Contribución de un desayuno de tipo mediterráneo a la prevención del desarrollo de aterosclerosis en individuos obesos

“Contribución de un desayuno de tipo mediterráneo a la prevención del desarrollo de aterosclerosis en individuos obesos.” Tesis doctoral realizada por: Laura Sinausía Nieva Bajo la dirección de: Dr. Javier Sánchez Perona Sevilla, 2017 ► INTRODUCCIÓN........................................................................................................1 1. La ateroesclerosis y el carácter aterogénico de las lipoproteínas ricas en triglicéridos.......................................................................................................................... 2 1.1 La ateroesclerosis...............................................................................................2 1.2 Las lipoproteínas................................................................................................7 -Tipos de lipoproteínas y sus características -Componentes lipídicos de las lipoproteínas -Componentes proteicos de las lipoproteínas las apolipoproteínas 1.3 Las lipoproteínas ricas en triglicéidos..............................................................17 -Los quilomicrones -Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) 1.4 Vías de incorporación de TRL por los macrófagos..........................................28 -Endocitosis mediada por receptores de suerficie dependentes de Apo E:LDLR, VLDLR, LRP-1 -Endocitos mediada por receptores de superficie independientes de Apo E:SRA2, SRB1, CD36 1.5 Propiedades aterogénicas de las partículas TRL...............................................33 Las TRL en el periodo postprandial 2. Obesidad como factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares.........................38 2.1 La obesidad. Un problema de salud pública....................................................38 2.2 La patofisiología de la obesidad.......................................................................39 -Obesidad y la reistencia a la insulina -Obesidad y el síndrome metabólico 2.3 La inflamación crónica en la obesidad y síndrome metabólico.......................42 2.4 Marcadores de inflamación como predictores de riesgo cardiovascular en la obesidad….............................................................................43 -La sensibilidad a la insulina como biomarcador de inflamación -Citoquinas y adipoquinas como biomarcadores de inflamación 3. La dieta como el primer factor de intervención para la prevención y tratamiento de las enfermedades cardiovasculares (ECV)............................................ 50 3.1 La dieta Mediterránea.......................................................................................51 -El carácter cardioprotector de la dieta mediterránea 3.2 El aceite de oliva..............................................................................................55 -Composición del aceite de oliva -El aceite de oliva como elemento clave del carácter cardioprotector de la dieta mediterránea ► HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................................ 73 ► MATERIALES Y MÉTODOS..........................................................................................77 1. Estudio de la respuesta lipídica postprandial en suero tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y un desayuno de tipo occidental en adultos obesos..............................................................................................78 1.1 Selección y características de los participantes del estudio.............................79 1.2 Diseño experimental de la intervención dietética............................................80 1.3 Ensayo postprandial.........................................................................................81 1.4 Determinaciones bioquímicas y estudio del perfil lipídico basal y postprandial en suero..............................................................................................84 2. Estudio del perfil de marcadores de inflamación postprandiales en suero de adultos obesos y normopesos tras la ingesta de los desayunos experimentales...................................................................................................................85 2.1 Medición de los niveles de adipoquinas y citoquinas en suero...................................86 3. Caracterización de las lipoproteínas ricas en triglicéridos postprandiales............. 91 3.1 Aislamiento de las lipoproteínas ricas en triglicéridos de suero.......................92 3.2 Caracterización de la composición de las lipoproteínas ricas en triglicéridos.............................................................................................…..........92 3.3 Caracterización de la composición proteica en las lipoproteínas ricas en triglicéridos............................................................................................ ….....96 4. Estudio de la influencia de las lipoproteinas ricas en triglicéridos postprandiales en la formación de células espumosas..................................................98 4.1 Cultivos celulares de monocitos THP-1 y diferenciación a macrófagos........100 4.2 Estudio de la acumulación lipídica en macrófagos........................................101 4.3 Estudio de los niveles de expresión de los receptores celulares de superficie implicados en los procesos de captación de las lipoproteínas ricas en triglicéridos en macófagos......................................................................103 5. Estudio de la capacidad del componente lipídico de las lipoproteínas ricas en triglicéridos para modular la actividad de la lipoproteín lipasa de macrófagos............................................................................................... …..............111 5.1 Procedimiento experimental...........................................................................111 5.2 Preparación de las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP)............ 112 5.3 Preparación de suero d<1.020 deficiente.......................................................113 5.4 Cuantificación de los triglicéridos incorporados en las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP)...................................................................114 5.5 Ensayo de medición de la actividad de la LPL..............................................115 5.6 Cuantificación de la acumulación lipídica en macrófagos.............................115 5.7 Cuantificación de la proteína total celular......................................................115 5.8 Análisis de expresión génica de LPL y ANGPTL4........................................116 6. Análisis estadístico.......................................................................................................117 ► RESULTADOS............................................................................................ …................118 1. Estudio de la respuesta lipídica postprandial en suero tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y un desayuno de tipo occidental en adultos obesos y normopesos....................................................................................119 1.1 Estudio del perfíl lipídico y bioquímico basal en suero.................................119 1.2 Estudio del perfíl lipídico y bioquímico postprandial en suero.....................122 2. Estudio del perfil de marcadores de inflamación basal y postprandial en suero de adultos obesos y normopesos tras la ingesta de los desayunos experimentales............................................................................................ …................136 2.1 Concentración basal en suero de los marcadores de inflamación..................136 2.2 Concentración postprandial en suero de los marcadores de inflamación............................................................................................ ….........138 3. Caracterización de los ácidos grasos componentes de las lipoproteínas ricas en triglicéridos aisladas de adultos obesos y normopesos, antes y tras la ingesta de los desayunos experimentales............................................................153 3.1 Estudio de la composición de ácidos grasos de los triglicéridos y fosfolípidos extraídos de las lipoproteínas ricas en triglicéridos aisladas de los participantes normopesos.............................................................155 3.2 Estudio de la composición de ácidos grasos de los triglicéridos y fosfolípidos extraídos de las lipoproteínas ricas en triglicéridos aisladas de los participantes obesos.....................................................................160 4. Influencia de las lipoproteinas ricas en triglicéridos postprandiales en la formación de células espumosas y caracterización del perfil lipídico intracelular de macrófagos tras la incorporación de las partículas..........................165 4.1 Estudio de la acumulación lipídica en macrófagos mediante tinción con aceite rojo O..................................................................................................165 4.2 Caracterización de los ácidos grasos componentes de los triglicéridos incorporados en el interior de los macrófagos tras su incubación con las lipoproteínas ricas en trigicéridos procedentes de los sujetos normopesos.........170 4.3 Caracterización de los ácidos grasos componentes de los triglicéridos incorporados en el interior de los macrófagos tras su incubación con las lipoproteínas ricas en trigicéridos procedentes de los sujetos obesos..................173 5. Estudio de la expresión génica de los receptores celulares de superficie implicados en los procesos de captación de las lipoproteínas ricas en triglicéridos por macrófagos...........................................................................................176 5.1 Modulación de los niveles de expresión de los receptores celulares dependientes de apo E: LDLR. VLDLR y LRP-1................................................176 5.2 Modulación de los niveles de expresión de los receptores celulares independientes de apo E (receptores Scavenger): SRA2, SRB1 y CD36............180 6. Estudio de la capacidad del componente lipídico de las lipoproteínas ricas en triglicéridos para modular la actividad de la lipoproteín lipasa de macrófagos ............................................................................................................... 185 6.1 Modulación de la actividad de la LPL de macrófagos por las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP) con distinta composición lipídica.............185 6.2 Modulación de los niveles de expresión de los genes LPL y ANGPTL4 por parte del componente lipídico de las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP).........................................................................................188 6.3 Estudio de la acumulación lipídica en macrófagos incubados con las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP) con diferente composición lipídica .................................................................................................................189 ► DISCUSIÓN ......................................................................................................................191 ► CONCLUSIONES..............................................................................................................246 ►REFERENCIAS..................................................................................................................249 ► ANEXO.................................................................................................................................298 Resumen ejecutivo......................................................................................................299 INTRODUCCIÓN 1 1. LA ATEROESCLEROSIS Y EL CARÁCTER ATEROGÉNICO DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS 1.1 La aterosclerosis a Organización Mundial de la Salud (OMS) define la enfermedad cardiovascular (ECV) como un grupo de desórdenes del corazón y vasos sanguíneos que incluyen las siguientes enfermedades: coronaria, cerebrovascular, arterial periférica, cardiopatía reumática, cardiopatías congénitas, y trombosis venosa y embolia pulmonar, siendo las manifestaciones clínicas más comunes el infarto de miocardio y derrame cerebral. En la mayoría de los casos, la causa subyacente de la ECV es la aterosclerosis. La aterosclerosis es un término general empleado para hacer referencia a un estado de inflamación crónica que afecta a las grandes arterias, principalmente la aorta y las coronarias, carótidas, ilíacas y femorales. Se caracteriza por el engrosamiento de la pared arterial debido al aumento del espesor del área de la íntima, y endurecimiento y pérdida de elasticidad de las arterias. Estos fenómenos son debidos a la formación de una placa construida en su interior, constituida por lípidos, restos celulares, calcio y elementos fibrosos (American Heart Associarion). En los años 60 y a principios de los 70, los eventos clínicos desencadenados por ECV alcanzaron cifras históricas en los países desarrollados [1], y aunque desde entonces la mortalidad por ECV se está reduciendo, aún sigue siendo la principal causa de muerte en los países desarrollados y en vías de desarrollo [2, 3]. Según datos de la Organización Mundial de la Salud, se calcula que en el año 2012 murieron 17.5 millones de personas a consecuencia de ECV, lo que representa un 31% de todas las muertes a nivel mundial, siendo de ellas el 80% a consecuencia del desarrollo de aterosclerosis. Esta enfermedad es lenta y progresiva, y cursa asintomáticamente en la mayoría de los casos, hasta que los eventos clínicos que desencadena pueden poner en riesgo la vida del individuo. Existen evidencias del posible comienzo de la lesión incluso a edad temprana, tal y como describieron los trabajos realizados por Holman de autopsias en niños norteamericanos de hasta 3 años, donde encontró algunas aortas que presentaban estrías grasas [4]. Este proceso es considerado reversible, pero con el paso de los años la acumulación de lípidos en las arterias se incrementa, pudiéndose presentar las primeras lesiones fibrosas en la adolescencia. En los años siguientes, estas placas aumentan de tamaño y sufren modificaciones que empeoran la lesión, hasta que la ulceración de la placa, su rotura y trombosis precipita el evento clínico [5]. En algunas personas, la enfermedad progresa rápidamente, manifestando los primeros síntomas a los 30 años. En cambio, 2 L en otras personas esta situación no llega a ser peligrosa hasta que alcanzan los 50 o 60 años (American Heart Association). 1.1.1 Fases del desarrollo del proceso aterogénico. Las distintas fases cronológicas del proceso de aterogénesis se detallan a continuación: 1. Inicio de la lesión. Disfunción endotelial y reclutamiento de células inmunes. El evento que desencadena el desarrollo de la aterosclerosis es la presencia de elevados niveles de lipoproteínas plasmáticas y su consiguiente acumulación en la matriz subendotelial de las arterias. El endotelio vascular es un importante regulador de la homeostasis vascular y, con sus uniones intercelulares complejas, funciona como una barrera permeable selectiva entre la sangre y los tejidos [6], además de controlar el tono vascular, inflamación y prevenir la formación de trombos [7]. En regiones susceptibles de desarrollar aterosclerosis, las células endoteliales presentan una fina capa de glicocalix y un alineamiento desordenado [8], mayor senescencia celular y apoptosis [9]. Además, existe una expresión reducida de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y superóxido dismutasa (SOD), las cuales promueven la migración de células endoteliales y supervivencia celular, y reducen el estrés oxidativo celular, respectivamente [10, 11]. Debido a estas circunstancias, la integridad de la barrera endotelial se ve comprometida en estas regiones, permitiendo que las lipoproteínas aterogénicas difundan pasivamente a través de las uniones de las células endoteliales. De esta manera, las lipoproteínas se acumulan y quedan retenidas en la capa íntima a través de interacciones que se establecen entre las células endoteliales y la apolipoproteína B (apo B) contenida en las lipoproteínas aterogénicas [12]. Los proteoglicanos unidos a la membrana celular de las células endoteliales también pueden actuar como receptores endocíticos, facilitando la captación de varios ligandos y metabolitos, entre ellos las lipoproteínas, contribuyendo en su retención [13]. Este fenómeno provoca la disfunción/activación del endotelio, con características protrombóticas y proinflamatorias [14]. Las células endoteliales activadas incrementan la expresión de proteínas de adherencia de monocitos: moléculas de adhesión intercelular1 (ICAM-1), moléculas de adhesión vascular-1 (VCAM-1), P-selectina; receptores proinflamatorios (receptor toll-like 2, TRL2) y citoquinas (MCP-1 y IL8) [15]. Además, la activación de las células endoteliales conlleva una mayor producción de especies reactivas de oxígeno (reactive oxigen species, ROS) [16] que pueden causar modificaciones por oxidación de lipoproteínas que contienen 3 obtenidas en el momento en el cual el tamaño de partícula es intermedio, con un tamaño medio de 195.1 nm [34]. De mayor a menor tamaño se distinguen los siguientes 5 grupos: Quilomicrones (QM); VLDL o lipoproteínas de muy baja densidad (Very Low Density Lipoproteins), IDL o lipoproteínas de densidad intermedia (Intermediate Density Lipoproteins), LDL o lipoproteínas de baja densidad (Low Density Lipoproteins) y HDL o lipoproteínas de alta densidad (High Density Lipoproteins). Estas últimas se subdividen a su vez en dos subtipos con distinta densidad, HDL2 y HDL3 [32]. En los últimos años, se ha comenzado a identificar otra lipoproteína, la Lp (a), como un factor de riesgo independiente para eventos aterotrombogénicos en múltiples estudios [35]. Esta lipoproteína consiste en una partícula de LDL en la cual apo B100 está covalentemente unida vía puente disulfito a apo A, una glicoproteína con unidades repetidas de Kringle que comparte homología con el plasminógeno. Aunque apo A es sintetizada por el hígado, las partículas de Lp (a) no son formadas en el hígado sino en el plasma. A pesar de ser una partícula modificada de LDL, los niveles de Lp (a) son independientes de los de LDL, y aunque su catabolismo aún no está del todo claro, no es captada por el receptor LDLR [36]. Tabla 1. Características principales de las distintas clases de lipoproteínas humanas [37]. Lipoproteína Densidad (g/ml) Peso molecular (106 Da) Diámetro (nm) Lípido mayoritario Apolipoproteínas principales* Quilomicrón < 0.95 >150 75-1200 TG B48, A, C, E* VLDL 0.95-1.006 5-130 30-80 TG B100, A,C, E IDL 1.006-1.019 4 25-35 TG / Colesterol B100, C, E LDL 1.019-1.063 3 18-25 Colesterol B100 HDL 1.063-1.210 0.3 5-12 FL/ Colesterol A, C, E Lp (a) 1.055-1.120 5.5 25 Colesterol (a), B100 *La composición apoproteica varía según el grado de maduración de la lipoproteína y de la subespecie específica. 10 1.2.2 Componentes lipídicos de las lipoproteínas El contenido y composición lipídica de los diferentes tipos de lipoproteínas se muestran en la figura 3. Los glicerolípidos, principalmente TG, son los componentes lipídicos mayoritarios de los QM y VLDL, mientras que constituyen tan solo el 4% de los lípidos contenidos en LDL y HDL, que están por el contrario enriquecidos en ésteres de colesterol (15-41%). En todas las clases de lipoproteínas hay moléculas de colesterol no esterificado, aunque se encuentran en proporciones relativamente bajas. Esto es debido a que es activamente esterificado por el enzima LCAT en HDL y posteriormente redistribuido entre las LDL y VLDL a través de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol. El contenido total de FL de las lipoproteínas aumenta con el incremento de la densidad. Además, está directamente relacionado con el área de superficie de las partículas de lipoproteínas, ya que la superficie de las lipoproteínas está cubierta por una monocapa de FL y apolipoproteínas. 11 Figura 3. Contenido y composición lipídica y proteica (%) de los diferentes tipos de lipoproteínas Datos extraídos de FEPREVA [38] TG: triglicéridos; CE: ésteres de colesterol; CL: colesterol; FL: fosfolípidos; P: proteínas; QM: quilomicrón; VLDL: lipoproteína de muy baja densidad; LDL: lipoproteína de baja densidad; IDL: lipoproteína de densidad intermedia; HDL: lipoproteína de alta densidad; Lp (a): Lipoproteína a. 12 TG 54 CE 13 CL 7 P 10 FL 16 VLDL TG 20 CE 34 CL 9 P 17 FL 20 IDL TG 4 CE 41 CL 11 P 23 FL 21 LDL TG 4 CE 15 CL 3 P 60 FL 28 HDL TG 3 CE 36 CL 9 P 34 FL 18 Lp(a) TG 90 CE 2 CL 1 P 2 FL 5 QM 1.2.3. Componentes proteicos de las lipoproteínas: las apolipoproteínas Las apolipoproteínas regulan el metabolismo de las lipoproteínas y determinan su función en el metabolismo lipídico. Se sitúan preferentemente hacia el exterior de las lipoproteínas aunque pueden incluir parte de su estructura en el núcleo hidrofóbico. Cuando esto ocurre, los aminoácidos también se disponen según su polaridad dentro de la estructura lipoproteica, orientándose los más polares hacia el exterior de la partícula, a diferencia de aquellos más apolares que lo harán hacia el interior [39]. La función común de todas las apolipoproteínas es ayudar a solubilizar lípidos en la circulación, para transportarlos y redistribuirlos entre varios tejidos. En las condiciones apropiadas, las apolipoproteínas pueden formar partículas de forma espontánea con los FL, pero para el ensamblaje in vivo de las apolipoproteínas con los lípidos se requiere la asistencia de proteínas celulares como la proteína de transferencia microsomal (MTP) de lípidos o el transportador ABC1 [31]. Además, las apolipoproteínas participan en el mantenimiento de la estructura de la partícula de las lipoproteínas, ya que tienen la capacidad de cambiar la conformación de las partículas y ajustar su contenido lipídico, composición y estado metabólico [31]. Las apolipoproteínas que se encuentran en el plasma se clasifican en 2 grupos: no transferibles y transferibles o solubles. Las apolipoproteínas no transferibles (apo B-100 y apo B-48) son proteínas muy grandes e insolubles en agua que son ensambladas con lípidos en su lugar de síntesis y circulan unidas a la misma partícula de lipoproteína a través de varias transformaciones metabólicas en el plasma, hasta que son retiradas de la circulación como lipoproteínas por la acción de los receptores específicos. Por el contrario, las proteínas transferibles (apo E, apo A1, apo A2, y apo C), tienen una masa molecular menor que las apolipoproteínas no transferibles, son más o menos solubles en agua en su estado deslipidado, pueden transferirse entre partículas de lipoproteínas, y adquirir lípidos mientras se encuentren en circulación [31]. Algunas de las apolipoproteínas transferibles, en sus correspondientes lipoproteínas, actúan como activadores o inhibidores de importantes enzimas plasmáticas implicadas en el metabolismo lipídico, como la LCAT, HL y la LPL [31]. 13 Las apolipoproteínas tienen también una importante función en el reconocimiento por receptores de membrana. Este evento es importante para la liberación de lípidos a células específicas, ya que implica el reconocimiento de apolipoproteínas específicas por los receptores de la superficie celular. La interacción mejor caracterizada es la establecida entre el receptor LDL (LDLR) y las lipoproteínas que contienen apo B-100 y apo E [31]. Las apolipoproteínas más representativas de las TRL son: -Apolipoproteína E La apolipoproteína E (apo E) es uno de los componentes proteicos de los QM, QM remanentes (QMr), VLDL y HDL, incluída en el grupo de las apoliproteínas transferibles. El hígado es el principal responsable de la producción de la apo E plasmática, aunque los macrófagos también son responsables de producir el 5-10% de apo E plasmática [40]. Existen seis fenotipos de apo E: tres fenotipos homozigotos (E4/4, E3/3, E2/2) y tres heterozigotos (E4/3, E4/2, y E3/2), siendo el fenotipo más común en la población humana el E3/3 [41]. La apo E es una de las apolipoproteínas más estudiadas por sus numerosas funciones, entre ellas, destaca su papel protector frente a la aterosclerosis. Son varios los mecanismos a través de los cuales ayuda a reducir la aterosclerosis: a) reduce la proliferación e infiltración de macrófagos en la íntima mediante su expresión por células hematopoiéticas [42]; b) reduce la acumulación lisomal de colesterol ya que su presencia en las lipoproteínas que contienen ApoB estimula la expresión de la lipasa ácida [43]; y c) la secreción de apo E por macrófago estimula la salida de colesterol tanto en presencia como ausencia de aceptores exógenos como HDL [44]. Esta apolipoproteína constituye el componente proteico mayoritario de lipoproteínas enriquecidas en colesterol que participan en el transporte y metabolismo del colesterol, como las HDL, lipoproteínas anti-aterogénicas encargadas del transporte del colesterol depositado en los tejidos periféricos al hígado para su eliminación del cuerpo [45];y de las partículas remanentes de VLDL, enriquecidas relativamente en colesterol por la pérdida de los TG debido a la acción hidrolítica de la LPL. Además, la apo E desempeña un importante papel en la rápida eliminación de las lipoproteínas plasmáticas que contienen apo B por el hígado, excepto de LDL, ya que actúa de ligando de estas partículas con receptores de superficie celular en tejidos hepáticos y extrahepáticos: LDLR y LRP. Del mismo modo, la apo E también es importante como molécula de unión a la superficie endotelial y captación de aquellas lipoproteínas enriquecidas en apo E mediante su interacción con moléculas de heparán sulfato proteoglicanos presentes en la superficie 14 celular [46, 47]. Varios trabajos de investigación en los que han empleado como modelo de estudio ratones mutantes que no expresan apo E para analizar los mecanismos del desarrollo de la aterosclerosis, han demostrado que una deficiencia de esta apolipoproteína genera hipercolesterolemia y el desarrollo espontáneno de lesiones ateroscleróticas [48]. -Apolipoproteína B La apolipoproteína B (apo B) existe en dos isoformas: apo B-48 y apo B-100. Ambas son codificadas por el mismo gen, pero se expresan diferente, en el enterocito la primera, y en el hígado la segunda. La apo B-48 debe su nombre a que solo expresa el 48% de la longitud de la proteína apo B100. Ello es debido a una enzima editora de la apo B, únicamente activa en las células intestinales humanas, que introduce una modificación post-transcripcional a través de la cual se introduce una señal de fin de síntesis prematura, generando un péptido de menor tamaño, la apo B-48. [32]. La apo B-100 es sintetizada en el hígado. En este lugar no se encuentra la enzima editora, por lo que la apolipoproteína se expresa por completo. La apo B-100 se encuentra en las VLDL y en las lipoproteínas que se sintetizan de su catabolismo:IDL y LDL [49]. Por el contrario, la apo B-48 se sintetiza en el intestino y se encuentra únicamente en los QM y QMr [50] siendo un marcador proteico específico de este tipo de lipoproteínas [32]. Puesto que la apo B tiene una importante función estructural, no se transfiere entre lipoproteínas. La apo B-100 es la proteína determinante para el reconocimiento y captación de LDL por los receptores LDL (LDLR) de superficie celular, tanto en tejidos hepáticos como extrahepáticos. La apo B-48 carece de la secuencia de reconocimiento localizada en el extremo Cterminal de la apo B que interacciona con LDLR y, por lo tanto, no puede mediar directamente la captación de lipoproteínas a través de LDLR [51]. Sin embargo, las lipoproteínas que contienen apo B-48 presentan un elevado contenido de apo E, la cual actúa como ligando para la captación de remanentes de VLDL y QM por los receptores LDLR y LRP [51]. La apo B-48 también es reconocida por el receptor apo B-48 (proteínas de unión de membrana, MBP 200 y 235) expresado en la superficie celular de monocitos/macrófagos, que constituyen una vía independiente de apo E y LPL, participando también en la formación de células espumosas [52]. 15 Ensayos con anticuerpos monoclonales han demostrado que por cada lipoproteína hay una sola molécula de apo B [53]. Esta característica posibilita la identificación de sujetos que se encuentren en riesgo de desarrollar ECV ya que la cuantificación mediante técnicas inmunológicas de los niveles de apo B en plasma permite conocer los niveles de lipoproteínas aterogénicas (QM, VLDL, LDL) en circulación. Además, el hecho de que haya una única molécula de apo B por partícula también hace posible cuantificar el ratio TG/apo B en suero, el cual puede ser empleado para estimar el tamaño de partícula [54]. -Apolipoproteínas C La familia de las apolipoproteínas C (apo Cs) está compuesta por tres apolipoproteínas de bajo peso molecular (6,6-8,8 kD), denominadas apo C-I, C-II, C-III, y son transferibles entre lipoproteínas. El hígado es el mayor lugar de síntesis de las apo Cs, aunque el intestino también contribuye pero en una menor proporción [55]. Durante el periodo de ayuno, las apo Cs se encuentran principalmente asociadas con HDL. En cambio, durante la absorción de las grasas por el intestino tras la ingesta de las comidas, con la producción de QM, o durante la síntesis activa de VLDL por el hígado, las apo Cs se redistribuyen preferentemente en la superficie de estas partículas ricas en triglicéridos: QM y VLDL. Sin embargo, a medida que el núcleo rico en TG de las VLDL y QM es hidrolizado y eliminado por acción de la LPL, se genera un exceso de componentes de superficie (FL, colesterol no-esterificado, y apolipoproteínas) y las apo Cs, junto con otros componentes de superficie, son transferidos a las partículas de HDL. De modo que las apo CS están en equilibrio con el metabolismo dinámico de “remodelado” de las lipoproteínas plasmáticas. La apo C-I, al igual que apo C-II y C-III, ha demostrado actuar como activador del enzima LCAT, por lo que las tres apo Cs participan en la esterificación del colesterol transferido a HDL [56] y en el “remodelado” de HDL. La principal función metabólica de apo C-II está asociada con su capacidad para actuar como un cofactor en la activación de la LPL [57]. Pacientes con una deficiencia en apo C-II presentan una hipertrigliceridemia severa y un aclaramiento plasmático alterado de VLDL y QM, incluso en presencia de una lipasa funcional [58]. La apo C-III es la proteína más abundante de este grupo de apolipoproteínas. Se ha sugerido que su presencia puede modular la internalización de residuos de TRL a través de receptores 16 hepáticos [59], y su capacidad para inhibir la captación hepática de TRL y de inhibir las funciones de la LPL y HL ha sido demostrada. Además, se ha demostrado que la apo C-III está implicada en la organización de la partícula de HDL, y su ausencia puede resultar en una deficiencia de HDLs, conduciendo al desarrollo de una aterosclerosis severa [60, 61]. -Apolipoproteinas A La apolipoproteína A (apo A-I) circula en el plasma principalmente como componente de HDL. También está presente en QM, aunque es dificil encontrarla en cantidades significativas en QMr, VLDL ,VLDL remanentes, o LDL. Los dos lugares donde se sintetiza principalmente son el intestino y el hígado, y no sufre niguna modificación postraduccional como glicosilación o fosforilación. La apo A-I derivada del intestino entra en circulación asociada a QM pero es rápidamente transferida a las partículas HDL durante la hidrólisis catalizada por la LPL de los QM. La apo A-I hepática entra en circulación como HDL naciente con muy poco o ningún contenido de ésteres de colesterol. Además de ser un importante componente estructural de las partículas de HDL a las que proporciona estabilidad termodinámica y funcionalidad fisiológica en varios estadios de su maduración, la apo A-I tiene otras funciones tales como servir de cofactor (activador) de LCAT. Ha sido demostrado in vitro que su presencia es requerida para la actividad de dicha enzima [62], por lo que desempeña una importante función en la mobilización del exceso de colesterol de las células que no pueden metabolizarlo o disponer de él. La apolipoproteína A-II (apo A-II) es la segunda apolipoproteína más abundante en HDL, y puede estar asociada a otras lipoproteínas aunque en menor cantidad. El principal lugar de síntesis es el hígado. Es sabido que la apo A-II es capaz de desplazar por completo a la apo A-I de HDL. Excepto por su presencia como componente estructural de HDL, se desconoce si la apo A-II tiene una función estructural específica en HDL o en su metabolismo [63]. La apolipoproteína A-IV (apo A-IV) se trata de un componente de las nuevas particulas secretadas de QM, pero no se encuentra en QMr, VLDL o LDL. A diferencia de otras apolipoproteínas, la mayoría de la apo A-IV se encuentra libre en el plasma más que unida a lipoproteínas, y se redistribuye rápidamente entre estas dos fracciones. La apo A-IV se sintetiza casi exclusivamente por el hígado e intestino. En cuanto a sus funciones, se ha demostrado in vitro que también es un potente activador de LCAT [63]. 17 1.3 Las lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) Las TRL pueden derivar tanto de la vía exógena (constituidas a partir de los lípidos absorbidos de los alimentos) como la endógena (formadas a partir de lípidos almacenados). Mientras que todas las lipoproteínas transportan TG, las TRL son considerablemente más ricas en TG que las demás [64]. Las TRL son una mezcla heterogénea de lipoproteínas que incluye QM, QMr, VLDL y VLDL remanentes o IDL. Debido al considerable solapamiento de las densidades de estas lipoproteínas, el aislamiento de las diferentes clases desde el plasma humano posprandial es casi imposible. Así, la fracción de TRL ha sido ampliamente utilizada para el estudio del efecto de los lípidos que se ingieren con los alimentos sobre las enfermedades cardiovasculares [65]. 1.3.1 Los quilomicrones (QM) La principal función de los QM es permitir que los lípidos contenidos en los alimentos ingeridos y absorbidos por el intestino, sean transportados por el torrente sanguíneo, y alcancen los tejidos periféricos para la producción y almacenamiento de energía, o biosínteis de otras moléculas. Los QM constituyen las partículas lipoproteicas más grandes (diámetro 75-1200 nm) y menos densas (d<0.95 g/ml), con un gran componente lipídico muy enriquecido en triglicéridos (>90%). Contienen en su estructura diversas apolipoproteínas, incluyendo apo B-48, apo A-1, apo C-II, apo C-III, y apo E [32]. El tamaño de los QM depende del flujo de TG a través de los enterocitos. Durante la absorción de lípidos las partículas son mayores en diámetro [66, 67] en comparación con el período de ayunas, durante el cual predominarán las partículas de menor tamaño producidas por las células del intestino [67]. 1.3.1.1 Metabolismo de los quilomicrones a) Absorción de los lípidos La mayoría de los lípidos que son ingeridos en la dieta lo son en forma de TG, que constituyen más del 90% de la ingesta diaria de lípidos. El resto está formado por FL, colesterol, EC, ácidos grasos (AG) libres y vitaminas liposolubles A, D, E y K. 18 La eficiencia de absorción de las grasas es muy elevada. Bajo condiciones normales, prácticamente el total de las grasas ingeridas es absorbida, y menos de un 5% es expulsado con las heces. Los lípidos sufren previamente un proceso de hidrolización antes de poder ser absorbidos por nuestro organismo, y este proceso principalmente tiene lugar en el estómago y la parte proximal del intestino delgado. La digestión y absorción de los lípidos contenidos en los alimentos implica la función coordinada de varios órganos, comenzando en la boca. Al introducir los alimentos en la boca, la lipasa lingual inicia la hidrólisis de los TG, aunque los niveles de digestión son mínimos. Los AG liberados de esa primera hidrólisis estimulan la secreción de bilis y jugos pancreáticos. Posteriormente pasan al estómago, donde los lípidos son emulsionados y sufren una digestión parcial por lipasas digestivas antes de ser transferidos al duodeno y absorbidos a través del epitelio intestinal. La digestión de los lípidos que comienza en el estómago requiere la implicación de varias lipasas ácidas, siendo la lipasa pancreática la principal, la cual tiene preferencia por los AG de cadena media (6-12 átomos de carbono), produciendo de su actividad AG libres y βmonoacilglicéridos. El jugo pancréatico contiene también lipasas esterasas que actúan sobre TG con AG de cadena corta, EC, y monoglicéridos, sin necesidad de que haya sales biliares presentes. Los FL son hidrolizados por fosfolipasas específicas, especialmente por la fosfolipasa A2. El ratio de absorción de AG depende de su longitud de cadena. Los AG de cadena corta (<6 átomos de carbono) se comportan como simples carbohidratos; y los AG de cadena media son rápidamente absorbidos y transportados mediante su unión a albúmina directamente al hígado por la vena portal sin ser modificados. Debido al poco tiempo necesario para ser absorbidos por el intestino, los AG de cadena media son empleados como fuente de energía inmediata sin ser almacenados en el tejido adiposo, aunque proporcionan menor energía que los AG de cadena larga (>de 12 átomos de carbono ). En el duodeno, los ácidos biliares con propiedades detergentes, emulsionan los lípidos haciéndoles mejores substratos para su hidrólisis por la acción de varias lipasas localizadas en el lumen del intestino. Con dicho propósito, las sales biliares solubilizan los lípidos y forman agregados de pequeño tamaño (40-600 μm), denominados micelas [68]. La incorporación de los lípidos a las micelas se hace orientando los enlaces éster de los lípidos hacia la superficie, que son los más susceptibles a la digestión por las lipasas pancreáticas, las cuales se encuentran en solución acuosa [68]. Una vez que las micelas se encuentran en las microvellosidades intestinales, los 19 1.3.2.1 Metabolismo de las VLDL Varias horas después de la ingesta de alimentos, cuando los niveles de QM en circulación se ven reducidos, los requerimientos de AG por parte de los tejidos periféricos se satisfacen gracias a las VLDL, que transportan los TG sintetizados en el hígado. La cantidad de VLDL secretada por el hígado es extremadamente variable y está determinada por diversos factores., como es el caso de flujo de AG al interior del hígado, además del número de insaturaciones presentes en la estructura de los AG. En el caso de haber un incremento en el flujo de AG, este órgano responde por medio de un aumento en la cantidad y tamaño de las VLDL sintetizadas. Así, si predominasen los AG saturados (SFA, saturated fatty acid) en las moléculas de TG, las partículas de VLDL serán más numerosas pero de un tamaño menor que si predominasen los AG poliinsaturados (PUFA, polyunsaturated fatty acids). Aunque existe evidencia de que el hígado sintetiza constitutivamente partículas VLDL durante el estado de ayunas y post-absorción [101], el principal estímulo para la síntesis de VLDL parece ser la captación y el catabolismo de los QMr por parte del hígado [32]. Las nuevas partículas de VLDL secretadas adquieren apo C y apo E de las HDL circulantes. Al igual que las partículas de QM, las VLDLs serán hidrolizadas a su paso por los capilares por la acción de la LPL, y los AG liberados serán captados por los tejidos (Figura 5). El resultado de esta actividad es la reducción del tamaño de las partículas con una relación más similar en su contenido en colesterol y TG. Esto incrementa la densidad de la partícula, dando lugar a las VLDL remanentes o IDL, que siguen en circulación. El catabolismo de las VLDL también constituye una de las vías de síntesis de las HDL ya que la apo C es transferida nuevamente a las HDL. Las VLDL remanentes (IDL) entran en el espacio de Disse del hígado para ser rápidamente eliminadas de la circulación vía receptores endocíticos. Allí, las IDL serán catabolizadas por la HL y la proteína de transferencia de esteres de colesterol (CETP), resultando en la formación de LDL [32] que son las lipoproteínas con mayor contenido de colesterol en plasma [63]. La permanencia de las LDL en el plasma es bastante elevada con respecto al resto de lipoproteínas, presentando una vida media de casi tres días, y sirven como fuente de colesterol para la mayoría de los tejidos mediante su unión a receptores específicos presentes en las membranas plasmáticas de las células diana de los tejidos periféricos [30]. Las LDL irán lentamente desapareciendo de la circulación en el hígado, siendo aproximadamente un 75% de las LDL retiradas por el hígado a través de interacciones de elevada afinidad con el receptor LDLR via apo B-100, que sirve de ligando (figura 5). 26 -Transporte reverso del colesterol mediado por HDL El hígado es el único órgano con elevada capacidad de eliminación del colesterol, el cual es posteriormente secretado al intestino mediante su conversión a sales biliares y, finalmente excretado por las heces. Sin embargo, el colesterol que se acumula en el espacio subendotelial de la pared arterial también puede reducirse mediante su transferencia desde las células espumosas donde se acumula, a las partículas HDL maduras y su principal componente proteico, la apo A-I [103]. La apo A-I libre de lípidos se une a FL y colesterol libre de las membranas celulares de los hepatocitos, en un proceso mediado por el receptor celular de ATPasa ABCA1, siendo así transferido el exceso de colesterol libre de las células de los tejidos periféricos al hígado a través de HDL, que adquieren un mayor tamaño y menor densidad [18]. 27 Figura 5. Visión global del metabolismo de las lipoproteínas. Síntesis exógena: Los quilomicrones (QM) son ensamblados en el los enterocito y liberados al sistema linfático.La LPL unida al endotelio capilar hidroliza los TG de los QM para generar QM remanentes (QMr) que son rápidamente retirados de circulación por el hígado. Síntesis endógena: Los lípidos intrahepáticos son reempaquetados y secretados como VLDL que son substrato de la LPL entotelial. Los remanentes formados de la hidrólisis de las VLDL son también captados por el hígado o convertidos a LDL. El receptor LDL (LDLR) hepático es responsable de la retirada de LDL del plasma humano. Imagen de Errico et al. (2013) [102]. Las partículas HDL difunden al plasma, donde el colesterol libre es esterificado por la enzima LCAT que es sintetizada en el hígado y circula por el plasma en la superficie de las lipoproteínas, principalmente HDL [104]. El colesterol esterificado resultante es internalizado por los hepatocitos a través de receptores que reconocen HDL, como el receptor scavenger B1 (SRB1) [105]. A lo largo de su recorrido desde los tejidos periféricos al hígado, algunos EC son transferidos desde las partículas HDL a LDL, VLDL o QM mediante un intercambio con TG y FL [103]. Esta transferencia de TG está mediada por la CETP y la de FL por la proteína de tranferencia de fosfolípidos (PLTP) [103]. Debido a la función de HDL en el transporte reverso de colesterol, elevados niveles en circulación de esta lipoproteína se relacionan con propiedades de ateroprotección. Entre sus acciones principales están la estimulación de la salida de colesterol de las células espumosas, además de prevenir la activación del endotelio. Esto último es posible gracias a que potencian la producción de óxido nítrico, el cual es necesario para mantener la integridad de la barrera endotelial [106]. 1. 4 Vías de incorporación de TRL en los macrófagos La presencia de macrófagos con elevada carga de lípidos en su interior es el distintivo de las lesiones ateroscleróticas, y comprender las vías responsables de la acumulación de lípidos en los macrófagos es de especial importancia en el proceso aterosclerótico. Investigaciones realizadas con modelos animales hiperlipidémicos que no expresan los genes que codifican los receptores de superficie en macrófagos, mostraron una considerable reducción en el tamaño de las lesiones aterogénicas y acumulación lipídica arterial [107, 108]. En base a ello, se estableció que la vía de internalización de lipoproteínas mediada por receptores celulares de elevada afinidad es un requisito en la patología de la aterosclerosis y que constituye la mayor vía de formación de células espumosas in vivo. Sin embargo, existen envidencias considerables que muestran que la internalización de lípidos procedentes de lipoproteínas en macrófagos puede realizarse a través de otras vías alternativas independientes de receptores específicos de superficie como son el mecanismo de internalización fagocítico, patocítico o pinocítico [109]. De hecho, en circunstancias en las que la 28 concentración de lipoproteínas presentes en la íntima excede la concentración de lipoproteínas aterogénicas provocando la saturación de las vías de internalización de lípidos vía receptores, estos mecanismos adquieren incluso mayor importancia.[110]. Es importante señalar que la LPL expresada por los macrófagos en su superficie desempeña un papel importante en la retención de lipoproteínas en la superficie de los macrófagos ya que sirve de puente para la unión de entre lipoproteínas y proteoglicanos, facilitando la disponibilidad de las lipoproteínas para que interaccionen con sus correspondientes receptores[111]. A continuación, nos centramos en las vías de internalización de lípidos por los receptores celulares de superficie. Se diferencian dos grandes grupos de receptores: los que dependen de la presencia de apo E en la partícula de las lipoproteínas como ligando con el receptor; y los que son independientes de apoE y presentan afinidad por un amplio número de ligandos. 1.4.1 Endocitosis mediada por receptores celulares de superficie de macófagos dependientes de apolopoproteína E. El receptor LDLR constituye el miembro fundador de una clase entera de receptores transmembrana relacionados. Entre los receptores miembros de este grupo con los que LDLR muestra mayor homología destacan: el receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR), y la proteína-1 relacionada con el receptor LDL (LRP-1). Estos receptores combinan tres tipos de módulos extracelulares en diferentes reorganizaciones para llevar a cabo una amplio rango de funciones fisiológicas, tanto de transporte de proteínas, como de receptores y co-receptores en cascadas de transducción de señales. Los tres módulos extracelulares son repeticiones ricas en cisteína que contribuyen a la unión de la mayoría de los ligandos y facilitan la posterior liberación de la lipoproteína [112]. El LDLR es la proteína responsable en mayor medida de la internalización de partículas transportadoras de colesterol al interior celular. La mayoría del colesterol plasmático en circulación en humanos se encuentra en la forma de partículas de LDL [113]. La expresión de este receptor en la superficie celular de los macrófagos está inversamente regulada por la concentración intracelular de colesterol [114], por lo que en presencia de concentraciones muy elevadas de lipoproteínas ricas en colesterol se satura. 29 Cada miembro de la familia de receptores LDLR contribuye a la incorporación de lipoproteinas por macrófagos de forma diferente, siendo LDLR específico de lipoproteínas que contienen apo B-100, mientras que LRP-1 y VLDLR son dependientes de la presencia de apo E en las partículas. Las TRL son lipoproteínas con un elevado contenido de apo E, y son principalmente reconocidas e incorporadas por LRP-1 y VLDLR [115]. Con las TRL remanentes ocurre lo mismo [115], pues los QMr, partículas también muy enriquecidas en apo E, se unen con alta afinidad a LRP-1 y VLDLR [116, 117]. Además, los macrófagos producen apo E, lo que potencia aún más la unión de los QMr a los macrófagos, y la LPL sintetizada por los macrófagos acelera su incorporación y metabolismo. Sin embargo, ha quedado demostrado que, en células que no expresan el receptor LDLR, la incorporación de QMr no se ve alterada, y que las partículas siguen siendo internalizadas mediante otras vías independientres a la familia de receptor LDLR [118, 119]. 1.4.2 Endocitosis mediada por receptores celulares de superficie de macófagos independientes de apolopoproteína E. Los receptores Scavenger (SR) tienen una elevada influencia en el desarrollo y estabilidad de la placa aterosclerótica ya que representan una de las vías con mayor afinidad para la internalización tanto de lipoproteinas modificadas como nativas en los macrófagos [120]. Igualmente, se caracterizan por reconocer un amplio repertorio de macromoléculas con carga negativa como ligandos, no únicamente lipoproteínas. Así pues, su función de transporte de lípidos y colesterol dentro y fuera de las células es importante en el desarrollo de la lesión [121] y constituyen un determinante crítico de la activación del fenotivo proinflamatorio en los macrófagos localizados en la lesión atersclerótica [26]. Hasta la fecha, numerosos estudios respaldan el papel que los SR de clase A (SRA), SRA1 y SRA2, y dos miembros de la clase B, CD36 y SRB1 ejercen en el desarrollo de la lesión aterosclerótica [120, 122]. •SR de Clase A. Los SR clasificados dentro de esta familia son receptores transmembrana tipo I expresados en macrófagos [123], que incluye 5 miembros: SRA1, SRA2, SRA3, con un dominio común rico en cisteína; MARCO y SR con lectina tipo C, que carecen de él [26, 124]. SRA3 queda retenido en el retículo endoplasmático y no es accesible a los ligandos extracelulares, de modo que su importancia funcional no está clara [125]. 30 SRA1 y SRA2 se expresan en la superficie celular de macrófagos, incluyendo células espumosas presentes en la placa aterosclerotica [126] y son responsables de aproximadamente el 80% de la incorporación de LDL modificadas en el interior celular de los macrófagos, tanto acetiladas como oxidadas [127, 128]. A pesar de su colaboración en la formación de células espumosas, varios estudios han sugerido que al mismo ejercen funciones de protección. En estudios desarrollados con modelos animales, se ha visto que la expresión de SRA es mayor en animales con poca respuesta aterosclerótica [129]. También se ha detectado que la sobreexpresión de un dominio extracelular de SRA humano reduce en un 20% la adherencia de monocitos/macrófagos a las células endoteliales y lesiones ateroscleróticas de la aorta en ratones que no expresaban LDLR, retardando el desarrollo temprano de lesiones ateroscleroticas. En lesiones avanzadas, donde la muerte celular de macrófagos desencadena la formación del núcleo necrótico y la desestabilización de la placa, los SRA han demostrado además jugar un papel importante tanto en la inducción de la apoptosis como en el aclaramiento de estas células muertas [26]. •SR de Clase B. Esta familia de receptores scavenger incluye a los receptores SRB1, SRB2, y CD36. CD36 es un receptor tipo III con múltiples dominios transmembrana que atraviesa la membrana dos veces para formar un loop extracelular altamente glicosilado con 2 colas cortas intracelulares [130]. Presenta una gran homología con SRB1, pero desempeñan distintas funciones en el metabolismo lipídico y en el desarrollo de la aterosclerosis. CD36 es el receptor más importante entre los SR y entre los ligandos que une se incluyen oxLDL, células apoptóticas, y productos finales de glicosilación. La participación de CD36 en la progresión de la aterosclerosis es algo controvertida. Se ha visto que CD36 participa en la acumulación intracelular lipídica en macrófagos in vitro [128], y la delección de CD36 en monocitos in vivo parece además reducir la aterogénesis [131]. Sin embargo, en otros estudios con ratones hiperlipidémicos que no expresan apo E, se ha observado un importante incremento del tamaño de las lesiones ateroscleróticas si la vía de incorporación mediada por el receptor CD36 se inactivaba [132]. Además de mediar incorporación lipídica, CD36 puede estimular la señalización 31 proinflamatoria desencadenando una inflamación crónica en la pared arterial. No obstante, las vías que se activan a consecuencia de la unión de CD36 a lipoproteinas modificadas aún no están definidas. SRB1 se descubrió por su homología con CD36, con el que comparte el 30% de su secuencia de aminoácidos y, al igual que CD36, SRB1 puede unir tanto formas modificadas de LDL como lipoproteínas nativas HDL, LDL, y VLDL [133, 134]. SRB1 está altamente expresado en hígado y macrófagos y, dependiendo del contexto, también puede desarrollar funciones antiaterogénicas o proaterogénicas. Por un lado, participa en el transporte reverso del colesterol a través de dos mecanismos: a) participa en el transporte de colesterol de las células a HDL, y b) facilita la liberación selectiva del colesterol desde HDL al hígado para su excreción en forma de bilis y heces [134]. En contra, también se ha detectado que en lesiones tempranas, parece promover la formación de la estría grasa ya que contribuye a incorporar lipoproteínas en el interior de los macrófagos [135]. 32 33 Figura 6. Mecanismos de internalización de las TRL en macrófagos. Las TRL son incorporadas en macrófagos a través de la vía mediada por receptores celulares de superficie y por rutas independientes de los receptores celulares como macropinocitos y fagocitosis de partículas agregadas. La internalización de las TRL a través de LDLR, VLDLR y LRP-1 es apo E-dependiente. Una proporción menor de TRL es incorporada también por los receptores scavenger (SR), entre los que se incluyen SRA2, SRB1 y CD36. Estos son apo E-independientes. 1.5 Propiedades aterogénicas de las partículas TRL En los últimos 50 años, han comenzado a cobrar especial interés las características y propiedades de las TRL debido a su participación en la trigliceridemia postprandial y en los procesos aterogénicos [136]. Hasta hace relativamente poco, las LDL eran reconocidas como las lipoproteínas más aterogénicas y primera diana en el desarrollo de terapias [137]. No obstante, estudios recientes indican que las TRL son igual o incluso más aterogénicas que las LDL [138]. Una de las características que más controversia generaba con respecto a la aterogenicidad de las TRL es su tamaño de partícula. Se había asumido que las lipoproteínas de mayor tamaño (QM y VLDL) eran incapaces de penetrar la capa íntima de las arterias y estar disponibles para su internalización por los macrófagos en el espacio sub-endotelial, a menos que llegaran a ser más pequeñas tras su hidrólisis [139]. Sin embargo, además de la demostrada presencia de VLDL, IDL y LDL en los tejidos ateroscleróticos [140], existe evidencia de que los QM también son capaces de infiltrarse hasta la intima , acumularse en las células del músculo liso [141,142], atraer monocitos y ser internalizados por ellos, además de estimular la activación de la producción de marcadores de inflamación e inducir estrés oxidativo [143]. Por otro lado, a diferencia de las partículas LDL que precisan de modificaciones químicas u oxidación para ser internalizados en los macrófagos y formar células espumosas [144], las TRL no necesitan ser modificadas para ser identificadas por los receptores de superficie celular de los macrófagos e incorporar en su interior los lípidos que contienen [145]. Este factor hace que las TRL sean más aterogénicas que las LDL. Además, es necesario prestar especial atención a las partículas remanentes de TRL dadas las características pro-aterogénicas que exiben. Las TRL remanentes son partículas más pequeñas y densas que sus precursoras (QM y VLDL), pueden penetrar la pared arterial a través de una transcitosis mediada sin receptores, regulada por el grandiente de concentración entre el lumen del vaso y la íntima, y posteriormente ser retenidas en el espacio subendotelial [33]. Las TRL pueden a su vez agravar la aterosclerosis por medio de varias vías. Una de ellas es a través de la apo C-III contenida en las VLDL y sus remanentes. Dado que apo C-III tiene la 34 capacidad de inhibir la acción de la LPL, inhibe por tanto la incorporación de los remanentes al hígado, promoviendo la retención arterial de VLDL y sus remanentes, haciéndolas más aterogénicas [146] Por otro lado, la lipólisis de TRL produce AG libres y monoglicéridos. Estudios en cultivos celulares han demostrado que los AG de cadena larga, particularmente los SFA, son citotóxicos 160, [147, 148] por lo que la presencia de lipólisis de TG de las TRL y sus remanentes en lesiones ateroscleróticas debido a la acción de la LPL secretada por los macrófagos incrementa los niveles de AG libres tóxicos. Este factor promueve la muerte celular y la inflamación, ambos atributos clave de la aterogénesis [149]. 1.5.1 Las TRL en el periodo posprandial Los niveles de TRL se encuentran especialmente elevados en el periodo posprandial, y sus niveles pueden predecir el riesgo cardiovascular independientemente del nivel de otros lípidos [150, 151, 152]. Dado que los TG plasmáticos son principalmente transportados por TRL, sus niveles de concentración durante el perido postprandial son considerados un marcador de TRL y de sus partículas remanentes. Tradicionalmente, la medición de los niveles de TG plasmáticos se realizaba en ayunas [153]. Sin embargo, varios son los motivos por los que los niveles séricos de TG postprandiales podrían resultar ser mejores predictores de eventos cardiovasculares en comparación con los medidos en ayunas [151, 152]. En primer lugar, los niveles de TG se incrementan significativamente tras la ingesta de alimentos durante el periodo posprandial, y la medición de TG en ayunas no capta con precisión el efecto de las TRL y las partículas remanentes sobre el perfil lipoproteico en el periodo postprandial. Varios estudios prospectivos y datos epidemiológicos sugieren que un metabolismo postprandial de TG alterado contribuye a la aterosclerosis, es un distintivo de pacientes con enfermedades coronarias establecidas y puede ayudar a predecir el desarrollo de enfermedades cardiovasculares [154, 155]. Además, en los países industrializados, las personas nos encontramos en estado de no ayunas/postprandial durante la mayor parte del día, aproximadamente 18 horas [156]. Puesto que el periodo postprandial se caracteriza por la circulación de lipoproteínas potencialmente aterogénicas 35 2.3 La inflamación crónica en la obesidad y el síndrome metabólico La obesidad, inicialmente considerada una enfermedad de almacenaje de lípidos debido a la lipotoxicidad generada que causa daño en los tejidos, hoy día es vista por muchos investigadores como un proceso inflamatorio crónico de baja grado. La inflamación es una respuesta fisiológica del organismo a un estímulo dañino, físico-químico o biológico caracterizada por la activación de la respuesta inmune innata y adaptativa [158, 198]. La respuesta proporcionada implica la acción coordinada de muchas células (leucocitos y macrófagos) y mediadores (quimioquinas, citoquinas, moléculas vasoactivas, eicosanoides, y productos de cascadas proteolíticas), y generalmente conduce al reestablecimiento de la homeostasis. El endotelio activado permite la extravasación de neutrófilos y componentes solubles al tejido, donde son activados y liberan agentes tóxicos y enzimas proteolíticas con el fin de eliminar el agente dañino. Si tiene éxito, la respuesta inflamatoria cesa y se procede a la reparación del tejido mediante la conversión de los mediadores lipídicos proinflamatorios a antiinflamatorios y pro-resolutivos (lipoxinas, resolvinas, y protectinas) [199]. Los leucocitos del tejido sufren apoptosis y son eliminados por fagocitosis por los macrófagos [200]. Éstos adquieren un fenotipo que conduce a la resolución de la inflamación a través de la liberación de señales antiinflamatorias como interleuquina 10 (IL-10) y el factor de crecimiento β (TGFβ) [201]. Sin embargo, si la neutralización y eliminación del estímulo dañino o la propia retirada de las células inflamatorias apoptóticas del tejido inflamado falla, el proceso inflamatorio persiste y se establece un estado de inflamación crónica. La condición de inflamación crónica se ha asociado con obesidad mórbida y se caracteriza por una activación continua del sistema de inmunidad innata [202]. El estado de inflamación que acompaña al síndrome metabólico no se presenta con infección o signos de autoinmunidad y no parece que tenga lugar un tejido masivamente dañado. De hecho, la dimensión de la activación de la respuesta inflamatoria no es grande, por ello se le suele denominar inflamación crónica de “bajo grado” [182], pero es su persistencia a lo largo del tiempo lo que ocasiona el daño en los tejidos. Desde el punto de vista inmunológico, también se ha demostrado que la obesidad está ligada a un estado de inflamación crónica evidente. Se ha detectado que el tejido adiposo está infiltrado por células del sistema inmunitario, que también son fuente de citoquinas inflamatorias [203]. Además, cuando incrementa la adiposidad, el tejido adiposo estimula la producción por parte del endotelio vascular de agentes trombogénicos como el inhibidor del activador tisular del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y agentes trombolíticos como el activador tisular del plasminógeno (PA). También induce el aumento de la concentración plasmática de moléculas de adhesión de la 42 membrana endotelial: ICAM-1, VCAM-1 y la P-selectina, contribuyendo a un mayor reclutamiento de monocitos y mayor infiltración. Los monocitos infiltrados en el tejido adiposo se diferencian por acción del factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF, macrophage-colonies stimulator factor) derivado de adipocitos, conduciendo a una mayor acumulación de macrófagos en el tejido. La interacción entre adipocitos y macrófagos, a través de señales quimioquina/citoquina generadas, aumenta la reacción inflamatoria en el propio tejido adiposo, incrementando aún más los niveles en circulación de quimioquinas/citoquinas en obesidad [204]. 2.4 Marcadores de inflamación como predictores de riesgo cardiovascular en la obesidad El interés por las características inflamatorias de la obesidad y por sus factores de riesgo asociados, se ha intensificado en los últimos años. Esto es debido a que la inflamación crónica asociada a la obesidad, que parece también estar implicada en la resistencia a la insulina y disfunción endotelial, proporciona una posible explicación a la estrecha relación existente entre la obesidad y la aterosclerosis, la cual es la mayor causa de ECV y mortalidad [205, 206]. La elevada síntesis y liberación de citoquinas pro-inflamatorias circulantes procedentes del hígado y tejido adiposo (adipoquinas) durante la respuesta inflamatoria crónica, a largo plazo induce la disfunción del endotelio vascular, un mecanismo patogénico predictor de la aterosclerosis y ECV [207]. Gran parte de las moléculas proinflamatorias liberadas proceden del tejido adiposo, por lo que ya no es considerado como un órgano pasivo de almacenaje de TG y fuente de liberación de AG libres. Los adipocitos maduros han sido reconocidos como células secretoras endocrinas que liberan un gran número de sustancias biológicamente activas como hormonas, citoquinas, y otros factores que participan en los mecanismos de la activación plaquetaria, hipertrofia del miocardio, progresión de la enfermedad cardiovascular) [207], y de la resistencia a la insulina [187]. 43 2.4.1. La sensibilidad a la insulina como biomarcador de inflamación Dada la implicación de la acción de la insulina en el desarrollo de las ECV, mejoras en el nivel de sensibilidad a esta hormona implicarían una reducción de la respuesta inflamatoria y del riesgo de ECV. Se ha verificado que la pérdida de peso en pacientes obesos está asociada con una reducción de biomarcadores de inflamación [208, 209], entre ellos principalmente la RI [210, 211]. 2.4.2 Citoquinas y adipoquinas como biomarcadores de inflamación Las citoquinas participan en la regulación de las funciones y metabolismo celular a través de una red de señales paracrinas, endocrinas y autocrinas, que modulan la biología de la célula. La mayoría de adipoquinas se producen en elevadísimas cantidades con el aumento de la adiposidad, y no solo están relacionadas con la regulación del consumo de energía y la homeostasis del peso corporal, sino también tienen una estrecha asociación con las patologías relacionadas con la obesidad [212]. Por este motivo, las adipoquinas son importantes mediadores aterogénicos. La sustanciosa evidencia que une inflamación, aterosclerosis, y obesidad apoya el uso de las citoquinas y adipoquinas como biomarcadores de inflamación como una forma de medir el riesgo existente en condiciones de obesidad ya que la expresión de éstos biomarcadores plasmáticos se ve alterada en persona obesas con respecto a individuos con peso normal, siendo así de gran utilidad para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades cardiovasculares. 2.4.2.1 Biomarcadores analizados en el presente proyecto: ·Factor de necrosis tumoral α (TNFα) TNF-α es una citoquina proinflamatoria, implicada en las alteraciones metabólicas presentes en la inflamación crónica, patogénesis de la resistencia a la insulina, anorexia, y pérdida de peso en individuos con sobrepeso [213]. Varios estudios han mostrado que TNF-α regula el metabolismo de lípidos y glucosa en adipocitos ya que inhibe la internalización de los AG derivados de los TG de lipoproteínas [214], y estimula la expresión de la lipasa sensible a hormonas [215]. Las acciones metabólicas de TNF-α conducen al incremento de los niveles en circulación de AG libres y RI. Otros estudios han demostrado que el tratamiento crónico con TNF-α resulta en un importante desequilibrio de la señalización de insulina pues reduce los niveles de expresión del 44 transportador de glucosa sensible a la insulina-4 (GLUT4) y el sustrato-1 del receptor de la insulina (IRS-1), inhibe la fosforilación de la tirosina de IRS-1, y estimula la fosforilación de la serina de IRS-1 y la fosforilación específica del receptor de insulina [216]. Los niveles de expresión de TNF-α se incrementan en el tejido adiposo con el aumento de la adiposidad, y se reducen con la pérdida de peso [217, 218]. TNF-α actúa como un potente inductor de otras adipoquinas proinflamatorias como interleuquina-6 (IL-6), MCP-1, leptina, y el inhibidor del activador de plasminógeno1 (PAI-1) [217]. A su vez, también inhibe la síntesis de adipoquinas antiinflamatorias como la adiponectina, ya que inhibe su expresión y secreción, aunque posiblemente sea debido por la estimulación de la producción de IL-6, que también inhibe la secreción de adiponectina [219, 220]. Este hecho explica la correlación negativa existente entre la adiposidad visceral y los niveles de adiponectina en la que TNF-α parece estar implicado. ·Proteínas quimioatrayentes del monocito -1 (MCP-1) MCP-1 es una quimioquina inflamatoria, proteína especializada perteneciente a la familia de las citoquinas, producida predominantemente por macrófagos y células endoteliales. Recientes estudios han mostrado que los adipocitos también son fuente de quimioquinas específicas como MCP-1 [206]. MCP-1 es un potente factor quimiotáctico para monocitos [221], cuya principal función es su reclutamiento y adhesión al endotelio [222], por lo cual MCP-1 juega un papel importante en la aterogénesis. Varios ensayos realizados en ratones como modelo de estudio, han demostrado que la expresión de esta quimioquina proinflamatoria se ve incrementada en las lesiones ateroescleróticas [223], y la inhibición de su expresión o la de su receptor, el receptor de quimiocina CC-2 (CCR2), resulta en una reducción del tamaño de la lesión y del número de macrófagos en la lesión en ratones hiperlipidémicos que no expresan LDLR o apo E [224]. Además, los niveles de ARNm de MCP-1 se han visto hasta 7.2 veces más sobreexpresados en el tejido adiposo y plasma de ratones obesos con respecto a ratones de peso normal [225]. La acción de MCP-1 afecta a la sensibilidad a la insulina ya que reduce los niveles de captación de glucosa estimulados por la insulina, y también afecta a la expresión de genes adipogénicos como LPL, GLUT4, receptor β-3-adregénico y γ-PPAR [159]. Se ha visto que los niveles de expresión de estos genes se encuentran potencialmente elevados en pacientes con elevado riesgo cardiovascular [226], y más significativamente en personas con diabetes [227]. 45 ·Interleuquina 1-β (IL-1β ) La presencia de IL-1β ha sido demostrada en lesiones ateroscleróticas, pues se trata de una citoquina producida por los macrófagos presentes en las lesiones y son de elevada importancia en el inicio y amplificación de la lesión [228]. IL-1β puede alterar la función de las células endoteliales [229], potenciar la mitogénesis de las células del músculo liso vasculares [230], y reclutar leucocitos al espacio subendotelial [231] . ·Adiponectina La adiponectina es una adipoquina antiinflamatoria cuya función metabólica principal es la utilización de la glucosa y la oxidación de los AG. La adiponectina mejora la sensibilidad a la insulina mediante el incremento de la expresión del receptor de la insulina, y de su proteína adaptadora de señalización IRS-1 en el músculo esquelético [232]. Al igual que la leptina, es un regulador a largo plazo del apetito y del metabolismo lipídico [180]. La adiponectina ejerce importantes funciones frente al desarrollo de aterosclerosis gracias a sus propiedades antiaterogénicas, antidiabéticas y antiinflamatorias, pues tiene la capacidad de inhibir la actividad fagocítica y la producción de TNF-α de los macrófagos [180, 233]. Entre sus actividades, merece la pena destacar que es capaz de suprimir la expresión de moléculas de adhesión en las células endoteliares vasculares, y modula la señalización del NF-kB [234]. Asimismo, reduce los niveles de secreción de TNF-α por monocitos/macrófagos y reduce la expresión del gen que codifica los SRA en macrófagos. Debido a ello, el nivel de internalización de partículas LDL oxidadas y la formación de células espumosas se ve reducido de manera importante [235]. La adiponectina inhibe también la proliferación y migración de células del músculo liso [236]. Esto sugiere que esta adipoquina puede ser protectora frente a la aterogénesis mediante la inhibición de la acumulación de células espumosas derivadas de monocitos/macrófagos en la pared vascular. Los niveles circulantes de adiponectina en el plasma se correlacionan inversamente con el IMC, estando así, a diferencia de otras adipoquinas, muy reducidos en condiciones de obesidad y DMT2, al igual que en enfermedades arteriales coronarias [237, 238]. · 46 ·Leptina La leptina es una hormona cuyo nombre deriva del vocablo griego leptos, que significa “delgado”. Es una sustancia bioactiva que se produce tanto en los adipocitos como en el hipotálamo, ovarios y placenta [239, 240]. Esta hormona juega un importante papel en la regulación del consumo de energía a través del hipotálamo y en el incremento del gasto energético tanto por la inhibición de la lipogénesis como por la estimulación de la lipólisis en animales y humanos [241]. Esta hormona se encuentra en la circulación sistémica y su secreción es estimulada por la insulina, glucocorticoides y citoquinas como TNF-α e IL-1, y es inhibida por catecolamidas, testosterona y agonistas de PPAR-δ [242]. En las personas delgadas, cerca del 50% de la leptina está unida a proteínas, encontrándose a baja concentración en circulación, mientras que en las personas obesas, la mayoría se encuentra en su forma libre [239, 240, 243]. Dada la asociación existente entre los niveles en circulación de la leptina y la obesidad, esta citoquina parece ser útil en la predicción de la obesidad pues los niveles en circulación de la leptina son mayores cuanto mayor es la capa grasa subcutánea del individuo [244]. Entre las funciones más importantes de la leptina está la de inhibir el apetito, mediando el balance de energía al enviar información al cerebro acerca de la acumulación y agotamiento de los depósitos grasos [180], pero también es importante en la regulación de la respuesta inmune inflamatoria [245]. Varios estudios in vitro han demostrado que la leptina es capaz de unirse a su receptor expresado en las células del sistema inmune (linfocitos, células NK, mococitos/macrófagos, células dendríticas, neutrófilos y eosinófilos), y por consecuencia, ocurre la activación, proliferación, maduración y producción de mediadores inflamatorios [246]. La leptina puede potenciar a su vez la agregación plaquetaria y la trombosis arterial [247], promover angiogénesis, perjudicar la distensibilidad arterial, inducir la proliferación y migración de células vasculares del músculo liso [248] y parece ser un potenciador de la calcificación de células vasculares. Se considera que la leptina está asociada con la inflamación crónica de bajo nivel responsable de la progresión de la obesidad ya que induce producción de IL-6, la proteína C reactiva (PCR), y otras citoquinas como IL-10 [249] [250], además de participar en la RI y síndrome metabólico. Por estos motivos, se ha propuesto que existe una relación directa entre la hiperleptinemia y el incremento de ECV [247]. 47 ·Proteína C reactiva (PCR) La PCR es una proteína de fase aguda, producida principalmente por el hígado y participa de forma muy importante en la inmunidad innata. El nivel circulante de PCR se asocia al IMC, por lo que individuos obesos presentan mayores niveles de este marcador en comparación con individuos con peso normal [251]. Asimismo, se ha observado una disminución de PCR cuando se presenta una reducción de peso. Un estudio realizado por Trayhurn y Wood en 2004 encontró que el gen que codifica la PCR está expresado en el tejido adiposo, mostrando una aparente correlación directa entre los niveles de ARNm PCR y la adiposidad. Eso aumenta la posibilidad de que el tejido adiposo contribuya directamente al aumento de los niveles circulantes de la PCR [252]. La distribución de la grasa corporal también constituye un factor determinante de los niveles de PCR, independientemente del IMC. La relación cintura-cadera, que se utiliza clínicamente para evaluar la adiposidad visceral abdominal, se asocia positivamente con la PCR incluso después del ajuste por IMC [251]. Esta asociación apoya la hipótesis de que el aumento de la adiposidad, particularmente visceral, está relacionado con un estado de inflamación sistémica de bajo grado. Los niveles basales de PCR también correlacionan con el riesgo de DMT2 incidente, independientemente de la obesidad y otros determinantes de la diabetes [253]. Este hallazgo sugiere que, aunque la producción de PCR por el hígado se correlaciona fuertemente con la obesidad y con la secreción de IL-6 por el tejido adiposo [254], existen otros factores ambientales en los procesos inflamatorios que podrían contribuir a los niveles en sangre de PCR. Esta proteína es útil como biomarcador de inflamación y es un fuerte predictor independiente de eventos cardiovasculares tanto en individuos aparentemente sanos como en aquellos con manifestaciones de enfermedad aterosclerótica [255]. La PCR es una de las sustancias presentes en las lesiones ateroscleróticas, más específicamente en la íntima vascular, donde co-localiza con monocitos, macrófagos derivados de monocitos y lipoproteínas. Se ha sugerido que contribuye directamente al proceso aterosclerótico [256] mediante su participación en procesos como la activación del complemento, apoptosis, activación de células vasculares, reclutamiento de monocitos, acumulación lipídica y trombosis [257]. Adicionalmente, los componentes del síndrome metabólico (obesidad central, concentraciones elevadas de TG plasmáticos, baja concentración de HDL-c plasmático, hipertensión, y elevados niveles de glucosa en sangre) correlacionan con elevada concentración de PCR en plasma [258]. 48 ·Ceruloplasmina La ceruloplasmina (Cp) es una proteína sintetizada por el hígado con un papel muy importante en la regulación de la obesidad e inflamación. Esta molécula es abundante en el plasma humano y está involucrada en el transporte del cobre por el organismo, coagulación, angiogénesis, protección contra el estrés oxidativos, y la homeotasis del hierro [259]. Numerosos estudios epidemiológicos han informado de la observación de elevados niveles de Cp en pacientes con desórdenes cardiovasculares como aterosclerosis, aneurisma aórtico abdominal, angina inestable, vasculitis, y enfermedad arterial periférica [260, 261]. La Cp es importante en el control de la oxidación de lípidos de membrana, probablemente por la oxidación directa de cationes, previniendo así su catálisis por peroxidación lipídica [262]. Kim et al. [263] demostraron en 2011 la asociación entre unos niveles elevados de Cp y la obesidad, aunque no identificaron el mecanismo que los relaciona. No obstante, afirmaron que es posible que esté involucrada en la vía de inflamación inducida por la obesidad. Estos autores mostraron que elevados niveles de Cp se correlacionaban también con los niveles de PCR y ambos se identificaron como un factor independiente que contribuye al incremento de la obesidad . La Cp es sintetizada en el hígado durante el proceso de inflamación agudo [264] en respuesta a las citoquinas liberadas por parte de los tejidos dañados. Se especula que elevados niveles de Cp en plasma pueden indicar un estrés oxidativo anormalmente elevado entre sujetos obesos [261], siendo un potencial contribuyente de la aterogénesis y, por tanto, un útil marcador de riesgo cardiovascular [265, 266]. Además, el valor de Cp se ha propuesto como una medida predictiva para el síndrome metabólico en adolescentes [267]. 49 3. LA DIETA COMO EL PRIMER FACTOR DE INTERVENCIÓN PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES (ECV) a relación entre dieta y ECV ha sido una de la áreas más activas de investigación en la epidemiología nutricional durante los últimos 50 años. A través de numerosos estudios, el contenido graso de los alimentos ha demostrado ser una pieza clave en la determinación de una salud óptima en el individuo, debido a su capacidad para influir sobre los factores de riesgo cardiovascular y los mecanismos relacionados con el establecimiento y progreso de las placas de ateroma. Por ese motivo, una dieta de calidad constituye uno de los pilares fundamentales en la prevención de las ECV y su tratamiento [268, 269, 270, 271]. No obstante, actualmente se está considerando el estudio del efecto de distintos patrones alimentarios como un todo, más que focalizarse en nutrientes y alimentos de forma individual. Se trata de un acercamiento más acertado para la medición del efecto preventivo frente a ECV, ya que éstos miden la interacción sinérgica de diferentes alimentos y nutrientes contenidos en la dieta. La elección de unos patrones alimentarios de calidad está emergiendo como un potente paradigma para dirigir nuestros hábitos alimentarios, pues ha quedado demostrado que las elecciones de la dieta y estilo de vida son responsables de hasta el 40% de muerte prematura por enfermedad cardiovascular [272]. Las recomendaciones dietéticas de reducir el consumo de alimentos con un elevado contenido graso e incrementar la ingesta de frutas, verduras, y productos de grano entero es el factor común de las guías nutricionales proporcionadas hoy día a la población. La extensa información aportada por estudios de intervención nutricional indica que a través de la dieta se pueden reducir significativamente los niveles de lípidos plasmáticos, uno de los mayores factores de riesgo de las ECV. En las últimas décadas, los trabajos experimentales de intervención dietética realizados están haciendo impresionantes progresos con respecto a esta cuestión, y han permitido entre otras cosas identificar la dieta Mediterránea como la dieta que podría proporcionar beneficios superiores a aquellos observados con la adherencia a otros patrones alimentarios [273]. 50 L 3.1 La dieta mediterránea La dieta mediterránea es el resultado de la historia milenaria de la cuenca del Mediterráneo, transmitida de generación en generación, con una popularidad cada vez mayor a nivel mundial, e incluida por la UNESCO en la Lista Representativa de Patrimonio Cultural Intangible de la Humanidad en el año 2010 [274]. Sin embargo, definir la dieta mediterránea es una tarea compleja dada la amplia región geográfica que rodea el mar Mediterráneo, que incluye al menos 16 países con diferencias culturales, étnicas, religiosas, económicas y agrícolas que resultan en prácticas dietéticas diferentes. Aún así, existe un patrón dietético que es característico de estas regiones, el cual fue identificado por primera vez en los años 60 en Grecia, el sur de Italia, España y otros países de la cuenca del Mediterráneo. El factor común de estos países es el empleo de generosas cantidades de aceite de oliva como principal fuente de grasa, además de un elevado consumo de alimentos derivados de plantas (frutas, verduras,legumbres, frutos secos, semillas, y cereales de grano entero); una frecuente pero moderada ingesta de vino (especialmente vino tinto), normalmente con las comidas; un consumo moderado de pescado y marisco y productos lácteos (yogures y queso, pero no leche entera, mantequilla o nata), aves de corral y huevos; y un bajo consumo de dulces y carnes rojas y procesadas [275, 276, 277]. La dieta mediterránea no es solo unos patrones nutricionales determinados, existen otros aspectos no nutricionales ligados al estilo de vida de los países vinculados con este tipo de alimentación, que también contribuyen a sus efectos saludables. El consumo de productos frescos y locales, las actividades tradicionales culinarias, los aspectos socio-culturales y nutricionales de la región, junto con la práctica regular de actividad física, son partes fundamentales del modelo o estilo de vida Mediterráneo [274]. 3. 1.1 El carácter cardioprotector de la dieta mediterránea Existen evidencias científicas suficientes que apoyan los beneficios aportados por la adherencia a los patrones alimentarios tradicionales de la dieta mediterránea (cantidades, proporciones, combinaciones o variedades de los diferentes alimentos y bebidas consumidos y la frecuencia con la que normalmente se consumen) frente a la mortalidad y los eventos clínicos cardiovasculares [278, 279, 280]. De hecho, en términos de reducción de la morbilidad por ECV, mortalidad y eventos clínicos, la dieta mediterránea es comparable con otras intervenciones farmacológicas como aspirina y estatinas; con la actividad física, e incluso con antihipertensivos 51 insulina y obesidad abdominal, siendo todos ellos factores de riesgo críticos que contribuyen con el síndrome metabólico y las enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas [293, 305] (figura 8). Figura 8 Mecanismos de acción de los MUFA ingeridos con la dieta en la reducción de los factores de riesgo del síndrome metabólico y el desarrollo de enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas asociadas [305]. a) Los MUFA y su influencia sobre el proceso inflamatorio Un proceso inflamatorio prolongado está involucrado en el inicio, progresión y etapas finales de la aterosclerosis [159]. Si además hay presentes otros factores como la hipercolesterolemia, hiperlipidemia y la hipertensión, éstos causan a su vez la activación del endotelio vascular, lo que perpetúa la liberación de mediadores inflamatorios, y mantiene activa la migración de monocitos al foco de la lesión, permitiendo la evolución de la placa de ateroma. Por tanto, reducir la respuesta inflamatoria es crucial para prevenir los eventos ateroscleróticos. 58 MUFA de la dieta Dislipidemia aterogénica TG > 150 mg/dl HDL<40 mg/dl hombres o 50 mg/dl mujeres Obesidad Abdominal Circunferencia de la cintura >102 cm hombres y >88 cm mujeres Hipertensión Presión sanguínea >130/85 mmHg Hiperglicemia Glucosa >100 mg/dl - - - - Síndrome Metabólico Aterosclerosis Diabetes mellitus tipo 2 - Un buen número de estudios han demostrado que el consumo de AOV tiene efectos antiinflamatorios. Salas-Salvado et al. [291] encontraron que, en situación de elevado riesgo cardiovascular, los sujetos con los niveles de consumo de AOV más elevados presentaban los niveles más bajos de VCAM-1, ICAM-1, IL-6 y PCR. En otro estudio en el que participó un grupo de pacientes con síndrome metabólico, observaron tras dos años de seguimiento, que los sujetos que se adhirieron a la dieta mediterránea enriquecida con aceite de oliva, también resultaron tener menor concentración plasmática de PCR, IL-6 y otras citoquinas inflamatorias al contrastarlos con el grupo control que no consumió AOV [306]. Resultados similares se han observado en otros ensayos clínicos realizados, como fue el desarrollado por Mena et al.[307], aunque Estruch et al. solo identificaron la reducción de citoquinas en en el grupo de hombres hipercolesterolémicos [308]. Es importante mencionar que no solo las personas con riesgo de desarrollar ECV pueden beneficiarse de las propiedades antiinflamatorias aportadas por el AOV, sino que también individuos sanos han visto mejorada la respuesta inflamatoria tras un consumo de aceite de oliva. En poblaciones de sujetos sanos, se ha observado que la composición de partículas LDL se ha visto enriquecida en ácido oleico después de ingerir AOV [309] y, con ello, se reduce su capacidad para inducir la quimiotaxis de monocitos y la adhesión de monocitos al endotelio [310]. La lipemia postprandial tiene efectos inflamatorios, por lo que varias investigaciones en humanos se han centrado también en el estudio de la respuesta inflamatoria durante esta fase [311]. Tras la administración de una comida con aceite de oliva como principal fuente de grasa a voluntarios sanos, hipercolesterolémicos e hipertrigliceridémicos, se ha detectado una reducción en la concentración sérica de moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina durante el periodo postprandial, en comparación con la línea basal o con la fuente de grasa alternativa de la dieta control (mantequilla, aceite de girasol alto palmítico o PUFA n-3) [312, 313]. También se ha demostrado que una dieta enriquecida en AOV es capaz de causar una significativa reducción de los niveles sanguíneos de tromboxano B2 y LTB4 [314]. Es más, se ha observado que la inducción de la expresión de ARNm de TNF-α en células de macrófagos periféricos sanguíneos (PBMCs) aisladas en el periodo postprandial era menor en sujetos sanos que previamente habían consumido un desayuno que contenía aceite de oliva o frutos secos en comparación con el grupo de sujetos cuyo desayuno contenía mantequilla [315]. Asimismo, ha sido demostrado que NF-kB, un factor de transcripción que controla la expresión de genes responsables de numerosos procesos proinflamatorios, incluyendo TNF-α, IL-6 y MCP1 [316] es activado en monocitos tras una comida que contiene mantequilla o frutos secos, mientras que una comida que contiene aceite de oliva no causa tal efecto [312]. 59 Trabajos realizados con animales han proporcionado igualmente una importante evidencia de los efectos antiinflamatorios del aceite de oliva. En ratas, se ha demostrado que la administración de una dieta con un 20% de su composición de aceite de oliva, es capaz de reducir la actividad de las células natural killer [317]; la suplementación de la dieta con un 10% de aceite de oliva reduce la susceptibilidad de las lipoproteínas a la oxidación en animales hipercolesterolémicos [318]; y la producción de ROS y PGE2 también se redujo en neutrófilos tras ser alimentadas con un 15% de aceite de oliva con respecto a las que se alimentaron con una dieta baja en grasa durante dos meses [319]. Más aún, los niveles de secreción de mediadores inflamatorios como TNF-α, IL-6, IL-1β y PGE2 por macrófagos peritoneales murinos estimulados por liposomas aislados de ratones alimentados con 15-20% de aceite de oliva durante ocho semanas fueron también menores [317, 319]. Numerosos estudios in vitro también han proporcionado importantes resultados con respecto a la capacidad de modulación del proceso inflamatorio por el ácido oleico en cultivos de células endoteliales humanas. Se ha demostrado la capacidad del ácido oleico para reducir los niveles intracelulares de ROS, la expresión de moléculas de adhesión y la activación transcripcional de NFkB cuando este AG es añadido a los cultivos celulares. Además, se ha visto reducida la inducción de la expresión de VCAM-1 y E-selectina por parte de partículas LDL-ox aisladas directamente de sujetos que consumieron una dieta suplementada con aceite de oliva en comparación con los que consumieron SFA [301, 310, 311]. Adicionalmente, la quimiotaxis de monocitos y la adhesión endotelial de las células se incrementa ante su exposición a liposomas que contienen ácido linoleico, mientras que este efecto es casi nulo cuando el ácido linoleico es reemplazado con ácido oleico 350 [320]. Esta acción antiinflamatoria del ácido oleico ha sido atribuida a su baja capacidad de oxidación con respecto al ácido linoleico, el cual puede ser reemplazado en la composición de las lipoproteínas por ácido oleico en aquellos individuos que consumen una dieta rica en aceite de oliva [309]. b) Los MUFA y su influencia sobre el perfil lipídico plasmático La dislipidemia, uno de los componentes del síndrome metabólico, ha sido asociada con varias patologías inflamatorias, entre ellas la aterosclerosis [321]. El contenido graso de los alimentos juega un papel imprescindible en la modulación del perfil lipídico plasmático y en la determinación del riesgo de enfermedades cardiovasculares, así como en favorecer la reversión de enfermedades. 60 La capacidad del aceite de oliva para ayudar a proteger frente al desarrollo de la aterosclerosis incluye entre sus acciones la modificación del perfíl lipídico a uno menos aterogénico, que consiste en un aumento de la concentración de colesterol unido a HDL (HDL-c) y una disminución de LDL-c, TG y colesterol total, además de la reducción de lipoproteínas oxidadas [322]. Desde los años 90, se han realizado varios meta-análisis que han confirmado que los MUFA y PUFA de la dieta tienen un efecto comparable en la reducción de los niveles de colesterol [310, 311, 323]. Desde que en estudios como el llevado a cabo por Hu et al. demostraran que la sustitución del 5% de los SFA de la dieta por ácidos grasos insaturados resulta en una reducción del 43% en ECV [324], cada vez hay mayor interés en incrementar la cantidad de MUFA y PUFA en la dieta, y reducir el consumo de SFA. De hecho, el reciente estudio PREDIMED dejó bien claro que la dieta mediterránea suplementada con el AOVE o nueces, ambos fuente de grasas insaturadas, se asocia con una mejora del perfil lipídico plasmático [322].Otros estudios clínicos en humanos demostrado también el efecto del consumo de MUFA y PUFA en la mejora de los ratios colesterol total/HDL-c [325] y TG/HDL-c [322] debido a una reducción en los niveles de LDL-c. Sin embargo, a pesar de los beneficios cardiovasculares aportados por los PUFA, su consumo ha sido limitado a menos del 10% de la energía diaria ingerida. Paradójicamente, se ha observado que los PUFA pueden generar a su vez efectos adversos potenciales que incluyen la reducción de los niveles de HDL-c y el incremento de la susceptibilidad de las LDL-c a la oxidación [326, 327], por lo que no conviene abusar de ellos. En cambio, el consumo de MUFA ha demostrado reducir los niveles de HDL-c menos frecuentemente [325, 328]. Las lipoproteínas plasmáticas pueden sufrir modificaciones como la oxidación, que potencian su efecto dañino sobre el endotelio vascular y las hace más propensas a ser incorporadas por los macrófagos [329]. Un abundante número de estudios en humanos y animales han sugerido que el consumo de aceite de oliva reduce el estrés oxidativo, lo que ha sido en parte atribuido a su contenido de ácido oleico. Puesto que el único doble enlace de los MUFA hace que la formación de dienos conjugados sea menos favorable, es de esperar que las partículas LDL ricas en oleato sean más resistentes a la oxidación que las LDL ricas en PUFA [330]. Este hecho fue demostrado por Cicero et al. en el estudio EUROLIFE [331], cuyos resultados publicados en el año 2008 mostraron que gracias a la suplementación diaria de la dieta con 25 ml de aceite de oliva se incrementó el contenido de ácido oleico de las LDL, lo que se asoció con una reducción del daño oxidativo de los lípidos. Asimismo, Moreno et al. [332] demostraron que una dieta rica en MUFA reduce a su vez la 61 captación de las partículas LDL-ox por macrófagos, contribuyendo a disminuir la formación de células espumosas, uno de los eventos tempranos y clave en la aterogénesis c) Los MUFA y su efecto sobre el desarrollo o reversión de la obesidad Las recomendaciones nutricionales realizadas para el tratamiento de la obesidad han mostrado generalmente un especial énfasis en la importancia de reducir todo el contenido graso de la alimentación, y han promovido su reemplazo por carbohidratos. Sin embargo, cada vez es más evidente que dietas como la mediterránea, con un alto contenido graso procedente del aceite de oliva, pueden ser alternativas efectivas a las tradicionales dietas bajas en grasa para una pérdida inicial de peso en personas obesas [333]. Un meta-análisis de 21 estudios epidemiológicos realizado sobre la dieta mediterránea y la obesidad reveló que no existe documentación alguna que reporte un incremento significativo de obesidad en respuesta a la dieta mediterránea, a pesar del elevado consumo de grasa procedente del aceite de oliva asociado a ella. De hecho, cerca de la mitad de esos estudios proporcionaron evidencia científica de que la adherencia a estos patrones alimentarios está asociada con una pérdida de sobrepeso/obesidad o promoción de pérdida de peso [334]. Entre ellos, se encontraron el estudio EPIC (Investigación Europea Prospectiva en Cáncer y Nutrición) [335] y el estudio PREDIMED [308]. Este último, puso además de manifiesto que una intervención nutricional con la dieta mediterránea, con alto contenido de MUFA, en personas con adiposidad abdominal, el tipo de obesidad conocido más perjudicial, era capaz no solo de contrarrestar los elevados riesgos cardiovasculares asociados con el incremento de adiposidad [287, 336], sino que mostró una pérdida de peso después de tres meses de su consumo [308]. El Proyecto SUN (Seguimiento Universidad de Navarra) [304], llevado a cabo por el equipo de Martinez-Gonzalez de la Universidad de Navarra y publicado en el año 2015, es otro de los estudios cuyos resultados coinciden con los de PREDIMED, gracias a la virtud de la dieta mediterránea para contribuir a reducir el IMC y la circunferencia de la cintura. En este estudio se analizó la relación de la dieta o estilo de vida con la incidencia de varias enfermedades crónicas y la mortalidad. Evaluaron la relación entre la obesidad y la incidencia de los mayores eventos clínicos cardiovasculares según varias categorías o niveles de adherencia a la dieta mediterránea, en una muestra de 19,065 hombres y mujeres obesos o con sobrepeso, de 38 años de edad media y bajo riesgo de enfermedad cardiovascular al inicio del estudio. Tras un seguimiento de 10.9 años, se 62 detectó un riesgo de sufrir eventos cardiovasculares un 57% menor en aquellos participantes con la adherencia más alta a la dieta mediterránea. Estos resultados confirmaron que adoptar los hábitos alimentarios de la dieta mediterránea puede contrarrestar algunos de los efectos cardiovasculares adversos causados por el sobrepeso/obesidad gracias a sus efectos antiinflamatorios [205], aunque no solo en personas de avanzada edad con elevado riesgo cardiovascular, sino también en personas jóvenes, sanas y de alto nivel educativo. Varios estudios de intervención clínica han comparado el efecto logrado sobre la pérdida de peso o ausencia de ganancia de peso corporal asociado a la dieta mediterránea con otras dietas que tradicionalmente se recomiendan adoptar. Iris Shai et al. [337] analizaron el efecto sobre la pérdida de peso en 322 pacientes que adoptaron una dieta con bajo contenido graso, otra con bajo contenido en carbohidratos, y la dieta mediterránea, tras un seguimiento de dos años. Aunque todos los grupos perdieron peso, la mayor reducción se detectó en los grupos que consumieron la dieta con bajo contenido de carbohidratos (con una pérdida de 4.7 kg de media) y la mediterránea (con una pérdida de 4.4 kg de media). En cambio, con el consumo de la dieta de bajo contenido graso, solo se logró una pérdida 2.9 kg de media. Esta ausencia de una pérdida significativa de peso corporal asociada a una dieta de bajo contenido graso también se observó el ensayo clínico Women´s Heath Initiative Diet Modification Trial (WHI DMT) [338], lo que sugiere que la adherencia a la dieta mediterránea enriquecida con AOV es una mejor opción para perder peso que adoptar una dieta baja en grasa. Se ha propuesto que esta ausencia de ganancia de peso y la mejora de la condición de sobrepeso u obesidad podría ser debida al incremento de la oxidación postprandial de las grasas, la termogénesis inducida por la dieta y, fundamentalmente, por el gasto energético estimulado por el consumo de aceite de oliva [339] y su efecto saciante [340]. d) Los MUFA, la resistencia a la insulina y la diabetes mellitus tipo-2 La calidad de las grasas procedentes de la dieta parece ser determinante en el efecto de la dieta sobre la sensibilidad a la insulina. De la misma manera que ocurre con los niveles en circulación de lípidos, los SFA han mostrado alterar el control glicémico y la sensibilidad a la insulina [341]. Así pues, el reemplazo de los SFA procedentes de la dieta por carbohidratos o MUFA ha permitido obtener importantes mejoras en la sensibilidad a la insulina y respuesta glicémica tanto en individuos predispuestos a desarrollar RI [342, 343] como en personas sanas [344, 345]. 63 En el desarrollo de la DMT2, las células β-pancreáticas que secretan insulina para contrarrestar los picos postprandiales de glucosa en sangre, se ven saturadas y, como resultado, comienzan a fallar a la hora de proporcionar de manera efectiva los niveles de insulina necesarios para regular los niveles de glucosa. El consumo de dietas enriquecidas en MUFA ha mostrado ejercer una acción directa sobre la función de las células β-pancreáticas [346]. En 1988 ya se demostró que la administración de una dieta con alto contenido graso, enriquecida en MUFA (33% de la energía total) a pacientes con DMT2, resultó en una reducción de los requerimientos de insulina y una reducción de la concentración de glucosa en plasma con respecto a aquellos que consumieron una dieta de bajo contenido graso (25% de la energía total) pero alto en carbohidratos (60% de la energía total) [347]. Otro estudio que apoya el efecto beneficio de los MUFA en la reducción de la RI fue el realizado en el año 2008 por López S et al. [348], cuyos datos obtenidos revelaron que los MUFA mejoraron la sensibilidad a la insulina y la función de las células β-pancreáticas en los 14 hombres sanos que participaron en el ensayo clínico en comparación con los SFA, observándose una reducción linear directa en la RI a medida que se sustituía SFA por MUFA [348]. De hecho, el estudio llevado a cabo en Pizarra por el grupo de Rojo-Martinez et al. en 2006 [349] mostró que los MUFA de la dieta procedentes del aceite de oliva y los PUFA contribuyen a la variabilidad de la función de las células β-pancreáticas. El enriquecimiento de las membranas celulares con ácido oleico a través de su consumo con la dieta también contribuye a reducir la RI. Ryan et al. [350] examinaron la relación entre los cambios en la composición de AG de la membrana celular y el transporte de glucosa, y encontraron una reducción en la RI cuando una dieta rica en ácido linoleico se cambiaba por una rica en ácido oleico. e) Los MUFA y su influencia sobre la presión arterial La hipertensión es la causa prevenible más importante de las enfermedades cardiovasculares y accidentes cerebrovasculares del mundo. Si no se controla, puede provocar un infarto de miocardio, un ensanchamiento del corazón y, a la larga, una insuficiencia cardiaca. Los vasos sanguíneos pueden desarrollar protuberancias (aneurismas) y zonas débiles que los hacen más susceptibles de obstruirse y romperse. También puede ocasionar que la sangre se filtre en el cerebro y provoque un accidente cerebrovascular, e incluso provocar deficiencia renal, ceguera y deterioro cognitivo. 64 Las probabilidades de sufrir un infarto de miocardio, un accidente cerebrovascular o insuficiencia renal a consecuencia de la hipertensión, se pueden incrementar por otros factores como el consumo de tabaco, una dieta poco saludable, el uso nocivo del alcohol, la inactividad física y la exposición a un estrés permanente, así como la obesidad, el colesterol alto y la diabetes mellitus (OMS). En la literatura científica se pueden encontrar estudios epidemiológicos y clínicos que corroboran el efecto beneficioso que tiene el consumo de dietas con elevado contenido en MUFA procedente del aceite de oliva sobre la presión arterial. Es el caso del meta-análisis realizado en el año 2011 por Schwingshackl et al. [351], a través del cual investigaron los efectos a largo plazo (>6 meses) de dietas con elevado contenido en MUFA (>12% MUFA) frente a dietas con bajo contenido en MUFA (<12%MUFA) sobre los factores de riesgo cardiovasculares. Sus resultados mostraron que las dietas ricas en MUFA reducen significativamente la masa grasa y la presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD). Estos hayazgos coincidían con los obtenidos previamente en el estudio EPIC-NL [352]. A lo largo del estudio, los participantes mostraron una reducción del 44% del riesgo de mortalidad por ECV, y una menor incidencia de cardiopatías, entre otras cosas, gracias a la prevención de la hipertensión en la población que participó en el ensayo. Además, se hizo evidente una relación inversa entre el ratio MUFA:SFA en sangre y la presión sanguínea arterial, lo que corroboró el efecto del ácido oleico en la reducción de la presión sanguínea [353]. El proyecto SUN también reveló que la ingesta de aceite de oliva durante un tiempo promedio de 28.5 meses estaba asociado con una reducción en la incidencia de la hipertensión, aunque únicamente en la población masculina que participó en el estudio [304]. El efecto hipotensivo del aceite de oliva ha sido comparado con dietas ricas en SFA o PUFA, así como otras fuentes con alto contenido en MUFA distintas al aceite de oliva como es el aceite de girasol alto oleico. La adherencia a dietas con alto contenido en MUFA reducen la presión arterial en comparación con dietas ricas en SFA [310], y aunque el consumo de PUFA también logra reducir la presión arterial, este efecto es mayor con las dietas ricas en MUFA. Ferrara et al. [354] revelaron con su estudio que los pacientes a los que se les administró aceite de girasol (una fuente rica de PUFA) con la dieta, necesitaron más medicación para controlar su hipertensión que aquellos a los que se les dio una cantidad equivalente de aceite de oliva. Y cuando se ha comparado el consumo de aceite de oliva con el de aceite de girasol alto oleico, ambos con un contenido similar de MUFA, sobre un grupo de mujeres hipertensivas de elevada edad, se ha detectado que el AOV consumido 65 sigue siendo más efectivo en reducir la presión sanguínea [355]. Esto parece sugerir que los micronutrientes en el aceite de oliva juegan una parte importante en su efecto beneficioso sobre la hipertensión. Los mecanismos a través de los cuales el aceite de oliva reduce la presión sanguínea no están del todo claros, pero deben estar relacionados con las alteraciones estructurales y funcionales que sufren las membranas de los eritrocitos en caso de hipertensión [355, 356], así como con cambios en la composición de AG de las membranas plasmáticas de las células del endotelio vascular de la aorta [354]. Además, las propiedades antioxidantes de los MUFA y de los componentes menores del aceite de oliva como los compuestos fenólicos, deben también contribuir a reducir la producción de ROS e incrementar la disponibilidad de NO, permitiendo así una mejora de la función endotelial [310, 357]. f) Los MUFA, la composición lipídica de las lipoproteínas aterogénicas y su influencia en la formación de células espumosas El tamaño y composición de las nuevas partículas de QM sintetizadas, así como de los QMr, dependen del tamaño y composición de las gotículas lipídicas formadas en el interior del enterocito, lo cual viene determinado por la composición de los lípidos absorbidos de la dieta [74]. La presencia de determinados AG en las lipoproteínas aterogénicas, y la proporción en la que se encuentran con respecto a los AG totales, tiene una importante repercusión en el desarrollo de la placa ateroesclerótica, ya que ésto influye sobre las diferentes vías de incorporación de las lipoproteínas en los macrófagos, y por tanto, sobre la formación de células espumosas [298, 358]. Uno de los estudios que ha corroborado la influencia del grado de saturación de los AG componentes de la partículas sobre su interacción con los receptores celulares de superficie de los macrófagos fue realizado por De Pascale et al. [358]. En él, estudiaron el efecto de partículas de QMr artificiales enriquecidas con AG con diferentes grados de saturación: SFA, MUFA, PUFA n-6, y PUFA n-3, sobre la formación de células espumosas derivadas de macrófagos THP-1.Esos AG fueron obtenidos mediante la incorporacióon de TG aislados de aceite de palma, oliva, maíz, y aceites de pescado, respectivamente. Estos autores mostraron que las partículas artificiales de QMr que fueron sintetizadas con SFA o MUFA eran incorporadas por los macrófagos más rápidamente que las enriquecidas en PUFA n-6 o n-3, además de que aquellas enriquecidas en SFA fueron las que indujeron la mayor incorporación lipídica en el interior de las células. Esos mismo resultados fueron obtenidos posteriormente en el trabajo experimental realizado por Quintero-Florez et al. 66 [298]. Tales revelaciones pusieron de manifiesto que existen factores que influyen en la incorporación de las partículas QMr, unas de las lipoproteínas más aterogénicas, por los macrófagos, y su tamaño de partícula y composición de AG parecen ser relevantes en el proceso de captación y acumulación de lípidos [359]. Este hecho, a su vez, es determinante para la acumulación de colesterol y TG en los macrófagos, afectando a su metabolismo y modulando de su perfil aterogénico [360]. g) Los MUFA y la modulación de los niveles de expresión de genes involucrados en la formación de células espumosas El contenido lipídico de los alimentos tiene la capacidad de modular los niveles de expresión génica y proteica y, en consecuencia, la producción de metabolitos, y la modulación de la expresión genética juega indudablemente un papel importante en la prevención de la aterosclerosis. Éste es un hecho del que tenemos conocimientos desde hace relativamente poco tiempo gracias a los avances científicos en el campo de la nutrigenómica, la ciencia que estudia la interacción entre los componentes dietéticos de los alimentos y los genes. En los últimos años, están siendo publicados estudios que están demostrando la capacidad de los MUFA para modular la expresión de genes proaterogénicos involucrados en la inflamación vascular [226, 361], reclutamiento de monocitos en el lugar de la lesión y la modulación de los niveles de síntesis de marcadores de inflamación [308]. Además, se ha sugerido que uno de los efectos saludables del aceite de oliva en la protección frente a la aterosclerosis puede ser la reducción de la capacidad de los macrófagos presentes en la lesión aterosclerótica de incorporar lipoproteínas. Esto es posible gracias a la capacidad de los MUFA y polifenoles que contiene para modular los niveles de expresión de receptores de superficie tanto en humanos [226], como en ratones [362], reduciendo así la formación de células espumosas y los eventos trombóticos [361]. En el estudio desarrollado por Llorente-Cortés et al. [226], se evaluó el efecto de la dieta mediterránea sobre la expresión de genes proaterogénicos en poblaciones con elevado riesgo cariovascular. Sus resultados indicaron que la dieta mediterránea enriquecida en AOV prevenía de forma específica la sobreexpresión de LRP-1, uno de los receptores de mayor importancia en la formación de células espumosas, lo que ha sido confirmado por otros estudios in vivo [363, 364] como in vitro [365, 366]. De hecho, pacientes con obstrucciones coronarias mostraron tener una expresión alterada del receptor LRP-1 en células sanguíneas mononucleares [367, 368]. Uno de los 67 HIPÓTESIS a obesidad es considerada la principal epidemia del siglo XXI debido a su crecimiento imparable entre la población mundial adulta y una prevalencia cada vez mayor entre la población infantil. Esta enfermedad, vista hoy día como un proceso inflamatorio crónico de bajo grado, se relaciona con un desorden en el metabolismo postprandial de los lípidos. Cuando éste se mantiene con el tiempo, acaba generando otras complicaciones como resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensión. Es por ello que las personas obesas tienen mayor riesgo de desarrollar ECV, particularmente aterosclerosis, y se prevé que la obesidad será antes del año 2030 responsable del 80% de las muertes en todo el mundo. Los costes globales que supone la obesidad en los Sistemas de Salud Pública son muy elevados, y cada vez serán mayores a medida que las enfermedades asociadas a la obesidad sigan manifestándose de forma progresiva. Por este motivo, reducir su prevalencia se ha convertido en una de las mayores prioridades para los sistemas sanitarios en muchos países tanto desarrollados como en vías de desarrollo. El contenido graso de los alimentos ha demostrado ser una pieza clave en la determinación de una salud óptima en el individuo debido a su capacidad para influir sobre los factores de riesgo cardiovascular y de estar implicado directamente en el proceso aterosclerótico. Debido a ello, existe un gran interés por desarrollar e implementar estrategias efectivas para reducir los factores de riesgo por medio de las intervenciones dietéticas, pues han sido identificadas como una herramienta especialmente importante para terapias de prevención primaria y tratamientos secundarios. Muchos son los trabajos científicos que han demostrado los beneficios aportados por la adherencia a los patrones alimentarios tradicionales de la dieta mediterránea frente a la mortalidad y los eventos clínicos cardiovasculares. Esto es posible gracias a su carácter antioxidante, antiinflamatorio, antitrombótico, su capacidad para prevenir la peroxidación lipídica y para mejorar en perfil lipídico y la función endotelial. Aunque los mecanismos de protección no son del todo comprendidos, una de sus características más destacables es su elevada concentración de grasas insaturadas, principalmente de MUFA proporcionados por el aceite de oliva como fuente de grasa mayoritaria, el cual representa hasta el 70% del total de los lípidos consumidos con esta dieta. 74 L Los efectos antiaterogénicos proporcionados por los MUFA han sido ampliamente documentados, y se ha demostrado que ayudan a reducir no solo la dislipidemia, sino también la obesidad y su cuadro inflamatorio crónico, reduciendo con ello el resto de factores de riesgo que contribuyen con el síndrome metabólico y el desarrollo de enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas. En la actualidad, podemos encontrar en la literatura científica estudios sobre las propiedades cardioprotectoras proporcionadas por dietas ricas en grasas insaturadas, sin embargo, pocos han sido realizados con la participación de personas obesas. En este contexto, proponemos la hipótesis de que un desayuno tipo mediterráneo enriquecido en MUFA contribuye a mejorar el perfil lipídico postprandial y la respuesta inflamatoria presente en los sujetos obesos participantes del estudio, así como a reducir la formación de células espumosas durante las primeras fases del desarrollo de la aterosclerosis, con respecto a un desayuno de tipo occidental. 75 OBJETIVOS ara cumplir el presente propósito, nos planteamos los siguientes objetivos: 1. Valorar la influencia de una carga lipídica sobre el metabolismo lipídico postprandial e inflamación vascular en adultos obesos frente a controles normopesos. 2. Determinar los efectos diferenciales de un desayuno de tipo mediterráneo frente a un desayuno de tipo occidental sobre el metabolismo lipídico postprandial en adultos obesos. 3. Determinar los efectos diferenciales de un desayuno de tipo mediterráneo frente a un desayuno de tipo occidental sobre la síntesis de marcadores de inflamación en sujetos obesos con respecto a sujetos normopesos. 4. Estudiar el efecto de las lipoproteína ricas en triglicéridos postprandiales aisladas de adultos obesos sobre la formación de células espumosas. 5. Analizar la capacidad del componente lipídico de las lipoproteínas ricas en triglicéricos para modular la actividad de la LPL en macrófagos. 76 P MATERIALES Y MÉTODOS 77 1. ESTUDIO DE LA RESPUESTA LIPÍDICA POSTPRANDIAL EN SUERO TRAS LA INGESTA DE UN DESAYUNO DE TIPO MEDITERRÁNEO Y UN DESAYUNO DE TIPO OCCIDENTAL EN ADULTOS OBESOS 1.1 Selección y características de los participantes del estudio n total de 24 sujetos fueron reclutados para participar en el presente estudio, todos ellos varones adultos con una edad media de 26.2 ± 4.3 años. Se les tomó las medidas antropométricas y, atendiendo su índice de masa corporal (IMC), se les dividió en dos grupos: 12 controles o normopesos (IMC entre 20-25 Kg/m2) y 12 obesos (IMC > 30 Kg/m2). La participación fue voluntaria, así como la posibilidad de retirarse del estudio en cualquier momento. Mediante historial médico se verificó que todos los voluntarios participantes del estudio carecían de problemas digestivos y de trastornos metabólicos, no tomaban suplementos alimenticios y no estaban bajo tratamiento con ninguna medicación. Además, todos ellos se sometieron a un análisis bioquímico y hematológico realizado por los profesionales sanitarios del Hospital Virgen del Rocío, para comprobar que se trataban de sujetos sanos y que no cumplían los criterios de exclusión establecidos, así como que presentaban unos valores de perfil lipídico plasmático dentro de los intervalos de referencia. En la tabla 2 se muestran los resultados del perfil lipídico plasmático y de los parámetros de bioquímica de los voluntarios obtenidos antes de comenzar el estudio. Los valores que se obtuvieron confirmaron que todos los participantes cumplían con los requisitos establecidos. Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con los principios fundamentales de la Declaración de Helsinki de 1975 (revisada en 2000), del Convenio del Consejo de Europa, y de la Declaración Universal de la UNESCO. Con este fin se elaboró un protocolo para el estudio con humanos que fue aprobado por el Comité Institucional para Investigación en Humanos del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. Los sujetos voluntarios dieron consentimiento escrito a este protocolo después de ser convenientemente informados, tanto oralmente como por escrito, y fueron exhortados a evitar el consumo de bebidas alcohólicas y tabaco durante el día precedente al comienzo del experimento. 78 U Tabla 2 Características antropométricas, presión sanguínea, niveles basales de lípidos y concentración de glucosa e insulina en suero de los participantes del estudio. Parámetros Adultos Normopesos Obesos Número de sujetos 12 12 Edad 27.3±3.0 35.8 ± 12.0* Peso (Kg) 74.9 ± 7.8 112.9 ± 13.5*** Altura (cm) 179.6 ± 7.0 180.8 ± 5.2 IMC (Kg/m2) 23.2 ± 1.1 34.7 ± 5.0*** Presión sistólica (mmHg) 110.9 ± 12.7 130.8 ± 16.3** Presión diastólica (mmHg) 68.9 ± 7.3 74.5 ± 10.1 Glucosa (mg/dl) 73.7 ± 4.7 83.6 ± 8.3** Insulina (mU/ml) 4.9 ± 2.7 12.6 ± 3.5*** HOMA-IR 0.9 ± 0.5 2.4 ± 1.2*** Triglicéridos (mg/dl) 78.7 ± 24.5 129.7 ± 60.3* Colesterol (mg/dl) 172.5 ± 32.6 202.9 ± 34.6* LDL-c (mg/dl) 94.7 ± 19.4 158.7 ± 16.7*** HDL-c (mg/dl) 57.5 ± 9.5 45.9 ± 8.5** Los datos están expresados como media ± SD; n=12 en todos los grupos. IMC: índice de masa corporal; HOMA-IR: modelo homeostático de medida de la resistencia a la insulina; LDL-c: colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad; HDL-c: colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad. Las diferencias estadísticas entre los dos grupos fueron analizadas mediante test t de Student no pareado. * =P <0.05, **= P <0.01, *** =P <0.001 vs. Normopesos. 79 1.2 Diseño experimental de la intervención dietética La intervención dietética postprandial se realizó en dos etapas siguiendo el siguiente esquema de intervención: Figura 9. Esquema del diseño experimental. Antes de comenzar con la ingesta de las dietas experimentales, se le realizó a los voluntarios una extracción de sangre para medir de los niveles basales de los parámetros a considerar, siendo esta muestra la correspondiente a las 0 horas del ensayo. Las dietas experimentales fueron administradas a los voluntarios como un único desayuno tras un ayuno de 12 horas. Al inicio del ensayo, los voluntarios consumieron uno de los tipos de desayuno estudiados (mediterráneo u occidental), realizando inmediatamente después la extracción de sangre a diferentes tiempos durante el periodo postprandial. Transcurrida al menos una semana de lavado para evitar interferencias entre períodos experimentales, se procedió con la segunda fase del ensayo. En ella, aquellos participantes que inicialmente consumieron el desayuno mediterráneo, en la segunda fase consumieron el desayuno occidental, y viceversa. Tras la ingesta de la dieta experimental de la segunda fase, de nuevo se llevó a cabo la toma de muestras sanguíneas en fase postprandial. De esta manera, todos los participantes del estudio consumieron ambos tipos de dietas experimentales, siguiendo un diseño aleatorizado y cruzado (figura 9). 80 Desayuno Occidental Desayuno Occidental Desayuno Mediterráneo Desayuno Mediterráneo 1 Semana (período de lavado) PERÍODO EXPERIMENTAL 1.3 Ensayo postprandial El proceso seguido para la toma de muestras durante el ensayo postprandial y estudio posterior de la respuesta lipídica postprandial en suero de los voluntarios tras la ingesta de las dietas experimentales se representa en la figura 10. Figura 10. Esquema representativo del proceso seguido para la toma de muestras sanguíneas de los voluntarios en ayunas y durante el periodo postprandial, con el fin de obtener el suero sobre el que se realizarán los análisis experimentales. 81 Normopesos (n=12) Obesos (n=12) Extracción basal 0h Intervención dietética Extracción postprandial 1, 2, 3, 4, 5 y 6h Determinación del perfil lipídico Obtención suero 1, 2, 3, 4, 5 y 6h Estudio de los marcadores de inflamación Caracterización de las TRL aisladas 1.3.1 Extracción basal Tras 12 horas de ayuno nocturno, a cada voluntario se le extrajo una muestra de 9 mL de sangre en condiciones basales por punción de la vena cubital con un sistema SmartsiteTM equipado con vacutainer (Vacutainer®, Meylen, Cedex, Francia). La sangre fue recogida en tubos Vacuette® con separador para suero Clot Activator. 1.3.2. Ingesta de las comidas experimentales Inmediatamente después de la extracción basal, los sujetos recibieron la comida experimental. Las dietas experimentales empleadas consistieron en un desayuno de tipo mediterráneo y un desayuno de tipo occidental. La cantidad de grasa administrada en ambos desayunos fue equivalente a 0.75 g por Kg de peso corporal de los voluntarios participantes del estudio. •El desayuno de tipo mediterráneo se compone por aceite de oliva “Cardioliva®” (55 g), tomate natural triturado (20 g), pan “Panrico línea” (marca comercial) (tres rebanadas por voluntario; 23.7 g/rebanada), zumo de naranja (250 ml) y un vaso de leche desnatada (200 ml). El aceite de oliva ingerido con el desayuno de tipo mediterráneo denominado “Cardioliva” fue proporcionado por la compañía Oleícola El Tejar S.C.A (El Tejar, Córdoba). Los datos de la composición de la fracción saponificable e insaponificable fueron facilitados por dicha compañía, y se detallan en la tabla 3. •El desayuno de tipo occidental estaba formado por mantequilla (55 g), pan “Panrico línea” (tres rebanadas por voluntario; 23.7 g/rebanada) y un vaso de leche desnatada (200 ml) con cacao (20 g). La mantequilla suministrada a los voluntarios fue una comercial, y la composición de AG y colesterol fue previamente analizada por nuestro laboratorio del Instituto de la Grasa. La composición de la mantequilla se indica también en la tabla 3. 82 Tabla 3. Composición de AG del aceite de oliva, como fuente de grasa del desayuno de tipo mediterráneo, y de la mantequilla, como fuente de grasa del desayuno de tipo occidental. Los datos están expresados como: media ± SD; n= 3 (aceite de oliva) y n=5 (mantequilla). La cantidad de cada AG se expresa como % del total de AG contenidos. La composición de la comida experimental se detalla en la tabla 4, y fue recogida de la información declarada en los envases de cada uno de los alimentos incorporados en los desayunos. Tabla 4. Tabla de la composición de los desayunos administrados. 83 Aceite de oliva Mantequilla AG MEDIA (%) SD MEDIA (%) SD 10:0 1,77 0,03 12:0 2,66 0,03 14:0 10,15 0,04 14:1 1,13 0,01 16:0 9,94 0,02 33,18 0,17 16:1 n-7 0,81 0,00 2,33 0,04 18:0 3,31 0,01 13,85 0,07 18:1 n-9t 3,11 0,13 18:1 n-9c 77,69 0,05 27,47 0,11 18:2 n-6 3,47 0,03 18:3 n-3 1,14 0,01 0,56 0,02 20:0 0,45 0,02 20:4 n-6 0,32 0,01 2022 1963 485 471 15 14 62 53 36 26 57 53 8 32 44 15 5 2 0 104 7 6,4 Desayuno tipo mediterráneo Desayuno tipo occidental Energía (kJ) Energía (kcal) Proteínas (g) Hidratos de carbono (g) Azúcares (g) Grasas (g) - Saturadas (g) - Monoinsaturadas (g) - Poliinsaturadas (g) Colesterol (mg) Fibra (g) Una vez se han preparado los reactivos proporcionados por el kit, realizar una curva patrón de seis puntos con un rango de concentración de 400-12.5 pg/ml mediante diluciones seriadas del estándar de TNF-α proporcionado y previamente reconstituido. Añadir 200 µl de muestra de suero sin diluir, estándares, controles y blanco en los pocillos correspondientes de la microplaca y, a continuación, añadir a los mismos pocillos 50 µl del anticuerpo anti-TNF-α biotinilado. Cubrir la placa e incubar 3 horas. Lavar la placa 3 veces con 300 µl de solución de lavado y añadir 100 µl del anticuerpo conjugado con estreptavidina-HRP a todos los pocillos. Cubrir de nuevo e incubar 30 minutos. Lavar la placa 3 veces con 300 µl de solución de lavado y añadir 100 µl de solución TMB a todos los pocillos. Proteger de la luz e incubar 12-15 minutos. La reacción enzima-sustrato se detiene añadiendo 100 µl de solución H2SO4. Medir inmediatamente la absorbancia en el lector de placas a 450 nm. Medir también la absorbancia a 620 nm y substraer dicha lectura a la obtenida a 450 nm para corregir imperfecciones ópticas. Determinar la concentración de la muestra desconocida a partir de la curva patrón preparada. 90 3. CARACTERIZACIÓN DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS POSTPRANDIALES ras haber realizado el estudio de la influencia de dos fuentes de grasa diferentes, aceite de oliva y mantequilla, proporcionadas por los desayunos experimentales (mediterráneo y occidental) sobre el perfil lipídico postprandial y parámetros bioquímicos en adultos obesos, se analizó la composición lipídica de las partículas de TRL sintetizadas tras la ingesta de los desayunos. Para ello, se caracterizará la composición de las TRL aisladas a nivel lipídico y proteico (figura 12). Figura 12. Esquema del proceso seguido para la caracterización de las TRL aisladas de los sueros de los pacientes, que fueron obtenidos de las muestras de sangre extraídas antes (0 h) y 2 h y 4 h después de consumir las dietas experimentales. 91 1. Extracción de lípidos totales 2. Separación: FL y TG 3. Metilación de ácidos grasos 4. Perfil cromatográfico de ácidos grasos Caracterización de TRL Aislamiento de TRL del suero Determinación de la composición lipídica Determinación de la composición proteica Cuantificación de Apo B total Cuantificación de proteínas totales T 3.1 Aislamiento de las lipoproteínas ricas en triglicéridos de suero Las TRL (densidad <0.93 Kg/L) fueron obtenidas a partir de 4-4.5 ml de suero depositado bajo 7 ml de una solución de NaCl al 0.9% (m/v) (densidad 1.006 Kg/L) contenida dentro de tubos PolyallomerTM (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, EEUU). Las TRL se aislaron mediante ultracentrifugación como describieron Mills et al. (1986) (39.000 rpm, 16 horas, 12ºC), utilizando un rotor SW 41 Ti en una ultracentrífuga preparativa Beckman Coulter L90K (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, EEUU). Tras el proceso de separación, se recogió la fase blanquecina que quedó separada por flotación en la parte superior del tubo. 3.2 Caracterización de la composición de las lipoproteínas ricas en triglicéridos 3.2.1 Extracción de lípidos totales de las TRL Los volúmenes de TRL obtenidas a partir del suero, fueron ajustados a 1.5 ml de volumen final con una solución de cloruro potásico (KCl) 0.1 M (Merck, Darmstadt, Alemania). Seguidamente, los lípidos totales fueron extraídos siguiendo una modificación del método de Folch et al. [412], como se describe a continuación. Las TRL se colocaron en un tubo cónico y se añadieron 5 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v) (BDH/Prolabo, París, Francia). Tras agitarse vigorosamente durante 1 minuto, los tubos permanecieron en reposo hasta separarse dos fases bien diferenciadas con una pequeña interfase entre ambas. En caso de no obtener dicha separación, se añadieron varias gotas de KCl 0.1 M y se agitó vigorosamente de nuevo, seguido de un período de reposo. Con el fin de favorecer el proceso de separación de las fases, se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos y se obtuvieron tres fases: en la parte superior, la fase metanólica o hidroalcohólica, formada por metanol y la solución de KCl; en el centro, la interfase, que contenía precipitados de proteínas, y puede presentar lípidos adsorbidos sobre éstas; y por último, en la parte inferior se encontraba la fase clorofórmica que contenía los lípidos. La fase clorofórmica fue recogida y filtrada sobre un papel de filtro Whatman nº1 (Whatman Paper Ltd., Maidstone, Reino Unido) que contenía sulfato sódico anhidro (Merck, Darmstadt, Alemania), con el objeto de retener las trazas de agua que pudieran haber sido 92 arrastradas, y se colocó en un tubo para evaporador. La fase acuosa fue lavada con 2 ml de la mezcla cloroformo:metanol (2:1, v/v) que se añadieron al tubo original. Los tubos se agitaron vigorosamente durante 1 minuto y se centrifugaron de nuevo a 3.000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de rotor vasculante (Eppendorf Centrifuge 5804R, Hamburg, Alemania). La fase clorofórmica se recogió y se añadió a la obtenida anteriormente tras su filtración. Una vez finalizada la segunda extracción, el extracto clorofórmico fue evaporado a sequedad con ayuda de un rotavapor (Büchi Labortechnic AG, Flawil, Suiza) a una velocidad de rotación de 160 rpm. El rotavapor estaba acoplado a un baño con agua destilada a 40 ºC y a una bomba de vacío para acelerar el proceso. Los lípidos obtenidos se redisolvieron en 0.5 ml de cloroformo:metanol (2:1, v/v), del cual se tomó una alícuota de 200 µl para la separación de TG y FL mediante extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE). Los viales, herméticamente cerrados con tapón de teflón, se mantuvieron a -20 ºC, en atmósfera de nitrógeno para evitar la oxidación de los lípidos hasta el momento de su procesamiento. 3.2.2 Separación de fracciones de lípidos mediante extracción de fase sólida Los TG y FL presentes en la fracción de lípidos totales se aislaron mediante extracción en fase sólida (SPE). Esta técnica está basada en el mismo principio que la cromatografía líquida, por lo que en el interior de dichas columnas tienen lugar fuertes interacciones de tipo reversible entre el analito y la fase estacionaria. Los procesos de separación en fase normal implican: un analito polar disuelto en una matriz de polaridad media o no polar y una fase estacionaria polar, formada por grupos polares unidos a una superficie de sílice. La retención de un determinado analito bajo las condiciones de una columna normal se debe, principalmente, a interacciones entre los grupos funcionales polares del analito y los grupos polares sobre la superficie del adsorbente. Los compuestos absorbidos por estos mecanismos son eluídos al pasar a través de la columna un solvente que altere su mecanismo de unión, normalmente un solvente más polar que la matriz original de la muestra. 93 En nuestro estudio se emplearon columnas de fase normal tipo LCDiol que presentan grupos hidroxilo unidos a la sílice (SupelcleanTM LC-Diol, Supelco, Bellefonte, EEUU) con 3 ml de capacidad y 45 µm de tamaño de partícula. Las columnas LC-Diol se colocaron en un sistema de elución acoplado a una bomba de vacío y se acondicionaron lavando con dos volúmenes de hexano (3ml x 2), evitando que la columna volviera a sequedad tras el segundo lavado. A continuación, se dispusieron 200 µl de lípidos totales sobre las columnas. Una vez entró la muestra en contacto con la columna, se añadieron dos volúmenes de hexano:cloruro de metileno (9:1, v/v) (VWR Chemicals, Int., EEUU ) y se dejaron pasar por la columna para recoger los TG eluídos en el tubo correspondiente. Para obtener los FL se añadió un volumen de metanol seguido de otro volumen de acetona (VWR Chemicals, Int., EEUU), que tras su paso a través de la columna arrastraron los FL eluyéndolos en los tubos preparados para tal efecto. Finalmente, se lavó la columna con cinco volúmenes de acetona y se secó bajo corriente de nitrógeno. Los TG y FL obtenidos fueron llevados a sequedad bajo corriente de nitrógeno y se redisolvieron en 500 µl de cloroformo:metanol (1:1, v/v). Los TG y FL aislados serán empleados para el análisis de los ésteres metílicos de AG mediante la técnica de cromatografía de gases (CG). 3.2.3 Análisis de ésteres metílicos de AG de triglicéridos y fosfolípidos La determinación de la composición de AG de TG y FL se llevó a cabo mediante cromatografía de gases (GC). La GC es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La CG se desarrolla en una columna cerrada en la que se encuentra retenida la fase estacionaria y por la que se hace pasar el gas portador, siendo la técnica de separación la elución. Iniciado el proceso cromatográfico los componentes de la mezcla se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil, por lo que la elución tiene lugar forzando el paso de un gas inerte a través de la columna. A diferencia de otros tipos de cromatografía la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito y su única función es la de transportar la muestra a través de la columna. 94 Para ello, los AG fueron previamente derivatizados a ésteres metílicos de ácidos grasos (fatty acid methyl esters, FAME) de bajo punto de ebullición, siguiendo el procedimiento de metilación en caliente basado en el método B del anexo 10 contenido en el Reglamento de la UE CE 2568 /91 (punto 4.2 del método IUPAC nº 2.301). El principio por el que se obtienen los FAME a través de este método se basa en una neutralización de los AG libres y una metanólisis de los glicéridos, seguida de una esterificación de los AG en medio ácido. Con este fín, las alícuotas de 200 µl de TG y FL fueron transferidas a tubos de metilación, donde el disolvente fue evaporado a sequedad en corriente de nitrógeno empleando un evaporador conectado a corriente de nitrógeno (Techne Dri-Block DB-3D, Bibby Scientific Limited, Stone, Reino Unido). Tras añadir un plato poroso a los tubos de metilación, las fracciones lipídicas fueron saponificadas por la acción de 10 ml de metóxido sódico (Alfa Aesar, Massachusetts, EEUU) a una concentración del 0.5% en metanol anhidro (m/v) y calentamiento durante 30 minutos a 80ºC en un termobloque (Grupo-Selecta, Barcelona, España). Los FAME se formaron tras una neutralización con aproximadamente 2 ml de ácido sulfúrico (Sigma Aldrich, Missouri, EEUU) al 6% (v/v) en metanol anhidro, que se visualizó gracias a la presencia de fenolftaleína (Scharlau, Barcelona, España) añadida previamente; y después de un segundo calentamiento de 10 minutos a 80ºC, en el caso de FL fueron otros 30 minutos. Tras atemperar los tubos, con el fin de favorecer la separación de las distintas fases para el proceso de extracción, se añadieron 6 ml de una disolución saturada de NaCl (Sigma-Aldrich, Missouri, EEUU ) y se agitó suavemente. Para la extracción de los FAME se añadieron 2 ml de hexano, se agitó vigorosamente, y tras un período de reposo se recogió la fase superior (hexano). Esta operación se repitió dos veces más para optimizar la extracción. El hexano recogido se evaporó a sequedad en corriente de nitrógeno y los FAME se redisolvieron en 100 µl de hexano. Los FAME se mantuvieron bajo refrigeración en tubos herméticamente cerrados hasta proceder con el análisis cromatográfico. Un volumen de 2 µL de los FAME resultantes fueron inyectados en el cromatógrafo de gases con la ayuda de una microjeringa integrada en un inyector automático HewlettPackard 6890 Series (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU) acoplado a un cromatógrafo de gases HewlettPackard 5890 Series II (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU) y controlado por una estación de datos ChemStation Rev. A-03-02 (Hewlett-Packard, Avondale, EEUU). El cromatógrafo, equipado con un detector de ionización de llama (Flame Ionization Detector, FID) separó los FAME gracias a una columna capilar de sílice fundida BPX70 SGE Analytical Science (Trajan, 95 Victoria, Australia) de 10 m de longitud, 0.1 mm de diámetro interno y 0.2 µm de film de recubrimiento interior. Como gas portador se empleó nitrógeno a 2.0 bares de presión, además de una presión de 1.5 bares de aire y 1.5 bares de hidrógeno. Las temperaturas del detector y del inyector se mantuvieron constantes a 270 ºC, mientras que la del horno varió a lo largo del análisis, partiendo de una temperatura inicial de 190 ºC, para pasar a una rampa de 5 ºC/min, con la que se alcanzaron los 250 ºC, y terminar en régimen isotermo hasta el final del análisis. Todo el proceso supuso un tiempo total de 12 minutos. Los AG fueron identificados por comparación de sus tiempos de retención con los de los patrones inyectados en las mismas condiciones. La cuantificación se llevó a cabo mediante el cálculo del porcentaje relativo de cada FAME respecto al total. 3.3 Caracterización de la composición proteica en las lipoproteínas ricas en triglicéridos 3.3.1 Cuantificación del contenido de apolipoproteína B total en TRL La cantidad de apo B total se determinó mediante inmunoturbidimetría. El kit utilizado (BioSystems, Barcelona, España) permite que la apo B presente en la muestra precipite en presencia de los anticuerpos de cabra específicos que contiene. La dispersión de la luz generada por los complejos antígeno-anticuerpo es proporcional a la concentración de apo B y puede ser cuantificada por turbidimetría. Las medidas de turbidez se tomaron a 340 nm con un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan Spectrum (Thermo Scientific, Massachusetts, EEUU). Las condiciones del ensayo fueron las indicadas por el fabricante, a excepción de la curva de calibrado con la que calcular la concentración de apo B, la cual se elaboró a partir del patrón apo B, con cinco puntos cuyas concentraciones estaban comprendidas entre 01.278 μg/μl. 96 3.3.2 Determinación del contenido proteico de las TRL La concentración de proteína total en la fracción de TRL se determinó mediante el ensayo colorimétrico descrito por Bradford [413], utilizando el reactivo Bradford 5x (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania). El método de Bradford se basa en el cambio que se produce en el espectro de color del reactivo Comassie Brilliant Blue G-250 al unirse con proteínas y que resulta en un cambio de su absorbancia máxima, pasando de 465 nm a 595 nm. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos y los valores de absorbancia se registraron en un lector de placas de Thermo Scientific Multiskan Spectrum (Thermo Scientific, Massachusetts, EEUU), a 595 nm tras 15 segundos de agitación. Para el ensayo, se diluyeron 20 µl de TRL hasta la mitad de su concentración (1:2), por lo que se añadieron 20 µl de una solución de NaCl al 0.9% (m/v). La recta de calibrado se elaboró con albúmina de suero bovino (BSA) a distintas concentraciones (200-700 µg/ml) en NaCl al 0.9% (m/v). En cada pocillo se dispusieron 10 µl de muestra y 200 µl de reactivo de Bradford. Todas las placas incluyeron una recta de calibrado y un blanco, realizado con NaCl al 0.9% (m/v). Por último, la reacción se dejó reposar en oscuridad durante 15 minutos antes de medir su absorbancia a 595 nm en el lector de placas. 97 4. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS LIPOPROTEINAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS POSTPRANDIALES EN LA FORMACIÓN DE CÉLULAS ESPUMOSAS na vez la composición de las TRL ha sido caracterizada, procedemos a estudiar in vitro la capacidad del componente lipídico de las TRL para modular la captación de las partículas por los macrófagos a través de su interacción con los receptores celulares de superficie. De esa manera, se evaluará su efecto en el proceso de formación de células espumosas por la acumulación de lípidos intracelularmente. La figura 13 representa el proceso experimental que se ha seguido en esta parte del estudio. 98 U Figura 13. Diseño del proceso experimental seguido en el estudio de la influencia de las TRL postprandiales sobre el proceso de incorporación en macrófagos y la posterior formación de células espumosas. 99 TRL Estudio de acumulación lipídica Tinción de lípidos intracelulares Caracterización de los lípidos intracelulares 1. Extracción de lípidos totales 2. Separación: FL y TG 3. Metilación de ácidos grasos 4. Perfil cromatográfico de ácidos grasos intracelulares Nivel de expresión de receptores celulares 1. Extracción mRNA 2. RT-qPCR Monocitos THP-1 Macrófagos PMA 48 h Células espumosas Sonicar reacción, las muestras fueron transferidas a hielo. Siempre que se desarrolló una reacción de RT se incluyeron entre la batería de muestras un control negativo sin ARN, para confirmar la pureza de los reactivos utilizados y descartar posibles contaminaciones por ADN genómico en las muestra de ARN. Reacción de PCR cuantitativa La técnica de PCR permite amplificar el número de copias de una secuencia de ADN o ADNc gracias a la acción de una enzima polimerasa, mediante la repetición sucesiva de un ciclo que consta de tres fases. Dichas fases se caracterizan por su duración y sus diferentes temperaturas, las cuales permiten la desnaturalización de las cadenas de ADNc, la hibridación de los cebadores, y la extensión de la cadena por la enzima polimerasa. La reacción de PCR requiere la presencia de cebadores, pequeños oligonucleótidos que se unen específicamente a una secuencia complementaria de ADN, permitiendo que la enzima polimerasa comience la extensión de la hebra de ADN. Las secuencias codificantes de los genes estudiados se obtuvieron de la base de datos GenebankTM. El diseño de las secuencias de los cebadores se realizó con el software Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, EEUU), intentando que el producto final no superase los 100 pares de bases (pb) y que fuera posible someter a todos los cebadores a las mismas condiciones de temperatura de anillado (60ºC). Además, el uso de la herramienta para la búsqueda de alineamientos BLASTN permitió confirmar que la homología entre la secuencia de los cebadores y los genes de interés era única. Las secuencias de los cebadores diseñados se muestran en la tabla 5 y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd. (Haverhill, Reino Unido). 106 Tabla 5. Características de los cebadores sentido y antisentido utilizados en la técnica de qPCR. Gen Genebank™ Cebadores sentido y antisentido (5’- 3’) Nucleótidos Tamaño amplicón (pb) LDLR AY114155 TGAAGTTGGCTGCGTTAATGTG CATTCGCCGCTGTGACACT 812-833 862-880 69 LRP-1 NM_002332 CCGGAGTGGTATTCTGGTATAAGC CTCCGCCTTCGTACATCTTGTA 13779-13802 13883-13904 126 VLDLR D16493 ATGTTATCCAGCGTGGACTTGA GGATGAGCTAGGAACTCCAGAGACT 1937-1958 1986-2010 74 SRA2 NM_002445 GCCAACCTCATGGACACAGA GCTGCAGAAGAATGTCATTAAATCTT 519-538 572-597 79 SRB1 BC080647 TTCTACACTCAGCTGGTGTTGATG AGCGCCAGGAGGAGCTACT 1415-1438 1461-1479 65 CD36 L06850 CTCTTTCCTGCAGCCCAATG ACTGTGAAGTTGTCAGCCTCTGTT 468-487 519-542 75 GAPDH AF261085 CAACGGATTTGGTCGTATTGG GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA 127-147 171-198 72 Abreviaturas: LDLR, receptor de las lipoproteínas de baja densidad; LRP-1, proteína-1 relacionada con el LDLR; VLDLR, receptor de lipoproteínas de muy baja densidad; SRA2, receptor scavenger de clase A tipo 2; SRB1, receptor scavenger de clase B tipo 1; CD36, receptor scavenger CD36 y GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. La técnica de qPCR se caracteriza por monitorizar la cantidad de ADNc amplificado a lo largo de la reacción de PCR mediante el uso de técnicas de fluorescencia, emitiéndose una señal proporcional a la cantidad de producto amplificado. Aunque existen diversos tipos de sondas y marcadores fluorescentes para la detección de los productos de qPCR, en nuestro estudio se utilizó SYBR Green I, un agente intercalante fluorescente específico de ADN bicatenario, cuyas longitudes de onda máximas de excitación y emisión son 494 nm y 521 nm, respectivamente. 107 Para llevar a cabo la reacción de qPCR se adquirió el reactivo Precision PLUSTM Mastermix, de Primer Design (Chandler's Ford, Reino Unido). Por reacción, se añadió 150 ng de ADNc, 10 µl de Precision PLUSTM mastermix (Primer Design, Chandler's Ford, Reino Unido), 1 μl de cada uno de los cebadores específicos sentido y antisentido (10 μM) y agua Milli-Q (Millipore, Watford, Reino Unido) hasta un volumen final de 20 μl por reacción. Como control negativo se incluyó una reacción con todos los elementos salvo ADNc. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado para cada muestra en placas de 96 pocillos y se procesaron en un termociclador CFX96TM Real-Time System de BIORAD (California, EEUU). La descripción de los tiempos y temperaturas aplicados en cada ciclo de la reacción qPCR se detallan en la tabla 6. Tabla 6. Condiciones de tiempo, temperaturas y número de ciclos aplicadas a la reacción de pPCR. Fase Ciclos Tiempo Temperatura Objetivo 1 1 2 min 95ºC Desnaturalización inicial y activación de la enzima 2 39 15 seg 95ºC Desnaturalización 60 seg 60ºC Hibridación de los cebadores y extensión. Colección de datos. 3 Curva de disociación Comprobación de la especificidad de los cebadores La detección de los productos de qPCR con SYBR Green I posee la ventaja de su alta sensibilidad, aunque no es tan específico como las sondas fluorescentes y su uso requiere el análisis de la curva de “melting” o curva de disociación del producto. Dicha curva se obtiene tras la amplificación del ADNc, al representar gráficamente el descenso de la señal fluorescente (eje de ordenadas) debido a la disociación del producto de la qPCR conforme se incrementa la temperatura (eje de abscisas). La derivada de dicha curva debe resultar en un sólo pico cuyo máximo corresponde a la temperatura de fusión (Tm) del producto de qPCR, la cual es específica para cada amplicón. Esto nos informa que el diseño de los cebadores es correcto y específico del gen estudiado, así como de la ausencia de primer dimer o contaminaciones en la reacción. Así mismo, la Tm permite monitorizar en distintos días la correcta formación del amplicón esperado. 108 Los productos de la qPCR fueron analizados con el software Opticon Monitor™, Analysis Software V 2.01 (MJ Research Inc., Waltham, EEUU). El análisis de la curva de disociación mostró un único pico con la temperatura esperada para cada tránscrito amplificado. Los datos obtenidos se analizaron siguiendo un método de cuantificación relativa, el cual indica el cambio de expresión de un gen diana en una determinada situación experimental (células incubadas con TRL), respecto a una situación control (células sin TRL). Además, para normalizar el resultado de la qPCR respecto a las posibles diferencias en la cantidad de ARN añadido a la reacción de RT, este método incluye la determinación de la expresión de un gen control interno cuya expresión es constante y no se ve afectada por las condiciones experimentales. En el presente estudio, la cuantificación del ADNc amplificado se corrigió en función de la expresión del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Finalizada la reacción de qPCR con el fluoróforo intercalante de la doble hélice SYBR Green I, se obtuvieron distintos valores del parámetro ciclo umbral (CT, cycle threshold) para cada gen en las distintas condiciones experimentales. El valor de CT nos informó sobre el ciclo de la reacción de la polimerasa a partir del cual comenzaron a existir un número suficiente de copias de ADN para que la fluorescencia emitida sea superior al nivel umbral. Así, una “muestra 1” de ADNc con un elevado número de copias inicial tendrá un valor CT más bajo que otra “muestra 2” con un menor número de copias, pues la “muestra 1” necesitará menos ciclos para alcanzar el nivel umbral de fluorescencia (figura 14). 109 Figura 14. Detección de ADN por PCR cuantitativa (qPCR). El número de ciclos (eje de abscisas) se representa frente a la fluorescencia emitida por las dobles cadenas de ADNc (eje de ordenadas). La cuantificación de cada muestra (Muestra 1, 2 y 3) se realiza a partir del número de ciclos (valor CT1, CT2, y CT3, respectivamente) que necesita cada muestra para alcanzar el nivel umbral de fluorescencia. Para cuantificar los cambios de expresión relativos de los genes estudiados se empleó el método 2-Δ Δ Ct. Para que este método sea válido, la eficiencia de amplificación del gen diana debe ser igual a la del gen de control interno. Se realizaron diluciones seriadas del ADNc, y se calculó la diferencia entre el CT del gen diana y el del gen de control interno para cada dilución (ΔCT = CT,Diana - CT,GAPDH) tanto en las muestras procedentes de la situación control como experimental. Seguidamente, se hizo una segunda corrección entre ambas, para lo cual se calculó el parámetro Δ∆CT= [ (CT,Diana - CT,GAPDH)+TRL - (CT,Diana - CT,GAPDH)-TRL]. Así, se pudo concluir que las diferencias de ciclo entre las distintas condiciones eran atribuidas al tratamiento con TRL. Finalmente, para dar un valor relativo de la variación de la expresión del gen diana en las células incubadas con TRL frente a la situación control se calculó el parámetro 2-∆∆Ct, cuya función es transformar el dato obtenido en las correcciones de CT anteriores en un valor numérico que expresa la cantidad relativa con respecto a la situación control, a la cual se le asigna arbitrariamente una cantidad igual a 1. 110 Ciclos Fase exponencial Fase no exponencial CT1 CT2 CT3 Nivel umbral Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 5. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DEL COMPONENTE LIPÍDICO DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE LA LIPOPROTEÍN LIPASA DE MACRÓFAGOS 5.1 Procedimiento experimental os cultivos de monocitos THP-1 crecidos en medio RPMI-1640 con LGlutamina, 10% (v/v) de SFB y 50 µg/ml de Garamicina, fueron sembrados a una densidad de 1x106 células/ml en medio de cultivo con PMA (160 mM). Después de 72 horas, se le cambió el medio de cultivo a los monocitos THP-1 ya diferenciados a macrófagos, por medio fresco sin PMA. Transcurridas 24 horas, se añadió 0.3 mM TG/ml de las partículas de QM sintetizadas artificialmente (chilomycron remnant-like particles, CRLP) a los cultivos celulares. Los cultivos celulares control, a los que no se les añadió partículas artificiales (-CRLP), permanecieron con el mismo medio de cultivo. Los macrófagos THP-1 se mantuvieron a una temperatura de 37°C y en una atmósfera de 5% CO 2 /95% aire y, tras un periodo de incubación de 6 y 24 horas en presencia de las CRLP, se procedió a recolectar las diferentes fracciones en las que tendría lugar el análisis de la actividad de la LPL. Se trabajó sobre hielo en todo momento para evitar la pérdida de actividad de la enzima. Tras recoger el medio de cultivo, las células se trataron con nuevo medio de cultivo preparado con heparina (100 IU/ml RPMI) (Lövens, Malmö, Suecia) y 0.2% BSA (Sigma-Adrich, St. Louis, MO), durante 30 minutos a 4ºC. Ese medio se recolectó de nuevo, ya que contendría la LPL anclada a la superficie celular, siendo liberada al medio por su unión a la heparina. Posteriormente, los macrófagos fueron tratados con buffer de solubilización frío y, tras causar la rotura celular, el contenido intracelular también fue recolectado para el estudio de la actividad de la LPL intracelular. Todas las alícuotas fueron almacenadas a -70ºC hasta el momento de análisis. En paralelo, otros cultivos de macrófagos THP-1 fueron tratados bajo las mismas condiciones e incubados con o sin las CRLP, para analizar la acumulación intracelular de lípidos. Además, con ellos se realizaría también el estudio de la modulación de los niveles de expresión de los genes codificantes de la LPL y ANGPTL4 por acción de las CRLP preparadas con diferente contenido de TG. 111 L 5.2 Preparación de las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP) Todos los lípidos fueron adquiridos a Larodan Inc. (Malmo, Sweden). Las partículas artificiales fueron preparadas empleando una mezcla de lípidos, con la siguiente composición: 70% TG (OOO, LLL, o POP), 2% colesterol, 5% éster de colesterol (CE) y 25% de FL en NaCl al 0.9% preparado en buffer tricina (20 mmol/L, pH 7.4), como fue descrito por Redgrave & Maranhao [415]. La composición de la fracción de FL fue: 70.50% fosfatidilcolina, 6.88% lisofosfatidilcolina, 11.00% fosfatidiletanolamina, 2.58 % fosfatidilinositol, 2.58% fosfatidilserina y 6.54% esfingomielina. La mezcla lipídica fue sonicada mediante inmersión de una sonda ultrasónica (Bandelin Electronics Berlin, Alemania) directamente en la mezcla y aplicando un voltaje de 50W durante 20 minutos (pulsos de 5 minutos alternados con 5 minutos de reposo para permitir que se enfríe) a una temperatura de 56ºC. La emulsión resultante fue ajustada a una densidad de 1.21 g/ml con KBr, y se llevó a un tubo de plástico con capacidad para 12 ml (Beckman). Sobre la solución lipídica, se preparó un gradiente de densidad (2.5 ml, d1.065 g/ml; 2,5 ml, d1.020 g/ml; 3 ml, d1.006 g/ml) como fue descrito por Diard et al. [416]. La preparación se centrifugó a 11000 rpm durante 20 minutos a 12ºC en una centrífuga Beckman Optima L-90 K (Beckman Coulter, Palo Alto, CA), utilizando un rotor basculante SW41 Ti. Finalizada la centrifugación, se eliminó la capa superior, se reemplazó ese mismo volumen por solución NaCl (d1.006 g/ml), y se volvió a centrifugar a 23500 rpm durante 1 hora a 12ºC en el mismo rotor. La capa superior formada que contiene las CRLP fue recolectada e incubada con el doble de su volumen de suero d<1.020 deficiente, durante 5 horas a 37ºC con agitación. La mezcla CRLP/suero fue posteriormente situada en los tubos de centrifugación (Beckman Coulter, Palo Alto, CA) con solución d1.006 sobre ella hasta completar el volumen del tubo, y fue centrifugada a 3000 rpm durante 16 horas a 12ºC, de nuevo en un rotor basculante SW41 Ti. La capa superior se recogió, se le añadió 15 mg de NaCl, y se centrifugó una vez más bajo una solución d1.006 a 4000 rpm durante 5 horas a 12ºC. Por último, después de volver a recolectar la capa superior formada, ésta fue dializada en 2 L de solución salina NaCl 0.9% durante 2 horas con membranas 4MWCO 12K-14K, 25mm, 1x30M (Spectra). El producto final fue almacenado a 4ºC hasta su uso, sin exceder los 3 días. 112 5.3 Preparación de suero d<1.020 deficiente El suero fue aislado de una muestra de sangre humana extraída en ayunas, mediante centrifugación a 3000 rpm, 20 minutos a temperatura ambiente. Se ajustó un volumen de 5 ml del suero obtenido a una densidad de 1.020 g/ml usando KBr y, posteriormente, se transfirió a un tubo de centrifugación. El suero depositado en el tubo se cubrió por una solución de densidad 1.020 g/ml hasta completar los 14 ml de la capacidad del tubo, y se centrifugó a 40000 rpm a 22ºC, durante la noche (16 horas). La capa superior formada fue desechada, y el suero que permaneció en el fondo del tubo de centrifugación se recogió y se sometió a diálisis durante 6 horas en 2 L de solución salina al 0.9% NaCl a 4ºC, empleando las membranas 4MWCO 12K14K, 25mm, 1x30M (Spectra). Cada dos horas la solución salina fue cambiada por otra preparada en el momento. Después de la diálisis, el suero obtenido fue almacenado a -20ºC hasta que fue requerido. 5.4 Cuantificación de los triglicéridos incorporados en las partículas artificiales de quilomicrones (CRLP) Para poder añadir 0.3 μmol TG/ml de CRLP en cada cultivo de células, los TG incorporados en las partículas fueron cuantificados mediante el kit “Triglyceride Colorimetric Assay” (Cayman Chemical, MI, EEUU). Los TG empleados como estándar fueron diluidos 1:5, 1:10 y 1:20 en dH2O, al igual que las preparaciones de CRLP, que se diluyeron 1:10, 1:20 y 1:40 en dH2O. Los reactivos fueron reconstituidos según las indicaciones del fabricantes. Se añadieron 10 μl de estándar de triglicéridos y muestras en los pocillos correspondientes de una placa P96, por triplicado. Se inició la reacción mediante la adición de 150 μl de la solución de mezcla enzimática a cada pocillo. La placa se cubrió y se agitó cuidadosamente durante unos segundos para mezclar los compuestos correctamente. Se incubó la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se procedió a medir la D.O de cada muestra a 500 nm y 570 nm, siendo empleada la primera medición para la eliminación de ruido. 113 5.5 Ensayo de medición de la actividad de la LPL La actividad de la LPL recogida en cada una de las diferentes fracciones de los cultivos celulares, fue medida bajo las mismas condiciones que han sido previamente descritas por Holm C et al. [417]. Para ello, se empleó leche fresca extraída de vacas como emulsión lipídica, con trioleína marcada radiactivamente con tritio (trioleína-H3), incorporada por sonicación. Se preparó una mezcla de incubación para todas las reacciones y se añadió 180 µl/tubo en tubos Kimble 13x100 mm. La solución de incubación por tubo se constituía por: por 100 ul de buffer de incubación (12% BSA, 16.65 U/ml 0.2 mg heparina/ml, 0.2M NaCl, 0.3M Tris HCl, pH 8.5), 50 µl de la emulsión lipídica con trioleína-H3, 5 µl de suero de rata congelado tratado con fenilmetilsulfonil fluorido inactivado por calor (PMSF-HIFRS), que es la fuente del activador de LPL, y 25 µl de dH2O. A cada tubo se le añadió 20 µl de la correspondiente fracción del cultivo celular, que contiene la LPL activa. Cada reacción se mezcló con vórtex y todos los tubos fueron incubados durante 3 horas en un baño de agua a 25ºC, con agitación continua. La hidrólisis lipídica se detuvo mediante la adición de 2 ml por tubo de la solución de extracción (isopropanol, heptano y 1M H2SO4, 40:48.3:1), más 0.5 ml de dH2O. Cada uno de los tubos se centrifugó a 2250 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente. La fase superior fue recogida y mezclada por vortex con 1ml de etanol alcalino (95% etanol, 1 N NaOH, dH2O) y 3 ml de heptano para el lavado de la muestra. Los tubos fueron nuevamente centrifugados a 2250 rpm durante 3 minutos y la fase superior fue eliminada por succión, que contenía el heptano de lavado. A la solución resultante se le añadió otros 3 ml de heptano, se mezcló con el vortex y se centrifugó otra vez para un segundo lavado bajo las mismas condiciones. Del fondo del tubo fueron recogidos 800 µl y llevados a los tubos de centelleo, donde fueron mezclados con la solución Opti-phase “Hi safe” 3 mezclada previamente con ácido acético. Finalmente, la radioactividad emitida de cada uno de los tubos que contenían las muestras fue medida en el contador-β (contador de centelleo). 114 5.6 Cuantificación de la acumulación lipídica en macrófagos El contenido lipídico intracelular de los cultivos de monocitos THP-1 diferenciados a macrófagos después de ser incubados durante 24 horas en presencia de la diferentes preparaciones de CRLP, fue teñido con el colorante aceite rojo O de la misma manera que ha sido descrito en la sección 4.2.1. Como diferencia hubo lo siguiente: tras los 10 minutos de incubación con el colorante de elevada afinidad lipídica, y de ser lavados adecuadamente con 1x PBS, se añadió 0.5 ml de Isopropanol al 98% a cada uno de los cultivos. Fueron incubados en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente, y las células fueron recogidas para proceder con la medición de la D.O a 510 nm. Los resultados son expresados como acumulación intracelular de lípidos/proteína total, y se tomó la media del valor de todos los controles (-CRLP) como valor de referencia, siendo todos divididos por esa cifra, para poder realizar la comparación entre los diferentes ensayos. 5.7 Cuantificación de la proteína total celular Se preparó una curva patrón con BSA como estándar, en las siguientes concentraciones: 10, 20, 40, 60, 80 y 100 µg BSA/ ml en dH2O, en un volumen final de 200 µl. De las fracciones intracelulares recolectadas para la medición de la actividad de LPL intracelular, se tomó una alícuota para cuantificar la proteína total de cada uno de los cultivos celulares. Cada muestra se diluyó 1:8, 1:4 y 1:2 en dH2O, también en un volumen final de 200 µl. Como Blanco, para el estándar se empleó dH2O, mientras que para cada muestra intracelular se dispuso de 0.2M NaOH 1:2 en dH2O. Las diluciones de estándar y de las muestras, así como los blancos, fueron tratados siguiendo el mismo procedimiento. Se preparó una mezcla constituida por el Reactivo A (2.0% NaCO3, 0.4% NaOH, 0.16% Na-tartrate, 1% SDS) y el Reactivo B (4% CuSO4 x5 H2O) (A:B=100:1), y se añadió 0.6 ml de ésta a cada tubo y se mezcló por vortex. Después de una incubación de 10-60 minutos a temperatura ambiente, se añadió 60 µl del reactivo 1N FolinCiocalteu a cada reacción, se mezcló adecuadamente, y de nuevo se incubó durante 45 minutos, esta vez en oscuridad. A continuación se midió la D.O. de cada muestra a 750 nm. 115 1.2. Estudio del perfíl lipídico y bioquímico postprandial en suero El ensayo postprandial comenzó con la administración de los dos desayunos experimentales, el de tipo mediterráneo y el de tipo occidental, a todos los sujetos participantes del estudio. Durante las 6 horas siguientes a la ingesta de los desayunos, se fue extrayendo una muestra de sangre a cada hora, lo que permitió determinar la influencia de la carga lipídica de la dieta en la evolución del perfil lipídico y de la glucosa e insulina a lo largo del periodo postprandial, en el grupo de obesos y normopesos. 1.2.1 Colesterol total Tanto en el grupo de obesos (figura 15.A) como en el de normopesos (figura 15.B), el consumo de los dos tipos de desayunos no demostró alterar los niveles postprandiales de colesterol total (CT) respecto a los valores basales a lo largo de las 6 horas posteriores a la ingesta de las dietas experimentales, manteniéndose los niveles constantes en ambos grupos del estudios. Además, no hubo diferencias significativas en los valores de colesterol obtenidos al comparar entre los desayunos, el de tipo mediterráneo y el de tipo occidental. Tan solo a la hora 5 en el grupo de sujetos normopesos se encontró una diferencia significativa entre el consumo de los desayunos experimentales (P<0.05), con una concentración de colesterol en suero más elevada tras la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo. Figura 15. Concentración de colesterol sérico antes (0h) y después (1-6h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 122 T i e m p o ( h ) C o l e s t e r o l ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 * M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l AB T i e m p o ( h ) C o l e s t e r o l ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 1.2.2 HDL-c En el grupo de sujetos obesos, la concentración de HDL-c postprandial se mantuvo constante con respecto al nivel basal durante las 6 horas analizadas después de consumir tanto el desayuno de tipo mediterráneo como el de tipo occidental, con valores similares entre ambas dietas. Además, desde la hora 0 y a lo largo del periodo postprandial, se mantuvieron unos niveles de HDL-c en circulación dentro de los niveles considerados normales, superiores a 40 mg/dl en varones según NCEP ATP III (figura 16.A). En cambio, los valores postprandiales de HDL-c en el grupo de normopesos fueron superiores al grupo de sujetos obesos (figura 16.B). Y al igual que ellos, no presentaron ninguna variación durante el periodo postprandial con respecto a los valores basales tras el consumo de los dos desayunos experimentales. Tampoco se detectaron diferencias significativas entre los valores de HDL-c postprandial obtenidos con los dos desayunos. Figura 16. Concentración de colesterol HDL (HDL-c) sérico antes (0h) y después (1-6h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. (Test t de Student pareado). 123 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l AB T i e m p o ( h ) H D L - c ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T i e m p o ( h ) H D L - c ( m g / d l ) 0123456 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1.2.3 Triglicéridos Al determinar la evolución de la concentración de TG en suero a lo largo del periodo postprandial después de que los sujetos obesos consumieran las dietas que se les administró, se observó que los niveles postprandiales de TG fueron experimentando un incremento gradual causado tanto por el desayuno de tipo mediterráneo como por el de tipo occidental (figura 17.A). No se identificaron diferencias significativas en el efecto causado sobre los niveles de TG entre desayunos. El grupo de normopesos experimentó un incremento en la concentración de TG plasmáticos entre las 2-4 horas del periodo postprandial con respecto al valor basal después de consumir el desayuno de tipo occidental (figura 17.B). A continuación, la concentración sérica postprandial de TG comenzó a sufrir un descenso constante. Por el contrario, el consumo del desayuno de tipo mediterráneo solo causó un ligero incremento en la concentración postprandial de TG, aunque los valores a las 3 horas fueron similares a los basales. A pesar de la diferencia encontrada entre ambos desayunos, ésta tampoco fue estadísticamente significativa. Figura 17. Concentración de triglicéridos séricos antes (0h) y después (1-6h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. (Test t de Student pareado). 124 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l AB T i e m p o ( h ) T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 T i e m p o ( h ) T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 100 150 200 250 Para calcular la respuesta postprandial que tiene lugar tras la ingesta de la dieta con contenido graso, diversos métodos han sido a menudo empleados en varios estudios [422, 423]. Entre ellos, es frecuente realizar el cálculo del área bajo la curva (AUC) y el área bajo la curva incremental (iAUC). Ha sido demostrado que el AUC correlaciona con la concentración de TG en ayunas, sin embargo, es el cálculo del iAUC el que se asocia fuertemente con el incremento de TG durante el periodo postprandial. Tanto en individuos sanos como en individuos que presentan algún desorden metabólico, el iAUC describe mejor la situación postprandial que el AUC total, el cual parece ser más un factor descriptivo, relacionado con el nivel basal, tal y como quedó demostrado mediante el estudio realizado por Carstensen et al. en el año 2003 [424]. El cálculo del valor incremental de la concentración de TG a cada hora con respecto al nivel basal permitió apreciar más claramente el incremento y/o reducción experimentado de sus niveles tras el consumo de los dos desayunos a lo largo del período postprandial. En el grupo de obesos, se hizo más evidente el incremento que sufrió la concentración de TG tras el consumo del desayuno de tipo occidental frente al de tipo mediterráneo (figura 18.A). Esta diferencia en los niveles alcanzados de TG en el periodo postprandial después de consumir los dos desayunos experimentales fue confirmada con el cálculo del iAUC en este grupo de individuos. El nivel total de TG plasmáticos postprandiales fue mayor por el consumo del de tipo occidental, aunque sin representar una diferencia significativa respecto al desayuno de tipo mediterráneo (figura 18.B). En el caso del grupo de normopesos, el cálculo de los valores incrementales a todas las horas con respecto al nivel basal (figura 18.C) sí reveló una diferencia significativa entre ambos desayunos a las 2 y 3 horas del periodo postprandial (P<0.05), siendo, como ya se ha comentado anteriormente, los niveles de TG plasmáticos más elevados con el consumo del desayuno de tipo occidental. Además, el cálculo del iAUC (figura 18.D) ayudó a verificar que la concentración total de TG en el período postprandial era estadísticamente superior tras la ingesta del desayuno de tipo occidental (P<0.05). 125 Figura 18. Valor incremental de la concentración sérica de triglicéridos (TG) en el periodo postprandial con respecto al nivel basal de TG (en ayunas), tras la ingesta de un desayuno de tipo mediteráneo (Med) y occidental (Occ) por los sujetos obesos (A) y normopesos (C); y área bajo la curva incremental (iAUC) de la concentración sérica postprandial de TG en los pacientes obesos (B) y normopesos (D). Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 126 T i e m p o ( h ) T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 ** M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l T i e m p o ( h ) T r i g l i c é r i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A C B D T r i g l i c é r i d o s ( m g / d L  h o r a ) M e d O c c 0 5 0 100 150 200 250 300 T r i g l i c é r i d o s ( m g / d L  h o r a ) M e d O c c 0 5 0 100 150 200 250 300 * 1.2.4 Apolipoproteína B (apo B) La variación de la concentración de apo B durante el periodo postprandial en el grupo de sujetos obesos se muestra en la figura 19.A. Después de ingerir los dos tipos de desayunos experimentales, los valores de apo B aumentaron ligeramente con respecto a la concentración basal en ambos casos. La diferencia en los valores de apo B después de la ingesta de los dos desayunos resultó ser significativa a las 4h (P<0.05) debido a la mayor concentración detectada a causa del de tipo mediterráneo. No obstante, esto tuvo como explicación la significativa diferencia entre los niveles basales al comienzo del ensayo postprandial mediterráneo y occidental, que fueron bastante más elevados en el caso del desayuno de tipo mediterráneo (P<0.01). De la misma manera, el grupo de sujetos normopesos (figura 19.B) experimentó un ligero incremento en los valores de apo B durante el periodo postprandial frente a los valores basales tras la ingesta del desayuno occidental. En cambio, el desayuno de tipo mediterráneo mantuvo aparentemente constante el nivel de apo B durante las 4 horas siguientes a su consumo. Figura 19. Concentración de apolipoproteína B (Apo B) sérica antes (0h) y después (2 y 4h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. *=P<0.05; **=P<0.01 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 127 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l AB T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 0 2 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 0 2 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 Debido a la diferencia en los valores basales detectados en los sujetos obesos al inicio de los ensayos postprandiales, el cálculo de los valores incrementales de apo B con respecto al nivel basal permitió un análisis más objetivo de la evolución de su concentración a lo largo del periodo postprandial después de ingerir las dos dietas experimentales. Tanto en el grupo de obesos (figura 20.A) como en el de normopesos (figura 20.C), se observó una concentración de apo B mayor después de ingerir el desayuno de tipo occidental a las 2 y 4 horas del periodo postprandial. Tal diferencia resultó ser estadísticamente significativa al compararse con el desayuno de tipo mediterráneo sólo en el grupo de los obesos a la hora 2 (P<0.05). Esta diferencia en la concentración postprandial de apo B entre desayunos fue confirmada con el cálculo del iAUC en los dos grupos del estudio, los sujetos obesos (figura 20.B) y los sujetos normopesos (figura 20.D). En los dos casos, los niveles de apo B séricos detectados en todo el periodo postprandial fueron superiores después de que se consumiera el desayuno de tipo occidental, aunque en ningún caso resultó ser estadísticamente significativa la diferencia frente al valor obtenido con el desayuno de tipo mediterráneo. 128 Figura 20. Valor incremental de la concentración de apolipoproteína B (ApoB) sérica en el periodo postprandial con respecto al nivel basal de Apo B (en ayunas), tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo (Med) y occidental (Occ) por los sujetos obesos (A) y normopesos (C); y área bajo la curva incremental (iAUC) de la concentración sérica postprandial de Apo B en los pacientes obesos (B) y normopesos (D). Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 129 T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 2 4 - 5 0 5 1 0 1 5 2 0 * T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 2 4 - 5 0 5 1 0 1 5 2 0 A C D B M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l A p o B ( m g / d L  hora) M e d O c c 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 A p o B ( m g / d L  h o r a ) M e d O c c 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 1.2.5 Glucosa La concentración de glucosa en sangre experimentó un pico máximo 1 hora después de ingerir los dos desayunos en el grupo de sujetos obesos (figura 21.A.) y en el de sujetos normopesos (figura 21.B). Se observó que los niveles de glucosa alcanzados en ese momento fueron ligeramente superiores tras el consumo del desayuno de tipo occidental en los dos grupos de participantes. A partir de la hora 1 del periodo postprandial, la concentración tendió a disminuir en todos los sujetos, alcanzando de nuevo los niveles plasmáticos basales. En el caso del grupo de los obesos, esto ocurrió a las 3 horas después de consumir el desayuno de tipo mediterráneo, y a las 4 horas del consumo del desayuno de tipo occidental (figura 21.A), mientras que en el grupo normopeso, sucedió algo más temprano, 2 horas después de la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo, y a las 3 horas tras el desayuno de tipo occidental (figura 21.B). Sin embargo, una vez se recuperaron los valores basales, éstos sufrieron de nuevo un ligero incremento en todos los casos a partir de las 3-4 horas. Los dos desayunos experimentales generaron diferencias significativas entre los niveles de glucosa obtenidos tras su consumo. De hecho, la diferencia en la concentración de glucosa resultó ser estadísticamente significativa a las 3 horas del periodo postprandial en obesos (P<0.01) (figura 21.A), y a las 2 horas (P<0.01) en el grupo de normopesos (figura 21.B), en ambos casos debido a que el desayuno de tipo occidental provocó que los niveles de glucosa fuesen más elevados en comparación con el de tipo mediterráneo. Hay que mencionar que, antes de que los dos tipos de desayunos fuesen administrados a los individuos normopesos, el nivel de glucosa basal (0h) del ensayo que se realizó con el desayuno de tipo occidental fue superior con respecto a la concentración basal del ensayo que se llevó a cabo con el de tipo mediterráneo, siendo muy significativa estadísticamente la diferencia entre ellos (P<0.001). Por esa razón, la concentración de glucosa postprandial se mantuvo más elevada después de consumir el desayuno de tipo occidental, en comparación con los resultados del desayuno de tipo mediterráneo. 130 Figura 21. Concentración de glucosa sérica antes (0h) y después (1-6h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. **=P<0.01, ***=P<0.001 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). El cálculo incremental de cada uno de los valores postprandiales con respecto a la concentración basal permitió verificar de nuevo la variación real de los niveles de glucosa tras el consumo de los dos desayunos. Con la representación gráfica de dichos valores incrementales se observó una evolución muy similar de la glucosa durante las 6 horas después del consumo de las dietas experimentales en el grupo obeso y normopeso. Ambos experimentaron un importante incremento de glucosa a la hora 1 tras el consumo de los dos desayunos como como se indicó previamente. Y la reducción que empezó a sufrir a partir de las 2 horas en los dos grupos llegó a alcanzar valores inferiores a los basales a las 3 horas. A partir de las 4 horas, la concentración de glucosa comenzó a incrementarse de nuevo tanto en el grupo de sujetos obesos como en el de sujetos normopeso (figuras 22.A y 22.C, respectivamente). En el grupo de obesos, se mantuvo la diferencia significativa observada a las 3 horas de consumir los dos desayunos experimentales, ya que los valores de glucosa seguían siendo mayores después del de tipo occidental (P<0.05) (figura 22.A.). En los sujetos normopesos, la elevada concentración de glucosa a las 2 horas tras el consumo del desayuno tipo occidental también siguió mostrando una diferencia significativa con respecto al mediterráneo (P<0.05). Además, el cálculo incremental reveló que el aumento de glucosa experimentado a las 4 horas después de ingerir el desayuno de tipo mediterráneo fue significativamente mayor con respecto 131 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l AB T i e m p o ( h ) G l u c o s a ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * T i e m p o ( h ) G l u c o s a ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * 2.2 Concentración postprandial en suero de los marcadores de inflamación 2.2.1 Adiponectina Como puede verse en la figura 26.A, antes de la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo por los sujetos obesos, los niveles de adiponectina fueron significativamente superiores a los detectados antes de que consumieran el desayuno de tipo occidental (P<0.05). No obstante, 2 horas después del consumo de los dos tipos de desayunos experimentales, el nivel de adiponectina sérica fue el mismo para los dos casos. Esto fue debido a que la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo indujo una reducción en la liberación de adiponectina respecto al nivel basal detectado, mientras que el consumo del desayuno de tipo occidental provocó su incremento. Sin embargo, a las 4 horas, la concentración de adiponectina volvió a los niveles originales (0h) en ambos casos. Por parte de los individuos normopesos (figura 26.B), el consumo del desayuno de tipo occidental produjo una progresiva reducción de la expresión de adiponectina a lo largo del periodo postprandial. Esta reducción también se observó a las 2 horas de consumir el desayuno de tipo mediterráneo, aunque 4 horas después se elevó, detectándose unos valores mayores al nivel de expresión basal y superiores también a los alcanzados por el desayuno de tipo occidental. No obstante, no se detectaron diferencias significativas entre el consumo de los dos tipos de desayunos en este grupo de individuos. 138 Figura 26. Concentración de adiponectina sérica antes (0h) y después (2 y 4 h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). Los valores incrementales de la concentración sérica de adiponectina respecto a la concentración basal a lo largo del periodo postprandial se representan en la figura 27. El cálculo incremental permitió apreciar una diferencia significativa en el efecto causado por la ingesta de los desayunos sobre los niveles de expresión de adiponectina, antes no detectada, en el grupo de individuos obesos (figura 27.A). La elevada liberación de adiponectina 2 horas después de consumir el desayuno de tipo occidental resultó ser estadísticamente significativa frente a la reducción de su concentración tras la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo (0<0.01). De hecho, esta influencia de los dos tipos de dietas experimentales sobre los niveles de adiponenctina quedó demostrada con el cálculo de iAUC (figura 27.B), con el que se determinó que la cantidad total de adiponectina producida en el periodo postprandial fue significativamente mayor después de ingerir el desayuno de tipo occidental (P<0.05). En los sujetos normopesos (figura 27.C) se observó de manera más clara la reducción que sufrió el nivel de secreción de adiponectina 2 horas después de consumir los dos desayunos experimentales respecto a los valores basales. De la misma manera, el incremento en su concentración a las 4 horas de consumir el desayuno de tipo mediterráneo se hace más apreciable. La capacidad del desayuno de tipo occidental para reducir los niveles de adiponectina postprandial por debajo del nivel basal, no observada tras la ingesta del de tipo mediterráneo, explica que la cantidad de adiponectina secretada durante todo el periodo postprandial sea 139 T i e m p o ( h ) A d i p o n e c t i n a (  g / m l ) 0 2 4 0 2 4 6 8 1 0 * T i e m p o ( h ) A d i p o n e c t i n a (  g / m l ) 0 2 4 0 2 4 6 8 1 0 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l A B significativamente inferior respecto a la secretada tras el consumo del desayuno de tipo mediterráneo(P<0.05), tal y como se observa con el cálculo del iAUC (figura 27.D). Figura 27. Valor incremental de la concentración de adiponectina sérica durante el periodo postprandial con respecto al nivel basal de adiponectina (en ayunas), tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo (Med) y occidental (Occ) por los sujetos obesos (A) y normopesos (C); y área bajo la curva incremental (iAUC) de la concentración sérica postprandial de adiponectina en los pacientes obesos (B) y normopesos (D). Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 140 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l T i e m p o ( h ) A d i p o n e c t i n a (  g / m l ) 2 4 - 6 - 4 - 2 0 2 4 * * T i e m p o ( h ) A d i p o n e c t i n a (  g / m l ) 2 4 - 6 - 4 - 2 0 2 4 A B C D A d i p o n e c t i n a (  g / m l  h o r a ) M e d O c c - 6 - 4 - 2 0 2 4 * A d i p o n e c t i n a (  g / m l  h o r a ) M e d O c c - 6 - 4 - 2 0 2 4 * 2.2.2 Leptina El consumo de los dos tipos de desayunos experimentales también demostró ejercer una influencia distinta sobre la concentración sérica de leptina a lo largo del periodo postprandial en el grupo de individuos obesos (figura 28.A). De nuevo, el desayuno occidental produjo un descenso progresivo en los niveles de leptina desde el momento inicial del ensayo (0h) y hasta las 4 horas en que fue medida, aunque no se trató de una reducción muy pronunciada frente al nivel basal de leptina. En el caso del consumo del desayuno de tipo mediterráneo, 2 horas después la leptina también vio reducida su expresión sérica de forma considerable frente al valor inicial (0h). Sin embargo, los valores iniciales de leptina antes de consumir el desayuno mediterráneo ya eran superiores al valor en ayunas del ensayo realizado con el desayuno de tipo occidental. Ello contribuyó a que la diferencia a las 2 horas fuera estadísticamente significativa (P<0.01). Al igual que lo fue a las 4 horas, ya que se detectó un significativo incremento en nivel de expresión de leptina tras la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo (P<0.01). Por el contrario, el grupo de normopesos (figura 28.B) no experimentó alteración alguna en la concentración sérica de leptina durante el periodo postprandial después de consumir el desayuno de tipo mediterráneo y el de tipo occidental. Se observó que los niveles postprandiales de leptina se mantuvieron constantes y similares a la concentración sérica basal durante todo el ensayo. Figura 28. Concentración sérica de leptina antes (0h) y después (2 y 4 h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. **=P<0.01 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 141 A B T i e m p o ( h ) L e p t i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 1 0 2 0 3 0 4 0 * * * * T i e m p o ( h ) L e p t i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 1 0 2 0 3 0 4 0 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l Mediante el cálculo incremental de la concentración postprandial de leptina respecto al nivel basal en el grupo de sujetos obesos pudo determinarse que las diferencias que anteriormente resultaron ser significativas entre los niveles de leptina alcanzados tras la ingesta de los dos tipos de desayuno experimentales, realmente no existían. Además, se pudo a preciar que el desayuno de tipo occidental aparentemente no manifestó tener influencia sobre la expresión de leptina en el periodo postprandial (figura 29.A). Además, el cálculo de iAUC reflejó que consumir el desayuno de tipo mediterráneo causaba una reducción en los niveles de expresión total de leptina postprandial en el grupo de los obesos (figura 29.B). No obstante, no hubo diferencias que pudieran considerarse significativas entre los dos tipos de desayunos. En el grupo de sujetos normopesos, el cálculo incremental (figura 29.C) no reflejó grandes cambios con respecto a lo observado con anterioridad, tan solo que la concentración sérica de leptina experimentó un ligero descenso tras el consumo del desayuno de tipo mediterráneo, alcanzando unos valores inferiores a los obtenidos con el de tipo occidental, antes inapreciables. Y de la misma manera que sucedió con el grupo de obesos, con el cálculo del iAUC (figura 29.D) quedó reflejado de nuevo que el desayuno de tipo mediterráneo tenía mayor capacidad para reducir los niveles de leptina postprandial totales frente al de tipo occidental, aunque no de manera significativa. 142 Figura 29. Valor incremental de la concentración de leptina sérica durante el periodo postprandial con respecto al nivel basal de leptina (en ayunas), tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo (Med) y occidental (Occ) por los sujetos obesos (A) y normopesos (C); y área bajo la curva incremental (iAUC) de la concentración sérica postprandial de leptina en los pacientes obesos (B) y normopesos (D). Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; (Test t de Student pareado). 143 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l A B C D T i e m p o ( h ) L e p t i n a ( n g / m l ) 2 4 - 1 0 - 5 0 5 1 0 T i e m p o ( h ) L e p t i n a ( n g / m l ) 2 4 - 1 0 - 5 0 5 1 0 L e p t i n a ( n g / m l  h o r a ) M e d O c c - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 4 L e p t i n a ( n g / m l  h o r a ) M e d O c c - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 4 2.2.3 Ceruloplasmina Los valores iniciales de ceruloplasmina en los individuos obesos (figura 30.A) al comienzo de los ensayos postprandiales realizados con los dos tipos de desayunos, ya mostraron una diferencia importante, ya que fueron significativamente más elevados antes de proceder con la ingesta del de tipo occidental (P<0.05). El consumo de las dos dietas experimentales provocó una reducción en los niveles de expresión de ceruloplasmina sérica en la hora 2 del periodo postprandial respecto al valor basal. A pesar de esta reducción detectada en los dos casos, la diferencia en la expresión de ceruloplasmina alcanzada entre desayunos fue significativa, puesto que ésta era superior tras el consumo del desayuno de tipo occidental (P<0.05). Sin embargo, a las 4 horas de ingerir el desayuno de tipo mediterráneo, el nivel de expresión de la ceruloplasmina aumentó, igualándose al detectado con el desayuno de tipo occidental a las 4 horas de su consumo, con el cual se mantuvieron constantes desde la hora 2. En el grupo de individuos normopesos (figura 30.B) la evolución de los niveles séricos de ceruloplasmina a lo largo del periodo postprandial tras consumir los dos tipos de dietas experimentales fue muy parecida a la que experimentaron los sujetos obesos. En este caso, la expresión de ceruloplasmina fue parecida en todos los casos después de ingerir un desayuno u otro, sin diferencias significativas entre ellos. Figura 30. Concentración de ceruloplasmina sérica antes (0h) y después (2 y 4 h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 vs desayuno de tipo mediterráneo (Test t de Student pareado). 144 A B T i e m p o ( h ) C e r u l o p l a s m i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 * * * T i e m p o ( h ) C e r u l o p l a s m i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l A pesar de las diferencias significativas obtenidas en los niveles de ceruloplasmina tras la ingesta de los dos tipos de desayunos en el grupo obeso, el cálculo incremental de los valores postprandiales en estos sujetos permitió detectar que la diferente influencia de los dos desayunos sobre su nivel de expresión no era significativa (figura 31.A). Ambos desayunos experimentales fueron responsables de reducir la concentración de ceruloplasmina a las 2 horas. Y aunque la reducción fue ligeramente superior con el consumo del desayuno de tipo mediterráneo, a las 4 horas de su ingesta, la producción de ceruloplasmina detectada fue de nuevo equivalente al nivel de producción basal. Por el contrario, el consumo del desayuno de tipo occidental lo mantuvo siempre por debajo del nivel basal. No obstante, estas ligeras diferencias entre desayunos no generaron una cantidad de ceruloplasmina postprandial total diferente entre ellos. El cáculo del iAUC demostró que la cantidad de ceruloplasmina total liberada a lo largo del periodo postprandial fue la misma tras la ingesta de los dos tipos de desayunos experimentales (figura 31.B) En el caso de los individuos normopesos (figura 31.C), los valores incrementales tampoco presentaron diferencias significativas entre desayunos. El consumo de los dos tipos de desayunos por parte de los sujetos normopesos ejerció la misma influencia sobre los niveles de expresión de ceruloplasmina que la que ejercieron sobre los sujetos obesos. Así mismo, el cálculo del iAUC demostró una menor producción de ceruloplasmina total en el periodo postprandial causada tanto por el consumo del desayuno de tipo mediterráneo como por el de tipo occidental con respecto a los valores basales (figura 31.D). 145 Figura 31. Valor incremental de la concentración de ceruloplasmia sérica durante el periodo postprandial con respecto al nivel basal de ceruloplasmina (en ayunas), tras la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo (Med) y occidental (Occ) por los sujetos obesos (A) y normopesos (C); y área bajo la curva incremental (iAUC) de la concentración sérica postprandial de ceruloplasmia en los pacientes obesos (B) y normopesos (D). Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; (Test t de Student pareado). 146 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l A B C D T i e m p o ( h ) C e r u l o p l a s m i n a (  g / m l ) 2 4 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 T i e m p o ( h ) C e r u l o p l a s m i n a (  g / m l ) 2 4 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 C e r u l o p l a s m i n a (  g / m l  h o r a ) M e d O c c - 1 . 0 - 0 . 8 - 0 . 6 - 0 . 4 - 0 . 2 0 . 0 C e r u l o p l a s m i n a (  g / m l  h o r a ) M e d O c c - 1 . 0 - 0 . 8 - 0 . 6 - 0 . 4 - 0 . 2 0 . 0 2.2.4 PCR La PCR fue el único marcador de inflamación cuyos niveles de expresión no se vieron alterados durante todo el periodo postprandial con respecto a la concentración basal, tras el consumo del desayuno de tipo mediterráneo y de tipo occidental en el grupo de sujetos obesos (figura 32.A), ni en el de normopesos (figura 32.B). A pesar de las ligeras fluctuaciones observadas, los valores de PCR no se alejaron del valor basal a ninguna de las horas en las que su expresión fue medida. Es importante señalar que en el grupo de los individuos obesos, la concentración de PCR siempre se mantuvo superior con el consumo del desayuno de tipo occidental frente al de tipo mediterráneo. Esto se debió a que los valores basales de PCR fueron más elevados al inicio del ensayo realizado con el desayuno de tipo occidental que con el de tipo mediterráneo, como ya ha ocurrido con otros marcadores de inflamación. Figura 32. Concentración sérica de PCR antes (0h) y después (2 y 4 h) de la ingesta de un desayuno de tipo mediterráneo y occidental por los sujetos obesos (A) y normopesos (B) participantes del estudio. Valores expresados como media ± error estándar de la media (SEM); n=12; (Test t de Student pareado). El cálculo incremental de las concentraciones de PCR obtenidas en los sujetos obesos tras la toma de los desayunos frente al valor basal (figura 33.A) permitió apreciar de forma más objetiva la capacidad de los dos tipos desayunos experimentales para modular el nivel de expresión de PCR. La ingesta del desayuno de tipo mediterráneo por parte de estos individuos provocó un pequeño incremento en el nivel de expresión de PCR 1 hora después, quedando por encima del nivel basal, y manteniéndose constante a lo largo del periodo postprandial. En 147 A B T i e m p o ( h ) P C R (  g / m l ) 0123456 0 1 2 3 4 T i e m p o ( h ) P C R (  g / m l ) 0123456 0 1 2 3 4 M e d i t e r r á n e o O c c i d e n t a l [1] M. O’Flaherty, I. Buchan, and S. Capewell, “Contributions of treatment and lifestyle to declining CVD mortality: why have CVD mortality rates declined so much since the 1960s?,” Heart Br. Card. Soc., vol. 99, no. 3, pp. 159–162, Feb. 2013. [2] H. 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Botham, and P. a Mayes, “Modification of the fatty acid composition 291 ANEXO 298 RESUMEN EJECUTIVO INTRODUCCION: La obesidad es considerada en la actualidad una enfermedad inflamatoria crónica de bajo grado, relacionada con un desorden en el metabolismo postprandial de los lípidos que, a largo plazo, acaba generando otras complicaciones como resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensión. Es por ello que las personas obesas tienen mayor riesgo de desarrollar ECV. El contenido graso de los alimentos ha demostrado ser una pieza clave en la determinación de una salud óptima en el individuo debido a su capacidad para influir sobre los factores de riesgo CV y de estar implicado directamente en el proceso aterosclerótico. Las intervenciones dietéticas han sido identificadas como una herramienta importante de prevención primaria y tratamientos secundarios. La adherencia a la dieta Mediterránea ha demostrado aportar beneficios cardioprotectores principalmente gracias a su elevada concentración de MUFA proporcionados por el aceite de oliva, su fuente de grasa mayoritaria. En la actualidad, podemos encontrar en la literatura científica estudios sobre las propiedades cardioprotectoras proporcionadas por dietas ricas en grasas insaturadas y de su capacidad para reducir la aterosclerosis. Sin embargo, pocos trabajos han sido realizados con la participación de personas obesas. En este contexto, proponemos que un desayuno tipo mediterráneo enriquecido en MUFA sería capaz de contribuir a mejorar el perfil lipídico postprandial y la respuesta inflamatoria presente en los sujetos obesos participantes del estudio, así como a reducir la formación de células espumosas durante las primeras fases del desarrollo de la aterosclerosis, con respecto a un desayuno de tipo occidental. HIPÓTESIS: En este contexto, proponemos la hipótesis de que un desayuno tipo mediterráneo enriquecido en MUFA contribuye a mejorar el perfil lipídico postprandial y la respuesta inflamatoria presente en los sujetos obesos participantes del estudio, así como a reducir la formación de células espumosas durante las primeras fases del desarrollo de la aterosclerosis, con respecto a un desayuno de tipo occidental. 299 OBJETIVOS: 1. Valorar la influencia de una carga lipídica sobre el metabolismo lipídico postprandial e inflamación vascular en adultos obesos frente a controles normopesos. 2. Determinar los efectos diferenciales de un desayuno de tipo mediterráneo frente a un desayuno de tipo occidental sobre el metabolismo lipídico postprandial en adultos obesos. 3. Determinar los efectos diferenciales de un desayuno de tipo mediterráneo frente a un desayuno de tipo occidental sobre la síntesis de marcadores de inflamación en sujetos obesos con respecto a sujetos normopesos. 4. Estudiar el efecto de las lipoproteína ricas en triglicéridos postprandiales aisladas de adultos obesos sobre la formación de células espumosas. 5. Analizar la capacidad del componente lipídico de las lipoproteínas ricas en triglicéricos para modular la actividad de la LPL en macrófagos. RESULTADOS: 1. La medición de los parámetros basales de los participantes del estudio confirmó que los sujetos obesos presentaban dislipidemia, así como niveles de glucosa e insulina significativamente superiores a los del grupo control, aunque no eran insulinorresistentes, ni presentaban hipertensión arterial. El consumo de los dos tipos de desayunos experimentales no alteró los niveles basales de colesterol total ni HDL-c durante el periodo postprandial analizado en ninguno de los dos grupos del estudio. En cambio, la concentración postprandial de TG sufrió un rápido incremento inmediatamente después de que los sujetos obesos consumieran las dos comidas, especialmente tras la ingesta del desayuno de tipo occidental. En ellos, la formación de nuevas partículas TRL también fue inmediata. Esta misma respuesta la experimentaron los individuos normopesos, aunque únicamente cuando consumieron el desayuno de tipo occidental. Estos resultados indican que el desayuno rico en MUFA favorece una respuesta lipídica postprandial más reducida en individuos obesos que las comidas ricas en SFA. Se observó que los individuos obesos tenían a su vez un retraso en el aclaramiento de las partículas TRL en comparación con los de peso normal, y que el consumo del desayuno rico en SFA requirió una síntesis significativamente mayor de insulina para que los sujetos obesos mantuvieran los niveles de glucosa. Por tanto, un consumo continuado de este tipo de comida podría contribuir a la resistencia a la insulina en los obesos. En cambio, en los individuos normopeosos, el consumo del desayuno rico en MUFA demostró ayudar a que fueran más sensibles a la insulina y mostraran un perfil lipídico menos aterogénico. 300 2. El perfil inflamatorio basal del grupo obeso reveló un estado inflamatorio crónico al compararse con el de los individuos normopeso, ya que los niveles basales de leptina, Cp, PCR y MCP-1 detectados en ayunas en el grupo obeso fueron significativamente superiores, aunque no hubo importantes diferencias en los niveles de adiponectia, TNF-α ni IL-1β entre ambos. Demostrada la capacidad de los AG para activar/reducir la respuesta inflamatoria y para modular la liberación de los mediadores de inflamación en circulación, se evaluó la capacidad de la comida experimental rica en MUFA para reducir el estado inflamatorio crónico establecido en los pacientes obesos. El consumo del desayuno de tipo mediterráneo tuvo el efecto cardioprotector esperado en las personas con peso normal, al inducir una menor liberación postprandial de Cp y MCP-1 y un incremento de los niveles totales postprandiales de adiponectina; mientras que el consumo del desayuno de tipo occidental colaboró a que presentaran un peor pefil inflamatorio, debido principalmente la reducción de los niveles de adiponectina en circulación. En el grupo de los obesos, en cambio, no observó una mejoría en la concentración postprandial de adiponecina, leptina y PCR con respecto a la basal tras el consumo del desayuno de tipo mediterráneo. Ello parece sugerir que sería necesaria una previa pérdida de peso para que los individuos obesos se vieran beneficiados de las propiedades anti-inflamatorias de una dieta rica en MUFA. 3. La caracterización de la composición de AG de las TRL aisladas en ayunas fue similar en los dos grupos, normopeso y obeso, mostrando el mismo perfil de aterogenicidad antes de comenzar los ensayos postprandiales. El consumo del aceite de oliva con el desayuno de tipo mediterráneo incrementó el contenido de MUFA en los TG de las nuevas TRL de ambos grupos experimentales, debido a una mayor incorporación de ácido oleico en las partículas principalmente. Por el contrario, la ingesta del desayuno de tipo occidental generó partículas más aterogénicas al incrementar su concentración de SFA. Se demostró, por tanto, que el perfil de AG de las nuevas partículas fue un reflejo de la composición lipídica de la fuente de grasa de la que procedían. No obstante, se observó una significativa incorporación de PUFA n-3 solo en las nuevas TRL aisladas de los sujetos normopeso después de consumir la comida de tipo occidental. Ello parecía sugerir que el consumo de una dieta rica en SFA por personas normopeso estimula la incorporación de PUFA endógenos en las nuevas TRL. La composición de AG de los FL extraídos de las partículas procedentes del grupo nomopeso no se vio alterada por el contenido lipídico de las comidas experimentales con respecto al perfil de AG en ayunas, mientras que en el grupo obeso sí se reflejó de nuevo la composición lipídica del desayuno ingerido. Estos resultados podrían indicar que en caso de padecer obesidad, el contenido graso de la dieta adquiere aún más importancia sobre la composición de AG de las TRL y, en consecuencia, sobre su perfil aterogénico, que si se tiene un peso corporal normal. 301 4. Tras incubar los cultivos de macrófagos con las TRL en ayunas y las aisladas a las 2 y 4 horas de ingerir las comidas experimentales, la caracterización de los AG de los TG intracelulares reveló que, de acuerdo con trabajos previos, las partículas procedentes de la hora 4 del periodo postprandial de ambos grupos fueron las captadas por las células más eficientemente, ya que el contenido lipídico intracelular reflejaba la composición de AG de las partículas. Con las TRL aisladas en ayunas en los sujetos obesos sucedió algo similar, indicando que también colaboran con la formación de células espumosas, aunque de forma más discreta que las TRL-4h. También se estudió con las imágenes tomadas al microscopio de los lípidos intracelulares, el tamaño de las gotículas lipídicas formadas en el interior de las células según la composición de las TRL. Las TRL4h procedentes de los sujetos normopesos derivadas del consumo del desayuno de tipo mediterráneo generaron células espumosas con una carga lipídica muy similar a las TRL-0h, mientras que las derivadas del consumo del desayuno de tipo occidental provocaron una mayor incorporación de lípidos por parte de los macrófagos. Las TRL-4h aisladas de los sujetos obesos, independientemente de cual fuera la fuente de grasa de la que derivasen, provocaron en ambos casos una exacerbada incorporación lipídica en los macrófagos. La caracterización de los AG intracelulares reveló que cuando los macrófagos se incubaron con las TRL derivadas de la ingesta del desayuno de tipo mediterráneo de los dos grupos, el contenido intracelular de SFA totales se redujo significativamente, pero no se incrementó la concentración de los MUFA; y la ingesta del desayuno de tipo occidental por el grupo obeso causó un importante incremento de los SFA intracelulares y redujo los MUFA, generando un perfil lipídico intracelular más aterogénico. Estos resultados indican que los alimentos ricos en SFA aumentan las propiedades aterogénicas de las TRL de las personas con obesidad, pero no en los individuos normopeso, mientras que el consumo de alimentos con alto contenido en MUFA mejoran el perfil lipídico intracelular solo de los individuos normopeso. 5. Las diferencias observadas en los lípidos intracelulares se relacionaron con las modificaciones en la expresión génica de los receptores de membrana. Se detectó que, coincidiendo con el momento en el cual las TRL aisladas del grupo normopeso son incorporadas más eficientemente y causan los mayores depósitos de lípidos intracelulares (4 horas tras la ingesta), los niveles de expresión de los receptores celulares son los más bajos. Además, el incremento intracelular de los MUFA tras la captación de las TRL aisladas después de consumir el desayuno de tipo mediterráneo provocó que se obtuvieran los menores niveles de ARNm de prácticamente todos los receptores celulares. De modo que el consumo del desayuno mediterráneo estaría proporcionando tanto a la población obesa como a la normopesa una actividad cardioprotectora al colaborar con la reducción de la formación 302 de células espumosas. En contra, se ha detectado el efecto perjudicial causado en las personas con obesidad cuando consumen el desayuno occidental, ya que éste parece potenciar la relación colaborativa LDLR-LRP1, además de inducir un incremento significativo de la expresión del receptor CD36 durante el periodo postprandial, no detectado en los sujetos normopeso, colaborando así a la formación de células espumosas. 6. El tratamiento de los cultivos de macrófagos con partículas CRLP compuestas por AG de distinto grado de saturación reveló que, a las 6 horas de incubación, momento en el que la LPL es más activa, fueron las CRLP-LLL las que causaron una mayor reducción de los niveles de actividad de LPL localizada en la superficie celular, y las CRLP-POP la menor. Estos resultados coinciden con la literatura científica, pues se ha establecido que los complejos formados entre ANGPTL4 y los AG son más fuertes con SFA, colaborando a mantener la actividad de LPL, y los más débiles con PUFA, reduciéndose por tanto su actividad. En cambio, a las 24 horas, la capacidad moduladora de la actividad catalítica de la enzima por parte de las diferentes partículas CRLP es muy similar, viéndose ésta reducida sin diferencias significativas entre los AG componentes de las partículas. Estos resultados coinciden con los niveles de actividad detectados en el medio de cultivo y en el espacio intracelular, siendo el control de la actividad de LPL en esta última fracción atribuido a la acción moduladora de los AG sobre PPARs, y no ANGPTL4. La cuantificación de la abundacia relativa de ARNm LPL y ANGPTL4 mostró que el contenido de PUFA y MUFA de las CRLP causó una importante reducción en los niveles de expresión de LPL y una sobreexpresión de ANGPTL4, siendo este efecto más acusado cuando los macrófagos fueron tratados con CRLP-LLL. Estos resultados apoyan la función protectora de MUFA y PUFA ante la formación de células espumosas, al contribuir a reducir la interacción entre TRL y los receptores celulares mediante la reducción de la actividad de la LPL. En cambio, en contenido de SFA en las CRLP parece ayudar a mantener la actividad de LPL de macrófagos, estimulando la acumulación de lípidos en el interior de las células. CONCLUSIÓN: En general, los resultados obtenidos permiten concluir que el consumo de un desayuno de tipo mediterráneo ayuda a reducir la respuesta lipidémica postprandial en las personas obesas, y contribuye a una menor formación de células espumosas mediante la reducción de los niveles de expresión de los receptores celulares, así como la actividad de la LPL. No obstante, para que la respuesta inflamatoria establecida en la obesidad se reduzca por la ingesta de una dieta rica en MUFA, sería necesario que éstos individuos perdieran previamente peso corporal. 303