Efecto en la regeneración ósea guiada de una membrana de PLGA modificada a nivel microtopográfico con plasma de oxígeno y funcionalizada con una capa inorgánica de óxido de silicio

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA TESIS DOCTORAL EFECTO EN LA REGENERACIÓN ÓSEA GUIADA DE UNA MEMBRANA DE PLGA MODIFICADA A NIVEL MICRO-TOPOGRÁFICO CON PLASMA DE OXÍGENO Y FUNCIONALIZADA CON UNA CAPA INORGÁNICA DE ÓXIDO DE SILICIO ANTONIO BATISTA CRUZADO SEVILLA, 2015 ABREVIATURAS %: Porcentaje 3D: Tres dimensiones ADN: Ácido desoxirribonucleico AK: Anticuerpo ALP: Fosfatasa alcalina ATP: Adenosín trifosfato BG: Vidrios bioactivos BMUs : Unidades óseas multicelulares BT: Azul de toluidina Cel: Célula CO2: Dióxido de carbono D: Día H: Hidrogeno HA: Hidroxiapatita IT: Ingeniería tisular MEC: Matriz extracelular MG: May Growmball-Giemsa Mm: Milímetro OB: Osteoblasto OC: Osteoclasto OPG: Osteoprogeterina OSS: Óseo PET: Tereflalato de Polietileno PLGA: Ácido poliláctico-co-poliglicólico P-O2: Plasma de oxígeno RANK: Receptor activador del factor nuclear RANKL: Ligando de receptor activador para el factor nuclear ROG: Regeneración ósea guiada RTG: Regeneración tisular guiada SEM: Microscopía electrónica de barrido Sem: Semana Si: Silicio SiO2: Óxido de silicio Tº: Temperatura Ti: Titanio TiO2: Óxido de Titanio TRAP: Fosfatasa ácida tartrato de sodio resistente VK: Von Kossa A mis padres y a Blanca, por hacerme rico en valores, en estudios, en cultura y en cariño. La sencillez como personas es un grado reservado sólo a los que viven una vida plena y da muestra de la mucha inteligencia que encierran en su interior. AGRADECIMIENTOS Daniel Torres Lagares: Director incansable de trabajos y estudios. Referente de persona trabajadora y del camino docente. Profesor volcado en el trabajo en equipo, llegando a superponer el interés colectivo al personal. Muchas gracias por tu apoyo y por tu dedicación. Gabriel Castillo Dalí: Director emprendedor, trabajador innegable, siempre en busca de recursos y con nuevas ideas que aportar. Muchas gracias por contribuir con tu conocimiento y por tus muchas horas de trabajo. José Luis Gutiérrez Pérez: Hombre de múltiples aptitudes y valores. Líder innato y comprometido con la sociedad, pensador perenne y velador de las cosas bien hechas. Muchas gracias por las puertas abiertas. Pablo Galindo Moreno: Profesor enamorado de la docencia hasta límites incalculables. La formación y la investigación es su razón de ser. Sin su compromiso como profesor nunca habría conocido la magnificencia de la Odontología. Muchas gracias por el camino que hemos recorrido juntos y por ser un buen amigo. Elena Sánchez Fernández: A mi primera profesora de Cirugía Bucal muchas gracias por transmitirme el amor hacia esta gran carrera y por ser nexo de unión entre Granada y Sevilla. José Liébana Ureña: Maestro de Maestros, benditas sean las ramas que al tronco salen. Nunca olvidaré el origen. Muchas gracias por recoger el germen y sembrarlo a buen recaudo. Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva: Muchas gracias a todos los responsables institucionales, equipo veterinario y personal auxiliar que hicieron posible la experimentación animal. Blanca Moreno Manteca: Por su complicidad, por su apoyo y por su comprensión. Por llenarme de luz cuando no veía el final del camino y por darme fuerzas cuando ya escaseaban. No existen suficientes expresiones de gratitud porque lo bello al corazón es difícil a la palabra. Muchas gracias por tu gran ayuda. Mis padres y mis hermanos: A mi familia que siempre unida y apoyándonos los unos en los otros hemos conseguido crecer y superar los obstáculos de la vida. Mi alegría es que mis pasos os llenen de orgullo. Equipo de Cirugía Bucal de Sevilla: Gracias por recibirme en vuestro equipo con los brazos abiertos y haberme hecho uno más entre vosotros. Compañeros de Granada: Gracias a todos los que me antecedieron y con su ejemplo me ayudaron: Miguel, Gustavo, Ildefonso, etc. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 8 - ÍNDICE CERTIFICADO DE DIRECTOR Y CO-DIRECTOR FIRMADO ... ¡Error! Marcador no definido. ABREVIATURAS ........................................................................................................ 3 AGRADECIMIENTOS .................................................................................................. 6 ÍNDICE ...................................................................................................................... 8 1. RESUMEN ....................................................................................................... 11 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 15 2.1. Biología ósea ..................................................................................................................... 15 Desarrollo ................................................................................................................................ 15 Células óseas ........................................................................................................................... 16 Composición del hueso ............................................................................................................ 17 Modelado y remodelado ......................................................................................................... 19 Cicatrización ósea ................................................................................................................... 21 2.2. Regeneración ósea guiada (ROG) ..................................................................................... 22 Concepto ................................................................................................................................. 22 Membranas ............................................................................................................................. 24 Injertos óseos .......................................................................................................................... 27 Factores de crecimiento utilizados en la reparación del hueso .............................................. 33 2.3. Biomaterial ........................................................................................................................ 35 Biomateriales en medicina y odontología............................................................................... 36 Evolución de los biomateriales ................................................................................................ 38 Mecanismos para el desarrollo de nuevos tejidos .................................................................. 41 Citotoxicidad de los biomateriales .......................................................................................... 42 Necesidad de ensayos celulares y animales. ........................................................................... 44 2.4. Polímeros .......................................................................................................................... 45 Polímeros naturales ................................................................................................................ 46 Polímeros sintéticos ................................................................................................................ 46 PLGA. Diseños morfológicos ................................................................................................... 49 Técnicas de elaboración de andamios poliméricos para ingeniería de tejidos ....................... 52 Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 9 - Aplicaciones biomédicas y farmacológicas de los polímeros .................................................. 57 2.5. Iones inorgánicos. SiO2 ...................................................................................................... 61 Rol de los iones inorgánicos en el metabolismo óseo. ............................................................ 63 Vidrios bioactivos basados en SiO2 ......................................................................................... 65 2.6. Nanomedicina aplicada a la regeneración tisular ............................................................. 67 Importancia de las matrices tridimensionales ........................................................................ 68 Importancia de la superficie y la interfaz sustrato–matriz extracelular ................................. 69 2.7. Funcionalización del PLGA ................................................................................................ 71 Técnica de funcionalización superficial de la membrana de PLGA ......................................... 73 El plasma de oxígeno .............................................................................................................. 74 Dióxido de silicio...................................................................................................................... 74 3. HIPÓTESIS ....................................................................................................... 77 4. OBJETIVO ........................................................................................................ 78 4.1 Objetivo general ................................................................................................................ 78 4.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 78 5. MATERIAL Y MÉTODO ................................................................................. 795.f 5.1. Material ............................................................................................................................. 79 Membranas de estudio. ......................................................................................................... 79 Fabricación de las membranas de estudio. ............................................................................ 79 Ejemplares para la experimentación animal.......................................................................... 82 5.2. Método ............................................................................................................................. 83 Descripción del estudio. .......................................................................................................... 83 Procedimiento quirúrgico. ....................................................................................................... 83 Sacrificio .................................................................................................................................. 86 Procesamiento de las muestras. ............................................................................................. 87 Estudio morfométrico. ............................................................................................................ 94 Análisis estadístico. ............................................................................................................... 102 6. RESULTADOS ................................................................................................. 103 6.1. Evaluación cualitativa de la estructura y densidad ósea global...................................... 103 6.2. Nivel de regeneración ósea (porcentaje óseo neoformado) .......................................... 104 6.3. Superficie ósea mineralizada (milímetros hueso neoformado por día) ......................... 106 6.4. Actividad resortiva (número de osteoclastos por milímetro). ........................................ 107 Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 16 - osteoblastos, proceso conocido como osteogénesis intramembranosa. Por el contrario, el cóndilo, los huesos largos y las vértebras se forman inicialmente a través de una plantilla de cartílago, que sirve como un esbozo que es gradualmente reemplazado por hueso. La formación cartílago dependiente se conoce como crecimiento endocondral8. El hueso perdido como resultado de una lesión, enfermedad o trauma atraviesa un proceso de reparación que es esencialmente una combinación de procesos osteogénicos intramembranos y endocondrales9. Células óseas Dentro del hueso es posible identificar diferentes componentes celulares como las células precursoras de la osteogénesis, los osteoblastos, osteoclastos, osteocitos y los elementos hematopoyéticos de la médula ósea. Las tres principales células responsables de la homeostasis del esqueleto son:  Los osteoblastos: Son las células responsables de la formación de los huesos. Derivan de las células osteoprogenitoras de la médula ósea y son responsables de la síntesis de la matriz ósea inmadura conocida como osteoide. Sintetizan los componentes de la matriz orgánica y median en la mineralización de la matriz. Se localizan en las superficies óseas y realizan la deposición de la matriz activa, y cuando dicha actividad llega a su fin, algunos de ellos se diferencian en osteocitos, mientras que otros permanecen en las superficies del periositio o endostio como células de revestimiento del hueso. Las células de revestimiento son células alargadas que cubren una superficie de tejido óseo y no muestra actividad sintética10.  Los osteocitos pueden ser definidos como los orquestadores del proceso de remodelación del hueso. Poseen formas estrelladas y se encuentran atrapados dentro de la matriz ósea mineralizada en unos espacios conocidos como lagunas. Mantienen una red de procesos citoplasmáticos Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 17 - conocidos como dendritas. Dichas proyecciones citoplasmáticas osteocíticas se extienden a través de compartimentos cilíndricos encerrados denominados como canalículos. A través de éstos llegan a diferentes áreas contactando con vasos sanguíneos y con otros osteocitos. La red de osteocitos es, por lo tanto, un canal de comunicación que es sensible al potencial de membrana debido al estrés causado por la dirección de fluido dentro de los espacios de los canalículos como resultados de los estímulos mecánicos. Las señales mecánicas son traducidas en mediadores bioquímicos que contribuyen a la orquestación de eventos anabólicos y catabólicos dentro del hueso. Esta disposición le permite a los osteocitos participar en la regulación de la homeostasis del calcio en la sangre, detectar la carga mecánica y transmitir dicha información a otras células dentro del hueso para posteriormente orquestar funciones osteoblásticas y osteoclásticas11.  Los osteoclastos son células especializadas multinucleadas que se originan en la línea hematopoyética de monocitos-macrófagos. Estas células tienen capacidad para desarrollarse y adherirse a la matriz ósea para luego secretar ácido y enzimas líticas que degradan y descomponen los minerales y componentes orgánicos del hueso y del cartílago calcificado. El proceso de degradación de la matriz da como resultado la formación de un compartimento extracelular especializado conocido como la laguna de Howship10. Composición del hueso El hueso es un tejido conjuntivo especializado que está compuesto de elementos orgánicos e inorgánicos. La matriz orgánica del hueso constituye aproximadamente el 30-35% del peso total del hueso y está formado por un 90% de colágeno tipo I. El 10% restante se compone de proteínas no colágenas, proteoglicanos, glicoproteínas, hidratos de carbono y lípidos. La matriz orgánica es sintetizada por los osteoblastos y Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 18 - cuando aun se encuentra sin mineralizar es conocida como osteoide. Dentro de las fibras de colágeno, se produce la deposición de los iones de calcio y fosfato que se establecen y forman, en última instancia, cristales de hidroxiapatita. Las proteínas no colágenas ayudan a la propagación del mineral y la mineralización completa de la matriz. La iniciación de la nucleación mineral dentro del osteoide se produce dentro de unos pocos días de la secreción, pero la terminación y la maduración son completadas en el transcurso de varios meses. Además de proporcionar al hueso la resistencia y la rigidez para proteger los órganos sensibles, la mineralización del osteoide permite el almacenamiento de minerales que contribuyen a la homeostasis sistémica (Figura 1). Figura 1: La tasa de formación de hueso puede ser analizada mediante el uso de fluorocromos. La calceína en verde marca el frente de mineralización cuando se administra a intervalos diferentes Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 19 - Modelado y remodelado El hueso es un tejido altamente dinámico que posee la capacidad de adaptarse según las necesidades fisiológicas. Por lo tanto, el hueso ajusta sus propiedades mecánicas de acuerdo a los requerimientos metabólicos y mecánicos12. El mecanismo de adaptación esquelética es realizado principalmente por procesos de reabsorción y formación ósea denominada generalmente como remodelación ósea. El hueso es reabsorbido por los osteoclastos y a continuación es depositado por las células osteoblásticas13. Desde la perspectiva del remodelado óseo, se ha propuesto que los osteoclastos pueden reconocer y dirigirse a los sitios del esqueleto que tienen una integridad comprometida e iniciar el proceso de remodelado óseo con el propósito de inducir la regeneración ósea14 (Figura 2). Figura 2: Remodelado óseo. El proceso de remodelado óseo tiene lugar en las unidades ósea multicelulares (BMUs) Una BMU está compuesta por un frente de osteoclastos que residen en la superficie del hueso recién reabsorbido denominado frente de reabsorción; un compartimento que contiene vasos y pericitos y, una capa de osteoblastos presentes en la matriz orgánica recién formada conocida como frente de deposición. El número de unidades óseas multicelulares nuevas y activas están reguladas por una amplia variedad de hormonas y citosinas, las cuáles determinan la sincronización espacio-temporal y la conexión de los elementos anabólicos y catabólicos de remodelado (Figura 3). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 20 - Figura 3: El frente de reabsorción se vincula la tinción de las células con fosfatasa ácida tártaro-resistente (TRAP). Uno de los mecanismos de conexión mejor estudiados en el remodelado óseo es la activación de los osteoclastos mediada por el ligando de receptor activador para el factor nuclear (RANKL). RANKL es una citosina producida por los osteoblastos y otras células y reside en la superficie de dichas células. Las células producen RANKL en respuesta a hormonas sistémicas y citosinas (IL-6). El contacto celular entre las células que expresan RANKL y de precursores de los osteoclastos que expresan el receptor activador del factor nuclear (RANK) induce la diferenciación, fusión y activación de los osteoclastos. La modulación de este mecanismo de unión se produce a través de una molécula conocida como osteoprogesterina (OPG). La OPG se une al RANKL antes de que tenga oportunidad de unirse al RANK. Por lo tanto, la OPG suprime la capacidad de aumentar la reabsorción ósea. La OPG ha sido propuesta como un agente terapéutico activo para el tratamiento de trastornos óseos, particularmente la osteoporosis, ya que representa un mecanismo seguro y controlado para modificar la tasa de remodelación ósea (Figura 4). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 21 - Figura 4: Conexión entre formación y reabsorción ósea. Cicatrización ósea La cicatrización de un tejido lesionado conduce a la formación de un tejido que difiere en la morfología o función del tejido original. Este tipo de cicatrización se llama reparación. La regeneración tisular, por otro lado, es un término más utilizado para describir la cicatrización que conduce a la completa restauración de la morfología y función del tejido dañado. La cicatrización del tejido óseo incluye tanto fenómenos de regeneración como de reparación, dependiendo del carácter de la lesión. Por ejemplo, una fractura ósea adecuadamente estabilizada cicatrizará mediante regeneración, mientras que un defecto mayor en el hueso a menudo cicatrizará mediante reparación. Existen ciertos factores que pueden interferir en la formación de tejido óseo después de una lesión como: 1. Fracaso de la vascularización en la herida. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 22 - 2. Inadecuada estabilización del coágulo y del tejido de granulación en el defecto. 3. Crecimiento interno de tejidos no óseos con una alta actividad proliferativa. 4. Contaminación bacteriana. La cicatrización de una herida incluye cuatro fases: 1. Coagulación de la sangre. 2. Limpieza de la herida. 3. Formación de tejido. 4. Modelado y remodelado tisular. Dichas fases se producen en una secuencia ordenada pero pueden superponerse en un sitio dado de tal manera que, en algunas áreas de la herida, el tejido en formación puede estar en progreso, mientras que en otras áreas el modelado de tejidos es el evento que predomina. 2.2. Regeneración ósea guiada (ROG) Aunque el tejido óseo posee un gran potencial de regeneración y puede recuperar su estructura y función originales por completo, algunos defectos óseos a menudo no pueden lograr cicatrizar mediante tejido óseo de forma completa. Para solventar este problema hay descritas diferentes técnicas bajo el nombre de regeneración ósea guiada con el fin de facilitar y mejorar la cicatrización ósea. Concepto La ROG es una técnica quirúrgica que persigue la formación de hueso nuevo para el relleno de defectos óseos perimplantarios, o en áreas óseas deficitarias. Esta técnica Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 23 - está indicada en todos aquellos procedimientos quirúrgicos en los que las condiciones para la regeneración ósea estén limitadas o se prevea dificultosa, con el fin de resolver el problema que aparece a partir de la existencia de una velocidad de crecimiento diferente entre los distintos tipos de tejido. Melcher estudió el potencial regenerativo del periodonto. Distintos estudios han concluido que sólo el ligamento periodontal y el hueso son capaces de conseguir una regeneración de los tejidos periodontales15, 16. El proceso de ROG fue descrito por Gottlow17, y consistía en eliminar de la zona quirúrgica todos los tejidos que no favorecen la regeneración ósea por medio de membranas que impiden el contacto de la herida ósea con el epitelio y el tejido conectivo. La oclusión celular de la membrana evita la migración de células epiteliales y conectivas con una velocidad de crecimiento superior a la de las células óseas al interior del defecto óseo, preservándolo para su colonización por las células óseas y permitiendo así la regeneración del defecto óseo. Este proceso se basa en el uso de barreras o membranas físicas para evitar que las células del epitelio gingival y del tejido conjuntivo invadan durante la cicatrización las zonas que van a ser regeneradas. De esta forma se favorece que las células osteoprogenitoras puedan proliferar para formar hueso nuevo. Como resultado de los experimentos con animales y aplicaciones clínicas en seres humanos, la regeneración ósea guiada se ha convertido en un método aceptado clínicamente para el aumento óseo en situaciones con un inadecuado volumen para la colocación de implantes dentales. El defecto óseo, a diferencia del periodontal, no involucra la participación de epitelio invadiendo la zona de regeneración. Como consecuencia, en la ROG la membrana utilizada separa dos espacios que contienen células mesenquimáticas pluripotenciales, capaces de generar de manera equivalente tanto tejido óseo como tejido fibroso18, 19. En esta técnica, la membrana proporciona protección adicional a la herida, disminuyendo el choque de las fuerzas que inciden sobre ella y garantizando la diferenciación de las células mesenquimatosas hacia osteoblastos, en lugar de hacia fibroblastos. Un defecto con paredes óseas conservadas (defecto cerrado) puede cicatrizar con el simple uso de hueso autólogo, siempre que el mismo, conjuntamente con el coágulo de sangre permanezca estable dentro del espacio a regenerar. En un Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 24 - defecto con ausencia de una o más paredes óseas (defecto abierto), la regeneración puede ser obstaculizada debido a factores como la falta de espacio causado por el colapso de tejidos superficiales, o la inestabilidad del coágulo debido a micromovimientos durante la fase de cicatrización. En estos casos la membrana además de cumplir con la función de barrera mecánica, cumple con la función de mantenedor de espacio, creando a nivel del defecto óseo un ambiente cerrado delimitado por un lado por las paredes óseas residuales y del otro lado por la membrana que sirve de pared provisional durante el período de cicatrización. Este ambiente debe ser espacioso y protegido, de manera que el coágulo sea estable en las primeras fases de cicatrización y de esta forma no se interrumpa el proceso de regeneración ósea. Mientras menor es el número de paredes óseas residuas, mayor será la necesidad de emplear biomateriales osteoinductivos. Por otra parte, los injertos de hueso autólogo representan la alternativa más adecuada para reparar defectos óseos complejos. Dado que las membranas en las que basamos nuestro estudio están orientadas a futuras aplicaciones clínicas de regeneración ósea guiada (ROG) in vivo, su desarrollo responde a una técnica en la que hay que sopesar varios factores: la absorción de la membrana debe producirse en el plazo adecuado para la regeneración; el proceso de absorción debe realizarse con una reacción inflamatoria mínima compatible con la regeneración; y la pérdida de distintos grupos de polímeros deben afectar lo menos posible al pH para no influir en el proceso de reparación. Resultados clínicos positivos con ácido poliláctico, poligalactina o poliglicólico en diversos grados han sido descritos por diferentes autores18. Membranas Las membranas oclusivas que se usan en ROG podemos clasificarlas en diferentes grupos según su naturaleza y degradación. Según su capacidad reabsortiva podemos diferenciarlas en membranas reabsorbibles y no reabsorbibles, y dentro de cada uno de estos apartados tenemos las que son de origen animal y las sintetizadas en Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 25 - laboratorio. En nuestro estudio nos centraremos en las membranas reabsorbibles sintéticas, en concreto en las de PLGA. Membranas Reabsorbibles Sintéticas Son películas de biomateriales poliméricos de naturaleza orgánica usados como barrera en el tratamiento de defectos óseos críticos que son difícilmente recuperables de manera óptima. Las características ideales de las membranas reabsorbibles según Scantlebury20 son:  Biocompatibilidad.  Integración tisular.  Oclusión celular.  Manejabilidad clínica.  Mantenimiento del espacio. Presentan las características de ser biodegradables y ser reabsorbidas por el propio organismo sin generar una respuesta inmune de rechazo19. Estas membranas a su vez, actúan como matrices que permiten el crecimiento de las células en su interior, y están diseñadas para inhibir o retardar la migración apical del tejido conjuntivo durante la fase de cicatrización. Este efecto es el resultado del fenómeno conocido como “inhibición por contacto”, reduciéndose así la formación de bolsas en la superficie externa de la membrana. Se ha demostrado además una buena adhesión y vascularización de los tejidos en los que se hallan colocadas. El empleo de membranas reabsorbibles es necesario para evitar una segunda cirugía invasiva para retirar la membrana no absorbible que puede dañar el tejido en regeneración y producir inflamación indeseada. Una de las razones para el uso de membranas reabsorbibles sintéticas en lugar de las de origen animal como las de colágeno es evitar el miedo y rechazo por parte de los pacientes, que suele ser habitual, a una probable infección cruzada. Así mismo, Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 32 - Con frecuencia, ocurre que los tres mecanismos básicos de formación ósea están implicados en la regeneración del hueso. De hecho, la osteogénesis sin osteoconducción y osteoinducción es poco probable que ocurra ya que casi ninguna de las células transmitidas mediante los injertos de hueso esponjoso autógeno sobrevive al trasplante. Así, el material de injerto funciona predominantemente como una plataforma para invadir las células del huésped. Además, los osteoblastos y osteocitos del hueso circundante carecen de la capacidad de migrar y dividirse, lo que a su vez significa que el trasplante es invadido por células mesenquimales no involucradas que más tarde se diferencian en osteoblastos. Sobre esta base, es apropiado definir tres condiciones básicas como prerrequisito para la regeneración ósea. 1. Suministro de células formadoras de hueso o de aquéllas que son capaces de diferenciarse en células formadoras de hueso. 2. Presencia de estímulos osteoinductivos para iniciar la diferenciación de células mesenquimales en osteoblastos. 3. Presencia de un entorno osteoconductivo que forme un andamiaje sobre el que pueda proliferar el tejido invasor y en donde células osteoprogenitoras estimuladas puedan diferenciarse en osteoblastos y formar hueso. Actualmente, varios productos biológicamente activos están disponibles con la intención de mejorar la proliferación y diferenciación celular, permitiendo un proceso de señalización anabólica más rápida y predecible entre el injerto y el huésped (Tabla 1). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 33 - Tabla 1: Distintos materiales utilizados en ROG. Factores de crecimiento utilizados en la reparación del hueso En el mismo momento que se hace la incisión quirúrgica, un coágulo de sangre se forma en el sitio de la herida, liberando factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-B) provenientes de la degranulación plaquetaria30, 31. Estos mitogénicos atraen a células madre mesenquimales (MSC) y a fibroblastos para que emigren al sitio de la herida ósea y estimulen la proliferación y la diferenciación de precursores osteoblásticos32. El proceso de neogénesis tisular es seguido por la formación de un tejido de granulación que constituye una fuente de futuras células de tejido conjuntivo, tales como osteoblastos, fibroblastos del ligamento periodontal o Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 34 - cementoblastos33. Para la regeneración del hueso alveolar, las células mesenquimales son transformadas en células osteoprogenitoras mediante la expresión localizada de BMP34. Los enfoques en la cicatrización de heridas usando factores de crecimiento que tengan como propósito la restauración del hueso que soporta el diente, el ligamento peridontal y el cemento, han avanzado el campo de la medicina regenerativa oral y periodontal. Varios estudios en la reconstrucción oral y craneofacial han evaluado el impacto de las estrategias de transporte de los factores de crecimiento usando células productoras del factor de crecimiento, proteínas o genes que codifican los factores de crecimiento35. La Figura 5 destaca los diversos sistemas de transporte, biomateriales de injerto y reemplazo óseo y factores de crecimiento utilizados clínicamente. Los avances en la clonación molecular han puesto a disposición cantidades ilimitadas de factores de crecimiento óseos recombinantes para aplicaciones en la ingeniería de tejidos del complejo facial incluyendo el hueso alveolar. Factores de crecimiento recombinantes conocidos por promover la cicatrización de la piel y los huesos, tales como PDGF36,37, factores de crecimiento similares a la insulina (IGF)38,39, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF)40 y BMP41 se han utilizado en ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de defectos óseos periodontales grandes, así como alrededor de implantes dentales14,30. La BMP-2 está actualmente aprobada por la FDA para la reparación local de la cresta alveolar y los procedimientos de elevación del seno, mientras que el PDGF está aprobado para la reparación de grandes defectos óseos asociados con dientes periodontales afectados y para la reparación tisular de tejidos blandos en defectos de recesión. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 35 - Figura 5: Diveras moléculas con implicación en la regeneración ósea y tuilizados clínicamente. 2.3. Biomaterial El concepto actual de biomaterial es el de cualquier material, no necesariamente biológico, que es tolerado por el organismo y puede, por tanto, tener un uso protésico o inducir un proceso reparativo en la búsqueda de la restitutio ad integrum del tejido lesionado. Este último concepto implica además que el tejido dañado es sustituido por otro de idénticas características de tal modo que, en el caso que nos ocupa, el resultado final sea un tejido óseo y no un tejido cicatricial funcionalmente inadecuado e incapaz de restaurar la función perdida. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 36 - Biomateriales en medicina y odontología En medicina, los biomateriales tienen un alto valor añadido. Su desarrollo y uso se ha hecho profuso en sus diferentes campos, destacando el de la ingeniería tisular, área en expansión que, asentada en los conocimientos básicos de la histología, tiene por objeto construir tejidos nuevos, funcionalmente activos, a partir de células procedentes de cultivos desarrollados previamente y de biomateriales de distinta naturaleza que sirven como soporte o andamiaje42. La ingeniería tisular se asienta en los conocimientos histológicos y recibe asimismo aportaciones de otras disciplinas fundamentales que ayudan al logro final del objetivo propuesto: la construcción de un nuevo tejido vivo y funcional capaz de sustituir con eficacia al tejido original dañado. Biomateriales cerámicos Entre los distintos grupos de biomateriales que se utilizan en medicina y odontología encontramos los denominados cerámicos. Si bien en principio su principal ventaja parecía ser la baja reactividad química, es decir, su carácter inerte y por tanto su biocompatibilidad, se ha demostrado que no todas las biocerámicas son inocuas, dándose la circunstancia de que gran parte de las utilizadas en cirugía reconstructiva presentan bioactividad. Estos productos se introdujeron en la década de los setenta, cuando comenzaron a detectarse fracasos en los materiales que hasta ese momento se utilizaban, como el acero, aleaciones de cobalto y el polimetilmetacrilato. Entre las cerámicas más desarrolladas se encuentran los biovídrios, empleadas principalmente en la reparación de huesos, debido a su eficiente capacidad de integración con el tejido vivo. Así mismo, se avanza en la investigación de los cementos quirúrgicos, provistos de actividad biológica, lo que ha dado pie a una mejora de la fijación y estabilización del implante a largo plazo, ya que la acción de dichos rellenos promueve la diferenciación celular e induce la formación de depósitos de hidroxiapatita Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 37 - proveniente del medio biológico en la zona de contacto entre el cemento y el hueso, lo que posibilita el crecimiento de tejido nuevo. Biomateriales metálicos Otro grupo de biomateriales son los denominados metálicos. El principal límite para su utilización es la tolerancia por el organismo, por lo que es determinante la cantidad de producto que pueden llegar a aportar a los tejidos vivos. Así mismo, es también imprescindible que tengan una buena resistencia a la corrosión43. En el momento actual se investiga en la mejora de las propiedades mecánicas de las aleaciones usadas de forma habitual, así como en lograr que sus superficies tengan texturas adecuadas que provoquen la respuesta biológica deseada. Bajo esta premisa, se han desarrollado microelectrodos en dispositivos neurológicos que resisten la corrosión, especialmente el fenómeno de tensión – corrosión (stress, corrosión, cracking) inducida por el medio biológico. También se está prestando una especial atención a las propiedades súper elásticas de diferentes aleaciones, como la de níquel y titanio, así como al fenómeno de memoria de forma. Este conocimiento se ha aplicado para la creación de dispositivos tubulares expansibles (stents), usados en medicina con el propósito de mantener abiertos conductos tales como arterias, venas, uretra y tráquea, evitando así su colapso. El término superelástico describe la capacidad de algunas aleaciones metálicas de sufrir grandes deformaciones y retornar a la forma original una vez que la fuerza que la genera desaparece. Por ejemplo, un acero inoxidable común sufre deformaciones elásticas de un 0,5%, mientras que las aleaciones utilizadas en los stents, alcanzan deformaciones de hasta un 11%43. Biomateriales poliméricos Por último encontramos el grupo de los biomateriales poliméricos. La gran variedad de fórmulas y la versatilidad de diseño (fibras, tejidos, películas, bloques) de Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 38 - estos materiales los han convertido en los componentes utilizados de forma más frecuente en la fabricación de dispositivos biomédicos. Clásicamente se han clasificado en naturales y sintéticos, si bien funcionalmente se diferencian en bioestables: de carácter permanente y particularmente útiles para sustituir de forma parcial o total tejidos u órganos lesionados o destruidos, y biodegradables: es decir, de carácter temporal, y por tanto con una funcionalidad limitada, ceñida al tiempo en el que el problema subsista. Así mismo, se desarrollan materiales híbridos formados por la combinación de productos de naturaleza sintética y natural. Evolución de los biomateriales Los primeros polímeros degradables desarrollados y los más comúnmente utilizados son los obtenidos a partir del ácido poliglicólico (PGA) y del ácido poliláctico (PLA), los cuales han encontrado multitud de usos en la industria médica, comenzando con las suturas biodegradables que fueron aprobadas en 1960. En 1980, Nyman y cols.15, publicaron un estudio sobre el principio de la RTG para regenerar hueso alveolar. En ese trabajo utilizaron ya barreras para prevenir la aparición de repoblación de células ajenas al tejido óseo vecino en el área lesionada tratada. La meta de la ingeniería tisular era superar las limitaciones de los tratamientos convencionales basados en el trasplante de órganos y la implantación de biomateriales para producir una fuente de órganos “artificiales” inmunológicamente tolerantes y sustitutos de tejidos que puedan crecer con el paciente. Desde entonces, numerosos dispositivos basados en PGA y PLA han sido desarrollados en forma de copolímeros, los cuales han sido aceptados como materiales de uso biomédico. Estos implantes deben permitir una reparación permanente de órganos y tejidos dañados, sin la necesidad de terapias suplementarias, las cuales hacen al tratamiento más caro a largo plazo. La utilización de esta metodología implicaría la disminución de muchos de los problemas relacionados con otras técnicas como: segundas intervenciones costosas y dolorosas de extracción de materiales no reabsorbibles, en caso de tejidos de autoinjertos la disponibilidad del donantes o en Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 39 - caso de aloinjertos las reacciones de rechazo o el riesgo de infección y formación de tejido fibroso, asociados a los implantes permanentes16, 17. Actualmente nos encontramos en la tercera generación de biomateriales. Los materiales diseñados en esta generación buscan interactuar con el tejido de forma específica, mediante estímulos a nivel celular y molecular, y combinan las propiedades de bioabsorbabilidad y bioactividad dentro del mismo material, por lo que cada vez los criterios se van acercando más a lo que sería el biomaterial ideal. La ingeniería de tejidos es una de la áreas con más potencial dentro de la medicina regenerativa. Su principal objetivo es crear materiales que induzca una reacción controlada por parte del tejido vivo y eliminarse completamente por vías metabólicas. Es decir, materiales bioactivos y bioabsorbibles, como los polímeros biodegradables principalmente, que presentan capacidad de degradarse gracias a reacciones de hidrólisis en condiciones fisiológicas. Actualmente son los materiales más atractivos para la elaboración de andamios en ingeniería de tejidos. Los andamios elaborados a partir de este tipo de polímeros ofrecen la posibilidad de crear tejidos completamente naturales, por ello, en la actualidad los polímeros continúan en amplio crecimiento y sus aplicaciones son cada vez mayores dentro del campo de la medicina, mejorando las propiedades de los materiales ya existentes y desarrollando nuevos polímeros reabsorbibles por el organismo para aplicaciones biomédicas específicas, como es el caso de la ROG19, 44-50. Numerosos materiales metálicos, cerámicos y poliméricos de orígenes biológicos o sintéticos han sido usados y propuestos como scaffolds en reconstrucción de tejido óseo, observándose una dramática reducción del uso de materiales membranosos no reabsorbibles frente al uso de los materiales reabsorbibles. Tradicionalmente, las reparaciones de los grandes defectos óseos y condrales constituyeron y todavía son un reto para cirujanos del sistema musculo-esquelético. La regeneración ósea y la posibilidad de hacer crecer hueso han ocupado parte del afán investigador de traumatólogos y cirujanos ortopedas durante siglos. Un gran defecto óseo se consideraba frecuentemente irrecuperable por lo que en ocasiones los pacientes que los padecían se clasificaban como candidatos a la amputación. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 40 - Las necesidades de regeneración ósea incluyen no solamente los defectos postraumáticos sino también los causados por otras patologías musculo-esqueléticas como tumores, enfermedades inflamatorias, osteopenia, infecciones y necrosis entre otras, y, sobre todo, defectos óseos relacionados con ciertas técnicas quirúrgicas como osteotomías, aunque, por su frecuencia, merecen mención especial las osteolisis provocadas por el desgaste y la producción de partículas desprendidas de biomateriales empleados en reconstrucciones osteoarticulares. Uno de los problemas más tempranos es la inflamación, cuyos mediadores extracelulares secretados hacen que ésta reacción destructiva ósea persista y se haga crónica. Los grandes avances que se han producido en ingeniería tisular han dado lugar a la aparición de técnicas que en la actualidad prometen ventajas relacionadas con la implantación quirúrgica de armazones osteoconductores, con transportadores de agentes biológicamente activos u osteoinductores, y finalmente con el trasplante de células aisladas o en soportes. Frecuentemente, osteoconductores, osteoinductores y células óseas indiferenciadas se combinan para tratar defectos óseos. Para los tratamientos de los defectos óseos segmentarios post-traumáticos, tradicionalmente se han venido utilizando técnicas como el acortamiento de la extremidad, el aporte de hueso autólogo no vascularizado, la osteogénesis por distracción así como la transposición de hueso vascularizado y aloinjertos. Sin embargo, actualmente también se han descrito sistemas de relleno con sustitutivos óseos sintéticos como la hidroxiapatita o el fosfato tricálcico entre otros derivados. Las sustituciones óseas en cirugía oncológica son otra de las indicaciones para las nuevas tecnologías. Aparte de las indicaciones citadas, como también se ha mencionado, la incidencia alta de osteolisis provocadas por el empleo de biomateriales constituye una fuente importante en la demanda de investigación tanto para la preservación del tejido y su buena función como para su regeneración en los casos de destrucción. Por más de tres décadas, las artroplastias totales, principalmente las de cadera y rodilla mejoraron notablemente la calidad de vida de los pacientes. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 41 - Mecanismos para el desarrollo de nuevos tejidos En la actualidad se han desarrollado tres mecanismos fundamentales para la creación de un nuevo tejido: 1. En primer lugar, el diseño y posterior crecimiento de los tejidos fuera del cuerpo para más tarde implantarlos a fin de reparar o sustituir los tejidos dañados. Ejemplo de este mecanismo es la creación de piel artificial para su utilización en las quemaduras. 2. En segundo lugar se ha inducido la creación de un nuevo tejido utilizando el implante de dispositivos con determinados tipos de células o libres de éstas y el uso de los adecuados factores de crecimiento y estímulo del sustrato biológico en el que se asienta el biomaterial que generalmente configura el dispositivo. Prueba de esta modalidad es la regeneración tisular guiada para estimular la regeneración ósea. 3. Un tercer mecanismo para desarrollar nuevos tejidos consiste en dispositivos internos o externos diseñados mediante el aislamiento de células del organismo y situarlas sobre o dentro de matrices estructurales y ubicar el sistema de nuevo en el organismo o bien hacerlo funcionar desde fuera. Para ello, ha tenido que evolucionar la idea que sobre la matriz extracelular se tenía, que la consideraba como un mero soporte. Hoy sabemos que es un sistema dinámico integrado por diversas moléculas y que su organización varía con los diferentes tejidos. Este conocimiento es uno de los pilares de la ingeniería de tejidos para la elaboración de este tercer tipo de dispositivo, a fin de crear un sustrato ideal para el injerto en el que se produzca el correcto desarrollo y diferenciación celular. La utilización de implantes biocompatibles compuestos por moléculas poliméricas sembradas con células autólogas es una de las estrategias a considerar. El posterior agregado de factores de crecimiento y diferenciación celular incrementará potencialmente la calidad del tejido a reemplazar, aparte de la Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 48 - Mediante la dimerización del ácido glicólico se obtiene el monómero, el cual polimeriza por apertura de anillo produciendo un material de alto peso molecular y con un porcentaje de monómero residual comprendido entre el 1% y el 3%. Al igual que el ácido poliláctico, el poliglicólico se sintetiza y degrada en el organismo dando una sustancia no tóxica que es metabolizada de la misma manera por el ciclo del ácido cítrico, tal y como se muestra en el esquema de la Figura 10. Figura 10: Síntesis del poli (ácido glicólico) PGA. Copolímeros de ácido láctico y glicólico (PLGA) Encuadrados dentro de la familia de los poli-α-hidroxiácidos, se han usado para la liberación de esteroides, agentes anticancerígenos, péptidos, proteínas, antibióticos, anestésicos y vacunas. Sus propiedades fisicoquímicas vienen determinadas por la arquitectura del copolímero y el peso molecular, aunque al tratarse de copolímeros la composición también juega un papel importante. En la Figura 11 se muestra el esquema de síntesis del ácido poliláctico-co- poliglicólico (PLGA) a partir de ácido láctico y glicólico, ambos ácidos naturales presentes biológicamente en el interior celular. Figura 11: Síntesis del ácido poliláctico-co-glicólico a partir de sus monómeros. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 49 - Los materiales bioreabsorbibles son interesantes porque se eliminan sin necesidad de una nueva cirugía. En general, son materiales que se degradan sin dar productos tóxicos para el organismo, siendo éstos eliminados posteriormente. Los biopolímeros más utilizados como materiales reabsorbibles son los hidroxiácidos que se degradan hasta la mitad de su masa en pocos meses. A la vista de las estadísticas que se realizan sobre el número de fallos producidos en la implantación de materiales poliméricos sintéticos puede afirmarse que actualmente las funciones que llevan a cabo los implantes fabricados en materiales sintéticos pueden llegar a ser tan buenas como los órganos naturales a los que sustituyen 18, 19, 51, 67. PLGA. Diseños morfológicos Membranas 2D Se componen de láminas finas de scaffolds estructurados en fibras de dimensiones micro/nano-métricas. Estas fibras, hiladas en forma de láminas, establecen un substrato favorable a la adhesión y crecimiento celular. Son fabricadas mediante metodologías de base nanotecnológica basadas en el uso de plasmas fríos y de magnetrón sputtering, entre otras. Se muestra un ejemplo tipo de estas membranas en la Figura 12 a y b. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 50 - Figura 12: 12a: Micrografía de superficie de una membrana tipo de PLGA a SEM. Figura 12b: Microestructura interna de la membrana a FSEM alta resolución. Discos y cilindros 3D Se trata de masas de poliláctico cilíndricas a modo de relleno de cavidades óseas peri-implantarias. Los tamaños y curvaturas dependen de la zona tratada. Esferas 3D Desde hace pocos años ha aumentado el uso de estos polímeros de PLGA en forma de inyectables conteniendo microesferas. La Figura 13a muestra una micrografía en la que se puede apreciar la homogeneidad de las microesferas, y la Figura 13b su proceso de degradación al ponerse en contacto con los fluidos del cuerpo produciendo fragmentos de polímero más pequeños. a b Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 51 - Figura 13: Figura 13a: Microesferas de PLGA. Figura 13b: Degradación de una micropartícula. Los beneficios que proporciona este sistema son, entre otros, una magnifica biocompatibilidad y una excelente reproducibilidad tanto en el proceso de microencapsulación como en el de liberación del principio activo. Con este sistema de microesferas 3D se ha elaborado un anticonceptivo inyectable que contiene microesferas portadoras de esteroides. En otros casos, como es el de la liberación de determinadas proteínas, péptidos o antígenos se han encontrado problemas. Por ejemplo, en el caso de dispositivos que contienen la hormona del crecimiento aparece una notable pérdida de actividad después de pocos días, que se atribuye a interacciones entre el polímero y la hormona. Por el contrario en otros casos, como es el de la hormona luteínica, se han encontrado muy buenos resultados, debido a que los polipéptidos de bajo peso molecular son muy estables tanto en presencia del copolímero como de sus residuos de bioerosión18, 19, 51. Otros tipos de scaffolds Nanotubos de carbono (SWNTs): han sido propuestos como la carga ideal para la siguiente generación de nanomateriales, debido a sus características mecánicas excelentes. Geles de liberación controlada de drogas: hidrogeles diversos están comenzando a utilizarse en aplicaciones de contacto con sangre y fluidos oculares debido a la baja adsorción de proteínas que poseen y a la capacidad de lubricación. Se trata de geles a b Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 52 - poliméricos de disolución controlada, que portan microvesículas de drogas para tratamiento de patologías específicas. En las Figuras 14a y 14b se muestran dos ejemplos del mecanismo de acción de estos scaffolds en forma de gel. Figura 14a y 14b: Esquemas tipo de un sistema terapéutico en gel. Técnicas de elaboración de andamios poliméricos para ingeniería de tejidos Las estructuras poliméricas porosas pueden ser obtenidas a través de numerosos métodos. Cada técnica de elaboración le confiere al andamio final características estructurales diferentes, por lo que es muy importante elegir la técnica correcta según la aplicación final del andamio. Algunas de las técnicas utilizadas hoy en día para la fabricación de andamios porosos se encuentran resumidas en la Figuras 15 y 16. a b Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 53 - Tabla 2: Tiempo de degradación de los principales polímeros en investigación. Figura 15: Imagen tridimensional de algunas matrices y técnicas de elaboración de andamios poliméricos para ingeniería de tejidos. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 54 - Figura 16: Métodos y técnicas de modificación superficial clasificados así como el efecto de dichas modifaciones sobre las propiedas superficiales. Unión de fibras Esta técnica consiste en la elaboración de redes interconectadas mediante la unión de fibras. Para esto se utilizan dos polímeros diferentes como el PLA y el PGA. Las fibras del PGA son alineadas con la forma final de la estructura deseada, y son embebidas en una solución de PLA/cloruro de metileno. Después de la evaporación del solvente, los polímeros son calentados por encima de su temperatura de fusión. Finalmente el PLA es disuelto en cloruro de metileno, dejando las fibras de PGA unidas de forma tal que forman una estructura porosa. Esto se puede conseguir ya que el PGA es insoluble en el cloruro de metileno. Dada la especificidad del solvente, del par de polímeros y de sus temperaturas de fusión, esta técnica es de difícil aplicación con otros polímeros. En general, casi todas estas técnicas pueden ser utilizadas no sólo para Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 55 - elaborar esponjas poliméricas, sino también para generar materiales compuestos porosos. Para esto, se añaden las partículas o fibras de la fase de refuerzo (fosfato de calcio) en la fase inicial de la elaboración de las estructuras. Gel casting Este método consiste en disolver el polímero en un solvente orgánico como la acetona. La solución polimérica es colocada en un molde hasta alcanzar consistencia de gel. Seguidamente el gel es procesado mediante diferentes concentraciones de acetona, etanol y agua para así obtener una estructura microporosa. Disolución y colado con liberación de partículas En este método se incorpora a la solución polimérica una proporción determinada de partículas minerales (cloruro de sodio) u orgánicas (sacarosa). La mezcla es luego colada en un molde donde el solvente se evapora o puede ser procesada por freeze-drying (técnica recientemente utilizada en la fabricación de geles de poliláctico ó colágeno para la liberación controlada de drogas). Una vez evaporado el solvente, las partículas son disueltas en agua dejando a su paso los diferentes poros. Con esta técnica se pueden conseguir porcentajes de porosidad bastante elevados. El tamaño de los poros dependerá de las partículas utilizadas. Laminación de membranas Es similar a la técnica conocida como Laminated Object Manufacturing (LOM) usada en la creación rápida de prototipos. Consiste en la utilización de diferentes films porosos generalmente obtenidos a partir de la técnica de disolución y colado con liberación de partículas, y colocados uno Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 56 - sobre otro unidos con la ayuda de la impregnación con cloroformo en la superficie, para obtener estructuras tridimensionales de forma compleja. Separación de fases El polímero se disuelve en un solvente como el dioxano a una temperatura baja. La separación líquido-líquido, y posteriormente sólido-líquido, es inducida al bajar la temperatura de la solución. Subsecuentemente se elimina el solvente solidificado por medio de la sublimación del mismo dejando así el andamio polimérico. La concentración del polímero, el solvente utilizado y la estrategia de enfriamiento juegan un papel fundamental en la morfología final de los poros. Saturación con gas Para esto se utilizan especímenes poliméricos sólidos previamente prensados, los cuales son expuestos a altas presiones de CO2 permitiendo así la saturación del polímero con el gas. Se crea una inestabilidad termodinámica al reducir la presión del gas a niveles ambientales que conlleva la nucleación y expansión del CO2 disuelto, generando así macroporos. La mayor ventaja de este proceso es que no utiliza solventes orgánicos. La mayor desventaja es que el producto final es poco poroso en la superficie y además permanece un cierto porcentaje de porosidad cerrada en el interior del material. Para solucionar estos problemas se está utilizando esta técnica en combinación con partículas solubles en agua. Liofilización Esta técnica es similar a la separación de fases. Consiste en liofilizar soluciones congeladas del polímero con ácido acético glacial o benceno. La morfología de las Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 57 - esponjas depende notablemente del polímero y del solvente. Por ejemplo, el benceno, induce una estructura de tipo capilar, mientras que el ácido acético produce una estructura de tipo librillo. Aplicaciones biomédicas y farmacológicas de los polímeros Equipos e instrumentos quirúrgicos Los materiales más usados son aquellos de origen sintético y que no son biodegradables, como polietileno, polipropileno, policloruro de vinilo, polimetilmetacrilato o policarbonato. Aplicaciones permanentes dentro del organismo Las aplicaciones más importantes son las prótesis o implantes ortopédicos, elementos de fijación como cementos óseos, membranas y componentes de órganos artificiales, entre otros. Entre los materiales más utilizados se encuentran: polímeros fluorados como el teflón, poliamidas, elastómeros, siliconas, poliésteres, policarbonatos, etc. En el caso de prótesis vasculares, al ser un implante expuesto al contacto con la sangre, la propiedad fundamental requerida es que el material no provoque coagulación. Considerando este requisito, se aplican fibras y espumas de politetrafluoroetileno expandido, poliuretanos segmentados y silicona porosa. Otro de los campos donde los polímeros empiezan a tener una presencia significativa son los dispositivos de fijación ósea. Una de las opciones en este campo la constituyen los cementos óseos, que son mezclas de materiales cerámicos con polímeros sintéticos rígidos como el polimetilmetacrilato. También se han desarrollado numerosos estudios e investigaciones en el campo de implantes biodegradables que permitan solucionar las dificultades anteriores. Los polímeros o copolímeros de PLGA Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 64 - Los iones actúan como enzimas e influyen en la señales y los efectos metabólicos que ocurren durante la formación de los tejidos129. Estas propiedades de los materiales hacen que sus iones sean atractivos como agente terapéuticos130. Es importante saber la concentración extracelular de los iones porque pueden afectar a partir de una concentración determinada de manera negativa. Así concentraciones de Ca > 10 mmol son citotóxicas122. Además del Ca y P, en la formación de la apatita ósea hay otros iones que son considerados prometedores en la mejora de la formación ósea como el Si, Sr, Zn, Cu, Mg y B. El silicio es un elemento importante en la osteogénesis131. Tiene un efecto estimulante sobre la actividad celular, es decir, proliferación, diferenciación y mineralización por osteoblastos132-134. Algunos autores afirman que la adición de silicio a los fosfatos alcalinos puede aumentar la actividad de estas enzimas y la producción de proteínas en los osteoblastos135. Otros autores afirman que el suministro de silicatos a pacientes osteoporóticos en lugar de bifosfonatos, produce un importante aumento de la densidad ósea observada en el fémur y la columna vertebral131. Asimismo el óxido de silicio es un elemento esencial de los procesos metabólicos asociados con la formación y calcificación del tejido óseo126, 127. Se han detectado altas concentraciones de Si en etapas tempranas de la calcificación de la matriz ósea127. El Si acuoso es capaz de inducir la precipitación de HA136. Además el Si dietético aumenta la densidad mineral ósea en hombres y mujeres posmenopáusicas137. Un estudio en ratas con déficit de Ca mostraron que un suplemento de Si causó efectos positivos en la densidad ósea gracias a la reducción de la reabsorción138. También Nielsen y cols.139 han sugerido que el Si tiene una función bioquímica en el crecimiento óseo que afecta al volumen de colágeno óseo y a las proteínas de la matriz extracelular como las osteopontinas. El ácido ortosilicato Si(OH)4 estimula la formación de colágeno I por parte de los osteoblastos y estimula la diferenciación osteoblástica128. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 65 - Vidrios bioactivos basados en SiO2 Desde que Hench y cols140 descubrieron el primer material de silicato bioactivo, ahora llamado 45S5 Bioglass (45SiO2-25CaO-25Na2O-6P2O5) con sus propiedades biológicas únicas, ha habido mucha investigación sobre la ingeniería tisular. Sin embargo, hasta Xynos100, el trabajo investigador no se centró en las interacciones moleculares iónicas, en su entorno fisiológico. Muchos estudios muestran efectos osteogénicos de los vidrios de silicatos bioactivos que se resumen en la Tabla 4. Tabla 4: Respuesta biológicas a los silicatos. Un descubrimiento importante de Xynos100 fue que los productos disueltos de 45S5 Bioglass son capaces de regular la expresión génica de los osteoblastos. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 66 - Kaufmann141 confirmó esos resultados observando la expresión de muchos genes (osteocalcina, osteonectina, osteopontina) en osteoblastos y aumentando la fosfatasa alcalina. Estudios similares con vidrios bioactivos de sol-gel han sido descritos. Por ejemplo un derivado sol-gel de 77S (mol%: 80SiO2-16CaO-4P2O5) ha demostrado promover la osteoinducción y mejorar la mineralización celular142. Desde que se ha comprobado la importancia de la vascularización en la regeneración ósea, ha habido muchas investigaciones centradas en los efectos angiogénicos de los biomateriales143. La vascularización de los tejidos duros juega un papel primordial en la remodelación ósea actuando como reservorio y conducto para las células óseas, factores de crecimiento y permitiendo que se transmitan señales metabólicas144. La vascularización del scaffold debe mejorar el metabolismo óseo. Por ello, muchos estudios están centrados en investigar el potencial de estimulación de los vidrios bioactivos en la angiogénesis, usando células endoteliales y fibroblastos145, 146. Los iones de los vidrios de silicato han demostrado estimular la osteogénesis y la angiogénesis gracias a la activación de muchos genes asociados con la formación ósea y la vascularización147. Los numerosos estudios llevados a cabo en los vidrios bioactivos confirman la hipótesis de que los iones liberados por los vidrios bioactivos estimulan los genes de las células hacia el camino de la regeneración148. Para mejorar la bioactividad de los vidrios se han incorporado varios metales a la red del silicato. El principal objetivo es aumentar la osteogénesis, la angiogénesis y la promoción de las propiedades antibacterianas. Estos estudios incluyen Co, Zn, Cu, Sr, Zn, Mg, Ag, y F147. El control de los iones metálicos liberados desde los scaffolds inorgánicos es considerado un buen enfoque para mejorar la capacidad biológica de los scaffolds (Figura 22). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 67 - Figura 22: Propiedades del sustrato, el tipo de modificación y el impacto sobre las características de la superficie del material. 2.6. Nanomedicina aplicada a la regeneración tisular La nanomedicina es una ciencia que estudia el desarrollo de materiales biomédicos a escala microscópica, así como sus modificaciones químicas y estructurales. Esta parte de la ciencia se apoya fundamentalmente en la física, la química cuántica, y la electrónica. La ingeniería de tejidos es una rama de la nanomedicina que se basa en la utilización de técnicas nanotecnológicas con las características mencionadas para crear materiales bioactivos y bioabsorbibles, capaces de estimular la respuesta celular y molecular de forma controlada, para que actúen como soportes temporales en la reparación de defectos tisulares. Dentro de esta área existen dos tendencias principalmente, la primera consiste en el desarrollo de andamios tridimensionales acelulares ó scaffolds, que servirán para alojar las diferentes células una vez implantados in vivo. La segunda tendencia consiste en el desarrollo de matrices tridimensionales, que inicialmente son colonizados por las células progenitoras bajo condiciones in vitro, y luego son implantados en el paciente para reemplazar el tejido dañado149-150. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 68 - Importancia de las matrices tridimensionales Las matrices tridimensionales son dispositivos que proporcionan a las células el apoyo necesario para su proliferación y el mantenimiento de sus funciones diferenciadas y las señales biológicas requeridas para la conservación de la expresión génica específica y, además, definen la arquitectura del tejido. Las células interactúan con estos dispositivos de manera activa en el proceso de regeneración del tejido, lo cual induce la liberación de factores de diferenciación y crecimiento, mientras que sintetizan su propia matriz extracelular, que proporciona un ambiente y arquitectura específicos del tejido, y sirve como reservorio de agua, nutrientes, citocinas y factores de crecimiento, entre otros. Las matrices tridimensionales para ingeniería tisular ósea (ITO) deben satisfacer ciertos criterios18, 19: 1. Biocompatibilidad; Los materiales y sus subproductos de degradación no deben presentar efectos tóxicos (genotóxicos o citotóxicos) o causar respuesta inmune permitiendo la integración adecuada al tejido hospedador. Deben ser antisépticos y esterilizables. 2. Porosidad; Deben tener poros abiertos e interconectados, necesarios para la difusión de nutrientes y gases y para la remoción de desechos metabólicos como resultado de la actividad celular, lo cual es fundamental en el hueso, debido a sus características metabólicas, ya que se esperan altas tasas de transferencia de masa, incluso cuando se realizan procesos in vitro. 3. Tamaño del poro; El tamaño ideal del poro según la ITO varía entre 200 y 900 μm. 4. Propiedades de la superficie; Tanto las alteraciones químicas como topográficas de la superficie pueden controlar y afectar a la adhesión y proliferación celular. Las propiedades químicas están relacionadas con la habilidad de las células para adherirse al material. Las propiedades topográficas son fundamentales para la osteoconducción, que es el proceso mediante el cual las células osteogénicas y vasculares migran a la superficie de la matriz tridimensional a través de un Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 69 - coágulo de fibrina, que se establece después de implantado el material, para promover la reparación. 5. Osteoinducción; Es el proceso mediante el cual las células madre y osteoprogenitoras son reclutadas en el sitio de regeneración ósea y estimuladas para diferenciarse hacia la línea osteogénica y segregar matriz ósea mineralizada. 6. Propiedades mecánicas; Dependen del lugar de implantación y de las fuerzas mecánicas a las que se verá expuesto el implante. 7. Biodegradabilidad; Para la fabricación de las matrices se deben utilizar materiales que tengan tasas de resorción progresivas que igualen a las de formación ósea, transfiriendo las cargas de manera gradual, de tal manera que, para cuando la lesión esté totalmente regenerada, la matriz tridimensional se haya degradado totalmente. La necesidad de un fácil procesado y la capacidad de conformarse en distintas formas son otros requisitos que deberían cumplirse. 8. Material radiolúcido; Es preferible a la hora de diferenciar radiográficamente el nuevo hueso del material implantado. Importancia de la superficie y la interfaz sustrato–matriz extracelular Actualmente hay consenso en que la complejidad del micro-medioambiente tridimensional que envuelve a las células in vivo, incluyendo los cambios en el tiempo de fuerzas y estímulos, influyen de modo significativo en los mecanismos de respuesta celular en términos de cambios fenotípicos, morfológicos y funcionales. Así ha surgido en la última década el concepto de mecanotransducción, basado en la hipótesis de que la topografía de la superficie sobre la que descansan las células adherentes es capaz de inducir cambios en la morfología nuclear y en la transcripción génica, modificándose, por tanto la expresión fenotípica de modo que la respuesta celular y de la matriz extracelular a las características tridimensionales y estructurales de los scaffolds va a ser el aspecto fundamental que condicione el diseño y desarrollo de una nueva generación de biomateriales utilizados para la reparación de los tejidos lesionados. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 70 - La respuesta inicial del huésped al biomaterial es una reacción inflamatoria desencadenada por el trauma quirúrgico. En estos estadios iniciales, las células comienzan entonces la deposición de una capa de proteínas no colágenas sobre la superficie del biomaterial, que regulan la adhesión celular y la mineralización. Las células, como los osteoblastos que crecen ancladas a una matriz extracelular (ECM), necesitan adherirse al sustrato ante de poder iniciar su funcionamiento normal. Esa capacidad de adherirse al sustrato es lo que permite la señalización desde la ECM al núcleo mediante cascadas de proteínas intracelulares intermediarias. Asimismo, los materiales capaces de estimular la adhesión osteoblástica pueden incrementar su diferenciación funcional regulando genes osteoespecíficos que intervienen en la neogénesis de matriz mineralizada y formación de tejido óseo. Se admite que la topografía de la superficie tiene un papel determinante sobre la adhesión osteoblástica, su migración y metabolismo, modificando y controlando el proceso de diferenciación osteoblástica67, 151-155. Los scaffolds para osteogénesis deben mimetizar la morfología ósea, la estructura y función para poder optimizar la integración dentro del tejido implantado. La porosidad y el tamaño del poro juegan un papel crítico en la formación de hueso in vitro e in vivo. El tejido óseo tiene una morfología trabecular con porosidad del 50-90%. Los poros son necesarios para la formación del tejido óseo, ya que permiten la migración y la proliferación de los osteoblastos y las células mesenquimales, así como su vascularización. Además, una superficie porosa mejora el enclavamiento mecánico entre el implante biomaterial y el hueso circundante natural, proporcionando una mayor estabilidad mecánica a esta interfaz crítica. La necesidad de porosidad en la regeneración ósea ha sido demostrada en distintos estudios54. La porosidad se define como el porcentaje de espacio vacío en un sólido, y es una característica morfológica independiente del material. El tamaño mínimo necesario de poro requerido para regenerar hueso mineralizado se considera generalmente en torno a 100 µm44, 150, 156, 157, aunque ha sido demostrada una mejor osteogénesis a tamaños de poro de más de 300 µm ya que facilita una mejor vascularización y oxigenación del tejido. Un menor tamaño de los poros (75-100 µm) provoca desmineralización interna y los poros más pequeños (10-44 µm y 44-75 µm) son obturados por tejido fibroso. Para Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 71 - controlar las dimensiones del poro y su densidad en el scaffold se pueden aplicar distintas variaciones, tal como se ha descrito anteriormente44, 67, 150, 156, 157-161. 2.7. Funcionalización del PLGA El poliglicolato se ha conocido desde 1954 como una fibra dura de formación de polimérica. En la actualidad el poliglicolato y sus copolímeros con o sin ácido láctico son ampliamente utilizados como material para la síntesis de suturas absorbibles y se están evaluando en otras áreas del campo biomédico. Puede prepararse a partir de ácido glicólico por medio de la policondensación o ciertas formas de polimerización. Estos materiales han ofreciendo generalmente buena biocompatibilidad y procesamiento. Sin embargo han aparecido numerosos problemas durante el uso de estos biopolímeros cuando son aplicados en ingeniería de tejidos, por ejemplo, problemas asociados al PLGA respecto a la hidrofobicidad, que comprometen su resistencia mecánica y facilitan la liberación de restos ácidos por degradación, disminuyendo el pH y favoreciendo la proliferación bacteriana y los procesos inflamatorios. Para intentar paliar estos inconvenientes se han incorporado en el PLGA materiales inorgánicos a modo de composites, como la hidroxiapatita (HA), el fosfato tricálcico (TCP) o cristales bioactivos, actualmente en estudio18, 19, 43, 44, 51. Las características ideales de las membranas reabsorbibles de PLGA según Scantlebury20, son:  Biocompatibilidad.  Biodegradabilidad.  Integración tisular.  Oclusión celular.  Manejabilidad clínica.  Mantenimiento del espacio. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 72 - Estas matrices en forma de membrana presentan las características de ser reabsorbidas por el propio organismo sin generar una respuesta inmune de rechazo, y a su vez, actúan como matrices que permiten el crecimiento de las células en su interior. Están diseñadas para inhibir o retardar la migración apical del tejido conjuntivo durante la fase de cicatrización reduciéndose así la formación de bolsas en la superficie externa de la membrana, y se ha demostrado además una buena adhesión y vascularización de los tejidos en los que se hallan colocadas. La mejora de las propiedades osteoinductivas puede conseguirse a través de la funcionalización superficial de estas membranas poliméricas de tal manera que la incorporación de capas delgadas de depósitos de cristales a escala nanométricas cree una superficie de topografía más compleja que incremente la capacidad osteoinductora56-58, 162, 163. El diseño adecuado de una topografía de superficie afecta a su potencial adhesivo y a la capacidad de las células para adherirse en la interfase célula-sustrato, y nos ayuda a dirigir y organizar la adhesión y diferenciación de las células óseas en migración para conseguir una buena reparación tisular. La calidad de la adhesión celular condicionará la morfología, capacidad de proliferación y diferenciación celular. Por tanto, el material empleado debe ser capaz de reclutar células formadoras de hueso, osteoblastos, y acondicionar adecuadamente el ambiente extracelular de forma que puedan sintetizar hueso nuevo de calidad óptima. En la última década, se ha reportado la fabricación de matrices porosas mediante diferentes técnicas, entre las que se destacan: gas foaming, solvent casting/particulate leaching, rapid prototyping y H2O2 foaming, que permiten el procesamiento de materiales metálicos, cerámicos (hidroxiapatita, fosfato tricálcico) y poliméricos, de origen natural (colágeno, ácido hialurónico, fibrinógeno, quitina, chitosán) o sintéticos (policarbonatos, polímeros de PLA, PGA y sus derivados copolímeros)21-27, 44, 149, 150, 157. Hay tres razones fundamentales por las que la adición de una fase inorgánica en una matriz polimérica resulta interesante en un substrato para ingeniería de tejidos: 1. La bioactividad del polímero aumenta debido a la incorporación de una fase bioactiva. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 73 - 2. La introducción de la fase inorgánica podría modificar de forma positiva el patrón de degradación del polímero. 3. La incorporación de esta segunda fase modifica el comportamiento mecánico del material, así como la integridad estructural del andamio. Actualmente se están estudiando multitud de funcionalizaciones para favorecer la osteoinducción de los osteoblastos de la zona anatómica donde son insertadas quirúrgicamente y así favorecer la síntesis de materia mineral y regenerar el defecto óseo con hueso autólogo neoformado18, 19, 43, 44, 50, 67 151-153, 163-167. Algunas de estas modificaciones o mejoras en las matrices extracelulares respecto a la regulación del metabolismo, función, activación y señalización en la regeneración ósea en estudio se muestran en la Tabla 5. Tabla 5: Principales nanocomposites utilizadosw a modo de modificaciones para las matrices de PLGA. Técnica de funcionalización superficial de la membrana de PLGA Con el fin de promover una mayor osteointegración se realizan modificaciones en la superficie de las membranas. Estas modificaciones incluyen procesos de recubrimiento con capas inorgánicas de óxidos metálicos con propiedades Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 80 - Fabricación de las membranas del grupo PLGA sencillo (Control) Para su preparación se añadió 0,15g de perlas de poliláctico-poliglicólico en proporción 75% ácido poliláctico + 25% ácido poliglicólico (Purasorb®, Holanda), previamente atemperadas, en 10 ml de disolvente orgánico diclorometano líquido (CH2Cl2), y se procedió a su disolución en agitador magnético caliente. Tras su completa disolución se procedió a su secado en platillo de teflón, donde el PLGA adquirió su morfología final laminar membranosa. Posteriormente se procedió al corte manual, esterilización con luz ultravioleta durante 30 minutos por ambas caras, y aislamiento almacenado en sobres plastificados hasta su uso en quirófano. En la Figura 23 se ilustra una imagen tipo de una de las membranas de PLGA control de nuestro estudio a escala macroscópica y a microscopía electrónica (SEM). Figura 23: a;(Izq); Membrana tipo de PLGA a escala real. b;(Dcha); Imagen superficial de la membrana tipo de PLGA a microscopía electrónica de barrido (SEM). Fabricación de las membranas del grupo SiO2/PLGA+PO2 Es éste un procedimiento idéntico al grupo anterior. Una vez realizado le siguen dos tratamientos consecutivos: 1. El primero de ellos es un pretratamiento físico superficial de plasma de oxígeno (P-O2), antes de la deposición de la capa inorgánica sobre su superficie. Este tratamiento de plasma produce la modificación superficial de la membrana de PLGA y aumenta su rugosidad debido al etching producido por el plasma. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 81 - Este tratamiento facilita la degradación de las membranas de PLGA haciéndola más sensible a medios líquidos de cultivo favoreciendo su degradación. También produce una mejora de la adherencia entre la capa nanométrica inorgánica y la propia membrana de PLGA. Estos procesos tienen lugar a temperaturas próximas a la ambiente y no afectan a la integridad de la membrana polimérica. Las condiciones de trabajo para este proceso intermedio de funcionalización con plasma de oxígeno pueden encontrarse en un trabajo previo, así como una descripción de la metodología experimental utilizada para depositar la capa nanométrica inorgánica sobre la membrana de PLGA194. Un esquema de este conjunto de procesos se presenta en la Figura 24, donde se muestra cómo en una primera etapa el tratamiento con el plasma de oxígeno produce la activación superficial de la membrana de PLGA aumentando su rugosidad. Figura 24: Funcionalización superficial de las membranas. 2. Posteriormente se procedió a añadir el segundo tratamiento con nanopartículas de óxido de silicio en la superficie de las membranas con el fin de promover una mayor osteointegración tisular. Estas modificaciones incluyen procesos de recubrimiento con capas inorgánicas bioactivas de varias decenas de nanómetros de óxido de silicio (SiO2) con propiedades potencialmente bioactivas, es decir, superficies que puedan formar un enlace químico directo entre el hueso y la superficie del implante (fijación activa). Para ello se realizó un proceso de deposición química desde fase vapor asistida por plasma (PECVD) a temperatura ambiente, en una cámara de vacío acoplada a un generador de microondas de tipo SLAN, empleando un plasma de oxígeno y como precursor tetraisopropóxido de silicio (TTIP, Sigma-Aldrich, EE.UU). La deposición se hizo Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 82 - siguiendo metodologías de base nanotecnológica basadas en el uso de plasmas fríos y de magnetrón sputtering. Figura 25: Funcionalizador de nanopartículas de silicio (SLAN). Ejemplares para la experimentación animal Para este estudio se utilizaron cuatro conejos de experimentación (raza New Zeland, color: blanco, edad: 6 meses, peso: 3,5 Kg), proporcionándoles agua y alimentación diaria de tipo mantenimiento “Harlan Teckland Lab Animal Diets” (2030) (Harlan, España). Estos ensayos de experimentación animal cuentan con el permiso del Comité de Ético de Experimentación de la Universidad de Sevilla y con el permiso del Comité Ético de Experimentación Animal del CCMI Jesús Usón. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 83 - 5.2. MÉTODO Descripción del estudio Tras un análisis previo de rendimiento global in vitro en varios modelos de membranas poliméricas modificadas de PLGA reabsorbibles, se procedió a realizar un estudio comparativo de regeneración ósea guiada in vivo de la membrana que ofreció mejor resultado. Para ello se utilizaron cuatro conejos de experimentación, en cuya calota (zona frontal del cráneo) se les efectuaron dos defectos críticos (no autoregenerables) de 11mm de diámetro y separados por 0,5 cm de hueso sano. En uno de ellos se colocó las membranas de estudio (SiO2/PLGA+P-O2), y en el otro, las membranas controles (PLGA sencillo). Posteriormente se les facilitó reposo durante un mes, y tras el sacrificio de los ejemplares, se enviaron las muestras de calota al laboratorio para hacer un análisis comparativo cualitativo y cuantitativo de todos los defectos, para elaborar una evaluación objetiva y estadística de la efectividad y viabilidad de estas membranas. Procedimiento quirúrgico Las intervenciones, así como el sustento de los animales y sacrificio de los mismos se efectuaron en el CCMI (Centro de Cirugía de Mínima Invasión de Cáceres). Durante la intervención se contó con la ayuda de dos odontólogos cirujanos al frente, dos odontólogos asistentes, un veterinario, un anestesiólogo, un biólogo, y un grupo de auxiliares clínicos de la especialidad. Se comenzó con la sujeción de los animales y control de sus constantes vitales. Para el proceso de anestesia se utilizó inducción intravenosa con midazolan 0,25mg/kg y propofol 5mg/kg, mantenimiento con gas inhalatorio de sevofluorano 2,8% aspirado y analgesia con ketorolaco 1,5mg/kg y tramadol 3mg/kg. Una vez sedados y preparados los conejos, se realizó una incisión entre las bases de las orejas comunicándola con una incisión en la línea media de la calota (de Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 84 - aproximadamente 5 cm) con hoja de bisturí nº15. Consecutivamente se despegó y diseccionó la capa epitelial, conectiva y muscular con un periosteotomo de Prichard, controlando en todo momento el sangrado mediante compresión y aspiración. Posteriormente se produjo la exposición de la superficie externa del cráneo y el lavado de la zona con solución salina (suero fisiológico). Despegados los colgajos triangulares, se separaron mediante sutura de 2/0 colgando de ellos dos mosquitos para dejar despejado el campo de intervención. Se identificaron dos estructuras: la cresta sagital del hueso parietal, y la salida del nervio facial. Entre ambas estructuras, a ambos lados de la línea media se realizaron dos defectos óseos separados cada uno de ellos por 6 mm, con una trefina puesta en un contraángulo de implantes con irrigación de suero fisiológico estéril. La trefina utilizada fue la de Helmut Zepf, de diámetro interno de 11 mm, de dientes 2,35 mm y longitud 30mm, ref.08.910.13 (Helmut Zepf Medizintechnik GMBH, Alemania). Con dicha trefina y a una velocidad de 2000 rpm se marcó el defecto con una profundidad de 1 mm. El hueso se eliminó usando piezocirugía y controlando la profundidad a 2 mm mediante sonda periodontal. Una vez realizados los defectos, éstos se cubrieron con las distintas membranas de PLGA, organizadas según el grupo asignado al defecto tal y como muestra la Figura 26. Figura 26: Organización posicional de las membranas. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 85 - Las membranas de PLGA se fijaron con un adhesivo hemostático fisiológico Tissucol® (Baxter, EE.UU.) aprobado por la FDA, el cual contiene fibrinógeno y fibrina humanas. El adhesivo fue colocado en el reborde óseo adyacente a los defectos para fijar mejor la membrana, consiguiendo una adecuada fijación y poca movilidad de las membranas al desplazar el colgajo a su posición inicial. Se procedió a la sutura en dos planos; una primera de 4/0 en el plano de periostio subepidérmico, y una segunda de 2/0 no reabsorbible en el plano epidérmico. Se efectuaron puntos simples con la mejor aproximación posible de bordes, y se finalizó la intervención con el limpiado de la herida, (Figura 27). El tiempo aproximado de la intervención quirúrgica fue de una hora por cada ejemplar. Posteriormente se les administró analgesia antiinflamatoria con buprenorfina (0.05 mg/kg) y carprofeno (1 ml/12.5 kg pv), y reposo programado de un mes. Figura 27: Imágenes de la operación. (1 y 2); Incisión y desplazamiento tisular. (3); Trefinado. (4); Colocación de las membranas en los defectos óseos. (5); Sutura de la herida. (6); Visión de los defectos óseos regenerados tras el sacrificio. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 86 - Sacrificio Los conejos fueron sacrificados al mes de la intervención utilizando una dosis letal vía intravenosa de cloruro potásico, lo que les provocó un paro cardíaco. Las muestras fueron obtenidas para su posterior estudio a partir de la calota de cada ejemplar, cortadas en plano sagital anatómico, y tras la separación de la masa cerebral y lavado con suero fisiológico, se procedió al corte y marcado de las piezas individualmente de la siguiente manera: 1. Precorte (3x3cm): En cuadrado de 3cm en total como máximo, para cada lado (tal como se aprecia en el esquema abajo). 2. Marcado: Corte en triángulo de la esquina caudal izquierda de cada calota, en vista dorsal del animal (como se indica en el esquema de la Figura 28. 3. El proceso de precorte de las cabezas y el tallado de la esquina de las calotas se efectuó de uno en uno, con irrigación de suero fisiológico, y lo más rápido posible para evitar la desecación de las células (Figura 29). 4. Fotografiado de las piezas junto a la etiqueta del código de ejemplar del conejo tanto en el precorte como en el corte de la esquina. 5. Fijación: Se introdujeron las calotas (aun húmedas de suero) en frascos que se rellenaron con etanol 70°C (a 4°C) hasta un dedo del tope del frasco. 6. Traslado al laboratorio conservadas en hielo seco (CO2 a baja temperatura y alta presión). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 87 - Figura 28: Esquema del precorte y marcado en la calota. (Nota: Referimos siempre Izq/Dcha y Frontal/Caudal del animal, no del operador. En vista dorsal de la calota (no ventral-cerebral). Figura 29: (a); Calota precortada tras sacrificio. (b); Muestra de calota marcada y preparada en fijación para traslado al laboratorio. Procesamiento de las muestras. El procesado de las muestras y su tratamiento histológico tras la fijación de las muestras precortadas, en etanol de 70° durante 48h a 4°C (Figura 30), se efectuó en el laboratorio histológico de la Faculté de Chirurgie Dentaire. EA: 2496 (Universidad Paris Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 88 - V – René Descartes), y siguiendo el protocolo que se explica a continuación para todas las variables de estudio hasta el comienzo de las pruebas para microscopía. Figura 30: Pretratamiento de las muestras, fijación fría etanol 70° (4°C). Pretratamiento y tratamiento tisular Deshidratación Se comenzó metiendo las muestras de calota en etanol de 95° en frigorífico (4°C) durante 48 horas. Seguidamente se sumergieron cuatro veces en etanol absoluto durante una hora cada uno a 4°C. Por último se introdujeron en xileno con un pase de tres horas. Impregnación Se sumergieron las muestras en Solución-1: (xileno + metil metacrilato; en proporción 1:1) durante dos horas en fregadero con vasija a presión hídrica al vacío, y mezclando en agitador. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 89 - Posteriormente se sumergieron en Solución-2: (metil metacrilato + dibutil-x; en proporción 1:1) durante dos horas en fregadero con vasija presión hídrica, y se guardaron a 4°C hasta comenzar la inclusión. En la Figura 31 se muestra una imagen con el material empleado para el proceso; Figura 31: Impregnación y preinclusión a alta presión. Inclusión Se procedió a sumergir completamente las muestras en una solución líquida de resina tipo metil metacrilato (MMA) Merck (Merck & Co., EE.UU.) en frascos de cristal cilíndricos para fabricar los bloques. Para ello se añadió una mezcla equitativa de la Solución A (peróxido orgánico de benzoilo (BPO)) y la Solución B (dioctil adipato (DMPT) + Butil-x). Previamente estas soluciones se mezclaron con agitador con palomita y fueron presolidificados durante una semana a -20°C. La inclusión se realizó colocando las muestras centradas en el interior y se vertió la mezcla de soluciones A y B lentamente. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 96 - Figura 38: Montaje típico en portamuestras con cubreobjetos. Para llevar a cabo la evaluación cualitativa del estudio morfométrico de la estructura y densidad del hueso neoformado en cada caso se adquirió una imagen central de 6 mm de lado para cada defecto y para el hueso original (de los flancos del defecto) con objetivo 5x mediante el microscopio óptico “Zeis Axioscop Plus” (Zeiss Microscopy, LLC; EE.UU). Se valoraron tomando en cuenta la cantidad de osteoide (violeta), la presencia de hueso maduro (azul oscuro) y la cantidad de tejido medular y adipocitos (tejido blanco con microesferas grises de células en formación, y bolsas de ácidos grasos). Con estas imágenes se evaluaron de forma cualitativa la estructura y densidad ósea global de los defectos regenerados con las membranas de estudio (SiO2/PLGA/P- O2), frente a los controles (PLGA sencillo). Nivel de regeneración ósea (porcentaje de hueso neoformado) en los defectos tratados con las membranas de estudio frente a los controles Para analizar cuantitativamente el porcentaje óseo neoformado se eligió la coloración Von Kossa (VK) (Sigma-Aldrich, EE.UU.), que se emplea para detectar la materia mineral calcificada mediante plata molecular. Esta técnica de marcaje corresponde a un método de sustitución del calcio por plata. El nitrato de plata se une Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 97 - sólo a la parte aniónica de las sales de calcio (fosfatos o carbonatos), compuesto que es de color amarillo y que expuesto al sol o a la luz adquiere color negro por reducción de la plata. Para llevar a cabo esta coloración se les añadió a cada corte histológico tres gotas de nitrato de plata al 5% durante 30 minutos en oscuridad. Seguidamente se le aplicaron tres lavados de tres minutos en agua destilada. Tras esto, se sumergieron en carbonato de sodio formaldehido durante dos minutos, y se lavaron en agua destilada durante unos segundos. El montaje de las muestras es idéntico al empleado en el apartado anterior para el azul de toluidina. Para la adquisición de imágenes se utilizó el microscopio óptico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Microscopy, LLC; EE.UU) y la cámara SONY 3CCD (DSP) (Sony Corp, Japón) junto con el software Smart Matrox Intelicam 8.0 (Matrox Imaging, Reino Unido) (Figura 39). Figura 39: Microscopio de óptico de campo claro + ordenador personal de cuantificación y análisis de datos estadísticos. Para calcular el porcentaje óseo neoformado se procedió a un enfoque con objetivo 10x para distinguir los límites del defecto óseo regenerado. Una vez localizado se procedió al enfoque con objetivo 4x para obtener imágenes digitales integrales, por separado, de los defectos y el hueso original a cada lado de los defectos. Para la cuantificación del nuevo tejido regenerado y su comparación con el original se analizaron las zonas de estudio en dirección de distal (externa) a proximal (interna), Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 98 - mediante análisis por regiones ROI de 11 mm (para cada defecto) y de 5 mm (en el hueso original). Posteriormente se transformó la imagen a blanco/negro por selección manual de umbrales gamma, y se calculó automáticamente los porcentajes medios totales de blanco y negro mediante el software informático Fiji-Image J 1.0 (JAVA, EE.UU.) Superficie ósea mineralizada (milímetros de hueso neoformado por día) en los grupos de estudio frente a los controles Para cuantificar los milímetros de superficie ósea mineralizada por día se eligió el marcaje con calceína, que se utiliza para poner de manifiesto la fijación del calcio tisular de nueva aposición. El par calceína / demeclociclina son marcadores fluorescentes, que emiten luz de diferente longitud de onda bajo fluorescencia. Son administrados por vía intravenosa y señalizan los procesos anabólicos de fijación ósea tisular. Esta prueba ofrece una visión mesurable a microscopio óptico del tejido óseo neoformado presentando dos líneas de diferenciación que corresponden con el hueso regenerado a uno y ocho días previos al sacrificio de los ejemplares ya que en esos momentos se les administró al animal los marcadores. El análisis histomorfométrico de la presencia del marcador y la distancia entre las señales es un método eficaz para determinar y cuantificar los mecanismos de crecimiento óseo y de adaptación funcional. El protocolo de administración para los ejemplares fue el siguiente:  Administración vía intravenosa de 5ml de la solución-1: 45mg de calceina + 0,1g de carbonato de sodio (SIGMA C0875; Sigma-Aldrich, EE.UU.) en 5 ml de suero fisiológico, a razón de 30mg/kg animal, ocho días antes del sacrificio.  Administración vía intravenosa de 5ml de solución-2: 45mg de demeclociclina hidrocloruro (SIGMA A6140; Sigma-Aldrich, EE.UU.) en 5ml de suero fisiológico, el día previo al sacrificio. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 99 - Una vez cortadas las muestras, éstas se montaron sin tinción alguna con una gota de etanol 80° sobre el porta y colocando suavemente el cubremuestras en cada material. Para la adquisición de imágenes se utilizó el microscopio óptico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Microscopy, LLC; EE.UU) y la cámara SONY 3CCD (DSP) (Sony Corp, Japón) junto con el software Smart Matrox Intelicam 8.0 (Matrox Imaging, Reino Unido) (Figura 39). Para la cuantificación de los milímetros de hueso neoformado por día se adquirieron imágenes con los instrumentos citados anteriormente con objetivo 20x y zoom 1,5, y se midió la distancia entre las marcas lineales naranja y verde, respectivamente de cada marcador fluorescente, y correspondientes al hueso aposicionado entre los días uno y ocho días antes del sacrificio. La medición se realizó en las regiones centrales de cada muestra y el hueso original. Posteriormente, se hizo una conversión proporcional entre las medias de las distancias mesuradas y el objetivo de adquisición empleado en el método, trasladando de este modo las medidas a milímetros. Finalmente dividiendo entre siete días, se obtuvieron los milímetros de hueso neoformado por día en cada defecto en ambos grupos. Actividad resortiva (osteoclastos por milímetro) en los grupos de estudio, frente a los controles Para comparar cuantitativamente los osteoclastos por milímetro de perímetro óseo de cada muestra, se utilizó la técnica de evidencia de la fosfatasa ácida tartrato de sodio resistente (TRAP). La TRAP es una hidrolasa ácida exclusiva de osteoclastos y preosteoclastos liberada al medio circundante por estas células durante la resorción ó reabsorción ósea para facilitar la disolución del hueso, y que se relaciona con el grado de vitalidad del tejido óseo. Esta coloración enzimática pone de evidencia la actividad osteoclástica del tejido óseo analizado marcando los osteoclastos de color rojizo. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 100 - Para ello se preparó la siguiente mezcla madre mediante agitación con palomita imantada y filtración en papel:  10 mg de naftol ASTR fosfato (SIGMA N-600; Sigma-Aldrich, EE.UU.)  50 μl de NN dimetilformamida  10 ml de tampón acetato de sodio anhidro (SIGMA S-2889; Sigma-Aldrich, EE.UU.) 0,1M en agua destilada, y mezclado con 100μl de ácido acético glacial (en campana de gases).  2 x 115mg de tartrato de sodio (SIGMA S-4797; Sigma-Aldrich, EE.UU.)  10mg de Fast Red TR Salt (ALDRICH 368881; Sigma-Aldrich, EE.UU.)  Se finaliza la mezcla filtrando en papel y ajustando el pH a 5,2. Tras escurrir muy bien las láminas, se añadió a cada muestra tres gotas de esta solución madre, se colocaron en caja portamuestras humidificadas con papel de filtro mojado en agua y se incubaron una hora a 37°C en estufa (Figura 40). Una vez finalizado este periodo se lavaron las muestras en agua destilada durante cinco minutos, y se contrastaron con azul de toluidina al 1% durante un minuto. Figura 40: Kit de tinción y estufa de secado para tratamientos enzimáticos (TRAP y ALP). Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 101 - El montaje de estas muestras fue al agua únicamente, añadiendo dos gotas de agua sobre las muestras y colocando el cubremuestras suavemente eliminando las posibles burbujas. Se mantuvo la hidratación permanentemente en refrigerador. Para comparar cuantitativamente la actividad resortiva del tejido óseo neoformado y del hueso original mediante la TRAP, cuyo resultado positivo son agregados rojizos celulares, se adquirieron imágenes a objetivo 4x de cada defecto óseo y del hueso original, y se cuantificó el número de osteoclastos por campo, tanto en las zonas de estudio, como en los controles y el hueso original. Posteriormente se calculó el promedio del número proporcional de osteoclastos por milímetro en la zona de los defectos (11 mm), y del hueso original (5 mm), lo que nos permitió valorar objetivamente el nivel resortivo aproximado del tejido analizado. Para la adquisición de imágenes se utilizó el microscopio óptico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Microscopy, LLC; EE.UU) y la cámara SONY 3CCD (DSP) (Sony Corp, Japón) junto con el software Smart Matrox Intelicam 8.0 (Matrox Imaging, Reino Unido) (Figura 39). Evaluación cualitativa de la aposición (actividad osteoblástica) en el grupo de estudio frente al control Para poner de manifiesto la actividad osteoblástica se utilizó la coloración enzimática de la fosfatasa alcalina (ALP). La ALP es una enzima característica de osteoblastos y preosteoblastos. Es una enzima hidrolasa marcadora de diferenciación osteosintética, responsable de formar colágeno tipo I y nódulos calcificados. Para realizar esta técnica se preparó una solución madre en oscuridad:  5,32 mg naftol ASTR fosfato (Sigma-Aldrich, EE.UU.) en 100μl de dimetil formamida con agitación.  8 mg de Fast Blue RR Salt (Sigma-Aldrich, EE.UU.).  10 ml de tampón Tris 0,1M ph 9 (Sigma-Aldrich, EE.UU.).  3,33 mg de cloruro de magnesio. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 102 -  Finalmente se filtró la preparación con papel y se ajustó el pH a 9. Se preincubaron las muestras en portamuestras durante diez minutos en una disolución de Tris-Triton al 0,1% mezclado previamente durante cinco horas, y elaborado mediante 5 ml de Triton X-100 + 45 ml de Tris 0,1 M (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Seguidamente se enjuagaron las láminas en tampón Tris 0,1 M a pH 9. Posteriormente se incubaron las muestras con tres gotas de la solución madre durante 30 minutos a 37°C en estufa, y se enjuagaron en tampón Tris 0,1 M a pH 9 (Sigma-Aldrich, EE.UU.). Para evaluar cualitativamente la presencia de actividad osteosintética positiva normal en los osteoblastos del tejido estudiado se utilizó la técnica de la ALP, cuyo resultado positivo son células marcadas de color azul-violeta (osteoblastos). Para ello se empleó un método de adquisición similar al de la TRAP, y se observó la presencia positiva normal de osteoblastos en cada uno de los defectos y el hueso original. Estas imágenes se incluyen para ilustrar objetivamente el nivel de aposición de los defectos de estudio frente a los controles. Para observar los detalles celulares y conseguir una buena discriminación, se utilizó un zoom x2 previa a la adquisición de las imágenes, que se realizó utilizando el microscopio óptico Zeis Axioscop Plus (Zeiss Microscopy, LLC; EE.UU) y la cámara SONY 3CCD (DSP) (Sony Corp, Japón) junto con el software Smart Matrox Intelicam 8.0 (Matrox Imaging, Reino Unido) (Figura 39). Análisis estadístico Para la valoración estadística de los resultados obtenidos se utilizó el análisis no paramétrico de U de Mann Whitney para comparación de los resultados obtenidos en ambos grupos de estudios, mediante el software STATVIEW F-4.5 en ordenador Mac. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 103 - 6. RESULTADOS Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación son los siguientes: 6.1. Evaluación cualitativa de la estructura y densidad ósea global Tras los ensayos con la coloración azul de toluidina (BT) se obtuvieron imágenes globales cualitativas de la estructura y densidad de los defectos regenerados tras un mes. Respecto al hueso original y los controles, se observó una estructura más estable y de mayor densidad ósea en los defectos regenerados con las membranas de SiO2/PLGA+ P-O2 frente a control. En los defectos óseos del grupo de estudio no se observó presencia de inflamación anormal, y se identificó una mayor semejanza con el hueso original que en los defectos controles, con mayor densidad de tejido medular (Figuras 41-43). Figura 41: Coloración BT en hueso original. Zonas marginales del defecto. Objetivo 5x. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 104 - Figura 42: Control PLGA. Figura 43 : SiO2/PLGA+P-O2. Microscopía óptica. Coloraciones. Azul de Toluidina (BT); Comparación de los niveles de hueso estructural en los diferentes nanocomposites respecto al control, tras un mes de regeneración; Objetivo 5x. 6.2. Nivel de regeneración ósea (porcentaje óseo neoformado) Las capturas digitales obtenidas tras la coloración de nitrato de plata (VK) ilustran las formaciones de fosfato cálcico durante la regeneración de los defectos óseos tras un mes de cicatrización, y confirman una mayor densidad de calcio mineral en las membranas del tipo SiO2/PLGA+P-O2, respecto a los controles de PLGA sencillo. Tomando los valores promedios y la desviación estándar de los resultados cuantitativos obtenidos en el estudio tras los análisis con coloración de Von Kossa (VK), se obtuvieron los siguientes resultados: los datos de porcentajes óseos neoformados medidos a un mes de reposo tras el postoperatorio fueron de 39,72 % ± 3,53 en las Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 105 - membranas funcionalizadas de estudio, frente a un 30,57% ± 1,96 en las membranas control (p < 0,05) (Figuras 44 y 45). Así mismo, los datos de las membranas funcionalizadas con silicio y plasma de oxígeno ofrecen menor diferencia respecto al nivel de hueso original que los defectos regenerados con las membranas controles, con un dato de +2,90 % ± 9,3) frente al - 12,03% ± 5,1) de los controles, respectivamente (p < 0,05) (Tabla 6). Figura 44: Control PLGA. Figura 45: SiO2/PLGA+P-O2. Microscopía óptica. Mineralización. Von Kossa: Comparación de los niveles de mineralización entre los tratamientos respecto al control, tras un mes postcirugía; Objetivo 5x. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 112 - las condiciones locales que presente la zona intervenida. En este último punto es donde se pretende incidir en el proyecto de investigación para mejorar la cicatrización ósea67. A la hora de decidir sobre la especie animal hay varios factores que hay que tener en cuenta. Según Schimandle y Boden 200, los factores de selección de animales son: el coste de adquisición y de cuidado de los animales, disponibilidad de los animales, aceptabilidad para la sociedad, tolerancia a la cautividad y facilidad para su espacio de habitabilidad. Otros factores que influyen son el cuidado, el mantenimiento, facilidad para la manipulación, resistencia a la infección y la enfermedad, características biológicas análogas a los seres humanos, tolerancia a la cirugía, instalaciones adecuadas y personal de apoyo. Además de esto la vida útil de las especies deben ser adecuadas para la duración del estudio. En nuestro caso es muy importante las características específicas del hueso y su posterior extrapolación de los resultados a la situación humana. Las normas internacionales en relación a las especies que son adecuadas para la implantación de materiales óseos, subrayan que los perros, ovejas, cabras, cerdos y conejos son animales adecuados. Aunque la rata es una de las especies más utilizadas en la investigación médica, no se puede tomar en cuanta en este tipo de ensayos debido a las diferencias entre los huesos humanos y el de las ratas, y la limitación para crear varios defectos. En nuestro caso, el conejo es uno de los animales más usados para la investigación médica, se utiliza en aproximadamente el 35% de los estudios de investigación musculo-esqueléticos201. Esto es en parte debido a la facilidad de manejo y tamaño. El conejo también alcanza su madurez esquelética en breve, alrededor de los seis meses de edad202. En cuanto a su estructura es evidente que hay grandes diferencias entre la anatomía ósea del conejo y el humano tanto en el tamaño, la forma y en la carga debido a las diferencias en las posturas entre las dos especies. Hay muy poca literatura sobre las diferencias entre la composición y la densidad ósea humana y la de los conejos, pero se han descrito algunas similitudes en la densidad mineral ósea (DMO) y en la resistencia a la fractura entre conejos y seres humanos203. En comparación con otras especies, como primates y algunos roedores, el conejo tiene un recambio esquelético y óseo más rápido202, 204. Aunque hay que tener esta consideración a la hora de extrapolar Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 113 - los resultados en humanos, los conejos se utilizan comúnmente para el cribado de materiales antes de hacer una prueba en un modelo animal mayor. Aportación del modelo animal Actualmente hay consenso en que la complejidad del micro-medioambiente tridimensional que envuelve a las células in vivo, incluyendo los cambios en el tiempo de fuerzas y estímulos, influye de modo significativo en los mecanismos de respuesta celular en términos de cambios fenotípicos, morfológicos y funcionales. Los modelos animales proveen de datos necesarios y adecuados antes de proceder con las aplicaciones humanas 65, 67, 152, 195. Una de las principales limitaciones del cultivo óseo es la falta controlada de carga fisiológica, ya que el hueso sin carga aumenta la resorción, como se puede apreciar en los pacientes después de un reposo prolongado205. Por estos motivos los modelos animales son esenciales para evaluar la biocompatibilidad, la respuesta de los tejidos y la función mecánica antes de la utilización clínica en el ser humano. Los modelos animales permiten la evaluación de los materiales en diferentes situaciones con o sin carga, en diferentes intervalos de tiempo y en diferentes calidades de tejido (por ejemplo hueso sano u osteopenia) y edades. Mientras que los modelos animales pueden representar la situación clínica, mecánica y fisiológica, hay que recordar que es sólo una aproximación, y que cada modelo animal tiene unas ventajas y desventajas. La regeneración ósea no sólo implica el crecimiento celular, ni la secreción de matriz ósea, sino también la creación y maduración de un tejido óseo de acuerdo a unas características estructurales necesarias para que pueda ejercer las funciones mecánicas propias de dicho tejido. Dicha maduración estructural es imposible de recrear fuera de un ser vivo. Por todo ello, y habiendo quedado demostrado la completa replicabilidad de los procesos aplicados en este ensayo, puede considerarse este estudio de origen como una gran ayuda en procesos de ROG para posteriores investigaciones clínicas de mayor complejidad. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 114 - Podemos afirmar que el uso de la calota ha sido acreditado en numerosos estudios, y presenta importantes ventajas frente a otras localizaciones de la anatomía del conejo que también podrían utilizarse:  El hueso presenta una amplia medular en sentido horizontal y un doble diploe (interno y externo). El diploe interno, que no debe dañarse, asegura la no realización de un mayor daño que el deseado. La medular asegura un alto aporte de sangre y células al defecto.  La arquitectura macroscópica del defecto en dicho hueso, que es plano, sin la convexidad propia de los huesos largos, favorece la adaptación de la membrana sobre el mismo, asegurando que no habrá despegamiento de la misma durante la experiencia, y haciendo que sea fiable todo el diseño propuesto.  El origen de la calota, por osificación membranosa, frente a la osificación endocondral, es similar a la de los huesos maxilares en el humano, por lo que la cercanía entre ambos hueso es mayor que la que encontraríamos entre otros huesos.  El tamaño de la calota del conejo, cuando se utilizan defectos medianos posibilita la realización de varios defectos, lo que permite que cada defecto tenga su control en el mismo animal, lo que permite disminuir el número de animales a estudiar, siempre que el efecto de la intervención a evaluar sea local, no sistémico, como el caso que nos ocupa.  El tamaño de los defectos, de 11 mm de diámetro, se decidió en base a bibliografías previas sobre la importancia de creación de defectos óseos críticos (no autoregenerables) por el propio organismo, y poder así elaborar una conclusión firme sobre la viabilidad de estas membranas en procesos ROG in vivo y su recomendación en futuro uso en ensayos clínicos en humanos 18, 42, 61, 206. Finalmente, las muestras obtenidas tras el sacrificio de los animales de experimentación deben ser convertidas en datos cuantitativos y objetivos que permitan comparar dimensiones como el crecimiento óseo, la presencia de osteoide y su Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 115 - cantidad, la cantidad y calidad del hueso neoformado (pudiendo diferenciarlo del residual tras crear el defecto), etc. Trascendencia de los biomateriales en la cirugía regenerativas Los requerimientos de nuevo hueso para restaurar o reemplazar el tejido óseo perdido o dañado es una de las mayores necesidades clínicas en la traumatología en la actualidad, siendo el daño total o parcial de tejido y la pérdida de la función de un órgano uno de los problemas más graves y costosos de la salud humana. Inicialmente, esos problemas se han abordado mediante el trasplante de órganos y tejidos alogénicos. Sin embargo, esta opción se ve limitada por la baja disponibilidad de donantes, los prejuicios y molestias derivadas, la complicación de la técnica y los efectos secundarios derivados del proceso21, 44. La ingeniería tisular, sin embargo, gracias a sus continuas investigaciones en el desarrollo de nuevos materiales para la reparación y la regeneración de tejidos, ha generado un gran avance en el siglo XXI, dando lugar al desarrollo de scaffolds y composites diseñados y modificados para ROG71, 207. Esta emergente área (la ingeniería de tejidos óseos), está diseñando y desarrollando materiales que pueden reensamblar la estructura nativa del hueso, centrándose principalmente en polímeros sintéticos para mimetizar la matriz extracelular proteica principal (MEC) del hueso, colágeno tipo I. Con el fin de regenerar completamente el hueso, están siendo evaluadas incorporaciones de metales y minerales como los óxidos metálicos y la hidroxiapatita (HA), a modo de sustratos de nanocomposites en los scaffolds, para ser implantados en los defectos óseos206. Los grandes avances que se han producido en ingeniería tisular han dado lugar a la aparición de técnicas que en la actualidad prometen ventajas como las que podrían estar relacionadas con la implantación quirúrgica de armazones osteoconductores, con transportadores de agentes biológicamente activos u osteoinductores, y finalmente con el trasplante de células aisladas o en soportes. Frecuentemente, elementos osteoconductores, osteoinductores y células óseas e indiferenciadas se combinan para Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 116 - tratar defectos óseos. Para los tratamientos de los defectos óseos segmentarios posttraumáticos, tradicionalmente se han venido utilizando técnicas como:  Aporte de hueso autólogo no vascularizado.  La osteogénesis por distracción así como la transposición de hueso vascularizado.  Aloinjertos. Las sustituciones óseas en cirugía oncológica son otra de las indicaciones para las nuevas tecnologías. Aparte de las indicaciones citadas, como también se ha mencionado, la incidencia alta de las osteolisis provocadas por el empleo de biomateriales constituye una fuente importante en la demanda de investigación tanto para la preservación del tejido y su buena función como para su regeneración en los casos de destrucción. Estudios recientes sugieren que el incremento de sobrecarga hospitalaria de las artroplastias en los próximos 20 años será notable. Las prótesis primarias de cadera, en algunos países aumentarán hasta en un 174%, mientras que las de rodilla llegarán a un 673%. Se incrementará también el número de recambios de prótesis que alcanzará el doble del actual en el año 2015 para las rodillas y en 2026 para las caderas. En general, las cifras de aumento de cirugías de revisión que se calculan entre los años 2005 y 2030 serán de un 137% para las caderas y un 601% para las rodillas. Entre 1990 y 2002, en Estados Unidos, la cirugía de revisión para las prótesis totales de caderas oscilaba entre un 15,2% y un 20,5% (media de 17,5%) y entre 7,5% y 9,7% (8,2% promedio) para las rodillas 45, 47-50, 54, 55, 63, 64, 151-155. Todo ello demuestra, en definitiva, no sólo la justificación de este trabajo de investigación, sino la eficiencia y relevancia de este tipo de materiales biocompatibles reabsorbibles de tercera generación en la práctica clínica humana para regeneración tisular guiada (RTG) y concretamente en la variante ósea (ROG), tanto en estos Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 117 - momentos como en épocas venideras donde el continuo desarrollo de estas modificaciones promete grandes e interesantes expectativas. Importancia de los polímeros de PLGA Hay una gran variedad de membranas poliméricas reabsorbibles que permiten procedimientos de regeneración ósea en un solo paso, reduciendo así las molestias, costes y las posibles complicaciones para el paciente. Estos recubrimientos poliméricos son especialmente interesantes en biomedicina debido tanto a la diversidad de sus propiedades químicas y físicas como a su similitud con los tejidos humanos. Estas membranas son biocompatibles, no tóxicas, no inmunogénicas y actuán como soporte durante la formación de hueso, pero no tienen propiedades bioactivas que promuevan la osteogénesis208-212. Se sabe que el PLGA se degrada por hidrólisis y es eliminado del organismo a través del ciclo de Krebs como dióxido de carbono y agua, por lo tanto, han sido utilizados con éxito como membranas reabsorbibles para la regeneración ósea guiada. Además está aprobado por la FDA (Food and Drugs Administration, EE.UU.) para multitud de aplicaciones, por lo que son utilizados comúnmente en investigaciones biomédicas51. Actualmente, los polilácticos, poliglicólicos y sus copolímeros y derivados son los polímeros biodegradables más comúnmente usados en ingeniería tisular, y el copolímero PLGA presenta mejores propiedades de degradación controlada que sus constituyentes monoméricos213. Sin embargo, el propio polímero es bastante bioinerte y no promueve una respuesta biológica significativa en las células óseas214. Algunos autores discuten sobre su biocompatibilidad porque los productos derivados de su degradación disminuyen el pH causando inflamación y reacción a cuerpo extraño in vivo215. Además los productos de la degradación ácida tienen el potencial de inhibir la formación de cristales de apatita216, inhibiendo a priori la osteointegración. Sus propiedades hidrofóbicas influyen negativamente en la adhesión celular, sin embargo para intentar reducir la inflamación y mejorar la biocompatibilidad del PLGA, se han añadido diferentes partículas con resultados muy positivos en el PLGA: Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 118 - nanopartículas de titanio195, 217, partículas de hueso desmineralizado215, y partículas de nanoapatita218. De esta forma se han desarrollado diferentes materiales a base de PLGA en forma de scaffolds, films, membranas, y nanopartículas. Las mejoras en el PLGA hace que cuando se utilizan como membranas estén dando muy buenos resultados en los procesos de regeneración ósea, y además se le están incorporando nuevos materiales para mejorar algunos de los puntos débiles antes mencionados219-221. Los scaffolds se usan para regenerar tejidos junto con células madres, y las nanopartículas de PLGA han demostrado un amplio beneficio en los campos de la endodoncia, caries, cirugía, implantes y periodoncia222. Como scaffolds se pueden utilizar solos, como transportadores de células o de fármacos223. Entre sus muchos campos de actuación están la regeneración del tejido cardiaco, la ciatrización y la regeneración ósea. Entre sus aplicaciones están las de transportar rhBMP-2 para promover la regeneración ósea224, añadir simvastatina que mejora la formación ósea225 y la utilización de beta fostato tricálcico226 que mejora las propiedades del material. A nivel microscócpico, diferentes términos han sido utilizados para describir a las nanopartículas: nanovehículos, nanosistemas, nanotubos y nanocristales. Entre sus ventajas está que penetran fácilmente en las celulas, aumenta la eficiencia del fármaco y mejora la actividad antibacteriana del medicamento227. El concepto de utilizar sistemas que mantengan concentraciones terapéuticas de medicamentos ha sido estudiado durante décadas con el objeto de minimizar los efectos de los fármacos libres228. Las micro y nanopatículas son los sistemas preferidos por su flexibilidad en la preparación y uso229. Una amplia variedad de sustancias han sido añadidas al PLGA para que se liberen lentamente y ayuden en el tratamiento periodontal y regenerativo: amoxicilina230, tetraciclina231, clorhexidina232 y corticoides como la dexametasona233 y todos con resultados esperanzadores. En general, los procesos de adición de factores de promoción ósea o biomateriales a las membranas de PLGA parecen mejorar los resultados195, 234, 235 en la regeneración del tejido óseo. Como en el caso nuestro que la adición de SiO2 y el Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 119 - tratamiento con plasma de oxígeno promueve más la regeneración ósea que las membranas de PLGA solas. Además de sus propiedades bioactivas, las características de la superficie son muy influyentes para la adhesión y el crecimiento celular y deben ser estudiadas con esmero a la hora de plantear el paso de un biomaterial a un medio ambiente biológico, donde cierta hidrofilicidad en los materiales ayudará a las conexiones entre las células y el scaffold para controlar la adhesión celular y mantener las expresiones fenotípicas de diferenciación20. El test mecánico también debe de desarrollarse bajo condiciones fisiológicas, ya que todos los scaffolds se desarrollan para ser usados en un cuerpo vivo donde hay multitud de fluidos tisulares y una temperatura de 37°C71 . Según Liao, el PLGA tiene un excelente módulo de elasticidad que es equivalente al de los ligamentos interóseos236 que le confiere unas excelentes propiedades mecánicas. En cuanto a las perspectivas sobre este tipo de materiales, es evidente el gran avance científico y tecnológico que ha traído consigo la incursión de los biopolímeros en el área de la salud, al permitir una mejora sobre los sistemas terapéuticos convencionales en aras de obtener líneas de trabajo tendentes a lograr terapias inteligentes a la medida de cada paciente o situación patológica. Nuestro scaffold de poliláctico-co-poliglicólico en forma de membranas ha resultado de fácil manejo y manipulación, no observándose desplazamiento tras la implantación. Así mismo, no se observó inflamación anormal ni signos claros o síntomas de alergia, reacción inmunológica o incompatibilidad en ninguno de los defectos tras el periodo de reposo analizado, el material implantado fue bien tolerado por el tejido blando subyacente sin evidencias de necrosis, considerándose por tanto al PLGA como alternativa viable y recomendable para los procesos de ROG in situ. Los defectos situados en el cráneo y la cara, en contraste con otros huesos corporales, necesitan de materiales de degradación rápida de alrededor de semanas, para una correcta absorción y de esta forma facilitar el crecimiento y regeneración del tejido óseo donde son implantados. No obstante, todo el material implantado debió ser progresivamente degradado durante el primer período de regeneración y totalmente reemplazado por el nuevo tejido en regeneración, ya que tras cuatro semanas no se Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 120 - observaron evidencias del mismo en los cortes histológicos tras los análisis de Von Kossa y azul de toluidina, lo que sugiere la biocompatibilidad razonable del mismo151. Tal y como se ha remarcado anteriormente, los requerimientos de los scaffolds para ROG son muy complejos, ya que deben tener en cuenta multitud de variables para un correcto comportamiento del material en el tejido implantado y llevar a cabo la función para la cual está diseñado150, 237-239. Importancia de la rugosidad y del plasma de oxígeno Los procesos por los que se produce la adhesión celular están determinados por las propiedades físicas y químicas de su superficie. La adhesión que se produce al inicio entre una célula y la superficie del biomaterial determinará los siguientes procesos como morfología, migración, proliferación y diferenciación163. Una vez que se ha producido la adhesión celular, la formación de la capa de apatita se verá determinada por la textura y funcionalidad de la superficie del material, incluyendo la orientación cristalina del sílice superfical171. Es muy interesante determinar de forma aislada el papel que juega cada una de las propiedades superficiales de los biomateriales. Sin embargo, las superficies son muy heterogéneas por los diferentes tipos de grupos químicos funcionales, textura, rugosidad y áreas hidrofílicas e hidrofóbicas. El estudio del efecto causado por cada una de estas propiedades es complejo, porque además la modificación de alguna de ellas tiene efecto en alguna otra. Tan importante como la composición química de la superficie, es la micro y nanotopografía de la superficie240,241. Es por ello que hemos utilizado una superficie nanorugosa fabricada a través de plasma de oxígeno. Dimensiones menores a la micra influyen en los contactos focales, el citoesqueleto, la adhesión, la morfología y la orientación de las células242. En el rango de 1-100 micras la superficie rugosa influye en las células sobre su adhesión, morfología, orientación y formación ósea242. En intervalos mayores a 100 micras, los cambios son muy importantes para la micro-retención243. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 121 - En la osteogénesis, son muy importantes las primeras fases de cicatrización como es la formación del coágulo. Una vez que se forma éste, por adsorción se pegan al elemento de soporte una gran variedad de proteínas sobre su superficie. Las proteínas están formadas por péptidos y a su vez por aminoácidos que son las biomoléculas más pequeñas. Por ello podemos entender que la adsorción de proteínas sobre la superficie es un factor que determina su buena biocompatibilidad. Estas proteínas las podemos entender como ligandos específicos para cada célula que promoverán genéticamente la quimiotaxis, proliferación, crecimiento y diferenciación celular244. Estas proteínas que provienen del plasma o suero del paciente tienen una gran importancia en la adhesión de las plaquetas, liberarán una gran cantidad de factores de crecimiento y quimiotácticos que darán lugar a la proliferación y diferenciación de células osteogénicas, por lo que la adsorción de proteínas a las que se adhieren plaquetas es un factor osteoconductivo muy importante186, 245, 246. Algunas de las proteínas que se unen son fibronectina, vitronectina, elastina, laminina y colágeno que tienen un especial interés en la formación de la malla de fibrina del coágulo. Estas proteínas se unen específicamente a las células osteogénicas de una manera única gracias los receptores de membrana. Gracias a estos receptores podemos plantearnos el uso de proteínas específicas de osteoblastos y huir de adhesiones inespecíficas o de células de tejido blando186, 245. Una vez se ha formado la malla de fibrina (gracias a la adsorción de la fibronectina), los osteoblastos se podrán adherir a ésta y migrar por este scaffold tridimensional y llegar al metal donde comenzarán a depositar la matriz orgánica de colágeno que se irá mineralizando poco a poco. A esta unión a modo de interdigatación micro-mecánica se le conoce como cement line. Por eso una superficie rugosa a la que se pueda adherir más fácilmente las células es crucial para que se forme la matriz ósea por la que se pegará a la superficie de la membrana186, 245, 246. Un diseño adecuado de la topografía de la superficie de la membrana puede mejorar su potencial adhesivo y la capacidad de las células para unirse a la interfaz sustrato-célula; y ayudar a dirigir y a organizar la adhesión y la diferenciación de las células óseas con el fin de facilitar una buena regeneración del tejido43. A su vez, la calidad de la adhesión celular está relacionada con la morfología de las células y su Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 128 - original preexistente en la calota, parece evidente que la membrana con nanocomposites de óxido de silicio y pretratamiento con plasma de oxígeno tiene mayor potencial osteoregenerador frente al control75. Los ensayos de marcaje con calceína muestran la prueba más concluyente del estudio, mostrando el doble de milímetros de mineral neoformado en los defectos regenerados con las membranas con plasma y silicio respecto a los defectos controles. Por tanto, el tratamiento con plasma de oxígeno (P-O2) en las membranas de este trabajo parece aumentar la capacidad osteoinductora de las mismas, impulsada por los nanocomposites de óxido de silicio, dato que queda respaldado también en los análisis de la fosfatasa ácida (TRAP). Todas las membranas estudiadas son biocompatibles. En todos los casos se encontraron una capa de tejido cortical denso endocraneal junto con una capa de hueso espeso exocraneal, que proporcionan una gran estabilidad al hueso neoformado195. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 129 - 8. CONCLUSIONES Las conclusiones obtenidas en nuestro estudio, en base a los estudios de experimentación animal realizada in vivo en conejos raza New-Zeland mediante ensayos de regeneración ósea guiada (ROG) son las siguientes: 1. Las membranas de ácido poliláctico-co-poliglicólico modificadas a escala nanométrica con óxido de silicio y pretratamiento físico de plasma de oxígeno (SiO2/PLGA +P- O2), en comparación a los controles sin estas modificaciones (PLGA sencillo), presentan un rendimiento más adecuado, disminuyendo notablemente las diferencias estructurales de los defectos cicatrizados y estudiados un mes tras la intervención quirúrgica respecto al hueso original preexistente, en este grupo frente al grupo control. 2. La adición de nanocomposites de óxido de silicio junto con el pretratamiento físico de plasma de oxígeno a las membranas sencillas de PLGA tiene como efecto, mostrado claramente en los resultados de nuestro estudio, un aumento de la capacidad regeneradora del tejido óseo en los defectos estudiados: densidad ósea, porcentaje de hueso neoformado, actividad osteoblástica y actividad osteoclástica. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 130 - 3. No se han observado signos de inflamación tisular anormal, reacción alérgica o incompatibilidad física o química de ningún tipo en ninguna de las muestras analizadas, por lo que puede afirmarse que las membranas estudiadas son biocompatibles con el tejido óseo sobre el que se han utilizado. 4. A raíz de nuestros resultados, es aconsejable la realización de futuros estudios para avanzar en una posible aplicación de las membranas desarrolladas en regeneración ósea guiada en humanos. Tesis Doctoral Antonio Batista Cruzado - 131 - 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Burger EH, Klein-Nulend J, Van der Plas A, Nijweide PJ. Function of osteocytes in bone - their role in mechanotransduction. J Nutr. 1995;125:2020S-3S. 2. Duncan RL, Turner CH. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcif Tissue Int. 1995;57:344-58. 3. Marotti G, Palumbo C. The mechanism of transduction of mechanical strains into biological signals at the bone cellular level. 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