Uso de bioestimulantes obtenidos a partir de okara en la biorremediación de suelos contaminados por herbicidas. Efecto en propiedades biológicas del suelo

USO DE BIOESTIMULANTES OBTENIDOS A PARTIR DE OKARA EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HERBICIDAS EFECTO EN PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL SUELO MANUELORTIZ BOTELLA SEVILLA, 2019 DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFÍA, MINERALOGÍA Y QUÍMICA AGRÍCOLA i 2019 Uso de bioestimulantes obtenidos a partir de okara en la biorremediación de suelos contaminados por herbicidas Efecto en propiedades biológicas del suelo MANUEL ORTIZ BOTELLA Memoria que presenta Manuel Ortiz Botella para optar al título de doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2019 ii iii USO DE BIOESTIMULANTES OBTENIDOS A PARTIR DE OKARA EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR HERBICIDAS. EFECTO EN PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL SUELO. SEVILLA, 2019 LOS DIRECTORES Dr. Manuel Tejada Moral Dr. Isidoro A. Gómez Parrales Profesor Titular de la Universidad de Sevilla Profesor Titular de la Universidad de Sevilla iv v ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola DRA. ROSARIO VAZ PARDAL, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFÍA, MINERALOGÍA Y QUÍMICA AGRÍCOLA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Certifica: Que la presente Memoria de Investigación, con título “Uso de bioestimulantes obtenidos a partir de okara en la biorremediación de suelos contaminados por herbicidas. Efecto en propiedades biológicas del suelo”, presentada por D. Manuel Ortiz Botella para optar al título de Doctor, ha sido realizada en el marco del Programa de Doctorado en Recursos Naturales y Medioambiente del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola, bajo la supervisión de Isidoro Á. Gómez Parrales y Manuel Tejada Moral. Firmado: Dra. Rosario Vaz Pardal Sevilla, 2019 vi xiii ÍNDICE xiv 1. INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................................1 1.1. Plaguicidas ................................................................................................................... 2 1.1.1. Concepto ................................................................................................................ 2 1.1.2. Dinámica de plaguicidas en el suelo........................................................................ 2 1.2.2. Procesos de transformación ..................................................................................10 1.1.3. Problemática de los plaguicidas en el medioambiente ...........................................12 1.2. Uso de la materia orgánica en la biorremediación de suelos contaminados por plaguicidas .........................................................................................................................15 1.2.1. Biosólidos..............................................................................................................16 1.2.2. Estiércol ................................................................................................................17 1.2.3. Compost ................................................................................................................17 1.2.4. Restos de origen vegetal ........................................................................................19 1.2.5. Biorremediación con productos orgánicos hidrolizados ........................................22 1.3. Índices de calidad del suelo .........................................................................................23 1.3.1. Concepto ...............................................................................................................23 1.3.2. Indicadores biológicos de la calidad del suelo........................................................27 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................... 31 3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................................................... 33 3.1. Características del suelo, la okara y los herbicidas .......................................................34 3.1.1. Características del suelo ........................................................................................34 3.1.2. Características de la okara .....................................................................................35 3.1.3. Herbicidas empleados ...........................................................................................35 3.2. Proceso de hidrólisis enzimática para la obtención de los bioestimulantes ..................41 3.3. Diseño experimental ....................................................................................................44 3.3.1. Primera experiencia de incubación........................................................................45 3.3.2. Segunda experiencia de incubación .......................................................................47 3.3.3. Tercera experiencia de incubación ........................................................................48 3.4. Determinaciones analíticas ..........................................................................................49 3.4.1. Determinaciones analíticas en suelo ......................................................................49 3.4.2. Caracterización de los hidrolizados .......................................................................62 3.5. Análisis estadístico ......................................................................................................63 4. RESULTADOS .......................................................................................................................................................... 65 4.1. Obtención de los bioestimulantes a partir de okara .....................................................66 4.2. Tratamiento estadístico de los datos de actividades enzimáticas .................................67 4.2.1. Actividad deshidrogenasa......................................................................................67 xv 4.2.2. Actividad fosfatasa ................................................................................................72 4.2.3. Actividad glucosidasa ............................................................................................76 4.2.4. Actividad ureasa ....................................................................................................83 4.3. Tratamiento estadístico de los datos de concentración de herbicidas ..........................87 4.4. Primera experiencia de incubación ..............................................................................92 4.5. Segunda experiencia de incubación .............................................................................98 4.6. Tercera experiencia de incubación ............................................................................ 105 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................................................ 111 5.1. Obtención de los nuevos bioestimulantes .................................................................. 112 5.2. Efecto de los bioestimulantes sobre las propiedades biológicas del suelo. ................. 113 5.3. Efecto de los herbicidas sobre las propiedades biológicas del suelo. .......................... 117 5.4. Oxifluorfén................................................................................................................. 119 5.4.1. Efecto del oxifluorfén sobre las propiedades biológicas del suelo ........................ 119 5.4.2. Capacidad biorremediadora de los bioestimulantes ............................................ 123 5.5. Imazamox .................................................................................................................. 127 5.5.1. Efecto del imazamox sobre las propiedades biológicas del suelo ......................... 127 5.5.2. Capacidad biorremediadora de los bioestimulantes ............................................ 130 5.5.3. Evolución del imazamox en suelo ........................................................................ 134 5.6. Diurón ....................................................................................................................... 138 5.6.1. Efecto del diurón sobre las propiedades biológicas del suelo............................... 138 5.6.2. Capacidad biorremediadora de los bioestimulantes ............................................ 141 5.6.3. Evolución del diurón del suelo............................................................................. 144 6. CONCLUSIONES................................................................................................................................................... 145 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................................... 148 xvi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Destino de los pesticidas en suelo. ............................................................................................ 3 Figura 2: Tipos de isotermas de adsorción................................................................................................ 6 Figura 3: Estructura del herbicida oxifluorfén. .................................................................................... 36 Figura 4: Estructura del herbicida imazamox....................................................................................... 38 Figura 5: Estructura del herbicida diurón............................................................................................... 40 Figura 6: Obtención del bioestimulante OB. .......................................................................................... 42 Figura 7: Obtención del bioestimulante OF. ........................................................................................... 44 Figura 8: Gráfico de perfiles para la actividad deshidrogenasa. ................................................ 69 Figura 9: Gráfico de perfiles para la actividad deshidrogenasa en el suelo control y en suelos contaminados con los tres herbicidas. ....................................................................................... 70 Figura 10: Gráfico de perfiles para la actividad deshidrogenasa en suelos contaminados y no contaminados tratados............................................................................................................................. 71 Figura 11: Gráfico de perfiles para la actividad fosfatasa.............................................................. 73 Figura 12: Gráfico de perfiles para la actividad fosfatasa en el suelo control y en los suelos contaminados con los tres herbicidas. ....................................................................................... 74 Figura 13: Gráfico de perfiles para la actividad fosfatasa en suelos contaminados y no contaminados tratados con bioestimulantes. ....................................................................................... 75 Figura 14: Gráfico de perfiles para la actividad glucosidasa........................................................ 77 Figura 15: Gráfico de perfiles para la actividad glucosidasa en el suelo control y en los suelos contaminados con los tres herbicidas. ....................................................................................... 78 Figura 16: Gráfico de perfiles para la actividad glucosidasa en suelos contaminados y no contaminados tratados con bioestimulantes. ................................................................................ 80 Figura 17: Gráfico de perfiles para la actividad glucosidasa en suelos contaminados y tratados con bioestimulantes.......................................................................................................................... 82 Figura 18: Gráfico de perfiles para la actividad ureasa................................................................... 84 Figura 19: Gráfico de perfiles para la actividad ureasa en el suelo control y en suelos contaminados con oxifluorfén y diurón y tratados con bioestimulantes. ........................... 85 Figura 20: Gráfico de perfiles para la actividad ureasa en el suelo con imazamox y tratados con bioestimulantes.......................................................................................................................... 86 Figura 21: Gráfico de perfiles para la evolución de oxifluorfén en suelos enmendados y sin enmendar............................................................................................................................................................. 89 xvii Figura 22: Gráfico de perfiles para la evolución de imazamox en suelos enmendados y sin enmendar............................................................................................................................................................. 90 Figura 23: Gráfico de perfiles para la evolución de diurón en suelos enmendados y sin enmendar..................................................................................................................................................................... 91 Figura 24: Evolución del contenido en oxifluorfén en suelos no enmendados y enmendados con los dos bioestimulantes experimentales. ......................................................... 97 Figura 25: Evolución del contenido en imazamox en suelos no enmendados y enmendados con los dos bioestimulantes experimentales. ...................................................... 103 Figura 26: Evolución del contenido en diurón en suelos no enmendados y enmendados con los dos bioestimulantes experimentales...................................................................................... 109 xviii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: valores nutricionales de la okara por 100 g de producto húmedo....................... 21 Tabla 2: Indicadores físicos, químicos y biológicos de la calidad del suelo........................ 26 Tabla 3: Funciones de algunas actividades enzimáticas del suelo. .......................................... 29 Tabla 4: Características físico-químicas del suelo experimental. ............................................. 34 Tabla 5: Composición química y distribución del peso molecular de la proteína (Da) en el okara utilizado en la fabricación de bioestimulantes. ................................................................ 35 Tabla 6: Tiempos de retención de la columna empleada en la cromatografía de exclusión y tamaños moleculares correspondientes........................................................................ 63 Tabla 7: Características químicas y distribución del peso molecular de las proteínas de los bioestimulantes obtenidos a partir de okara................................................................................. 66 Tabla 8: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad deshidrogenasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar........................................................................ 69 Tabla 9: ANOVA de medidas repetidas para la actividad deshidrogenasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar........................................................................ 69 Tabla 10: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad deshidrogenasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................... 72 Tabla 11: ANOVA de medidas repetidas para la actividad deshidrogenasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................................... 72 Tabla 12: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad fosfatasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar. ........................................................................................ 74 Tabla 13: ANOVA de medidas repetidas para la actividad fosfatasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar. ............................................................................................ 74 Tabla 14: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad fosfatasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................................... 76 Tabla 15: MANOVA de medidas repetidas para la actividad fosfatasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................................... 76 Tabla 16: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad glucosidasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar........................................................................ 78 Tabla 17: MANOVA de medidas repetidas para la actividad glucosidasa del suelo control y de los suelos contaminados sin enmendar........................................................................ 79 xix Tabla 18: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad glucosidasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................................... 80 Tabla 19: MANOVA de medidas repetidas para la actividad glucosidasa en los suelos contaminados y sin contaminar, enmendados con bioestimulantes. ..................................... 81 Tabla 20: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad glucosidasa en los suelos contaminados y tratados con bioestimulantes..................................................................................... 82 Tabla 21: MANOVA de medidas repetidas para la actividad glucosidasa en los suelos contaminados y tratados con bioestimulantes..................................................................................... 83 Tabla 22: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad ureasa en los suelos sin contaminar y contaminados con oxifluorfén y diurón y enmendados con bioestimulantes. ...................................................................................................................................................... 85 Tabla 23: ANOVA de medidas repetidas para la actividad ureasa en los suelos sin contaminar y contaminados con oxifluorfén y diurón y enmendados con bioestimulantes. ...................................................................................................................................................... 85 Tabla 24: Prueba de esfericidad de Mauchly para la actividad ureasa en los suelos contaminados con imazamox y enmendados con bioestimulantes. ....................................... 86 Tabla 25: ANOVA de medidas repetidas para la actividad ureasa en los suelos contaminados con imazamox y enmendados con bioestimulantes. ....................................... 87 Tabla 26: Prueba de esfericidad de Mauchly para la degradación de oxifluorfén en suelos. ............................................................................................................................................................................ 89 Tabla 27: ANOVA de medidas repetidas para la degradación de oxifluorfén en suelos. ............................................................................................................................................................................................ 89 Tabla 28: Prueba de esfericidad de Mauchly para la degradación de imazamox en suelos. ............................................................................................................................................................................ 90 Tabla 29: ANOVA de medidas repetidas para la degradación de imazamox en suelos. ............................................................................................................................................................................................ 90 Tabla 30: Prueba de esfericidad de Mauchly para la degradación de diurón en suelos. ............................................................................................................................................................................................ 91 Tabla 31: ANOVA de medidas repetidas para la degradación de diurón en suelos....... 91 Tabla 32: Evolución de las actividades deshidrogenasa y ureasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con oxifluorfén. ........................ 93 Tabla 33: Evolución de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con oxifluorfén. ........................ 96 xx Tabla 34: Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) para los tratamientos experimentales a los 10 y 90 días de incubación. ............... 98 Tabla 35: Evolución de las actividades deshidrogenasa y ureasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con imazamox............................. 100 Tabla 36: Evolución de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con imazamox............................. 101 Tabla 37: Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) para los tratamientos experimentales a los 10 y 90 días de incubación. ............ 104 Tabla 38: Evolución de las actividades deshidrogenasa y ureasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con diurón. .................................... 107 Tabla 39: Evolución de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con diurón. .................................... 108 Tabla 40: Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) para los tratamientos experimentales a los 10 y 90 días de incubación. ............ 110 1 1. INTRODUCCIÓN 2 1.1. PLAGUICIDAS 1.1.1. CONCEPTO De acuerdo con la FAO (2014), los plaguicidas pueden definirse como cualquier sustancia o mezcla de sustancias, de origen químico o biológico, cuyo propósito sea repeler, destruir o controlar cualquier plaga, o regular el crecimiento de una planta. Como consecuencia de ello, pueden contribuir tanto a la rentabilidad de un cultivo, ya que permite un aumento en la producción agrícola, como a la protección de los alimentos durante su producción y almacenamiento. En la actualidad, los plaguicidas no solo se usan en agricultura, también son de gran importancia en silvicultura, producción ganadera y acuicultura en el control de plagas y las enfermedades que estas puedan transmitir. Esto hace pensar que a pesar de las nuevas tendencias agrícolas que se están imponiendo desde hace algunos años, como por ejemplo la agricultura ecológica, el uso de tales plaguicidas en muchas superficies agrícolas tiene todavía un importante peso específico (Calderón, 2017). Debido a este aumento en el uso de insecticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas, etc., se hace necesario entender sus ciclos en el medioambiente, especialmente en el suelo, así como los efectos que pueden tener sobre la salud humana y sobre el equilibrio de los ecosistemas (Burrows et al., 2002). 1.1.2. DINÁMICA DE PLAGUICIDAS EN EL SUELO Es imprescindible conocer los distintos tipos de procesos que puede sufrir un plaguicida tras su adición a un suelo puesto que estos son los que determinarán su potencial contaminante, su persistencia a largo plazo o su transporte a otros lugares. La Figura 1 muestra un esquema de los principales procesos a los que se ve sometido un plaguicida en suelo. Dentro de estos procesos, hay que destacar: 1. Procesos de transferencia o transporte. 2. Procesos de transformación. 9 V. LIXIVIACIÓN La lixiviación es el proceso mediante el cual el agua de lluvia o riego disuelve y/o arrastra moléculas presentes en el suelo, originando un movimiento vertical y a favor de la gravedad en el perfil del suelo. El arrastre de plaguicidas puede provocar pérdidas, contaminación de lugares cercanos, contaminación de acuíferos, etc. Aunque está muy ligada al fenómeno de difusión, la difusión solo tiene un alcance de unos pocos centímetros dentro del suelo (Hartley, 1960). Numerosos factores influyen en el lixiviado de plaguicidas. • Propiedades del plaguicida: Características como su estructura, capacidad para protonarse y desprotonarse, hidrofobicidad, solubilidad en agua o presión de vapor afectarán a la retención del plaguicida por parte de los coloides del suelo (Calderón, 2017). • Adsorción por los coloides del suelo: los minerales de la arcilla y la materia orgánica son los principales responsables de retener a los plaguicidas en el suelo. La materia orgánica tiene mayor influencia en la retención de la mayoría de compuestos que las arcillas (Helling et al., 1971). • Textura y estructura del suelo: relacionado con el punto anterior, suelos con textura más gruesa tienen mayor capacidad para evitar el lixiviado de plaguicidas al tener, habitualmente, mayor contenido en materia orgánica o arcillas y una mayor capacidad de campo (Helling et al., 1971). Por otro lado, suelos formados por agregados mayores, con sistemas de poros donde predominen los macroporos, tienen mayor capacidad para el transporte de plaguicidas a mayores profundidades (Flury, 1996). • Aporte de agua y presencia de agua inicial: La retención de plaguicidas en el suelo aumenta con el tiempo. Así, como se ha comentado antes, el aporte de agua (de lluvia o por riego) poco después de la aplicación de un plaguicida también aumenta el lixiviado de los mismos. • Prácticas culturales. El tipo de laboreo que se establezca en un determinado cultivo puede influir notablemente en la lixiviación de plaguicidas, principalmente cuando se trate de un sistema como el laboreo tradicional (Calderón, 2017). Al realizar labores profundas donde se destruye la estructura del suelo, se originan grietas que hacen que los plaguicidas se pierdan con mayor facilidad. La aplicación de materia orgánica al suelo hace disminuir los 10 procesos de lixiviación al ser retenidos por procesos de adsorción (Cox et al., 2007). VI. VOLATILIZACIÓN La volatilización puede definirse como el paso de un herbicida de estado sólido o líquido a gas y su transporte por la atmósfera. Suele ocurrir tras las primeras horas de aplicación y en dos fases; primero tiene lugar el paso a fase gaseosa y después, la dispersión por difusión y turbulencia que lo mezcla con la atmósfera. Los factores que más afectan a la volatilización son las características físicoquímicas del compuesto, las condiciones climáticas (temperatura, humedad del suelo, tipo de cultivo, incidencia de la luz solar, turbulencia del aire, etc.), así como las prácticas que se lleven a cabo en el cultivo (Bedos et al., 2002). VII. DIFUSIÓN Es el proceso por el cual un compuesto se mueve en el suelo dentro de la misma fase (sólida, líquida o gaseosa). Puede estar afectada por las características moleculares del herbicida, la adsorción, el contenido en humedad y el tiempo. La humedad tiende a aumentar la difusión de determinados plaguicidas, pero para otros, como es el caso del herbicida trifluralina, puede disminuirlo, pues este tiene mayor tendencia a moverse en la fase gaseosa (Giles et al., 1960). De entre estos factores, la solubilidad y la presión de vapor del plaguicida son los más importantes (Helling et al., 1971). 1.2.2. PROCESOS DE TRANSFORMACIÓN Los procesos de transformación son aquellos en los que el compuesto original se transforma o degrada, dando lugar a compuestos con una estructura distinta a la del original. La toxicidad del herbicida puede aumentar, disminuir o desaparecer por completo. Los más importantes son la degradación química, biológica y la fotodegradación. I. DEGRADACIÓN QUÍMICA Entre las reacciones químicas que pueden degradar plaguicidas podemos distinguir aquellas catalizas por el suelo y aquellas que no lo son. Las reacciones químicas más 11 comunes que suelen ocurrir en el suelo son la hidrólisis, la oxidación y la isomerización (Helling et al., 1971). Las reacciones catalizadas por el suelo suelen estar relacionadas con los minerales de la arcilla y, en concreto, con su naturaleza acídica. Aunque estas reacciones suelen estar investigadas solo en condiciones que no suelen darse en el suelo (a elevadas temperaturas y en disolventes no acuosos) sirven como guía de los efectos que pueden tener en los distintos plaguicidas en suelo. II. DEGRADACIÓN BIOLÓGICA La degradación biológica es la que se da gracias a los organismos vivos del suelo, principalmente bacterias y hongos. Está afectada por la actividad y distribución de los mismos, y por las condiciones ambientales (temperatura y contenido en humedad). Pueden degradar el plaguicida total o parcialmente. Si es total, se originará CO2, H2O y CH4. Si es parcial pueden originar metabolitos que pueden presentar una toxicidad igual, menor o superior al compuesto de partida (Calderón, 2017). III. FOTODEGRADACIÓN La fotodegradación es un proceso abiótico de transformación en el que la excitación electrónica por absorción de luz origina reacciones orgánicas. En dichas reacciones se generan especies reactivas de oxígeno, como OH*, O3 y 1O2, que oxidan los grupos funcionales del plaguicida. Es difícil hacer generalizaciones debido a la diversidad de plaguicidas que existen y se comercializan, así como a la variedad de condiciones meteorológicas y ambientales que pueden influir (Katagi, 2004). Los factores que afectan a la fotodegradación de los plaguicidas son el tiempo de exposición, el pH del suelo, la porosidad, el estado del plaguicida y su modo de aplicación, el grado de adsorción del mismo y la presencia de otras especies catalíticas en el medio. Debido a que es un proceso dependiente de la incidencia de la luz directa, solo afecta a los plaguicidas presentes en superficie. La presencia en suelo de materia orgánica facilita la fotólisis de los plaguicidas, acelerando este proceso (Konstantinou et al., 2001). 12 1.1.3. PROBLEMÁTICA DE LOS PLAGUICIDAS EN EL MEDIOAMBIENTE Actualmente, está demostrado que la aplicación de plaguicidas puede causar importantes problemas a la salud humana, así como en el equilibrio de los ecosistemas. Desde el punto de vista de la salud humana, se tiene constancia que los plaguicidas pueden ser la causa de importantes efectos tóxicos tales como envenenamiento (Richter, 2002; Pimentel y Burgess, 2005), cáncer, destacando cáncer de labio, enfermedad de Hodgkin, melanoma maligno, mieloma múltiple, cáncer de estómago, de próstata, de mama, de cerebro y leucemia (Blairet al., 1992; Meyer et al., 2003; Engel, 2005; Miranda-Filho et al., 2012) y diversos efectos neurotóxicos como cefaleas mareos, náuseas, mareos y vómitos (Alavanja et al., 2004). Todos estos efectos nocivos llevados a cabo por los plaguicidas descritos para la salud humana son consecuencia del contacto de dichos compuestos químicos con los humanos. Son varios los mecanismos por los que los humanos podemos entrar en contacto directo con dichos plaguicidas: a) Consumo directo en alimentos al no respetar el denominado límite máximo de residuos en alimentos. Este parámetro, que generalmente se determina en el momento de la recolección, nos indica la máxima cantidad de un plaguicida que puede admitirse en cualquier alimento (animal o vegetal) e incluso bebidas (alcohólicas o no alcohólicas) y el periodo de seguridad en los alimentos. Cualquier acción que implique no respetar este límite de residuos puede suponer la ingesta de alimentos contaminados por plaguicidas que pueden causar los efectos nocivos anteriormente descritos. b) Debido a la contaminación de aguas subterráneas riego plantas. Los productos fitosanitarios liberados al medio ambiente de forma incontrolada pueden llegar a causar problemas muy severos de contaminación de aguas subterráneas y cauces fluviales por fenómenos de lixiviación o de escorrentía. El reciente informe fruto de la colaboración de Ecologistas en Acción y Pesticide Action Network Europe refleja la detección de hasta 47 plaguicidas distintos en las aguas españolas, de los cuales 21 son insecticidas, 19 son herbicidas y 5 son fungicidas. El informe alerta de que muchos de estos plaguicidas son compuestos químicos prohibidos en la Unión Europea, pero con alto poder de persistencia, como el DDT, la atrazina o el endosulfán. Además, alerta de que 26 de los plaguicidas encontrados son 13 disruptores endocrinos o hay indicios para pensar que pueden serlo (Balaguer et al., 2018). Ecologistas en Acción advierte, sin embargo, que el informe resulta incompleto debido el limitado número de estaciones de control y a que estas no examinan todos los plaguicidas activos que se comercializan (aproximadamente 400, según el Registro de Productos Fitosanitarios). Las cuencas hidrográficas más contaminadas son, como cabría esperar, las que están presentes en zonas con mayor agricultura intensiva, como la del Júcar o la del Ebro (Balaguer et al., 2018). Es desconocido el efecto concreto que estas mezclas de plaguicidas pueden tener en conjunto, pero está comprobado que la exposición simultánea a diversos plaguicidas disruptores endocrinos puede tener un efecto tóxico acumulativo o incluso sinérgico (Hass et al., 2012). La diversidad y cantidad de sustancias químicas, así como el elevado número de combinaciones posibles de estas, hace urgente una evaluación del riesgo que puede suponer la exposición a las mezclas más probables. En este aspecto relacionado con la contaminación de ríos, es necesario también destacar que los plaguicidas transportados en ríos tienen su camino final hacia mares y océanos, pudiendo pasar a los distintos organismos que habitan en dicho ecosistema, provocando toxicidad en los mismos. Cuando una persona se alimenta de ellos, dichos plaguicidas pueden también actuar ejerciendo los diferentes efectos tóxicos descritos con anterioridad. Por otro lado, la presencia de plaguicidas en el medioambiente y en sistemas agrícolas puede llevar al envenenamiento de animales domésticos y silvestres. Respecto a los domésticos, perros y gatos son los animales más afectados, debido a que suelen tenerse en el entorno agrícola (como defensa, control de otros animales de menor tamaño o como compañía) y a que suelen moverse sin supervisión humana. En cuanto a animales domésticos de consumo, a las pérdidas por envenenamiento se añaden las pérdidas económicas que genera la contaminación de carne, leche y huevos por presencia de plaguicidas. Una estimación de las pérdidas económicas y en número de animales puede encontrarse en Pimentel y Burgess (2005). En la naturaleza, el envenenamiento de animales silvestres puede darse de forma directa o de forma indirecta. Dentro de la forma directa puede encontrarse el consumo accidental por parte de los animales o el envenenamiento deliberado e ilegal 14 (Berny, 2007). Este último suele ser debido a competencia de los depredadores naturales con las costumbres de los habitantes locales, ganaderos o cazadores. Como se ha mencionado antes, la presencia de plaguicidas en el medio, no solo el consumo directo o indirecto, pueden llevar a problemas en la salud de la fauna. La ocurrencia de cáncer es escasa, pero otros efectos más comunes son la disrupción endocrina, la disminución de la fertilidad, alteraciones etológicas e inmunotoxicidad. En aves, por ejemplo, puede darse una reducción de la producción de huevos y la alteración del tiempo dedicado a la búsqueda de alimento (Berny, 2007). Los herbicidas, en concreto, tienen baja toxicidad en vertebrados pues su mecanismo de acción se encuentra relacionado con el metabolismo de las plantas. La mayoría de los compuestos, además, tienen baja afinidad por lípidos y son muy solubles en agua. Los herbicidas responsables (o sospechosos de serlo) de envenenamiento de vertebrados suelen ser herbicidas antiguos, ahora prohibidos (Freemark, 1995). Los insecticidas aplicados para el control de artrópodos con carácter de plaga en determinados cultivos pueden también actuar sobre artrópodos beneficiosos, entre los que podemos encontrar depredadores naturales, parásitos, parasitoides y otros insectos beneficiosos para la especie humana, como polinizadores. Insectos y artrópodos evolutivamente cercanos representan un 90% de las especies de animales y plantas globales y su pérdida, en cantidad y diversidad, puede conllevar un grave peligro para los ecosistemas de los que forman parte (Pimentel, 1994). Los insectos polinizadores son otros de los grandes afectados por el uso y abuso de plaguicidas, en especial de insecticidas. Otras de las causas para la disminución de número y diversidad de polinizadores, en especial de ápidos, son los cambios en el uso del suelo y la introducción de especies alóctonas. La transformación de una agricultura tradicional a una intensiva, normalmente con una única especie (monocultivo), no solo favorece la pérdida y fragmentación del hábitat, sino que aumenta la cantidad de herbicidas e insecticidas utilizados. Esto disminuye directamente las poblaciones de polinizadores por envenenamiento y por pérdida de recursos (Klein et al., 2007; Ricketts et al., 2008; Aizen et al., 2009; Winfree et al., 2009) . Además, la tendencia es al aumento de la demanda de polinizadores, sobre todo en el caso de países en vías de desarrollo, que pueden sufrir un cambio de cultivos no dependientes de polinizadores hacia otros que sí lo son (Aizen et al., 2009). 15 Por otra parte, la preocupación por el efecto que puedan tener plaguicidas y otros compuestos xenobióticos en la microbiota del suelo es creciente, debido a que estos pueden influir directamente en la productividad de los cultivos, sostenibilidad del suelo y calidad medioambiental. La estructura, diversidad y actividad metabólica son factores cruciales a la hora de evaluar dichos efectos (Topp, 2003; Imfeld y Vuilleumier, 2012). En este sentido, diversos estudios han puesto de manifiesto el efecto tóxico que ejercen diferentes plaguicidas sobre la actividad bioquímica de los microorganismos del suelo, así como su diversidad en dicho ecosistema. Así, Franco-Andreu et al. (2016) observaron tras la aplicación del herbicida oxifluorfén al suelo a la dosis recomendada por el fabricante (2 L ha-1) una disminución significativa de diferentes actividades enzimáticas del suelo (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa) durante los primeros 100 días después de su aplicación. Tras este tiempo y después de ser degradado dicho herbicida, dichas actividades enzimáticas comenzaron a aumentar, indicando en consecuencia el efecto tóxico de dicho herbicida sobre los microorganismos del suelo. Estudios llevados a cabo Tejada et al., (2017) demostraron que tras la aplicación del herbicida diurón al suelo a dosis de 2 Kg ha-1, se produjo una disminución significativa de las actividades enzimáticas deshidrogenasa y β-glucosidasa. Del mismo modo, la aplicación del insecticida clorpirifós al suelo a dosis de 5 L ha-1 causó una disminución comprendida entre 55% y 58% de las actividades enzimáticas deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa, así como una disminución en la población de bacterias Gram+, Gram- y fúngica del suelo (Tejada et al., 2014; Orts et al., 2017). 1.2. USO DE LA MATERIA ORGÁNICA EN LA BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR PLAGUICIDAS El concepto de remediación, hace referencia a la aplicación de estrategias físicoquímicas y biológicas para evitar el daño y la contaminación de los suelos. En la actualidad, un gran número de contaminantes como hidrocarburos aromáticos policíclicos, petróleo y derivados, herbicidas, clorofenoles y metales pesados son incorporados al suelo como resultado de la actividad industrial y agrícola, ocasionando graves problemas de contaminación que afectan a su funcionalidad y a la 16 salud medioambiental. Como consecuencia de ello, se suelen emplear diversas técnicas de remediación con el objeto de disminuir o eliminar dicha toxicidad causada por tales contaminantes. Dentro de las distintas técnicas de remediación hay que destacar técnicas físicas, químicas y biológicas. Las técnicas de remediación químicas o físicas suelen tener costes muy elevados o no ser del todo efectivas, a diferencia de las técnicas biológicas que son más efectivas y menos costosas (M. Chen et al., 2015). Las técnicas de remediación biológicas, también conocidas como biorremediación, consisten en utilizar las habilidades metabólicas y el potencial de los microorganismos para la degradación de los contaminantes citados en diversos medios, como el suelo o medios acuáticos. La biorremediación, además, ha de llevarse a cabo en medio abierto, y no estéril, que contenga una gran variedad de microorganismos. De estos, las bacterias suelen tener un papel crucial; otros organismos, como hongos y protozoos también pueden afectar al proceso (Watanabe, 2001). Dentro de las diferentes técnicas de biorremediación, una de las más usadas debido principalmente a su alta eficacia y bajo coste económico es el empleo de distintas fuentes de materia orgánica. Con la aplicación de dicha materia orgánica, se pretende estimular a la población microbiana tolerante, acelerando de esta forma la degradación de los diferentes compuestos tóxicos orgánicos (Tejada et al., 2010a; Gómez et al., 2014). Por otra parte, es también importante considerar la capacidad de adsorción de las sustancias húmicas sobre dichos compuestos tóxicos, provocando una disminución en la concentración de los mismos en la solución del suelo, y en consecuencia, una disminución de los efectos tóxicos de dichos contaminantes (Dolaptsoglou et al., 2007; Delgado-Moreno y Peña, 2009; Tejada et al., 2011b). A continuación, dentro de las distintas fuentes de materia orgánica usadas en procesos de biorremediación de suelos contaminados por plaguicidas, se hará un breve repaso por las más comúnmente utilizadas. 1.2.1. BIOSÓLIDOS Los biosólidos, también conocidos como lodos de depuradora estabilizados, son subproductos de aguas municipales y restos del sistema de aguas residuales. Estos 17 residuos son sometidos a tratamientos para eliminar la mayor cantidad de agua posible, así como a diversos tratamientos de digestión aeróbica o anaeróbica. Esto los lleva a tener un contenido final de materia orgánica de entre un 50% y un 60%. Son también una fuente de nitrógeno, fósforo y, en menor medida, potasio. Sin embargo, los biosólidos también pueden tener un alto contenido en sustancias peligrosas como metales pesados, compuestos orgánicos de baja biodegradabilidad y organismos patógenos como virus y bacterias, limitando su uso potencial en agricultura (Cartagena, 2005). Durante muchos años ha habido un amplio debate sobre la efectividad o no de dichos residuos orgánicos en la degradación de plaguicidas en suelo. En este sentido, algunos autores como Perrin-Ganier et al. (2001), no encontraron efecto en la degradación del herbicida isoproturón. Contenidos elevados de metales pesados pueden modificar la tasa de degradación de plaguicidas, complicando todavía más la aplicación de biosólidos como agente bioestimulante. 1.2.2. ESTIÉRCOL El estiércol como enmienda orgánica ha demostrado ser capaz de contribuir a la degradación de atrazina y metolacloro cuando es añadido en concentraciones de 0.5% y 5% (p/p) respectivamente (Moorman et al., 2001). Doyle et al. (1978) documentan un incremento de la degradación de plaguicidas metabolizados por reacciones de desalcalinización (fenilureas, s-triazinas, etc.) con la adición de estiércol de vaca. También se cita la degradación de plaguicidas como el fonofós, terbufós y forato (Somasundaram et al., 1987), así como el de la permetrina (Doyle et al., 1981), el carbofurano (Koeppel y Lichtenstein, 1984) y el metil isotiocianato (Dungan y Yates, 2003). Otros tipos de estiércol, como por ejemplo el de oveja, han ocasionado resultados muy positivos en la disminución de oxifluorfén en la solución del suelo debido tanto a su capacidad bioestimulante como su capacidad de adsorción (Gómez et al., 2014). 1.2.3. COMPOST La adición de compost como enmienda orgánica puede aumentar la fertilidad del suelo y el contenido de materia orgánica, además de tener efectos biorremediativos. El 18 compostaje es una de las soluciones más económicamente efectivas para la biorremediación del suelo (Chen et al., 2015). Barriuso et al., (1997) emplearon compost procedente de sólidos de aguas municipales y diversos herbicidas con el fin de caracterizar la sorción, mineralización y extractabilidad de los residuos. Los herbicidas utilizados fueron: atrazina, simazina, terbutrina, pendimetalina, carbetamida, 2,4-D, metsulfurón metil y dimefurón. La adición de compost generalmente provocó una disminución de la mineralización al favorecer la estabilización de los residuos de herbicida. De acuerdo a estos autores, el aumento del contenido en materia orgánica derivado del compost puede ser responsable en parte de la estabilización de los residuos de herbicida, al menos en el caso de los que presentaron una alta sorción. Sin embargo, es imposible separar el efecto del aumento de la materia orgánica de la mayor actividad de los microorganismos tras la adición de compost. Esta tuvo escaso efecto sobre los herbicidas menos sorbidos (carbetamida, 2,4-D, metsulfurón metil y dimefurón). En el trabajo de Said-Pullicino et al., (2004) se añadió compost de residuos sólidos urbanos con el objetivo de estudiar el efecto sobre las interacciones entre el suelo y el herbicida triasulfurón. Este herbicida es una sulfonilurea utilizado en el tratamiento de gramíneas en postemergencia. En general, la adición de compost aumentó la adsorción del herbicida por el aumento del contenido en materia orgánica. Asimismo, se aumentó también la hidrólisis del herbicida, al menos en las primeras fases del experimento, donde dominaba la biodegradación sobre la degradación química. También, Miller et al., (2004) observaron una disminución del contenido de PCP del 76% en suelos contaminados tratados con compost de residuos sólidos municipales. Estos autores sugieren que el compost empleado es una muy buena solución para la descontaminación de suelos, pero advierten de la dependencia del tratamiento del suelo en particular y de la necesidad de realizar estudios previos antes de emprender proyectos a gran escala. Del mismo modo, Gómez et al. (2014) encontraron un descenso importante de la toxicidad del herbicida oxifluorfén tras la aplicación de un compost de residuos sólidos urbanos. Por último, Delgado-Moreno y Peña (2009) observaron un descenso de la toxicidad de triazinas tras la adición de un compost obtenido a partir de residuos de la industria olivarera. 25 et al., 1997). Estos parámetros se conocen como indicadores de calidad del suelo y pueden ser físicos, químicos o biológicos. La tabla 2 muestra los distintos tipos de indicadores (físicos, químicos y biológicos) en el suelo, así como su relación con las funciones y condiciones del suelo. En esta tesis doctoral se han hecho uso/estudio solo de los indicadores de tipo biológico, los cuales serán los que se describan más detalladamente a continuación. 26 TABLA 2: INDICADORES FÍSICOS, QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS DE LA CALIDAD DEL SUELO. Indicadores Relación con las funciones y condiciones del suelo FÍSICOS Textura del suelo Retención y transporte de agua y minerales, erosión del suelo. Profundidad del suelo Estimación del potencial productivo y de erosión. Infiltración y densidad aparente Potencial de lavado; productividad y erosividad. Capacidad de retención de agua Relación con la retención de agua, transporte, y erosividad; humedad aprovechable, textura y materia orgánica. Estabilidad de los agregados Erosión potencial de un suelo. Infiltración de agua. QUÍMICOS Materia orgánica (C y N orgánico) Define la fertilidad del suelo; estabilidad; erosión. pH Define la actividad química y biológica, límites para el crecimiento de plantas y actividad biológica. Conductividad eléctrica Define la actividad vegetal y microbiana, límites para el crecimiento de plantas y actividad biológica. N, P y K extraíble Nutrientes disponibles para la planta, pérdida potencial de N; productividad e indicadores de la calidad ambiental. Capacidad de intercambio catiónico Fertilidad del suelo, potencial productivo. Metales pesados disponibles Niveles de toxicidad para el crecimiento de la planta y la calidad del cultivo. BIOLÓGICOS Biomasa microbiana (C y N) Potencial catalizador microbiano y reposición de C y N. N potencial mineralizable Productividad del suelo y aporte potencial de N. Respiración edáfica Medición de la actividad microbiana. Número de lombrices Relacionado con la actividad microbiana. Rendimiento del cultivo Producción potencial del cultivo. 27 1.3.2. INDICADORES BIOLÓGICOS DE LA CALIDAD DEL SUELO En los últimos años, el estudio y la investigación sobre la biología del suelo ha ido en aumento debido a la necesidad de conocer el papel fundamental que pueden ejercer los diversos organismos del suelo sobre las diferentes reacciones químicas que ocurren en dicho suelo. De acuerdo con Karlen et al., (1997), los indicadores biológicos incluyen una gran variabilidad de parámetros que van a incidir directamente, tanto sobre la calidad del suelo, como la abundancia y subproductos de micro y macroorganismos, incluidos bacterias, hongos, nematodos, lombrices, anélidos y artrópodos. Incluyen funciones como la tasa de respiración, actividades enzimáticas, ergosterol y otros subproductos de los hongos, tasas de descomposición de los residuos vegetales, N y C de la biomasa microbiana. Puesto que, en los últimos años, tanto el estudio de diversos parámetros bioquímicos, así como de la biodiversidad microbiana del suelo han tenido y aún sigue teniendo un gran peso específico sobre el estudio de la calidad del suelo, dentro de esta tesis doctoral se han estudiado ambos parámetros. Esto se debe principalmente a que estos parámetros biológicos, a diferencia de los físicos y químicos, responden mucho más rápido y a corto plazo tras la aplicación de cualquier producto al suelo o cualquier manejo al que se esté sometiendo dicho suelo (Andreoni et al., 2004; Zabaloy et al., 2008; Franco-Andreu et al., 2017). El hecho de que estos cambios ocurran mucho más rápidamente que los parámetros químicos y físicos se debe principalmente a que los microorganismos del suelo son muy sensibles a cualquier cambio, positivo o negativo. 1.3.2.1. ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS COMO INDICADORES DE LA CALIDAD DEL SUELO Las actividades de ciertas enzimas han sido utilizadas, en diversas combinaciones, para el desarrollo de índices de calidad bioquímica. Stefanic et al., (1984) propusieron el índice de actividad biológica, basado en una expresión que combina la actividad deshidrogenasa del suelo con la actividad catalasa. En el mismo año, Beck (1984) propuso el índice de número de enzimas, basado en la actividad de cinco enzimas diferentes. Por otro lado, Perucci, (1992) propone el coeficiente de hidrolizado, calculado a partir de la cantidad de acetato de fluoresceína hidrolizado por el suelo. Una de las ventajas de evaluar las distintas actividades enzimáticas en lugar de la 28 biomasa microbiana, es que estos métodos se centran en la fracción activa (Blagodatskaya y Kuzyakov, 2013). El uso de las actividades enzimáticas tiene su base teórica en que estas: - están estrechamente relacionadas con otros indicadores de la calidad del suelo como el contenido en materia orgánica, la biomasa, o la actividad microbiana. - responden más rápidamente a estímulos que otros factores. - pueden constituir un índice biológico e integrativo que informe sobre las prácticas llevadas a cabo sobre el suelo. - pueden ser relativamente fáciles de medir y, por tanto, tienen potencial para llevarse a cabo de forma rutinaria. La extracción de las enzimas del suelo es costosa y puede conllevar la desnaturalización de estas, así que son determinadas mediante la medida de la actividad enzimática en una serie de condiciones ideales (temperatura, pH y concentración de sustrato). Así, en realidad cuando se habla de actividad enzimática se mide la actividad enzimática potencial y no la actividad in situ. La actividad enzimática ha demostrado ser capaz de discernir entre diversas prácticas agrícolas, pero los resultados pueden variar en función de la actividad elegida y el suelo analizado. Determinar el objetivo a evaluar debe ser prioritario para elegir correctamente las actividades enzimáticas a analizar, así como los indicadores complementarios (Doran et al., 1996; Tabatabai, 2003). Según su función, las enzimas del suelo más estudiadas son las oxidorreductasas (en particular, deshidrogenasas y catalasas) y las hidrolasas, que son enzimas relacionadas con el ciclo del C, N, P y S, dentro de las cuales, destacamos β-glucosidasas, proteasas, ureasa, fosfatasas, y arilsulfatasas. En consecuencia, existe una fuerte correlación entre la actividad bioquímica de los microorganismos de un suelo con la calidad de dicho suelo. En la tabla 3 se muestran algunas de las actividades enzimáticas más estudiadas. 1.3.2.2. BIODIVERSIDAD MICROBIANA COMO INDICADOR DE LA CALIDAD DEL SUELO La biodiversidad de los microorganismos del suelo suele ser pasada por alto en beneficio de la de organismos de mayor tamaño, ignorando por completo su potencial como indicador de calidad. Evaluarla directamente, además, puede resultar difícil debido a impedimentos taxonómicos y metodológicos. Una alternativa es examinar los 29 componentes de la biodiversidad para detectar patrones biológicamente significativos, como la biodiversidad funcional (Zak et al., 1994). TABLA 3: FUNCIONES DE ALGUNAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DEL SUELO. Hidrolasas: - Invertasa: Sacarosa → glucosa + fructosa. - Celulasa: celulosa (cristalina) → celulosa (amorfa) → celobiosa. - β-Glucosidasa: celobiosa → glucosa + ROH. - Fosfomonoesterasa: Fósforo orgánico → Fósforo inorgánico. - Ureasa: Urea → CO2 + NH4+. - Proteasa: Proteínas y péptidos → NH4. - Arilsulfatasa: Azufre orgánico → Azufre inorgánico. Oxidoreductasas: - Deshidrogenasa: XH2 + A → X + AH2. - Fenol oxidasas: monofenol + ½ O2 → Quinona + H2O. - Lacasa: 4(difenol) + O2 → 4(quinona) + 2H2O. - Peroxidasa: donador e- + H2O2 → donador oxid. + H2O. - Catalasa: 2H2O2 → 2H2O + O2. La heterogeneidad y diversidad procariótica es difícil, si no imposible, de medir de forma directa. Suele ser expresada en función de diversidad de capacidades biológicas, no en diversidad de morfologías. Una aproximación para resolver este tema es estudiar la morfología de las colonias que muestras de suelo puedan formar en placas de un medio nutritivo. Sin embargo, esta metodología asume que los microorganismos formadores de colonias son representativos de la microbiota total del suelo y existe evidencia que apunta a lo contrario (Pillai et al., 1991; Doran et al., 1996; Torsvik et al., 2002). Por tanto, existen cada vez más alternativas bioquímicas para suplir estos defectos metodológicos. Uno de ellos es el análisis de fosfolípidos de membrana (PLFA). Esta metodología ha sido usada para estimar el tamaño de las poblaciones microbianas residentes en suelos desde la subsuperficie hasta profundidades de 200 cm. El método consiste en la extracción de los fosfolípidos de las membranas de los microorganismos usando disolventes orgánicos. Ya que no hay una fase de enriquecimiento, el análisis 30 de PLFA es un indicador directo de la estructura de las poblaciones microbianas. Este método tiene como ventaja que informa sobre el tamaño de la población, así como de la composición de la misma, ya que los PLFA extraídos pueden ser caracterizados en función de la cantidad y tipo (Findlay et al., 1989; Zelles et al., 1992; Doran et al., 1996). Además de estos métodos, existen otra serie de procedimientos de carácter molecular en continuo crecimiento y expansión. Algunos de ellos son la reasociación de ADN, la hibridación de ADN-ADN y mARN:ADN, amplificación y secuenciación de ADN, así como otros métodos basados también en el uso de la PCR, como electroforesis en gel desnaturalizante, por gradiente de temperatura, análisis de espaciadores intergénicos ribosomales (RISA) y análisis de espaciadores intergénicos ribosomales automático (ARISA) (Kirk et al., 2004). El problema de los métodos basados en PCR es que están sesgados, al estar limitados por el diseño previo de cebadores. Nuevos métodos independientes de secuencias conocidas ya han sido desarrollados y probados con éxito (Stokes et al., 2001). La metagenómica del suelo permite identificar y caracterizar los genes de una muestra e informa sobre las vías metabólicas activas, los elementos regulatorios, genes de patogénesis, de virulencia, etc. Los actuales retos de la genómica del suelo consisten en extraer información funcional de estos datos, es decir, saber qué vías y genes se están expresando y cuáles de estos son claves en los procesos biogeoquímicos, así como relacionar filogenia y función o, dicho de otro modo, adscribir funciones microbiológicas a microorganismos en concreto (Torsvik et al., 2002). Estudios metagenómicos han demostrado ser capaces de mostrar diferencias a nivel de comunidad, distinguiendo entre diversas prácticas agrícolas (Souza et al., 2013). 31 2. OBJETIVOS 32 En la última década, el diseño y desarrollo de nuevos bioestimulantes fabricados mediante procesos de hidrólisis enzimática de subproductos agroindustriales con fines biorremediadores de suelos contaminados por plaguicidas está alcanzando un gran interés dentro de la comunidad científica. En esta línea, la okara es un subproducto obtenido de la fabricación de leche de soja, tofu y derivados, rica en fibra dietética y proteínas, que contiene aminoácidos esenciales. Este alto contenido proteico lo hace un buen candidato para originar nuevos bioestimulantes que sean de utilidad en la recuperación de suelos contaminados por plaguicidas. En consecuencia, se pueden definir y establecer dos objetivos claramente diferenciados durante el desarrollo de este trabajo de tesis: Objetivo 1 Desarrollo de nuevos bioestimulantes a partir de okara mediante el uso de distintas enzimas. En este sentido, se diseñarán y crearán dos tipos de hidrolizados proteicos: 1. Hidrolizado proteico en el que se hace uso de una sola enzima. En este caso, se usará la endoproteasa subtilisina. 2. Hidrolizados proteico en el que se hace uso de dos enzimas. En primer lugar, se hará uso de la subtilisina y, a continuación, se hará uso de la exoproteasa flavourzyme. Ambos bioestimulantes se desarrollarán a nivel de laboratorio, utilizando para ello un biorreactor. Se caracterizarán ambos productos desde un punto de vista químico. Objetivo 2 Una vez desarrollados los bioestimulantes propuestos en el objetivo 1, se estudiará la eficacia de estos en la biorremediación de suelos contaminados por tres herbicidas de toxicidad en suelo documentada. Para ello, se contaminará un suelo con dichos herbicidas y posteriormente se añadirán los bioestimulantes, comprobando su repercusión sobre diferentes propiedades biológicas del suelo, tales como el estudio de diferentes actividades enzimáticas (actividades deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa) y el análisis de la biodiversidad microbiana del suelo mediante el estudio de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). 33 3. MATERIAL Y MÉTODOS 34 3.1. CARACTERÍSTICAS DEL SUELO, LA OKARA Y LOS HERBICIDAS 3.1.1. CARACTERÍSTICAS DEL SUELO El suelo utilizado en los distintos experimentos que engloba esta memoria fue un Regosol calcárico (FAO, 1989). Dicho suelo se sitúa en las inmediaciones de Montequinto, perteneciente al término de Dos Hermanas (Sevilla). Las muestras de suelo fueron recolectadas de los primeros 25 cm del horizonte superficial (Ap). Una vez trasladado al laboratorio, se dejó secar a temperatura ambiente y posteriormente se tamizó con un tamiz de luz de malla de 2 mm. Por último, las muestras se guardaron en botes de plástico hasta su análisis físico-químico. Las características físico-químicas de este suelo se recogen en la tabla 4. TABLA 4: CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DEL SUELO EXPERIMENTAL (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3). pH (H2O) 7,7 ± 0,1 Arena gruesa (g kg-1) 480 ± 38 Arena fina (g kg-1) 132 ± 21 Limo (g kg-1) 127 ± 32 Arcilla (g kg-1) 261 ± 33 N-Kjeldahl (g kg-1) 0,91 ± 0,07 Materia orgánica (g kg-1) 16,7 ± 1,2 C ácidos húmicos (mg kg-1) 3148 ± 44 C ácidos fúlvicos (mg kg-1) 2875 ± 36 C orgánico soluble en agua (µg C g-1) 483 ± 8 P (g kg-1) 12,7 ± 1,4 K (g kg-1) 22,8 ± 1,9 Fe (g kg-1) 11,8 ± 2,1 Cu (g kg-1) 8,7 ± 1,1 Mn (g kg-1) 9,2 ± 1,7 Zn (g kg-1) 5,7 ± 1,3 Cd (g kg-1) 4,0 ± 0,8 Pb (g kg-1) 2,0 ± 0,6 Ni (g kg-1) 2,1 ± 0,4 Cr (g kg-1) 1,1 ± 0,2 41 septiembre de 2019 (mediante prórroga) y, tras esta fecha, será reevaluado. Se encuentra en el Plan de acción móvil comunitario (Community Rolling Action Plan, CoRAP), lo que significa que su regulación y uso será evaluada en los próximos años. Está permitido en Italia y Eslovaquia, y en regulación en Austria, República Checa, Grecia, España, Irlanda y Reino Unido (European Commission, 2018). El reglamento citado estipula que solo se podrán autorizar los usos del herbicida en cantidades no superiores a 0,5 kg ha─1. Además, el reglamento hace especial énfasis en la necesidad de la seguridad del operario aplicante y en la necesidad de un equipo de protección individual, así como en la protección de los organismos acuáticos y de las plantas no objetivo. Debido a su peligrosidad y persistencia, tanto en suelo como en agua, ha sido incluido en la lista de sustancias tóxicas prioritarias de la Comisión Europea de Recursos de Agua Dulce. Además, a nivel internacional, se encuentra en la tercera lista de contaminantes prioritarios de aguas para consumo humano presentada por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. 3.2. PROCESO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA PARA LA OBTENCIÓN DE LOS BIOESTIMULANTES El proceso de hidrólisis tuvo lugar en un biorreactor mediante el método pH-stat (Adler-Nissen, 1979). De este proceso, que se detalla a continuación, se obtuvieron dos nuevos bioestimulantes a partir de la okara anteriormente comentado denominados como OB y OF. A la hora de fabricar dichos bioestimulantes, hay que tener en consideración que la okara se recibió en laboratorio con una humedad reducida para aumentar su estabilidad como producto de consumo. Si se emplease dicho producto con ese nivel de humedad, surgirían problemas a la hora de realizar el proceso bioquímico de hidrólisis, ya que las enzimas utilizadas en el proceso no realizarían sus funciones en óptimas condiciones y, en consecuencia, no habría una buena solubilización del producto. Para evitar esta problemática, se secó y rehidrató la okara hasta obtener un producto con un porcentaje final de materia seca del 10%. Para obtener el primer bioestimulante (OB), se usó la enzima subtilisina. Esta enzima es una endoproteasa que rompe las proteínas internamente, generando péptidos de diverso tamaño molecular, pero raramente aminoácidos libres. La 42 subtilisina se obtuvo mediante fermentación líquida con Bacillus licheniformis ATCC® 21415™ (Romero et al., 2007). La hidrólisis se llevó a cabo a una temperatura de 55 °C, con un 0.3% de enzima y en condiciones constantes de pH ajustando con KOH (ph = 9). La hidrólisis duró 2 h, pero se permitió que el proceso durase 20 h para asegurar que se llevara a cabo por completo. Después de este proceso, el producto se centrifugó 30 minutos a 8000 x g y 4 °C para retirar la fracción sólida. La fracción líquida, la de interés, se concentró a 80 °C y presión de vacío mediante rotavapor. A esta temperatura, la enzima es inactivada, eliminando la actividad residual que pueda tener. La figura 6 muestra un resumen esquemático del proceso hidrolítico descrito. FIGURA 6: OBTENCIÓN DEL BIOESTIMULANTE OB. 43 Para la fabricación del segundo bioestimulante (OF), se partió del producto que se obtuvo de la primera hidrólisis (antes de que tuviese lugar su centrifugación y concentración). Este producto se calentó 20 minutos a 80 °C para inactivar la primera enzima (subtilisina) e impedir que esta actuase sobre la segunda. A continuación, se inició el segundo proceso enzimático, llevando el producto a una temperatura de 55 °C, en pH constante ajustando con KOH (pH = 6.5) y con una concentración de enzima del 0,3%. Esta segunda enzima, flavourzyme®, es una exoproteasa que corta las cadenas peptídicas en el extremo N’-terminal, generando un gran número de aminoácidos libres. Fue provista por Beerzymes.dk. El procesó duró 2 h, pero, de nuevo, se permitió que durase 20 h. Después de esto, el producto fue centrifugado y concentrado en las mismas condiciones que el anterior. Un resumen de este proceso puede observarse en la figura 7. 44 FIGURA 7: OBTENCIÓN DEL BIOESTIMULANTE OF. 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL Para alcanzar el segundo objetivo descrito con anterioridad, se realizaron diversas experiencias de incubación. En ellas, se emplearon tanto los tres herbicidas descritos como los nuevos bioestimulantes experimentales. Por ello, a partir de ahora hablaremos de primera experiencia de incubación, segunda experiencia de incubación y tercera experiencia de incubación. 45 3.3.1. PRIMERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN El objetivo de esta primera experiencia fue estudiar la capacidad de biorremediación de los nuevos bioestimulantes en suelos contaminados por el herbicida oxifluorfén. Dicho estudio se realizó en el laboratorio (microcosmos), utilizando para ello botes de cristal con una capacidad de 0,5 L donde se introdujeron 300 g del suelo experimental (seco a temperatura ambiente y tamizado con tamiz de 2 mm de luz de malla). Hay que destacar que, en este tipo de experimentos de contaminación de suelos con compuestos orgánicos, es aconsejable el uso de recipientes de cristal para que el contaminante no se adhiera a las pareces del recipiente y altere los datos de forma artificial. En la naturaleza existe una gran variabilidad de factores y resulta difícil determinar las relaciones causa-efecto. En otras palabras, es complicado asignar las variaciones a un factor concreto cuando existen muchos y cuando estos pueden interactuar entre sí. Extraer el suelo del medio y aislarlo en contenedores idénticos, permite, en gran medida igualar y controlar numerosas variables. Los estudios en microcosmos se presentan como una alternativa a los estudios de toxicidad sobre especies concretas, pues estos integran las interrelaciones que se producen en la naturaleza, así como los efectos sinérgicos o compensatorios que pueden darse en presencia de ciertos compuestos naturales u otros contaminantes presentes (Sánchez Gimeno et al., 1987). Los contenedores fueron contaminados con la dosis de oxifluorfén recomendada por el fabricante (4 L ha─1). Las muestras de suelo se mezclaron con los bioestimulantes OB y OF a una dosis de materia orgánica de 3% para OB y 3% para OF, con el objetivo de aplicar la misma dosis al suelo (20 Tm de materia orgánica ha-1). Con este fin, se aplicaron 5 g de bioestimulante OB a cada microcosmos, y 4,2 del bioestimulante OF a los microcosmos correspondientes. Ambos bioestimulantes se solubilizaron en agua destilada antes de la aplicación y añadieron al suelo. Del mismo modo, se usó un suelo no enmendado orgánicamente y no contaminado con oxifluorfén como control. Se agregó agua destilada a cada suelo para llevarla al 60% de su capacidad de retención de agua. Los tratamientos de incubación se detallan a continuación: 1) S, suelo no enmendado orgánicamente y no contaminado con oxifluorfén. 46 2) S+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y no contaminado con oxifluorfén. 3) S+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y no contaminado con oxifluorfén. 4) S+Ox, suelo no enmendado orgánicamente y contaminado con oxifluorfén. 5) S+Ox+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y contaminado con oxifluorfén. 6) S+Ox+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y contaminado con oxifluorfén. Cada tratamiento se realizó por triplicado (18 contenedores en total). Dichos contenedores se colocaron de forma aleatoria en una cámara de incubación con temperatura controlada (25 ± 1 °C). El contenido de humedad se controló gravimétricamente y la pérdida de humedad se reemplazó por agua destilada según sea necesario. El periodo de incubación fue de 90 días. Durante dicho periodo se cogieron 15 gramos de suelo para realizar los pertinentes análisis, excepto para los días 10 y 90, en los que se recogieron 30 gramos de suelo. Las muestras se guardaron en congelador a ─20 °C hasta su análisis. De cada tratamiento fertilizante, se realizó un muestreo a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado dicho experimento. En dichas muestras se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: 1) Propiedades bioquímicas: determinación de distintas actividades enzimáticas (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa alcalina). Dichas determinaciones se realizaron a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado el experimento. 2) Biomasa de la comunidad microbiana del suelo, mediante el análisis de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). Dichas determinaciones se realizaron a los 10 y 90 días de haber iniciado el experimento, para bacterias Gram─, Gram+, totales y hongos. 3) Determinación de la concentración de oxifluorfén en suelo a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 días de haber iniciado el experimento. 47 3.3.2. SEGUNDA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN El objetivo de esta segunda experiencia fue estudiar la capacidad de biorremediación de los nuevos bioestimulantes experimentales en suelos contaminados por el herbicida imazamox, también en laboratorio (condiciones de microcosmos). Los contenedores fueron contaminados con una dosis de imazamox de 2,5 L ha─1, siendo utilizadas en este caso las mismas dosis de los bioestimulantes experimentales expuestas en la primera experiencia de incubación. Los tratamientos para esta segunda experiencia se detallan a continuación: 1) S, suelo no enmendado orgánicamente y no contaminado con imazamox. 2) S+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y no contaminado con imazamox. 3) S+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y no contaminado con imazamox. 4) S+I, suelo no enmendado orgánicamente y contaminado con imazamox. 5) S+I+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y contaminado con imazamox. 6) S+I+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y contaminado con imazamox. En este caso, también cada tratamiento se realizó por triplicado (18 contenedores en total). Del mismo modo, los contenedores se colocaron de forma aleatoria en una cámara de incubación con temperatura controlada (25 ± 1 °C). El contenido de humedad se controló gravimétricamente y la pérdida de humedad se reemplazó por agua destilada según fuese necesario. El periodo de incubación fue también de 90 días. Durante dicho periodo se cogieron 15 gramos de suelo para realizar los pertinentes análisis, excepto para los días 10 y 90, en los que se recogieron 30 gramos de suelo. Las muestras se guardaron en congelador a ─20 °C hasta su análisis. De cada tratamiento fertilizante, se realizó un muestreo a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado dicho experimento. En dichas muestras se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: 1) Propiedades bioquímicas: determinación de las actividades enzimáticas (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa alcalina). Dichas 48 determinaciones se realizaron a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado el experimento. 2) Biodiversidad de la comunidad microbiana del suelo, mediante el análisis de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). Estas determinaciones se realizaron a los 10 y 90 días de haber iniciado el experimento. 3) Determinación de la concentración de imazamox en suelo a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 días de haber iniciado el experimento. 3.3.3. TERCERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN Esta tercera y última experiencia se realizó, también en ensayos en microcosmos, con el objetivo de estudiar la capacidad de biorremediación de los nuevos bioestimulantes experimentales en suelos contaminados por el herbicida diurón a una dosis de 2 Kg ha─1. Las condiciones de incubación, así como las dosis de bioestimulantes empleados, también fueron las mismas que en los casos anteriores: Para este experimento, los tratamientos de incubación se detallan a continuación: 1) S, suelo no enmendado orgánicamente y no contaminado con diurón. 2) S+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y no contaminado con diurón. 3) S+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y no contaminado con diurón. 4) S+D, suelo no enmendado orgánicamente y contaminado con diurón. 5) S+D+OB, suelo enmendado con el bioestimulante OB y contaminado con diurón. 6) S+D+OF, suelo enmendado con el bioestimulante OF y contaminado con diurón. También, el periodo de incubación fue de 90 días. Durante dicho periodo se cogieron 15 gramos de suelo para realizar los pertinentes análisis, excepto para los días 10 y 90, en los que se recogieron 30 gramos de suelo. Las muestras se guardaron en congelador a ─20°C hasta su análisis. En este sentido, se muestreó cada tratamiento fertilizante a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado el experimento. En dichas muestras se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: 1) Propiedades bioquímicas: determinación de las actividades enzimáticas (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa y fosfatasa alcalina). Dichas determinaciones también se realizaron a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 de haber iniciado el experimento. 49 2) Biodiversidad de la comunidad microbiana del suelo, mediante el análisis de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). También se realizaron a los 10 y 90 días de haber iniciado el experimento. 3) Determinación de la concentración de diurón en suelo a los 5, 10, 20, 35, 55 y 90 días de haber iniciado el experimento. 3.4. DETERMINACIONES ANALÍTICAS A continuación, se detallan las determinaciones realizadas en suelos y residuos orgánicos. 3.4.1. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN SUELO 3.4.1.1. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FÍSICOS I. DETERMINACIÓN DE LA TEXTURA Se determinó según el método descrito por Bascomb y Avery, (1982). El procedimiento seguido es el siguiente: A una muestra de suelo en baño de arena se le añaden cantidades sucesivas de agua oxigenada (30%) hasta completa destrucción de materia orgánica. Posteriormente, se añaden cantidades sucesivas de ácido clorhídrico 0,1 M con el objetivo de destruir los carbonatos que tenga el suelo. Se toman 30 g de suelo y se mezclan 300 mL de agua destilada y 15 mL de hexametafosfato sódico. Posteriormente, se agita la muestra en un agitador rotatorio y se pasa el contenido a una probeta de 1.000 mL, utilizando para ello un tamiz de malla de 0,063 mm, que permite separar la fracción arena de la de limos y arcillas. Las arenas se llevan a una cápsula de porcelana que se introduce en una estufa a una temperatura de 105 °C. Una vez secadas, se tamizan con un tamiz de luz de malla de 0,1 mm, con el objetivo de separar arena fina de arena gruesa. Posteriormente y por diferencia de pesadas se calcula el porcentaje de ambas fracciones. En la probeta enrasada se extraen mediante la pipeta de Robinson las fracciones de limos y arcillas de acuerdo a los tiempos internacionalmente admitidos y teniendo en cuenta la temperatura. Ambas extracciones por separado se llevan a sendas cápsulas de porcelana en las que, previo secado en estufa, se determina el peso de la arcilla y limos de la muestra. 50 3.4.1.2. DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS QUÍMICOS I. DETERMINACIÓN DE PH La determinación de pH se realizó siguiendo el método descrito en el Manual de Métodos Oficiales de Análisis (MAPA, 1994) Para ello, la determinación se hizo en agua siguiendo una proporción 1/2,5 (p/v). Tras la adición de agua, la muestra de suelo se agita durante 10 minutos y posteriormente se deja reposar 30 minutos. Transcurrido este tiempo, se determina el pH en pH-metro. II. DETERMINACIÓN DEL N-KJELDHAL La determinación del N-Kjeldahl se realizó siguiendo el método descrito en el Manual de Métodos Oficiales de Análisis (MAPA, 1994). El método consiste en convertir las distintas formas de nitrógeno del suelo en NH4+, que servirá para determinar el contenido en nitrógeno de la muestra. Para ello, se sigue el método de Kjeldahl, consistente en una digestión ácida y posterior arrastre por vapor del amoniaco desprendido en medio alcalino. El procedimiento es el siguiente: se pesan 5 g de suelo y se colocan en un tubo de digestión junto con 20 mL de H2SO4 concentrado y una cucharadita de una mezcla formada por sulfato de cobre, sulfato de potasio y selenio, catalizadores de la reacción de digestión (la reacción de digestión se lleva a cabo a una temperatura de 360 °C, durante 2,5 h, en un sistema digestor conectado a un extractor de gases). A continuación, se deja enfriar el tubo el tiempo necesario y se añade agua destilada con precaución (aproximadamente 75 mL). Se filtra y enrasa en un matraz aforado de 100 mL. La destilación de la muestra se realiza sobre una alícuota (10 mL), añadiendo sosa concentrada hasta la aparición de color negro; con ello, se desplaza el amoníaco y se recoge por arrastre en 25 ml de H2SO4 (N/10) y unas gotas de indicador mixto. Finalmente, se valora el H2SO4 (N/10) con NaOH (N/10). Por otro lado, se trabaja del mismo modo con una muestra en blanco, sin presencia de suelo. El contenido en nitrógeno de la muestra se expresa en porcentaje, teniendo en cuenta que 1 ml de H2SO4 (N/10) corresponde a 1.4 mg de nitrógeno. - Cantidad de nitrógeno (mg) en la alícuota (Nal): 𝑁𝑎𝑙 =(B−M) 𝑚𝐿 𝐻2𝑆𝑂4 𝑥 𝑓 𝑥 1.4 𝑚𝑔 𝑁 𝑚𝐿−1𝐻2𝑆𝑂4 - Cantidad de nitrógeno (g) en la muestra (Nm): 𝑁𝑚=𝑁𝑎𝑙 𝑚𝑔 𝑥 10 𝑥 10−3 𝑔/𝑚𝑔 57 mL de sustrato y 2 mL de tampón. Muestra, control y blanco, se incuban en baño termostático con agitación a 37 °C durante 1 hora. Terminado este período se añaden 0,5 mL de sustrato a los controles. A continuación, todos los tubos se enfrían a 4 °C en baño con hielo durante 15 minutos, para frenar la reacción enzimática. Pasado este tiempo, se adicionan a todos los tubos, muestra, control y blanco, 0,5 mL de CaCl2 0,5 M y 2 mL de disolución THAM- NaOH 0,1 M, pH 12. Se agita bien para que la suspensión se mezcle completamente. Seguidamente se centrifugan los tubos a 3.000 rpm durante 10 minutos. Se diluye convenientemente el sobrenadante y se mide su absorbancia en el espectrofotómetro, después de haber ajustado el equipo a cero con el blanco, a una longitud de onda de 400 nm. El CaCl2 se añade para bloquear la reacción y para provocar la floculación de coloides que podrían interferir en la lectura espectrofotométrica, y la disolución THAM-NaOH sirve para salificar el producto de reacción obtenido dándole color amarillo. La densidad óptica relativa medida se transforma en concentración mediante una recta patrón obtenida con concentraciones conocidas de PNF. Las unidades propuestas para expresar esta actividad enzimática son μmoles PNF g-1 h-1. La actividad β-glucosidasa se calcula usando la siguiente ecuación: AG =(C x V) (Pm x G x T) donde: ─ AG = actividad β-glucosidasa μmol PNF g-1suelo seco h-1 ─ C = concentración de PNF (μg) en el extracto, según la recta de calibración obtenida. ─ V = factor de dilución. ─ Pm = peso molecular del p-nitrofenol (139 g mol-1). ─ G = factor referente al peso del suelo seco. ─ T = factor relativo al tiempo de incubación, en horas. 58 IV. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA FOSFATASA Esta actividad enzimática se determinó por el método descrito por Tabatabai y Bremner (1969), basado en la determinación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado cuando se incuba el suelo a 37 °C con una disolución tamponada (pH 11,5 para la alcalina) del substrato artificial p-nitrofenil-fosfato (PNF). El método colorimétrico para medir el p-nitrofenol liberado se basa en el hecho de que las disoluciones alcalinas de este compuesto tienen color amarillo. Para ello, a 0,5 g de muestra de suelo se le añaden 0,5 mL de p-nitrofenil fosfato 0,025 M y 2 mL de tampón MUB pH 11,5. Paralelamente se prepara para cada muestra un control con 0,5 g de suelo y 2 mL de tampón MUB pH 11,5. Además, se prepara un blanco con 0,5 mL de sustrato y 2 mL de tampón MUB pH 11,5. Muestra, control y blanco, se incuban en baño termostático con agitación a 37 °C durante 1 hora. Terminado este período se añaden 0,5 mL de sustrato a los controles. A continuación, todos los tubos se enfrían a 4 °C durante 15 minutos, para frenar la reacción enzimática. Pasado este tiempo, se adicionan a todos los tubos, muestra, control y blanco, 0,5 mL de CaCl2 0,5 M y 2 mL de NaOH 0,5 M. Se agita bien para que la suspensión se mezcle completamente. Seguidamente se centrifugan los tubos a 3.400 rpm durante 10 minutos. Se diluye convenientemente el sobrenadante y se mide su absorbancia, en el espectrofotómetro, después de haber ajustado el equipo a cero con el blanco, a una longitud de onda de 400 nm. La densidad óptica medida se transforma en concentración mediante una recta patrón obtenida con concentraciones conocidas de p-nitrofenol-fosfato. Las unidades propuestas para expresar esta actividad enzimática son μmoles p-nitrofenol liberado g-1 h-1. La actividad fosfatasa se calcula usando la siguiente expresión: AP=(C x V) (Pm x G x T) donde: ─ AP = actividad fosfatasa (μmoles p-nitrofenol liberado g-1 h-1) ─ C = cantidad p-nitrofenol de la muestra en μg. ─ V = factor de dilución. ─ Pm= peso molecular del p-nitrofenol (139 g mol-1). 59 ─ G = factor relativo al peso del suelo seco utilizado. ─ T = factor relativo al tiempo de incubación en horas. V. DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS DE FOSFOLÍPIDOS DE MEMBRANA Para la medición de los ácidos grasos de fosfolípidos de membrana (PLFAs) se siguió la metodología recogida en Schutter y Dick (2000). Previamente a la extracción, todo el material empleado debe lavarse dos veces con cloroformo. 3 g de suelo se introducen en tubos de centrífuga de 50 mL de capacidad. A estos, se les adicionan 30 μL del estándar interno 21:0 (3-metil-heneicosano), 15 mL de solución alcalina de KOH 0,2M en metanol y se agitan las muestras 30 segundos en vórtex. Se introducen las muestras en un baño a 37 °C sin agitación. Durante esta incubación, las muestras han de agitarse en vórtex durante 5 segundos cada 10 minutos. Transcurrido ese tiempo, se añaden 3 mL de ácido acético 1 M para neutralizar el pH del contenido de los tubos y se agitan en vórtex 5 segundos. A continuación, se añaden 10 mL de hexano (o iso-octano) y se agitan en vórtex 30 segundos. Se procede a centrifugar los tubos a 2.200 rpm durante 10 minutos. Los ácidos grasos quedarán en la fase orgánica (superior). Esta fase se traslada a tubos de vidrio de 10 mL, que son secados en centrífuga de vacío a 1.000 rpm y 40 °C hasta completar la evaporación del disolvente. Después, la muestra se redisuelve en 50 μL de iso-octano y se trasvasa al inserto en un vial de 2 mL. Para la determinación por cromatografía, el concentrado disuelto en iso-octano y los patrones cromatográficos, también disueltos en iso-octano, se trasladan al cromatógrafo. Este es un sistema Perkin Elmer Autosystem XL, que utiliza una columna de diámetro interno 0,2 mm. El gas portador es He a 250 kPa y la secuencia de temperaturas la que se especifica a continuación: de 70 °C hasta 160 °C durante 2 minutos a una velocidad de 30 °C min─1, aumento a 280 °C a una velocidad de 3 °C min─1, mantenimiento del flujo durante 15 minutos. El cálculo para la concentración de cada PLFA se realiza mediante la siguiente fórmula: - Para el blanco: 𝐶= (𝐹𝐹𝑀 𝑥 𝐶𝐼𝑆𝑥 1000) (𝑃 𝑥 𝐹𝐼𝑆 𝑥 𝑀𝐺𝐹𝑀) 60 - Para cada muestra: 𝐶 = (𝐹𝐹𝑀 𝑥 𝐶𝐼𝑆 𝑥 1000) (𝐶𝐵𝑊 𝑥 𝐹𝐼𝑆 𝑥 𝑀𝐺𝐹𝑀) 𝑥 100 𝑃 donde: ─ C = Concentración nmol g─1. ─ FFM = área del pico en la muestra. ─ MGFM = peso molecular del ácido correspondiente con el pico. ─ CIS = concentración del estándar interno expresada en μg. ─ FIS = área del pico correspondiente al patrón estándar interno. ─ P = peso del suelo. ─ 1000 = factor de conversión a nmol. ─ CBW = concentración del PLFA en el blanco calculado por la primera fórmula. Para calcular la diversidad de PLFAs mediante el índice de Shanon, HPLFA, se utiliza la siguiente expresión: 𝐻𝑃𝐿𝐹𝐴= − ∑𝑝𝑖ln𝑝𝑖 ∞ 𝑛=1 donde: ─ pi: es la abundancia relativa de cada ácido graso con respecto a la suma total. ─ n: es el número total de ácidos grasos detectados. V.I. NOMENCLATURA, CLASIFICACIÓN DE PLFAs Y DIVERSIDAD La nomenclatura de los PLFA se designa atendiendo al esquema X:Y:Z, donde X se refiere al número de átomos de carbono, Y al número de dobles enlaces, y Z indica la posición del primer doble enlace desde el extremo alifático de la molécula. El símbolo ω expresa la posición del primer doble enlace desde el extremo metilo de la molécula. Los prefijos iso (i) y anteiso (a) indican ramificación en los átomos de C número 2 y 3, respectivamente. El prefijo cy indica presencia de un grupo ciclopropilo. La configuración cis o trans se expresa mediante los prefijos c o t respectivamente. Los ácidos grasos i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:1ω7c, 17:0, i17:0, cy17:0, 18:1ω9c, y cy19:0 representan biomasa bacteriana (Frostegård et al., 1993; Bardgett 61 et al., 1996; Dungait et al., 2011) mientras que el ácido graso 18:2ω6 es exclusivo de hongos (Federle et al., 1986; Zelles et al., 1992; Bååth, 2003). Los ácidos grasos específicos de bacterias Gram positivas son los siguientes: i15:0, a15:0, i16:0, y i17:0; y los correspondientes a Gram negativas son cy17:0, 18:1ω9c, y cy19:0. 3.4.1.4. DETERMINACIÓN DE HERBICIDAS EN SUELO I. DETERMINACIÓN DE OXIFLUORFÉN EN SUELO La extracción de oxifluorfén se realizó siguiendo la metodología descrita por Anastassiades y Lehotay (2003). Para ello, se utilizó una mezcla de trifenilfosfato y acetonitrilo para agitar el suelo. Una vez agitado y centrifugado, al sobrenadante se le añadió sulfato magnésico, se volvió a agitar y centrifugar. El sobrenadante se concentró y se recompuso el residuo seco con 1 mL de ciclohexano:acetato de etilo 9:1. El oxifluorfén se determinó mediante un espectrómetro de masas en tándem e impacto electrónico, donde las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: Gas portador: He a 1 mL min-1; Temperatura inicial inyector: 70 °C durante 0,50 min, 310 °C a 100 °C/min durante 10 min; Columna: 30 mm x 0,25 mm ID; Temperatura inicial del horno de columna: 70 °C durante 3,5 min., 180 °C a 35 °C/min, 300 °C a 10 °C/min durante 5 min; Temperaturas del detector: Trampa a 250 °C, Colector a 60 °C, Xferline hasta 280 °C; Volumen de inyección: 5 µl. II. DETERMINACIÓN DE IMAZAMOX EN SUELO La determinación del herbicida imazamox se realizó mediante un espectrómetro de masas y uno de impacto electrones en tándem. Se siguió la metodología recogida en Liu et al., (2016). El herbicida se extrajo usando diclorometano y su medida se realizó mediante HPLC en un sistema Quattro micro API (Waters, EE.UU.). La separación tuvo lugar en una columna Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) a 30 oC usando metanol y ácido acético (7:3) como fase móvil y una un flujo de 0,8 mL min─1. Los parámetros de la espectrometría de masas fueron los siguientes: ionización electrospray (ESI), modo de ionización positiva, flujo del gas de cono de 80 L h─1, flujo del gas de solvatación de 600 L h─1, temperatura fuente de 120 °C, temperatura de ionización de 350 °C, capilar de 3.5 kV, cono de 50 V, rango escaneado de 100 – 350 m/z (Frommberger et al., 2007; Liu et al., 2016). 62 III. DETERMINACIÓN DE DIURÓN EN SUELO La determinación del herbicida diurón se realizó usando la metodología descrita en Tejada et al. (2017). El herbicida se extrajo usando metanol (2 g de suelo:10 mL de metanol) y la medida se realizó mediante HPLC. Con el fin de eliminar la actividad de los microorganismos y asegurar que solo predominaban los efectos de las condiciones abióticas, el suelo se trató con HgCl2. La medida de la concentración mediante HPLC fue realizada usando una columna de fase reversa Kromasil C18 (15 x 0,40 cm), a 30 °C (la columna fue suministrada por Teknokroma, España). La fase móvil fue una mezcla de acetonitrilo y agua en una proporción de 6:4, el flujo fue de 1 mL min─1, y el volumen de inyección de 100 μL. La detección tuvo lugar mediante un detector de fotodiodos en serie a 230 nm. El límite de cuantificación fue de 0,15 mg L─1. 3.4.2. CARACTERIZACIÓN DE LOS HIDROLIZADOS Las determinaciones de materia orgánica y macro- y micronutrientes fueron llevadas a cabo de acuerdo a la metodología descrita en Rodríguez-Morgado et al., (2015a). La materia orgánica fue determinada por combustión a 550 °C durante seis horas. El contenido de grasa bruta se determinó gravimétricamente después de la extracción con hexano durante 12 h en un extractor Soxhlet (Clemente et al., 1997). Los carbohidratos solubles totales se determinaron después de la extracción con una mezcla de etanol/agua (2:3) durante 2 h. Después de la centrifugación a 4000 x g, el sobrenadante se filtró a través de un papel Whatman No. 1 y los azúcares solubles totales se estimaron colorimétricamente utilizando el método del ácido fenol-sulfúrico con una curva estándar de glucosa DuBois et al., (1956). El nitrógeno total fue determinado mediante el método Kjeldahl (MAPA, 1994). El contenido de proteína se determinó multiplicando el contenido total de nitrógeno en una proteína por el factor de conversión 5.71, que es aplicable a la proteína de soja (Orts et al., 2018). Los macro- y micronutrientes fueron determinados tras la combustión y fueron analizados por espectrometría de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) usando un modelo Fisons-ARL 3410 equipado con un sistema de control y adquisición de datos. Las condiciones operacionales fueron las siguientes: el gas transportador, gas refrigerante y gas plasma es argón a 80 psi de presión; el flujo de gas transportador fue de 0,8 L·min─1, el de gas refrigerante fue de 7,5 de L·min─1 y el de gas plasma de 0,8 63 L·min─1, con un tiempo de integración de 1 segundo. El consumo de gas argón se dio a un poder de radiofrecuencia de 650 W. Se realizó también una cromatografía de exclusión molecular para separar las moléculas obtenidas de los procesos de hidrólisis en función de su tamaño. Se empleó el sistema JASCO LC-4000 con una columna SuperdexPeptide™ 10/300 GL (con óptimo de separación en 0,1 – 7KDa). Los tiempos de retención en la columna se recogen en la tabla 6. Las muestras fueron centrifugadas a 12000 x g durante 30 minutos a 4 °C para lograr la eliminación de moléculas insolubles. El sobrenadante se hizo pasar por un filtro de 0,2 μm y se cargó en un bucle de 0,1 mL conectado a un sistema de purificación AKTA. Para equilibrar y eluir la columna se empleó el tampón Tris-HCl 0,25 M (pH = 7) en modo isocrático, a una velocidad de flujo de 0,5 mL min─1. TABLA 6: TIEMPOS DE RETENCIÓN DE LA COLUMNA EMPLEADA EN LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN Y TAMAÑOS MOLECULARES CORRESPONDIENTES. Tamaño molecular (KDa) Tiempo de retención (min) > 10 0 – 20,801 10 – 5 20,801-23,202 5 – 3 23,202-24,971 3 – 1 24,971-28,776 1 – 0,3 28,776- 32,946 0,3 > 32,946 Las proteínas y los péptidos fueron detectados a 280 y 215 nm con un módulo detector JASCO UV-4075 UV/Vis acoplado a la columna. A 215 nm, los picos que se observan corresponden a enlaces entre átomos de carbono, es decir, a la materia orgánica. A 280 nm los picos corresponden a anillos aromáticos, es decir, principalmente (pero no solo) a proteínas, péptidos y aminoácidos. 3.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Con el objeto de estudiar si la adición de los hidrolizados produce una estimulación significativa de la actividad microbiana del suelo, así como un aumento estadísticamente significativo de la biodegradación de los herbicidas tratados, se ha realizado un análisis de la varianza (ANOVA). En los casos en que este análisis arrojó 64 diferencias estadísticamente significativas, se procedió a llevar a cabo la comparación de medias mediante el test post-hoc de Tukey. Antes de proceder al análisis de la varianza, se obtuvieron los gráficos de perfiles para comprobar el comportamiento de las variables estudiadas en función del tiempo, con cada uno de los tratamientos realizados. Estos gráficos se obtuvieron, en primer lugar, para todos los tratamientos y luego se separaron los tratamientos sin bioestimulantes de los tratamientos con bioestimulantes. Posteriormente, se realizó la prueba de esfericidad de Maunchly para comprobar si las varianzas de las diferencias entre todos los pares de grupos son iguales. Si la hipótesis nula (esfericidad) se rechaza (p < 0,05), se aplican técnicas multivariantes (MANOVA); por el contrario, si no se rechaza (p > 0,05), se aplicarán técnicas univariantes (ANOVA) para analizar: - La igualdad de los efectos de los tratamientos (los perfiles coinciden). - Los efectos de los tratamientos permanecen constantes a lo largo del tiempo (los perfiles son líneas rectas, paralelas al eje x), - La ausencia de interacción entre el tiempo y los parámetros (los perfiles son paralelos entre ellos). El tratamiento estadístico se llevó a cabo mediante el software R (R Core Team, 2018) con los paquetes car (Fox et al., 2011) y multcomp (Hothorn et al., 2008). Con la función “lm” del paquete “car” (Fox et al., 2011) se ajustó un modelo lineal para cada variable y con la función “Anova” se obtuvo el análisis de la varianza. Para hacer la comparación entre medias en cada instante, primero se ajustó un modelo lineal, para cada variable, con la función “lm” del paquete “multcomp” (Hothorn et al., 2008). Finalmente, se ejecuta la función “glht” de dicho paquete, utilizando el test de Tukey. 65 4. RESULTADOS 66 4.1. OBTENCIÓN DE LOS BIOESTIMULANTES A PARTIR DE OKARA La Tabla 7 muestra los resultados químicos en cuanto a materia orgánica, macro-, micronutrientes y distribución del peso molecular de las proteínas en los bioestimulantes OB y OF obtenidos a partir de okara tras los procesos de hidrólisis enzimática descritos en el capítulo de Material y métodos de esta memoria. TABLA 7: CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS Y DISTRIBUCIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEÍNAS (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N=3) DE LOS BIOESTIMULANTES OBTENIDOS A PARTIR DE OKARA. Bioestimulante OB Bioestimulante OF Materia seca (%) 32,1 ± 0,2 35,4 ± 0,2 Materia orgánica (g kg-1) 445 ± 12 417 ± 19 Proteína (g kg-1) 439 ± 34 383 ± 23 N (g kg-1) 108± 10 102 ± 13 P (g kg-1) 4,2 ± 0,3 5,3 ± 0,3 S (g kg-1) 8,5 ± 0,8 9,1 ± 0,5 K (g kg-1) 21,8± 1,5 24,6± 1,1 Ca (g kg-1) 2,9 ±0,7 2,5±0,4 Mg (g kg-1) 24,5 ± 3,8 27,8±2,5 Fe (mg kg-1) 65,9±3,1 64,6±2,7 Cu (mg kg-1) 12,6 ±1,5 13,7 ±1,3 Mn (mg kg-1) 27,4±1,8 26,9±1,4 Zn (mg kg-1) 28,1 ± 1,9 24,0 ± 1,4 Distribución del peso molecular de las proteínas (Da) >10000 5,6 ± 1,6 3,5 ± 1,3 10000– 5000 4,1 ± 1,1 3,2 ± 1,0 5000-3000 4,3 ± 1,6 3,2 ± 1,5 3000-1000 12,4 ± 1,9 8,7 ± 1,3 1000-300 17,5 ± 2,3 12,6 ± 2,2 <300 56,0 ± 2,5 68,8 ± 3,1 Tras el proceso de hidrólisis enzimática, los bioestimulantes resultantes mostraron diferencias importantes con respecto al okara puro de partida en cuanto a su composición química. En este sentido, con respecto al okara puro se observa un 73 El test de Mauchly para el grupo formado por el suelo control y los suelos contaminados no rechaza la hipótesis nula, por lo que se aplicaron técnicas univariantes al análisis de la varianza (tabla 12). El ANOVA realizado a los datos de fosfatasa para estos suelos muestra que el tiempo influye por igual (p >0,05) en todos los tratamientos (interacción tratamiento:tiempo en la tabla 13) confirmando que los perfiles son paralelos entre ellos, como se apreciaba en la figura 11. Asimismo, en la mencionada tabla se comprueba que tampoco hay influencia del tiempo en la evolución de los valores de fosfatasa para ninguno de los tratamientos (p > 0,05). Por el contrario, el tratamiento sí afecta de manera significativa a esta actividad enzimática (p < 0,05). FIGURA 11: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA TENIENDO EN CUENTA TODOS LOS TRATAMIENTOS. 5 10 15 20 25 30 Tiempo de incubación (días) PHA (µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S S+D S+D+OB S+D+OF S+I S+I+OB S+I+OF S+OB S+OF S+Ox S+Ox+OB S+Ox+OF 74 FIGURA 12: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA EN EL SUELO CONTROL Y EN LOS SUELOS CONTAMINADOS CON LOS TRES HERBICIDAS. TABLA 12: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA DEL SUELO CONTROL Y DE LOS SUELOS CONTAMINADOS SIN ENMENDAR. Test statistic p-value Tiempo 0,33546 0,95296 Tratamiento:tiempo 0,33546 0 0,95296 TABLA 13: ANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA DEL SUELO CONTROL Y DE LOS SUELOS CONTAMINADOS SIN ENMENDAR. Sum Sq num Df Error SS den Df F value Pr(>F) (Intercept) 332,35 1 1,3792 8 1927,7833 7,989e-11 *** Tratamiento 34,55 3 1,3792 8 66,8054 5,260e-06 *** Tiempo 0,84 5 10,0659 40 0,6673 0,6504 Tratamiento:tiempo 1,78 15 10,0659 40 0,4707 0,9419 0 1 2 3 4 5 Tiempo de incubación (días) PHA (µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S S+D S+I S+Ox 75 Con respecto al grupo formado por los suelos contaminados y no contaminados enmendados con bioestimulantes, el test de Mauchly rechaza la hipótesis nula (tabla 14), indicando que deben usarse técnicas multivariantes para el análisis de la varianza. La tabla 15 recoge el MANOVA realizado a los resultados de la actividad fosfatasa para este segundo grupo de suelos. A diferencia del ANOVA, aquí aparecen varias pruebas para cada uno de los efectos. En principio, cualquiera de ellos puede ser utilizado para establecer si se rechazan o no las hipótesis nulas. De cualquier manera, en el caso que aquí se estudia, todos los tests rechazan dichas hipótesis, por lo que se puede afirmar: i) que el tiempo de incubación afecta de manera diferente al comportamiento de la fosfatasa en función del tratamiento realizado al suelo, ii) que la evolución de la actividad enzimática se ve afectada por el tiempo y iii) que el tratamiento realizado afecta significativamente los resultados obtenidos de dicha actividad. En definitiva, el MANOVA realizado respalda lo observado en los gráficos de perfiles (figuras 12 y 13). FIGURA 13: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA EN SUELOS CONTAMINADOS Y NO CONTAMINADOS TRATADOS CON BIOESTIMULANTES. 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo de incubación (días) PHA (µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S+D+OB S+D+OF S+I+OB S+I+OF S+OB S+OF S+Ox+OB S+Ox+OF 76 TABLA 14: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA EN LOS SUELOS CONTAMINADOS Y SIN CONTAMINAR, ENMENDADOS CON BIOESTIMULANTES. Test statistic p-value Tiempo 0,087752 0,002097 Tratamiento:tiempo 0,087752 0,002097 TABLA 15: MANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA ACTIVIDAD FOSFATASA EN LOS SUELOS CONTAMINADOS Y SIN CONTAMINAR, ENMENDADOS CON BIOESTIMULANTES. Tratamiento Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 5 0,95944 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Wilks 5 0,04056 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Hotelling-Lawley 5 23,65455 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Roy 5 23,65455 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 1 0,99622 633,2379 5 12 4,2279e-14 *** Wilks 1 0,00378 633,2379 5 12 4,2279e-14 *** Hotelling-Lawley 1 263,84912 633,2379 5 12 4,2279e-14 *** Roy 1 263,84912 633,2379 5 12 4,2279e-14 *** Tratamiento:tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 7 0,95944 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Wilks 7 0,04056 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Hotelling-Lawley 7 23,65455 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** Roy 7 23,65455 54,06754 7 16 5,9347e-10 *** 4.2.3. ACTIVIDAD GLUCOSIDASA El gráfico de perfiles de la figura 14 es parecido al de las dos actividades anteriores, mostrando dos grupos con comportamientos diferentes. En el suelo control y los suelos contaminados con los tres herbicidas, los perfiles son paralelos entre sí y al eje de abscisas. La figura 15, por su parte, evidencia una posible diferencia en la evolución de la actividad -glucosidasa en el suelo contaminado con imazamox con respecto a los suelos contaminados con oxifluorfén y diurón y al suelo control. De nuevo, se procede al análisis de la varianza para establecer si realmente hay diferencias en la tendencia que siguen los valores de esta actividad a lo largo del tiempo de incubación en estos suelos. La prueba de esfericidad de Mauchly (tabla 16) sugiere 77 que se realice un análisis de la varianza con técnicas multivariante (p < 0,05). El MANOVA de la tabla 17 confirma que el tiempo de incubación no afecta a los valores de la -glucosidasa, en ninguno de estos tratamientos. Es decir, las diferencias observadas en los perfiles de la figura 15 no son estadísticamente significativas. FIGURA 14: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA TENIENDO EN CUENTA TODOS LOS TRATAMIENTOS. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Tiempo de incubación (días) GLA (µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S S+D S+D+OB S+D+OF S+I S+I+OB S+I+OF S+OB S+OF S+Ox S+Ox+OB S+Ox+OF 78 FIGURA 15: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN EL SUELO CONTROL Y EN LOS SUELOS CONTAMINADOS CON LOS TRES HERBICIDAS. TABLA 16: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA DEL SUELO CONTROL Y DE LOS SUELOS CONTAMINADOS SIN ENMENDAR. Test statistic p-value Tiempo 0,011341 0,024797 Tratamiento:tiempo 0,011341 0 0,024797 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Tiempo de incubación (días) GLA(µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S S+D S+I S+Ox 79 TABLA 17: MANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA DEL SUELO CONTROL Y DE LOS SUELOS CONTAMINADOS SIN ENMENDAR. Tratamiento Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 3 0,7202315 6,865023 3 8 0,013277 * Wilks 3 0,2797685 6,865023 3 8 0,013277 * Hotelling-Lawley 3 2,5743837 6,865023 3 8 0,013277 * Roy 3 2,5743837 6,865023 3 8 0,013277 * Tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 1 0,6714608 1,635022 5 4 0,32711 Wilks 1 0,3285392 1,635022 5 4 0,32711 Hotelling-Lawley 1 2,0437772 1,635022 5 4 0,32711 Roy 1 2,0437772 1,635022 5 4 0,32711 Tratamiento:tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 3 1,1517632 0,7478024 15 18,00000 0,71237 Wilks 3 0,1808352 0,6545765 15 11,44364 0,78188 Hotelling-Lawley 3 2,7750929 0,4933499 15 8,00000 0,88662 Roy 3 1,9339605 2,3207526 5 6,00000 0,16736 A diferencia de lo observado en los perfiles de los suelos contaminados y sin contaminar enmendados con los bioestimulantes en las actividades deshidrogenasa y fosfatasa, en la -glucosidasa se distinguen dos comportamientos diferentes. Por un lado, los suelos no contaminados y tratados con bioestimulantes y, por otro, los suelos contaminados y enmendados (figura 16). El análisis multivariante de estos datos (tabla 18) corrobora estas afirmaciones, dando como resultado que existen diferencias estadísticamente significativas, tanto entre los tratamientos (Tratamientos, p < 0,05), como en la influencia del tiempo de incubación (Tiempo, p < 0,05) y en la evolución de la actividad a lo largo del tiempo para los diferentes tratamientos (tratamiento:tiempo, p < 0,05). Como se puede observar en la tabla 19, en todos los tests se obtienen valores de p< 0,05, tanto para la influencia del tiempo como para el tratamiento, sin embargo, en la interacción tratamiento:tiempo, el test de Pillai arroja un valor de p >0,05, lo que indicaría que los perfiles son paralelos entre ellos. Esto, unido al comportamiento de los perfiles de los suelos contaminados y enmendados que muestra la figura 16, sugiere que se analicen los datos de la actividad -glucosidasa en estos suelos por separado. 80 FIGURA 16: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN SUELOS CONTAMINADOS Y NO CONTAMINADOS TRATADOS CON BIOESTIMULANTES. TABLA 18: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN LOS SUELOS CONTAMINADOS Y SIN CONTAMINAR, ENMENDADOS CON BIOESTIMULANTES. Test statistic p-value Tiempo 0,010724 1,3264e-06 Tratamiento:tiempo 0,010724 1,3264e-06 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Tiempo de incubación (días) GLA(µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S+D+OB S+D+OF S+I+OB S+I+OF S+OB S+OF S+Ox+OB S+Ox+OF 81 TABLA 19: MANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN LOS SUELOS CONTAMINADOS Y SIN CONTAMINAR, ENMENDADOS CON BIOESTIMULANTES. Tratamiento Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 1 0,9860 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Wilks 1 0,0140 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Hotelling-Lawley 1 70,4483 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Roy 1 70,4483 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 1 0,9860 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Wilks 1 0,0140 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Hotelling-Lawley 1 70,4483 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Roy 1 70,4483 140,8966 5 10 6,1903e-09 *** Tratamiento:tiempo Df test stat approx F num Df den Df Pr(>F) Pillai 6 1,562231 1,06034 30 70 0,4087205 Wilks 6 0,021210 2,26854 30 42 0,0072094 ** Hotelling-Lawley 6 22,992964 6,43803 30 42 3 3,3340e-08 *** Roy 6 22,143924 51,66916 6 14 9 9,3708e-09 *** Así pues, al representar solo los perfiles de los suelos contaminados y enmendados (figura 17) se ve que, en principio, hay coincidencia de perfiles y un cierto paralelismo entre algunos de ellos, indicando que el tratamiento no afectará significativamente a los valores de esta actividad, así como tampoco habrá diferencias en la tendencia de los diferentes tratamientos a lo largo del tiempo de incubación. Como se hizo anteriormente, se procedió al análisis de la varianza, que, de nuevo, a la luz de los resultados arrojados por el test de esfericidad de Mauchly (tabla 20) debe realizarse utilizando técnicas multivariantes. La tabla 21 apoya la coincidencia de perfiles, ya que todas las pruebas dan valores de p > 0,05 para la influencia del tratamiento en los valores de la actividad. Asimismo, se confirma que hay paralelismo de perfiles, es decir, el tiempo de incubación influye de la misma manera en todos los tratamientos (tratamiento:tiempo, p > 0,05). Por último, los perfiles no son paralelos al eje de abscisas, lo que indica que los resultados de esta actividad varían de manera significativa a lo largo del periodo de incubación (Tiempo, p < 0,05). 82 FIGURA 17: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN SUELOS CONTAMINADOS Y TRATADOS CON BIOESTIMULANTES. TABLA 20: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA ACTIVIDAD GLUCOSIDASA EN LOS SUELOS CONTAMINADOS Y TRATADOS CON BIOESTIMULANTES. Test statistic p-value design 0,0022943 1,4982e-05 gla.hbs$trt:desi 0,0022943 1,4982e-05 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Tiempo de incubación (días) GLA (µmol PNP g-1 h-1) 510 20 35 55 90 S+D+OB S+D+OF S+I+OB S+I+OF S+Ox+OB S+Ox+OF 89 FIGURA 21: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA EVOLUCIÓN DE OXIFLUORFÉN EN SUELOS ENMENDADOS Y SIN ENMENDAR. TABLA 26: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA DEGRADACIÓN DE OXIFLUORFÉN EN SUELOS. Test statistic p-value Tiempo 0,015599 0,33064 Tratamiento:tiempo 0,015599 0,33064 TABLA 27: ANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA DEGRADACIÓN DE OXIFLUORFÉN EN SUELOS. Sum Sq num Df Error SS den Df F value Pr(>F) (Intercept) 1,19201 1 0,0016359 6 4371,9710 8,048e-10 *** Tratamiento 0,05959 2 0,0016359 6 109,2797 1,907e-05 *** Tiempo 0,07744 5 0,0078788 30 58,9700 1,303e-14 *** Tratamiento:tiempo 0,00527 10 0,0078788 30 2,0065 0,06871 0.10 0.15 0.20 0.25 Tiempo de incubación (días) Oxifluorfen (mg/kg) 510 20 35 55 90 S+Ox S+Ox+OB S+Ox+OF 90 FIGURA 22: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA EVOLUCIÓN DE IMAZAMOX EN SUELOS ENMENDADOS Y SIN ENMENDAR. TABLA 28: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA DEGRADACIÓN DE IMAZAMOX EN SUELOS. Test statistic p-value Tiempo 0,0043114 0,1145 Tratamiento:tiempo 0,0043114 0,1145 TABLA 29: ANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA DEGRADACIÓN DE IMAZAMOX EN SUELOS. Sum Sq num Df Error SS den Df F value Pr(>F) (Intercept) 0,0289815 1 7,0333e-05 6 2472,3555 4,438e-09 *** Tratamiento 0,0013303 2 7,0333e-05 6 56,7441 0,0001266 *** Tiempo 0,0018564 5 2,0767e-04 30 53,6356 4,652e-14 *** Tratamiento:tiempo 0,0002508 10 2,0767e-04 30 3,6228 0,0029859 ** 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 Tiempo de incubación (días) Imazamox (mg/kg) 510 20 35 55 90 S+I S+I+OB S+I+OF 91 FIGURA 23: GRÁFICO DE PERFILES PARA LA EVOLUCIÓN DE DIURÓN EN SUELOS ENMENDADOS Y SIN ENMENDAR. TABLA 30: PRUEBA DE ESFERICIDAD DE MAUCHLY PARA LA DEGRADACIÓN DE DIURÓN EN SUELOS. Test statistic p-value Tiempo 0,0049698 0,13042 Tratamiento:tiempo 0,0049698 0,13042 TABLA 31: ANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS PARA LA DEGRADACIÓN DE DIURÓN EN SUELOS. Sum Sq num Df Error SS d den Df F value Pr(>F) (Intercept) 6270,5 1 3,0133 6 12485,5313 3,464e-11 *** Tratamiento 441,4 2 3,0133 6 439,4074 3,118e-07 *** Tiempo 1698,9 5 16,6667 30 611,5907 < 2,2e-16 *** Tratamiento:tiempo 22,9 10 16,6667 30 4,1283 0,00 92 4.4. PRIMERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN La aplicación del herbicida oxifluorfén ocasionó una disminución significativa (p<0,05) en la actividad de la deshidrogenasa del suelo durante todo el período experimental (tabla 32). En este sentido, al final del periodo de incubación y en comparación con el suelo no contaminado y no enmendado orgánicamente, esta actividad enzimática significativamente (p<0,05) disminuyó un 43,4%. 93 TABLA 32: EVOLUCIÓN DE LAS ACTIVIDADES DESHIDROGENASA Y UREASA (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS ENMENDADOS CON LOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES Y CONTAMINADOS CON OXIFLUORFÉN DURANTE EL PERIODO DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). INTF: 2-P-IODO-3-NITROPHENYL FORMAZÁN. Días de incubación 5 10 20 35 55 90 Actividad deshidrogenasa (µg INTF g-1 h-1) S 4,7b ± 1,0 4,6b ± 0,8 4,8b ± 1,1 4,6b ± 1,2 4,8b ± 1,0 4,6b ± 0,9 S+OF 33,5e ± 2,5 21,2d ± 1,9 9,4c ± 1,8 4,6b ± 1,9 4,8b ± 1,3 4,5a ± 1,2 S+OB 20,4d ± 2,7 11,4c ± 2,2 7,5b ± 1,5 4,2b ± 1,0 4,4b ± 1,3 4,5b ± 1,4 S+Ox 2,5a ± 0,75 2,4a ± 0,84 2,5a ± 1,0 2,4a ± 0,66 2,5a ± 0,96 2,6a ± 0,62 S+Ox+OF 21,6d ± 1,6 13,3c ± 1,9 5,0b ± 1,6 2,3a ± 0,83 2,5a ± 1,0 2,4a ± 0,91 S+Ox+OB 16,1c ± 2,0 8,9bc ± 1,7 5,3b ± 1,4 3,2a ± 0,91 2,4a ± 0,89 2,5a ± 0,88 Actividad ureasa (µg NH4+ g-1 h-1) S 2,3b ± 0,4 2,2b ± 0,4 2,2b ± 0,4 2,3b ± 0,5 2,3b ± 0,4 2,4b ± 0,3 S+OF 2,5b ± 0,3 2,4b ± 0,2 2,3b ± 0,4 2,5b ± 0,4 2,4b ± 0,3 2,5b ± 0,5 S+OB 2,4b ± 0,5 2,5b ± 0,3 2,4b ± 0,5 2,4b ± 0,5 2,2b ± 0,3 2,3b ± 0,2 S+Ox 1,2a ± 0,3 1,1a ± 0,3 1,0a ± 0,2 0,95a ± 0,15 1,1a ± 0,2 1,1a ± 0,3 S+Ox+OF 1,4a ± 0,3 1,0a ± 0,2 1,1a ± 0,1 1,0a ± 0,2 1,2a ± 0,2 1,2a ± 0,4 S+Ox+OB 1,4a ± 0,2 1,2a ± 0,4 1,1a ± 0,2 1,0a ± 0,1 1,1a ± 0,2 1,2a ± 0,3 94 Del mismo modo, la aplicación de cada bioestimulante experimental ocasionó una significativa estimulación de la actividad deshidrogenasa (p<0,05) durante los primeros días de incubación. Así, fue a los 5 primeros días del periodo experimental cuando se observó la máxima estimulación de la actividad deshidrogenasa en los suelos enmendados con OB y OF. Con respecto al tratamiento S, la actividad deshidrogenasa aumentó un 86% para el tratamiento S+OF y un 77% para el tratamiento S+OB. Esta estimulación fue disminuyendo de forma progresiva, de tal forma que al final del periodo experimental, la actividad deshidrogenasa de los suelos enmendados orgánicamente fue similar a la obtenida para el suelo control (tabla 32). Cuando se aplicaron los dos bioestimulantes experimentales en el suelo contaminado con oxifluorfén se observó también una disminución de la actividad deshidrogenasa con respecto a los suelos enmendados orgánicamente y no contaminados (tabla 32). Sin embargo, esta inhibición fue menor con respecto a los suelos contaminados y no enmendados orgánicamente. Del mismo modo, se observa durante los primeros días de incubación cómo el tipo de bioestimulante experimental influyó de forma significativa en los valores de dicha actividad enzimática. No obstante, al final del periodo de incubación los valores de los tratamientos S+Ox+OF y S+Ox+OB fueron similares a los del tratamiento S+Ox. Al igual que la actividad deshidrogenasa, la aplicación de oxifluorfén al suelo provocó una inhibición significativa (p<0,05) de la actividad ureasa. Esta inhibición se mantuvo durante los 90 días experimentales, de tal forma que al final de dicho tiempo y comparado con el tratamiento S, la actividad ureasa significativamente (p<0,05) disminuyó un 54,2% en el tratamiento S+Ox (tabla 32). Por otro lado, y a diferencia de la actividad deshidrogenasa, la actividad ureasa no se estimuló cuando se añadieron ambos bioestimulantes, manteniendo valores muy similares a los del tratamiento S (Tabla XX). También, en los suelos contaminados con el herbicida se observaron valores de la actividad ureasa muy similares a los obtenidos para los suelos contaminados y sin enmendar orgánicamente. La tabla 33 muestra la evolución de las actividades enzimáticas β-glucosidasa y fosfatasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con oxifluorfén durante el periodo de incubación. A igual que para las dos enzimas anteriores, tanto la actividad β-glucosidasa como la actividad fosfatasa se inhibieron en los suelos contaminados por oxifluorfén. Esta inhibición se mantuvo 95 durante los 90 días de incubación. Así, comparado con el tratamiento S y al final del periodo de incubación, las actividades β-glucosidasa y fosfatasa significativamente (p<0,05) disminuyeron un 29,6 % y un 45,4% en el tratamiento S+Ox. Del mismo modo, la aplicación de los dos bioestimulantes experimentales al suelo no contaminado causó una estimulación significativa (p<0,05) de ambas actividades enzimáticas durante los 20 primeros días de incubación, alcanzando su máxima estimulación a los 5 días en donde la actividad β-glucosidasa aumentó un 73,3% y 80,8% en los tratamientos S+OF y S+OB (comparado con el tratamiento) y la actividad fosfatasa aumentó un 82,1% y 89,1% en los tratamientos S+OF y S+OB (comparado con el tratamiento) (tabla 33). Cuando se aplicaron los dos bioestimulantes experimentales en el suelo contaminado con oxifluorfén se observó también una disminución de las actividades βglucosidasa y fosfatasa con respecto a los suelos enmendados orgánicamente y no contaminados (tabla 33). Sin embargo, y al igual que para la actividad deshidrogenasa, esta inhibición fue menor con respecto a los suelos contaminados y no enmendados orgánicamente. También se observa durante los primeros días de incubación cómo el tipo de bioestimulante experimental influyó de forma significativa en los valores de dicha actividad enzimática. No obstante, al final del periodo de incubación los valores de los tratamientos S+Ox+OF y S+Ox+OB fueron similares a los del tratamiento S+Ox. La figura 24 muestra la evolución del herbicida oxifluorfén durante el periodo experimental. Como se puede observar, la concentración del herbicida fue disminuyendo de forma progresiva durante los 90 días de incubación, de tal forma que al final del periodo experimental la concentración de oxifluorfén había descendido un 45 % para el tratamiento S+Ox+OF y un 34,5 % para el tratamiento S+Ox+OB respecto al día 5 de incubación. La aplicación de los bioestimulantes en el suelo contaminado aumentó la degradación de dicho herbicida, haciendo disminuir significativamente su concentración en suelo. Sin embargo, el tipo de bioestimulante influyó en esta degradación, ya que al final de los 90 días de incubación la concentración de oxifluorfén había descendido un 34,5 % y 24,4 % en los tratamientos S+Ox+OF y S+Ox+OB respecto al tratamiento S+Ox. 96 TABLA 33: EVOLUCIÓN DE LAS ACTIVIDADES Β-GLUCOSIDASA Y FOSFATASA (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS ENMENDADOS CON LOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES Y CONTAMINADOS CON OXIFLUORFÉN DURANTE EL PERIODO DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). PNP: P-NITROFENOL. Días de incubación 5 10 20 35 55 90 Actividad β-glucosidasa (mmol PNP g-1 h-1) S 0,48b ± 0,11 0,52b ± 0,11 0,58b ± 0,17 0,53b ± 0,13 0,55b ± 0,18 0,54b ± 0,15 S+OF 1,8c ± 0,2 1,3c ± 0,2 1,0c ± 0,1 0,48b ± 0,11 0,50b ± 0,14 0,52b ± 0,18 S+OB 2,5d ± 0,3 1,9c ± 0,2 1,7c ± 0,3 0,51b ± 0,15 0,52b ± 0,10 0,54b ± 0,11 S+Ox 0,29a ± 0,06 0,34a ± 0,10 0,26a ± 0,09 0,32a ± 0,10 0,31a ± 0,08 0,38a ± 0,10 S+Ox+OF 1,2c ± 0,1 0,86b ± 0,11 0,74b ± 0,14 0,49b ± 0,11 0,48b ± 0,09 0,53b ± 0,12 S+Ox+OB 1,4c ± 0,2 1,0c ± 0,1 0,72b ± 0,12 0,46b ± 0,10 0,45ab ± 0,13 0,42ab ± 0,11 Actividad fosfatasa (µmol PNP g-1 h-1) S 3,3b ± 1,0 3,5b ± 1,2 3,4b ± 0,97 3,3b ± 1,1 3,1b± 1,0 3,3b± 1,1 S+OF 18,4d ± 2,2 8,0c ± 2,3 6,1c ± 1,8 3,3b ± 1,2 3,4b± 1,2 3,1b± 1,2 S+OB 30,3e ± 2,9 10,2c ± 2,5 5,9b ± 1,4 3,2b ± 1,0 3,2b± 0,98 3,1b± 1,1 S+Ox 1,8a ± 0,87 1,6a ± 0,59 1,7a ± 0,66 1,8a ± 0,89 1,9a± 0,49 1,8a± 0,88 S+Ox+OF 10,3c ± 1,6 8,2c ± 1,3 6,6c ± 1,5 3,7b ± 1,0 2,4a± 0,81 2,3a± 0,77 S+Ox+OB 14,7cd ± 1,8 10,0c ± 1,5 6,8c ± 1,2 3,6b ± 1,2 2,5a± 0,84 2,2a± 0,94 97 FIGURA 24: EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO EN OXIFLUORFÉN (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS NO ENMENDADOS Y ENMENDADOS CON LOS DOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). La tabla 35 muestra la evolución de la comunidad microbiana (bacterias y hongos) durante los 90 días de incubación. Cuando los bioestimulantes experimentales se aplicaron al suelo se observó una importante estimulación tanto en la población bacteriana como fúngica del suelo durante los 10 primeros días de incubación. En este sentido y comparado con el tratamiento S10, la población de bacterias Gram+ significativamente (p<0,05) aumentó un 60,2% para el tratamiento S+OF10 y un 61,1% para el tratamiento S+OB10. Del mismo modo, la población de bacterias Gramsignificativamente (p<0,05) aumentó un 61,8% para el tratamiento S+OF10 y un 62,9% para el tratamiento S+OB10, mientras que la población de hongos significativamente (p<0,05) aumentó un 41,4% para el tratamiento S+OF10 y un 43,3% para el tratamiento S+OB10. Posteriormente, la población de dichas bacterias y hongos fue disminuyendo progresivamente durante el periodo de incubación, de tal manera que al final de los 90 días, la población de bacterias y hongos era similar entre los tratamientos S, S+OF y S+OB. Cuando el herbicida oxifluorfén se aplicó al suelo, la población total de bacterias y hongos significativamente (p<0,05) disminuyó (tabla 34). Así, a los 10 primeros días de incubación y comprado con el tratamiento S10, en el tratamiento S+OX10 la 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 5 10 20 35 55 90 Oxyfluorfen (mg kg-1) S+Ox S+Ox+OF S+Ox+OB a a a a ab a ab b b ab b b b bc bb c 98 población de bacterias Gram+ significativamente (p<0,05) disminuyó un 55,6%, la población de bacterias Gramsignificativamente (p<0,05) disminuyó un 57,7% y la población fúngica disminuyó un 59,4%. Al final del periodo experimental, la población de bacterias y hongos también siguió inhibida en una proporción muy similar a los valores dados para el día 10 de incubación. Por último, la aplicación de los bioestimulantes en el suelo contaminado mostró una población microbiana del suelo muy similar a la obtenida para el suelo contaminado y sin enmendar orgánicamente (tabla 34). TABLA 34: EVOLUCIÓN DE BACTERIAS GRAM+, GRAM-, BACTERIAS TOTALES PLFAS Y HONGOS PLFAS (NG G-1) (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) PARA LOS TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES A LOS 10 Y 90 DÍAS DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). bacGram+ bacGram- Bacterias totales PLFAs Hongos PLFAs S10 14,4b ± 1,3 2,6b ±0,5 17,0b ± 1,7 1,7b ± 0,3 S+OF10 36,2c ± 2,8 6,8c ± 1,1 43,0c ± 3,7 2,9c ± 0,6 S+OV10 37,0c ± 2,0 7,0c ± 1,4 44,0c ± 3,3 3,0c ± 0,8 S+Ox10 7,9a ± 1,1 1,4a ± 0,2 9,3a ± 1,4 0,69a ± 0,10 S+Ox+OF10 20,5b ± 2,9 3,7b ± 1,1 24,2b ± 3,9 0,82a ± 0,08 S+Ox+OV10 19,7b ± 2,4 4,0b ± 1,4 23,7b ± 3,9 0,89a ± 0,14 S90 14,2b ± 1,8 2,9b ± 0,9 17,1b ± 2,6 1,8b ± 0,1 S+OF90 14,8b ± 1,3 2,6b ± 0.7 17,4b ± 1,9 1,6b ± 0,2 S+OV90 15,1b ± 1,9 2,b4± 0,5 17,5b ± 2,5 1,8b ± 0,2 S+Ox90 7,7a ± 1,2 1,3a ±0,2 8,0a ± 1,5 0,72a ± 0,09 S+Ox+OF90 8,3a ± 1,8 1,2a ± 0,4 9,5a ± 2,3 0,91a ± 0.16 S+Ox+OB90 8,9a ± 2,0 1,1a ± 0,3 10,0a ± 2,2 0,92a ± 0,11 4.5. SEGUNDA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN La tabla 36 muestra la evolución de la actividad deshidrogenasa en suelos enmendados con los bioestimulantes experimentales y contaminados con el herbicida imazamox durante el periodo de incubación. Los resultados indican que al igual que tras la contaminación con el herbicida oxifluorfén, la contaminación con imazamox causó durante todo el periodo de incubación una inhibición significativa (p<0,05) de dicha actividad enzimática. Así, al final de dicho periodo experimental la actividad deshidrogenasa significativamente (p<0,05) disminuyó un 43,2 %. Al igual que la primera experiencia de incubación, la evolución de la actividad deshidrogenasa en los suelos no contaminados tras la aplicación de los dos 105 4.6. TERCERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN Al igual que ocurre con los herbicidas anteriores, la aplicación del herbicida diurón ocasionó una disminución significativa (p<0,05) en la actividad de la deshidrogenasa del suelo a lo largo de todo el período de incubación (tabla 38). Al final de los 90 días de incubación y en comparación con el suelo no contaminado y no enmendado orgánicamente, la actividad deshidrogenasa disminuyó significativamente (p<0,05) un 42,6%. El comportamiento de los bioestimulantes experimentales fue similar al de los dos experimentos anteriores, destacan una estimulación significativa (p<0,05) de la actividad deshidrogenasa durante los primeros días de incubación. Esta estimulación disminuye de forma progresiva durante el periodo experimental, de tal forma que al final de los 90 días de incubación la actividad deshidrogenasa de los suelos enmendados orgánicamente fue similar a la obtenida para el suelo control (tabla 38). Al igual que para los dos herbicidas anteriores, cuando se aplicaron los dos bioestimulantes experimentales en el suelo contaminado con diurón se observó también una inhibición de la actividad deshidrogenasa con respecto a los suelos enmendados orgánicamente y no contaminados (tabla 38). No obstante, esta inhibición fue menor con respecto a los suelos contaminados y no enmendados orgánicamente. De la misma forma, también se observa durante los primeros días de incubación cómo el tipo de bioestimulante experimental influyó de forma significativa en los valores de dicha actividad enzimática observándose que tras los 5 primeros días de incubación y la aplicación del bioestimulante OF en el suelo contaminado presentaba una mayor estimulación de dicha actividad enzimática (31,5 %) que tras la aplicación del bioestimulante OB. Al igual que en los experimentos anteriores, al final del periodo de incubación los valores de los tratamientos S+D+OF y S+D+OB fueron similares a los del tratamiento S+D. A diferencia del comportamiento de oxifluorfén e imazamox en el suelo, tras la aplicación de diurón al suelo no enmendado no causó ningún efecto sobre la actividad ureasa. Los valores de dicha actividad enzimática para el tratamiento S fueron similares a los del tratamiento S+D durante todo el periodo de incubación (tabla 38). De la misma forma, la aplicación de los bioestimulantes experimentales no influyeron sobre los valores de la actividad ureasa con respecto al tratamiento S. 106 Igualmente, los valores de los tratamientos S+D+OF y S+D+OB tampoco sufrieron cambios a lo largo del periodo experimental con respecto al tratamiento S (tabla 38). Las actividades enzimáticas β-glucosidasa y fosfatasa tuvieron un comportamiento similar al observado para las experiencias anteriores con oxifluorfén e imazamox (tabla 39). Así, la aplicación de diurón al suelo no enmendado causó una inhibición significativa (p<0,05) de ambas enzimas durante el periodo experimental. Así, al final del periodo de incubación y comparado con el tratamiento S, las actividades β-glucosidasa y fosfatasa significativamente (p<0,05) disminuyeron un 30,4 % y un 60,6% en el tratamiento S+D. Al igual que para las dos experiencias de incubación, la aplicación de los dos bioestimulantes experimentales al suelo no contaminado causó una estimulación significativa (p<0,05) de ambas actividades enzimáticas durante los 20 primeros días de incubación, alcanzando su máxima estimulación a los 5 días en donde la actividad β-glucosidasa aumentó un 67,6% y 81,0% en los tratamientos S+OF y S+OB (comparado con el tratamiento) y la actividad fosfatasa aumentó un 82,1% y 89,1% en los tratamientos S+OF y S+OB (comparado con el tratamiento) (Tabla 39). Al aplicar diurón los dos bioestimulantes al suelo contaminado con diurón también se observó una inhibición de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa con respecto a los suelos enmendados orgánicamente y no contaminados (tabla 39). Al igual que ocurría para la actividad deshidrogenasa, esta inhibición fue menor con respecto a los suelos contaminados y no enmendados orgánicamente. También se observa durante los primeros días de incubación cómo el tipo de bioestimulante experimental influyó de forma significativa en los valores de dicha actividad enzimática. Al final del periodo de incubación los valores de los tratamientos S+D+OF y S+D+OB fueron similares a los del tratamiento S+D. La concentración de diurón en el suelo sin enmendar orgánicamente también disminuyó de forma progresiva a lo largo del periodo experimental (figura 26). La aplicación de los bioestimulantes experimentales aumentó la degradación del herbicida en suelo, de tal forma que al final de los 90 días de incubación la concentración de oxifluorfén había descendido un 77,3 % y 59,2 en los tratamientos S+D+OF y S+D+OB respecto al tratamiento S+D, poniendo de manifiesto nuevamente el comportamiento diferente de ambos bioestimulantes con el diurón. 107 TABLA 38: EVOLUCIÓN DE LAS ACTIVIDADES DESHIDROGENASA Y UREASA (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS ENMENDADOS CON LOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES Y CONTAMINADOS CON DIURÓN DURANTE EL PERIODO DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). INTF: 2-P-IODO-3-NITROPHENYL FORMAZÁN. Días de incubación 5 10 20 35 55 90 Actividad deshidrogenasa (µg INTF g-1 h-1) S 4,9b ± 1,2 4,8b ± 1,1 4,6b ± 1,3 4,9b ± 1,4 4,6b ± 0,8 4,7b ± 1,3 S+OF 32,8e ± 1,9 24,7d ± 2,2 11,3c ± 2,1 5,1b ± 1,3 4,6b ± 1,2 4,8b ± 1,6 S+OB 21,7d ± 2,2 12,0c ± 1,7 6,9c ± 0,9 4,6b ± 1,1 4,7b ± 1,1 4,7b ± 1,3 S+D 2,5a± 0,96 1,9a± 0,59 2,0a± 0,66 2,1a± 0,89 2,6a± 0,96 2,7a± 0,75 S+D+OF 25,4d± 2,4 21,4d± 2,1 9,4c± 2,0 4,4b± 1,2 4,5b± 1,9 4,2b± 1,5 S+D+OB 17,4c± 2,8 10,7c± 2,0 8,3c± 1,7 4,5b± 1,0 4,3b± 1,3 4,4b± 1,2 Actividad ureasa (µg NH4+ g-1 h-1) S 2,2a ± 0,5 2,3a ± 0,3 2,3a ± 0,5 2,1a ± 0,4 2,4a ± 0,3 2,5a ± 0,4 S+OF 2,4a ± 0,4 2,4a ±0,5 2,2a ± 0,3 2,2a ± 0,3 2,2a ± 0,4 2,4a ± 0,4 S+OB 2,4a ± 0,4 2,3a ± 0,3 2,4a ± 0,3 2,2a ± 0,4 2,3a ± 0,4 2,4a ± 0,5 S+D 2,2a ± 0,3 2,1a ± 0,3 2,3a ± 0,2 2,3a ± 0,4 2,2a ± 0,2 2,2a ± 0,4 S+D+OF 2,3a ± 0,5 2,4a ± 0,3 2,1a ± 0,3 2,2a ± 0,3 2,3a ± 0,3 2,1a ± 0,3 S+D+OB 2,2a ± 0,4 2,3a ± 0,4 2,1a ± 0,3 2,1a ± 0,4 2,1a ± 0,2 2,3a ± 0,3 108 TABLA 39: EVOLUCIÓN DE LAS ACTIVIDADES Β-GLUCOSIDASA Y FOSFATASA (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS ENMENDADOS CON LOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES Y CONTAMINADOS CON DIURÓN DURANTE EL PERIODO DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). PNP: P-NITROFENOL. Días de incubación 5 10 20 35 55 90 Actividad β-glucosidasa (mmol PNP g-1 h-1) S 0,55b ± 0,15 0,55 ± 0,12 0,53 ± 0,12 0,56 ± 0,14 0,55 ± 0,10 0,56 ± 0,13 S+OF 1,7c ± 0,3 1,1c ± 0,3 0,89b ± 0,17 0,54b ± 0,13 0,55b ± 0,15 0,56b ± 0,14 S+OB 2,9d ± 0,3 2,1c ± 0,4 1,8c ± 0,4 0,55b ± 0,10 0,56b ± 0,13 0,57b ± 0,15 S+D 0,32a ± 0,10 0,34a ± 0,09 0,37a ± 0,08 0,36a ± 0,10 0,35a ± 0,09 0,39a ± 0,10 S+D+OF 1,1c ± 0,1 0,88b ± 0,16 0,76b ± 0,14 0,57b ± 0,10 0,56b ± 0,12 0,52b ± 0,12 S+D+OB 1,3c ± 0,2 1,1c ± 0,1 0,85b ± 0,16 0,53b ± 0,12 0,52b ± 0,13 0,55b ± 0,14 Actividad fosfatasa (µmol PNP g-1 h-1) S 3,3b ± 1,0 3,5b ± 1,2 3,4b ± 0,97 3,3b ± 1,1 3,1b ± 1,0 3,3b ± 1,1 S+OF 18,4d ± 2,2 8,0c ± 2,3 6,1bc ± 1,8 3,3b ± 1,2 3,4b ± 1,2 3,1b ± 1,2 S+OB 30,3e ± 2,9 10,2c ± 2,5 5,9bc ± 1,4 3,2b ± 1,0 3,2b ± 0,98 3,1b ± 1,1 S+D 2,2ab ± 0,94 1,8a ± 0,89 1,4a ± 0,95 1,4a ± 0,88 1,5a ± 0,70 1,3a ± 0,81 S+D+OF 11,0cd ± 1,5 7,2c ± 1,5 6,2c ± 1,4 4,6b ± 1,4 3,4b ± 1,3 2,3ab ± 0,89 S+D+OB 14,5d ± 1,8 7,6c ± 1,2 6,2c ± 1,2 4,5b ± 1,1 3,3b ± 1,0 2,2ab ± 0,77 109 FIGURA 26: EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO EN DIURÓN (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) EN SUELOS NO ENMENDADOS Y ENMENDADOS CON LOS DOS BIOESTIMULANTES EXPERIMENTALES. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). Como era de esperar, y al igual que en las dos experiencias de incubación anteriores, la aplicación de los dos bioestimulantes estimuló significativamente (p<0,05) la población de bacterias y hongos del suelo durante los 10 primeros días de incubación. En este sentido y comparado con el tratamiento S10, la población de bacterias aumentó significativamente (p<0,05) un 59,1% para el tratamiento S+OF10 y un 59,2% para el tratamiento S+OB10. Del mismo modo, la población de hongos significativamente (p<0,05) aumentó un 36,7% para el tratamiento S+OF10 y un 42,4% para el tratamiento S+OB10 (tabla 40). Al igual que ocurría en las dos experiencias de incubación anteriormente comentadas, la población de bacterias y hongos del suelo disminuyó de forma progresiva durante el periodo experimental, de tal forma que al final de los 90 días de incubación, la población de bacterias y hongos era similar entre los tratamientos S, S+OF y S+OB (tabla 40). Cuando el herbicida diurón se aplicó al suelo, la población total de bacterias y hongos significativamente (p<0,05) disminuyó (tabla 40). Así, a los 10 primeros días de incubación y comparado con el tratamiento S10, en el tratamiento S+D10 la población de bacterias Gram+ significativamente (p<0,05) disminuyó un 58,2%, la población de bacterias Gramsignificativamente (p<0,05) disminuyó un 41,7% y la 110 población de hongos disminuyó un 67,4%. También, al final del periodo experimental y comparado con el tratamiento S90, en el tratamiento S+D90 la población de bacterias Gram+ significativamente (p<0,05) disminuyó un 55,1%, la población de bacterias Gramsignificativamente (p<0,05) disminuyó un 51,9% y la población de hongos disminuyó un 66,7% (tabla 40). Por último, la aplicación de los bioestimulantes en el suelo contaminado con diurón fue muy similar a la del suelo contaminado con diurón sin enmendad orgánicamente (tabla 40). TABLA 40: EVOLUCIÓN DE BACTERIAS GRAM+, GRAM-, BACTERIAS TOTALES PLFAS Y HONGOS PLFAS (NG G-1) (MEDIA ± ERROR ESTÁNDAR, N = 3) PARA LOS TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES A LOS 10 Y 90 DÍAS DE INCUBACIÓN. COLUMNAS CON LA MISMA LETRA(S) NO PRESENTAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS (P>0,05). bacGram+ bacGram- Bacterias totales PLFAs Hongos PLFAs S10 15,3b ± 1,8 2,4b ± 0,7 17,7a ± 2,3 1,9b ± 0,4 S+OF10 37,3d ± 2,3 6,0c ± 1,4 43,3d ± 3,8 3,0c ± 0,6 S+OB10 38,1d ± 2,0 6,3c ± 1,9 43,4d ± 3,7 3,3c ± 0,9 S+D10 7,7a ± 1,1 1,6a ± 0,2 9,3a ± 1,3 0,62a ± 0,10 S+D+OF10 20,7c ± 1,7 4,9b ± 1,0 25,6c ± 2,5 0,88a ± 0,14 S+D+OB10 20,5c ± 1,5 5,3c ± 1,3 25,8c ± 2,7 0,82a ± 0,17 S90 15,6b ± 1,4 2,7b ± 0,4 18,3b ± 1,6 1,8b ± 0,3 S+OF90 15,9b ± 1,6 2,6b ± 0,7 18,5b ± 2,2 2,0b ± 0,5 S+OB90 15,3b ± 1,4 2,8b ± 0,8 18,1b ± 2,1 2,0b ± 0,2 S+D90 8,9a ± 1,4 1,5a ± 0,4 10,4a ± 1,8 0,60a ± 0,08 S+D+OF90 7,9a ± 1,0 1,9a ± 0,8 9,8a ± 1,7 1,1a ± 0,3 S+D+OB90 8,1a ± 1,6 2,0a ± 0,4 10,1a ± 1,9 1,3a ± 0,4 111 5. DISCUSIÓN 112 5.1. OBTENCIÓN DE LOS NUEVOS BIOESTIMULANTES Como ya se ha comentado en el apartado de resultados, los nuevos bioestimulantes desarrollados a partir de la okara de soja presentan una gran proporción de proteínas de bajo peso molecular. La disminución de las proteínas de alto peso molecular (>10 kDa) en ambos bioestimulantes y el aumento de las proteínas de bajo peso molecular (<300 Da) nos indican que los procesos de hidrólisis se han llevado a cabo satisfactoriamente y que las proteínas que formaban parte de la okara se han hidrolizado hasta el nivel de péptidos conformados por pocos aminoácidos o, incluso, de aminoácidos libres. Se planteó en el apartado de objetivos la fabricación de dos bioestimulantes distintos a partir del mismo subproducto. El bioestimulante OB fue el resultado de un único proceso de hidrólisis, llevado a cabo por la endoproteasa subtilisina, mientras que el bioestimulante OF fue el resultado de dos procesos de hidrólisis consecutivos, llevados a cabo por la misma subtilisina y por otra enzima, la exoproteasa Flavourzyme. La proporción de péptidos menores de 300 Da es mayor en el bioestimulante OF que en el bioestimulante OB, de 68,8 ± 3,1 frente a 56,0 ± 2,5. Esto sugiere que la acción de la Flavourzyme llevada a cabo en el bioestimulante OF ha permitido un mayor grado de hidrólisis sobre las proteínas que conformaban la materia orgánica de origen. Es decir, la aplicación de dos enzimas, a efectos prácticos complementarias, ha aumentado el grado de rotura de las cadenas peptídicas, originando aminoácidos libres o cadenas conformadas por muy pocos aminoácidos. Además, lo ha hecho en mayor proporción que la hidrólisis con una única enzima llevada a cabo sobre el bioestimulante OB. El uso de enzimas sobre materia orgánica con el fin de obtener productos con capacidad bioestimulante, entre otras, surge como alternativa al empleo de bases y ácidos fuertes y elevadas temperaturas usados en procesos de hidrólisis química. Esto permite obtener productos con menores inconvenientes desde un punto de vista medioambiental y ecológico, y que además cuenta con beneficios adicionales, como el de estar permitidos en sistemas de agricultura ecológica (Ugolini et al., 2015). El uso de dos proteasas complementarias está bien establecido como proceso a aplicar sobre diversos tipos de materia orgánica. La predigestión con subtilisina, 113 en este caso, permite un aumento del número de sitios N-terminales sobre las que la Flavourzyme puede actuar, aumentado el grado de hidrólisis y produciendo un producto distinto. Algunos autores apuntan, además, que el uso de dos enzimas combinadas permite un ahorro económico en la producción de hidrolizados enzimáticos (Villanueva et al., 1999a, 1999b; Vioque, et al., 1999) y otros beneficios adicionales como la reducción de la capacidad alergénica de los productos (Clemente et al., 1999). En el trabajo de Orts et al. (2017) se usa una única enzima con el fin de obtener un hidrolizado con capacidad biorremediadora en suelos. En este caso, la enzima utilizada fue también la endoproteasa subtilisina procedente de Bacillus licheniformis. La distribución de los productos obtenidos en este trabajo es menos uniforme, con un elevado contenido en péptidos entre 10 kDa y 5 kDa (23.5 ± 2.8) y prácticamente el resto del contenido proteico situado en tamaños menores a 300 Da (75.7 ± 10.6). Es decir, con un único proceso de hidrólisis, se consigue una proporción mayor de péptidos menores de 300 Da. Sin embargo, y aunque es tentativa la comparación, es posible que las diferencias en cuanto a la calidad del material de partida (distintos procesos de deshidratación e hidratación del material en origen) hayan sido las responsables de la diferencia en las proporciones entre el producto referido y los obtenidos en este trabajo. Por otro lado, debe recordarse que, en este trabajo, la hidrólisis con subtilisina se permitió durante 20 horas en total (Orts et al., 2017). Así pues, la comparación más válida es la que puede realizarse entre los productos aquí obtenidos pues proceden estrictamente del mismo material de partida. Como ya se ha mencionado, el uso de una segunda hidrólisis desplaza la proporción de péptidos hacia cadenas de menor tamaño. El efecto que tiene esta diferencia sobre las actividades biológicas del suelo se analizará más adelante. 5.2. EFECTO DE LOS BIOESTIMULANTES SOBRE LAS PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL SUELO. A lo largo de las tres experiencias de incubación se puede comprobar el efecto positivo de los bioestimulantes (OB y OF) sobre las diversas actividades enzimáticas y sobre la comunidad microbiana de los suelos enmendados. 114 Las enzimas del suelo pueden encontrarse de forma libre, fijadas al suelo (enzimas extracelulares no libres) o pueden ser intracelulares. Los procesos bioquímicos de reciclado de nutrientes y biodegradación de xenobióticos están mediados, en gran parte, por la acción de estas enzimas, que pueden pertenecer a los microorganismos del suelo, a las plantas y su rizosfera o a animales. Su estudio, por tanto, constituye una importante forma de medir la actividad de los microorganismos y su potencial actividad en los procesos mencionados (Burns, 1982). La actividad deshidrogenasa ha sido ampliamente utilizada como un indicador biológico de la calidad del suelo, al estar bien establecida la relación que existe entre esta y la actividad biológica y a su alto grado de especificidad por su sustrato (García et al., 1997a). La deshidrogenasa es una enzima intracelular y, en consecuencia, está presente en todas los microorganismos viables y no dañados (García et al., 1993). Esta actividad muestra un aumento significativo tras la aplicación de los bioestimulantes durante los días 5, 10 y 20 desde el inicio de las experiencias de incubación. Esto indica que los bioestimulantes están actuando como una fuente extra de carbono y otros nutrientes y mejorando el estado nutricional del suelo, con las correspondientes consecuencias positivas sobre la comunidad microbiana. Este efecto desaparece en las consecutivas tomas de muestra (días 35, 55 y 90) debido al rápido consumo de los recursos por parte de los microorganismos (principalmente, por parte de las bacterias). La bioestimulación de la actividad deshidrogenasa fue mayor en el caso de los suelos enmendados con el hidrolizado OF. Teniendo en cuenta que los dos bioestimulantes proceden de la misma materia orgánica, el motivo de su diferente efecto sobre las poblaciones y actividades enzimáticas debe estar en el segundo proceso enzimático al que se ha sometido al bioestimulante OF. Este segundo proceso enzimático, como se ha apuntado anteriormente, ha aumentado la proporción de péptidos de bajo peso molecular (300 Da) y aminoácidos libres en el producto final, frente al hidrolizado OB. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Tejada et al., (2013). En el trabajo de estos autores, se aplican bioestimulantes hidrolizados procedentes de lodos de depuradora y con diverso perfil de tamaños moleculares. Las diferencias 121 pronunciado desde el inicio del experimento (día 5 de muestreo) y duradero hasta el último día de muestreo (día 90). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros autores como García-Orenes et al. (2010), Gómez et al. (2014) y Franco- Andreu et al. (2016). La actividad deshidrogenasa es un buen medidor de la calidad del suelo por su rápida respuesta a cambios ambientales. Está relacionada con la degradación inicial de la materia orgánica (Bolton et al., 1985). Más que con las enzimas libres presentes en la matriz el suelo, la actividad deshidrogenasa parece estar más relacionada con el estado metabólico general del suelo, así como con la actividad de la población general (Ross, 1970). La deshidrogenasa del suelo es una enzima intracelular asociada con los procesos de respiración microbianos del suelo. Además de este hecho, tiene otras ventajas como indicador de cambios en la calidad del suelo, como su correlación con otros índices de actividad microbiana del suelo, como la respiración basal y la biomasa de carbono (García et al., 1997a). La reducción de esta actividad puede indicar una incapacidad por parte de la microbiota nativa del suelo, o por la mayoría de esta, de usar el herbicida como fuente de carbono, además del efecto tóxico que pueda producir (García-Orenes et al., 2010). Saha et al. (2015), además, apuntan a que el grupo NO2─ del oxifluorfén puede actuar como aceptor de electrones alternativo, afectando todavía más a la disminución de la actividad deshidrogenasa. Este efecto puede estar presente en el trabajo aquí presentado, pero en otras publicaciones en las que la única enzima inhibida es la deshidrogenasa, puede ser el principal responsable de esta inhibición (Shukla, 1997). Las actividades ureasa, fosfatasa y β-glucosidasa son buenos indicadores de los cambios en la fertilizad del suelo; las tres son hidrolasas encargadas del reciclado de los nutrientes N, P y C y su retorno a la biota del suelo. La inhibición de estas enzimas por parte del oxifluorfén indica una reducción, por tanto, de la fertilidad y de la capacidad de reciclado de nutrientes del suelo. Respecto a la actividad ureasa, se observa una inhibición persistente de esta enzima desde el inicio hasta el final de la experiencia de incubación. La activación de la actividad ureasa está relacionada con adiciones de materia orgánica compleja (Goyal et al., 1999); la ausencia de activación e inhibición puede relacionarse con una estabilidad de las condiciones experimentales o con la adición de materias 122 orgánicas ricas en compuestos nitrogenados no complejos (García-Orenes et al., 2010; Tejada et al., 2013; Gómez et al., 2014). En este caso, al no haber un aporte de materia orgánica de ningún tipo, si no de un herbicida de comprobado efecto tóxico sobre la población microbiana, la disminución e inactivación de la población tiene como consecuencia una disminución de la actividad ureasa. En lo que respecta a las actividades fosfatasa y β-glucosidasa, se observan efectos y tendencias similares a las recogidas en el caso de las actividades deshidrogenasa y ureasa. El oxifluorfén causa un efecto tóxico desde su aplicación y mantenido en el tiempo hasta el final de la experiencia de incubación. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Gómez et al. (2014) y Rodríguez- Morgado et al. (2014), en los que se observa una inhibición de las actividades enzimáticas mencionadas desde el inicio de los diversos experimentos hasta el final de los mismos (120 días en estos casos). Sobre las poblaciones de bacterias y hongos, gracias al análisis de los PLFAs, se puede observar una disminución de las bacterias Gram+, Gram─, totales y hongos en las muestras tomadas el día 10 y contaminadas con oxifluorfén. Esto, unido a la inhibición de ciertas actividades enzimáticas, ayuda a confirmar el efecto tóxico del herbicida sobre las poblaciones microbianas. Respecto a al segundo análisis de PLFAs, el del día 90, se observa que los valores del suelo contaminado se mantienen similares a los del inicio del tratamiento (S+Ox10) y que no se aproximan a los valores del suelo no contaminado, ni al principio ni al final de la experiencia. Esto indica que el herbicida resulta tóxico incluso a las bajas concentraciones que se registran al final de la experiencia, en otras palabras, se puede confirmar la persistencia del oxifluorfén y la elevada toxicidad sobre las comunidades microbianas del suelo incluso a bajas concentraciones. Tanto los valores como las tendencias encontrados concuerdan con los obtenidos por Rodríguez-Morgado et al., (2014), respecto al suelo control y al contaminado. Sí es cierto, sin embargo, que se encuentra mayor abundancia relativa de bacterias Gram─ en los suelos del presente trabajo que en la referencia citada. La disminución de las poblaciones bacterianas puede estar relacionada con la disminución de la actividad bacteriana de dos formas. Según Renella et al., (2005), el cambio de las propiedades biológicas del suelo puede deberse tanto a una 123 inactivación de las enzimas extracelulares por parte de los xenobióticos, como a una menor secreción de estas desde los microorganismos. 5.4.2. CAPACIDAD BIORREMEDIADORA DE LOS BIOESTIMULANTES Como ya se ha visto, el efecto de la aplicación de ambos BS fue positivo sobre la actividad deshidrogenasa. La aplicación de oxifluorfén sobre suelo enmendado orgánicamente fue, al igual que en el suelo control, de disminución de la actividad enzimática, sin embargo, la inhibición fue menor en suelos enmendados. Desde el día 35 de muestreo y hasta el final del periodo experimental, los tratamientos S+Ox+OF y S+Ox+OB tienden a igualarse con el tratamiento S+Ox y los valores nunca llegan a los niveles del suelo control, S (tabla 32). En este sentido, estamos ante dos fenómenos: por un lado, la persistencia del herbicida impide que la actividad del suelo llegue a los niveles del suelo no contaminado. Algunos autores informan también de una elevada persistencia del herbicida oxifluorfén: Ying & Williams (2000) cifran la persistencia del oxifluorfén en 119 días y además hacen hincapié en la alta capacidad de este para adsorberse a las partículas del suelo, así como en la gran cantidad de factores que intervienen en la degradación del oxifluorfén. Por otro lado, el efecto de los BS es máximo en los primeros muestreos (5 días) y va disminuyendo hasta un momento entre los 20 y los 35 días, en los que puede considerarse que su efecto se ha disipado por consumo de los recursos por parte de la microbiota del suelo. Se observa una tendencia similar en el trabajo de Gómez et al. (2014), en el que el efecto de las enmiendas orgánicas es máximo entre el día 10 y el 20, y comienza a disiparse después de este punto. El efecto inhibitorio del oxifluorfén fue menor en los suelos enmendados con el bioestimulante OF que en los enmendados con el BS OB, en los dos primeros muestreos (días 5 y 10). Esto no se observa en el caso de la fosfatasa y de la βglucosidasa. En estas actividades, se observa una mayor actividad inicial para los suelos contaminados tratados con el BS OB. Esta diferencia puede deberse al mayor gasto energético que deben realizar los microorganismos para extraer los recursos del BS OB, de más difícil acceso que en el caso del BS OF (Meidute et al., 2008). Tejada et al., (2013) desarrollan diversos bioestimulantes que se distinguen, entre otros, por el tamaño molecular de las proteínas y péptidos que los constituyen. 124 En el presente trabajo los bioestimulantes desarrollados difieren, como ya se ha mencionado, en el mayor contenido en péptidos de bajo peso molecular (< 300 Da) de OF frente a OB, si bien ambos cuentan con un contenido relativamente elevado de estos. El alto contenido en proteínas de bajo peso molecular permite una disponibilidad mayor y más rápida del N por parte de los microorganismos del suelo (y, por extensión, de otros organismos como las plantas). Esto puede explicar la elevada actividad deshidrogenasa de los primeros días de muestreo, especialmente si se compara esta con los valores obtenidos en Orts et al. (2017), donde la actividad deshidrogenasa del suelo tratado con okara puro (mayor proporción de péptidos de elevado peso molecular) es solo ligeramente superior a la del suelo control del presente trabajo. Estas diferencias cualitativas en los bioestimulantes son las responsables de la mayor inhibición de la toxicidad del herbicida en los suelos enmendados con OF, respecto a los tratados con OB. El uso de los bioestimulantes, además, permite un aumento de la población microbiana en general, pero cuando se añade el herbicida a los suelos enmendados solo los microorganismos resistentes se ven favorecidos, permitiendo una selección positiva de estos y colaborando en la degradación del compuesto xenobiótico (Eichner et al., 1999; Van Der Meer, 2006). La fosfatasa es una enzima extracelular producida por muchos microorganismos del suelo que es responsable de la mineralización del fósforo en dicho ambiente, es decir, de la hidrólisis de los compuestos del fósforo a fósforo inorgánico (Hussain et al., 2009). Los valores de la actividad fosfatasa son similares a los valores recogidos por Rodríguez-Morgado et al. (2014), en sus ensayos con suelo contaminado con oxifluorfén y enmendado con bioestimulantes procedentes de plumas de pollo y lodos de depuradora; o los de Gómez et al. (2014), con ensayos en suelo contaminado con oxifluorfén y enmendado con materia orgánica procedente de diferentes fuentes (salvado de arroz, residuos sólidos urbanos y estiércol de oveja). Los productos de hidrólisis de la β-glucosidasa son una importante fuente de carbono para los microorganismos del suelo; cataliza la hidrólisis de disacáridos a β-glucósidos (Eivazi & Tabatabai, 1988; Hussain et al., 2009). La inhibición de la actividad β-glucosidasa también fue menor cuando se aplicaron enmiendas orgánicas al suelo contaminado, en concordancia con trabajos realizados con 125 bioestimulantes procedentes de materias orgánicas similares (Orts et al., 2017) y a los ensayos de Rodríguez-Morgado et al. (2014) y Gómez et al. (2014) citados con anterioridad. Respecto a la ureasa, no se encuentra una disminución de la inhibición causada por el oxifluorfén al aplicar los bioestimulantes. La actividad no fue estimulada tras la adición de los bioestimulantes en ningún caso. No hubo diferencias entre el final y el inicio del experimento. El elevado grado de hidrólisis, responsable del alto contenido en péptidos de bajo peso molecular, puede ser también responsable de la ausencia de estimulación de actividad ureasa. No hay necesidad por parte de los microorganismos del suelo de excretar enzimas para digerir compuestos nitrogenados, ya que los bioestimulantes ya aportan estos compuestos fácilmente asimilables en forma de aminoácidos libres o de cadenas peptídicas de corta extensión (García-Orenes et al., 2010; Gómez et al., 2014; Tejada et al., 2013). Los suelos enmendados con materias orgánicas más ricas en péptidos de elevado peso molecular sí que muestran aumentos de la actividad ureasa pasado un tiempo tras la aplicación, como puede ser el caso de los estudios de Tejada et al., (2011) o de Gómez et al., (2014). En general, la actividad ureasa está relacionada con la acumulación de materia orgánica en el suelo (Goyal et al., 1999). La aplicación de las materias orgánicas hidrolizadas en este trabajo produjo un efecto positivo y estadísticamente significativo sobre los grupos estudiados (bacterias Gram+, Gram, totales y hongos) respecto a los suelos contaminados y no enmendados. Este efecto fue más acusado en el caso de las bacterias Gram+ y menor en el caso de los hongos. Los valores de los suelos enmendados y contaminados quedan incluso por encima de los valores de suelo control (no de forma significativa), cuando se habla de la primera toma de muestra (día 10). Este efecto desaparece en el día 90, en el que los PLFAs analizados toman valores similares a los del suelo contaminado y no enmendado del día 10. Esto es un signo de que el efecto positivo de la materia orgánica hidrolizada es pasajero y solo se da a corto plazo. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por Rodríguez- Morgado et al., (2014) en suelo contaminado con el mismo herbicida y enmendado con hidrolizados procedentes de plumas de pollo o lodos de depuradora. De forma similar, al principio del experimento la estimulación fue notable, mientras que, al 126 final, los valores coincidían con los de un suelo contaminado con oxifluorfén. Esto indica una elevada persistencia y efecto tóxico del oxifluorfén. Los resultados también concuerdan con los obtenidos por Gómez et al. (2014), en cuyo trabajo la estimulación de las poblaciones estudiadas fue mayor cuando se usaron enmiendas orgánicas con elevada proporción de péptidos de bajo peso molecular. 5.4.3. Evolución del oxifluorfén en el suelo La cantidad de oxifluorfén al final del experimento en los suelos no enmendados cae hasta casi la prácticamente la mitad de la cantidad medida en el día 5. Esto indica una vida media de aproximadamente 90 días, en concordancia solo con algunos de los trabajos consultados, como se verá a continuación. La cantidad de herbicida presente al final del experimento es menor para los suelos enmendados con los hidrolizados y, además, la cantidad final es menor en los suelos tratados con OF que con OB. Esto hace pensar que el efecto positivo de los bioestimulantes se traduce en una mayor degradación por parte de los microorganismos y que este es más acusado en el bioestimulante con mayor proporción de péptidos de bajo peso molecular. Algunos autores muestran una alta persistencia del oxifluorfén en suelos. Baruah y Mishra (1986) informan de una vida media de 72 a 160 días. Ying y Williams (2000) establecen la vida media del herbicida en 119 días en viñedos plantados sobre un suelo tipo haploxeralf. Distintos autores encuentran vidas medias muy inferiores en suelos muy distintos. Das et al. (2003) informan de una vida media de 12 días en suelos plantados con arroz, en concordancia con otros autores, como Walker et al. (1988), que citan la vida media en 16 días sobre sedimento procedente de estuario. Dada la importancia de la actividad microbiana en la degradación de herbicidas, Das et al. (2003) informan de la importante actividad de los microorganismos de la rizosfera como principales responsables de la actividad degradativa de este y otros herbicidas, como el oxadiazón. Las enormes diferencias experimentales (suelo arcilloso aluvial, Fluvaquent típico) hacen difícil comparar estos estudios, pero resulta interesante comprobar que, pese a la corta vida media en comparación, se observa persistencia del herbicida a los 60 días del inicio del trabajo citado. 127 Ying y Williams (2000) destacan la diferencia entre la elevada vida del oxifluorfén que detectan (119 días) frente a la de otros manuales de referencia (Humburg et al., 1989), que la establecen en 30 – 40 días. Explican esta diferencia basándose en que, en suelo, el herbicida es poco sensible a la degradación por microorganismos, así como a hidrólisis en rangos de pH de 5 – 9. Esta resistencia a la degradación, unida a su fuerte adsorción a partículas del suelo, lo hacen especialmente persistente. Por otro lado, se observa un aumento de la velocidad de degradación del oxifluorfén en los suelos enmendados respecto a la degradación en los suelos control. Este incremento puede relacionarse con el aumento observado en las poblaciones bacterianas. Dicho aumento es especialmente relevante al inicio de los tratamientos, coincidiendo con los periodos de estimulación de las actividades enzimáticas analizadas (excepto la ureasa). Los resultados obtenidos concuerdan con los de Rodríguez-Morgado et al. (2014). En sus ensayos se encuentra un aumento de la velocidad de degradación del mismo herbicida cuando las muestras de suelo son tratadas con bioestimulantes hidrolizados procedentes de diversas fuentes de materia orgánica. Además, el efecto biorremediador del primero fue mayor, coincidiendo con una elevada proporción de péptidos bajo tamaño molecular frente al segundo (64,0 ± 3,6 % de péptidos < 300 Da, frente a 34,0 ± 3,1 % de péptidos < 300 Da). 5.5. IMAZAMOX 5.5.1. EFECTO DEL IMAZAMOX SOBRE LAS PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL SUELO La principal vía de degradación para el imazamox es la fotólisis y la degradación mediante microorganismos en suelos aeróbicos. La degradación en ambiente acuático o en condiciones anaeróbicas es escasa. No se informa de problemas de bioacumulación. Estudios de laboratorio confirman su alto potencial como lixiviado, aunque ensayos de campo parecen indicar que no hay problemas más allá de los primeros 45 cm de suelo (Cessna et al., 2012; Cabrera et al., 2016). Respecto al efecto del imazamox sobre las actividades enzimáticas, se observa un efecto muy similar al comentado en el caso del oxifluorfén. La inhibición de la actividad deshidrogenasa, fosfatasa, β-glucosidasa y ureasa corrobora el efecto tóxico del herbicida sobre los microorganismos del suelo. Sobre la actividad 128 deshidrogenasa, el efecto del imazamox se mantiene desde la primera toma de muestra hasta el final del experimento. Lo mismo ocurre en el caso de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa. Los trabajos sobre el efecto de imazamox en las actividades enzimáticas son escasos, pero sí se encuentran datos del efecto de otras imidazolinonas, como el imazetapir. Otros trabajos confirman el efecto tóxico del herbicida a través de la medición de otros parámetros, como el contenido en carbono microbiano (Vischetti et al., 2002). Perucci et al. (2000) no observan efecto sobre la actividad fosfatasa del imazetapir cuando éste es aplicado a tasa de campo (50 g ha─1), pero sí que observan un efecto cuando el herbicida se aplica a diez veces esta tasa. El efecto fue el de la estimulación de la actividad, pero los autores advierten que tomar este hecho como un efecto positivo puede no resultar correcto, ya que la fosfatasa alcalina no solo está involucrada en la toma de fosfato del medio, sino que también tiene un papel en la división celular y la transducción de señales (Riccio et al., 1997); además, su síntesis también puede ser posible en condiciones en las que el crecimiento no lo sea (Özkanca y Flint, 1997). La conclusión de este estudio es que el imazetapir resulta tóxico sobre la comunidad microbiana (Perucci et al., 2000). En un experimento anterior de los mismos autores (Perucci y Scarponi, 1994), el mismo herbicida (imazetapir) inhibió la actividad deshidrogenasa del suelo cuando se aplicó a 10 y 100 veces el nivel normal de aplicación. Esto refuerza la idea de que las imidazolinonas pueden afectar, en general, a la población microbiana del suelo, especialmente cuando se acumulan o cuando se aplican por encima del nivel recomendado. La deshidrogenasa del suelo es un buen indicador de la actividad del sistema redox microbiano y puede ser considerada un indicador de la actividad oxidativa del suelo (Rossel et al., 1992). Una inhibición de esta indica una menor actividad microbiana, lo que apunta al efecto tóxico de las imidazolinonas. Hay que destacar, como se ha visto en el apartado de resultados, que la actividad ureasa aumenta según lo hace el tiempo en los tratamientos contaminados con el herbicida imazamox (figura 18). Es posible que el efecto tóxico del imazamox haya provocado un cambio en la comunidad de bacterias y hongos, de manera que han proliferado microorganismos capaces de usarlo como fuente de carbono; es 129 decir, se estaría hablando de un proceso de selección positiva. Dado un cambio en el ambiente, es fácil pensar que este puede afectar positivamente a ciertos grupos de microorganismos concretos de entre la enorme biodiversidad que puede albergar el suelo (Van Der Meer, 2006). Sin embargo, de ser así, debería observarse un repunte análogo en el resto de actividades enzimáticas, cosa que puede observarse solo ligeramente, así que esta afirmación debe tomarse con precaución. Sannino y Gianfreda (2001) encuentra una situación similar, en la que la actividad ureasa se ve incrementada cuando el suelo está contaminado con el herbicida glifosato. En esta situación, además, se encontró también que la actividad invertasa se vio incrementada a la vez que la actividad fosfatasa se vio inhibida. Otras moléculas que han demostrado aumentar la actividad ureasa son los fungicidas carbendazima y validamicina. En el caso de la validamicina, esto ocurre poco después de la aplicación y la actividad puede mantenerse elevada durante cierto tiempo (hasta 35 días, dependiendo de la dosis) (Qian et al., 2007). En este caso, la activación ocurre mientras está presente el fungicida, de manera que los autores apuntan a que esta o alguno de sus productos de degradación están actuando como fuentes de carbono, siguiendo un comportamiento muy distinto al planteado aquí. La carbendazima ha demostrado afectar positivamente a la actividad ureasa, en solitario o en combinación con otros compuestos (Yan et al., 2011). De nuevo, se observa que el efecto de este fungicida tiene lugar tras su aplicación y que disminuye con el tiempo, según se consume el aporte de carbendazima, que funciona como fuente de carbono. Dadas las diferencias entre las distintas evoluciones, resulta difícil pensar que el motivo de la activación tardía de la actividad ureasa en el caso del imazamox es que este o sus productos derivados estén funcionando como fuente de carbono. La causa más probable del repunte de las actividades enzimáticas, especialmente de la ureasa, es, por tanto, que los niveles de imazamox hayan alcanzado un punto tan bajo que no resulten tóxicos (o lo hagan en menor medida). En cuanto al análisis de PLFAs, se observa una acusada disminución (>50%) en la primera toma de muestra de los correspondientes a los grupos estudiados. Esto apoya la idea del efecto tóxico de esta imidazolinona sobre los microorganismos del suelo. Algunos autores relacionan la toxicidad de las imidazolinonas con la presencia 130 de grupos que se encuentran en la molécula de imazamox, como OH y OCH3 (Desai et al., 2009). En la toma de muestras del día 90 (S+I90) no se observa recuperación de las poblaciones, salvo en el caso de las poblaciones de bacterias Gram+, que no resultan significativamente diferentes de los controles (S10 y S90), pero tampoco de los suelos tratados con imazamox (S+I10), obteniéndose un resultado intermedio. El hecho de que el resto de poblaciones de microorganismos estudiadas no se recuperen también indica que el herbicida o sus moléculas derivadas pueden seguir resultando ligeramente tóxicos a los niveles presentes. Es interesante encontrar un efecto negativo del imazamox sobre las comunidades fúngicas del suelo puesto que estudios previos informaban de un aumento en el número de hongos en suelos forestales tratados con el mismo herbicida (Vasic et al., 2019). 5.5.2. CAPACIDAD BIORREMEDIADORA DE LOS BIOESTIMULANTES Como se ha comentado, el efecto de la aplicación de los dos bioestimulantes en la actividad deshidrogenasa fue positivo. La aplicación del imazamox sobre suelo enmendado con los BS (S+I+OF y S+I+OB) fue, al igual que con el control, negativo, dándose una inhibición de la actividad deshidrogenasa. Sin embargo, la inhibición de esta actividad fue menor en suelos enmendados que en los no enmendados. Al igual que en la primera experiencia de incubación, el efecto de los bioestimulantes es máximo en la primera toma de muestra (día 5) y disminuye progresivamente hasta que tiende a igualarse al tratamiento S+I. La falta de diferencia significativa entre los valores finales de los tres tratamientos mencionados puede atribuirse al efecto residual del herbicida imazamox, aunque, como ya se ha visto, existe un repunte en la actividad deshidrogenasa hacia el final del experimento que apunta a que los niveles del herbicida son los suficientemente bajos como para que su toxicidad sea menor. La disminución progresiva inicial de la actividad deshidrogenasa puede atribuirse, por otro lado, al agotamiento por parte de los microorganismos del aporte de nutrientes extra que significaban los bioestimulantes. El efecto inhibitorio del imazamox fue menor en los suelos enmendados con el bioestimulante OF que en los suelos a los que se aplicó el bioestimulante OB. Esto puede apreciarse en la actividad deshidrogenasa de S+I+OF de los días 5 y 10