Contribución de un desayuno de tipo mediterráneo a la prevención del desarrollo de aterosclerosis en individuos obesos

“Con ibución de un desayuno de ipo medi e áneo a la p e ención del desa ollo de a e oscle osis en indi iduos obesos.” Tesis doc o al ealizada po : Lau a Sinausía Nie a Bajo la di ección de: D . Ja ie Sánchez Pe ona Se illa, 2017 ► INTRODUCCIÓN........................................................................................................1 1. La a e oescle osis y el ca ác e a e ogénico de las lipop o eínas icas en iglicé idos.......................................................................................................................... 2 1.1 La a e oescle osis...............................................................................................2 1.2 Las lipop o eínas................................................................................................7 -Tipos de lipop o eínas y sus ca ac e ís icas -Componen es lipídicos de las lipop o eínas -Componen es p o eicos de las lipop o eínas las apolipop o eínas 1.3 Las lipop o eínas icas en iglicéidos..............................................................17 -Los quilomic ones -Lipop o eínas de muy baja densidad (VLDL) 1.4 Vías de inco po ación de TRL po los mac ó agos..........................................28 -Endoci osis mediada po ecep o es de sue icie dependen es de Apo E:LDLR, VLDLR, LRP-1 -Endoci os mediada po ecep o es de supe icie independien es de Apo E:SRA2, SRB1, CD36 1.5 P opiedades a e ogénicas de las pa ículas TRL...............................................33 Las TRL en el pe iodo pos p andial 2. Obesidad como ac o de iesgo de en e medades ca dio ascula es.........................38 2.1 La obesidad. Un p oblema de salud pública....................................................38 2.2 La pa o isiología de la obesidad.......................................................................39 -Obesidad y la eis encia a la insulina -Obesidad y el sínd ome me abólico 2.3 La in lamación c ónica en la obesidad y sínd ome me abólico.......................42 2.4 Ma cado es de in lamación como p edic o es de iesgo ca dio ascula en la obesidad….............................................................................43 -La sensibilidad a la insulina como bioma cado de in lamación -Ci oquinas y adipoquinas como bioma cado es de in lamación 3. La die a como el p ime ac o de in e ención pa a la p e ención y a amien o de las en e medades ca dio ascula es (ECV)............................................ 50 3.1 La die a Medi e ánea.......................................................................................51 -El ca ác e ca diop o ec o de la die a medi e ánea 3.2 El acei e de oli a..............................................................................................55 -Composición del acei e de oli a -El acei e de oli a como elemen o cla e del ca ác e ca diop o ec o de la die a medi e ánea ► HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................................ 73 ► MATERIALES Y MÉTODOS..........................................................................................77 1. Es udio de la espues a lipídica pos p andial en sue o as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y un desayuno de ipo occiden al en adul os obesos..............................................................................................78 1.1 Selección y ca ac e ís icas de los pa icipan es del es udio.............................79 1.2 Diseño expe imen al de la in e ención die é ica............................................80 1.3 Ensayo pos p andial.........................................................................................81 1.4 De e minaciones bioquímicas y es udio del pe il lipídico basal y pos p andial en sue o..............................................................................................84 2. Es udio del pe il de ma cado es de in lamación pos p andiales en sue o de adul os obesos y no mopesos as la inges a de los desayunos expe imen ales...................................................................................................................85 2.1 Medición de los ni eles de adipoquinas y ci oquinas en sue o...................................86 3. Ca ac e ización de las lipop o eínas icas en iglicé idos pos p andiales............. 91 3.1 Aislamien o de las lipop o eínas icas en iglicé idos de sue o.......................92 3.2 Ca ac e ización de la composición de las lipop o eínas icas en iglicé idos.............................................................................................…..........92 3.3 Ca ac e ización de la composición p o eica en las lipop o eínas icas en iglicé idos............................................................................................ ….....96 4. Es udio de la in luencia de las lipop o einas icas en iglicé idos pos p andiales en la o mación de células espumosas..................................................98 4.1 Cul i os celula es de monoci os THP-1 y di e enciación a mac ó agos........100 4.2 Es udio de la acumulación lipídica en mac ó agos........................................101 4.3 Es udio de los ni eles de exp esión de los ecep o es celula es de supe icie implicados en los p ocesos de cap ación de las lipop o eínas icas en iglicé idos en macó agos......................................................................103 5. Es udio de la capacidad del componen e lipídico de las lipop o eínas icas en iglicé idos pa a modula la ac i idad de la lipop o eín lipasa de mac ó agos............................................................................................... …..............111 5.1 P ocedimien o expe imen al...........................................................................111 5.2 P epa ación de las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP)............ 112 5.3 P epa ación de sue o d<1.020 de icien e.......................................................113 5.4 Cuan i icación de los iglicé idos inco po ados en las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP)...................................................................114 5.5 Ensayo de medición de la ac i idad de la LPL..............................................115 5.6 Cuan i icación de la acumulación lipídica en mac ó agos.............................115 5.7 Cuan i icación de la p o eína o al celula ......................................................115 5.8 Análisis de exp esión génica de LPL y ANGPTL4........................................116 6. Análisis es adís ico.......................................................................................................117 ► RESULTADOS............................................................................................ …................118 1. Es udio de la espues a lipídica pos p andial en sue o as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y un desayuno de ipo occiden al en adul os obesos y no mopesos....................................................................................119 1.1 Es udio del pe íl lipídico y bioquímico basal en sue o.................................119 1.2 Es udio del pe íl lipídico y bioquímico pos p andial en sue o.....................122 2. Es udio del pe il de ma cado es de in lamación basal y pos p andial en sue o de adul os obesos y no mopesos as la inges a de los desayunos expe imen ales............................................................................................ …................136 2.1 Concen ación basal en sue o de los ma cado es de in lamación..................136 2.2 Concen ación pos p andial en sue o de los ma cado es de in lamación............................................................................................ ….........138 3. Ca ac e ización de los ácidos g asos componen es de las lipop o eínas icas en iglicé idos aisladas de adul os obesos y no mopesos, an es y as la inges a de los desayunos expe imen ales............................................................153 3.1 Es udio de la composición de ácidos g asos de los iglicé idos y os olípidos ex aídos de las lipop o eínas icas en iglicé idos aisladas de los pa icipan es no mopesos.............................................................155 3.2 Es udio de la composición de ácidos g asos de los iglicé idos y os olípidos ex aídos de las lipop o eínas icas en iglicé idos aisladas de los pa icipan es obesos.....................................................................160 4. In luencia de las lipop o einas icas en iglicé idos pos p andiales en la o mación de células espumosas y ca ac e ización del pe il lipídico in acelula de mac ó agos as la inco po ación de las pa ículas..........................165 4.1 Es udio de la acumulación lipídica en mac ó agos median e inción con acei e ojo O..................................................................................................165 4.2 Ca ac e ización de los ácidos g asos componen es de los iglicé idos inco po ados en el in e io de los mac ó agos as su incubación con las lipop o eínas icas en igicé idos p oceden es de los suje os no mopesos.........170 4.3 Ca ac e ización de los ácidos g asos componen es de los iglicé idos inco po ados en el in e io de los mac ó agos as su incubación con las lipop o eínas icas en igicé idos p oceden es de los suje os obesos..................173 5. Es udio de la exp esión génica de los ecep o es celula es de supe icie implicados en los p ocesos de cap ación de las lipop o eínas icas en iglicé idos po mac ó agos...........................................................................................176 5.1 Modulación de los ni eles de exp esión de los ecep o es celula es dependien es de apo E: LDLR. VLDLR y LRP-1................................................176 5.2 Modulación de los ni eles de exp esión de los ecep o es celula es independien es de apo E ( ecep o es Sca enge ): SRA2, SRB1 y CD36............180 6. Es udio de la capacidad del componen e lipídico de las lipop o eínas icas en iglicé idos pa a modula la ac i idad de la lipop o eín lipasa de mac ó agos ............................................................................................................... 185 6.1 Modulación de la ac i idad de la LPL de mac ó agos po las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP) con dis in a composición lipídica.............185 6.2 Modulación de los ni eles de exp esión de los genes LPL y ANGPTL4 po pa e del componen e lipídico de las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP).........................................................................................188 6.3 Es udio de la acumulación lipídica en mac ó agos incubados con las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP) con di e en e composición lipídica .................................................................................................................189 ► DISCUSIÓN ......................................................................................................................191 ► CONCLUSIONES..............................................................................................................246 ►REFERENCIAS..................................................................................................................249 ► ANEXO.................................................................................................................................298 Resumen ejecu i o......................................................................................................299 INTRODUCCIÓN 1 1. LA ATEROESCLEROSIS Y EL CARÁCTER ATEROGÉNICO DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS 1.1 La a e oscle osis a O ganización Mundial de la Salud (OMS) de ine la en e medad ca dio ascula (ECV) como un g upo de desó denes del co azón y asos sanguíneos que incluyen las siguien es en e medades: co ona ia, ce eb o ascula , a e ial pe i é ica, ca diopa ía eumá ica, ca diopa ías congéni as, y ombosis enosa y embolia pulmona , siendo las mani es aciones clínicas más comunes el in a o de mioca dio y de ame ce eb al. En la mayo ía de los casos, la causa subyacen e de la ECV es la a e oscle osis. La a e oscle osis es un é mino gene al empleado pa a hace e e encia a un es ado de in lamación c ónica que a ec a a las g andes a e ias, p incipalmen e la ao a y las co ona ias, ca ó idas, ilíacas y emo ales. Se ca ac e iza po el eng osamien o de la pa ed a e ial debido al aumen o del espeso del á ea de la ín ima, y endu ecimien o y pé dida de elas icidad de las a e ias. Es os enómenos son debidos a la o mación de una placa cons uida en su in e io , cons i uida po lípidos, es os celula es, calcio y elemen os ib osos (Ame ican Hea Associa ion). En los años 60 y a p incipios de los 70, los e en os clínicos desencadenados po ECV alcanza on ci as his ó icas en los países desa ollados [1], y aunque desde en onces la mo alidad po ECV se es á educiendo, aún sigue siendo la p incipal causa de mue e en los países desa ollados y en ías de desa ollo [2, 3]. Según da os de la O ganización Mundial de la Salud, se calcula que en el año 2012 mu ie on 17.5 millones de pe sonas a consecuencia de ECV, lo que ep esen a un 31% de odas las mue es a ni el mundial, siendo de ellas el 80% a consecuencia del desa ollo de a e oscle osis. Es a en e medad es len a y p og esi a, y cu sa asin omá icamen e en la mayo ía de los casos, has a que los e en os clínicos que desencadena pueden pone en iesgo la ida del indi iduo. Exis en e idencias del posible comienzo de la lesión incluso a edad emp ana, al y como desc ibie on los abajos ealizados po Holman de au opsias en niños no eame icanos de has a 3 años, donde encon ó algunas ao as que p esen aban es ías g asas [4]. Es e p oceso es conside ado e e sible, pe o con el paso de los años la acumulación de lípidos en las a e ias se inc emen a, pudiéndose p esen a las p ime as lesiones ib osas en la adolescencia. En los años siguien es, es as placas aumen an de amaño y su en modi icaciones que empeo an la lesión, has a que la ulce ación de la placa, su o u a y ombosis p ecipi a el e en o clínico [5]. En algunas pe sonas, la en e medad p og esa ápidamen e, mani es ando los p ime os sín omas a los 30 años. En cambio, 2 L en o as pe sonas es a si uación no llega a se pelig osa has a que alcanzan los 50 o 60 años (Ame ican Hea Associa ion). 1.1.1 Fases del desa ollo del p oceso a e ogénico. Las dis in as ases c onológicas del p oceso de a e ogénesis se de allan a con inuación: 1. Inicio de la lesión. Dis unción endo elial y eclu amien o de células inmunes. El e en o que desencadena el desa ollo de la a e oscle osis es la p esencia de ele ados ni eles de lipop o eínas plasmá icas y su consiguien e acumulación en la ma iz subendo elial de las a e ias. El endo elio ascula es un impo an e egulado de la homeos asis ascula y, con sus uniones in e celula es complejas, unciona como una ba e a pe meable selec i a en e la sang e y los ejidos [6], además de con ola el ono ascula , in lamación y p e eni la o mación de ombos [7]. En egiones suscep ibles de desa olla a e oscle osis, las células endo eliales p esen an una ina capa de glicocalix y un alineamien o deso denado [8], mayo senescencia celula y apop osis [9]. Además, exis e una exp esión educida de la óxido ní ico sin asa endo elial (eNOS) y supe óxido dismu asa (SOD), las cuales p omue en la mig ación de células endo eliales y supe i encia celula , y educen el es és oxida i o celula , espec i amen e [10, 11]. Debido a es as ci cuns ancias, la in eg idad de la ba e a endo elial se e comp ome ida en es as egiones, pe mi iendo que las lipop o eínas a e ogénicas di undan pasi amen e a a és de las uniones de las células endo eliales. De es a mane a, las lipop o eínas se acumulan y quedan e enidas en la capa ín ima a a és de in e acciones que se es ablecen en e las células endo eliales y la apolipop o eína B (apo B) con enida en las lipop o eínas a e ogénicas [12]. Los p o eoglicanos unidos a la memb ana celula de las células endo eliales ambién pueden ac ua como ecep o es endocí icos, acili ando la cap ación de a ios ligandos y me aboli os, en e ellos las lipop o eínas, con ibuyendo en su e ención [13]. Es e enómeno p o oca la dis unción/ac i ación del endo elio, con ca ac e ís icas p o ombó icas y p oin lama o ias [14]. Las células endo eliales ac i adas inc emen an la exp esión de p o eínas de adhe encia de monoci os: moléculas de adhesión in e celula - 1 (ICAM-1), moléculas de adhesión ascula -1 (VCAM-1), P-selec ina; ecep o es p oin lama o ios ( ecep o oll-like 2, TRL2) y ci oquinas (MCP-1 y IL8) [15]. Además, la ac i ación de las células endo eliales conlle a una mayo p oducción de especies eac i as de oxígeno ( eac i e oxigen species, ROS) [16] que pueden causa modi icaciones po oxidación de lipop o eínas que con ienen 3 ob enidas en el momen o en el cual el amaño de pa ícula es in e medio, con un amaño medio de 195.1 nm [34]. De mayo a meno amaño se dis inguen los siguien es 5 g upos: Quilomic ones (QM); VLDL o lipop o eínas de muy baja densidad (Ve y Low Densi y Lipop o eins), IDL o lipop o eínas de densidad in e media (In e media e Densi y Lipop o eins), LDL o lipop o eínas de baja densidad (Low Densi y Lipop o eins) y HDL o lipop o eínas de al a densidad (High Densi y Lipop o eins). Es as úl imas se subdi iden a su ez en dos sub ipos con dis in a densidad, HDL2 y HDL3 [32]. En los úl imos años, se ha comenzado a iden i ica o a lipop o eína, la Lp (a), como un ac o de iesgo independien e pa a e en os a e o ombogénicos en múl iples es udios [35]. Es a lipop o eína consis e en una pa ícula de LDL en la cual apo B100 es á co alen emen e unida ía puen e disul i o a apo A, una glicop o eína con unidades epe idas de K ingle que compa e homología con el plasminógeno. Aunque apo A es sin e izada po el hígado, las pa ículas de Lp (a) no son o madas en el hígado sino en el plasma. A pesa de se una pa ícula modi icada de LDL, los ni eles de Lp (a) son independien es de los de LDL, y aunque su ca abolismo aún no es á del odo cla o, no es cap ada po el ecep o LDLR [36]. Tabla 1. Ca ac e ís icas p incipales de las dis in as clases de lipop o eínas humanas [37]. Lipop o eína Densidad (g/ml) Peso molecula (106 Da) Diáme o (nm) Lípido mayo i a io Apolipop o eínas p incipales* Quilomic ón < 0.95 >150 75-1200 TG B48, A, C, E* VLDL 0.95-1.006 5-130 30-80 TG B100, A,C, E IDL 1.006-1.019 4 25-35 TG / Coles e ol B100, C, E LDL 1.019-1.063 3 18-25 Coles e ol B100 HDL 1.063-1.210 0.3 5-12 FL/ Coles e ol A, C, E Lp (a) 1.055-1.120 5.5 25 Coles e ol (a), B100 *La composición apop o eica a ía según el g ado de madu ación de la lipop o eína y de la subespecie especí ica. 10 1.2.2 Componen es lipídicos de las lipop o eínas El con enido y composición lipídica de los di e en es ipos de lipop o eínas se mues an en la igu a 3. Los glice olípidos, p incipalmen e TG, son los componen es lipídicos mayo i a ios de los QM y VLDL, mien as que cons i uyen an solo el 4% de los lípidos con enidos en LDL y HDL, que es án po el con a io en iquecidos en és e es de coles e ol (15-41%). En odas las clases de lipop o eínas hay moléculas de coles e ol no es e i icado, aunque se encuen an en p opo ciones ela i amen e bajas. Es o es debido a que es ac i amen e es e i icado po el enzima LCAT en HDL y pos e io men e edis ibuido en e las LDL y VLDL a a és de la p o eína de ans e encia de és e es de coles e ol. El con enido o al de FL de las lipop o eínas aumen a con el inc emen o de la densidad. Además, es á di ec amen e elacionado con el á ea de supe icie de las pa ículas de lipop o eínas, ya que la supe icie de las lipop o eínas es á cubie a po una monocapa de FL y apolipop o eínas. 11 Figu a 3. Con enido y composición lipídica y p o eica (%) de los di e en es ipos de lipop o eínas Da os ex aídos de FEPREVA [38] TG: iglicé idos; CE: és e es de coles e ol; CL: coles e ol; FL: os olípidos; P: p o eínas; QM: quilomic ón; VLDL: lipop o eína de muy baja densidad; LDL: lipop o eína de baja densidad; IDL: lipop o eína de densidad in e media; HDL: lipop o eína de al a densidad; Lp (a): Lipop o eína a. 12 TG 54 CE 13 CL 7 P 10 FL 16 VLDL TG 20 CE 34 CL 9 P 17 FL 20 IDL TG 4 CE 41 CL 11 P 23 FL 21 LDL TG 4 CE 15 CL 3 P 60 FL 28 HDL TG 3 CE 36 CL 9 P 34 FL 18 Lp(a) TG 90 CE 2 CL 1 P 2 FL 5 QM 1.2.3. Componen es p o eicos de las lipop o eínas: las apolipop o eínas Las apolipop o eínas egulan el me abolismo de las lipop o eínas y de e minan su unción en el me abolismo lipídico. Se si úan p e e en emen e hacia el ex e io de las lipop o eínas aunque pueden inclui pa e de su es uc u a en el núcleo hid o óbico. Cuando es o ocu e, los aminoácidos ambién se disponen según su pola idad den o de la es uc u a lipop o eica, o ien ándose los más pola es hacia el ex e io de la pa ícula, a di e encia de aquellos más apola es que lo ha án hacia el in e io [39]. La unción común de odas las apolipop o eínas es ayuda a solubiliza lípidos en la ci culación, pa a anspo a los y edis ibui los en e a ios ejidos. En las condiciones ap opiadas, las apolipop o eínas pueden o ma pa ículas de o ma espon ánea con los FL, pe o pa a el ensamblaje in i o de las apolipop o eínas con los lípidos se equie e la asis encia de p o eínas celula es como la p o eína de ans e encia mic osomal (MTP) de lípidos o el anspo ado ABC1 [31]. Además, las apolipop o eínas pa icipan en el man enimien o de la es uc u a de la pa ícula de las lipop o eínas, ya que ienen la capacidad de cambia la con o mación de las pa ículas y ajus a su con enido lipídico, composición y es ado me abólico [31]. Las apolipop o eínas que se encuen an en el plasma se clasi ican en 2 g upos: no ans e ibles y ans e ibles o solubles. Las apolipop o eínas no ans e ibles (apo B-100 y apo B-48) son p o eínas muy g andes e insolubles en agua que son ensambladas con lípidos en su luga de sín esis y ci culan unidas a la misma pa ícula de lipop o eína a a és de a ias ans o maciones me abólicas en el plasma, has a que son e i adas de la ci culación como lipop o eínas po la acción de los ecep o es especí icos. Po el con a io, las p o eínas ans e ibles (apo E, apo A1, apo A2, y apo C), ienen una masa molecula meno que las apolipop o eínas no ans e ibles, son más o menos solubles en agua en su es ado deslipidado, pueden ans e i se en e pa ículas de lipop o eínas, y adqui i lípidos mien as se encuen en en ci culación [31]. Algunas de las apolipop o eínas ans e ibles, en sus co espondien es lipop o eínas, ac úan como ac i ado es o inhibido es de impo an es enzimas plasmá icas implicadas en el me abolismo lipídico, como la LCAT, HL y la LPL [31]. 13 Las apolipop o eínas ienen ambién una impo an e unción en el econocimien o po ecep o es de memb ana. Es e e en o es impo an e pa a la libe ación de lípidos a células especí icas, ya que implica el econocimien o de apolipop o eínas especí icas po los ecep o es de la supe icie celula . La in e acción mejo ca ac e izada es la es ablecida en e el ecep o LDL (LDLR) y las lipop o eínas que con ienen apo B-100 y apo E [31]. Las apolipop o eínas más ep esen a i as de las TRL son: -Apolipop o eína E La apolipop o eína E (apo E) es uno de los componen es p o eicos de los QM, QM emanen es (QM ), VLDL y HDL, incluída en el g upo de las apolip o eínas ans e ibles. El hígado es el p incipal esponsable de la p oducción de la apo E plasmá ica, aunque los mac ó agos ambién son esponsables de p oduci el 5-10% de apo E plasmá ica [40]. Exis en seis eno ipos de apo E: es eno ipos homozigo os (E4/4, E3/3, E2/2) y es he e ozigo os (E4/3, E4/2, y E3/2), siendo el eno ipo más común en la población humana el E3/3 [41]. La apo E es una de las apolipop o eínas más es udiadas po sus nume osas unciones, en e ellas, des aca su papel p o ec o en e a la a e oscle osis. Son a ios los mecanismos a a és de los cuales ayuda a educi la a e oscle osis: a) educe la p oli e ación e in il ación de mac ó agos en la ín ima median e su exp esión po células hema opoié icas [42]; b) educe la acumulación lisomal de coles e ol ya que su p esencia en las lipop o eínas que con ienen ApoB es imula la exp esión de la lipasa ácida [43]; y c) la sec eción de apo E po mac ó ago es imula la salida de coles e ol an o en p esencia como ausencia de acep o es exógenos como HDL [44]. Es a apolipop o eína cons i uye el componen e p o eico mayo i a io de lipop o eínas en iquecidas en coles e ol que pa icipan en el anspo e y me abolismo del coles e ol, como las HDL, lipop o eínas an i-a e ogénicas enca gadas del anspo e del coles e ol deposi ado en los ejidos pe i é icos al hígado pa a su eliminación del cue po [45];y de las pa ículas emanen es de VLDL, en iquecidas ela i amen e en coles e ol po la pé dida de los TG debido a la acción hid olí ica de la LPL. Además, la apo E desempeña un impo an e papel en la ápida eliminación de las lipop o eínas plasmá icas que con ienen apo B po el hígado, excep o de LDL, ya que ac úa de ligando de es as pa ículas con ecep o es de supe icie celula en ejidos hepá icos y ex ahepá icos: LDLR y LRP. Del mismo modo, la apo E ambién es impo an e como molécula de unión a la supe icie endo elial y cap ación de aquellas lipop o eínas en iquecidas en apo E median e su in e acción con moléculas de hepa án sul a o p o eoglicanos p esen es en la supe icie 14 celula [46, 47]. Va ios abajos de in es igación en los que han empleado como modelo de es udio a ones mu an es que no exp esan apo E pa a analiza los mecanismos del desa ollo de la a e oscle osis, han demos ado que una de iciencia de es a apolipop o eína gene a hipe coles e olemia y el desa ollo espon áneno de lesiones a e oscle ó icas [48]. -Apolipop o eína B La apolipop o eína B (apo B) exis e en dos iso o mas: apo B-48 y apo B-100. Ambas son codi icadas po el mismo gen, pe o se exp esan di e en e, en el en e oci o la p ime a, y en el hígado la segunda. La apo B-48 debe su nomb e a que solo exp esa el 48% de la longi ud de la p o eína apo B- 100. Ello es debido a una enzima edi o a de la apo B, únicamen e ac i a en las células in es inales humanas, que in oduce una modi icación pos - ansc ipcional a a és de la cual se in oduce una señal de in de sín esis p ema u a, gene ando un pép ido de meno amaño, la apo B-48. [32]. La apo B-100 es sin e izada en el hígado. En es e luga no se encuen a la enzima edi o a, po lo que la apolipop o eína se exp esa po comple o. La apo B-100 se encuen a en las VLDL y en las lipop o eínas que se sin e izan de su ca abolismo:IDL y LDL [49]. Po el con a io, la apo B-48 se sin e iza en el in es ino y se encuen a únicamen e en los QM y QM [50] siendo un ma cado p o eico especí ico de es e ipo de lipop o eínas [32]. Pues o que la apo B iene una impo an e unción es uc u al, no se ans ie e en e lipop o eínas. La apo B-100 es la p o eína de e minan e pa a el econocimien o y cap ación de LDL po los ecep o es LDL (LDLR) de supe icie celula , an o en ejidos hepá icos como ex ahepá icos. La apo B-48 ca ece de la secuencia de econocimien o localizada en el ex emo C- e minal de la apo B que in e acciona con LDLR y, po lo an o, no puede media di ec amen e la cap ación de lipop o eínas a a és de LDLR [51]. Sin emba go, las lipop o eínas que con ienen apo B-48 p esen an un ele ado con enido de apo E, la cual ac úa como ligando pa a la cap ación de emanen es de VLDL y QM po los ecep o es LDLR y LRP [51]. La apo B-48 ambién es econocida po el ecep o apo B-48 (p o eínas de unión de memb ana, MBP 200 y 235) exp esado en la supe icie celula de monoci os/mac ó agos, que cons i uyen una ía independien e de apo E y LPL, pa icipando ambién en la o mación de células espumosas [52]. 15 Ensayos con an icue pos monoclonales han demos ado que po cada lipop o eína hay una sola molécula de apo B [53]. Es a ca ac e ís ica posibili a la iden i icación de suje os que se encuen en en iesgo de desa olla ECV ya que la cuan i icación median e écnicas inmunológicas de los ni eles de apo B en plasma pe mi e conoce los ni eles de lipop o eínas a e ogénicas (QM, VLDL, LDL) en ci culación. Además, el hecho de que haya una única molécula de apo B po pa ícula ambién hace posible cuan i ica el a io TG/apo B en sue o, el cual puede se empleado pa a es ima el amaño de pa ícula [54]. -Apolipop o eínas C La amilia de las apolipop o eínas C (apo Cs) es á compues a po es apolipop o eínas de bajo peso molecula (6,6-8,8 kD), denominadas apo C-I, C-II, C-III, y son ans e ibles en e lipop o eínas. El hígado es el mayo luga de sín esis de las apo Cs, aunque el in es ino ambién con ibuye pe o en una meno p opo ción [55]. Du an e el pe iodo de ayuno, las apo Cs se encuen an p incipalmen e asociadas con HDL. En cambio, du an e la abso ción de las g asas po el in es ino as la inges a de las comidas, con la p oducción de QM, o du an e la sín esis ac i a de VLDL po el hígado, las apo Cs se edis ibuyen p e e en emen e en la supe icie de es as pa ículas icas en iglicé idos: QM y VLDL. Sin emba go, a medida que el núcleo ico en TG de las VLDL y QM es hid olizado y eliminado po acción de la LPL, se gene a un exceso de componen es de supe icie (FL, coles e ol no-es e i icado, y apolipop o eínas) y las apo Cs, jun o con o os componen es de supe icie, son ans e idos a las pa ículas de HDL. De modo que las apo CS es án en equilib io con el me abolismo dinámico de “ emodelado” de las lipop o eínas plasmá icas. La apo C-I, al igual que apo C-II y C-III, ha demos ado ac ua como ac i ado del enzima LCAT, po lo que las es apo Cs pa icipan en la es e i icación del coles e ol ans e ido a HDL [56] y en el “ emodelado” de HDL. La p incipal unción me abólica de apo C-II es á asociada con su capacidad pa a ac ua como un co ac o en la ac i ación de la LPL [57]. Pacien es con una de iciencia en apo C-II p esen an una hipe iglice idemia se e a y un acla amien o plasmá ico al e ado de VLDL y QM, incluso en p esencia de una lipasa uncional [58]. La apo C-III es la p o eína más abundan e de es e g upo de apolipop o eínas. Se ha suge ido que su p esencia puede modula la in e nalización de esiduos de TRL a a és de ecep o es 16 hepá icos [59], y su capacidad pa a inhibi la cap ación hepá ica de TRL y de inhibi las unciones de la LPL y HL ha sido demos ada. Además, se ha demos ado que la apo C-III es á implicada en la o ganización de la pa ícula de HDL, y su ausencia puede esul a en una de iciencia de HDLs, conduciendo al desa ollo de una a e oscle osis se e a [60, 61]. -Apolipop o einas A La apolipop o eína A (apo A-I) ci cula en el plasma p incipalmen e como componen e de HDL. También es á p esen e en QM, aunque es di icil encon a la en can idades signi ica i as en QM , VLDL ,VLDL emanen es, o LDL. Los dos luga es donde se sin e iza p incipalmen e son el in es ino y el hígado, y no su e niguna modi icación pos aduccional como glicosilación o os o ilación. La apo A-I de i ada del in es ino en a en ci culación asociada a QM pe o es ápidamen e ans e ida a las pa ículas HDL du an e la hid ólisis ca alizada po la LPL de los QM. La apo A-I hepá ica en a en ci culación como HDL nacien e con muy poco o ningún con enido de és e es de coles e ol. Además de se un impo an e componen e es uc u al de las pa ículas de HDL a las que p opo ciona es abilidad e modinámica y uncionalidad isiológica en a ios es adios de su madu ación, la apo A-I iene o as unciones ales como se i de co ac o (ac i ado ) de LCAT. Ha sido demos ado in i o que su p esencia es eque ida pa a la ac i idad de dicha enzima [62], po lo que desempeña una impo an e unción en la mobilización del exceso de coles e ol de las células que no pueden me aboliza lo o dispone de él. La apolipop o eína A-II (apo A-II) es la segunda apolipop o eína más abundan e en HDL, y puede es a asociada a o as lipop o eínas aunque en meno can idad. El p incipal luga de sín esis es el hígado. Es sabido que la apo A-II es capaz de desplaza po comple o a la apo A-I de HDL. Excep o po su p esencia como componen e es uc u al de HDL, se desconoce si la apo A-II iene una unción es uc u al especí ica en HDL o en su me abolismo [63]. La apolipop o eína A-IV (apo A-IV) se a a de un componen e de las nue as pa iculas sec e adas de QM, pe o no se encuen a en QM , VLDL o LDL. A di e encia de o as apolipop o eínas, la mayo ía de la apo A-IV se encuen a lib e en el plasma más que unida a lipop o eínas, y se edis ibuye ápidamen e en e es as dos acciones. La apo A-IV se sin e iza casi exclusi amen e po el hígado e in es ino. En cuan o a sus unciones, se ha demos ado in i o que ambién es un po en e ac i ado de LCAT [63]. 17 1.3 Las lipop o eínas icas en iglicé idos (TRL) Las TRL pueden de i a an o de la ía exógena (cons i uidas a pa i de los lípidos abso bidos de los alimen os) como la endógena ( o madas a pa i de lípidos almacenados). Mien as que odas las lipop o eínas anspo an TG, las TRL son conside ablemen e más icas en TG que las demás [64]. Las TRL son una mezcla he e ogénea de lipop o eínas que incluye QM, QM , VLDL y VLDL emanen es o IDL. Debido al conside able solapamien o de las densidades de es as lipop o eínas, el aislamien o de las di e en es clases desde el plasma humano posp andial es casi imposible. Así, la acción de TRL ha sido ampliamen e u ilizada pa a el es udio del e ec o de los lípidos que se ingie en con los alimen os sob e las en e medades ca dio ascula es [65]. 1.3.1 Los quilomic ones (QM) La p incipal unción de los QM es pe mi i que los lípidos con enidos en los alimen os inge idos y abso bidos po el in es ino, sean anspo ados po el o en e sanguíneo, y alcancen los ejidos pe i é icos pa a la p oducción y almacenamien o de ene gía, o biosín eis de o as moléculas. Los QM cons i uyen las pa ículas lipop o eicas más g andes (diáme o 75-1200 nm) y menos densas (d<0.95 g/ml), con un g an componen e lipídico muy en iquecido en iglicé idos (>90%). Con ienen en su es uc u a di e sas apolipop o eínas, incluyendo apo B-48, apo A-1, apo C-II, apo C-III, y apo E [32]. El amaño de los QM depende del lujo de TG a a és de los en e oci os. Du an e la abso ción de lípidos las pa ículas son mayo es en diáme o [66, 67] en compa ación con el pe íodo de ayunas, du an e el cual p edomina án las pa ículas de meno amaño p oducidas po las células del in es ino [67]. 1.3.1.1 Me abolismo de los quilomic ones a) Abso ción de los lípidos La mayo ía de los lípidos que son inge idos en la die a lo son en o ma de TG, que cons i uyen más del 90% de la inges a dia ia de lípidos. El es o es á o mado po FL, coles e ol, EC, ácidos g asos (AG) lib es y i aminas liposolubles A, D, E y K. 18 La e iciencia de abso ción de las g asas es muy ele ada. Bajo condiciones no males, p ác icamen e el o al de las g asas inge idas es abso bida, y menos de un 5% es expulsado con las heces. Los lípidos su en p e iamen e un p oceso de hid olización an es de pode se abso bidos po nues o o ganismo, y es e p oceso p incipalmen e iene luga en el es ómago y la pa e p oximal del in es ino delgado. La diges ión y abso ción de los lípidos con enidos en los alimen os implica la unción coo dinada de a ios ó ganos, comenzando en la boca. Al in oduci los alimen os en la boca, la lipasa lingual inicia la hid ólisis de los TG, aunque los ni eles de diges ión son mínimos. Los AG libe ados de esa p ime a hid ólisis es imulan la sec eción de bilis y jugos panc eá icos. Pos e io men e pasan al es ómago, donde los lípidos son emulsionados y su en una diges ión pa cial po lipasas diges i as an es de se ans e idos al duodeno y abso bidos a a és del epi elio in es inal. La diges ión de los lípidos que comienza en el es ómago equie e la implicación de a ias lipasas ácidas, siendo la lipasa panc eá ica la p incipal, la cual iene p e e encia po los AG de cadena media (6-12 á omos de ca bono), p oduciendo de su ac i idad AG lib es y β- monoacilglicé idos. El jugo panc éa ico con iene ambién lipasas es e asas que ac úan sob e TG con AG de cadena co a, EC, y monoglicé idos, sin necesidad de que haya sales bilia es p esen es. Los FL son hid olizados po os olipasas especí icas, especialmen e po la os olipasa A2. El a io de abso ción de AG depende de su longi ud de cadena. Los AG de cadena co a (<6 á omos de ca bono) se compo an como simples ca bohid a os; y los AG de cadena media son ápidamen e abso bidos y anspo ados median e su unión a albúmina di ec amen e al hígado po la ena po al sin se modi icados. Debido al poco iempo necesa io pa a se abso bidos po el in es ino, los AG de cadena media son empleados como uen e de ene gía inmedia a sin se almacenados en el ejido adiposo, aunque p opo cionan meno ene gía que los AG de cadena la ga (>de 12 á omos de ca bono ). En el duodeno, los ácidos bilia es con p opiedades de e gen es, emulsionan los lípidos haciéndoles mejo es subs a os pa a su hid ólisis po la acción de a ias lipasas localizadas en el lumen del in es ino. Con dicho p opósi o, las sales bilia es solubilizan los lípidos y o man ag egados de pequeño amaño (40-600 μm), denominados micelas [68]. La inco po ación de los lípidos a las micelas se hace o ien ando los enlaces és e de los lípidos hacia la supe icie, que son los más suscep ibles a la diges ión po las lipasas panc eá icas, las cuales se encuen an en solución acuosa [68]. Una ez que las micelas se encuen an en las mic o ellosidades in es inales, los 19 1.3.2.1 Me abolismo de las VLDL Va ias ho as después de la inges a de alimen os, cuando los ni eles de QM en ci culación se en educidos, los eque imien os de AG po pa e de los ejidos pe i é icos se sa is acen g acias a las VLDL, que anspo an los TG sin e izados en el hígado. La can idad de VLDL sec e ada po el hígado es ex emadamen e a iable y es á de e minada po di e sos ac o es., como es el caso de lujo de AG al in e io del hígado, además del núme o de insa u aciones p esen es en la es uc u a de los AG. En el caso de habe un inc emen o en el lujo de AG, es e ó gano esponde po medio de un aumen o en la can idad y amaño de las VLDL sin e izadas. Así, si p edominasen los AG sa u ados (SFA, sa u a ed a y acid) en las moléculas de TG, las pa ículas de VLDL se án más nume osas pe o de un amaño meno que si p edominasen los AG poliinsa u ados (PUFA, polyunsa u a ed a y acids). Aunque exis e e idencia de que el hígado sin e iza cons i u i amen e pa ículas VLDL du an e el es ado de ayunas y pos -abso ción [101], el p incipal es ímulo pa a la sín esis de VLDL pa ece se la cap ación y el ca abolismo de los QM po pa e del hígado [32]. Las nue as pa ículas de VLDL sec e adas adquie en apo C y apo E de las HDL ci culan es. Al igual que las pa ículas de QM, las VLDLs se án hid olizadas a su paso po los capila es po la acción de la LPL, y los AG libe ados se án cap ados po los ejidos (Figu a 5). El esul ado de es a ac i idad es la educción del amaño de las pa ículas con una elación más simila en su con enido en coles e ol y TG. Es o inc emen a la densidad de la pa ícula, dando luga a las VLDL emanen es o IDL, que siguen en ci culación. El ca abolismo de las VLDL ambién cons i uye una de las ías de sín esis de las HDL ya que la apo C es ans e ida nue amen e a las HDL. Las VLDL emanen es (IDL) en an en el espacio de Disse del hígado pa a se ápidamen e eliminadas de la ci culación ía ecep o es endocí icos. Allí, las IDL se án ca abolizadas po la HL y la p o eína de ans e encia de es e es de coles e ol (CETP), esul ando en la o mación de LDL [32] que son las lipop o eínas con mayo con enido de coles e ol en plasma [63]. La pe manencia de las LDL en el plasma es bas an e ele ada con espec o al es o de lipop o eínas, p esen ando una ida media de casi es días, y si en como uen e de coles e ol pa a la mayo ía de los ejidos median e su unión a ecep o es especí icos p esen es en las memb anas plasmá icas de las células diana de los ejidos pe i é icos [30]. Las LDL i án len amen e desapa eciendo de la ci culación en el hígado, siendo ap oximadamen e un 75% de las LDL e i adas po el hígado a a és de in e acciones de ele ada a inidad con el ecep o LDLR ia apo B-100, que si e de ligando ( igu a 5). 26 -T anspo e e e so del coles e ol mediado po HDL El hígado es el único ó gano con ele ada capacidad de eliminación del coles e ol, el cual es pos e io men e sec e ado al in es ino median e su con e sión a sales bilia es y, inalmen e exc e ado po las heces. Sin emba go, el coles e ol que se acumula en el espacio subendo elial de la pa ed a e ial ambién puede educi se median e su ans e encia desde las células espumosas donde se acumula, a las pa ículas HDL madu as y su p incipal componen e p o eico, la apo A-I [103]. La apo A-I lib e de lípidos se une a FL y coles e ol lib e de las memb anas celula es de los hepa oci os, en un p oceso mediado po el ecep o celula de ATPasa ABCA1, siendo así ans e ido el exceso de coles e ol lib e de las células de los ejidos pe i é icos al hígado a a és de HDL, que adquie en un mayo amaño y meno densidad [18]. 27 Figu a 5. Visión global del me abolismo de las lipop o eínas. Sín esis exógena: Los quilomic ones (QM) son ensamblados en el los en e oci o y libe ados al sis ema lin á ico.La LPL unida al endo elio capila hid oliza los TG de los QM pa a gene a QM emanen es (QM ) que son ápidamen e e i ados de ci culación po el hígado. Sín esis endógena: Los lípidos in ahepá icos son eempaque ados y sec e ados como VLDL que son subs a o de la LPL en o elial. Los emanen es o mados de la hid ólisis de las VLDL son ambién cap ados po el hígado o con e idos a LDL. El ecep o LDL (LDLR) hepá ico es esponsable de la e i ada de LDL del plasma humano. Imagen de E ico e al. (2013) [102]. Las pa ículas HDL di unden al plasma, donde el coles e ol lib e es es e i icado po la enzima LCAT que es sin e izada en el hígado y ci cula po el plasma en la supe icie de las lipop o eínas, p incipalmen e HDL [104]. El coles e ol es e i icado esul an e es in e nalizado po los hepa oci os a a és de ecep o es que econocen HDL, como el ecep o sca enge B1 (SRB1) [105]. A lo la go de su eco ido desde los ejidos pe i é icos al hígado, algunos EC son ans e idos desde las pa ículas HDL a LDL, VLDL o QM median e un in e cambio con TG y FL [103]. Es a ans e encia de TG es á mediada po la CETP y la de FL po la p o eína de an e encia de os olípidos (PLTP) [103]. Debido a la unción de HDL en el anspo e e e so de coles e ol, ele ados ni eles en ci culación de es a lipop o eína se elacionan con p opiedades de a e op o ección. En e sus acciones p incipales es án la es imulación de la salida de coles e ol de las células espumosas, además de p e eni la ac i ación del endo elio. Es o úl imo es posible g acias a que po encian la p oducción de óxido ní ico, el cual es necesa io pa a man ene la in eg idad de la ba e a endo elial [106]. 1. 4 Vías de inco po ación de TRL en los mac ó agos La p esencia de mac ó agos con ele ada ca ga de lípidos en su in e io es el dis in i o de las lesiones a e oscle ó icas, y comp ende las ías esponsables de la acumulación de lípidos en los mac ó agos es de especial impo ancia en el p oceso a e oscle ó ico. In es igaciones ealizadas con modelos animales hipe lipidémicos que no exp esan los genes que codi ican los ecep o es de supe icie en mac ó agos, mos a on una conside able educción en el amaño de las lesiones a e ogénicas y acumulación lipídica a e ial [107, 108]. En base a ello, se es ableció que la ía de in e nalización de lipop o eínas mediada po ecep o es celula es de ele ada a inidad es un equisi o en la pa ología de la a e oscle osis y que cons i uye la mayo ía de o mación de células espumosas in i o. Sin emba go, exis en en idencias conside ables que mues an que la in e nalización de lípidos p oceden es de lipop o eínas en mac ó agos puede ealiza se a a és de o as ías al e na i as independien es de ecep o es especí icos de supe icie como son el mecanismo de in e nalización agocí ico, pa ocí ico o pinocí ico [109]. De hecho, en ci cuns ancias en las que la 28 concen ación de lipop o eínas p esen es en la ín ima excede la concen ación de lipop o eínas a e ogénicas p o ocando la sa u ación de las ías de in e nalización de lípidos ía ecep o es, es os mecanismos adquie en incluso mayo impo ancia.[110]. Es impo an e señala que la LPL exp esada po los mac ó agos en su supe icie desempeña un papel impo an e en la e ención de lipop o eínas en la supe icie de los mac ó agos ya que si e de puen e pa a la unión de en e lipop o eínas y p o eoglicanos, acili ando la disponibilidad de las lipop o eínas pa a que in e accionen con sus co espondien es ecep o es[111]. A con inuación, nos cen amos en las ías de in e nalización de lípidos po los ecep o es celula es de supe icie. Se di e encian dos g andes g upos de ecep o es: los que dependen de la p esencia de apo E en la pa ícula de las lipop o eínas como ligando con el ecep o ; y los que son independien es de apoE y p esen an a inidad po un amplio núme o de ligandos. 1.4.1 Endoci osis mediada po ecep o es celula es de supe icie de macó agos dependien es de apolopop o eína E. El ecep o LDLR cons i uye el miemb o undado de una clase en e a de ecep o es ansmemb ana elacionados. En e los ecep o es miemb os de es e g upo con los que LDLR mues a mayo homología des acan: el ecep o de lipop o eínas de muy baja densidad (VLDLR), y la p o eína-1 elacionada con el ecep o LDL (LRP-1). Es os ecep o es combinan es ipos de módulos ex acelula es en di e en es eo ganizaciones pa a lle a a cabo una amplio ango de unciones isiológicas, an o de anspo e de p o eínas, como de ecep o es y co- ecep o es en cascadas de ansducción de señales. Los es módulos ex acelula es son epe iciones icas en cis eína que con ibuyen a la unión de la mayo ía de los ligandos y acili an la pos e io libe ación de la lipop o eína [112]. El LDLR es la p o eína esponsable en mayo medida de la in e nalización de pa ículas anspo ado as de coles e ol al in e io celula . La mayo ía del coles e ol plasmá ico en ci culación en humanos se encuen a en la o ma de pa ículas de LDL [113]. La exp esión de es e ecep o en la supe icie celula de los mac ó agos es á in e samen e egulada po la concen ación in acelula de coles e ol [114], po lo que en p esencia de concen aciones muy ele adas de lipop o eínas icas en coles e ol se sa u a. 29 Cada miemb o de la amilia de ecep o es LDLR con ibuye a la inco po ación de lipop o einas po mac ó agos de o ma di e en e, siendo LDLR especí ico de lipop o eínas que con ienen apo B-100, mien as que LRP-1 y VLDLR son dependien es de la p esencia de apo E en las pa ículas. Las TRL son lipop o eínas con un ele ado con enido de apo E, y son p incipalmen e econocidas e inco po adas po LRP-1 y VLDLR [115]. Con las TRL emanen es ocu e lo mismo [115], pues los QM , pa ículas ambién muy en iquecidas en apo E, se unen con al a a inidad a LRP-1 y VLDLR [116, 117]. Además, los mac ó agos p oducen apo E, lo que po encia aún más la unión de los QM a los mac ó agos, y la LPL sin e izada po los mac ó agos acele a su inco po ación y me abolismo. Sin emba go, ha quedado demos ado que, en células que no exp esan el ecep o LDLR, la inco po ación de QM no se e al e ada, y que las pa ículas siguen siendo in e nalizadas median e o as ías independien es a la amilia de ecep o LDLR [118, 119]. 1.4.2 Endoci osis mediada po ecep o es celula es de supe icie de macó agos independien es de apolopop o eína E. Los ecep o es Sca enge (SR) ienen una ele ada in luencia en el desa ollo y es abilidad de la placa a e oscle ó ica ya que ep esen an una de las ías con mayo a inidad pa a la in e nalización an o de lipop o einas modi icadas como na i as en los mac ó agos [120]. Igualmen e, se ca ac e izan po econoce un amplio epe o io de mac omoléculas con ca ga nega i a como ligandos, no únicamen e lipop o eínas. Así pues, su unción de anspo e de lípidos y coles e ol den o y ue a de las células es impo an e en el desa ollo de la lesión [121] y cons i uyen un de e minan e c í ico de la ac i ación del eno i o p oin lama o io en los mac ó agos localizados en la lesión a e scle ó ica [26]. Has a la echa, nume osos es udios espaldan el papel que los SR de clase A (SRA), SRA1 y SRA2, y dos miemb os de la clase B, CD36 y SRB1 eje cen en el desa ollo de la lesión a e oscle ó ica [120, 122]. •SR de Clase A. Los SR clasi icados den o de es a amilia son ecep o es ansmemb ana ipo I exp esados en mac ó agos [123], que incluye 5 miemb os: SRA1, SRA2, SRA3, con un dominio común ico en cis eína; MARCO y SR con lec ina ipo C, que ca ecen de él [26, 124]. SRA3 queda e enido en el e ículo endoplasmá ico y no es accesible a los ligandos ex acelula es, de modo que su impo ancia uncional no es á cla a [125]. 30 SRA1 y SRA2 se exp esan en la supe icie celula de mac ó agos, incluyendo células espumosas p esen es en la placa a e oscle o ica [126] y son esponsables de ap oximadamen e el 80% de la inco po ación de LDL modi icadas en el in e io celula de los mac ó agos, an o ace iladas como oxidadas [127, 128]. A pesa de su colabo ación en la o mación de células espumosas, a ios es udios han suge ido que al mismo eje cen unciones de p o ección. En es udios desa ollados con modelos animales, se ha is o que la exp esión de SRA es mayo en animales con poca espues a a e oscle ó ica [129]. También se ha de ec ado que la sob eexp esión de un dominio ex acelula de SRA humano educe en un 20% la adhe encia de monoci os/mac ó agos a las células endo eliales y lesiones a e oscle ó icas de la ao a en a ones que no exp esaban LDLR, e a dando el desa ollo emp ano de lesiones a e oscle o icas. En lesiones a anzadas, donde la mue e celula de mac ó agos desencadena la o mación del núcleo nec ó ico y la deses abilización de la placa, los SRA han demos ado además juga un papel impo an e an o en la inducción de la apop osis como en el acla amien o de es as células mue as [26]. •SR de Clase B. Es a amilia de ecep o es sca enge incluye a los ecep o es SRB1, SRB2, y CD36. CD36 es un ecep o ipo III con múl iples dominios ansmemb ana que a a iesa la memb ana dos eces pa a o ma un loop ex acelula al amen e glicosilado con 2 colas co as in acelula es [130]. P esen a una g an homología con SRB1, pe o desempeñan dis in as unciones en el me abolismo lipídico y en el desa ollo de la a e oscle osis. CD36 es el ecep o más impo an e en e los SR y en e los ligandos que une se incluyen oxLDL, células apop ó icas, y p oduc os inales de glicosilación. La pa icipación de CD36 en la p og esión de la a e oscle osis es algo con o e ida. Se ha is o que CD36 pa icipa en la acumulación in acelula lipídica en mac ó agos in i o [128], y la delección de CD36 en monoci os in i o pa ece además educi la a e ogénesis [131]. Sin emba go, en o os es udios con a ones hipe lipidémicos que no exp esan apo E, se ha obse ado un impo an e inc emen o del amaño de las lesiones a e oscle ó icas si la ía de inco po ación mediada po el ecep o CD36 se inac i aba [132]. Además de media inco po ación lipídica, CD36 puede es imula la señalización 31 p oin lama o ia desencadenando una in lamación c ónica en la pa ed a e ial. No obs an e, las ías que se ac i an a consecuencia de la unión de CD36 a lipop o einas modi icadas aún no es án de inidas. SRB1 se descub ió po su homología con CD36, con el que compa e el 30% de su secuencia de aminoácidos y, al igual que CD36, SRB1 puede uni an o o mas modi icadas de LDL como lipop o eínas na i as HDL, LDL, y VLDL [133, 134]. SRB1 es á al amen e exp esado en hígado y mac ó agos y, dependiendo del con ex o, ambién puede desa olla unciones an ia e ogénicas o p oa e ogénicas. Po un lado, pa icipa en el anspo e e e so del coles e ol a a és de dos mecanismos: a) pa icipa en el anspo e de coles e ol de las células a HDL, y b) acili a la libe ación selec i a del coles e ol desde HDL al hígado pa a su exc eción en o ma de bilis y heces [134]. En con a, ambién se ha de ec ado que en lesiones emp anas, pa ece p omo e la o mación de la es ía g asa ya que con ibuye a inco po a lipop o eínas en el in e io de los mac ó agos [135]. 32 33 Figu a 6. Mecanismos de in e nalización de las TRL en mac ó agos. Las TRL son inco po adas en mac ó agos a a és de la ía mediada po ecep o es celula es de supe icie y po u as independien es de los ecep o es celula es como mac opinoci os y agoci osis de pa ículas ag egadas. La in e nalización de las TRL a a és de LDLR, VLDLR y LRP-1 es apo E-dependien e. Una p opo ción meno de TRL es inco po ada ambién po los ecep o es sca enge (SR), en e los que se incluyen SRA2, SRB1 y CD36. Es os son apo E-independien es. 1.5 P opiedades a e ogénicas de las pa ículas TRL En los úl imos 50 años, han comenzado a cob a especial in e és las ca ac e ís icas y p opiedades de las TRL debido a su pa icipación en la iglice idemia pos p andial y en los p ocesos a e ogénicos [136]. Has a hace ela i amen e poco, las LDL e an econocidas como las lipop o eínas más a e ogénicas y p ime a diana en el desa ollo de e apias [137]. No obs an e, es udios ecien es indican que las TRL son igual o incluso más a e ogénicas que las LDL [138]. Una de las ca ac e ís icas que más con o e sia gene aba con espec o a la a e ogenicidad de las TRL es su amaño de pa ícula. Se había asumido que las lipop o eínas de mayo amaño (QM y VLDL) e an incapaces de pene a la capa ín ima de las a e ias y es a disponibles pa a su in e nalización po los mac ó agos en el espacio sub-endo elial, a menos que llega an a se más pequeñas as su hid ólisis [139]. Sin emba go, además de la demos ada p esencia de VLDL, IDL y LDL en los ejidos a e oscle ó icos [140], exis e e idencia de que los QM ambién son capaces de in il a se has a la in ima , acumula se en las células del músculo liso [141,142], a ae monoci os y se in e nalizados po ellos, además de es imula la ac i ación de la p oducción de ma cado es de in lamación e induci es és oxida i o [143]. Po o o lado, a di e encia de las pa ículas LDL que p ecisan de modi icaciones químicas u oxidación pa a se in e nalizados en los mac ó agos y o ma células espumosas [144], las TRL no necesi an se modi icadas pa a se iden i icadas po los ecep o es de supe icie celula de los mac ó agos e inco po a en su in e io los lípidos que con ienen [145]. Es e ac o hace que las TRL sean más a e ogénicas que las LDL. Además, es necesa io p es a especial a ención a las pa ículas emanen es de TRL dadas las ca ac e ís icas p o-a e ogénicas que exiben. Las TRL emanen es son pa ículas más pequeñas y densas que sus p ecu so as (QM y VLDL), pueden pene a la pa ed a e ial a a és de una ansci osis mediada sin ecep o es, egulada po el g andien e de concen ación en e el lumen del aso y la ín ima, y pos e io men e se e enidas en el espacio subendo elial [33]. Las TRL pueden a su ez ag a a la a e oscle osis po medio de a ias ías. Una de ellas es a a és de la apo C-III con enida en las VLDL y sus emanen es. Dado que apo C-III iene la 34 capacidad de inhibi la acción de la LPL, inhibe po an o la inco po ación de los emanen es al hígado, p omo iendo la e ención a e ial de VLDL y sus emanen es, haciéndolas más a e ogénicas [146] Po o o lado, la lipólisis de TRL p oduce AG lib es y monoglicé idos. Es udios en cul i os celula es han demos ado que los AG de cadena la ga, pa icula men e los SFA, son ci o óxicos 160, [147, 148] po lo que la p esencia de lipólisis de TG de las TRL y sus emanen es en lesiones a e oscle ó icas debido a la acción de la LPL sec e ada po los mac ó agos inc emen a los ni eles de AG lib es óxicos. Es e ac o p omue e la mue e celula y la in lamación, ambos a ibu os cla e de la a e ogénesis [149]. 1.5.1 Las TRL en el pe iodo posp andial Los ni eles de TRL se encuen an especialmen e ele ados en el pe iodo posp andial, y sus ni eles pueden p edeci el iesgo ca dio ascula independien emen e del ni el de o os lípidos [150, 151, 152]. Dado que los TG plasmá icos son p incipalmen e anspo ados po TRL, sus ni eles de concen ación du an e el pe ido pos p andial son conside ados un ma cado de TRL y de sus pa ículas emanen es. T adicionalmen e, la medición de los ni eles de TG plasmá icos se ealizaba en ayunas [153]. Sin emba go, a ios son los mo i os po los que los ni eles sé icos de TG pos p andiales pod ían esul a se mejo es p edic o es de e en os ca dio ascula es en compa ación con los medidos en ayunas [151, 152]. En p ime luga , los ni eles de TG se inc emen an signi ica i amen e as la inges a de alimen os du an e el pe iodo posp andial, y la medición de TG en ayunas no cap a con p ecisión el e ec o de las TRL y las pa ículas emanen es sob e el pe il lipop o eico en el pe iodo pos p andial. Va ios es udios p ospec i os y da os epidemiológicos sugie en que un me abolismo pos p andial de TG al e ado con ibuye a la a e oscle osis, es un dis in i o de pacien es con en e medades co ona ias es ablecidas y puede ayuda a p edeci el desa ollo de en e medades ca dio ascula es [154, 155]. Además, en los países indus ializados, las pe sonas nos encon amos en es ado de no ayunas/pos p andial du an e la mayo pa e del día, ap oximadamen e 18 ho as [156]. Pues o que el pe iodo pos p andial se ca ac e iza po la ci culación de lipop o eínas po encialmen e a e ogénicas 35 2.3 La in lamación c ónica en la obesidad y el sínd ome me abólico La obesidad, inicialmen e conside ada una en e medad de almacenaje de lípidos debido a la lipo oxicidad gene ada que causa daño en los ejidos, hoy día es is a po muchos in es igado es como un p oceso in lama o io c ónico de baja g ado. La in lamación es una espues a isiológica del o ganismo a un es ímulo dañino, ísico-químico o biológico ca ac e izada po la ac i ación de la espues a inmune inna a y adap a i a [158, 198]. La espues a p opo cionada implica la acción coo dinada de muchas células (leucoci os y mac ó agos) y mediado es (quimioquinas, ci oquinas, moléculas asoac i as, eicosanoides, y p oduc os de cascadas p o eolí icas), y gene almen e conduce al ees ablecimien o de la homeos asis. El endo elio ac i ado pe mi e la ex a asación de neu ó ilos y componen es solubles al ejido, donde son ac i ados y libe an agen es óxicos y enzimas p o eolí icas con el in de elimina el agen e dañino. Si iene éxi o, la espues a in lama o ia cesa y se p ocede a la epa ación del ejido median e la con e sión de los mediado es lipídicos p oin lama o ios a an iin lama o ios y p o- esolu i os (lipoxinas, esol inas, y p o ec inas) [199]. Los leucoci os del ejido su en apop osis y son eliminados po agoci osis po los mac ó agos [200]. És os adquie en un eno ipo que conduce a la esolución de la in lamación a a és de la libe ación de señales an iin lama o ias como in e leuquina 10 (IL-10) y el ac o de c ecimien o β (TGF- β) [201]. Sin emba go, si la neu alización y eliminación del es ímulo dañino o la p opia e i ada de las células in lama o ias apop ó icas del ejido in lamado alla, el p oceso in lama o io pe sis e y se es ablece un es ado de in lamación c ónica. La condición de in lamación c ónica se ha asociado con obesidad mó bida y se ca ac e iza po una ac i ación con inua del sis ema de inmunidad inna a [202]. El es ado de in lamación que acompaña al sínd ome me abólico no se p esen a con in ección o signos de au oinmunidad y no pa ece que enga luga un ejido masi amen e dañado. De hecho, la dimensión de la ac i ación de la espues a in lama o ia no es g ande, po ello se le suele denomina in lamación c ónica de “bajo g ado” [182], pe o es su pe sis encia a lo la go del iempo lo que ocasiona el daño en los ejidos. Desde el pun o de is a inmunológico, ambién se ha demos ado que la obesidad es á ligada a un es ado de in lamación c ónica e iden e. Se ha de ec ado que el ejido adiposo es á in il ado po células del sis ema inmuni a io, que ambién son uen e de ci oquinas in lama o ias [203]. Además, cuando inc emen a la adiposidad, el ejido adiposo es imula la p oducción po pa e del endo elio ascula de agen es ombogénicos como el inhibido del ac i ado isula del plasminógeno ipo 1 (PAI-1) y agen es ombolí icos como el ac i ado isula del plasminógeno (PA). También induce el aumen o de la concen ación plasmá ica de moléculas de adhesión de la 42 memb ana endo elial: ICAM-1, VCAM-1 y la P-selec ina, con ibuyendo a un mayo eclu amien o de monoci os y mayo in il ación. Los monoci os in il ados en el ejido adiposo se di e encian po acción del ac o de es imulación de colonias de mac ó agos (M-CSF, mac ophage-colonies s imula o ac o ) de i ado de adipoci os, conduciendo a una mayo acumulación de mac ó agos en el ejido. La in e acción en e adipoci os y mac ó agos, a a és de señales quimioquina/ci oquina gene adas, aumen a la eacción in lama o ia en el p opio ejido adiposo, inc emen ando aún más los ni eles en ci culación de quimioquinas/ci oquinas en obesidad [204]. 2.4 Ma cado es de in lamación como p edic o es de iesgo ca dio ascula en la obesidad El in e és po las ca ac e ís icas in lama o ias de la obesidad y po sus ac o es de iesgo asociados, se ha in ensi icado en los úl imos años. Es o es debido a que la in lamación c ónica asociada a la obesidad, que pa ece ambién es a implicada en la esis encia a la insulina y dis unción endo elial, p opo ciona una posible explicación a la es echa elación exis en e en e la obesidad y la a e oscle osis, la cual es la mayo causa de ECV y mo alidad [205, 206]. La ele ada sín esis y libe ación de ci oquinas p o-in lama o ias ci culan es p oceden es del hígado y ejido adiposo (adipoquinas) du an e la espues a in lama o ia c ónica, a la go plazo induce la dis unción del endo elio ascula , un mecanismo pa ogénico p edic o de la a e oscle osis y ECV [207]. G an pa e de las moléculas p oin lama o ias libe adas p oceden del ejido adiposo, po lo que ya no es conside ado como un ó gano pasi o de almacenaje de TG y uen e de libe ación de AG lib es. Los adipoci os madu os han sido econocidos como células sec e o as endoc inas que libe an un g an núme o de sus ancias biológicamen e ac i as como ho monas, ci oquinas, y o os ac o es que pa icipan en los mecanismos de la ac i ación plaque a ia, hipe o ia del mioca dio, p og esión de la en e medad ca dio ascula ) [207], y de la esis encia a la insulina [187]. 43 2.4.1. La sensibilidad a la insulina como bioma cado de in lamación Dada la implicación de la acción de la insulina en el desa ollo de las ECV, mejo as en el ni el de sensibilidad a es a ho mona implica ían una educción de la espues a in lama o ia y del iesgo de ECV. Se ha e i icado que la pé dida de peso en pacien es obesos es á asociada con una educción de bioma cado es de in lamación [208, 209], en e ellos p incipalmen e la RI [210, 211]. 2.4.2 Ci oquinas y adipoquinas como bioma cado es de in lamación Las ci oquinas pa icipan en la egulación de las unciones y me abolismo celula a a és de una ed de señales pa ac inas, endoc inas y au oc inas, que modulan la biología de la célula. La mayo ía de adipoquinas se p oducen en ele adísimas can idades con el aumen o de la adiposidad, y no solo es án elacionadas con la egulación del consumo de ene gía y la homeos asis del peso co po al, sino ambién ienen una es echa asociación con las pa ologías elacionadas con la obesidad [212]. Po es e mo i o, las adipoquinas son impo an es mediado es a e ogénicos. La sus anciosa e idencia que une in lamación, a e oscle osis, y obesidad apoya el uso de las ci oquinas y adipoquinas como bioma cado es de in lamación como una o ma de medi el iesgo exis en e en condiciones de obesidad ya que la exp esión de és os bioma cado es plasmá icos se e al e ada en pe sona obesas con espec o a indi iduos con peso no mal, siendo así de g an u ilidad pa a el diagnós ico y p onós ico de en e medades ca dio ascula es. 2.4.2.1 Bioma cado es analizados en el p esen e p oyec o: ·Fac o de nec osis umo al α (TNF- α) TNF-α es una ci oquina p oin lama o ia, implicada en las al e aciones me abólicas p esen es en la in lamación c ónica, pa ogénesis de la esis encia a la insulina, ano exia, y pé dida de peso en indi iduos con sob epeso [213]. Va ios es udios han mos ado que TNF-α egula el me abolismo de lípidos y glucosa en adipoci os ya que inhibe la in e nalización de los AG de i ados de los TG de lipop o eínas [214], y es imula la exp esión de la lipasa sensible a ho monas [215]. Las acciones me abólicas de TNF-α conducen al inc emen o de los ni eles en ci culación de AG lib es y RI. O os es udios han demos ado que el a amien o c ónico con TNF-α esul a en un impo an e desequilib io de la señalización de insulina pues educe los ni eles de exp esión del 44 anspo ado de glucosa sensible a la insulina-4 (GLUT4) y el sus a o-1 del ecep o de la insulina (IRS-1), inhibe la os o ilación de la i osina de IRS-1, y es imula la os o ilación de la se ina de IRS-1 y la os o ilación especí ica del ecep o de insulina [216]. Los ni eles de exp esión de TNF-α se inc emen an en el ejido adiposo con el aumen o de la adiposidad, y se educen con la pé dida de peso [217, 218]. TNF-α ac úa como un po en e induc o de o as adipoquinas p oin lama o ias como in e leuquina-6 (IL-6), MCP-1, lep ina, y el inhibido del ac i ado de plasminógeno- 1 (PAI-1) [217]. A su ez, ambién inhibe la sín esis de adipoquinas an iin lama o ias como la adiponec ina, ya que inhibe su exp esión y sec eción, aunque posiblemen e sea debido po la es imulación de la p oducción de IL-6, que ambién inhibe la sec eción de adiponec ina [219, 220]. Es e hecho explica la co elación nega i a exis en e en e la adiposidad isce al y los ni eles de adiponec ina en la que TNF-α pa ece es a implicado. ·P o eínas quimioa ayen es del monoci o -1 (MCP-1) MCP-1 es una quimioquina in lama o ia, p o eína especializada pe enecien e a la amilia de las ci oquinas, p oducida p edominan emen e po mac ó agos y células endo eliales. Recien es es udios han mos ado que los adipoci os ambién son uen e de quimioquinas especí icas como MCP-1 [206]. MCP-1 es un po en e ac o quimio ác ico pa a monoci os [221], cuya p incipal unción es su eclu amien o y adhesión al endo elio [222], po lo cual MCP-1 juega un papel impo an e en la a e ogénesis. Va ios ensayos ealizados en a ones como modelo de es udio, han demos ado que la exp esión de es a quimioquina p oin lama o ia se e inc emen ada en las lesiones a e oescle ó icas [223], y la inhibición de su exp esión o la de su ecep o , el ecep o de quimiocina CC-2 (CCR2), esul a en una educción del amaño de la lesión y del núme o de mac ó agos en la lesión en a ones hipe lipidémicos que no exp esan LDLR o apo E [224]. Además, los ni eles de ARNm de MCP-1 se han is o has a 7.2 eces más sob eexp esados en el ejido adiposo y plasma de a ones obesos con espec o a a ones de peso no mal [225]. La acción de MCP-1 a ec a a la sensibilidad a la insulina ya que educe los ni eles de cap ación de glucosa es imulados po la insulina, y ambién a ec a a la exp esión de genes adipogénicos como LPL, GLUT4, ecep o β-3-ad egénico y γ-PPAR [159]. Se ha is o que los ni eles de exp esión de es os genes se encuen an po encialmen e ele ados en pacien es con ele ado iesgo ca dio ascula [226], y más signi ica i amen e en pe sonas con diabe es [227]. 45 ·In e leuquina 1-β (IL-1β ) La p esencia de IL-1β ha sido demos ada en lesiones a e oscle ó icas, pues se a a de una ci oquina p oducida po los mac ó agos p esen es en las lesiones y son de ele ada impo ancia en el inicio y ampli icación de la lesión [228]. IL-1β puede al e a la unción de las células endo eliales [229], po encia la mi ogénesis de las células del músculo liso ascula es [230], y eclu a leucoci os al espacio subendo elial [231] . ·Adiponec ina La adiponec ina es una adipoquina an iin lama o ia cuya unción me abólica p incipal es la u ilización de la glucosa y la oxidación de los AG. La adiponec ina mejo a la sensibilidad a la insulina median e el inc emen o de la exp esión del ecep o de la insulina, y de su p o eína adap ado a de señalización IRS-1 en el músculo esquelé ico [232]. Al igual que la lep ina, es un egulado a la go plazo del ape i o y del me abolismo lipídico [180]. La adiponec ina eje ce impo an es unciones en e al desa ollo de a e oscle osis g acias a sus p opiedades an ia e ogénicas, an idiabé icas y an iin lama o ias, pues iene la capacidad de inhibi la ac i idad agocí ica y la p oducción de TNF-α de los mac ó agos [180, 233]. En e sus ac i idades, me ece la pena des aca que es capaz de sup imi la exp esión de moléculas de adhesión en las células endo elia es ascula es, y modula la señalización del NF-kB [234]. Asimismo, educe los ni eles de sec eción de TNF-α po monoci os/mac ó agos y educe la exp esión del gen que codi ica los SRA en mac ó agos. Debido a ello, el ni el de in e nalización de pa ículas LDL oxidadas y la o mación de células espumosas se e educido de mane a impo an e [235]. La adiponec ina inhibe ambién la p oli e ación y mig ación de células del músculo liso [236]. Es o sugie e que es a adipoquina puede se p o ec o a en e a la a e ogénesis median e la inhibición de la acumulación de células espumosas de i adas de monoci os/mac ó agos en la pa ed ascula . Los ni eles ci culan es de adiponec ina en el plasma se co elacionan in e samen e con el IMC, es ando así, a di e encia de o as adipoquinas, muy educidos en condiciones de obesidad y DMT2, al igual que en en e medades a e iales co ona ias [237, 238]. · 46 ·Lep ina La lep ina es una ho mona cuyo nomb e de i a del ocablo g iego lep os, que signi ica “delgado”. Es una sus ancia bioac i a que se p oduce an o en los adipoci os como en el hipo álamo, o a ios y placen a [239, 240]. Es a ho mona juega un impo an e papel en la egulación del consumo de ene gía a a és del hipo álamo y en el inc emen o del gas o ene gé ico an o po la inhibición de la lipogénesis como po la es imulación de la lipólisis en animales y humanos [241]. Es a ho mona se encuen a en la ci culación sis émica y su sec eción es es imulada po la insulina, glucoco icoides y ci oquinas como TNF-α e IL-1, y es inhibida po ca ecolamidas, es os e ona y agonis as de PPAR-δ [242]. En las pe sonas delgadas, ce ca del 50% de la lep ina es á unida a p o eínas, encon ándose a baja concen ación en ci culación, mien as que en las pe sonas obesas, la mayo ía se encuen a en su o ma lib e [239, 240, 243]. Dada la asociación exis en e en e los ni eles en ci culación de la lep ina y la obesidad, es a ci oquina pa ece se ú il en la p edicción de la obesidad pues los ni eles en ci culación de la lep ina son mayo es cuan o mayo es la capa g asa subcu ánea del indi iduo [244]. En e las unciones más impo an es de la lep ina es á la de inhibi el ape i o, mediando el balance de ene gía al en ia in o mación al ce eb o ace ca de la acumulación y ago amien o de los depósi os g asos [180], pe o ambién es impo an e en la egulación de la espues a inmune in lama o ia [245]. Va ios es udios in i o han demos ado que la lep ina es capaz de uni se a su ecep o exp esado en las células del sis ema inmune (lin oci os, células NK, mococi os/mac ó agos, células dend í icas, neu ó ilos y eosinó ilos), y po consecuencia, ocu e la ac i ación, p oli e ación, madu ación y p oducción de mediado es in lama o ios [246]. La lep ina puede po encia a su ez la ag egación plaque a ia y la ombosis a e ial [247], p omo e angiogénesis, pe judica la dis ensibilidad a e ial, induci la p oli e ación y mig ación de células ascula es del músculo liso [248] y pa ece se un po enciado de la calci icación de células ascula es. Se conside a que la lep ina es á asociada con la in lamación c ónica de bajo ni el esponsable de la p og esión de la obesidad ya que induce p oducción de IL-6, la p o eína C eac i a (PCR), y o as ci oquinas como IL-10 [249] [250], además de pa icipa en la RI y sínd ome me abólico. Po es os mo i os, se ha p opues o que exis e una elación di ec a en e la hipe lep inemia y el inc emen o de ECV [247]. 47 ·P o eína C eac i a (PCR) La PCR es una p o eína de ase aguda, p oducida p incipalmen e po el hígado y pa icipa de o ma muy impo an e en la inmunidad inna a. El ni el ci culan e de PCR se asocia al IMC, po lo que indi iduos obesos p esen an mayo es ni eles de es e ma cado en compa ación con indi iduos con peso no mal [251]. Asimismo, se ha obse ado una disminución de PCR cuando se p esen a una educción de peso. Un es udio ealizado po T ayhu n y Wood en 2004 encon ó que el gen que codi ica la PCR es á exp esado en el ejido adiposo, mos ando una apa en e co elación di ec a en e los ni eles de ARNm PCR y la adiposidad. Eso aumen a la posibilidad de que el ejido adiposo con ibuya di ec amen e al aumen o de los ni eles ci culan es de la PCR [252]. La dis ibución de la g asa co po al ambién cons i uye un ac o de e minan e de los ni eles de PCR, independien emen e del IMC. La elación cin u a-cade a, que se u iliza clínicamen e pa a e alua la adiposidad isce al abdominal, se asocia posi i amen e con la PCR incluso después del ajus e po IMC [251]. Es a asociación apoya la hipó esis de que el aumen o de la adiposidad, pa icula men e isce al, es á elacionado con un es ado de in lamación sis émica de bajo g ado. Los ni eles basales de PCR ambién co elacionan con el iesgo de DMT2 inciden e, independien emen e de la obesidad y o os de e minan es de la diabe es [253]. Es e hallazgo sugie e que, aunque la p oducción de PCR po el hígado se co elaciona ue emen e con la obesidad y con la sec eción de IL-6 po el ejido adiposo [254], exis en o os ac o es ambien ales en los p ocesos in lama o ios que pod ían con ibui a los ni eles en sang e de PCR. Es a p o eína es ú il como bioma cado de in lamación y es un ue e p edic o independien e de e en os ca dio ascula es an o en indi iduos apa en emen e sanos como en aquellos con mani es aciones de en e medad a e oscle ó ica [255]. La PCR es una de las sus ancias p esen es en las lesiones a e oscle ó icas, más especí icamen e en la ín ima ascula , donde co-localiza con monoci os, mac ó agos de i ados de monoci os y lipop o eínas. Se ha suge ido que con ibuye di ec amen e al p oceso a e oscle ó ico [256] median e su pa icipación en p ocesos como la ac i ación del complemen o, apop osis, ac i ación de células ascula es, eclu amien o de monoci os, acumulación lipídica y ombosis [257]. Adicionalmen e, los componen es del sínd ome me abólico (obesidad cen al, concen aciones ele adas de TG plasmá icos, baja concen ación de HDL-c plasmá ico, hipe ensión, y ele ados ni eles de glucosa en sang e) co elacionan con ele ada concen ación de PCR en plasma [258]. 48 ·Ce uloplasmina La ce uloplasmina (Cp) es una p o eína sin e izada po el hígado con un papel muy impo an e en la egulación de la obesidad e in lamación. Es a molécula es abundan e en el plasma humano y es á in oluc ada en el anspo e del cob e po el o ganismo, coagulación, angiogénesis, p o ección con a el es és oxida i os, y la homeo asis del hie o [259]. Nume osos es udios epidemiológicos han in o mado de la obse ación de ele ados ni eles de Cp en pacien es con desó denes ca dio ascula es como a e oscle osis, aneu isma aó ico abdominal, angina ines able, asculi is, y en e medad a e ial pe i é ica [260, 261]. La Cp es impo an e en el con ol de la oxidación de lípidos de memb ana, p obablemen e po la oxidación di ec a de ca iones, p e iniendo así su ca álisis po pe oxidación lipídica [262]. Kim e al. [263] demos a on en 2011 la asociación en e unos ni eles ele ados de Cp y la obesidad, aunque no iden i ica on el mecanismo que los elaciona. No obs an e, a i ma on que es posible que es é in oluc ada en la ía de in lamación inducida po la obesidad. Es os au o es mos a on que ele ados ni eles de Cp se co elacionaban ambién con los ni eles de PCR y ambos se iden i ica on como un ac o independien e que con ibuye al inc emen o de la obesidad . La Cp es sin e izada en el hígado du an e el p oceso de in lamación agudo [264] en espues a a las ci oquinas libe adas po pa e de los ejidos dañados. Se especula que ele ados ni eles de Cp en plasma pueden indica un es és oxida i o ano malmen e ele ado en e suje os obesos [261], siendo un po encial con ibuyen e de la a e ogénesis y, po an o, un ú il ma cado de iesgo ca dio ascula [265, 266]. Además, el alo de Cp se ha p opues o como una medida p edic i a pa a el sínd ome me abólico en adolescen es [267]. 49 3. LA DIETA COMO EL PRIMER FACTOR DE INTERVENCIÓN PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES (ECV) a elación en e die a y ECV ha sido una de la á eas más ac i as de in es igación en la epidemiología nu icional du an e los úl imos 50 años. A a és de nume osos es udios, el con enido g aso de los alimen os ha demos ado se una pieza cla e en la de e minación de una salud óp ima en el indi iduo, debido a su capacidad pa a in lui sob e los ac o es de iesgo ca dio ascula y los mecanismos elacionados con el es ablecimien o y p og eso de las placas de a e oma. Po ese mo i o, una die a de calidad cons i uye uno de los pila es undamen ales en la p e ención de las ECV y su a amien o [268, 269, 270, 271]. No obs an e, ac ualmen e se es á conside ando el es udio del e ec o de dis in os pa ones alimen a ios como un odo, más que ocaliza se en nu ien es y alimen os de o ma indi idual. Se a a de un ace camien o más ace ado pa a la medición del e ec o p e en i o en e a ECV, ya que és os miden la in e acción siné gica de di e en es alimen os y nu ien es con enidos en la die a. La elección de unos pa ones alimen a ios de calidad es á eme giendo como un po en e pa adigma pa a di igi nues os hábi os alimen a ios, pues ha quedado demos ado que las elecciones de la die a y es ilo de ida son esponsables de has a el 40% de mue e p ema u a po en e medad ca dio ascula [272]. Las ecomendaciones die é icas de educi el consumo de alimen os con un ele ado con enido g aso e inc emen a la inges a de u as, e du as, y p oduc os de g ano en e o es el ac o común de las guías nu icionales p opo cionadas hoy día a la población. La ex ensa in o mación apo ada po es udios de in e ención nu icional indica que a a és de la die a se pueden educi signi ica i amen e los ni eles de lípidos plasmá icos, uno de los mayo es ac o es de iesgo de las ECV. En las úl imas décadas, los abajos expe imen ales de in e ención die é ica ealizados es án haciendo imp esionan es p og esos con espec o a es a cues ión, y han pe mi ido en e o as cosas iden i ica la die a Medi e ánea como la die a que pod ía p opo ciona bene icios supe io es a aquellos obse ados con la adhe encia a o os pa ones alimen a ios [273]. 50 L 3.1 La die a medi e ánea La die a medi e ánea es el esul ado de la his o ia milena ia de la cuenca del Medi e áneo, ansmi ida de gene ación en gene ación, con una popula idad cada ez mayo a ni el mundial, e incluida po la UNESCO en la Lis a Rep esen a i a de Pa imonio Cul u al In angible de la Humanidad en el año 2010 [274]. Sin emba go, de ini la die a medi e ánea es una a ea compleja dada la amplia egión geog á ica que odea el ma Medi e áneo, que incluye al menos 16 países con di e encias cul u ales, é nicas, eligiosas, económicas y ag ícolas que esul an en p ác icas die é icas di e en es. Aún así, exis e un pa ón die é ico que es ca ac e ís ico de es as egiones, el cual ue iden i icado po p ime a ez en los años 60 en G ecia, el su de I alia, España y o os países de la cuenca del Medi e áneo. El ac o común de es os países es el empleo de gene osas can idades de acei e de oli a como p incipal uen e de g asa, además de un ele ado consumo de alimen os de i ados de plan as ( u as, e du as,legumb es, u os secos, semillas, y ce eales de g ano en e o); una ecuen e pe o mode ada inges a de ino (especialmen e ino in o), no malmen e con las comidas; un consumo mode ado de pescado y ma isco y p oduc os lác eos (yogu es y queso, pe o no leche en e a, man equilla o na a), a es de co al y hue os; y un bajo consumo de dulces y ca nes ojas y p ocesadas [275, 276, 277]. La die a medi e ánea no es solo unos pa ones nu icionales de e minados, exis en o os aspec os no nu icionales ligados al es ilo de ida de los países inculados con es e ipo de alimen ación, que ambién con ibuyen a sus e ec os saludables. El consumo de p oduc os escos y locales, las ac i idades adicionales culina ias, los aspec os socio-cul u ales y nu icionales de la egión, jun o con la p ác ica egula de ac i idad ísica, son pa es undamen ales del modelo o es ilo de ida Medi e áneo [274]. 3. 1.1 El ca ác e ca diop o ec o de la die a medi e ánea Exis en e idencias cien í icas su icien es que apoyan los bene icios apo ados po la adhe encia a los pa ones alimen a ios adicionales de la die a medi e ánea (can idades, p opo ciones, combinaciones o a iedades de los di e en es alimen os y bebidas consumidos y la ecuencia con la que no malmen e se consumen) en e a la mo alidad y los e en os clínicos ca dio ascula es [278, 279, 280]. De hecho, en é minos de educción de la mo bilidad po ECV, mo alidad y e en os clínicos, la die a medi e ánea es compa able con o as in e enciones a macológicas como aspi ina y es a inas; con la ac i idad ísica, e incluso con an ihipe ensi os 51 insulina y obesidad abdominal, siendo odos ellos ac o es de iesgo c í icos que con ibuyen con el sínd ome me abólico y las en e medades ca dio ascula es a e oscle ó icas [293, 305] ( igu a 8). Figu a 8 Mecanismos de acción de los MUFA inge idos con la die a en la educción de los ac o es de iesgo del sínd ome me abólico y el desa ollo de en e medades ca dio ascula es a e oscle ó icas asociadas [305]. a) Los MUFA y su in luencia sob e el p oceso in lama o io Un p oceso in lama o io p olongado es á in oluc ado en el inicio, p og esión y e apas inales de la a e oscle osis [159]. Si además hay p esen es o os ac o es como la hipe coles e olemia, hipe lipidemia y la hipe ensión, és os causan a su ez la ac i ación del endo elio ascula , lo que pe pe úa la libe ación de mediado es in lama o ios, y man iene ac i a la mig ación de monoci os al oco de la lesión, pe mi iendo la e olución de la placa de a e oma. Po an o, educi la espues a in lama o ia es c ucial pa a p e eni los e en os a e oscle ó icos. 58 MUFA de la die a Dislipidemia a e ogénica TG > 150 mg/dl HDL<40 mg/dl homb es o 50 mg/dl muje es Obesidad Abdominal Ci cun e encia de la cin u a >102 cm homb es y >88 cm muje es Hipe ensión P esión sanguínea >130/85 mmHg Hipe glicemia Glucosa >100 mg/dl - - - - Sínd ome Me abólico A e oscle osis Diabe es melli us ipo 2 - Un buen núme o de es udios han demos ado que el consumo de AOV iene e ec os an iin lama o ios. Salas-Sal ado e al. [291] encon a on que, en si uación de ele ado iesgo ca dio ascula , los suje os con los ni eles de consumo de AOV más ele ados p esen aban los ni eles más bajos de VCAM-1, ICAM-1, IL-6 y PCR. En o o es udio en el que pa icipó un g upo de pacien es con sínd ome me abólico, obse a on as dos años de seguimien o, que los suje os que se adhi ie on a la die a medi e ánea en iquecida con acei e de oli a, ambién esul a on ene meno concen ación plasmá ica de PCR, IL-6 y o as ci oquinas in lama o ias al con as a los con el g upo con ol que no consumió AOV [306]. Resul ados simila es se han obse ado en o os ensayos clínicos ealizados, como ue el desa ollado po Mena e al.[307], aunque Es uch e al. solo iden i ica on la educción de ci oquinas en en el g upo de homb es hipe coles e olémicos [308]. Es impo an e menciona que no solo las pe sonas con iesgo de desa olla ECV pueden bene icia se de las p opiedades an iin lama o ias apo adas po el AOV, sino que ambién indi iduos sanos han is o mejo ada la espues a in lama o ia as un consumo de acei e de oli a. En poblaciones de suje os sanos, se ha obse ado que la composición de pa ículas LDL se ha is o en iquecida en ácido oleico después de inge i AOV [309] y, con ello, se educe su capacidad pa a induci la quimio axis de monoci os y la adhesión de monoci os al endo elio [310]. La lipemia pos p andial iene e ec os in lama o ios, po lo que a ias in es igaciones en humanos se han cen ado ambién en el es udio de la espues a in lama o ia du an e es a ase [311]. T as la adminis ación de una comida con acei e de oli a como p incipal uen e de g asa a olun a ios sanos, hipe coles e olémicos e hipe iglice idémicos, se ha de ec ado una educción en la concen ación sé ica de moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, VCAM-1 y E-selec ina du an e el pe iodo pos p andial, en compa ación con la línea basal o con la uen e de g asa al e na i a de la die a con ol (man equilla, acei e de gi asol al o palmí ico o PUFA n-3) [312, 313]. También se ha demos ado que una die a en iquecida en AOV es capaz de causa una signi ica i a educción de los ni eles sanguíneos de omboxano B2 y LTB4 [314]. Es más, se ha obse ado que la inducción de la exp esión de ARNm de TNF-α en células de mac ó agos pe i é icos sanguíneos (PBMCs) aisladas en el pe iodo pos p andial e a meno en suje os sanos que p e iamen e habían consumido un desayuno que con enía acei e de oli a o u os secos en compa ación con el g upo de suje os cuyo desayuno con enía man equilla [315]. Asimismo, ha sido demos ado que NF-kB, un ac o de ansc ipción que con ola la exp esión de genes esponsables de nume osos p ocesos p oin lama o ios, incluyendo TNF-α, IL-6 y MCP1 [316] es ac i ado en monoci os as una comida que con iene man equilla o u os secos, mien as que una comida que con iene acei e de oli a no causa al e ec o [312]. 59 T abajos ealizados con animales han p opo cionado igualmen e una impo an e e idencia de los e ec os an iin lama o ios del acei e de oli a. En a as, se ha demos ado que la adminis ación de una die a con un 20% de su composición de acei e de oli a, es capaz de educi la ac i idad de las células na u al kille [317]; la suplemen ación de la die a con un 10% de acei e de oli a educe la suscep ibilidad de las lipop o eínas a la oxidación en animales hipe coles e olémicos [318]; y la p oducción de ROS y PGE2 ambién se edujo en neu ó ilos as se alimen adas con un 15% de acei e de oli a con espec o a las que se alimen a on con una die a baja en g asa du an e dos meses [319]. Más aún, los ni eles de sec eción de mediado es in lama o ios como TNF-α, IL-6, IL-1β y PGE2 po mac ó agos pe i oneales mu inos es imulados po liposomas aislados de a ones alimen ados con 15-20% de acei e de oli a du an e ocho semanas ue on ambién meno es [317, 319]. Nume osos es udios in i o ambién han p opo cionado impo an es esul ados con espec o a la capacidad de modulación del p oceso in lama o io po el ácido oleico en cul i os de células endo eliales humanas. Se ha demos ado la capacidad del ácido oleico pa a educi los ni eles in acelula es de ROS, la exp esión de moléculas de adhesión y la ac i ación ansc ipcional de NF- kB cuando es e AG es añadido a los cul i os celula es. Además, se ha is o educida la inducción de la exp esión de VCAM-1 y E-selec ina po pa e de pa ículas LDL-ox aisladas di ec amen e de suje os que consumie on una die a suplemen ada con acei e de oli a en compa ación con los que consumie on SFA [301, 310, 311]. Adicionalmen e, la quimio axis de monoci os y la adhesión endo elial de las células se inc emen a an e su exposición a liposomas que con ienen ácido linoleico, mien as que es e e ec o es casi nulo cuando el ácido linoleico es eemplazado con ácido oleico 350 [320]. Es a acción an iin lama o ia del ácido oleico ha sido a ibuida a su baja capacidad de oxidación con espec o al ácido linoleico, el cual puede se eemplazado en la composición de las lipop o eínas po ácido oleico en aquellos indi iduos que consumen una die a ica en acei e de oli a [309]. b) Los MUFA y su in luencia sob e el pe il lipídico plasmá ico La dislipidemia, uno de los componen es del sínd ome me abólico, ha sido asociada con a ias pa ologías in lama o ias, en e ellas la a e oscle osis [321]. El con enido g aso de los alimen os juega un papel imp escindible en la modulación del pe il lipídico plasmá ico y en la de e minación del iesgo de en e medades ca dio ascula es, así como en a o ece la e e sión de en e medades. 60 La capacidad del acei e de oli a pa a ayuda a p o ege en e al desa ollo de la a e oscle osis incluye en e sus acciones la modi icación del pe íl lipídico a uno menos a e ogénico, que consis e en un aumen o de la concen ación de coles e ol unido a HDL (HDL-c) y una disminución de LDL-c, TG y coles e ol o al, además de la educción de lipop o eínas oxidadas [322]. Desde los años 90, se han ealizado a ios me a-análisis que han con i mado que los MUFA y PUFA de la die a ienen un e ec o compa able en la educción de los ni eles de coles e ol [310, 311, 323]. Desde que en es udios como el lle ado a cabo po Hu e al. demos a an que la sus i ución del 5% de los SFA de la die a po ácidos g asos insa u ados esul a en una educción del 43% en ECV [324], cada ez hay mayo in e és en inc emen a la can idad de MUFA y PUFA en la die a, y educi el consumo de SFA. De hecho, el ecien e es udio PREDIMED dejó bien cla o que la die a medi e ánea suplemen ada con el AOVE o nueces, ambos uen e de g asas insa u adas, se asocia con una mejo a del pe il lipídico plasmá ico [322].O os es udios clínicos en humanos demos ado ambién el e ec o del consumo de MUFA y PUFA en la mejo a de los a ios coles e ol o al/HDL-c [325] y TG/HDL-c [322] debido a una educción en los ni eles de LDL-c. Sin emba go, a pesa de los bene icios ca dio ascula es apo ados po los PUFA, su consumo ha sido limi ado a menos del 10% de la ene gía dia ia inge ida. Pa adójicamen e, se ha obse ado que los PUFA pueden gene a a su ez e ec os ad e sos po enciales que incluyen la educción de los ni eles de HDL-c y el inc emen o de la suscep ibilidad de las LDL-c a la oxidación [326, 327], po lo que no con iene abusa de ellos. En cambio, el consumo de MUFA ha demos ado educi los ni eles de HDL-c menos ecuen emen e [325, 328]. Las lipop o eínas plasmá icas pueden su i modi icaciones como la oxidación, que po encian su e ec o dañino sob e el endo elio ascula y las hace más p opensas a se inco po adas po los mac ó agos [329]. Un abundan e núme o de es udios en humanos y animales han suge ido que el consumo de acei e de oli a educe el es és oxida i o, lo que ha sido en pa e a ibuido a su con enido de ácido oleico. Pues o que el único doble enlace de los MUFA hace que la o mación de dienos conjugados sea menos a o able, es de espe a que las pa ículas LDL icas en olea o sean más esis en es a la oxidación que las LDL icas en PUFA [330]. Es e hecho ue demos ado po Cice o e al. en el es udio EUROLIFE [331], cuyos esul ados publicados en el año 2008 mos a on que g acias a la suplemen ación dia ia de la die a con 25 ml de acei e de oli a se inc emen ó el con enido de ácido oleico de las LDL, lo que se asoció con una educción del daño oxida i o de los lípidos. Asimismo, Mo eno e al. [332] demos a on que una die a ica en MUFA educe a su ez la 61 cap ación de las pa ículas LDL-ox po mac ó agos, con ibuyendo a disminui la o mación de células espumosas, uno de los e en os emp anos y cla e en la a e ogénesis c) Los MUFA y su e ec o sob e el desa ollo o e e sión de la obesidad Las ecomendaciones nu icionales ealizadas pa a el a amien o de la obesidad han mos ado gene almen e un especial én asis en la impo ancia de educi odo el con enido g aso de la alimen ación, y han p omo ido su eemplazo po ca bohid a os. Sin emba go, cada ez es más e iden e que die as como la medi e ánea, con un al o con enido g aso p oceden e del acei e de oli a, pueden se al e na i as e ec i as a las adicionales die as bajas en g asa pa a una pé dida inicial de peso en pe sonas obesas [333]. Un me a-análisis de 21 es udios epidemiológicos ealizado sob e la die a medi e ánea y la obesidad e eló que no exis e documen ación alguna que epo e un inc emen o signi ica i o de obesidad en espues a a la die a medi e ánea, a pesa del ele ado consumo de g asa p oceden e del acei e de oli a asociado a ella. De hecho, ce ca de la mi ad de esos es udios p opo ciona on e idencia cien í ica de que la adhe encia a es os pa ones alimen a ios es á asociada con una pé dida de sob epeso/obesidad o p omoción de pé dida de peso [334]. En e ellos, se encon a on el es udio EPIC (In es igación Eu opea P ospec i a en Cánce y Nu ición) [335] y el es udio PREDIMED [308]. Es e úl imo, puso además de mani ies o que una in e ención nu icional con la die a medi e ánea, con al o con enido de MUFA, en pe sonas con adiposidad abdominal, el ipo de obesidad conocido más pe judicial, e a capaz no solo de con a es a los ele ados iesgos ca dio ascula es asociados con el inc emen o de adiposidad [287, 336], sino que mos ó una pé dida de peso después de es meses de su consumo [308]. El P oyec o SUN (Seguimien o Uni e sidad de Na a a) [304], lle ado a cabo po el equipo de Ma inez-Gonzalez de la Uni e sidad de Na a a y publicado en el año 2015, es o o de los es udios cuyos esul ados coinciden con los de PREDIMED, g acias a la i ud de la die a medi e ánea pa a con ibui a educi el IMC y la ci cun e encia de la cin u a. En es e es udio se analizó la elación de la die a o es ilo de ida con la incidencia de a ias en e medades c ónicas y la mo alidad. E alua on la elación en e la obesidad y la incidencia de los mayo es e en os clínicos ca dio ascula es según a ias ca ego ías o ni eles de adhe encia a la die a medi e ánea, en una mues a de 19,065 homb es y muje es obesos o con sob epeso, de 38 años de edad media y bajo iesgo de en e medad ca dio ascula al inicio del es udio. T as un seguimien o de 10.9 años, se 62 de ec ó un iesgo de su i e en os ca dio ascula es un 57% meno en aquellos pa icipan es con la adhe encia más al a a la die a medi e ánea. Es os esul ados con i ma on que adop a los hábi os alimen a ios de la die a medi e ánea puede con a es a algunos de los e ec os ca dio ascula es ad e sos causados po el sob epeso/obesidad g acias a sus e ec os an iin lama o ios [205], aunque no solo en pe sonas de a anzada edad con ele ado iesgo ca dio ascula , sino ambién en pe sonas jó enes, sanas y de al o ni el educa i o. Va ios es udios de in e ención clínica han compa ado el e ec o log ado sob e la pé dida de peso o ausencia de ganancia de peso co po al asociado a la die a medi e ánea con o as die as que adicionalmen e se ecomiendan adop a . I is Shai e al. [337] analiza on el e ec o sob e la pé dida de peso en 322 pacien es que adop a on una die a con bajo con enido g aso, o a con bajo con enido en ca bohid a os, y la die a medi e ánea, as un seguimien o de dos años. Aunque odos los g upos pe die on peso, la mayo educción se de ec ó en los g upos que consumie on la die a con bajo con enido de ca bohid a os (con una pé dida de 4.7 kg de media) y la medi e ánea (con una pé dida de 4.4 kg de media). En cambio, con el consumo de la die a de bajo con enido g aso, solo se log ó una pé dida 2.9 kg de media. Es a ausencia de una pé dida signi ica i a de peso co po al asociada a una die a de bajo con enido g aso ambién se obse ó el ensayo clínico Women´s Hea h Ini ia i e Die Modi ica ion T ial (WHI DMT) [338], lo que sugie e que la adhe encia a la die a medi e ánea en iquecida con AOV es una mejo opción pa a pe de peso que adop a una die a baja en g asa. Se ha p opues o que es a ausencia de ganancia de peso y la mejo a de la condición de sob epeso u obesidad pod ía se debida al inc emen o de la oxidación pos p andial de las g asas, la e mogénesis inducida po la die a y, undamen almen e, po el gas o ene gé ico es imulado po el consumo de acei e de oli a [339] y su e ec o sacian e [340]. d) Los MUFA, la esis encia a la insulina y la diabe es melli us ipo-2 La calidad de las g asas p oceden es de la die a pa ece se de e minan e en el e ec o de la die a sob e la sensibilidad a la insulina. De la misma mane a que ocu e con los ni eles en ci culación de lípidos, los SFA han mos ado al e a el con ol glicémico y la sensibilidad a la insulina [341]. Así pues, el eemplazo de los SFA p oceden es de la die a po ca bohid a os o MUFA ha pe mi ido ob ene impo an es mejo as en la sensibilidad a la insulina y espues a glicémica an o en indi iduos p edispues os a desa olla RI [342, 343] como en pe sonas sanas [344, 345]. 63 En el desa ollo de la DMT2, las células β-panc eá icas que sec e an insulina pa a con a es a los picos pos p andiales de glucosa en sang e, se en sa u adas y, como esul ado, comienzan a alla a la ho a de p opo ciona de mane a e ec i a los ni eles de insulina necesa ios pa a egula los ni eles de glucosa. El consumo de die as en iquecidas en MUFA ha mos ado eje ce una acción di ec a sob e la unción de las células β-panc eá icas [346]. En 1988 ya se demos ó que la adminis ación de una die a con al o con enido g aso, en iquecida en MUFA (33% de la ene gía o al) a pacien es con DMT2, esul ó en una educción de los eque imien os de insulina y una educción de la concen ación de glucosa en plasma con espec o a aquellos que consumie on una die a de bajo con enido g aso (25% de la ene gía o al) pe o al o en ca bohid a os (60% de la ene gía o al) [347]. O o es udio que apoya el e ec o bene icio de los MUFA en la educción de la RI ue el ealizado en el año 2008 po López S e al. [348], cuyos da os ob enidos e ela on que los MUFA mejo a on la sensibilidad a la insulina y la unción de las células β-panc eá icas en los 14 homb es sanos que pa icipa on en el ensayo clínico en compa ación con los SFA, obse ándose una educción linea di ec a en la RI a medida que se sus i uía SFA po MUFA [348]. De hecho, el es udio lle ado a cabo en Piza a po el g upo de Rojo-Ma inez e al. en 2006 [349] mos ó que los MUFA de la die a p oceden es del acei e de oli a y los PUFA con ibuyen a la a iabilidad de la unción de las células β-panc eá icas. El en iquecimien o de las memb anas celula es con ácido oleico a a és de su consumo con la die a ambién con ibuye a educi la RI. Ryan e al. [350] examina on la elación en e los cambios en la composición de AG de la memb ana celula y el anspo e de glucosa, y encon a on una educción en la RI cuando una die a ica en ácido linoleico se cambiaba po una ica en ácido oleico. e) Los MUFA y su in luencia sob e la p esión a e ial La hipe ensión es la causa p e enible más impo an e de las en e medades ca dio ascula es y acciden es ce eb o ascula es del mundo. Si no se con ola, puede p o oca un in a o de mioca dio, un ensanchamien o del co azón y, a la la ga, una insu iciencia ca diaca. Los asos sanguíneos pueden desa olla p o ube ancias (aneu ismas) y zonas débiles que los hacen más suscep ibles de obs ui se y ompe se. También puede ocasiona que la sang e se il e en el ce eb o y p o oque un acciden e ce eb o ascula , e incluso p o oca de iciencia enal, cegue a y de e io o cogni i o. 64 Las p obabilidades de su i un in a o de mioca dio, un acciden e ce eb o ascula o insu iciencia enal a consecuencia de la hipe ensión, se pueden inc emen a po o os ac o es como el consumo de abaco, una die a poco saludable, el uso noci o del alcohol, la inac i idad ísica y la exposición a un es és pe manen e, así como la obesidad, el coles e ol al o y la diabe es melli us (OMS). En la li e a u a cien í ica se pueden encon a es udios epidemiológicos y clínicos que co obo an el e ec o bene icioso que iene el consumo de die as con ele ado con enido en MUFA p oceden e del acei e de oli a sob e la p esión a e ial. Es el caso del me a-análisis ealizado en el año 2011 po Schwingshackl e al. [351], a a és del cual in es iga on los e ec os a la go plazo (>6 meses) de die as con ele ado con enido en MUFA (>12% MUFA) en e a die as con bajo con enido en MUFA (<12%MUFA) sob e los ac o es de iesgo ca dio ascula es. Sus esul ados mos a on que las die as icas en MUFA educen signi ica i amen e la masa g asa y la p esión a e ial sis ólica (PAS) y dias ólica (PAD). Es os hayazgos coincidían con los ob enidos p e iamen e en el es udio EPIC-NL [352]. A lo la go del es udio, los pa icipan es mos a on una educción del 44% del iesgo de mo alidad po ECV, y una meno incidencia de ca diopa ías, en e o as cosas, g acias a la p e ención de la hipe ensión en la población que pa icipó en el ensayo. Además, se hizo e iden e una elación in e sa en e el a io MUFA:SFA en sang e y la p esión sanguínea a e ial, lo que co obo ó el e ec o del ácido oleico en la educción de la p esión sanguínea [353]. El p oyec o SUN ambién e eló que la inges a de acei e de oli a du an e un iempo p omedio de 28.5 meses es aba asociado con una educción en la incidencia de la hipe ensión, aunque únicamen e en la población masculina que pa icipó en el es udio [304]. El e ec o hipo ensi o del acei e de oli a ha sido compa ado con die as icas en SFA o PUFA, así como o as uen es con al o con enido en MUFA dis in as al acei e de oli a como es el acei e de gi asol al o oleico. La adhe encia a die as con al o con enido en MUFA educen la p esión a e ial en compa ación con die as icas en SFA [310], y aunque el consumo de PUFA ambién log a educi la p esión a e ial, es e e ec o es mayo con las die as icas en MUFA. Fe a a e al. [354] e ela on con su es udio que los pacien es a los que se les adminis ó acei e de gi asol (una uen e ica de PUFA) con la die a, necesi a on más medicación pa a con ola su hipe ensión que aquellos a los que se les dio una can idad equi alen e de acei e de oli a. Y cuando se ha compa ado el consumo de acei e de oli a con el de acei e de gi asol al o oleico, ambos con un con enido simila de MUFA, sob e un g upo de muje es hipe ensi as de ele ada edad, se ha de ec ado que el AOV consumido 65 sigue siendo más e ec i o en educi la p esión sanguínea [355]. Es o pa ece suge i que los mic onu ien es en el acei e de oli a juegan una pa e impo an e en su e ec o bene icioso sob e la hipe ensión. Los mecanismos a a és de los cuales el acei e de oli a educe la p esión sanguínea no es án del odo cla os, pe o deben es a elacionados con las al e aciones es uc u ales y uncionales que su en las memb anas de los e i oci os en caso de hipe ensión [355, 356], así como con cambios en la composición de AG de las memb anas plasmá icas de las células del endo elio ascula de la ao a [354]. Además, las p opiedades an ioxidan es de los MUFA y de los componen es meno es del acei e de oli a como los compues os enólicos, deben ambién con ibui a educi la p oducción de ROS e inc emen a la disponibilidad de NO, pe mi iendo así una mejo a de la unción endo elial [310, 357]. ) Los MUFA, la composición lipídica de las lipop o eínas a e ogénicas y su in luencia en la o mación de células espumosas El amaño y composición de las nue as pa ículas de QM sin e izadas, así como de los QM , dependen del amaño y composición de las go ículas lipídicas o madas en el in e io del en e oci o, lo cual iene de e minado po la composición de los lípidos abso bidos de la die a [74]. La p esencia de de e minados AG en las lipop o eínas a e ogénicas, y la p opo ción en la que se encuen an con espec o a los AG o ales, iene una impo an e epe cusión en el desa ollo de la placa a e oescle ó ica, ya que és o in luye sob e las di e en es ías de inco po ación de las lipop o eínas en los mac ó agos, y po an o, sob e la o mación de células espumosas [298, 358]. Uno de los es udios que ha co obo ado la in luencia del g ado de sa u ación de los AG componen es de la pa ículas sob e su in e acción con los ecep o es celula es de supe icie de los mac ó agos ue ealizado po De Pascale e al. [358]. En él, es udia on el e ec o de pa ículas de QM a i iciales en iquecidas con AG con di e en es g ados de sa u ación: SFA, MUFA, PUFA n-6, y PUFA n-3, sob e la o mación de células espumosas de i adas de mac ó agos THP-1.Esos AG ue on ob enidos median e la inco po acióon de TG aislados de acei e de palma, oli a, maíz, y acei es de pescado, espec i amen e. Es os au o es mos a on que las pa ículas a i iciales de QM que ue on sin e izadas con SFA o MUFA e an inco po adas po los mac ó agos más ápidamen e que las en iquecidas en PUFA n-6 o n-3, además de que aquellas en iquecidas en SFA ue on las que induje on la mayo inco po ación lipídica en el in e io de las células. Esos mismo esul ados ue on ob enidos pos e io men e en el abajo expe imen al ealizado po Quin e o-Flo ez e al. 66 [298]. Tales e elaciones pusie on de mani ies o que exis en ac o es que in luyen en la inco po ación de las pa ículas QM , unas de las lipop o eínas más a e ogénicas, po los mac ó agos, y su amaño de pa ícula y composición de AG pa ecen se ele an es en el p oceso de cap ación y acumulación de lípidos [359]. Es e hecho, a su ez, es de e minan e pa a la acumulación de coles e ol y TG en los mac ó agos, a ec ando a su me abolismo y modulando de su pe il a e ogénico [360]. g) Los MUFA y la modulación de los ni eles de exp esión de genes in oluc ados en la o mación de células espumosas El con enido lipídico de los alimen os iene la capacidad de modula los ni eles de exp esión génica y p o eica y, en consecuencia, la p oducción de me aboli os, y la modulación de la exp esión gené ica juega indudablemen e un papel impo an e en la p e ención de la a e oscle osis. És e es un hecho del que enemos conocimien os desde hace ela i amen e poco iempo g acias a los a ances cien í icos en el campo de la nu igenómica, la ciencia que es udia la in e acción en e los componen es die é icos de los alimen os y los genes. En los úl imos años, es án siendo publicados es udios que es án demos ando la capacidad de los MUFA pa a modula la exp esión de genes p oa e ogénicos in oluc ados en la in lamación ascula [226, 361], eclu amien o de monoci os en el luga de la lesión y la modulación de los ni eles de sín esis de ma cado es de in lamación [308]. Además, se ha suge ido que uno de los e ec os saludables del acei e de oli a en la p o ección en e a la a e oscle osis puede se la educción de la capacidad de los mac ó agos p esen es en la lesión a e oscle ó ica de inco po a lipop o eínas. Es o es posible g acias a la capacidad de los MUFA y poli enoles que con iene pa a modula los ni eles de exp esión de ecep o es de supe icie an o en humanos [226], como en a ones [362], educiendo así la o mación de células espumosas y los e en os ombó icos [361]. En el es udio desa ollado po Llo en e-Co és e al. [226], se e aluó el e ec o de la die a medi e ánea sob e la exp esión de genes p oa e ogénicos en poblaciones con ele ado iesgo ca io ascula . Sus esul ados indica on que la die a medi e ánea en iquecida en AOV p e enía de o ma especí ica la sob eexp esión de LRP-1, uno de los ecep o es de mayo impo ancia en la o mación de células espumosas, lo que ha sido con i mado po o os es udios in i o [363, 364] como in i o [365, 366]. De hecho, pacien es con obs ucciones co ona ias mos a on ene una exp esión al e ada del ecep o LRP-1 en células sanguíneas mononuclea es [367, 368]. Uno de los 67 HIPÓTESIS a obesidad es conside ada la p incipal epidemia del siglo XXI debido a su c ecimien o impa able en e la población mundial adul a y una p e alencia cada ez mayo en e la población in an il. Es a en e medad, is a hoy día como un p oceso in lama o io c ónico de bajo g ado, se elaciona con un deso den en el me abolismo pos p andial de los lípidos. Cuando és e se man iene con el iempo, acaba gene ando o as complicaciones como esis encia a la insulina, hipe glicemia e hipe ensión. Es po ello que las pe sonas obesas ienen mayo iesgo de desa olla ECV, pa icula men e a e oscle osis, y se p e é que la obesidad se á an es del año 2030 esponsable del 80% de las mue es en odo el mundo. Los cos es globales que supone la obesidad en los Sis emas de Salud Pública son muy ele ados, y cada ez se án mayo es a medida que las en e medades asociadas a la obesidad sigan mani es ándose de o ma p og esi a. Po es e mo i o, educi su p e alencia se ha con e ido en una de las mayo es p io idades pa a los sis emas sani a ios en muchos países an o desa ollados como en ías de desa ollo. El con enido g aso de los alimen os ha demos ado se una pieza cla e en la de e minación de una salud óp ima en el indi iduo debido a su capacidad pa a in lui sob e los ac o es de iesgo ca dio ascula y de es a implicado di ec amen e en el p oceso a e oscle ó ico. Debido a ello, exis e un g an in e és po desa olla e implemen a es a egias e ec i as pa a educi los ac o es de iesgo po medio de las in e enciones die é icas, pues han sido iden i icadas como una he amien a especialmen e impo an e pa a e apias de p e ención p ima ia y a amien os secunda ios. Muchos son los abajos cien í icos que han demos ado los bene icios apo ados po la adhe encia a los pa ones alimen a ios adicionales de la die a medi e ánea en e a la mo alidad y los e en os clínicos ca dio ascula es. Es o es posible g acias a su ca ác e an ioxidan e, an iin lama o io, an i ombó ico, su capacidad pa a p e eni la pe oxidación lipídica y pa a mejo a en pe il lipídico y la unción endo elial. Aunque los mecanismos de p o ección no son del odo comp endidos, una de sus ca ac e ís icas más des acables es su ele ada concen ación de g asas insa u adas, p incipalmen e de MUFA p opo cionados po el acei e de oli a como uen e de g asa mayo i a ia, el cual ep esen a has a el 70% del o al de los lípidos consumidos con es a die a. 74 L Los e ec os an ia e ogénicos p opo cionados po los MUFA han sido ampliamen e documen ados, y se ha demos ado que ayudan a educi no solo la dislipidemia, sino ambién la obesidad y su cuad o in lama o io c ónico, educiendo con ello el es o de ac o es de iesgo que con ibuyen con el sínd ome me abólico y el desa ollo de en e medades ca dio ascula es a e oscle ó icas. En la ac ualidad, podemos encon a en la li e a u a cien í ica es udios sob e las p opiedades ca diop o ec o as p opo cionadas po die as icas en g asas insa u adas, sin emba go, pocos han sido ealizados con la pa icipación de pe sonas obesas. En es e con ex o, p oponemos la hipó esis de que un desayuno ipo medi e áneo en iquecido en MUFA con ibuye a mejo a el pe il lipídico pos p andial y la espues a in lama o ia p esen e en los suje os obesos pa icipan es del es udio, así como a educi la o mación de células espumosas du an e las p ime as ases del desa ollo de la a e oscle osis, con espec o a un desayuno de ipo occiden al. 75 OBJETIVOS a a cumpli el p esen e p opósi o, nos plan eamos los siguien es obje i os: 1. Valo a la in luencia de una ca ga lipídica sob e el me abolismo lipídico pos p andial e in lamación ascula en adul os obesos en e a con oles no mopesos. 2. De e mina los e ec os di e enciales de un desayuno de ipo medi e áneo en e a un desayuno de ipo occiden al sob e el me abolismo lipídico pos p andial en adul os obesos. 3. De e mina los e ec os di e enciales de un desayuno de ipo medi e áneo en e a un desayuno de ipo occiden al sob e la sín esis de ma cado es de in lamación en suje os obesos con espec o a suje os no mopesos. 4. Es udia el e ec o de las lipop o eína icas en iglicé idos pos p andiales aisladas de adul os obesos sob e la o mación de células espumosas. 5. Analiza la capacidad del componen e lipídico de las lipop o eínas icas en iglicé icos pa a modula la ac i idad de la LPL en mac ó agos. 76 P MATERIALES Y MÉTODOS 77 1. ESTUDIO DE LA RESPUESTA LIPÍDICA POSTPRANDIAL EN SUERO TRAS LA INGESTA DE UN DESAYUNO DE TIPO MEDITERRÁNEO Y UN DESAYUNO DE TIPO OCCIDENTAL EN ADULTOS OBESOS 1.1 Selección y ca ac e ís icas de los pa icipan es del es udio n o al de 24 suje os ue on eclu ados pa a pa icipa en el p esen e es udio, odos ellos a ones adul os con una edad media de 26.2 ± 4.3 años. Se les omó las medidas an opomé icas y, a endiendo su índice de masa co po al (IMC), se les di idió en dos g upos: 12 con oles o no mopesos (IMC en e 20-25 Kg/m2) y 12 obesos (IMC > 30 Kg/m2). La pa icipación ue olun a ia, así como la posibilidad de e i a se del es udio en cualquie momen o. Median e his o ial médico se e i icó que odos los olun a ios pa icipan es del es udio ca ecían de p oblemas diges i os y de as o nos me abólicos, no omaban suplemen os alimen icios y no es aban bajo a amien o con ninguna medicación. Además, odos ellos se some ie on a un análisis bioquímico y hema ológico ealizado po los p o esionales sani a ios del Hospi al Vi gen del Rocío, pa a comp oba que se a aban de suje os sanos y que no cumplían los c i e ios de exclusión es ablecidos, así como que p esen aban unos alo es de pe il lipídico plasmá ico den o de los in e alos de e e encia. En la abla 2 se mues an los esul ados del pe il lipídico plasmá ico y de los pa áme os de bioquímica de los olun a ios ob enidos an es de comenza el es udio. Los alo es que se ob u ie on con i ma on que odos los pa icipan es cumplían con los equisi os es ablecidos. Todos los ensayos se ealiza on de acue do con los p incipios undamen ales de la Decla ación de Helsinki de 1975 ( e isada en 2000), del Con enio del Consejo de Eu opa, y de la Decla ación Uni e sal de la UNESCO. Con es e in se elabo ó un p o ocolo pa a el es udio con humanos que ue ap obado po el Comi é Ins i ucional pa a In es igación en Humanos del Hospi al Uni e si a io Vi gen del Rocío de Se illa. Los suje os olun a ios die on consen imien o esc i o a es e p o ocolo después de se con enien emen e in o mados, an o o almen e como po esc i o, y ue on exho ados a e i a el consumo de bebidas alcohólicas y abaco du an e el día p eceden e al comienzo del expe imen o. 78 U Tabla 2 Ca ac e ís icas an opomé icas, p esión sanguínea, ni eles basales de lípidos y concen ación de glucosa e insulina en sue o de los pa icipan es del es udio. Pa áme os Adul os No mopesos Obesos Núme o de suje os 12 12 Edad 27.3±3.0 35.8 ± 12.0* Peso (Kg) 74.9 ± 7.8 112.9 ± 13.5*** Al u a (cm) 179.6 ± 7.0 180.8 ± 5.2 IMC (Kg/m2) 23.2 ± 1.1 34.7 ± 5.0*** P esión sis ólica (mmHg) 110.9 ± 12.7 130.8 ± 16.3** P esión dias ólica (mmHg) 68.9 ± 7.3 74.5 ± 10.1 Glucosa (mg/dl) 73.7 ± 4.7 83.6 ± 8.3** Insulina (mU/ml) 4.9 ± 2.7 12.6 ± 3.5*** HOMA-IR 0.9 ± 0.5 2.4 ± 1.2*** T iglicé idos (mg/dl) 78.7 ± 24.5 129.7 ± 60.3* Coles e ol (mg/dl) 172.5 ± 32.6 202.9 ± 34.6* LDL-c (mg/dl) 94.7 ± 19.4 158.7 ± 16.7*** HDL-c (mg/dl) 57.5 ± 9.5 45.9 ± 8.5** Los da os es án exp esados como media ± SD; n=12 en odos los g upos. IMC: índice de masa co po al; HOMA-IR: modelo homeos á ico de medida de la esis encia a la insulina; LDL-c: coles e ol asociado a lipop o eínas de baja densidad; HDL-c: coles e ol asociado a lipop o eínas de al a densidad. Las di e encias es adís icas en e los dos g upos ue on analizadas median e es de S uden no pa eado. * =P <0.05, **= P <0.01, *** =P <0.001 s. No mopesos. 79 1.2 Diseño expe imen al de la in e ención die é ica La in e ención die é ica pos p andial se ealizó en dos e apas siguiendo el siguien e esquema de in e ención: Figu a 9. Esquema del diseño expe imen al. An es de comenza con la inges a de las die as expe imen ales, se le ealizó a los olun a ios una ex acción de sang e pa a medi de los ni eles basales de los pa áme os a conside a , siendo es a mues a la co espondien e a las 0 ho as del ensayo. Las die as expe imen ales ue on adminis adas a los olun a ios como un único desayuno as un ayuno de 12 ho as. Al inicio del ensayo, los olun a ios consumie on uno de los ipos de desayuno es udiados (medi e áneo u occiden al), ealizando inmedia amen e después la ex acción de sang e a di e en es iempos du an e el pe iodo pos p andial. T anscu ida al menos una semana de la ado pa a e i a in e e encias en e pe íodos expe imen ales, se p ocedió con la segunda ase del ensayo. En ella, aquellos pa icipan es que inicialmen e consumie on el desayuno medi e áneo, en la segunda ase consumie on el desayuno occiden al, y ice e sa. T as la inges a de la die a expe imen al de la segunda ase, de nue o se lle ó a cabo la oma de mues as sanguíneas en ase pos p andial. De es a mane a, odos los pa icipan es del es udio consumie on ambos ipos de die as expe imen ales, siguiendo un diseño alea o izado y c uzado ( igu a 9). 80 Desayuno Occiden al Desayuno Occiden al Desayuno Medi e áneo Desayuno Medi e áneo 1 Semana (pe íodo de la ado) PERÍODO EXPERIMENTAL 1.3 Ensayo pos p andial El p oceso seguido pa a la oma de mues as du an e el ensayo pos p andial y es udio pos e io de la espues a lipídica pos p andial en sue o de los olun a ios as la inges a de las die as expe imen ales se ep esen a en la igu a 10. Figu a 10. Esquema ep esen a i o del p oceso seguido pa a la oma de mues as sanguíneas de los olun a ios en ayunas y du an e el pe iodo pos p andial, con el in de ob ene el sue o sob e el que se ealiza án los análisis expe imen ales. 81 No mopesos (n=12) Obesos (n=12) Ex acción basal 0h In e ención die é ica Ex acción pos p andial 1, 2, 3, 4, 5 y 6h De e minación del pe il lipídico Ob ención sue o 1, 2, 3, 4, 5 y 6h Es udio de los ma cado es de in lamación Ca ac e ización de las TRL aisladas 1.3.1 Ex acción basal T as 12 ho as de ayuno noc u no, a cada olun a io se le ex ajo una mues a de 9 mL de sang e en condiciones basales po punción de la ena cubi al con un sis ema Sma si eTM equipado con acu aine (Vacu aine ®, Meylen, Cedex, F ancia). La sang e ue ecogida en ubos Vacue e® con sepa ado pa a sue o Clo Ac i a o . 1.3.2. Inges a de las comidas expe imen ales Inmedia amen e después de la ex acción basal, los suje os ecibie on la comida expe imen al. Las die as expe imen ales empleadas consis ie on en un desayuno de ipo medi e áneo y un desayuno de ipo occiden al. La can idad de g asa adminis ada en ambos desayunos ue equi alen e a 0.75 g po Kg de peso co po al de los olun a ios pa icipan es del es udio. •El desayuno de ipo medi e áneo se compone po acei e de oli a “Ca dioli a®” (55 g), oma e na u al i u ado (20 g), pan “Pan ico línea” (ma ca come cial) ( es ebanadas po olun a io; 23.7 g/ ebanada), zumo de na anja (250 ml) y un aso de leche desna ada (200 ml). El acei e de oli a inge ido con el desayuno de ipo medi e áneo denominado “Ca dioli a” ue p opo cionado po la compañía Oleícola El Teja S.C.A (El Teja , Có doba). Los da os de la composición de la acción saponi icable e insaponi icable ue on acili ados po dicha compañía, y se de allan en la abla 3. •El desayuno de ipo occiden al es aba o mado po man equilla (55 g), pan “Pan ico línea” ( es ebanadas po olun a io; 23.7 g/ ebanada) y un aso de leche desna ada (200 ml) con cacao (20 g). La man equilla suminis ada a los olun a ios ue una come cial, y la composición de AG y coles e ol ue p e iamen e analizada po nues o labo a o io del Ins i u o de la G asa. La composición de la man equilla se indica ambién en la abla 3. 82 Tabla 3. Composición de AG del acei e de oli a, como uen e de g asa del desayuno de ipo medi e áneo, y de la man equilla, como uen e de g asa del desayuno de ipo occiden al. Los da os es án exp esados como: media ± SD; n= 3 (acei e de oli a) y n=5 (man equilla). La can idad de cada AG se exp esa como % del o al de AG con enidos. La composición de la comida expe imen al se de alla en la abla 4, y ue ecogida de la in o mación decla ada en los en ases de cada uno de los alimen os inco po ados en los desayunos. Tabla 4. Tabla de la composición de los desayunos adminis ados. 83 Acei e de oli a Man equilla AG MEDIA (%) SD MEDIA (%) SD 10:0 1,77 0,03 12:0 2,66 0,03 14:0 10,15 0,04 14:1 1,13 0,01 16:0 9,94 0,02 33,18 0,17 16:1 n-7 0,81 0,00 2,33 0,04 18:0 3,31 0,01 13,85 0,07 18:1 n-9 3,11 0,13 18:1 n-9c 77,69 0,05 27,47 0,11 18:2 n-6 3,47 0,03 18:3 n-3 1,14 0,01 0,56 0,02 20:0 0,45 0,02 20:4 n-6 0,32 0,01 2022 1963 485 471 15 14 62 53 36 26 57 53 8 32 44 15 5 2 0 104 7 6,4 Desayuno ipo medi e áneo Desayuno ipo occiden al Ene gía (kJ) Ene gía (kcal) P o eínas (g) Hid a os de ca bono (g) Azúca es (g) G asas (g) - Sa u adas (g) - Monoinsa u adas (g) - Poliinsa u adas (g) Coles e ol (mg) Fib a (g) Una ez se han p epa ado los eac i os p opo cionados po el ki , ealiza una cu a pa ón de seis pun os con un ango de concen ación de 400-12.5 pg/ml median e diluciones se iadas del es ánda de TNF-α p opo cionado y p e iamen e econs i uido. Añadi 200 µl de mues a de sue o sin dilui , es ánda es, con oles y blanco en los pocillos co espondien es de la mic oplaca y, a con inuación, añadi a los mismos pocillos 50 µl del an icue po an i-TNF-α bio inilado. Cub i la placa e incuba 3 ho as. La a la placa 3 eces con 300 µl de solución de la ado y añadi 100 µl del an icue po conjugado con es ep a idina-HRP a odos los pocillos. Cub i de nue o e incuba 30 minu os. La a la placa 3 eces con 300 µl de solución de la ado y añadi 100 µl de solución TMB a odos los pocillos. P o ege de la luz e incuba 12-15 minu os. La eacción enzima-sus a o se de iene añadiendo 100 µl de solución H2SO4. Medi inmedia amen e la abso bancia en el lec o de placas a 450 nm. Medi ambién la abso bancia a 620 nm y subs ae dicha lec u a a la ob enida a 450 nm pa a co egi impe ecciones óp icas. De e mina la concen ación de la mues a desconocida a pa i de la cu a pa ón p epa ada. 90 3. CARACTERIZACIÓN DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS POSTPRANDIALES as habe ealizado el es udio de la in luencia de dos uen es de g asa di e en es, acei e de oli a y man equilla, p opo cionadas po los desayunos expe imen ales (medi e áneo y occiden al) sob e el pe il lipídico pos p andial y pa áme os bioquímicos en adul os obesos, se analizó la composición lipídica de las pa ículas de TRL sin e izadas as la inges a de los desayunos. Pa a ello, se ca ac e iza á la composición de las TRL aisladas a ni el lipídico y p o eico ( igu a 12). Figu a 12. Esquema del p oceso seguido pa a la ca ac e ización de las TRL aisladas de los sue os de los pacien es, que ue on ob enidos de las mues as de sang e ex aídas an es (0 h) y 2 h y 4 h después de consumi las die as expe imen ales. 91 1. Ex acción de lípidos o ales 2. Sepa ación: FL y TG 3. Me ilación de ácidos g asos 4. Pe il c oma og á ico de ácidos g asos Ca ac e ización de TRL Aislamien o de TRL del sue o De e minación de la composición lipídica De e minación de la composición p o eica Cuan i icación de Apo B o al Cuan i icación de p o eínas o ales T 3.1 Aislamien o de las lipop o eínas icas en iglicé idos de sue o Las TRL (densidad <0.93 Kg/L) ue on ob enidas a pa i de 4-4.5 ml de sue o deposi ado bajo 7 ml de una solución de NaCl al 0.9% (m/ ) (densidad 1.006 Kg/L) con enida den o de ubos Polyallome TM (Beckman Ins umen s, Inc., Palo Al o, EEUU). Las TRL se aisla on median e ul acen i ugación como desc ibie on Mills e al. (1986) (39.000 pm, 16 ho as, 12ºC), u ilizando un o o SW 41 Ti en una ul acen í uga p epa a i a Beckman Coul e L90K (Beckman Ins umen s, Inc., Palo Al o, EEUU). T as el p oceso de sepa ación, se ecogió la ase blanquecina que quedó sepa ada po lo ación en la pa e supe io del ubo. 3.2 Ca ac e ización de la composición de las lipop o eínas icas en iglicé idos 3.2.1 Ex acción de lípidos o ales de las TRL Los olúmenes de TRL ob enidas a pa i del sue o, ue on ajus ados a 1.5 ml de olumen inal con una solución de clo u o po ásico (KCl) 0.1 M (Me ck, Da ms ad , Alemania). Seguidamen e, los lípidos o ales ue on ex aídos siguiendo una modi icación del mé odo de Folch e al. [412], como se desc ibe a con inuación. Las TRL se coloca on en un ubo cónico y se añadie on 5 ml de clo o o mo:me anol (2:1, / ) (BDH/P olabo, Pa ís, F ancia). T as agi a se igo osamen e du an e 1 minu o, los ubos pe manecie on en eposo has a sepa a se dos ases bien di e enciadas con una pequeña in e ase en e ambas. En caso de no ob ene dicha sepa ación, se añadie on a ias go as de KCl 0.1 M y se agi ó igo osamen e de nue o, seguido de un pe íodo de eposo. Con el in de a o ece el p oceso de sepa ación de las ases, se cen i ugó a 3.000 pm du an e 10 minu os y se ob u ie on es ases: en la pa e supe io , la ase me anólica o hid oalcohólica, o mada po me anol y la solución de KCl; en el cen o, la in e ase, que con enía p ecipi ados de p o eínas, y puede p esen a lípidos adso bidos sob e és as; y po úl imo, en la pa e in e io se encon aba la ase clo o ó mica que con enía los lípidos. La ase clo o ó mica ue ecogida y il ada sob e un papel de il o Wha man nº1 (Wha man Pape L d., Maids one, Reino Unido) que con enía sul a o sódico anhid o (Me ck, Da ms ad , Alemania), con el obje o de e ene las azas de agua que pudie an habe sido 92 a as adas, y se colocó en un ubo pa a e apo ado . La ase acuosa ue la ada con 2 ml de la mezcla clo o o mo:me anol (2:1, / ) que se añadie on al ubo o iginal. Los ubos se agi a on igo osamen e du an e 1 minu o y se cen i uga on de nue o a 3.000 pm du an e 10 minu os en una cen í uga de o o asculan e (Eppendo Cen i uge 5804R, Hambu g, Alemania). La ase clo o ó mica se ecogió y se añadió a la ob enida an e io men e as su il ación. Una ez inalizada la segunda ex acción, el ex ac o clo o ó mico ue e apo ado a sequedad con ayuda de un o a apo (Büchi Labo echnic AG, Flawil, Suiza) a una elocidad de o ación de 160 pm. El o a apo es aba acoplado a un baño con agua des ilada a 40 ºC y a una bomba de acío pa a acele a el p oceso. Los lípidos ob enidos se edisol ie on en 0.5 ml de clo o o mo:me anol (2:1, / ), del cual se omó una alícuo a de 200 µl pa a la sepa ación de TG y FL median e ex acción en ase sólida (Solid Phase Ex ac ion, SPE). Los iales, he mé icamen e ce ados con apón de e lón, se man u ie on a -20 ºC, en a mós e a de ni ógeno pa a e i a la oxidación de los lípidos has a el momen o de su p ocesamien o. 3.2.2 Sepa ación de acciones de lípidos median e ex acción de ase sólida Los TG y FL p esen es en la acción de lípidos o ales se aisla on median e ex acción en ase sólida (SPE). Es a écnica es á basada en el mismo p incipio que la c oma og a ía líquida, po lo que en el in e io de dichas columnas ienen luga ue es in e acciones de ipo e e sible en e el anali o y la ase es aciona ia. Los p ocesos de sepa ación en ase no mal implican: un anali o pola disuel o en una ma iz de pola idad media o no pola y una ase es aciona ia pola , o mada po g upos pola es unidos a una supe icie de sílice. La e ención de un de e minado anali o bajo las condiciones de una columna no mal se debe, p incipalmen e, a in e acciones en e los g upos uncionales pola es del anali o y los g upos pola es sob e la supe icie del adso ben e. Los compues os abso bidos po es os mecanismos son eluídos al pasa a a és de la columna un sol en e que al e e su mecanismo de unión, no malmen e un sol en e más pola que la ma iz o iginal de la mues a. 93 En nues o es udio se emplea on columnas de ase no mal ipo LC- Diol que p esen an g upos hid oxilo unidos a la sílice (SupelcleanTM LC-Diol, Supelco, Belle on e, EEUU) con 3 ml de capacidad y 45 µm de amaño de pa ícula. Las columnas LC-Diol se coloca on en un sis ema de elución acoplado a una bomba de acío y se acondiciona on la ando con dos olúmenes de hexano (3ml x 2), e i ando que la columna ol ie a a sequedad as el segundo la ado. A con inuación, se dispusie on 200 µl de lípidos o ales sob e las columnas. Una ez en ó la mues a en con ac o con la columna, se añadie on dos olúmenes de hexano:clo u o de me ileno (9:1, / ) (VWR Chemicals, In ., EEUU ) y se deja on pasa po la columna pa a ecoge los TG eluídos en el ubo co espondien e. Pa a ob ene los FL se añadió un olumen de me anol seguido de o o olumen de ace ona (VWR Chemicals, In ., EEUU), que as su paso a a és de la columna a as a on los FL eluyéndolos en los ubos p epa ados pa a al e ec o. Finalmen e, se la ó la columna con cinco olúmenes de ace ona y se secó bajo co ien e de ni ógeno. Los TG y FL ob enidos ue on lle ados a sequedad bajo co ien e de ni ógeno y se edisol ie on en 500 µl de clo o o mo:me anol (1:1, / ). Los TG y FL aislados se án empleados pa a el análisis de los és e es me ílicos de AG median e la écnica de c oma og a ía de gases (CG). 3.2.3 Análisis de és e es me ílicos de AG de iglicé idos y os olípidos La de e minación de la composición de AG de TG y FL se lle ó a cabo median e c oma og a ía de gases (GC). La GC es una écnica c oma og á ica en la que la mues a se ola iliza y se inyec a en la cabeza de una columna c oma og á ica. La CG se desa olla en una columna ce ada en la que se encuen a e enida la ase es aciona ia y po la que se hace pasa el gas po ado , siendo la écnica de sepa ación la elución. Iniciado el p oceso c oma og á ico los componen es de la mezcla se dis ibuyen en e la ase es aciona ia y la ase mó il, po lo que la elución iene luga o zando el paso de un gas ine e a a és de la columna. A di e encia de o os ipos de c oma og a ía la ase mó il no in e acciona con las moléculas del anali o y su única unción es la de anspo a la mues a a a és de la columna. 94 Pa a ello, los AG ue on p e iamen e de i a izados a és e es me ílicos de ácidos g asos ( a y acid me hyl es e s, FAME) de bajo pun o de ebullición, siguiendo el p ocedimien o de me ilación en calien e basado en el mé odo B del anexo 10 con enido en el Reglamen o de la UE CE 2568 /91 (pun o 4.2 del mé odo IUPAC nº 2.301). El p incipio po el que se ob ienen los FAME a a és de es e mé odo se basa en una neu alización de los AG lib es y una me anólisis de los glicé idos, seguida de una es e i icación de los AG en medio ácido. Con es e ín, las alícuo as de 200 µl de TG y FL ue on ans e idas a ubos de me ilación, donde el disol en e ue e apo ado a sequedad en co ien e de ni ógeno empleando un e apo ado conec ado a co ien e de ni ógeno (Techne D i-Block DB-3D, Bibby Scien i ic Limi ed, S one, Reino Unido). T as añadi un pla o po oso a los ubos de me ilación, las acciones lipídicas ue on saponi icadas po la acción de 10 ml de me óxido sódico (Al a Aesa , Massachuse s, EEUU) a una concen ación del 0.5% en me anol anhid o (m/ ) y calen amien o du an e 30 minu os a 80ºC en un e mobloque (G upo-Selec a, Ba celona, España). Los FAME se o ma on as una neu alización con ap oximadamen e 2 ml de ácido sul ú ico (Sigma Ald ich, Missou i, EEUU) al 6% ( / ) en me anol anhid o, que se isualizó g acias a la p esencia de enol aleína (Scha lau, Ba celona, España) añadida p e iamen e; y después de un segundo calen amien o de 10 minu os a 80ºC, en el caso de FL ue on o os 30 minu os. T as a empe a los ubos, con el in de a o ece la sepa ación de las dis in as ases pa a el p oceso de ex acción, se añadie on 6 ml de una disolución sa u ada de NaCl (Sigma-Ald ich, Missou i, EEUU ) y se agi ó sua emen e. Pa a la ex acción de los FAME se añadie on 2 ml de hexano, se agi ó igo osamen e, y as un pe íodo de eposo se ecogió la ase supe io (hexano). Es a ope ación se epi ió dos eces más pa a op imiza la ex acción. El hexano ecogido se e apo ó a sequedad en co ien e de ni ógeno y los FAME se edisol ie on en 100 µl de hexano. Los FAME se man u ie on bajo e ige ación en ubos he mé icamen e ce ados has a p ocede con el análisis c oma og á ico. Un olumen de 2 µL de los FAME esul an es ue on inyec ados en el c oma óg a o de gases con la ayuda de una mic oje inga in eg ada en un inyec o au omá ico Hewle - Packa d 6890 Se ies (Hewle -Packa d, A ondale, EEUU) acoplado a un c oma óg a o de gases Hewle - Packa d 5890 Se ies II (Hewle -Packa d, A ondale, EEUU) y con olado po una es ación de da os ChemS a ion Re . A-03-02 (Hewle -Packa d, A ondale, EEUU). El c oma óg a o, equipado con un de ec o de ionización de llama (Flame Ioniza ion De ec o , FID) sepa ó los FAME g acias a una columna capila de sílice undida BPX70 SGE Analy ical Science (T ajan, 95 Vic o ia, Aus alia) de 10 m de longi ud, 0.1 mm de diáme o in e no y 0.2 µm de ilm de ecub imien o in e io . Como gas po ado se empleó ni ógeno a 2.0 ba es de p esión, además de una p esión de 1.5 ba es de ai e y 1.5 ba es de hid ógeno. Las empe a u as del de ec o y del inyec o se man u ie on cons an es a 270 ºC, mien as que la del ho no a ió a lo la go del análisis, pa iendo de una empe a u a inicial de 190 ºC, pa a pasa a una ampa de 5 ºC/min, con la que se alcanza on los 250 ºC, y e mina en égimen iso e mo has a el inal del análisis. Todo el p oceso supuso un iempo o al de 12 minu os. Los AG ue on iden i icados po compa ación de sus iempos de e ención con los de los pa ones inyec ados en las mismas condiciones. La cuan i icación se lle ó a cabo median e el cálculo del po cen aje ela i o de cada FAME espec o al o al. 3.3 Ca ac e ización de la composición p o eica en las lipop o eínas icas en iglicé idos 3.3.1 Cuan i icación del con enido de apolipop o eína B o al en TRL La can idad de apo B o al se de e minó median e inmuno u bidime ía. El ki u ilizado (BioSys ems, Ba celona, España) pe mi e que la apo B p esen e en la mues a p ecipi e en p esencia de los an icue pos de cab a especí icos que con iene. La dispe sión de la luz gene ada po los complejos an ígeno-an icue po es p opo cional a la concen ación de apo B y puede se cuan i icada po u bidime ía. Las medidas de u bidez se oma on a 340 nm con un espec o o óme o The mo Scien i ic Mul iskan Spec um (The mo Scien i ic, Massachuse s, EEUU). Las condiciones del ensayo ue on las indicadas po el ab ican e, a excepción de la cu a de calib ado con la que calcula la concen ación de apo B, la cual se elabo ó a pa i del pa ón apo B, con cinco pun os cuyas concen aciones es aban comp endidas en e 0- 1.278 μg/μl. 96 3.3.2 De e minación del con enido p o eico de las TRL La concen ación de p o eína o al en la acción de TRL se de e minó median e el ensayo colo imé ico desc i o po B ad o d [413], u ilizando el eac i o B ad o d 5x (SERVA Elec opho esis GmbH, Heidelbe g, Alemania). El mé odo de B ad o d se basa en el cambio que se p oduce en el espec o de colo del eac i o Comassie B illian Blue G-250 al uni se con p o eínas y que esul a en un cambio de su abso bancia máxima, pasando de 465 nm a 595 nm. El ensayo se ealizó en una placa de 96 pocillos y los alo es de abso bancia se egis a on en un lec o de placas de The mo Scien i ic Mul iskan Spec um (The mo Scien i ic, Massachuse s, EEUU), a 595 nm as 15 segundos de agi ación. Pa a el ensayo, se diluye on 20 µl de TRL has a la mi ad de su concen ación (1:2), po lo que se añadie on 20 µl de una solución de NaCl al 0.9% (m/ ). La ec a de calib ado se elabo ó con albúmina de sue o bo ino (BSA) a dis in as concen aciones (200-700 µg/ml) en NaCl al 0.9% (m/ ). En cada pocillo se dispusie on 10 µl de mues a y 200 µl de eac i o de B ad o d. Todas las placas incluye on una ec a de calib ado y un blanco, ealizado con NaCl al 0.9% (m/ ). Po úl imo, la eacción se dejó eposa en oscu idad du an e 15 minu os an es de medi su abso bancia a 595 nm en el lec o de placas. 97 4. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LAS LIPOPROTEINAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS POSTPRANDIALES EN LA FORMACIÓN DE CÉLULAS ESPUMOSAS na ez la composición de las TRL ha sido ca ac e izada, p ocedemos a es udia in i o la capacidad del componen e lipídico de las TRL pa a modula la cap ación de las pa ículas po los mac ó agos a a és de su in e acción con los ecep o es celula es de supe icie. De esa mane a, se e alua á su e ec o en el p oceso de o mación de células espumosas po la acumulación de lípidos in acelula men e. La igu a 13 ep esen a el p oceso expe imen al que se ha seguido en es a pa e del es udio. 98 U Figu a 13. Diseño del p oceso expe imen al seguido en el es udio de la in luencia de las TRL pos p andiales sob e el p oceso de inco po ación en mac ó agos y la pos e io o mación de células espumosas. 99 TRL Es udio de acumulación lipídica Tinción de lípidos in acelula es Ca ac e ización de los lípidos in acelula es 1. Ex acción de lípidos o ales 2. Sepa ación: FL y TG 3. Me ilación de ácidos g asos 4. Pe il c oma og á ico de ácidos g asos in acelula es Ni el de exp esión de ecep o es celula es 1. Ex acción mRNA 2. RT-qPCR Monoci os THP-1 Mac ó agos PMA 48 h Células espumosas Sonica eacción, las mues as ue on ans e idas a hielo. Siemp e que se desa olló una eacción de RT se incluye on en e la ba e ía de mues as un con ol nega i o sin ARN, pa a con i ma la pu eza de los eac i os u ilizados y desca a posibles con aminaciones po ADN genómico en las mues a de ARN. Reacción de PCR cuan i a i a La écnica de PCR pe mi e ampli ica el núme o de copias de una secuencia de ADN o ADNc g acias a la acción de una enzima polime asa, median e la epe ición sucesi a de un ciclo que cons a de es ases. Dichas ases se ca ac e izan po su du ación y sus di e en es empe a u as, las cuales pe mi en la desna u alización de las cadenas de ADNc, la hib idación de los cebado es, y la ex ensión de la cadena po la enzima polime asa. La eacción de PCR equie e la p esencia de cebado es, pequeños oligonucleó idos que se unen especí icamen e a una secuencia complemen a ia de ADN, pe mi iendo que la enzima polime asa comience la ex ensión de la heb a de ADN. Las secuencias codi ican es de los genes es udiados se ob u ie on de la base de da os GenebankTM. El diseño de las secuencias de los cebado es se ealizó con el so wa e P ime P emie 5.0 (P emie Bioso In e na ional, Palo Al o, EEUU), in en ando que el p oduc o inal no supe ase los 100 pa es de bases (pb) y que ue a posible some e a odos los cebado es a las mismas condiciones de empe a u a de anillado (60ºC). Además, el uso de la he amien a pa a la búsqueda de alineamien os BLASTN pe mi ió con i ma que la homología en e la secuencia de los cebado es y los genes de in e és e a única. Las secuencias de los cebado es diseñados se mues an en la abla 5 y ue on sin e izados po Sigma-Genosys L d. (Ha e hill, Reino Unido). 106 Tabla 5. Ca ac e ís icas de los cebado es sen ido y an isen ido u ilizados en la écnica de qPCR. Gen Genebank™ Cebado es sen ido y an isen ido (5’- 3’) Nucleó idos Tamaño amplicón (pb) LDLR AY114155 TGAAGTTGGCTGCGTTAATGTG CATTCGCCGCTGTGACACT 812-833 862-880 69 LRP-1 NM_002332 CCGGAGTGGTATTCTGGTATAAGC CTCCGCCTTCGTACATCTTGTA 13779-13802 13883-13904 126 VLDLR D16493 ATGTTATCCAGCGTGGACTTGA GGATGAGCTAGGAACTCCAGAGACT 1937-1958 1986-2010 74 SRA2 NM_002445 GCCAACCTCATGGACACAGA GCTGCAGAAGAATGTCATTAAATCTT 519-538 572-597 79 SRB1 BC080647 TTCTACACTCAGCTGGTGTTGATG AGCGCCAGGAGGAGCTACT 1415-1438 1461-1479 65 CD36 L06850 CTCTTTCCTGCAGCCCAATG ACTGTGAAGTTGTCAGCCTCTGTT 468-487 519-542 75 GAPDH AF261085 CAACGGATTTGGTCGTATTGG GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA 127-147 171-198 72 Ab e ia u as: LDLR, ecep o de las lipop o eínas de baja densidad; LRP-1, p o eína-1 elacionada con el LDLR; VLDLR, ecep o de lipop o eínas de muy baja densidad; SRA2, ecep o sca enge de clase A ipo 2; SRB1, ecep o sca enge de clase B ipo 1; CD36, ecep o sca enge CD36 y GAPDH, glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa. La écnica de qPCR se ca ac e iza po moni o iza la can idad de ADNc ampli icado a lo la go de la eacción de PCR median e el uso de écnicas de luo escencia, emi iéndose una señal p opo cional a la can idad de p oduc o ampli icado. Aunque exis en di e sos ipos de sondas y ma cado es luo escen es pa a la de ección de los p oduc os de qPCR, en nues o es udio se u ilizó SYBR G een I, un agen e in e calan e luo escen e especí ico de ADN bica ena io, cuyas longi udes de onda máximas de exci ación y emisión son 494 nm y 521 nm, espec i amen e. 107 Pa a lle a a cabo la eacción de qPCR se adqui ió el eac i o P ecision PLUSTM Mas e mix, de P ime Design (Chandle 's Fo d, Reino Unido). Po eacción, se añadió 150 ng de ADNc, 10 µl de P ecision PLUSTM mas e mix (P ime Design, Chandle 's Fo d, Reino Unido), 1 μl de cada uno de los cebado es especí icos sen ido y an isen ido (10 μM) y agua Milli-Q (Millipo e, Wa o d, Reino Unido) has a un olumen inal de 20 μl po eacción. Como con ol nega i o se incluyó una eacción con odos los elemen os sal o ADNc. Las eacciones se lle a on a cabo po iplicado pa a cada mues a en placas de 96 pocillos y se p ocesa on en un e mociclado CFX96TM Real-Time Sys em de BIORAD (Cali o nia, EEUU). La desc ipción de los iempos y empe a u as aplicados en cada ciclo de la eacción qPCR se de allan en la abla 6. Tabla 6. Condiciones de iempo, empe a u as y núme o de ciclos aplicadas a la eacción de pPCR. Fase Ciclos Tiempo Tempe a u a Obje i o 1 1 2 min 95ºC Desna u alización inicial y ac i ación de la enzima 2 39 15 seg 95ºC Desna u alización 60 seg 60ºC Hib idación de los cebado es y ex ensión. Colección de da os. 3 Cu a de disociación Comp obación de la especi icidad de los cebado es La de ección de los p oduc os de qPCR con SYBR G een I posee la en aja de su al a sensibilidad, aunque no es an especí ico como las sondas luo escen es y su uso equie e el análisis de la cu a de “mel ing” o cu a de disociación del p oduc o. Dicha cu a se ob iene as la ampli icación del ADNc, al ep esen a g á icamen e el descenso de la señal luo escen e (eje de o denadas) debido a la disociación del p oduc o de la qPCR con o me se inc emen a la empe a u a (eje de abscisas). La de i ada de dicha cu a debe esul a en un sólo pico cuyo máximo co esponde a la empe a u a de usión (Tm) del p oduc o de qPCR, la cual es especí ica pa a cada amplicón. Es o nos in o ma que el diseño de los cebado es es co ec o y especí ico del gen es udiado, así como de la ausencia de p ime dime o con aminaciones en la eacción. Así mismo, la Tm pe mi e moni o iza en dis in os días la co ec a o mación del amplicón espe ado. 108 Los p oduc os de la qPCR ue on analizados con el so wa e Op icon Moni o ™, Analysis So wa e V 2.01 (MJ Resea ch Inc., Wal ham, EEUU). El análisis de la cu a de disociación mos ó un único pico con la empe a u a espe ada pa a cada ánsc i o ampli icado. Los da os ob enidos se analiza on siguiendo un mé odo de cuan i icación ela i a, el cual indica el cambio de exp esión de un gen diana en una de e minada si uación expe imen al (células incubadas con TRL), espec o a una si uación con ol (células sin TRL). Además, pa a no maliza el esul ado de la qPCR espec o a las posibles di e encias en la can idad de ARN añadido a la eacción de RT, es e mé odo incluye la de e minación de la exp esión de un gen con ol in e no cuya exp esión es cons an e y no se e a ec ada po las condiciones expe imen ales. En el p esen e es udio, la cuan i icación del ADNc ampli icado se co igió en unción de la exp esión del gen de la glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa (GAPDH). Finalizada la eacción de qPCR con el luo ó o o in e calan e de la doble hélice SYBR G een I, se ob u ie on dis in os alo es del pa áme o ciclo umb al (CT, cycle h eshold) pa a cada gen en las dis in as condiciones expe imen ales. El alo de CT nos in o mó sob e el ciclo de la eacción de la polime asa a pa i del cual comenza on a exis i un núme o su icien e de copias de ADN pa a que la luo escencia emi ida sea supe io al ni el umb al. Así, una “mues a 1” de ADNc con un ele ado núme o de copias inicial end á un alo CT más bajo que o a “mues a 2” con un meno núme o de copias, pues la “mues a 1” necesi a á menos ciclos pa a alcanza el ni el umb al de luo escencia ( igu a 14). 109 Figu a 14. De ección de ADN po PCR cuan i a i a (qPCR). El núme o de ciclos (eje de abscisas) se ep esen a en e a la luo escencia emi ida po las dobles cadenas de ADNc (eje de o denadas). La cuan i icación de cada mues a (Mues a 1, 2 y 3) se ealiza a pa i del núme o de ciclos ( alo CT1, CT2, y CT3, espec i amen e) que necesi a cada mues a pa a alcanza el ni el umb al de luo escencia. Pa a cuan i ica los cambios de exp esión ela i os de los genes es udiados se empleó el mé odo 2-Δ Δ C . Pa a que es e mé odo sea álido, la e iciencia de ampli icación del gen diana debe se igual a la del gen de con ol in e no. Se ealiza on diluciones se iadas del ADNc, y se calculó la di e encia en e el CT del gen diana y el del gen de con ol in e no pa a cada dilución (ΔCT = CT,Diana - CT,GAPDH) an o en las mues as p oceden es de la si uación con ol como expe imen al. Seguidamen e, se hizo una segunda co ección en e ambas, pa a lo cual se calculó el pa áme o Δ∆CT= [ (CT,Diana - CT,GAPDH)+TRL - (CT,Diana - CT,GAPDH)-TRL]. Así, se pudo conclui que las di e encias de ciclo en e las dis in as condiciones e an a ibuidas al a amien o con TRL. Finalmen e, pa a da un alo ela i o de la a iación de la exp esión del gen diana en las células incubadas con TRL en e a la si uación con ol se calculó el pa áme o 2-∆∆C , cuya unción es ans o ma el da o ob enido en las co ecciones de CT an e io es en un alo numé ico que exp esa la can idad ela i a con espec o a la si uación con ol, a la cual se le asigna a bi a iamen e una can idad igual a 1. 110 Ciclos Fase exponencial Fase no exponencial CT1 CT2 CT3 Ni el umb al Mues a 1 Mues a 2 Mues a 3 5. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DEL COMPONENTE LIPÍDICO DE LAS LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE LA LIPOPROTEÍN LIPASA DE MACRÓFAGOS 5.1 P ocedimien o expe imen al os cul i os de monoci os THP-1 c ecidos en medio RPMI-1640 con L- Glu amina, 10% ( / ) de SFB y 50 µg/ml de Ga amicina, ue on semb ados a una densidad de 1x106 células/ml en medio de cul i o con PMA (160 mM). Después de 72 ho as, se le cambió el medio de cul i o a los monoci os THP-1 ya di e enciados a mac ó agos, po medio esco sin PMA. T anscu idas 24 ho as, se añadió 0.3 mM TG/ml de las pa ículas de QM sin e izadas a i icialmen e (chilomyc on emnan -like pa icles, CRLP) a los cul i os celula es. Los cul i os celula es con ol, a los que no se les añadió pa ículas a i iciales (-CRLP), pe manecie on con el mismo medio de cul i o. Los mac ó agos THP-1 se man u ie on a una empe a u a de 37°C y en una a mós e a de 5% CO 2 /95% ai e y, as un pe iodo de incubación de 6 y 24 ho as en p esencia de las CRLP, se p ocedió a ecolec a las di e en es acciones en las que end ía luga el análisis de la ac i idad de la LPL. Se abajó sob e hielo en odo momen o pa a e i a la pé dida de ac i idad de la enzima. T as ecoge el medio de cul i o, las células se a a on con nue o medio de cul i o p epa ado con hepa ina (100 IU/ml RPMI) (Lö ens, Malmö, Suecia) y 0.2% BSA (Sigma-Ad ich, S . Louis, MO), du an e 30 minu os a 4ºC. Ese medio se ecolec ó de nue o, ya que con end ía la LPL anclada a la supe icie celula , siendo libe ada al medio po su unión a la hepa ina. Pos e io men e, los mac ó agos ue on a ados con bu e de solubilización ío y, as causa la o u a celula , el con enido in acelula ambién ue ecolec ado pa a el es udio de la ac i idad de la LPL in acelula . Todas las alícuo as ue on almacenadas a -70ºC has a el momen o de análisis. En pa alelo, o os cul i os de mac ó agos THP-1 ue on a ados bajo las mismas condiciones e incubados con o sin las CRLP, pa a analiza la acumulación in acelula de lípidos. Además, con ellos se ealiza ía ambién el es udio de la modulación de los ni eles de exp esión de los genes codi ican es de la LPL y ANGPTL4 po acción de las CRLP p epa adas con di e en e con enido de TG. 111 L 5.2 P epa ación de las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP) Todos los lípidos ue on adqui idos a La odan Inc. (Malmo, Sweden). Las pa ículas a i iciales ue on p epa adas empleando una mezcla de lípidos, con la siguien e composición: 70% TG (OOO, LLL, o POP), 2% coles e ol, 5% és e de coles e ol (CE) y 25% de FL en NaCl al 0.9% p epa ado en bu e icina (20 mmol/L, pH 7.4), como ue desc i o po Redg a e & Ma anhao [415]. La composición de la acción de FL ue: 70.50% os a idilcolina, 6.88% liso os a idilcolina, 11.00% os a idile anolamina, 2.58 % os a idilinosi ol, 2.58% os a idilse ina y 6.54% es ingomielina. La mezcla lipídica ue sonicada median e inme sión de una sonda ul asónica (Bandelin Elec onics Be lin, Alemania) di ec amen e en la mezcla y aplicando un ol aje de 50W du an e 20 minu os (pulsos de 5 minu os al e nados con 5 minu os de eposo pa a pe mi i que se en íe) a una empe a u a de 56ºC. La emulsión esul an e ue ajus ada a una densidad de 1.21 g/ml con KB , y se lle ó a un ubo de plás ico con capacidad pa a 12 ml (Beckman). Sob e la solución lipídica, se p epa ó un g adien e de densidad (2.5 ml, d1.065 g/ml; 2,5 ml, d1.020 g/ml; 3 ml, d1.006 g/ml) como ue desc i o po Dia d e al. [416]. La p epa ación se cen i ugó a 11000 pm du an e 20 minu os a 12ºC en una cen í uga Beckman Op ima L-90 K (Beckman Coul e , Palo Al o, CA), u ilizando un o o basculan e SW41 Ti. Finalizada la cen i ugación, se eliminó la capa supe io , se eemplazó ese mismo olumen po solución NaCl (d1.006 g/ml), y se ol ió a cen i uga a 23500 pm du an e 1 ho a a 12ºC en el mismo o o . La capa supe io o mada que con iene las CRLP ue ecolec ada e incubada con el doble de su olumen de sue o d<1.020 de icien e, du an e 5 ho as a 37ºC con agi ación. La mezcla CRLP/sue o ue pos e io men e si uada en los ubos de cen i ugación (Beckman Coul e , Palo Al o, CA) con solución d1.006 sob e ella has a comple a el olumen del ubo, y ue cen i ugada a 3000 pm du an e 16 ho as a 12ºC, de nue o en un o o basculan e SW41 Ti. La capa supe io se ecogió, se le añadió 15 mg de NaCl, y se cen i ugó una ez más bajo una solución d1.006 a 4000 pm du an e 5 ho as a 12ºC. Po úl imo, después de ol e a ecolec a la capa supe io o mada, és a ue dializada en 2 L de solución salina NaCl 0.9% du an e 2 ho as con memb anas 4MWCO 12K-14K, 25mm, 1x30M (Spec a). El p oduc o inal ue almacenado a 4ºC has a su uso, sin excede los 3 días. 112 5.3 P epa ación de sue o d<1.020 de icien e El sue o ue aislado de una mues a de sang e humana ex aída en ayunas, median e cen i ugación a 3000 pm, 20 minu os a empe a u a ambien e. Se ajus ó un olumen de 5 ml del sue o ob enido a una densidad de 1.020 g/ml usando KB y, pos e io men e, se ans i ió a un ubo de cen i ugación. El sue o deposi ado en el ubo se cub ió po una solución de densidad 1.020 g/ml has a comple a los 14 ml de la capacidad del ubo, y se cen i ugó a 40000 pm a 22ºC, du an e la noche (16 ho as). La capa supe io o mada ue desechada, y el sue o que pe maneció en el ondo del ubo de cen i ugación se ecogió y se some ió a diálisis du an e 6 ho as en 2 L de solución salina al 0.9% NaCl a 4ºC, empleando las memb anas 4MWCO 12K- 14K, 25mm, 1x30M (Spec a). Cada dos ho as la solución salina ue cambiada po o a p epa ada en el momen o. Después de la diálisis, el sue o ob enido ue almacenado a -20ºC has a que ue eque ido. 5.4 Cuan i icación de los iglicé idos inco po ados en las pa ículas a i iciales de quilomic ones (CRLP) Pa a pode añadi 0.3 μmol TG/ml de CRLP en cada cul i o de células, los TG inco po ados en las pa ículas ue on cuan i icados median e el ki “T iglyce ide Colo ime ic Assay” (Cayman Chemical, MI, EEUU). Los TG empleados como es ánda ue on diluidos 1:5, 1:10 y 1:20 en dH2O, al igual que las p epa aciones de CRLP, que se diluye on 1:10, 1:20 y 1:40 en dH2O. Los eac i os ue on econs i uidos según las indicaciones del ab ican es. Se añadie on 10 μl de es ánda de iglicé idos y mues as en los pocillos co espondien es de una placa P96, po iplicado. Se inició la eacción median e la adición de 150 μl de la solución de mezcla enzimá ica a cada pocillo. La placa se cub ió y se agi ó cuidadosamen e du an e unos segundos pa a mezcla los compues os co ec amen e. Se incubó la placa du an e 15 minu os a empe a u a ambien e. Finalmen e, se p ocedió a medi la D.O de cada mues a a 500 nm y 570 nm, siendo empleada la p ime a medición pa a la eliminación de uido. 113 5.5 Ensayo de medición de la ac i idad de la LPL La ac i idad de la LPL ecogida en cada una de las di e en es acciones de los cul i os celula es, ue medida bajo las mismas condiciones que han sido p e iamen e desc i as po Holm C e al. [417]. Pa a ello, se empleó leche esca ex aída de acas como emulsión lipídica, con ioleína ma cada adiac i amen e con i io ( ioleína-H3), inco po ada po sonicación. Se p epa ó una mezcla de incubación pa a odas las eacciones y se añadió 180 µl/ ubo en ubos Kimble 13x100 mm. La solución de incubación po ubo se cons i uía po : po 100 ul de bu e de incubación (12% BSA, 16.65 U/ml 0.2 mg hepa ina/ml, 0.2M NaCl, 0.3M T is HCl, pH 8.5), 50 µl de la emulsión lipídica con ioleína-H3, 5 µl de sue o de a a congelado a ado con enilme ilsul onil luo ido inac i ado po calo (PMSF-HIFRS), que es la uen e del ac i ado de LPL, y 25 µl de dH2O. A cada ubo se le añadió 20 µl de la co espondien e acción del cul i o celula , que con iene la LPL ac i a. Cada eacción se mezcló con ó ex y odos los ubos ue on incubados du an e 3 ho as en un baño de agua a 25ºC, con agi ación con inua. La hid ólisis lipídica se de u o median e la adición de 2 ml po ubo de la solución de ex acción (iso- p opanol, hep ano y 1M H2SO4, 40:48.3:1), más 0.5 ml de dH2O. Cada uno de los ubos se cen i ugó a 2250 pm du an e 3 minu os a empe a u a ambien e. La ase supe io ue ecogida y mezclada po o ex con 1ml de e anol alcalino (95% e anol, 1 N NaOH, dH2O) y 3 ml de hep ano pa a el la ado de la mues a. Los ubos ue on nue amen e cen i ugados a 2250 pm du an e 3 minu os y la ase supe io ue eliminada po succión, que con enía el hep ano de la ado. A la solución esul an e se le añadió o os 3 ml de hep ano, se mezcló con el o ex y se cen i ugó o a ez pa a un segundo la ado bajo las mismas condiciones. Del ondo del ubo ue on ecogidos 800 µl y lle ados a los ubos de cen elleo, donde ue on mezclados con la solución Op i-phase “Hi sa e” 3 mezclada p e iamen e con ácido acé ico. Finalmen e, la adioac i idad emi ida de cada uno de los ubos que con enían las mues as ue medida en el con ado -β (con ado de cen elleo). 114 5.6 Cuan i icación de la acumulación lipídica en mac ó agos El con enido lipídico in acelula de los cul i os de monoci os THP-1 di e enciados a mac ó agos después de se incubados du an e 24 ho as en p esencia de la di e en es p epa aciones de CRLP, ue eñido con el colo an e acei e ojo O de la misma mane a que ha sido desc i o en la sección 4.2.1. Como di e encia hubo lo siguien e: as los 10 minu os de incubación con el colo an e de ele ada a inidad lipídica, y de se la ados adecuadamen e con 1x PBS, se añadió 0.5 ml de Isop opanol al 98% a cada uno de los cul i os. Fue on incubados en oscu idad du an e 1 ho a a empe a u a ambien e, y las células ue on ecogidas pa a p ocede con la medición de la D.O a 510 nm. Los esul ados son exp esados como acumulación in acelula de lípidos/p o eína o al, y se omó la media del alo de odos los con oles (-CRLP) como alo de e e encia, siendo odos di ididos po esa ci a, pa a pode ealiza la compa ación en e los di e en es ensayos. 5.7 Cuan i icación de la p o eína o al celula Se p epa ó una cu a pa ón con BSA como es ánda , en las siguien es concen aciones: 10, 20, 40, 60, 80 y 100 µg BSA/ ml en dH2O, en un olumen inal de 200 µl. De las acciones in acelula es ecolec adas pa a la medición de la ac i idad de LPL in acelula , se omó una alícuo a pa a cuan i ica la p o eína o al de cada uno de los cul i os celula es. Cada mues a se diluyó 1:8, 1:4 y 1:2 en dH2O, ambién en un olumen inal de 200 µl. Como Blanco, pa a el es ánda se empleó dH2O, mien as que pa a cada mues a in acelula se dispuso de 0.2M NaOH 1:2 en dH2O. Las diluciones de es ánda y de las mues as, así como los blancos, ue on a ados siguiendo el mismo p ocedimien o. Se p epa ó una mezcla cons i uida po el Reac i o A (2.0% NaCO3, 0.4% NaOH, 0.16% Na- a a e, 1% SDS) y el Reac i o B (4% CuSO4 x5 H2O) (A:B=100:1), y se añadió 0.6 ml de és a a cada ubo y se mezcló po o ex. Después de una incubación de 10-60 minu os a empe a u a ambien e, se añadió 60 µl del eac i o 1N Folin- Ciocal eu a cada eacción, se mezcló adecuadamen e, y de nue o se incubó du an e 45 minu os, es a ez en oscu idad. A con inuación se midió la D.O. de cada mues a a 750 nm. 115 1.2. Es udio del pe íl lipídico y bioquímico pos p andial en sue o El ensayo pos p andial comenzó con la adminis ación de los dos desayunos expe imen ales, el de ipo medi e áneo y el de ipo occiden al, a odos los suje os pa icipan es del es udio. Du an e las 6 ho as siguien es a la inges a de los desayunos, se ue ex ayendo una mues a de sang e a cada ho a, lo que pe mi ió de e mina la in luencia de la ca ga lipídica de la die a en la e olución del pe il lipídico y de la glucosa e insulina a lo la go del pe iodo pos p andial, en el g upo de obesos y no mopesos. 1.2.1 Coles e ol o al Tan o en el g upo de obesos ( igu a 15.A) como en el de no mopesos ( igu a 15.B), el consumo de los dos ipos de desayunos no demos ó al e a los ni eles pos p andiales de coles e ol o al (CT) espec o a los alo es basales a lo la go de las 6 ho as pos e io es a la inges a de las die as expe imen ales, man eniéndose los ni eles cons an es en ambos g upos del es udios. Además, no hubo di e encias signi ica i as en los alo es de coles e ol ob enidos al compa a en e los desayunos, el de ipo medi e áneo y el de ipo occiden al. Tan solo a la ho a 5 en el g upo de suje os no mopesos se encon ó una di e encia signi ica i a en e el consumo de los desayunos expe imen ales (P<0.05), con una concen ación de coles e ol en sue o más ele ada as la inges a del desayuno de ipo medi e áneo. Figu a 15. Concen ación de coles e ol sé ico an es (0h) y después (1-6h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 122 T i e m p o ( h ) C o l e s e o l ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 * M e d i e á n e o O c c i d e n a l AB T i e m p o ( h ) C o l e s e o l ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 1.2.2 HDL-c En el g upo de suje os obesos, la concen ación de HDL-c pos p andial se man u o cons an e con espec o al ni el basal du an e las 6 ho as analizadas después de consumi an o el desayuno de ipo medi e áneo como el de ipo occiden al, con alo es simila es en e ambas die as. Además, desde la ho a 0 y a lo la go del pe iodo pos p andial, se man u ie on unos ni eles de HDL-c en ci culación den o de los ni eles conside ados no males, supe io es a 40 mg/dl en a ones según NCEP ATP III ( igu a 16.A). En cambio, los alo es pos p andiales de HDL-c en el g upo de no mopesos ue on supe io es al g upo de suje os obesos ( igu a 16.B). Y al igual que ellos, no p esen a on ninguna a iación du an e el pe iodo pos p andial con espec o a los alo es basales as el consumo de los dos desayunos expe imen ales. Tampoco se de ec a on di e encias signi ica i as en e los alo es de HDL-c pos p andial ob enidos con los dos desayunos. Figu a 16. Concen ación de coles e ol HDL (HDL-c) sé ico an es (0h) y después (1-6h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. (Tes de S uden pa eado). 123 M e d i e á n e o O c c i d e n a l AB T i e m p o ( h ) H D L - c ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T i e m p o ( h ) H D L - c ( m g / d l ) 0123456 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1.2.3 T iglicé idos Al de e mina la e olución de la concen ación de TG en sue o a lo la go del pe iodo pos p andial después de que los suje os obesos consumie an las die as que se les adminis ó, se obse ó que los ni eles pos p andiales de TG ue on expe imen ando un inc emen o g adual causado an o po el desayuno de ipo medi e áneo como po el de ipo occiden al ( igu a 17.A). No se iden i ica on di e encias signi ica i as en el e ec o causado sob e los ni eles de TG en e desayunos. El g upo de no mopesos expe imen ó un inc emen o en la concen ación de TG plasmá icos en e las 2-4 ho as del pe iodo pos p andial con espec o al alo basal después de consumi el desayuno de ipo occiden al ( igu a 17.B). A con inuación, la concen ación sé ica pos p andial de TG comenzó a su i un descenso cons an e. Po el con a io, el consumo del desayuno de ipo medi e áneo solo causó un lige o inc emen o en la concen ación pos p andial de TG, aunque los alo es a las 3 ho as ue on simila es a los basales. A pesa de la di e encia encon ada en e ambos desayunos, és a ampoco ue es adís icamen e signi ica i a. Figu a 17. Concen ación de iglicé idos sé icos an es (0h) y después (1-6h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. (Tes de S uden pa eado). 124 M e d i e á n e o O c c i d e n a l AB T i e m p o ( h ) T i g l i c é i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 T i e m p o ( h ) T i g l i c é i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 5 0 100 150 200 250 Pa a calcula la espues a pos p andial que iene luga as la inges a de la die a con con enido g aso, di e sos mé odos han sido a menudo empleados en a ios es udios [422, 423]. En e ellos, es ecuen e ealiza el cálculo del á ea bajo la cu a (AUC) y el á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC). Ha sido demos ado que el AUC co elaciona con la concen ación de TG en ayunas, sin emba go, es el cálculo del iAUC el que se asocia ue emen e con el inc emen o de TG du an e el pe iodo pos p andial. Tan o en indi iduos sanos como en indi iduos que p esen an algún deso den me abólico, el iAUC desc ibe mejo la si uación pos p andial que el AUC o al, el cual pa ece se más un ac o desc ip i o, elacionado con el ni el basal, al y como quedó demos ado median e el es udio ealizado po Ca s ensen e al. en el año 2003 [424]. El cálculo del alo inc emen al de la concen ación de TG a cada ho a con espec o al ni el basal pe mi ió ap ecia más cla amen e el inc emen o y/o educción expe imen ado de sus ni eles as el consumo de los dos desayunos a lo la go del pe íodo pos p andial. En el g upo de obesos, se hizo más e iden e el inc emen o que su ió la concen ación de TG as el consumo del desayuno de ipo occiden al en e al de ipo medi e áneo ( igu a 18.A). Es a di e encia en los ni eles alcanzados de TG en el pe iodo pos p andial después de consumi los dos desayunos expe imen ales ue con i mada con el cálculo del iAUC en es e g upo de indi iduos. El ni el o al de TG plasmá icos pos p andiales ue mayo po el consumo del de ipo occiden al, aunque sin ep esen a una di e encia signi ica i a espec o al desayuno de ipo medi e áneo ( igu a 18.B). En el caso del g upo de no mopesos, el cálculo de los alo es inc emen ales a odas las ho as con espec o al ni el basal ( igu a 18.C) sí e eló una di e encia signi ica i a en e ambos desayunos a las 2 y 3 ho as del pe iodo pos p andial (P<0.05), siendo, como ya se ha comen ado an e io men e, los ni eles de TG plasmá icos más ele ados con el consumo del desayuno de ipo occiden al. Además, el cálculo del iAUC ( igu a 18.D) ayudó a e i ica que la concen ación o al de TG en el pe íodo pos p andial e a es adís icamen e supe io as la inges a del desayuno de ipo occiden al (P<0.05). 125 Figu a 18. Valo inc emen al de la concen ación sé ica de iglicé idos (TG) en el pe iodo pos p andial con espec o al ni el basal de TG (en ayunas), as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo (Med) y occiden al (Occ) po los suje os obesos (A) y no mopesos (C); y á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC) de la concen ación sé ica pos p andial de TG en los pacien es obesos (B) y no mopesos (D). Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 126 T i e m p o ( h ) T i g l i c é i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 ** M e d i e á n e o O c c i d e n a l T i e m p o ( h ) T i g l i c é i d o s ( m g / d l ) 0 1 2 3 4 5 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A C B D T i g l i c é i d o s ( m g / d L  h o a ) M e d O c c 0 5 0 100 150 200 250 300 T i g l i c é i d o s ( m g / d L  h o a ) M e d O c c 0 5 0 100 150 200 250 300 * 1.2.4 Apolipop o eína B (apo B) La a iación de la concen ación de apo B du an e el pe iodo pos p andial en el g upo de suje os obesos se mues a en la igu a 19.A. Después de inge i los dos ipos de desayunos expe imen ales, los alo es de apo B aumen a on lige amen e con espec o a la concen ación basal en ambos casos. La di e encia en los alo es de apo B después de la inges a de los dos desayunos esul ó se signi ica i a a las 4h (P<0.05) debido a la mayo concen ación de ec ada a causa del de ipo medi e áneo. No obs an e, es o u o como explicación la signi ica i a di e encia en e los ni eles basales al comienzo del ensayo pos p andial medi e áneo y occiden al, que ue on bas an e más ele ados en el caso del desayuno de ipo medi e áneo (P<0.01). De la misma mane a, el g upo de suje os no mopesos ( igu a 19.B) expe imen ó un lige o inc emen o en los alo es de apo B du an e el pe iodo pos p andial en e a los alo es basales as la inges a del desayuno occiden al. En cambio, el desayuno de ipo medi e áneo man u o apa en emen e cons an e el ni el de apo B du an e las 4 ho as siguien es a su consumo. Figu a 19. Concen ación de apolipop o eína B (Apo B) sé ica an es (0h) y después (2 y 4h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. *=P<0.05; **=P<0.01 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 127 M e d i e á n e o O c c i d e n a l AB T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 0 2 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 0 2 4 0 5 0 1 0 0 1 5 0 Debido a la di e encia en los alo es basales de ec ados en los suje os obesos al inicio de los ensayos pos p andiales, el cálculo de los alo es inc emen ales de apo B con espec o al ni el basal pe mi ió un análisis más obje i o de la e olución de su concen ación a lo la go del pe iodo pos p andial después de inge i las dos die as expe imen ales. Tan o en el g upo de obesos ( igu a 20.A) como en el de no mopesos ( igu a 20.C), se obse ó una concen ación de apo B mayo después de inge i el desayuno de ipo occiden al a las 2 y 4 ho as del pe iodo pos p andial. Tal di e encia esul ó se es adís icamen e signi ica i a al compa a se con el desayuno de ipo medi e áneo sólo en el g upo de los obesos a la ho a 2 (P<0.05). Es a di e encia en la concen ación pos p andial de apo B en e desayunos ue con i mada con el cálculo del iAUC en los dos g upos del es udio, los suje os obesos ( igu a 20.B) y los suje os no mopesos ( igu a 20.D). En los dos casos, los ni eles de apo B sé icos de ec ados en odo el pe iodo pos p andial ue on supe io es después de que se consumie a el desayuno de ipo occiden al, aunque en ningún caso esul ó se es adís icamen e signi ica i a la di e encia en e al alo ob enido con el desayuno de ipo medi e áneo. 128 Figu a 20. Valo inc emen al de la concen ación de apolipop o eína B (ApoB) sé ica en el pe iodo pos p andial con espec o al ni el basal de Apo B (en ayunas), as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo (Med) y occiden al (Occ) po los suje os obesos (A) y no mopesos (C); y á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC) de la concen ación sé ica pos p andial de Apo B en los pacien es obesos (B) y no mopesos (D). Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 129 T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 2 4 - 5 0 5 1 0 1 5 2 0 * T i e m p o ( h ) A p o B ( m g / d l ) 2 4 - 5 0 5 1 0 1 5 2 0 A C D B M e d i e á n e o O c c i d e n a l A p o B ( m g / d L  ho a) M e d O c c 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 A p o B ( m g / d L  h o a ) M e d O c c 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 1.2.5 Glucosa La concen ación de glucosa en sang e expe imen ó un pico máximo 1 ho a después de inge i los dos desayunos en el g upo de suje os obesos ( igu a 21.A.) y en el de suje os no mopesos ( igu a 21.B). Se obse ó que los ni eles de glucosa alcanzados en ese momen o ue on lige amen e supe io es as el consumo del desayuno de ipo occiden al en los dos g upos de pa icipan es. A pa i de la ho a 1 del pe iodo pos p andial, la concen ación endió a disminui en odos los suje os, alcanzando de nue o los ni eles plasmá icos basales. En el caso del g upo de los obesos, es o ocu ió a las 3 ho as después de consumi el desayuno de ipo medi e áneo, y a las 4 ho as del consumo del desayuno de ipo occiden al ( igu a 21.A), mien as que en el g upo no mopeso, sucedió algo más emp ano, 2 ho as después de la inges a del desayuno de ipo medi e áneo, y a las 3 ho as as el desayuno de ipo occiden al ( igu a 21.B). Sin emba go, una ez se ecupe a on los alo es basales, és os su ie on de nue o un lige o inc emen o en odos los casos a pa i de las 3-4 ho as. Los dos desayunos expe imen ales gene a on di e encias signi ica i as en e los ni eles de glucosa ob enidos as su consumo. De hecho, la di e encia en la concen ación de glucosa esul ó se es adís icamen e signi ica i a a las 3 ho as del pe iodo pos p andial en obesos (P<0.01) ( igu a 21.A), y a las 2 ho as (P<0.01) en el g upo de no mopesos ( igu a 21.B), en ambos casos debido a que el desayuno de ipo occiden al p o ocó que los ni eles de glucosa uesen más ele ados en compa ación con el de ipo medi e áneo. Hay que menciona que, an es de que los dos ipos de desayunos uesen adminis ados a los indi iduos no mopesos, el ni el de glucosa basal (0h) del ensayo que se ealizó con el desayuno de ipo occiden al ue supe io con espec o a la concen ación basal del ensayo que se lle ó a cabo con el de ipo medi e áneo, siendo muy signi ica i a es adís icamen e la di e encia en e ellos (P<0.001). Po esa azón, la concen ación de glucosa pos p andial se man u o más ele ada después de consumi el desayuno de ipo occiden al, en compa ación con los esul ados del desayuno de ipo medi e áneo. 130 Figu a 21. Concen ación de glucosa sé ica an es (0h) y después (1-6h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. **=P<0.01, ***=P<0.001 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). El cálculo inc emen al de cada uno de los alo es pos p andiales con espec o a la concen ación basal pe mi ió e i ica de nue o la a iación eal de los ni eles de glucosa as el consumo de los dos desayunos. Con la ep esen ación g á ica de dichos alo es inc emen ales se obse ó una e olución muy simila de la glucosa du an e las 6 ho as después del consumo de las die as expe imen ales en el g upo obeso y no mopeso. Ambos expe imen a on un impo an e inc emen o de glucosa a la ho a 1 as el consumo de los dos desayunos como como se indicó p e iamen e. Y la educción que empezó a su i a pa i de las 2 ho as en los dos g upos llegó a alcanza alo es in e io es a los basales a las 3 ho as. A pa i de las 4 ho as, la concen ación de glucosa comenzó a inc emen a se de nue o an o en el g upo de suje os obesos como en el de suje os no mopeso ( igu as 22.A y 22.C, espec i amen e). En el g upo de obesos, se man u o la di e encia signi ica i a obse ada a las 3 ho as de consumi los dos desayunos expe imen ales, ya que los alo es de glucosa seguían siendo mayo es después del de ipo occiden al (P<0.05) ( igu a 22.A.). En los suje os no mopesos, la ele ada concen ación de glucosa a las 2 ho as as el consumo del desayuno ipo occiden al ambién siguió mos ando una di e encia signi ica i a con espec o al medi e áneo (P<0.05). Además, el cálculo inc emen al e eló que el aumen o de glucosa expe imen ado a las 4 ho as después de inge i el desayuno de ipo medi e áneo ue signi ica i amen e mayo con espec o 131 M e d i e á n e o O c c i d e n a l AB T i e m p o ( h ) G l u c o s a ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * T i e m p o ( h ) G l u c o s a ( m g / d l ) 0123456 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * * * * * 2.2 Concen ación pos p andial en sue o de los ma cado es de in lamación 2.2.1 Adiponec ina Como puede e se en la igu a 26.A, an es de la inges a del desayuno de ipo medi e áneo po los suje os obesos, los ni eles de adiponec ina ue on signi ica i amen e supe io es a los de ec ados an es de que consumie an el desayuno de ipo occiden al (P<0.05). No obs an e, 2 ho as después del consumo de los dos ipos de desayunos expe imen ales, el ni el de adiponec ina sé ica ue el mismo pa a los dos casos. Es o ue debido a que la inges a del desayuno de ipo medi e áneo indujo una educción en la libe ación de adiponec ina espec o al ni el basal de ec ado, mien as que el consumo del desayuno de ipo occiden al p o ocó su inc emen o. Sin emba go, a las 4 ho as, la concen ación de adiponec ina ol ió a los ni eles o iginales (0h) en ambos casos. Po pa e de los indi iduos no mopesos ( igu a 26.B), el consumo del desayuno de ipo occiden al p odujo una p og esi a educción de la exp esión de adiponec ina a lo la go del pe iodo pos p andial. Es a educción ambién se obse ó a las 2 ho as de consumi el desayuno de ipo medi e áneo, aunque 4 ho as después se ele ó, de ec ándose unos alo es mayo es al ni el de exp esión basal y supe io es ambién a los alcanzados po el desayuno de ipo occiden al. No obs an e, no se de ec a on di e encias signi ica i as en e el consumo de los dos ipos de desayunos en es e g upo de indi iduos. 138 Figu a 26. Concen ación de adiponec ina sé ica an es (0h) y después (2 y 4 h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). Los alo es inc emen ales de la concen ación sé ica de adiponec ina espec o a la concen ación basal a lo la go del pe iodo pos p andial se ep esen an en la igu a 27. El cálculo inc emen al pe mi ió ap ecia una di e encia signi ica i a en el e ec o causado po la inges a de los desayunos sob e los ni eles de exp esión de adiponec ina, an es no de ec ada, en el g upo de indi iduos obesos ( igu a 27.A). La ele ada libe ación de adiponec ina 2 ho as después de consumi el desayuno de ipo occiden al esul ó se es adís icamen e signi ica i a en e a la educción de su concen ación as la inges a del desayuno de ipo medi e áneo (0<0.01). De hecho, es a in luencia de los dos ipos de die as expe imen ales sob e los ni eles de adiponenc ina quedó demos ada con el cálculo de iAUC ( igu a 27.B), con el que se de e minó que la can idad o al de adiponec ina p oducida en el pe iodo pos p andial ue signi ica i amen e mayo después de inge i el desayuno de ipo occiden al (P<0.05). En los suje os no mopesos ( igu a 27.C) se obse ó de mane a más cla a la educción que su ió el ni el de sec eción de adiponec ina 2 ho as después de consumi los dos desayunos expe imen ales espec o a los alo es basales. De la misma mane a, el inc emen o en su concen ación a las 4 ho as de consumi el desayuno de ipo medi e áneo se hace más ap eciable. La capacidad del desayuno de ipo occiden al pa a educi los ni eles de adiponec ina pos p andial po debajo del ni el basal, no obse ada as la inges a del de ipo medi e áneo, explica que la can idad de adiponec ina sec e ada du an e odo el pe iodo pos p andial sea 139 T i e m p o ( h ) A d i p o n e c i n a (  g / m l ) 0 2 4 0 2 4 6 8 1 0 * T i e m p o ( h ) A d i p o n e c i n a (  g / m l ) 0 2 4 0 2 4 6 8 1 0 M e d i e á n e o O c c i d e n a l A B signi ica i amen e in e io espec o a la sec e ada as el consumo del desayuno de ipo medi e áneo(P<0.05), al y como se obse a con el cálculo del iAUC ( igu a 27.D). Figu a 27. Valo inc emen al de la concen ación de adiponec ina sé ica du an e el pe iodo pos p andial con espec o al ni el basal de adiponec ina (en ayunas), as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo (Med) y occiden al (Occ) po los suje os obesos (A) y no mopesos (C); y á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC) de la concen ación sé ica pos p andial de adiponec ina en los pacien es obesos (B) y no mopesos (D). Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 140 M e d i e á n e o O c c i d e n a l T i e m p o ( h ) A d i p o n e c i n a (  g / m l ) 2 4 - 6 - 4 - 2 0 2 4 * * T i e m p o ( h ) A d i p o n e c i n a (  g / m l ) 2 4 - 6 - 4 - 2 0 2 4 A B C D A d i p o n e c i n a (  g / m l  h o a ) M e d O c c - 6 - 4 - 2 0 2 4 * A d i p o n e c i n a (  g / m l  h o a ) M e d O c c - 6 - 4 - 2 0 2 4 * 2.2.2 Lep ina El consumo de los dos ipos de desayunos expe imen ales ambién demos ó eje ce una in luencia dis in a sob e la concen ación sé ica de lep ina a lo la go del pe iodo pos p andial en el g upo de indi iduos obesos ( igu a 28.A). De nue o, el desayuno occiden al p odujo un descenso p og esi o en los ni eles de lep ina desde el momen o inicial del ensayo (0h) y has a las 4 ho as en que ue medida, aunque no se a ó de una educción muy p onunciada en e al ni el basal de lep ina. En el caso del consumo del desayuno de ipo medi e áneo, 2 ho as después la lep ina ambién io educida su exp esión sé ica de o ma conside able en e al alo inicial (0h). Sin emba go, los alo es iniciales de lep ina an es de consumi el desayuno medi e áneo ya e an supe io es al alo en ayunas del ensayo ealizado con el desayuno de ipo occiden al. Ello con ibuyó a que la di e encia a las 2 ho as ue a es adís icamen e signi ica i a (P<0.01). Al igual que lo ue a las 4 ho as, ya que se de ec ó un signi ica i o inc emen o en ni el de exp esión de lep ina as la inges a del desayuno de ipo medi e áneo (P<0.01). Po el con a io, el g upo de no mopesos ( igu a 28.B) no expe imen ó al e ación alguna en la concen ación sé ica de lep ina du an e el pe iodo pos p andial después de consumi el desayuno de ipo medi e áneo y el de ipo occiden al. Se obse ó que los ni eles pos p andiales de lep ina se man u ie on cons an es y simila es a la concen ación sé ica basal du an e odo el ensayo. Figu a 28. Concen ación sé ica de lep ina an es (0h) y después (2 y 4 h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. **=P<0.01 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 141 A B T i e m p o ( h ) L e p i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 1 0 2 0 3 0 4 0 * * * * T i e m p o ( h ) L e p i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 1 0 2 0 3 0 4 0 M e d i e á n e o O c c i d e n a l Median e el cálculo inc emen al de la concen ación pos p andial de lep ina espec o al ni el basal en el g upo de suje os obesos pudo de e mina se que las di e encias que an e io men e esul a on se signi ica i as en e los ni eles de lep ina alcanzados as la inges a de los dos ipos de desayuno expe imen ales, ealmen e no exis ían. Además, se pudo a p ecia que el desayuno de ipo occiden al apa en emen e no mani es ó ene in luencia sob e la exp esión de lep ina en el pe iodo pos p andial ( igu a 29.A). Además, el cálculo de iAUC e lejó que consumi el desayuno de ipo medi e áneo causaba una educción en los ni eles de exp esión o al de lep ina pos p andial en el g upo de los obesos ( igu a 29.B). No obs an e, no hubo di e encias que pudie an conside a se signi ica i as en e los dos ipos de desayunos. En el g upo de suje os no mopesos, el cálculo inc emen al ( igu a 29.C) no e lejó g andes cambios con espec o a lo obse ado con an e io idad, an solo que la concen ación sé ica de lep ina expe imen ó un lige o descenso as el consumo del desayuno de ipo medi e áneo, alcanzando unos alo es in e io es a los ob enidos con el de ipo occiden al, an es inap eciables. Y de la misma mane a que sucedió con el g upo de obesos, con el cálculo del iAUC ( igu a 29.D) quedó e lejado de nue o que el desayuno de ipo medi e áneo enía mayo capacidad pa a educi los ni eles de lep ina pos p andial o ales en e al de ipo occiden al, aunque no de mane a signi ica i a. 142 Figu a 29. Valo inc emen al de la concen ación de lep ina sé ica du an e el pe iodo pos p andial con espec o al ni el basal de lep ina (en ayunas), as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo (Med) y occiden al (Occ) po los suje os obesos (A) y no mopesos (C); y á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC) de la concen ación sé ica pos p andial de lep ina en los pacien es obesos (B) y no mopesos (D). Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; (Tes de S uden pa eado). 143 M e d i e á n e o O c c i d e n a l A B C D T i e m p o ( h ) L e p i n a ( n g / m l ) 2 4 - 1 0 - 5 0 5 1 0 T i e m p o ( h ) L e p i n a ( n g / m l ) 2 4 - 1 0 - 5 0 5 1 0 L e p i n a ( n g / m l  h o a ) M e d O c c - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 4 L e p i n a ( n g / m l  h o a ) M e d O c c - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 0 2 4 2.2.3 Ce uloplasmina Los alo es iniciales de ce uloplasmina en los indi iduos obesos ( igu a 30.A) al comienzo de los ensayos pos p andiales ealizados con los dos ipos de desayunos, ya mos a on una di e encia impo an e, ya que ue on signi ica i amen e más ele ados an es de p ocede con la inges a del de ipo occiden al (P<0.05). El consumo de las dos die as expe imen ales p o ocó una educción en los ni eles de exp esión de ce uloplasmina sé ica en la ho a 2 del pe iodo pos p andial espec o al alo basal. A pesa de es a educción de ec ada en los dos casos, la di e encia en la exp esión de ce uloplasmina alcanzada en e desayunos ue signi ica i a, pues o que és a e a supe io as el consumo del desayuno de ipo occiden al (P<0.05). Sin emba go, a las 4 ho as de inge i el desayuno de ipo medi e áneo, el ni el de exp esión de la ce uloplasmina aumen ó, igualándose al de ec ado con el desayuno de ipo occiden al a las 4 ho as de su consumo, con el cual se man u ie on cons an es desde la ho a 2. En el g upo de indi iduos no mopesos ( igu a 30.B) la e olución de los ni eles sé icos de ce uloplasmina a lo la go del pe iodo pos p andial as consumi los dos ipos de die as expe imen ales ue muy pa ecida a la que expe imen a on los suje os obesos. En es e caso, la exp esión de ce uloplasmina ue pa ecida en odos los casos después de inge i un desayuno u o o, sin di e encias signi ica i as en e ellos. Figu a 30. Concen ación de ce uloplasmina sé ica an es (0h) y después (2 y 4 h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12. *=P<0.05 s desayuno de ipo medi e áneo (Tes de S uden pa eado). 144 A B T i e m p o ( h ) C e u l o p l a s m i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 * * * T i e m p o ( h ) C e u l o p l a s m i n a ( n g / m l ) 0 2 4 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 M e d i e á n e o O c c i d e n a l A pesa de las di e encias signi ica i as ob enidas en los ni eles de ce uloplasmina as la inges a de los dos ipos de desayunos en el g upo obeso, el cálculo inc emen al de los alo es pos p andiales en es os suje os pe mi ió de ec a que la di e en e in luencia de los dos desayunos sob e su ni el de exp esión no e a signi ica i a ( igu a 31.A). Ambos desayunos expe imen ales ue on esponsables de educi la concen ación de ce uloplasmina a las 2 ho as. Y aunque la educción ue lige amen e supe io con el consumo del desayuno de ipo medi e áneo, a las 4 ho as de su inges a, la p oducción de ce uloplasmina de ec ada ue de nue o equi alen e al ni el de p oducción basal. Po el con a io, el consumo del desayuno de ipo occiden al lo man u o siemp e po debajo del ni el basal. No obs an e, es as lige as di e encias en e desayunos no gene a on una can idad de ce uloplasmina pos p andial o al di e en e en e ellos. El cáculo del iAUC demos ó que la can idad de ce uloplasmina o al libe ada a lo la go del pe iodo pos p andial ue la misma as la inges a de los dos ipos de desayunos expe imen ales ( igu a 31.B) En el caso de los indi iduos no mopesos ( igu a 31.C), los alo es inc emen ales ampoco p esen a on di e encias signi ica i as en e desayunos. El consumo de los dos ipos de desayunos po pa e de los suje os no mopesos eje ció la misma in luencia sob e los ni eles de exp esión de ce uloplasmina que la que eje cie on sob e los suje os obesos. Así mismo, el cálculo del iAUC demos ó una meno p oducción de ce uloplasmina o al en el pe iodo pos p andial causada an o po el consumo del desayuno de ipo medi e áneo como po el de ipo occiden al con espec o a los alo es basales ( igu a 31.D). 145 Figu a 31. Valo inc emen al de la concen ación de ce uloplasmia sé ica du an e el pe iodo pos p andial con espec o al ni el basal de ce uloplasmina (en ayunas), as la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo (Med) y occiden al (Occ) po los suje os obesos (A) y no mopesos (C); y á ea bajo la cu a inc emen al (iAUC) de la concen ación sé ica pos p andial de ce uloplasmia en los pacien es obesos (B) y no mopesos (D). Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; (Tes de S uden pa eado). 146 M e d i e á n e o O c c i d e n a l A B C D T i e m p o ( h ) C e u l o p l a s m i n a (  g / m l ) 2 4 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 T i e m p o ( h ) C e u l o p l a s m i n a (  g / m l ) 2 4 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 C e u l o p l a s m i n a (  g / m l  h o a ) M e d O c c - 1 . 0 - 0 . 8 - 0 . 6 - 0 . 4 - 0 . 2 0 . 0 C e u l o p l a s m i n a (  g / m l  h o a ) M e d O c c - 1 . 0 - 0 . 8 - 0 . 6 - 0 . 4 - 0 . 2 0 . 0 2.2.4 PCR La PCR ue el único ma cado de in lamación cuyos ni eles de exp esión no se ie on al e ados du an e odo el pe iodo pos p andial con espec o a la concen ación basal, as el consumo del desayuno de ipo medi e áneo y de ipo occiden al en el g upo de suje os obesos ( igu a 32.A), ni en el de no mopesos ( igu a 32.B). A pesa de las lige as luc uaciones obse adas, los alo es de PCR no se aleja on del alo basal a ninguna de las ho as en las que su exp esión ue medida. Es impo an e señala que en el g upo de los indi iduos obesos, la concen ación de PCR siemp e se man u o supe io con el consumo del desayuno de ipo occiden al en e al de ipo medi e áneo. Es o se debió a que los alo es basales de PCR ue on más ele ados al inicio del ensayo ealizado con el desayuno de ipo occiden al que con el de ipo medi e áneo, como ya ha ocu ido con o os ma cado es de in lamación. Figu a 32. Concen ación sé ica de PCR an es (0h) y después (2 y 4 h) de la inges a de un desayuno de ipo medi e áneo y occiden al po los suje os obesos (A) y no mopesos (B) pa icipan es del es udio. Valo es exp esados como media ± e o es ánda de la media (SEM); n=12; (Tes de S uden pa eado). El cálculo inc emen al de las concen aciones de PCR ob enidas en los suje os obesos as la oma de los desayunos en e al alo basal ( igu a 33.A) pe mi ió ap ecia de o ma más obje i a la capacidad de los dos ipos desayunos expe imen ales pa a modula el ni el de exp esión de PCR. La inges a del desayuno de ipo medi e áneo po pa e de es os indi iduos p o ocó un pequeño inc emen o en el ni el de exp esión de PCR 1 ho a después, quedando po encima del ni el basal, y man eniéndose cons an e a lo la go del pe iodo pos p andial. En 147 A B T i e m p o ( h ) P C R (  g / m l ) 0123456 0 1 2 3 4 T i e m p o ( h ) P C R (  g / m l ) 0123456 0 1 2 3 4 M e d i e á n e o O c c i d e n a l [1] M. O’Flahe y, I. Buchan, and S. Capewell, “Con ibu ions o ea men and li es yle o declining CVD mo ali y: why ha e CVD mo ali y a es declined so much since he 1960s?,” Hea B . Ca d. Soc., ol. 99, no. 3, pp. 159–162, Feb. 2013. [2] H. 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La adhe encia a la die a Medi e ánea ha demos ado apo a bene icios ca diop o ec o es p incipalmen e g acias a su ele ada concen ación de MUFA p opo cionados po el acei e de oli a, su uen e de g asa mayo i a ia. En la ac ualidad, podemos encon a en la li e a u a cien í ica es udios sob e las p opiedades ca diop o ec o as p opo cionadas po die as icas en g asas insa u adas y de su capacidad pa a educi la a e oscle osis. Sin emba go, pocos abajos han sido ealizados con la pa icipación de pe sonas obesas. En es e con ex o, p oponemos que un desayuno ipo medi e áneo en iquecido en MUFA se ía capaz de con ibui a mejo a el pe il lipídico pos p andial y la espues a in lama o ia p esen e en los suje os obesos pa icipan es del es udio, así como a educi la o mación de células espumosas du an e las p ime as ases del desa ollo de la a e oscle osis, con espec o a un desayuno de ipo occiden al. HIPÓTESIS: En es e con ex o, p oponemos la hipó esis de que un desayuno ipo medi e áneo en iquecido en MUFA con ibuye a mejo a el pe il lipídico pos p andial y la espues a in lama o ia p esen e en los suje os obesos pa icipan es del es udio, así como a educi la o mación de células espumosas du an e las p ime as ases del desa ollo de la a e oscle osis, con espec o a un desayuno de ipo occiden al. 299 OBJETIVOS: 1. Valo a la in luencia de una ca ga lipídica sob e el me abolismo lipídico pos p andial e in lamación ascula en adul os obesos en e a con oles no mopesos. 2. De e mina los e ec os di e enciales de un desayuno de ipo medi e áneo en e a un desayuno de ipo occiden al sob e el me abolismo lipídico pos p andial en adul os obesos. 3. De e mina los e ec os di e enciales de un desayuno de ipo medi e áneo en e a un desayuno de ipo occiden al sob e la sín esis de ma cado es de in lamación en suje os obesos con espec o a suje os no mopesos. 4. Es udia el e ec o de las lipop o eína icas en iglicé idos pos p andiales aisladas de adul os obesos sob e la o mación de células espumosas. 5. Analiza la capacidad del componen e lipídico de las lipop o eínas icas en iglicé icos pa a modula la ac i idad de la LPL en mac ó agos. RESULTADOS: 1. La medición de los pa áme os basales de los pa icipan es del es udio con i mó que los suje os obesos p esen aban dislipidemia, así como ni eles de glucosa e insulina signi ica i amen e supe io es a los del g upo con ol, aunque no e an insulino esis en es, ni p esen aban hipe ensión a e ial. El consumo de los dos ipos de desayunos expe imen ales no al e ó los ni eles basales de coles e ol o al ni HDL-c du an e el pe iodo pos p andial analizado en ninguno de los dos g upos del es udio. En cambio, la concen ación pos p andial de TG su ió un ápido inc emen o inmedia amen e después de que los suje os obesos consumie an las dos comidas, especialmen e as la inges a del desayuno de ipo occiden al. En ellos, la o mación de nue as pa ículas TRL ambién ue inmedia a. Es a misma espues a la expe imen a on los indi iduos no mopesos, aunque únicamen e cuando consumie on el desayuno de ipo occiden al. Es os esul ados indican que el desayuno ico en MUFA a o ece una espues a lipídica pos p andial más educida en indi iduos obesos que las comidas icas en SFA. Se obse ó que los indi iduos obesos enían a su ez un e aso en el acla amien o de las pa ículas TRL en compa ación con los de peso no mal, y que el consumo del desayuno ico en SFA equi ió una sín esis signi ica i amen e mayo de insulina pa a que los suje os obesos man u ie an los ni eles de glucosa. Po an o, un consumo con inuado de es e ipo de comida pod ía con ibui a la esis encia a la insulina en los obesos. En cambio, en los indi iduos no mopeosos, el consumo del desayuno ico en MUFA demos ó ayuda a que ue an más sensibles a la insulina y mos a an un pe il lipídico menos a e ogénico. 300 2. El pe il in lama o io basal del g upo obeso e eló un es ado in lama o io c ónico al compa a se con el de los indi iduos no mopeso, ya que los ni eles basales de lep ina, Cp, PCR y MCP-1 de ec ados en ayunas en el g upo obeso ue on signi ica i amen e supe io es, aunque no hubo impo an es di e encias en los ni eles de adiponec ia, TNF-α ni IL-1β en e ambos. Demos ada la capacidad de los AG pa a ac i a / educi la espues a in lama o ia y pa a modula la libe ación de los mediado es de in lamación en ci culación, se e aluó la capacidad de la comida expe imen al ica en MUFA pa a educi el es ado in lama o io c ónico es ablecido en los pacien es obesos. El consumo del desayuno de ipo medi e áneo u o el e ec o ca diop o ec o espe ado en las pe sonas con peso no mal, al induci una meno libe ación pos p andial de Cp y MCP-1 y un inc emen o de los ni eles o ales pos p andiales de adiponec ina; mien as que el consumo del desayuno de ipo occiden al colabo ó a que p esen a an un peo pe il in lama o io, debido p incipalmen e la educción de los ni eles de adiponec ina en ci culación. En el g upo de los obesos, en cambio, no obse ó una mejo ía en la concen ación pos p andial de adiponecina, lep ina y PCR con espec o a la basal as el consumo del desayuno de ipo medi e áneo. Ello pa ece suge i que se ía necesa ia una p e ia pé dida de peso pa a que los indi iduos obesos se ie an bene iciados de las p opiedades an i-in lama o ias de una die a ica en MUFA. 3. La ca ac e ización de la composición de AG de las TRL aisladas en ayunas ue simila en los dos g upos, no mopeso y obeso, mos ando el mismo pe il de a e ogenicidad an es de comenza los ensayos pos p andiales. El consumo del acei e de oli a con el desayuno de ipo medi e áneo inc emen ó el con enido de MUFA en los TG de las nue as TRL de ambos g upos expe imen ales, debido a una mayo inco po ación de ácido oleico en las pa ículas p incipalmen e. Po el con a io, la inges a del desayuno de ipo occiden al gene ó pa ículas más a e ogénicas al inc emen a su concen ación de SFA. Se demos ó, po an o, que el pe il de AG de las nue as pa ículas ue un e lejo de la composición lipídica de la uen e de g asa de la que p ocedían. No obs an e, se obse ó una signi ica i a inco po ación de PUFA n-3 solo en las nue as TRL aisladas de los suje os no mopeso después de consumi la comida de ipo occiden al. Ello pa ecía suge i que el consumo de una die a ica en SFA po pe sonas no mopeso es imula la inco po ación de PUFA endógenos en las nue as TRL. La composición de AG de los FL ex aídos de las pa ículas p oceden es del g upo nomopeso no se io al e ada po el con enido lipídico de las comidas expe imen ales con espec o al pe il de AG en ayunas, mien as que en el g upo obeso sí se e lejó de nue o la composición lipídica del desayuno inge ido. Es os esul ados pod ían indica que en caso de padece obesidad, el con enido g aso de la die a adquie e aún más impo ancia sob e la composición de AG de las TRL y, en consecuencia, sob e su pe il a e ogénico, que si se iene un peso co po al no mal. 301 4. T as incuba los cul i os de mac ó agos con las TRL en ayunas y las aisladas a las 2 y 4 ho as de inge i las comidas expe imen ales, la ca ac e ización de los AG de los TG in acelula es e eló que, de acue do con abajos p e ios, las pa ículas p oceden es de la ho a 4 del pe iodo pos p andial de ambos g upos ue on las cap adas po las células más e icien emen e, ya que el con enido lipídico in acelula e lejaba la composición de AG de las pa ículas. Con las TRL aisladas en ayunas en los suje os obesos sucedió algo simila , indicando que ambién colabo an con la o mación de células espumosas, aunque de o ma más disc e a que las TRL-4h. También se es udió con las imágenes omadas al mic oscopio de los lípidos in acelula es, el amaño de las go ículas lipídicas o madas en el in e io de las células según la composición de las TRL. Las TRL- 4h p oceden es de los suje os no mopesos de i adas del consumo del desayuno de ipo medi e áneo gene a on células espumosas con una ca ga lipídica muy simila a las TRL-0h, mien as que las de i adas del consumo del desayuno de ipo occiden al p o oca on una mayo inco po ación de lípidos po pa e de los mac ó agos. Las TRL-4h aisladas de los suje os obesos, independien emen e de cual ue a la uen e de g asa de la que de i asen, p o oca on en ambos casos una exace bada inco po ación lipídica en los mac ó agos. La ca ac e ización de los AG in acelula es e eló que cuando los mac ó agos se incuba on con las TRL de i adas de la inges a del desayuno de ipo medi e áneo de los dos g upos, el con enido in acelula de SFA o ales se edujo signi ica i amen e, pe o no se inc emen ó la concen ación de los MUFA; y la inges a del desayuno de ipo occiden al po el g upo obeso causó un impo an e inc emen o de los SFA in acelula es y edujo los MUFA, gene ando un pe il lipídico in acelula más a e ogénico. Es os esul ados indican que los alimen os icos en SFA aumen an las p opiedades a e ogénicas de las TRL de las pe sonas con obesidad, pe o no en los indi iduos no mopeso, mien as que el consumo de alimen os con al o con enido en MUFA mejo an el pe il lipídico in acelula solo de los indi iduos no mopeso. 5. Las di e encias obse adas en los lípidos in acelula es se elaciona on con las modi icaciones en la exp esión génica de los ecep o es de memb ana. Se de ec ó que, coincidiendo con el momen o en el cual las TRL aisladas del g upo no mopeso son inco po adas más e icien emen e y causan los mayo es depósi os de lípidos in acelula es (4 ho as as la inges a), los ni eles de exp esión de los ecep o es celula es son los más bajos. Además, el inc emen o in acelula de los MUFA as la cap ación de las TRL aisladas después de consumi el desayuno de ipo medi e áneo p o ocó que se ob u ie an los meno es ni eles de ARNm de p ác icamen e odos los ecep o es celula es. De modo que el consumo del desayuno medi e áneo es a ía p opo cionando an o a la población obesa como a la no mopesa una ac i idad ca diop o ec o a al colabo a con la educción de la o mación 302 de células espumosas. En con a, se ha de ec ado el e ec o pe judicial causado en las pe sonas con obesidad cuando consumen el desayuno occiden al, ya que és e pa ece po encia la elación colabo a i a LDLR-LRP1, además de induci un inc emen o signi ica i o de la exp esión del ecep o CD36 du an e el pe iodo pos p andial, no de ec ado en los suje os no mopeso, colabo ando así a la o mación de células espumosas. 6. El a amien o de los cul i os de mac ó agos con pa ículas CRLP compues as po AG de dis in o g ado de sa u ación e eló que, a las 6 ho as de incubación, momen o en el que la LPL es más ac i a, ue on las CRLP-LLL las que causa on una mayo educción de los ni eles de ac i idad de LPL localizada en la supe icie celula , y las CRLP-POP la meno . Es os esul ados coinciden con la li e a u a cien í ica, pues se ha es ablecido que los complejos o mados en e ANGPTL4 y los AG son más ue es con SFA, colabo ando a man ene la ac i idad de LPL, y los más débiles con PUFA, educiéndose po an o su ac i idad. En cambio, a las 24 ho as, la capacidad modulado a de la ac i idad ca alí ica de la enzima po pa e de las di e en es pa ículas CRLP es muy simila , iéndose és a educida sin di e encias signi ica i as en e los AG componen es de las pa ículas. Es os esul ados coinciden con los ni eles de ac i idad de ec ados en el medio de cul i o y en el espacio in acelula , siendo el con ol de la ac i idad de LPL en es a úl ima acción a ibuido a la acción modulado a de los AG sob e PPARs, y no ANGPTL4. La cuan i icación de la abundacia ela i a de ARNm LPL y ANGPTL4 mos ó que el con enido de PUFA y MUFA de las CRLP causó una impo an e educción en los ni eles de exp esión de LPL y una sob eexp esión de ANGPTL4, siendo es e e ec o más acusado cuando los mac ó agos ue on a ados con CRLP-LLL. Es os esul ados apoyan la unción p o ec o a de MUFA y PUFA an e la o mación de células espumosas, al con ibui a educi la in e acción en e TRL y los ecep o es celula es median e la educción de la ac i idad de la LPL. En cambio, en con enido de SFA en las CRLP pa ece ayuda a man ene la ac i idad de LPL de mac ó agos, es imulando la acumulación de lípidos en el in e io de las células. CONCLUSIÓN: En gene al, los esul ados ob enidos pe mi en conclui que el consumo de un desayuno de ipo medi e áneo ayuda a educi la espues a lipidémica pos p andial en las pe sonas obesas, y con ibuye a una meno o mación de células espumosas median e la educción de los ni eles de exp esión de los ecep o es celula es, así como la ac i idad de la LPL. No obs an e, pa a que la espues a in lama o ia es ablecida en la obesidad se eduzca po la inges a de una die a ica en MUFA, se ía necesa io que és os indi iduos pe die an p e iamen e peso co po al. 303