Glicodendrones como plataformas multivalentes para la transferencia selectiva de moléculas de interés biológico

GLICODENDRONES COMO PLATAFORMAS MULTIVALENTES PARA LA TRANSFERENCIA SELECTIVA DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO Mª Oli ia Sánchez Maldonado Se illa , 2010 CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS ISLA DE LA CARTUJA GLICODENDRONES COMO PLATAFORMAS MULTIVALENTES PARA LA TRANSFERENCIA SELECTIVA DE MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOLÓGICO Memo ia p esen ada po la Licenciada Mª Oli ia Sánchez Maldonado pa a op a al g ado de Doc o en Química Se illa, 2010 INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA D . F ancisco Ja ie Rojo Ma cos, Cien í ico Ti ula del C.S.I.C. CERTIFICA: Que el p esen e abajo i ulado: “Glicodend ones como pla a o mas mul i alen es pa a la ans e encia selec i a de moléculas de in e és biológico” ha sido ealizado bajo mi di ección y aseso amien o en los labo a o ios del Ins i u o de In es igaciones Químicas del Cen o de In es igaciones Cien í icas Isla de la Ca uja (Se illa) cons i uyendo la Memo ia que p esen a la Lcda. Mª Oli ia Sánchez Maldonado pa a aspi a al g ado de Doc o en Química. Se illa, Sep iemb e de 2010 Fdo.: F ancisco Ja ie Rojo Ma cos ÍNDICE 1. In oducción . 3 1.1. Los ca bohid a os en la na u aleza . 3 1.2. Modelos a i iciales de sis emas mul i alen es de ca bohid a os . 6 1.3. Dend íme os . 8 1.3.1. Ca ac e ís icas gene ales de los dend íme os . 8 1.3.2. Es a egias sin é icas pa a la p epa ación de dend íme os . 10 1.4. Glicodend íme os . 14 1.5. Respues a inmune y células dend í icas . 25 1.5.1. DC - SIGN, ecep o de es uc u as oligosaca ídicas . 29 1.5.2. Ac i a ción de la espues a inmune po in e acción con el ecep o DC-SIGN. 34 2. An eceden es y obje i os . 47 2.1. An eceden es del G upo de In es igación . 47 2.2. Obje i os . 53 3. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido bis - MPA . 57 3.1. Sín esis di e gen e de dend ones basados en el ácido 2,2 - bis - (hid oxime il)p opiónico empleando como núcleo TRIS. 63 3.1.1. Sín esis del sopo e dend í ico . 63 3.1.2. Sín esis del glicodend ón 3GTBoc(SucMan) 24 y del co espondien e con ol 3GTBoc(SucC) 24 . 67 3.1.3. Análisis de la in e ación usando biosenso es . 73 3.1.3.1. Biosenso con de ección SPR . 74 3.1.3.2. E aluación de la inhibición de la in e acción gp120/DC - SIGN usando el glicodend ón 3GTBoc(SucMan) 24 . 77 3.1.4. Modi icación de la posición ocal de dend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico empleando como núcleo TRIS. 79 3.2. Dend ones basados en el ácido 2,2 - bis - (hid oxime il)p opiónico con espaciado . 83 3.2.1. Sín esis del sopo e dend í ico . 83 3.2.2. Sín esis de los glicodend ones de p ime a y segunda gene ación . 89 3.2.3. Análisis de la ac i idad de 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 usando biosenso es. 101 4. Ma caje luo escen e e in e nalización . 107 4.1. Ma caje luo escen e del glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 . 107 4.2. Sín esis y ma caje luo escen e de dend ones con ol . 113 4.3. Es udios de in e na lización de los glicoconjugados 2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 . 124 5. Conjugación de biomoléculas . 133 5.1. Adición quimioselec i a . 135 5.2. Sín esis de glicoconjugados a a és de de i ados de maleimida . 142 5.2.1. Acoplamien o del glicodend ón 54 a un pép ido modelo . 146 5.2.2. Acoplamien o de glicodend ón 54 a un oligonucleó ido modelo . 152 6. Conclusiones . 163 7. Pa e expe imen al . 169 7.1. Disol en es y eac i os . 169 7.2. Técnicas y apa a os . 170 7.3. Ca ac e ización . 172 7.3.1. Sín esis di e gen e de dend ones basados en el ácido 2,2 - bis(hid oxime il)p opiónico empleando como núcleo TRIS. 172 7.3.2. Dend ones basados en el ácido 2,2 - bis - (hid oxime il)p opiónico con espaciado . 192 7.3.3. Ma caje luo escen e de dend ones . 210 7.3.4. Conjugación de biomoléculas . 223 Anexo 1. Es uc u as y ab e ia u as de aminoácidos . 231 Anexo 2. Es uc u as y ab e ia u as de nucleó idos . 237 Anexo 3. Espec os . 241 Capí ulo 1 In oducción In oducción 3 1. In oducción. 1.1. Los ca bohid a os en la na u aleza. La supe icie de la mayo ía de las células de mamí e os se encuen a cubie a po una densa capa de ca bohid a os denominada glicocálix. Es os ca bohid a os apa ecen undamen almen e conjugados a o as biomoléculas (p o eínas y lípidos), dando luga a las denominadas glicop o eínas y los glicolípidos, espec i amen e. 1 Los glicolípidos y glicop o eínas es án in oluc ados en nume osos p ocesos biológicos de adhesión y econocimien o célula-célula y célula-ma iz ex acelula a a és de la in e acción con sus co espondien es ecep o es ( undamen almen e in e acción p o eína-ca bohid a o) (Figu a 1). 2 En e es os p ocesos biológicos na u ales o pa ológicos cabe des aca la emb iogénesis, 3 la di e enciación celula , 4 el p oceso in lama o io, 5 la me ás asis, 6 e c. 1 Dwek, R.A. Chem. Re . 1996, 96, 683-720. 2 Feizi, T. Cu . Opin. S uc . Biol. 1993, 3, 701-710. 3 Mu ama su, T. J. Cell. Biochem. 1988, 36, 1-14. 4 Hakomo i, S. Ann. Re . Biochem. 1981, 50, 733-740. 5 Lasky, L.A. Ann. Re . Biochem. 1995, 64, 113-139. 6 Mu ama su, T. Glycobiology 1993, 3, 291-296. Capí ulo 1 4 Figu a 1. Rep esen ación de alguno de los di e en es p ocesos na u ales e in ecciosos de econocimien o en los que es án implicados los glicoconjugados de la supe icie celula . Las in e acciones de los ca bohid a os con sus ecep o es son al amen e selec i as y, en la mayo ía de los casos, dependien es de ca iones di alen es ( undamen almen e calcio); sin emba go, es as in e acciones p esen an una baja a inidad, sol en ada en la na u aleza po una p esen ación mul i alen e de los ca bohid a os y del ecep o . 7 La combinación de múl iples in e acciones en e dos o más unidades de ca bohid a o y su co espondien e ecep o mul imé ico, da luga a las llamadas in e acciones mul i alen es, ambién conocido como e ec o clus e (Figu a 2). 8 Es as in e acciones mul i alen es p esen an en ajas uncionales sob e las in e acciones mono alen es; no solo aumen an la a inidad de o ma signi ica i a, sino que ambién aumen an la especi icidad de la in e acción y po lo an o, del p oceso de econocimien o molecula . 7 Lundquis , J.J.; Toone, E.J. Chem. Re . 2002, 102, 555-578. 8 (a) Lee, Y.C.; Lee, R.T. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 321-327. (b) Mammen, M.; Choi, S.K.; Whi esides, G.M. Angew. Chem. In . Ed. 1998, 37, 2754-2794. In oducción 5 Recep o mono alen e Ligando mono alen e In e acción mono alen e Recep o mul i alen e Ligando mul i alen e In e acción Mul i alen e A B Figu a 2. Rep esen ación gene al de una in e acción ligando- ecep o mono alen e (A) y una in e acción ligando- ecep o mul i alen e (B). Pa a en ende co ec amen e el “e ec o clus e ” es necesa io es ablece las di e encias en e coope a i idad y mul i alencia. 9 La coope a i idad desc ibe la in luencia que puede ene sob e u u as uniones la unión de un ligando mono alen e sob e su ecep o si és e posee a ios si ios ac i os. La coope a i idad puede se posi i a o siné gica cuando la a inidad po la segunda unión es mayo que po la p ime a; nega i a o in e e en e, cuando dicha a inidad es meno ; o no coope a i a o adi i a cuando la magni ud de las uniones es la misma. Los ligandos que se unen sob e los dis in os si ios ac i os no ienen po qué se los mismos. El ejemplo más cla o de coope a i idad desc i o en la na u aleza es la oxigenación alos é ica de la hemoglobina, donde es a p o eína e amé ica se une a cua o moléculas de oxígeno con a inidad c ecien e has a que los cua o si ios ac i os p esen es es án ocupados. 10 Po o o lado, la mul i alencia implica la unión simul ánea de dos o más ligandos idén icos, que descansan sob e un mismo sopo e, y un ecep o múl iple que a 9 Badjic, J.D.; Nelson, A.; Can ill, S.J.; Tu nbull,W.C.; S odda , J.F. Acc. Chem. Res. 2005, 38, 723-732. 10 Ea on, W.A.; Hen y, E.R.; Ho ich e , J.; Mozza elli, A. Na . S uc . Biol. 1999, 6, 351-358. Capí ulo 1 6 su ez se encuen a sob e una misma en idad, siendo la in ensidad de la in e acción a ios ó denes de magni ud mayo que la co espondien e a la in e acción mono alen e. Los sis emas mul i alen es de ca bohid a os de o igen na u al son di íciles de ob ene de sus uen es na u ales, dada su escasez, así como la di icul ad de aisla los pu os. En la mayo ía de los casos, es os sis emas na u ales se encuen an como mezclas de compues os (glico o mas), sis emas muy pa ecidos en los que a ían en mayo o meno medida el ipo de ca bohid a o o la posición que ocupan es os ca bohid a os en el glicoconjugado, siendo muy complicada su sepa ación. 1.2. Modelos a i iciales de sis emas mul i alen es de ca bohid a os. El es udio de los p ocesos molecula es (biológicos) en los que pa icipan de o ma ac i a los ca bohid a os equie e el desa ollo de he amien as que pe mi an una p esen ación mul i alen e de dichos ca bohid a os. En la bibliog a ía se encuen an desc i os nume osos modelos de sis emas mul i alen es de ca bohid a os pa a el es udio de es os p ocesos biológicos. 11 El diseño de es os sis emas es á basado en imi a a los glicoconjugados na u ales que es án in oluc ados en dichos p ocesos biológicos. Es os sis emas a i iciales consis en undamen almen e en sopo es de muy di e sa na u aleza sob e los que se unen a ias copias del ca bohid a o, o iginando una p esen ación mul i alen e del mismo. 12 La unión del ca bohid a o al sopo e se es ablece no malmen e a a és de un espaciado , que p opo ciona el medio de anclaje, así como una sepa ación su icien e en e el sopo e y el ligando pa a que el p ime o no in e ie a en la in e acción. En e los sis emas mul i alen es más usados cabe des aca los pép idos y p o eínas, 13 los 11 Houseman, T.B.; M ksich, M. Top. Cu . Chem. 2002, 218, 1-44. 12 Ma os, V.; Cas eño, P.; Vale o, J.; de Mendoza, J. Cu . Opin. Chem. Biol. 2008, 12, 698-706. 13 Da is, B.G. Science 2004, 303, 480-482. In oducción 7 liposomas, 14 los dend íme os, 15 los calixa enos, 16 las ciclodex inas, 17 oligóme os y políme os, 18 y las nanopa ículas 19 (Figu a 3). Figu a 3. Rep esen ación de di e en es sis emas modelo mul i alen es de ca bohid a os. El diseño y p epa ación de sis emas mul i alen es sin é icos de ca bohid a o pe mi e un acceso a una can idad mayo de compues o y a un mayo con ol sob e la es uc u a, la pu eza, la na u aleza del sopo e, la mul i alencia (núme o de copias de ca bohid a os p esen es), e c. En e odos es os sis emas mul i alen es, los dend íme os cons i uyen unos sis emas muy in e esan es. Dado que el abajo que se desc ibe en es a memo ia se cen a en el uso de es os sis emas como sopo e mul i alen e, en el siguien e apa ado desc ibi emos las ca ac e ís icas más in e esan es de los mismos. 14 (a) B ewe , G.J.; Ma inyan, N. Biochemis y 1992, 31, 1816-1820. (b) S ewa , R.J.; Boggs, J.M. Biochemis y 1993, 32, 10666-10674. 15 Röckendo , N.; Lindho s , T.H. Top. Cu . Chem. 2001, 217, 201-238. 16 Dondoni, A.; Ma a, A.; Sche mann, M.C.; Casna i, A.; Sansone, F.; Unga o, R. Chem. Eu . J. 1997, 3, 1774-1782. 17 Roy, R.; He nández-Ma eo, F.; San oyo-González, F. J. O g. Chem. 2000, 65, 8743-8746. 18 Roy, R. Cu . Opin. S uc . Biol. 1996, 6, 692-702. 19 de la Fuen e, J.M.; Ba ien os, A.G.; Rojas, T.C.; Rojo, J.; Cañada, F.J.; Fe nández, A.; Penadés, S. Angew. Chem. In . Ed. 2001, 40, 2258-2261. Capí ulo 1 14 N NH N NH N HN O O NH H2N O HN NH2 O NH H2N O HN H2N O O N O N H N N HN N H N O O H N H2NO HN H2NO HN H2N O N H H2N O N HN N N H N H N O O N HNH2 O NH NH2 O N H NH2 O H N NH2 O O N ONN H N NH N N H O O NH NH2 O H NNH2 O NH H2N OHN NH2 O N N N H2NH2N H2N H2N N N N H2N H2N H2N H2N N N N NH2 NH2 NH2 NH2 NN NNH2 NH2 NH2 NH2 NN AB PAMAM G2 PPI G3 O O O OO OOH OH OH OH O O O O O OH OH OH OH O O O OO HO HO HO HO O O O O O O HO HO HO HO O O HO O O HO HO O OH OH O OOH OH O O O O O O HO OH OH HO O HO HO O OOH O OH OH O OH O HO HO O OH O HO O HO OH CD Poliglice ol Bol o n BH20 Figu a 10. Es uc u as de algunos sopo es dend imé icos disponibles come cialmen e. Como hemos comen ado an e io men e, los dend íme os poseen múl iples uncionalidades en su pe i e ia, lo que pe mi e in oduci múl iples ligandos en su supe icie. En o as palab as, son pla a o mas ideales pa a la p esen ación mul i alen e de ligandos. Dependiendo de la es uc u a y gene ación del dend íme o se puede modula la mul i alencia así como la p esen ación de es os ligandos en la supe icie del dend íme o. La u ilización de ca bohid a os como ligandos pe mi e dispone de una p esen ación mul i alen e de és os, aspec o undamen al pa a pode en ende y pa icipa en los p ocesos biológicos en los que es án implicados dichos ca bohid a os. 1.4. Glicodend íme os. Los glicodend íme os son un ipo de dend íme os que inco po an ca bohid a os en su es uc u a. Es e ipo de compues os pueden se clasi icados en es g upos di e en es: los que con ienen ca bohid a os en la supe icie (Figu a 11A), los que In oducción 15 su núcleo es un ca bohid a o (Figu a 11B) y aquellos cuya es uc u a es a basada en ca bohid a os (Figu a 11C). En nues o caso, y dado el obje i o de la p esen e memo ia nos amos a cen a en aquellos en los que los ca bohid a os se encuen an en la supe icie de los dend íme os. Figu a 11. Tipos de glicodend íme os. Como hemos comen ado an e io men e, los dend íme os se ca ac e izan po su al a ami icación al ededo de un núcleo poli uncional, posibili ando la al a uncionalización de la supe icie. Cuando es os g upos pe i é icos es án cons i uidos po ca bohid a os se ob ienen lo que se denomina glicodend íme os. Debido al g an núme o de posibilidades exis en es, los glicodend íme os pueden se de muy di e sa na u aleza dependiendo de la es uc u a dend í ica, así como de los ca bohid a os exis en es en su supe icie. El núme o de ejemplos que se desc iben en la bibliog a ía es muy amplio po lo que se ha decidido selecciona algunos ejemplos a modo ilus a i o de la di e sidad de es uc u as y mé odos de p epa a es os compues os. 24,7 Cen ándonos en los glicodend íme os con ligandos ca bohid a o en su supe icie (Figu a 11A), la uncionalización de dend íme os come ciales ha sido un mé odo muy ú il pa a la ob ención de glicoconjugados poli alen es en un núme o educido de e apas. Es po an o lógico que se haya explo ado ex ensamen e es a me odología, sob e odo empleando dos ipos de dend íme os come ciales, PAMAM y 24 (a) Okada, M. P og. Polym. Sci. 2001, 26, 67-104. (b) Tu nbull, W.B.; S odda , J.F. Re . Mol. Bio echol. 2002, 90, 231-255. (c) Bezouska, K. Re . Mol. Bio ech. 2002, 90, 269-290. (d) Lindho s , T.K. Top. Cu . Chem. 2002, 218, 201-235. 7 Lundquis , J.J.; Toone, E.J. Chem. Re . 2002, 102, 555-578. Capí ulo 1 16 PPI. Ambos dend íme os ienen un esquele o basado en aminas e cia ias y disponen de aminas p ima ias en su supe icie que pueden eacciona con o as moléculas o g upos uncionales o mando enlaces amida, u ea o iou ea. Así, S odda y colabo ado es 25 p epa a on glicodend íme os de has a quin a gene ación, basados en el dend íme o PPI, que con enían 64 unidades de galac osa o lac osa en la supe icie. Pa a ello, hicie on eacciona un equi alen e del co espondien e glicosil NHS-és e (N- hid oxisucinimida) con los g upos amino del dend íme o (Figu a 12). Figu a 12. Sín esis de glicodend íme os PPI de lac osa. Aunque es a es a egia pa ece limi ada po la escasa a iedad de dend íme os come ciales, ha sido posible ob ene di e en es glicodend íme os modi icando, po ejemplo, los espaciado es que unen el esquele o dend í ico con los azúca es. Es e mismo g upo de in es igación 26 modi icó la longi ud de es os espaciado es has a en 10 unidades de me ileno a iando la densidad supe icial de los ca bohid a os. Es e aspec o es in e esan e debido a que Roy y colabo ado es 27 obse a on que las a inidades 25 Ash on, P.R.; Boyd, S.E.; B own, C.L.; Nepogodie , S.A.; Meije , E.W.; Pee lings, H.W.I.; S odda , J.F. Chem. Eu . J. 1997, 3, 974-983. 26 Pee lings, H.W.I.; Nepogodie , S.A.; S odda , J.F.; Meije , E.W. Eu . J. O g. Chem. 1998, 9, 1879-1886. 27 Pagé, D.; Roy, R. Bioconjuga e Chem. 1997, 8, 714-723. In oducción 17 de es os dend íme os pod ían disminui a pa i de cie a alencia, debido a impedimen os es é icos. O a o ma de in oduci di e sidad en es e ipo de glicodend íme os es la unión de glicodend ones, p e iamen e p epa ados, a dend íme os come ciales usando és os como núcleos. Es a me odología ue empleada po S odda y colabo ado es 25 usando iadas dend imé icas de galac osa que se unie on al dend íme o come cial PPI de baja gene ación (Figu a 13). Figu a 13. Glicodend íme o de p ime a gene ación de galac osa empleando como núcleo PPI. En la sín esis de glicodend íme os ambién se han empleado dend íme os no come ciales. Así Roy y colabo ado es 28 sin e iza on dend ones basados en la N,N-bis(3- aminop opil)glicina (Figu a 14) y ambién basados en el ácido N,N-bis(3- aminop opil)succinámico median e una es a egia en ase sólida. 29 En ambos casos se comple aba la sín esis en una e apa di e gen e inal uncionalizando los g upos pe i é icos con ácidos siálicos median e la o mación de ioés e es y amidas espec i amen e. 28 Zanini D.; Roy, R. J. O g. Chem. 1996, 61, 7348-7354. 29 Llina es, M.; Roy, R. Chem. Commun. 1997, 2119-2120. Capí ulo 1 18 N HN HN O O N H N HN O O N HN N H O O S O COOH HO HO HO OH AcHN S O COOH HO HO HO OH AcHN S O HOOC HO OH HO OH AcHN S O HOOC HO HO HO OH AcHN OH O Figu a 14. Glicodend íme o basado en la N,N-bis (3-aminop opil)glicina. O a al e na i a pa a lle a a cabo la sín esis de glicodend íme os es median e el uso de una es a egia con e gen e, en la que se pa e de azúca es simples o pequeños glicoclus e s que se unen a unidades ami icadas aumen ando su amaño pa a inalmen e conjuga se a un núcleo. La p epa ación de es os dend íme os se puede lle a a cabo u ilizando unidades de epe ición ami icadas p e iamen e sin e izadas de modo que pe mi en una cons ucción más ápida de g andes es uc u as. Así, el dend ón de is(hid oxime ilamino)me ano uncionalizado con di e en es monosacá idos pe ace ilados se ha unido a di e en es unidades de epe ición bi o iden adas así como a di e en es núcleos mul iden ados, pa a la sín esis de dend íme os que p esen an 9, 18 y 36 unidades de monosacá ido en su pe i e ia. La p ime a ap oximación se ealizó usando β-D-glucopi anosa 30 como ca bohid a o y más a de se ex endió a la sín esis de de i ados de α-D-manopi anosa (Figu a 15). 31 30 (a) Ash on, P.R.; Boyd, S.E.; B own, C.L.; Jaya aman, N.; Nepogodie , S.A.; S odda , J.F. Chem. Eu . J. 1996, 2, 1115-1128. (b) Ash on, P.R.; Boyd, S.E.; B own, C.L.; Jaya aman, N.; S odda , J.F. Angew. Chem. In . Ed. 1997, 36, 732-735. 31 Ash on, P.R.; Hounsell, E.F.; Jaya aman, N.; Nielsen, T.M.; Spence , N.; S odda , J.F.; Young, M. J. O g. Chem. 1998, 63, 3429-3437. In oducción 19 Figu a 15. Sín esis con e gen e de glicodend íme os de manosa. La mayo ía de las sín esis de dend íme os mencionadas has a el momen o implican la u ilización de ca bohid a os p o egidos. Es o se debe a que los g upos hid oxilo lib es pueden in e e i en las eacciones de acoplamien o u ilizadas en la sín esis de glicodend íme os. Además, la na u aleza al amen e pola de los azúca es los Capí ulo 1 20 hacen inadecuados pa a la pu i icación median e c oma og a ía en gel de sílice. Sin emba go, los g upos p o ec o es aen asociado un aumen o en el impedimen o es é ico que puede se impo an e en sis emas de ele ada gene ación con un g an núme o de ca bohid a os. Pa a sol en a es e p oblema, S odda y colabo ado es 32 desc ibie on la sín esis de glicodend íme os usando ca bohid a os o almen e desp o egidos, po o mación de enlaces amida en e un glicoclus e desp o egido con eniendo un g upo amino y un núcleo con és e es ac i ados con N-hid oxisuccinimida (Figu a 16). Figu a 16. Sín esis de glicodend íme os a pa i de azúca es desp o egidos. O os mé odos pa a la de i a izacion de dend íme os con g upos amino e minales se lle a on a cabo median e la ape u a de anillos de aldolac onas, 33 o o mación de iou eas con iso iociana os (Figu a 17). 34 32 Jaya aman N.; S odda , J.F. Te ahed on Le . 1997, 38, 6767-6770. 33 Aoi, K.; I oh, K.; Okada, M. Mac omolecules 1995, 28, 5391-5393. 34 Kiebu g, C.; Dubbe , M.; Lindho s , T.K. Synle 1997, 1447-1449. In oducción 21 Figu a 17. Acoplamien o di ec o de azúca es ac i ados como iso iociana os (a) y glicolac onas (b) a dend íme os que con ienen g upos amino p ima ios en su supe icie. La impo ancia de los glicodend íme os se pone de mani ies o debido al g an núme o de aplicaciones biomédicas que se han desc i o pa a es e ipo de compues os. En e es as aplicaciones podemos des aca es udios de inhibición de in ecciones í icas y bac e ianas, e adicación de umo es po es imulación de la espues a inmune, e c. A con inuación desc ibi emos algunos ejemplos ep esen a i os de glicodend íme os con aplicaciones biológicas. El p ime ejemplo de glicodend íme o que encon amos en la bibliog a ía ue publicado en 1993 po Roy y colabo ado es. 35 És e consis ía en una oligolisina hipe ami icada que p esen aba 16 moléculas de ácido siálico. Es e compues o demos ó se un po en e inhibido de la hemoaglu inación causada po el i us de la g ipe. En la Figu a 18 se mues a la es uc u a del glicodend ón que con iene 8 moléculas de ácido siálico en su supe icie. 35 Roy, R.; Zanini, D.; Meunie , S.J.; Romanowska, A.J. Chem. Commun. 1993, 1869-1872. Capí ulo 1 22 S H NN H H NN H H NH NN HOH O O O O O O OO NH NH HN NH S O O O O N H H N N H S O O O O COOH HO HO HO OH AcHN O COOH HO HO HO OH AcHN O COOH HO HO HO OH AcHN HN NH S O O O O HOOC HO OH HO HO AcHN NH S HN NH HN NH HN HN O O O O O O H N H N N H H N S O O O O NH HN NH S O O O O HOOC HO OH HO HO NHAc O HOOC HO OH HO HO NHAc O HOOC HO OH HO HO NHAc HN NH S O O O O HOOC HO OH OH HO NHAc NH Figu a 18. Glicodend ón que con iene 8 unidades de ácido siálico basado en una oligolisina ami icada. Es e p ime abajo dio luga a la apa ición de nume osos es udios en es e campo, demos ándose que los glicodend íme os e an unas he amien as muy ú iles pa a ob ene in o mación de allada de la in e acción ca bohid a o-p o eína a ni el molecula . Pos e io men e, Roy, Tomalia y Bake 36 p epa a on un glicodend íme o empleando la cua a gene ación del dend íme o come cial PAMAM de i a izado ambién con ácidos siálicos (Figu a 19). Los es udios expe imen ales ealizados in i o con a ones demos a on la p o ección en e al i us de la g ipe. En es e caso, el glicodend íme o no solo mos ó un inc emen o en la a inidad debido a la mul i alencia, 36 Reu e , J.D.; Myc, A.; Hayes, M.M.; Gan, Z.; Roy, R.; Qin, D.; Yin, R.; Piehle , L.T.; Es and, R.; Tomalia, D.A.; Bake , J.R. Bioconjuga e Chem. 1999, 10, 271-278. In oducción 23 sino que ambién acili ó la libe ación de ácido siálico p e iniendo el p oceso enzimá ico in i o y disminuyendo la ci o oxicidad. 37 Figu a 19. 4ª gene ación del dend íme o PAMAM conjugado con ácido siálico. O o ejemplo in e esan e lo cons i uyen los glicodend íme os que p esen an mimé icos de GM1. La pa e oligosaca ídica del gangliósido GM1 (βGal1-3βGalNAc1- 4[αSia2-3]-βGal1-4Glc) (Figu a 20) es esponsable de la adhesión de la oxina del cóle a a la supe icie de las células del in es ino, siendo es a in e acción c ucial pa a que se desa olle la en e medad. Dend íme os basados en PPI y PAMAM han sido uncionalizados con el oligosacá ido GM1 mos ando p opiedades de inhibición 1000 eces supe io a la del oligosacá ido mono alen e. 38 Además, es e oligosacá ido se ha unido a o o ipo de es uc u a dend imé ica más asequible como el ácido 3,5-bis-(2- aminoe oxi)benzoico. La a inidad mos ada po es e e áme o con espec o al monóme o lib e ambién supone una mejo a muy signi ica i a de la ac i idad. 39 Figu a 20. Es uc u a oligosaca ídica del gangliósido GM1 . 37 Lande s, J.J.; Cao, Z.; Lee, I.; Piehle , L.T.; Myc, P.P.; Myc, A.; Hamouda, T.; Galecki, A.T.; Bake , J.R. J. In ec . Dis. 2002, 186, 1222-1230. 38 Thompson, J.P.; Scheng und, C.L. Glycoconjuga e J. 1997, 14, 837-845. 39 A osio, D.; V asidas, I.; Valen ini, P.; Liskamp, R.M.; Pie e s, R.J.; Be na di, A. O g. Biomol. Chem. 2004, 2, 2113–2124. Capí ulo 1 30 p o eína es á p esen e undamen almen e en la supe icie de las células dend í icas inmadu as. DC-SIGN, es una p o eína ansmemb ana de ipo II que pe enece a la amilia de las lec inas de ipo C ( econocen ca bohid a os de o ma Ca 2+ dependien e). Es a lec ina p esen a a ios dominios bien di e enciados: un pequeño dominio in acelula en el ex emo N- e minal, que es á implicado en p ocesos de in e nalización y de señalización in acelula ; un dominio ansmemb ana hid o óbico; y un dominio ex acelula (Figu a 24). En el dominio ex acelula se dis inguen dos zonas bien di e enciadas, una zona denominada cuello cons i uido po un agmen o pep ídico de 23 aminoácidos que se epi e 7 eces de o ma comple a y o a ez más de o ma incomple a, el cual es esponsable de la oligome ización de la p o eína (DC-SIGN es un homo e áme o). 52 En el ex emo C- e minal se encuen a el dominio de lec ina de ipo C, o dominio de econocimien o de ca bohid a os (CRD) (Figu a 24). El CRD es el esponsable de la in e acción con ca bohid a os p esen es en glicop o eínas de ligandos na u ales como ICAM-3, ICAM-2 o glicop o eínas de pa ógenos como gp120 (VIH), GP1 (Ébola), e c. DC-SIGN ue descubie a y clonada po p ime a ez po cien í icos de la compañía a macéu ica B is ol Mye s Squibb en 1992. 53 Pe o no ue has a el año 2000, cuando el g upo de an Kooyk edescub ió es a p o eína y puso de mani ies o el papel que pod ía juga en el p oceso de in ección del VIH. 54 aa 1-40 , N- e minal aa 41-61 T ansmemb ana aa 253-404 Dominio lec ina ipo C aa 77-252 7.5 x (23 aa) Oligome ización In e nalización Reconocimien o de ca bohid a os aa 1-40 , N- e minal aa 41-61 T ansmemb ana aa 253-404 Dominio lec ina ipo C aa 77-252 7.5 x (23 aa) Oligome ización In e nalización Reconocimien o de ca bohid a os Figu a 24. Dominios del ecep o DC-SIGN. 52 Feinbe g, H.; Guo, Y, Mi chel, D.A.; D ickame , K.; Weis, W.I. J. Biol. Chem. 2005, 280, 1327- 1335. 53 Cu is, B.M.; Scha nowski, S.; Wa son, A.J. P oc. Na l. Acad. Sci. USA 1992, 89, 8356-8360. 54 (a) Geij enbeek, T.B.H.; To ensma, R.; an Vlie , S.J.; an Duijnho en, G.C.F.; Adema, G.J.; an Kooyk, Y.; Figdo , C.G. Cell 2000, 100, 575-585. (b) Geij enbeek, T.B.H.; Kwon, D.S.; To ensma, R.; an Vlie , S.J.; an Duijnho en, G.C.F.; Middel, J.; Co nelissen, I.L.M.H.A.; No e , H.S.L.M.; KewalRamani, V.N.; Li man, D.R.; Figdo , C.G.; an Kooyk, Y. Cell 2000, 100, 587-597. In oducción 31 Van Kooyk y col. demos a on que el VIH podía usa , a a és de la in e acción de la glicop o eína gp120 de la supe icie i al con el ecep o DC-SIGN, el mecanismo de de ensa desc i o an e io men e, como u a pa a pode in ec a las células T del sis ema inmuni a io. So p enden emen e (no hay una explicación cla a a es e hecho), as la in e acción con el ecep o en las DCs, el i us no es deg adado sino que en una o ma pe ec amen e in ec i a iaja jun o con las DCs has a alcanza los nódulos lin á icos donde en a en con ac o con las células T. En o as palab as, el i us del SIDA es capaz de “secues a ” es e mecanismo de de ensa del o ganismo pa a su p opio bene icio y pode alcanza así sus células diana (células T) del sis ema inmune. A pa i de es e descub imien o, nume osos g upos de in es igación han demos ado que el dominio de econocimien o de ca bohid a os (CRD) de DC-SIGN in e acciona con mul i ud de p o eínas al amen e glicosiladas como las p esen es en la supe icie de muchos pa ógenos además del VIH. DC-SIGN in e acciona con glicop o eínas de i us (VIH-1 54 y VIH-2, 55 SIV-1, 56 Ébola, 57 Hepa i is C, 58 SARS, 59 Ci omegalo i us 60 o Dengue 61 ), bac e ias (Helicobac e pylo i, 62 Mycobac e ium ube culosis 63 ), 55 Pöhlmann, S.; Soilleux, E.J.; Ba ibaud, F.; Leslie, G.J.; Mo is, L.S.; T owsdale, J.; Lee, B., Coleman, N.; Doms, R.W. P oc. Na l. Acad. Sci. USA 2001, 98, 2670-2675. 56 Lee, B.; Leslie, G.; Soilleux, E.; O'Dohe y, U.; Baik, S.; Le oney, E.; Flumme el , K.; Swigga d, W.; Coleman, N.; Malim, M.; Doms, R.W. J. Vi ol. 2001, 75, 12028-12038. 57 Ál a ez, C.P.; Lasala, F.; Ca illo, J.; Muñiz, O.; Co bí, A.L.; Delgado, R. J. Vi ol. 2002, 76, 6841-6844. 58 Pöhlmann, S.; Zhang, J.; Ba ibaud, F.; Chen, Z.; Leslie, G.J.; Lin, G.; G anelli-Pipe no, A.; Doms, R. W.; Rice, C.M.; McKea ing, J.A. J. Vi ol. 2003, 77, 4070-4080. 59 Ma zi, A.; G ambe g , T.; Simmons, G.; Mölle , P.; Rennekamp, A.J.; K umbiegel, M.; Geie , M.; Eisemann, J.; Tu za, N.; Saunie , B.; S einkasse e , A.; Becke , S.; Ba es, P.; Ho mann, H.; Pöhlmann, S. J. Vi ol. 2004, 78, 12090-12095. 60 Hala y, F.; Ama a, A.; Lo a -Jacob, H.; Messe le, M.; Delaunay, T.; Houlès, C.; Fieschi, F.; A enzana-Seisdedos, F.; Mo eau, J. F.; Déchane -Me ille, M.J. Immuni y 2002, 17, 653-664. 61 Na a o-Sanchez, E.; Al meye , R.; Ama a, A.; Schwa z, O.; Fieschi, F.; Vi elizie , J.L.; A enzana-Seisdedos, F.; Desp ès, P. EMBO ep. 2003, 4, 723–728. 62 Be gman, M.P.; Enge ing, A.; Smi s, H.H.; an Vlie , S.J.; an Bodeg a en, A.A.; Wi h, H.P.; Kapsenbe g, M.L.; Vandenb oucke-G auls, C.M.; an Kooyk, Y.; Appelmelk, B.J. J. Exp. Med. 2004, 200, 979-990. 63 Tailleux, L.; Schwa z, O.; He mann, J.L.; Pi e , E.; Jackson, M.; Ama a, A.; Leg es, L.; D ehe , D.; Nicod, L.P.; Gluckman, J.C.; Lag ange, P.H.; Gicquel, B.; Ney olles, O. J. Exp. Med. 2003, 197, 121-127. Capí ulo 1 32 hongos (Candida albicans 64 ), y pa ási os (Schis osoma mansoni, 65 Leishmania pi anoi 66 ) en e o os. Es e amplio espec o de pa ógenos que son econocidos po DC-SIGN ha con ibuido a que se conside e a es a lec ina como un ecep o uni e sal de pa ógenos. 67 Las glicop o eínas de es os pa ógenos que son econocidas po DC-SIGN con ienen, undamen almen e, es uc u as oligosaca ídicas que p esen an manosas y ucosas como pa e de los N-glicanos unidos al aminoácido Asn p esen e en di e en es posiciones de es ás glicop o eínas. La es uc u a de high mannose (Figu a 25), cons i uida po Man 9 GlcNAc 2 como epí opo p incipal, se conside a como uno de los ligandos que in e accionan de o ma más ue e con es a lec ina. DC-SIGN econoce an o es uc u as ami icadas con un mínimo de es unidades de manosa ( isacá idos del ipo Manα1-3[Manα1-6]Man indicado en colo azul en la Figu a 25) como es uc u as con dos unidades de manosa e minales (disacá idos Manα1-2Man indicado en colo ojo en la Figu a 25). Además, el econocimien o especí ico de di e en es es uc u as oligosaca ídicas po DC-SIGN pa ece que depende del luga que ocupe el ca bohid a o en la glicop o eína. 68 Pa ece e iden e que la disposición espacial de es e “clus e ” de manosas ami icadas p esen es en dis in os encla es de la p o eína i al es c í ico en la in e acción selec i a mul i alen e con DC-SIGN. 64 Cambi, A.; Gijzen, K.; de V ies, J.M.; To ensma, R.; Joos en, B.; Adema, G.J.; Ne ea, M.G.; Kullbe g, B.J.; Romani, L.; Figdo , C.G. Eu . J. Immunol. 2003, 33, 532-538. 65 an Die, I.; an Vlie , S.J.; Nyame, A.K., Cummings, R.D.; Bank, C.M.; Appelmelk, B.; Geij enbeek, T.B.; an Kooyk, Y. Glycobiology 2003, 13, 471-478. 66 Colmena es, M.; Puig-K öge , A.; Pello, O.M.; Co bí, A.L.; Ri as, L. J. Biol. Chem. 2002, 277, 36766-36769. 67 (a) an Kooyk, Y.; Geij enbeek, T.B. Na . Re . Immunol. 2003, 3, 697-709. (b) Pöhlmann, S.; Ba ibaud, F.; Doms, R.W. T ends Immunol. 2001, 22, 643-646. 68 Mi chell, D. A.; Fadden, A. J.; D ickame , K. J. Biol. Chem. 2001, 276, 28939-28945. In oducción 33 O O OO O O O O OOO O O OOO O O O O O OH O HO HO HO HO NHAc NHAc HO HO HO HO HO HO HO HO HO HO OH HO HO HO OH HO HO HO HO HO HO HO OH HO OH HO HO Asn Figu a 25. Es uc u a del oligosacá ido high mannose. La lec ina DC-SIGN iene un dominio in acelula que es á implicado en el p oceso de in e nalización de dicha p o eína. Cuando dicho ecep o in e acciona con un ligando especí ico, se p oduce un p oceso de in e nalización que in oduce el i us (pa ógeno) den o de la célula dend í ica. Pos e io men e, es as células mig an hacia los nódulos lin á icos al mismo iempo que se an p oduciendo una se ie de p ocesos mo ológicos, es uc u ales y bioquímicos que an a pe mi i desencadena una espues a inmune en e a dicho pa ógeno o an ígeno. El descub imien o de es a nue a lec ina implicada en p ocesos de inmuno egulación ue un hecho des acado que iene un g an in e és debido a la po encial aplicación de es a lec ina como diana pa a el desa ollo de agen es e apéu icos. 69 A con inuación se comen a an algunos de los sis emas mul i alen es de ca bohid a os que han sido desa ollados pa a induci una espues a inmune median e la in e acción con el ecep o DC-SIGN. 69 (a) Zhou, T.; Chen, Y.; Hao, L.; Zhang, Y. Cell. Mol. Immunol. 2006, 3, 279-283. (b) an Kooyk, Y. Biochem. Soc. T ans. 2008, 36, 1478-1481. (c) den Dunnen, J.; G inghuis, S.I.; Geij enbeek, T.B.H. Cance Immunol. Immuno he . 2009, 58, 1149-1157. (d) Geij enbeek, T.B.H.; den Dunnen, J.; G inghuis, S.I. Fu u e Mic obiol. 2009, 4, 879-890. (e) G inghuis, S.I.; Dunnen, J.; Li jens, M.; Vlis , M.; Geij enbeek, T.B.H. Na . Immunol. 2010, 10, 1081-1089. ( ) Dunnen, J.; G inghuis, S.I.; Geij enbeek, T.B.H. Immunol. Le . 2010, 128, 12-16. Capí ulo 1 34 1.5.2. Ac i ación de la espues a inmune po in e acción con el ecep o DC- SIGN. A inales de los años 90 se publica on las p ime as e idencias de que epí opos (o pép idos inmunogénicos) manosilados es imulaban la co espondien e espues a inmune po la in e acción con Recep o es de Manosa (MR) de células dend í icas. De mane a simul ánea, Pie e s 70 y Koning 71 demos a on que p o eínas o pép idos inmunogénicos manosilados inducían una ue e es imulación de células T. Pie e s y colabo ado es pusie on de mani ies o que la p o eína BSA (albumina de sue o bo ino) manosilada (BSA-man) es econocida po ecep o es de manosa, in e nalizándose y localizándose en compa imen os in acelula es pa a se deg adada y p esen ada en o ma de complejos MHC de clase II. El econocimien o de BSA-man a a és de ecep o es de manosa se inc emen ó 100 eces con espec o a la BSA no manosilada. Koning y colabo ado es ealiza on un es udio complemen a io empleando di e en es pép idos an igénicos manosilados y BSA, concluyendo que la manosilacion podía p o oca una mejo a de 200-10.000 eces en la ac i idad po es imulación de células T. Es os esul ados mos a on po p ime a ez la po encial aplicación de an ígenos manosilados usando células dend í icas como ehículos pa a su p esen ación. Hay algunos ejemplos in e esan es p e ios al descub imien o de DC-SIGN como el desc i o po G andjean y colabo ado es 72 en los que un ecep o de manosa se conside aba como ía de en ada al in e io celula . Es os au o es emplea on una es a egia modula pa a la unión de manosas y un pép ido a una pla a o ma pep ídica basada en lisinas (Figu a 26). Es e ue el p ime ejemplo que combinaba una p esen ación mul i alen e de manosas y un pép ido an igénico, el cual pod ía se usado pa a induci una espues a inmune mediada po células dend í icas. Es udios de in e nalización en modelos celula es que p esen aban ecep o es de manosa, de es os clus e (basados en lisina uncionalizados con manosa, quinina o ácido siquímico 70 Enge ing, A.J.; Cella, M.; Flui sma, D.; B ockhaus, M.; Hoe smi , E.C.M.; Lanza ecchia, A.; Pie e s, J. Eu . J. Immunol. 1997, 27, 2417-2425. 71 Tan, M.C.A.A.; Mommaas, A.M.; D ij hou , J.W. y col. Eu . J. Immunol. 1997, 27, 2426-2435. 72 G andjean, C.; Rommens, C.; G as-Masse, H.; Melnyk, O. Angew. Chem. In . Ed. 2000, 39, 1068-1072. In oducción 35 ma cados luo escen emen e) mos a on la co-localización de los compues os dend í icos y de los ecep o es de manosa, así como el p oceso de in e nalización. 73 SN H H NN H H NN HN HN H X OOO NH O NH O NH O O NH NH O NH S S O O O S O H NN H S HN S NH HN SHN S O O O O O O O HO HO HO O HO O HO HO HO O HO O HO HO OH O OH O HO HO OH O OH O HO HO OH O OH OOH OH OH OH OOOH OH OH OH O OOH OH OH OH O H NN H PKYVKQNTLKLAT-NH2 O X = [(ClCH2C=O)-Lys(ClCH2C=O)]4-Lys2-Lys-Lys- Ala-HN-(CH2)3-HN H O O SH O HO HO OH O OH H2NN H PKYVKQNTLKLAT-NH2 O 1) 2) DMF/ci a o-Tampon os a o pH 5.2 K2CO3, pH 8-8.5, .a. Figu a 26. Sín esis de una es uc u a dend í ica manosilada basada en una pla a o ma pep ídica de lisinas conjugada con un pép ido inmunogénico. Sin emba go, la mayo ía de los abajos desc i os es án basados en la glicosilación de p o eínas an igénicas pa a se cap u adas po APCs. En odos es os ejemplos hay una ausencia comple a del con ol sob e el ni el de manosilación. Uno de los p ime os ejemplos ue desc i o po Roche y colabo ado es. 74 Es os au o es usa on BSA conjugada con a ias copias (25 unidades) de manosa, ucosa o lac osa (como con ol nega i o) demos ando la in e nalización y el á ico de es os glicoconjugados 73 G andjean, C.; Angyalosi, G.; Loing, E.; Ad iaenssens, E.: Melnyk, O.; Panc é, V.; Au iaul , C.; G as-Masse, H. ChemBioChem 2001, 2, 747-757. 74 F ison, N.; Taylo , M.E.; Soilleux, E.; Bousse , M.T.; Maye , R.; Monsigny, M.; D ickame , K; Roche, A.C. J. Biol. Chem. 2003, 278, 23922-23929. Capí ulo 1 36 as la in e acción mediada po lec inas ipo C ( undamen almen e ecep o es de manosa y DC-SIGN). Po o a pa e, es os au o es usa on ambién pequeños pép idos basados en lisina pa a conjuga en e 2 y 6 copias de di e en es azúca es incluyendo dimanósidos lineales, Lewis a, Lewis b o lewis x (Figu a 27). Los expe imen os in i o demos a on una endoci osis, dependien e del ecep o , de los glicoconjugados manosilados y ucosilados. Los ca bohid a os p esen es en es os glicoclus e s modulaban la selec i idad de la lec ina ipo C. Así, los glicoconjugados que p esen aban unidades de ipo Manα1,6Man in e accionaban undamen almen e con ecep o es de manosa, mien as que los glicoconjugados de Lewis lo hacían más selec i amen e con el ecep o DC-SIGN. Figu a 27. Glicodend ón basado en oligolisinas de Manα1,6Man. Es os es udios ue on comple ados pos e io men e usando un pép ido consis en e en 25 aminoácidos del an ígeno de un melanoma elongado en su ex emo N- e minal con cua o lisinas y glicosilado con cua o copias de Manα1,6Man o una mezcla de Lewis a y Lewis x o bien lac osa como con ol nega i o (Figu a 28). 75 Las células dend í icas induje on una e icien e in e nalización de es os conjugados (con 75 S ini as, O.; La ieu, P.; Du enge , E. ; Boccaccio, C.; Bousse , M.T.; Monsigny, M.; Fon eneau, J.F.; Jo e eau, F.; Roche, A.C. Bioconjuga e Chem. 2007, 18, 1547-1554. In oducción 37 excepción de los lac osil de i ados). Median e el uso de biosenso es con de ección po Resonancia de Plasmón de Supe icie (SPR) se demos ó la selec i idad del ecep o DC-SIGN po los glicoconjugados del de i ado de dimanosa y Lewis x mien as los ecep o es de manosa econocie on undamen almen e de i ados de manosa. Los glicoconjugados de manosa o de Lewis induje on una cla a ac i ación de lin oci os ci o óxicos dependien e del complejo MHC clase I. Figu a 28. A) Oligosacá idos usados pa a p epa a los glicosin ones. B) Ap oximación sin é ica en la p epa ación de glicosin ones. C) Sín esis de glicopép idos an igénicos. Capí ulo 1 38 Chang y colabo ado es 76 han desc i o un mé odo di ec o basado en la sín esis en ase sólida pa a p epa a dend ones de polilisina manosilados. La 4ª gene ación, que p esen aba 16 copias de manosa en su supe icie, ue ma cado luo escen emen e (Figu a 29) y se e aluó el p oceso de in e nalización ía endoci osis. Median e mic oscopía con ocal pudo obse a se que el glicodend íme o se acumuló den o de esículas en las células dend í icas. La in e nalización a a és de ecep o es de manosa ue demos ada median e el empleo de con oles nega i os. Figu a 29. Dend ón monodispe so de 4ª gene ación basado en polilisina con 16 manosas. F isch y colabo ado es 77 ealiza on una ap oximación mul i alen e que implicaba la u ilización de mono, di, y e amanosil de i ados de moléculas an i ílicas que con enía una cola lipo ílica (Figu a 30). És os ue on anclados den o de liposomas p epa ados median e una combinación de os olípidos y coles e ol. La in e nalización en células dend í icas ue e aluada usando liposomas luo escen es. El con enido de manosa de es os liposomas esul ó juga un papel muy 76 Kan che , E.A.B.; Chang, C.C.; Cheng, S.F.; Roche, A.C.; Chang, D.K. O g. Biomol. Chem. 2008, 6, 1377-1385. 77 Espuelas, S.; Thumann, C.; Heu aul , B.; Schube , F.; F isch, B. Bioconjuga e Chem. 2008, 19, 2385-2393. In oducción 39 impo an e en el p oceso de in e nalización. Es e hecho con i mó la necesidad de una p esen ación mul i alen e de manosas pa a el diseño de sis emas que u ilizan como diana las células dend í icas. El econocimien o de liposomas manosilados ue inhibido po manano, demos ando una endoci osis ía ecep o es especí icos de manosa. Po an o, es os liposomas manosilados pod ían se conside ados como unos ehículos ap opiados pa a la p esen ación y libe ación de á macos o an ígenos en células dend í icas. Es a es a egia pod ía se ap o echada una espues a inmune que pod ía emplea se pa a el desa ollo de acunas. Figu a 30. Mono, di y e amanosilde i ados usados pa a p epa a liposomas. Hacohen y colabo ado es 78 han modi icado o albumina (OVA) con una selección de oligosacá idos di igidos a la diana DC-SIGN en DCs pa a la p esen ación de an ígenos y con la posibilidad de modula la señalización de células dend í icas. OVA ue uncionalizado con un g upo maleimida pos e io men e acoplado a una ba e ía de oligosacá idos (Figu a 31) que p esen aban un espaciado en la posición anomé ica con un g upo iol. 78 Adams, E.W.; Ra ne , D.M.; Seebe ge , P.H.; Hacohen, N. ChemBioChem 2008, 9, 294-303. An eceden es y obje i os 47 2. An eceden es y obje i os. 2.1. An eceden es del G upo de In es igación. An e io men e al abajo desa ollado en la p esen e memo ia, en nues o g upo de in es igación se habían p epa ado políme os glicodend í icos de manosa uniendo unidades de es e ca bohid a o a una es uc u a polimé ica come cial al amen e ami icada a a és de un espaciado . Es os políme os denominados Bol o n es án basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico como unidad de c ecimien o y en el 2,2-bis(hid oxime il)-1,3-p opanodiol o pen ae i i ol como núcleo cen al de c ecimien o. Exis en di e en es gene aciones de es e políme o dend í ico que se encuen an disponibles come cialmen e, lo que ha pe mi ido accede a di e sos políme os con un núme o di e en e de g upos hid oxilo en la supe icie pa a se uncionalizados: segunda gene ación (2G), Bol o n H20 (16 OH); e ce a gene ación (3G), Bol o n H30 (32 OH); y cua a gene ación (4 G), Bol o n H40 (64 OH) (Figu a 34). Capí ulo 2 48 Figu a 34. Políme os dend í icos Bol o n de segunda (BH20) y e ce a (BH30) gene ación. Es os políme os come ciales se han u ilizado undamen almen e en la indus ia como adi i os en pin u as y como supe icies p o ec o as pa a plás icos. Sólo se había desc i o una excepción a es as aplicaciones, su uso como sopo e sólido pa a la sín esis de oligosacá idos en disolución. 83 Dichos sis emas nunca habían sido conside ados como sopo e pa a una p esen ación mul i alen e de ligandos con impo ancia biológica. En nues o g upo de in es igación se ha abajado undamen almen e con los políme os de segunda (BH20) y e ce a (BH30) gene ación. Pa a la p epa ación de los sis emas mul i alen e basados en los políme os Bol o n se ac i ó, en p ime luga , la supe icie de dichos políme os median e la in oducción de g upos ca boxílo. Es e paso p opo cionó un sopo e dend í ico uncionalizado con ácidos ca boxílico e minales que pe mi ió, en una segunda e apa, la in oducción de glicoconjugados a a és de la o mación de un enlace amida, como se indica en el Esquema 1. 83 Kan che , A.S.; Pa que e, J. R.; Te ahed on Le . 1999, 40, 8049-8053. An eceden es y obje i os 49 O O O OH OH O O O H NOR R= Man, n=16 n=32 R= H n=16 n=32 nn BH20sucMan BH30sucMan BH20sucL BH30sucL anhíd ido succínico, DMAP, Pi idina, 50 ºC, 15 h, cuan . HOB , DIC 17 ó HOCH2CH2NH2 (1.2 eq. po OH) 24 h, 60-88% O OH HO HO OH ONH2 17 n Esquema 1. P epa ación de los sis emas dend í icos BH20sucL, BH20sucMan, BH30sucL y BH30sucMan. Como p ime a ap oximación se había u ilizado como azúca un monosacá ido, la α-D-manopi anosa. Pa a pode uni el azúca al sopo e mul i alen e ue necesa io uncionaliza dicha manosa en la posición anomé ica con un espaciado que p esen a a un g upo amino e minal (compues o 17) como se ep esen a en el Esquema 1. Una ez p epa ados es os compues os, se e aluó su solubilidad en medios isiológicos y su oxicidad en e a di e en es líneas celula es demos ándose su iabilidad pa a aplicaciones biológicas. 84 También se con i mó que las unidades de manosa p esen es en la supe icie del políme o dend í ico Bol o n e an econocidas po una lec ina modelo (Lens Culina is), que econoce manosa y además, es e p oceso de econocimien o anscu ía de o ma mul i alen e, o mándose ag egados que p ecipi aban en el medio de eacción. 84 Los p ime os es udios biológicos que se ealiza on con es os sis emas mul i alen es ue on los expe imen os de inhibición de la in e acción del ecep o DC- SIGN con la glicop o eína GP1 del i us del Ébola. 85 Es os expe imen os se ealiza on en el Hospi al 12 de Oc ub e de Mad id en colabo ación con el doc o Ra ael Delgado. En es os expe imen os se u iliza on células Ju ka capaces de exp esa DC-SIGN de o ma es able y se de e minó la can idad de p o eína GP1 unida al ecep o en p esencia y en ausencia de los inhibido es glicodend í icos, median e la u ilización de an icue pos 84 A ce, E.; Nie o, P.M.; Díaz, V.; Ga cía-Cas o, R.; Be nad, A.; Rojo, J. Bioconjuga e Chem., 2003, 14, 817-823. 85 (a) Lasala, F.; A ce, E.; O e o, J.R.; Rojo, J.; Delgado, R. An imic ob. Agen s Chemo he . 2003, 47, 3970-3972. (b) Rojo, J.; Delgado, R. J. An imic ob. Chemo he . 2004, 54, 579-581. Capí ulo 2 50 ma cados luo escen emen e. En es e expe imen o se demos ó que al menos la 3ª gene ación con 32 manosas en la supe icie (BH30sucMan) inhibía la in e acción en e DC-SIGN y GP1. Pos e io men e, se ealiza on expe imen os de inhibición de la in ección en cis (di ec a) y en ans (a a és de un in e medio) con un modelo a i icial del i us del Ébola. Los esul ados ob enidos indicaban que los con oles BH20sucL, BH30sucL p oducían una pequeña disminución de la in ección a ibuida a in e acciones no selec i as de es os compues os con la supe icie celula . En el caso de BH20sucMan ambién se obse ó una pequeña disminución de la in ección. Po el con a io, cuando se usó BH30sucMan como inhibido se obse ó una disminución de la in ección muy signi ica i a, calculándose un IC 50 de 0.3 µM (Figu a 35). También se lle a on a cabo expe imen os con el sis ema mono alen e O-me il-α-D-manopi anosido (ManOMe) obse ándose un IC 50 del o den 1 mM. Es os esul ados indicaban que pasa de un sis ema mono alen e (ManOMe), al sis ema mul i alen e con 32 manosas (BH30sucMan) suponía un inc emen o de la ac i idad de 3000 eces, lo que puso de elie e un cla o e ec o mul i alen e. 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucMan BH20sucMan BH30sucL BH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibido [M] % in ección Inhibido 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucMan BH20sucMan BH30sucL BH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibido [M] % in ección Inhibido 0 0 20 40 60 80 100 BH30sucManBH30sucMan BH20sucManBH20sucMan BH30sucLBH30sucL BH20sucLBH20sucL 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 Inhibido [M] % in ección Inhibido Figu a 35. Resul ados de inhibición de la in ección en cis. Pos e io men e, se ealiza on los expe imen os de in ección en ans. Es e es un expe imen o más complicado donde una de las líneas celula es (K562 que exp esa DC- SIGN) ac úa como anspo ado a del pa ógeno a una segunda línea celula (HeLa) An eceden es y obje i os 51 donde se p oduce la in ección. En ausencia de inhibido se obse ó una in ección en las células HeLa co espondien e al 100%. El mismo alo se ob u o con el dend íme o con ol BH30sucL. Sin emba go, el compues o BH30sucMan dio luga de nue o a una cla a inhibición en el p oceso de in ección en ans de o ma simila a como lo hizo en cis. Además de es os es udios, ambién se lle a on a cabo es udios de in e acción de sis emas glicodend í icos con DC-SIGN u ilizando biosenso es con de ección po Resonancia del Plasmón de Supe icie (SPR). Pa a lle a a cabo es os expe imen os se u iliza on dos modelos di e en es de la lec ina DC-SIGN: el dominio de econocimien o de ca bohid a os (CDR) monomé ico y el dominio ex acelula (ECD) soluble e amé ico. Es os dos modelos pe mi ie on es udia el papel de la mul i alencia desde el pun o de is a del ecep o , debido a que el CRD posee únicamen e un cen o de econocimien o de ca bohid a os mien as que el ECD posee cua o cen os de econocimien o, pudiendo da luga a in e acciones mul i alen es. Las p o eínas (CRD y ECD de DC-SIGN) u ilizadas en es os es udios se ob u ie on po sob eexp esión de los co espondien es plásmidos en E. coli en el labo a o io del P o . F anck Fieschi. 60 En los expe imen os se SPR se u iliza on es ipos di e en es de supe icies con las dos p o eínas (Figu a 36). Así, en es e es udio se pudo obse a que las es uc u as dend í icas con ol (BH20sucL y BH30sucL) no p esen aban una in e acción ap eciable con ninguna de las es supe icies, es o mismo ue obse ado con el políme o dend í ico de segunda gene ación con 16 manosas (BH20sucMan). Sin emba go, el compues o dend í ico con 32 manosas (BH30sucMan) in e accionó de o ma cla a con la supe icie ECD de al a densidad. 86 Es e da o demos ó que la al a densidad y la p oximidad en e dominios de CRD e an esenciales pa a que u ie a luga una in e acción mul i alen e. 60 Hala y, F.; Ama a, A.; Lo a -Jacob, H.; Messe le, M.; Delaunay, T.; Houlès, C.; Fieschi, F.; A enzana-Seisdedos, F.; Mo eau, J. F.; Déchane -Me ille, M.J. Immuni y 2002, 17, 653-664. 86 Taba ini, G.; Reina, J. J.; Ebel, C.; Vi és, C.; Lo a -Jacob, H.; Rojo, J.; Fieschi, F. FEBS Le . 2006, 580, 2402-2408. Capí ulo 2 52 Anali o: BH30sucMan Ligangos Respues a (RU) Tiempo (s) Anali o: BH30sucMan Ligangos Anali o: BH30sucMan Ligangos Respues a (RU) Tiempo (s) Figu a 36. A) Rep esen ación esquemá ica de las es supe icies uncionalizadas in e accionando con BH30sucMan; B) Sensog ama del p oceso de in e acción de BH30sucMan con las es supe icies . Pos e io men e, se empleó la supe icie de al a densidad ECD-HD y di e en es concen aciones de BH30sucMan pa a la ob ención de los sensog amas (Figu a 37) a pa i de los cuales se pudo deduci que dicha in e acción e a es able y además se ob u o una cons an e de a inidad apa en e del o den submic omola . Respues a (RU) Tiempo (s) Respues a (RU) Tiempo (s) Figu a 37. Sensog amas de la in e acción DC-SIGN con BH30sucMan a di e en es concen aciones. El pos e io es udio de la in e acción de DC-SIGN con la glicop o eína i al gp120 del VIH en compe ición con los compues os glicodend í icos p epa ados puso en e idencia que los compues os dend í icos BH30sucL, BH20sucL y BH20sucMan no e an capaces de inhibi la asociación en e el ecep o DC-SIGN y gp120 (Figu a 38B) mien as que el compues o BH30sucMan (Figu a 38A) e a capaz de inhibi dicha in e acción con una IC 50 de 50 µM. An eceden es y obje i os 53 Respues a (RU) Tiempo (s) Respues a (RU) Tiempo (s) Respues a (RU) Tiempo (s) Respues a (RU) Tiempo (s) Figu a 38. Inhibición de la in e acción DC-SIGN/gp120 usando una supe icie de ECD de al a densidad. A) BH30sucMan; B) BH30sucL a las siguien es concen aciones 0, 7.5, 14, 28, 57, 85, 128 µM. Es os expe imen os pe mi ie on es udia en de alle la in e acción de las es uc u as glicodend í icas con una supe icie uncionalizada con DC-SIGN demos ándose que pa a obse a una ue e in e acción se eque ía al menos 32 manosas y una supe icie con una al a densidad de DC-SIGN. También se con i mó que la in e acción e a calcio y ca bohid a o dependien e. A la is a de los esul ados ob enidos en nues o g upo de in es igación se deduce que, la e ce a gene ación del políme o dend í ico Bol o n p esen a una es uc u a y amaño adecuado pa a in e acciona con el ecep o DC-SIGN y es una buena pla a o ma pa a el diseño de sis emas mul i alen es de ca bohid a os. 2.2. Obje i os. El obje i o undamen al del abajo que se p esen a es la p epa ación de sis emas glicodend í icos como ehículos pa a in e naliza de o ma selec i a moléculas de in e és biológico en dianas celula es. Pa a ello u iliza emos la capacidad del ecep o DC-SIGN pa a in e naliza compues os en las células dend í icas median e el econocimien o de ca bohid a os, undamen almen e manosas. Pa a alcanza es e obje i o gene al se plan ea on los siguien es obje i os especi icos como pa e del abajo de la p esen e Memo ia: Capí ulo 2 54 1. P epa ación de sis emas mul i alen es que p esen en ca bohid a os y una posición uncionalizada de o ma di e en e que nos pe mi a la pos e io conjugación de moléculas de in e és biológico. 2. Análisis de la in e acción con el ecep o DC-SIGN u ilizando biosenso es con de ección de Resonancia del Plasmón de Supe icie de los sis emas glicodend í icos p epa ados. 3. Es udios de in e nalización de los sis emas glicodend í icos p epa ados. 4. Es udios de conjugación con biomoléculas. Capí ulo 3 Sín esis de glicodend ones basados en el ácido bis- MPA Capí ulo 3 62 Pos e io men e Malkoch y colabo ado es, 91 emplea on como agen e acilan e el anhíd ido del ácido isop opiliden-2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico pa a ealiza la sín esis di e gen e de dend ones cuyo pun o ocal p esen aba dis in os g upos uncionales los cuales e an sensibles a la hid ogenolisis. Es os au o es, u ilizan la misma es a egia de c ecimien o que la empleada en el caso del anhíd ido del ácido benciliden- 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico y la pos e io desp o ección de los g upos isop opilidenace al es lle ada a cabo median e el empleo de una esina ácida. Más adelan e, en 2005, Sha pless y colabo ado es 92 desc ibie on la p ime a sín esis de glicodend ones a pa i de es e ipo de es uc u as. Pa a ello, sin e iza on dend ones de 1ª a 4ª gene ación y uncionaliza on los g upos hid oxilo de su supe icie con el anhíd ido del ácido 4-pen inóico. De es e modo, median e el uso de una eacción de cicloadición 1,3 dipola se in oducía en la supe icie de los dis in os dend ones el monosacá ido 2-azidoe il-α-D-manopi anósido. En es e ejemplo pa icula , la posición ocal del dend ón se uncionalizó con di e en es cuma inas lo que condujo a “compues os duales” que combinaban econocimien o con de ección, es deci , en una misma molécula, con aban con un g upo que acili aba su de ección, un luo ó o o en es e caso, y g upos que e an especí icos pa a un ecep o , en es e caso los ca bohid a os. Es as p opiedades hacían de es os sis emas modelos muy in e esan es pa a la iden i icación de di e en es p ocesos que anscu ían ía in e acción mul i alen e. En la siguien e igu a se ecoge la es uc u a de uno de los glicodend ones p epa ados. 91 Malkoch, M.; Malms öm, E.; Hul , A. Mac omolecules 2002, 35, 8307-8314. 92 Malkoch, M. ; Hun , J.N.; Ves be g, R. ; Ka g ad, E.; Finn, M.G.; Fokin, V.V.; Sha pless, K.B.; Hawke , C.J. Chem. Commun. 2005, 43, 5775. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 63 Figu a 39. Es uc u a del p ime glicodend ón desc i o basado en el ácido bis-MPA. 3.1. Sín esis di e gen e de dend ones basados en el ácido 2,2-bis- (hid oxime il)p opiónico empleando como núcleo TRIS. 3.1.1. Sín esis del sopo e dend í ico. Como p ime a ap oximación, pa a ealiza la sín esis de los dend ones u ilizando una me odología di e gen e se empleó como núcleo de c ecimien o el ishid oxime ilaminome ano o TRIS (1) (Esquema 5). Es e núcleo p esen a una posición di e enciada, el g upo amino, que se á p o egido du an e la sín esis y pos e io men e se á u ilizado pa a in oduci di e en es moléculas de in e és biológico. Pa a la p epa ación de las di e en es gene aciones del dend ón se ha u ilizado como unidad de c ecimien o el anhíd ido del ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico (5). En el Esquema 5 se mues a el esquema e osin é ico de la sín esis de un dend ón de e ce a gene ación basado en el núcleo TRIS. Capí ulo 3 64 Esquema 5. Esquema e osin é ico de la p epa ación de un dend ón de e ce a gene ación. La sín esis del anhíd ido 5 se ha lle ado a cabo según el p ocedimien o desc i o en la bibliog a ía. 89 Así, en p ime luga se ealizó la p o ección del diol del ácido 2,2- bis(hid oxime il)p opiónico (3) con benzaldehído dime ilace al en p esencia de una can idad ca alí ica de ácido p- oluensul ónico (p-TsOH), en ace ona anhid a. Pos e io men e, se ealizó la au ocondesación del ácido benciliden-2,2-bis(hid oxime il) p opiónico (4) usando DCC como ac i ado del ácido ca boxílico (Esquema 6). La o mación del anhíd ido 5 se con i mó po el análisis de su espec o de 13 C-RMN donde se obse ó la a iación del desplazamien o químico del ca bono ca bonílico, pasando de 178.7 ppm en el compues o 4 a 169.2 ppm en el anhíd ido 5, ya que el es o de señales en los espec os de 1 H-RMN y 13 C-RMN apa ecen a desplazamien os químicos muy pa ecidos debido a la simili ud de las moléculas. O O O Ph O O O Ph O O O O PhHO OH OH O HO 345 DCC, DMAP Ph OMe OMe p-TsOH Ace ona 64% CH2Cl2 89% Esquema 6. Sín esis del anhíd ido 5. Una ez p epa ado el anhíd ido 5 que se a a u iliza como unidad de c ecimien o, ue necesa io p o ege el g upo amino p esen e en el núcleo de c ecimien o 1. Es a p o ección se lle o a cabo empleando Boc 2 O en p esencia de E 3 N, dando luga al in e medio 2 (Esquema 7). La p o ección del g upo amino se con i mó en el espec o de 1 H-RMN po la señal ca ac e ís ica del me ilo del g upo Boc a 1.26 89 Ih e, H.; Padilla, O.L.; F éche , J.M.J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5908-5917. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 65 ppm. Hemos de des aca que las condiciones empleadas en es a eacción mejo an sensiblemen e las condiciones desc i as has a aho a en la bibliog a ía. 93, 94 O O O BocHN OO O O O O P h Ph O OO Ph OH BocHN HO OH OH H 2 N OH OH OH OH O BocHN OO O OH OH O HO HO O O O O BocHN OO OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O Ph Ph Ph Ph Ph Ph O O O BocHN OO OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O Ph O O Ph O O Ph O O O Ph O O OO Ph O O O Ph O O O Ph O O O Ph O OO Ph O O O Ph O O O Ph O O OPh O 1 6 27 8 O O O BocHN OO OO O OH OH O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O HO HO OH OH O OH OH O OH OHO OH OH O OH OH O HO HO O HO HO O O HO HO O OH OH O OH OH O O O O BocHN OO OOH OH OH OH O O O O O OH OH OH OH O O O OO HO HO HO HO O O 10 11 H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% Boc 2 O, E 3 N DMF, 84% 5, DMAP Pi idina/CH 2 Cl 2 92% H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% 5, DMAP Pi idina/CH 2 Cl 2 90% H 2 /Pd (C) CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) 99% 5, DMAP Pi idina/CH 2 Cl 2 85% 9 Esquema 7. Sín esis di e gen e de los dend ones de 1ª (7), 2ª (9) y 3ª (11) gene ación basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico. 93 Se o, C.T.; Ma hias, J.P.; Whi esides, G.M. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 1321-1329. 94 Kang, J.H.; Chung, H.E.; Kim, S.Y.; Kim, Y.; Lee, J.; Lewin, N.E.; Pea ce, L.V.; Blumbe g, P.M.; Ma quez, V.E. Bioo g. Med. Chem. 2003, 11, 2529-2539. Capí ulo 3 66 Una ez p o egido el g upo amino del núcleo de c ecimien o 1, los dend ones se cons uye on paso a paso median e la epe ición de la secuencia de eacciones que se comen a a con inuación (acoplamien o y desp o ección), empleando las condiciones de eacción desc i as en la bibliog a ía pa a ob ene las di e en es gene aciones de dend ones (Esquema 7). 89 El compues o 2 se hizo eacciona con el anhíd ido 5 (1.35 equi alen es po enlace o mado) en una mezcla diclo ome ano/pi idina en p esencia de una can idad ca alí ica de dime ilaminopi idina (DMAP) dando luga al dend ón de p ime a gene ación p o egido 6 con un endimien o excelen e. La es e i icación de los es g upos hid óxilo se con i mó po 1 H-RMN donde apa ecen nue as señales, ca ac e ís icas del monóme o 4, (7.28-7.46, 5.45, 4.62, 3.63 y 0.96 ppm) cuya in eg ación concue da exac amen e con la en ada de es unidades de dicho monóme o. Adicionalmen e, en el espec o de masas se obse ó exclusi amen e la señal co espondien e al ión molecula , m/z = 856.3 [M+ Na] + , lo que con i ma la en ada de es unidades de monóme o 4. Es os análisis demues an la monodispe sidad de los compues os sin e izados. En una segunda e apa, se lle ó a cabo la desp o ección de los g upos hid oxilo median e una hid ogenación con paladio sob e ca bono como ca alizado , en una mezcla diclo ome ano/me anol a empe a u a ambien e. De es e modo, se ob u o la p ime a gene ación de nues o sis ema mul i alen e 7 con buenos endimien os. La eliminación del g upo p o ec o se con i mó po la desapa ición en el espec o de 1 H- RMN de odas las señales a omá icas co espondien es a los enilos del benciliden ace al. Siguiendo la misma secuencia sin é ica (acoplamien o con el anhíd ido 5 e hid ogenación) se p epa ó la segunda gene ación del dend ón co espondien e, compues o 9, que p esen a 12 g upos hid oxilo en la supe icie, y el p oduc o de e ce a gene ación 11 con eniendo 24 hid oxilos en su supe icie. Median e el análisis de los 89 Ih e, H.; Padilla, O. L.; F éche , J.M.J. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5908-5917. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 67 espec os de 1 H-RMN y 13 C-RMN se pudie on co obo a las es uc u as de los compues os ob enidos, obse andose a campo bajo, p ime o la apa ición y después la pé dida de las señales co espondien es a los g upos enilo. La monodispe sidad de es os compues os se con i mó nue amen e median e espec ome ía de masas. En la Figu a 40 se mues an los espec os de masas de los compues os desp o egidos de segunda y e ce a gene ación 9 y 11 espec i amen e. 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compues o 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 In ens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1304.5 [M+K] + 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compues o 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3 [M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+ Na ] + Compues o 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z Compues o 11 2658.1 m/z 909.3 3+ 1352.3 2+ 2681.3 1+ +MS, 6.3-7.5min #(179-191), 100%=2075350 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 6 x10 In ens. 500 1000 1500 2000 2500 m/z 909.3[M+3Na] 3+ 1352.3 [M+2Na] 2+ 2681.3 [M+Na] + 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 In ens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1288.5 [M+Na] + +MS, 0.2-0.5min #(6-15) 0.0 0.5 1.0 1.5 6 x10 In ens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z 1304.5 [M+K] + Compues o 9 1265.6 m/z Figu a 40. Espec os de masas (ESI) de los dend ones desp o egidos 9 y 11. De es a o ma, median e una sín esis di e gen e se han podido p epa a los dend ones de p ime a, segunda y e ce a gene ación en escala mul ig amo, de una o ma sencilla, ba a a y monodispe sa. Además, cabe des aca que la pu i icación de odos es os dend ones se ealizó po ec is alización lo que acili ó eno memen e la pu i icación de dichos compues os, ob eniéndose en odos los casos p oduc os de ele ada pu eza. 3.1.2. Sín esis del glicodend ón 3GTBoc(SucMan) 24 y del co espondien e con ol 3GTBoc(SucC) 24 . La p epa ación de los sis emas mul i alen es glicodend í icos equie e, en p ime luga , la ac i ación del dend ón de e ce a gene ación 11, median e la Capí ulo 3 68 in oducción de ácidos ca boxílicos en la supe icie siguiendo la me odología que había sido pues a a pun o en nues o g upo de in es igación p e iamen e. 83 Es os g upos ca boxílico e minales pe mi i án pos e io men e el anclaje de los glicoconjugados y los co espondien es con oles al sopo e mul i alen e a a és de la o mación de un enlace amida. La uncionalización del dend ón de e ce a gene ación con ácidos ca boxílicos se ealizó en una e apa median e la ape u a de anhíd ido succínico (en g an exceso), en pi idina empleando DMAP como ca alizado . De es a o ma, se ob u o con buen endimien o el compues o 12 (Esquema 8). Esquema 8. P epa ación del dend ón 12. La o mación de es e p oduc o se con i mó median e el análisis de su espec o 1 H-RMN en el que se pudo obse a la apa ición de un mul iple e a 2.55-2.72 ppm, co espondien e a los p o ones de los me ilenos del ácido succínico. El análisis po espec ome ía de masas de es e compues o p esen aba una dis ibución gaussiana de picos en o no al peso molecula espe ado (5058.5), lo que indicaba la polidispe sidad del compues o (Figu a 41). 83 A ce, E.; Nie o, P.M.; Díaz, V.; Ga cía-Cas o, R.; Be nad, A.; Rojo, J. Bioconjuga e Chem. 2003, 14, 817-823. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 69 Figu a 41. Espec o de masas MALDI-ToF del dend ón 12. La siguien e e apa en la p epa ación del glicodend ón ue la in oducción de las unidades de ca bohid a o, en es e caso manosa, en la supe icie del dend ón. Pa a ello ue necesa io uncionaliza adecuadamen e dicho monosacá ido en su posición anomé ica con un espaciado que p esen a a un g upo amino e minal. Así, el de i ado de manosa 17 se p epa ó en cua o e apas a pa i de la co espondien e manosa pe ace ilada come cial 13 siguiendo la me odología desa ollada en nues o g upo de in es igación, según se mues a en el Esquema 9. 83 Esquema 9. Sín esis del de i ado de manosa 17. 83 A ce, E.; Nie o, P.M.; Díaz, V.; Ga cía-Cas o, R.; Be nad, A.; Rojo, J. Bioconjuga e Chem. 2003, 14, 817-823. Capí ulo 3 70 La p ime a e apa consis ió en la glicosilación del de i ado pe ace ilado 13 usando como acep o de glicosilo el 2-b omoe anol y como p omo o BF 3. E 2 O, ob eniéndose el de i ado glicosilado 14 con un endimien o del 73%. El análisis del espec o de 1 H-RMN nos mues a la apa ición de un doble e a 4.87 ppm co espondien e al p o ón anomé ico cuya cons an e de acoplamien o es 1.5 Hz, lo que indica la o mación exclusi a del anóme o α. El siguien e paso consis ió en la sus i ución nucleó ila del g upo B del ex emo e minal del espaciado del de i ado de manosa 14 po un g upo azida. Es a e apa se ealizó u ilizando un g an exceso de NaN 3 en DMF anhid a, ob eniéndose el de i ado 15 de o ma cuan i a i a. La sus i ución ue con i mada po el análisis del espec o de 13 C-RMN del p oduc o 15 en que se pudo obse a la desapa ición de la señal del ca bono unido al b omo (30.1 ppm) y la apa ición de una nue a señal a 50.7 ppm co espondien e al desplazamien o de un ca bono unido a un g upo azida. La desace ilación del compues o 15 u ilizando NaOMe 1M en MeOH condujo al p oduc o 16 con excelen es endimien os. Median e el análisis del espec o de 1 H- RMN se pudo obse a la desapa ición de las señales co espondien es a los me ilos de los g upos ace a o. Po úl imo, la hid ogenación del g upo azida u ilizando como ca alizado paladio sob e ca bono a p esión y empe a u a ambien e, condujo al de i ado de manosa 17 cuya o mación ue co obo ada median e el análisis del espec o de 13 C-RMN. La desapa ición de la señal a 51.7 ppm (CH 2 -N 3 ) y la apa ición de una nue a señal a 41.8 ppm ca ac e ís ica de un ca bono me ilénico unido a un g upo amino con i mó la o mación del p oduc o 17. Una ez ob enido el dend ón 12 y el de i ado de manosa 17 con enien emen e uncionalizados, se lle o a cabo la conjugación en e ambos u ilizando las condiciones clásicas de o mación de enlaces pep ídicos (Esquema 10). Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 71 O O O BocHN OO O O O OO OOO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HO O OOH O O OH OO OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O OH O O HO O O HO O O OH O O HO O O HO O O HO O O OH O O HO O O OH OO OH O O OH O O OH O O OH OO HO O O O O O BocHN OO O O O OO O OO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HN O OHN O O HN OO H N O O NH O O H N O O NH O O NH O O NH O O NH O O NH O O NH O O N H O O H N O O H N O O HN O O NH O O HN O O NH OO NH O O NH O O N H O O N H OO HN O O O O O O O O O O OO OO O O O O O O O O O OO O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O HO HO OH O OH NH2 O O NH2 O O O BocHN OO O O O OO OOO O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O O HN O OHN O O HN OO HN O O HN O O H N O O H N O O NH O O NH O O NH O O NH O O N H O O N H O O N H O O H N O O HN O O NH O O HN O O NH OO N H O O NH O O N H O O HN OO HN O O OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH HO OH OH HO HO OH HO HO HO HO 17 12 3GTBoc(SucC)24 3GTBoc(SucMan)24 17, DIC, HOB DMF, 24h, .a. 86% H2NOH DIC, HOB DMF, 24h, .a. 50% Esquema 10. P epa ación del glicodend ón 3GTBoc(SucMan) 24 y del dend ón con ol 3GTBoc(SucC) 24 . Así, los ácidos ca boxílicos del dend ón 12 se ac i a on u ilizando diisop opilca bodiimida (DIC) y 1-hid oxibenzo iazol (HOB ) en DMF, y a con inuación se hicie on eacciona con el de i ado de manosa 17 (1.2 eq. po g upo ca boxílico del dend ón) a empe a u a ambien e. De es a o ma se ob u o el glicodend ón de e ce a gene ación que hemos denominado 3GTBoc(SucMan) 24 . El p oduc o se pu i icó po ul a il ación, u ilizando il os de exclusión po amaño cen iplus YM-3000, con amaño de po o de 3000 dal ons. En el espec o de 1 H-RMN se pudo obse a la apa ición de la señal co espondien e al p o ón anomé ico de la Capí ulo 3 78 Tiempo (s) R e s p u e s a ( R U ) Tiempo (s) R e s p u e s a ( R U ) [3GTBoc(SucMan) 24 ][3GTBoc(SucC) 24 ] -- + + Figu a 46. Inhibición de la in e acción DC-SIGN/gp120 usando una supe icie de gp120 y como inhibido es: a) 3GTBoc(SucC) 24 a concen aciones (0, 7.5, 14, 28, 57, 85 y 128 µM); b) 3GTBoc(SucC) 24 a concen aciones (0, 7.5, 14, 28, 57, 85 y 128 µM). Como se ha comen ado an e io men e en los an eceden es, se había demos ado usando biosenso es que el políme o dend í ico Bol o n de e ce a gene ación uncionalizado con 32 manosas (BH30SucMan) e a capaz de inhibi la in e acción DC-SIGN/gp120 con un IC 50 de 50 µM. La inhibición de la in e acción en e DC-SIGN/gp120 que se ob iene usando el glicodend ón 3GTBoc(SucMan) 24 es del mismo o den (≈ 50 µM) que la ob enida usando el glicodend íme o homólogo de e ce a gene ación con 32 manosas. A la is a de es os esul ados, se pudo conclui que la ausencia de un b azo en es os sis emas dend í icos, que implica ía un meno núme o de manosas en la supe icie, no iene un e ec o signi ica i o en la capacidad de inhibición de la in e acción de DC-SIGN/gp120. En o as palab as, el nue o dend ón p epa ado, con una media de 20 manosas es capaz de in e acciona con el ecep o DC- SIGN con una a inidad simila a como lo hacía el dend íme o co espondien e BH30SucMan con 32 manosas. Es o pa ece indica , que en es e p oceso de in e acción, es más impo an e una adecuada p esen ación de los ligandos que posibili e la in e acción de o ma mul i alen e con el ecep o , que el núme o o al de ligandos (manosas en es e caso). Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 79 Una ez sin e izado el glicodend ón y comp obada su capacidad de in e acción con el ecep o DC-SIGN, el siguien e paso se ía la uncionalización de la posición ocal di e enciada del dend ón pa a in oduci moléculas de in e és biologico. 3.1.4. Modi icación de la posición ocal de dend ones basados en el ácido 2,2- bis-(hid oxime il)p opiónico empleando como núcleo TRIS. Dados los p oblemas de ca ac e ización y con el in de educi al máximo la polidispe sidad en el dend ón ac i ado con ácidos ca boxílicos, se plan eó una es a egia sin é ica di e en e que consis ió en in oduci el ácido succínico p o egido como monobencilés e , de o ma que se acili a a la sín esis y pu i icación del compues o inal. Pa a lle a a cabo es a uncionalización ue necesa io, en p ime luga , p epa a el monobencilés e del ácido succínico, u ilizando la me odología desc i a en la bibliog a ía. 98 La ape u a del anillo de anhíd ido succínico se ealizó po a aque nucleó ilo del alcohol bencílico en CH 2 Cl 2 ca alizado po DMAP, dando luga al monosuccina o de bencilo 18 (Esquema 11). La o mación del p oduc o pudo con i ma se cla amen e median e la apa ición de las señales ca ac e ís icas del g upo bencilo a 7.38 y 5.18 ppm en el espec o 1 H-RMN. Esquema 11. Sín esis del monobencilés e del ácido succínico 18. Una ez sin e izado el monobencilés e de i ado 18, la siguien e e apa ue la uncionalización de la supe icie del dend ón 11 con 24 unidades del compues o 18, median e la o mación de enlaces és e . Aunque el núme o de enlaces que se ienen que o ma en una única e apa sin é ica sob e la supe icie del dend ón 11 es muy ele ado, 98 Isomu a, I.; Wi sching, P.; Janda, K. D. J. O g. Chem. 2001, 66, 4115-4121. Capí ulo 3 80 se consiguie on uncionaliza odas las posiciones del dend ón con un buen endimien o. Pa a ello, se u iliza on las condiciones desa olladas po Ih e y col. 88 El dend ón 11, el monobencilés e del anhíd ido succínico 18 y p- oluensul ona o de dime ilaminopi idina (DPTS) 99 se disol ie on en CH 2 Cl 2 en a mos e a ine e y pos e io men e se añadió DCC a la mezcla de eacción. T as 24 ho as a empe a u a ambien e se ob u o el compues o 19 con un excelen e endimien o(Esquema 12), que ue pu i icado median e c oma og a ía de exclusión po amaños (Sephadex LH-20). Esquema 12. Sín esis del dend ón 20. 88 Ih e, H.; Hul , A.; F éche , J.M.J.; Gi so , I. Mac omolecules 1998, 31, 4061-4068. 99 Moo e, J. S.; S upp, S. I. Mac omolecules 1990, 23, 65-70. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 81 El compues o 19 se ca ac e izó median e expe imen os de RMN y espec ome ía de masas. En el espec o de 1 H-RMN se pudo obse a la apa ición de nue as señales a 7.26 ppm co espondien es a los p o ones a omá icos, un single e a 5.03 ppm co espondien e al me ileno del g upo bencilo y la señal co espondien e a los me ilenos del succínico a 2.57 ppm. La in eg ación de es as señales puso de mani ies o el acoplamien o de 24 unidades de monosuccina o de bencilo. Adicionalmen e, po espec ome ía de masas usando ionización elec osp ay (ESI) se pudo obse a las señales co espondien es al compues o con dos y es ca gas cuya masa coincide con el p oduc o comple amen e uncionalizado, lo que indicaba cla amen e que es e p oduc o e a monodispe so (Figu a 47). Figu a 47. Espec o de masas ESI del dend ón 19. An es de in oduci los azuca es sob e el dend ón 19 y dado el cos e sin é ico que suponía p epa a dicho glicodend ón de manosa, se decidió ealiza las p uebas de desp o ección del g upo amino sob e el dend ón 19 y su pos e io uncionalización pa a demos a la iabilidad de la es a egia sin é ica. La desp o ección del g upo ca bama o se lle ó a cabo empleando condiciones clásicas (CH 2 Cl 2 /ácido i luo ace ico (TFA)(1:1) a empe a u a ambien e) ob eniéndose el compues o 20 de o ma cuan i a i a (Esquema 12). La eliminación del g upo p o ec o Boc se con i mó median e el análisis del espec o de 1 H-RMN de es e compues o, en el que se pudo obse a la desapa ición de la señal a 1.33 ppm ca ac e ís ica del g upo e -bu ilo del Boc. Capí ulo 3 82 Una ez sin e izado el compues o 20 nues o obje i o e a in oduci en la posición amino lib e di e en es moléculas de in e és biológico. Pa a ello, e a necesa io añadi un espaciado adecuadamen e uncionalizado y su icien emen e la go pa a pe mi i , en e apas pos e io es, la conjugación de moléculas biológicas de in e és. En es e sen ido, se in en ó la ape u a del anhíd ido succínico con obje o de in oduci pos e io men e un espaciado que pe mi ie a dicha conjugación. Sin emba go, los dis in os ensayos de ape u a empleando can idades c ecien es de anhíd ido succínico (1.5, 2.5 y 5 eq), así como el aumen o de la empe a u a ( .a., 40 ºC y 60 ºC) no condujo, en ningún caso, al p oduc o deseado. Median e c oma og a ía en capa ina no se obse ó la apa ición de un nue o p oduc o, con i mándose a a és del espec o de 1 H- RMN la ecupe ación del p oduc o de pa ida en odos los casos. También, se in en ó la uncionalización del p oduc o 20 con luo esceína, u ilizando el iso iociana o de luo esceína (FITC) y ie ilamina en DMF. La eacción de una amina con un isociana o es una eacción muy e icaz, limpia y ápida que se usa de o ma gene al pa a in oduci luo esceína en moléculas complejas como p o eínas. Sin emba go, en odas las condiciones que se ensaya ón, donde se a ió an o el núme o de equi alen es de FITC, la empe a u a y los iempos de eacción, se ecupe ó, al igual que en el caso comen ado an e io men e, el p oduc o de pa ida inal e ado. A pesa de que en la bibliog a ía 100,101 exis en desc i os ejemplos en que una amina unida a un ca bono e asus i uido y con un impedimen o es é ico semejan e se uncionaliza, en nues o caso odos los in en os pa a uncionaliza el compues o 20 esul a on in uc uosos. A la is a de es os esul ados, se decidió cambia la es a egia sin é ica y ealiza una sín esis di e gen e en la que la posición di e enciada del núcleo de c ecimien o es u ie a uncionalizada con un espaciado la go desde el inicio de la secuencia sin é ica. 100 Kleine , M.; Röcke do , N.; Lindho s , T. K. Eu . J. O g. Chem. 2004, 3931-3940. 101 Huang, K.; Voss, B.; Kuma , D.; Hamm, H. E.; Ha h, E. Bioconjuga e Chem. 2007, 18, 403- 409. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 83 3.2. Dend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico con espaciado . Dadas las di icul ades encon adas a la ho a de in en a la uncionalización del dend ón 20, nos plan eamos la sín esis de dend ones a pa i de un núcleo de c ecimien o que lle a a desde el inicio un espaciado con enien emen e p o egido y con la lexibilidad su icien e pa a que nos pe mi ie a la in oducción de cualquie molécula de in e és en e apas pos e io es. Además, como ya se ha comen ado an e io men e, el dend ón de e ce a gene ación 3GTBoc(SucMan) 24 no p esen aba una pé dida signi ica i a de ac i idad en la inhibición de la in e acción DC-SIGN/gp120 con espec o al dend íme o BH30sucMan, po ello nos plan eamos la sín esis de dend ones de gene aciones in e io es (2ª gene ación en luga de e ce a), lo que implica un meno núme o de unidades de ca bohid a o en su supe icie. La sín esis de gene aciones in e io es, conlle a ía po consiguien e un aho o sin é ico que puede se impo an e a la ho a de su posible uso en aplicaciones biomédicas aunque ello supusie a una disminución en la a inidad po el ecep o . En el Esquema 13 se mues a el análisis e osin é ico pa a la p epa ación de un dend ón de segunda gene ación que con iene en su es uc u a un espaciado . Esquema 13. Esquema e osin é ico de la p epa ación de un dend ón de segunda gene ación con un espaciado . 3.2.1. Sín esis del sopo e dend í ico. La p ime a cues ión a abo da pa a p epa a el núcleo de c ecimien o e a la elección de un espaciado adecuado. Se op ó po la diamina come cial 1,13-diamino- Capí ulo 3 84 4,7,10- ioxa idecano (21). Es a diamina es un de i ado de e ae ilenglicol que a p io i debe apo a nos una g an lexibilidad y una al a solubilidad en disol en es pola es. Dado que el de i ado 21 es una diamina, el p ime paso ue la p o ección de una de las aminas. Pa a ello se seleccionó un g upo p o ec o que ue a compa ible con cada una de las e apas de c ecimien o pos e io del dend ón. De odas las opciones posibles elegimos como más adecuado pa a nues os obje i os el g upo p o ec o Boc. De es a o ma la diamina 21 se monop o egió u ilizando Boc 2 O y dioxano como disol en e, en las condiciones desc i as en la bibliog a ía 102 (Esquema 14), ob eniéndose el compues o 22 con un excelen e endimien o. El espec o de 1 H-RMN del p oduc o 22 con i mó la inco po ación del ca bama o al p esen a la señal ca ac e ís ica del g upo e -bu ilo a 1.43 ppm. La in eg ación de es a señal en dicho espec o nos indicaba cla amen e que se había p oducido la monop o eccion de la diamina. En el espec o de masas, se obse ó un único pico, co espondien e al ión molecula del p oduc o monop o egido (m/z 343.3 [M+ Na] + ). Esquema 14. Sín esis de la diamina monop o egida 22. Una ez sin e izado el espaciado con enien emen e p o egido ealizamos la sín esis de un nue o núcleo al que pode ancla lo. Pa a ello se lle ó a cabo la p o ección selec i a de es de los cua o g upos hid oxilo p esen es en el pen ae i i ol (23), dejando una posición lib e pa a la pos e io unión del espaciado . Pa a es a eacción se u iliza on es equi alen es de clo u o de bencilo en p esencia de hid u o sódico. El análisis del espec o de 1 H-RMN y del espec o de masas del c udo de eacción indicó la exis encia de es p oduc os que co espondían a las especies di-, i- y e abenciladas. La pos e io pu i icación median e el empleo de c oma og a ía en columna condujo ácilmen e al compues o ibencilado 24 con un endimien o del 51% (Esquema 15). La p o ección de los es hid oxilos se con i mó en el espec o de 1 H- 102 B aun, M.; Ha nagel, U.; Ra anelli, E.; Schade, B.; Bö che , C.; Vos owsky, O.; Hi sch, A. Eu . J. O g. Chem. 2004, 1983-2001. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 85 RMN po la apa ición de las señales ca ac e ís icas del g upo bencilo (4.56 y 7.31-7.43 ppm) del p oduc o 24. Po o a pa e, se obse ó ambién las señales co espondien es a los me ilenos unidos a los g upos hid oxilo p o egidos, ya que en es e compues o apa ecían a mayo campo, pe maneciendo la señal geminal de los me ilos inal e ada. La in eg ación de las señales con i mó la p o ección de 3 de las posiciones hid oxilo, hecho que ue a i icado po espec ome ía de masas donde se obse ó una única señal co espondien e al ión molecula (429.3 [M +Na] + ). La siguien e e apa sin é ica e a la ape u a del anhíd ido succínico en p esencia de DMAP y pi idina po el g upo hid oxilo lib e p esen e en el compues o 24. Es a eacción condujo, con un excelen e endimien o al p oduc o 25 el cual ue pu i icado empleando c oma og a ía en columna de gel de sílice. La inco po ación del ácido succínico en la es uc u a ue con i mada en el espec o de 1 H-RMN del p oduc o 25 po la apa ición de un mul iple e a 2.50-2.57 ppm co espondien e a los g upos me ileno del es o succínico in oducido en la molécula. Esquema 15. Sín esis del núcleo de c ecimien o 27. Capí ulo 3 86 Pos e io men e, el ácido ca boxílico se acopló con el espaciado 22 median e la o mación de un enlace amida, empleando como eac i os DIC y HOB en DMF anhid a, ob eniéndose el compues o 26 con buen endimien o. En el espec o de 13 C- RMN del p oduc o 26 se con i mó la o mación del enlace amida po la desapa ición de la señal a 178.1 ppm co espondien e al ácido ca boxílico lib e y la apa ición de una nue a señal a 171.3 ppm. Una ez ensamblados el espaciado y el núcleo, el siguien e paso de la sín esis e a el c ecimien o del núcleo pa a p epa a las dis in as gene aciones del dend ón. Pa a ello, p ocedimos a la desp o ección de los g upos hid oxilo po hid ogenación del p oduc o 26, empleando como ca alizado paladio sob e ca bono. Es a eacción dio luga a la libe ación de los g upos hid oxilo ob eniéndose el compues o 27 de o ma cuan i a i a (Esquema 15). En el espec o de 1 H-RMN del compues o 27 se obse ó la desapa ición del mul iple e a 7.23-7.33 ppm, co espondien e a los p o ones a omá icos, y de la señal a 4.49 ppm, de los me ilenos del g upo bencilo. Una ez sin e izado el núcleo de c ecimien o 27 adecuadamen e uncionalizado, se siguió la misma me odología que en el caso de los dend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico sin espaciado , pa a la sín esis de los dend ones de p ime a y segunda gene ación 29 y 31 (Esquema 16). Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 87 O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O Ph Ph O O O Ph OH OH O O O O OH OH O HO HO O O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O O O O O O O Ph O O O Ph O O OPh O O O Ph O O O Ph O O O P h O O O NHO 3 BocHN OO O O O O O O O O O O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O OH OH O HO HO O O O O NHO 3 BocHN 27 5, DMAP Pi idina/CH2Cl2, 40ºC 87% 5, DMAP Pi idina/CH2Cl2, 40ºC 85% H2/Pd (C) CH2Cl2/MeOH (1:1) 99% H2/Pd (C) CH2Cl2/MeOH (1:1) 99% 28 29 30 31 Esquema 16. Sín esis de los dend ones 29 y 31. El compues o 27 se hizo eacciona con el anhíd ido 5 en una mezcla diclo ome ano/pi idina empleando DMAP como ca alizado a 40 ºC du an e 24 h, dando luga al compues o 28 el cual ue pu i icado empleando c oma og a ía po columna. La es e i icación de odos los g upos hid oxilo se con i mó median e la in eg ación de las señales ca ac e ís icas de la unidad de c ecimien o en el espec o de 1 H-RMN. Adicionalmen e, la monodispe sidad del compues o se puso de mani ies o po la obse ación de una única señal co espondien e al ión molecula en el espec o de masas del compues o 28, m/z 1173.5 [M+Na] + . La hid ogenación de es e compues o, empleando paladio sob e ca bono como ca alizado , condujo al dend ón de p ime a gene ación desp o egido 29. La desp o ección se con i mó median e el análisis del espec o de 1 H-RMN, en el cual se obse ó la desapa ición de las señales co espondien es a los g upos enilo. Realizando la misma secuencia de eacciones, acoplamien o con el anhíd ido 5 e hid ogenación, se ob u o el dend ón de segunda gene ación 31 con buenos endimien os. La monodispe sidad de los p oduc os 29 y 31 Capí ulo 3 94 ppm ( 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 CH3Boc CH3b´ CH3c´ H1 NH CH2 b CH2 a NH H8 H2-H7+ CH2OCH2 suc NH CH3b´ CH3Boc CH2 suc NH H1 CH2 b H2-H7+ CH2O ppm ( 1 ) 1 .02.03. 0 4 .05.0 H8 CH2 a+c O O O NHO O OBocHN O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ 37 O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O O NH O O O BocHN O O O O O O O O a b b´ 36 O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH PPM 2.92 2.88 2.84 2.80 2.76 2.72 2.68 2.64 2.60 2.56 2.52 2.48 2.44 2.40 2.36 2.32 2.28 2.24 2.20 2.16 2.12 2.08 2.04 2.00 1H-RMN del compues o 35 PPM 2.88 2.84 2.80 2.76 2.72 2.68 2.64 2.60 2.56 2.52 2.48 2.44 2.40 2.36 2.32 2.28 2.24 2.20 2.16 2.12 2.08 2.04 2.00 1H-RMN del compues o 34 Figu a 50. Espec os de 1 H-RMN de los glicodend ones 36 y 37 en D 2 O. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 95 El análisis po espec ome ía de masas de los glicodend ones 36 y 37 se lle ó a cabo median e la écnica MALDI-ToF. En el caso del glicodend ón de p ime a gene ación 36, las mejo es condiciones pa a egis a es e espec o ue on las siguien es: el p oduc o se disol ió en H 2 O y se uso el ácido 2,5-dihid oxibenzóico (DHB) como ma iz. Así, como puede obse a se en la Figu a 51, el espec o mues a un pico a m/z 2739.6 muy mayo i a io, el cual co esponde a la en ada de 6 unidades del de i ado de manosa 17. Figu a 51. Espec o de masas MALDI-ToF del glicodend ón de p ime a gene ación 36. En el espec o ambién se obse aba un pico a m/z 2432.9, que no se co esponde con el pico espe ado si el compues o p esen a a una unidad menos de manosa. Un análisis más exhaus i o de dicho pico e ela que es e podía debe se a una agmen ación del compues o 36. La agmen ación obse ada co esponde ía a la up u a del enlace és e más ex e no de la molécula como se indica en la Figu a 51. Capí ulo 3 96 Pa a el análisis po espec ome ía de masas MALDI-ToF del glicodend ón de segunda gene ación 37, las mejo es condiciones pa a la ob ención del espec o se consiguie on disol iendo el compues o en H 2 O y usando ácido α-ciano-4- hid oxicinámico (HCCA) como ma iz. El espec o de masas mues a un g upo de señales, en e las que se puede obse a el pico m/z 5267.3 que co esponde a la en ada de 12 unidades del de i ado de manosa 17 (Figu a 52). En el espec o ambién apa ecen o as señales a m/z in e io es que, al igual que se obse ó en el caso del glicodend ón de p ime a gene ación, no co esponden a la en ada de un meno núme o de unidades de manosa sino a la agmen ación de los enlaces és e es más ex e nos de la molécula. Figu a 52. Espec o de masas MALDI-ToF del glicodend ón de segunda gene ación 37. Una ez ob enidos los glicodend ones de p ime a y segunda gene ación (36 y 37), se p ocedió a la desp o ección del g upo amino. Pa a ello los compues os p o egidos se a a on con una mezcla H 2 O/TFA (1:2) du an e 16 ho as a empe a u a ambien e. En es as condiciones se ob u ie on los glicodend ones de p ime a y segunda gene ación que hemos denominado 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 , Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 97 espec i amen e (Esquema 19). La desp o ección del g upo amino se con i mó en el espec o de 1 H-RMN po la desapa ición de la señal ca ac e ís ica del g upo e -bu ilo (1.36 ppm), así como la desapa ición de la señal co espondien e en el espec o de 13 C- RMN a 27.8 ppm an o pa a el compues o 36 como pa a el compues o 37. Esquema 19. Sín esis de los glicodend ones 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 . Además de la desapa ición de las señal co espondien es al g upo e -bu ilo, en los espec os de 1 H-RMN y 13 C-RMN de los p oduc os 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 , se pudie on obse a no ables cambios en dichos espec os que ue on ealizados en las mismas condiciones y disol en e que los espec os de los co espondien es p oduc os de pa ida p o egidos. A con inuación se comen a án los cambios de ec ados en el espec o de 1 H-RMN del glicodend ón de 2GLL(SucMan) 12 (Figu a 53), los cuales son ex ensibles al glicodend ón de p ime a gene ación 1GLL(SucMan) 6 . Capí ulo 3 98 2GLL(SucMan)12 O O O NH O O O H2N O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH ppm ( 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 CH3Boc CH3b' CH3c' NH CH2 b CH2 a + c 37 ppm ( 1 ) 1 . 0 2 . 0 3 . 0 4 . 0 5 . 0 NH CH3 b' + c' CH2 c O O O NHO O OBocHN O O O O O O O O O O OO O O O O O O a b c b´ c´ O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH O O H N OH OH OH OH CH2 a + b Figu a 53. Espec os de 1 H-RMN de los glicodend ones 37 y 2GLL(SucMan) 12 en D 2 O. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 99 En p ime luga , se pudo obse a cambios an o en los desplazamien os químicos como en la mul iplicidad de los me ilenos co espondien es a la unidad de c ecimien o (CH 2a , CH 2b , CH 2c ). En el caso del glicodend ón p o egido 37 es as señales apa ecían como un conjun o de single es anchos en o no a 4.0-4.4 ppm, mien as que es el caso del glicodend ón desp o egido 2GLL(SucMan) 12 los me ilos ex e nos (CH 2c ) man enían su desplazamien o químico aunque a iando su mul iplicidad, y los me ilenos in e nos (CH 2a , CH 2b ) cambiaban sus ancialmen e su desplazamien o químico apa eciendo en la zona de 3.5 a 3.9 ppm. También, se pudo obse a que las señales de los me ilos (CH 3b´ , CH 3c´ ) del glicodend ón p o egido 37 que apa ecían como single es, cambia on su aspec o en el caso del p oduc o desp o egido. O a a iación obse ada ue el desdoblamien o de los p o ones be a al amino del espaciado . En el espec o de 1 H-RMN del glicodend ón p o egido 37 es os apa ecían como un único mul iple e cen ado a 1.70 ppm, po el con a io en el compues o desp o egido 2GLL(SucMan) 12 la señal se desdoblaba en dos mul iple es cen ados a 1.70 y 1.88 ppm. Todas es os cambios en el desplazanmien o químico y mul iplicidad de las señales ue on co obo adas median e el análisis de los espec os bidimensonales de co elación p o ón-ca bono HMQC, los cuales se mues an en la Figu a 54. Es os cambios de ec ados en el espec o de 1 H-RMN del p oduc o 2GLL(SucMan) 12 no ienen una explicación sencilla y segu amen e se deban a la con o mación di e en e de es a molécula en disolución. Capí ulo 3 100 Figu a 54. Espec os HMQC de los compues os 37 y 2GLL(SucMan) 12 . Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 101 3.2.3. Análisis de la ac i idad biológica de 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 usando biosenso es. Pa a la e aluación de la ac i idad biológica de los sis emas p epa ados (1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 ) se eligió un expe imen o de compe ición. Pa a ello se uncionalizó un chip CM4 del biosenso (cubie o con una supe icie de ca boxidex ano que pe mi e su uncionalización median e la o mación de enlaces amida), con la p o eína α1-3,α1-6 Mano iosa BSA (BSA-Man) que con enía 15 esiduos del isacá ido mano iosa po molécula de BSA. Se hizo lui una can idad ija del dominio ex acelula soluble de la lec ina (DC-SIGN-EDC) en p esencia o ausencia de los glicodend ones de p ime a y segunda gene ación 1GLL(SucMan) 6 y 2GLL(SucMan) 12 p epa ados p e iamen e. Se inyec a on conjun amen e can idades c ecien es del compues o mul i alen e 1GLL(SucMan) 6 (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 µΜ) y una concen ación ija del ecep o DC-SIGN (800 µM). En la Figu a 55 se ep esen an los sensog amas ob enidos pa a el ensayo de inhibición de la in e acción del ecep o DC-SIGN con BSA-Man. En ausencia de inhibido es, se ob u o una cu a que co espondía al p oceso de in e acción de DC-SIGN con la supe icie uncionalizada con la p o eína BSA-Man. Sin emba go, cuando se inyec a on can idades c ecien es del glicodend ón 1GLL(SucMan) 6 se obse ó una disminución de la señal que e a di ec amen e p opo cional a la concen ación de glicodend ón, lo que indicaba una inhibición de dicha in e acción. Desa o unadamen e, el análisis de las cu as del sensog ama mos ó que el es ado de disociación comenzaba an es de llega al es ado en el que la supe icie se encuen a sa u ada (si uación de equilib io en el que la señal se es abiliza, p obablemen e sea debido a una in e acción débil). Dado que los da os en dicha si uación de equilib io se u ilizan pa a calcula el IC 50 no ue posible es ima el mismo pa a la inhibición de la in e acción DC-SIGN/BSA-Man. Capí ulo 3 102 -100 0 100 200 300 400 500 600 -50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respues a (RU) - + [1GLL(SucMan)6] -100 0 100 200 300 400 500 600 -50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respues a (RU) - + [1GLL(SucMan)6] Figu a 55. Sensog amas del p oceso de inhibición de la in e acción DC-SIGN/BSA-Man usando como inhibido el glicodend ón 1GLL(SucMan) 6 a dis in as concen aciones. Del mismo modo, se ealizó el es udio de inhibición de la in e acción empleando el compues o mul i alen e 2GLL(SucMan) 12 . Se inyec a on conjun amen e can idades c ecien es de dicho glicodend ón (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 µΜ) y una concen ación ija del ecep o DC-SIGN (800 µM). En la Figu a 56 se ep esen an los sensog amas ob enidos pa a el ensayo de inhibición de la in e acción del ecep o DC-SIGN con BSA-Man. Cuando se inyec a on can idades c ecien es del glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 se obse ó una cla a disminución de la señal di ec amen e p opo cional a la concen ación de dicho glicodend ón (Figu a 56). Es o indicaba que el compues o 2GLL(SucMan) 12 compe ía de o ma a o able con la p o eína BSA-Man po la in e acción con el ecep o DC-SIGN, inhibiendo dicha in e acción. En es e caso, el análisis de las cu as ob enidas en el sensog ama pe mi ió es ima un IC 50 pa a el glicodend ón de segunda gene ación 2GLL(SucMan) 12 de 200 µM. Sín esis de glicodend ones basados en el ácido 2,2-bis-(hid oxime il)p opiónico 103 - 100 0 100 200 300 400 500 600 - 50 0 50 100 150 200 250 300 Tiempo (s) Respues a (RU) - + [2GLL( SucMan ) 12 ] Figu a 56. Sensog amas del p oceso de inhibición de la in e acción DC-SIGN/BSA-Man usando como inhibido el glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 a dis in as concen aciones. De es e modo, y median e el uso de biosenso es hemos demos ado que el compues o 2GLL(SucMan) 12 es capaz de inhibi la in e acción del ecep o DC-SIGN y la glicop o eína BSA-Man. En o as palab as, es e compues o iene el amaño y el núme o de azúca es necesa io pa a pode in e acciona con el ecep o DC-SIGN de mane a signi ica i a. Po lo an o, es un buen candida o pa a se conjugado con biomoléculas y es udia el p oceso de in e nalización dependien e de DC-SIGN. Capí ulo 4 110 2GLL(SucMan)12 2GLLBodipy(SucMan)12 41 EDC, HOB E 3N, DMF 93% O O O NHO H2N O 3 O O O O HN 12 OH OH OH OH O O O NH O O 3 O O O O HN 12 OH OH OH OH O O N NB FF H N Esquema 21. Sín esis del glicodend ón de manosa ma cado luo escen emen e con bodipy, 2GLLBodipy(SucMan) 12 . En la Figu a 58 se mues an los espec os de 1 H-RMN del de i ado de bodipy 41 (Figu a 58a), así como del glicodend ón de manosa de segunda gene ación ma cado luo escen emen e 2GLLBodipy(SucMan) 12 (Figu a 58b). El análisis del espec o de dicho compues o ma cado luo escen emen e nos indica la apa ición de una se ie de señales que es án en conco dancia con el anclaje del luo ó o o 41 al sopo e glicodend í ico median e un enlace ipo amida. Así, en el espec o que se mues a podemos obse a la apa ición de las señales A-G las cuales pe enecen al esiduo de bodipy unido al glicodend ón. Ma caje luo escen e e in e nalización 111 ppm ( 1 ) 1. 0 2. 0 3. 0 4.05.06.07.0 C B G E, F AD 41 C B A G E, F a b Figu a 58. (a) Espec o de 1 H-RMN del luo ó o o 41 en CDCl 3 . (b) Espec o de 1 H-RMN del glicodend ón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en MeOH-d 4 . O a a iación obse ada ue el desdoblamien o de los p o ones be a al amino del espaciado . En el espec o de 1 H-RMN del glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 , és os apa ecían como dos mul iple es cen ados a 1.70 y 1.88 ppm mien as que en el nue o compues o es a señal apa ece como un único mul iple e cen ado a 1.55 ppm (Figu a 59). Capí ulo 4 112 ppm ( 1) 1.60 1.70 1.80 1.90 ppm ( 1) 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 a b Figu a 59. Ampliación de los espec os de 1 H-RMN del glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 (a) y del 2GLLBodipy(SucMan) 12 (b). Adicionalmen e, se ealizó el es udio de las p opiedades espec ocópicas del de i ado de bodipy 41 en compa ación con el glicodend ón ma cado luo escen emen e 2GLLBodipy(SucMan) 12 . En un p incipio se ealiza on es as medidas en agua y no se obse ó ninguna a iación signi ica i a en las medidas de máximos de abso ción, emisión y endimien o cuán ico en e las dos moléculas luo escen es. Además, en es e mismo medio ambién se midió el iempo de ida media de ambos compues os obse andose un inc emen o mode ado de és e en el caso del glicodend ón. Dado el e ec o que puede ene el medio (pH, ue za iónica, e c.) en la luo escencia de es e ipo de luo ó o os, ambién se ealizo el es udio de las p opiedades luo escen es del glicodend ón en un medio H 2 O-PBS pa a simula el pH y las condiciones isiológicas en las que se ha ían los es udios biológicos de es e ipo de compues os. Así, al igual que en el caso de los es udios en agua no se obse ó ningún cambio signi ica i o sal o en la mejo a del iempo de ida media, po lo que podemos deci que el glicodend ón 2GLLBodipy(SucMan) 12 posee unas buenas p opiedades de luo escencia a pH isiológico (Figu a 60). Ma caje luo escen e e in e nalización 113 0 0.02 0.04 0.06 0.08 300 350 400 450 500 550 600 650 700 UV Fluo 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 240 340 440 540 640 740 Fluo UV H 2 O Máximo de abso ción: 522nm Máximo de emisión: 535nm Φ = 0.2 (Rodamina B) τ= 5.66 ns χ 2 = 1.192 H 2 O - PBS Máximo de abso ción: 524nm Máximo de emisión: 541nm Φ = 0.1 (Rodamina B) τ= 7.06 ns χ 2 = 1.155 (H 2 O) τ = 6.87 ns χ 2 = 1.167 (PBS) a b Figu a 60. Espec os de emisión y abso ción de UV y luo escencia. (a) De i ado de bodipy 41 en H 2 O; (b) Glicodend ón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en H 2 O-PBS. 4.2. Sín esis y ma caje luo escen e de dend ones con ol. Adicionalmen e, se plan eó la sín esis del glicodend ón de galac osa ma cado luo escen emen e que se ía empleado pos e io men e como con ol nega i o pa a los es udios de in e nalización en células dend í icas. El ecep o DC-SIGN econoce de i ados de manosa, ucosa e incluso glucosa pe o no galac osa. Es e glicodend ón nos pe mi i ía con i ma que el p oceso de in e nalización es dependien e del ca bohid a o y po an o del ecep o DC-SIGN de o ma selec i a. Pa a sin e iza el glicodend ón de galac osa ue necesa ia la sín esis de un de i ado de galac osa que con u iese en su es uc u a un g upo amino lib e, que al igual que en el caso de la manosa 17, nos pe mi iese la unión al dend ón de segunda gene ación 35. Así, el de i ado de galac osa 46 se p epa ó en cua o e apas a pa i de la co espondien e galac osa pe ace ilada come cial 42, u ilizando la misma me odología empleada pa a la sín esis del de i ado de manosa 17 (Esquema 22). Capí ulo 4 114 Esquema 22. Sín esis del de i ado de galac osa 46. La p ime a e apa consis ió en la glicosidación del compues o pe ace ilado 42 con 2-b omoe anol empleando las condiciones desc i as p e iamen e en la bibliog a ia, 111 ob eniéndose el de i ado glicosilado 43 con un endimien o del 67%. El espec o de 1 H-RMN del p oduc o 43 mos aba la apa ición de un doble e a 4.52 ppm co espondien e al p o ón anomé ico cuya cons an e de acoplamien o e a 8 Hz, lo que indicaba la o mación exclusi a del anóme o β. Pos e io men e, se ealizó la sus i ución nucleó ila del g upo B del ex emo e minal del espaciado del p oduc o 43 po un g upo azida. Es a e apa se ealizó u ilizando un g an exceso de NaN 3 en DMF anhid a, ob eniéndose el de i ado 44 de o ma cuan i a i a. La sus i ución de b omo po azida ue con i mada po el análisis del espec o de 13 C-RMN del p oduc o 44 en que se pudo obse a la desapa ición de la señal del ca bono unido al b omo a 29.8 ppm y la apa ición de una nue a señal a 50.6 ppm co espondien e al desplazamien o de un ca bono unido a un g upo azida. La desace ilación del p oduc o 44 u ilizando NaOMe 1M en MeOH condujo al compues o 45 con excelen es endimien os. Median e el análisis del espec o de 1 H- RMN se pudo obse a la desapa ición de las señales co espondien es a los me ilos de los g upos ace a o. Po úl imo, la hid ogenación del g upo azida u ilizando como ca alizado paladio sob e ca bono a p esión y empe a u a ambien e, condujo al 111 Da is, B.G.; Maughan, M.A.T.; Ullman, A.; Jones, J.B. Te ahed on: Asymm. 2000, 11, 245–262. Ma caje luo escen e e in e nalización 115 de i ado de galac osa 46. El análisis del espec o de 13 C-RMN del p oduc o 46 mos ó la desapa ición de la señal a 52.0 ppm (CH 2 -N 3 ) y la apa ición de una nue a señal a 42.3 ppm ca ac e ís ica de un ca bono unido a un g upo amino. Una ez sin e izado el de i ado de galac osa 46 co ec amen e uncionalizado, se lle ó a cabo el acoplamien o con el dend ón de segunda gene ación 35. Pa a ello, se emplea on las mismas condiciones an e io men e u ilizadas pa a la sín esis del glicodend ón de manosa de segunda gene ación 37. Así, el dend ón de segunda gene ación 35 y el de i ado de galac osa 46 (2 eq x COOH) se disol ie on en DMF anhid a. Pos e io men e, se ealizó la adición a empe a u a ambien e de DIC y HOB (3 eq x COOH) y se man u o la eacción a 40ºC du an e 48 h. En es as condiciones se ob u o el glicodend ón de segunda gene ación de galac osa 47 con buen endimien o as su pu i icación po c oma og a ía de exclusión po amaño usando Sephadex LH20 (Esquema 23). Esquema 23. Sín esis del glicodend ón de galac osa 47 . Al igual que en el caso del glicodend ón de manosa de segunda gene ación 37, en el espec o de 1 H-RMN en D 2 O del glicodend ón 47 se obse ó un desdoblamien o de las señales co espondien es a los g upos me ilénicos de los succínicos mien as que en el espec o del p oduc o de pa ida apa ecían como un único mul iple e. Es e esul ado indicaba un cla o cambio en el en o no químico de los mismos, poniendo de Capí ulo 4 116 mani ies o la o mación de los enlaces amida necesa ios pa a la conjugación del ca bohid a o. Además, en el espec o ambién se pudo ap ecia la apa ición de nue as señales co espondien es a la unidad de galac osa, cuya in eg ación con espec o a las señales p opias de los dend ones pusie on de mani ies o la en ada de 12 unidades de galac osa (Figu a 61). Figu a 61. Espec o de 1 H-RMN de los glicodend ones 47 en D 2 O. Una ez ob enido el glicodend ón de galac osa 47, se ealizó la desp o ección del g upo amino. Pa a ello, dicho compues o se a ó con una mezcla H 2 O/TFA (1:2) du an e 16 ho as a empe a u a ambien e, bajo es as condiciones se ob u o el glicodend ón 2GLL(SucGal) 12 (Esquema 24). La desp o ección del g upo amino se con i mó en el espec o de 1 H-RMN po la desapa ición de la señal ca ac e ís ica del g upo e -bu ilo (1.36 ppm) del p oduc o 47, así como la desapa ición de la señal co espondien e en el espec o de 13 C-RMN a 27.8 ppm. Ma caje luo escen e e in e nalización 117 O O O NH O BocHN O 3 O O 47 HN 12 O O O O NHO H2N O 3 O O 2GLL(SucGal)12 HN 12 O O O N NB FF O O NH O H N 3 2GLLBodipy(SucGal)12 TFA/H2O (2:1) 16h, .a. 97% 41 EDC, HOB E 3N, DMF 90% O HO OH OH OH O HO OH OH OH OO O O HN 12 O O HO OH OH OH Esquema 24. Sín esis del glicodend ón 2GLL(SucGal) 12 y del glicodend ón ma cado luo escen emen e 2GLLBodipy(SucGal) 12 . Pos e io men e, se ealizó el acoplamien o del glicodend ón de galac osa con el luo ó o o 41, ob eniéndose de es e modo el glicodend ón ma cado 2GLLBodipy(SucGal) 12 (Esquema 24). El análisis del espec o 1 H-RMN del glicodend ón de galac osa ma cado luo escen emen e p esen aba al igual que en el caso del compues o 2GLLBodipy(SucMan) 12 la apa ición de las señales del luo ó o o 41 lo que de e minó el anclaje de és e al sopo e glicodend í ico median e un enlace ipo amida. Capí ulo 4 118 O o con ol nega i o pa a los es udios de in e nalización celula in e esan e se ía el mismo dend ón pe o sin azúca es. Es e sis ema nos pe mi i ía demos a que son los ca bohid a os los que ealmen e inducen la in e nalización de o ma selec i a dependien e del ecep o . Pod ía ocu i que en las células u ilizadas hubie a algún ecep o de galac osa y po an o pod ía in e e i en el es udio de la selec i idad del p oceso de in e nalización dependien e del ecep o DC-SIGN. Po ello se plan eó la sín esis del de i ado 52 (Figu a 62) que p esen a g upos hid oxilo en su supe icie. O O O NH O O O NH OO O O O OO O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O O O O O OO O O O O OO OO O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O H OH OH OH O O NN B F F 52 Figu a 62. Dend ón con ol 52 con g upos hid oxilo en su supe icie ma cado luo escen en e. El p ime paso de es a u a sin é ica implicaba el acoplamien o median e un enlace és e del 2-benciloxie anol come cial al dend ón 35 (Esquema 25). Pa a ello se u iliza on las condiciones empleadas an e io men e pa a la ob ención de los dend ones de p ime a y segunda gene ación 32 y 33 (DCC, DPTS y como disol en e diclo ome ano a 40ºC). Ma caje luo escen e e in e nalización 119 Esquema 25. Sín esis del dend ón 48 a pa i del dend ón 35. Sin emba go, en es as condiciones se ob u o una mezcla de p oduc os consecuencia de una en ada incomple a del 2-benciloxie anol al y como se mues a en la Figu a 63. El aumen o en el núme o de equi alen es de alcohol, DCC o HOB no mos ó una mejo a signi ica i a, ob eniéndose espec os de masas muy simila es. El cambio de disol en e po o os ales como THF o DMF no condujo en ningún caso al p oduc o monodispe so deseado. Figu a 63. Espec o de masas ESI del dend ón 48. Dado que has a el momen o, los acoplamien os ipo és e que se habían ealizado median e el empleo de DCC y DPTS habían dado excelen es esul ados en la ob ención de p oduc os monodispe sos, se plan eó que el p oblema podía adica en el acoplamien o sob e una supe icie de poliácidos como es el p oduc o 35. Así, se plan eó una nue a sín esis del de i ado 48 a pa i del dend ón de segunda gene ación 31. Es a u a implicaba la sín esis del p oduc o 49 que as el acoplamien o nos conduci ía al dend ón deseado. El p oduc o 49 se ob u o median e la ape u a del anillo de anhíd ido succínico po a aque nucleo ilo del 2-benciloxie anol en pi idina (Esquema 26). La o mación del p oduc o pudo con i ma se cla amen e median e la Capí ulo 4 126 -1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 0 20 40 60 80 [ glicodend ón] µl/ml 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodypy(SucMan)12 Figu a 67. Ensayos de in e acción/in e nalización de los glicodend ones 2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 empleando ci ome ía de lujo. Es os esul ados demues an que es e ipo de glicodend ones son capaces de in e acciona con el ecep o DC-SIGN e in e naliza se al in e io de las células dend í icas. Aunque el ecep o DC-SIGN no es capaz de econoce galac osas, el glicodend on que lle a como ligando es e ipo de ca bohid a o es in e nalizado en las células dend í icas, aunque en meno medida que el que p esen a manosas. Una explicación pa a es e hecho pod ía se que las células dend í icas pueden exp esa en su supe icie o os ecep o es dis in os de DC-SIGN capaces de in e acciona con galac osas lo que explica ía los esul ados encon ados. Es cla o que el glicodend ón de galac osas 2GLLBodipy(SucGal) 12 no es un con ol nega i o adecuado pa a es os expe imen os aunque la di e encia encon ada en e el compues o de manosa y galac osa pone en e idencia la selec i idad del p oceso dependien e de un ecep o . A la is a de es os esul ados podemos conclui que los glicodend ones sin e izados que con ienen 12 copias de manosas son capaces de se in e nalizados en las células dend í icas ía DC-SIGN. Pa a con i ma el p oceso de in e nalización al in e io celula se es án lle ando a cabo es os es udios usando un mic oscopio con ocal y ma cado es especí icos de de e minados es uc u as in acelula es pa a con i ma que el p oceso de in e acción del glicodend ón con el ecep o conduce a un p oceso de in e nalización mediado po dicho ecep o . Ma caje luo escen e e in e nalización 127 Es os esul ados muy p ome edo es ab en las pue as pa a la po encial u ilización de es os sis emas glicodend í icos como anspo ado es selec i os de moléculas ( á macos, pép idos, ácidos nucleicos) que puedan conjuga se a dichos sis emas con aplicaciones en di e en es campos de in es igación como pueden se la e apia génica no i al, el desa ollo de acunas, y el anspo e selec i o de á macos aumen ando su e iciencia y disminuyendo los po enciales e ec os secunda ios. La implicación de DC-SIGN en p ocesos de señalización hace de es e ecep o una diana muy in e esan e pa a pode modula , a a és de la in e acción de di e en es ca bohid a os con dicho ecep o , el p oceso de señalización y po an o una espues a inmune especí ica. 69 Pa a e alua si nues os sis emas glicodend í icos, al in e acciona con el ecep o DC-SIGN, dan luga a algún ipo de señalización, se lle a on a cabo expe imen os en los que se analizó la sec eción de ci oquinas median e ELISA, usando de nue o las DC inmadu as ob enidas a pa i de células leucoci a ias de dos donan es sanos. Es as células se incuba on en p esencia o ausencia de ambos glicodend ones y en p esencia o ausencia de lipopolisacá idos (LPS) du an e 18 ho as a 37º C. Los Lipopolisacá idos (LPS) son mac omoléculas cons i uidas po un lípido y un polisacá ido, que se encuen an en la memb ana ex e na de bac e ias G am- nega i as. Es os ac úan como endo oxinas p o o ípo po que pueden se econocidas po TLRs desencadenado, en e o as espues as, la sec eción de la ci oquina in e leuquina 10 (IL-10). El econocimien o de los epí opos de manosa po el ecep o DC-SIGN puede hace que és e ac ué como inmunomodulado , ac i ando los TLRs y aumen ando po an o el econocimien o de LPS, un e ec o que end ía como consecuencia el aumen o de la p oducción de IL-10. 69 (a) Zhou, T.; Chen, Y.; Hao, L.; Zhang, Y. Cell. Mol. Immunol. 2006, 3, 279-283. (b) an Kooyk, Y. Biochem. Soc. T ans. 2008, 36, 1478-1481. (c) den Dunnen, J.; G inghuis, S.I.; Geij enbeek, T.B.H. Cance Immunol. Immuno he . 2009, 58, 1149-1157. (d) Geij enbeek, T.B.H.; den Dunnen, J.; G inghuis, S.I. Fu u e Mic obiol. 2009, 4, 879-890. (e) G inghuis, S.I.; Dunnen, J.; Li jens, M.; Vlis , M.; Geij enbeek, T.B.H. Na . Immunol. 2010, 10, 1081-1089. ( ) Dunnen, J.; G inghuis, S.I.; Geij enbeek, T.B.H. Immunol. Le . 2010, 128, 12-16. Capí ulo 4 128 Median e es e expe imen o, se obse ó, como puede e se en la Figu a 68, un cie o g ado de sine gia en la ele ación de la sec eción de la ci oquina, IL-10 en el caso del glicodend ón 2GLLBodipy(SucMan) 12 en p esencia de LPS, y en meno medida con el glicodend ón 2GLLBodipy(SucGal) 12 . Es os esul ados indican que es os glicodend ones pueden induci una señalización de e minada as su in e acción con el ecep o DC-SIGN. Sin emba go, es e e ec o es dependien e del donan e del que se ob engan las células dend í icas, como se e en la Figu a 68, el e ec o es di e en e en el caso del donan e B, en el que dicho e ec o no es á an cla o ya que se ap ecian menos di e encias en la p oducción de IL-10. 0.0 1000.0 2000.0 3000.0 4000.0 5000.0 6000.0 7000.0 8000.0 9000.0 10000.0 Con ol 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodipy(SucMan)12 IL-10 (ng/ml) No LPS LPS 0.0 200.0 400.0 600.0 800.0 1000.0 1200.0 1400.0 Con ol 2GLLBodipy(SucGal)12 2GLLBodipy(SucMan)12 IL-10 (ng/ml) No LPS LPS Donan e A Donan e B Figu a 68. Expe imen os de sec eción de ci oquinas IL-10 10 po los glicodend ones de manosa y galac osa en p esencia de LPS. En esumen podemos deci que se han p epa ado glicodend ones que p esen an 12 unidades de manosa o de galac osa ma cados luo escen emen e Ma caje luo escen e e in e nalización 129 (2GLLBodipy(SucMan) 12 y 2GLLBodipy(SucGal) 12 espec i amen e) los cuales se han empleado pa a ealiza es udios de in e acción/in e nalización que han sido e aluados median e ci ome ía de lujo, así como expe imen os de sec eción de ci oquinas IL-10 e aluados median e el empleo de ELISA en células dend í icas. Es os expe imen os han pues o de elie e que el p oceso de in e nalización es dependien e del ca bohid a o y po an o del ecep o DC-SIGN de o ma selec i a. Capí ulo 5 Conjugación de biomoléculas Conjugación de biomoléculas 133 5. Conjugación de biomoléculas. Como comen amos en el capí ulo 3 de la p esen e memo ia el glicodend ón 2GLL(SucMan) 12 iene la capacidad de bloquea la in e acción en e el ecep o DC- SIGN y la glicop o eína BSA-Man. Ap o echando el mecanismo de in e nalización del ecep o DC-SIGN y la in e acción en e DC-SIGN y el glicodend ón de manosa de segunda gene ación 2GLL(SucMan) 12 nos plan eamos la p epa ación de sis emas mul i alen es mix os que p esen en ca bohid a os y o as moléculas de in e és biológico. De es a o ma, es os glicodend ones mix os in e acciona ían de o ma selec i a con el ecep o DC-SIGN a a és de los ca bohid a os y se in e naliza ían in oduciendo de o ma selec i a las moléculas de in e és biológico que lle an ancladas. Como moléculas de in e és biológico po la po encial aplicación que pueden ene en el u u o, amos a emplea pép idos y oligonucleó idos. Los ca bohid a os son moléculas poco inmunogénicas y no an a da luga a an icue pos especí icos en e a los mismos; sin emba go, los pép idos en gene al si lo son. Seleccionando adecuadamen e es os pép idos se pod ía in e naliza en las células dend í icas es os sis emas desencadenando una espues a inmune especí ica en e a Capí ulo 5 134 dichos pép idos que se pod ía u iliza en el desa ollo de acunas en e a un de e minado ipo de en e medad. 112 Además de la gene ación de acunas, los sis emas mul i alen es mix os ambién pod ían emplea se en ans e encia de plásmidos en lo que se denomina e apia génica. Desde el descub imien o del o igen gené ico (gen de ec uoso, inac i o, e c.) de muchas en e medades en e a las cuales no hay po el momen o ningún ipo de e apia, la espe anza pa a cu a es e ipo de en e medades eside en lo que se denomina la e apia génica. Es a e apia génica consis e en la sus i ución del gen de ec uoso po o o uncional u ilizando un ec o de ans e encia adecuado. 113 Inicialmen e se han u ilizado ec o es de ans ección basados en sis emas i ales, pe o es os sis emas es án dando muchos p oblemas desde el pun o de is a expe imen al, é ico y de segu idad. Po es a azón, el uso de ec o es no i ales ha ecibido una g an a ención en los úl imos años. Aunque se han desa ollado un g an núme o de es os ec o es, odos ellos adolecen de una al a pa cial o o al de selec i idad a la ho a de ans e i el plásmido a una de e minada célula diana. 114 En es e sen ido, se p e ende u iliza los glicodend ones pa a consegui plásmidos de o ma que, a a és de los ca bohid a os del sis ema mul i alen e, se do e al sis ema una especi icidad adecuada en unción del ca bohid a o elegido pa a cada ipo de ecep o celula . De es a o ma, se pod á hace una ans e encia selec i a del plásmido a un de e minado ipo de célula diana. En es e capí ulo se ha es udiado la uncionalización del sis ema mul i alen e de ca bohid a os 2GLL(SucMan) 12 pa a gene a sis emas mix os con un pép ido o un oligonucleó ido modelo. A con inuación se ha a un b e e epaso sob e los dis in os ipos de adición quimioselec i a que han sido empleados mayo i a iamen e en los p ocesos de conjugación de biomoléculas. 112 Rojo, J. An i-In ec i e Agen s Med. Chem. 2009, 23, 50-72. 113 S ephanopoulos, N. Ha a d Sci. Re . 2001, 14, 43-46. 114 Fe be , D. Science 2001, 294, 1638-1642. Conjugación de biomoléculas 135 5.1. Adición quimioselec i a. La adición de biomoléculas quimioselec i a es el acoplamien o co alen e de dos o más sus ancias desp o egidas en medio acuoso en el cual dichas moléculas es án al amen e uncionalizadas y con ienen únicamen e un g upo eac i o uncional. El concep o subyacen e que ca ac e iza la adición de biomoléculas quimioselec i a es el é mino “bioo ogonalidad”. En o as palab as, el pa de g upos uncionales que dan luga a la unión deben se los únicos que se ean al e ados. En esumen podemos deci que la mejo conjugación de moléculas de o ma quimioselec i a debe se : ápida, de ele ado endimien o, no debe eque i un g an exceso de eac i os (y si lo emplea que sean ácilmen e eu ilizables), deben lle a se a cabo en medios acuosos sin eque i el uso de co-disol en es y han de se i e e sibles en condiciones isiológicas. Una de las eacciones que ha sido empleada en es e ipo de uniones quimioselec i as han sido las eacciones de cicloadición (Figu a 69), en e ellas podemos des aca la cicloadición 1,3-dipola de Huisgen en e azidas y alquinos (Figu a 69B). La u ilidad de es e ipo de eacciones adica en la acilidad pa a in oduci las unciones alquino o azida en moléculas o gánicas, y en el hecho de que es as unciones son es ables bajo una g an a iedad de condiciones. Además, son undamen almen e ine es an o en disol en es o gánicos como en condiciones isiológicas donde exis en moléculas con al a uncionalización, ine es en p esencia de oxígeno molecula y/o agua, y bajo la mayo ía de las condiciones comunes en sín esis o gánica. Anexo 3 Espec os Espec os 241 1 H-RMN 400 MHz CD 3 OD Anexo 3 242 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 1 H-RMN 300 MHz CDCl 3 Espec os 243 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Anexo 3 244 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Espec os 245 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 S p i n W o k s 3 : P o o n 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD Anexo 3 246 PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 S p i n W o k s 3 : P o o n 1 H-RMN 300 MHz CD 3 OD