Estudio de las diferencias infraespecíficas en Trifolium Subterraneum L. mediante electroforesis de proteinas

ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECIFICAS EN TRIFOL1UM SUBTERKANEUM L. MEDIANTE ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS por PASTOR PIXK1KO «ANALES DE = gOWQtOClAj •AGUDtlOLOGlV PUBLICADO EN ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA TOMO XXXI, NÚMS. 9-10.—MADRID, 1972 ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECIFICAS EN TRIFOLIUM SUBTERRANEUM L. MEDIANTE ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS por J. PASTOR PJSEIRO S U M M A R Y STUDV OF INFRAESPECIFIC DIFFERENCES IX TRIFOLIUM SCfíTF.RRANEUM L. BY PROTEIN ELECTROPHORESIS Proicins of seeds froni eight australian cuitivars of Trifohum subterraueutn T,. haw been separated ussing acrylamide gel electrophoresis techniquc. Cuitivars belong ;o the three existing suhespecies according to Katznelson and Morley (1965). The number of bands dctected by this procedure \vas high. as the diagrum shows, and all the cuitivars coulcl be differenced by their baños. Results were reproducible, even in cultivara in which seeds oí different origin and/or year were used. The contrast was rcmarkable between the constancy of the pattern within every cultivar and the variabiüty of patterns among cuitivars. Coefficients of similarity of protein baños among different cuitivars have been stablished. The results obtained are discussed in relation to the oncs obtained by morphological and genetic studies by other authors. The interest of the method for the quick identification of cuitivars is pointed out. El problema de la subespeciación y variación de Trifoliiini subtc^rancum L. ha sido estudiado por varios autores. Katznelson y Morley (12, 13), en su estudio taxonómico de las categorías infraespecíficas de T. subterranctnn T.., intentan asociar barreras reproductoras con característicns morfológicas. Los resultados obtenidos les han llevado a concluir que Trifolium svbterronewn L. está constituido por tres subespecies simpátncas, ssf>. subtcrmneum. ssp. yamtinicum y ssp. brarhycalychium. que son, en un !)."">-100 por 100, interestériles. Atribuyen la esterilidad de los híbridos a cambios cromosómicos, traslocaciones e inversiones, asociados con las diferencias de tipo subespecífico o varietal. Dada la gran dificultad que ofrece la separación de las distintas poblaciones del trébol subterráneo por sus caracteres morfológicos, pensamos 792 ANALES DE EDAFOLOGÍA V AGROBIOLOGÍA en la conveniencia de utilizar métodos quimiosistemáticos para estudiar las diferencias infraespecificas en esta especie. La electroforesis de proteínas se encuentra entre las técnicas que han experimentado un mayor incremento en los últimos años en los estudios taxonómicos. La mayoría de los trabajos se efectúan en semillas por razones prácticas muy importantes, como son la estabilización de sustancias y la ventaja de no tener que realizar estudios a lo largo del ciclo de desarrollo. Fox, Thurman y Bouiter (9) obtuvieron las bandas de proteína en semillas de 1.7 especies de leguminosas y señalaron la utilidad potencial de la técnica. Bouiter y col. (4, 5), al examinar por separado las fracciones de albúmina y globulina en semillas de leguminosas, observaron que las globulinas tienen un valor taxonómico a nivel de tribu y género. En el caso concreto de la tribu Trifolioleas el electroforegrama de globulinas se caracterizaba por la presencia de dos bandas fuertemente teñidas en la parte superior del gel. A nivel de género. Kleczowska (14) encontró que las proteínas de trébol podían separarse mediante electroforesis en 18 fracciones. Adriaanse y Robbers (2) estudiaron las fracciones de albúmina y globulina en cultivares de Vicia faba L., Piswn satnmm L. \ vulgaris L. Las fracciones de albúmina eran características en las especies estudiadas, y de las tres fracciones de globulina obtenidas una de ellas diferenciaba mejor los cultivares. Bingham y Yeh (3) hallaron, en 30 variedades de alfalfa y 26 diploides y tetraploides de Medicado sath'a L. y Medicago fal cata L., que las proteínas va riciales de las semillas eran cualitativamente similares en 12 ó 13 bandas en todos los casos estudiados. Esta semejanza estaba de acuerdo con los resultados obtenidos en estudios genéticos y citogenéticos. La mayoría de las variedades diferían más en los electroforegramas de las proteínas que en sus caracteres morfológicos. La variación detectada en las proteínas era suficiente para justificar el empleo del método en la identificación de variedades. Vaughan y col. (21, 22) estudiaron las fracciones de albúmina y globulina de semillas de varias especies pertenecientes a los géneros Brassica y Sinapis, tanto por métodos serológicos como de electroforesis sobre geles. y correlacionaron los resultados obtenidos con lo? de la clasificación ya establecida. Crouden y col. (f>) examinaron 174 muestras de semillas de Umbelíferas pertenecientes a 99 especies y 39 géneros La investigación reveló diferencias entre las especies examinadas, algunas de indudable significado taxonómico. Silano y col. (19) estudiaron las fracciones de albúmina y globulina de diversas variedades de Tritícum a estiva ni L. y Triticii-mdurum Desf., no encontrando diferencias varietales muy marcadas, si bien las bandas de albúmina de movimiento rápido presentaban diferencias mayores. ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS WFRAESPEC1FICAS EN «TRIFOLIUM SUBTEKRANEUM» L. 793 En la separación electroforética de proteínas en otras partes de la planta señalamos los trabajos de Lee y Fairbrothers (16), efectuados en polen y semillas procedentes de cuatro taxa de Typlia, utilizando métodos serológicos y electroforéticos. Los resultados obtenidos por ambos métodos eran complementarios y semejantes en el polen y las semillas. Zwartz (24) estudió diferencias varietales en la patata mediante la electroforesis de proteínas del tubérculo. Me Co\vn y col. (17) investigaron las proteínas del tallo y hojas de tres clones de Diantlms. Hilty y Schmitthenner (10) compararon proteínas de la hoja de dos variedades de soja Harosoy y llarosoy (5:5, sin apreciar diferencias en la composición de proteínas de ambas variedades. Nuestro propósito en este trabajo fue: Identificar cultivares de Trifolium siibtcrrancum L. utilizando la electroforcsis de proteínas de semillas en geles de poliacrilamida. Estudiar la similitud existente entre los proteinogramas de dichos cultivares. Comparar, a nivel subespecífico. los datos obtenidos por el método quimiotaxonómico con la clasificación establecida por Katznelson y Morley. MATERIAL Y MÉTODOS Se estudiaron ocho cultivares australianos pertenecientes a las tres subespecies de Trifolium sitbterraneum L.. ssp. siibterrnneum (Tallarook, Monnt Barker, Geraldton, Woogenellup. Bacchus Marsh y Dwalganup). Trifolium subterrancum L. ssp. bracliycalvchiuin. Katzn. et Morley (Clare). Trifnliuní suMcrroncum L. ssp. yaninnicinn. Katzn. et Morley (Yarloop). Extracción de proteínas Las proteínas se extrajeron de las semillas de los ocho cultivares. Las semillas fueron proporcionadas por el CSIRO y por el Instituto Nacional de Selección de Semillas y Plantas de Vivero. La cantidad de harina utilizada fue de 1 gr. por cada 20 mi. de solución extractora (tampón tris-glicina). por ser esta razón la más idónea para lograr la resolución del mayor número de bandas. El procedimiento seguido fue el utilizado por Boulter y col. (4-). Preparación de los gelcs v electraitircsis El método empleado fue el de Ornstein y Davis (18, Ti. simplificado por Tombs y Akroyd (20) según lo señalado por Hjertén y col. (11), 794 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA quienes usaron en lugar de gel separador una solución de sacarosa al 40 por 100. Se colocaron 100 [il de extracto de proteína en el extremo de cada gel. Como indicador se usó azul de bromofenol. Fox y col. (9) y Vaughan y col. (21), entre otros, efectuaron por separado la electroforesis de albúminas y globulinas, en tanto que Fairbrothers (8) no separó las dos fracciones antes de efectuar la electroforesis. obteniendo datos satisfactorios. Nosotros hemos seguido el criterio de este último autor. Tinción y desteñido Los geles se tiñeron con una solución de negro de almidón en metanol/agua/acético (5 :5 :1). A continuación se pasaron durante unas horas a la misma mezcla pero sin colorante. El colorante empleado da resultados análogos a los obtenidos mediante el uso de colorantes enzimaticos (6). Examinamos los electroforegramas sobre una superficie luminosa y las bandas de proteína se fotografiaron y representaron mediante esquemas. Las fotografías y los densitogramas no recogen todas las bandas detectadas a simple vista, hecho ya señalado por varios autores (9, 20) La posición de una banda de proteína después de efectuada la electroforesis se expresa por un valor Rp o posición relativa de la banda comparada con el frente de azul de bromofenol. El criterio usado para estudiar las bandas de proteína, de acuerdo con Whitney y col. (23), ha sido considerarlas similares cuando se solapan en más de 50 por 100. Para comparar dos taxa se calculó un índice de similitud de la siguiente forma: n.° de pares de bandas similares n.° de bandas diferentes + n.° de pares de bancias similares RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en la separación de las bandas de proteína de los taxa investigados se muestran en la fig. 1. Cada representación de ésta se obtuvo a partir de 7 a 9 repeticiones. La diferente intensidad de tinción que presentan las bandas se expresa de la manera convencional que se indica en la figura. Esta diferencia de intensidad puede tener significado taxonómico, pero en el presente trabajo no la hemos tenido en cuenta. En el diagrama destaca el gran número de bandas que pueden apreciarse con el extracto utilizado. Las oscilaciones entre los valores, una vez transformados en valores de Rp, =on pequeñas dentro de cada cultivar y serie de experimentos, por lo que no se consideró necesario incluir los valores del error standard. LSTUDIO DK LAS DIFERENCIAS INFRAESl'ECÍFICAS EN aTRIFOLIUM SUBTERRANEUM» L. 705 o - 10'- 2030405060708090100C. D. M.B. B.M. T. G. W. Y Fig. 1.—Diagrama de las bandas de proteínn de semillas de 8 cultivares australianos de Trifolium subterraneum L. (C. - Clare ; D. - Dwalganup ; M. B. - Mount Barkt-r ; b'. M. - Bacchus Marsh; T. - Tallarook ; G. - Geraláton ; W. - Woogenellup ; Y. - Yarloop). Las intensidades de tinción se expresaron, en orden creciente, de la siguiente forma: intensidad 1: líneas discontinuas ; intensidad 2: lineas de trazo fino ; intensidad 3: líneas de trazo grueso ; intensidad 4: líneas cruzadas ; intensidad 5: bandas negras. En el estudio comparativo de las bandas, Boulter y col. (4) señalaron que es necesario tener presente lo siguiente: n) e! extracto inicial puede contener un gran número de proteínas diferentes, por lo que una banda puede estar formada por más de una proteína ; b~] es imposible asegurar que las bandas situadas en la misma posición en ¿relés obtenidos de diferentes taxa sean debidas a proteínas iguales. No obstante, en el caso presente todo el material examinado son taxa infraespecíficos con bastantes rassjos comunes. 79^ \-\\I.KS DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA Todos los cultivares pueden distinguirse claramente por sus bandas de proteína en contraste con lo encontrado por IJinghan y Veh (3) en variedades y poliploides pertenecientes al género Medicado, donde la mayor diferencia cualitativa observada entre todo el material era la presencia o ausencia de una banda; teniendo en cuenta esta banda podían establecerse cuatro grupos, dentro de los cuales fue posible separar la mayoría de las variedades sólo en razón de la diferencia de densidad observada en las otras bandas. Hemos prescindido de las bandas de la zona inicial por no ser fácilmente homologables debido a su extrema delgadez y por sufrir algunas alteraciones. T A I! L A I índices de similitud de las bandas de proteina entre 8 cultivares de "Trifolium subterraneutn' L. (T. - Fallarook : B. _V/. - Bacchus Marsh ; G. - Geraldton ; M. B. - Mount tiarker \V. - Woogeneüiip: D. - Divalganup, C. - Clare; Y. - Yarloop). Se señalan con negritas los porcentajes iguales o superiores al 2í por 100. T B.M. G. M.B. W. D. C. Y ••••(%% 50 m 38 41 W% 42 36 32 ¡ü 41 32 41 28 • 21 23 28 25 19 Ü 18 19 28 31 13 31 Wfl//' 9 14 15 9 12 9 10 ü T. B.M. G. M.B. W. L/. C. Y I.a tabla 1 muestra los índices de similitud de las bandas de proteína entre todos los cultivares. F.l índice de similitud más elevado e-, el existente entre los cultivares Tallarook y Bacchus Marsh, ."ifl por 100. Los cultivares Tallarook. Bacchus Marsh. Geraldton, Mount Barker y \Yoogenellup están más asociados entre sí que respecto a las otras formas, como lo pone de manifiesto el que los índices de similitud entre ellos oscilan c'e un 2S a un ."O por 100. siendo valores más altos que los que presentan respecto a los otros tres cultivares. Dwalganup. Clare y Yar- ESTfDlO UK LAS DJl-'ERENCIAS DIFEAESPKCÍFICA8 K.N «TRIFOUL'M SUBTERKAKBUMl L. 797 loop. Esto concuerda con la clasificación establecida por Kat/nelson y Morley, que los introducen dentro de la misma subespecie, ssf>. ;,ul>ti>-i\incum, y con los datos de cruzamiento obtenidos por ellos (1-J. Existe una excepción, Alount Barker, que tiene un índice de similitud mayor respecto a Clare, perteneciente a la ssp. brachycalycinutn, que respecto a Woogenellup, aunque la diferencia no es muy grande. Un estudio parecido, realizado por Whitney y col. ('23) en especies pertenecientes a los géneros l'crticilliiim y Fitsar'mm, puso de manifiesto una mayor diferencia interespecífica que ínter genérica, explicando este hecho mediante la hipótesis de que la relación entre la semejanza de proteínas y la semejanza establecida por otros criterios no es lineal. Así, algunas! proteínas reflejan solamente diferencias genéticas menores; otras, en cambio, reflejan diferencias genéticas mayores, y entre ellas puede haber algunas proteínas de apariencia difusa, cuya variación corresponde a grandes diferencias genéticas. El cultivar Dwalganup, que Katznelson y Morley incluyen en la ssp. siibterraiiemn, muestra, con el grupo de cultivares mencionado con anterioridad, índices de similitud notablemente más bajos, pareciendo presentar una posición intermedia entre dicho grupo y Clare, aunque tiene un índice de similitud mayor con este último (31 por 100j. El cultivar Clare, perteneciente a la ssp. brachycal\'dnnm, presenta índices de similitud aún menores en relación al grupo de formas anteriormente citado, excepto el caso ya mencionado con respecto a Alount Barker. Esto también coincide con la clasificación establecida. En el caso del cultivar Yarloop los índices de similitud son bajos respecto a los restantes cultivares, lo que está de acuerdo con lo encontrado por los autores ya nombrados, que lo incluyen en la ssp. yaiininiciim y también con los cruzamientos realizados por ellos. Un hecho que parece oportuno resaltar es la repetibilidad de los resultados dentro de cada cultivar, aun usando semillas de distinta procedencia obtenidas en diferente época, en comparación con la marcada diferencia entre cultivares. Esto concuerda con lo observado por Fox y col. (9) en Cytisns scoparius (L.) Link procedentes de dos localidades. También Adriaanse y col. (1), en un estudio efectuado en 32 cultivares de Pltaseohis vulgarís L.. establecieron que los electroforegramas de proteína no parecían afectados por las condiciones externas, tales como la fertilización con nitrógeno, condiciones climáticas y propiedades del suelo. Larsen (15) estudió 61 variedades de soja, encontrando modelos de banda muy reproductibles y uniformes dentro de cada variedad, que no se veían afectadas por año, localidad o serie de separación electroforética. El gran número de bandas y el hecho de que los índices de similitud entre los cultivares no sobrepasen el valor del 50 por 100 refleja la gran heterogeneidad de la especie ya comentada por diversos autores. Los resultados obtenidos están de acuerdo con las subespecies 798 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA que Katznelson y Morle\n asociando ciertas barreras de esterilidad con determinadas características morfológicas ; sin embargo, estas barreras existen también y además muy difundidas entre numerosas poblaciones que no se pueden separar por los caracteres morfológicos. Un hecho importante en los procesos de subespeciación ha sido la autogamia casi absoluta de todas las formas de trébol subterráneo, lo que facilita la fijación de las alteraciones cromosómicas y los cambios genéticos. Esto causa una divergencia progresiva y da características de mosaico a la estructura de la variación de la especie. Concluyendo, el método utilizado parece muy adecuado para la 'dentificación de cultivares de trébol subterráneo a partir de las semillas. Identificación que es difícil sin este sistema, pues exige en algunos de ellos la observación de la planta en varios estadios de su ciclo y una descripción muy detallada que no puede ser objetiva y además con frecuencia difícil de interpretar. Esta aplicación puede tener interés inmediato, siendo fácil la comparación de los resultados; las posibilidades de confusión entre cultivares son pequeñas, dadas las características muy individuales de cada proteinograma, Agradecimiento El autor agradece al Prof. Dr. F. González Bernáldez, catedrático de Ecología de la Universidad de Sevilla, la ayuda prestada para la realización de este trabajo. R K ? U M K N Las proteínas de las semillas oe ocho cultivares pertenecientes a las tres subespecies de Trifolium subterraneiim L. se separaron mediante electroforesis en ge!es de poliacrilamida. El número de bandas detectadas por este procedimiento era elevado, como refleja el diagrama adjunto. Todos los cultivares pudieron diferenciarse por sus bandas. Los resultados eran reproducibles incluso en cultivares en los que se usaron semillas de distinta procedencia y obtenidas en época diferente. Es notable el contraste entre la constancia del electroforegrama obtenido dentro de cada estirpe con la variabilidad de dicho electroforegrama entre estirpes. Se establecieron los índices ¿e similitud de las bandas de proteína entre los diferentes cultivares. Los resultados obtenidos se discutieron con los proporcionados por estudios morfológicos y genéticos de otros autores. Finalmente se señala el interés del 7iiétodo para la rápida identificación de cultivares. Sección de Kcofisiología l'egctal. Instituto de I-'ilafolagia y Biología Vegetal. Madrid.