Regulación de la función sináptica de neurexinas por presenilinas: Implicaciones en la enfermedad de alzheimer

N  De REG U EURE X E U N pa am e U LACI Ó X INAS P N LA E N IVERSI n o de F Ó N DE L A P OR PR E N FER M TESI S Emilia S e  DAD D E F isiologí a A FUN C E SENI L M EDAD D S DOC T Se ián e illa, 2 0 E SEVI L a Médic a C IÓN SI L INAS. I D E A L Z T ORAL Mo illa 0 12 L LA a y Bio í s NÁPTI C MPLIC A Z HEIME R s ica C A DE A CION E R. E S     Don Dep a CE R Que i ul a Impl de d   DEPAR T FACUL F ancisc o a amen o R TIFICA: Doña E m a do “Reg u icaciones d oc o po l T AMEN T TAD DE o Gómez de Fisiol o m ilia Se i u lación de en la en e a Uni e si T O DE FI S MEDICI N Scholl, P o gía Médic a i án Mo ill a la unció n medad d e dad de S e S IOLOG Í N A. UNI V P o eso T a y Bio ísi c a ha eali z n sináp ic a e A lzheim e e illa.  Í A MÉDI C V ERSID A T i ula de c a de la U n z ado baj o a de neu e ” que p e Fdo.: Se illa a C A Y BI O A D DE S E Uni e sid a n i e sidad su di ec c exinas p o s en a pa a F ancisc o 6 de sep i e O FÍSICA . E VILLA. a d, adsc i de Se illa c ión el a o p eseni l a op a al g o Gómez S emb e de . o al a bajo l inas. g ado S choll 2012  Ag adecimien os Después de an o iempo espe ando a que el momen o de los ag adecimien os se hicie a ealidad, quizás no encuen e palab as pa a desc ibi los sen imien os que a lo an en mi in e io , pe o lo oy a in en a . En p ime luga quisie a ag adece a F ancisco Gómez Scholl, di ec o de es a Tesis, la opo unidad que me b indó y la con ianza deposi ada en mí pa a el desa ollo de es a ma a illosa Tesis doc o al. Ag adezco eno memen e su pasión po la ciencia y su a án po ansmi i me sus conocimien os a lo la go de odos es os años. El camino no ha sido ácil, pe o g acias a él he ap endido a lucha po un obje i o. G acias po compa i conmigo es a a en u a cien í ica y po habe me hecho mejo pe sona, an o p o esional como pe sonalmen e. Mi más since o ag adecimien o a Amalia Ma ínez Mi . Sin aquella p ime a en e is a en su despacho y la pos e io p esen ación con F ancisco no hab ía llegado has a donde es oy. G acias po su apo ación en la esc i u a del a ículo cien í ico, u o de es a Tesis doc o al y muy pa icula men e po habe nos dado la opo unidad de o ma pa e del IBiS, habiéndonos sacado de aquella ca acola que an buenos momen os nos dió. Mi g a i ud a los doc o es: Ca los Sau a, Ra ael Fe nández Chacón, Ja ie Vi o ica y Albe o Pascual; po su disponibilidad y colabo ación en es e abajo. Al Depa amen o de Fiosología Médica y Bio ísica, a odos los p o eso es, PAS, écnicos y beca ios/con a ados que me han acompañado es os años. De mane a especial ag adece a mis compañe os de labo a o io la ayuda y sabidu ía p es ada. Pa icula men e a Juan An onio po habe me enseñado la mayo ía de los conocimien os adqui idos. Des aco su hon adez, su bondad y la paciencia que ha enido conmigo. A Ma isa, po su ayuda, su expe iencia y su ca iño. Po odos esos años que aún nos espe an compa iendo con idencias y amis ad. Ojalá odos e ean como e eo yo. A En ique a, Sil ia, Ra a y Luis po anima me en el sp in inal. A mis que idísimos “chacones” po habe me ayudado siemp e en los buenos momen os y en los no an buenos. A Leo po esas isas compa idas, po alo a me como nunca nadie lo ha hecho y po ese ca iño an especial que nos une. A José An onio po anima me, escucha me y po compa i conmigo esa a en u a inol idable del descenso de ba ancos en el nacimien o del Guadalqui i . A Fabi po su simpa ía y esa son isa ca ac e ís ica que nos aleg a el día. A José Luis po su amplio conocimien o y ayuda nos en odo lo que pueda y más. A Mª Ca men, Alejand o, Ángela, Josi , José Luis Rozas, Glo ia, Pablo y Pe ico po los momen os i idos. A mis compañe os del IBiS po la acogida an buena que u e y po ese quin o año jun o a oso os que ojalá es é po eni . En especial a Inma, po su ánimo y compañía en es os úl imos meses de abajo. A mis amigos del depa amen o: Rocío, Raquel, Lau a, Ma ga, Mª Ángeles, Imane, Eli, Ángel, Susana, Juanjo, Alexand a, José An onio y José Ma ía po ues o ca iño, comp esión y apoyo. Es es upendo mezcla el compañe ismo con la amis ad de odos oso os. A mis niñas del más e : Mª Luz, Mª José, Daniela, Lau a y Ve o. G acias a oso os las a des del más e ue on más amenas. Espe o segui compa iendo con oso as esas ce eci as a media a de. A mis amigos, ya que odas mis aleg ías, log os, sen imien os y i encias las he compa ido con oso os. Es oy absolu amen e con encida de que puedo p esumi de los g andes amigos que engo, lo que me hace sen i una pe sona muy a o unada. A esos compañe os de la acul ad que se con i ie on en g andes amigos. Pa icula men e a C is ina y Glo ia po compa i es e camino conmigo desde hace ya diez años y a mi Ch is ian, la mejo pe sona que he conocido. De o ma muy especial, quie o deja cons ancia del ag adecimien o a mi amilia, po apoya me incondicionalmen e a lo la go de mi ida. A mis he manos, po hace me sen i siemp e an especial. A mis pad es, po c ee siemp e en mí y es a ahí en odo momen o. Mi lucha ha sido ues a lucha, que sepáis que nunca lo ol ida é. Y po úl imo y no menos impo an e, a i Juan José, po a anca me siemp e una son isa, po ayuda me a lucha po lo que quie o, po aguan a me en los días en los que ni yo misma me aguan o, pe o sob e odo, po hace me eliz. Es a Tesis no hubie a podido e la luz sin el apoyo de odos oso os. Sabéis que he pasado po momen os du os, pe o g acias al es ue zo, la cons ancia y el abajo, hoy es oy aquí ag adeciendo odo el apoyo y ca iño que he ecibido de oso os. Una ez más y que sepáis que nunca me cansa é de epe i lo: MUCHÍSIMAS GRACIAS. “La ciencia se compone de e o es, que a su ez, son los pasos hacia la e dad” Julio Ve ne (1828-1905)   “A eces, el eplan eamien o de un p oblema es más decisi o que el hallazgo de la solución, que puede se un pu o asun o de habilidad ma emá ica o expe imen al. La capacidad de susci a nue as cues iones, nue as posibilidades de mi a iejos p oblemas, equie e una imaginación c ea i a y de e mina los a ances cien í icos au én icos" Albe Eins ein (1879-1955)   ÍNDICE ÍNDICE FIGURAS Figu a 25. E ec o del inhibido TAPI-1 en el p ocesamien o de HA-βN x1 en cul i os de neu onas .................................................................................................................................... 99 Figu a 26. Acumulación de los CTFs de las neu exinas en las acciones sináp icas de los a ones cDKO de PS ......................................................................................................... 100 Figu a 27. Reclu amien o de PS1 a las sinapsis mediadas po neu exinas-neu oliguinas ................................................................................................................................................... 102 Figu a 28. Colocalización de PS1 con ma cado es sináp icos en las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 .............................................................................................................................. 103 Figu a 29. Esquema expe imen al de un ensayo de co-cul i o. ......................................... 104 Figu a 30. Reclu amien o de PS1 en las hemisinapsis mediadas po neu exina- neu oliguina ............................................................................................................................. 105 Figu a 31. Esquema expe imen al de un ensayo de in ección- ans ección.. .................. 106 Figu a 32. Reclu amien o de neu exinas a sinapsis mediadas po HA-Nlg1 en neu onas de icien es en PS. .................................................................................................................... 107 Figu a 33. Esquema expe imen al de un ensayo de in ección-co-cul i o. ....................... 108 Figu a 34. Reclu amien o de neu exinas en las hemisinapsis mediadas po HA-Nlg1 en neu onas de icien es en PS ................................................................................................... 109 Figu a 35. Incubación con soluciones despola izan es ac i an el p ocesamien o de las neu exinas en cul i os de neu onas de hipocampo ........................................................... 112 Figu a 36. Cuan i icación de los ni eles de CTF de neu exinas en cul i os incubados con KCl ............................................................................................................................................ 113 Figu a 37. La despola ización ac i a el p ocesamien o de HA-βN x1 en cul i os de neu onas de hipocampo ......................................................................................................... 114 Figu a 38. Esquema ep esen a i o del p oceso de in ección- ans ección del ensayo expe imen al pa a el análisis de libe ación esicula ......................................................... 117 Figu a 39. E ec o de la inhibición de la ac i idad -sec e asa po DAPT sob e la libe ación de esículas sináp icas en las sinapsis mediadas po neu exinas-neu oliguinas. ......... 119 Figu a 40. Cuan i icación de los ni eles de luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cul i os a ados con DAPT ................................................................................................... 121 Figu a 41. Análisis de la libe ación de esículas en neu onas de hipocampo de icien es en PS median e exp esión len i i al de PS1 D385A ............................................................ 123 Figu a 42. Cuan i icación de los ni eles de luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cul i os in ec ados con PS1 D385A ...................................................................................... 124 ÍNDICE FIGURAS Figu a 43. Acumulación de los CTFs de las neu exinas en neu onas de hipocampo que ca ecen de la exp esión de PS............................................................................................... 127 Figu a 44. Exp esión len i i al de C e y C e en cul i os de neu onas ............................ 128 Figu a 45. Análisis de la luo escencia de sypHy en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2+/- in ec adas con C e. .................................................................................. 130 Figu a 46. Análisis de la luo escencia de sypHy en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec adas con C e o C e. ...................................................................... 131 Figu a 47. Cuan i icación de la luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2+/- in ec adas con C e .............................................................. 133 Figu a 48. Cuan i icación de la luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec adas con C e o C e ................................................... 134 Figu a 49. Cuan i icación de la luo escencia de Vamp2 en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec ados con C e o C e.. ................................................. 135 Figu a 50. PS o ma un complejo con β-neu exina1 en células Hek 293T ........................ 137 Figu a 51. La inhibición de PS inc emen a los ni eles de β-neu exina en la memb ana de células MEF KO y de neu onas de icien es en PS1. ............................................................ 139 Figu a 52. Dis ibución de las neu exinas endógenas en axones de ec i os en PS. ...... 141 Figu a 53. La inhibición de PS inc emen a la in e acción en e HA-β-neu exina y CASK. ................................................................................................................................................... 143 Figu a 54. Reclu amien o de CASK en sinapsis mediadas po HA-Nlg1 en neu onas de icien es en PS1. .................................................................................................................. 144 Figu a 55. Reclu amien o de CASK y neu exinas en neu onas de hipocampo KO de PS ................................................................................................................................................... 145 Figu a 56. Exp esión y localización del ICD de neu exinas ................................................ 147 Figu a 57. El p ocesamien o de β-neu exina-1 es á a ec ado po los mu an es de PS1 asociados con FAD. ................................................................................................................ 150 Figu a 58. El p ocesamien o de las neu exinas es á a ec ado en a ones ansgénicos que exp esan mu an es de PS1 asociados con FAD. ......................................................... 152 Figu a 59. Alineamien o de las secuencias de neu exinas ................................................. 158 Figu a 60. Modelo del p ocesamien o sináp ico de las neu exinas dependien e de ac i idad. .................................................................................................................................. 167     1 INTRODUCCIÓN          INTRODUCCIÓN 21 1.1 MECANISMOS DE FORMACIÓN DE SINAPSIS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL. PAPEL DE NEUREXINAS Las sinapsis son adhesiones in e celula es especializadas en e neu onas, que pe mi en la ansmisión del impulso ne ioso. Las sinapsis ienen una es uc u a ca ac e ís ica, en la que se dis inguen es zonas: el e minal p esináp ico, la hendidu a sináp ica y el e minal pos sináp ico. La es uc u a asimé ica de las sinapsis pe mi e el sen ido de la ansmisión del impulso ne ioso desde el e minal p esináp ico al e minal pos sináp ico. La llegada de un po encial de acción al e minal p esináp ico induce la ape u a de canales de calcio dependien es de ol aje (VGCC), y como consecuencia de la en ada de calcio, se p oduce la usión de las esículas sináp icas con la memb ana libe ando el neu o ansmiso en la hendidu a sináp ica. La usión de las esículas sináp icas se es inge a una zona de e minada del e minal p esináp ico, la zona ac i a, donde se concen a un complejo p o eico in oluc ado en el anclaje y madu ación de las esículas sináp icas pa a la exoci osis y en el eclu amien o de VGCC (Südho , 2012). La zona ac i a con ibuye además a la localización p ecisa de los e minales p e- y pos sináp icos en en ados unos a o os median e la in e acción de moléculas de adhesión ans-sináp ica (Südho , 2012). Al ededo de la zona ac i a se encuen a una zona pe isináp ica donde iene luga la endoci osis de las esículas sináp icas (B odin y Shupliako , 2006). A ni el uncional, las esículas sináp icas pueden se di e enciadas en es g andes g upos: el con ingen e de esículas de libe ación ápida (RRP, eadily eleasable pool), el con ingen e de ese a y el de eposo (Südho , 2000). El RRP es el con ingen e de esículas impo an e pa a la libe ación ápida de neu o ansmiso es y comp ende de 5 a 9 esículas sináp icas medidas po FM1-43 en sinapsis de neu onas de hipocampo en cul i o (Mu hy y S e ens, 1999). Sin emba go, es e con ingen e cons i uye sólo una pequeña acción del conjun o o al de esículas. T as la libe ación del RRP iene luga el eclu amien o y la exoci osis de las esículas del con ingen e de ese a que p esen an una meno p obabilidad de libe ación que el RRP. El conjun o del RRP y el con ingen e de ese a cons i uyen el con ingen e de eciclaje o al que con iene en o no a 21-25 esículas en cul i o de neu onas del hipocampo (Mu hy y S e ens, 1999). El con ingen e de eciclaje o al ep esen a un po cen aje del o al de esículas sináp icas, que en neu onas de hipocampo es de al ededo de 200 esículas. Po an o, la mayo ía de las esículas en las sinapsis se encuen an en un es ado inac i o y cons i uyen el con ingen e de eposo. Una ez libe ado, el neu o ansmiso se une a ecep o es especí icos en el e minal pos sináp ico ac i ando la en ada de iones, p oduciéndose de es a o ma la p opagación del impulso ne ioso. INTRODUCCIÓN 22 Du an e el desa ollo del sis ema ne ioso cen al (SNC), y una ez comple ado el p oceso de guía axonal, los axones con ac an y o man sinapsis con las dend i as en las células diana median e a ias es a egias celula es (Shen y Schei ele, 2010). El con ac o inicial en e las neu onas p e- y pos sináp icas dispa a la o mación y pos e io madu ación de las sinapsis en los si ios de con ac o. En los úl imos años, el abajo de a ios g upos de in es igación ha lle ado a la ca ac e ización de la secuencia de e en os que se p oducen du an e la o mación de sinapsis (Wai es e al., 2005). En los e en os iniciales de la sinap ogénesis, la asociación de moléculas de adhesión ans-sináp ica gene a si ios de nucleación en las memb anas p e- y pos sináp icas, donde se inse an complejos mul ip o eicos que lle an al ensamblaje de los e minales p e- y pos sináp icos, espec i amen e. Se ha desc i o que la polime ización de ac ina p esináp ica y la inco po ación en la memb ana de esículas que con ienen componen es p e-ensamblados de la zona ac i a ocu en du an e una e apa emp ana en la o mación del e minal p esináp ico (Zhang y Benson, 2001; Maas e al., 2012). La polime ización del ci oesquele o de ac ina pod ía o ma un si io de anclaje pa a el eclu amien o pos e io de las esículas sináp icas (Colicos e al., 2001). El ensamblaje del e minal p esináp ico p ecede al ensamblaje del e minal pos sináp ico, que p obablemen e se o me median e la inco po ación g adual de sus componen es (B esle e al., 2004). A pesa de que se han iden i icado muchos de los componen es que apa ecen en las sinapsis, se desconocen en de alle los mecanismos molecula es que lle an al ensamblaje de las sinapsis una ez que se ha es ablecido el con ac o inicial y como és os se egulan po ac i idad sináp ica. La oposición de las memb anas sináp icas y la es abilidad de las es uc u as sináp icas e lejan la p esencia de mecanismos de adhesión ans-sináp icos. Exis en dis in os ipos de moléculas de adhesión homo ílicas que pa icipan en la o mación del ci cui o sináp ico, e incluyen a las cadhe inas y a la supe amilia de p o eínas con dominios inmunoglobulinas. Po o a pa e, se han iden i icado di e sos sis emas de adhesión he e o ílicos que in e ienen en los e en os iniciales de la o mación de las sinapsis (Shen y Schei ele, 2010). Los sis emas de adhesión he e o ílicos pueden conduci al ensamblaje de e minales p e- y pos sináp icos al ensambla complejos asimé icos de p o eínas a ambos lados de las sinapsis. En e es os des acan los sis emas de adhesión he e o ílicos mediados po E inaB y sus ecep o es EphB, Ne inasG y NGLs y el sis ema de neu exinas y neu oliguinas. Las neu exinas es án codi icadas po es genes en humanos y en a ón (NRXN1, 2 y 3), con dos p omo o es al e na i os que dan luga a las iso o mas la gas (α- INTRODUCCIÓN 23 neu exinas) o las iso o mas co as (β-neu exinas) (Missle e al., 1998; Ushka yo e al., 1992). Las α-neu exinas p esen an una egión ex acelula con o mada po es dominios simila es al ac o de c ecimien o epide mal (EGF) lanqueados cada uno po dos dominios homólogos a laminina G (LNG), una egión ica en se inas y eoninas donde se p oduce la O-glicosilación, una egión co a que pe mi e la inse ción ansmemb ana, y una egión in acelula que con iene un si io de econocimien o de mo i os PDZ. Las β-neu exinas son o mas co as de α-neu exinas que con ienen el úl imo dominio LNG de la egión ex acelula , la egión ansmemb ana y la egión in acelula (Figu a 1). Además, el dominio ex acelula de las neu exinas con iene 5 si ios de splicing al e na i o, siendo dos de ellos (splicing 4 y 5) comunes a α- y β- neu exinas. Debido a la p esencia de a ios genes con p omo o es sepa ados y al uso ex ensi o de splicing al e na i o se pueden gene a más de es mil iso o mas di e en es de neu exinas (Ull ich e al., 1995; Tabuchi y Südho , 2002). Sin emba go, los segmen os ci oplásmico y ansmemb ana de las neu exinas son comunes a odas las iso o mas.  Figu a 1. Es uc u a y splicing al e na i o de las neu exinas. Las α-neu exinas es án compues as de una secuencia N- e minal con eniendo un pép ido señal (SP), seis dominios homólogos a laminina G (LNG) que lanquean a es dominios simila es al ac o de c ecimien o epide mal (EGF), seguido de una egión de O-glicosilación (O-Glyc), una egión ansmemb ana (TM) y una co a egión aminoacídica in acelula que con iene un si io de in e acción a mo i os PDZ en los úl imos es esiduos (no mos ado). Las β-neu exinas con ienen el úl imo dominio LNG p ecedido de una secuencia especí ica de β- neu exinas (βN) y un pép ido señal di e en e al de α-neu exinas. Las pun as de lecha indican la localización de splicing (Sp) al e na i o p esen es en α y β-neu exinas.  Se ha iden i icado una unción de las neu exinas en el e minal p esináp ico. Las neu exinas se desc ibie on o iginalmen e po el g upo del D . Thomas Südho como ecep o es axonales pa a α-la o oxina, una oxina p oducida po la a aña iuda neg a que induce la usión masi a de las esículas sináp icas en el e minal p esináp ico (Ushka yo e al., 1992; Sugi a e al., 1999). Median e abo dajes bioquímicos, el INTRODUCCIÓN 24 mismo g upo iden i icó a las neu oliguinas como moléculas de adhesión de unión a neu exinas (Ich chenko e al., 1995; Ich chenko e al., 1996). Las neu exinas y neu oliguinas median adhesión he e o ílica dependien e de Ca2+ como se demos ó en ensayos de ag egación in i o (Nguyen y Südho , 1997). Es os esul ados sugi ie on una unción de neu exinas y neu oliguinas en las sinapsis. Hallazgos pos e io es del g upo de D . Pe e Schei ele mos a on una capacidad sinap ogénica desde el e minal pos sináp ico de neu oliguinas, que dependía de la in e acción ans-sináp ica con neu exinas axonales (Schei ele e al., 2000; Dean e al., 2003). Es os esul ados lle a on a iden i ica po p ime a ez un sis ema de adhesión ans-sináp ico que egula la o mación/es ablecimien o de las sinapsis. T abajos pos e io es de a ios labo a o ios han iden i icado o os ligandos pos sináp icos de neu exinas con capacidad sinap ogénica, indicando que en las neu exinas con e gen u as de señalización impo an es pa a la di e enciación sináp ica. Los aspec os más impo an es de es os sis emas de adhesión mediados po neu exinas se esumen a con inuación. 1.2 SISTEMAS DE ADHESIÓN SINÁPTICOS MEDIADOS POR NEUREXINAS Las neu exinas p esináp icas se unen a di e sos ligandos pos sináp icos como neu oliguinas, LRRTMs y Cbln1/GluR2, que egulan la o mación de sinapsis a a és del es ablecimien o de sis emas de adhesión con iso o mas de splicing de neu exinas. 1.2.1 Neu oliguinas Las neu oliguinas son una amilia de p o eínas de adhesión celula p esen es en el e minal pos sináp ico. Hay cinco genes de neu oliguinas en humanos (NLGN1, 2, 3, 4X y 4Y) y cua o en oedo es (NLGN1-4X), con una localización di e encial en las sinapsis. Neu oliguina-1 se localiza en e minales pos sináp icos de sinapsis glu ama é gicas, mien as que neu oliguina-2 se localiza en e minales pos sináp icos GABAé gicos in i o (Song e al., 1999; Va oqueaux e al., 2004). La localización di e encial de neu oliguinas en el SNC es á asociada a su capacidad sinap ogénica en cul i o. La sob eexp esión de ne oliguina-1 en cul i os de neu onas induce p e e en emen e sinapsis gu ama é gicas, mien as que la sob eexp esión de neu oliguina-2 induce la o mación de sinapsis GABAé gicas (Chih e al., 2005; Chih e al., 2006). Las neu oliguinas p esen an en su egión ex acelula un dominio colines e asa ca alí icamen e inac i o. Un dominio simila se encuen a en o as p o eínas de adhesión neu onal (Scholl y Schei ele, 2003). Es e dominio es uncionalmen e impo an e pues a a és de él las neu oliguinas median la adhesión INTRODUCCIÓN 25 con neu exinas du an e la o mación de sinapsis (Dean e al., 2003). En el dominio colines e asa se ubica un si io de splicing al e na i o (A) común a odas las neu oliguinas, aunque neu oliguina-1 p esen a un si io splicing al e na i o adicional (B) (Ich chenko e al., 1996; Bouca d e al., 2005; Chih e al., 2006). T as el dominio colines e asa exis e una egión de O-glicosilación jus o an es de la egión ansmemb ana, que es seguida po una egión in acelula con un dominio de econocimien o PDZ (Figu a 2). Figu a 2. Es uc u a de las neu oliguinas. Las neu oliguinas es án compues as de una secuencia N- e minal que con iene un pép ido señal (SP), seguido de un dominio colines e asa sin ac i idad ca alí ica que con iene dos splicing al e na i o (A y B), una secuencia de dime ización (SD) y un si io de O- glicosilación (O-Gly). A es e dominio le sigue una egión ansmemb ana (TM) y una secuencia aminoacídica in acelula co a que con iene un mo i o de econocimien o PDZ (no mos ado). La in e acción en e neu exinas y neu oliguinas es á egulada po splicing al e na i o. La inse ción de los 8 aminoácidos que o man el splicing B en neu oliguina- 1 inhibe la in e acción con α-neu exinas, es ingiendo la in e acción a iso o mas de β- neu exinas que ca ecen del splicing al e na i o 4. Es deci , iso o mas de neu oliguina- 1 (+B) se asocian a iso o mas de β-neu exinas (-Sp4). Sin emba go, iso o mas de neu oliguina que ca ecen del splicing B, como neu oliguina-2, se unen an o a α- como a β-neu exinas independien emen e de la p esencia de Sp4 (Bouca d e al., 2005; Chih e al., 2006). En p o eínas de adhesión, la glicosilación es un ac o undamen al que egula la in e acción en e p o eínas. Se ha demos ado que la N-glicosilación que ocu e en el esiduo Asp 303 localizado en el splicing B de neu oliguina-1 egula la in e acción selec i a con β-neu exinas (-Sp4) (Comole i e al., 2003; Bouca d e al., 2005; Chih e al., 2006). Es os da os sugie en la exis encia de un código ansináp ico en e iso o mas de neu exinas y neu oliguinas pa a el es ablecimien o de las sinapsis glu ama é gicas y GABAé gicas (Figu a 3). Sin emba go, es e modelo es pu amen e eó ico debido a que no se conoce el epe o io de iso o mas de neu exinas en ipos especí icos de neu onas. INTRODUCCIÓN 32 neu exinas in i o. Es os sis emas modelo p opo cionan un mé odo al e na i o pa a in e p e a las obse aciones ealizadas en las sinapsis en e eb ados. En D osophila, α-neu exina-1 se localiza en neu onas del SNC y p incipalmen e en las zonas ac i as de los e minales p esináp icos glu ama é gicos de las sinapsis neu omuscula (Li e al., 2007; Zeng e al., 2007; Sun e al., 2009). Mu an es nulos de α-neu exina-1 en D osophila p esen a on una disminución en el núme o de bo ones sináp icos y anomalías en la dis ibución de esículas sináp icas, de p o eínas de la zona ac i a y de p o eínas de la densidad pos sináp ica (Li e al., 2007; Chen e al., 2010; Owald e al., 2012). Además, el análisis elec o isiológico en las uniones neu omuscula es de es os mu an es p esen ó una disminución en la ansmisión sináp ica e ocada co elacionada con al e aciones en la es uc u a sináp ica (Li e al., 2007; Chen e al., 2010). Po o a pa e, el doble mu an e he e ocigo o en neu exina y CAKI/CMG, homólogo de la p o eína de mamí e o CASK, mos ó una disminución mayo en la libe ación en esículas sináp icas medidas con ma cado es FM, que la obse ada po los he e ocigo os simples en neu exina o en CAKI/CMG, sugi iendo que la in e acción de neu exinas y CAKI/CMG juega un papel impo an e en la libe ación de esículas sináp icas (Sun e al., 2009). En conjun o, es os da os indican que las neu exinas se equie en pa a la o ganización y unción de los e minales p esináp icos. En Caeno habdi is elegans, α-neu exina-1 se exp esa exclusi amen e casi en la o alidad de odas las células del sis ema ne ioso y se localiza p e e en emen e en los e minales p esináp icos (Haklai-Toppe e al., 2011). Mu an es en α-neu exinas-1 p esen an al e aciones del compo amien o, incluyendo el ciclo de de ecación, la asa de mo imien o, la capacidad de explo ación, la espues a mecanosenso ial y la e i ación del es és osmó ico (Tesis doc o al Fe nando Calaho o Núñez, 2011; Calaho o e al., 2009). Es os esul ados sugie en que la unción de neu exinas se equie e pa a la espues a adecuada a di e sos es ímulos en Caeno habdi is elegans. 1.6 NEUREXINAS Y NEUROLIGUINAS EN ENFERMEDADES MENTALES La unción no mal del ci cui o sináp ico se encuen a asociada a p ocesos de memo ia y ap endizaje y de ec os en la unción sináp ica son esponsables de algunas pa ologías del SNC, como epilepsia, au ismo y e aso men al. En los úl imos años se han iden i icado mu aciones en genes de neu exinas que a ec an a las iso o mas α y β en pacien es con au ismo (Feng e al., 2006; Sza ma i e al., 2007; Gau hie e al., 2011; Camacho e al., 2012). Además, se ha desc i o que deleciones en NRXN1 pueden con e i iesgo a padece o as en e medades men ales, INTRODUCCIÓN 33 como la esquizo enia, sugi iendo cie o solapamien o en las bases molecula es de ambos as o nos (Ki o e al., 2008). La sob eexp esión de mu aciones pun uales de β-neu exinas-1 asociadas con au ismo en cul i os de neu onas de hipocampo mos ó una educción de los ni eles sináp icos de β-neu exina-1 (Camacho e al., 2012), sugi iendo que de ec os en la unción sináp ica de neu exinas pueden con ibui al desa ollo de en e medades men ales (Südho , 2008). En pa alelo a es os esul ados, se han iden i icado mu aciones en los genes de NLGN3 y NLGN4 asociadas con au ismo con o sin e aso men al (Jamain e al., 2003; Laumonnie e al., 2004). En algunos casos se ha desc i o que las mu aciones asociadas con au ismo a ec an la capacidad sinap ogénica de neu oliguina-3 y 4 (Chih e al., 2004; Zhang e al., 2009b). Po o a pa e, los a ones KO en genes de NLGN mues an un eno ipo que pod ía es a elacionado con el desc i o en el as o no au is a. En es e sen ido, los a ones KO en el gen NLGN3 p esen an pa ones de compo amien o con pé dida de in e és hacia la no edad, así como una pé dida en la ocalización y emisión de sonidos empleados en su comunicación (Radyushkin e al., 2009). Los a ones KO en el gen NLGN4 mues an una disminución en las in e acciones sociales y una educción en la comunicación, con espec o a a ones sil es es (Jamain e al., 2008). Las mu aciones asociadas a au ismo en los genes de neu exinas y neu oliguinas se han iden i icado en un bajo po cen aje de los pacien es es udiados, pe o su iden i icación pod ía explica , al menos en pa e, algunos de los p oblemas asociados al au ismo y e ela mecanismos asociados a en e medad men al. Po o a pa e, es os esul ados apoyan que allos en la señalización del sis ema de neu exinas y neu oliguinas pod ían es a implicados en los de ec os cogni i os asociados a deso denes neu ológicos del SNC en un ango amplio de en e medades. 1.7 LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER La en e medad de Alzheime (AD) es una en e medad neu odegene a i a que se ca ac e iza po la pé dida p og esi a de memo ia y unciones cogni i as en los pacien es. 1.7.1 An eceden es La AD se desc ibió en 1907 po el neu opa ólogo y psiquia a alemán Alois Alzheime en el a ículo i ulado “Sob e una en e medad especí ica de la co eza del ce eb o” (Alzheime e al., 1907). El diagnós ico se ealizó en una pacien e de 51 años INTRODUCCIÓN 34 de edad (Augus e De e ) que mu ió as su i du an e cinco años una pé dida p og esi a de la memo ia, la o ien ación, el habla y o as unciones elacionadas con la pe sonalidad y capacidad isual-espacial. El análisis ana omopa ológico de su ce eb o e eló una a o ia ce eb al y la p esencia de depósi os ex acelula es (placas seniles) y ag egados neu o ib ila es (o illos), localizados p incipalmen e en la co eza ce eb al y en el hipocampo. En 1910, el psiquia a alemán Emil K aepelin dio el nomb e de En e medad de Alzheime a es a nue a en idad clínica y pa ológica, denominación empleada has a nues os días. A inales de la década de 1960 se desc ibió la hipó esis coliné gica de la en e medad de Alzheime , que conside aba que la mayo ía de los sín omas de la demencia e an p oducidos po una pé dida de g andes can idades de neu onas coliné gicas del núcleo basal de Meyne que p oyec an a la neoco eza (Whi ehouse e al., 1981; A end e al., 1985). Es a hipó esis no ha enido apoyo, debido a que los medicamen os que a an una de iciencia coliné gica no ienen e ec i idad en la p e ención o cu a del Alzhéime . Además, se iden i ica on en ce eb os de pacien es con AD de iciencias en o os sis emas de neu o ansmisión, poniendo de mani ies o que es a en e medad no implica la degene ación de una única clase de neu onas. A pa i de en onces los es udios se cen a on en el análisis de los signos pa ológicos más ca ac e ís icos de la AD, como son, las placas amiloides y los o illos neu o ib ila es, desc i os po p ime a ez po Alois Alzheime (Kidd, 1964; Te y y Pena, 1965), con el obje i o de pode iden i ica los mecanismos implicados en la dis unción sináp ica y en la degene ación de neu onas que p esen an los en e mos. En 1990 se p opusie on dos nue as hipó esis que pod ían explica el desa ollo de la AD: - Hipó esis de la cascada del amiloide, que sos iene que el p oceso neu odegene a i o obse ado en ce eb os de pacien es de AD pod ía se explicado como una se ie de e en os a pa i del p ocesamien o ano mal de la p o eína p ecu so a del β-amiloide (APP), cuya consecuencia es la p oducción, ag egación, deposición y oxicidad del pép ido β-amiloide (Aβ) de i ado del APP (Ha dy y Higgins, 1992). - Hipó esis de la degene ación del ci oesquele o neu onal, que p opone que cambios en el ci oesquele o, en los que pa icipa la o ma hipe os o ilada de la p o eína au, son los esponsables de la en e medad (B aak H y B aak E, 1991). INTRODUCCIÓN 35 1.7.2 Ma cado es pa ológicos de la En e medad de Alzheime En el ce eb o de en e mos de Alzheime se obse an dos anomalías ca ac e ís icas: una abundancia de depósi os amiloides ex acelula es, denominados placas Aβ y depósi os de p o eínas ib ila es en el in e io de las neu onas, conocidos como o illos neu o ib ila es. - Placas β-amiloide (Aβ) Las placas de β-amiloide es án cons i uidas po depósi os ex acelula es insolubles o mados po a ios compues os, siendo el más abundan e el pép ido β amiloide (Glenne y Wong, 1984; Mas e s e al., 1985). El pép ido Aβ iene una longi ud a iable, en e 39 y 43 aminoácidos, y es un p oduc o na u al del me abolismo del APP po acción de pep idasas llamadas sec e asas (De S oope , 2010). Las iso o mas más comunes son Aβ40 y Aβ42. Debido a su mayo ag egación e insolubilidad el Aβ42 es más abundan e en las placas que el Aβ40. Es as placas ac úan como cen os de degene ación neu onal en las es uc u as in ace eb ales in oluc adas en la memo ia y el con ol emocional, la amígdala, el hipocampo y los núcleos basales coliné gicos del ce eb o an e io (Van Gassen y Annae , 2003). Po o o lado, la pé dida de sinapsis es á mejo co elacionada con el decli e cogni i o de la AD (Dekosky y Sche , 1990; Te y e al., 1991; Sze e al., 1997; Masliah e al., 2001). La co elación exis en e en e las placas Aβ y los p oblemas cogni i os de la AD (Blessed e al., 1968), sugie e que dichas placas pod ían al e a la in eg idad sináp ica (Cummings y Co man, 1995). - O illos neu o ib ila es Son ag egaciones in acelula es que se gene an cuando la p o eína au se hipe os o ila, se disocia de los mic o úbulos y o ma, espon áneamen e po polime ización, ilamen os helicoidales apa eados que más a de ocasiona án los o illos neu o ib ila es en el in e io de neu onas dis ó icas (Goede e al., 1992; A ila e al., 2004). Los o illos neu o ib ila es que se o man en el in e io de las células ne iosas de la co eza ce eb al y del hipocampo y de las dend i as apicales y dis ales, se elacionan con la demencia. Como consecuencia, las células ne iosas degene an y mue en debido a esas lesiones neu o ib ila es. Los o illos neu ob ila es apa ecen, a eces, asociados a las placas amiloides. INTRODUCCIÓN 36 1.7.3 Tipos de En e medad de Alzheime - Alzheime Espo ádico Es una en e medad de inicio a dío, apa ece después de los 65 años de edad, en su mayo pa e espo ádico sin iesgo gené ico apa en e y ep esen a en e el 90 y 95% del o al de los casos de AD. La apa ición de AD espo ádico puede es a de e minado po ac o es que p edisponen en mayo o meno g ado a la en e medad. - Alzheime amilia Es una en e medad de inicio emp ano, los sín omas se inician en e los 30 y 60 años de edad, y se debe a una ansmisión de ca ác e au osómico dominan e. Las o mas amilia es de la en e medad de Alzheime (FAD) es án asociadas con mu aciones en los siguien es genes: APP, en el c omosoma 21; PS1, en el c omosoma 14 y PS2, en el c omosoma 1 (Shas y, 1998). Aunque las mu aciones en es os genes ep esen an menos del 5% del núme o o al de casos de AD (Rocchi e al., 2003), la iden i icación de las bases gené icas de FAD ha supues o un a ance impo an e en el es udio de las mecanismos isiopa ológicos asociados con AD. 1.7.4 P ocesamien o de la p o eína p ecu so a del pép ido β-amiloide (APP) La p o eína p ecu so a del pép ido Aβ o APP es una glicop o eína in eg al de memb ana de ipo I, que con iene 695-770 aminoácidos. La sín esis del APP se ealiza de mane a ubicua en el ce eb o y no pa ece gua da una co elación especí ica con la dis ibución de las lesiones ce eb ales (Kang e al., 1987). Po splicing al e na i o se gene an di e en es iso o mas de APP, siendo las más abundan es las que con ienen 695, 751 y 770 aminoácidos (Selkoe, 2001). La p o eína APP se p ocesa de o ma secuencial po es p o easas llamadas α-, β- y -sec e asas. Es as es ac i idades enzimá icas dis inguen dos ías p incipales pa a su p ocesamien o. Una de es as ía es la esponsable de la o mación de los depósi os amiloides ca ac e ís icos en los ce eb os de los indi iduos a ec ados po AD. - Vía no Amiloidogénica: Es a ía comienza con la acción de la α-sec e asa, la cual ealiza un co e en la pa e ex acelula de APP a ni el del aminoácido 687, libe ándose el agmen o N- e minal (NTF, N- e minal agmen ) soluble (αAPP) al espacio ex acelula , con la consecuen e gene ación del agmen o C- e minal (CTF, C- e minal agmen ) de 83 aminoácidos (APP-C83) asociado a la memb ana. El segundo e en o p o eolí ico es INTRODUCCIÓN 37 lle ado a cabo po una ac i idad -sec e asa, la cual p ocesa el CTF dando luga a un pequeño pép ido de 23 aminoácidos (P3) que se libe a al espacio ex acelula y a un agmen o ci osólico de 57-59 aminoácidos (AICD, In acellula Domain) que se libe a al ci osol celula (Figu a 5). Es a ía se conoce como no amiloidogénica, po que no p oduce pép idos Aβ, ya que el si io de hid ólisis de α-sec e asa en APP se encuen a en la egión del pép ido β-amiloide, impidiendo con ello su o mación (Checle , 1995; Ling e al., 2003). Se han iden i icado a ias p o eínas con ac i idad α-sec e asa, odas ellas pe enecien es a la amilia de las desin eg inas y me alop o easas (ADAM, a disin eg in and me allop o einase- amily). Se han p opues o es miemb os de es a amilia como los esponsables de la ac i idad α-sec e asa que p ocesa APP: ADAM 17 ( ambién denominada TACE, enzima con e ido a de TNF-α), ADAM 10 y ADAM 9 (Maccioni e al., 2001; Sisodia y Geo ge-Hyslop, 2002; Van Gassen y Annae , 2003). - Vía Amiloidogénica: En es a ía, el co e del ec odominio de APP se ealiza po la acción de la β- sec e asa a ni el del aminoácido 671, gene ándose de es a o ma un NTF soluble (βAPP) más co o que el p oducido po la acción de las α-sec e asas, y un CTF de 99 aminoácidos asociado a memb ana (APP-C99), cuya secuencia comienza en el esiduo 1 de la egión Aβ. Seguidamen e, el CTF se p ocesa po la ac i idad - sec e asa, libe ándose al medio un pép ido de 40 o 42 aminoácidos, dependiendo del si io de co e de la enzima (Figu a 5) (Takami e al., 2009). La ac i idad β-sec e asa se a ibuye a la p o eína conocida como BACE 1 (β-si e APP clea ing enzime 1), que es la p incipal y única p o eína con es a ac i idad en el ce eb o (Vassa e al., 1999; Vassa e al., 2009). Figu a 5. P ocesamien o de la p o eína APP y gene ación del pép ido Aβ. Rep esen ación esquemá ica de las ías amiloidogénica y no amiloidogénica. El Aβ sólo es gene ado cuando el APP es INTRODUCCIÓN 38 sus a o de la β-sec e asa y a con inuación de la -sec e asa. Si el APP es p ocesado po la α-sec e asa no se gene a Aβ, ya que co a a ni el de su secuencia. Se han desc i o a ias mu aciones en el gen del APP que ep esen an el 5% de los casos de FAD (Rocchi e al., 2003). Una lis a ac ualizada de las mu aciones en APP se puede encon a en www.uia.ac.be/ADMu a ions. Algunas de las mu aciones en APP que causan FAD al e an el me abolismo de APP, ya que se localizan ce ca de los si ios de escisión de α-, β- y -sec e asas, con la consecuen e ele ación del pép ido Aβ42 que conlle a a las ag egaciones neu o óxicas (Suzuki e al., 1994; De Jonghe e al., 2001, Nilsbe h e al., 2001) 1.8 PRESENILINAS Las P esenilinas (PS) 1 y 2 (PS1 y PS2) son p o eínas ansmemb ana con ac i idad p o easa que con ienen 467 y 448 aminoácidos, espec i amen e. P esen an un al o g ado de homología, especialmen e, en los dominios ansmemb ana. Las PS se exp esan de mane a ubicua incluyendo el SNC. Respec o a la localización subcelula , di e sos es udios han demos ado que PS se localizan en memb anas de endosomas, en el sis ema e ículo endoplásmico-Golgi, en compa imen os soma odend í icos y en la memb ana plasmá ica (Suh y Checle , 2002; Kae he e al., 2002). Las PS se sin e izan como polipép idos de 50 kDa con 9 dominios ansmemb ana (Laudon e al., 2005; Spasic e al., 2006) y su en un p ocesamien o endop o eolí ico p obablemen e po au oca álisis dando luga a he e odíme os es ables, que comp enden el NTF de 27-28 kDa y el CTF de 17-18 kDa (Thinaka an e al., 1996; Wol e e al., 1999; Fukumo i e al., 2010). El p ocesamien o endop o eolí ico de PS es á egulado po ac o es limi an es celula es, de mane a que un exceso de holop o eína no esul a en endop o eolisis y se deg ada po el p o eosoma (Thinaka an e al., 1996; Kim e al., 1997; Podlisny e al., 1997). Las PS o man la subunidad ca alí ica del complejo -sec e asa enca gado del p ocesamien o de p o eínas ansmemb anas ipo I. Dicho complejo con iene además las p o eínas: nicas ina, Aph1 y Pen2 (De S oope , 2003; Kimbe ly e al., 2003) (Figu a 6). Pa a o ma el complejo -sec e asa, la holop o eína de PS se inco po a al complejo dimé ico o mado po Aph1 y nicas ina. Pos e io men e, se ensambla Pen2 y iene luga la endop o eolisis de PS pa a o ma el complejo ac i o -sec e asa INTRODUCCIÓN 39 (Takasugi e al., 2003; Ve dile e al., 2007). La ac i idad p o easa de PS es á mediada po dos esiduos de aspa a o den o de los dominios ansmemb ana 6 y 7 (D257 y D385, espec i amen e). Ambos esiduos aspá icos son esenciales pa a la endop o eolisis de PS y pa a la ac i idad -sec e asa ya que o man el cen o ca alí ico del complejo -sec e asa, haciendo que és e sea uncional (Wol e e al., 1999). Las PS se dis ibuyen en múl iples compa imen os subcelula es. No se conoce con exac i ud donde iene luga la ac i idad p o eolí ica de los di e sos sus a os de PS, pe o hay e idencias que sugie en que la memb ana plasmá ica y los endosomas son los si ios p incipales de p o eólisis de APP y o os sus a os (Kae he e al., 2006).  Figu a 6. Modelo opológico del complejo -sec e asa. Cua o p o eínas ansmemb ana se equie en pa a la unción -sec e asa: p esenilina, nicas ina, Aph-1 y Pen-2. P esenilina con iene 10 dominios hid o óbicos, de los cuales 9 son ansmemb ana. Los esiduos ca alí icos, D257 y D385 en los dominios ansmemb ana 6 y 7, espec i amen e, se indican con cí culos ama illos. PS su e endop o eolisis den o del dominio hid o óbico si uado en el bucle ci osólico g ande ( lecha oja) pa a da el agmen o amino- e minal (NTF) y el ca boxi- e minal (CTF). Figu a modi icada de Lundk is y Naslund, 2006.  Las mu aciones en los genes que codi ican las PS engloban ap oximadamen e el 80% de los casos de FAD (Rocchi e al., 2003). Las mu aciones en PS1 son las esponsables de la mayo ía de los casos de FAD y causan dis unción sináp ica, pé dida de memo ia y neu odegene ación. Es as mu aciones, que se dis ibuyen po oda la molécula, se localizan p incipalmen e en los dominios ansmemb anas al amen e conse ados y en los esiduos hid o óbicos del NTF o del dominio hid o óbico si uado en el ci osol, en e los dominios ansmemb anas 6 y 7 (Tandon y F ase , 2002). Ac ualmen e se conocen unas 185 mu aciones, que se pueden encon a en www.uia.ac.be/ADMu a ions (Figu a 7). Po o o pa e, la mayo ía de las mu aciones en PS2 ambién se localizan en dominios ansmemb anas conse ados INTRODUCCIÓN 40 en e las dos p o eínas y ac ualmen e hay 13 mu aciones asociadas con FAD encon adas en www.uia.ac.be/ADMu a ions. El mecanismo median e el cuál las mu aciones en PS asociadas con FAD p omue en la degene ación neu onal no es á del odo escla ecido. Sin emba go, es udios in i o e in i o sugie en que ac úan p omo iendo la deposición del pép ido Aβ, pa icula men e la o ma Aβ42, y la o mación de placas (Du e al., 1996; Xia e al., 1997; Wang e al., 2006).  Figu a 7. Mu aciones desc i as en PS1. En la imagen se mues an algunas de las mu aciones encon adas en PS1 p esen es en casos de Alzheime amilia . Adap ado de Tandon y F ase , 2002.  1.8.1 Funciones biológicas de p esenilinas Las PS p opo cionan el cen o ac i o del complejo -sec e asa y se descub ie on como consecuencia de sus unciones en la gene ación del pép ido Aβ asociado a AD. Desde su descub imien o, se han encon ado nue os sus a os de PS y p o eínas con las que in e accionan, sugi iendo una di e sidad de unciones pa a PS du an e el desa ollo y la ida adul a, algunas de las cuales pod ían con ibui con la p og esión de la AD. Algunas de es as unciones dependen de la ac i idad -sec e asa y o as son independien es de su papel como p o easa (Pa ks y Cu is e al., 2007; De S oope , 2012). INTRODUCCIÓN 41 1.8.1.1 Funciones de p esenilinas dependien es de ac i idad -sec e asa en adhesión celula y señalización Un núme o impo an e de los sus a os del complejo -sec e asa son moléculas de adhesión o de señalización celula , como po ejemplo: nec ina 1α, la subunidad β2 del canal de sodio ol aje dependien e (SCNB2), -p o ocadhe inas, N-cadhe inas, e inas y ecep o es de i osina quinasa eph, sugi iendo que la ac i idad -sec e asa egula adhesión celula y unción sináp ica. Nec ina 1 se localiza en uniones adhe en es neu onales y es á in oluc ada en la o mación de las sinapsis (Kim e al., 2002). SCNB2 unciona como subunidad auxilia del canal de sodio ol aje dependien e y como molécula de adhesión celula . La inhibición del p ocesamien o de nec ina 1α y SCNB2 po ac i idad -sec e asa bloquea la adhesión celula e induce mig ación, sugi iendo que el p ocesamien o mediado po -sec e asa p omue e la adhesión celula (Kim e al., 2002; Kim e al 2005). Las -p o ocadhe inas son moléculas de la supe amilia de las cadhe inas que ienen una unción sináp ica. Exis en di e en es iso o mas de -p o ocadhe inas o iginadas po splicing al e na i o, pe o odas ienen en común el ICD, el cual se libe a as el p ocesamien o mediado po la ac i idad -sec e asa y se asloca al núcleo, egulando la ansc ipción génica (Haas e al., 2005). Al e ación en la ac i idad - sec e asa induce la pé dida de unción de -p o ocadhe inas y, como consecuencia, iene luga una degene ación neu onal pa ecida a la encon ada en pacien es con AD con la unción de PS educida (Hambsch e al., 2005; Weine e al., 2005). Las cadhe inas median adhesión celula homo ílica dependien e de calcio y es án implicadas en plas icidad y unción sináp icas (Rubio e al., 2005). Se ha desc i o que PS acili an la madu ación y anspo e de N-cadhe ina del RE a la memb ana plasmá ica. De es a o ma, cuando la ac i idad de PS es á bloqueada se educen los ni eles de N-cadhe ina en los con ac os y adhesiones celula es (Uemu a e al., 2003). Las p esenilinas se concen an en los si ios de con ac o sináp ico o en e células epi eliales, asociándose po el lado in acelula a las ca eninas, β-ca enina y - ca enina, p omo iendo la es abilización del complejo cadhe ina-ca enina y su asociación con el ci oesquele o de ac ina (Pa isiadou e al., 2004). La escisión de E- cadhe inas po -sec e asa ocu e después del p ocesamien o del ec odominio inducido po calcio, p oduciéndose la deso ganización del complejo cadhe ina- ca enina con la consecuen e pé dida de adhesión celula (Pa isiadou e al., 2004;   OBJETIVOS 49 Los obje i os p opues os en es a Tesis han sido los siguien es: 1. Es udio del p ocesamien o p o eolí ico de neu exinas po PS/-sec e asa in i o e in i o. 2. Papel de la ac i ación sináp ica en el p ocesamien o de neu exinas en cul i os de neu onas de hipocampo. 3. Es udio del e ec o es uc u al y uncional del p ocesamien o sináp ico de neu exinas po PS: eclu amien o de ligandos sináp icos y análisis de la libe ación esicula en e minales mediados po neu exinas en neu onas de ec i as en PS. 4. Análisis del p ocesamien o p o eolí ico de neu exinas po mu an es de PS1 asociados con o mas amilia es de en e medad de Alzheime .               3 MATERIALES Y MÉTODOS        MATERIALES Y MÉTODOS 53 3.1 CULTIVOS CELULARES 3.1.1 Recub imien o de placas de cul i o con poli-lisinas La poli-D-lisina y poli-L-lisina se usan pa a pe mi i la adhesión de neu onas de hipocampo de emb iones de a a y de a ón en placas de cul i o, espec i amen e. A pa i de una solución de 20 mg/ml de poli-D/L-lisina (Sigma) en ácido bó ico (75 mM, pH 8,2) se diluye a una concen ación de abajo de 0,5 mg/ml con el mismo ampón. A con inuación se cub en las placas de cul i o con el olumen adecuado y se dejan oda una noche a 37ºC. Se la an 3 eces con H2O Milli-Q ( olumen su icien e pa a que cub a oda la supe icie de los pocillos), se aspi a el agua y se dejan seca 30 minu os den o de una campana de lujo pa a man ene la es e ilidad. Una ez secas, se i adian con luz UV du an e 10-15 minu os. En de e minados casos las células se siemb an sob e cub eobje os de bo osilica o (Hi schmann Labo ge ä e) de 12 ó 15 mm de diáme o p e-incubados con poli-D/L-lisina pa a ealiza expe imen os de inmuno luo escencia o egis os de ac i idad sináp ica, espec i amen e. 3.1.2 Medios de cul i o, componen es y soluciones usadas A con inuación se de alla la composición de los medios de cul i o empleados:  Medio DMEM-DB1. Medio de siemb a de neu onas de a a: DMEM (In i ogen) suplemen ado con 10% sue o e al bo ino (FBS) (Hyclone), 44,4 mM de D-(+)- glucosa (Sigma), 2 mM glu amax-I (In i ogen) y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml es ep omicina (Pen/S ep) (Gibco).  Medio Neu obasal-B27. Medio de c ecimien o de neu onas de a a y a ón: Neu obasal (In i ogen) suplemen ado con B27 (In i ogen), 2 mM Glu amax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml es ep omicina (Pen/S ep).  Medio DMEM-DB1. Medio de siemb a pa a neu onas de a ón: DMEM suplemen ado con 10% FBS, 2 mM Glu amax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml es ep omicina (Pen/S ep).  PBG: PBS (In i ogen) con eniendo 0,6% de D-(+)-glucosa.  Medio de cul i o pa a células MEF: Medio DMEM suplemen ado con 10% FBS, 4 mM Glu amax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml es ep omicina (Pen/S ep). T as el p ime pase de células emplea el medio suplemen ado con 0,1 mg/ml G418. MATERIALES Y MÉTODOS 54  Medio de cul i o pa a células Hek 293T y COS: Medio DMEM suplemen ado con 10% FBS, 2 mM Glu amax-I y 100 U/ml penicilina + 100 µg/ml es ep omicina (Pen/S ep). 3.1.3 Cul i os de neu onas de hipocampo 3.1.3.1 Cul i o de neu onas de hipocampo de a a Los cul i os de neu onas de hipocampo se gene a on a pa i de emb iones de a as Wis a p oceden es del Cen o de P oducción y Expe imen ación Animal (CPEA) de la Uni e sidad de Se illa, si uado en Espa inas (Se illa). Las a as y los emb iones se a a on siguiendo las no mas sob e el a o animal en expe imen ación es ablecidas po la Uni e sidad de Se illa. El esquema del cul i o se ilus a en la Figu a 8. Ra as ges an es en e los días 18 y 19 de ges ación se sac i ica on po inhalación de CO2 en una cáma a sellada. El sac i icio se ealiza ápidamen e ( iempo medio ap oximado 2 minu os) pa a disminui los iesgos causados po en enenamien o de CO2 que pudie an educi la iabilidad de las neu onas du an e el cul i o. T as el sac i icio, se ex aen po cesá ea ambas amas del ú e o man eniendo los emb iones en su in e io y se colocan en una placa de Pe i. Seguidamen e, el ú e o se ab e median e una incisión longi udinal, se ex aen los emb iones y se colocan en una nue a placa de Pe i, donde se decapi an. A con inuación, se colocan las cabezas en o a placa de Pe i pa a man ene los limpios de es os de sang e y líquido amnió ico. Pa a la ex acción de los ce eb os, las cabezas decapi adas se man ienen suje as con una pinza de pun as cu as y se inse an las pun as de una pinza de pun a ina a a és de los ojos siguiendo el eje an e opos e io , con una inclinación al que e i e daña el ce eb o. Con unas ije as de pinza sp ing scisso s se co a el c áneo po la línea medial, in oduciendo una pun a po la nuca, le an ándola al co a pa a no daña el ce eb o, has a ap oximadamen e la al u a de los ojos. Se sepa a con o a pinza la piel y ca ílago co ados y con la ayuda de una pale a se ex ae el ce eb o y se coloca inmedia amen e en una placa de Pe i con PBG ío más an ibió icos pa a con ene la ca ga mic obiana, man eniendo en hielo la placa con los ce eb os. Una ez ex aídos los ce eb os de odos los emb iones, se e i an las meninges de los ce eb os y se ex aen los hipocampos p ac icando incisiones a lo la go de la zona que bo dea a cada hipocampo con la co eza ce eb al y se colocan en una placa de Pe i de 35 mm de diáme o con PBG más an ibió icos, man enida en hielo. Figu ges a c disec c empl e pun a cu a s hipo c cen min u se i n (con c con a y 2 5 min u mec á (Hi s Pos e p ell e sus p pocil a a d incu b a 8. Esquem a c ión. B) Emb c ión de hipo c e ado du an e ina Mo ia # 5 s y pale a de e Una ez e c ampos en í uga de 1 u os a 1.50 0 n cuban co n c en ación a gi ación s u 5 0 µl de D u os adicio n á nica de lo s s chmann L e io men e , e de célul a p ensión cel u lo en plac a das con p o b ado a 37 a de un cul i iones. C-G) c ampos. H) M el cul i o. De 5 , pinza y ije a e x acción. El e x aídos lo 2 o 3 pa e 5 ml con 2 0 pm elim i n 1,5 ml d inal de ip s u a e. Segu Nasa (Ro c n ales a 37 ° s hipocam p L abo ge ä e , la suspen s a s disg ega d u la se cu e a s mul ipo c o li-D-lisina °C y 5% C o de neu o n Decapi ación M ic oscopio i izquie da a d a de 14cm pa ma e ial p o c s hipocam p e s con una ml de PB G i nándose e d e PBG c o s ina 0,05% idamen e, s c he) pa a d ° C en el ba p os aplican d e ) con l a s ión celula d as se es n a en un illos Cells a (65000 cél u C O2. Una n as de hipoc a y ex acción i n e ido Zei s d e echa y de a a la cesá ea , c ede de Fine S p os se eli m cuchilla. L o G ío sin a e l sob enad o n eniendo ) du an e 8 s e añaden 7 d e ene la ño. A con i d o 5 embol a pun a c se cen i u uspende e n hemoci óm a (G eine ulas/1,13 c ez que la s a mpo de a a de ce eb os s s Axio Obs e a iba abajo: , ije a de pin z S cience Tool s m ina el m e o s hipocam p a n ibió icos an e. A co n 30 µl de minu os e n 7 50 µl de s ipsinizaci ó n uación, s e adas con u c e ada p a u ga du an e n 1 ml de e o y se s Bio-One) d c m2). Los c s células s e MATERIA L a . A) Ra a Wi s emb iona ios e e - A1. I) Cáma a de N z a sp ing scis s . e dio PBG y p os se col o y se cen i n inuación, ipsina 2 , n un baño d u e o de ca b ó n y se in e p ocede a na pipe a P a cialmen e 5 minu os DMEM-DB 1 iemb an 6 5 d e 24 pocil u l i os se m e han adhe L ES Y MÉT O  s a a los 18 d s pa a una p o Ma e ial de N eubaue , pin z s o ; pinza de y se oce a o can en ub o i ugan du a los hipoca ,5% (In i o d e agua a 3 b allo (In i o n cuba du a a la disg eg P as eu de e a la l a 1.000 p m 1. Po úl i m 5 000 célul a l los p e ia m m an ienen ido al sub s O DOS 55 d ías de o s e io c i ugía z as de p un as a n los o s de a n e 3 mpos o gen) 7ºC y o gen) n e 8 ación id io lama. m y el m o, la a s po m en e en el s a o MATERIALES Y MÉTODOS 56 (ap oximadamen e 2 ho as) el medio de siemb a DMEM-DB1 se sus i uye po medio de c ecimien o Neu obasal-B27. Du an e el desa ollo in i o del cul i o se o ma una densa ed neu onal. En la Figu a 9 se mues a el aspec o del cul i o a lo la go de los días. Figu a 9. Cul i os de neu onas. Se mues a el aspec o de neu onas de hipocampo de emb iones de a a con 1 día de cul i o (A), 3 días de cul i o (B), 5 días de cul i o (C) y 14 días de cul i o (D). Las imágenes ue on omadas en una lupa Olympus con obje i os de 20 aumen os (A), 10 aumen os (B) y 5 aumen os (C y D).  3.1.3.2 Cul i o de neu onas de hipocampo de a ón PS1/ PS1 Los cul i os de neu onas de hipocampo se gene a on a pa i de emb iones de a ón loxeados pa a el gen de PS1 ( PS1/ PS1) y knock-ou (KO) de PS2. Los animales PS1/ PS1 y KO de PS2 ue on cedidos po el D . Ca los A. Sau a (Uni e sidad Au ónoma de Ba celona). Pa a es e cul i o se empleó el mismo p o ocolo desc i o pa a el cul i o de neu onas de hipocampo de a a, pe o empleando los medios pa a cul i o de a ón y el ecub imien o de las placas de cul i o con poli-L-lisina, p e iamen e mencionados. El geno ipo de los animales se comp obó median e PCR. 3.1.4 Líneas celula es 3.1.4.1 Líneas celula es Hek 293T y COS La línea celula humana de iñón emb iona io Hek 293T es un buen modelo celula pa a sob e-exp esa p o eínas exógenas. Las células HEK 293T son una a ian e de la línea humana del epi elio enal 293 ans o mada con el gen E1A de adeno i us ipo 5, que exp esa el an ígeno T de SV40. Las células Hek 293T se ob u ie on de la ATCC (Ame ican Type Cul u e Collec ion). Las células COS de i an de una línea celula del mono e de a icano (CV1) ans o mada con un i us SV40 de ec i o. Ambas líneas celula es se c ecen en ascos de cul i o (The mo) con medio MATERIALES Y MÉTODOS 57 de c ecimien o DMEM suplemen ado. El cul i o se man iene en un incubado con un 5% de CO2 y a una empe a u a de 37ºC. Cuando el cul i o alcanza ap oximadamen e un 80-90% de con luencia se p ocede a ealiza el subcul i o que es necesa io pa a man ene su capacidad mi ó ica. Pa a ello, se añade ipsina-EDTA (In i ogen) en una can idad su icien e pa a cub i oda la monocapa de células, p e io la ado con ampón salino PBS (In i ogen) pa a elimina los es os de medio y las células mue as en suspensión. A con inuación, se incuba el cul i o 2-3 minu os a 37ºC obse ando al mic oscopio has a que las células se despeguen. Una ez en suspensión se añaden 4 olúmenes de medio de c ecimien o con sue o. De la suspensión celula esul an e se pasa un olumen de un décimo ó un quin o a un nue o asco de cul i o. 3.1.4.2 Fib oblas os de emb iones mu inos (MEF) Las células MEF (mouse emb yonic ib oblas s) wild- ype (WT) y knock-ou (KO) pa a PS empleadas en es e abajo han sido amablemen e cedidas po el D . Ba De S oope (Ka holieke Uni e si ei Leu en; Bélgica) (He eman e al., 2000). Las células se man ienen en medio de c ecimien o DMEM suplemen ado, den o de un incubado a 37ºC y 5% C02, y se subcul i an a un décimo es eces a la semana. 3.1.5 Descongelación-congelación de líneas celula es Los iales que con ienen las líneas celula es se ex aen del con enedo de N2 líquido y se descongelan ápidamen e en un baño a 37ºC con agi ación sua e. A con inuación, se coloca la suspensión celula en un ubo de cen í uga de ondo cónico y se cen i uga a 1.000 pm du an e 5 minu os. El pelle celula se sepa a po decan ación del sob enadan e. Pos e io men e, el pelle celula se esuspende en 5 ml de medio de cul i o y se uel e a cen i uga de la misma o ma. El p ecipi ado celula esul an e se esuspende en 1ml de medio de cul i o y se aspasa a un asco de cul i o de 25 cm2 con 4 ml de medio de c ecimien o a empe ado. Pa a congela las líneas celula es, el pelle celula ob enido de la ipsinización de una placa de cul i o de 75 cm2 con luen e se esuspende en 2 ml de FBS con 10% de DMSO. Se dis ibuye un olumen de 1 ml de células po cada ial c iogénico y se man ienen a -80ºC du an e 24 ho as pa a consegui un p oceso de congelación len o. Seguidamen e se almacenan las células congeladas en N2 líquido. MATERIALES Y MÉTODOS 64 3.3.2 T ans ección de células Hek 293T y células MEF Cul i os de células Hek 293T o de células MEF c ecidos a 70-80% de con luencia se ans ec an empleando Lipo ec amina (In i ogen), siguiendo las ecomendaciones del ab ican e. Las can idades de plásmido a ans ec a po cada pocillo de una placa de 6 pocillos son: 1,5 µg pa a las células Hek 293T y 5 µg pa a las células MEF. Pa a un pocillo de una placa de 24 pocillos la can idad de plásmido a ans ec a es de 0,5 µg o en el caso de co- ans ecciones con una p o eína luo escen e, 0,4 µg del plásmido más 0,2 µg del plásmido de la p o eína luo escen e. La e ec i idad de ans ección en células Hek 293T es de ap oximadamen e 60-75%, mien as que pa a células MEF onda el 30%. 3.4 PRODUCCIÓN LENTIVIRAL Los ec o es len i i ales pe mi en la in eg ación del gen o genes exógenos en el genoma de las células que in ec an, po ello ienen la en aja de consegui una exp esión a la go plazo. La p oducción de len i i us se ealiza como se ha desc i o p e iamen e (Gascon e al., 2008). Las células Hek 293T se ans ec an median e el mé odo de os a o cálcico con los plásmidos necesa ios pa a la cons ucción de las pa ículas i ales. Es os plásmidos son: - pCAG-VSVg∆C: ec o que codi ica pa a la p o eína de la cápsida del i us. La p o eína í ica es del i us es oma i is esicula (VSV), pe mi iendo la in ección de una amplia a iedad de ejidos y líneas celula es. La secuencia de la p o eína VSV empleada ca ece del epí opo VSV pa a e i a p oblemas de eacción c uzada con an icue pos an i VSV. - 8.9: ec o que codi ica pa a la maquina ia de e o ansc ipción del i us (Gag/Pol). Gag es un gen que codi ica pa a di e en es p o eínas de la nucleocápsida y de la ma iz y Pol es un gen que codi ica pa a la ansc ip asa in e sa, pa a una p o easa y pa a la in eg asa. - Vec o len i i al que codi ica la secuencia de in e és: es e ec o con iene la secuencia de DNA a ans e i a la célula diana. En el caso de los ec o es que con ienen el p omo o de sinapsina, el elemen o egulado pos ansc ipcional del i us de la hepa i is de la ma mo a (WPRE) se inco po a pa a aumen a la exp esión del ansgén. MATERIALES Y MÉTODOS 65 El día p e io a la ans ección se siemb an placas de cul i o de 15 cm de diáme o con 12×106 células Hek 293T en medio de cul i o. Pa a la ans ección, se mezclan los plásmidos de exp esión y empaque amien o con agua es é il y clo u o cálcico de la siguien e mane a: 20 µg del ec o len i i al, 20 µg de 8.9, 10 µg de VSVg∆C, CaCl2 2,5 M y se comple a con agua es é il has a 2 ml. A con inuación, se añaden a la mezcla 2 ml de 2×HBSS pH 7,05 (1,5 mM Na2HPO4, 280 mM NaCl, 50 mM HEPES) go a a go a y se bu bujea du an e 40 ó 50 segundos con una pipe a se ológica de 1 ml. Pos e io men e se añade la mezcla a la placa con las células Hek 293T go a a go a, con agi ación o bi al len a y se incuba du an e 4 ho as en el incubado a 37°C y 5% CO2. T as la incubación, se la a con PBS, se añade medio de c ecimien o esco y las células se man ienen du an e 72 ho as en el incubado . Pasadas las 72 ho as se ecolec a el medio con las pa ículas i ales, se cen i uga a 2.000 pm du an e 5 minu os y el sob enadan e esul an e se il a con un il o de 0,45 µm de diáme o de po o (The mo). A con inuación, el il ado se cen i uga du an e 90 minu os a 25.000 pm (108.205 g) con un o o SW32-Ti en una ul acen í uga Op ima L-100 XP (Beckman Coul e ), se desca a el sob enadan e y el p ecipi ado i al se esuspende con 100 µl de PBS ío. Finalmen e, se alicuo a y se almacena a -80°C. Pa a in ec a los cul i os p ima ios de neu onas se emplean de 1 a 5 µl de la p epa ación i al po pocillo de placa de 24 pocillos, que se añaden di ec amen e al medio de cul i o. Los cul i os de neu onas de hipocampo se in ec an a 2-6 días in i o y se analizan 8-10 días después de la in ección. 3.5 ENSAYO DE CO-CULTIVO DE CÉLULAS HEK 293T CON NEURONAS DE HIPOCAMPO Células Hek 293T ans ec adas con iso o mas de neu oliguinas se co-cul i an con cul i os p ima ios de neu onas de hipocampo como se ha desc i o p e iamen e (Schei ele e al., 2000). Las células Hek 293T ans ec adas se ipsinizan y un núme o de 40.000 a 50.000 células se añaden po pocillo de cul i os de neu onas man enidos du an e 12-14 días in- i o. Los cul i os se analizan 24-48 ho as después de es ablece el co-cul i o 3.6 TÉCNICAS BIOQUÍMICAS PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS 3.6.1 Ob ención de lisados celula es y ce eb ales Pa a la lisis de células Hek 293T, MEF y de cul i os de neu onas de hipocampo, se incuban las células p e iamen e la adas con PBS ío con bu e de lisis (50 mM MATERIALES Y MÉTODOS 66 T is-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% T i on X-100, 0,1% SDS, 1:500 PNT, 1:50 inhibido es de p o easas y os a asas (Roche) du an e 15 minu os en hielo. A con inuación, se disg egan mecánicamen e con una je inga de 25½G y se man ienen en hielo du an e 10 minu os más. Pos e io men e, el lisado se cen i uga a 13.000 pm du an e 10 minu os pa a elimina los es os celula es y el sob enadan e se calien a a 95ºC du an e 5 minu os en ampón de ca ga de p o eínas laemmli más 0,1 M β- me cap oe anol. En expe imen o con inhibido es químicos, las células se a an con 2,5 µM GM6001 (Calbiochem), 20 µM TAPI-1 (Calbiochem), 5 µM GL189 (Calbiochem), 5 µM DAPT (Sigma), 100 nM -aga oxina IV (Ascen Scien i ic), 5 µM - cono oxina MIIC (Ascen Scien i ic), 4 µM Tapsiga gina (Ascen Scien i ic), 10 µM Ni edipina (Ascen Scien i ic), 1 µM TTX (Ascen Scien i ic), du an e 14 ho as an es del lisado. En el caso de lisados p o enien es de ce eb os emb iona ios y de co ezas de a ones, és os se homogenizan mecánicamen e con un po e en ampón RIPA (50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% T i on X-100, 1mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1mM O o anada o de sodio pH 10, inhibido es de os a asas y p o esasas). El homogenado co espondien e al lisado o al se cen i uga a 5.000 g du an e 30 minu os a 4ºC, ob eniéndose un sob enadan e que cons i uye la acción de p o eínas. La concen ación de p o eínas en el lisado se de e mina median e el ki BCA (Pie ce). Los lisados se calien an a 95ºC du an e 5 minu os en ampón de ca ga de p o eínas laemmli más 0,1 M β-me cap oe anol. 3.6.2 Aislamien o y accionamien o de sinap osomas Ra ones adul os ( es animales po condición) se decapi an y las co ezas se diseccionan y se homogeneízan en bu e A ío (5 mM HEPES pH 7,4, 0,32 M de saca osa, 1 mM de NaHCO3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl2, 1 mM NaF, inhibido es de os a asas y p o easas) usando el homogeneizado de Te lon-c is al. El homogenado co espondien e al lisado o al se cen i uga a 1.400 g du an e 10 minu os y el pelle (P1) se ex ae de nue o con bu e A, se homogeniza y se cen i uga a 710 g du an e 10 minu os Los sob enadan es (S1 + S1’) se combinan y se cen i ugan a 13.800 g du an e 10 minu os pa a ecoge el pelle (P2). Dicho pelle se esuspende en 3 ml de bu e B ío (6 mM T is pH 8,0, 0,32 M de saca osa, 1 mM NaHCO3, 1 mM NaF, inhibido es de os a asas y p o easas) usando el homogeneizado y se ca ga en la pa e supe io de un g adien e discon inuo de saca osa (0,85 M, 1 M y 1,2 M de saca osa) y se cen i uga a 82.500 g du an e 2 ho as. La acción de sinap osomas se ecoge de la in e ase de las capas de 1 M-1,2 MATERIALES Y MÉTODOS 67 M de saca osa, se diluye en bu e C (12 mM T is HCl pH 8,0, 1% de T i on X-100) y se incuba en hielo du an e 15 minu os. La suspensión se cen i uga a 32.800 g du an e 1 ho a pa a ob ene el sob enadan e ( acción p esináp ica). El sedimen o que con iene la acción pos sináp ica se esuspende en bu e D ío (40 mM T is pH 8,0, 1% de NP40). La concen ación de p o eína se de e minó median e el ki BCA. 3.6.3 Inmunop ecipi ación La inmunop ecipi ación es una écnica que consis e en p ecipi a el an ígeno de in e és en una solución u ilizando un an icue po que se une especí icamen e a ese an ígeno. En p ime luga el lisado o medio condicional de las células Hek ans ec adas con el plásmido co espondien e se incuban con el an icue po p ima io a una concen ación sa u an e (1-2 µg) du an e 1 ho a a 4ºC en agi ación. A con inuación se añade la p o eína G o A se a osa (GE Heal hca e) p e-equilib ada con bu e de lisis du an e 30 minu os a 4ºC en agi ación. La p o eína G o A se a osa se une a la cadena pesada de las inmunoglobulinas con g an a inidad. Se ha usado la p o eína G pa a uni el an icue po an i-HA de a a y la p o eína A pa a el an icue po con a el NTF de PS1 de conejo. Pos e io men e, se cen i uga la mezcla a 3.000 g du an e 5 minu os pa a sedimen a el complejo an ígeno-an icue po y p o eína se a osa. El pelle se la a con bu e de lisis, se cen i uga y se mezcla con ampón de ca ga de p o eínas laemmli más 0,1 M β-me cap oe anol pa a pos e io men e calen a a 95ºC y disocia el complejo. Finalmen e, los inmunop ecipi ados se ca gan en un gel de poliac ilamida y se analizan po Wes e n blo . 3.6.4 Bio inilización En los ensayos de bio inilización se ma can las p o eínas de memb ana median e su unión co alen e a la molécula de bio ina. Las células Hek 293T ans ec adas con el plásmido co espondien e se incuban con bio ina (1 mg/ml) (EZ-Link Sul o-NHS- Bio ina, The mo Scien i ic) a 4ºC du an e 30 minu os. A con inuación las células se lisan y se incuban con a idina (Neu A idin Aga ose Resin, The mo Scien i ic) du an e 1 ho a a 4ºC. Pos e io men e, los lisados se cen i ugan y el pelle se la a con bu e de lisis, se cen i uga y se mezcla con ampón de ca ga de p o eínas laemmli más 0,1 M β-me cap oe anol pa a pos e io men e calen a a 95ºC y disocia el complejo. Los p ecipi ados se analizan po Wes e n blo . MATERIALES Y MÉTODOS 68 3.6.5 Elec o o esis en geles de SDS-poliac ilamida Los geles de SDS-PAGE se han usado empleando el sis ema Mini-P o ean 3 (Bio- Rad). Se ha usado un sis ema de elec o o esis discon inuo, en el cual el gel de apilamien o posee un amaño de po o más g ande que el gel sepa ado . El gel de apilamien o asegu a el desplazamien o de las p o eínas en el mismo en e de mig ación, mien as que en el sepa ado las p o eínas se sepa an po su peso molecula . Pa a p o eínas de bajo peso molecula (de 10 a 50 kDa) se han usado geles con una concen ación de ac ilamida del 10-13,5% y pa a aquellas de peso molecula medio o ele ado (de 50 a 150 kDa), del 8%. Las mues as p epa adas en ampón de ca ga de p o eínas laemmli se ca gan en pa alelo a ma cado es con p o eínas de peso molecula conocido (Bio-Rad). Ac o seguido, se añade a la cube a el bu e pa a elec o o esis (T is-glicina 0,1 M, 0,01% SDS), asegu ando en odo momen o el con ac o de los geles con dicho ampón. La elec o o esis se ealiza a un ol aje cons an e de 120 V du an e 20 minu os, pa a la o mación del en e de p o eínas en el gel apilado y a 100 V du an e 1-2 ho as, pa a la sepa ación de p o eínas en el gel sepa ado . 3.6.6 T ans e encia de p o eínas a memb anas de PVDF Las p o eínas p e iamen e sepa adas po el sis ema SDS-PAGE, se ans ie en a una memb ana usando el sis ema de ans e encia en “sándwich” (Bio-Rad). En es a Tesis se ha usado memb anas de poli inilideno de di luo ido (PVDF) de 0,45 µm de po o (Millipo e). La ans e encia se ealiza a un ampe aje ijo de 220 mA du an e 2 ho as ó 300 mA du an e 1 ho a. 3.6.7 Inmunode ección de p o eínas en memb anas Las memb anas de PVDF se bloquean du an e 1 ho a con TBS-T pH 7,6 (200 mM T is-HCl, 1,4 M NaCl, 1 % Tween 20) más 5% de leche lib e de g asa, pa a p e eni uniones inespecí icas de los an icue pos a la memb ana. Pos e io men e, la memb ana se la a con TBS-T pa a elimina el exceso de agen e bloquean e y se incuba con el an icue po p ima io diluido en TBS-T más 2,5% de leche. La incubación se ealiza en una bolsi a de plás ico e mosellada du an e 1 ho a a empe a u a ambien e o bien du an e oda una noche a 4ºC. Pasado es e iempo, la memb ana se la a con TBS-T pa a elimina el an icue po p ima io no unido a la memb ana y se incuba du an e 1 ho a a empe a u a ambien e con el an icue po secunda io diluido en TBS-T más 5% de leche. Los an icue pos secunda ios empleados en es a Tesis es án gene ados en MATERIALES Y MÉTODOS 69 cab a con a an icue pos de di e en es especies y conjugados a la enzima pe oxidasa de ábano pican e (HRP) (Jackson ImmunoResea ch). Finalmen e, se la a con TBS-T pa a elimina el exceso de an icue po secunda io y se incuba du an e 5 minu os con el eac i o Supe Signal (Pie ce) o ECL-plus (Heal hca e) pa a de ec a las p o eínas po quimioluminiscencia. La enzima HRP unida al an icue po secunda io, en p esencia de pe óxidos, ca aliza la eacción de oxidación de luminol. Una ez oxidado, el luminol emi e quimioluminiscencia. La adquisición y análisis de la imagen se ealiza con el equipo ChemiDoc XRS (Bio-Rad) y su pos e io análisis con el p og ama in o má ico Quan i y One especí ico pa a Wes e n blo . Tabla 1. Lis ado de an icue pos usados pa a Wes e n blo . An icue po p ima io Especie Dilución T abajo Banda Reconocida (kDa) P o eedo An i-HA Ra a 1:1000 (WB) 1:100 (IP) Roche Cy o neu exina Pollo 1:250 (WB) 150 (αN x) 100 (βN x) 14-16 (α/β N x-CTF) Dean e al. 2003 An i-N x1 Ra ón 1:500 (WB) 150 (αN x) 100 (βN x) BD T ansduc ion Labo a o ies An i-α/Ac ina Conejo 1:2000 (WB) 42 Sigma-Ald ich An i-β/Ac ina Ra ón 1:60000 (WB) 42 Sigma-Ald ich An i- NCadhe ina Ra ón 1:1000 (WB) 120 35 (NCadh-CTF) Biological Labo a o ies An i-CASK Ra ón 1:200 (WB) 120 Biological Labo a o ies An i-PS1 Conejo 1:5000 (WB) 1:100 (IP) 50 20-30 (PS-NTF) Me ck An i-PS1 (Ab2) Ra ón Ra a 1:500 (WB) 20-30 (PS-NTF) No econoce a la p o eína humana Me ck An i- Nicas ina Ra ón 1:1000 (WB) 115 Biological Labo a o ies An i- Sinap o isina Ra ón 1:120000 (WB) 37 Sigma-Ald ich An i-PSD95 Ra ón 1:2000 (WB) 90 Biological Labo a o ies MATERIALES Y MÉTODOS 70 An i- βamiloide Ra ón 1:5000 (WB) 4.5 Signe An i-Nlg1 Ra ón 1:200 WB 120 (Nlg1) 15 (Nlg1-CTF) Neu oMab 3.6.8 S ipping de memb anas de PVDF La memb ana de PVDF a eu iliza se sume ge en una solución de 62,5 mM T is- HCl pH 6,7, 100 mM β-me cap oe anol y 2% de SDS a 70ºC du an e 20 minu os en agi ación. Con es e a amien o se consigue que los an icue pos que es aban unidos a la memb ana se desp endan de ella. Seguidamen e, se la a la memb ana es eces du an e 10 minu os con TBS-T a empe a u a ambien e y se p ocede con una nue a inmunode ección. 3.7 INMUNOFLUORESCENCIA Las células c ecidas sob e los cub eobje os se ijan empleando una solución de ampón os a o 0,1 M pH 7,4 con 4% pa a o maldehído y 4% glucosa pa a e i a la lisis osmó ica de las células. Seguidamen e, se ealizan 3 la ados con PBS. Las mues as se pe meabilizan y se bloquean median e la incubación con solución de bloqueo PBS con 5% de sue o de cab a y 0,05% T i ón X-100 du an e 1 ho a. Pa a la de ección de an ígenos nuclea es, las células ijadas se incuban con me anol ío a 20ºC du an e 10 minu os p e io a la incubación en solución de bloqueo sin T i ón X-100. T as el bloqueo, las células se incuban du an e 1 ho a a empe a u a ambien e con an icue pos p ima ios diluidos en la misma solución de bloqueo. Pasado es e pe iodo de incubación se ealizan es la ados con PBS y se incuban las mues as du an e 1 ho a con los an icue pos secunda ios diluidos en solución de bloqueo. Se han usado an icue pos secunda ios gene ados en bu o con a an icue pos de di e en es especies y conjugados con los luo ó o os cianida Cy2 (exci ación en azul, emisión en e de), Cy3 (exci ación en e de, emisión en ojo) o Cy5 (exci ación en ojo, emisión en ojo lejano-e in a ojo) (Jackson ImmunoResea ch). Finalmen e, las mues as se la an 3 eces du an e 5 minu os y se p ocede al mon aje de los cub eobje os en po aobje os empleando Fluo omoun -G (Sou he nBio ech). Las mues as se conse an en ío p o egidas de la acción di ec a de la luz. MATERIALES Y MÉTODOS 71 Tabla 2. Lis ado de an icue pos usados pa a Inmuno luo escencia. An icue po p ima io Especie Dilución T abajo P o eedo An i-HA Ra a 1:1000 Roche An i-HA Ra a 1:1000 Roche Cy o-neu exina Pollo 1:250 Dean e al. 2003 An i-Vglu 1 Conejo 1:1000 Synap ic Sys ems An i- Vamp2 Ra ón 1:3000 Synap ic Sys ems An i-PSD95 Ra ón 1:1000 Biological Labo a o ies An i-CASK Ra ón 1:200 Biological Labo a o ies An i-PS1 Conejo 1:500 Me ck An i-PS1 (Ab2) Ra ón Ra a 1:25 Me ck An i-GFP Ra ón 1:1000 Synap ic Sys ems En es a Tesis hemos empleado di e en es ipos de mic oscopios pa a la adquisición de imágenes de inmuno luo escencia: el mic oscopio Zeiss in e ido, Axio Obse e .A1, el mic oscopio con ocal Olympus FLUOVIEW 1000 y el mic oscopio con ocal Leica SP2-AOBS. 3.7.1 Análisis de imagen de con ocal Pa a cuan i ica la luo escencia de los di e en es ma cado es celula es, adqui imos las imágenes de doble o iple inmuno luo escencia median e mic oscopía con ocal. El análisis de las imágenes con la in o mación en canales RGB se ealiza median e el p og ama ImageJ. A pa i del canal de luo escencia co espondien e a HA-Nlg1 o GFP se dibuja una másca a bina ia que comp ende el á ea de in e és. Dich a di e e más c ima g sele c co e 3.8 3.8. 1 E di e e écn i Figu (New p Asso c pe u s  emp l - M  a másca a e n es ma c c a a. T as l g en bina i a c cionado, c e spondien e TÉCNIC A 1 Equip E n es a Te s e n es disp o i cas de ad q a 10. Comp o p o ). 3) Mic c ia es). 5) C á s ión. 8) Lámp a A con inu a l eado: M ic oscopi o Obje i o aumen o a , se expo ado es, pe l a aplicació a que co n c alculando a e s en el ca n A S DE REG os y ma e s is se ha u i o si i os pa a q uisición de o nen es del oscopio in e á ma a (Ham a a a de me cu a ción se d e o Zeiss in e s de 10, 2 o s (Zeiss Pl a al es o mi iendo l a n de un a n iene el a pa i de n al sin bina ISTRO EX P iales expe lizado un s a el desa o imágenes u sis ema ex p ido (Zeiss A a ma su O ca io. 9) O dena d e allan los d ido, A xio O 2 0 y 40 a u an- A POC H o de canal a selección lo umb al núme o d la misma l iza . P ERIMEN T imen ale s s is ema de e o llo de exp e usando lu o p e imen al. 1 A xio Obse e R 2 ). 6) Es i m do pa a egi s d is in os c o O bse e .A u men os ( Z H ROMAT). es que c o de los píx e pa a elimin e píxeles l a in ensid a T AL s e xpe imen a e imen os d o escencia ( 1 ) Jaula de F e .A1). 4) Co m ulado (A-M s o y adquisi c o mponen e s 1. Es e mi c Z eiss Ach o MATERIA L o n ienen la e les con eni a el ondo po enci m a d p omedi o a ción en el d e es imula c ( Figu a 10) .  F a aday. 2) M n olado del Sys ems 21 0 c ión de imáge n s del sis e m oscopio e s plan) y un L ES Y MÉT O in o maci ó dos den o , se ob ien e m a del u o de los p í que se co m c ión de ca m . M esa an i- i b ob u ado ( V 00). 7) Sis e m n es. m a expe i m s á do ado d n obje i o d O DOS 72 ó n de de la e una m b al í xeles m bina m po y b a o ia V incen m a de m en al d e: d e 63 MATERIALES Y MÉTODOS 73  Fil os especí icos (AHF analysen echnik AG) pa a de ec a la luo escencia de GFP/Cy2; Cy3/DsRed y Cy5.  Ob u ado Unibli z CS25 (Vincen Associa es) manejado po el con olado Unibli z VCM-D1 (Vincen Associa es) conec ado a un o denado . - Cáma a de egis o modelo O ca R2 Es a cáma a cons a de un senso CCD con una esolución de 1344 x 1024 pixeles, siendo el amaño del pixel de 6,45 μm de lado. En es a Tesis las imágenes se han adqui ido aplicando un binning de 2 x 2 pa a aumen a la sensibilidad. Po lo an o pa a el obje i o de 63 aumen os el amaño del pixel es de 0,2 µm de lado as aplica el binning. La cáma a y el ob u ado se con olan con el so wa e p opo cionado po el ab ican e de la cáma a. Conc e amen e, con la cáma a O ca R2 se empleó el so wa e HCImage ( e siones 1.0 a 2.0). - Es imulado modelo A-M SYSTEMS 2100 Con es e es imulado se con igu a la ampli ud, du ación y ecuencia de los pulsos eléc icos. Los es ímulos, consis en es en enes de pulsos bi ásicos de 5 ms de du ación o al y 10 mA de ampli ud a 20 Hz, se aplican manualmen e. - Sis ema de pe usión y de succión Pa a man ene las mues as biológicas i as y en condiciones adecuadas du an e el anscu so de los expe imen os se ha empleado un sis ema de pe usión con inua con un lujo de 60 ml/ho a. El sis ema de pe usión mon ado en nues o labo a o io cons a de un ese o io de solución, un sis ema con olado de lujo, una cáma a de pe usión/es imulación, y una bomba de succión (Figu a 11).  Figu a 11. Sis ema de pe usión y de succión. La pe usión es de 1ml/min lo que equi ale a 20 go as/min, pe mi iendo man ene las neu onas i as du an e el anscu so del expe imen o.    4 RESULTADOS    RESULTADOS 83 4.1 ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN DE ISOFORMAS DE NEUREXINAS 4.1.1 Dis ibución de HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C en cul i os de neu onas Las neu exinas (N x) son p o eínas neu onales que egulan el ensamblaje y madu ación de las sinapsis. Como se ha desc i o en la In oducción, exis en es genes de neu exinas con 2 p omo o es al e na i os, que dan luga a las iso o mas α y β que se di e encian en el dominio ex acelula . Además el dominio ex acelula de las neu exinas con iene di e sos si ios de splicing al e na i o (Sp), o iginándose más de mil iso o mas di e en es de neu exinas (Ull ich e al., 1995). Sin emba go, los segmen os ci oplásmico y ansmemb ana son comunes a odas las neu exinas. T abajos p e ios empleando un an icue po cy o-neu exina con capacidad pa a econoce a odas las iso o mas han demos ado una localización sináp ica de neu exinas in i o po expe imen os de mic oscopía elec ónica. En es os es udios se de ec ó la p esencia de neu exinas an o en e minales p esináp icos como, inespe adamen e, en la memb ana pos sináp ica, además de la p esencia de un pool en el soma neu onal (Taniguchi e al., 2007). Sin emba go, se desconoce si la dis ibución de neu exinas se debe a la localización di e encial de iso o mas o si, po el con a io, mismas iso o mas de neu exinas pueden localiza en di e en es compa imen os celula es, debido a la al a de da os sob e la localización de iso o mas conc e as. Po o a pa e, da os p e ios han mos ado que la localización sináp ica de neu exinas puede depende del dominio ci oplásmico. Missle y colabo ado es desc ibie on que la deleción de los úl imos esiduos de dominio ci oplásmico de neu exinas que o man el mo i o de unión a PDZ impide el á ico de neu exinas a la memb ana plasmá ica (Fai less e al., 2008). Po el con a io, o os esul ados indican que el eclu amien o de β-neu exina-1 po Cbln1 es independien e del mo i o de unión a PDZ (Ma suda y Yuzaki, 2011). En base a es os da os, en una p ime a ase de la Tesis nos in e esó analiza el e ec o del dominio ci oplásmico en la localización de β-neu exina-1. Pa a ello, se in ec a on neu onas de hipocampo con ec o es len i i ales que exp esan HA-βN x1 WT o un mu an e de deleción del dominio ci oplásmico, HA-βN x1 C (Figu a 18A). Es as p o eínas ca ecen del si io de splicing 4 y además es án ma cadas con la e ique a HA en la egión ex acelula , pe mi iendo es udia la localización de la p o eína exógena. T as 10 días de in ección los cul i os se p ocesa on po inmuno luo escencia con los an icue pos an i-HA y con a el ma cado sináp ico VGlu 1 pa a es ablece la co-localización de las neu exinas en sinapsis glu ama é gicas. En es os expe imen os la localización de HA-βN x1 WT ep odujo la dis ibución de las RESULTADOS 84 neu exinas endógenas (Dean e al., 2003; Taniguchi e al., 2007). Además, las imágenes de con ocal mos a on una localización ex asináp ica y sináp ica simila pa a ambas cons ucciones de neu exinas, siendo la localización somá ica del mu an e HA-βN x1 C más acusada (Figu a 18C). El análisis de los cul i os in ec ados con HA-βN x1 WT po Wes e n blo con el an icue po an i-HA e eló la p esencia de dos bandas de ap oximadamen e 50 y 100 kDa co espondien es a la p o eína no glicosilada y a la p o eína madu a glicosilada, espec i amen e (Figu a 18B). Ambas p o eínas se obse a on igualmen e en lisados in ec ados con HA-βN x1 C con una di e encia de peso molecula de ap oximadamen e 7 kDa, co espondien e a la deleción del dominio ci oplásmico (Figu a 18B). Es os esul ados sugi ie on que la deleción del dominio ci oplásmico de las neu exinas no impide la localización en memb ana y no iene un g an e ec o en la localización subcelula de β-neu exinas. RESULTADOS 85 Figu a 18. Colocalización sináp ica de HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C en cul i os de neu onas. A) Esquema ep esen a i o de las cons ucciones len i i ales de HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C. B) Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) in ec ados con LV que exp esan: HA-βn x1 o HA-βn x1 C. T as 10 días de in ección, se analizó la exp esión de HA-βN x1 median e Wes e n blo con el an icue po RESULTADOS 86 an i-HA. C) Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) in ec ados con LV que exp esan: HA- βn x1 o HA-βn x1 C. T as 10 días de in ección, las neu onas se analiza on po inmuno luo escencia con an icue pos con a la e ique a HA ( ojo en la colocalización) y con a el ma cado Vglu 1 ( e de en la colocalización). Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . Ba a de escala: 5μm. 4.1.2 Reclu amien o de HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C en los con ac os sináp icos mediados po Nlg1AB T as demos a que la deleción del dominio ci oplásmico de HA-βN x1 no impidió su localización sináp ica en cul i os de neu onas, se es udió en más de alle si la p esencia del dominio ci oplásmico se equie e pa a la in e acción con neu oliguinas en las sinapsis. Pa a ello, se empleó un ensayo de in ección-co-cul i o que consis ió en co-cul i a células Hek 293T ans ec adas con VSV-Nlg1 (AB), con cul i os de neu onas de hipocampo in ec ados du an e 10 días con ec o es len i i ales que exp esan: GFP, HA-βN x1 WT o HA-βN x1 C (Figu a 19A). En es e ensayo, neu oliguina induce el eclu amien o de neu exinas axonales y la o mación de e minales p esináp icos en los axones que con ac an dichas células Hek 293T ans ec adas (Schei ele e al., 2000, Dean e al., 2003). La iso o ma de neu oliguina ans ec ada con iene el splicing B y se une p incipalmen e a -neu exinas que ca ecen del splicing 4 (Bouca d e al., 2005; Chih e al., 2006). Los cul i os de neu onas se p ocesa on pa a inmuno luo escencia 24 ho as as el co-cul i o con an icue pos con a HA y VSV, pa a de ec a las p o eínas exógenas, y con an icue pos con a la p o eína de esículas sináp icas glu ama é gicas Vglu 1. En imágenes de mic oscopía con ocal se obse ó un eclu amien o simila de las p o eínas HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C a los e minales mediados po VSV-Nlg1 (AB). Dicha localización coincidió con los si ios de eclu amien o de esículas sináp icas econocidos con el an icue po Vglu 1 (Figu a 19B). Es os esul ados sugi ie on que la deleción del dominio ci oplásmico de neu exinas no a ec a a la in e acción con neu oliguinas en las sinapsis. Es os esul ados es án en consonancia con o os esul ados desc i os que indican que la in e acción de β-neu exina-1 con Cbln1 no depende de la in eg idad del dominio de unión a PDZ (Ma suda y Yuzaki, 2011). RESULTADOS 87  Figu a 19. Ac i idad sinap ogénica de HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C. A) Esquema expe imen al de un ensayo in ección-co-cul i o. Neu oliguina exp esada en células Hek 293T induce el eclu amien o de ma cado es axonales y la o mación de e minales p esináp icos en los axones que con ac an dichas células Hek 293T. B) Imágenes de con ocal mos ando el eclu amien o de HA-βN x1 y Vglu en los axones que con ac an las células Hek 293T. Cul i os de neu onas de hipocampo in ec ados du an e 9-10 días con ec o es len i i ales que exp esan GPF, HA-βN x1 WT y HA-βN x1 C, se co-cul i a on du an e 24 ho as con células Hek 293T que exp esan HA-Nlg1 (AB). Las neu onas se analiza on po inmuno luo escencia con el an icue po con a la e ique a HA ( e de en la colocalización), con el an icue po con a la e ique a VSV ( ojo en la colocalización) y con a el ma cado sináp ico Vglu 1 (azul en la colocalización). Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado , ob enidas a pa i de secciones óp icas consecu i as. Ba a de escala: 5μm.  RESULTADOS 88 4.1.3 Localización de las dis in as iso o mas de splicing de β-neu exinas Como hemos desc i o en la In oducción, la in e acción en e iso o mas de neu exinas y neu oliguinas es á egulada po splicing al e na i o en el dominio ex acelula . La inse ción del splicing B en neu oliguina-1 es inge la in e acción de neu oliguina-1 a iso o mas de β-neu exinas que ca ecen del splicing Sp4 (-Sp4), mien as que la ausencia del splicing B pe mi e la in e acción de neu oliguina-1 con α- neu exinas y β-neu exinas (Bouca d e al., 2005; Chih e al., 2006). Nues os da os an e io es ob enidos con el mu an e de deleción del dominio ci oplásmico sugie en que la localización de neu exinas pod ía depende de in e acciones mediadas po el dominio ex acelula . En el siguien e expe imen o se analizó el papel del splicing 4 en la localización de β-neu exinas, ya que, basado en la in e acción con neu oliguinas, se pod ía espe a una localización di e encial de iso o mas dependien e de Sp4. Pa a compa a el papel de Sp4 en la dis ibución de di e en es iso o mas de β-neu exinas, se co- ans ec a on neu onas de hipocampo con: HA-βN x1 (-Sp4) y VSV-βN x1 (+Sp4) o con HA-βN x2 (-Sp4) y VSV-βn x1 (- Sp4). Como con ol los cul i os se co- ans ec a on con HA-βN x1 (-Sp4) y VSV-βN x1 (-Sp4) (Figu a 20A). T as 24 ho as de exp esión de los plásmidos ans ec ados, se p ocedió al p ocesado de las neu onas po inmuno luo escencia con an icue pos an i- HA y an i-VSV, pa a de ec a las neu exinas exógenas, y an i-Vglu 1 pa a localiza los e minales glu ama é gicos. Se oma on imágenes po mic oscopía con ocal y se analizó el pa ón de localización de las di e en es iso o mas (Figu a 20B). En las ans ecciones con ol, HA-βN x1 (-Sp4) y VSV-βN x1 (-Sp4) p esen a on el mismo pa ón de inción, indicando que la inse ción de las di e en es e ique as empleadas pa a la de ección no a ec aban a la dis ibución de β-neu exinas. En las neu onas co- ans ec adas con HA-βN x1 (-Sp4) y VSV-βN x1 (+Sp4) se obse ó el mismo pa ón pa a ambas iso o mas, con una dis ibución en e minales glu ama é gicos (Figu a 20). De la misma o ma, la dis ibución de VSV-βN x1 (-Sp4) ue indis inguible de la dis ibución de HA-βN x2 (-Sp4), indicando que la localización de β-neu exinas no se e a ec ada po Sp4 (Figu a 20). Es os esul ados sugie en que Sp4 no de e mina la dis ibución subcelula de β-neu exinas en sinapsis glu ama é gicas. RESULTADOS 89 Figu a 20. Colocalización de di e en es iso o mas de β-neu exinas en e minales p esináp icos. A) Esquema ep esen a i o de las dis in as cons ucciones de β-neu exinas. B) Cul i os de neu onas de hipocampo se co- ans ec a on con di e en es iso o mas de β-neu exinas: HAβN x1-Splice4 y VSVβn x1- Splice4, HAβN x1-Splice4 y VSVβn x1+Splice4 o HAβN x2-Splice4 y VSVβn x1-Splice4 a los 10-13 días in i o. Las neu onas se analiza on po inmuno luo escencia con an icue pos con a la e ique a HA ( ojo en la colocalización), con a la e ique a VSV ( e de en la colocalización) y con a Vglu 1 (azul en la colocalización). Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . Las lechas indican colocalización en e ma cado es. Ba a de escala: 5μm. RESULTADOS 96 complejo -sec e asa que se o ma es inac i o, lle ando a la consecuen e acumulación de los sus a os -sec e asas (Wol e e al., 1999; Yu e al., 2001; Sau a e al., 2005). Con el in de es udia si las neu exinas endógenas son p ocesadas po una ac i idad dependien e de PS/-sec e asa, se abo da on a ias ap oximaciones. En p ime luga se analizó el p ocesamien o de las neu exinas en cul i os de neu onas de hipocampo a ados con DAPT. Los análisis po Wes e n blo de los ex ac os de neu onas de hipocampo con el an icue po cy o-neu exina e ela on la p esencia de la p o eína madu a glicosilada de α- y β-neu exinas en bandas de ap oximadamen e 150 y 100 kDa, espec i amen e, y una doble banda de 12-16 kDa co espondien e a los CTFs endógenos de las neu exinas (Figu a 24A). Los CTFs de las neu exinas se inc emen a on con el a amien o con DAPT (Figu a 24A). En segundo luga se cons uye on ec o es len i i ales (LV) que exp esan p esenilina 1 wild- ype (PS1 WT) y un mu an e dominan e nega i o de p esenilina (PS1 D385A) que p esen a una mu ación en un esiduo esencial pa a la ac i idad p o eolí ica de PS1. Los ec o es len i i ales empleados di igen la exp esión de la p o eínas exógenas a neu onas pe o no a células no neu onales p esen es en el cul i o (Gascon e al., 2007). A con inuación, se gene a on len i i us ecombinan es y se in ec a on cul i os de neu onas de hipocampo. De es a mane a se ob ienen cul i os ansgénicos en los que odas las neu onas ienen bloqueada la unción de PS. T as 10 días de in ección los cul i os se lisa on y se analiza on po Wes e n blo usando el an icue po cy o- neu exina. La sob eexp esión del mu an e PS1 D385A inc emen ó el acúmulo de los CTFs de las neu exinas a ni eles simila es a los encon ados en lisados con ol a ados con DAPT (Figu a 24A). La exp esión de PS1 exógena ue con i mada po Wes e n blo con un an icue po que econoce el NTF de PS1. El an icue po con a PS1 de ec ó mayo i a iamen e una banda de 30 kDa co espondien e al NTF en los cul i os con ol o in ec ados con PS1 WT y una banda de 50 kDa co espondien e a la holop o eína en los lisados in ec ados con el mu an e PS1 D385A (Figu a 24A). Como con ol posi i o se midie on los ni eles del CTF de N-cadhe ina, un sus a o del complejo PS/-sec e asa (Ma ambaud e al., 2003). La inhibición de la ac i idad - sec e asa con el mu an e PS1 D385A o con el a amien o con DAPT p o ocó un acúmulo signi ica i o del CTF de N-Cadhe ina (Figu a 24A). Sin emba go, el bloqueo de la unción de PS no a ec ó a los ni eles de CASK, un ligando del dominio ci oplásmico de las neu exinas (Bu z e al., 1998) (Figu a 24A). RESULTADOS 97  Figu a 24. Acumulación de los CTFs de las neu exinas en neu onas de hipocampo de icien es en ac i idad PS/-sec e asa. A) Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) no in ec ados o in ec ados con LV que exp esan: GFP, PS1 o el mu an e PS1 D385A. Los ni eles de neu exinas (N x), PS1, N-Cadhe ina (N-Cadh), y CASK se analiza on po Wes e n blo después de 10 días de in ección. Los cul i os no in ec ados e in ec ados con GFP se a a on en p esencia de ehículo o DAPT du an e 12-14 ho as. FLα: ull-leng h α-neu exinas; FLβ: ull-leng h β-neu exinas. B) Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) no in ec ados o in ec ados con LV que exp esan: GFP, HA-βn x1 o HA-βN x C y a adas con ehículo o DAPT. La exp esión de β-neu exinas con la e ique a HA y de los CTFs de las neu exinas se analiza on po Wes e n blo usando los an icue po an i-HA y cy o-neu exina, espec i amen e. C) Los ni eles de exp esión de neu exinas se de ec a on median e Wes e n blo con dos ipos de an icue pos, el cy o-neu exina que econoce el dominio ci oplásmico común de odas las neu exinas y un an icue po come cial an i-N x1, que econoce las iso o mas α- y β- de neu exina-1. Los ni eles de α-ac ina se usa on como con ol de ca ga.  RESULTADOS 98 Si bien es os esul ados nos pe mi ie on cons a a que las neu exinas endógenas son p ocesadas po PS/-sec e asa no ue posible disce ni la con ibución de iso o mas conc e as de neu exinas, ya que odas compa en el mismo dominio ci oplásmico, econocido po el an icue po cy o-neu exina. Po ello, nos in e esó es udia una iso o ma conc e a de neu exinas, β-neu exina-1, ya que β-neu exina-1 se une con neu oliguina-1 mediando di e enciación glu ama é gica y una al e ación en el p ocesamien o de β-neu exina-1 pod ía con ibui a las al e aciones en la unción sináp ica glu ama é gica asociada con la pé dida de unción de PS (Sau a e al., 2004). Pa a ello, in ec amos cul i os de neu onas con LV que exp esan HA-βn x1 y se analiza on los ni eles de los CTFs po Wes e n blo . La sob eexp esión de HA-βn x1 lle ó a un inc emen o conside able de los ni eles de los CTFs de las neu exinas en compa ación con cul i os no in ec ados o in ec ados con GFP. Es e inc emen o se obse ó an o en cul i os sin a a como a ados con DAPT (Figu a 24B). Pa a con i ma que el inc emen o de los CTFs p o iene del p ocesamien o de HA-βN x1 y no de la indución de la p o eólisis de cualquie o a iso o ma, exp esamos HA-βN x1 C, un mu an e de β-neu exina-1 que ca ece del dominio ci oplásmico y no puede se de ec ado po el an icue po cy o-neu exina (Figu a 24B). La sob eexp esión de HA- βN x1 C no gene ó el inc emen o de los ni eles de los CTFs, sugi iendo que la iso o ma de β-neu exina-1 exp esada es suscep ible de se p ocesada en neu onas. La incubación con el an icue po an i-HA con i mó la exp esión de HA-βN x1 y HA- βN x1 C (Figu a 24B). En es os expe imen os los ni eles endógenos de β-neu exinas de ec ados con el an icue po cy o-neu exina ue on ela i amen e bajos en compa ación con α- neu exinas (Figu a 24B). Sin emba go, un an icue po come cial an i-neu exina 1 de ec ó ni eles simila es de α- y β-neu exinas (Figu a 24C), sugi iendo que ambas p o eínas se exp esan en cul i os de neu onas de hipocampo a ni eles simila es. En conjun o, los esul ados ob enidos demos a on que las neu exinas endógenas son p ocesadas po una ac i idad PS/-sec e asa y que la inac i ación de la ac i idad PS/- sec e asa lle a a un inc emen o de los CTFs de las neu exinas en neu onas. A con inuación, se es udió si el p ocesamien o del ec odominio en neu onas es á mediado po ac i idad ADAM17, como ocu e con las neu exinas sob eexp esadas en células he e ólogas. Pa a ello, se in ec a on cul i os de neu onas con HA-βN x1 y se a a on con DAPT solo o en combinación con TAPI-1. El análisis de los lisados celula es median e Wes e n blo con el an icue po cy o-neu exina, e eló una disminución del acúmulo de los CTFs de HA-βN x1 cuando a amos con TAPI-1, RESULTADOS 99 sugi iendo que el p ocesamien o del ec odominio de HA-βN x1 en neu onas equie e ac i idad ADAM17. En pa alelo, la inhibición del p ocesamien o del ec odominio mediado po ADAM17 es u o asociada a un inc emen o en los ni eles de la p o eína madu a econocida con el an icue po an i-HA (Figu a 25).  Figu a 25. E ec o del inhibido TAPI-1 en el p ocesamien o de HA-βN x1 en cul i os de neu onas. Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) ue on no in ec ados o in ec ados con LV que exp esan HA-βn x1 y a ados con DMSO (con ol) o con DAPT solo o en combinación con el inhibido TAPI-1. La exp esión de β-neu exinas con la e ique a HA y de los CTFs de las neu exinas ue on analizados po Wes e n blo usando los an icue po an i-HA y cy o-neu exina, espec i amen e. Se usó como con ol de ca ga -ac ina.  4.2.3 Acumulación de los CTFs de las neu exinas en a ones knock-ou de PS Con la inalidad de es udia si el p ocesamien o de las neu exinas ocu e in i o, se examinó el p ocesamien o de las neu exinas endógenas en a ones KO de PS1 (PS1-/-) y en a ones KO doble condicional de PS1 y 2 (cDKO). Los a ones KO de PS1 (PS1-/-) mue en al nace , po an o los es udios sob e el p ocesamien o de las neu exinas en ausencia de PS1 se ealiza on en lisados de ce eb os de emb iones PS1-/-. En los a ones cDKO de PS la exp esión de PS1 y 2 es á inhibida en las neu onas glu ama é gicas de la co eza ce eb al (neoco eza e hipocampo) a pa i de la e ce a semana pos na al (Sau a e al., 2004). Es os a ones cDKO de PS no mue en al nace , pe mi iéndonos es udia el p ocesamien o de neu exinas en ausencia de PS1 y PS2 en el ce eb o adul o. Los expe imen os con lisados p o enien es de es as líneas de animales se ealiza on en colabo ación con el D . Ca los A. Sau a de la Uni e sidad Au ónoma de Ba celona. Consis en e con el papel de PS en la p o eólisis de neu exinas, se encon ó una acumulación signi ica i a de los CTFs de las neu exinas en los ex ac os ce eb ales de emb iones PS1-/- y de a ones de 2 RESULTADOS 100 meses de edad cDKO de PS espec o a sus con oles (Figu a 26A). Asociada a una disminución de PS, los ni eles del CTF de N-Cadhe ina ambién se inc emen a on en los lisados ce eb ales p oceden es de los emb iones PS1-/- y de los a ones cDKO de PS (Figu a 26A).  Figu a 26. Acumulación de los CTFs de las neu exinas en las acciones sináp icas de los a ones cDKO de PS. A) Ex ac os ce eb ales de emb iones WT y KO de PS1 y de a ones de 2 meses WT y cDKO de PS, se analiza on median e Wes e n blo con el an icue po cy o-neu exina (N x), PS1 y N- Cadhe ina (N-Cadh). El inc emen o de los CTFs de las neu exinas y el CTF de N-Cadhe ina se encon ó asociado con una disminución de la exp esión de PS en animales que ca ecen de PS. B) Acumulación de los CTFs de las neu exinas en acciones sináp icas de los a ones cDKO de PS. Lisados de co eza ce eb al y las acciones p e- y pos -sináp icas ob enidas del accionamien o de los sinap osomas de a ones con oles WT y a ones cDKO de PS se analiza on po Wes e n blo con el an icue po cy o- neu exina, PS1, sinap o isina (SYP) y PSD95. Los ni eles de los CTFs de las neu exinas se inc emen a on en los sinap osomas y acciones p esináp icas de los a ones cDKO de PS. Sinap o isina y PSD95 es aban en iquecidas en las acciones p esináp icas y pos sináp ica espec i amen e. Es os expe imen os se ealiza on po el D . Ca los A. Sau a. Es udios p e ios han mos ado una localización p esináp ica de neu exinas (Dean e al., 2003; Taniguchi e al., 2007) y de PS (Zhang e al., 2009a; Sau a e al., 2005). De es e modo, nos p egun amos si los CTFs de las neu exinas se acumulan en el e minal p esináp ico. Pa a ello, el D . Ca los A. Sau a es udió la localización de los CTFs en acciones de sinap osomas de co ezas de animales adul os WT y cDKO de RESULTADOS 101 PS. Más conc e amen e, cada mues a analizada consis ió en un pool de sinap osomas de 3 animales de cada condición y la p esencia de los CTFs de las neu exinas se analizó po Wes e n blo . Los esul ados ob enidos mos a on una acumulación de los CTFs de neu exinas en los sinap osomas de los a ones cDKO de PS asociada con una educción de PS1. Los ni eles esiduales de PS1 en los a ones cDKO se deben a la exp esión de PS1 en la glía e in e neu onas (Sau a e al., 2005; Zhang e al., 2009a). Po o a pa e, el p oceso de accionamien o u ilizado puso de mani ies o que PS1 se dis ibuye p incipalmen e en la acción p esináp ica en iquecida en sinap o isina en el a ón con ol (Figu a 26B). Los CTFs de neu exinas apa ecie on muy concen ados en la acción p esináp ica de los a ones cDKO de PS, aunque bajos ni eles de es os CTFs ambién se de ec a on en la acción pos sináp ica (Figu a 26B). Es os esul ados, que concue dan con e idencias p e ias sob e la acumulación de los CTFs de APP en los e minales p esináp icos de los a ones cKO de PS (Sau a e al., 2005), indican que PS egula el p ocesamien o de los CTFs de las neu exinas en los compa imen os sináp icos, sugi iendo una p o eólisis de las neu exinas en el e minal p esináp ico. 4.2.4 La exp esión de neu oliguina-1(+B) pos sináp ica eclu a a PS1 en los e minales sináp icos Según los da os an e io es, PS1 se dis ibuye en los e minales p esináp icos donde p ocesa a los CTFs de las neu exinas. Es e p ocesamien o ocu i ía, al menos, en e minales glu ama é gicos. Con el in de comp oba si el p ocesamien o de neu exinas po PS ocu e en las sinapsis glu ama é gicas, decidimos es udia en p ime luga si PS se eclu a a los e minales glu ama é gicos mediados po el sis ema de neu exinas-neu oliguinas. Pa a ello, se ans ec a on neu onas de hipocampo con HA-Nlg1 (AB), una iso o ma de neu oliguina con los splicing A y B (pa a simpli ica , HA-Nlg1) que induce la o mación de sinapsis glu ama é gicas. La dis ibución de PS y de neu exinas se analizó po inmuno luo escencia. Como con ol del expe imen o, se ans ec a on cul i os de neu onas con GFP. Las imágenes de con ocal mos a on un eclu amien o de neu exinas endógenas a las sinapsis inducidas po HA-Nlg1, consis en e con esul ados p e ios (Dean e al., 2003). La incubación con el an icue po an i PS1 mos ó un aumen o en la dis ibución de la señal de PS1 en las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1 pe o no en las células ecinas sin ans ec a o en dend i as ans ec adas con GFP (Figu a 27A). A con inuación, se cuan i icó an o la in ensidad como el á ea ela i a ocupada po neu exinas y PS1 en las dend i as ans ec adas. Es as cuan i icaciones mos a on RESULTADOS 102 inc emen os signi ica i os an o en á ea como en in ensidad de las neu exinas en las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1 en compa ación a las dend i as ans ec adas con GFP (0,84±0,01 y 100,29±4,42, á ea e in ensidad p omedio de neu exinas en HA- Nlg1 s 0,30±0,02 y 42,08±2,35, á ea e in ensidad p omedio de neu exinas en GFP) (Figu a 27A y Figu a 27B). El eclu amien o de neu exinas debe ía co esponde p incipalmen e a las iso o mas β-neu exinas, ya que la iso o ma de HA-Nlg1 empleada in e acciona con iso o mas β- y no con las α-neu exinas debido a la p esencia del si io de splicing B (Bouca d e al., 2005; Siddiqui e al., 2010; Chih e al., 2006). Respec o a PS1 ambién se obse ó un inc emen o signi ica i o an o en á ea como en in ensidad en las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1 espec o a las ans ec adas con GFP (0,57±0,03 y 130,32±5,14, á ea e in ensidad p omedio de PS1 en HA-Nlg1 s 0,34±0,02 y 114,03±5,33, á ea e in ensidad p omedio de PS1 en GFP) (Figu a 27A y Figu a 27C). Además la obse ación de las imágenes mos ó cie o g ado de colocalización en e PS y neu exinas. En de ini i a, a juzga po los esul ados ob enidos, podíamos suge i que PS1 se concen a en las sinapsis glu ama é gicas mediadas po HA-Nlg1 donde pod ía p ocesa a las neu exinas en es os e minales sináp icos.  Figu a 27. Reclu amien o de PS1 a las sinapsis mediadas po neu exinas-neu oliguinas. A) Cul i os de neu onas de hipocampo se ans ec a on con GFP o HA-Nlg1 a los 10-13 días in i o. T as la ijación, las neu onas se p ocesa on pa a inmuno luo escencia con el an icue po con a la e ique a HA a in de iden i ica las células ans ec adas ( e de en la colocalización), con el an icue po cy o-neu exina (azul en la colocalización) y con el an icue po con a el domino N- e minal de PS1 ( ojo en la colocalización). Se RESULTADOS 103 mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado , ob enidas a pa i de secciones óp icas consecu i as. B) Cuan i icación de píxeles o ales de las neu exinas y de PS1 no malizados espec o a la supe icie dend í ica. C) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los píxeles posi i os pa a neu exinas y PS1 den o de la supe icie dend í ica. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , p omedios de es expe imen os independien es (n=25 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (***) p<0.001; (**), p<0.05. Ba a de escala: 5μm.  Pa a apoya una localización sináp ica de PS se es udió la dis ibución de PS con ma cado es sináp icos en las sinapsis mediadas po HA-Nlg1. Las imágenes de mic oscopía con ocal mos a on cie a co-localización de PS1 con el ma cado p esináp ico sinap ob e ina-2 (Vamp2) y con el ma cado pos sináp ico PSD95 (Figu a 28). Sin emba go, es os da os no disc iminan en e una localización p e o pos sináp ica de PS1, debido al lími e de la esolución espacial de los expe imen os de epi luo escencia.  Figu a 28. Colocalización de PS1 con ma cado es sináp icos en las sinapsis mediadas po HA- Nlg1. A) Cul i os de neu onas de hipocampo se ans ec a on con HA-Nlg1 a los 10-13 días in i o. Las neu onas se analiza on po inmuno luo escencia con el an icue po con a HA ( e de en la colocalización), con el an icue po con a el dominio N- e minal de PS1 ( ojo en la colocalización), y con el ma cado p esináp ico sinap ob e ina Vamp2 (azul en la colocalización) o con el ma cado pos sináp ico PSD95 (azul en la colocalización). Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . Las lechas señalan la colocalización de PS1 con los ma cado es sináp icos en las sinapsis mediadas po HA-Nlg1. Ba a de escala: 5μm. Pa a analiza si el eclu amien o de PS ocu e en los e minales p esináp icos, se empleó un ensayo de co-cul i o de neu onas de hipocampo con células Hek 293T que exp esan po ans ección GFP (con ol) o HA-Nlg1 (Figu a 29). Con es e ensayo, neu oliguina induce el eclu amien o de ma cado es axonales y la o mación de e minales p esináp icos en los axones que con ac an dichas células Hek 293T (Schei ele e al., 2000). De es e modo, es udiamos únicamen e el eclu amien o de ma c exp e Sch e Figu hipoc a co-cu ansi pa a de l a com o Hek dis i inde p imá g de l a no m píxel célul á ea Nlg1 in e n p o m obs e ecl u (0,6 7 0,28 ± 30B c ado es p e e san una i s e i ele e al. a 29. Esqu e a mpo se aña d l i o pe mi e náp ico de ne Los cul i o s inmuno lu o a s neu exin a o un en iq u 293T que i bución de p endien e m g enes de m a s neu exi n m alizados l es posi i o a Hek 293 T como en i espec o n sidad p o m m edio de P S e ó un i n u amien o d 7 ±0,03 y 1 2 ± 0,03 y 76 y Figu a 3 e sináp icos s o o ma e s , 2007). e ma expe im e d en células H e dispa a la u u exinas y ne s se ija on o escencia a s y de PS 1 u ecimien o exp esan es os m a m en e de l a m ic oscopía n as y de P en e al á e s pa a neu T . Es as cu a i n ensidad d a las a n m edio de P S S 1 en GF P n c emen o e neu exin 2 9,40±4,41 , ,71±4,49, á 3 0C). Res p en espu e pecí ica d e e n al de un e k 293T que e u a de señali z u oliguinas. a las 24 h o con an icu e 1 en las he m del ma caj e HA -Nlg1. E a cado es a p esenci a con ocal s S1 como p e a de la c é exinas y P a n i icacion d e PS1 so b n s ec adas S 1 en HA- N P ) (Figu a 3 signi ica i o as sob e l a á ea e in á ea e in e n ec o al pa e s a al con e neu oligui ensayo de e xp esan po z ación sinap o o as de es a e pos cy o- n misinapsis e de las n e E n las célu ue simil a a de las c s e cuan i ic a p íxeles po é lula Hek 2 P S1 se cua es mos a o b e las cél u con GFP N lg1 s 0,1 9 3 0B y Figu o an o e n a s células H ensidad p o n sidad p o m ón de di s ac o con c na (Schei e co-cul i o. S ans ección H o génica medi a blece se e n eu exina y dispa adas e u exinas y las Hek 2 9 a en od a c élulas He k a on pa a d encima d e 2 93T. La i n n i icó den o n un inc e u las Hek 2 9 (0,33±0,0 9 ±0,02 y 93 a 30C). E n n á ea c o H ek 293T o medio de m edio de n e s ibución d c élulas no e le e al., 2 S ob e el cul i H A-Nlg1. Es e ada po el si l co-cul i o y an i-PS1. po HA-Nl g y de PS1 s 9 3T que e x a s las á e k 293T (Fi d e e mina e un umb a n ensidad p o del á e a men o sign 9 3T ans e 3 y 116,0 ,12±1,43, á n es e sen o mo en in ans ec ad a neu exina s e u exinas e e PS y n e RESULT A neu onale s 2 000; Bied e  o de neu o n e sis ema mo d i s ema de ad y se p oce s El eclu a m g 1 ue de e s ob e las c é x p esan G F e as del c a i gu a 30 A ) el eclu a m a l de e min a p omedio d a ocupada p i ica i o a n e c adas co n 0 1±2,10, á á ea e in en ido, ambi é n ensidad e as con H A s en HA-Nl g e n GFP) ( F e u exinas e A DOS 104 s que e e y n as de d elo de hesión s a on m ien o c ado é lulas F P, la a mpo, . Las m ien o a do y d e los p o la n o en n H A - ea e sidad é n se e n el A -Nlg1 g 1 s F igu a e n las RESULTADOS 105 hemisinapsis, se obse ó cie o g ado de colocalización en e PS1 y neu exinas. Es os da os, en consonancia con la localización p esináp ica de PS1 mos ada en los ensayos bioquímicos, sugie en que la exp esión de HA-Nlg1 induce el eclu amien o de PS1 axonal a los e minales p esináp icos mediados po β-neu exinas.  Figu a 30. Reclu amien o de PS1 en las hemisinapsis mediadas po neu exina-neu oliguina. A) Cul i os de neu onas de hipocampo de 14-16 días in i o se co-cul i a on du an e 24 ho as con células Hek 293T que exp esa GFP o HA-Nlg1. El eclu amien o de PS1 y de las neu exinas en las células Hek 293T ans ec adas se analizó po inmuno luo escencia con el an icue po con a PS1 de a ón ( ojo en la colocalización) y con el an icue po cy o-n x (azul en la colocalización). El an icue po de PS1 de a ón empleado (Ab2) no econoce PS1 humana exp esada en Hek 293T. La exp esión de HA-Nlg1 se analizó con el an icue po con a la e ique a HA a in de iden i ica las células ans ec adas ( e de en la colocalización) y GFP se de ec ó po inmuno luo escencia di ec a. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia. B) Cuan i icación de píxeles o ales posi i os pa a neu exinas o PS1 no malizados espec o a la supe icie de las células Hek 293T. C) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los píxeles posi i os pa a neu exinas o PS1 den o del á ea de las células Hek 293T. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , p omedios de es expe imen os independien es (n=20 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (***) p<0.001; (**), p<0.05. Ba a de escala: 5μm. RESULTADOS 112 desc i os p e iamen e y, a su ez, simila es a los ob enidos analizando los ni eles de los CTFs de neu exinas (Figu a 35A-C y Figu a 36). Figu a 35. Incubación con soluciones despola izan es ac i an el p ocesamien o de las neu exinas en cul i os de neu onas de hipocampo. A, B y C) Wes e n blo s ep esen a i os de cul i os de neu onas de hipocampo (15 días in i o) es imulados con 50 mM KCl solo o en combinación con DAPT RESULTADOS 113 incubado en p esencia de los siguien es inhibido es: AP5 más CNQX, -aga oxina IVA, -cono oxina MVIIC, -aga oxina IVA más -cono oxina MVIIC, Cadmio, Tapsiga gina, Ni edipina, TTX o GM6001, como se indica. Los CTFs de las neu exinas y el CTF de N-Cadhe ina se analiza on po Wes e n blo usando el an icue po cy o-neu exina y el an icue po an i-N-Cadhe ina, espec i amen e. Los inmunoblo s se incuba on con el an icue po an i α-ac ina pa a no maliza la ca ga de p o eína o al po ca il.   Figu a 36. Cuan i icación de los ni eles de CTF de neu exinas en cul i os incubados con KCl. Análisis cuan i a i os de los ni eles de los CTFs de las neu exinas y CTF de N-Cadhe ina en cada una de las condiciones indicadas no malizados con espec o a la si uación con ol sin es imula . Los da os se p esen an como medias±e o es ánda y son p omedios de 6 expe imen os independien es pa a las condiciones expe imen ales: con ol, DAPT, KCl, KCl+DAPT, KCl+DAPT+AP5+CNQX, KCl+DAPT+- Aga oxina IVA (Aga), KCl+DAPT+Cd2+, KCl+DAPT+Tapsiga gina (TH) y KCl+DAPT+GM6001, y p omedios de dos expe imen os independien es pa a las condiciones KCl+DAPT+Ni edipina y KCl+DAPT+TTX. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Bon e oni, (**), p<0.05. Los as e iscos de colo neg o y g is ep esen an di e encias signi ica i as espec o al con ol sin es imula con KCl y los de colo ojo y azul espec o a la condición KCl+DAPT. Los esul ados an e io es sugi ie on que el p ocesamien o de las neu exinas endógenas se dispa a po ac i idad sináp ica. A con inuación nos in e esó analiza si el p ocesamien o de una iso o ma conc e a de neu exina, β-neu exina-1, se egula igualmen e po ac i idad sináp ica. Pa a ello, se in ec a on cul i os de neu onas de hipocampo con LV que exp esan HA-βN x1 y as 10 días de in ección se es imula on con KCl solo o en combinación con DAPT y se analizó la p esencia de los agmen os de neu exinas po Wes e n blo . La cuan i icación de los CTFs de HA-βN x1, e eló un RESULTADOS 114 inc emen o de 2,2 eces en los cul i os incubados con KCl espec o a cul i os con ol sin es imula (Figu a 37A y Figu a 37B). Los ni eles de los CTFs de HA-βN x1 inducidos po despola ización ue on supe io es a los ob enidos en las células a adas con DAPT sin es imula (Figu a 37A, Figu a 37B y Figu a 37C).  Figu a 37. La despola ización ac i a el p ocesamien o de HA-βN x1 en cul i os de neu onas de hipocampo. A, B) Cul i os de neu onas de hipocampo (3-5 días in i o) in ec ados con un ec o len i i al que exp esa HA-βn x1. T as 10 días de in ección, las neu onas se es imula on con 50 mM KCl solo o en RESULTADOS 115 combinación con DAPT y en p esencia de los siguien es inhibido es: AP5 y CNQX, -aga oxina IVA (Aga) y -cono oxina MVIIC (Cono) o GM6001, como se indica. Los CTFs de las neu exinas se analiza on po Wes e n blo usando el an icue po cy o-neu exina. C) Análisis cuan i a i os de los ni eles de los CTFs de las neu exinas no malizados con espec o a la si uación con ol sin es imula . Los da os se p esen an como medias±e o es ánda y son p omedios de cua o expe imen os independien es pa a las condiciones expe imen ales: con ol, DAPT, KCl, KCl+DAPT y KCl+DAPT+GM6001, y p omedios de dos expe imen os independien es pa a las condiciones KCl+DAPT+AP5+CNQX y KCl+DAPT+Aga+Cono. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Bon e oni, (***) p<0.001; (**), p<0.05. Los as e iscos de colo neg o ep esen an di e encias signi ica i as espec o al con ol sin es imula con KCl y los de colo ojo espec o a la condición KCl+DAPT.  Además, la incubación con KCl y DAPT inc emen a on los ni eles de los CTFs de neu exinas 1,4 eces espec o a la condición es imulada en ausencia de DAPT. Además, el a amien o con GM6001 lle o a una educción de un 34% en los ni eles de los CTFs de neu exinas inducidos po la incubación con KCl y DAPT (Figu a 37A, Figu a 37B y Figu a 37C). Resul ados simila es se ob u ie on cuando los cul i os de neu onas es imulados con KCl y a ados con DAPT se incuba on con AP5 y CNQX (Figu a 37B y Figu a 37C). Es os esul ados ob enidos con una iso o ma conc e a de neu exina, son simila es a los ob enidos con las neu exinas endógenas y sugi ie on que la despola ización inc emen a el p ocesamien o del ec odominio de, al menos, β- neu exinas que conlle a a un aumen o de los ni eles de los CTFs. 4.3.2 Análisis de la unción de PS sob e la libe ación esicula en e minales mediados po el complejo neu exinas-neu oliguinas Los esul ados desc i os has a aho a demues an que: i) las neu exinas se p ocesan po PS en los e minales p esináp icos; ii) que los CTFs de las neu exinas se acumulan en los e minales glu ama é gicos de neu onas de icien es en PS; y iii) que la ac i idad sináp ica es imula el p ocesamien o de las neu exinas. Da os ecien es sugie en una unción p esináp ica de PS en la egulación de la libe ación de neu o ansmiso es (Zhang e al., 2009a). Los de ec os obse ados en la LTP en el hipocampo de a ones cDKO de PS se deben a un papel de PS en el e minal p esináp ico egulando la libe ación de neu o ansmiso es (Zhang e al., 2009a). Es os da os sugie en que la unción de PS hacia sus sus a os en el e minal p esináp ico se equie e pa a man ene la libe ación de neu o ansmiso es. Po o a pa e, da os ob enidos po Juan An onio Páez Gómez en el g upo han mos ado que la ac i ación de las neu exinas po neu oliguinas inc emen a la libe ación de neu o ansmiso es en RESULTADOS 116 sinapsis glu ama é gicas. Es os da os sugi ie on la posibilidad de que el inc emen o en la libe ación mediada po neu exinas pod ía eque i de la ac i idad de PS. Pa a e alua es a hipó esis, se analizó la libe ación esicula de las sinapsis mediadas po neu exinas en cul i os de neu onas de ec i os o no en PS. Pa a ello, se desa olló un ensayo expe imen al que cons a de los siguien es pasos (Figu a 38): 1 In ección de cul i os de neu onas de hipocampo con la sonda sináp ica sypHy. La in ección se ealizó a los 3 días in i o. SypHy es una p o eína de usión de una EGFP sensible a pH con la pa e luminal de la p o eína de esícula sináp ica, sinap o isina (G anse h e al., 2006). En si uación de eposo, el pH ácido de la esícula sináp ica impide la luo escencia mediada po EGFP. Con la llegada de los po enciales de acción, las esículas se usionan con la memb ana, de mane a que el pH in aluminal de las esículas se uel e más básico al equilib a se con el espacio ex acelula , inc emen ando la luo escencia de sypHy. La pos e io endoci osis y e-acidi icación de la esícula induce el apagado de la luo escencia. 2 Co- ans ección de los cul i os con los plásmidos HA-Nlg1 (AB) y la p o eína luo escen e DsRed2. La co- ans ección se ealizó a los 8-9 días de in ección con sypHy (11-12 días in i o). La iso o ma de neu oliguina exp esada p omue e la o mación de e minales glu ama é gicos e induce el eclu amien o de las β- neu exinas. La co- ans ección con DsRed2 nos pe mi e iden i ica du an e el expe imen o de imagen las dend i as ans ec adas. 3 Es imulación eléc ica del cul i o. A las 24 ho as de la co- ans ección de HA-Nlg1 y DsRed2 se p ocede a la es imulación de campo del cul i o. Los cub eobje os que con ienen el cul i o de neu onas se mon a on en una cáma a de egis o y se pe undie on con una solución ex e na, a la que se le añadió CNQX y AP5, con el in de inhibi la ac i idad sináp ica exci a o ia glu ama é gica ecu en e. Los cul i os se es imula on con 300 PA a 20 Hz, gene ando un campo eléc ico su icien e pa a ac i a las neu onas si uadas en e los dos elec odos y simula la llegada de po enciales de acción al e minal sináp ico. 4 Regis o de la libe ación esicula analizada como cambios de luo escencia de sypHy median e la g abación de imágenes en iempo eal, empleando el so wa e HCLmage 1.0. 5 Análisis de las secuencias g abadas median e el so wa e Image J. Se selecciona on egiones de in e és (ROI) que comp enden ap oximadamen e el á ea de una sinapsis. Median e la aplicación del sc ip Wa eme ics de Igo P o, se c s c s d i m equ PS/ - I n - B D - I n n Figu pa a sináp los c u cul i o c alculó el i s elecciona o c o espond e s ypHy que c d e ROI con m agen pe o Pa a de e m ie e de ac i -sec e asa n hibición d e B loqueo de D 385A. n hibición d n eu onas p a 38. Esque m el análisis d ica luo esce n u l i os in ec a o exp esan s y i nc emen o o n dos po b e a los e m c on ac an a ol de inid o o que no c o m ina si la i idad de P (Figu a 38 ) e la ac i id a la unción d e la exp e oceden es m a ep esen e libe ación n e sypHy m e dos se co- a y pHy, pe o s o máximo d b laciones d m inales me a la dend i a o s como si n ac an a l a libe ación d S, se empl e : a d -sec e a d e PS med e sión de P de a ones a i o del p o esicula . G e dian e el em a ns ec a on c o o lo aquellos e in ección d e luo es c d e ROI d e diados po a que exp i ios de e s a dend i a d e esícul a e a on es a a sa median d ian e el us o P S1 y PS2 KO pa a P o ceso de in e ene ación de pleo de len i o n HA-Nlg1 y e minales qu e c encia (∆F ) e n o de c a HA-Nlg1 esa DsRe d s pues a de ans ec ad a a s sináp ica s a bo dajes d e la incub a o de LV qu e median e S 2 y loxea c ción- ans e cul i os de n i us especí i c y DsRed2. Vi e con ac an c ans ec c ) du an e e a da expe i m isualizado s d , y una se g sypHy den a con H A -N l s mediada s d e inhibició n a ción con D A e exp esan el empleo dos pa a el e cción del e n n eu onas que c os de neu o n ualmen e o d c on dend i as c ión RESULT A el es ímul o m en o, un a s como si i o g unda pobl n o de la m lg1/DsRed. s po neu e n de la ac i A PT. el mu an e o de cul i o l gen de P S n sayo expe i m e exp esan la n as. Pos e io m d as las sinap s que sob eex p A DOS 117 o . Se a que o s de ación m isma e xinas idad e PS1 o s de S 1. m en al sonda m en e, s is del p esan RESULTADOS 118 HA-Nlg1, iden i icadas median e la co-exp esión de DsRed2, dependen del sis ema de adhesión de neu exinas-neu oliguinas. Los paneles in e io es mues an esquemá icamen e las modi icaciones del sis ema empleadas pa a bloquea la unción de PS. El ensayo expe imen al empleado conjun amen e con los es abo dajes de inhibición de PS, nos pe mi ió compa a la libe ación de neu o ansmiso es en sinapsis no mediadas y mediadas po HA-Nlg1 y analiza el e ec o de la inhibición de PS espec o a las neu onas con ol. La libe ación sináp ica se es udió como cambios en la luo escencia de la sonda sypHy debido a la es imulación con 300 PA, es ímulo su icien e pa a p o oca la exoci osis/endoci osis del RRP y, pa cialmen e, del con ingen e de ese a de las esículas sináp icas. Los esul ados de libe ación esicula ob enidos con cada una de las ap oximaciones se desc iben a con inuación. 4.3.2.1 Análisis de la libe ación de esículas sináp icas en cul i os de neu onas con la ac i idad -sec e asa inhibida po DAPT En p ime luga , se es udió la libe ación analizada con sypHy de los e minales sináp icos o mados sob e las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1 (sinapsis mediadas po HA-Nlg1) y ue a de las dend i as ans ec adas (sinapsis con ol) en dos si uaciones expe imen ales: sin a a y a adas con DAPT. Pa a ello, se empleó el ensayo expe imen al explicado an e io men e, pe o añadiendo DAPT al cul i o du an e las úl imas 12 ho as an es de p ocede con la es imulación (Figu a 38). El DAPT se man u o en la solución de pe usión. De es a o ma, se p e endió man ene inhibida la ac i idad PS/-sec e asa desde la exp esión de HA-Nlg1. Du an e el análisis, se obse ó que las neu onas espondie on al es ímulo de 300 PA de mane a e icien e, ya que la secuencia de imágenes egis ada p esen ó un inc emen o de luo escencia que coincidió en odo momen o con el es ímulo (Figu a 39A). El F de las sinapsis con ol ( eclu amien o de sypHy en si ios que no con ac an con las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1) y de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (si ios de espues a de sypHy que con ac an con las dend i as ans ec adas con HA- Nlg1), se cuan i icó en las dos si uaciones expe imen ales (Figu a 39). En neu onas no a adas con DAPT, el ∆F de sypHy de las sinapsis medidas po HA-Nlg1 aumen ó 3,4 eces espec o a las sinapsis con ol si uadas en la p oximidad (Figu a 39D). El a amien o con DAPT disminuyó un 33% el ∆F de sypHy de las RESULTADOS 119 sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (Figu a 39D). Sin emba go, el ∆F de sypHy de las sinapsis con ol no se a ec ó po la p esencia de DAPT (Figu a 39). Es os esul ados sugi ie on que la exp esión de HA-Nlg1 en la neu ona pos sináp ica inc emen a la libe ación esicula en los e minales p esináp icos mediados po neu exinas. Po o a pa e, la inhibición de la ac i idad PS/-sec e asa con DAPT educe la libe ación de esículas sináp icas especí icamen e en las sinapsis mediadas po el sis ema de neu exinas-neu oliguinas. Es os da os sugie en que la libe ación de neu o ansmiso es en sinapsis inducidas po β-neu exinas equie e de PS.  Figu a 39. E ec o de la inhibición de la ac i idad -sec e asa po DAPT sob e la libe ación de esículas sináp icas en las sinapsis mediadas po neu exinas-neu oliguinas. A) Neu onas in ec adas con sypHy y co- ans ec adas con DsRed2 y HA-Nlg1, a adas o no con DAPT. Se ep esen an los cambios de la luo escencia de sypHy an es, du an e y después de la aplicación de 300 PA a una ecuencia de 20 Hz. B,C) Rep esen ación de la ciné ica de la luo escencia de sypHy en sinapsis con ol (B) o en sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (C). Las cu as es án no malizadas a la si uación expe imen al RESULTADOS 120 sin a amien o con DAPT y p o ienen de un expe imen o ep esen a i o. D) Rep esen ación g á ica de los F de las sinapsis con ol y de las mediadas po HA-Nlg1, a adas o no con DAPT. Los alo es de F es án no malizados a las sinapsis con ol de la si uación expe imen al sin a a con DAPT. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , son p omedios de es expe imen os independien es. Cul i os no a ados con DAPT: n=21 neu onas, >900 ROI po condición. Cul i os a ados con DAPT: n=21 neu onas, >750 ROI po condición. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (***) p<0.001. Ba a de escala en A: 5μm. La diminución del F en las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 al inhibi la ac i idad -sec e asa se pod ía debe a una educción en los ni eles de HA-Nlg1, a una disminución en el núme o de esículas sináp icas o a sinapsis que esponden menos al es ímulo. Pa a desca a en e es as posibilidades, se analiza on los ni eles de sypHy y de HA-Nlg1. Pa a ello, as los expe imen os de es imulación, los cul i os se ija on y se cuan i ica on los ni eles de sypHy po luo escencia di ec a y los de HA- Nlg1 con un an icue po con a HA. El análisis de las imágenes de con ocal mos ó ni eles de in ensidad de HA-Nlg1 simila es en e neu onas sin a a y a adas con DAPT (119,72±4,83, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os con ol s 125,23±4,07, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os a ados con DAPT) (Figu a 40A y Figu a 40B), desca ando una meno libe ación po meno exp esión de HA-Nlg1. Respec o al á ea e in ensidad de sypHy en las dend i as que exp esan HA-Nlg1, no se obse a on di e encias signi ica i as en e la condición sin a a y a ada con DAPT (0,67±0,02 y 133,36±2,37, á ea ela i a e in ensidad p omedio de sypHy en cul i os con ol s 0,60±0,03 y 133,95±2,97, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os a ados con DAPT) (Figu a 40A y Figu a 40C), demos ando que ni la capacidad sinap ogénica ni el eclu amien o de esículas sináp icas inducido po HA-Nlg1 es á a ec ado po DAPT. El conjun o de es os esul ados sugi ie on que la disminución del F se pod ía debe a sinapsis que esponden en meno medida al es ímulo. RESULTADOS 121  Figu a 40. Cuan i icación de los ni eles de luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en cul i os a ados con DAPT. A) Neu onas in ec adas con sypHy y co- ans ec adas con HA-Nlg1 y DsRed2, a adas o no con DAPT. T as la ijación, las neu onas se p ocesa on po inmuno luo escencia con el an icue po con a la e ique a HA a in de iden i ica las células ans ec adas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se de ec a on po luo escencia di ec a. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado , ob enidas a pa i de secciones óp icas consecu i as. B) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los pixeles de HA-Nlg1 en las dend i as ans ec adas. C) Cuan i icación del á ea de sypHy no malizada a la supe icie dend í ica (g á ica izquie da), y de la in ensidad p omedio de los píxeles posi i os de sypHy en las dend i as ans ec adas (g á ica de echa). Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , son p omedios de es expe imen os independien es (n=20 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden . Ba a de escala: 5μm.  RESULTADOS 128 sináp icos iden i icados po Vglu 1 no exp esaban GFP, pe mi iendo su análisis con sypHy ( éase más adelan e). Es os da os asegu aban un e ec o de las p o eínas C e en la p ác ica o alidad de las células del cul i o.  Figu a 44. Exp esión len i i al de C e y C e en cul i os de neu onas. Cul i os de neu onas de hipocampo de emb iones PS1/ PS1; PS2-/- se in ec a on a los 3 días in i o con ec o es len i i ales que exp esan C e y C e. T as 9 días de in ección, las neu onas se ija on y se p ocesa on pa a inmuno luo escencia con an icue po con a el ma cado sináp ico Vglu 1 ( ojo en la colocalización). La exp esión de C e y C e se isualizó po inmuno luo escencia di ec a de GFP. Los núcleos se iñe on con DAPI. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . Ba a de escala: 5μm.  Una ez con i mada la gene ación de cul i os KO de PS, median e la exp esión len i i al de C e con el consiguien e acúmulo de los CTFs de las neu exinas, se p ocedió al es udio de la ac i idad de los e minales sináp icos inducidos sob e las dend i as ans ec adas con HA-Nlg1 (sinapsis mediadas po HA-Nlg1) y ue a de las dend i as ans ec adas (sinapsis con ol) en dos si uaciones expe imen ales: en cul i os con ol (sin in ec a e in ec ados con C e) o en cul i os in ec ados con C e. Pa a ello, se empleó el ensayo expe imen al explicado an e io men e (Figu a 38), con modi icaciones: co-in ección de sypHy con el LV C e o C e. - En un p ime expe imen o se p ocedió al análisis de las espues as de sypHy esul an es de un cul i o PS1/ PS1; PS2+/- que a ojó los siguien es esul ados: Se cuan i icó el F de las sinapsis con ol (si ios de espues a de sypHy que no con ac an con las células ans ec adas con HA-Nlg1) y de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (si ios de espues a de sypHy que con ac an con las células ans ec adas RESULTADOS 129 con HA-Nlg1), en cul i os sin in ec a o in ec ados con C e. En neu onas sin in ec a con C e, el F de sypHy de las sinapsis mediadas po Nlg1 aumen ó 3,1 eces espec o a las sinapsis con ol (Figu a 45D). Sin emba go, la in ección de C e disminuyó un 52% el ∆F de sypHy de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (Figu a 45D). Asimismo, el ∆F de sypHy de las sinapsis con ol en los cul i os in ec ados con C e disminuyó un 37% (Figu a 45D). - En un segundo expe imen o, se analizó la espues a de sypHy ob enida de un cul i o PS1/ PS1; PS2-/- in ec ado con C e o C e: En cul i os de neu onas sin in ec a con C e, el F de sypHy de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 aumen ó 3,8 eces espec o a las sinapsis con ol (Figu a 46D). La in ección de C e disminuyó un 53% el ∆F de sypHy de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (Figu a 46D). Sin emba go, el ∆F de sypHy de las sinapsis con ol no se a ec ó en ninguna de las condiciones. La in ección del mu an e C e no u o ningún e ec o (Figu a 46D). Los esul ados ob enidos demues an que la inac i ación de la exp esión de PS en neu onas de hipocampo educe la libe ación p esináp ica en sinapsis mediadas po el sis ema de neu exinas-neu oliguinas. Es os da os, que con i man los esul ados ob enidos con las dos ap oximaciones an e io es con DAPT y con el mu an e de PS1 D385A, sugie en además que los e minales inducidos po neu exinas equie en de una ac i idad de PS pa a man ene la libe ación esicula . El p ocesamien o po PS de iso o mas de neu exinas, como β-neu exinas, en el e minal p esináp ico pod ía se esencial pa a aspec os cla es de la libe ación esicula , de o ma que en ausencia de unción de PS, el p ocesamien o anómalo de neu exinas pod ía a ec a a la u a sináp ica mediada po neu exinas y a la libe ación del neu o ansmiso . RESULTADOS 130 Figu a 45. Análisis de la luo escencia de sypHy en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2+/- in ec adas con C e. A) Neu onas in ec adas con sypHy o co-in ec adas con C e, se co- ans ec a on con DsRed2 y HA-Nlg1. Se ep esen an los cambios de la luo escencia de sypHy an es, du an e y después de la aplicación de un es imulo de 300 PA a una ecuencia de 20 Hz. B,C) Rep esen ación de la ciné ica de la luo escencia de sypHy en sinapsis con ol (B) o en sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (C). Las cu as es án no malizadas a la si uación expe imen al sin in ec a con C e y p o ienen de un expe imen o ep esen a i o. D) Rep esen ación g á ica de los F de las sinapsis con ol y de las mediadas po HA-Nlg1, en la condición in ec ada o no con C e. F no malizados a las sinapsis con ol de la si uación expe imen al sin in ec a . Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un expe imen o. Cul i os no in ec ados con C e: n=5 neu onas, >220 ROI po condición. Cul i os in ec ados con C e: n=4 neu onas, >160 ROI po condición. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (***) p<0.001. Ba a de escala: 5μm. RESULTADOS 131 Figu a 46. Análisis de la luo escencia de sypHy en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec adas con C e o C e. A) Neu onas in ec adas con sypHy o co-in ec adas con sypHy y C e o el mu an e C e, se co- ans ec a on con DsRed2 y HA-Nlg1. Se ep esen an los cambios de la luo escencia de sypHy an es, du an e y después de la aplicación de 300 PA a una ecuencia de 20 Hz. B,C) Rep esen ación de la ciné ica de la luo escencia de sypHy en sinapsis con ol (B) o en sinapsis mediadas po HA-Nlg1 (C). Las cu as es án no malizadas a la si uación expe imen al sin in ec a con C e y p o ienen de un expe imen o ep esen a i o. D) Rep esen ación g á ica de los F de las sinapsis con ol y de las sinapsis mediadas po HA-Nlg1, en cul i os no in ec ados o in ec ados con C e o C e. F no malizados a las sinapsis con ol de la si uación expe imen al sin in ec a . Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un solo expe imen o. Cul i os no in ec ados: n=5 neu onas, >215 ROI po condición. Cul i os in ec ados con el mu an e C e: n=4 neu onas, >130 ROI po condición. Cul i os in ec ados con C e: n=6 neu onas, >220 ROI po condición. La signi icación es adís ica se e aluó RESULTADOS 132 median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Bon e oni, (***) p<0.001. Ba a de escala: 5μm. Pa a es udia posibles al e aciones en el eclu amien o de esículas sináp icas y en los ni eles de HA-Nlg1 al inhibi la exp esión de PS, se analiza on los ni eles de sypHy y de HA-Nlg1. Pa a ello, as los expe imen os de es imulación, los cul i os se ija on y se cuan i ica on los ni eles de sypHy po luo escencia di ec a y los de HA- Nlg1 con un an icue po con a HA. El análisis de las imágenes de con ocal mos ó lo siguien e: Cul i os PS1/ PS1; PS2+/-: Los ni eles de in ensidad de HA-Nlg1 esul a on simila es en e las neu onas sin in ec a o in ec adas con C e (117,89±4,43, in ensidad de HA- Nlg1 en cul i os con ol s 110,74±8,06, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 47A y Figu a 47B). La cuan i icación del á ea e in ensidad de sypHy en las dend i as que exp esan HA-Nlg1 no p esen ó di e encias signi ica i as en e la condición sin in ec a e in ec ada con C e (0,66±0,01 y 115,72±1,99, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os con ol s 0,68±0,05 y 113,94±5,06, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 47A y Figu a 47C). Cul i os PS1/ PS1; PS2-/-: Los ni eles de in ensidad de HA-Nlg1 esul a on homogéneos en e las neu onas sin in ec a e in ec adas con C e o C e (126,60±2,07, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os con ol; 112,67±4,13, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os in ec ados con C e y 122,59±2,55, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 48A y Figu a 48B). La cuan i icación del á ea e in ensidad de sypHy en las dend i as que exp esan HA-Nlg1, no p esen ó di e encias signi ica i as en e la condición sin in ec a e in ec ada con C e o C e (0,43±0,03 y 143,15±2,34, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os con ol; 0,57±0,07 y 141,42±5,66, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os in ec ados con C e y 0,67±0,03 y 145,12±0,89, á ea ela i a e in ensidad de sypHy en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 48A y Figu a 48C). Los esul ados ep oducen los da os ob enidos con las dos ap oximaciones an e io es y mues an que la inac i ación de PS no a ec a a la densidad de esículas sináp icas en e minales mediados po HA-Nlg1 y que, po an o, la disminución del F se pod ía debe a una meno libe ación de los e minales en espues a al es ímulo. RESULTADOS 133  Figu a 47. Cuan i icación de la luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2+/- in ec adas con C e. A) Neu onas in ec adas con sypHy o co-in ec adas con sypHy y C e, se co- ans ec a on con DsRed2 y HA-Nlg1. T as la ijación, las neu onas se p ocesa on pa a inmuno luo escencia con a la e ique a HA pa a iden i ica a las células ans ec adas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se de ec a on po luo escencia di ec a. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . B) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los pixeles de HA-Nlg1. C) Cuan i icación de pixeles o ales de sypHy no malizados a la supe icie dend í ica (g á ica izquie da) y de la in ensidad p omedio de los pixeles de sypHy en las dend i as ans ec adas (g á ica de echa). Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un expe imen o independien e: n=10 células po condición. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden . Ba a de escala: 5μm.  RESULTADOS 134 Figu a 48. Cuan i icación de la luo escencia de HA-Nlg1 y de sypHy en neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec adas con C e o C e. A) Neu onas in ec adas con sypHy solo o en combinación con C e o C e, se co- ans ec a on con DsRed2 y HA-Nlg1. T as la ijación, las neu onas se p ocesa on po inmuno luo escencia con el an icue po an i-HA pa a de ec a las células ans ec adas con HA-Nlg1 (azul en la colocalización). SypHy y DsRed2 se de ec a on po luo escencia di ec a. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . B) Cuan i icación de la in ensidad p omedia de los pixeles dend í icos de HA-Nlg1. C) Cuan i icación de los pixeles o ales de sypHy no malizados a la supe icie dend í ica (g á ica izquie da), y de la in ensidad p omedio de los pixeles de sypHy en las dend i as ans ec adas. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un único expe imen o (n=7 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Bon e oni. Ba a de escala: 5μm.  A con inuación se es udió el eclu amien o de esículas sináp icas empleando un ma cado sináp ico endógeno, Vamp2. Es e análisis solo se ealizó en neu onas PS1/ PS1; PS2-/- in ec adas con C e o in ec adas con C e. La cuan i icación no RESULTADOS 135 mos ó di e encias signi ica i as en la in ensidad de Vamp2 en e neu onas in ec adas con C e y las in ec adas con C e (122,22±5,92, in ensidad de Vamp2 en cul i os con ol s 109,87±2,72, in ensidad de Vamp2 en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 49A y Figu a 49C). Sin emba go se obse a on di e encias signi ica i as en el á ea de Vamp2 en e ambas condiciones expe imen ales (0,64±0,04, á ea ela i a en cul i os con ol s 0,48±0,04, á ea ela i a en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 49A y Figu a 49C). Los ni eles de HA-Nlg1 esul a on simila es en ambas condiciones (141,90±7,14, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os con ol s 121,26±8,86, in ensidad de HA-Nlg1 en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 49A y Figu a 49B). Es os esul ados empleando dos ma cado es de esículas sináp icas, sypHy y Vamp2, indican que el eclu amien o de esículas sináp icas en las sinapsis mediadas po HA-Nlg1 no se encuen a a ec ado cuando se inhibe la exp esión de PS, desca ando la posibilidad que una disminución en el núme o de esículas sináp icas sea la p incipal causa de la meno espues a de sypHy.   Figu a 49. Cuan i icación de la luo escencia de Vamp2 en cul i os de neu onas de hipocampo PS1/ PS1; PS2-/- in ec ados con C e o C e. A) Cul i os de neu onas in ec adas con LV que exp esa RESULTADOS 136 C e o C e se ans ec a on con HA-Nlg1. La localización de Ha-Nlg1 y Vamp2 se es udió po inmuno luo escencia. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . B) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los pixeles de HA-Nlg1. C) Cuan i icación de los pixeles o ales de Vamp2 no malizados a la supe icie dend í ica (g á ica izquie da), y de la in ensidad p omedio de los pixeles de Vamp2 en el á ea de las dend i as ans ec adas (g á ica de echa). Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un expe imen o independien e (n=10 células po condición. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (**) p<0.05. Ba a de escala: 5μm.  4.4 IMPLICACIONES DE LA FUNCIÓN DE PS EN LA DISTRIBUCIÓN DE LIGANDOS DE NEUREXINAS. Los esul ados an e io es mos a on un papel de PS en la egulación de la libe ación de los e minales p esináp icos mediados po neu exinas. Es os da os sugi ie on la posibilidad de que la unción p esináp ica de dichos e minales es u ie a egulada po la ac i idad de PS hacia sus sus a os p esináp icos. De es a o ma, una al a de unción de PS induci ía el p ocesamien o anómalo de sus sus a os que pod ía con ibui a los de ec os sináp icos obse ados en las neu onas de icien es en PS. Una ez demos ado que las neu exinas son sus a os p esináp icos de PS, nos plan eamos la posibilidad de que la in e acción de neu exinas hacia sus ligandos sináp icos dependie a de la unción de PS. Los esul ados ob enidos se desc iben en es e bloque. 4.4.1 Análisis de la asociación de β-neu exinas con PS median e ensayos de co-inmunop ecipi ación en células Hek 293T T as iden i ica que las neu exinas se p ocesan po PS in i o e in i o, se analizó la exis encia de un posible complejo o mado po PS y β-neu exina. Pa a ello, se ans ec a on células Hek 293T con las siguien es cons ucciones de HA-βN x1: HA- βN x1 WT, HA-βN x1 C, HA-βN x1 LNG, HA-βN x1 GPI. Es as cons ucciones con ienen deleciones en el dominio ci oplásmico (HA-βN x1 C), en la egión LNG del dominio ex acelula (HA-βN x1 LNG) y en la egiones ansmemb ana y ci oplásmica pe o conse ando el dominio ex acelula (HA-βN x1 GPI) (Figu a 50A). Como con ol se ans ec ó PS1 WT. Pos e io men e, las células se lisa on y una décima pa e del lisado se p ocesó po Wes e n blo con los an icue pos an i-HA y an i PS. El an icue po an i-HA mos ó la exp esión de las di e en es cons ucciones de neu exinas con sus amaños espe ados, mien as que el an icue po an i-PS1 e eló el NTF de PS1 en odos los lisados jun o con una banda adicional de 50 kDa co espondien e a la RESULTADOS 137 holop o eína en los lisados ans ec ados con PS1 WT (Figu a 50B). El es o del lisado se some ió a inmunop ecipi ación con el an icue po de PS1 y los inmunop ecipi ados se analiza on median e Wes e n blo con los an icue pos an i-HA y an i PS1. El an icue po con a PS1 e i icó la inmunop ecipi ación de PS1 de los lisados celula es (Figu a 50B). La p esencia adicional de la banda co espondien e a la holop o eína de PS1 en los inmunop ecipi ados ans ec ados con PS1, con i ma on la especi icidad del an icue po (Figu a 50B). El an icue po an i-HA de ec ó la p esencia de HA-βN x1 WT y de cada una de las mu aciones ensayadas en los inmunop ecipi ados. Es os esul ados sugi ie on que HA-βN x1 o ma un complejo con PS1. Po o a pa e, nues os da os indica on que la ausencia del dominio LNG ex acelula , de la egión ansmemb ana o del dominio ci oplásmico no inhibe la o mación del complejo. El hecho de que la zona yux amemb ana del dominio ex acelula no es u ie a delecionada en ninguna de las cons ucciones ensayadas, apun a a un posible papel de es a egión en la o mación de complejos con PS1.  Figu a 50. PS o ma un complejo con β-neu exina1 en células Hek 293T. A) Esquema ep esen a i o de las dis in as cons ucciones de deleción de HA-βN x1. B) Las células Hek 293T se ans ec a on con las di e en es cons ucciones de HA-βN x1 o con PS1 WT. Los lisados celula es y los inmunop ecipi ados an i-PS1 se analiza on po Wes e n blo usando el an icue po an i-HA y el an icue po an i-PS1, como se indica. RESULTADOS 144 glu ama é gicos inducidos po el sis ema neu exinas-neu oliguinas de neu onas de icien es en PS1.  Figu a 54. Reclu amien o de CASK en sinapsis mediadas po HA-Nlg1 en neu onas de icien es en PS1. A) Neu onas de hipocampo se in ec a on o no a los 3 días in i o con ec o es len i i ales que exp esan GFP, PS1 o el mu an e PS1 D385A. T as 9 días de in ección, los cul i os se ans ec a on con HA-Nlg1 y se p ocesa on po inmuno luo escencia con el an icue po con a CASK (azul en la colocalización) y con a la e ique a HA ( ojo en la colocalización). Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . B) Cuan i icación del eclu amien o de CASK en dend i as que exp esan HA-Nlg1. C) Cuan i icación de la in ensidad p omedio de los píxeles posi i os pa a CASK en las dend i as ans ec adas. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , p omedios de es expe imen os independien es (n>24 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Bon e oni, (***) p<0.001. Ba a de escala: 5μm. Pos e io men e, y pa a comp oba los esul ados an e io es, se analiza on los ni eles de CASK eclu ados a las sinapsis mediadas po el sis ema de neu exinas- neu oliguinas en cul i os KO de PS. La ac i ación de neu exinas se consiguió median e la ans ección de neu oliguinas en cul i os de neu onas de hipocampo gene ados a pa i de emb iones de a ón PS1/ PS1; PS2-/- in ec ados con LV C e o RESULTADOS 145 C e. Además, pa a con i ma los esul ados ob enidos en expe imen os p e ios empleando dominan es nega i os de PS (Figu a 32 y Figu a 34), en pa alelo se cuan i ica on los ni eles de neu exinas con el an icue po cy o-neu exina en los cul i os KO de PS. Los da os mos a on el inc emen o espe ado an o en á ea como en in ensidad de luo escencia en neu onas in ec adas con C e espec o a las in ec adas con C e (0,64±0,04 y 178,60±5,20; á ea e in ensidad p omedio de neu exinas en cul i os in ec ados con C e s 0,43±0,04 y 161,71±3,73, á ea e in ensidad p omedio de neu exinas en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 55A y Figu a 55B). Figu a 55. Reclu amien o de CASK y neu exinas en neu onas de hipocampo KO de PS. A) Cul i os de neu onas de hipocampo gene ados a pa i de emb iones PS1/ PS1; PS2-/- in ec ados con LV que exp esan C e o C e se ans ec a on con HA-Nlg1. T as la ans ección, las neu onas se analiza on po inmuno luo escencia con los an icue pos an i-CASK y cy o-neu exina. Se mues an imágenes de con ocal con la p oyección máxima de luo escencia pa a cada ma cado . Cuan i icación de píxeles o ales no malizados a la supe icie dend í ica e in ensidad p omedio de los píxeles posi i os pa a neu exinas (C) o pa a CASK (D). Los da os se p esen an como medias±e o es ánda de un único expe imen o (n=10 RESULTADOS 146 células po condición). La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico de la de S uden , (***) p<0.001; (**), p<0.05. Ba a de escala: 5μm.  De o ma in e esan e, la cuan i icación de CASK mos ó un inc emen o signi ica i o an o en el á ea como en la in ensidad en neu onas in ec adas con C e espec o a las in ec adas con C e (0,53±0,05 y 114,63±3,10, á ea e in ensidad p omedio de CASK en cul i os in ec ados con C e s 0,28±0,03 y 102,21±1,51, á ea ela i a e in ensidad p omedio de CASK en cul i os in ec ados con C e) (Figu a 55A y Figu a 55C). Si bien po disponibilidad de iempo sólo se pudo analiza un único cul i o, los esul ados ob enidos ep oducen los da os obse ados con el empleo del mu an e PS1 D385A y mues an que el bloqueo de la unción de PS aumen a el eclu amien o de CASK en e minales mediados po HA-Nlg1. En conjun o, es os da os sugie en que la asociación de neu exinas con CASK puede es a egulada po PS y que la inhibición de es a u a pod ía con ibui a la educción en la libe ación de esículas obse ada en las sinapsis mediadas po neu exinas en cul i os de ec i os en PS. 4.4.6 Posibilidad de un mecanismo al e na i o de egulación génica El complejo PS/-sec e asa es á in oluc ado en el co e del CTF anclado a la memb ana de más de 60 p o eínas in eg ales de memb ana ipo I, libe ando los ICD en el ci osol (Pa ks y Cu is, 2007; Beel y Sande s, 2008; Lleo, 2008). En algunos casos, como con APP y No ch, el ICD se asloca al núcleo y egula la ansc ipción de genes dianas (Koo y Kopan, 2004). En el caso de las neu exinas, la ac i idad p o eolí ica de PS debe ía libe a el dominio in acelula de las neu exinas, que se debe ía de ec a con el an icue po cy o-neu exina como una banda de meno amaño molecula (ap oximadamen e 6-7 KDa) y la consiguien e desapa ición del sus a o de 12-16 KDa (CTF). En ninguno de los ensayos bioquímicos ealizados en es a Tesis, se de ec ó la p esencia del ICD de las neu exinas, debido p obablemen e a una ápida deg adación de és e po el p o eosoma, como ocu e con o os sus a os de PS (Res i ui o e al., 2011). Po an o, pa a es udia la dis ibución del ICD de las neu exinas, se gene ó po PCR el dominio in acelula soluble de β-neu exina-1 (N x1-ICD). Pos e io men e se ans ec a on células Hek 293T con N x1-ICD o con HA-βN x1 en p esencia y ausencia de DAPT y as 24 ho as de exp esión se analiza on los ex ac os celula es median e Wes e n blo , usando el an icue po cy o-neu exina. Dicho an icue po de ec ó el ICD RESULTADOS 147 como una banda de ~ 7 KDa, con una mayo mo ilidad elec o o é ica que los CTFs de las neu exinas (Figu a 56A). El DAPT inc emen ó los ni eles de los CTFs de β- neu exina. Sin emba go, no a ec ó los ni eles del ICD, ya que és e no p o iene del p ocesamien o p o eolí ico del CTF, sino de la p opia sob eexp esión (Figu a 56A).  Figu a 56. Exp esión y localización del ICD de neu exinas. A) Las células Hek 293T se ans ec a on con ec o acío (con ol), HA-βN x1 o N x1-ICD y se incuba on en p esencia o ausencia DAPT, como se indica. La exp esión de los CTFs y de N x1-ICD se analizó po Wes e n blo usando el an icue po cy o- neu exina. El panel in e io mues a los esul ados ob enidos con un iempo de exposición mayo . B) Las células Hek 293T se co- ans ec a on con GFP y HA-βN x1 o N x1-ICD y se analiza on po inmuno luo escencia con el an icue po cy o-neu exina ( ojo en la colocalización). GFP se de ec ó po RESULTADOS 148 luo escencia di ec a ( e de en la colocalización). Los núcleos se iñe on con DAPI (azul en la colocalización). En el panel in e io se mues a una p oyección xz mos ando la localización nuclea de N x1-ICD compa ada con la localización en la memb ana del HA-βN x1. Ba a de escala: 5μm. Es os esul ados sugi ie on que el an icue po cy o-neu exina pod ía de ec a el ICD de las neu exinas an e un acúmulo. Pa a es udia la posible localización nuclea del ICD de β-neu exina, se co- ans ec a on células Hek 293T con GFP y HA-βN x1 o βN x-ICD. T as 24 ho as de exp esión las células se ija on con me anol y se p ocesa on po inmuno luo escencia con el an icue po cy o-neu exina. Los núcleos se iñe on con DAPI. En células ans ec adas con βN x1-ICD, el an icue po cy o- neu exina mos ó una inción concen ada en el núcleo y ex endida en el ci oplasma. Dicha localización nuclea se e i icó en p oyecciones xy y xz de imágenes de mic oscopía con ocal (Figu a 56B). Po lo an o, la localización nuclea del ICD de neu exinas sugie e un papel po encial no explo ado en egulación génica. 4.5 IMPLICACIONES DEL PROCESAMIENTO DE NEUREXINAS EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 4.5.1 E ec o di e encial de las mu aciones de PS1 asociadas con FAD en el p ocesamien o de β-neu exina-1 Mu aciones au osómicas dominan es en los genes de PS1 y PS2 son la p incipal causa de la mayo ía de las o mas amilia es de la en e medad de Alzheime (FAD). Una ca ac e ís ica de es a en e medad es la acumulación de placas de β-amiloide (Aβ) p oceden es del p ocesamien o p o eolí ico del APP po el complejo PS/-sec e asa. Mu aciones en PS1 asociadas con FAD al e an el p ocesamien o de APP, lle ando a un inc emen o de la elación Aβ42/ Aβ40, que da luga a una mayo o mación de oligóme os y o mas ib ila es (Chen y Glabe, 2006; Wol e, 2007). T as demos a el p ocesamien o de las neu exinas po PS/-sec e asa, nos p egun amos si mu aciones en PS1 asociadas con FAD pod ían a ec a al p ocesamien o de neu exinas. Pa a analiza el e ec o de mu aciones en PS1 asociadas con FAD en el p ocesamien o de β-neu exina-1, se op ó po un abo daje expe imen al ealizado po el D . Ca los A. Sau a. Pa a ello, células MEF WT y KO de PS se ans ec a on con ec o acío o se co- ans ec a on con HA-βN x1 solo o en combinación con PS1 WT o las siguien es mu aciones asociadas a FAD: PS1 M146L, PS1 H163R, PS1 C410Y, E9. El análisis de los lisados celula es median e Wes e n blo con el an icue po cy o- neu exina mos ó el inc emen o espe ado de los CTFs de β-neu exina-1 en células RESULTADOS 149 MEF KO de PS que no se obse ó en las células MEF WT (Figu a 57A y Figu a 57B). La co-exp esión de PS1 WT esca ó el p ocesamien o p o eolí ico de las neu exinas, ya que los ni eles de los CTFs se eduje on a los ni eles de ec ados en las células MEF WT (Figu a 57A). Es os esul ados con i ma on que la ac i idad PS/-sec e asa se equie e pa a un co ec o p ocesamien o de neu exinas. Los mu an es de PS1 asociados con FAD, M146L y H163R, ambién esca a on el p ocesamien o no mal de HA-βN x1 (Figu a 57A). Po el con a io, la co-exp esión de los mu an es de PS1 asociados con FAD, E9 y C410Y, no lle ó a una educción signi ica i a de los ni eles de los CTFs (Figu a 57A). Como con ol posi i o se midie on los ni eles del CTF de N- cadhe ina, un sus a o conocido de PS. La exp esión de PS1 WT y los mu an es de PS1 M146L y H163R disminuye on la acumulación endógena del CTF de N-cadhe ina en MEF KO de PS, mien as que la exp esión de PS1 C410Y y PS1 E9 no al e a on los ni eles del CTF de N-cadhe ina (Figu a 57A). Pa a in es iga si los e ec os obse ados con los mu an es asociados a FAD se debían a de ec os en la uncionalidad del complejo -sec e asa gene ado o a la al a de inco po ación de los mu an es en dicho complejo, se analiza on los ni eles de nicas ina como medida indi ec a de la o mación del complejo. Expe imen os de Wes e n blo mos a on dos bandas de nicas ina: una banda de mayo peso molecula co espondien e a la o ma madu a glicosilada de la p o eína, mayo i a ia en las células MEF WT; y una banda de meno peso molecula co espondien e a la p o eína inmadu a, mayo i a ia en las células MEF KO de PS. Es os da os concue dan con el eque imien o de la o mación de un complejo ac i o de -sec e asa pa a la madu ación de nicas ina (Edbaue e al., 2002; Leem e al., 2002a; Yang e al., 2002). La exp esión de PS1 WT y de los mu an es asociados con FAD aumen ó los ni eles de la o ma madu a de nicas ina en odos los casos, indica i o de la inco po ación al complejo -sec e asa. Es de no a que la madu ación de nicas ina ue meno con los mu an es PS1 C410Y y PS1 E9 (Figu a 57A). Po o o lado, el análisis de la exp esión de PS1 e eló que los mu an es PS1 C410Y y PS1 E9 ca ecen de ac i idad endop o eolí ica debido a la ausencia del agmen o CTF gene ado po p o eolisis de PS1 (Figu a 57A). Es os esul ados indica on que algunas mu aciones de PS1 asociadas a FAD causan una pé dida de unción en el p ocesamien o de neu exinas en células MEF KO de PS y sugi ie on que dicho p ocesamien o ano mal de las neu exinas pod ía es a asociado con la AD. RESULTADOS 150  Figu a 57. El p ocesamien o de β-neu exina-1 es á a ec ado po los mu an es de PS1 asociados con FAD. A) Células MEF WT y MEF KO de PS se ans ec a on con ec o acío o co- ans ec a on con HA-βN x1 y las siguien es cons ucciones: ec o acío, PS1 WT y los mu an es de PS1 asociados a FAD, M146L, H163R, C410 o DE9. Los lisados celula es se analiza on median e Wes e n blo usando los an icue pos cy o-neu exina (N x), N-Cadhe ina (N-Cadh), PS1 y Nicas ina (NCT). La exp esión de PS1 ue con i mada po Wes e n blo con dos an icue pos di e en es, el an icue po an i-PS1 N- e minal que econoce PS1 humana (PS1) y el an icue po ab2 que econoce PS1 de a ón (mPS1). La o ma comple a de PS1 en o no a 50 KDa se endop o eoliza gene ando un CTF en o no a 18-20 KDa. Se usó como con ol de ca ga β-ac ina. B) Análisis cuan i a i os de los ni eles ela i os de los CTFs de neu exinas no malizados con espec o a la media de exp esión ob enida pa a la o ma madu a de N x. Los da os se p esen an como medias±e o es ánda , p omedios de es expe imen os independien es. La signi icación es adís ica se e aluó median e el es es adís ico ANOVA seguido del es de compa ación múl iple Tukey, (***) p<0.001. RESULTADOS 151 4.5.2 Acumulación de los CTFs de las neu exinas en a ones ansgénicos que exp esan mu aciones de PS1 asociadas con FAD La en e medad de Alzheime amilia cons i uye solo el 5% del o al de casos de Alzheime (Rocchi e al., 2003), pe o la iden i icación de sus bases molecula es ha sido ex emadamen e impo an e pa a el hallazgo de mu aciones en los genes APP, PS1 y PS2, esponsables de las o mas he edi a ias de es a en e medad (P ice y Sisodia, 1998). Es os descub imien os han lle ado al desa ollo en los úl imos años de di e en es modelos animales ansgénicos que, aunque no ep oducen la o alidad de las ca ac e ís icas de la AD, sí p opo cionan una aliosa in o mación sob e su pa ogénesis. En los expe imen os an e io es mos amos que mu aciones en PS1 asociadas con FAD a ec an di e encialmen e al p ocesamien o de neu exinas in i o. Pa a con i ma es os da os in i o se es udió el p ocesamien o de las neu exinas en dos modelos de a ones dobles ansgénicos de PS1xAPP que sob eexp esan ambas p o eínas humanas con mu aciones asociadas a FAD. Es os a ones son conside ados buenos modelos de la AD (Schmi z e al., 2004). El D . Ja ie Vi o ica, de la Uni e sidad de Se illa, nos p opo cionó ex ac os de hipocampo p oceden es de a ones PS1 M146LxAPP, que exp esan el mu an e de PS1 M146L y la o ma mu ada de APP751-SL, y de a ones PS1 E9xAPP, que sob eexp esan el mu an e de PS1 E9 y la o ma mu ada de APP695-S. Es os a ones a pa i de 3-4 meses p esen an placas de pép ido β-amiloide que an aumen ando con o me lo hace la edad del animal (Blancha d e al., 2003). Los ni eles de neu exinas y del pép ido Aβ en lisados de a ones ansgénicos de 4 y 18 meses se analiza on po Wes e n blo con los an icue pos cy o-neu exina y 6E10, espec i amen e, y se compa a on con lisados ob enidos de a ones con ol. El an icue po 6E10 mos ó un acúmulo de la banda de 4,5 kDa que coincide con el peso molecula de Aβ en su o ma monomé ica en los lisados de los a ones ansgénicos de 4 meses, que no ue ap eciable en el lisado del a ón PS1 E9xAPP (Figu a 58A). En los lisados de a ones ansgénicos de 18 meses se obse ó que el acúmulo del monóme o de β ue supe io en el lisado del a ón PS1 M146LxAPP que en el lisado del a ón PS1 E9xAPP (Figu a 58B). Es os esul ados son los espe ados según los da os ob enidos po el g upo de in es igación del D . Ja ie Vi o ica. El an icue po cy o-neu exina de ec ó un aumen o signi ica i o de los CTFs de las neu exinas en los lisados de los a ones dobles ansgénicos de 4 y 18 meses, espec o al con ol. La compa ación en e ambos mu an es mos ó una mayo acumulación de los CTFs de las neu exinas en el mu an e de PS1 E9xAPP, sugi iendo un mayo e ec o del RESULTADOS 152 mu an e PS1E9 en el p ocesamien o de las neu exinas (Figu a 58A y Figu a 58B). En pa alelo, la inhibición del p ocesamien o de los CTFs de neu exinas en el mu an e PS1E9 es u o asociada a una educción de los ni eles de la p o eína madu a. Es os esul ados indican que el p ocesamien o de neu exinas es á a ec ado in i o en modelos animales que ep oducen mu aciones asociadas con FAD. Asimismo, nues os da os sugie en que un p ocesamien o de ec uoso de neu exinas puede es a asociado con la en e medad de Alzheime en humanos.  Figu a 58. El p ocesamien o de las neu exinas es á a ec ado en a ones ansgénicos que exp esan mu an es de PS1 asociados con FAD. Ex ac os de hipocampo de animales con oles y de dobles ansgénicos, PS1 M146LxAPP y PS1 E9xAPP, que exp esan mu aciones de PS1 y de APP asociadas con FAD, a dos edades del desa ollo, 4 meses (A) y 18 meses (B), se analiza on po Wes e n blo con el an icue po cy o-neu exina (N x) y con el 6E10 (Aβ). Los a ones que exp esan mu aciones en PS1 y en APP allan el p ocesamien o de las neu exinas.  5 DISCUSIÓN   