Efecto antiinflamatorio de la oleuropeína en células SW982

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! TATIANA%MONTOYA%GARCÍA% UNIVERSIDAD%DE%SEVILLA% FACULTAD%DE%FARMACIA% EFECTO& ANTIINFLAMATORIO& DE& LA& OLEUROPEÍNA& EN& CÉLULAS&SW982& ! Facul ad!de!Fa macia! Depa amen o!de!Fa macología! Uni e sidad!de!Se illa! ! ! T abajo'Fin'de'G ado'Expe imen al' G ado'en'Fa macia' ! ! ! EFECTO'ANTIINFLAMATORIO'DE'LA' OLEUROPEÍNA'EN'CÉLULAS'SW982' ' ' ' Realizado'po :'Ta iana'Mon oya'Ga cía.' Di igido'po :'Ca alina'Ala cón'de'la'Las a'Rome o.'Ca ed á ica'de' Fa macología.' ! Facul ad'de'Fa macia,'Se illa.' 7'de'julio'de'2016' ! ! 1! RESUMEN' In oducción:'La# a i is# euma oide# (AR)# es# una# en e medad# in lama o ia# sis émica# c ónica#de#e iología#au oinmune#ca ac e izada#po #una#sino i is#e osi a#en#la#cual#el# ejido#de# g anulación# de# o igen# sino ial# (pannus),# in ade# y# e osiona# el# ca ílago# y# el# hueso# de# las# a iculaciones#dia odiales.#Los# ib obals os#sino iales#(FS)#o#sino ioci os#de# ipo# ib oblás ico# juegan#un#papel# undamen al#en#la#pe sis encia#de#la#in lamación#c ónica#y#en#el#daño#a icula ,# siendo#unas#de#las#poblaciones#celula es#más#abundan es#del#pannus.#' La#oleu opeína#(OLE)#es#un#secoi idoide,#componen e# enólico#mayo i a io#de#la#pulpa#del# u o# y# hojas# de# Olea+ eu opaea+ L.#y,#que#a# su# ez,# se# encuen a# en# el# acei e# de# oli a.# Se# han# documen ado# di e sas# ac i idades# a macológicas# del# ci ado# secoi idoide,# en e# las# que# se# des aca#la# an ioxidan e# y# an iin lama o ia.# No# obs an e#no# exis en,# has a# la# echa,# es udios# expe imen ales#en# ib oblas os#humanos#que# aliden#su#po encial#an i eumá ico,#así#como#los# mecanismos#bioquímicos#y#molecula es#implicados.## Obje i os:'Es e#es udio#p e ende#e alua #el#e ec o#an iin lama o io#de#OLE#en#la#línea# celula #SW982#inducida#con#IL-1β,#median e#el#análisis#de#la#p oducción#de#la#p oducción#de# mediado es#p o-in lama o ios,#así#como,#las# ías#de#señalización#in oluc adas.# Ma e iales'y'mé odos:'Las#células#SW982# ue on#cul i adas#en#DMEM#y#es imuladas# con# IL-1β#(5# ng/mL)# en#p esencia#o#ausencia#de# OLE#(50# y# 100# μM).#La# iabilidad#celula #se# de e minó# median e# # un# ensayo# con# sul o odamina# B# (SRB).# Los# ni eles# de# TNF-α# e# IL-6## ue on#e aluados#po #la# écnica#ELISA.#La#exp esión#de#las#p o eínas#in lama o ias#COX-2#y#m- PGES-1#y,#es udio#de#las# ías#de#señalización#celula # ue on#lle ados#a#cabo#median e#Wes e n# blo .# Resul ados:#El# a amien o#con#OLE# edujo#signi ica i amen e#los#ni eles#de#IL-6#y#TNF- α,# y# además# disminuyó# la#sob eexp esión# de# COX-2# y# m-PGES-1.# Es e# compues o# a# las# concen aciones# ensayadas# ue#capaz,# además,# de# modula # la# ac i ación# de# JNK# y# p38,# impidiendo#su# os o ilación.# Conclusión:'OLE# educe#la#p oducción#de#ci ocinas#p o-in lama o ias#IL-6#y#TNF-α#y#la# exp esión#p o eíca#de#COX-2#y#m-PGES-1,#posiblemen e#a# a és#de#la#inhibición#de#la# ía#de# señalización#de#MAPK:#PJNK#y#p38,#en# ib oblas os#sino iales#humanos#SW982#es imulados#con# IL-1β.# PALABRAS'CLAVE:'Oleu opeína'–'in lamación'–' ib oblas o'sino ial'–'SW982' ! ! 2! ÍNDICE' I. INTRODUCCIÓN'Y'ANTENCEDENTES'DEL'TEMA……………………..3' § Oleu opeína' § Ac i idad1 a macológica1de1la1oleu opeína' ' II. JUSTIFICACIÓN'Y'OBJETIVOS…………………………………………………17' ' III. METODOLOGÍA…………………………………………………………………….18' § Oleu opeína:1Ex acción1y1ca ac e ización1química' § Cul i o1celula ' § Viabilidad1celula 1 § De e minación1de1ci ocinas:1IL-61y1TNF-α1 § De e minación1de1la1exp esión1p o eíca1 § E aluación1es adís ica1de1los1 esul ados1 1 IV. RESULTADOS………………………………………………………………………..231 § E ec os1de1la1oleu opeína1en1la1 iabilidad1celula 1 § E ec os1de1la1oleu opeína1en1la1p oducción1de1ci ocinas1p o-in lama o ias1 In e leucina-61 (IL-6)1 y1 Fac o 1 de1 Nec osis1 Tumo al1 α1 (TNF-α)1 en1 células1 SW9821 § E ec os1de1la1oleu opeína1sob e1la1exp esión1de1Ciclooxigenasa-21(COX-2)1y1 P os aglandina1E1Sin asa111mic osomal1(m-PGES-1)1en1células1SW9821 § Es udio1de1 ías1de1señalización1 1 V. DISCUSIÓN………………………………………………………………….………281 1 VI. CONCLUSIONES…......………………………..………………….....…….....301 1 VII. ABREVIATURAS'Y'SIGLAS……………………………………….…………….311 1 VIII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..321 1 ' ! 3! INTRODUCCIÓN*Y*ANTECEDENTES*DEL*TEMA* I. OLEUROPEÍNA* A. Ca ac e ís icas*químicas*y*dis ibución*en*la*na u aleza! La!oleu opeína!(OLE)!es!un!glucósido!secoi idoide!es e i icado!con!un!alcohol! enilp opanoide.! En! conc e o! es a! sus ancia! es a! cons i uida! po ! la! unión! de! es! moléculas:! hid oxi i osol,! glucosa!y!ácido!enólico.!Químicamen e!se!conoce!como!un!és e !del!oleósido-11-me il-és e ! (ácido!elenólico!glucosado)!con!el!3,4-dihid oxi enile anol!ó!3,4-DHPEA!(Figu a'1).! ! ! Figu a'1:'Es uc u a'química'de'la'oleu opeína.' OLE!es!abundan e!en!las! amilias'Gen inaceae,'Co naleae,'Oleaceae.!En!es a!úl ima! amilia,!el! secoi idoide!se!puede!encon a !y!aisla !de!nume osos!géne os,!y!ha!sido!desc i a!en!F axinus' ame icana' L.,' F.' excelsio ' L.,' F.' chinenis' Roxb.,'(Sanz' y' cols.,' 2012)' Sy inga' pubescens' Tu cz.(Deng!y! cols.,'2010),! S.' josikaea' J.Jacq.!ex! Rchb.,' S.' ulga is' L.,! S.' e icula a' (Blume)' H.Ha a.,'(Bi'y'cols.,'2011),!Ligus um'lucidum'Ai .'(Guo'y'cols.,'2011),'L.' ulga e'L.,'L.'o ali olim' Hassk.,'Phily ea'la i olia'L.,'en e!o as!(Sole -Ri as,'2000).!Sin!emba go,!la!más!comúnmen e! conocida!es!la!Olea'eu opaea'L.'(que!da!nomb e!al!glicósido),!siendo!el!componen e! enólico! mayo i a io!de!la!pulpa!de!las!acei unas! e des,!aunque! ambién!las!hojas!del!oli o!con ienen! OLE!como!componen e!p incipal;!asimismo,!se!puede!encon a !en!el!acei e!de!oli a! i gen! ex a!(AOVE),!al!que!da!su!sabo !ama go.! La! u a!del!ácido!me alónico!es!la! esponsable!de!la!sín esis!de!!los!secoi idoides!!oleósidos! como!OLE.!Es as! u as!me abólicas!son!complejas!y!se!pueden! e se!a ec adas!po !nume osas! a iables! ales! como! la! a iedad! del! u o,! las! condiciones! del! c ecimien o! y! el! es és! ambien al,!en e!!o os!(Ryan'y'cols.,'2002).! ! 10! como! espues a!del!sis ema!inmune! en e!a! odo! ipo!de!mic oo ganismos!(Saija'y'Uccella,' 2001).! En!cuan o! a! la!ac i idad!an i i al,!se!ha!demos ado! su! e icacia!sob e!células!de!ca cinoma! hepa ocelula ! (HepG2! 2.2.15)! in ec adas! en e! sep icemia! hemo ágica! i al! (Micol' y' cols.,' 2005);' i us!de!la!hepa i is!B!(VHB)!(Zhao'y'cols.,'2009)!y! i us!de!inmunode iciencia!humana! (VIH)!(Lee-Huang'y'cols.,'2007).!En!es e!caso!su!mecanismo!de!acción!se!basa!en!la!inhibición! de!la!in eg asa! í ica!y!al e ación!de!la!en ol u a! í ica.! ! D. Ac i idad*an i umo al! Va ios! es udios! han! con i mado! la! ac i idad! an icance osa/an i umo al! de! OLE!y! han! dilucidado!los!posibles!mecanismos!en!la!úl ima!década.!Hamdi!y!Cas ellon!han! alidado,! an o! en! es udios! in' i o' e'in' i o,!que! el! secoi idoide!inhibe! el! c ecimien o! celula ,! mo ilidad! celula ,!capacidad!de!in asión!e!induce!un!e ec o!p oapop ó ico!en!líneas!celula es!cance osas! como!glioblas oma!(LN-18),!e i oleucemia!(TF-1a),!células!de!adenoca cinoma! enal!(786-O),! ca cinoma!me as ásico!de!de ame!pleu al!(T-47D),!adenoca cinoma!de!glándula!mama ia!o! de ame! pleu al! (MCF-7),! melanoma! maligno! de! piel! o! nodo! lin á ico! (RPMI-7951)! ! y! adenoca cinoma! colo ec al! o! egión! me as ásica! sup acla icula ! (LoVo)! (Hamdi' y' Cas ellon,' 2005).! En!base!a!es o,!es udios!expe imen ales!en!animales!han!de e minado!que!el! a amien o!con! OLE!p e iene! el! desa ollo! de! cánce ! de! piel! (Kimu a' y' Sumiyoshi,' 2009),! ejidos! blandos! (Hamdi'y'Cas ellon,'2005)!y!cánce !de!pulmón!(Seppo a'y'cols.,'2014).' Además! de! ac ua ! di ec amen e! sob e! el! umo ,! OLE!puede! desempeña ! una! unción! an iangiogénica,!inhibiendo!la!p oli e ación!del!endo elio,!p oduciendo!así!una! educción!del! núme o!de! asos!sanguíneos.!Es o! ue!demos ado!po !es udios!en!memb ana!co ioalan oidea! de!pollo!y!en!modelos!de! a ón!(Hamdi'y'cols.,'2003).! Po ! odo!es o,!Hamdi!y!Cas ellon!se! e ie en!es e!secoi idoide!como!una!nue a!clase!de!agen e! an icance oso,!que!ac úa!en!la!p og esión!del! umo ,!ac i a!!sis emas! epa ado es!de!ADN!e! inhibe!de!la!angiogénesis.! ! ! ! 11! E. *Ac i idad*hepa op o ec o a* Se! ha! obse ado! en! di e sos! es udios! un! e ec o! hepa op o ec o ,! demos ando! que! el! a amien o! con! OLE!disminuye! signi ica i amen e! las! ansaminasas! en! plasma,! especialmen e! la! alanina! amino ans e asa!(ALT)!y! aspa a o! amino ans e asa!(AST)!en! a ones! in oxicados! con! e aclo u o! de! ca bono.! Es os! esul ados! se! asocian! con! una! cla a! eg esión!de!á eas!nec ó icas!y!un!ma cado!aumen o!de!la!ac i idad!SOD!y!la!concen ación!de! GHS.!La!inmunoquímica! ambién! e eló!que!OLE!a enúa!de! o ma!dosis-dependien e!ERO/ERN! y!sup ime!la!in lamación!(Domi o ic'´'y'cols.,'2012)(Kim'y'cols.,'2014).! Además,!en!hígado!de! a a! a ado!con!hid oxi olueno!bu ilado,!el!secoi idoide! ue!capaz!de! educi !los!ni eles!de!u ea!ni ogenada!en!sang e,! ansaminasa!glu ámico!pi ú ica!en!sue o! (sGPT),! ansaminasa! glu ámico! oxalacé ica! (GOT),! os a asa! alcalina!(FA),! lac a o! deshid ogenasa!(LDH),! iacilglicé idos!(TG)!y! c ea inina! (Lin' y' cols.,' 2007);' además! de! minimiza !la!gene ación!de! ib osis!y!nec osis!(Fang'y'cols.,'2008)(Kim'y'cols.,'2014).! Po ! an o,!es os!es udios! alidan!el!po encial!hepa op o ec o !de!OLE,!p oponiéndola!como!un! nue o!agen e!segu o!y!p o ec o !a!es e!ni el!(Hassen'y'cols.,'2015).' ! F. Ac i idad*ca diop o ec o a! La! ac i idad! ca diop o ec o a! de! OLE!en! modelos!de! expe imen ación! in' i o!ha! sido! demos ada! en! di e sos! es udios.! En! a as! con! ca dio oxicidad! aguda! inducida! po ! doxo ubicina! (DXR),! se! ealiza on! inyecciones! in a enosas! de! OLE,! p oduciéndose! un! descenso!en!el!ni el!de!c ea inquinasa!(CK),!c ea inquinasa!-MB!(CK-MB),!LDH,!AST!y!ALT.!A!su! ez,!la!inmunoquimica! e eló!una! educción!en!el!con enido!de!ca bonilos,!ni o i osinas,!iNOS! y! pe oxidación! lipídica! en! ejido! miocá dico;! y! en! his opa ología,! la! educción! de! la! ascula ización! ci oplasmá ica! en! ca diomioci os! e eló!su! e ec o! p o ec o ! en e! a! la! ca dio oxicidad!inducida!po !DXR!(And eadou'y'cols.,'2007).'! El!p e a amien o!con!el!compues o! enólico!en! a ones!con!in a o!agudo!de!mioca dio!(IAM),! mos ó! un! e ec o! p o ec o ! en e! al! IAM,! p e iniendo! el! desa ollo! de! un! allo! ca diaco! secunda io! al! mismo,! ! al! descenso! en! los! ni eles! sé icos! de! CK-MB,! oponina! I,! LDH! (Janahmadi'y'cols.,'2014).! ! ! ! 12! G. Ac i idad*neu op o ec o a* Tan o! OLE!como! los! poli enoles! del! oli o! exhiben! un! e ec o! neu op o ec o ! signi ica i o! en!! modelos! expe imen ales! y! sugi iéndose! una! nue a! es a egia! e apéu ica! po encial! en! en e medades!neu odegene a i as!como!Pa kinson!y!Alzheime .! En! un! ensayo! en! a as! OLE!mos ó! un!núme o! mayo ! de! neu onas! en! la! sus ancia! neg a,! espec o! a! las! a as! sin! a a .! De! hecho,! las! in es igaciones! con! GC-MS!desc ibie on! al! secoi idoide!como! una! molécula! de! unión! ! no! co alen e! al! pép ido! β-amieloide! (1-40),! con a es ando! la! p oducción! y! gene ación! de! la! placa! amieloide! (Bazo i' y' cols.,' 2006).! En! adición,!el!secoi idoide! ue!capaz!de!inhibi !la!p o eína!Tau,!que! o ma!ag egados!amieloides! ca ac e ís icos!del!Alzheime ,!en! a ones!(Daccache' y'cols.,'2011).'Es os! esul ados!a alan!a! es a! molécula! como! una! no edosa! diana! a macológica! en! la! p e ención! o! a enuación! del! daño!o!pé dida!de!neu onas!dopaminé gicas!en!pa ologías!neu odegene a i as.! ! H. Ac i idad*an ien ejecimien o* Los!FS!su en!la!senescencia!po !la!in luencia!de! ac o es!gené icos!y!ambien ales.!La! unción! isiológica!del!p o eosoma,!una!p o easa!no!liposomal!mul ica alí ica,!se!de e io a!con!el!paso! del! iempo,!de! o ma!más!acen uada!en! ib oblas os!du an e!la!senescencia.!Ka siki!y! cols.,! demos a on!que!OLE!mejo a!la!ac i idad!de!los!p o eosomas!in' i o,!de! o ma!más!e icaz!que! o os!quimioac i ado es! conocidos,! posiblemen e! median e! cambios! en! la! con o mación! de! és os.!Además,!el! a amien o!con inuo!de! ib oblas os!emb iona ios!en! ase! emp ana!con! OLE,!disminuyó!los!ni eles!in acelula es!de!ERO,! educiendo!la!can idad!de!p o eínas!oxidadas! median e! el! inc emen o! de! la! asa! de! deg adación! mediada! po ! p o eosomas! y,! man eniéndose! la! unción! del! p o eosoma! ! du an e! la! senescencia! eplica i a.! De! o ma! impo an e,!los!cul i os!celula es! a ados!con!OLE!exhibie on!una!demo a!en!la!apa ición!de! la! senescencia,! y! su! iempo! de! ida! se! ex endió! ap oximadamen e! un! 15%! (Ka siki' y' cols.,' 2007).' ' I. Ac i idad*an iin lama o ia* La!in lamación!es!una! espues a! undamen al!inducida!po !el!sis ema!inmune!pa a!p o ege !el! o ganismo!con a!pa ógenos,!daño! isula !y!!es és.!! Una!amplia! a iedad!de!es udios!han!demos ado!la!e idencia!de!la!con ibución!de!ci ocinas! en!la!in lamación!y!el! ejido!dañado.!Las!ci ocinas!p o-in lama o ias!como!IL-6,!IL-!1β!y!el! ac o ! ! 13! de!nec osis! umo al!α!(TNF-α)!se!ac i an!po ! ías!de!señalización!implicadas!en!la!in lamación,!! en e!las!que!se!incluyen!los! ac o es!nuclea es!de! ansc ipción!NF-kB!y!las!p o eínas!cinasas! ac i adas! po ! mi ógenos! (MAPK):! c-Jun! NH2! – e minal! cinasa! (JNK),! p38! cinasa! y! cinasa! egulada!po !señal!ex acelula !(ERK),! undamen almen e!(Auppe le!y!cols.,!2001;!McInnes!y! Sche ,!2011).! El! ac o !de! ansc ipción!NF-ĸB!juega!un!papel! undamen al!en!la! unción!biológica!y! en!la!pa ogenia!de!desó denes!in lama o ios!y!au oinmunes!(Sun'y'cols.,'2013).!Es!un! ac o ! ansc ipcional! egulado ! de! la! exp esión! de! nume osos! genes! que! codi ican! moléculas! in oluc adas!en!el!p oceso!in lama o io,!en e!los!que!podemos!incluí !ciclooxigenasa-!2!(COX- 2),!óxido!ní ico!sin asa!inducible!(iNOS),!p o aglandina!E!sin asa-1!mic osomal!(m-PGES-1)!y! cie as!ci ocinas!p oin lama o ias!en e!las!cuales!se!incluyen!TNF-!α,!IL-1β,!IL-6,!IL-17!e!IL-23! (Cho,'2006;'Neu a h'y'cols.,'1998).!! El!NF-κβ!es á! egulado!po !la! ía!de!las!MAPK,!que!en!su!es ado!inac i o!(no! os o ilado)! esiden! en! el! ci oplasma,! pe o! cuando! se! ac i an! son! os o iladas! y! a! su! ez! os o ilan! en! se inas!y! eoninas!a!los! ac o es!de! ansc ipción.!Es os!úl imos!p omue en!la! ansc ipción!de! genes! esponsables! de! la! ac i ación! de! las! células! in lama o ias! e! inmunocompe en es! y! la! exp esión!de!p o eínas!mediado as!cla e!con!el!consiguien e!e ec o!biológico!(Ghosh'y'cols.,' 2003).!! La! ía!de!las!MAPK!pa ece!juga !un!papel!impo an e!en!el!con ol!de!la!in lamación!(Wei'y' Feng,' 2010).! !Las! ías! de! la! cinasa! N-! e minal! p38! y! ! JNK! ! se! ac i an! po ! el! es és! celula ! (Ky iakis' y!A uch,' 2001).! La! MAPK! p38! ambién! es á! in oluc ada! en! el! con ol! pos - ansc ipcional! de! la! exp esión! génica! median e! la! es abilización! de! los! ARN! mensaje os! (ARNm).! De! igual! mane a,! se! ha! desc i o! que! puede! egula ! la! p oducción! de! ci ocinas! en! espues a!a!una! a iedad!de!es ímulos!y!la!sob eexp esión!de!COX-2!(Hommes'y'cols.,'2002)! (Figu a'4).!! El!e ec o!an iin lama o io!de!OLE!es a!mediado!po !su!capacidad!de!inhibi !la!ac i idad!p o- in lama o ia!de!ERO!lib es!p oducidas!po !enzimas,!como!la!COX-2!e!iNOS!y!modula !di e en es! ías!de!señalización:!inhibición!del!NF-kβ!y!su! anslocación!al!núcleo,!IL-1β,!MAPK,!median e! la!al e ación!de!los!p ocesos! edox!en!células!inmunes!sensibles'(Cá deno'y'cols.,'2013).' ! ! 14! ! Figu a'4:'Esquema'del'mecanismo'an iin lama o io'de'compues os' enólicos'(Cá deno'y'cols.,' 2013).' A! con inuación,! se! incluyen! los! es udios! in' i o' e! in' i o!más! signi ica i os! que! a alan! la! ac i idad!an iin lama o ia!de!OLE.! o Es udios!in' i o'con!OLE' Dell’Agli!y!cols.,!in es iga on!el!e ec o!del!aglicón!OLE,!ex aído!de!acei e!de!oli a! i gen!ex a! (AOVE),!en!la!exp esión!de!me alop o easas!de!la!ma iz-9!(MMP-9)!en!células!de!leucemia! aguda!monocí ica!(THP-1),!el!cual!p e iene!la!es imulación!de!la!exp esión!de!dicha!enzima!en! células!THP-1!es imuladas!con!TNF-α,!debido!a!la!al e ación!en!la!!señalización!de!NF-kB.!Es o! e idenció!el!mecanismo!po !el!que!el!AOVE! educía!la!in lamación!asociada!a!en e medades! (Dell’Agli'y'cols.,'2010).! O os!es udios,!en!la!línea!celula !RAW-264.7!(macó ga os!monocí icos!inducidos!po !el! i us! de! leucemia! mu ina! de! Abselon),! es imulada! con! lipopolisacá idos! (LPS)! pusie on! de! mani ies o! que! el! compues o! enólico!inhibe! la! p oducción! de! ci ocinas! p o-in lama o ias! como! la! IL-1β! e! IL-6! y! la! gene ación! de! óxido! ní ico! (NO),! median e! la! sup esión! de! la! exp esión! de! enzimas! p o-in lama o ias,! iNOS! y! COX-2.! Así! mismo,se! obse ó! una! disminucuión!de!la!ac i ación!de!las!MAPK!(ERK1/2!y!JNK),!las!cuales!se!asocian!al!p oceso!de! in lamación!(Ryu'y'cols.,'2015).! Memb ane(Phospholipids A aquidonic Acid PGG2 PGH2 PGD2,'PGE2,' PGF2,PGI2 (TxA2)'''''''''TxB2 PG(syn hases TX(syn hase PLA2 COX-2 OLIVE'OIL'POLYPHENOLS MMP-9 NF-ƘB IƘBα p65 p50 NF-ƘB STAT-1 p STAT-1 STAT-1 p STAT-1 p STAT-1 p MAPKs p38,(JNK,(ERK iNOS NO P o-in lamma o y' cy okines T ansc ip ion(o ( a ge (genes ! 15! Además,! se! demos ó!que! OLE! educía! el! e ec o! de! la! mielope oxidasa! (MPO)! (enzima! que! ca aliza!la! o mación!de!ácido!hipoclo oso)!en!neu ó ilos!humanos!de! o ma!concen ación- dependien e!(Cze wisńka'y'cols.,'2012).* o Es udios!in' i o'con!OLE' La!e icacia!de!OLE!en!modelos!in' i o!de!in lamación!ha!sido!p obada!con!g an!ex ensión.!Es e! secoi idoide! ambién!ha!mos ado!unos!buenos!bene icios!p e en i os!a!ni el!gas oin es inal,! en!el!modelo!de!úlce a!gás ica!inducida!con!e anol,!disminuyendo!el!índice!de!ulce ación!e! inc emen ando!la!ac i idad!de!enzimas!con!ac i idad!an ioxidan e!en! a as,!el!con enido!de! GHS,!SOD!y!CAT!en! ejido!gás ico!(Ali ezaei'y'cols.,'2012).!! De!la!misma! o ma,!se!ha! epo ado!que!OLE!a enúa!la!ex ensión!y!se e idad!en!coli is!aguda! inducida!con!DSS!a!la! ez!que! educe!la!in il ación!de!neu ó ilos,!la!p oducción!de!NO,!IL-1β,! IL-6!y!TNF-α,!los!ni eles!exp esión!génica!de!p o eína!iNOS,!COX-2,!MMP-9!y!la! anslocación!al! núcleo!subunidad!p65!de!NF-kB!en! ejido!de!colón!(Gine 'y'cols.,'2011,'2013).! Son!conocidos!los!e ec os!an iin lama o ios!del!aglicón!OLE!en! a ones!con!a i is!colágeno- inducida! (CIA).! Po ! ejemplo,! el! aglicón! OLE!a enúa! el! desa ollo! de! la! a i is! causada! po ! inyección! de! colágeno! ipo! II!en! a ones,! mejo ando! el! es ado! his ológico! an o! en! la! a iculación!como!en!la!pa a,!el!g ado!de!daño!oxida i o!y!ni osa i o!y!los!ni eles!plasmá icos! de!ci ocinas!p o-in lama o ias!(Impellizze i'y'cols.,'2011).!Asimismo,!el! a amien o!con!aglicón! OLE!disminuyó! signi ica i amen e! el! daño! his ológico,! la! p oducción! de! ci ocinas! p o- in lama o ias!(TNF-α!e!IL-1β),!la!exp esión!de!iNOs,!la!in il ación!de!neu ó ilos,!la! o mación! de!ni o i osina!y!!los!ni eles!de! ac o !neu o ó ico!de i ado!de!células!gliales!(GDNF),!a! a és! de!la!inhibición!de!la! ía!de!señalización!!NF-kB!e!!impidiendo!la!!deg adación!!de!la!p o eína! inhibi o ia! IKB-α.! Del! mismo! modo,! el! aglicón! OLE!! ue! capaz! de! ! educi ! ac i idad! de! la! p o einquinasa!A!(PKA),!y!es imuló!la!apop osis,!en!el!mismo!modelo!expe imen al!en! a ones! (Impellizze i'y'cols.,'2012)'(Tabla'2).' ' ' ' ' ' ! 16! Tabla'2:'Es udios'in' i o'e'in' i o'de'la'ac i idad'an iin lama o ia'de'la'oleu opeína.'' Re e encia! Poli enol! Mé odo!de! expe imen ación! Mecanismos!de!acción! Dosis! usadas! In'Vi o! ! Dell’Agli'y' cols.,'2010' ! Aglicón!OLE! Células!THP-1! TNF-α! es imuladas! Inhibición!de!la!exp esión! anómala!de!MMP-9! median e!la!señal!NF-kB! ! 2.5-50μM! Ryu'y'cols.,' 2015' ! OLE! RAW!264.7! LPS!es imuladas! Sup esión!de!la!p oducción! de!iNOS,!COX-2,!IL-1β,!IL-6! y!MAPK! 100,!200,! 300!μM! Cze wisńka'y' cols.,'2012' OLE! Neu ó ilos! humanos! Reducción!de!MPO! 5-50!μM! In'Vi o' ! ! Ali ezaei'y' cols.,'2012! ! ! ! OLE! ! ! Úlce a!gás ica! inducida!con! e anol!en! a as! Ele ación!de!la!ac i idad!de! enzimas!an ioxidan es,! aumen o!del!índice!de! úlce as!inhibidas,!el! con enido!de!GSH,!SOD!y! CAT!en!el! ejido!gás ico! ! ! ! 12!y!18! mg/kg! ! Gine 'y'cols.,' 2011! ! ! OLE! ! Coli is!aguda! inducida!con!DSS! Reducción!de!la!in il ación! de!neu ó ilos,!la! p oducción!de!NO,!IL-1β,! IL-6,!y!TNF-α;!la!exp esión! de!iNOS,!COX-2,!y!MMP-9;! y!la! anslocación!al!núcleo! de!la!subunidad!p65!NF-kB!! ! ! 2%!OL!en! die a! ! ! ! Impellizze i'y' cols.,'2011' Impellizze i'y' cols.'2012! ! ! ! ! ! Aglicon!OLE! ! En e medad!de!la! médula!espinal! en! a ón! A i is!(colágeno! ipo!II)!en! a ón! Disminución!del!daño! his ológicamen e,!!TNF-α!e! IL-1β,!iNOS,!inl il ación!de! neu ó ilos,!pe oxidación! lipídica,!ni o i osina,! o mación!de!PKA,!ni eles! de!GDNF,!inhibición!de!la! exp esión!de!NF-kB,!! deg adación!de!IkB-α!e! inducción!de!apop osis! ! ! ! ! ! 20,!40,!100! μg/kg! * * * * ! 17! JUSTIFICACIÓN*Y*OBJETIVOS* Según!la!O ganización!Mundial!de!la!Salud,!las!en e medades! eumá icas!son!una!de!las!causas! más! ecuen es!de!incapacidad!en!el!mundo.!En!España!es as!pa ologías!es án! elacionadas! con! el! 50,7%! de! las! incapacidades! labo ales! y! son! la! p incipal! causa! de! bajas! labo ales! pe manen es.!Especial! ele ancia! iene!la!AR,!po !sus! epe cusiones!sob e!la!calidad!de! ida!de! los!pacien es!y!el!de e io o!p og esi o!que!p oduce!es a!en e medad.!!! AR!es!una!en e medad!au oinmune,!in lama o ia,!c ónica!y!sis émica!que!se!ca ac e iza!po ! una!sino i is!e osi a!simé ica,!en!la!cual!el! ejido!de!g anulación!de!o igen!sino ial!(pannus),! in ade!y!e osiona!el!ca ílago!y!el!hueso!de!las!a iculaciones!dia odiales.!Los!FS!juegan!un! papel! undamen al!en!la!pe sis encia!de!la!in lamación!c ónica!y!en!!el!daño!a icula ,!siendo! unas! de! las! poblaciones! celula es! más! abundan es! en! el! pannus.! Ac úan! di ec amen e! deg adando!la!ma iz!del!ca ílago,!e!indi ec amen e!sob e!el!hueso!como!induc o es!de!la! di e enciación!y!ac i ación!de!los!os eoclas os!(Fauci,'2010).! El! abo daje! e apéu ico! de! la! AR! es! mul idisciplina ,! di igida! a! la! sup esión! inespecí ica! del! p oceso! in lama o io,! con! el! obje i o! de! mi iga ! los! sín omas! y! signos! de! la! en e medad,! englobando! a amien o! isio e ápico!y! a macológico.!No!obs an e,!!dado!las!limi aciones!!en! e icacia!y!segu idad!!de!la! a maco e apia!ac ual!an i eumá ica,!se!ha!gene ado!en!los!úl imos! años,! un! auge! en! el! uso! de! o as! es a egias! e apéu icas,! en e! las! que! des aca! la! e apia! nu icional!y!el!uso!de!nu acéu icos!(Fauci,'2010).! Recien emen e! nues o! g upo! de! in es igación! ha! pues o! de! mani ies o! el! po encial! an i eumá ico!del!AOVE,!base!de!nues a!die a!medi e ánea,!!de!su! acción!poli enólica!y!!de! un!!uno!de!sus! enoles!de i ado!del!hid oxi i osol!(ace a o!de!hid oxi i osol)!!(Rosillo'y'cols.,'' 2014,'2015,'2016)!!en!un!modelo!in' i o'de!a i is!inducida!po !colágeno!en! a ones!DBA/1.! No!obs an e,!no!exis en!has a!la! echa,!es udios!expe imen ales!in' i o'en!células!humanas' que! aliden!el!po encial!an i eumá ico!de!los!!secoi idoides,!y!en!pa icula !de!OLE!así!como! los!!mecanismos!bioquímicos!y!molecula es!!implicados.!!!! En! base!a! la! ac i idad! an iin lama o ia! de! OLE!pues a! de! mani ies o! en! modelos!! expe imen ales!in' i o!e!in' i o,!se!plan ea! lle a !a!cabo!un! desa ollo!expe imen al!! cuyo! obje i o!p incipal!es!llega !al!conocimien o!del! uncionalismo!de!es e!secoi idoide!!en!una!línea! celula ! alidada! pa a! el! es udio! de! la! AR! de! FS! humanos! (SW982)!y!dilucida ! los! posibles! mecanismos!molecula es,!así!como,!las!! ías!de!señalización!in oluc adas.!!! ! 18! METODOLOGÍA* 1. Oleu opeína:*Ex acción*y*ca ac e ización*química* Pa a! la! ex acción! de!OLE! a! pa i ! de! hojas! de! oli o,! se! siguió! el! mé odo! desc i o! po ! (S ama opoulos' y' cols.,' 2014).! Pos e io men e,! el! ex ac o! se! concen ó! a! sequedad! y! el! esiduo! se! pu i icó! median e! c oma og a ía! en! columna! de! gel! de! sílice! (Diclo ome ano- me anol! 10:1--->5:1)! ob eniéndose! OLE!como! un! sólido! débilmen e! ama illo! que! ue! analiazado!pos e io men e!po !RMN!de!al a! esolución!(Se icios!Gene ales!de!la!Uni e sidad! de!Se illa,!Ci ius,!que!cuen a!con!equipos!B uke !Ad ance!III!500!y!700!MHz).! * 2. Cul i o*celula * La!línea! celula ! de! FS!humanos! SW982! se! ob u o!de! Ame ican! Tissue! Cul u e! Collec ion! (ATTC®,!Numbe !HTB-93!(Manassas,!VA,!EE.UU.)).!Las!células!SW982!se!cul i a on!en! lasks!T- 150!(NuncTM,!Ba celona,!España),!con!Dulbecco's!Modi ied!Eagle!Medium!(DMEM)!con!2!mM! de!L-glu amina,!sue o! e al!bo ino!al!10%!(SFB)!y!penicilina-es ep omicina!al!1%,!a!37ºC!y!5%! CO2.! 3. Viabilidad*celula * Las!células! ue on!semb adas!en!placas!de!96!pocillos!(1!x!105!células/pocillo)!e!incubadas!en! p esencia!o!ausencia!de!OLE!du an e!24!h.!T anscu ido!es e! iempo!de!exposición,!el!e ec o! del!compues o!en!la! iabilidad!celula ! ue!analizado!median e!el!ensayo!de!la!sul o odamina!B! (SRB)! (Skehan' y' cols.,' 1990).! Después!del!pe iodo!de! incubación,!las!células! adhe en es! del! cul i o! ue on! ijadas! a! la! placa,! añadiendo! 50! mL! de! ácido! iclo oacé ico!(50%!p/ )! ío! (Sigma-Ald ich®,!Mad id,!España)!e!incubadas!du an e!60!minu os!a!4ºC.!El!sob enadan e!se! desca ó,!y!las!placas!se!la a on!cinco! eces!con!agua!des ilada!y!se!seca on!al!ai e.!Se!añadió!a! cada! pocillo! 50!µL!de! solución! SRB! (Sigma-Ald ich®,! Mad id,! España)! (0.4%! p/ )! en! ácido! acé ico!al!1%!(Pan eac®,!Ba celona,!España)!y!se!incubó!du an e!30!minu os!a! empe a u a! ambien e.! Se! eliminó! la!solución! SRB! de! las! placas! y!pos e io men e,! ue on!la adas! cinco! eces!con!ácido!acé ico!al!1%.!Seguidamen e,!se!seca on!las!placas!y!se!añadie on!100!µL!po ! pocillo! de!T is! base! (100! mmol/L,! pH! 10.5)! (Sigma-Ald ich®,! Mad id,! España),! leyendo,! a! con inuación,! la! abso bancia! a! 510!nm! u ilizando! un! lec o ! de! placas!(BioRad®,! Mad id,! España).!Finalmen e,!la! iabilidad!de!las!células!se!calculó!como!el!po cen aje!de!abso bancia! compa ado!con!el!ob enido!en!las!células!sin! a a ,!a!los!que!se!les!asignó!el! alo !100%.! ! ! 19! 4. De e minación*de*ci ocinas:*IL-6*y*TNF-α! Las! células! SW982! se! semb a on!en! placas! de! 24! pocillos! (2.5x105!células/pocillo).! 48! h! después!de!semb a las,!se!incuba on!en!p esencia!o!ausencia!de!OLE!(50!y!100!µM)!du an e!24! h! en! DMEM! con! 10%! ( / )! de! SFB! en! una! a mós e a! del! 5%! CO2!a! 37ºC.! Seguidamen e,!se! es imula on!con!IL-1β!(5ng/mL)!y!se!incuba on!du an e!24!h.!Los!sob enadan es!del!cul i o! ue on! ecogidos!y!conse ados!a!-80!ºC.! Los!ni eles!de!IL-6!y!de!TNF-α!se!han! alo ado!median e!un!enzimoinmunoanálisis!(ELISA)! ipo! compe i i o!usando! un!ki !come cial!de!eBioscience®(!San!Diego,!CA,!EE.UU.),!siguiendo!las! ins ucciones!indicadas!en!los!mismos.!El!mé odo!es u o!basado!en!la!compe ición!en e!la!IL- 6!y!TNF-α!de!la!mues a,!y!un!es ánda !po !la!unión!a!un!an icue po!(Ac)!policlonal!an i-IL-6!o! an i-TNF-α!que! e es ía!la!placa.!T as!la!incubación,!se!añadió!un!Ac!monoclonal!que!se!unió!al! an e io ,!y!!es a!ligado!a!la!enzima!ca alasa!(enzima!de!de ección).!T as!un!nue o!la ado,!se! adicionó!el!subs a o!y!la! eacción!enzimá ica!p odujo!un!colo !cuya!in ensidad!se!midió!a!450! nm! en! lec o ! de! placa! Labsys ems! Mul iskan! Ex.! (Helsinki,! Finlandia)! siendo! di ec amen e! p opo cional!a!la!can idad!de!IL-6!o!de!TNF-α!de!las!mues as.'' ' 5. De e minación*de*la*exp esión*p o eica** Con!es e! es udio,! se! de e mina on! los! cambios! en!la! exp esión! de! de e minadas! p o eínas! p esen es! en! las! células! SW982! median e! elec o o esis! en! gel! de! dodecil!sul a o!sódico! (SDS)/poliac ilamida!y,!pos e io ! ans e encia!a!una!memb ana!de!ni ocelulosa,!y!de ección! median e! una! eacción! de! quimioluminiscencia! empleando! an icue pos! especí icos! de! la! p o eína!de!in e és!(Wes e n'blo )(Figu a'5).! Las! células! se! incuba on! en! p esencia! o! ausencia! de!OLE!(50! y! 100! µM)!du an e! 24! h! y!se! es imula on!con!IL-1β!(5ng/mL)!a!dis in os! iempos,!dependiendo!de!la!p o eína!es udiada!(30! min!o!24!h).!Pasado!el! iempo!de!es ímulo,!las!células!se!lisa on!u ilizando!un! ampón,!que! con enía!un!cock ail!de!inhibido es!de!p o easas!y! os a asas,!y!se!p ocesa on!según!desc iben! Sánchez-Hidalgo!y!cols.!(2005)!pa a!aisla !las!p o eínas.! La!concen ación!p o eica!de!cada!mues a!se!de e minó!de!acue do!al!mé odo!colo imé ico! desc i o!po !B ad o d.!En!es e!ensayo,!5!µl!de!cada!una!de!las!mues as!a!de e mina ! ue on! añadidos!y!mezclados!con!el! eac i o!de!Bio-Rad'p o ein'assay'(Bio-Rad®),!el!cual!alcanza!una! abso bancia!máxima!a!595!nm,!pe mi iendo!su!pos e io !lec u a!en!un!espec o o óme o.!! ! 26! La!exp esión!de!m-PGES-1!(Figu a'8),! ue!inc emen ada!en!FS! as!la!es imulación!con!IL-1β!con! espec o!a!los!que!no! ue on!es imulados!con!la!ci ocina!(***'p<0.001' s.'células'con ol'no' es imuladas).!No! obs an e,! el! a amien o! con! ambas! dosis! de! OLE!causó! una! disminución! es adís icamen e!signi ica i a!de!la!exp esión!de!dicha!p o eína! espec o!a!las!células!con ol! as!la!es imulación!con!IL-1β'(++'p<0.01' s.'células'con ol'es imuladas'con'IL-1 β ).! ! !!!!!!!!!!!!!!! ! Figu a'8.'Exp esión'p o eica'de'm-PGES-1' as'el' a amien o'con'OLE'en'células'SW982.'Las' células' ue on'no' a adas'o' a adas'con'OLE'(50'y'100'μM)'du an e'24'h'en'p esencia'de'IL-1 β ' (5'ng/mL).'Las'células'con ol'no'es imuladas' ue on'incubadas'en'ausencia'de'IL-1 β .'El'g á ico' ep esen a'la'in ensidad'de'la'banda.'La' β -ac ina'si ió'como'con ol'pa a'la'no malización'de' la' igualdad' de' ca ga.' Los' da os' mos ados' son' medias' ±' SEM!(n=4).' ***p<0.001' s.' células' con ol'sin'es imula ;'++p<0.01'células'con ol'es imuladas'con'IL-1 β .' ' 4. Es udio*de** ías*de*señalización* Pa a! explo a ! el! posible! mecanismo! molecula ! de! la! ac i idad! a macológica! de! OLE! en! FS! humanos,!de e minamos!sus!e ec os!po enciales!en!la! ía!de!señalización!de!las!MAPK:!JNK!y! p38,! as!30!minu os!de!es imulo!con!IL-1β.! Nues os! esul ados!pusie on!de!mani ies o!que!los!FS!de!la!línea!SW982!es imulados!con!IL- 1β,! inducían! un! aumen o! signi ica i o! de! la! os o ilación! de! las! p o eínas! JNK! y! p38,! en! compa ación!con!los! ib oblas os!con ol!no!es imulados.!Po !el!con a io,!el! a amien o!con! β-ac ina 46 kDa m-PGES-1 16 kDa ! 27! OLE!(50!y!100!μM)! edujo!signi ica i amen e!la! os o ilación!de!ambas!MAPK:!JNK!y!p38,! as! 30!minu os!de!es ímulo!con!IL-1β!(++'p<0.01'y'+++'p<0.001' s.'células'con ol'es imuladas'con' IL-1 β )'(Figu a'9).! ! ! Figu a'9.'Exp esión'p o eica'de'las'p o eínas'MAPK:'pp38'y'pJNK.'Las'células' ue on' a adas' con'OLE'(50'y'100'μM)'du an e'24'h'y'es imuladas'con'IL-1 β '(5'ng/mL)'du an e'30'minu os.'Las' células' con ol' no' es imuladas' se' incuba on' en' ausencia' de' IL-1 β .' El' g á ico' mues a' la' in ensidad'de'la'banda.'El'análisis'densi omé ico'se' ealizó' as'la'no malización'con'los'genes' de'con ol'(JNK'y'p38)'pa a'la'igualdad'de'ca ga.'Los'da os'mos ados'son'medias'±'SEM!(n=6).' ***p<0.001' s.'células' con ol' sin' es imuladas;' ++p<0.01' y' +++p<0.001' s.' células' con ol' es imuladas'con'IL-1 β .' ' ' ' ' pJNK JNK 46 KDa 46 KDa 38 kDa 38 kDa P38 pp38 ! 28! DISCUSIÓN* Los!FS!desempeñan!una! unción! ele an e!en!la!pa ogenia!de!la!AR.!En!la!memb ana!sino ial! euma oide,!los!FS!aumen an!en!núme o!y!mues an!un! eno ipo!al e ado.!Es e! ipo!de!células! p oducen! ci ocinas,! que! jun o! con! la! p oducción! de! an icue pos! e! inmunocomplejos,! man ienen!la!in lamación!c ónica!y!des uyen!el! ejido,!debido!sob e odo!a!la!sob eexp esión! local!de!mediado es!in lama o ios,!como!IL-6,!en e!o os!(Izquie do'y'Pablos,'2013).' 'Son! a ios! los! es udios! lle ados! a! cabo! po ! nues o! g upo! de! in es igación! con! dis in os! compues o! enólicos!en!modelos!in' i o'e'in' i o!!de!AR!(Rosillo'y'cols.,'2014,'2015,'2016).!Sin! emba go,!has a!la! echa,!no!se!conoce!el!po encial!an i eumá ico!de!OLE!en!los! ib oblas os! sino iales!humanos.!' En e! las! p incipales! ci ocinas!p o-in lama o ias! implicadas! en! la! pa ogénesis! de! AR! se! encuen an:!TNF-α,!IL-1β!e! IL-6.!P incipalmen e,!la!IL-6!se! encuen a!en! células!sino iales!y! mac ó agos!p omo iendo!la!deg adación!del!ca ílago!y!la!ac i ación!de!os eoclas os!(Baille 'y' cols.,'2015).!Nues o!es udio!demos ó!como!la!es imulación!con!IL-1β,!p oducía!un!aumen o! en!la!exp esión!de!IL-6!y!TNF-α!en!las!células!SW982,!mien as!que!el!p e a amien o!con!OLE! disminuyó!de! o ma!signi ica i a!los!ni eles!de!ambas!ci ocinas.! Así!mismo,!la!COX-2,!iso o ma!inducible!de!COX,!es!una!enzima!cla e!que!ca aliza!la!biosín esis! de!PG!a!pa i !de!ácido!a aquidónico,!y!a!su! ez,!de!!m-PGES-1,!y!juega!un!papel!cla e!en!la! espues a!in lama o ia.!Nues os! esul ados!pusie on!de!mani ies o!como!la!exp esión!p o eica! de!ambas!enzimas! (COX-2!y!m-PGES-1)! aumen aba!de! o ma!signi ica i a!en! células!SW982! es imuladas!po !IL-1β;!no!obs an e,!el! a amien o!con!OLE!indujo!un!descenso!conside able! de!la!exp esión!de!es as!enzimas!in lama o ias.!! Es os! esul ados!concue dan!con! los!ob enidos!en! o os!es udios,! en!los! que! se! demues a! como!OLE!es!capaz!de! educi !la! epues a!in lama o ia!median e!una!disminución!en!en!los! ni eles! de! COX-2,! m-PGES-1,! IL-6,! TNF-α,! en e! o os! (Ryu' y' cols.,' 2015;' Impellizze i' y' cols.,' 2011;'Co ona'y'cols.,'2007).! En e!las! ías!de!señalización!implicadas!en!la!AR!se!encuen a!la! ía!de!las!MAPK!(Smolen'y' S eine ,'2003).!Las!MAPK!ac i adas,!ERK,!JNK!y!p38!se!localizan!en!el! ejido!sino ial!y!pueden! se !es imuladas!po !ci ocinas!p oin lama o ias! como! IL-1β! (Sche ' y' cols.,' 2000).!Del!mismo! modo,!en!nues o! abajo!pudimos!demos a !como!cuando!es as!células!son! a adas!con!OLE! se! educía!la! os o ilación!de!ambas!MAPK:!JNK!y!p38,!da os!coinciden es!con!los!ob enidos! ! 29! po ! nues o! g upo! de! in es igación! en! es udios! lle ados! a! cabo! con! o os! compues os! enólicos!en!modelos!mu inos!inducidos!de!a i is!(Rosillo'y' cols.,'2015),!donde!se!puso!de! mani ies o! el! e ec o! an i eumá ico! de! es os! compues os! enólicos! median e! la! d ás ica! disminución!de!la!ac i ación!de!las!MAPK.!! ! En! esumen,!los! esul ados!de!es e!T abajo! Fin! de!G ado! ponen!de! mani ies o!un!ma cado! e ec o!an iin lama o io!de!OLE!sob e! ib oblas os!sino iales!humanos!(SW982),!ca ac e izado! po ! una! ! disminución! en! los! ni eles! de! ci ocinas! p o-in lama o ias:! IL-6! y! TNF-α.! En e! los! dis in os!mecanismos!de!acción!posiblemen e!implicados! igu an!el!descenso!de!la!exp esión! de!la!enzima!inducible!COX-2,!y!po ! an o,!de!m-PGES-1,!a! a és!de!la!inhibición!de!la! ía!de! señalización!de!MAPK.! * ! * * * * * * * ! 30! CONCLUSIÓN* Los! esul ados!de!es e!T abajo!Fin!de!G ado!pe mi en!conclui !que:! 1. La!OLE!p esen a!un!ma cado!e ec o!an iin lama o io!sob e!los!FS!humanos!(SW982),! ca ac e izado!po !una!disminución!en!los!ni eles!de!ci ocinas!p o-in lama o ias:!IL-6!y! TNF-α.!En e!los!dis in os!mecanismos!de!acción!posiblemen e!implicados! igu an!el! descenso!de!la!exp esión!de!la!enzima!inducuble!COX-2,!y!po ! an o,!de!m-PGES-1,!a! a és!de!la!inhibición!de!la! ía!de!señalización!MAPK.! ! 2. Es os! esul ados!p elimina es!sugie en!que!OLE!pod ía!pa icipa !en!el!desa ollo!de! una! nue a! es a egia! e apéu ica! di igida! a! los! elemen os! del! sis ema! inmuni a io,! cuyas! limi aciones! en! e icacia! y! segu idad! son! bien! conocidas,! y! cons i ui ! un! complemen o! nu icional! de! g an! alo ! en! a amien o! y/o! p e ención! de! la! AR! al! ac ua !sob e!po cesos!FS-dependien es.! * * * * * * * * ! 31! ABREVIATURAS*Y*SIGLAS* ! ! o Ac:!An icue po! o ALMT:! Ácido! logánico! me il ans e asa! o ALT:!Alanina!amino ans e asa! o AOVE:!Acei e!de!oli a! i gen!ex a! o AR:!A i is! euma oide! o ARNm:!ARN!mensaje o! o AST:!Aspa a o!amino ans e asa! o CAT:!Ca alasa! o CCF:!C oma og a ía!de!capa! ina! o CE:!Elec o o esis!capila ! o CIA:!A i is!colágeno-inducida! o CK-MB:!C ea inquinasa-MB! o CK:!C ea inquinasa! o COX-2:!Ciclooxigenasa!2! o DMEM:!Dulbecco's!Modi ied!Eagle! Medium! o DXR:!Doxo ubicina! o ELISA:!Enzimoinmunoanálisis! o ERK:! Cinasa! egulada! po ! señal! ex acelula ! o ERN:! Especies! eac i as! de! ni ógeno! o ERO:!Especias! eac i as!de!oxígeno! o ESI-MS/MS:! Ionización! po ! elec osp ay-espec ocopía! de! masa! o FA:!Fos a asa!alcalina! o FAMS:! Full! Au oma ic! Modelling! Sys em! o FS:!Fib oblas os!sino iales! o GC-MS:! C oma og a ía! de! masas- espec ome ía!de!masas! o GDNF:! Fac o ! neu ó ico! de i ado! de!células!gliales! o GE10H:!Ge aniol!10-hid oxilasa! o GES:!Ge aniol!sin asa! o GHS:!Glu a ion! o GOT:! T ansaminasa! glu ámico! oxalacé ica! o GPx:!Glu a ion!pe oxidasa! o GRx:!Glu a ion! educ asa! o GT:!Glucosil ans e asa! o HPLC:!C oma og a ía!líquida!de!al a! e icacia! o IAM:!In a o!agudo!de!mioca dio! o IL:!In e leucina! o iNOS:! Óxido! ní i ico! sin asa! inducible! o JNK:!c-Jun!NH2!– e minal!cinasa! o LDH:!Lac a o!deshid ogenasa! o LPS:!Lipopolisacá idos! o m-PGES-1:P os aglandina!E!sin asa- 1!mic osomal! o MAPK:!P o eínas!cinasas!ac i adas! po !mi ógenos!! o MMP:!Me alop o easa!de!la!ma iz! o MPO:!Mielope oxidasa! o NDHI:!NADH!deshid ogenasa! o NO:!Óxido!ní ico! o OLE:!Oleu opeína! o PG2:!P os aglandina!E2! o PKA:!P o einquinasa!A! o SDS:!Dodecil!sul a o!sódico! o SEM:!E o !es ánda !de!la!media! o SFB:!Sue o! e al!bo ino! o sGPT:! T ansaminasa! glu ámico! pi ú ica!en!sue o! o SLS:!Secologanina!sin asa! o SOD:!Supe óxido!dismu asa! o SRB:!Sul o odamina!B! o TG:!T iacilglicé idos! o TNF:!Fac o !de!nec osis! umo al! o VHB:!Vi us!de!la!hepa i is!B! o VIH:!Vi us!de!la!inmonode iciencia! humana! ! ! * ! 32! BIBLIOGRAFÍA* o Ahmad-Qasem!MH,! Ba ajón-Ca alán! E,! Micol! V,! Mule ! A,! Ga cía-Pé ez! JV.! In luence!o ! eezing!and!dehyd a ion!o !oli e!lea es!( a .!Se ana)!on!ex ac !composi ion! and!an ioxidan !po en ial.!Food!Res!In .!2013;!50(1):!189-196.! o Al-Azzawie* HF,! Alhamdani! MS.!Hypoglycemic! and! an ioxidan ! e ec ! o ! oleu opein!in!alloxan-diabe ic! abbi s.!Li e!Sci.!2006;!78(12):1371–1377.!! o Alagna* F,!Ma io i!R,!Pana a!F,!Capo ali!S,!U bani!S,!Veneziani!G!e !al.!Oli e! phenolic! compounds:! Me abolic! and! ansc ip ional! p o iling! du ing! ui ! de elopmen .! BMC!Plan !Biology.!2012;!12:!162.!! o Ali ezaei*M,!Dez oulian!O,!Neama i!S,!Rashidipou !M,!Tanideh!N,!Khe admand! A.!Oleu opein!p e en s!e hanol-induced!gas ic!ulce s! ia!ele a ion!o !an ioxidan !enzyme! ac i i ies!in! a s.!J!Physiol!Biochem.!2012;!68(4),!583–592.! o Allouche*N,!Fki! I,!Sayadi!S.! Towa d!a!high!yield! eco e y! o !an ioxidan s! and! pu i ied!hyd oxy y osol! om!oli e!mill!was ewa e s.!J!Ag ic!Food!Chem.!2004;!52(2):!267– 273.! o Al inyay* C,!Al un! ML.! HPLC! analysis! o ! oleu opein! in! Olea! eu opaea! L.! J! Fac! Pha m.!2006;!35(1):!1–11.!! o And eadou*I,!Sigala!F,!Iliod omi is!EK,!Papae himiou!M,!Sigalas!C,!Aligiannis!N! e ! al.! Acu e! doxo ubicin! ca dio oxici y! is! success ully! ea ed! wi h! he! phy ochemical! oleu opein! h ough! supp ession! o ! oxida i e! and! ni osa i e! s ess.! J! ! Mol! Cell! Ca diol.! 2007;!42(3):!549–558.! o Ansa i*M,!Kazemipou ! M,!Fa hi!S.! De elopmen ! o !a!simple!g een!ex ac ion! p ocedu e!and!HPLC!me hod! o !de e mina ion!o !oleu opein!in!oli e!lea !ex ac !applied! o!a!mul i-sou ce!compa a i e!s udy.!J!I an!Chem!Soc.!2011;!8(1):!38–47.!! o Auppe le* KR,! Yamanishi! Y,! Benne ! BL,! Me cu io! F,! Boyle! DL,! Fi es ein! GS.! Exp ession! and! egula ion! o ! inducible! ikappaB! kinase! (IKK-i)! in! human! ib oblas -like! syno iocy es.!Cell!immunol.!2001;!214(1):!54-59.! o Baille * A,!Gossec! L,! Pa e no e! S,! E che o! A,! Combe! B,! Meye ! O! e ! al.! E alua ion!o !se um!in e leukin-6!le el!as!a!su oga e!ma ke !o !syno ial!in lamma ion!and! as! a! ac o ! o ! s uc u al! p og ession! in! ea ly! heuma oid! a h i is:! esul s! om! a! F ench! na ional!mul icen e !coho .!A h i is!Ca e!Res!(Hoboken).!2015;!67(7):!905-912.! ! 33! o Ba ba o&B,"Toie a"G,"Maggio"R,"A ciello"M,"Ta occhi"M,"Galli"A"e "al."E ec s"o " he" oli e-de i ed" polyphenol" oleu opein" on" human" heal h." In " J" Mol" Sci." 2014;" 15(10):" 18508-18524." o Bazo i&FN,"Be gquis "J,"Ma kides"KE,"Tsa bopoulos"A."Nonco alen "in e ac ion" be ween"amyloid-β-pep ide"(1–40)"and"oleu opein"s udied"by"elec osp ay"ioniza ion"mass" spec ome y."J"Am"Soc"Mass"Spec om."2006;"17(4):"568–575." o Bi&X,"Li"W,"Sasaki"T,"Li"Q,"Mi suha a"N,"Asada"Y"e "al."Secoi idoid"glucosides"and" ela ed"compounds" om"Sy inga" e icula a"and" hei "an ioxidan s"ac i i ies."Bioo g"Med" Chem"Le ."2011;"21(21):"6426–"6429." o Bisignano& G,"Tomaino"A,"Lo"Cascio"R,"C isa i"G,"Uccella"N,"Saija"A."On" he"in" i o" an imic obial"ac i i y"o "oleu opein"and"hyd oxy y osol."J"Pha m"Pha macol."1999;" 51(8):"971–974." o Boccio& P," DiDeo" A," De" Cu is" A," Celli" N," Iaco iello" L," Ro ilio" D." Liquid" ch oma og aphy- andem" mass" spec ome y" analysis" o " oleu opein" and" i s" me aboli e" hyd oxy y osol"in" a "plasma"and"u ine"a e "o al"adminis a ion."J" Ch oma og "B."2003;" 785(1):"47–56."" o Bouaziz&M,"Jemai"H,"Khabou"W,"Sayadi"S."Oil"con en ,"phenolic"p o iling"and" an ioxidan "po en ial"o "Tunisian"oli e"d upes."J"Sci"Food"Ag ic."2010;"90(10):"1750–1758."" o B ad o d&MM."A" apid"and"sensi i e"me hod" o " he"quan i a ion"o "mic og am" quan i ies"o "p o ein"u ilizing" he"p inciple"o "p o ein-dye"binding."Anal"Biochem."1976;"72:" 248-254." o Čaba kapa& A," Ži ko ic´" L," Žuko ec" D," Djelic´" N," Bajic´" V," Dekanski" D" e " al." P o ec i e" e ec " o " d y" oli e" lea " ex ac " in" ad enaline" induced" DNA" damage" e alua ed" using"in" i o"come "assay"wi h"human"pe iphe al"leukocy es."Toxicol"In"Vi o."2014;"28(3):" 451–456." o Caponio& F," Alloggio" V," Gomes" T." Phenolic" compounds" o " i gin" oli e" oil:" In uence"o "pas e"p epa a ion" echniques."Food"Chem."1999;"64(2):"203–209."" o Cá deno&A,&Sánchez-Hidalgo"M,"Ala cón-de-la-Las a"C."An"up-da e"o "oli e"oil" phenols"in"in lamma ion"and"cance :"Molecula "mechanisms"and"clinical"implica ions."Cu " Med"Chem."2013;"20:"4758-4776." o Ca e a-González&MP,"Ramí ez-Expósi o"MJ",Mayas"MD,"Ma ínez-Ma os"JM." P o ec i e" ole"o "oleu opein"and"i s"me aboli e"hyd oxy y osol"on"cance ."T ends""Food"Sci" Tech."2013;"31(2):"92–99." ! 34! o Ca u la'N,"Pe ez"Fons"L,"Es epa"A,"Micol"V."Di e en ial"e ec s"o "oleu opein,"a" biophenol" om" Olea" eu opaea," on" anionic" and" zwi e ionic" phospholipid" model" memb anes."Chem"Phys"Lipids."2005;"137(1-2):"2–17." o Cha oenp ase 'S,"Mi chell"A."Fac o s"in luencing"phenolic"compounds"in" able" oli es"(Olea"eu opaea)."J"Ag ic"Food"Chem."2012;"60(29):"7081–7095." o Cho' JH." Recen " p og ess" in" in lamma o y" bowel" disease." Ad " Exp" Med" Biol." 2006;"579:"24-34." o Cice ale'S,"Lucas"LJ,"Keas "RS."An imic obial,"an ioxidan "and"an i-in lamma o y" phenolic"ac i i ies"in"ex a" i gin"oli e"oil."Cu "Opin"Bio echnol."2012;"23(2):"129–135." o Co ona' G," Deiana" M," Incani" A," Vauzou " D," Dessì" MA," Spence " JPE." (2007)." Inhibi ion" o " p38/CREB" phospho yla ion" and" COX-2" exp ession" by" oli e" oil" polyphenols" unde lies" hei " an i-p oli e a i e" e ec s." Biochem" "Biophys" Res" Commun." 2007;" 362(3)," 606–611." o Cze wisńka'M,"Kiss"AK,"Na uszewicz"M."A"compa ison"o "an ioxidan "ac i i ies" o " oleu opein" and" i s" dialdehydic" de i a i e" om" oli e" oil," oleacin." Food" Chem." 2012;" 131(3):"940–947." o Daccache' A," Lion" C," Sibille" N," Ge a d" M," Slomianny" C," Lippens" G," Co elle" P." Oleu opein" and" de i a i es" om" oli es" as" Tau" agg ega ion" inhibi o s." Neu ochem" In ." 2011;"58(6):"700–707." o Dam o ' S," F anzyk" H," Jensen" SR." Biosyn hesis" o " i idoids" in" Sy inga" and" F axinus:"ca bocyclic"i idoid"p ecu so s."Phy ochemis y."1995;"40(3):"785–792." o De'La'To e-Ca bo 'K,"Jau egui"O,"Gimeno"E,"Cas ello e"AI,"Lamuela-Ra en ós" RM," López-Saba e " MC." Cha ac e iza ion" and" quan i ica ion" o " phenolic" compounds" in" oli e"oils"by"solid-phase"ex ac ion,"HPLC-DAD,"and"HPLC-MS/MS."J"Ag ic"Food"Chem."2005;" 53(11):"4331-4340."" o Dell’Agli'M,"Fagnani"R,"Galli"GV,"Maschi"O,"Gila di"F,"Bellos a"S"e "al."Oli e"oil" polyphenols"modula e" he"exp ession"o "me allop o einase"9"in"THP-1"cells"by"ac ing"on" nuclea " ac o -kβ"signalling."J"Ag ic"Food"Chem."2010;"58(4):"2246–2252." o Deng' RX," Yuan" H," Yin" WP," Wang" XS," Zhao" TZ." Chemical" cons i uen s" om" Sy inga"pubescens"Tu cz."Biochem"Sys "Ecol."2010;"38:"813–815." o Domi o ic´'R,"Jako ac"H,"Ma chesi"VV,"Šain"I,"Romic´"Ž,""Rahelic´"D.""P e en i e" and" he apeu ic"e ec s"o "oleu opein"agains "ca bon" e achlo ide-induced"li e "damage"in" mice."Pha macol"Res."2012;"65(4):"451–464." o Es i'M,"Cinquan a"L,"la"No e"E."Phenolic"compounds"in"di e en "oli e" a ie ies." J"Ag ic"Food"Chem."1998;"46(1):"32–35." ! 35! o Fang% HL,!Lai! JT,! Lin! WC.! Inhibi o y! e ec ! o !oli e! oil! on! ib osis! induced! by! ca bon! e achlo ide!in! a !li e .!Clin!Nu .!2008;!27(6):!900–907.! o Fauci% AS,! Lang o d! CA.! Ha ison! Reuma ología! (2nd! ed.).! Mc-G aw-Hill! In e ame icana.!2010.! o Fe nández-Bolaños%J,!Rod íguez!G,!Rod íguez!R,!He edia!A,!Guillén!R,!Jiménez! A.!P oduc ion!in!la gue!quan i ies!o !highly!pu i ied!hyd oxy y osol! om!liquid-solid!was e! o ! wo-phase!oli e!oil!p ocessing!o !“Alpe ujo”.!J!Ag ic!Food!Chem.!2002;!50!(23):!6804- 6811.! o Fuen es% E,! Palomo! I.! An ipla ele ! e ec s! o ! na u al! bioac i e! compounds! bymul iple! a ge s.!Food!and!d ug!in e ac ions.!J!Func !Foods.!2014;!6(1):!73–81.! o Fu ne i%PM,!Ma ino!A,!Saija!A,!Uccella!N,!Bisignano!G.!In! i o!an imycoplasmal! ac i i y!o !oleu opein.!In !J!An imic ob!Agen s.!2002;!20(4):!293–296.! o Ghosh%S,!Goldin!E,!Go don!FH,!Malchow!HA,!Rask-Madsen!J,!Ru gee s!P!e !al.! Na alizumab! o !ac i e!C ohn’s!disease.!N!Engl!J!Med.!2003;!348(1):!24-32.! o Gine %E,!Andúja !I,!Recio!MC,!Ríos!JL,!Ce dá-Nicolás!JM,!Gine !RM.!Oleu opein! amelio a es!acu e!coli is!in!mice.!J!Ag ic!Food!Chem.!2011;!59(24):!!12882–!12892.!! o Gine % E,! Recio! MC,! Ríos! JL,! Gine ! RM.! Oleu opein! p o ec s! agains ! dex an! sodium!sul a e-induced!ch onic!coli is!in!mice.!J!Na !P od.!2013;!76(6),!1113–!1120.! o Goldsmi h% CD,! S a hopoulos! CE,! Golding! JB,! Roach! PD.! Fa e! o ! he! phenolic! compounds!du ing!oli e!oil!p oduc ion!wi h! he! adi ional!p ess!me hod.!In !Food!Res!J! 2014;!21(1):!101–109.! o !González% M,! Za zuelo! A,! Gamez! MJ,! U illa! MP,! Jimenez! J,! Osuna! I.! Hypoglycemic!ac i i y!o !oli e!lea .!Plan a!Med.!1992;!58(6):513–515.!! o Guo% N,! Yu! Y,! Ablajan! K,! Li! L,! Fan! B,! Peng! J! e ! al.! Seasonal! a ia ions! in! me aboli es! p o iling! o ! he! ui s! o ! Ligus um! lucidum! Ai .! Rapid! Commun! Mass! Spec om.!2011;!25(12):!1701–1714.!! o Hamdi%HK,!Cas ellon!R.!Oleu opein,!a!non- oxic!oli e!i idoid,!is!an!an i- umo ! agen !and!cy oskele on!dis up o .!Biochem!Biophys!Res!Commun.!2005;!334(3):!769–778.! o Hassem%I,!Casabianca!H,!Hosni!K.!Biological!ac i i ies!o ! he!na u al!an ioxidan ! oleu opeína:!Exceeding! he!expec a ion-!A!mini- e iew.!J!Func !Foods.!2015;!18:!926-40.! o Hommes%D,! an!den!Blink!B,!Plasse!T,!Ba elsman!J,!Xu!C,!Macphe son!B!e !al.! Inhibi ion! o ! s ess-ac i a ed!MAP!kinases! induces!clinical!imp o emen ! in!mode a e! o! se e e!C ohn’s!disease.!Gas oen e ol.!2002;!122(1):!7-14.!