Síntesis y caracterización de poliuretanos sensibles al medio para aplicaciones biomédicas

! !! ! ! Síntesis y caracterización de poliuretanos sensibles al medio para aplicaciones biomédicas Francisco José Pérez García Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia ! ! ! 2 ! ! ! 3 Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia Síntesis y caracterización de poliuretanos sensibles al medio para aplicaciones biomédicas Alumno: Francisco José Pérez García Tutoras: Mª de Gracia García Martín y Elena Mª Benito Hernández Trabajo Fin de Grado de Carácter Experimental Sevilla, a 5 de septiembre de 2016 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica ! ! ! 4 ! ! ! 5 ÍNDICE 1. RESUMEN .................................................................................................................. 6 2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 7 3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 21 4. METODOLOGÍA Y PARTE EXPERIMENTAL ................................................. 22 4.1 Métodos generales ............................................................................................... 22 4.2 Síntesis de monómeros ........................................................................................ 24 4.3 Síntesis de polímeros ........................................................................................... 27 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 31 5.1 Síntesis y caracterización de monómeros ......................................................... 31 5.2 Síntesis y caracterización de polímeros ............................................................. 32 6. CONCLUSIONES .................................................................................................... 35 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 36 8. ANEXOS: ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ................................................... 39 ! ! ! ! 6 1. RESUMEN La mayoría de los fármacos administrados por vía sistémica presentan baja biodisponibilidad, de manera que la concentración en plasma se encuentra por debajo de los niveles de efectividad. Actualmente, los sistemas de liberación controlada (SLC) permiten mejorar la biodisponibilidad de los fármacos previniendo la degradación, controlando la velocidad de liberación, disminuyendo los efectos secundarios y haciendo más eficaz su transporte hacia las dianas terapéuticas. Existe una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos con potencial aplicabilidad como SLC de fármacos, sin embargo, hay varios aspectos que restringen el uso de muchos de ellos, como son la biocompatibilidad y la toxicidad. También hay que tener en cuenta el coste de producción de estos sistemas. Los polímeros destinados a SLC deben presentar propiedades físicas y químicas que regulen los siguientes aspectos: permeabilidad, respuesta al medio, funcionalidad superficial, biodegradabilidad y lugares de reconocimiento biomolecular. En este Trabajo de Fin de Grado se describe la síntesis y caracterización estructural de Co-poliuretanos anfifílicos funcionalizados, derivados de carbohidratos, biocompatibles y biodegradables, y sensibles a las condiciones redox. Estas propiedades las aportan las unidades estructurales que contienen enlaces disulfuro, que pueden reducirse en los ambientes hipoxídicos reductores de las células tumorales, y grupos hidroxilo libres. En primer lugar se ha llevado a cabo la síntesis de los monómeros correspondientes para las reacciones de poliadición. Posteriormente, se han preparado cinco Co-poliuretanos que presentan diversas concentraciones de grupos hidroxilo y de grupos disulfuro en sus cadenas poliméricas. La hidrofilia de estos polímeros será modulada por la concentración de grupos hidroxilo presentes en las unidades de azúcar, la cual garantizará la biodegradación de los mismos. Palabras clave: Polímeros Biodegradables, Polímeros Derivados de Carbohidratos, CoPoliuretanos, Sistemas de Liberación Controlada, Polímeros Redox ! ! ! 7 2. INTRODUCCIÓN Aunque existe una gran cantidad de compuestos con actividad terapéutica reconocida, solamente unos cuantos han encontrado utilidad clínica como fármacos para el tratamiento de determinadas enfermedades. Esto se debe a que la actividad terapéutica que muchos de estos compuestos presentan in vivo suele ser inferior a la encontrada en los estudios in vitro preliminares. La causa de la reducción de la actividad terapéutica es, en muchos casos, la baja biodisponibilidad, es decir, la extensión y velocidad con que el principio activo, o fármaco en cuestión, alcanza las dianas terapéuticas en el organismo. Para la evaluación de la eficacia terapéutica es necesario tener en cuenta la vía de administración, los mecanismos fisiológicos y el metabolismo del fármaco. La biodisponibilidad que presentan la mayoría de los fármacos administrados por vía sistémica suele ser baja, la concentración en plasma puede incluso encontrarse por debajo de los niveles de efectividad, requiriéndose la administración de nuevas dosis. En tales casos, la falta de confianza del paciente en la eficacia de los fármacos les hace recurrir a repetidas administraciones, que pueden llevarles a sobredosis con dramáticos resultados en muchos casos. Actualmente, los sistemas de liberación controlada (SLC) permiten mejorar la biodisponibilidad de los fármacos previniendo la degradación prematura, controlando la velocidad de liberación, disminuyendo los efectos secundarios y dirigiéndolos a las dianas terapéuticas. La FDA (Food and Drug Administration) aprobó en 1990 el primer SLC, el “Liposomal amphotericin B”, y desde entonces se han comercializado más de diez SLC para el tratamiento de enfermedades como el cáncer, infecciones, o enfermedades degenerativas musculares (Zhang y cols., 2013) (Figura 1), siendo millones los pacientes que actualmente se benefician de estos avances. Como consecuencia, se ha producido un cambio económico relacionado con el desarrollo de nuevos fármacos. El coste y tiempo promedios requeridos para desarrollar un SLC es aproximadamente de 2050 millones de dólares (USD) y 3-4 años, que es significativamente menor que para el desarrollo de un nuevo fármaco, aproximadamente 500 millones USD y 10 años. Los SLC se basan en incorporar el agente terapéutico a un compuesto de naturaleza polimérica, de manera que aquél se vaya liberando de una manera predeterminada. Dependiendo de la formulación farmacéutica y de la aplicación requerida, el tiempo de liberación puede ir de varias horas hasta un mes o incluso varios años. Se ha estudiado una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos como ! ! ! 8 transportadores de fármacos que incluyen tanto componentes hidrófobos como hidrófilos. Con objeto de establecer la aplicabilidad de los SLC, los estudios de las diversas interacciones polímero-polímero, polímero-principio activo, polímero-disolvente y polímero-medio fisiológico son de especial relevancia. Aunque en principio las combinaciones de materiales son ilimitadas, hay varios aspectos que restringen la aplicabilidad de muchos de ellos en liberación controlada, como son la biocompatibilidad, la toxicidad propia y la de los subproductos correspondientes, incluso la necesidad de eliminación de muchos de ellos vía quirúrgica. También hay que tener en cuenta el coste económico de producción de estos sistemas. Figura 1. Sistemas de liberación controlada aprobados por la FDA (Zhang y cols., 2013) Las propiedades físicas y químicas de los SLC son decisivas para producir sistemas “inteligentes” que regulen específicamente la permeabilidad, la respuesta al medio, la funcionalidad superficial, la biodegradabilidad y los lugares de reconocimiento biomolecular. Los avances de la química de materiales han impulsado el desarrollo de nuevos SLC biodegradables y biocompatibles, focalizados a determinadas dianas terapéuticas que además puedan responder a determinados estímulos. En este sentido, la nanotecnología está jugando un papel muy importante ya que el tamaño de las nanopartículas (NPs) es un factor determinante en la biodistribución (Zhang y cols., 2013). El control del tamaño y forma de un SLC particulado mediante nanofabricación y nanomanofacturación jugarán un importantísimo papel en el futuro (Wong y Choi, 2015). El desarrollo de avanzados sistemas poliméricos de transporte y liberación de fármacos, capaces de responder a estímulos o señales fisiológicas en el ambiente ! ! ! 9 intracelular (ej., iones, proteínas, enzimas, cambios de pH, temperatura, condiciones redox) está suponiendo desde la pasada década un área de investigación preferente (Bajpai y cols., 2008). De manera muy eficaz se ha conseguido incorporar en las estructuras poliméricas ciertas unidades estructurales reactivas que pueden provocar tanto cambios estructurales en el SLC como liberar directamente la molécula del fármaco, que previamente es anclada mediante enlaces covalentes (Wei y cols., 2013). La Figura 2 muestra un ejemplo del diseño de copolímeros de naturaleza anfifílica capaces de responder a estímulos en el ambiente intracelular. Figura 2. Diseño de copolímeros dibloque anfifílicos que responden a estímulos (temperatura, pH, condiciones redox) (Wei y cols., 2013) Los polímeros redox son macromoléculas electroactivas que contienen grupos funcionales que pueden ser oxidados (pierden electrones) y reducidos (ganan electrones) (Figura 3). Aparte de sus aplicaciones en la producción de energía (baterías, células solares y termoeléctricas, etc.) estos polímeros tienen un importante campo de aplicaciones en medicina como SLC, biosensores, actuadores y superficies inteligentes (Figura 4) (Casado y cols., 2016). ! ! ! 16 b) Poliamidas estereorregulares análogas al Nylon 6 c) Poliamidas análogas al Nylon 6,6 y Nylon 5,6 d) Poliamidas estereorregulares análogas al Nylon 3 mediante ROP Esquema 5. Poliamidas basadas en carbohidratos (Galbis y cols., 2016) Los poliésteres lineales alifáticos se han preparado a partir de ácidos aldáricos y dioles alifáticos, o por reacción de ácidos dicarboxílicos alifáticos con alditoles. También se han llevado a cabo modificaciones del PET (polietilentereftalato) y del PBT (polibutilentereftalato) sustituyendo el etilenglicol y el butilenglicol por unidades de alditol en diversas proporciones. El ácido ftálico también ha sido sustituido por unidades de ácidos aldáricos de estructura bicíclica (D-gluco y D-galacto) (Esquemas 6 y 7). Estos ! ! ! 17 polímeros modificados con unidades de azúcar presentaron propiedades físicas y mecánicas muy interesantes, y resultaron ser más fácilmente degradables tanto bajo condiciones hidrolíticas como enzimáticamente. Poliésteres lineales derivados de L-arabinitol y xilitol Poliésteres derivados de ácido galactárico Esquema 6. Poliésteres alifáticos (Galbis y cols., 2016) ! ! ! 18 Esquema 7. Poliésteres aromáticos (Galbis y cols., 2016) También se sintetizaron policarbonatos a partir de alditioles y poliesteramidas a partir de aminoalcoholes derivados de carbohidratos, así como poliureas a partir de diaminas (Galbis y cols., 2016). Los poliuretanos se prepararon a partir de alditoles y diisocianatos comerciales como el HMDI (hexametilendiisocianato) y el MDI [4,4’-metilen-bis(fenilisocianato)]. Se demostró que la presencia de grupos metoxilo fue determinante en la hidrodegradabilidad de los mismos, los derivados de pentitoles conteniendo mayor número de grupos metoxilo se degradaron más rápidamente (Esquema 8). Esquema 8. Poliuretanos lineales (De Paz y cols., 2007; Ferris y cols., 2011; Marin y cols., 2008; Marin y cols., 2009) ! ! ! 19 Los Co-poliuretanos preparados a partir de L-arabinitol y 2,2’-ditioetanol, se degradaron en presencia de glutatión bajo condiciones fisiológicas (Esquema 9). Esquema 9. Poliuretanos degradables por glutatión (De Paz y cols., 2007; Ferris y cols., 2010; Ferris y cols., 2012) Algunos de los polímeros mostrados en el Esquema 10 fueron estudiados como matrices para sistemas de liberación controlada del fármaco anticanceroso metotrexato in vitro, presentando un excelente perfil de liberación a nivel de colon. Esquema 10. Poliuretanos degradables por glutatión (Campiñez y cols., 2013; Ferris y cols., 2014) ! ! ! 20 El Esquema 11 muestra una serie de poliuretanos basados en hexitoles, de ellos el PU(DipMa-HDI) fue transformado, por hidrólisis de los grupos isopropilidenos protectores de los grupos hidroxilo secundarios del D-manitol, en el más hidrofílico PU(Ma-HDI) que se degradó totalmente a pH 7, en 7 días. Esquema 11. Poliuretanos lineales derivados de monómeros acetalizados (Begines y cols., 2016) Según los antecedentes expuestos podemos concluir diciendo que la presencia en las cadenas poliméricas de enlaces disulfuro junto con unidades estructurales que aporten hidrofilia a los correspondientes materiales, asegura la biodegradación de los mismos en ambientes reductores hipoxídicos. Con estos patrones podemos diseñar sistemas poliméricos biodegradables anfifílicos con propiedades redox. La hidrofilia puede ser modulada por la presencia de unidades estructurales derivadas de carbohidratos, las cuales además garantizarán la menor toxicidad de estos materiales para aplicaciones biomédicas. ! ! ! 21 3. OBJETIVOS Como se indica previamente, uno de los grandes retos hoy en día es el interés por la liberación controlada de fármacos centrándose los estudios en el desarrollo de nuevos sistemas que sean biodegradables y biocompatibles. En este sentido, en el presente Trabajo Fin de Grado se plantean los siguientes objetivos: 1. Síntesis y caracterización de monómeros que contengan grupos hidroxilos primarios a partir de monosacáridos fácilmente asequibles. También se prepararán monómeros que contengan grupos isocianato y grupos disulfuro como parte del esqueleto. 1.1. Dado que los polímeros tienen que ser biodegradables y biocompatibles, los correspondientes monómeros deben presentar una constitución adecuada. Así, se prepararán monómeros derivados de carbohidratos que aportarán a los polímeros un carácter anfifílico. 1.2. Para asegurar la degradación de los correspondientes polímeros en ambientes reductores, se prepararán monómeros que contengan enlaces disulfuro en su estructura. 1.3. Estos monómeros, además deben contener grupos funcionales reactivos para las reacciones de polimerización. Estos serán grupos hidroxilos libres y grupos isocianato. 2. Síntesis de polímeros: 2.1. Las reacciones de polimerización se llevarán a cabo por poliadición de los monómeros dando lugar a poliuretanos. 2.2. Se emplearán distintas proporciones de los monómeros hidroxílicos con el fin de obtener una serie de Co-poliuretanos cuya degradación pueda ser modulada por la mayor o menor presencia de grupos funcionales. 3. Finalmente se procederá a la caracterización estructural tanto de los monómeros como de los nuevos polímeros. Para ello se utilizarán las técnicas espectroscópicas habituales FTIR-ATR y RMN. Los tamaños moleculares de los polímeros se determinarán mediante GPC. ! ! ! 22 4. METODOLOGÍA Y PARTE EXPERIMENTAL 4.1 Métodos generales Los reactivos utilizados en las distintas síntesis fueron comerciales (Sigma-Aldrich Chemical Co, Fluka, Merck y Panreac) y se utilizaron sin purificación previa. Los disolventes se secaron y purificaron, cuando fue necesario, utilizando los métodos estándares. Los reactivos que así lo requerían fueron almacenados en frío a 4 °C y se manejaron bajo atmósfera inerte. Las reacciones en atmósfera inerte se llevaron a cabo bajo atmósfera de argón. Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de la casa Electrothermal en tubos capilares abiertos y sin corregir. Las evaporaciones de los disolventes se efectuaron a presión reducida (0,1 a 20 mmHg) y temperaturas inferiores a 60 °C. Cromatografía en capa fina El seguimiento de las reacciones se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina (c.c.f.). Las cromatografias en capa fina con fines cualitativos se realizaron en cromatoplacas de Sílica Gel 60 F254 sobre aluminio (Merck) de 0,2 mm de espesor. Como eluyentes se emplearon los que se indican en cada caso. La detección de los compuestos en las placas se llevó a cabo mediante la exposición de éstas a la luz UV (λmax = 254 nm) y posterior revelado por inmersión en disoluciones de H2SO4 en EtOH al 10% o ácido fosfomolíbdico en EtOH al 3%, y posterior calentamiento. Espectros de absorción en el infrarrojo (IR) Los espectros de absorción de IR se registraron en un espectrofotómetro JASCO FT/IR-4200 equipado con ATR. Espectros de resonancia magnética nuclear de protón (1H-RMN) Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de protones (1H-RMN) se registraron en espectrofotómetros Bruker AV-500 (500,13 MHz) y AMX-300 (300,1 MHz). Las muestras se prepararon en disolución de deuterocloroformo o dimetilsulfóxido deuterado. Los valores de desplazamientos químicos (δ) se expresaron en ppm referidos al tetrametilsilano (SiMe4) y los valores de las constantes de acoplamiento (J) se refirieron ! ! ! 23 en Hertzios (Hz). La multiplicidad de señales se indica mediante las abreviaturas: s (singulete), sa (singulete ancho), d (doblete), dd (doble doblete), t (triplete), m (multiplete). Espectros de resonancia magnética nuclear de carbono-13 (13C-RMN) Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de Carbono-13 (13C-RMN) se realizaron en los mismos equipos nombrados anteriormente a 125 ó 75 MHz respectivamente. Los espectros se calibraron usando las señales de los disolventes como referencias internas. Para facilitar la interpretación de los espectros se utilizaron las siguientes técnicas: - Experimentos DEPT (Distorsionless Enhacement by Polarization Transfer). La longitud de pulsos utilizada se ha elegido de forma que los carbonos primarios y terciarios aparecen como fase positiva, los secundarios como fase negativa y los carbonos que no están unidos a hidrógeno no aparecen. - Experimentos de correlación homonuclear (COSY 1HlH). - Experimentos de correlación heteronuclear (HETCOR 1H-13C). Cromatografía de permeabilidad en gel (GPC) Las cromatografías de permeación en gel (GPC) se realizaron en un cromatógrafo Waters 1515 utilizando un detector de índice de refracción Waters 2414 y equipado con dos columnas Styragel® HR (7,8 x 300 mm) dispuestas en serie, termostatizado a 60 °C, usando dimetilformamida (DMF) con bromuro de litio, grado HPLC, como fase móvil. El flujo empleado fue de 0,5 mL/min y la concentración de los estándares y las muestras fue del 0,1% p/v. Los pesos moleculares fueron estimados usando patrones de poliestireno. ! ! ! 24 4.2 Síntesis de monómeros 3,3’-ditiodipropionato de dietilo (2) El ácido 3,3’-ditiopropiónico (1) (10 g, 47,6 mmol) se introdujo en un matraz y se adicionaron 30 mL de etanol, 30 mL de tolueno y 0,17 mL de ácido sulfúrico. La mezcla de reacción se agitó a reflujo con una trampa Dean Stark durante 15 horas. Pasado este tiempo se concentró a sequedad, el residuo resultante se disolvió en dietil éter y la disolución se lavó tres veces con 20-30 mL de agua hasta pH neutro. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró a sequedad para dar el producto 2 como un líquido incoloro (12,64 g, 99,84 %). Los datos espectrofotométricos coincidieron con los descritos en la literatura para el compuesto 2 (Teramura y cols., 2007). 3,3’-disulfanediildi(propanohidrazida) (3) A una disolución de 2 (12,64 g, 47,53 mmol) en 13,6 mL de metanol se le añadió una disolución acuosa al 65% de hidrazina monohidrato (22,71 mL, 304,16 mmol) y la mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente. La suspensión obtenida se filtró, se lavó con metanol y el sólido filtrado se recristalizó de metanol para dar lugar al producto 3 como un sólido blanco (7,81 g, 69%). Sus características físicas fueron idénticas a las descritas en la literatura para este compuesto 3, p.f. 130-131 °C [Lit. 125-126 °C (Vercruysse KP y cols., 1997)]. SS O O O O SS O H N O N H NH2 H2N ! ! ! 25 2,2’-ditiodietildiisocianato (DTDI) (4) Una disolución del compuesto 3 (7,23 g, 30,4 mmol) en una mezcla de ácido clorhídrico y agua (5,75 mL de HCl concentrado y 28,08 mL de agua) se agitó en un baño de hielo durante cinco minutos. A continuación se adicionó gota a gota una disolución de nitrito de sodio (4,13 g, 60,50 mmol) en agua (5,75 mL) y 31 mL de tolueno. La agitación se mantuvo a 5 °C durante 20 minutos y la suspensión resultante se filtró. La fase orgánica se separó, se secó con sulfato de sodio anhidro y se filtró. El filtrado se calentó a reflujo durante 30 minutos. Finalmente la disolución se concentró a sequedad obteniéndose el compuesto 4 como un líquido amarillento (4,80 g, 77,4%) (Teramura y cols., 2007). 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ (ppm) 2,90 (t, 4H, J = 6,3 Hz, SCH2), 3,64 (t, 4H, J = 6,3 Hz, OCNCH2). 13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ (ppm) 39,7 (SCH2), 41,6 (OCNCH2), 123,6 (NCO). 1,2:3,4:5,6-tri-O-isopropilidén-D-manitol (6) A una suspensión de D-manitol comercial (5) (40 g, 0,21 moles) en 500 mL de acetona se le añadieron 4 mL de ácido sulfúrico concentrado y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La disolución resultante se neutralizó por adición gota a gota de una disolución de sosa concentrada hasta pH neutro. Las sales formadas se filtraron y la disolución resultante se concentró a un tercio de su volumen original. A continuación se diluyó al doble con agua dando lugar a una cristalización en masa, obteniéndose el compuesto 6 (38,91 g, 58,95%) que se utilizó en la siguiente etapa sin SSOCN NCO OO O O O O ! ! ! 32 grupos isopropilideno protectores, obteniéndose así el 3,4-O-isopropilidén-D-manitol (7), con un rendimiento del 91,3% (Esquema 13). Esquema 13. (a) Acetona, H2SO4 concentrado; (b) CH3COOH, 40 ºC. ! 5.2 Síntesis y caracterización de polímeros Síntesis de Co-poliuretanos derivados del DTDI Se han preparado los Co-poliuretanos 9, 10, 11, 12 y 13 a partir del 2,2’- ditiodietildiisocianato (4), 3,4-O-isopropilidén-D-manitol (7) y 2,2’-ditiodietanol (8). El método general consistió en disolver una mezcla de los dioles 7 y 8, en las proporciones correspondientes, en THF y adicionar 4 junto con una gota de dilaurato de dibutilestaño, que se utilizó como catalizador (Ferris y cols., 2011) (Esquema 14). Esquema 14. Síntesis de los Co-poliuretanos PU{[(iPr)Man]m:[ditiodietanol]n-DTDI} (9-13). Las polimerizaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 24 horas, tras las cuales se detuvo la reacción por adición de terc-butanol. Los poliuretanos se aislaron HO OH OH OH OH OH OO O O O O HO OH OH O O OH a b 5 6 7 SSOCN NCO HO SSOH HO OH OH O O OH + + Dilaurato de dibutilestaño THF 4 7 8 OSSO H NSSN H OO H NSSN H O O OH O O OH O O mn 9-13 ! ! ! 33 por precipitación sobre dietil éter frío, y posterior filtración, lavando con el mismo disolvente. Finalmente fueron secados a vacío durante varios días. Los rendimientos obtenidos fueron del orden del 50-60% y los pesos moleculares que presentaron los nuevos copolímeros estuvieron entre 23000 y 78000 g/mol con polidispersidades de 1,1 a 1,9 (Tabla 1). Tabla 1: Comparación de pesos moleculares y rendimientos de los Co-poliuretanos PU{[(iPr)Man]m:[ditiodietanol]n-DTDI} (9-13). Co-poliuretano Rto. (%) Mwa Mna Mw/Mna 9 55 27000 24800 1,09 10 51 25000 22900 1,08 11 56 23000 20900 1,08 12 60 28000 24700 1,13 13 68 27000 23800 1,13 a Pesos moleculares y polidispersidades estimados mediante GPC usando patrones de poliestireno y utilizando DMF con bromuro de litio como fase móvil. El análisis de los espectros de RMN de protones y carbono-13 de los compuestos preparados demuestran la formación de los enlaces uretano. La elucidación de las señales se llevó a cabo empleando técnicas de espectroscopía bidimensional (COSY y HETCOR). En el RMN de protones se aprecian las dos señales correspondientes a los H de cada uno de los NH formados. En los espectros de carbono-13 también se evidencia la presencia de los uretanos formados, apareciendo dos señales de carbonilo diferentes a 155,9 y 156,3 ppm. Así mismo se pueden observar el resto de señales esperadas, siendo significativa la disminución en la intensidad de las señales correspondientes a los CH3 del azúcar a medida que disminuye su proporción en la mezcla de partida. Analizando con detalle la intensidad de estas señales mediante la integración de las mismas se pudo determinar la proporción de cada diol contenida en cada uno de los copolímeros preparados. Estas proporciones se ajustaron bastante a las de partida para cada caso, excepto para los polímeros 12 y 13 en las que se observó una pequeña desviación (Tabla 2). Los espectros estudiados también revelan que los grupos hidroxilos secundarios del manitol reaccionaron con el diisocianato 4, por lo que el poliuretano obtenido no es lineal, sino que posee cierto grado de ramificación. Las señales de entrecruzamiento se observan ! ! ! 34 claramente en el espectro de carbono-13, donde aparecen varias señales para cada uno de los carbonos de la cadena de manitol. En ensayos anteriores realizados el grupo de investigación se comprobó que el homopolímero derivado de manitol presentó hasta un 10% de entrecruzamiento (Romero-Azogil, 2014). Tabla 2: Comparación de las proporciones de partida y las halladas de dioles en los Co-poliuretanos PU{[(iPr)Man]m:[ditiodietanol]n-DTDI} (9-13) Co-poliuretano Proporciones de partida Proporciones halladas m n m n 9 50 50 50 50 10 80 20 80 20 11 20 80 25 75 12 60 40 52 48 13 40 60 50 50 Finalmente, en el espectro de infrarrojos de los Co-poliuretanos 9-13 se observan bandas de vibración típicas de tensión y flexión de los uretanos (1680, 1530 cm-1) y la vibración de tensión OH a 3330 cm-1, así como la vibración de esqueleto de los metilos de los grupos isopropilideno a 1250 cm-1, variando la intensidad de las señales en función de la proporción de manitol y ditiodietanol presente en cada Co-poliuretano. Actualmente, en el grupo de investigación, se están llevando a cabo diversos estudios de degradación tanto en condiciones hidrolíticas como en condiciones reductoras, mediadas por glutatión (ambas en condiciones fisiológicas), de los homopolímeros previamente sintetizados y de los Co-poliuretanos que se presentan en este trabajo. Los resultados preliminares muestran que, en ambos casos, el porcentaje de degradación aumenta con la proporción del fragmento azucarado del copolímero, por lo que se deduce que la degradación viene determinada más bien por la presencia de grupos hidroxilo libres del polímero, es decir por su hidrofilia, y no tanto por la proporción de puentes disulfuro presentes en el mismo. ! ! ! 35 6. CONCLUSIONES 1. Con objeto de preparar polímeros sensibles al ambiente reductor presente en las células tumorales, que puedan ser aplicados como SLC de fármacos, es necesario sintetizar previamente los monómeros adecuados. Estos monómeros deben estar debidamente funcionalizados, por ejemplo con grupos disulfuro que se reducen en ambientes hipoxídicos reductores. La presencia en estos monómeros de grupos hidroxilo libres, o grupos protectores fácilmente eliminables, facilita la degradación tanto hidrolítica como mediada por glutatión de los correspondientes polímeros. 2. En este Trabajo Fin de Grado ha sido posible sintetizar, con buenos rendimientos, dos monómeros bifuncionales necesarios para llevar a cabo las reacciones de polimerización: un diisocianato que contiene el grupo disulfuro y el 3,4-O-isopropiliden-D-manitol que contiene cuatro grupos hidroxilo libres y un grupo protector que puede hidrolizarse fácilmente. También se ha utilizado como comonómero el 2,2’-ditiiodietanol. 3. Para conseguir sistemas cuya degradación pueda ser modulada por la presencia de los distintos grupos funcionales, se han preparado cinco Co-poliuretanos, mediante reacciones de poliadición, con buenos rendimientos, empleando distintas proporciones de los monómeros anteriormente mencionados. Las proporciones derivado de D-manitolditiodietanol fueron 80:20, 60:40, 50:50, 40:60 y 20:80, que se hicieron reaccionar con la cantidad equivalente del diisocianato. 4. Mediante 1H-RMN se ha demostrado que los Co-poliuretanos han incorporado los monómeros en prácticamente las mismas proporciones que en la fuente de alimentación de las correspondientes reacciones de poliadición, si bien presentaron cierto grado de entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas. 5. Con posterioridad a la finalización de este trabajo experimental, el grupo de investigación ha demostrado que los Co-poliuretanos más hidrofílicos, con mayor concentración de grupos hidroxilo libres, se degradan más rápidamente en presencia de glutatión bajo condiciones fisiológicas. ! ! ! 36 7. BIBLIOGRAFÍA Bajpai AK, Shukla SK, Bhanu S, Kankane S. Responsive polymers in controlled drug delivery. Prog. Polym. Sci. 2008; 33(11): 1088–118. Begines B, Zamora F, Benito E, García-Martín MG, Galbis JA. Conformationally restricted linear polyurethanes from acetalized sugar-based monomers. J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2012; 50(22): 4638–46. Campiñez MD, Aguilar-de-Leyva Á, Ferris C, de Paz MV, Galbis JA, Caraballo I. Study of the properties of the new biodegradable polyurethane PU (TEG-HMDI) as matrix forming excipient for controlled drug delivery. Drug Dev. Ind. Pharm. 2013; 39(11):1 758–64. Casado N, Hernández G, Sardon H, Mecerreyes D. 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ANEXOS: ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ATR Attenuated Total Reflection 13C-RMN Resonancia Magnética Nuclear de carbono-13 CDCl3 Cloroformo deuterado CH3COOH Ácido acético COSY Correlation Spectroscopy d Doblete dd Doble doblete DEPT Distorsionless Enhacement by Polarization Transfer DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado DTDI 2,2’-ditiodietildiisocianato EtOH Etanol FDA Food and Drug Administration FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy g Gramos GPC Cromatografía de permeación de gel HCl Ácido clorhídrico HETCOR Heteronuclear Correlation Spectroscopy 1H-RMN Resonancia Magnética Nuclear de protones HMDI Hexametilendisiocianato HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia Hz Hertzios H2NNH2 Hidrazina H2O Agua H2SO4 Ácido sulfúrico IR Infrarrojo J Constante de acoplamiento Lit. Literatura m Multiplete Man Manitol MDI 4,4’-metilen-bis(fenilisocianato) ! ! ! 40 MHz Mega Hertzios min Minuto mL Mililitros mmHg Milímetros de mercurio mmol Milimol Mn Peso Molecular promediado en número Mw Peso Molecular promediado en peso Mw/Mn Polidispersidad NaNO2 Nitrito de sodio NPs Nanopartículas p.f. Punto de fusión PBT Polibutilentereftalato pDNA Plasmid DNA PEG Polietilenglicol PET Polietilentereftalato ppm Partes por millón PU Poliuretano ROP Ring opening polymeritation RMN Resonancia Magnética Nuclear Rto. Rendimiento s Singulete sa Singulete ancho siRNA Small interfering RNA SLC Sistemas de Liberación Controlada t Triplete SiMe4 Tetrametilsilano THF Tetrahidrofurano USD Dólar estadounidense UV Ultravioleta δ Desplazamiento químico λ Longitud de onda ν Número de onda