente también en las otras especies mucorales estudiadas, las enzimas de la carotenogénesis se organizan como un complejo multimérico, formado por cuatro desaturasas y dos ciclasas, que se transfieren los sustratos entre sí (De la Guardia et al., 1971; Aragón et al., 1976; Candau, Bejarano y Cerdá-Olmedo, 1991; Sanz et al., 2002). La situación es algo más compleja en B. trispora, donde se han encontrado evidencias de dos ciclasas diferentes, una encargada de realizar las dos ciclaciones y otra capaz de hacer sólo la primera ciclación para producir g-caroteno. Síntesis de β-caroteno en otros hongos Además de los zigomicetos, algunos hongos de otros grupos taxonómicos también producen β-caroteno como caroteno predominante. Entre ellos figuran los basidiomicetos Rhodosporidium sp. (De Miguel et al., 1997), Sclerotinia sclerotiorum (Georgiou et al., 2001), Sclerotium rolfsii (Georgiou et al., 2001a), Sporidiobolus pararoseus (Han, He y Hang, 2012), Ustilago maydis (Estrada et al., 2010) y Ustilago sp. (Will, Garber y Kezdy, 1984; Will y Newland, 1985) y los ascomicetos Leptospkaeria michotii (Jerebzoff-Quintin y Jerebzoff, 1980), Aspergillus giganteus (El-Jack, Mackenzie y Bramley, 1988), Cercospora nicotianae (Daub y Payne, 1989), Aschersonia aleyroides (Van Eijk et al., 1979) y Penicillium sp. (Han et al., 2005). Los genes responsables de esta ruta han recibido escasa atención a nivel molecular en estos organismos, y sólo se ha descrito el gen de la desaturasa en C. nicotianae (Ehrenshaft y Daub, 1994). Como se describirá más adelante, el β-caroteno puede estar presente además como intermediario o producto lateral de la síntesis de xantofilas en otros hongos. También acumulan β-caroteno algunos mutantes de X. dendrorhous (Johnson, 2003) o Rhodotorula glutinis (Bhosale y Gadre, 2001). 284 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos 1990; Schmidhauser et al., 1990), AL-2 la sintasa de fitoeno (Schmidhauser et al., 1994) y AL-3 la transferasa de prenilo que sintetiza GGPP a partir de FPP (Sandmann et al., 1993). Mientras que los mutantes nulos para los genes al-1 y al-2 son viables, sólo se obtienen mutantes con actividad residual de AL-3 (Barbato et al., 1996), un resultado coherente con la utilización del GGPP para la síntesis de otros terpenoides esenciales. Análisis más detallados confirmaron que AL-1 es capaz de llevar a cabo las cinco desaturaciones de la ruta Los primeros pasos de la ruta coinciden con los de la síntesis de β-caroteno, empezando por la síntesis de fitoeno a partir de GGPP (Spurgeon, Turner y Harding, 1979). Los genes responsables de los primeros pasos se identificaron inicialmente en N. crassa gracias al análisis genético de mutantes albinos, denominados al-1, al-2 (Huang, 1964) y al-3 (Goldie y Subden, 1973). Sus posteriores estudios a nivel molecular mostraron que AL-1 es la desaturasa responsable de las reacciones de desaturación (Bartley et al., figura 2. Biosíntesis de la neurosporaxantina en Fusarium y Neurospora. Los intermediarios pueden variar según el orden en que se produzcan las reacciones. De acuerdo con los intermediarios detectados en las distintas especies, los pasos indicados con flechas blancas sólo se han observado en Neurospora, con flechas grises sólo en Fusarium, y con flechas negras en ambos géneros. Como rama lateral, el g-caroteno puede ser convertido también en β-caroteno (reacción no mostrada en la figura). 285 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos apoyen la separación física de los dominios sintasa de fitoeno y ciclasa como polipéptidos independientes. Las cinco desaturaciones y la ciclación dan lugar al toruleno, el precursor de la neurosporaxantina. La síntesis de esta xantofila requiere dos actividades enzimáticas adicionales. Una oxigenasa de carotenoides, codificada por los genes cao- 2 en Neurospora (Saelices et al., 2007) y carT en Fusarium (Prado-Cabrero et al., 2007), produce una rotura asimétrica en el extremo lineal de la molécula de toruleno para producir β-apo-4’-carotenal, que tiene 35 átomos de carbono. CAO-2 no es capaz de reconocer como sustrato al g-caroteno, por lo cual son necesarias las cinco desaturaciones para que esta enzima pueda llevar a cabo su reacción. Sin embargo, es capaz de producir el corte oxidativo en ausencia de ciclación, como indica la introducción de la ciclación al final de la ruta en Neurospora cuando este hongo se incuba a baja temperatura (Estrada et al., 2008a). El β-apo-4’-carotenal es sustrato de una deshidrogenasa de aldehído, codificada por los genes ylo-1 en Neurospora (Estrada et al., 2008b) y carD en Fusarium (Díaz- Sánchez et al., 2011), y que oxida el grupo aldehído a carboxilo para generar finalmente la neurosporaxantina. La participación de estos genes en la ruta biosintética fue confirmada por el fenotipo de sus pérdidas de función por mutación. Los mutantes albinos o carecen de caroteno (al-2, al-3, carRA) o acumulan fitoeno (al-1, carB), indistinguible a simple vista. Los mutantes cao-2 (Saelices et al., 2007) y carT (Prado-Cabrero et al., 2007) presentan una pigmentación rojiza, causada por la acumulación de toruleno. Finalmente, los mutantes de los genes ylo-1 (Estrada et al., 2008b) y carD (Díaz-Sánchez et al., 2011) muestran una pigmentación amarillenta, causada por una mezcla compleja de carotenoides. La carencia de la deshidrogenasa de aldehído (Hausmann y Sandmann, 2000) y que AL-2 posee también actividad ciclasa (Arrach, Schmidhauser y Ávalos, 2002), como ya se ha mencionado para la enzima ortóloga de otros hongos. Esta función dual de AL-2 se ha confirmado además mediante análisis de nuevos alelos mutantes del gen (Díaz- Sánchez et al., 2011a) y mediante ensayos enzimáticos en un sistema heterólogo (Sandmann et al., 2006). Este último estudio mostró además que AL-2 lleva a cabo preferentemente una única ciclación, como cabe esperar de su participación en la síntesis de un apocarotenoide monocíclico como la neurosporaxantina. Se han identificado también genes similares a al-1, al-2 y al-3 en Fusarium fujikuroi, donde se han denominado respectivamente carB, carRA (Linnemannstöns et al., 2002; Prado-Cabrero et al., 2009) y ggs1 (Mende, Homann y Tudzynski, 1997), habiéndose identificado también en otras especies de Fusarium (Jin, Lee y Lee, 2010; Ádám et al., 2011; Rodríguez-Ortiz et al., 2012). En el caso de al-2 y carRA, a diferencia de su homólogo de mucorales, no hay datos que 286 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos carotenal a β-apo-4’-carotenol y, presumiblemente, a derivados esterificados (Díaz-Sánchez et al., 2011). La mayoría de estos genes también mutan en Gibberella zeae (Fusarium graminearum), confirmando los fenotipos observados en F. fujikuroi (Jin, Lee y Lee, 2010). sÍntesis de astaxantina y otras xantofilas La astaxantina es una xantofila de color rojizo producida por microalgas y bacterias, con frecuencia en ecosistemas acuáticos, en los que a través de la cadena alimentaria acaban siendo fuente de pigmentación (color “salmón”) en muchos peces y crustáceos, así como en algunas aves, como los flamencos. La astaxantina es producida también por la levadura X. dendrorhous, anteriormente conocida como Phaffia rhodozyma (Johnson, 2003). Esta xantofila posee un notable interés biotecnológico, especialmente debido a su empleo en acuicultura para proporcionar pigmentación en truchas y salmones (Higuera-Ciapara, Félix-Valenzuela y Goycoolea, 2006). Su producción industrial se basa en gran medida en cultivos de X. dendrorhous y del alga Haematococcus pluvialis (Domínguez-Bocanegra, Ponce-Noyola y Torres-Muñoz, 2007). La astaxantina se sintetiza a partir del β-caroteno mediante la introducción de grupos ceto e hidroxilo en sus anillos β (figura 3a ). La síntesis de β-caroteno es llevada a cabo en x. dendrorhous por la desaturasa Crti (Verdoes et al., 1999a) y la sintasa de fitoeno-ciclasa CrtYB (Verdoes et al., 1999). Como ya se ha indicado, el análisis bioquímico de CrtYB permitió asignar por primera vez la actividad ciclasa en hongos a la región del extremo amino de la sintasa de fitoeno. En X. dendrorhous la conversión de β-caroteno en astaxantina la debería dar lugar a la acumulación de β-apo-4’-carotenal carotenal, por lo que estos mutantes deberían tener un color anaranjado, pero la inestabilidad de este carotenoide provoca la acumulación de otros derivados. En el caso del mutante ylo- 1, en función de las condiciones de cultivo, se ha detectado apo-4’-licopenal, apo-4’-licopenol (Estrada et al., 2008a), apo- 4’-g-carotenal, apo-4’-g-carotenol, y derivados esterificados, como 4’-apolicopeno-4’-miristato o 4’-apo-g-caroteno-4’- miristato (Sandmann, Takaichi y Fraser, 2008). La complejidad química de este mutante, conocido hace más de cuarenta años (Goldie y Subden, 1973), retrasó mucho la identificación de la actividad enzimática afectada. Sin embargo, el mutante del gen ortólogo en Fusarium, carD, presenta un color anaranjado en la fase inicial de cultivo, pero vira a un color amarillento a medida que envejece debido a la conversión del β-apo-4’- 287 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos El interés biotecnológico de las xantofilas ha justificado numerosos estudios para su búsqueda en otras levaduras. Tras la astaxantina destaca la torularodina, un derivado carboxílico del toruleno de estructura similar a la neurosporaxantina (figura 3b). La síntesis de torularodina ha recibido especial atención en el género Rhodotorula (Frengova y Beshkova, 2009; Moliné, Libkind y Van Broock, 2012), pero también se ha encontrado en otras levaduras, como Peniophora (Arpin, Lebreton y Fiasson., 1966), Cystofilobasidium, Rhodosporidium, Sporobolomyces, y Sporidiobolus (Davoli, Mierau y Weber, 2004; Buzzini et al., 2007; iurkov et al., 2008). También se han identificado otras xantofilas en hongos, como la cantaxantina en Cantharellus cinnabarinus (Haxo, 1950), el 16’-hidroxitoruleno en Cystofilobasidium (Herz et al., 2007), la plectaniaxantina en Dioszegia sp. (Madhour et al., 2005) y la filipsiaxantina en Phillipsia carminea (Arpin y Liaaen-Jensen, 1967). La disponibilidad de herramientas moleculares permite modificar genéticamente otros hongos para producir xantofilas. La introducción en M. circinelloides de genes heterólogos de origen bacteriano ha permitido la producción de cantidades variables de β-criptoxantina, zeaxantina, equinenona, cantaxantina y astaxantina además de su producto habitual, el β-caroteno (Papp et al., 2006; 2013; Csernetics et al., 2011). Los mismos carotenoides los sintetizan estirpes de S. cerevisiae a las que se han introducido genes bacterianos y la levadura X. dendrorhous para la producción de xantofilas (Ukibe et al., 2009). realiza una sola enzima de la familia de las oxigenasas P450 (Álvarez et al., 2006; Ojima et al., 2006), codificada por el gen crtS/ast, con la participación de al menos una reductasa de citocromo P450 para proporcionar los electrones en las reacciones de oxigenación (Alcaíno et al., 2008). Este paso biosintético difiere en algas y bacterias productoras de astaxantina, donde su síntesis a partir de β-caroteno es mediada por dos enzimas independientes con actividades hidrolasa y cetolasa (Fraser, Miura y Misawa, 1997). figura 3. Biosíntesis de otras xantofilas en hongos: a) biosíntesis de la astaxantina en X. dendrorhous. Sólo se indican los pasos a partir del g-caroteno. En una rama lateral, el g-caroteno puede sufrir una quinta desaturación para producir toruleno, el cual puede ser objeto de las reacciones de hidroxilación y cetolización en el anillo β para producir 3-dihidroxi-4- cetotoruleno como producto secundario; b) estructura química de otras xantofilas fúngicas. 288 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos En algunos casos la fotoinducción se ha estudiado con gran detalle. En P. blakesleeanus, la fotorrespuesta se limita a una etapa concreta del desarrollo, antes de la formación de los esporangióforos, estructuras en las que se desarrollan las esporas asexuales (Bejarano et al., 1991). En esta fase del desarrollo, la aplicación de distintos flujos de luz al mismo tiempo permitió detectar dos niveles de sensibilidad, con distintos umbrales y rangos de respuesta. Una exposición a luz muy débil produce una pequeña estimulación que se satura a flujos mayores, hasta alcanzar un umbral capaz de producir una respuesta mucho más fuerte. Se ha encontrado también una respuesta bifásica al flujo luminoso en N. crassa (Schrott, 1980). La fotoinducción es particularmente eficaz en este hongo, capaz de producir un incremento sensible de la carotenogénesis después de sólo un minuto de exposición a la luz (Zalokar, 1955) o incluso menos (Rau, Lindemann y Rau- Hund, 1968), alcanzando su valor máximo aproximadamente 6-8 horas después del estímulo. Sin embargo, una vez disparada la respuesta a un pulso de luz, el hongo es insensible temporalmente a un segundo pulso (Schrott, 1981), indicando un bloqueo temporal del sistema de fotorrecepción. La respuesta es menos eficaz en Fusarium aquaeductuum (Bindl, Lang y Rau, 1970) y F. fujikuroi (Ávalos y Schrott, 1990), y en estos casos es necesario al menos una hora de iluminación para una respuesta detectable. En los casos investigados, la inducción mediante la luz tiene lugar a nivel de transcripción de los genes estructurales. En los hongos mucorales, el incremento es particularmente fuerte en M. circinelloides, y es suficiente un pulso de 10 minutos de luz azul para que los niveles de ARNm de los genes carB y carRA aumenten hasta 300 veces (Velayos et al., 2000; 2000a), mientras que el incremento no es tan acusado en P. blakesleeanus (Ruiz-Hidalgo et al., 1997; Blasco et al., 2001; regulación de la sÍntesis de carotenoides en Hongos Debido al interés en las aplicaciones de los carotenoides y al uso de algunos hongos para su producción biotecnológica, la regulación de su síntesis ha recibido especial atención en estos organismos. En función de las especies, la síntesis se estimula mediante la luz o por algunas condiciones adversas de cultivo, como la escasez de nutrientes o el estrés oxidativo. En algunos casos se conocen los mecanismos de regulación asociados a determinadas etapas del desarrollo o del ciclo de vida. La existencia de proteínas reguladoras específicas se evidencia debido a la existencia de mutantes regulatorios, algunos de los cuales se han estudiados con especial detalle. Se describen a continuación los principales aspectos de los mecanismos de regulación. Estimulación mediante la luz La inducción por luz es un carácter frecuente en los hongos productores de carotenoides (Ávalos, Bejarano y Cerdá-Olmedo, 1993). Entre los casos mejor conocidos figuran la fotoinducción de la síntesis de β-caroteno en P. blakesleeanus (Bejarano et al., 1991), M. circinelloides (Navarro, Sandmann y Torres-Martínez, 1995; Velayos et al., 1997) y A. giganteus (El-Jack, Mackenzie y Bramley, 1988) junto con la de neurosporaxantina en N. crassa (Ávalos y Corrochano, 2013) y en distintas especies de Fusarium (Ávalos y Estrada, 2010). También se ha descrito fotoinducción de la síntesis de astaxantina en mutantes de X. dendrorhous (Meyer y Du Preez, 1994). Sin embargo, la inducción por luz no es una regla general. Así, por ejemplo, la síntesis de β-caroteno no aumenta significativamente en B. trispora (Sutter, 1970) o en U. maydis (Estrada et al., 2010) cuando se cultivan bajo iluminación continua. 295 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos (Harding, 1974). Este efecto requiere síntesis de proteínas de novo, ya que no tiene lugar en presencia de cicloheximida. Es interesante resaltar que la iluminación de N. crassa a baja temperatura no sólo produce la síntesis de mayores cantidades de carotenoides, sino que la proporción de neurosporaxantina en la mezcla de carotenoides es mayor. Esta circunstancia ha facilitado el estudio de mutantes en pasos tardíos de la ruta, como los afectados en los genes cao-2 (Saelices et al., 2007) e ylo-1 (Estrada et al., 2008b), que acumulan así el carotenoide intermediario de forma más limpia. Además, en N. crassa se ha observado que la temperatura determina el orden en el que se producen las reacciones (Estrada et al., 2008a): a baja temperatura la ciclación por AL-2 se produce en último lugar y CAO-2 lleva a cabo la rotura oxidativa sobre el 3,4-didehidrolicopeno en lugar de sobre el toruleno. De esta forma, los precursores inmediatos de la neurosporaxantina son el apo-4’-licopenal y el ácido apo-4’-licopenoico (figura 2). Por el contrario, a alta temperatura el 3,4-didehidrolicopeno es reconocido preferentemente por el dominio ciclasa de AL-2 para producir toruleno. En F. fujikuroi, la síntesis de neurosporaxantina es estimulada por la escasez de nitrógeno, una señal nutricional que controla la síntesis de otros metabolitos, como las giberelinas o la bikaverina. Este efecto a nivel de carotenogénesis se descubrió inicialmente en cultivos con micelio inmovilizado, en los que se observó que la mayor producción de carotenoides en escasez de nitrógeno decae si se añade este nutriente (Garbayo et al., 2003). Resultados similares se encontraron en experimentos de intercambio del micelio inmovilizado entre condiciones de presencia o ausencia de nitrógeno. En otros experimentos se observó que la síntesis de carotenoides, tanto de la estirpe silvestre como de mutantes superproductores, es mayor en medio con una baja relación N/C, y que la inducción El AMP cíclico (AMPc) es una importante señal en el desarrollo de los hongos. Las mutaciones en el gen de la ciclasa de adenilato en algunas especies dan lugar a alteraciones en el desarrollo y el crecimiento y a cambios en la síntesis de carotenoides. Así, los mutantes de dicho gen, cr-1 en N. crassa (Kritsky et al., 1982) y acyA en F. fujikuroi (García- Martínez, Ádám y Ávalos, 2012), contienen más carotenoides en la oscuridad. En F. fujikuroi, además, da lugar a una menor respuesta a la luz, mientras que en N. crassa los niveles de AMPc aumentan durante la fotoinducción de la carotenogénesis y la fotorrespuesta se reduce en presencia de AMPc exógeno (Harding, 1973). También se han observado conexiones regulatorias en otros genes asociados a la señalización por AMPc. La sobreexpresión del gen gna-1 de N. crassa, que codifica la proteína Ga de un complejo G heterotrimérico, da lugar a hifas aéreas más largas y a una reducción en el desarrollo de conidios y en la producción de carotenoides (Yang y Borkovich, 1999). Por otra parte, la mutación del gen dcc-1, que codifica una quinasa de histidina, produce un aumento tanto de la conidiación como de la producción de carotenoides, y este efecto es revertido por adición de AMPc exógeno (Barba-Ostria, Lledias y Georgellis, 2011). Regulación por condiciones ambientales Las condiciones de cultivo pueden afectar a la producción de carotenoides de forma distinta en diferentes hongos. Un ejemplo significativo se encuentra en el efecto de la temperatura. La síntesis de neurosporaxantina en respuesta a la luz se reduce en F. aquaeductuum cuando disminuye la temperatura (Rau, 1962), sin embargo, en N. crassa se observa el efecto contrario: la fotoinducción es tanto más eficiente cuanto más baja es la temperatura a la que se ilumina el cultivo, alcanzado la respuesta óptima entre 6 y 12 °C 296 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos P. blakesleeanus (Cerdá-Olmedo, 1987) o X. dendrorhous (Johnson, 2003). Sin embargo, la frecuencia de la síntesis de carotenoides en los hongos sugiere funciones biológicas relevantes. Se resumen a continuación las funciones mejor conocidas. El β-caroteno como precursor de las hormonas sexuales en los mucorales Los ácidos trispóricos, hormonas sexuales de los mucorales mencionadas antes, se sintetizan a partir de β-caroteno, y ésta es posiblemente la principal función de este caroteno en dicho grupo taxonómico. Estos compuestos pertenecen a una familia químicamente compleja (Austin, Bu’Lock y Winstanley, 1969; Austin, Bu’Lock y Drake, 1970), denominada trisporoides. En función de diferentes modificaciones químicas, los ácidos trispóricos se clasifican en varios tipos, denominados por las letras A, B, C, D y E (Caglioti et al., 1966; Austin, Bu’Lock y Winstanley, 1969; Sutter et al., 1989). La síntesis de estas hormonas se ha estudiado en detalle en B. trispora, en cuyos cultivos se encuentran diferentes derivados del metabolismo del β-caroteno, incluyendo trisporoides de 18 carbonos, ciclofarnesoides de 15 carbonos y metilhexanoides de siete carbonos (Barrero et al., 2011). Compuestos parecidos se han identificado en los cultivos de P. blakesleeanus (Polaino et al., 2012). La ruta biosintética de los ácidos trispóricos comienza con la rotura oxidativa del β-caroteno, un tipo de reacción llevada a cabo por enzimas de la familia de las oxigenasas de carotenoides. La enzima a cargo de esta reacción se identificó por primera vez en Rhizopus oryzae y B. trispora, y se denominó Tsp3 (Burmester et al., 2007). El gen tsp3 se activa en los cultivos mixtos en ambas especies y en el caso por escasez de nitrógeno es independiente y aditiva con la inducción por la luz (Rodríguez-Ortiz, Limón y Ávalos, 2009). Además, la transferencia del micelio de un medio con nitrógeno a una solución de glucosa produce un aumento rápido aunque transitorio de los niveles de ARNm de los genes carRA y carB. La carotenogénesis también es reprimida por nitrógeno en N. crassa, como indican los mayores niveles de ARNm de los genes al-1 y al-2 en condiciones de escasez de este nutriente (Sokolovsky et al., 1992). Este efecto se observa también en los mutantes del complejo WC, indicando que también en N. crassa la inducción por escasez de nitrógeno es independiente de la inducción por luz. funciones biológicas de los carotenoides en los Hongos En los organismos fotosintéticos, los carotenoides desempeñan papeles importantes en la fotosíntesis, como por ejemplo en la captación de luz y en la fotoprotección de la maquinaria fotosintética, entre otros procesos (Domonkos et al., 2013). Además, en las plantas superiores, los carotenoides proporcionan colores llamativos a muchas flores y frutos, ayudando a su ciclo de vida mediante la atracción de insectos para la polinización y la dispersión de las semillas. En los animales, los carotenoides ingeridos en la dieta sirven de fuente de retinoides, con importantes papeles en la visión (vitamina A) y en el desarrollo (ácido retinoico) (Blomhoff y Blomhoff, 2006), además de proporcionar pigmentación en algunos casos. En lo que respecta a los hongos, los carotenoides no desempeñan funciones vitales. Así lo indica tanto la ausencia de estos pigmentos en algunas especies como la viabilidad de los mutantes albinos, como los descritos en F. fujikuroi (Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1987), 297 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos modificada para producir β-caroteno (Medina, Cerdá-Olmedo y Al-Babili, 2011). Posteriormente se confirmó la misma reacción enzimática para Tsp3 en B. trispora (Sahadevan et al., 2013). En P. blakesleeanus, el β-apo-12’-carotenal es objeto de una nueva reacción de corte, llevada a cabo por una segunda oxigenasa de carotenoides, AcaA, para producir un apocarotenoide de 18 átomos de carbono, la β-apo-13- carotenona (Medina, Cerdá-Olmedo y Al-Babili, 2011), que es objeto de nuevas reacciones químicas para dar lugar a los ácidos trispóricos. El otro apocarotenoide resultante de esta serie de reacciones posee 15 átomos de carbono, y es el precursor de los ciclofarnesoides, una familia de compuestos químicos cuya función es desconocida. Reacciones similares muy probablemente se producen en otros mucorales, como B. trispora. de B. trispora, mediante su expresión heteróloga en una estirpe de E. coli productora de β-caroteno, se demostró la capacidad de la enzima Tsp3 para cortar dicha molécula. Posteriormente, el análisis químico de los apocarotenoides presentes en cultivos mixtos de P. blakesleeanus, muy especialmente el hallazgo de derivados de siete átomos de carbono, llevó a postular la existencia de dos reacciones de corte consecutivas sobre los dobles enlaces 11’,12’ y 12,13 de la molécula (Polaino et al., 2010) (figura 4). El gen tsp3 de P. blakesleeanus resultó ser carS, ya mencionado, y el fenotipo superproductor de β-caroteno de los mutantes de este gen se debe por lo tanto a la ausencia de su rotura enzimática (Tagua et al., 2012). La identidad del gen se confirmó tanto por el hallazgo de mutaciones en varios mutantes carS independientes como por la capacidad de producir β-apo-12’-carotenal cuando se expresa en E. coli figura 4. Metabolismo del β-caroteno como intermediario en la síntesis de otros compuestos: a) primeros pasos del corte oxidativo del β-caroteno para la síntesis de los ácidos trispóricos. Se muestra el ácido trispórico B como ejemplo representativo de esta familia. Se indican con flechas grises los sitios de corte reconocidos por las oxigenasas CarS y AcaA en P. blakesleeanus; b) producción de retinal tras el corte simétrico del β-caroteno realizado por las enzimas CarX de F. fujikuroi y Cco1 de U. maydis. 298 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos formar retinal. Aunque la neurosporaxantina es el carotenoide acumulado mayoritariamente en F. fujikuroi y N. crassa, en estos hongos se han detectado pequeñas cantidades de g-caroteno (Mitzka y Rau, 1977; Ávalos y Cerdá-Olmedo, 1987), lo que implica que sus ciclasas pueden introducir un segundo anillo en la molécula de g caroteno. En el caso de N. crassa, estudios in vitro mostraron que la desaturasa AL-1 no reconoce el g-caroteno como sustrato para producir toruleno (Hausmann y Sandmann, 2000), lo que indica que la neurosporaxantina se sintetiza a través del 3,4-didehidrolicopeno y que el destino del g-caroteno es su acumulación o su conversión a β-caroteno. A diferencia de N. crassa y F. fujikuroi, no hay información sobre síntesis de carotenoides en L. maculans, aunque la síntesis de β-caroteno en L. michotii (Jerebzoff-Quintin y Jerebzoff, 1980) sugiere una actividad biosintética similar en el primero. La primera oxigenasa de carotenoides identificada en hongos capaz de producir retinal fue Carx en F. fujikuroi (Thewes et al., 2005; Prado-Cabrero et al., 2007a). En este hongo, la función de la carotenogénesis para producir retinal se pone en evidencia por la organización genética del gen carX formando un agrupamiento génico (cluster) con los dos genes necesarios para producir β-caroteno, carRA y carB, y con el gen de la opsina CarO. Los cuatro genes del cluster están sujetos a un mismo mecanismo de regulación por luz, bajo control del producto del gen carS. El basidiomiceto U. maydis posee tres genes para opsinas, y una enzima capaz también de producir retinal a partir de β-caroteno (Estrada et al., 2010). Sin embargo, no se ha identificado aún la enzima responsable de la síntesis de retinal en N. crassa. El papel del β-caroteno como precursor de retinal traslada su función biológica al papel que desempeñen las opsinas en los hongos. Sin embargo, los intentos por averiguar el papel Los genes y enzimas responsables de los pasos posteriores en la ruta de los ácidos trispóricos son actualmente objeto de investigación. Entre las enzimas figura la deshidrogenasa de 4-dihidrometiltrisporato, Tsp1, purificada de cultivos de Mucor mucedo estimulados por ácidos trispóricos (Czempinski et al., 1996). El análisis del gen tsp1 mostró que la estimulación sexual se produce a nivel de actividad enzimática y no de transcripción (Schimek et al., 2005). Experimentos similares permitieron identificar también tsp2, el gen de la deshidrogenasa de 4-dihidrotrisporina, en este caso regulado tanto a nivel de transcripción como de actividad enzimática (Wetzel et al., 2009). Genes similares se encuentran en P. blakesleeanus (Polaino, 2009) y en otros mucorales (Schimek y Wöstemeyer, 2009). El β-caroteno como precursor de retinal El retinal es un apocarotenoide de 20 átomos de carbono, procedente normalmente de la rotura simétrica del β-caroteno (figura 4b) (Von Lintig, 2012). Además del precursor de otros apocarotenoides, el retinal es el cromóforo de las opsinas, una extensa familia de fotorreceptores de membrana con diferentes funciones en los principales grupos taxonómicos, tanto en bacterias y arqueas como en eucariotas (Ernst et al., 2014). En los animales, las opsinas desempeñan un papel fundamental en la visión, ya que son responsables de la detección de luz en la retina. Muchos hongos poseen también proteínas de la familia de las opsinas, supuestamente dependientes de retinal para ejercer su función (Brown, 2004). Entre ellas han recibido especial atención NOP-1 en N. crassa (Bieszke et al., 1999; 1999a), OPS en Leptosphaeria maculans (Waschuk et al., 2005) y CarO (Prado et al., 2004) y OpsA (Estrada y Ávalos, 2009) en F. fujikuroi. La presencia de opsinas sugiere la existencia en estos hongos de una oxigenasa de carotenoides capaz de 299 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos Roukas, 2011) o la adición de hydroxitolueno butilado (Nanou y Roukas, 2010) aumentan los niveles tanto de catalasa y SOD como de β-caroteno. Sin embargo, dichas actividades enzimáticas son menores en los cultivos mixtos que en los cultivos individuales, mientras que la adición de inhibidores de actividad SOD produce un aumento en el contenido en β-caroteno (Gessler, Sokolov y Belozerskaya, 2002). Un resultado especialmente concluyente es el aumento en la resistencia al peróxido de hidrógeno manifestado por estirpes de S. cerevisiae a las que se han introducido artificialmente genes para la producción de carotenoides (Ukibe et al., 2009). La inducción de la síntesis de carotenoides por la luz puede estar asociada a un aumento de la oxidación. En N. crassa, la luz produce un efecto negativo sobre la respiración, tanto en micelio como en preparaciones de mitocondrias, y este efecto es más acusado en los mutantes albinos que en los controles silvestres (Ramadan-Talib y Prebble, 1978). En consonancia con su efecto perjudicial, la luz aumenta los niveles de catalasas y de SOD (Gessler, Sokolov y Belozerskaya, 2002), y además los efectos del estrés oxidativo sobre la síntesis de carotenoides son sólo patentes en estas condiciones (Yoshida y Hasunuma, 2004; iigusa, Yoshida y Hasunuma, 2005). Los efectos pueden ser especialmente acusados en el caso de la radiación UV. Como ya se ha indicado, los conidios de N. crassa acumulan carotenoides con independencia de la iluminación. Es muy significativo que los conidios albinos sean más sensibles que los pigmentados a la exposición a luz blanca en presencia de agentes fotosensibilizadores, como el azul de metileno, o la radiación UV-A en ausencia de estos compuestos. En consonancia con este resultado, se ha encontrado una correlación entre el contenido en carotenoides de diferentes estirpes silvestres de Neurospora y la latitud a la que se aislaron (Luque et al., 2012). Las estirpes procedentes biológico de opsinas fúngicas mediante experimentos de mutagénesis dirigida no han dado resultados (Bieszke et al., 1999a; Prado et al., 2004; Estrada y Ávalos, 2009), ya que los mutantes muestran fenotipo silvestre en las condiciones de cultivo en laboratorio. Los carotenoides como antioxidantes Una característica especialmente conocida de los carotenoides es su potencial como agentes protectores frente al estrés oxidativo (Edge, McGarvey y Truscott, 1997; Young y Lowe, 2001). Como todos los seres vivos, los hongos poseen enzimas destinadas a contrarrestar las especies reactivas de oxígeno (ROS) formadas por el metabolismo normal de la célula. Entre ellas han recibido especial atención las catalasas y las dismutasas de superóxido (SOD) (Gessler, Sokolov y Belozerskaya, 2002; Hansberg, Salas-Lizana y Domínguez, 2012). Sin embargo, numerosas pruebas indirectas apoyan un papel auxiliar de los carotenoides como protectores del estrés oxidativo en hongos de diferentes grupos taxonómicos. En muchos casos se ha observado una correlación positiva entre los niveles de estrés oxidativo y la acumulación de carotenoides. Como ejemplos representativos, la presencia de peróxido de hidrógeno en los cultivos incrementa la producción de β-caroteno en B. trispora (Jeong et al., 1999), astaxantina en X. dendrorhous (Liu y Wu, 2006) 2 y neurosporaxantina en N. crassa (iigusa, Yoshida y Hasunuma, 2005) y en F. aquaeductuum (Bindl, Lang y Rau, 1970). Un efecto parecido se observa en las estirpes afectadas en su capacidad de actuar contra las ROS, como los mutantes carentes de la enzima SOD-1 (Yoshida y Hasunuma, 2004) o de la catalasa CAT-3 (Michán, Lledías y Hansberg, 2003) en N. crassa. En B. trispora varios indicios asocian el estrés oxidativo al contenido en β-caroteno: el aumento de oxígeno en el cultivo (Nanou y 300 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos ruberrimus y Cystofilobasidium capitatum son tanto más resistentes a la radiación UV-B cuanto mayor es su contenido en carotenoides (Moliné et al., 2009). Considerados en su conjunto, estos y otros datos publicados respaldan un efecto protector de la carotenoides frente a daños producidos por la luz visible y por la radiación UV. de latitudes más altas producen menos carotenoides y sus conidios son más sensibles a la radiación UV. Resultados parecidos se han obtenido en otros hongos. Así, las células de Wangiella dermatitidis que contienen carotenoides son más resistentes a la radiación UV que las no pigmentadas (Geis y Szaniszlo 1984), y las estirpes naturales de Sporobolomyces AGRADECIMIENTOS 301 15. Biosíntesis de carotenoides en hongos Aasen, A.J. y Jensen, S.L. 1965. Acta Chem. Scand., 19: 1843-1853. Ádám, A.L., García-Martínez, J., Szücs, E.P., Ávalos, J., Hornok, L. 2011. FEMS Microbiol. Lett., 318: 76-83. Alcaíno, J., Barahona, S., Carmona, M., Lozano, C., Marcoleta, A., Niklitschek, M., et al. 2008. BMC Microbiol., 8: 169. Almeida, E.R. y Cerdá-Olmedo, E. 2008. Curr. Genet., 53: 129-137. Álvarez, V., Rodríguez-Sáiz, M., De la Fuente, J.L., Gudina, E.J., Godio, R.P., Martín, J.F., et al. 2006. Fungal Genet. Biol., 43: 261-272. Aragón, C.M., Murillo, F.J., De la Guardia, M.D., Cerdá- Olmedo, E. 1976. Eur. J. Biochem., 63: 71-75. Arpaia, G., Carattoli, A., Macino, G. 1995. Dev. Biol., 170: 626-635. Arpin, N., Lebreton, P., Fiasson, J.L. 1966. Bull. Soc. 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