Bdellovibrio ¿Qué hay de nuevo, viejo?

FACULTAD DE BIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SEVILLA TRABAJO FIN DE GRADO BDELLOVIBRIO ¿QUÉ HAY DE NUEVO, VIEJO? AUTOR: RAFAEL GONZALEZ BRIOSO FECHA: JUNIO 2022 TUTORA: MARIA DEL ROSARIO ESPUNY GÓMEZ DEPARTAMENTO MICROBIOLOGÍA ÍNDICE 1. Resumen…………………………………………………………………………………………………………………..1 2. Introducción……………………………………………………………………………………………………………..1 3. Ciclo de vida .................................................................................................................. 3 3.1. Ciclo de Bdellovibrio bacteriovorus....................................................................... 3 3.2. Ciclo epibiótico....................................................................................................... 6 3.3. Ciclo independiente de hospedador ........................................................................ 7 3.4. Señalización durante el ciclo de depredación ......................................................... 8 4. Procesos moleculares durante el ciclo ........................................................................... 9 4.1. Pilus de tipo IV ....................................................................................................... 9 4.2. Papel del diguanilato cíclico (C-di-GMP) ........................................................... 11 4.3. Expresión génica ................................................................................................... 12 4.4. DivIVA y ParA ..................................................................................................... 14 4.5. Mecanismos para evitar la depredación por Bdellovibrio .................................... 15 5. Ecología ....................................................................................................................... 16 5.1. Temperatura .......................................................................................................... 17 5.2. Salinidad ............................................................................................................... 18 5.3. Impacto de la presa ............................................................................................... 18 6. Aplicaciones ................................................................................................................ 19 6.1. Alternativa a los antibióticos ............................................................................... .21 6.2. Tratamiento de aguas ........................................................................................... 23 6.3. Bioextracción de bioplásticos ............................................................................... 24 7. Conclusiones y perspectivas futuras………………………………………………………………………..25 8. Bibliografía…………………………………………………………………………………………………..……..…27 1 1. Resumen Bdellovibrio bacteriovorus es un pequeño depredador Gram negativo que ha evolucionado para invadir a otras bacterias Gram negativas, alimentarse y multiplicarse en el periplasma a expensas de sus nutrientes. Debido a su estilo de vida único, ha sido reconocido como un agente de biocontrol con muchas aplicaciones. Además, se han encontrado bacterias del género Bdellovibrio que son epibióticos, es decir, no se introducen en el periplasma. Los dos tipos de Bdellovibrio pueden convertirse en independientes de hospedador si sufren algunas mutaciones específicas en el genoma. En la última década, se han publicado artículos sobre los detalles moleculares que se dan durante el ciclo (expresión de genes, proteínas secretadas, estructuras importantes, etc), además se ha demostrado que existen dos señales en la presa para que ocurra la depredación, una señal temprana y una señal tardía. En este TFG se reúne y resume el conocimiento actual sobre Bdellovibrio y sus posibles aplicaciones. 2. Introducción La depredación es una interacción natural y esencial presente en todos los niveles tróficos y en todos los ecosistemas, que contribuye al mantenimiento del equilibrio ecológico (Johnke et al., 2019). Las bacterias depredadoras están distribuidas en diferentes grupos taxonómicos. Mientras que los depredadores obligados sobreviven consumiendo la célula de la presa, los facultativos cambian fácilmente a un estilo de vida saprofítico, consumiendo una amplia gama de sustratos en ausencia de presas adecuadas (Jurkevitch, 2007; Korp et al., 2016). El descubrimiento de la depredación obligada en bacterias fue accidental; la primera bacteria con este tipo de depredación fue aislada en 1962 por H. Stolp y H. Petzold, cuando intentaban aislar del suelo un bacteriófago para un patógeno vegetal (Pseudomonas phaseolicola), pero aparecieron calvas de la que se aisló Bdellovibrio (Stolp and Petzold., 1963). Bellovibrio engloba a bacterias Gram negativas aerobias o microaerófilas, quimiorganotrofas, con un tamaño promedio de 0,2 a 0,5 μm de ancho y de 0,5 a 2,5 μm de largo, con forma de vibrio; presenta un flagelo polar que la hace altamente móvil, se desplaza 100 veces su tamaño por segundo (Caulton and Lovering, 2020). La alta movilidad le sirve para llevar a cabo una búsqueda selectiva de la presa por hidrodinámica que lleva al depredador donde hay mayor densidad de presa, y cuando entra en contacto con ella, se adhiere a su superficie celular, atraviesa la membrana externa hacia el periplasma, formando al entrar un “bdelloplasto” 2 donde se inician los procesos digestivos de los componentes de la presa, el crecimiento y la multiplicación del depredador para dar lugar a nueva progenie (Prehna et al., 2014). A raíz de la expansión de los genes de resistencia a antibióticos en los patógenos bacterianos, la búsqueda de nuevas técnicas para la eliminación de estos patógenos se ha convertido en un objetivo principal. La necesidad de una mejor gestión de nuestro medio ambiente también impulsa la investigación hacia aplicaciones en agricultura, acuicultura y tecnologías ambientales. Así, se están empleando los Bdellovibrio en sistemas de control biológico, para el uso de sus enzimas (del tipo de las hidrolasas) y su empleo como depredadores frente a ciertas bacterias (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). Las bacterias del género Bdellovibrio han evolucionado para invadir, matar y digerir una amplia gama de hospedadores o presas, todas Gram negativas. El representante más estudiado y conocido es Bdellovibrio bacteriovorus un pequeño depredador de bacterias Gram negativas (Salmonella sp., E. coli entre otras) y desde entonces este comportamiento ha sido estudiado por bioquímicos, ecólogos y microbiólogos (Negus et al., 2017). Bdellovibrio presenta dos tipos de ciclos de vida, puede crecer con la presa denominándose dependiente de hospedador (HD) o, más raramente y tras mutaciones, puede crecer axénicamente, es decir, sin hospedador al que depredar, denominándose independiente de hospedador (HI) (Prehna et al., 2014). Los HD pueden presentar un ciclo endobiótico, si entra en el periplasma para replicarse, o epibiótico, si se replica fuera del hospedador. En general, el ciclo de vida es bifásico con una fase de ataque o de vida libre, en la que busca y se adhiere a la presa y una fase de crecimiento, y de división en la que se alimenta de la presa (Deeg et al., 2020). El pequeño genoma de B. bacteriovorus HD100 ha sido secuenciado, posee aproximadamente 3,8 Mb, típico de un depredador obligado, codifica un secretoma (conjunto de proteínas que son secretadas al medio extracelular) de 1520 proteínas de las cuales 293 aproximadamente son proteínas líticas entre ellas 150 proteasas y peptidasas, 10 glicanasas, 20 ADNasa, 9 ARNasa y 15 lipasas (Bratanis et al., 2020); también codifica numerosas proteínas que están implicadas en la vía de señalización del segundo mensajero di-GMP cíclico (c-di-GMP) (Hobley et al., 2012). Las proteínas poseen diferentes tipos de secreción tanto de membrana externa, como de membrana interna, por lo que las proteínas líticas tienen que jugar un papel crucial en su ciclo (Bratanis et al., 2020). 3 Existen ciertos microorganismos que tienen un comportamiento semejante a Bdellovibrio, son los pertenecientes al grupo de los BALO (Bdellovibrio and like organisms); constituyen un grupo exclusivo de bacterias Gram negativas depredadoras obligadas que se alimentan únicamente de otras bacterias Gram negativas y, como tales, se consideran agentes potenciales de control biológico y antibióticos vivos (Rotem et al., 2015b). En la naturaleza el grupo de los BALO es importante ya que se considera un equilibrador ecológico de otras comunidades microbianas, y se encuentran tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos y en los intestinos de los animales (Snyder et al., 2002). Debido a que los depredadores obligados no pueden replicarse en ausencia de la presa, la estructura de las poblaciones de los BALO está bajo selección ambiental (Chen et al., 2011). La clasificación de los BALO ha ido evolucionando a lo largo del tiempo y, actualmente, pertenecen a dos clases, la clase Oligoflexia (antes se incluía en las Deltaproteobacteria) e incluye a los géneros Bdellovibrio, Bacteriovorax, Pseudobacteriovorax y Peredibacter y, la segunda clase Alfaproteobacteria que solo tiene a Micovibrio, un depredador epibiótico (Ezzedine et al., 2020). 3. Ciclo de vida 3.1. Ciclo de Bdellovibrio bacteriovorus B. bacteriovorus es un depredador obligado, dependiente de hospedador (HD) que posee un ciclo de vida bifásico con una fase de ataque (AP) de vida libre y una fase de crecimiento (GP) intraperiplasmático, existiendo una fase de transición entre estas dos fases (Bratanis et al., 2020). El ciclo de vida dura unas cuatro horas. Los depredadores se encuentran libres con movimiento muy activo buscando a las presas; cuando se produce el encuentro y el reconocimiento de la presa, se adhiere a ella, en primer lugar de forma reversible, pero, instantes después, la unión se vuelve irreversible. Posteriormente, Bdellovibrio hidroliza la membrana externa de la presa utilizando diferentes enzimas y entra por el poro desarrollado. Una vez dentro, el poro se sella para asegurar la mínima pérdida de metabolitos y comienza a asimilar y metabolizar moléculas de la presa lo que le permite el crecimiento en forma de filamento; por último, el filamento se divide y genera la progenie, la célula de la presa se lisa 4 para que salgan las células hijas y vuelva a comenzar otro ciclo (Caulton and Lovering, 2020) (figura 1). La depredación es un proceso multifactorial de encuentro con las presas, reconocimiento y degradación programada, en la que son importantes los flagelos, los orgánulos deslizantes y los pili tipo IV (Negus et al., 2017). Los flagelos proporcionan una alta movilidad a la bacteria lo que es importante para las colisiones depredador-presa y conducir a una depredación eficiente en un medio líquido. El reconocimiento de la presa puede ser al azar pero, en algunas ocasiones, las fuerzas hidrodinámicas aumentan la posibilidad de encontrar a la presa (Jashnsaz et al., 2017). Sin embargo, el flagelo en si no es absolutamente necesario para la depredación, ya que se ha demostrado (Lambert et al., 2006) que mutantes del flagelo pueden depredar aunque con menos eficiencia; esto es debido a que pueden utilizar los orgánulos deslizantes, ya que presentan un mecanismo de polimerización y despolarización de las fibras de pilina en un polo de la célula bacteriana permitiendo el movimiento hacia delante mediante un mecanismo de movilidad por contracción (Luciano et al., 2011). Esta movilidad deslizante está asociada a una flexibilidad inusual de la célula. Figura 1. Ciclo de vida de B. bacteriovorus. 1. Fase de ataque de nado libre; 2. Adhesión a la presa; 3-4. Invasión de la presa; 5. Pérdida del flagelo, sellado del poro y formación del bdelloplasto; 6. Crecimiento filamentoso; 7. Septación; 8. Lisis. Adaptado de Caulton and Lovering, 2020, elaboración propia. 5 La depredación por deslizamiento requiere de complejos multiproteicos que se expresan en la envoltura celular y, aunque el desplazamiento es más lento, permite la entrada y la salida en las bacterias presas que se desarrollan en biopelículas en ambientes con poca humedad (figura 2). Los complejos proteicos se denominan FAC (focal adhesion complexes), se acumulan en el lado ventral periódicamente y en ellos se expresa una proteína de movilidad deslizante (AglZ-YEP). La formación de focos AglZ-YEP requiere del citoesqueleto bacteriano (MreB-actina) y un motor impulsado por la fuerza protón motriz (AglRQS) para poder producirse el deslizamiento (Luciano et al., 2011). Los pili tipo IV son necesarios para la depredación (Milner et al., 2014), el depredador tiene que utilizarlos para poder adentrarse al periplasma a través del poro formado, ya que es más delgado que el propio Bdellovibrio, por lo que debe tener la capacidad de deformarse y para eso se ayuda del mencionado pilus (Caulton and Lovering, 2020). Una vez el depredador está dentro, el poro se sella y se forma el ”bdelloplasto”, estructura redondeada, osmóticamente estable, en la que el depredador crece absorbiendo eficientemente los nutrientes, proteínas y nucleótidos del citosol del hospedador para su propio crecimiento, además de servirle de protección. Una vez se le acaban los nutrientes, el Figura 2. Ciclo del depredador B. bacteriovorus (en amarillo) con bacteria presa (en verde) . En un medio líquido (parte superior de cada imagen, fondo en azul) la utilidad de la movilidad es importante para los encuentros y la salida de la presa y sobre una superficie (parte inferior con fondo gris) los orgánulos deslizantes producen movilidad para el encuentro y la salida de la presa (Negus et al., 2017:443). 6 depredador deja de multiplicarse y las células hijas, formadas por septación sincrónica del largo filamento con numerosos nucleoides, salen lisando la célula de la presa (Deeg et al., 2020). Para que la depredación ocurra, las presas deben estar activas energéticamente, es decir, se necesita que haya un contenido de nutrientes aceptable, porque si es bajo, la depredación se detiene y la célula muere. Además, se ha observado que utilizan algunos de los componentes de la presa, por ejemplo, se estima que aproximadamente el 70% del ADN de la presa se incorpora al ADN recién sintetizado del depredador (Bukowska-Faniband et al., 2020), y otros muchos se sintetizan de novo (Lambert et al., 2006). 3.2. Ciclo epibiótico Dentro del grupo de los microorganismos epibióticos se encuentra Bdellovibrio exovorus que posee un rango de hospedador muy estrecho y emplea una estrategia de replicación epibiótica con una fase de ataque, igual que la de B. bacteriovorus , y una fase de crecimiento en la que las células no penetran al periplasma sino que se quedan adheridas al exterior; se asemeja al comportamiento de Microvibrio, pero con algunas diferencias ya que B. exovorus genera un bdelloplasto y Microvibrio no, y extrae el contenido del citoplasma de la presa a través de las membranas; una vez se agota todo, se produce una fisión binaria liberando dos células (Deeg et al., 2020). En un estanque de agua dulce eutrófica en la Columbia Británica (Canadá), se aisló un parasitoide al que se le llamó “Candidatus Bdellovibrio qaytius” que también es epibiótico, se replica fuera y se alimenta preferiblemente de la Betaproteobacteria Paraburkholderia fungorum. A pesar de esto, el genoma es más similar a depredadores intraperiplasmáticos complejos y se sugiere que es un grupo basal y que este tipo de depredación es ancestral (Deeg et al., 2020).“Candidatus Bdellovibrio qaytius” es un depredador obligado, no puede crecer axénicamente y, en la fase de ataque, las células en forma de vibrio con flagelo nadan muy rápidamente; cuando las células entran en contacto con la presa adecuada, se adhieren irreversiblemente y forman una amplia sinapsis depredadora, no forma bdelloplasto por lo que es un epibiótico, va vaciando a la célula hospedadora a medida que crece (figura 3); al final se produce la fisión y la producción de las células hijas (Deeg et al., 2020). 7 3.3. Ciclo independiente de hospedador Algunas bacterias del género Bdellovibrio tras mutaciones pueden crecer sin presa (axénicamente), pero este comportamiento es algo raro. Se ha visto que son mutaciones en las proteínas que forman el pilus retráctil, de lo que se deduce que para que tenga lugar el ciclo intraperiplasmático es necesario que el pilus se encuentre en perfecto estado (Prehna et al., 2014). Existen dos tipos de mutantes HI; los de tipo I se caracterizan porque pueden formar colonias aisladas en ausencia de presas si se encuentran en un medio rico suplementado con extracto de presa, denominándose mutantes saprófitos y se cree que se debe a una mutación el gen Bd0108, implicado en la regulación del desarrollo del pilus tipo IV, aunque pueden existir otras mutaciones desconocidas. Los de tipo II pueden crecer en un medio completo estándar pero no necesitan extracto de presa para crecer, a esto se le denomina crecimiento axénico y por tanto son mutantes axénicos; se observó que estos mutantes tenían mutados además de Bd0108, dos genes adyacentes, Bd3461 (codifica RhlB, una ARN helicasa dependiente de ATP que forma parte del degradosoma) y Bd3464 (que codifica PcnB, la poli(A) polimerasa que cataliza la poliadenilación del ARN en el extremo 3') (Roschanski et al., 2011). Los mutantes tipo II de B. bacteriovous se replican sin presas y sin extracto de esta, tienen regulados positivamente los genes implicados en el crecimiento general y en la división celular, muestran un crecimiento dimórfico y normalmente, mantienen sus capacidades depredadoras (Bratanis et al., 2020), lo mismo ocurre en crecimiento saprófito, cuando sí existe extracto de presa. Figura 3. "California Bdellovibrio qaytius” estrategia de depredación y replicación. C) Micrografía electrónica de tinción negativa de una fase de crecimiento tardío de "California Bdellovibrio qaytius”(flecha) junto a una presa (punta de flecha). El flagelo se desprende para poder producir la fisión binaria. (Deeg et al., 2020). 14 Los laboratorios de Sockett y Lovering en colaboración han demostrado que B. bacteriovorus tiene una proteína de autoprotección que inhibe a las proteínas PBP4 una vez está dentro de la presa para proteger así las propias paredes celulares del hospedador, por lo que la expresión de estos genes aumenta en la fase de crecimiento (Lambert et al., 2015). 4.4. DivIVA y ParA Bdellovibrio se divide por división sincrónica dentro de la presa y, a partir de una sola célula filamentosa alargada y polinucleada, se formará toda la progenie que suele ser de entre 5 a 8 células hijas. La replicación y la división celular van a depender de los nutrientes que tenga la presa en su interior (Milner et al., 2020). La proteína DivIVA interviene en el crecimiento polar y la formación de esporas en bacterias Gram positivas; parece que en Bdellovibrio controla la morfología filamentosa durante la Figura 6. Expresión diferencial de los genes en cada fase de transición de B. bacteriovorus. A1) B. bacteriovorus en fase de ataque (AP). B1) B. bacteriovorus en fase de reconocimiento. C1) B. bacteriovorus en inicio de fase de crecimiento (GP). A2) Durante la AP no hay detección de la presa y se expresan al alza los genes bd0108 y merRNA. B2) El reconocimiento causa cambios en la extrusión/ retracción del pilus tipo IV, se logra después de detectar la primera señal de la membrana citoplasmática, y CdgA receptor de C-di-GMP que interactúa con el complejo proteico regulador del pilus. Comienzan a activarse los genes de formación del bdelloplasto y los genes tempranos de GP. C2) La perforación de la membrana conduce a la liberación de la segunda señal citosólica que provoca la inducción de genes GP para permitir la replicación y síntesis de ADN. Adaptado de Rotem et al., 2015b, elaboración propia. 15 división celular y, además, puede interactuar con proteínas que responden a indicadores metabólicos de biosíntesis de aminoácidos o cambios en el estado redox (puede ser un indicador del agotamiento de nutrientes para el depredador ya que el bdelloplasto está totalmente sellado) (Milner et al., 2020). La expresión constitutiva de DivIVABd y su localización bipolar a lo largo de 2 horas desde el crecimiento del depredador hasta la hora de la tabicación y la nueva especificación del polo celular, sugiere que DivIVABd coordina procesos importantes de los polos celulares durante el crecimiento del depredador (Milner et al., 2020). La proteína ParA interviene en la segregación de cromosomas y contribuye en la septación, además de ser importante para la motilidad flagelar. Se ha visto que en el caso de los depredadores HI también hay una septación de la célula filamentosa pero las células son pleiomórficas y la división puede ocurrir de forma sincrónica o no (Milner et al., 2020). Antes de la división celular, los componentes celulares deben repartirse a lo largo del filamento y es un proceso fundamental para la organización celular, en el caso de la segregación de cromosomas se lleva a cabo por el sistema ParAB canónico (Milner et al., 2020). 4.5. Mecanismos para evitar la depredación por Bdellovibrio Se sabe que B. bacteriovorus nunca erradica completamente a sus presas y persiste una pequeña población resistente debido a que hay un tipo de resistencia plástica; pero la resistencia de las presas es algo extremadamente raro y es algo transitorio. Shemesh y Jurkevitch (2003) usando cultivos sucesivos han demostrado que se recupera la susceptibilidad a la depredación. Antes de la invasión, Bdellovibrio se adhiere a la membrana externa de la presa y la composición de carbohidratos de las cadenas laterales del antígeno O de esta membrana pueden variar pero no suponen un problema para la depredación, ya que no son específicos (figura 7. a)). Pueden existir barreras físicas como las cápsulas bacterianas (figura 7. b)) que, en algunos casos, impiden el acceso total de los depredadores, pero muchas otras veces no supone ninguna barrera, como es el caso de la invasión de B. bacteriovorus a través de capsulas de E.coli (Koval and Bayer, 1997). En el caso de la capa S (figura 7. c)), una estructura paracristalina con repeticiones proteicas, el depredador tiene que buscar huecos 16 que les permita penetrar en la célula de la presa, por lo que la depredación no suele ser eficiente (Koval and Hynes, 1991). B. bacteriovorus también ataca a presas que se encuentran formando parte de una biopelícula, es decir, formando comunidades bacterianas asociada a una superficie con matriz polimérica extracelular. A pesar de que el desarrollo de bacterias en biopelículas determina más resistencia a antibióticos y antimicrobianos, Bdellovibrio sigue atacando y reduce la biomasa de la biopelícula (Negus et al., 2017). En este tipo de depredación, se expresan genes relacionados con la biosíntesis flagelar, la movilidad deslizante, la quimiotaxis y la proteólisis; y puede afectar además a bacterias Gram positivas ya que se liberan muchas enzimas extracelulares (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). 5. Ecología El género Bdellovibrio posee una amplia distribución de hábitats por todo el planeta, sobre todo en aguas dulces y en el medio terrestre. Los factores ambientales que se han estudiado para la supervivencia y ecología de Bdellovibrio y organismos similares (BALO) son la temperatura, salinidad y distribución de la presa. Estos factores van a influir en el éxito para habitar un nicho particular, en su abundancia, en las funciones celulares y metabólicas y en las interacciones con otros miembros de la comunidad (William and Chen, 2020). Figura 7. a) B. bacteriovorus (amarillo) se adhiere al antígeno O de la membrana externa de un lipopolisacárido (LPS) de una bacteria Gram negativa (izquierda) o sin antígeno O (derecha) y hay depredación. b) B. bacteriovorus se adhiere a una bacteria Gram negativa con cápsula, la cápsula de polisacáridos de E. coli no es una barrera para la depredación (izquierda), pero de otras no se ha estudiado (derecha). c) B. bacteriovorus se adhiere a una bacteria Gram negativa con una capa superficial proteica (capa S), solo en los puntos donde la capa S está incompleta (Derecha) (Negus et al., 2017). 17 Estos microorganismos participan en los ciclos biogeoquímicos y tienen un papel importante en el medio ambiente, ya que pueden afectar la estructura y la dinámica de las comunidades bacterianas; además, son organismos omnipresentes, se encuentran en aguas dulces, aguas saladas, aguas residuales, suelos, sedimentos, en sistemas vegetales como en el cuerpo de los animales (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). Los BALO tienen una gran importancia funcional en las redes tróficas; son considerados depredadores superiores y afectan fuertemente a la diversidad porque pueden limitar la abundancia de especies dominantes y liberar así nichos para taxones que son menos abundantes (Jabiol et al., 2013). Según Hungate et al., (2021) los depredadores obligados aplican un fuerte control trófico “top-down”, es decir, de arriba abajo en la red alimentaria, y de acuerdo con la teoría ecológica predice, que la importancia funcional de los depredadores aumenta con la productividad. 5.1. Temperatura La temperatura es importante porque influye sobre el crecimiento bacteriano de los BALO, su temperatura óptima es más baja para los de agua salada que para los de agua dulce y terrestres. Además, no es solo importante la temperatura para los depredadores, sino que también hay que tener en cuenta el crecimiento de las presas (William and Chen, 2020). Los estudios revelan que los BALO no halotolerantes, es decir, aquellos que no habitan en agua salada, crecen mejor a una temperatura alta de entre 30- 37 °C, y los halotolerantes crecen mejor a una temperatura menor, de entre 20 a 30 °C (William and Chen, 2020). Además, se han conseguido aislar bacterias epibióticas del género Bdellovibrio en aguas termales a temperaturas de entre 57-91 °C (Sangwan et al., 2015). Cuando se supera cierta temperatura, o la temperatura es demasiado baja, los BALO se inhiben. Por lo que, la distribución de los BALO va a depender también de la estación del año, suelen aparecer más bacterias en verano que en invierno, ya que la temperatura también influye en el crecimiento de las presas. Además, el sedimento cuando llega el invierno protege más que la columna de agua, por lo que en invierno se trasladan al sedimento y, en primavera, empiezan a multiplicarse y a salir a la columna de agua (William and Chen, 2020). 18 5.2. Salinidad La salinidad es otro parámetro importante. Hay BALO halófitos, que requieren sal para realizar sus funciones celulares y solo se encuentran en lugares salados, con distinto grado de tolerancia a la sal, y los BALO de agua dulce/terrestres que son no halotolerantes se inhiben con concentraciones de sal superiores al 0,5% (William and Chen, 2020). La sal es un determinante ambiental importante en la ecología, fisiología, genética y distribución de Halobacteriovorax, un organismo halófilo. Dentro de los ambientes salinos pueden existir diferencias en el óptimo de sal. El NaCl no se puede reemplazar por otra sal (William and Chen, 2020), y existen diferencias de salinidad en los mares y océanos del planeta por lo que las bacterias han tenido que adaptarse a esas condiciones. Por ejemplo, en el Mar Mediterráneo (Marbach et al., 1976) los BALO requieren más sal que los BALO del océano Pacífico (Taylor et al., 1974). Se han realizado estudios con cuatro cationes (Na+, K+, Mg2+ y Ca2+). Los resultados fueron que, en ausencia de K+, se redujo mucho la velocidad y movilidad de las bacterias, por lo que disminuyó la depredación y la supervivencia. En el caso de ausencia de Ca2+ se inhibe el crecimiento continuo de los depredadores sobre la presa. En ausencia de Mg2+, el ciclo del depredador fue prolongado y alteró las concentraciones de la presa; se piensa que este ion promueve la fijación, penetración, y la formación del bdellopasto, es decir, interviene en la integridad estructural de los BALO. La conclusión de este estudio es que los efectos de los cationes son específicos e interdependientes, si no están estos cuatro la depredación no ocurriría (William and Chen, 2020). 5.3. Impacto de la presa Bdellovibrio y BALO son principalmente depredadores obligados, y se encargan de controlar las poblaciones bacterianas. Por tanto, dependen de la presa para la nutrición, reproducción y protección (William and Chen, 2020). Por lo que la presa es un factor ambiental crítico en la distribución de estos organismos, como ya sabemos los BALO se alimentan de bacterias Gram negativas aunque recientemente se ha demostrado que algunas pueden obtener nutrientes de bacterias Gram positivas que forman biopelículas, sin penetrar en la pared celular (Waso et al., 2019). Además, los BALO poseen sistemas quimiotácticos 19 (Lambert et al., 2003), y les ayudan a detectar altas densidades de presas potenciales, al menos, en los sistemas acuáticos. Las presas estructuran la comunidad de los BALO a nivel de filotipo (grupo taxonómico); para estos estudios se han utilizado métodos moleculares, como análisis comparativos de ARNr 16S y la metagenómica, para permitir distinguir las comunidades ya que no se cultivan fácilmente en un cultivo puro (William and Chen, 2020). Los BALO halófilos se alimentan con mayor frecuencia y eficiencia de bacterias marinas que de bacterias terrestres o de agua dulce; en el caso de Halobacteriovorax las bacterias que son más susceptibles a la depredación son las especies clasificadas como Vibrio con un 97,5%, las bacterias fotótrofas y relacionadas son también altamente susceptibles con un 80%, y, dentro de las eubacterias no marinas que incluía especies entéricas, las más susceptibles fueron Vibrio cholerae con un 76,9% y Aeromonas formicans con un 100% de susceptibilidad (William and Chen, 2020). Los BALO no halotolerantes formados por los géneros Bdellovibrio, Peredibacter y Bacteriovorax se encuentran en agua dulce, suelo, aguas residuales, en plantas y animales. Generalmente las bacterias más susceptibles a su depredación son Gram negativas y no halófilas (William and Chen, 2020). Un estudio en aguas residuales y lodos (Yu et al., 2017) demostró que las bacterias más susceptibles a la depredación son la de los géneros Aeromonas, Klebsiella, Escherichia, Raoultella y Enterobacter. Además, se ha conseguido aislar muchas bacterias susceptibles de muestras de suelo y rizosfera (Jurkevitch et al., 2000). 6. Aplicaciones Las bacterias depredadoras están ganando ahora una mayor atención, en gran parte debido a los informes alarmantes sobre el aumento de la resistencia a los antimicrobianos y un aumento general de la conciencia ambiental. Varios informes han propuesto y demostrado el potencial uso de bacterias depredadoras como antibióticos vivos, agentes de limpieza del agua y biocontrol, además de ser fuente para el descubrimiento de nuevas herramientas biotecnológicas para la investigación (Yair et al., 2009; Pérez et al., 2016). Cuando fallan los métodos convencionales para la eliminación de microorganismos contaminantes y/o patógenos, los agentes de control biológico, en la que se utiliza 20 organismos para atacar a una población indeseable, es una técnica cada vez más reconocida por su bajo coste y sus limitados efectos adversos sobre el medio ambiente, la vida silvestre y la salud pública (Kergunteuil et al., 2016) podrían constituir una alternativa viable. Los BALO tienen muchas posibles aplicaciones, pueden utilizarse en avicultura para reducir a Salmonella, en acuicultura para eliminar patógenos, en agricultura para combatir contra fitopatógenos, en la industria alimentaria para prevenir el deterioro de ciertos alimentos por bacterias, y así ser una alternativa natural a los antioxidantes y conservantes, limitar la contaminación bacteriana en estanques abiertos de microalgas para la producción de biocombustibles, como tratamiento de los fangos activados en las plantas de aguas residuales, para reducir la corrosión de tuberías causadas por bacterias reductoras de sulfatos, como agente lítico para la recuperación de productos intracelulares producidos por bacterias Gram negativas (bioextracción de bioplásticos), para combatir contra bacterias patógenas de humanos con resistencia a antibióticos llamadas “ESKAPE” ( Enterobacter, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli), utilizar las enzimas bacterianas como herramientas biotecnológicas, etc. (figura 8) (Bratanis et al., 2020). Figura 8. Listados de las posibles aplicaciones biotecnológicas que pueden tener los BALO y sus enzimas secretadas en el campo de medicina, agricultura e industria. Adaptado de Bratanis et al., 2020, elaboración propia. 21 6.1. Alternativa a los antibióticos Los antibióticos son productos naturales, o sus derivados semisintéticos, producidos por microorganismos que matan o impiden el crecimiento de otros microorganismos, por lo que las bacterias han necesitado desarrollar algunas formas de resistencia a los antibióticos para sobrevivir (Pérez et al., 2020). Por ejemplo, algunas bacterias inactivan los antibióticos al producir enzimas que los modifican, también pueden alterar su diana, o evitar que los antibióticos se acumulen, ya sea porque se expulsan mediante bombas de eflujo o alterando la permeabilidad de la membrana (Blair et al., 2015). Los genes de resistencia a los antibióticos se ven favorecidos en la naturaleza debido a la presión selectiva de la producción natural de antibióticos por parte de las bacterias (Pérez et al., 2020). Sin embargo, el uso excesivo o la aplicación incorrecta de estos con fines terapéuticos o en la alimentación animal y en la agricultura, han supuesto una presión selectiva adicional (Gudda et al., 2020) y han acelerado la capacidad de las bacterias para evolucionar y, en consecuencia, conducir a la inevitable aparición y propagación de genes de resistencia. Además, las bacterias pueden acumular múltiples mecanismos de resistencia, y este hecho ha propiciado la aparición de las denominadas superbacterias multirresistentes, que son cepas que han adquirido resistencia a una amplia variedad de antibióticos (Pérez et al., 2020). En medicina, uno de los patógenos multirresistentes a antibióticos que más preopuca es K. pneumoniae, y se están realizando estudios in vitro e in vivo con ratas para poder utilizar a Bdellovibrio para su biocontrol (Shatzkes et al., 2016). Una de las posibles soluciones a esta problema mundial es la utilización de los BALO ya que las pueden depredar y acabar eliminándolas. Se ha demostrado que B. bacteriovorus es incapaz de invadir las células de mamíferos y que no tiene efectos patológicos para la salud humana (Bratanis et al., 2020); pudiendo contribuir además a la salud como parte de la microbiota intestinal, pero aún se necesitan hacer más estudios. Además, Bdellovibrio es resistente a los beta-lactámicos debido a que tiene modificado su peptidoglicano (Kuru et al., 2017), y se puede utilizar como tratamiento combinando con penicilina (Sockett and Lambert, 2004; Dwidar et al., 2012). Por todo esto, es interesante y esperanzador el uso de los BALO ya que se podría convertir en un tratamiento alternativo a los antibióticos para ciertas enfermedades. Otro problema que existe ante la resistencia de las bacterias es que muchas de las poblaciones bacterianas crecen en biopelículas dado que la matriz polimérica extracelular contiene ADN 22 extracelular, polisacáridos, lípidos y proteínas (figura 9) que dificultan la erradicación de los organismos que están incrustados en ella y le da mayor resistencia ante los agentes antimicrobianos porque dificulta que lleguen hasta las presas e incluso pueden bloquear antibióticos (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). Las biopelículas son una fuente de infecciones recurrentes por bacterias patógenas en humanos y en otros animales. Por lo tanto, controlar el crecimiento de biopelículas es de suma importancia. B. bacteriovorus puede reducir las estructuras de biopelículas formadas por varias especies, aunque no de una forma tan eficiente como cuando las bacterias crecen de forma plantónicas. Interfiere con las biopelículas formadas por patógenos Gram positivos y Gram negativos secretando proteasas extracelulares que degradan e inhiben eficientemente la biopelíula y su formación (figura 9), reduciendo así su virulencia (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). B. bacteriovorus también es interesante porque puede contribuir a la salud de la microbiota intestinal humana (Iebba et al., 2013), aunque se considera una bacteria aeróbica obligada puede sobrevivir en condiciones de anoxia, y ciertas cepas pueden llegar a atacar y crecer en condiciones con poco oxígeno en el ambiente (Kadouri and Tran, 2013; Patini et al., 2019). Figura 9. La interacción de Bdellovibrio y organismos similares (BALO) con biopelículas compuestas de bacterias mixtas Gram positivas (no presas) y Gram negativas (presas y no presas). C) Matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) compuestas de ADN extracelular, polisacáridos, lípidos y proteínas. D) Las células BALO en fase de ataque buscan presas y utilizan la matriz EPS como fuente de alimento, iniciando el crecimiento celular. E) Los BALO atacan las células presa y secretan enzimas hidrolíticas (proteasas y nucleasas) que degradan los componentes de la matriz de la biopelícula. F) La biopelícula y las células presa se consumen en gran medida y las células que no son presa y las presas restantes se liberan al medio ambiente. (Mookherjee and Jurkevitch, 2021). 23 6.2. Tratamiento de aguas Se está investigando aplicar una técnica combinada en la potabilización del agua, utilizando tratamientos biológicos junto con la depredación de bacterias. En algunas aguas, la presencia de ciertos organismos oportunistas y patógenos puede ser un riesgo para la salud de la zona, este es el caso de V. cholerae, una de las causas principales de mortalidad en África (Reyneke et al., 2020). Con el tratamiento biológico, las bacterias depredadoras eliminarían de forma selectiva a los microorganismos y, posteriormente, se utilizarían unos biofiltros que eliminarían lo no selectivo de los contaminantes bacterianos, es decir, lo que no pueden eliminar las bacterias depredadoras (Reyneke et al., 2020). Se ha propuesto, la utilización de Bdellovibrio y BALO como tratamiento previo a la filtración durante el tratamiento de potabilización y en las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR); ya que pueden reducir la carga microbiana inicial, sobre todo, de bacterias Gram negativas (Reyneke et al., 2020). Uno de los principales problemas es que puede haber transferencia horizontal entre bacterias de los genes de resistencia a los antibióticos en las aguas residuales. Pero el uso de la cepa de B. bacteriovorus HD 100 posee una ventaja, es capaz de eliminar bacterias recombinantes degradando completamente el ADN ; controlando así la transferencia horizontal de genes de resistencia en el medio ambiente, mediante la liberación proteasas y nucleasas (Bratanis et al., 2020). Este tratamiento requiere de más estudio, debido a que este tipo de bacterias depredadoras también se encuentran con algunos problemas; se ha observado que en algunos entornos debido a la entrada de contaminantes se puede reducir la actividad depredadora de Bdellovibrio, aunque estos microorganismos se ven menos afectados a los contaminantes si se encuentran formando una biopelícula y se asocian a una superficie. Si hay contaminantes las condiciones se vuelven desfavorables y se forman bdelloplastos para poder sobrevivir y resistir al contaminante (Markelova and Gariev, 2005). Algunos de los contaminantes por los que se ve afectado son altas concentraciones de cadmio (Markelova and Gariev, 2005), además del fenol y la urea, que son compuestos muy comunes en las aguas residuales, también son sensibles a docecilsulfato de sodio (SDS) que es un compuesto que aparece en detergentes (Bratanis et al., 2020). En la mayoría de plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas, se adopta una tecnología de lodos activados como paso de tratamiento secundario en el que se produce la 30 Stolp, H. and Starr, M.P. (1963). Bdellovibrio bacteriovorus gen. et sp. n., a predatory, ectoparasitic, and bacteriolytic microorganism. Antonie van Leeuwenhoek, 29(1), 217–248. Disponible en: doi: 10.1007/BF02046064. Tamer, I.M., Moo-Young, M. and Chisti, Y. (1998). 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