Efecto en la regeneración ósea guiada de una membrana de PLGA modificada a nivel microtopográfico con plasma de oxígeno y funcionalizada con una capa inorgánica de óxido de silicio

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA TESIS DOCTORAL EFECTO EN LA REGENERACIÓN ÓSEA GUIADA DE UNA MEMBRANA DE PLGA MODIFICADA A NIVEL MICRO-TOPOGRÁFICO CON PLASMA DE OXÍGENO Y FUNCIONALIZADA CON UNA CAPA INORGÁNICA DE ÓXIDO DE SILICIO ANTONIO BATISTA CRUZADO SEVILLA, 2015 ABREVIATURAS %: Po cen aje 3D: T es dimensiones ADN: Ácido desoxi ibonucleico AK: An icue po ALP: Fos a asa alcalina ATP: Adenosín i os a o BG: Vid ios bioac i os BMUs : Unidades óseas mul icelula es BT: Azul de oluidina Cel: Célula CO2: Dióxido de ca bono D: Día H: Hid ogeno HA: Hid oxiapa i a IT: Ingenie ía isula MEC: Ma iz ex acelula MG: May G owmball-Giemsa Mm: Milíme o OB: Os eoblas o OC: Os eoclas o OPG: Os eop oge e ina OSS: Óseo PET: Te e lala o de Polie ileno PLGA: Ácido polilác ico-co-poliglicólico P-O2: Plasma de oxígeno RANK: Recep o ac i ado del ac o nuclea RANKL: Ligando de ecep o ac i ado pa a el ac o nuclea ROG: Regene ación ósea guiada RTG: Regene ación isula guiada SEM: Mic oscopía elec ónica de ba ido Sem: Semana Si: Silicio SiO2: Óxido de silicio Tº: Tempe a u a Ti: Ti anio TiO2: Óxido de Ti anio TRAP: Fos a asa ácida a a o de sodio esis en e VK: Von Kossa A mis pad es y a Blanca, po hace me ico en alo es, en es udios, en cul u a y en ca iño. La sencillez como pe sonas es un g ado ese ado sólo a los que i en una ida plena y da mues a de la mucha in eligencia que encie an en su in e io . AGRADECIMIENTOS Daniel To es Laga es: Di ec o incansable de abajos y es udios. Re e en e de pe sona abajado a y del camino docen e. P o eso olcado en el abajo en equipo, llegando a supe pone el in e és colec i o al pe sonal. Muchas g acias po u apoyo y po u dedicación. Gab iel Cas illo Dalí: Di ec o emp endedo , abajado innegable, siemp e en busca de ecu sos y con nue as ideas que apo a . Muchas g acias po con ibui con u conocimien o y po us muchas ho as de abajo. José Luis Gu ié ez Pé ez: Homb e de múl iples ap i udes y alo es. Líde inna o y comp ome ido con la sociedad, pensado pe enne y elado de las cosas bien hechas. Muchas g acias po las pue as abie as. Pablo Galindo Mo eno: P o eso enamo ado de la docencia has a lími es incalculables. La o mación y la in es igación es su azón de se . Sin su comp omiso como p o eso nunca hab ía conocido la magni icencia de la Odon ología. Muchas g acias po el camino que hemos eco ido jun os y po se un buen amigo. Elena Sánchez Fe nández: A mi p ime a p o eso a de Ci ugía Bucal muchas g acias po ansmi i me el amo hacia es a g an ca e a y po se nexo de unión en e G anada y Se illa. José Liébana U eña: Maes o de Maes os, bendi as sean las amas que al onco salen. Nunca ol ida é el o igen. Muchas g acias po ecoge el ge men y semb a lo a buen ecaudo. Cen o de Ci ugía Mínimamen e In asi a: Muchas g acias a odos los esponsables ins i ucionales, equipo e e ina io y pe sonal auxilia que hicie on posible la expe imen ación animal. Blanca Mo eno Man eca: Po su complicidad, po su apoyo y po su comp ensión. Po llena me de luz cuando no eía el inal del camino y po da me ue zas cuando ya escaseaban. No exis en su icien es exp esiones de g a i ud po que lo bello al co azón es di ícil a la palab a. Muchas g acias po u g an ayuda. Mis pad es y mis he manos: A mi amilia que siemp e unida y apoyándonos los unos en los o os hemos conseguido c ece y supe a los obs áculos de la ida. Mi aleg ía es que mis pasos os llenen de o gullo. Equipo de Ci ugía Bucal de Se illa: G acias po ecibi me en ues o equipo con los b azos abie os y habe me hecho uno más en e oso os. Compañe os de G anada: G acias a odos los que me an ecedie on y con su ejemplo me ayuda on: Miguel, Gus a o, Ilde onso, e c. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 8 - ÍNDICE CERTIFICADO DE DIRECTOR Y CO-DIRECTOR FIRMADO ... ¡E o ! Ma cado no de inido. ABREVIATURAS ........................................................................................................ 3 AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. 6 ÍNDICE ...................................................................................................................... 8 1. RESUMEN ....................................................................................................... 11 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 15 2.1. Biología ósea ..................................................................................................................... 15 Desa ollo ................................................................................................................................ 15 Células óseas ........................................................................................................................... 16 Composición del hueso ............................................................................................................ 17 Modelado y emodelado ......................................................................................................... 19 Cica ización ósea ................................................................................................................... 21 2.2. Regene ación ósea guiada (ROG) ..................................................................................... 22 Concep o ................................................................................................................................. 22 Memb anas ............................................................................................................................. 24 Inje os óseos .......................................................................................................................... 27 Fac o es de c ecimien o u ilizados en la epa ación del hueso .............................................. 33 2.3. Bioma e ial ........................................................................................................................ 35 Bioma e iales en medicina y odon ología............................................................................... 36 E olución de los bioma e iales ................................................................................................ 38 Mecanismos pa a el desa ollo de nue os ejidos .................................................................. 41 Ci o oxicidad de los bioma e iales .......................................................................................... 42 Necesidad de ensayos celula es y animales. ........................................................................... 44 2.4. Políme os .......................................................................................................................... 45 Políme os na u ales ................................................................................................................ 46 Políme os sin é icos ................................................................................................................ 46 PLGA. Diseños mo ológicos ................................................................................................... 49 Técnicas de elabo ación de andamios polimé icos pa a ingenie ía de ejidos ....................... 52 Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 9 - Aplicaciones biomédicas y a macológicas de los políme os .................................................. 57 2.5. Iones ino gánicos. SiO2 ...................................................................................................... 61 Rol de los iones ino gánicos en el me abolismo óseo. ............................................................ 63 Vid ios bioac i os basados en SiO2 ......................................................................................... 65 2.6. Nanomedicina aplicada a la egene ación isula ............................................................. 67 Impo ancia de las ma ices idimensionales ........................................................................ 68 Impo ancia de la supe icie y la in e az sus a o–ma iz ex acelula ................................. 69 2.7. Funcionalización del PLGA ................................................................................................ 71 Técnica de uncionalización supe icial de la memb ana de PLGA ......................................... 73 El plasma de oxígeno .............................................................................................................. 74 Dióxido de silicio...................................................................................................................... 74 3. HIPÓTESIS ....................................................................................................... 77 4. OBJETIVO ........................................................................................................ 78 4.1 Obje i o gene al ................................................................................................................ 78 4.2 Obje i os especí icos ........................................................................................................ 78 5. MATERIAL Y MÉTODO ................................................................................. 795. 5.1. Ma e ial ............................................................................................................................. 79 Memb anas de es udio. ......................................................................................................... 79 Fab icación de las memb anas de es udio. ............................................................................ 79 Ejempla es pa a la expe imen ación animal.......................................................................... 82 5.2. Mé odo ............................................................................................................................. 83 Desc ipción del es udio. .......................................................................................................... 83 P ocedimien o qui ú gico. ....................................................................................................... 83 Sac i icio .................................................................................................................................. 86 P ocesamien o de las mues as. ............................................................................................. 87 Es udio mo omé ico. ............................................................................................................ 94 Análisis es adís ico. ............................................................................................................... 102 6. RESULTADOS ................................................................................................. 103 6.1. E aluación cuali a i a de la es uc u a y densidad ósea global...................................... 103 6.2. Ni el de egene ación ósea (po cen aje óseo neo o mado) .......................................... 104 6.3. Supe icie ósea mine alizada (milíme os hueso neo o mado po día) ......................... 106 6.4. Ac i idad eso i a (núme o de os eoclas os po milíme o). ........................................ 107 Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 16 - os eoblas os, p oceso conocido como os eogénesis in amemb anosa. Po el con a io, el cóndilo, los huesos la gos y las é eb as se o man inicialmen e a a és de una plan illa de ca ílago, que si e como un esbozo que es g adualmen e eemplazado po hueso. La o mación ca ílago dependien e se conoce como c ecimien o endocond al8. El hueso pe dido como esul ado de una lesión, en e medad o auma a a iesa un p oceso de epa ación que es esencialmen e una combinación de p ocesos os eogénicos in amemb anos y endocond ales9. Células óseas Den o del hueso es posible iden i ica di e en es componen es celula es como las células p ecu so as de la os eogénesis, los os eoblas os, os eoclas os, os eoci os y los elemen os hema opoyé icos de la médula ósea. Las es p incipales células esponsables de la homeos asis del esquele o son:  Los os eoblas os: Son las células esponsables de la o mación de los huesos. De i an de las células os eop ogeni o as de la médula ósea y son esponsables de la sín esis de la ma iz ósea inmadu a conocida como os eoide. Sin e izan los componen es de la ma iz o gánica y median en la mine alización de la ma iz. Se localizan en las supe icies óseas y ealizan la deposición de la ma iz ac i a, y cuando dicha ac i idad llega a su in, algunos de ellos se di e encian en os eoci os, mien as que o os pe manecen en las supe icies del pe iosi io o endos io como células de e es imien o del hueso. Las células de e es imien o son células ala gadas que cub en una supe icie de ejido óseo y no mues a ac i idad sin é ica10.  Los os eoci os pueden se de inidos como los o ques ado es del p oceso de emodelación del hueso. Poseen o mas es elladas y se encuen an a apados den o de la ma iz ósea mine alizada en unos espacios conocidos como lagunas. Man ienen una ed de p ocesos ci oplasmá icos Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 17 - conocidos como dend i as. Dichas p oyecciones ci oplasmá icas os eocí icas se ex ienden a a és de compa imen os cilínd icos ence ados denominados como canalículos. A a és de és os llegan a di e en es á eas con ac ando con asos sanguíneos y con o os os eoci os. La ed de os eoci os es, po lo an o, un canal de comunicación que es sensible al po encial de memb ana debido al es és causado po la di ección de luido den o de los espacios de los canalículos como esul ados de los es ímulos mecánicos. Las señales mecánicas son aducidas en mediado es bioquímicos que con ibuyen a la o ques ación de e en os anabólicos y ca abólicos den o del hueso. Es a disposición le pe mi e a los os eoci os pa icipa en la egulación de la homeos asis del calcio en la sang e, de ec a la ca ga mecánica y ansmi i dicha in o mación a o as células den o del hueso pa a pos e io men e o ques a unciones os eoblás icas y os eoclás icas11.  Los os eoclas os son células especializadas mul inucleadas que se o iginan en la línea hema opoyé ica de monoci os-mac ó agos. Es as células ienen capacidad pa a desa olla se y adhe i se a la ma iz ósea pa a luego sec e a ácido y enzimas lí icas que deg adan y descomponen los mine ales y componen es o gánicos del hueso y del ca ílago calci icado. El p oceso de deg adación de la ma iz da como esul ado la o mación de un compa imen o ex acelula especializado conocido como la laguna de Howship10. Composición del hueso El hueso es un ejido conjun i o especializado que es á compues o de elemen os o gánicos e ino gánicos. La ma iz o gánica del hueso cons i uye ap oximadamen e el 30-35% del peso o al del hueso y es á o mado po un 90% de colágeno ipo I. El 10% es an e se compone de p o eínas no colágenas, p o eoglicanos, glicop o eínas, hid a os de ca bono y lípidos. La ma iz o gánica es sin e izada po los os eoblas os y Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 18 - cuando aun se encuen a sin mine aliza es conocida como os eoide. Den o de las ib as de colágeno, se p oduce la deposición de los iones de calcio y os a o que se es ablecen y o man, en úl ima ins ancia, c is ales de hid oxiapa i a. Las p o eínas no colágenas ayudan a la p opagación del mine al y la mine alización comple a de la ma iz. La iniciación de la nucleación mine al den o del os eoide se p oduce den o de unos pocos días de la sec eción, pe o la e minación y la madu ación son comple adas en el anscu so de a ios meses. Además de p opo ciona al hueso la esis encia y la igidez pa a p o ege los ó ganos sensibles, la mine alización del os eoide pe mi e el almacenamien o de mine ales que con ibuyen a la homeos asis sis émica (Figu a 1). Figu a 1: La asa de o mación de hueso puede se analizada median e el uso de luo oc omos. La calceína en e de ma ca el en e de mine alización cuando se adminis a a in e alos di e en es Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 19 - Modelado y emodelado El hueso es un ejido al amen e dinámico que posee la capacidad de adap a se según las necesidades isiológicas. Po lo an o, el hueso ajus a sus p opiedades mecánicas de acue do a los eque imien os me abólicos y mecánicos12. El mecanismo de adap ación esquelé ica es ealizado p incipalmen e po p ocesos de eabso ción y o mación ósea denominada gene almen e como emodelación ósea. El hueso es eabso bido po los os eoclas os y a con inuación es deposi ado po las células os eoblás icas13. Desde la pe spec i a del emodelado óseo, se ha p opues o que los os eoclas os pueden econoce y di igi se a los si ios del esquele o que ienen una in eg idad comp ome ida e inicia el p oceso de emodelado óseo con el p opósi o de induci la egene ación ósea14 (Figu a 2). Figu a 2: Remodelado óseo. El p oceso de emodelado óseo iene luga en las unidades ósea mul icelula es (BMUs) Una BMU es á compues a po un en e de os eoclas os que esiden en la supe icie del hueso ecién eabso bido denominado en e de eabso ción; un compa imen o que con iene asos y pe ici os y, una capa de os eoblas os p esen es en la ma iz o gánica ecién o mada conocida como en e de deposición. El núme o de unidades óseas mul icelula es nue as y ac i as es án eguladas po una amplia a iedad de ho monas y ci osinas, las cuáles de e minan la sinc onización espacio- empo al y la conexión de los elemen os anabólicos y ca abólicos de emodelado (Figu a 3). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 20 - Figu a 3: El en e de eabso ción se incula la inción de las células con os a asa ácida á a o- esis en e (TRAP). Uno de los mecanismos de conexión mejo es udiados en el emodelado óseo es la ac i ación de los os eoclas os mediada po el ligando de ecep o ac i ado pa a el ac o nuclea (RANKL). RANKL es una ci osina p oducida po los os eoblas os y o as células y eside en la supe icie de dichas células. Las células p oducen RANKL en espues a a ho monas sis émicas y ci osinas (IL-6). El con ac o celula en e las células que exp esan RANKL y de p ecu so es de los os eoclas os que exp esan el ecep o ac i ado del ac o nuclea (RANK) induce la di e enciación, usión y ac i ación de los os eoclas os. La modulación de es e mecanismo de unión se p oduce a a és de una molécula conocida como os eop oges e ina (OPG). La OPG se une al RANKL an es de que enga opo unidad de uni se al RANK. Po lo an o, la OPG sup ime la capacidad de aumen a la eabso ción ósea. La OPG ha sido p opues a como un agen e e apéu ico ac i o pa a el a amien o de as o nos óseos, pa icula men e la os eopo osis, ya que ep esen a un mecanismo segu o y con olado pa a modi ica la asa de emodelación ósea (Figu a 4). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 21 - Figu a 4: Conexión en e o mación y eabso ción ósea. Cica ización ósea La cica ización de un ejido lesionado conduce a la o mación de un ejido que di ie e en la mo ología o unción del ejido o iginal. Es e ipo de cica ización se llama epa ación. La egene ación isula , po o o lado, es un é mino más u ilizado pa a desc ibi la cica ización que conduce a la comple a es au ación de la mo ología y unción del ejido dañado. La cica ización del ejido óseo incluye an o enómenos de egene ación como de epa ación, dependiendo del ca ác e de la lesión. Po ejemplo, una ac u a ósea adecuadamen e es abilizada cica iza á median e egene ación, mien as que un de ec o mayo en el hueso a menudo cica iza á median e epa ación. Exis en cie os ac o es que pueden in e e i en la o mación de ejido óseo después de una lesión como: 1. F acaso de la ascula ización en la he ida. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 22 - 2. Inadecuada es abilización del coágulo y del ejido de g anulación en el de ec o. 3. C ecimien o in e no de ejidos no óseos con una al a ac i idad p oli e a i a. 4. Con aminación bac e iana. La cica ización de una he ida incluye cua o ases: 1. Coagulación de la sang e. 2. Limpieza de la he ida. 3. Fo mación de ejido. 4. Modelado y emodelado isula . Dichas ases se p oducen en una secuencia o denada pe o pueden supe pone se en un si io dado de al mane a que, en algunas á eas de la he ida, el ejido en o mación puede es a en p og eso, mien as que en o as á eas el modelado de ejidos es el e en o que p edomina. 2.2. Regene ación ósea guiada (ROG) Aunque el ejido óseo posee un g an po encial de egene ación y puede ecupe a su es uc u a y unción o iginales po comple o, algunos de ec os óseos a menudo no pueden log a cica iza median e ejido óseo de o ma comple a. Pa a sol en a es e p oblema hay desc i as di e en es écnicas bajo el nomb e de egene ación ósea guiada con el in de acili a y mejo a la cica ización ósea. Concep o La ROG es una écnica qui ú gica que pe sigue la o mación de hueso nue o pa a el elleno de de ec os óseos pe implan a ios, o en á eas óseas de ici a ias. Es a écnica Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 23 - es á indicada en odos aquellos p ocedimien os qui ú gicos en los que las condiciones pa a la egene ación ósea es én limi adas o se p e ea di icul osa, con el in de esol e el p oblema que apa ece a pa i de la exis encia de una elocidad de c ecimien o di e en e en e los dis in os ipos de ejido. Melche es udió el po encial egene a i o del pe iodon o. Dis in os es udios han concluido que sólo el ligamen o pe iodon al y el hueso son capaces de consegui una egene ación de los ejidos pe iodon ales15, 16. El p oceso de ROG ue desc i o po Go low17, y consis ía en elimina de la zona qui ú gica odos los ejidos que no a o ecen la egene ación ósea po medio de memb anas que impiden el con ac o de la he ida ósea con el epi elio y el ejido conec i o. La oclusión celula de la memb ana e i a la mig ación de células epi eliales y conec i as con una elocidad de c ecimien o supe io a la de las células óseas al in e io del de ec o óseo, p ese ándolo pa a su colonización po las células óseas y pe mi iendo así la egene ación del de ec o óseo. Es e p oceso se basa en el uso de ba e as o memb anas ísicas pa a e i a que las células del epi elio gingi al y del ejido conjun i o in adan du an e la cica ización las zonas que an a se egene adas. De es a o ma se a o ece que las células os eop ogeni o as puedan p oli e a pa a o ma hueso nue o. Como esul ado de los expe imen os con animales y aplicaciones clínicas en se es humanos, la egene ación ósea guiada se ha con e ido en un mé odo acep ado clínicamen e pa a el aumen o óseo en si uaciones con un inadecuado olumen pa a la colocación de implan es den ales. El de ec o óseo, a di e encia del pe iodon al, no in oluc a la pa icipación de epi elio in adiendo la zona de egene ación. Como consecuencia, en la ROG la memb ana u ilizada sepa a dos espacios que con ienen células mesenquimá icas plu ipo enciales, capaces de gene a de mane a equi alen e an o ejido óseo como ejido ib oso18, 19. En es a écnica, la memb ana p opo ciona p o ección adicional a la he ida, disminuyendo el choque de las ue zas que inciden sob e ella y ga an izando la di e enciación de las células mesenquima osas hacia os eoblas os, en luga de hacia ib oblas os. Un de ec o con pa edes óseas conse adas (de ec o ce ado) puede cica iza con el simple uso de hueso au ólogo, siemp e que el mismo, conjun amen e con el coágulo de sang e pe manezca es able den o del espacio a egene a . En un Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 24 - de ec o con ausencia de una o más pa edes óseas (de ec o abie o), la egene ación puede se obs aculizada debido a ac o es como la al a de espacio causado po el colapso de ejidos supe iciales, o la ines abilidad del coágulo debido a mic o- mo imien os du an e la ase de cica ización. En es os casos la memb ana además de cumpli con la unción de ba e a mecánica, cumple con la unción de man enedo de espacio, c eando a ni el del de ec o óseo un ambien e ce ado delimi ado po un lado po las pa edes óseas esiduales y del o o lado po la memb ana que si e de pa ed p o isional du an e el pe íodo de cica ización. Es e ambien e debe se espacioso y p o egido, de mane a que el coágulo sea es able en las p ime as ases de cica ización y de es a o ma no se in e umpa el p oceso de egene ación ósea. Mien as meno es el núme o de pa edes óseas esiduas, mayo se á la necesidad de emplea bioma e iales os eoinduc i os. Po o a pa e, los inje os de hueso au ólogo ep esen an la al e na i a más adecuada pa a epa a de ec os óseos complejos. Dado que las memb anas en las que basamos nues o es udio es án o ien adas a u u as aplicaciones clínicas de egene ación ósea guiada (ROG) in i o, su desa ollo esponde a una écnica en la que hay que sopesa a ios ac o es: la abso ción de la memb ana debe p oduci se en el plazo adecuado pa a la egene ación; el p oceso de abso ción debe ealiza se con una eacción in lama o ia mínima compa ible con la egene ación; y la pé dida de dis in os g upos de políme os deben a ec a lo menos posible al pH pa a no in lui en el p oceso de epa ación. Resul ados clínicos posi i os con ácido polilác ico, poligalac ina o poliglicólico en di e sos g ados han sido desc i os po di e en es au o es18. Memb anas Las memb anas oclusi as que se usan en ROG podemos clasi ica las en di e en es g upos según su na u aleza y deg adación. Según su capacidad eabso i a podemos di e encia las en memb anas eabso bibles y no eabso bibles, y den o de cada uno de es os apa ados enemos las que son de o igen animal y las sin e izadas en Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 25 - labo a o io. En nues o es udio nos cen a emos en las memb anas eabso bibles sin é icas, en conc e o en las de PLGA. Memb anas Reabso bibles Sin é icas Son películas de bioma e iales polimé icos de na u aleza o gánica usados como ba e a en el a amien o de de ec os óseos c í icos que son di ícilmen e ecupe ables de mane a óp ima. Las ca ac e ís icas ideales de las memb anas eabso bibles según Scan lebu y20 son:  Biocompa ibilidad.  In eg ación isula .  Oclusión celula .  Manejabilidad clínica.  Man enimien o del espacio. P esen an las ca ac e ís icas de se biodeg adables y se eabso bidas po el p opio o ganismo sin gene a una espues a inmune de echazo19. Es as memb anas a su ez, ac úan como ma ices que pe mi en el c ecimien o de las células en su in e io , y es án diseñadas pa a inhibi o e a da la mig ación apical del ejido conjun i o du an e la ase de cica ización. Es e e ec o es el esul ado del enómeno conocido como “inhibición po con ac o”, educiéndose así la o mación de bolsas en la supe icie ex e na de la memb ana. Se ha demos ado además una buena adhesión y ascula ización de los ejidos en los que se hallan colocadas. El empleo de memb anas eabso bibles es necesa io pa a e i a una segunda ci ugía in asi a pa a e i a la memb ana no abso bible que puede daña el ejido en egene ación y p oduci in lamación indeseada. Una de las azones pa a el uso de memb anas eabso bibles sin é icas en luga de las de o igen animal como las de colágeno es e i a el miedo y echazo po pa e de los pacien es, que suele se habi ual, a una p obable in ección c uzada. Así mismo, Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 32 - Con ecuencia, ocu e que los es mecanismos básicos de o mación ósea es án implicados en la egene ación del hueso. De hecho, la os eogénesis sin os eoconducción y os eoinducción es poco p obable que ocu a ya que casi ninguna de las células ansmi idas median e los inje os de hueso esponjoso au ógeno sob e i e al asplan e. Así, el ma e ial de inje o unciona p edominan emen e como una pla a o ma pa a in adi las células del huésped. Además, los os eoblas os y os eoci os del hueso ci cundan e ca ecen de la capacidad de mig a y di idi se, lo que a su ez signi ica que el asplan e es in adido po células mesenquimales no in oluc adas que más a de se di e encian en os eoblas os. Sob e es a base, es ap opiado de ini es condiciones básicas como p e equisi o pa a la egene ación ósea. 1. Suminis o de células o mado as de hueso o de aquéllas que son capaces de di e encia se en células o mado as de hueso. 2. P esencia de es ímulos os eoinduc i os pa a inicia la di e enciación de células mesenquimales en os eoblas os. 3. P esencia de un en o no os eoconduc i o que o me un andamiaje sob e el que pueda p oli e a el ejido in aso y en donde células os eop ogeni o as es imuladas puedan di e encia se en os eoblas os y o ma hueso. Ac ualmen e, a ios p oduc os biológicamen e ac i os es án disponibles con la in ención de mejo a la p oli e ación y di e enciación celula , pe mi iendo un p oceso de señalización anabólica más ápida y p edecible en e el inje o y el huésped (Tabla 1). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 33 - Tabla 1: Dis in os ma e iales u ilizados en ROG. Fac o es de c ecimien o u ilizados en la epa ación del hueso En el mismo momen o que se hace la incisión qui ú gica, un coágulo de sang e se o ma en el si io de la he ida, libe ando ac o es de c ecimien o como el ac o de c ecimien o de i ado de las plaque as (PDGF) y el ac o de c ecimien o ans o man e be a (TGF-B) p o enien es de la deg anulación plaque a ia30, 31. Es os mi ogénicos a aen a células mad e mesenquimales (MSC) y a ib oblas os pa a que emig en al si io de la he ida ósea y es imulen la p oli e ación y la di e enciación de p ecu so es os eoblás icos32. El p oceso de neogénesis isula es seguido po la o mación de un ejido de g anulación que cons i uye una uen e de u u as células de ejido conjun i o, ales como os eoblas os, ib oblas os del ligamen o pe iodon al o Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 34 - cemen oblas os33. Pa a la egene ación del hueso al eola , las células mesenquimales son ans o madas en células os eop ogeni o as median e la exp esión localizada de BMP34. Los en oques en la cica ización de he idas usando ac o es de c ecimien o que engan como p opósi o la es au ación del hueso que sopo a el dien e, el ligamen o pe idon al y el cemen o, han a anzado el campo de la medicina egene a i a o al y pe iodon al. Va ios es udios en la econs ucción o al y c aneo acial han e aluado el impac o de las es a egias de anspo e de los ac o es de c ecimien o usando células p oduc o as del ac o de c ecimien o, p o eínas o genes que codi ican los ac o es de c ecimien o35. La Figu a 5 des aca los di e sos sis emas de anspo e, bioma e iales de inje o y eemplazo óseo y ac o es de c ecimien o u ilizados clínicamen e. Los a ances en la clonación molecula han pues o a disposición can idades ilimi adas de ac o es de c ecimien o óseos ecombinan es pa a aplicaciones en la ingenie ía de ejidos del complejo acial incluyendo el hueso al eola . Fac o es de c ecimien o ecombinan es conocidos po p omo e la cica ización de la piel y los huesos, ales como PDGF36,37, ac o es de c ecimien o simila es a la insulina (IGF)38,39, ac o es de c ecimien o de ib oblas os (FGF)40 y BMP41 se han u ilizado en ensayos p eclínicos y clínicos pa a el a amien o de de ec os óseos pe iodon ales g andes, así como al ededo de implan es den ales14,30. La BMP-2 es á ac ualmen e ap obada po la FDA pa a la epa ación local de la c es a al eola y los p ocedimien os de ele ación del seno, mien as que el PDGF es á ap obado pa a la epa ación de g andes de ec os óseos asociados con dien es pe iodon ales a ec ados y pa a la epa ación isula de ejidos blandos en de ec os de ecesión. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 35 - Figu a 5: Di e as moléculas con implicación en la egene ación ósea y uilizados clínicamen e. 2.3. Bioma e ial El concep o ac ual de bioma e ial es el de cualquie ma e ial, no necesa iamen e biológico, que es ole ado po el o ganismo y puede, po an o, ene un uso p o ésico o induci un p oceso epa a i o en la búsqueda de la es i u io ad in eg um del ejido lesionado. Es e úl imo concep o implica además que el ejido dañado es sus i uido po o o de idén icas ca ac e ís icas de al modo que, en el caso que nos ocupa, el esul ado inal sea un ejido óseo y no un ejido cica icial uncionalmen e inadecuado e incapaz de es au a la unción pe dida. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 36 - Bioma e iales en medicina y odon ología En medicina, los bioma e iales ienen un al o alo añadido. Su desa ollo y uso se ha hecho p o uso en sus di e en es campos, des acando el de la ingenie ía isula , á ea en expansión que, asen ada en los conocimien os básicos de la his ología, iene po obje o cons ui ejidos nue os, uncionalmen e ac i os, a pa i de células p oceden es de cul i os desa ollados p e iamen e y de bioma e iales de dis in a na u aleza que si en como sopo e o andamiaje42. La ingenie ía isula se asien a en los conocimien os his ológicos y ecibe asimismo apo aciones de o as disciplinas undamen ales que ayudan al log o inal del obje i o p opues o: la cons ucción de un nue o ejido i o y uncional capaz de sus i ui con e icacia al ejido o iginal dañado. Bioma e iales ce ámicos En e los dis in os g upos de bioma e iales que se u ilizan en medicina y odon ología encon amos los denominados ce ámicos. Si bien en p incipio su p incipal en aja pa ecía se la baja eac i idad química, es deci , su ca ác e ine e y po an o su biocompa ibilidad, se ha demos ado que no odas las bioce ámicas son inocuas, dándose la ci cuns ancia de que g an pa e de las u ilizadas en ci ugía econs uc i a p esen an bioac i idad. Es os p oduc os se in oduje on en la década de los se en a, cuando comenza on a de ec a se acasos en los ma e iales que has a ese momen o se u ilizaban, como el ace o, aleaciones de cobal o y el polime ilme ac ila o. En e las ce ámicas más desa olladas se encuen an los bio íd ios, empleadas p incipalmen e en la epa ación de huesos, debido a su e icien e capacidad de in eg ación con el ejido i o. Así mismo, se a anza en la in es igación de los cemen os qui ú gicos, p o is os de ac i idad biológica, lo que ha dado pie a una mejo a de la ijación y es abilización del implan e a la go plazo, ya que la acción de dichos ellenos p omue e la di e enciación celula e induce la o mación de depósi os de hid oxiapa i a Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 37 - p o enien e del medio biológico en la zona de con ac o en e el cemen o y el hueso, lo que posibili a el c ecimien o de ejido nue o. Bioma e iales me álicos O o g upo de bioma e iales son los denominados me álicos. El p incipal lími e pa a su u ilización es la ole ancia po el o ganismo, po lo que es de e minan e la can idad de p oduc o que pueden llega a apo a a los ejidos i os. Así mismo, es ambién imp escindible que engan una buena esis encia a la co osión43. En el momen o ac ual se in es iga en la mejo a de las p opiedades mecánicas de las aleaciones usadas de o ma habi ual, así como en log a que sus supe icies engan ex u as adecuadas que p o oquen la espues a biológica deseada. Bajo es a p emisa, se han desa ollado mic oelec odos en disposi i os neu ológicos que esis en la co osión, especialmen e el enómeno de ensión – co osión (s ess, co osión, c acking) inducida po el medio biológico. También se es á p es ando una especial a ención a las p opiedades súpe elás icas de di e en es aleaciones, como la de níquel y i anio, así como al enómeno de memo ia de o ma. Es e conocimien o se ha aplicado pa a la c eación de disposi i os ubula es expansibles (s en s), usados en medicina con el p opósi o de man ene abie os conduc os ales como a e ias, enas, u e a y áquea, e i ando así su colapso. El é mino supe elás ico desc ibe la capacidad de algunas aleaciones me álicas de su i g andes de o maciones y e o na a la o ma o iginal una ez que la ue za que la gene a desapa ece. Po ejemplo, un ace o inoxidable común su e de o maciones elás icas de un 0,5%, mien as que las aleaciones u ilizadas en los s en s, alcanzan de o maciones de has a un 11%43. Bioma e iales polimé icos Po úl imo encon amos el g upo de los bioma e iales polimé icos. La g an a iedad de ó mulas y la e sa ilidad de diseño ( ib as, ejidos, películas, bloques) de Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 38 - es os ma e iales los han con e ido en los componen es u ilizados de o ma más ecuen e en la ab icación de disposi i os biomédicos. Clásicamen e se han clasi icado en na u ales y sin é icos, si bien uncionalmen e se di e encian en bioes ables: de ca ác e pe manen e y pa icula men e ú iles pa a sus i ui de o ma pa cial o o al ejidos u ó ganos lesionados o des uidos, y biodeg adables: es deci , de ca ác e empo al, y po an o con una uncionalidad limi ada, ceñida al iempo en el que el p oblema subsis a. Así mismo, se desa ollan ma e iales híb idos o mados po la combinación de p oduc os de na u aleza sin é ica y na u al. E olución de los bioma e iales Los p ime os políme os deg adables desa ollados y los más comúnmen e u ilizados son los ob enidos a pa i del ácido poliglicólico (PGA) y del ácido polilác ico (PLA), los cuales han encon ado mul i ud de usos en la indus ia médica, comenzando con las su u as biodeg adables que ue on ap obadas en 1960. En 1980, Nyman y cols.15, publica on un es udio sob e el p incipio de la RTG pa a egene a hueso al eola . En ese abajo u iliza on ya ba e as pa a p e eni la apa ición de epoblación de células ajenas al ejido óseo ecino en el á ea lesionada a ada. La me a de la ingenie ía isula e a supe a las limi aciones de los a amien os con encionales basados en el asplan e de ó ganos y la implan ación de bioma e iales pa a p oduci una uen e de ó ganos “a i iciales” inmunológicamen e ole an es y sus i u os de ejidos que puedan c ece con el pacien e. Desde en onces, nume osos disposi i os basados en PGA y PLA han sido desa ollados en o ma de copolíme os, los cuales han sido acep ados como ma e iales de uso biomédico. Es os implan es deben pe mi i una epa ación pe manen e de ó ganos y ejidos dañados, sin la necesidad de e apias suplemen a ias, las cuales hacen al a amien o más ca o a la go plazo. La u ilización de es a me odología implica ía la disminución de muchos de los p oblemas elacionados con o as écnicas como: segundas in e enciones cos osas y dolo osas de ex acción de ma e iales no eabso bibles, en caso de ejidos de au oinje os la disponibilidad del donan es o en Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 39 - caso de aloinje os las eacciones de echazo o el iesgo de in ección y o mación de ejido ib oso, asociados a los implan es pe manen es16, 17. Ac ualmen e nos encon amos en la e ce a gene ación de bioma e iales. Los ma e iales diseñados en es a gene ación buscan in e ac ua con el ejido de o ma especí ica, median e es ímulos a ni el celula y molecula , y combinan las p opiedades de bioabso babilidad y bioac i idad den o del mismo ma e ial, po lo que cada ez los c i e ios se an ace cando más a lo que se ía el bioma e ial ideal. La ingenie ía de ejidos es una de la á eas con más po encial den o de la medicina egene a i a. Su p incipal obje i o es c ea ma e iales que induzca una eacción con olada po pa e del ejido i o y elimina se comple amen e po ías me abólicas. Es deci , ma e iales bioac i os y bioabso bibles, como los políme os biodeg adables p incipalmen e, que p esen an capacidad de deg ada se g acias a eacciones de hid ólisis en condiciones isiológicas. Ac ualmen e son los ma e iales más a ac i os pa a la elabo ación de andamios en ingenie ía de ejidos. Los andamios elabo ados a pa i de es e ipo de políme os o ecen la posibilidad de c ea ejidos comple amen e na u ales, po ello, en la ac ualidad los políme os con inúan en amplio c ecimien o y sus aplicaciones son cada ez mayo es den o del campo de la medicina, mejo ando las p opiedades de los ma e iales ya exis en es y desa ollando nue os políme os eabso bibles po el o ganismo pa a aplicaciones biomédicas especí icas, como es el caso de la ROG19, 44-50. Nume osos ma e iales me álicos, ce ámicos y polimé icos de o ígenes biológicos o sin é icos han sido usados y p opues os como sca olds en econs ucción de ejido óseo, obse ándose una d amá ica educción del uso de ma e iales memb anosos no eabso bibles en e al uso de los ma e iales eabso bibles. T adicionalmen e, las epa aciones de los g andes de ec os óseos y cond ales cons i uye on y oda ía son un e o pa a ci ujanos del sis ema musculo-esquelé ico. La egene ación ósea y la posibilidad de hace c ece hueso han ocupado pa e del a án in es igado de auma ólogos y ci ujanos o opedas du an e siglos. Un g an de ec o óseo se conside aba ecuen emen e i ecupe able po lo que en ocasiones los pacien es que los padecían se clasi icaban como candida os a la ampu ación. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 40 - Las necesidades de egene ación ósea incluyen no solamen e los de ec os pos aumá icos sino ambién los causados po o as pa ologías musculo-esquelé icas como umo es, en e medades in lama o ias, os eopenia, in ecciones y nec osis en e o as, y, sob e odo, de ec os óseos elacionados con cie as écnicas qui ú gicas como os eo omías, aunque, po su ecuencia, me ecen mención especial las os eolisis p o ocadas po el desgas e y la p oducción de pa ículas desp endidas de bioma e iales empleados en econs ucciones os eoa icula es. Uno de los p oblemas más emp anos es la in lamación, cuyos mediado es ex acelula es sec e ados hacen que és a eacción des uc i a ósea pe sis a y se haga c ónica. Los g andes a ances que se han p oducido en ingenie ía isula han dado luga a la apa ición de écnicas que en la ac ualidad p ome en en ajas elacionadas con la implan ación qui ú gica de a mazones os eoconduc o es, con anspo ado es de agen es biológicamen e ac i os u os eoinduc o es, y inalmen e con el asplan e de células aisladas o en sopo es. F ecuen emen e, os eoconduc o es, os eoinduc o es y células óseas indi e enciadas se combinan pa a a a de ec os óseos. Pa a los a amien os de los de ec os óseos segmen a ios pos - aumá icos, adicionalmen e se han enido u ilizando écnicas como el aco amien o de la ex emidad, el apo e de hueso au ólogo no ascula izado, la os eogénesis po dis acción así como la ansposición de hueso ascula izado y aloinje os. Sin emba go, ac ualmen e ambién se han desc i o sis emas de elleno con sus i u i os óseos sin é icos como la hid oxiapa i a o el os a o icálcico en e o os de i ados. Las sus i uciones óseas en ci ugía oncológica son o a de las indicaciones pa a las nue as ecnologías. Apa e de las indicaciones ci adas, como ambién se ha mencionado, la incidencia al a de os eolisis p o ocadas po el empleo de bioma e iales cons i uye una uen e impo an e en la demanda de in es igación an o pa a la p ese ación del ejido y su buena unción como pa a su egene ación en los casos de des ucción. Po más de es décadas, las a oplas ias o ales, p incipalmen e las de cade a y odilla mejo a on no ablemen e la calidad de ida de los pacien es. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 41 - Mecanismos pa a el desa ollo de nue os ejidos En la ac ualidad se han desa ollado es mecanismos undamen ales pa a la c eación de un nue o ejido: 1. En p ime luga , el diseño y pos e io c ecimien o de los ejidos ue a del cue po pa a más a de implan a los a in de epa a o sus i ui los ejidos dañados. Ejemplo de es e mecanismo es la c eación de piel a i icial pa a su u ilización en las quemadu as. 2. En segundo luga se ha inducido la c eación de un nue o ejido u ilizando el implan e de disposi i os con de e minados ipos de células o lib es de és as y el uso de los adecuados ac o es de c ecimien o y es ímulo del sus a o biológico en el que se asien a el bioma e ial que gene almen e con igu a el disposi i o. P ueba de es a modalidad es la egene ación isula guiada pa a es imula la egene ación ósea. 3. Un e ce mecanismo pa a desa olla nue os ejidos consis e en disposi i os in e nos o ex e nos diseñados median e el aislamien o de células del o ganismo y si ua las sob e o den o de ma ices es uc u ales y ubica el sis ema de nue o en el o ganismo o bien hace lo unciona desde ue a. Pa a ello, ha enido que e oluciona la idea que sob e la ma iz ex acelula se enía, que la conside aba como un me o sopo e. Hoy sabemos que es un sis ema dinámico in eg ado po di e sas moléculas y que su o ganización a ía con los di e en es ejidos. Es e conocimien o es uno de los pila es de la ingenie ía de ejidos pa a la elabo ación de es e e ce ipo de disposi i o, a in de c ea un sus a o ideal pa a el inje o en el que se p oduzca el co ec o desa ollo y di e enciación celula . La u ilización de implan es biocompa ibles compues os po moléculas polimé icas semb adas con células au ólogas es una de las es a egias a conside a . El pos e io ag egado de ac o es de c ecimien o y di e enciación celula inc emen a á po encialmen e la calidad del ejido a eemplaza , apa e de la Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 48 - Median e la dime ización del ácido glicólico se ob iene el monóme o, el cual polime iza po ape u a de anillo p oduciendo un ma e ial de al o peso molecula y con un po cen aje de monóme o esidual comp endido en e el 1% y el 3%. Al igual que el ácido polilác ico, el poliglicólico se sin e iza y deg ada en el o ganismo dando una sus ancia no óxica que es me abolizada de la misma mane a po el ciclo del ácido cí ico, al y como se mues a en el esquema de la Figu a 10. Figu a 10: Sín esis del poli (ácido glicólico) PGA. Copolíme os de ácido lác ico y glicólico (PLGA) Encuad ados den o de la amilia de los poli-α-hid oxiácidos, se han usado pa a la libe ación de es e oides, agen es an icance ígenos, pép idos, p o eínas, an ibió icos, anes ésicos y acunas. Sus p opiedades isicoquímicas ienen de e minadas po la a qui ec u a del copolíme o y el peso molecula , aunque al a a se de copolíme os la composición ambién juega un papel impo an e. En la Figu a 11 se mues a el esquema de sín esis del ácido polilác ico-co- poliglicólico (PLGA) a pa i de ácido lác ico y glicólico, ambos ácidos na u ales p esen es biológicamen e en el in e io celula . Figu a 11: Sín esis del ácido polilác ico-co-glicólico a pa i de sus monóme os. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 49 - Los ma e iales bio eabso bibles son in e esan es po que se eliminan sin necesidad de una nue a ci ugía. En gene al, son ma e iales que se deg adan sin da p oduc os óxicos pa a el o ganismo, siendo és os eliminados pos e io men e. Los biopolíme os más u ilizados como ma e iales eabso bibles son los hid oxiácidos que se deg adan has a la mi ad de su masa en pocos meses. A la is a de las es adís icas que se ealizan sob e el núme o de allos p oducidos en la implan ación de ma e iales polimé icos sin é icos puede a i ma se que ac ualmen e las unciones que lle an a cabo los implan es ab icados en ma e iales sin é icos pueden llega a se an buenas como los ó ganos na u ales a los que sus i uyen 18, 19, 51, 67. PLGA. Diseños mo ológicos Memb anas 2D Se componen de láminas inas de sca olds es uc u ados en ib as de dimensiones mic o/nano-mé icas. Es as ib as, hiladas en o ma de láminas, es ablecen un subs a o a o able a la adhesión y c ecimien o celula . Son ab icadas median e me odologías de base nano ecnológica basadas en el uso de plasmas íos y de magne ón spu e ing, en e o as. Se mues a un ejemplo ipo de es as memb anas en la Figu a 12 a y b. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 50 - Figu a 12: 12a: Mic og a ía de supe icie de una memb ana ipo de PLGA a SEM. Figu a 12b: Mic oes uc u a in e na de la memb ana a FSEM al a esolución. Discos y cilind os 3D Se a a de masas de polilác ico cilínd icas a modo de elleno de ca idades óseas pe i-implan a ias. Los amaños y cu a u as dependen de la zona a ada. Es e as 3D Desde hace pocos años ha aumen ado el uso de es os políme os de PLGA en o ma de inyec ables con eniendo mic oes e as. La Figu a 13a mues a una mic og a ía en la que se puede ap ecia la homogeneidad de las mic oes e as, y la Figu a 13b su p oceso de deg adación al pone se en con ac o con los luidos del cue po p oduciendo agmen os de políme o más pequeños. a b Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 51 - Figu a 13: Figu a 13a: Mic oes e as de PLGA. Figu a 13b: Deg adación de una mic opa ícula. Los bene icios que p opo ciona es e sis ema son, en e o os, una magni ica biocompa ibilidad y una excelen e ep oducibilidad an o en el p oceso de mic oencapsulación como en el de libe ación del p incipio ac i o. Con es e sis ema de mic oes e as 3D se ha elabo ado un an iconcep i o inyec able que con iene mic oes e as po ado as de es e oides. En o os casos, como es el de la libe ación de de e minadas p o eínas, pép idos o an ígenos se han encon ado p oblemas. Po ejemplo, en el caso de disposi i os que con ienen la ho mona del c ecimien o apa ece una no able pé dida de ac i idad después de pocos días, que se a ibuye a in e acciones en e el políme o y la ho mona. Po el con a io en o os casos, como es el de la ho mona lu eínica, se han encon ado muy buenos esul ados, debido a que los polipép idos de bajo peso molecula son muy es ables an o en p esencia del copolíme o como de sus esiduos de bioe osión18, 19, 51. O os ipos de sca olds Nano ubos de ca bono (SWNTs): han sido p opues os como la ca ga ideal pa a la siguien e gene ación de nanoma e iales, debido a sus ca ac e ís icas mecánicas excelen es. Geles de libe ación con olada de d ogas: hid ogeles di e sos es án comenzando a u iliza se en aplicaciones de con ac o con sang e y luidos ocula es debido a la baja adso ción de p o eínas que poseen y a la capacidad de lub icación. Se a a de geles a b Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 52 - polimé icos de disolución con olada, que po an mic o esículas de d ogas pa a a amien o de pa ologías especí icas. En las Figu as 14a y 14b se mues an dos ejemplos del mecanismo de acción de es os sca olds en o ma de gel. Figu a 14a y 14b: Esquemas ipo de un sis ema e apéu ico en gel. Técnicas de elabo ación de andamios polimé icos pa a ingenie ía de ejidos Las es uc u as polimé icas po osas pueden se ob enidas a a és de nume osos mé odos. Cada écnica de elabo ación le con ie e al andamio inal ca ac e ís icas es uc u ales di e en es, po lo que es muy impo an e elegi la écnica co ec a según la aplicación inal del andamio. Algunas de las écnicas u ilizadas hoy en día pa a la ab icación de andamios po osos se encuen an esumidas en la Figu as 15 y 16. a b Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 53 - Tabla 2: Tiempo de deg adación de los p incipales políme os en in es igación. Figu a 15: Imagen idimensional de algunas ma ices y écnicas de elabo ación de andamios polimé icos pa a ingenie ía de ejidos. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 54 - Figu a 16: Mé odos y écnicas de modi icación supe icial clasi icados así como el e ec o de dichas modi aciones sob e las p opiedas supe iciales. Unión de ib as Es a écnica consis e en la elabo ación de edes in e conec adas median e la unión de ib as. Pa a es o se u ilizan dos políme os di e en es como el PLA y el PGA. Las ib as del PGA son alineadas con la o ma inal de la es uc u a deseada, y son embebidas en una solución de PLA/clo u o de me ileno. Después de la e apo ación del sol en e, los políme os son calen ados po encima de su empe a u a de usión. Finalmen e el PLA es disuel o en clo u o de me ileno, dejando las ib as de PGA unidas de o ma al que o man una es uc u a po osa. Es o se puede consegui ya que el PGA es insoluble en el clo u o de me ileno. Dada la especi icidad del sol en e, del pa de políme os y de sus empe a u as de usión, es a écnica es de di ícil aplicación con o os políme os. En gene al, casi odas es as écnicas pueden se u ilizadas no sólo pa a Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 55 - elabo a esponjas polimé icas, sino ambién pa a gene a ma e iales compues os po osos. Pa a es o, se añaden las pa ículas o ib as de la ase de e ue zo ( os a o de calcio) en la ase inicial de la elabo ación de las es uc u as. Gel cas ing Es e mé odo consis e en disol e el políme o en un sol en e o gánico como la ace ona. La solución polimé ica es colocada en un molde has a alcanza consis encia de gel. Seguidamen e el gel es p ocesado median e di e en es concen aciones de ace ona, e anol y agua pa a así ob ene una es uc u a mic opo osa. Disolución y colado con libe ación de pa ículas En es e mé odo se inco po a a la solución polimé ica una p opo ción de e minada de pa ículas mine ales (clo u o de sodio) u o gánicas (saca osa). La mezcla es luego colada en un molde donde el sol en e se e apo a o puede se p ocesada po eeze-d ying ( écnica ecien emen e u ilizada en la ab icación de geles de polilác ico ó colágeno pa a la libe ación con olada de d ogas). Una ez e apo ado el sol en e, las pa ículas son disuel as en agua dejando a su paso los di e en es po os. Con es a écnica se pueden consegui po cen ajes de po osidad bas an e ele ados. El amaño de los po os depende á de las pa ículas u ilizadas. Laminación de memb anas Es simila a la écnica conocida como Lamina ed Objec Manu ac u ing (LOM) usada en la c eación ápida de p o o ipos. Consis e en la u ilización de di e en es ilms po osos gene almen e ob enidos a pa i de la écnica de disolución y colado con libe ación de pa ículas, y colocados uno Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 56 - sob e o o unidos con la ayuda de la imp egnación con clo o o mo en la supe icie, pa a ob ene es uc u as idimensionales de o ma compleja. Sepa ación de ases El políme o se disuel e en un sol en e como el dioxano a una empe a u a baja. La sepa ación líquido-líquido, y pos e io men e sólido-líquido, es inducida al baja la empe a u a de la solución. Subsecuen emen e se elimina el sol en e solidi icado po medio de la sublimación del mismo dejando así el andamio polimé ico. La concen ación del políme o, el sol en e u ilizado y la es a egia de en iamien o juegan un papel undamen al en la mo ología inal de los po os. Sa u ación con gas Pa a es o se u ilizan especímenes polimé icos sólidos p e iamen e p ensados, los cuales son expues os a al as p esiones de CO2 pe mi iendo así la sa u ación del políme o con el gas. Se c ea una ines abilidad e modinámica al educi la p esión del gas a ni eles ambien ales que conlle a la nucleación y expansión del CO2 disuel o, gene ando así mac opo os. La mayo en aja de es e p oceso es que no u iliza sol en es o gánicos. La mayo des en aja es que el p oduc o inal es poco po oso en la supe icie y además pe manece un cie o po cen aje de po osidad ce ada en el in e io del ma e ial. Pa a soluciona es os p oblemas se es á u ilizando es a écnica en combinación con pa ículas solubles en agua. Lio ilización Es a écnica es simila a la sepa ación de ases. Consis e en lio iliza soluciones congeladas del políme o con ácido acé ico glacial o benceno. La mo ología de las Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 57 - esponjas depende no ablemen e del políme o y del sol en e. Po ejemplo, el benceno, induce una es uc u a de ipo capila , mien as que el ácido acé ico p oduce una es uc u a de ipo lib illo. Aplicaciones biomédicas y a macológicas de los políme os Equipos e ins umen os qui ú gicos Los ma e iales más usados son aquellos de o igen sin é ico y que no son biodeg adables, como polie ileno, polip opileno, policlo u o de inilo, polime ilme ac ila o o polica bona o. Aplicaciones pe manen es den o del o ganismo Las aplicaciones más impo an es son las p ó esis o implan es o opédicos, elemen os de ijación como cemen os óseos, memb anas y componen es de ó ganos a i iciales, en e o os. En e los ma e iales más u ilizados se encuen an: políme os luo ados como el e lón, poliamidas, elas óme os, siliconas, poliés e es, polica bona os, e c. En el caso de p ó esis ascula es, al se un implan e expues o al con ac o con la sang e, la p opiedad undamen al eque ida es que el ma e ial no p o oque coagulación. Conside ando es e equisi o, se aplican ib as y espumas de poli e a luo oe ileno expandido, poliu e anos segmen ados y silicona po osa. O o de los campos donde los políme os empiezan a ene una p esencia signi ica i a son los disposi i os de ijación ósea. Una de las opciones en es e campo la cons i uyen los cemen os óseos, que son mezclas de ma e iales ce ámicos con políme os sin é icos ígidos como el polime ilme ac ila o. También se han desa ollado nume osos es udios e in es igaciones en el campo de implan es biodeg adables que pe mi an soluciona las di icul ades an e io es. Los políme os o copolíme os de PLGA Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 64 - Los iones ac úan como enzimas e in luyen en la señales y los e ec os me abólicos que ocu en du an e la o mación de los ejidos129. Es as p opiedades de los ma e iales hacen que sus iones sean a ac i os como agen e e apéu icos130. Es impo an e sabe la concen ación ex acelula de los iones po que pueden a ec a a pa i de una concen ación de e minada de mane a nega i a. Así concen aciones de Ca > 10 mmol son ci o óxicas122. Además del Ca y P, en la o mación de la apa i a ósea hay o os iones que son conside ados p ome edo es en la mejo a de la o mación ósea como el Si, S , Zn, Cu, Mg y B. El silicio es un elemen o impo an e en la os eogénesis131. Tiene un e ec o es imulan e sob e la ac i idad celula , es deci , p oli e ación, di e enciación y mine alización po os eoblas os132-134. Algunos au o es a i man que la adición de silicio a los os a os alcalinos puede aumen a la ac i idad de es as enzimas y la p oducción de p o eínas en los os eoblas os135. O os au o es a i man que el suminis o de silica os a pacien es os eopo ó icos en luga de bi os ona os, p oduce un impo an e aumen o de la densidad ósea obse ada en el ému y la columna e eb al131. Asimismo el óxido de silicio es un elemen o esencial de los p ocesos me abólicos asociados con la o mación y calci icación del ejido óseo126, 127. Se han de ec ado al as concen aciones de Si en e apas emp anas de la calci icación de la ma iz ósea127. El Si acuoso es capaz de induci la p ecipi ación de HA136. Además el Si die é ico aumen a la densidad mine al ósea en homb es y muje es posmenopáusicas137. Un es udio en a as con dé ici de Ca mos a on que un suplemen o de Si causó e ec os posi i os en la densidad ósea g acias a la educción de la eabso ción138. También Nielsen y cols.139 han suge ido que el Si iene una unción bioquímica en el c ecimien o óseo que a ec a al olumen de colágeno óseo y a las p o eínas de la ma iz ex acelula como las os eopon inas. El ácido o osilica o Si(OH)4 es imula la o mación de colágeno I po pa e de los os eoblas os y es imula la di e enciación os eoblás ica128. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 65 - Vid ios bioac i os basados en SiO2 Desde que Hench y cols140 descub ie on el p ime ma e ial de silica o bioac i o, aho a llamado 45S5 Bioglass (45SiO2-25CaO-25Na2O-6P2O5) con sus p opiedades biológicas únicas, ha habido mucha in es igación sob e la ingenie ía isula . Sin emba go, has a Xynos100, el abajo in es igado no se cen ó en las in e acciones molecula es iónicas, en su en o no isiológico. Muchos es udios mues an e ec os os eogénicos de los id ios de silica os bioac i os que se esumen en la Tabla 4. Tabla 4: Respues a biológicas a los silica os. Un descub imien o impo an e de Xynos100 ue que los p oduc os disuel os de 45S5 Bioglass son capaces de egula la exp esión génica de los os eoblas os. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 66 - Kau mann141 con i mó esos esul ados obse ando la exp esión de muchos genes (os eocalcina, os eonec ina, os eopon ina) en os eoblas os y aumen ando la os a asa alcalina. Es udios simila es con id ios bioac i os de sol-gel han sido desc i os. Po ejemplo un de i ado sol-gel de 77S (mol%: 80SiO2-16CaO-4P2O5) ha demos ado p omo e la os eoinducción y mejo a la mine alización celula 142. Desde que se ha comp obado la impo ancia de la ascula ización en la egene ación ósea, ha habido muchas in es igaciones cen adas en los e ec os angiogénicos de los bioma e iales143. La ascula ización de los ejidos du os juega un papel p imo dial en la emodelación ósea ac uando como ese o io y conduc o pa a las células óseas, ac o es de c ecimien o y pe mi iendo que se ansmi an señales me abólicas144. La ascula ización del sca old debe mejo a el me abolismo óseo. Po ello, muchos es udios es án cen ados en in es iga el po encial de es imulación de los id ios bioac i os en la angiogénesis, usando células endo eliales y ib oblas os145, 146. Los iones de los id ios de silica o han demos ado es imula la os eogénesis y la angiogénesis g acias a la ac i ación de muchos genes asociados con la o mación ósea y la ascula ización147. Los nume osos es udios lle ados a cabo en los id ios bioac i os con i man la hipó esis de que los iones libe ados po los id ios bioac i os es imulan los genes de las células hacia el camino de la egene ación148. Pa a mejo a la bioac i idad de los id ios se han inco po ado a ios me ales a la ed del silica o. El p incipal obje i o es aumen a la os eogénesis, la angiogénesis y la p omoción de las p opiedades an ibac e ianas. Es os es udios incluyen Co, Zn, Cu, S , Zn, Mg, Ag, y F147. El con ol de los iones me álicos libe ados desde los sca olds ino gánicos es conside ado un buen en oque pa a mejo a la capacidad biológica de los sca olds (Figu a 22). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 67 - Figu a 22: P opiedades del sus a o, el ipo de modi icación y el impac o sob e las ca ac e ís icas de la supe icie del ma e ial. 2.6. Nanomedicina aplicada a la egene ación isula La nanomedicina es una ciencia que es udia el desa ollo de ma e iales biomédicos a escala mic oscópica, así como sus modi icaciones químicas y es uc u ales. Es a pa e de la ciencia se apoya undamen almen e en la ísica, la química cuán ica, y la elec ónica. La ingenie ía de ejidos es una ama de la nanomedicina que se basa en la u ilización de écnicas nano ecnológicas con las ca ac e ís icas mencionadas pa a c ea ma e iales bioac i os y bioabso bibles, capaces de es imula la espues a celula y molecula de o ma con olada, pa a que ac úen como sopo es empo ales en la epa ación de de ec os isula es. Den o de es a á ea exis en dos endencias p incipalmen e, la p ime a consis e en el desa ollo de andamios idimensionales acelula es ó sca olds, que se i án pa a aloja las di e en es células una ez implan ados in i o. La segunda endencia consis e en el desa ollo de ma ices idimensionales, que inicialmen e son colonizados po las células p ogeni o as bajo condiciones in i o, y luego son implan ados en el pacien e pa a eemplaza el ejido dañado149-150. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 68 - Impo ancia de las ma ices idimensionales Las ma ices idimensionales son disposi i os que p opo cionan a las células el apoyo necesa io pa a su p oli e ación y el man enimien o de sus unciones di e enciadas y las señales biológicas eque idas pa a la conse ación de la exp esión génica especí ica y, además, de inen la a qui ec u a del ejido. Las células in e ac úan con es os disposi i os de mane a ac i a en el p oceso de egene ación del ejido, lo cual induce la libe ación de ac o es de di e enciación y c ecimien o, mien as que sin e izan su p opia ma iz ex acelula , que p opo ciona un ambien e y a qui ec u a especí icos del ejido, y si e como ese o io de agua, nu ien es, ci ocinas y ac o es de c ecimien o, en e o os. Las ma ices idimensionales pa a ingenie ía isula ósea (ITO) deben sa is ace cie os c i e ios18, 19: 1. Biocompa ibilidad; Los ma e iales y sus subp oduc os de deg adación no deben p esen a e ec os óxicos (geno óxicos o ci o óxicos) o causa espues a inmune pe mi iendo la in eg ación adecuada al ejido hospedado . Deben se an isép icos y es e ilizables. 2. Po osidad; Deben ene po os abie os e in e conec ados, necesa ios pa a la di usión de nu ien es y gases y pa a la emoción de desechos me abólicos como esul ado de la ac i idad celula , lo cual es undamen al en el hueso, debido a sus ca ac e ís icas me abólicas, ya que se espe an al as asas de ans e encia de masa, incluso cuando se ealizan p ocesos in i o. 3. Tamaño del po o; El amaño ideal del po o según la ITO a ía en e 200 y 900 μm. 4. P opiedades de la supe icie; Tan o las al e aciones químicas como opog á icas de la supe icie pueden con ola y a ec a a la adhesión y p oli e ación celula . Las p opiedades químicas es án elacionadas con la habilidad de las células pa a adhe i se al ma e ial. Las p opiedades opog á icas son undamen ales pa a la os eoconducción, que es el p oceso median e el cual las células os eogénicas y ascula es mig an a la supe icie de la ma iz idimensional a a és de un Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 69 - coágulo de ib ina, que se es ablece después de implan ado el ma e ial, pa a p omo e la epa ación. 5. Os eoinducción; Es el p oceso median e el cual las células mad e y os eop ogeni o as son eclu adas en el si io de egene ación ósea y es imuladas pa a di e encia se hacia la línea os eogénica y seg ega ma iz ósea mine alizada. 6. P opiedades mecánicas; Dependen del luga de implan ación y de las ue zas mecánicas a las que se e á expues o el implan e. 7. Biodeg adabilidad; Pa a la ab icación de las ma ices se deben u iliza ma e iales que engan asas de eso ción p og esi as que igualen a las de o mación ósea, ans i iendo las ca gas de mane a g adual, de al mane a que, pa a cuando la lesión es é o almen e egene ada, la ma iz idimensional se haya deg adado o almen e. La necesidad de un ácil p ocesado y la capacidad de con o ma se en dis in as o mas son o os equisi os que debe ían cumpli se. 8. Ma e ial adiolúcido; Es p e e ible a la ho a de di e encia adiog á icamen e el nue o hueso del ma e ial implan ado. Impo ancia de la supe icie y la in e az sus a o–ma iz ex acelula Ac ualmen e hay consenso en que la complejidad del mic o-medioambien e idimensional que en uel e a las células in i o, incluyendo los cambios en el iempo de ue zas y es ímulos, in luyen de modo signi ica i o en los mecanismos de espues a celula en é minos de cambios eno ípicos, mo ológicos y uncionales. Así ha su gido en la úl ima década el concep o de mecano ansducción, basado en la hipó esis de que la opog a ía de la supe icie sob e la que descansan las células adhe en es es capaz de induci cambios en la mo ología nuclea y en la ansc ipción génica, modi icándose, po an o la exp esión eno ípica de modo que la espues a celula y de la ma iz ex acelula a las ca ac e ís icas idimensionales y es uc u ales de los sca olds a a se el aspec o undamen al que condicione el diseño y desa ollo de una nue a gene ación de bioma e iales u ilizados pa a la epa ación de los ejidos lesionados. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 70 - La espues a inicial del huésped al bioma e ial es una eacción in lama o ia desencadenada po el auma qui ú gico. En es os es adios iniciales, las células comienzan en onces la deposición de una capa de p o eínas no colágenas sob e la supe icie del bioma e ial, que egulan la adhesión celula y la mine alización. Las células, como los os eoblas os que c ecen ancladas a una ma iz ex acelula (ECM), necesi an adhe i se al sus a o an e de pode inicia su uncionamien o no mal. Esa capacidad de adhe i se al sus a o es lo que pe mi e la señalización desde la ECM al núcleo median e cascadas de p o eínas in acelula es in e media ias. Asimismo, los ma e iales capaces de es imula la adhesión os eoblás ica pueden inc emen a su di e enciación uncional egulando genes os eoespecí icos que in e ienen en la neogénesis de ma iz mine alizada y o mación de ejido óseo. Se admi e que la opog a ía de la supe icie iene un papel de e minan e sob e la adhesión os eoblás ica, su mig ación y me abolismo, modi icando y con olando el p oceso de di e enciación os eoblás ica67, 151-155. Los sca olds pa a os eogénesis deben mime iza la mo ología ósea, la es uc u a y unción pa a pode op imiza la in eg ación den o del ejido implan ado. La po osidad y el amaño del po o juegan un papel c í ico en la o mación de hueso in i o e in i o. El ejido óseo iene una mo ología abecula con po osidad del 50-90%. Los po os son necesa ios pa a la o mación del ejido óseo, ya que pe mi en la mig ación y la p oli e ación de los os eoblas os y las células mesenquimales, así como su ascula ización. Además, una supe icie po osa mejo a el encla amien o mecánico en e el implan e bioma e ial y el hueso ci cundan e na u al, p opo cionando una mayo es abilidad mecánica a es a in e az c í ica. La necesidad de po osidad en la egene ación ósea ha sido demos ada en dis in os es udios54. La po osidad se de ine como el po cen aje de espacio acío en un sólido, y es una ca ac e ís ica mo ológica independien e del ma e ial. El amaño mínimo necesa io de po o eque ido pa a egene a hueso mine alizado se conside a gene almen e en o no a 100 µm44, 150, 156, 157, aunque ha sido demos ada una mejo os eogénesis a amaños de po o de más de 300 µm ya que acili a una mejo ascula ización y oxigenación del ejido. Un meno amaño de los po os (75-100 µm) p o oca desmine alización in e na y los po os más pequeños (10-44 µm y 44-75 µm) son ob u ados po ejido ib oso. Pa a Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 71 - con ola las dimensiones del po o y su densidad en el sca old se pueden aplica dis in as a iaciones, al como se ha desc i o an e io men e44, 67, 150, 156, 157-161. 2.7. Funcionalización del PLGA El poliglicola o se ha conocido desde 1954 como una ib a du a de o mación de polimé ica. En la ac ualidad el poliglicola o y sus copolíme os con o sin ácido lác ico son ampliamen e u ilizados como ma e ial pa a la sín esis de su u as abso bibles y se es án e aluando en o as á eas del campo biomédico. Puede p epa a se a pa i de ácido glicólico po medio de la policondensación o cie as o mas de polime ización. Es os ma e iales han o eciendo gene almen e buena biocompa ibilidad y p ocesamien o. Sin emba go han apa ecido nume osos p oblemas du an e el uso de es os biopolíme os cuando son aplicados en ingenie ía de ejidos, po ejemplo, p oblemas asociados al PLGA espec o a la hid o obicidad, que comp ome en su esis encia mecánica y acili an la libe ación de es os ácidos po deg adación, disminuyendo el pH y a o eciendo la p oli e ación bac e iana y los p ocesos in lama o ios. Pa a in en a palia es os incon enien es se han inco po ado en el PLGA ma e iales ino gánicos a modo de composi es, como la hid oxiapa i a (HA), el os a o icálcico (TCP) o c is ales bioac i os, ac ualmen e en es udio18, 19, 43, 44, 51. Las ca ac e ís icas ideales de las memb anas eabso bibles de PLGA según Scan lebu y20, son:  Biocompa ibilidad.  Biodeg adabilidad.  In eg ación isula .  Oclusión celula .  Manejabilidad clínica.  Man enimien o del espacio. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 72 - Es as ma ices en o ma de memb ana p esen an las ca ac e ís icas de se eabso bidas po el p opio o ganismo sin gene a una espues a inmune de echazo, y a su ez, ac úan como ma ices que pe mi en el c ecimien o de las células en su in e io . Es án diseñadas pa a inhibi o e a da la mig ación apical del ejido conjun i o du an e la ase de cica ización educiéndose así la o mación de bolsas en la supe icie ex e na de la memb ana, y se ha demos ado además una buena adhesión y ascula ización de los ejidos en los que se hallan colocadas. La mejo a de las p opiedades os eoinduc i as puede consegui se a a és de la uncionalización supe icial de es as memb anas polimé icas de al mane a que la inco po ación de capas delgadas de depósi os de c is ales a escala nanomé icas c ee una supe icie de opog a ía más compleja que inc emen e la capacidad os eoinduc o a56-58, 162, 163. El diseño adecuado de una opog a ía de supe icie a ec a a su po encial adhesi o y a la capacidad de las células pa a adhe i se en la in e ase célula-sus a o, y nos ayuda a di igi y o ganiza la adhesión y di e enciación de las células óseas en mig ación pa a consegui una buena epa ación isula . La calidad de la adhesión celula condiciona á la mo ología, capacidad de p oli e ación y di e enciación celula . Po an o, el ma e ial empleado debe se capaz de eclu a células o mado as de hueso, os eoblas os, y acondiciona adecuadamen e el ambien e ex acelula de o ma que puedan sin e iza hueso nue o de calidad óp ima. En la úl ima década, se ha epo ado la ab icación de ma ices po osas median e di e en es écnicas, en e las que se des acan: gas oaming, sol en cas ing/pa icula e leaching, apid p o o yping y H2O2 oaming, que pe mi en el p ocesamien o de ma e iales me álicos, ce ámicos (hid oxiapa i a, os a o icálcico) y polimé icos, de o igen na u al (colágeno, ácido hialu ónico, ib inógeno, qui ina, chi osán) o sin é icos (polica bona os, políme os de PLA, PGA y sus de i ados copolíme os)21-27, 44, 149, 150, 157. Hay es azones undamen ales po las que la adición de una ase ino gánica en una ma iz polimé ica esul a in e esan e en un subs a o pa a ingenie ía de ejidos: 1. La bioac i idad del políme o aumen a debido a la inco po ación de una ase bioac i a. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 73 - 2. La in oducción de la ase ino gánica pod ía modi ica de o ma posi i a el pa ón de deg adación del políme o. 3. La inco po ación de es a segunda ase modi ica el compo amien o mecánico del ma e ial, así como la in eg idad es uc u al del andamio. Ac ualmen e se es án es udiando mul i ud de uncionalizaciones pa a a o ece la os eoinducción de los os eoblas os de la zona ana ómica donde son inse adas qui ú gicamen e y así a o ece la sín esis de ma e ia mine al y egene a el de ec o óseo con hueso au ólogo neo o mado18, 19, 43, 44, 50, 67 151-153, 163-167. Algunas de es as modi icaciones o mejo as en las ma ices ex acelula es espec o a la egulación del me abolismo, unción, ac i ación y señalización en la egene ación ósea en es udio se mues an en la Tabla 5. Tabla 5: P incipales nanocomposi es u ilizadosw a modo de modi icaciones pa a las ma ices de PLGA. Técnica de uncionalización supe icial de la memb ana de PLGA Con el in de p omo e una mayo os eoin eg ación se ealizan modi icaciones en la supe icie de las memb anas. Es as modi icaciones incluyen p ocesos de ecub imien o con capas ino gánicas de óxidos me álicos con p opiedades Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 80 - Fab icación de las memb anas del g upo PLGA sencillo (Con ol) Pa a su p epa ación se añadió 0,15g de pe las de polilác ico-poliglicólico en p opo ción 75% ácido polilác ico + 25% ácido poliglicólico (Pu aso b®, Holanda), p e iamen e a empe adas, en 10 ml de disol en e o gánico diclo ome ano líquido (CH2Cl2), y se p ocedió a su disolución en agi ado magné ico calien e. T as su comple a disolución se p ocedió a su secado en pla illo de e lón, donde el PLGA adqui ió su mo ología inal lamina memb anosa. Pos e io men e se p ocedió al co e manual, es e ilización con luz ul a iole a du an e 30 minu os po ambas ca as, y aislamien o almacenado en sob es plas i icados has a su uso en qui ó ano. En la Figu a 23 se ilus a una imagen ipo de una de las memb anas de PLGA con ol de nues o es udio a escala mac oscópica y a mic oscopía elec ónica (SEM). Figu a 23: a;(Izq); Memb ana ipo de PLGA a escala eal. b;(Dcha); Imagen supe icial de la memb ana ipo de PLGA a mic oscopía elec ónica de ba ido (SEM). Fab icación de las memb anas del g upo SiO2/PLGA+PO2 Es és e un p ocedimien o idén ico al g upo an e io . Una ez ealizado le siguen dos a amien os consecu i os: 1. El p ime o de ellos es un p e a amien o ísico supe icial de plasma de oxígeno (P-O2), an es de la deposición de la capa ino gánica sob e su supe icie. Es e a amien o de plasma p oduce la modi icación supe icial de la memb ana de PLGA y aumen a su ugosidad debido al e ching p oducido po el plasma. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 81 - Es e a amien o acili a la deg adación de las memb anas de PLGA haciéndola más sensible a medios líquidos de cul i o a o eciendo su deg adación. También p oduce una mejo a de la adhe encia en e la capa nanomé ica ino gánica y la p opia memb ana de PLGA. Es os p ocesos ienen luga a empe a u as p óximas a la ambien e y no a ec an a la in eg idad de la memb ana polimé ica. Las condiciones de abajo pa a es e p oceso in e medio de uncionalización con plasma de oxígeno pueden encon a se en un abajo p e io, así como una desc ipción de la me odología expe imen al u ilizada pa a deposi a la capa nanomé ica ino gánica sob e la memb ana de PLGA194. Un esquema de es e conjun o de p ocesos se p esen a en la Figu a 24, donde se mues a cómo en una p ime a e apa el a amien o con el plasma de oxígeno p oduce la ac i ación supe icial de la memb ana de PLGA aumen ando su ugosidad. Figu a 24: Funcionalización supe icial de las memb anas. 2. Pos e io men e se p ocedió a añadi el segundo a amien o con nanopa ículas de óxido de silicio en la supe icie de las memb anas con el in de p omo e una mayo os eoin eg ación isula . Es as modi icaciones incluyen p ocesos de ecub imien o con capas ino gánicas bioac i as de a ias decenas de nanóme os de óxido de silicio (SiO2) con p opiedades po encialmen e bioac i as, es deci , supe icies que puedan o ma un enlace químico di ec o en e el hueso y la supe icie del implan e ( ijación ac i a). Pa a ello se ealizó un p oceso de deposición química desde ase apo asis ida po plasma (PECVD) a empe a u a ambien e, en una cáma a de acío acoplada a un gene ado de mic oondas de ipo SLAN, empleando un plasma de oxígeno y como p ecu so e aisop opóxido de silicio (TTIP, Sigma-Ald ich, EE.UU). La deposición se hizo Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 82 - siguiendo me odologías de base nano ecnológica basadas en el uso de plasmas íos y de magne ón spu e ing. Figu a 25: Funcionalizado de nanopa ículas de silicio (SLAN). Ejempla es pa a la expe imen ación animal Pa a es e es udio se u iliza on cua o conejos de expe imen ación ( aza New Zeland, colo : blanco, edad: 6 meses, peso: 3,5 Kg), p opo cionándoles agua y alimen ación dia ia de ipo man enimien o “Ha lan Teckland Lab Animal Die s” (2030) (Ha lan, España). Es os ensayos de expe imen ación animal cuen an con el pe miso del Comi é de É ico de Expe imen ación de la Uni e sidad de Se illa y con el pe miso del Comi é É ico de Expe imen ación Animal del CCMI Jesús Usón. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 83 - 5.2. MÉTODO Desc ipción del es udio T as un análisis p e io de endimien o global in i o en a ios modelos de memb anas polimé icas modi icadas de PLGA eabso bibles, se p ocedió a ealiza un es udio compa a i o de egene ación ósea guiada in i o de la memb ana que o eció mejo esul ado. Pa a ello se u iliza on cua o conejos de expe imen ación, en cuya calo a (zona on al del c áneo) se les e ec ua on dos de ec os c í icos (no au o egene ables) de 11mm de diáme o y sepa ados po 0,5 cm de hueso sano. En uno de ellos se colocó las memb anas de es udio (SiO2/PLGA+P-O2), y en el o o, las memb anas con oles (PLGA sencillo). Pos e io men e se les acili ó eposo du an e un mes, y as el sac i icio de los ejempla es, se en ia on las mues as de calo a al labo a o io pa a hace un análisis compa a i o cuali a i o y cuan i a i o de odos los de ec os, pa a elabo a una e aluación obje i a y es adís ica de la e ec i idad y iabilidad de es as memb anas. P ocedimien o qui ú gico Las in e enciones, así como el sus en o de los animales y sac i icio de los mismos se e ec ua on en el CCMI (Cen o de Ci ugía de Mínima In asión de Cáce es). Du an e la in e ención se con ó con la ayuda de dos odon ólogos ci ujanos al en e, dos odon ólogos asis en es, un e e ina io, un anes esiólogo, un biólogo, y un g upo de auxilia es clínicos de la especialidad. Se comenzó con la sujeción de los animales y con ol de sus cons an es i ales. Pa a el p oceso de anes esia se u ilizó inducción in a enosa con midazolan 0,25mg/kg y p opo ol 5mg/kg, man enimien o con gas inhala o io de se o luo ano 2,8% aspi ado y analgesia con ke o olaco 1,5mg/kg y amadol 3mg/kg. Una ez sedados y p epa ados los conejos, se ealizó una incisión en e las bases de las o ejas comunicándola con una incisión en la línea media de la calo a (de Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 84 - ap oximadamen e 5 cm) con hoja de bis u í nº15. Consecu i amen e se despegó y diseccionó la capa epi elial, conec i a y muscula con un pe ios eo omo de P icha d, con olando en odo momen o el sang ado median e comp esión y aspi ación. Pos e io men e se p odujo la exposición de la supe icie ex e na del c áneo y el la ado de la zona con solución salina (sue o isiológico). Despegados los colgajos iangula es, se sepa a on median e su u a de 2/0 colgando de ellos dos mosqui os pa a deja despejado el campo de in e ención. Se iden i ica on dos es uc u as: la c es a sagi al del hueso pa ie al, y la salida del ne io acial. En e ambas es uc u as, a ambos lados de la línea media se ealiza on dos de ec os óseos sepa ados cada uno de ellos po 6 mm, con una e ina pues a en un con aángulo de implan es con i igación de sue o isiológico es é il. La e ina u ilizada ue la de Helmu Zep , de diáme o in e no de 11 mm, de dien es 2,35 mm y longi ud 30mm, e .08.910.13 (Helmu Zep Medizin echnik GMBH, Alemania). Con dicha e ina y a una elocidad de 2000 pm se ma có el de ec o con una p o undidad de 1 mm. El hueso se eliminó usando piezoci ugía y con olando la p o undidad a 2 mm median e sonda pe iodon al. Una ez ealizados los de ec os, és os se cub ie on con las dis in as memb anas de PLGA, o ganizadas según el g upo asignado al de ec o al y como mues a la Figu a 26. Figu a 26: O ganización posicional de las memb anas. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 85 - Las memb anas de PLGA se ija on con un adhesi o hemos á ico isiológico Tissucol® (Bax e , EE.UU.) ap obado po la FDA, el cual con iene ib inógeno y ib ina humanas. El adhesi o ue colocado en el ebo de óseo adyacen e a los de ec os pa a ija mejo la memb ana, consiguiendo una adecuada ijación y poca mo ilidad de las memb anas al desplaza el colgajo a su posición inicial. Se p ocedió a la su u a en dos planos; una p ime a de 4/0 en el plano de pe ios io subepidé mico, y una segunda de 2/0 no eabso bible en el plano epidé mico. Se e ec ua on pun os simples con la mejo ap oximación posible de bo des, y se inalizó la in e ención con el limpiado de la he ida, (Figu a 27). El iempo ap oximado de la in e ención qui ú gica ue de una ho a po cada ejempla . Pos e io men e se les adminis ó analgesia an iin lama o ia con bup eno ina (0.05 mg/kg) y ca p o eno (1 ml/12.5 kg p ), y eposo p og amado de un mes. Figu a 27: Imágenes de la ope ación. (1 y 2); Incisión y desplazamien o isula . (3); T e inado. (4); Colocación de las memb anas en los de ec os óseos. (5); Su u a de la he ida. (6); Visión de los de ec os óseos egene ados as el sac i icio. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 86 - Sac i icio Los conejos ue on sac i icados al mes de la in e ención u ilizando una dosis le al ía in a enosa de clo u o po ásico, lo que les p o ocó un pa o ca díaco. Las mues as ue on ob enidas pa a su pos e io es udio a pa i de la calo a de cada ejempla , co adas en plano sagi al ana ómico, y as la sepa ación de la masa ce eb al y la ado con sue o isiológico, se p ocedió al co e y ma cado de las piezas indi idualmen e de la siguien e mane a: 1. P eco e (3x3cm): En cuad ado de 3cm en o al como máximo, pa a cada lado ( al como se ap ecia en el esquema abajo). 2. Ma cado: Co e en iángulo de la esquina caudal izquie da de cada calo a, en is a do sal del animal (como se indica en el esquema de la Figu a 28. 3. El p oceso de p eco e de las cabezas y el allado de la esquina de las calo as se e ec uó de uno en uno, con i igación de sue o isiológico, y lo más ápido posible pa a e i a la desecación de las células (Figu a 29). 4. Fo og a iado de las piezas jun o a la e ique a del código de ejempla del conejo an o en el p eco e como en el co e de la esquina. 5. Fijación: Se in oduje on las calo as (aun húmedas de sue o) en ascos que se ellena on con e anol 70°C (a 4°C) has a un dedo del ope del asco. 6. T aslado al labo a o io conse adas en hielo seco (CO2 a baja empe a u a y al a p esión). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 87 - Figu a 28: Esquema del p eco e y ma cado en la calo a. (No a: Re e imos siemp e Izq/Dcha y F on al/Caudal del animal, no del ope ado . En is a do sal de la calo a (no en al-ce eb al). Figu a 29: (a); Calo a p eco ada as sac i icio. (b); Mues a de calo a ma cada y p epa ada en ijación pa a aslado al labo a o io. P ocesamien o de las mues as. El p ocesado de las mues as y su a amien o his ológico as la ijación de las mues as p eco adas, en e anol de 70° du an e 48h a 4°C (Figu a 30), se e ec uó en el labo a o io his ológico de la Facul é de Chi u gie Den ai e. EA: 2496 (Uni e sidad Pa is Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 88 - V – René Desca es), y siguiendo el p o ocolo que se explica a con inuación pa a odas las a iables de es udio has a el comienzo de las p uebas pa a mic oscopía. Figu a 30: P e a amien o de las mues as, ijación ía e anol 70° (4°C). P e a amien o y a amien o isula Deshid a ación Se comenzó me iendo las mues as de calo a en e anol de 95° en igo í ico (4°C) du an e 48 ho as. Seguidamen e se sume gie on cua o eces en e anol absolu o du an e una ho a cada uno a 4°C. Po úl imo se in oduje on en xileno con un pase de es ho as. Imp egnación Se sume gie on las mues as en Solución-1: (xileno + me il me ac ila o; en p opo ción 1:1) du an e dos ho as en egade o con asija a p esión híd ica al acío, y mezclando en agi ado . Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 89 - Pos e io men e se sume gie on en Solución-2: (me il me ac ila o + dibu il-x; en p opo ción 1:1) du an e dos ho as en egade o con asija p esión híd ica, y se gua da on a 4°C has a comenza la inclusión. En la Figu a 31 se mues a una imagen con el ma e ial empleado pa a el p oceso; Figu a 31: Imp egnación y p einclusión a al a p esión. Inclusión Se p ocedió a sume gi comple amen e las mues as en una solución líquida de esina ipo me il me ac ila o (MMA) Me ck (Me ck & Co., EE.UU.) en ascos de c is al cilínd icos pa a ab ica los bloques. Pa a ello se añadió una mezcla equi a i a de la Solución A (pe óxido o gánico de benzoilo (BPO)) y la Solución B (dioc il adipa o (DMPT) + Bu il-x). P e iamen e es as soluciones se mezcla on con agi ado con palomi a y ue on p esolidi icados du an e una semana a -20°C. La inclusión se ealizó colocando las mues as cen adas en el in e io y se e ió la mezcla de soluciones A y B len amen e. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 96 - Figu a 38: Mon aje ípico en po amues as con cub eobje os. Pa a lle a a cabo la e aluación cuali a i a del es udio mo omé ico de la es uc u a y densidad del hueso neo o mado en cada caso se adqui ió una imagen cen al de 6 mm de lado pa a cada de ec o y pa a el hueso o iginal (de los lancos del de ec o) con obje i o 5x median e el mic oscopio óp ico “Zeis Axioscop Plus” (Zeiss Mic oscopy, LLC; EE.UU). Se alo a on omando en cuen a la can idad de os eoide ( iole a), la p esencia de hueso madu o (azul oscu o) y la can idad de ejido medula y adipoci os ( ejido blanco con mic oes e as g ises de células en o mación, y bolsas de ácidos g asos). Con es as imágenes se e alua on de o ma cuali a i a la es uc u a y densidad ósea global de los de ec os egene ados con las memb anas de es udio (SiO2/PLGA/P- O2), en e a los con oles (PLGA sencillo). Ni el de egene ación ósea (po cen aje de hueso neo o mado) en los de ec os a ados con las memb anas de es udio en e a los con oles Pa a analiza cuan i a i amen e el po cen aje óseo neo o mado se eligió la colo ación Von Kossa (VK) (Sigma-Ald ich, EE.UU.), que se emplea pa a de ec a la ma e ia mine al calci icada median e pla a molecula . Es a écnica de ma caje co esponde a un mé odo de sus i ución del calcio po pla a. El ni a o de pla a se une Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 97 - sólo a la pa e aniónica de las sales de calcio ( os a os o ca bona os), compues o que es de colo ama illo y que expues o al sol o a la luz adquie e colo neg o po educción de la pla a. Pa a lle a a cabo es a colo ación se les añadió a cada co e his ológico es go as de ni a o de pla a al 5% du an e 30 minu os en oscu idad. Seguidamen e se le aplica on es la ados de es minu os en agua des ilada. T as es o, se sume gie on en ca bona o de sodio o maldehido du an e dos minu os, y se la a on en agua des ilada du an e unos segundos. El mon aje de las mues as es idén ico al empleado en el apa ado an e io pa a el azul de oluidina. Pa a la adquisición de imágenes se u ilizó el mic oscopio óp ico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Mic oscopy, LLC; EE.UU) y la cáma a SONY 3CCD (DSP) (Sony Co p, Japón) jun o con el so wa e Sma Ma ox In elicam 8.0 (Ma ox Imaging, Reino Unido) (Figu a 39). Figu a 39: Mic oscopio de óp ico de campo cla o + o denado pe sonal de cuan i icación y análisis de da os es adís icos. Pa a calcula el po cen aje óseo neo o mado se p ocedió a un en oque con obje i o 10x pa a dis ingui los lími es del de ec o óseo egene ado. Una ez localizado se p ocedió al en oque con obje i o 4x pa a ob ene imágenes digi ales in eg ales, po sepa ado, de los de ec os y el hueso o iginal a cada lado de los de ec os. Pa a la cuan i icación del nue o ejido egene ado y su compa ación con el o iginal se analiza on las zonas de es udio en di ección de dis al (ex e na) a p oximal (in e na), Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 98 - median e análisis po egiones ROI de 11 mm (pa a cada de ec o) y de 5 mm (en el hueso o iginal). Pos e io men e se ans o mó la imagen a blanco/neg o po selección manual de umb ales gamma, y se calculó au omá icamen e los po cen ajes medios o ales de blanco y neg o median e el so wa e in o má ico Fiji-Image J 1.0 (JAVA, EE.UU.) Supe icie ósea mine alizada (milíme os de hueso neo o mado po día) en los g upos de es udio en e a los con oles Pa a cuan i ica los milíme os de supe icie ósea mine alizada po día se eligió el ma caje con calceína, que se u iliza pa a pone de mani ies o la ijación del calcio isula de nue a aposición. El pa calceína / demeclociclina son ma cado es luo escen es, que emi en luz de di e en e longi ud de onda bajo luo escencia. Son adminis ados po ía in a enosa y señalizan los p ocesos anabólicos de ijación ósea isula . Es a p ueba o ece una isión mesu able a mic oscopio óp ico del ejido óseo neo o mado p esen ando dos líneas de di e enciación que co esponden con el hueso egene ado a uno y ocho días p e ios al sac i icio de los ejempla es ya que en esos momen os se les adminis ó al animal los ma cado es. El análisis his omo omé ico de la p esencia del ma cado y la dis ancia en e las señales es un mé odo e icaz pa a de e mina y cuan i ica los mecanismos de c ecimien o óseo y de adap ación uncional. El p o ocolo de adminis ación pa a los ejempla es ue el siguien e:  Adminis ación ía in a enosa de 5ml de la solución-1: 45mg de calceina + 0,1g de ca bona o de sodio (SIGMA C0875; Sigma-Ald ich, EE.UU.) en 5 ml de sue o isiológico, a azón de 30mg/kg animal, ocho días an es del sac i icio.  Adminis ación ía in a enosa de 5ml de solución-2: 45mg de demeclociclina hid oclo u o (SIGMA A6140; Sigma-Ald ich, EE.UU.) en 5ml de sue o isiológico, el día p e io al sac i icio. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 99 - Una ez co adas las mues as, és as se mon a on sin inción alguna con una go a de e anol 80° sob e el po a y colocando sua emen e el cub emues as en cada ma e ial. Pa a la adquisición de imágenes se u ilizó el mic oscopio óp ico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Mic oscopy, LLC; EE.UU) y la cáma a SONY 3CCD (DSP) (Sony Co p, Japón) jun o con el so wa e Sma Ma ox In elicam 8.0 (Ma ox Imaging, Reino Unido) (Figu a 39). Pa a la cuan i icación de los milíme os de hueso neo o mado po día se adqui ie on imágenes con los ins umen os ci ados an e io men e con obje i o 20x y zoom 1,5, y se midió la dis ancia en e las ma cas lineales na anja y e de, espec i amen e de cada ma cado luo escen e, y co espondien es al hueso aposicionado en e los días uno y ocho días an es del sac i icio. La medición se ealizó en las egiones cen ales de cada mues a y el hueso o iginal. Pos e io men e, se hizo una con e sión p opo cional en e las medias de las dis ancias mesu adas y el obje i o de adquisición empleado en el mé odo, asladando de es e modo las medidas a milíme os. Finalmen e di idiendo en e sie e días, se ob u ie on los milíme os de hueso neo o mado po día en cada de ec o en ambos g upos. Ac i idad eso i a (os eoclas os po milíme o) en los g upos de es udio, en e a los con oles Pa a compa a cuan i a i amen e los os eoclas os po milíme o de pe íme o óseo de cada mues a, se u ilizó la écnica de e idencia de la os a asa ácida a a o de sodio esis en e (TRAP). La TRAP es una hid olasa ácida exclusi a de os eoclas os y p eos eoclas os libe ada al medio ci cundan e po es as células du an e la eso ción ó eabso ción ósea pa a acili a la disolución del hueso, y que se elaciona con el g ado de i alidad del ejido óseo. Es a colo ación enzimá ica pone de e idencia la ac i idad os eoclás ica del ejido óseo analizado ma cando los os eoclas os de colo ojizo. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 100 - Pa a ello se p epa ó la siguien e mezcla mad e median e agi ación con palomi a iman ada y il ación en papel:  10 mg de na ol ASTR os a o (SIGMA N-600; Sigma-Ald ich, EE.UU.)  50 μl de NN dime il o mamida  10 ml de ampón ace a o de sodio anhid o (SIGMA S-2889; Sigma-Ald ich, EE.UU.) 0,1M en agua des ilada, y mezclado con 100μl de ácido acé ico glacial (en campana de gases).  2 x 115mg de a a o de sodio (SIGMA S-4797; Sigma-Ald ich, EE.UU.)  10mg de Fas Red TR Sal (ALDRICH 368881; Sigma-Ald ich, EE.UU.)  Se inaliza la mezcla il ando en papel y ajus ando el pH a 5,2. T as escu i muy bien las láminas, se añadió a cada mues a es go as de es a solución mad e, se coloca on en caja po amues as humidi icadas con papel de il o mojado en agua y se incuba on una ho a a 37°C en es u a (Figu a 40). Una ez inalizado es e pe iodo se la a on las mues as en agua des ilada du an e cinco minu os, y se con as a on con azul de oluidina al 1% du an e un minu o. Figu a 40: Ki de inción y es u a de secado pa a a amien os enzimá icos (TRAP y ALP). Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 101 - El mon aje de es as mues as ue al agua únicamen e, añadiendo dos go as de agua sob e las mues as y colocando el cub emues as sua emen e eliminando las posibles bu bujas. Se man u o la hid a ación pe manen emen e en e ige ado . Pa a compa a cuan i a i amen e la ac i idad eso i a del ejido óseo neo o mado y del hueso o iginal median e la TRAP, cuyo esul ado posi i o son ag egados ojizos celula es, se adqui ie on imágenes a obje i o 4x de cada de ec o óseo y del hueso o iginal, y se cuan i icó el núme o de os eoclas os po campo, an o en las zonas de es udio, como en los con oles y el hueso o iginal. Pos e io men e se calculó el p omedio del núme o p opo cional de os eoclas os po milíme o en la zona de los de ec os (11 mm), y del hueso o iginal (5 mm), lo que nos pe mi ió alo a obje i amen e el ni el eso i o ap oximado del ejido analizado. Pa a la adquisición de imágenes se u ilizó el mic oscopio óp ico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Mic oscopy, LLC; EE.UU) y la cáma a SONY 3CCD (DSP) (Sony Co p, Japón) jun o con el so wa e Sma Ma ox In elicam 8.0 (Ma ox Imaging, Reino Unido) (Figu a 39). E aluación cuali a i a de la aposición (ac i idad os eoblás ica) en el g upo de es udio en e al con ol Pa a pone de mani ies o la ac i idad os eoblás ica se u ilizó la colo ación enzimá ica de la os a asa alcalina (ALP). La ALP es una enzima ca ac e ís ica de os eoblas os y p eos eoblas os. Es una enzima hid olasa ma cado a de di e enciación os eosin é ica, esponsable de o ma colágeno ipo I y nódulos calci icados. Pa a ealiza es a écnica se p epa ó una solución mad e en oscu idad:  5,32 mg na ol ASTR os a o (Sigma-Ald ich, EE.UU.) en 100μl de dime il o mamida con agi ación.  8 mg de Fas Blue RR Sal (Sigma-Ald ich, EE.UU.).  10 ml de ampón T is 0,1M ph 9 (Sigma-Ald ich, EE.UU.).  3,33 mg de clo u o de magnesio. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 102 -  Finalmen e se il ó la p epa ación con papel y se ajus ó el pH a 9. Se p eincuba on las mues as en po amues as du an e diez minu os en una disolución de T is-T i on al 0,1% mezclado p e iamen e du an e cinco ho as, y elabo ado median e 5 ml de T i on X-100 + 45 ml de T is 0,1 M (Sigma-Ald ich, EE.UU.). Seguidamen e se enjuaga on las láminas en ampón T is 0,1 M a pH 9. Pos e io men e se incuba on las mues as con es go as de la solución mad e du an e 30 minu os a 37°C en es u a, y se enjuaga on en ampón T is 0,1 M a pH 9 (Sigma-Ald ich, EE.UU.). Pa a e alua cuali a i amen e la p esencia de ac i idad os eosin é ica posi i a no mal en los os eoblas os del ejido es udiado se u ilizó la écnica de la ALP, cuyo esul ado posi i o son células ma cadas de colo azul- iole a (os eoblas os). Pa a ello se empleó un mé odo de adquisición simila al de la TRAP, y se obse ó la p esencia posi i a no mal de os eoblas os en cada uno de los de ec os y el hueso o iginal. Es as imágenes se incluyen pa a ilus a obje i amen e el ni el de aposición de los de ec os de es udio en e a los con oles. Pa a obse a los de alles celula es y consegui una buena disc iminación, se u ilizó un zoom x2 p e ia a la adquisición de las imágenes, que se ealizó u ilizando el mic oscopio óp ico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Mic oscopy, LLC; EE.UU) y la cáma a SONY 3CCD (DSP) (Sony Co p, Japón) jun o con el so wa e Sma Ma ox In elicam 8.0 (Ma ox Imaging, Reino Unido) (Figu a 39). Análisis es adís ico Pa a la alo ación es adís ica de los esul ados ob enidos se u ilizó el análisis no pa amé ico de U de Mann Whi ney pa a compa ación de los esul ados ob enidos en ambos g upos de es udios, median e el so wa e STATVIEW F-4.5 en o denado Mac. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 103 - 6. RESULTADOS Los esul ados ob enidos en es e abajo de in es igación son los siguien es: 6.1. E aluación cuali a i a de la es uc u a y densidad ósea global T as los ensayos con la colo ación azul de oluidina (BT) se ob u ie on imágenes globales cuali a i as de la es uc u a y densidad de los de ec os egene ados as un mes. Respec o al hueso o iginal y los con oles, se obse ó una es uc u a más es able y de mayo densidad ósea en los de ec os egene ados con las memb anas de SiO2/PLGA+ P-O2 en e a con ol. En los de ec os óseos del g upo de es udio no se obse ó p esencia de in lamación ano mal, y se iden i icó una mayo semejanza con el hueso o iginal que en los de ec os con oles, con mayo densidad de ejido medula (Figu as 41-43). Figu a 41: Colo ación BT en hueso o iginal. Zonas ma ginales del de ec o. Obje i o 5x. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 104 - Figu a 42: Con ol PLGA. Figu a 43 : SiO2/PLGA+P-O2. Mic oscopía óp ica. Colo aciones. Azul de Toluidina (BT); Compa ación de los ni eles de hueso es uc u al en los di e en es nanocomposi es espec o al con ol, as un mes de egene ación; Obje i o 5x. 6.2. Ni el de egene ación ósea (po cen aje óseo neo o mado) Las cap u as digi ales ob enidas as la colo ación de ni a o de pla a (VK) ilus an las o maciones de os a o cálcico du an e la egene ación de los de ec os óseos as un mes de cica ización, y con i man una mayo densidad de calcio mine al en las memb anas del ipo SiO2/PLGA+P-O2, espec o a los con oles de PLGA sencillo. Tomando los alo es p omedios y la des iación es ánda de los esul ados cuan i a i os ob enidos en el es udio as los análisis con colo ación de Von Kossa (VK), se ob u ie on los siguien es esul ados: los da os de po cen ajes óseos neo o mados medidos a un mes de eposo as el pos ope a o io ue on de 39,72 % ± 3,53 en las Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 105 - memb anas uncionalizadas de es udio, en e a un 30,57% ± 1,96 en las memb anas con ol (p < 0,05) (Figu as 44 y 45). Así mismo, los da os de las memb anas uncionalizadas con silicio y plasma de oxígeno o ecen meno di e encia espec o al ni el de hueso o iginal que los de ec os egene ados con las memb anas con oles, con un da o de +2,90 % ± 9,3) en e al - 12,03% ± 5,1) de los con oles, espec i amen e (p < 0,05) (Tabla 6). Figu a 44: Con ol PLGA. Figu a 45: SiO2/PLGA+P-O2. Mic oscopía óp ica. Mine alización. Von Kossa: Compa ación de los ni eles de mine alización en e los a amien os espec o al con ol, as un mes pos ci ugía; Obje i o 5x. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 112 - las condiciones locales que p esen e la zona in e enida. En es e úl imo pun o es donde se p e ende incidi en el p oyec o de in es igación pa a mejo a la cica ización ósea67. A la ho a de decidi sob e la especie animal hay a ios ac o es que hay que ene en cuen a. Según Schimandle y Boden 200, los ac o es de selección de animales son: el cos e de adquisición y de cuidado de los animales, disponibilidad de los animales, acep abilidad pa a la sociedad, ole ancia a la cau i idad y acilidad pa a su espacio de habi abilidad. O os ac o es que in luyen son el cuidado, el man enimien o, acilidad pa a la manipulación, esis encia a la in ección y la en e medad, ca ac e ís icas biológicas análogas a los se es humanos, ole ancia a la ci ugía, ins alaciones adecuadas y pe sonal de apoyo. Además de es o la ida ú il de las especies deben se adecuadas pa a la du ación del es udio. En nues o caso es muy impo an e las ca ac e ís icas especí icas del hueso y su pos e io ex apolación de los esul ados a la si uación humana. Las no mas in e nacionales en elación a las especies que son adecuadas pa a la implan ación de ma e iales óseos, sub ayan que los pe os, o ejas, cab as, ce dos y conejos son animales adecuados. Aunque la a a es una de las especies más u ilizadas en la in es igación médica, no se puede oma en cuan a en es e ipo de ensayos debido a las di e encias en e los huesos humanos y el de las a as, y la limi ación pa a c ea a ios de ec os. En nues o caso, el conejo es uno de los animales más usados pa a la in es igación médica, se u iliza en ap oximadamen e el 35% de los es udios de in es igación musculo-esquelé icos201. Es o es en pa e debido a la acilidad de manejo y amaño. El conejo ambién alcanza su madu ez esquelé ica en b e e, al ededo de los seis meses de edad202. En cuan o a su es uc u a es e iden e que hay g andes di e encias en e la ana omía ósea del conejo y el humano an o en el amaño, la o ma y en la ca ga debido a las di e encias en las pos u as en e las dos especies. Hay muy poca li e a u a sob e las di e encias en e la composición y la densidad ósea humana y la de los conejos, pe o se han desc i o algunas simili udes en la densidad mine al ósea (DMO) y en la esis encia a la ac u a en e conejos y se es humanos203. En compa ación con o as especies, como p ima es y algunos oedo es, el conejo iene un ecambio esquelé ico y óseo más ápido202, 204. Aunque hay que ene es a conside ación a la ho a de ex apola Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 113 - los esul ados en humanos, los conejos se u ilizan comúnmen e pa a el c ibado de ma e iales an es de hace una p ueba en un modelo animal mayo . Apo ación del modelo animal Ac ualmen e hay consenso en que la complejidad del mic o-medioambien e idimensional que en uel e a las células in i o, incluyendo los cambios en el iempo de ue zas y es ímulos, in luye de modo signi ica i o en los mecanismos de espues a celula en é minos de cambios eno ípicos, mo ológicos y uncionales. Los modelos animales p o een de da os necesa ios y adecuados an es de p ocede con las aplicaciones humanas 65, 67, 152, 195. Una de las p incipales limi aciones del cul i o óseo es la al a con olada de ca ga isiológica, ya que el hueso sin ca ga aumen a la eso ción, como se puede ap ecia en los pacien es después de un eposo p olongado205. Po es os mo i os los modelos animales son esenciales pa a e alua la biocompa ibilidad, la espues a de los ejidos y la unción mecánica an es de la u ilización clínica en el se humano. Los modelos animales pe mi en la e aluación de los ma e iales en di e en es si uaciones con o sin ca ga, en di e en es in e alos de iempo y en di e en es calidades de ejido (po ejemplo hueso sano u os eopenia) y edades. Mien as que los modelos animales pueden ep esen a la si uación clínica, mecánica y isiológica, hay que eco da que es sólo una ap oximación, y que cada modelo animal iene unas en ajas y des en ajas. La egene ación ósea no sólo implica el c ecimien o celula , ni la sec eción de ma iz ósea, sino ambién la c eación y madu ación de un ejido óseo de acue do a unas ca ac e ís icas es uc u ales necesa ias pa a que pueda eje ce las unciones mecánicas p opias de dicho ejido. Dicha madu ación es uc u al es imposible de ec ea ue a de un se i o. Po odo ello, y habiendo quedado demos ado la comple a eplicabilidad de los p ocesos aplicados en es e ensayo, puede conside a se es e es udio de o igen como una g an ayuda en p ocesos de ROG pa a pos e io es in es igaciones clínicas de mayo complejidad. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 114 - Podemos a i ma que el uso de la calo a ha sido ac edi ado en nume osos es udios, y p esen a impo an es en ajas en e a o as localizaciones de la ana omía del conejo que ambién pod ían u iliza se:  El hueso p esen a una amplia medula en sen ido ho izon al y un doble diploe (in e no y ex e no). El diploe in e no, que no debe daña se, asegu a la no ealización de un mayo daño que el deseado. La medula asegu a un al o apo e de sang e y células al de ec o.  La a qui ec u a mac oscópica del de ec o en dicho hueso, que es plano, sin la con exidad p opia de los huesos la gos, a o ece la adap ación de la memb ana sob e el mismo, asegu ando que no hab á despegamien o de la misma du an e la expe iencia, y haciendo que sea iable odo el diseño p opues o.  El o igen de la calo a, po osi icación memb anosa, en e a la osi icación endocond al, es simila a la de los huesos maxila es en el humano, po lo que la ce canía en e ambos hueso es mayo que la que encon a íamos en e o os huesos.  El amaño de la calo a del conejo, cuando se u ilizan de ec os medianos posibili a la ealización de a ios de ec os, lo que pe mi e que cada de ec o enga su con ol en el mismo animal, lo que pe mi e disminui el núme o de animales a es udia , siemp e que el e ec o de la in e ención a e alua sea local, no sis émico, como el caso que nos ocupa.  El amaño de los de ec os, de 11 mm de diáme o, se decidió en base a bibliog a ías p e ias sob e la impo ancia de c eación de de ec os óseos c í icos (no au o egene ables) po el p opio o ganismo, y pode así elabo a una conclusión i me sob e la iabilidad de es as memb anas en p ocesos ROG in i o y su ecomendación en u u o uso en ensayos clínicos en humanos 18, 42, 61, 206. Finalmen e, las mues as ob enidas as el sac i icio de los animales de expe imen ación deben se con e idas en da os cuan i a i os y obje i os que pe mi an compa a dimensiones como el c ecimien o óseo, la p esencia de os eoide y su Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 115 - can idad, la can idad y calidad del hueso neo o mado (pudiendo di e encia lo del esidual as c ea el de ec o), e c. T ascendencia de los bioma e iales en la ci ugía egene a i as Los eque imien os de nue o hueso pa a es au a o eemplaza el ejido óseo pe dido o dañado es una de las mayo es necesidades clínicas en la auma ología en la ac ualidad, siendo el daño o al o pa cial de ejido y la pé dida de la unción de un ó gano uno de los p oblemas más g a es y cos osos de la salud humana. Inicialmen e, esos p oblemas se han abo dado median e el asplan e de ó ganos y ejidos alogénicos. Sin emba go, es a opción se e limi ada po la baja disponibilidad de donan es, los p ejuicios y moles ias de i adas, la complicación de la écnica y los e ec os secunda ios de i ados del p oceso21, 44. La ingenie ía isula , sin emba go, g acias a sus con inuas in es igaciones en el desa ollo de nue os ma e iales pa a la epa ación y la egene ación de ejidos, ha gene ado un g an a ance en el siglo XXI, dando luga al desa ollo de sca olds y composi es diseñados y modi icados pa a ROG71, 207. Es a eme gen e á ea (la ingenie ía de ejidos óseos), es á diseñando y desa ollando ma e iales que pueden eensambla la es uc u a na i a del hueso, cen ándose p incipalmen e en políme os sin é icos pa a mime iza la ma iz ex acelula p o eica p incipal (MEC) del hueso, colágeno ipo I. Con el in de egene a comple amen e el hueso, es án siendo e aluadas inco po aciones de me ales y mine ales como los óxidos me álicos y la hid oxiapa i a (HA), a modo de sus a os de nanocomposi es en los sca olds, pa a se implan ados en los de ec os óseos206. Los g andes a ances que se han p oducido en ingenie ía isula han dado luga a la apa ición de écnicas que en la ac ualidad p ome en en ajas como las que pod ían es a elacionadas con la implan ación qui ú gica de a mazones os eoconduc o es, con anspo ado es de agen es biológicamen e ac i os u os eoinduc o es, y inalmen e con el asplan e de células aisladas o en sopo es. F ecuen emen e, elemen os os eoconduc o es, os eoinduc o es y células óseas e indi e enciadas se combinan pa a Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 116 - a a de ec os óseos. Pa a los a amien os de los de ec os óseos segmen a ios pos - aumá icos, adicionalmen e se han enido u ilizando écnicas como:  Apo e de hueso au ólogo no ascula izado.  La os eogénesis po dis acción así como la ansposición de hueso ascula izado.  Aloinje os. Las sus i uciones óseas en ci ugía oncológica son o a de las indicaciones pa a las nue as ecnologías. Apa e de las indicaciones ci adas, como ambién se ha mencionado, la incidencia al a de las os eolisis p o ocadas po el empleo de bioma e iales cons i uye una uen e impo an e en la demanda de in es igación an o pa a la p ese ación del ejido y su buena unción como pa a su egene ación en los casos de des ucción. Es udios ecien es sugie en que el inc emen o de sob eca ga hospi ala ia de las a oplas ias en los p óximos 20 años se á no able. Las p ó esis p ima ias de cade a, en algunos países aumen a án has a en un 174%, mien as que las de odilla llega án a un 673%. Se inc emen a á ambién el núme o de ecambios de p ó esis que alcanza á el doble del ac ual en el año 2015 pa a las odillas y en 2026 pa a las cade as. En gene al, las ci as de aumen o de ci ugías de e isión que se calculan en e los años 2005 y 2030 se án de un 137% pa a las cade as y un 601% pa a las odillas. En e 1990 y 2002, en Es ados Unidos, la ci ugía de e isión pa a las p ó esis o ales de cade as oscilaba en e un 15,2% y un 20,5% (media de 17,5%) y en e 7,5% y 9,7% (8,2% p omedio) pa a las odillas 45, 47-50, 54, 55, 63, 64, 151-155. Todo ello demues a, en de ini i a, no sólo la jus i icación de es e abajo de in es igación, sino la e iciencia y ele ancia de es e ipo de ma e iales biocompa ibles eabso bibles de e ce a gene ación en la p ác ica clínica humana pa a egene ación isula guiada (RTG) y conc e amen e en la a ian e ósea (ROG), an o en es os Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 117 - momen os como en épocas enide as donde el con inuo desa ollo de es as modi icaciones p ome e g andes e in e esan es expec a i as. Impo ancia de los políme os de PLGA Hay una g an a iedad de memb anas polimé icas eabso bibles que pe mi en p ocedimien os de egene ación ósea en un solo paso, educiendo así las moles ias, cos es y las posibles complicaciones pa a el pacien e. Es os ecub imien os polimé icos son especialmen e in e esan es en biomedicina debido an o a la di e sidad de sus p opiedades químicas y ísicas como a su simili ud con los ejidos humanos. Es as memb anas son biocompa ibles, no óxicas, no inmunogénicas y ac uán como sopo e du an e la o mación de hueso, pe o no ienen p opiedades bioac i as que p omue an la os eogénesis208-212. Se sabe que el PLGA se deg ada po hid ólisis y es eliminado del o ganismo a a és del ciclo de K ebs como dióxido de ca bono y agua, po lo an o, han sido u ilizados con éxi o como memb anas eabso bibles pa a la egene ación ósea guiada. Además es á ap obado po la FDA (Food and D ugs Adminis a ion, EE.UU.) pa a mul i ud de aplicaciones, po lo que son u ilizados comúnmen e en in es igaciones biomédicas51. Ac ualmen e, los polilác icos, poliglicólicos y sus copolíme os y de i ados son los políme os biodeg adables más comúnmen e usados en ingenie ía isula , y el copolíme o PLGA p esen a mejo es p opiedades de deg adación con olada que sus cons i uyen es monomé icos213. Sin emba go, el p opio políme o es bas an e bioine e y no p omue e una espues a biológica signi ica i a en las células óseas214. Algunos au o es discu en sob e su biocompa ibilidad po que los p oduc os de i ados de su deg adación disminuyen el pH causando in lamación y eacción a cue po ex año in i o215. Además los p oduc os de la deg adación ácida ienen el po encial de inhibi la o mación de c is ales de apa i a216, inhibiendo a p io i la os eoin eg ación. Sus p opiedades hid o óbicas in luyen nega i amen e en la adhesión celula , sin emba go pa a in en a educi la in lamación y mejo a la biocompa ibilidad del PLGA, se han añadido di e en es pa ículas con esul ados muy posi i os en el PLGA: Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 118 - nanopa ículas de i anio195, 217, pa ículas de hueso desmine alizado215, y pa ículas de nanoapa i a218. De es a o ma se han desa ollado di e en es ma e iales a base de PLGA en o ma de sca olds, ilms, memb anas, y nanopa ículas. Las mejo as en el PLGA hace que cuando se u ilizan como memb anas es én dando muy buenos esul ados en los p ocesos de egene ación ósea, y además se le es án inco po ando nue os ma e iales pa a mejo a algunos de los pun os débiles an es mencionados219-221. Los sca olds se usan pa a egene a ejidos jun o con células mad es, y las nanopa ículas de PLGA han demos ado un amplio bene icio en los campos de la endodoncia, ca ies, ci ugía, implan es y pe iodoncia222. Como sca olds se pueden u iliza solos, como anspo ado es de células o de á macos223. En e sus muchos campos de ac uación es án la egene ación del ejido ca diaco, la cia ización y la egene ación ósea. En e sus aplicaciones es án las de anspo a hBMP-2 pa a p omo e la egene ación ósea224, añadi sim as a ina que mejo a la o mación ósea225 y la u ilización de be a os a o icálcico226 que mejo a las p opiedades del ma e ial. A ni el mic oscócpico, di e en es é minos han sido u ilizados pa a desc ibi a las nanopa ículas: nano ehículos, nanosis emas, nano ubos y nanoc is ales. En e sus en ajas es á que pene an ácilmen e en las celulas, aumen a la e iciencia del á maco y mejo a la ac i idad an ibac e iana del medicamen o227. El concep o de u iliza sis emas que man engan concen aciones e apéu icas de medicamen os ha sido es udiado du an e décadas con el obje o de minimiza los e ec os de los á macos lib es228. Las mic o y nanopa ículas son los sis emas p e e idos po su lexibilidad en la p epa ación y uso229. Una amplia a iedad de sus ancias han sido añadidas al PLGA pa a que se libe en len amen e y ayuden en el a amien o pe iodon al y egene a i o: amoxicilina230, e aciclina231, clo hexidina232 y co icoides como la dexame asona233 y odos con esul ados espe anzado es. En gene al, los p ocesos de adición de ac o es de p omoción ósea o bioma e iales a las memb anas de PLGA pa ecen mejo a los esul ados195, 234, 235 en la egene ación del ejido óseo. Como en el caso nues o que la adición de SiO2 y el Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 119 - a amien o con plasma de oxígeno p omue e más la egene ación ósea que las memb anas de PLGA solas. Además de sus p opiedades bioac i as, las ca ac e ís icas de la supe icie son muy in luyen es pa a la adhesión y el c ecimien o celula y deben se es udiadas con esme o a la ho a de plan ea el paso de un bioma e ial a un medio ambien e biológico, donde cie a hid o ilicidad en los ma e iales ayuda á a las conexiones en e las células y el sca old pa a con ola la adhesión celula y man ene las exp esiones eno ípicas de di e enciación20. El es mecánico ambién debe de desa olla se bajo condiciones isiológicas, ya que odos los sca olds se desa ollan pa a se usados en un cue po i o donde hay mul i ud de luidos isula es y una empe a u a de 37°C71 . Según Liao, el PLGA iene un excelen e módulo de elas icidad que es equi alen e al de los ligamen os in e óseos236 que le con ie e unas excelen es p opiedades mecánicas. En cuan o a las pe spec i as sob e es e ipo de ma e iales, es e iden e el g an a ance cien í ico y ecnológico que ha aído consigo la incu sión de los biopolíme os en el á ea de la salud, al pe mi i una mejo a sob e los sis emas e apéu icos con encionales en a as de ob ene líneas de abajo enden es a log a e apias in eligen es a la medida de cada pacien e o si uación pa ológica. Nues o sca old de polilác ico-co-poliglicólico en o ma de memb anas ha esul ado de ácil manejo y manipulación, no obse ándose desplazamien o as la implan ación. Así mismo, no se obse ó in lamación ano mal ni signos cla os o sín omas de ale gia, eacción inmunológica o incompa ibilidad en ninguno de los de ec os as el pe iodo de eposo analizado, el ma e ial implan ado ue bien ole ado po el ejido blando subyacen e sin e idencias de nec osis, conside ándose po an o al PLGA como al e na i a iable y ecomendable pa a los p ocesos de ROG in si u. Los de ec os si uados en el c áneo y la ca a, en con as e con o os huesos co po ales, necesi an de ma e iales de deg adación ápida de al ededo de semanas, pa a una co ec a abso ción y de es a o ma acili a el c ecimien o y egene ación del ejido óseo donde son implan ados. No obs an e, odo el ma e ial implan ado debió se p og esi amen e deg adado du an e el p ime pe íodo de egene ación y o almen e eemplazado po el nue o ejido en egene ación, ya que as cua o semanas no se Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 120 - obse a on e idencias del mismo en los co es his ológicos as los análisis de Von Kossa y azul de oluidina, lo que sugie e la biocompa ibilidad azonable del mismo151. Tal y como se ha ema cado an e io men e, los eque imien os de los sca olds pa a ROG son muy complejos, ya que deben ene en cuen a mul i ud de a iables pa a un co ec o compo amien o del ma e ial en el ejido implan ado y lle a a cabo la unción pa a la cual es á diseñado150, 237-239. Impo ancia de la ugosidad y del plasma de oxígeno Los p ocesos po los que se p oduce la adhesión celula es án de e minados po las p opiedades ísicas y químicas de su supe icie. La adhesión que se p oduce al inicio en e una célula y la supe icie del bioma e ial de e mina á los siguien es p ocesos como mo ología, mig ación, p oli e ación y di e enciación163. Una ez que se ha p oducido la adhesión celula , la o mación de la capa de apa i a se e á de e minada po la ex u a y uncionalidad de la supe icie del ma e ial, incluyendo la o ien ación c is alina del sílice supe ical171. Es muy in e esan e de e mina de o ma aislada el papel que juega cada una de las p opiedades supe iciales de los bioma e iales. Sin emba go, las supe icies son muy he e ogéneas po los di e en es ipos de g upos químicos uncionales, ex u a, ugosidad y á eas hid o ílicas e hid o óbicas. El es udio del e ec o causado po cada una de es as p opiedades es complejo, po que además la modi icación de alguna de ellas iene e ec o en alguna o a. Tan impo an e como la composición química de la supe icie, es la mic o y nano- opog a ía de la supe icie240,241. Es po ello que hemos u ilizado una supe icie nano ugosa ab icada a a és de plasma de oxígeno. Dimensiones meno es a la mic a in luyen en los con ac os ocales, el ci oesquele o, la adhesión, la mo ología y la o ien ación de las células242. En el ango de 1-100 mic as la supe icie ugosa in luye en las células sob e su adhesión, mo ología, o ien ación y o mación ósea242. En in e alos mayo es a 100 mic as, los cambios son muy impo an es pa a la mic o- e ención243. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 121 - En la os eogénesis, son muy impo an es las p ime as ases de cica ización como es la o mación del coágulo. Una ez que se o ma és e, po adso ción se pegan al elemen o de sopo e una g an a iedad de p o eínas sob e su supe icie. Las p o eínas es án o madas po pép idos y a su ez po aminoácidos que son las biomoléculas más pequeñas. Po ello podemos en ende que la adso ción de p o eínas sob e la supe icie es un ac o que de e mina su buena biocompa ibilidad. Es as p o eínas las podemos en ende como ligandos especí icos pa a cada célula que p omo e án gené icamen e la quimio axis, p oli e ación, c ecimien o y di e enciación celula 244. Es as p o eínas que p o ienen del plasma o sue o del pacien e ienen una g an impo ancia en la adhesión de las plaque as, libe a án una g an can idad de ac o es de c ecimien o y quimio ác icos que da án luga a la p oli e ación y di e enciación de células os eogénicas, po lo que la adso ción de p o eínas a las que se adhie en plaque as es un ac o os eoconduc i o muy impo an e186, 245, 246. Algunas de las p o eínas que se unen son ib onec ina, i onec ina, elas ina, laminina y colágeno que ienen un especial in e és en la o mación de la malla de ib ina del coágulo. Es as p o eínas se unen especí icamen e a las células os eogénicas de una mane a única g acias los ecep o es de memb ana. G acias a es os ecep o es podemos plan ea nos el uso de p o eínas especí icas de os eoblas os y hui de adhesiones inespecí icas o de células de ejido blando186, 245. Una ez se ha o mado la malla de ib ina (g acias a la adso ción de la ib onec ina), los os eoblas os se pod án adhe i a és a y mig a po es e sca old idimensional y llega al me al donde comenza án a deposi a la ma iz o gánica de colágeno que se i á mine alizando poco a poco. A es a unión a modo de in e diga ación mic o-mecánica se le conoce como cemen line. Po eso una supe icie ugosa a la que se pueda adhe i más ácilmen e las células es c ucial pa a que se o me la ma iz ósea po la que se pega á a la supe icie de la memb ana186, 245, 246. Un diseño adecuado de la opog a ía de la supe icie de la memb ana puede mejo a su po encial adhesi o y la capacidad de las células pa a uni se a la in e az sus a o-célula; y ayuda a di igi y a o ganiza la adhesión y la di e enciación de las células óseas con el in de acili a una buena egene ación del ejido43. A su ez, la calidad de la adhesión celula es á elacionada con la mo ología de las células y su Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 128 - o iginal p eexis en e en la calo a, pa ece e iden e que la memb ana con nanocomposi es de óxido de silicio y p e a amien o con plasma de oxígeno iene mayo po encial os eo egene ado en e al con ol75. Los ensayos de ma caje con calceína mues an la p ueba más concluyen e del es udio, mos ando el doble de milíme os de mine al neo o mado en los de ec os egene ados con las memb anas con plasma y silicio espec o a los de ec os con oles. Po an o, el a amien o con plasma de oxígeno (P-O2) en las memb anas de es e abajo pa ece aumen a la capacidad os eoinduc o a de las mismas, impulsada po los nanocomposi es de óxido de silicio, da o que queda espaldado ambién en los análisis de la os a asa ácida (TRAP). Todas las memb anas es udiadas son biocompa ibles. En odos los casos se encon a on una capa de ejido co ical denso endoc aneal jun o con una capa de hueso espeso exoc aneal, que p opo cionan una g an es abilidad al hueso neo o mado195. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 129 - 8. CONCLUSIONES Las conclusiones ob enidas en nues o es udio, en base a los es udios de expe imen ación animal ealizada in i o en conejos aza New-Zeland median e ensayos de egene ación ósea guiada (ROG) son las siguien es: 1. Las memb anas de ácido polilác ico-co-poliglicólico modi icadas a escala nanomé ica con óxido de silicio y p e a amien o ísico de plasma de oxígeno (SiO2/PLGA +P- O2), en compa ación a los con oles sin es as modi icaciones (PLGA sencillo), p esen an un endimien o más adecuado, disminuyendo no ablemen e las di e encias es uc u ales de los de ec os cica izados y es udiados un mes as la in e ención qui ú gica espec o al hueso o iginal p eexis en e, en es e g upo en e al g upo con ol. 2. La adición de nanocomposi es de óxido de silicio jun o con el p e a amien o ísico de plasma de oxígeno a las memb anas sencillas de PLGA iene como e ec o, mos ado cla amen e en los esul ados de nues o es udio, un aumen o de la capacidad egene ado a del ejido óseo en los de ec os es udiados: densidad ósea, po cen aje de hueso neo o mado, ac i idad os eoblás ica y ac i idad os eoclás ica. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 130 - 3. No se han obse ado signos de in lamación isula ano mal, eacción alé gica o incompa ibilidad ísica o química de ningún ipo en ninguna de las mues as analizadas, po lo que puede a i ma se que las memb anas es udiadas son biocompa ibles con el ejido óseo sob e el que se han u ilizado. 4. A aíz de nues os esul ados, es aconsejable la ealización de u u os es udios pa a a anza en una posible aplicación de las memb anas desa olladas en egene ación ósea guiada en humanos. Tesis Doc o al An onio Ba is a C uzado - 131 - 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Bu ge EH, Klein-Nulend J, Van de Plas A, Nijweide PJ. Func ion o os eocy es in bone - hei ole in mechano ansduc ion. J Nu . 1995;125:2020S-3S. 2. Duncan RL, Tu ne CH. Mechano ansduc ion and he unc ional esponse o bone o mechanical s ain. Calci Tissue In . 1995;57:344-58. 3. Ma o i G, Palumbo C. The mechanism o ansduc ion o mechanical s ains in o biological signals a he bone cellula le el. Eu opean Jou nal o His ochemis y. 2007;51:15-20. 4. 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