Nuevos politriazoles protonables para terapia génica

Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Nuevos politriazoles protonables para terapia génica María Ramírez Espinosa 2 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia Nuevos politriazoles protonables para terapia génica Alumno: María Ramírez Espinosa Tutoras: Ma de Gracia García Martín y Elena Ma Benito Hernández Trabajo de carácter experimental Sevilla, julio de 2018 3 Índice 1. RESUMEN............................................................................................................4 2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES………….............................................................5 3. OBJETIVOS.........................................................................................................12 4. METODOLOGÍA Y PARTE EXPERIMENTAL...........................................................13 4.1.1 Métodos generales……………..……………………………………………………………13 4.1.2 Síntesis de monómeros…………………………………………………….................15 4.1.3 Síntesis de politriazoles……………………………………………………….…………..18 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................24 5.1.1 Síntesis y caracterización de monómeros……………………….………………...24 5.1.2 Síntesis y caracterización de politriazoles……………………….…………………26 6. CONCLUSIONES..................................................................................................31 7. BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................32 8. ANEXO: ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS……………………………………………………………37 4 1. RESUMEN La terapia génica consiste en utilizar genes para tratar o prevenir enfermedades. En la actualidad es quizás junto a la inmunonoterapia una de las estrategias más prometedoras en lo que se refiere al tratamiento del cáncer. Los primeros transportadores de material genético que se ensayaron eran virus atenuados y se denominaron vectores víricos pero presentaron altos niveles de toxicidad. Por esta razón se recurrió a vectores no víricos y las primeras experiencias se llevaron a cabo con las polietileniminas (PEIs), que aunque presentaban menor toxicidad causaron reacciones inmunológicas. Posteriormente las investigaciones se han encaminado al desarrollo de materiales biocompatibles y biodegradables, entre los cuales se está prestando especial atención a los polímeros derivados de carbohidratos, debido a sus inherentes propiedades de biocompatibilidad y degradabilidad hidrolítica y enzimática. Este Trabajo Fin de Grado se centra en la preparación de politriazoles catiónicos derivados de los monosacáridos L-arabinitol y D-manitol. Se describe la síntesis y caracterización estructural de los monómeros, así como de los polímeros precursores y de los catiónicos conteniendo grupos amino protonables. Además los anillos de triazol también son susceptibles de protonación. En primer lugar, se sintetizaron los monómeros adecuadamente funcionalizados, como son los dialquinil derivados y los diazido derivados, para posteriormente llevar a cabo las reacciones de cicloadición 1,3-dipolar catalizada por Cu (I), una de las denominadas reacciones click, condecentes a los politriazoles. La generación de los grupos amino protonables se llevó a cabo mediante una metodología anteriormente desarrollada en el grupo de investigación Carbohidratos y Polímeros, grupo donde se ha desarrollado este trabajo. Los politriazoles catiónicos pueden formar poliplejos mediante interacciones electrostáticas con los grupos fosfato del ADN, que podrían actuar como vectores eficaces en el transporte celular y en el proceso de transfección genética. Palabras clave: Politriazoles, terapia génica, polímeros biocompatibles, polímeros biodegradables, química click. 5 2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES El concepto de terapia génica se introdujo en 1963 como estrategia terapéutica, y desde entonces se han estudiado diversos materiales para combatir desórdenes tanto hereditarios como adquiridos. Este tipo de terapia, donde los ácidos nucleicos son los agentes terapéuticos, supone una alternativa a la quimioterapia clásica, ya que permite sustituir o silenciar un gen que se esté expresando de manera disfuncional (Xu y Yang, 2011). Por ejemplo, en los casos hereditarios el procedimiento consistiría en introducir una copia normal del gen afectado restaurando el correcto funcionamiento celular. En cambio, en las enfermedades adquiridas como el cáncer, el método consistiría en, además de introducir una copia normal, añadir la supresión de la capacidad de sobreexpresión de los genes afectados en células, siendo esta acción anormal la causante de la enfermedad. La primera vez que se aplicó este tipo de terapia fue en 1989, cuando se transfirió un gen resistente a los linfocitos con inmunodeficiencia combinada severa (ICS) (Blaese y cols., 1995). Se comprobó que el gen se había incorporado y los niveles de células sanguíneas se habían normalizados. A partir de entonces, se aprobó el uso de la terapia génica en el tratamiento de otras enfermedades, como en el tratamiento de -talasemia en pacientes que no podían acceder a un trasplante de médula compatible (Cavazzana-Calvo y cols., 2000 y 2010; Sheridan, 2011). Los trastornos adquiridos y genéticos como la fibrosis quística, la esclerosis múltiple, el cáncer, la hemofilia o enfermedades cardiovasculares entre otras, poseen características ideales para ser tratados mediante este tipo de terapia (Xu y Yang, 2011). Sin embargo, la nueva terapia no estaba exenta de efectos secundarios graves, constatándose la muerte de algunos voluntarios, así como la aparición de leucemia en los pacientes tratados contra la ICS (Hacein-Bey-Abina y cols., 2008). Estos efectos se vincularon a la toxicidad producida por los vectores empleados para el transporte y transfección del material génico en estos ensayos (Branca, 2005). Durante los ensayos clínicos se descubrieron riesgos importantes a tener en cuenta, limitando la aplicación de estas terapias (Nayak y Herzog, 2010). Por ejemplo, los vectores víricos son potencialmente capaces de recombinarse con otros virus susceptibles de replicación pudiendo inducir respuestas inmunogénicas e inflamatorias, y en ocasiones producir inserciones no deseadas en el genoma del hospedador (Nayak y Herzog, 2010; Rosenberg y Schechter, 2000; Gansbacher, 2003). Para conseguir el éxito con estas nuevas terapias, es necesario actuar intracelularmente, de manera que el tamaño de los agentes transportadores es determinante para penetrar en las 6 células. De hecho, se ha demostrado que las partículas grandes quedan retenidas en el hígado y el bazo antes de llegar a la diana terapéutica, mientras que las partículas con tamaño inferior a 20 nm son eliminadas fácilmente (Zhang y cols., 2013). Otra de las características importantes que deben presentar los transportadores es la capacidad para controlar la liberación de los agentes terapéuticos, lo que incrementaría la eficacia en la actividad terapéutica buscada. El espectacular desarrollo experimentado por la química de polímeros ha permitido acceder a sistemas biodegradables y biocompatibles que responden a estímulos (pH, temperatura, ambientes hipóxicos) y que pueden ser utilizados como sistemas de liberación controlada, actuando sobre dianas terapéuticas específicas. En un principio, los agentes transportadores (vectores) empleados eran virus atenuados, pero estos producían una elevada mutagenicidad e inmunogenicidad, de manera que se trabajó en el desarrollo de sistemas de transporte de genes no víricos como polímeros catiónicos. Estos polímeros fueron capaces de formar complejos con ADN y liberarlo en el interior de las células fácilmente, presentando una alta capacidad de expresión génica (Figura 1). Los primeros polímeros catiónicos empleados como vectores fueron polietiléniminas y poli- L-lisina pero no eran biodegradables (Boussif y cols., 1995; Asayama y cols., 1997) y provocaron reacciones inmunes e interacciones no específicas con células y proteínas, resultando ser aún más tóxicas que los vectores víricos, tanto in vitro como in vivo. A causa de estos inconvenientes, las investigaciones se dirigieron hacia la producción de vectores como los polisacáridos naturales que aunque no fueron tóxicos presentaron una baja expresión genética (Mintzer y cols., 2009). Figura 1. Mecanismo basados en vectores catiónicos con capacidad de expresión génica (Xu y Yang, 2011). 7 Las reacciones de tipo click engloban una serie de reacciones que se caracterizan por una metodología sencilla, transcurren en condiciones suaves, presentan elevados rendimientos y transcurren con regio y estereoselectividad (Such y cols., 2012). Este concepto de química click fue introducido en 2001 por Sharpless y trata de imitar la obtención natural de biomoléculas mediante la unión de pequeñas unidades a través de enlaces carbono-heteroátomo (Kolb y cols., 2001). La aportación de las reacciones click a los nuevos métodos de síntesis (Kihara y cols., 2017) ha supuesto un importante avance en el desarrollo de los materiales sintéticos para aplicaciones especiales, especialmente en el campo de la biomedicina. Este tipo de reacciones ha permitido obtener materiales poliméricos estructuralmente muy variados y que son capaces de responder a estímulos, por ejemplo, cambios de pH, por lo que se les denomina materiales inteligentes. Una de las reacciones click más estudiadas es la cicloadición azida-alquino catalizada por Cu (I) para la obtención de 1,2,3- triazoles (Figura 2). Figura 2. Cicloadición 1,3-dipolar de diazidas y alquinos (Himo y cols., 2005). Las cicloadiciones azida-alquino catalizadas por cobre han contribuido a la síntesis de una variedad de polímeros nanoestructurados sofisticados como dendrímeros, hiperramificados, polímeros de injerto, tipo peine y estrella (Huo y cols., 2017). Las aplicaciones de estos materiales abarcan procesos relacionados con autorreparación adhesivos, dispositivos optoelectrónicos, transportadores de fármacos y diagnóstico por imagen (Hugo y cols., 2017). El control de la relación estequiométrica de monómeros alquino/azida es un factor muy importante en la obtención de materiales funcionales basados en politriazoles para aplicaciones como agentes de transfección génica (Shi y cols., 2016). Este tipo de reacciones también puede ser utilizada para la obtención de politriazoles derivados de carbohidratos, de manera que los polímeros así obtenidos sean biodegradables y biocompatibles, limitando así los efectos tóxicos. Además la introducción de grupos disulfuro en las cadenas poliméricas favorecerá su reducción en ambientes hipóxicos (como los que se 8 encuentran en tumores sólidos) y facilitará la liberación de ADN, favoreciendo la eficacia de la transfección (Ahmed y Narain, 2013). Sin embargo, aspectos como la heterogeneidad y polidispersidad que presentan los polímeros, al contrario a otros sistemas definidos estructuralmente como las ciclodextrinas (Ortiz y cols., 2011) hicieron que durante cierto tiempo dejaran de tener interés como vectores no virales (He y Wagner, 2015). Los materiales sintéticos biocompatibles y biodegradables desarrollados en las últimas décadas, han encontrado aplicaciones en áreas como la biomedicina, la ingeniería de tejidos, el diseño de nuevos dispositivos médicos, la liberación controlada, o la terapia génica, entre otros. Los carbohidratos han contribuido en gran medida al desarrollo de este tipo de materiales El primer derivado de carbohidrato utilizado como vector no vírico fue una poli-L-lisina conteniendo galactosa a los receptores asialoglicoproteína incluidos en la membrana celular de los hepatocitos (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Tanto galactosa como manosa han sido estudiadas como glicoligandos debido a la selectividad que presentan por las células de los sistemas hepático e inmune. La introducción interna de un PEI galactosilado por hepatocitos (Figura 3) no es suficiente para alcanzar la especificidad ya que existen otros mecanismos paralelos. Los glicoconjugados pueden ser reconocidos específicamente por los receptores de las membranas celulares y otros receptores intracelulares, cuya expresión depende también del estado en desarrollo de la célula (Bies y cols., 2004; Zhang y cols., 2010). Figura 3. Sintesis de PEI lactosilado. El polisacárido más estudiado como vector no vírico es el quitosano. También se han estudiado otros derivados de carbohidratos como transportadores de material genético Reineke y Guan (Liu y cols., 2004; Metzke y cols., 2005), prepararon de manera independiente una variedad de poliglicoamidoaminas (PGAAs) imitando la estructura lineal de las 9 polietileniminas (PEI) (Figura 4) y de la poli-L-lisina (PLL). Estas PGAAs se estudiaron frente a diversas líneas celulares y presentaron unos niveles de expresión génica comparables a los obtenidos con las PEIs, pero con perfiles de toxicidad mucho más moderados. Figura 4. Poliglicoamidoaminas (PGAAs) del tipo PEI. Srinivasachari y colaboradores (2006) presentaron una serie de glicopolímeros derivados de trehalosa conteniendo muchos grupos amino protonables en las cadenas, lo que les permitió interaccionar con ADN y formar complejos con plásmidos (Figura 5). Figura 5. Politrizoles derivados de trehalosa (Srinivassachari y cols., 2006). La reacción click se ha utilizado para sintetizar polímeros catiónicos lineales degradables por reducción de puentes disulfuro a través de la reacción de diazidas y dialquino-oligoaminas. Estos forman poliplejos con los plásmidos de ADN dado el tamaño de partícula y las cargas debido a la densidad de los grupos aminos. A mayor densidad de los grupos aminos en las cadenas, normalmente hay mejor enlace al ADN, y mayor capacidad de condensación, obteniendose poliplejos de tamaño menor y más cargas superficiales. Se comprobó también que cuanto menor era el tamaño de las partículas, más estables resultaban durante la incubación (Wang y cols., 2011). Los carbohidratos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y han supuesto una importante fuente de materias primas renovables para el desarrollo de materiales 16 se adicionó, gota a gota, una disolución del compuesto 2 (7 g; 11 mmol) en THF seco (46,5 mL), bajo atmósfera de argón, a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1 h a 30 °C y posteriormente se añadió bromuro de alilo (3,15 mL, 36,45 mmol) y se dejó agitando durante 24 h a la misma temperatura. Transcurrido este tiempo se añadió metanol (5,38 mL) gota a gota y se agitó durante 1 h más a 30 °C. Tras dejar enfriar a temperatura ambiente, se evaporó el disolvente a presión reducida y el residuo obtenido se trató con una mezcla H2O-CH2Cl2 (1:1) (232 mL). La fase orgánica extraída se lavó con agua (58 mL) y se secó con MgSO4 anhidro. Finalmente, se evaporó la fase orgánica obteniéndose un residuo que se purificó mediante cromatografía en columna utilizando una mezcla de TBME y hexano (1:9) como fase móvil. El compuesto esperado se obtuvo como un sólido blanco (5,92 g, 71,15%) de p.f. 66 °C [Lit. 65 - 66 °C (Ferris y cols., 2011)]. 1H-RNM (CDCl3, 300 MHz):  3,10 (dd, 1H, H-5a, J = 4,2 y 10,2 Hz), 3,21 (dd, 1H, H-1a, J = 6,7 y 9,6 Hz), 3,41 (dd, 1H, H-1b, J = 5,5 y 9,4 Hz), 3,48 (dd, 1H, H-5b, J = 2,4 y 10,2 Hz), 3,61-3,68 (m, 1H, H-4), 3,74-3,80 (m, 2H, CH2CH=CH2), 3,81-3,88 (m, 1H, H- 2), 3,9-3,96 (m, 1H, H-3), 3,96-4,02, 4,09-4,17, 4,2-4,3 (m, 4H, 2CH2CH=CH2), 4,76- 4,87, 5,07-5,14, 5,16-5,26 (m, 6H, 3CH=CH2), 5,31-5,47, 5,8-6,11 (m, 3H, 3CH=CH2), 7,18-7,56 (m, 30H, Ph). 13C-RNM (CDCl3, 75 MHz):  62,5 (C-5), 62,9 (C-1), 71,6, 72,5, 73,8 (3CH2-CH=CH2), 77,8 (C- 3), 78,1 (C-2, C-4), 86,6, 87,1 (2CPh3), 116,5, 116,8 (3CH=CH2), 127,0, 127,1, 127,9, 128,0, 129,0, 144,2, 144,3 (Ph), 135,2, 135,3, 135,5 (3CH=CH2). 2,3,4-Tri-O-alil-L-arabinitol (4) A una disolución de ácido p-toluensulfónico (p-TsOH) (3,05 g, 17,71 mmol) en una mezcla de CH2Cl2-MeOH (1:1) (54 mL) se le adicionó, gota a gota, una disolución del compuesto 3 (5,92 g, 21,76 mmol) en CH2Cl2-MeOH (1:1) (270mL), a temperatura ambiente y se mantuvo la agitación durante 22 h. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se neutralizó añadiendo bicarbonato sódico (NaHCO3) (5,33 g, 62,54 mmol) y se dejó bajo agitación media hora más. Posteriormente, se evaporó el CH2Cl2 y parte del MeOH en el rotavapor, dando lugar 17 a una suspensión de sales, que se filtró a través de celita. Los filtrados obtenidos se evaporaron a sequedad y el residuo resultante se purificó mediante columna de cromatografía utilizando acetato de etilo (AcOEt) y hexano (1:2) como fase móvil. El producto 4 se obtuvo como un líquido espeso (1,8 g, 84,11%), cuyas características coincidieron con las descritas en la literatura (Ferris y cols., 2011). 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz):  2,29-2,50 (m, 2H, OH), 3,56-3,65 (m, 2H, H-2, H-4), 3,66- 3,89 (m, 5H, H-1a/b, H-3, H-6a/b), 4,00-4,29 (m, 6H, 3CH2CH=CH2), 5,12-5,34 (m, 6H, 3CH=CH2), 5,82- 6,01 (m, 3H, 3CH=CH2). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz):  60,8 (C-5), 61,7 (C-1), 71,2, 72,0, 73,7 (3CH2-CH=), 79,1, 79,2, 79,3 (C-2, C-3, C-4), 117,5, 117,6, 117,8 (3CH=CH2), 134,6, 134,8, 134,9 (3CH=CH2). 1,5-Diazido-1,5-didesoxi-2,3,4-tri-O-alil-L-arabinitol (5) A una disolución de trifenilfosfato (6,55 g, 25 mmol) en tetrahidrofurano (THF) seco (28 mL) en baño de hielo a 0 °C se le adicionó gota a gota una solución de dietillazocarboxilato (DEAD) en tolueno al 40% (11,4 mL, 24,9 mmol) y se agitó durante cinco minutos. Posteriormente se añadió difenilfosforilazida (DPPA) (5,14 mL, 23,8 mmol) gota a gota y, seguidamente, una suspensión del compuesto 4 (1,54 g, 5,67 mmol) en THF (28 mL). Se agitó durante 3 h a temperatura ambiente y transcurrido este tiempo se evaporó el disolvente en rotavapor para dar lugar a un residuo naranja que se purificó por columna de cromatografía empleando una mezcla de TBME/Hexano 1:5 como eluyente. El compuesto 5 se obtuvo como un líquido incoloro (0,83 g, 45%). IR:νmax (cm-1) 2101 (azida) 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz):  3,21- 3-78 (m, 7H, H-1a/b, H-2, H-3, H-4, H-5a/b), 3,86- 4,19 (m, 6H, CH2CH=CH2), 5,06- 5,28 (m, 6H, CH2CH=CH2), 5,74- 5,92 (m, 3H, CH2CH=CH2). 13C-RMN (CDCl3, 175 MHz):  50,7, 51,7 (C-1, C-5), 71,4, 72,7, 73,9 (CH2CH=CH2), 78,1, 78,2, 78,5 (C-2, C-3, C-4), 117,6, 117,7 (CH2CH=CH2), 134,3, 134,5, 134,6 (CH2CH=CH2). 18 Terc-butil(2-mercaptoetil)carbamato (10) A una disolución de cisteamina (2 g, 26 mmol) en agua (30 mL) se le añadió di-terc- butildicarbonato (6,23 g, 28,7 mmol), poco a poco, y se agitó durante 6 h a temperatura ambiente. A continuación la mezcla de reacción se extrajo con CH2Cl2 (120 mL x 3) y la fase orgánica se secó con MgSO4 y evaporó a sequedad para dar un residuo que se purificó en columna de cromatografía utilizando una mezcla de TBME-hexano (1:2) como fase móvil. El compuesto deseado se obtuvo un líquido siruposo (2,24 g, 52%) con las mismas características que se describen en la literatura para este compuesto (Ferris y cols., 2012). 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz):  1,34 (t, 1H, SH, J = 8,58 Hz), 1,45 (s, 9H, 3CH3), 2,58- 2,70 (m, 2H, CH2SH), 3,22-3,38 (m, 2H, CH2NH), 4,91 (bs, 1H, NH). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz):  25,3 (CH2S) 28,6 (CH3), 43,8 (CH2N), 79,8 [C(CH3)3)], 155,9 (CO). 4.3. Síntesis de politriazoles Politriazol 1 Una suspensión del dialquino (8) (223,8 mg, 0,64 mmol) en una mezcla de terc-butanol- agua 1:1 (1,84 mL) se añadió sobre la diazida (5) (205,76 mg, 0,64 mmol). A continuación se agregó CuSO4 (31,8 mg, 127,35 mmol) y ascorbato de sodio (50,51 mg, 0,255 mmol) y la mezcla se agitó a 50 °C durante 24 horas. Al cabo de este tiempo se retiró el sobrenadante y el residuo se disolvió en la mínima cantidad de dimetilsulfóxido (DMSO) y se vertió gota a gota sobre TBME frío (200 mL). El sólido precipitado se filtró y se secó a vacío para dar lugar al polímero PT1 como un sólido amarillo (318 mg, 74%). Mw 82.729, Mn 45.997Mw/Mn1,8. IR:νmax (cm-1) 1650 (amida I), 1573 (amida II). 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz):  1,36 (s, 9H, CH3), 2,58-2,80 (m, 6H, CH2N), 2,90-3,07 (m, 2H, CH2NHBoc), 3,53-4,38 (m, 9H,H-2,H-3,H-4, CH2CH=CH2), 4,39- 4,89 (m, 4H, H1a/b, H6 a/b), 19 4,91 5,42 (m, 4H, CH2CH=CH2), 5,8- 6,08 (m, 3H, CH2CH=CH2), 6,67 (sa, 1H, NHBoc), 8,41 (sa, 2H, NH cadena), 8,49- 8,63 (m, 2H, CH triazol). 13C-RMN (DMSO-d6, 175 MHz):  28,2 (CH3), 36,8 (CH2NH), 50,3, 51,0 (C1-C6), 53,2 (NCH2CH2NH), 53,4 (NCH2CH2NHBoc), 70,3, 71,6, 72,7 (CH2CHCH2), 77,5 [C(CH3)3], 77,8, 78,0, 78,1 (C-2, C-3, C-4), 116,6, 116,9 (CH2CH=CH2), 127,2 (CH triazol), 134,4, 135,0 (CH2CH=CH2), 142,7, 142,8 (C cuaternario triazol), 155,6 (CO Boc), 159,6 (CO cadena). TGA: Td: 202 °C (temperatura de descomposición asociada al 10 % de la pérdida de peso) y Tds: 333 °C (máxima temperatura de descomposición asociada al 90 % de la pérdida de peso). DSC: Tg: 80 °C. Politriazol 2 A una suspensión del dialquino (9) (202 mg, 0,78 mmol) en una mezcla de terc-butanol- agua 1:1 (2,2 mL) se añadió sobre la diazida (5) (252 mg, 0,78 mmol). A continuación se agregó CuSO4 (38,94 mg, 155,96 mmol) y ascorbato de sodio (61,86 mg, 0,31 mmol) y la mezcla se agitó a 50 °C durante 24 horas. El politriazol PT2 se aisló como un sólido marrón siguiendo el procedimiento descrito anteriormente (420 mg, 92%). Mw28.416, Mn26.629, Mw/Mn1,1. IR:νmax (cm-1) 1731 (CO). Debido a la baja solubilidad que presentó este material en los disolventes deuterados habituales, no fue posible obtener los correspondientes espectros de RMN. TGA: Td: 154 °C (temperatura de descomposición asociada al 10 % de la pérdida de peso) y Tds: 289,95 °C (máxima temperatura de descomposición asociada al 90 % de la pérdida de peso). DSC: Tg: 80,2 °C. 20 Método general para la funcionalización de politriazoles mediante reacciones click tioleno. En un matraz de fondo redondo se introdujo el politriazol correspondiente PT1 o PT4 (200 mg), se sometió a 3 ciclos de argon/vacío y se le añadió N’,N’-dimetilformamida DMF (2,5 mL) hasta obtener una disolución homogénea. A continuación se añadió el compuesto 10 (16 eq.) y, poco a poco el catalizador azobisisobutironitrilo (AIBN, 0,8 eq. por grupo alilo), disuelto en 0,3 mL de DMF. La mezcla de reacción se fue calentando poco a poco hasta 80 °C y se dejó agitando 24 h a esta temperatura. Finalmente, la mezcla se vertió poco a poco sobre dietil éter (250 mL) y el sólido precipitado se filtró, se lavó con éter y se secó a vacío a 40 °C. Los polímeros PT3 y PT5 se obtuvieron como sólidos coloreados. Politriazol 3 Rto. 43%; Mw67.150, Mn42.036, Mw/Mn1,6. IR:νmax (cm-1) 1690 (amida I Boc), 1657 (amida I cadena), 1573 (amida II cadena), 1513 (amida II, Boc). 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz):  1,36 (sa, CH3), 1,51- 1,89 (m, OCH2CH2CH2S), 2,27-2,81 (m, SCH2CH2NH, OCH2CH2CH2S, CH2N), 2,89-3,17 (m, SCH2CH2NH, CH2NHBoc), 3,21-3,47 (m, CH2NH cadena), 3,47- 4,37 (m, OCH2, H-2, H-3, H-4), 4,45- 4,88 (m, H-1, H-6), 4,93 5,38 (m, CH2CH=CH2), 5,55-6,03 (m, CH2CH=CH2), 6,65 (sa, 1H, NCH2CH2NHBoc), 8,39 (sa, 2H, NH cadena), 8,46- 8,70 (m, 2H, CH triazol). 13C-RMN (DMSO-d6, 175 MHz):  27,4, 27,6 (OCH2CH2CH2S), 28,2 (CH3), 29,3, 29,5 (OCH2CH2CH2S), 30,8 (SCH2CH2NH), 36,8 (NCH2CH2NH), 38,4 (NCH2CH2NHBoc), 39,9 (SCH2CH2NH), 50,3, 50,6, 50,9 (C-1, C-6), 53,2, 53,5 (NCH2CH2NH), 70,3, 71,6, 72,7 (OCH2), 77,5 21 [C(CH3)3], 77,8, 78,0, 78,2 (C-2, C-3, C-4), 116,7, 116,8, 116,9 (CH2CH=CH2), 127,2, 128,7 (CH triazol), 134,5 (CH2CH=CH2), 142,8 (carbón cuaternario triazol), 155,4, 155,6 (CO Boc), 159,62 (CO cadena). Politriazol 5 Rto. 47 %; Mw59.954, Mn 43.189, Mw/Mn1,4. IR:νmax (cm-1) 1748 (CO acetilo), 1698 (amidaI, NHBoc), 1519 (amidaII, NHBoc). 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz):  1,36 (s, 27H, CH3Boc), 1,63-1,80 (m, 6H, OCH2CH2CH2S), 1,88, 2,08 (2s, 12H, OCOCH3), 2,39-2,61 (m, OCH2CH2CH2S, SCH2CH2NH), 2,97-3,13 (m, 6H, SCH2CH2NH), 3,46- 3,91 (m, 9H, OCH2CH2 CH2S, H-2’, H-3’, H-4’), 4,19-4,84 (m, 8H, H-1a/b, H-6a/b, H-1’a/b, H-5’a/b), 5,16-5,45 (m, 4H, H-2, H-3, H-4, H-5), 6,81 (sa, 3H, NHBoc), 8,77 (s, 2H, CH triazol). 13C-RMN (DMSO-d6, 175 MHz):  20,1, 20,6 (OCOCH3), 27,6 (OCH2CH2CH2S), 28,2 (CH3Boc), 29,6, 29,7, 29,8 (OCH2CH2CH2S), 30,7 (S2CH2CH2NH), 39,9 (SCH2CH2NH), 49,1 (C-1, C-6, manitol), 63,5, 64,5 (C-1’, C-5’ arabinitol), 68,1, 68,4 (C-2, C-3, C-4, C-5 manitol), 69,5, 70,4 (OCH2CH2CH2S), 77,3, 78,4 (C-2’, C-3’, C-4’, arabinitol), 77,6 (C cuaternario Boc), 130,0 (CH triazol), 138,6 (C cuaternario triazol), 155,4 (CO Boc), 160,0 (CO cadena), 168,8, 169,7 (OCOCH3). Procedimiento general de N-desprotección de los politriazoles A un matraz conteniendo PT3 o PT5 (100 mg, 0,083 mmol y 150 mg, 0,115 mmol, respectivamente) se le añadió cloruro de hidrógeno 4N en dioxano seco (8,3 mL y 8,6 mL respectivamente) y se agitó 6 h a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo la mezcla obtenida se filtró, el sólido obtenido se lavó con TBME y se secó a vacío durante 24 h para dar lugar a los correspondientes politriazoles catiónicos PT6 y PT7. 22 Politriazol 6 Rto. cuantitativo IR:νmax (cm-1) 2927 (NH2), 1648 (amida I), 1573 (amida II). 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz):  1,50-1,92 (2m, OCH2CH2CH2S), 2,32-2,85 (m, OCH2CH2CH2S), 2,88-3,17 (CH2NH2), 3,27-4,35 (m, SCH2CH2NH2, CH2N, CH2NH, OCH2, H-2, H-3, H-4), 4,42-4,92 (m, H-1, H-6), 4,98-5,42 (m, CH2CH=CH2), 5,54-6,05 (m, CH2CH=CH2), 8,25 (sa, NH3+), 8,56 (sa, NH), 8,86 (s, CH triazol). 13C-RMN (DMSO-d6, 175 MHz):  27,3 (OCH2CH2CH2S), 29,0, 29,5 (OCH2CH2CH2S), 33,2 (SCH2CH2NH2), 37,8 (SCH2CH2NH2) 38,4 (NCH2CH2NH2), 49,4 (NCH2CH2NH), 50,6 (C-1, C-6), 51,6 (CH2N), 70,5 (OCH2CH2CH2S, OCH2CH=CH2), 78,1, 78,6 (C-3, C-4, C-5), 116,6, 118,8 (OCH2CH=CH2), 127,7 (CH triazol), 134,2 (OCH2CH=CH2), 142,2 (C cuaternario triazol), 160,3, 160,5 (CO). Politriazol 7 Rto. cuantitativo IR:νmax (cm-1) 2952 (NH2), 1746 (CO acetilo), 1733 (CO cadena). 1H-RMN (DMSO-d6, 500 MHz):  1,68-1,83 (m, 6H, OCH2CH2CH2S), 1,90, 2,14 (2s, 12H, OCOCH3), 2,54-2,66 (m, 6H, OCH2CH2CH2S), 2,69-2,81 (m, 6H SCH2CH2NH), 2,88-3,00 (m, 6H, 23 CH2NH2), 3,50-3,96 (m, 9H, OCH2CH2CH2S, H-2’, H-3’, H-4’), 4,19-4,93 (m, 8H, H-1a/b, H-6a/b, H- 1’a/b, H-6’a/b), 5,14-5,49 (m, 4H, H-2, H-3, H-4, H-5), 8,22 (sa, 6H, NH3+), 8,93 (s, 2H, CH triazol). 13C-RMN (DMSO-d6, 175 MHz):  20,3, 20,7 (OCOCH3), 27,3 (OCH2CH2CH2S), 27,7 (SCH2CH2NH2), 29,5 (OCH2CH2CH2S), 38,4 (CH2NH), 50,0 (C-1, C-6), 63,7, 64,5 (C-1’, C-5’), 68,1, 68,4 (C-2, C-3, C-4, C-5), 69,5, 70,3 (OCH2CH2CH2S), 76,9, 78,4 (C-2’, C-3’, C-4’), 130,2 (CH triazol), 138,5 (C cuaternario triazol), 160,1 (CO cadena), 168,9, 169,8 (OCOCH3). 24 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1.1. Síntesis y caracterización de monómeros En primer lugar, se describe la síntesis de monómeros difuncionales con el fin de obtener politriazoles por reacciones de acoplamiento azida-alquino. A partir de L-arabinitol se sintetizó el monómero 5 según se indica en el Esquema 1. Se hizo reaccionar L-arabinitol con cloruro de trifenilmetilo, utilizando como disolvente piridina. Como resultado de esta reacción se obtuvo el correspondiente derivado 2, con los hidroxilos primarios protegidos, como un sólido blanco de punto de fusión 70 °C y un rendimiento del 56,14%. El tratamiento de este compuesto con bromuro de alilo en presencia de hidruro sódico, condujo al 2,3,4-tri-O-alil-1,5-di-O-tritil-L-arabinitol (3), como un sólido blanco con un rendimiento del 71,15%. El compuesto 3 se trató con ácido p-toluensulfónico en MeOH, para eliminar los grupos trililo, dando como resultado el 2,3,4-tri-O-alil-L-arabinitol (4), cuyas características fisicoquímicas coincidieron con las descritas en la literatura, a pesar de que el método de preparación no fue el mismo que se indica en la literatura (Ferris et al., 2011). Finalmente, el compuesto 4 se trató con trifenilfosfina, utilizando THF como disolvente y a la que se añadió DEAD y DPPA gota a gota. Finalmente se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La diazida deseada (5) se obtuvo como un líquido ligeramente coloreado con un rendimiento del 40%. Esquema 1. Síntesis de los monómeros. a) Ph3CCl, Py; b) Bromuro de alilo, NaH, THF, 30 °C; c) p- TsOH, CH2Cl2-MeOH, d) (PH3)P/THF, DEAD, DPPA, 0°C. 25 Todos los compuestos sintetizados se caracterizaron por infrarrojo (IR:νmax) y RMN (1H y 13C) observándose las señales esperadas. Los espectros de RMN obtenidos para los productos 2-4 coincidieron con los descritos en la literatura para estos compuestos. Para el compuesto 5 en el espectro 1H-RMN se puede observar desde  3,21 a 3,78 ppm un multiplete característico de los protones unidos a óxigeno formando parte de los grupos protectores. A  5,28 y 5,92 se encuentran las señales debidas a los protones alílicos de los grupos funcionales introducidos en el azúcar. Por otro lado, en el espectro de 13C-RMN se pueden ver las señales correspondientes a los carbonos de esos protones mencionados anteriormente a 71,4, 72,7, 73,9, 117,6, 117,7, 134,3, 134,5 y 134,6 ppm. El espectro de masas de este compuesto mostró un valor del pico base de 399,1 ppm, lo que corresponde al ión molecular de compuesto 5 junto con el ión sodio. Toda esta información nos indica que se ha incorporado el grupo azida al azúcar tal y como se esperaba. El monómero 5 se hizo reaccionar con los monómeros 8 y 9 (Esquemas 2 y 3). Los monómeros 8 y 9 habían sido previamente sintetizados en el grupo de investigación (resultados no publicados) para obtener los politriazoles PT1 y PT2 (Esquema 5). Esquema 2. Síntesis del monómero 8. a) (Boc)2O, dioxano; b) DCC, CH2Cl2, 0 °C. Esquema 3. Síntesis del monómero 9. a) Tolueno, p-TsOH, calor. 32 7. BIBLIOGRAFÍA Ahmed M, Narain R. Progress of RAFT based polymers in gene delivery. Prog Polym Sci. 2013; 38(5): 767-790. Andrés Suárez. An. Quím. 2012; 108(4), 306–313. Asayama, S.; Maruyama, A.; Cho, C.S.; Akaike, T. Design of Comb-Type Polyamine Copolymers for a Novel pH-Sensitive DNA Carrier. Bioconjug. Chem. 1997, 8, 833–838. Bies C, Lehr CM, Woodley JF. Lectin-mediated drug targeting: history and applications. Adv Drug Deliv Rev. 2004; 56(4): 425-435. Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M y cols. T-lymphocyte- directed gene-therapy for ada(-) scid-initial trial results after 4 years. Science. 1995; 270(5235): 475-480. Branca MA. 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Boc: terc-butildicarbonato. tBuOH: terc-butanol. c.c.f.: cromatografia de capa fina. CDCl3: cloroformo deuterado. CH2Cl2: diclorometano. CuSO4: sulfato de cobre. d: doblete. dd: doble doblete. dt: doble triplete. DCC: N,N’-diciclohexilcarbodiimida. DEAD: dietillazocarboxilato. DPPA: difenilfosforilazida. DEPT-135: Distorsionless Enhacement by Polarization Transfer. DMF: N’,N’-dimetilformamida. DMSO: dimetilsulfoxido. DMSO-d6: dimetilsulfoxido deuterado. ESI-MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry. FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopy. GPC: Gel Permeation Chromatography. HCl: ácido clorhídrico. H2O: Agua. HPLC: High Performance Liquid Chromatography. Hz: hertzios ICS: inmunodeficiencia combinada severa. IR: infrarrojo. J: constante de acoplamiento. Lit.: literatura. m: multiplete. Mw: peso molecular promedio en peso. Mn: peso molecular promedio en número. Mw/Mn: polidispersidad. MeOH: metanol. MHz: megahertzios. MgSO4: sulfato de magnesio. mmHg: milímetros de mercurio. MsCl: cloruro de mesilo. m/z: relación masa-carga. NaHCO3: bicarbonato de sodio. NaH: hidruro de sodio. NaN3: azida de sodio Na2SO4: sulfato de sodio. PBT: polibutilentereftalato. PEI: polietilenimina. PET: polietilentereftalato. p.f.: punto de fusión. PGAAs: poliglicoamidoaminas. Ph3CCl: cloruro de trifenilmetilo. PLL: poli-L-lisina. ppm: partes por millón. PT: politriazol. p-TsOH: ácido p-toluensulfónico Py: piridina. 1H-RMN: Resonancia Magnética Nuclear de protones. 38 13C-RMN: Resonancia Magnética Nuclear de carbono-13. Rto.: rendimiento. s: singulete. SiMe4: tetrametilsilano. t: triplete. TBME: terc-butil metil éter. THF: tetrahidrofurano.  desplazamiento químico.  longitud de onda. νmax: número máximo de onda.