Estudio de los plásmidos SEVA para el desarrollo de nuevas herramientas de biología sintética en cianobacterias.

Estudio de los plásmidos SEVA para el desarrollo de nuevas herramientas de biología sintética en cianobacterias Memoria del Trabajo de Fin de Grado Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular Grado en Bioquímica por las Universidades de Sevilla y de Málaga Curso 2023/2024 Autor: Pablo Sousa Sánchez Director: Luis Gonzaga Heredia Martínez Tutor: Luis López Maury 2 Índice 1. Resumen ............................................................................................................................. 3 2. Introducción ........................................................................................................................ 4 2.1. Cianobacterias .............................................................................................................. 4 2.2. Biología sintética ......................................................................................................... 6 2.3. Métodos de movilización horizontal del ADN ............................................................ 8 2.4. Colecciones de plásmidos sintéticos: pSEVA .............................................................. 9 3. Objetivos ........................................................................................................................... 10 4. Materiales y métodos ........................................................................................................ 11 4.1. Organismos y condiciones de cultivo ........................................................................ 11 4.2. Plásmidos y oligonucleótidos .................................................................................... 13 4.3. Métodos de Biología Molecular ................................................................................ 14 4.4. Transferencia de plásmidos en microorganismos ...................................................... 16 4.5. Análisis bioquímicos .................................................................................................. 19 4.6. Métodos bioinformáticos ........................................................................................... 20 5. Resultados ......................................................................................................................... 21 5.1. Viabilidad de pSEVA transferidos en Synechocystis .................................................. 21 5.2. Transferencia del vector R6K en la estirpe de Synechocystis pir+ ............................. 22 5.3. Creación de un plásmido sintético con el oriR RSF1010 y elementos SEVA ........... 23 5.4. Transferencia de los nuevos plásmidos pSEVA 25º1 en Synechocystis ..................... 25 5.5. Conjugación de los nuevos plásmidos pSEVA 25º1 en Anabaena ............................ 26 6. Discusión .......................................................................................................................... 27 6.1. Perspectivas futuras ................................................................................................... 29 7. Referencias ....................................................................................................................... 30 3 1. Resumen Los vectores plasmídicos son uno de los sistemas más eficientes para la modificación genética en bacterias, pero existe una falta de estandarización de estas herramientas. La librería SEVA-DB es una iniciativa que promueve la utilización de plásmidos sintéticos basados en elementos modulables para facilitar el diseño de los dispositivos genéticos. Sin embargo, no existen publicaciones que estudien de forma sistemática su viabilidad en cianobacterias. En el presente trabajo se establecieron cuáles de estos vectores son más eficientes, mediante diferentes métodos de transferencia del ADN, en el organismo modelo Synechocystis sp. PCC 6803. De entre los siete plásmidos probados, sólo los basados en el origen de replicación RSF1010 presentaron colonias y en estas, la electroporación fue el método más eficiente. Adicionalmente, se diseñó un nuevo vector sintético adaptado al estándar SEVA y este presentó una ventaja conjugativa respecto a los disponibles en la librería. Estos nuevos plásmidos fueron viables tanto en el organismo modelo estudiado, como en la cianobacteria filamentos Anabaena sp. PCC 7120. Este trabajo desarrolla y expande la utilización de los plásmidos SEVA para establecer metodologías optimizadas con el fin de facilitar la biología sintética en cianobacterias. 4 2. Introducción 2.1. Cianobacterias Las cianobacterias son organismos procariotas capaces de realizar la fotosíntesis oxigénica y son un grupo filogenéticamente muy diverso. Estas eubacterias poseen fotosistemas similares a las algas y plantas superiores (Stanier & Cohen-Bazire, 2003), siendo considerados los ancestros de los cloroplastos en las células vegetales eucariotas según la teoría endosimbiótica (Yagi & Shiina, 2014). Constituyen el grupo de organismos fotosintéticos más abundante del planeta por lo que son importantes agentes en numerosos ciclos biológicos cómo el de carbono (Reyes-Prieto et al., 2007) y nitrógeno, ya que existen cianobacterias capaces de fijar nitrógeno atmosférico (Berman-Frank et al., 2003). Son las responsables de la formación de la atmósfera oxigénica (Fischer et al., 2016) y se les atribuye 2/3 de la producción primaria de los océanos, lo que equivale a la mitad de la producción global (García-Fernández et al., 2004). Estas presentan una gran plasticidad metabólica, siendo capaces de crecer en condiciones fotoautótrofas, mixotróficas y fotoheterotróficas (Rippka, 1972), lo que les otorga una gran adaptabilidad. Además, el genoma de un gran número de cianobacterias ha sido secuenciado y publicado en bases de datos cómo BioCyc (Karp et al., 2019). Es por ello por lo que muchas cianobacterias se han establecido como modelos para estudiar la fotosíntesis y la fijación de carbono y nitrógeno. 2.1.1. Synechocystis sp. PCC 6803 Este trabajo se ha realizado en Synechocystis sp. PCC 6803 (en adelante Synechocystis) como organismo modelo. Esta es una especie unicelular no fijadora de nitrógeno que pertenece a la sección taxonómica I según Rippka et al., 1979. Presenta un genoma poliploide compuesto por un cromosoma circular de 3,57 Mb y 7 plásmidos de tamaños entre 119 y 2,2 kb (Kaneko et al., 2003). Fue la primera cianobacteria y primer organismo fotosintético cuyo genoma fue secuenciado (Kaneko et al., 1996) con un contenido en GC de un 47%. Tiene un tiempo de duplicación en crecimiento de 8 horas y es un gran modelo para estudios genéticos, puesto que es capaz de incorporar ADN exógeno mediante transformación natural e incorporarlo en su genoma por recombinación homóloga 5 (Porter, 1986). La capacidad de crecer heterotróficamente en ausencia de luz ha permitido una gran caracterización de los aparatos fotosintéticos ya que es posible estudiar mutantes de ambos fotosistemas (Williams, 1988). Su genoma también presenta ciertas similitudes con el del plasto con al menos 224 genes que comparten homología (Ikeuchi & Satoshi Tabata, 2001). Por lo tanto, es uno de los modelos más utilizados para el estudio del aparato fotosintético y diversas rutas metabólicas (Allaf & Peerhossaini, 2022). 2.1.2. Anabaena sp. PCC 7120 Otro organismo utilizado durante la realización de este trabajo es la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 (en adelante Anabaena), que pertenece a la sección taxonómica IV según Rippka et al., 1979. Se caracteriza por ser una cianobacteria filamentosa que posee una diferenciación celular terminal en heterocistos capaces de fijar nitrógeno atmosférico (Muro- Pastor & Hess, 2012), por lo que se utiliza cómo modelo para el estudio de este proceso. Su genoma consta de un cromosoma circular de 6,4 Mb y 6 plásmidos de entre 5,5 y 408 Kb y con un contenido en GC del 41% (Kaneko et al., 2001). Existen distintos métodos para introducir ADN exógeno en Anabaena cómo la conjugación triparental (Elhai & Wolk, 1988) o la electroporación (Thiel & Poo, 1989), aunque carece de la capacidad de ser transformada naturalmente. 2.1.3. Aplicaciones biotecnológicas en cianobacterias En el caso de las cianobacterias, existe un gran beneficio de utilizar estos organismos fotosintéticos por dos factores principales: lo primero es que pueden trabajar cómo biofactorías para la producción sostenible de compuestos de interés cómo combustibles, suplementos dietéticos, fertilizantes o biomateriales (Zahra et al., 2020). Lo segundo es que presentan una eficiencia fotosintética 10 veces mayor que en plantas superiores (Li et al., 2008), por lo que no tienen la necesidad de un sustrato costoso y contribuyen a convertir el CO2 atmosférico en O2. Sin embargo, a diferencia de otros modelos biológicos más estudiados cómo E. coli, las cianobacterias son un grupo con menos herramientas genéticas desarrolladas. Esto hace que la velocidad de los estudios y sus posibles aplicaciones sean ralentizados por esta falta de infraestructura. 6 2.2. Biología sintética La biología sintética es un campo de estudio basado en la “bioconvergencia”, que es la unión de varias disciplinas como la biología, la química, la ingeniería y las ciencias de la computación. Estas se combinan para dar lugar a los “re-writers” (Bensaude-Vincent, 2009), diseñadores que se rigen por el Dogma Central de la Biología Molecular para formar nuevos sistemas biológicos (Crick, 1970). Para ello, toman fundamentos de la ingeniería, como es el desarrollo de métodos optimizados basados en una lista de mecanismos y materiales predefinidos (protocolos y secuencias de ADN para alterar los genomas), junto con un conjunto de normas que describen cómo se utilizan los distintos materiales en combinación y definen un comportamiento predecible. Así, empezaron a crearse los primeros dispositivos sintéticos (Monod & Jacob, 1961), hasta la formación de genomas con los mínimos genes esenciales (Glass et al., 2017). El desarrollo de nuevas aproximaciones “ómicas", que permiten la obtención de grandes cantidades de datos con los que establecer modelos sobre la regulación de los organismos, han provocado grandes avances y abierto nuevas perspectivas sobre los sistemas biológicos (Aizat et al., 2018). Conjuntamente, el aumento en la eficiencia de las herramientas de síntesis de ADN (Carlson, 2009), ha permitido un enfoque más sistémico sobre las alteraciones genómicas y la modificación de procesos biológicos. La tendencia que esta disciplina ha desarrollado en las últimas décadas está basada en grupos de investigación aislados que han diseñado sus sistemas biológicos con criterios propios. Es por ello por lo que, debido a la falta de una estandarización de las herramientas disponibles, han aparecido iniciativas para homogeneizarlas como los BioBricks (Smolke, 2009). Estos son elementos genéticos funcionales predefinidos que son fácilmente intercambiables con el fin de acelerar y facilitar las modificaciones biológicas (Shetty et al., 2008). Otro de los proyectos destinados a estandarizar los sistemas de biología sintética ha sido la creación de un nuevo lenguaje denominado SBOL, que toma los principios de la ingeniería para facilitar la comunicación y acelerar el diseño de nuevos dispositivos (Galdzicki et al., 2014). 7 2.2.1. Nuevas plataformas de biología sintética en cianobacterias Existe un gran interés en desarrollar plataformas sintéticas funcionales en cianobacterias. Dado el contexto económico y medioambiental actual, que busca alternativas más sostenibles para la producción de ciertos compuestos de valor comercial (Zahra et al., 2020), muchas de estas propuestas están basadas en su adaptabilidad metabólica para crear fábricas celulares (Lindblad et al., 2019). Sin embargo, el rendimiento de la producción ha sido relativamente bajo en comparación con otros modelos cómo E. coli o levaduras. Una de las razones que explican esto es la escasez de elementos reguladores disponibles que son capaces de modificar específicamente la fisiología de la célula. No obstante, existen grandes avances en este campo en los últimos años. Estos se centran en la caracterización y optimización de elementos reguladores como promotores, sitios de unión al ribosoma o riboswitches (Sengupta et al., 2018). También se han desarrollado herramientas para la edición e integración cromosómica de genes mediante la utilización de vectores y sistemas CRISPR-Cas, que permiten modificar todas las copias cromosómicas y alterar genomas (Wang et al., 2020). 2.2.2. Vectores en la biología sintética de cianobacterias Los vectores son un vehículo para introducir alteraciones genéticas en los organismos. Estos son capaces de portar genes de resistencia frente a factores selectivos y a condiciones de estrés o de insertar genes para la expresión de proteínas de interés y elementos reguladores. Los vectores replicativos, que permanecen externos al genoma, tienen una gran utilidad en la expresión temporal de genes y son idóneos para formar dispositivos sintéticos complejos (Lee et al., 2011). Estos elementos pueden ser modificados u optimizados in vitro o in vivo, posibilitando el uso de colecciones de BioBricks ya creados. Sin embargo, las cianobacterias forman un grupo filogenéticamente muy diverso, por lo que la aplicabilidad de los vectores en muchos de estos microorganismos no siempre es la deseada. Los vectores basados en BioBricks permiten insertar sistemas muy optimizados, ya que son comunes entre filos, pero con una modularidad en la que se sustituye el origen de replicación y los elementos de transferencia del plásmido para una mayor adaptabilidad. La búsqueda de un vector de alto número de copias, funcional en diferentes modelos y con protocolos estandarizados es de gran interés en la industria. 8 2.2.3. Orígenes de replicación en cianobacterias Entre los vectores más utilizados en el campo, existe un gran número de orígenes de replicación. Uno de los más extendidos en cianobacterias, y en particular en Synechocystis, es el RSF1010 (Mermet-Bouvier et al., 1993), que es viable en diversas bacterias gram(-). Tiene un tamaño de 8,6 kb y se replica en un bajo número de copias (Marraccini et al., 1993). Presenta una replicación por desplazamiento de hebras dependientes de las proteínas RepBAC (Scherzinger et al., 1984). Debido a la actividad de estas tres proteínas, la replicación es independiente al mecanismo de transcripción del huésped, lo que podría favorecer su capacidad de amplio rango (Kües & Stahl, 1989). Otros de los orígenes de replicación más utilizados son los presentes en el plásmido pDU1, cuya región mínima para replicarse es de apenas 1,3 Kb (Jin et al., 2018) y en el plásmido pANS, que produce el mayor número de copias por célula respecto a los dos anteriores (Chen et al., 2016). Estos tres plásmidos son además compatibles entre sí. 2.3. Métodos de movilización horizontal del ADN 2.3.1. Transformación Ciertas estirpes bacterianas son capaces de integrar un vector exógeno mediante transformación natural, como es el caso de Synechocystis (Vermaas, 1996). El mecanismo por el cual es capaz de introducir ADN exógeno es aún desconocido, pero se sabe que sus pilis de tipo IV son esenciales para la transformación (Oeser et al., 2021). 2.3.2. Conjugación Es un método de transmisión de material genético mediante un contacto célula-célula. El ADN se moviliza debido a 3 módulos proteicos especializados: • El relaxosoma: está constituido por el origen de transferencia (oriT) y proteínas involucradas en el reconocimiento y procesamiento del ADN que se va a transferir. • MPF: complejo multiproteico formador del par conjugativo que establece uniones físicas mediante pilis entre de la célula donadora, con componentes de la superficie de la célula receptora (Fernández López, 2015). • Complejo acoplador (T4CP): comunica el relaxosoma con el MPF. 9 2.3.3. Electroporación No todas las cianobacterias poseen competencia para la transformación natural, por lo que deben utilizarse distintas estrategias para incorporar los plásmidos (Vioque, 2007). La electroporación es un método que introduce directamente el ADN en la célula mediante el uso de pulsos eléctricos de gran intensidad que permeabilizan la membrana bacteriana, permitiendo la entrada de moléculas de ADN exógeno (Cadoret et al., 2014). 2.4. Colecciones de plásmidos sintéticos: pSEVA La “Standard European Vector Architecture Database” (SEVA-DB, http://seva.cnb.csic.es) es una de estas propuestas que crea un repositorio de elementos estandarizados y de libre uso, organizados por una nomenclatura numérica (Silva-Rocha et al., 2013). Se busca adoptar materiales y metodologías comunes para trabajar eficientemente bajo unos mismos parámetros y que los resultados sean más fidedignamente comparables. En esta, se pueden elegir una serie de vectores modulables optimizados y fáciles de manipular para su uso en organismos procariotas, no sólo en organismos modelos. Los elementos genéticos funcionales son completamente intercambiables para adaptarse a las necesidades del organismo, adoptando un lenguaje propio (SEVA standard). Todos los módulos disponibles en la colección han sido modificados, eliminando los posibles defectos estructurales o funcionales y sustituyendo sitios de restricción comunes por únicos para facilitar el intercambio entre módulos. Además, han sido minimizados para disminuir el tamaño final del vector, lo que puede ser un factor limitante según el organismo y método utilizado (Yoshida & Sato, 2009). También, han diseñado 6 oligonucleótidos cuyas secuencias complementarias están presentes en todos los vectores con el fin de secuenciar o detectar la presencia de los módulos. Por último, se han introducido secuencias que posibilitan el ensamblaje de los vectores mediante recombinación homóloga con métodos de clonación más eficientes cómo el Golden Gate Clonning (Engler & Marillonnet, 2014). Los plásmidos SEVA (pSEVA) están organizados en módulos funcionales flanqueados por sitios de restricción específicos. Se distinguen tres elementos principales (Figura 1): gen de resistencia a antibiótico, módulo cargo, que contiene un sitio de clonación múltiple, y el origen de replicación (oriR), que proviene de plásmidos de amplio rango de huéspedes. Estos son viables en un gran número de estirpes bacterianas y tienen la capacidad 16 4.3.4. Purificación de ADN de geles de agarosa Tras una electroforesis en gel de agarosa, se reveló el gel utilizando luz UV y se cortaron las bandas de interés. El aislamiento del ADN de dichas bandas de agarosa se llevó a cabo mediante el uso del kit FavorPrepTM GEL/PCR Purification Mini Kit de Biotech Corp., siguiendo las instrucciones del fabricante. 4.3.5. Manipulación enzimática del ADN Para la construcción y modificación de los plásmidos sintéticos se trató enzimáticamente el ADN cómo se describe en Sambrook, 1989. Todas las enzimas empleadas se suministraron por New England Biolabs y se utilizaron siguiendo las indicaciones del fabricante. 4.3.6. Secuenciación del ADN El cultivo de E. coli transformado con el plásmido sintético se cultivó en medio selectivo. Posteriormente se aisló el ADN plasmídico (como se describe en el apartado 4.3.1) para comprobar las secuencias de ADN y la presencia del inserto mediante secuenciación. Esta se llevó a cabo con el servicio comercial de StabVida (Portugal). 4.4. Transferencia de plásmidos en microorganismos 4.4.1. Transformación de E. coli Se transfirieron los plásmidos de interés a las estirpes de células competentes DH5α y HB101. Se añadieron 20 µl de plásmido en 100 µl de células competentes mantenidas en hielo. A continuación, se llevó a cabo un choque térmico de 10 minutos en hielo, 1 minuto a 42 ºC y 2 minutos nuevamente en hielo. Después se añadieron 900 µl de medio LB y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, se sembró todo el volumen en placas con medio LB selectivo y se incubó a 37 ºC 24 horas. Las colonias crecidas se pasaron a una placa con medio LB selectivo y crecieron hasta su posterior comprobación. 17 4.4.2. Transformación de Synechocystis Este método es una modificación del descrito anteriormente por Chauvat et al. en 1986. Los cultivos líquidos en fase exponencial se centrifugaron a 4.500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para ser lavados 2 veces al descartar el sobrenadante y resuspender en 50 ml de medio BG11c. Tras el segundo lavado, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 1 ml de medio BG11c y se hicieron alícuotas de 200 µl, en tubos de poliuretano de 10 ml, y se añadieron los plásmidos purificados tratando de igualar la concentración final (10-20 µg de ADN). Después se incubó la mezcla de células y ADN durante 2-3 horas a 30 ºC y en condiciones estándar de iluminación (50 µE m-2 s-1). Posteriormente, se sembraron las células en una placa Petri de 25 ml de medio BG11c no selectivo sobre filtros de nitrocelulosa 0,45 µm (IMMOBILON-NC). Tras 20 horas en estas condiciones de crecimiento, se transfirieron los filtros a otra placa con medio BG11c selectivo con los antibióticos apropiados. Las colonias transformadas aparecieron en un periodo de 7-10 días. 4.4.3. Conjugación de Synechocystis Se realizó el método de conjugación triparental descrito por Thiel & Peter Wolk en 1987. Se incubaron las cepas de E. coli portadoras del plásmido a insertar en 3 ml de medio LB con el antibiótico apropiado, así como la estirpe ED8654, que porta el plásmido pRL443 con los elementos necesarios para la conjugación (Tabla 3). Se diluyeron los cultivos crecidos durante 24 horas a 37 ºC 1:100 en 10 ml de medio no selectivo (100 ml para la estirpe ED8654) y crecieron durante 2 horas en las mismas condiciones. Después, se recogieron los cultivos mediante centrifugación a 2.500 g durante 8 minutos, para luego resuspender el pellet en 500 µl de medio LB (se resuspenderán el mismo número de alícuotas de la ED8654 por el número de conjugaciones a realizar). Posteriormente, se dividieron alícuotas de 0,5 ml de cepa ED8654 con 0,5 ml de la cepa portadora del plásmido de interés. Se centrifugó a 2.500 g durante 5 minutos y se resuspendió el pellet en 100 µl de medio LB para incubar a 30 ºC durante 2 horas sin movimiento. Posteriormente, se añadieron 30 µl de cultivo de Synechocystis concentrado (10 µg de clorofila) a cada alícuota de conjugación. Se extendió la mezcla sobre filtros de nitrocelulosa 0,45 µm (IMMOBILON-NC) en placas de 25 ml con medio BG11c 18 suplementado con 5% de medio LB sin antibióticos y se incubaron en las condiciones anteriormente descritas. Después de 24 horas de crecimiento, se transfirió el filtro de nitrocelulosa a una placa con medio BG11c con el antibiótico apropiado y se incubó en luz entre 7-10 días hasta que se pudieron identificar colonias y se murieron las E. coli. 4.4.4. Electroporación de Synechocystis El protocolo utilizado es una variación de Ludwig et al., 2008. Se centrifugaron 25 ml de cultivo liquido en fase exponencial de crecimiento a 3.200 g durante 10 minutos a 4 ºC. Posteriormente, se resuspendió el pellet en 5 ml de tampón ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1- piperacinil) etanosulfónico (HEPES) pH 7,5 a una concentración de 1 mM, previamente preparado en frío y esterilizado con un filtro de 0,22 µm de tamaño de poro (Biofil). Tras 2 lavados, se resuspendió el pellet en alícuotas de 100 µl de HEPES y se incubó con 1 µg de plásmido en frío. La mezcla se transfirió a cubetas de electroporación de 0,2 mm (Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, Bio-Rad) y se electroporó con el aparato MicroPulser Electroporator (Bio-Rad) con un capacitor de 15-µF, a 2.500 V y con una constante de tiempo variable entre 4 y 6 ms. Inmediatamente tras el pulso, se recuperó con 400 µl de BG11c y se sembraron las células electroporadas sobre filtros de nitrocelulosa 0,45 µm (IMMOBILON-NC) en placas con 25 ml de medio BG11c no selectivo. Tras un día de crecimiento, el filtro se transfirió a una nueva placa con el antibiótico apropiado y se incubó entre 7-10 días hasta que se aprecien las colonias. 4.4.5. Conjugación de Anabaena Este protocolo está basado en la conjugación triparental mediante el uso de un plásmido conjugativo de amplio espectro según Elhai & Wolk en 1988. Se utilizaron una primera estirpe de E. coli HB101, que porta un vector auxiliar pRL623 para la metilación del ADN a transferir, y otra estirpe de E. coli ED8654, que porta el plásmido conjugativo pRL443 que contiene los genes para codificar el aparato conjugativo (Tabla 3). Primero, se transformó la estirpe HB101 con el plásmido cargo siguiendo el protocolo descrito en el apartado 4.4.1. Este cultivo, cómo el de la otra estirpe, fueron incubados a 37 ºC en agitación el día anterior a la conjugación en 3 ml de medio LB para que las células 19 estuvieran en fase exponencial. Tras esto, se inocularon 250 µl (para pRL443) y 300 µl (para la estirpe con el plásmido cargo) de los cultivos en 10 ml de medio LB con los antibióticos apropiados y se incubó en las mismas condiciones durante 2,5 horas. Posteriormente, se realizó la conjugación de pRL443 desde ED8654 a HB101. Para ello, previamente se retiraron los antibióticos de los cultivos al ser lavados dos veces mediante centrifugación y resuspendiendo en 15 ml de medio LB. Finalmente, se resuspendió en 5 ml de medio LB y se combinaron ambos cultivos para ser recogidos por centrifugación y resuspendidos en 60 µl de medio. Las dos estirpes se incubaron juntas a 30 ºC sin agitación durante 2,5 horas y tras esto, se combinaron con un inóculo concentrado de Anabaena (10 µg de clorofila) en un volumen máximo de 200-300 µl. Se extendió la mezcla sobre filtros estériles de nitrocelulosa 0,45 µm (IMMOBILON-NC) en placas Petri con medio BG11 suplementado con 5% de LB (v/v) y fueron incubadas a 30 ºC a baja intensidad lumínica durante 1-2 horas y después a alta intensidad. Al siguiente día, se transfirieron los filtros a placas Petri con medio BG11 y tras 24 horas, se pasaron a placas Petri con medio BG11 y medio selectivo (con el antibiótico apropiado). Cada 2 días se transfirió el filtro a una nueva placa con medio selectivo con el objetivo de eliminar a E. coli y las cianobacterias que no habían incorporado el plásmido. 4.5. Análisis bioquímicos 4.5.1. Determinación de la concentración de clorofila La concentración de clorofila es una medida que permite determinar el número de células en un cultivo de forma espectrofotométrica (Mackinney, 1941). Se tomaron 50 µl del inóculo y se añadieron 950 µl de metanol absoluto. La mezcla se agitó en un vórtex durante 1 minuto y se centrifugó a 13.000 g durante 2 minutos. Posteriormente se midió la densidad óptica del sobrenadante en un espectrofotómetro Jasco V-650 (Jasco Analítica Spain, S.L.) a una longitud de onda de 665 (Yéprémian et al., 2016): Chl total (µg/µl) = A665 × 13,45 20 4.5.2. Medida de la densidad óptica Para medir el grado de crecimiento de los cultivos de cianobacterias, se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 750 nm en un espectrofotómetro Jasco V-650 (Jasco Analítica Spain, S.L.). 4.6. Métodos bioinformáticos Se utilizaron distintas bases de datos y softwares para el procesamiento de datos. Las secuencias de los plásmidos se obtuvieron del National Center for Biotecnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y del SEVAhub (http://sevahub.es/). Se realizaron diversos análisis in silico con el software SerialCloner 2.6.1 (http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html). En este, se visualizaron las regiones anotadas de los plásmidos, se observaron las localizaciones de las dianas de restricción en las secuencias de ADN, se diseñaron y predijeron las PCRs, se analizaron los resultados de la secuenciación y se diseñaron los plásmidos sintéticos. Los protocolos de restricción se obtuvieron de la plataforma NEBcloner (https://nebcloner.neb.com) de New England Biolabs. 21 5. Resultados 5.1. Viabilidad de pSEVA transferidos en Synechocystis La librería de plásmidos SEVA tienen un uso extendido en distintas bacterias gram(-), pero no existe ningún estudio que haya comprobado su viabilidad en Synechocystis de forma sistemática y con varios métodos de transferencia. Con el fin de buscar nuevos vectores con diferentes oriR, se estudió la capacidad replicativa de diversos pSEVA (Tabla 5) en Synechocystis, tras ser transferidos mediante transformación, conjugación y electroporación al menos en dos ocasiones. Los plásmidos probados se diferencian únicamente en el oriR: R6K, RSF1010, RK2, pUC, pUC/SCP2, pUC/pIJ101 y pRO1600/ColE1. Estos son de amplio rango de huésped, a excepción del R6K que es de bajo rango, con un tamaño y número de copias variables. Todos los plásmidos presentan una resistencia a antibiótico y son capaces de replicarse en E. coli, de dónde fueron conjugados o aislados para la transformación y electroporación. Los cultivos con los plásmidos transferidos se cultivaron con el antibiótico al cual presentan resistencia, por lo cual deben replicarse y expresar el respectivo gen para poder crecer. En ninguna ocasión se obtuvieron colonias resistentes a los antibióticos a excepción de los que portan un oriR RSF1010, que crecieron con los tres métodos de transferencia. Figura 2. Crecimiento de colonias en cultivos de Synechocystis WT conjugados con los pSEVA. Estos crecieron en medio BG11c con el antibiótico al cual son resistentes. En los cultivos sin vector (ø), y con el resto de pSEVA no aparecieron colonias, a excepción del que portaba el oriR RSF1010. Esto fue representativo de la transformación y electroporación. 22 Adicionalmente, se observó que el sistema de transferencia que produjo un mayor número de colonias, en los cultivos que crecieron con los plásmidos con RSF1010, fue la electroporación, seguido por la transformación y conjugación con resultados semejantes. Por último, se comparó la eficiencia y mantenimiento mediante transformación de plásmidos con el oriR RSF1010, pero utilizando diferentes genes de resistencia a antibióticos para descartar su influencia en el crecimiento: pSEVA 251 (KmR), pSEVA 351 (CmR) y pSEVA 451 (St/SpR) (Tabla 5). No se observaron diferencias significativas en el número de colonias obtenidas. La presencia del plásmido en todos los cultivos crecidos se verificó mediante PCR con los oligonucleótidos 3 y 4 (Tabla 6). 5.2. Transferencia del vector R6K en la estirpe de Synechocystis pir+ Los plásmidos con un oriR R6K necesitan de una estirpe que exprese el gen pir en trans para su replicación (Kolter et al., 1978). Por ello, se utilizó una estirpe de Synechocystis de la colección del laboratorio capaz de expresar el gen pir (Tabla 1): esta se generó por recombinación homóloga de la secuencia del gen nrsD, implicado en la resistencia a níquel (García-Domínguez et al., 2000). La secuencia contiene el promotor constitutivo en Synechocystis Ptrc (Camsund et al., 2014), que controla la expresión del pir y de un gen de resistencia a Nourseotricina (Nat). La estirpe fue confirmada mediante PCR (Figura 3) con los oligonucleótidos 1 y 2 (Tabla 6). Figura 3. Electroforesis confirmativa de la PCR de la estirpe Synechocystys pir+. Se localiza la amplificación de la secuencia nrsD::Ptrc:pir:NatR (3293 pb) en la estirpe pir+, mientras que no hubo amplificación en el WT. Se transfirió el plásmido pSEVA411 con oriR R6K y el pSEVA 451 con oriR RSF1010 (Tabla 5), cómo control positivo, en las estirpes de Synechocystis WT y pir+(Tabla 1), que crecieron en medio selectivo (Figura 4A). Aparecieron colonias en las dos estirpes con plásmidos con RSF1010, pero ninguna con el R6K. La presencia del plásmido en las colonias fue confirmada mediante PCR (Figura 4B) con los oligonucleótidos 3 y 4 (Tabla 6). 23 Figura 4. Estudio de la viabilidad de los pSEVA con R6K mediante su transferencia en estirpes de Synechocystis WT y pir+. (A) Electroporación de los plásmidos en las dos estirpes de Synechocystis. Los cultivos con el pSEVA 451 (RSF1010) presentaron colonias en ambas estirpes. En los cultivos sin vector (ø) y con el pSEVA 411 (R6K) no hubo crecimiento. Esto fue representativo de la transformación y la conjugación. (B) Electroforesis confirmativa de la PCR de colonias del MCS amplificado de los pSEVA (135 pb) en estirpes de Synechocystis WT y pir+. Esto fue representativo del resto de confirmaciones. 5.3. Creación de un plásmido sintético con el oriR RSF1010 y elementos SEVA En experimentos anteriores (no publicados) se observó que la eficiencia de la conjugación de los pSEVA 451 era menor que en otros plásmidos con un oriR RSF1010 sin modificar (RSF1010 original). Por ello, se diseñó un nuevo plásmido sintético denominado pSEVA 25º1, adaptado al estándar SEVA, con el software SerialCloner 2.6.1. Este plásmido contiene el oriR RSF1010 original, con el sitio de restricción múltiple (MCS) y el gen de resistencia a antibiótico flanqueados por sitios de restricción AscI y XhoI (Figura 5A). Para obtenerlo, se amplificó mediante PCR el oriR RSF1010 original del pIL_J23100 (Mager et al., 2023) (Tabla 5), con los oligonucleótidos 6 y 7 (Tabla 6). También se amplificó el MCS y el gen de resistencia a kanamicina (KmR) del pSEVA251 (Silva-Rocha et al., 2013), con los oligonucleótidos 8 y 9. Los dos fragmentos generados se comprobaron mediante electroforesis y se aislaron por separado. Ambos, fueron digeridos con XhoI y AscI, se eliminó el ADN metilado correspondiente a los plásmidos molde con la enzima DpnI y finalmente se realizó una ligación con la ligasa del fago T4. Los plásmidos generados de la ligación se transformaron en estirpes de E. coli DH5α y se seleccionaron 3 colonias (RSF3, RSF4 y RSF5) para confirmar la estructura de los 24 plásmidos. Se realizó un protocolo de aislamiento de ADN plasmídico y una posterior digestión con las enzimas XhoI y AscI para visualizar el mapa de restricción por electroforesis (Figura 5B). Se observan por separado el oriR (5548 pb) y el inserto con el MCS y el gen de resistencia a Km (1353 pb) al digerir con XhoI y con AscI+XhoI, mientras que la digestión con AscI linearizaba el plásmido (6795 pb). Finalmente, los plásmidos aislados fueron secuenciados mediante metodología Sanger por StabVida con el oligonucleótido 4 (Tabla 6). Los datos indican que RSF3 y RSF5 son clones (pSEVA25º1 V1) que tienen dos sitios de restricción para XhoI y otros dos para AscI, mientras que RSF4 (pSEVA25º1 V2) tiene un sólo sitio de corte para XhoI y otro para AscI (Figura 5C). Esto último no es consistente con su mapa de restricción. Figura 5. Diseño y confirmación del nuevo plásmido sintético. (A) Mapa genético del plásmido pSEVA 25º1 diseñado. El oriV y oriT RSF1010 (verde). El gen de resistencia al antibiótico (KmR) (azul) y el sitio de restricción múltiple (MCS) (morado), aislado por los terminadores T1 y T0 (rosas), están flanqueados por sitios de restricción AscI y XhoI. (B) Electroforesis en gel de agarosa de la selección de colonias transformadas con el pSEVA 25º1 (RSF3, 4 y 5) tras una digestión con XhoI y AscI. En las digestiones con XhoI y XhoI+AscI se localiza el oriR (5548 pb) y el inserto MCS+KmR (1353 pb). La digestión con AscI produjo una banda única (6795 pb). Esto fue igual en los tres clones. (C) Representación de la secuenciación de los dos pSEVA25º1 aislados. RSF3 y RSF5 (pSEVA25º1 V1) presentan un sitio de corte XhoI entre dos AscI y otro sitio XhoI más alejado. RSF4 (pSEVA25º1 V2) presenta un único sitio de corte AscI y otro XhoI. 25 5.4. Transferencia de los nuevos plásmidos pSEVA 25º1 en Synechocystis El nuevo plásmido pSEVA 25º1 posee un oriT propio, distinto del presente en los pSEVA (RP4), por lo que la eficiencia en la transferencia puede verse afectada. Además, el tamaño del plásmido sintético es 1,5 kb más grande que el pSEVA de referencia, lo que puede tener una implicación en el proceso. A fin de corroborar el efecto en la transferencia de estas variaciones en la estirpe de Synechocystis WT, se transformaron y conjugaron por separado los tres plásmidos pSEVA 25º1 previamente secuenciados (RSF3, RSF4 y RSF5), junto con el pSEVA 251 y el pIL_J23100, para comparar su eficiencia de transferencia y replicación. Los elementos conjugativos presentes en estos plásmidos son distintos, pues el pSEVA 251 porta un oriT RP4, mientras que los plásmidos pIL_J23100 y pSEVA25º1 (RSF3, 4 y 5) portan un oriT RSF1010 (Tabla 5). Los cultivos crecieron en medio selectivo y se observó la aparición de colonias resistentes al antibiótico. Los resultados indican que hay una reducción en la eficiencia de la transformación de los pSEVA 25º1 y el pIL_J23100, debido a la formación de un menor número de colonias, respecto al pSEVA 251 (Figura 6). Sin embargo, ocurrió lo contrario con la eficiencia de la conjugación, que fue significativamente mayor en todos los plásmidos con un oriT RSF1010 respecto al pSEVA 251. Las colonias crecidas se genotiparon mediante PCR con los oligonucleótidos 3 y 4 (Tabla 6) para confirmar la presencia de los plásmidos. Figura 6. Transformación y conjugación de los nuevos plásmidos pSEVA25º1 en Synechocystis WT. Los cultivos sin vector no crecieron (imágenes no mostradas) en presencia de los antibióticos (Cm y Km). Los cultivos con pIL_J23100 (Cm) y pSEVA 25º1 (RSF3, 4 y 5) (Km) crecieron con una eficiencia similar. En las transformaciones, el pSEVA 251 (Km) presentó un mayor número de colonias, mientras que la conjugación fue significativamente más eficiente en los plásmidos pIL_J23100 y pSEVA 25º1 respecto al pSEVA 251. 32 Scherzinger, E., Bagdasarian, M. M., Scholz, P., Lurz, R., & Rückert, B. (1984). Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(3), 654. https://doi.org/10.1073/PNAS.81.3.654 Sengupta, A., Pakrasi, H. B., & Wangikar, P. P. (2018). Recent advances in synthetic biology of cyanobacteria. In Applied Microbiology and Biotechnology (Vol. 102, Issue 13, pp. 5457–5471). Springer Verlag. https://doi.org/10.1007/s00253- 018-9046-x Shetty, R. 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