Efecto de las vesículas extracelulares en el envejecimiento

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA EFECTO DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES EN EL ENVEJECIMIENTO. Marta Fernández Muñoz UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO DE FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA EFECTO DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES EN EL ENVEJECIMIENTO. Marta Fernández Muñoz. Tutora: Ángela del Carmen Fontán Lozano. Departamento de fisiología. Revisión bibliográfica. Sevilla, julio 2022. 1 RESUMEN. El envejecimiento se trata de un proceso biológico complejo que conlleva a un deterioro progresivo del organismo asociado a la edad. Se han identificado nueve procesos interconectados que caracterizan al envejecimiento. Además, existe evidencia de que las alteraciones en un tejido producidas por el envejecimiento pueden transmitirse a otros tejidos. En este proceso intervienen las vesículas extracelulares. Se tratan de estructuras delimitadas por una bicapa lipídica, de tamaño nanométrico que son secretadas por todas las células del organismo y presentes en la mayoría de fluidos corporales. Existen tres tipos de vesículas extracelulares en función de su biogénesis y tamaño: exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos. Estas vesículas son un importante mecanismo de comunicación intercelular ya que participan en la transmisión de biomoléculas entre las células. En el contexto del envejecimiento, estas vesículas son capaces de promover su progresión mediante la entrega de información nociva desde células envejecidas a células sanas. Dada su participación en los procesos que regulan el envejecimiento, las vesículas extracelulares también están vinculadas a la progresión de enfermedades relacionadas con la edad, entre las que destacan las enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cáncer. En estas patologías las vesículas extracelulares secretadas por las células afectadas median procesos de comunicación en los que promueven la progresión de la enfermedad. La compresión de los mecanismos por los cuales las vesículas participan en el transcurso de dichas enfermedades ha esclarecido nuevas estrategias de terapias basadas en vesículas extracelulares. Estas se presentan potencialmente útiles y con ventajas frente a otras terapias. Además, dada su localización generalizada y su participación en el transporte de moléculas patológicas, también presentan utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades en las que la detección temprana y el tratamiento precoz son determinantes en la evolución de la enfermedad. Palabras clave: vesículas extracelulares; envejecimiento; enfermedades relacionadas con la edad; terapias; biomarcadores. 2 Índice de abreviaturas. • ARD: enfermedades relacionadas con la edad; de sus siglas en inglés "Age-Related diseases". • Aβ: proteína β-amiloide. • BHE: barrera hematoencefálica. • CD: antígenos de diferenciación; de sus siglas en inglés “clusters of differentiation” • DAMP: patrones moleculares asociados al daño mitocondrial, de sus siglas en inglés “damage-asociated mitochondrial patterns”. • DDR: respuesta al daño en el ADN; de sus siglas en inglés "DNA damage response". • EA: enfermedad de Alzheimer. • EC: células endoteliales; de sus siglas en inglés “endotelial cells”. • EP: enfermedad de Parkinson. • EPC: células progenitoras endoteliales; de sus siglas en inglés "Endotelial Progenitor Cells" • ERO: especies reactivas de oxígeno. • ESCRT: complejos de clasificación endosomal requeridos para el transporte; de sus siglas en inglés “Endosomal Sorting Complexes Required for Transport” • GnRH: hormona liberadora de gonadotropina. • HSP: proteínas de choque térmico; de sus siglas en inglés “heat shock proteins”. • ICAM-1: molécula de adhesión intercelular 1; de sus siglas en inglés “Intercellular Adhesion Molecule 1”. • ILV: vesículas intraluminales; de sus siglas en inglés "intraluminal vesicles". • LDL: lipoproteínas de baja densidad; de sus siglas en inglés "low density lipoproteins". • LDLox: lipoproteínas de baja densidad oxidadas; de sus siglas en inglés "low density lipoproteins oxidized". • NF-kB: factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas; de sus siglas en inglés “Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells” • MHC: complejo mayor de histocompatiblidad; de sus siglas en inglés “Major Histocompatibility Complex”. • miARN: micro ARN. • MSC: células madre mesenquimales; de sus siglas en inglés "Mesenchymal Stem Cells". • mTOR: diana de rapamicina en células de mamífero; de sus siglás en inglés “mammalian Target of Rapamycin” • MV: microvesículas. • MVB: cuerpos multivesiculares; de sus siglas en inglés "Multivesicular Bodies". • ncARN: ARN no codificante. • PD-L: ligando para muerte programada; de sus siglas en inglés "Programmed Death-ligand". • SASP: fenotipo secretor asociado a la senescencia; de sus siglas en inglés “Senescence- Associated Secretory Phenotype”. • siARN: ARN de interfermencia pequeño; de sus siglas en inglés "small interfering RNA”. • SNC: sistema nervioso central. • TNF- a : factor de necrosis tumoral a; de sus siglasen inglés “tumor necrosis factor”. • VE: vesículas extracelulares. • 𝛼 -syn: 𝛼 sinucleína. 3 Índice. 1. Introducción. .................................................................................................................. 4 1.1. Envejecimiento. ........................................................................................................ 4 1.2. Vesículas extracelulares. ........................................................................................... 8 2. Objetivos. ...................................................................................................................... 11 3. Metodología. ................................................................................................................. 12 4. Resultados y discusión. ................................................................................................ 13 4.1. Papel de las vesículas extracelulares en el envejecimiento. ................................... 13 4.2. Vesículas extracelulares en las enfermedades relacionadas con la edad. ............... 16 4.2.1. Vesículas extracelulares y enfermedades cardiovasculares. .................. 16 4.2.1. Vesículas extracelulares y enfermedades neurodegenerativas. .............. 18 4.2.1. Vesículas extracelulares y cáncer. ........................................................... 21 4.3. Aplicaciones de VE en el en el envejecimiento y enfermedades relacionadas con la edad. ............................................................................................................................... 22 4.3.1 Uso de VE como biomarcadores. ............................................................ 22 4.3.2 Uso terapéutico de las VE. ....................................................................... 24 5. Conclusiones. ................................................................................................................. 29 6. Bibliografía. .................................................................................................................. 30 4 1. Introdución. 1.1 Envejecimiento. El envejecimiento es considerado el principal factor de riesgo asociado a la aparición de enfermedades. La tendencia creciente en el número de personas que envejecen hace que aumente la prevalencia de estas patologías, lo que supone un aumento de la morbilidad además de un gran coste económico en términos sanitarios (Kirkland y Tchkonia 2017). El envejecimiento se trata de un fenómeno biológico complejo que se produce por la acumulación de daños celulares irreparables en los distintos tejidos, que conllevan a un deterioro progresivo del funcionamiento del organismo asociado a la edad (Niccoli y Partridge 2012). Como resultado aparecen cambios biológicos típicos del envejecimiento manifestados como un deterioro en los sistemas sensoriales (vista, oído, gusto, tacto y olfato) y en sistemas orgánicos como el sistema cardiaco, respiratorio, excretor, digestivo y locomotor (Kritsilis et al. 2018). Por lo tanto, con la edad aumenta la probabilidad de aparición de patologías relacionadas con el envejecimiento como enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas y cáncer (Mohamad Kamal et al. 2020). Se han identificado nueve procesos biológicos que caracterizan el envejecimiento: inestabilidad genómica, desgaste de telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis, desregulación en la detección de nutrientes, disfunción mitocondrial, células senescentes, agotamiento de células madre y alteración de la comunicación intercelular (López-Otín et al. 2013; Aunan et al. 2016). No se sabe por completo cual es el porcentaje de contribución de cada uno de ellos en la progresión del envejecimiento (Kulkarni et al. 2020), y además existe una mayor complejidad ya que estos procesos están interconectados y, errores en un proceso puede tener una repercusión directa o indirecta en otros (Fakouri et al. 2019). Estos pueden agruparse en tres categorías interconectadas: causas del daño, respuestas al daño y responsables de los cambios fenotípicos del envejecimiento (Figura 1) (López-Otín et al. 2013; Aunan et al. 2016). 5 Figura 1. Procesos que intervienen en el envejecimiento e interconexión entre ellos. En un primer escalón se encuentran las causas del daño (inestabilidad genómica, desgaste de telómeros, alteraciones epigenéticas y pérdida de proteostasis), como consecuencia de ellas aparecen las respuestas al daño (desregulación de nutrientes, disfunción mitocondrial y senescencia celular) y finalmente como resultado de estas aparecen las alteraciones responsables de los principales cambios fenotípicos del envejecimiento (agotamiento de células madre y alteración en la comunicación intercelular) (Modificado de Aunan et al. 2016) La inestabilidad genómica, el desgaste de telómeros, las alteraciones epigenéticas y la pérdida de proteostasis son considerados mecanismos biológicos causantes del daño (Aunan et al. 2016). La inestabilidad genómica se produce por una acumulación de daños en el ADN causados tanto por factores endógenos (ej.: especies reactivas de oxígeno (ERO)) como exógenos (ej.: radiaciones). Normalmente estos daños pueden corregirse gracias a los mecanismos de reparación del ADN, pero a medida que se envejece también aparecen defectos en estos mecanismos, provocando la acumulación de daños en el material genético (Li et al. 2021). Estas lesiones en el ADN pueden desencadenar mutaciones y fallos en la replicación y transcripción, activando así la llamada respuesta al daño en el ADN (DDR), encargada de la reparación de este o, si no fuera posible, de la apoptosis o senescencia celular, para evitar la transmisión del daño. La inestabilidad genómica es una causa y no una consecuencia del envejecimiento y esto puede probarse atendiendo a síndromes en los que una mutación en el ADN conduce a un envejecimiento prematuro, como por ejemplo el síndrome de Werner (Niedernhofer et al. 2018). Los telómeros son secuencias repetitivas de nucleótidos de los extremos de los cromosomas. Estos extremos se acortan en cada ciclo de replicación y la ADN polimerasa no es capaz de extenderlos. Solo es posible gracias a la enzima telomerasa, pero la mayoría de las células somáticas no la expresan. Por tanto, con la edad se producirá un desgaste progresivo de los telómeros típico del envejecimiento (da Costa et al. 2016). Este acortamiento es fisiológicamente 6 normal con la edad y solo supone un problema cuando la longitud de estos alcanza el límite de Hayflick, ya que se desencadenan daños en el ADN y senescencia celular (Li et al. 2021). Las alteraciones epigenéticas son cambios en la expresión de genes sin afectar a la secuencia de bases del ADN. Incluyen cambios en la metilación del ADN, cambios en modificaciones postraduccionales de histonas, remodelación de la cromatina y alteraciones en la expresión de determinados ARN no codificantes (ncARN) (Kane y Sinclair 2019). Generalmente se considera que con la edad las células sufren una hipometilación del ADN. Todas estas alteraciones epigenéticas provocan una alteración en la homeostasis celular y tienen una contribución causal al envejecimiento y a la aparición prematura de enfermedades asociadas al envejecimiento (ARD) (Siametis et al. 2021). El mantenimiento de la proteostasis, es decir, de la homeostasis del proteoma celular se consigue gracias a mecanismos regulados y coordinados que aseguran la correcta síntesis de proteínas, plegamiento, tráfico y la degradación de polipéptidos no funcionales para evitar su acumulación. Esta red de proteostasis restaura alteraciones no deseadas en el proteoma permitiendo que las células dispongan de las proteínas necesarias y evitando que se formen agregados de proteínas mal plegadas. Esto se consigue gracias al plegamiento mediado por chaperonas, a la degradación vía proteasoma y a la autofagia (Labbadia y Morimoto 2015). Sin embargo, con la edad se produce un deterioro progresivo de estos mecanismos, por lo que se produce una acumulación de proteínas mal plegadas, característico de patologías neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer o Parkinson (Klaips et al. 2018). La segunda categoría incluye mecanismos que se producen como respuestas al daño y son la desregulación en la detección de nutrientes, disfunción mitocondrial y senescencia celular. Se ha visto que estos mecanismos son beneficiosos a baja intensidad, pero a alta intensidad causan el efecto contrario, inducen el envejecimiento y tienen un papel importante en el desarrollo de enfermedades (Aunan et al. 2016). En la vejez los sistemas sensores de detección de nutrientes se pierden o se regulan a la baja. Esto provoca un deterioro metabólico que implica principalmente una disminución de la sensibilidad a insulina, aumento de grasa visceral y disminución de masa magra. En consecuencia, se favorece la aparición de trastornos cardiovasculares o metabólicos, enfermedades neurodegenerativas, atrofia muscular y cáncer (López-Otín et al. 2013; Aunan et al. 2016). La vía insulina-IFG1 (factor de crecimiento similar a insulina) es uno de los sistemas de detección de nutrientes y su atenuación es una buena estrategia para retardar el envejecimiento (Pyo et al. 2020). 7 Las mitocondrias son los principales productores de ERO gracias a la cadena transportadora de electrones. Se ha demostrado que, por debajo de un umbral, estos ralentizan el envejecimiento, ya que activan vías de homeostasis celular. Sin embargo, a medida que aumenta la edad, también lo hace la producción de ERO en un intento de compensar el deterioro progresivo asociado al envejecimiento. Cuando los niveles de ERO superan un umbral se desencadena el efecto contrario: se produce disfunción mitocondrial, aumenta aún más la producción de ERO, se promueve la apoptosis y la inflamación y se agrava el daño asociado a la edad (Li et al. 2021). La senescencia celular consiste en la detención irreversible del ciclo celular y, por tanto, de la proliferación celular (Regulski 2017). Esto es debido a la expresión de genes inhibidores del ciclo celular. Los que principalmente expresan las células senescentes son los inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina (CDKI) p21 y p16 (Campisi y d’Adda di Fagagna 2007). En individuos jóvenes se trata de un mecanismo de protección, donde las células dañadas adquieren este estado de senescencia para evitar que continúen dividiéndose, pudiendo desencadenar carcinogénesis. Estas células senescentes se van eliminando gracias al sistema inmune, lo que favorece la regeneración de tejidos y la homeostasis corporal. Sin embargo, con el envejecimiento las células senescentes van acumulándose en los tejidos, como resultado tanto de una mayor producción de estas, dado el incremento de daños celulares con la edad, como por una reducción en su eliminación por la disminución de la funcionalidad del sistema inmune, conocida como inmunosenescencia. (Yin et al. 2021). Estas células se mantienen metabólicamente activas y adquieren un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) que hace que secreten moléculas perjudiciales, como citocinas proinflamatorias, que alteran la función de tejidos y promueven el envejecimiento y las enfermedades asociadas al mismo (Schumacher et al. 2021) Finalmente, la última categoría agrupa a los principales responsables de los cambios fenotípicos del envejecimiento: agotamiento de células madre y alteración en la comunicación intercelular (Aunan et al. 2016). El agotamiento de células madre supone la disminución de la capacidad regenerativa de los tejidos y por tanto de la pérdida de función de órganos y la aparición de patologías. Se produce como consecuencia de la DDR (Schumacher et al. 2021). Así el agotamiento de células madre hematopoyéticas conduce a la aparición de anemias, la disminución de células madre mesenquimales, a osteoporosis, el agotamiento de células madre intestinales, a una disminución de la función intestinal y el agotamiento de células madre musculares puede conducir a sarcopenia. Todas estas son características comunes del envejecimiento lo que sugiere que las células madre tienen un papel importante en el mismo (Li et al. 2021). 14 Durante el envejecimiento y especialmente en células senescentes se produce una mayor secreción de VE relacionadas con el mismo. Esto puede explicarse ya que la secreción de VE que contienen moléculas dañinas para la célula, especialmente ADN citosólico, es una forma de eliminarlas y es necesaria para la supervivencia celular ya que si no se induciría la apoptosis celular (Takasugi 2018). Estas VE son componentes del SASP, caracterizado por una gran secreción de moléculas como citocinas proinflamatorias, quimiocitocinas, factores de crecimiento y metaloproteinasas (Monti et al. 2021). La alteración del contenido de estas VE y el aumento en su secreción se debe a la acumulación de daños en la célula. Estos pueden ser debidos a la disfunción mitocondrial y peroxidación lipídica, que provoca un aumento en los niveles de ERO y en consecuencia se genera un gran estrés oxidativo, o a lesiones irreparables en el ADN que desencadenan la DDR. La célula dañada entra en estado de senescencia y libera gran cantidad de VE del SASP. La producción de estas VE se basa en p53 y p65, ya que se ha visto que su inhibición reduce la liberación de vesículas. Estas VE al interaccionar con las células receptoras, por interacción específica ligando-receptor o por endocitosis, liberan su contenido y este hace su efecto en las células. La consecuencia de la transmisión de VE de una célula envejecida a otra sana será la transmisión del estado de envejecimiento o de senescencia (Yin et al. 2021). Este estado de envejecimiento celular puede adquirirse de varias formas, aunque en realidad todos estos procesos están interconectados. Cuando el contenido de las VE se dirige al núcleo celular puede desencadenarse alteraciones epigenéticas, inestabilidad genómica y desgaste de los telómeros (Yin et al. 2021). Con el desgaste de los telómeros aumentan los niveles de expresión de ARN con repeticiones teloméricas (TERRA), cuya función es la protección de los extremos de los cromosomas, tanto libre en las células como englobado en VE (Takasugi 2018). Las VE transportan TERRA desde los telómeros disfuncionales al espacio extracelular y entonces se desencadena una respuesta inflamatoria mediada por macrófagos al reconocer estas VE, para eliminar a las células con telómeros desgastados (Wang y Lieberman 2016). Además, las VE pueden transportar distintos tipos de ncARN, como miARN, desde células dañadas hasta células sanas, lo que les hace partícipes de la transmisión célula-célula de la inestabilidad genómica (Bao et al. 2021) y las alteraciones epigenéticas (Behbahani et al. 2016). El contenido de las VE también puede provocar una desregulación en la proteostasis en las células receptoras. Existen dos mecanismos por los cuales las VE derivadas de células envejecidas pueden promover la desregulación de la homeostasis de las proteínas: el transporte de agregados proteicos disfuncionales provenientes de la célula de origen a través de las VE o la inhibición de la proteostasis en la célula receptora. En ambos casos el resultado final sería una acumulación de 15 agregados proteicos, provenientes de la célula envejecida, en la célula inicialmente sana. Este depósito de proteínas celulares es una característica típica de las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, que son patologías asociadas al envejecimiento (Guix 2020; Yin et al. 2021). Por otro lado, el contenido perjudicial de estas VE puede afectar a las mitocondrias de la célula receptora provocando su disfunción, en consecuencia, se producirá una mayor liberación de ERO y se ocasionará su acumulación y un elevado estrés oxidativo, induciendo senescencia en la célula receptora. Las células senescentes con mitocondrias disfuncionales pueden liberar VE cargadas con ADN mitocondrial. Estas actúan como patrones moleculares asociados al daño mitocondrial (DAMP). El aumento de los niveles de DAMP intracelular favorece la inestabilidad genómica, mientras que un aumento de los niveles de VE cargadas con ADN mitocondrial extracelular provoca el reconocimiento de los patrones generando una respuesta inmunitaria e inflamatoria (Yin et al. 2021). Asimismo, todos estos procesos, al participar en la disfunción celular, también contribuyen a la activación de fenómenos inflamatorios e inmunitarios. Las VE pueden desencadenarlos a través de las vías de activación del gen NF-kB, de la proteína cinasa activada por AMP (AMPK) en tejido adiposo, del receptor de reconocimiento de patrones TLR4 o de la diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR) en células madre mesenquimales (Mato-Basalo et al. 2022). Finalmente, las VE derivadas del SASP pueden inducir el agotamiento de células madre. Esto se desencadena porque el contenido de las VE provoca daños en las células madre que hacen que estas entren en estado de senescencia o de apoptosis. Esto puede justificarse mediante estudios en los que la incubación de vesículas derivadas de células madre jóvenes con vesículas derivadas de células madre envejecidas induce un estado de senescencia en las inicialmente sanas por la activación de la vía mTOR (Fafián-Labora et al. 2020). El agotamiento de células madre supone la incapacidad para la regeneración de tejidos y para mantener la homeostasis, por tanto, se trata de un mecanismo importante en la progresión del envejecimiento (Robbins 2017). Debido a la gran variedad y complejidad de las cargas de las VE, las funciones que estas tienen en el entorno del envejecimiento se ha visto que son muy diversas. Pero, lo que está claro es que las VE participan en la trasmisión del envejecimiento a través de la comunicación célulacélula. Estas tienen la capacidad de transformar el estado de la célula receptora mediante el traspaso de la información contenida en su carga. Por tanto, la VE derivadas de células envejecidas son capaces de transmitir este estado de envejecimiento en las células receptoras y así favorecer su propagación (Yin et al. 2021). 16 4.2. Vesículas extracelulares en las enfermedades relacionadas con la edad. El envejecimiento en si no es una enfermedad, pero si se trata de un factor de riesgo para las ARD (Krisko y Radman 2019). Las ARD más prevalentes en países desarrollados son las enfermedades cardiovasculares, neurodegeneración y el cáncer (Niccoli y Partridge 2012). Numerosos estudios han determinado que las VE tienen un papel importante en el contexto de estas enfermedades, ya que participan en su progreso. Además, una vez conocida la implicación de las VE en el transcurso de la enfermedad estas podrían usarse como una estrategia terapéutica (Hill 2019). 4.2.1. Vesículas extracelulares y enfermedades cardiovasculares. Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo. Las dos formas más destacadas son la enfermedad coronaria y el accidente cerebrovascular. Entre los factores de riesgo se encuentran la edad y patologías cuya incidencia aumenta con la edad como la obesidad, diabetes mellitus tipo II e hipertensión arterial (Niccoli y Partridge 2012; Buford 2016; Chatterjee et al. 2020; Fazeli et al. 2020). Con la edad aumenta la probabilidad de sufrir un infarto agudo de miocardio y de morir a causa de él (Niccoli y Partridge 2012). La aterosclerosis es la principal causa común de las enfermedades cardiovasculares. Consiste en la acumulación de placas fibroadiposas en la capa íntima arterial. Estas producen un estrechamiento en la luz de las arterias obstruyendo el flujo sanguíneo. En ocasiones pueden romperse y formar un coágulo de sangre. La oclusión de los vasos provoca isquemia, que contribuye a la aparición de accidentes cerebrovasculares (Libby et al. 2019). Se han observado vesículas extracelulares en placas de ateroma y niveles circulantes aumentados en pacientes con aterosclerosis, lo que evidencia la implicación de las VE en el progreso de la enfermedad, desde su inicio hasta etapas más tardías (Figura 4) (Giró et al. 2021). 17 Figura 4. Papel de las VE en la progresión de la placa aterosclerótica. En presencia de factores de riesgo, las EC liberan VE que favorecen la disfunción endotelial. Esto conduce a la inclusión de LDL que se oxida. Tanto las LDLox, las plaquetas como las EC liberan VE que promueven el reclutamiento de monocitos y su diferenciación a macrófagos con fenotipo proinflamatorio. Estos ingieren LDLox y se convierten en células espumosas, que liberan VE favoreciendo la migración de células de músculo liso de la capa media para formar, paralemente a la formación de un núcleo lipídico y necrótico, una capa fibrosa sobre la placa (elaboración propia con BioRender, basada en (Libby et al. 2019; Charla et al. 2020; Giró et al. 2021; Coly y Boulanger 2022). La aterosclerosis se inicia con una disfunción endotelial. Las VE y más comúnmente las microvesículas (MV) circulantes derivadas de células endoteliales (EC) provocan la disfunción del endotelio al disminuir la producción de óxido nítrico y aumentar la permeabilidad (Paone et al. 2019). Esta disfunción endotelial permite la incorporación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el espacio subendotelial, donde se oxida pasando a LDL oxidada (LDLox). Estas moléculas liberan VE promueven un aumento de los niveles de moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1), por lo que se fomenta el reclutamiento de monocitos (Fu et al. 2017). Las plaquetas también liberan VE que promueven el reclutamiento y adhesión de monocitos. Además, la persistencia de factores de riesgo (hipertensión, hiperglucemia, obesidad, inflamación…) favorece igualmente el reclutamiento de monocitos en el lugar de la lesión (Giró et al. 2021). Estos monocitos se diferencian a macrófagos y adquieren un fenotipo proinflamatorio llamado M1. Las EC en presencia de LDLox secretan VE que colaboran en la transformación del fenotipo de los macrófagos. Asimismo, estos macrófagos también secretan VE que favorecen la acumulación de más macrófagos (Coly y Boulanger 2022). Estos ingieren LDL oxidada sin ningún tipo de regulación y se convierten en células espumosas. Igualmente, también liberan VE que promueven la proliferación y migración de células de músculo liso desde la capa media a la íntima (Yang et al. 2021). 18 Esta migración de células de musculo liso provoca la formación de una capa fibrosa sobre la placa, que le confiere estabilidad. La liberación de VE por las EC promueve la diferenciación de estas células musculares hacia un fenotipo caracterizado por una mayor proliferación y migración. En engrosamiento de placa se produce en para aumentar su estabilidad (Charla et al. 2020). Sin embargo, la lesión progresa hacia el crecimiento de un núcleo lipídico y necrótico formado por la muerte por necrosis de células espumosas y de músculo liso. La presencia de este núcleo de células muertas desencadena una respuesta inflamatoria que provoca la liberación por los macrófagos de metalopreinasas de matriz (MMP) que participan en la degradación y ruptura de la placa (Charla et al. 2020). Al romperse, las VE contenidas en la placa quedan expuestas y, dado que en su superficie se encuentran factores necesarios para la coagulación (como el factor tisular), desencadenan la activación plaquetaria. Además, el enriquecimiento de sus superficies en fosfatidilserina contribuye a la producción de trombina. Por lo que, finalmente se favorece la formación de trombos en el lugar de la lesión. (Hutcheson y Aikawa 2018 ). 4.2.2. Vesículas extracelulares y enfermedades neurodegenerativas. Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva de neuronas y estructuras cerebrales. Las más comunes son la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) (aunque existen otras como la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple) y la edad es el principal factor de riesgo de ambas. En estas enfermedades es común la acumulación de proteínas no funcionales en distintas zonas del cerebro. A medida que se envejece, estas proteínas afectan más a las neuronas más viejas, tanto porque son más sensibles a ellas, como porque tienen una menor capacidad para degradarlas (Niccoli y Partridge 2012). El conocimiento actual manifiesta la participación de las VE en la patología de las enfermedades neurodegenerativas. Esto se apoya en el hecho de que en estas enfermedades las proteínas mal plegadas se extienden a diferentes regiones del cerebro (Figura 5) , lo que alude a que en el progreso de la enfermedad se produce la comunicación intercelular entre neuronas y células gliales de dichas proteínas (Hill 2019). 19 Figura 5. Transmisión de VE entre células del SNC en EA y EP. En la EA se secretan VE cargadas con Aß y VE cargadas con TAU. En la EP se secretan VE cargadas con a-syn. En ambos casos estas VE transportan estas proteínas patológicas hacia otras células sanas favoreciendo la propagación de ambas enfermedades (Modificado de Rastogi et al. 2021). La mayoría de las células del sistema nervioso central (SNC) (neuronas, microglía, oligodendrocitos y astrocitos) liberan VE (Xiao et al. 2021). Estas vesículas transportan con su contenido las proteínas mal plegadas contribuyendo a su propagación por el cerebro, por lo que cooperan en el progreso de las enfermedades neurodegenerativas. Asimismo, se ha visto que la carga de miARN también se altera con la enfermedad y puede transferirse a otras células modulando la expresión génica a nivel postranscripcional (Hill 2019). A continuación, nos centraremos en la EA y EP y la implicación que tienen las VE en ellas, ya que son las más prevalentes. La enfermedad de Alzheimer es la enfermedad neurodegenerativa que afecta a más personas en el mundo. Se manifiesta como demencia, deterioro cognitivo y pérdida de memoria. Está generada por la acumulación extracelular de proteína ß-amiloide (Aß) formando las llamadas placas seniles y la agregación intracelular de la proteína TAU anormalmente fosforilada formando ovillos neurofibrilares (Jan et al. 2017). En una situación de EA las células del SNC liberan al espacio extracelular VE que envuelven las proteínas citadas anteriormente y son capaces de transportarlas a otras zonas del cerebro, entre neuronas y células gliales, favoreciendo la progresión de la enfermedad. No se ha determinado qué células son las que liberan estas VE neurotóxicas, pero se ha propuesto microglía y astrocitos (Gao et al. 2021). La neurotoxicidad de estas VE se basa en que sus lípidos promueven la formación de Aß soluble a partir de Aß insoluble extracelular (Croese y Furlan 2018) y la transportan hacia las placas seniles (Quek y Hill 2017). Además, las VE pequeñas (exosomas) son capaces de propagar la proteína TAU entre las células, 20 principalmente hacia las interneuronas gabaérgicas del hipocampo. La transmisión de TAU a través de VE se ve favorecida frente a la de TAU libre (Ruan 2022). La expresión de varios tipos de miARN se ve disminuida, como por ejemplo miARN-29 (Jahangard et al. 2020). Por otro lado, también el contenido de estas VE incluye ceramida y factor de respuesta proapoptótico (PAR-4) que inducen la apoptosis de astrocitos. Además, participan en la desregulación de Ca2+ neuronal, por lo que la función mitocondrial se ve afectada, disminuyendo la capacidad neuronal de resistir daños (Yuan et al. 2021). La enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común. Se caracteriza por hipocinesia, temblor en reposo, rigidez e inestabilidad postural. La enfermedad aparece por la degradación de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra debido al depósito de una proteína mal plegada, a-sinucleína (a-syn), formando agregados llamados cuerpos de Lewy (Jan et al. 2017). Las VE liberadas al espacio extracelular por las células del SNC en el contexto de esta enfermedad promueven la transmisión y agregación de a-syn. Las VE transportan esta proteína entre neuronas, astrocitos y microglía favoreciendo la expansión de la enfermedad. Además, los agregados de a-syn contenidos en exosomas producen una mayor neurotoxicidad que los libres, ya que la asociación con exosomas facilita la absorción por la célula receptora (Croese y Furlan 2018). La acumulación de a-syn en células gliales promueve la inflamación de estas, que puede extenderse a otras células gliales o neuronas. Además, estas células liberarán también VE cargadas con MHC-II, factor de necrosis tumoral a (TNF-a) y citocinas proinflamatorias que estimulan la apoptosis neuronal (Yuan et al. 2021). Se ha visto que exosomas del líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EP indujeron la agregación de asyn en una línea celular sana, lo que confirma que, las VE pueden transferir señales que favorecen la progresión de la EP (Stuendl et al. 2016). Han et al. estudiaron el efecto de la inyección de VE aislados del suero de pacientes con EP a ratones sanos. El resultado fue la inducción de la enfermedad en estos últimos. Se desencadenó la degeneración neuronal por agregación de a-syn, activación microglial y elevación de los niveles de citocinas proinflamatorias. Esto confirma que en un contexto de EP, las vesículas se cargan con a-syn patológica y factores inflamatorios (como TNF-α e interleucinas 1β (IL-1β) y puede transferirse a otras células propagando la neurodegeneración. Estos resultados evidencian que la comunicación a través de VE juega un papel importante en la patogenia de la EP y, por extensión, en las enfermedades neurodegenerativas (Han et al. 2019). 21 4.2.3. Vesículas extracelulares y cáncer. El cáncer es una enfermedad asociada al envejecimiento en el que la edad es el principal factor de riesgo (Chatsirisupachai et al. 2019). Opuestamente a las enfermedades presentadas anteriormente, que se caracterizan por senescencia celular y un aumento de la apoptosis, el cáncer se caracteriza por una proliferación celular descontrolada porque las células no responden a los puntos de control. Los factores de riesgo del cáncer incluyen antecedentes familiares, exposición a sustancias nocivas (ej.: tabaco, radiaciones, virus del papiloma…) y la edad. El motivo por el cual con el envejecimiento aumenta el riesgo de desarrollar cáncer puede deberse a la acumulación de daños celulares o a la mayor susceptibilidad ante las mutaciones oncogénicas (Niccoli y Partridge 2012). Se ha descubierto que las VE tienen gran participación en el entorno tumoral. Las células cancerosas liberan VE que participan en la comunicación intercelular entre otras células cancerosas y células sanas. Estas vesículas actúan promoviendo el crecimiento y la supervivencia celular en las células receptoras por lo que son un mecanismo que refuerza el crecimiento del tumor. Las VE participan en varios procesos relacionados con el cáncer: progresión del cáncer, metástasis, inmunosupresión y quimiorresistencia (Figura 6) (Chang et al. 2021). Figura 6. Implicaciones de las vesículas extracelulares derivadas de células cancerosas. Las VE participan en la progresión del cáncer por varios mecanismos: un aumento de la angiogénesis que deriva en una mayor proliferación celular; la inmunosupresión gracias al enriquecimiento de las VE en PD-L1; y el favorecimiento de la metástasis por un aumento en la migración de células. Además de la aparición de resistencias a los fármacos quimioterápicos utilizados para el tratamiento (Modificado de Chang et al. 2021) 22 En cuanto a la progresión del tumor, las VE derivadas de células tumorales pueden promover la angiogénesis mediante un aumento del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), y la formación de nuevos vasos sanguíneos gracias a este, favorece el crecimiento del tejido canceroso (Chang et al. 2021). Por otro lado, también promueven la metástasis. Estas vesículas derivadas de células cancerígenas contienen oncoproteínas y fragmentos de ARN oncogénicos que pueden transferirse a células vecinas sanas e inducir ahí la formación de una zona con las condiciones óptimas para la formación de un segundo tumor, llamada nicho pre-metastásico (Cheng y Hill 2022). Además, también agilizan la metástasis facilitando el proceso de migración de células cancerosas desde el entorno de un tumor primario hacia una localización secundaria (Becker et al. 2016). Asimismo, también participan en la inmunosupresión, tanto del entorno del tumor como sistémica. Se ha visto que las VE derivadas de células cancerosas están enriquecidas en ligando para muerte programada (PD-L1). Este activa al receptor de muerte programada (PD- 1) y provoca la disfunción de las células inmunitarias. (Chang et al. 2021). Por último, las VE también están implicadas en la resistencia a quimioterápicos. Esto se basa en la hipótesis de que las células cancerosas tratadas con agentes quimioterápicos liberan gran cantidad de VE cargadas con survivina, una proteína que promueve la supervivencia celular. Al interaccionar con otras células cancerosas les transfiere la proteína y posteriormente el fármaco aplicado ya no sería efectivo contra esa célula (Kreger et al. 2016; Chang et al. 2021). Un estudio que prueba esta transferencia de información es el realizado por Yoon et al. en el que se trataron células epiteliales gástricas sanas con exosomas derivados de células cancerosas gástricas. El resultado fue un aumento de la viabilidad celular y una inhibición de la senescencia y apoptosis, lo que llevó a un gran crecimiento en el número de células. Además, se vio aumentada la expresión y la actividad de la telomerasa en las células tratadas. Esto sugiere que los exosomas derivados de las células tumorales pueden inducir la cancerización de las células sanas cercanas, promoviendo la progresión del tumor (Yoon et al. 2022). 4.3 Aplicaciones de VE en el en el envejecimiento y enfermedades relacionadas con la edad. 4.3.1 Uso de VE como biomarcadores. Un biomarcador es una sustancia medible y evaluable objetivamente que se utiliza como un indicador de un proceso fisiológico, patológico o de respuesta a farmacoterapia (Lee et al. 2019). La localización de las VE en todos los fluidos corporales en los que se han examinado hasta el momento las convierte en candidatos ideales a biomarcadores, por su gran accesibilidad (Doyle y Wang 2019) y su partición en la comunicación intercelular (DeCastro et al. 2021). 23 La función principal de los biomarcadores de enfermedades es permitir la detección temprana de las patologías, así como la determinación del pronóstico de la enfermedad. Esto se basa en que las VE secretadas por las células son capaces de reflejar la extensión de la lesión, lo que permite el abordaje de la patología en sus etapas más tempranas y en consecuencia la obtención de resultados más favorables. El contenido de las VE circulantes cambia en individuos enfermos en comparación con los sanos (Barile y Vassalli 2017), lo que permite el diagnóstico temprano de ARD, especialmente útil en las enfermedades neurodegenerativas (DeCastro et al. 2021). Estas se aislan de los distintos fluidos y se analiza su perfil de proteínas y genes expresados en busca de biomarcadores de enfermedades. Para ello se compara el perfil proteómico y genómico obtenido con el expresado por fluidos de individuos sanos (Figura 7) (Mathivanan et al. 2010). Figura 7. Obtención de biomarcadores derivados de VE. Los fluidos de un paciente enfermo contienen gran variedad de VE circulantes. Entre ellas se encuentran VE derivadas de células sanas y VE derivadas de las células enfermas implicadas en la patología, entre otras. El aislamiento de las VE, el análisis de su expresión de moléculas derivadas de enfermedades (ARN, ADN y proteínas) y su comparación con VE aisladas de individuos sanos, permite identificar biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades, así como para la monitorización de la respuesta a tratamientos (Elaboración propia basada en Mathivanan et al. 2010). Por ejemplo, en la EA, el diagnóstico se produce cuando se manifiestan los síntomas de la enfermedad, en una etapa avanzada de la misma. Esto es debido a que no se conocen biomarcadores eficientes para el diagnóstico temprano de EA, por lo que se detecta cuando ya existe un deterioro cognitivo importante. Se ha determinado que los pacientes con EA presentan menores niveles en sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) de exosomas con miARN-193b. Por lo que la medición de estos permite detectar la EA en sus primeras etapas y diferenciarla de un deterioro cognitivo leve (con mayores niveles de miARN-193b en exosomas circulantes) (Croese 30 limitaciones. Principalmente sería necesario el desarrollo de métodos de aislamiento relativamente rápido y con alto rendimiento de las VE, además de la estandarización entre laboratorios de los procedimientos empleados para el diagnóstico. La cuantificación de VE aún sigue siendo un reto debido al pequeño tamaño de estas. Por todo esto, aunque el potencial de las VE es muy prometedor y la investigación entorno a ellas ha tenido un crecimiento exponencial en los últimos años, aún se requiere de avances tecnológicos y ensayos clínicos que muestren seguridad y un balance beneficio/coste positivo. 6. Bibliografía. • Abels ER, Breakefield XO. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. 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