Estudio de las diferencias infraespecíficas en Trifolium Subterraneum L. mediante electroforesis de proteinas

ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECI- FICAS EN TRIFOL1UM SUBTERKANEUM L. MEDIANTE ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS po PASTOR PIXK1KO «ANALES DE = gOWQ OClAj •AGUD lOLOGlV PUBLICADO EN ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA TOMO XXXI, NÚMS. 9-10.—MADRID, 1972 ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS INFRAESPECI- FICAS EN TRIFOLIUM SUBTERRANEUM L. MEDIANTE ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS po J. PASTOR PJSEIRO S U M M A R Y STUDV OF INFRAESPECIFIC DIFFERENCES IX TRIFOLIUM SC íTF.RRA- NEUM L. BY PROTEIN ELECTROPHORESIS P oicins o seeds oni eigh aus alian cui i a s o T i ohum sub e aueu n T,. haw been sepa a ed ussing ac ylamide gel elec opho esis echniquc. Cui i a s belong ;o he h ee exis ing suhespecies acco ding o Ka znelson and Mo ley (1965). The numbe o bands dc ec ed by his p ocedu e as high. as he diag um shows, and all he cui i a s coulcl be di e enced by hei baños. Resul s we e ep oducible, e en in cul i a a in which seeds oí di e en o igin and/o yea we e used. The con as was cma kable be ween he cons ancy o he pa e n wi hin e e y cul i a and he a iabiü y o pa e ns among cui i a s. Coe icien s o simila i y o p o ein baños among di e en cui i a s ha e been s ablished. The esul s ob ained a e discussed in ela ion o he oncs ob ained by mo phological and gene ic s udies by o he au ho s. The in e es o he me hod o he quick iden i ica ion o cui i a s is poin ed ou . El p oblema de la subespeciación y a iación de T i oliiini sub c^ a- ncum L. ha sido es udiado po a ios au o es. Ka znelson y Mo ley (12, 13), en su es udio axonómico de las ca ego ías in aespecí icas de T. sub- e anc nn T.., in en an asocia ba e as ep oduc o as con ca ac e ís icns mo ológicas. Los esul ados ob enidos les han lle ado a conclui que T i olium s b e onewn L. es á cons i uido po es subespecies sim- pá ncas, ss >. sub c mneum. ssp. yam inicum y ssp. b a hycalychium. que son, en un !)."">-100 po 100, in e es é iles. A ibuyen la es e ilidad de los híb idos a cambios c omosómicos, aslocaciones e in e siones, asociados con las di e encias de ipo subespecí ico o a ie al. Dada la g an di icul ad que o ece la sepa ación de las dis in as pobla- ciones del ébol sub e áneo po sus ca ac e es mo ológicos, pensamos 792 ANALES DE EDAFOLOGÍA V AGROBIOLOGÍA en la con eniencia de u iliza mé odos quimiosis emá icos pa a es udia las di e encias in aespeci icas en es a especie. La elec o o esis de p o eínas se encuen a en e las écnicas que han expe imen ado un mayo inc emen o en los úl imos años en los es udios axonómicos. La mayo ía de los abajos se e ec úan en semillas po azones p ác icas muy impo an es, como son la es abilización de sus an- cias y la en aja de no ene que ealiza es udios a lo la go del ciclo de desa ollo. Fox, Thu man y Boui e (9) ob u ie on las bandas de p o eína en semillas de 1.7 especies de leguminosas y señala on la u ilidad po encial de la écnica. Boui e y col. (4, 5), al examina po sepa ado las accio- nes de albúmina y globulina en semillas de leguminosas, obse a on que las globulinas ienen un alo axonómico a ni el de ibu y géne o. En el caso conc e o de la ibu T i olioleas el elec o o eg ama de glo- bulinas se ca ac e izaba po la p esencia de dos bandas ue emen e eñi- das en la pa e supe io del gel. A ni el de géne o. Kleczowska (14) encon ó que las p o eínas de ébol podían sepa a se median e elec o- o esis en 18 acciones. Ad iaanse y Robbe s (2) es udia on las acciones de albúmina y glo- bulina en cul i a es de Vicia aba L., Piswn sa nmm L. ulga is L. Las acciones de albúmina e an ca ac e ís icas en las espe- cies es udiadas, y de las es acciones de globulina ob enidas una de ellas di e enciaba mejo los cul i a es. Bingham y Yeh (3) halla on, en 30 a iedades de al al a y 26 diploides y e aploides de Medicado sa h'a L. y Medicago al ca a L., que las p o- eínas a iciales de las semillas e an cuali a i amen e simila es en 12 ó 13 bandas en odos los casos es udiados. Es a semejanza es aba de acue do con los esul ados ob enidos en es udios gené icos y ci ogené icos. La mayo ía de las a iedades di e ían más en los elec o o eg amas de las p o eínas que en sus ca ac e es mo ológicos. La a iación de ec ada en las p o eínas e a su icien e pa a jus i ica el empleo del mé odo en la iden i icación de a iedades. Vaughan y col. (21, 22) es udia on las acciones de albúmina y glo- bulina de semillas de a ias especies pe enecien es a los géne os B assica y Sinapis, an o po mé odos se ológicos como de elec o o esis sob e geles. y co elaciona on los esul ados ob enidos con lo? de la clasi i- cación ya es ablecida. C ouden y col. ( >) examina on 174 mues as de semillas de Umbelí- e as pe enecien es a 99 especies y 39 géne os La in es igación e eló di e encias en e las especies examinadas, algunas de indudable signi i- cado axonómico. Silano y col. (19) es udia on las acciones de albúmina y globulina de di e sas a iedades de T i ícum a es i a ni L. y T i icii-m- du um Des ., no encon ando di e encias a ie ales muy ma cadas, si bien las bandas de albúmina de mo imien o ápido p esen aban di e encias mayo es. ESTUDIO DE LAS DIFERENCIAS WFRAESPEC1FICAS EN «TRIFOLIUM SUBTEKRANEUM» L. 793 En la sepa ación elec o o é ica de p o eínas en o as pa es de la plan a señalamos los abajos de Lee y Fai b o he s (16), e ec uados en polen y semillas p oceden es de cua o axa de Typlia, u ilizando mé o- dos se ológicos y elec o o é icos. Los esul ados ob enidos po ambos mé odos e an complemen a ios y semejan es en el polen y las semillas. Zwa z (24) es udió di e encias a ie ales en la pa a a median e la elec- o o esis de p o eínas del ubé culo. Me Co n y col. (17) in es iga on las p o eínas del allo y hojas de es clones de Dian lms. Hil y y Schmi henne (10) compa a on p o eínas de la hoja de dos a iedades de soja Ha osoy y lla osoy (5:5, sin ap ecia di e encias en la composi- ción de p o eínas de ambas a iedades. Nues o p opósi o en es e abajo ue: Iden i ica cul i a es de T i olium siib c ancum L. u ilizando la elec- o o csis de p o eínas de semillas en geles de poliac ilamida. Es udia la simili ud exis en e en e los p o einog amas de dichos cul i a es. Compa a , a ni el subespecí ico. los da os ob enidos po el mé odo quimio axonómico con la clasi icación es ablecida po Ka znelson y Mo ley. MATERIAL Y MÉTODOS Se es udia on ocho cul i a es aus alianos pe enecien es a las es subespecies de T i olium si b e aneum L.. ssp. siib e nneum (Talla ook, Monn Ba ke , Ge ald on, Woogenellup. Bacchus Ma sh y Dwalganup). T i olium sub e ancum L. ssp. b acliycal chiuin. Ka zn. e Mo ley (Cla- e). T i nliuní suMc oncum L. ssp. yaninnicinn. Ka zn. e Mo ley (Ya loop). Ex acción de p o eínas Las p o eínas se ex aje on de las semillas de los ocho cul i a es. Las semillas ue on p opo cionadas po el CSIRO y po el Ins i u o Nacional de Selección de Semillas y Plan as de Vi e o. La can idad de ha ina u ilizada ue de 1 g . po cada 20 mi. de solución ex ac o a ( ampón is-glicina). po se es a azón la más idónea pa a log a la esolución del mayo núme o de bandas. El p ocedimien o seguido ue el u ilizado po Boul e y col. (4-). P epa ación de los gelcs elec ai i csis El mé odo empleado ue el de O ns ein y Da is (18, Ti. simpli icado po Tombs y Ak oyd (20) según lo señalado po Hje én y col. (11), 794 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA quienes usa on en luga de gel sepa ado una solución de saca osa al 40 po 100. Se coloca on 100 [il de ex ac o de p o eína en el ex emo de cada gel. Como indicado se usó azul de b omo enol. Fox y col. (9) y Vaughan y col. (21), en e o os, e ec ua on po sepa ado la elec o o e- sis de albúminas y globulinas, en an o que Fai b o he s (8) no sepa ó las dos acciones an es de e ec ua la elec o o esis. ob eniendo da os sa is ac o ios. Noso os hemos seguido el c i e io de es e úl imo au o . Tinción y des eñido Los geles se iñe on con una solución de neg o de almidón en me a- nol/agua/acé ico (5 :5 :1). A con inuación se pasa on du an e unas ho as a la misma mezcla pe o sin colo an e. El colo an e empleado da esul- ados análogos a los ob enidos median e el uso de colo an es enzima- icos (6). Examinamos los elec o o eg amas sob e una supe icie luminosa y las bandas de p o eína se o og a ia on y ep esen a on median e esquemas. Las o og a ías y los densi og amas no ecogen odas las bandas de ec- adas a simple is a, hecho ya señalado po a ios au o es (9, 20) La posición de una banda de p o eína después de e ec uada la elec o- o esis se exp esa po un alo Rp o posición ela i a de la banda com- pa ada con el en e de azul de b omo enol. El c i e io usado pa a es udia las bandas de p o eína, de acue do con Whi ney y col. (23), ha sido conside a las simila es cuando se sola- pan en más de 50 po 100. Pa a compa a dos axa se calculó un índice de simili ud de la siguien- e o ma: n.° de pa es de bandas simila es n.° de bandas di e en es + n.° de pa es de bancias simila es RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los esul ados ob enidos en la sepa ación de las bandas de p o eína de los axa in es igados se mues an en la ig. 1. Cada ep esen ación de és a se ob u o a pa i de 7 a 9 epe iciones. La di e en e in ensidad de inción que p esen an las bandas se exp esa de la mane a con encional que se indica en la igu a. Es a di e encia de in ensidad puede ene signi icado axonómico, pe o en el p esen e abajo no la hemos enido en cuen a. En el diag ama des aca el g an núme o de bandas que pueden ap ecia se con el ex ac o u ilizado. Las oscilaciones en e los alo es, una ez ans o mados en alo es de Rp, =on pequeñas den o de cada cul i a y se ie de expe imen os, po lo que no se conside ó necesa io inclui los alo es del e o s anda d. LSTUDIO DK LAS DIFERENCIAS INFRAESl'ECÍFICAS EN aTRIFOLIUM SUBTERRANEUM» L. 705 o - 10'- 20- 30- 40- 50- 60- 70- 80- 90- 100- C. D. M.B. B.M. T. G. W. Y Fig. 1.—Diag ama de las bandas de p o eínn de semillas de 8 cul i a es aus alianos de T i olium sub e aneum L. (C. - Cla e ; D. - Dwalganup ; M. B. - Moun Ba k - ; b'. M. - Bacchus Ma sh; T. - Talla ook ; G. - Ge alá on ; W. - Woogenellup ; Y. - Ya - loop). Las in ensidades de inción se exp esa on, en o den c ecien e, de la siguien e o ma: in ensidad 1: líneas discon inuas ; in ensidad 2: lineas de azo ino ; in en- sidad 3: líneas de azo g ueso ; in ensidad 4: líneas c uzadas ; in ensidad 5: bandas neg as. En el es udio compa a i o de las bandas, Boul e y col. (4) señala on que es necesa io ene p esen e lo siguien e: n) e! ex ac o inicial puede con ene un g an núme o de p o eínas di e en es, po lo que una banda puede es a o mada po más de una p o eína ; b~] es imposible asegu a que las bandas si uadas en la misma posición en ¿ elés ob enidos de di e en es axa sean debidas a p o eínas iguales. No obs an e, en el caso p esen e odo el ma e ial examinado son axa in aespecí icos con bas- an es assjos comunes. 79^ - I.KS DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA Todos los cul i a es pueden dis ingui se cla amen e po sus bandas de p o eína en con as e con lo encon ado po IJinghan y Veh (3) en a iedades y poliploides pe enecien es al géne o Medicado, donde la mayo di e encia cuali a i a obse ada en e odo el ma e ial e a la p e- sencia o ausencia de una banda; eniendo en cuen a es a banda podían es ablece se cua o g upos, den o de los cuales ue posible sepa a la mayo ía de las a iedades sólo en azón de la di e encia de densidad obse ada en las o as bandas. Hemos p escindido de las bandas de la zona inicial po no se ácil- men e homologables debido a su ex ema delgadez y po su i algunas al e aciones. T A I! L A I índices de simili ud de las bandas de p o eina en e 8 cul i a es de "T i olium sub e a- neu n' L. (T. - Falla ook : B. _V/. - Bacchus Ma sh ; G. - Ge ald on ; M. B. - Moun ia ke V. - Woogeneüiip: D. - Di alganup, C. - Cla e; Y. - Ya loop). Se señalan con neg i as los po cen ajes iguales o supe io es al 2í po 100. T B.M. G. M.B. W. D. C. Y ••••(%% 50 m 38 41 W% 42 36 32 ¡ü 41 32 41 28 • 21 23 28 25 19 Ü 18 19 28 31 13 31 W l//' 9 14 15 9 12 9 10 ü T. B.M. G. M.B. W. L/. C. Y I.a abla 1 mues a los índices de simili ud de las bandas de p o eína en e odos los cul i a es. F.l índice de simili ud más ele ado e-, el exis en e en e los cul i a es Talla ook y Bacchus Ma sh, ."i l po 100. Los cul i a es Talla ook. Bacchus Ma sh. Ge ald on, Moun Ba ke y Yoogenellup es án más asociados en e sí que espec o a las o as o mas, como lo pone de mani ies o el que los índices de simili ud en e ellos oscilan c'e un 2S a un ."O po 100. siendo alo es más al os que los que p esen an espec o a los o os es cul i a es. Dwalganup. Cla e y Ya - EST DlO UK LAS DJl-'ERENCIAS DIFEAESPKCÍFICA8 K.N «TRIFOUL'M SUBTERKAKBUMl L. 797 loop. Es o concue da con la clasi icación es ablecida po Ka /nelson y Mo ley, que los in oducen den o de la misma subespecie, ss >. ;,ul> i>-i i- ncum, y con los da os de c uzamien o ob enidos po ellos (1-J. Exis e una excepción, Aloun Ba ke , que iene un índice de simili ud mayo espec o a Cla e, pe enecien e a la ssp. b achycalycinu n, que espec o a Woogenellup, aunque la di e encia no es muy g ande. Un es udio pa ecido, ealizado po Whi ney y col. ('23) en especies pe ene- cien es a los géne os l'c icilliiim y Fi sa 'mm, puso de mani ies o una mayo di e encia in e especí ica que ín e gené ica, explicando es e hecho median e la hipó esis de que la elación en e la semejanza de p o eínas y la semejanza es ablecida po o os c i e ios no es lineal. Así, algunas! p o eínas e lejan solamen e di e encias gené icas meno es; o as, en cambio, e lejan di e encias gené icas mayo es, y en e ellas puede habe algunas p o eínas de apa iencia di usa, cuya a iación co esponde a g andes di e encias gené icas. El cul i a Dwalganup, que Ka znelson y Mo ley incluyen en la ssp. siib e aiiemn, mues a, con el g upo de cul i a es menciona- do con an e io idad, índices de simili ud no ablemen e más bajos, pa e- ciendo p esen a una posición in e media en e dicho g upo y Cla e, aunque iene un índice de simili ud mayo con es e úl imo (31 po 100j. El cul i a Cla e, pe enecien e a la ssp. b achycal 'dnnm, p esen a índices de simili ud aún meno es en elación al g upo de o mas an e io - men e ci ado, excep o el caso ya mencionado con espec o a Aloun Ba ke . Es o ambién coincide con la clasi icación es ablecida. En el caso del cul i a Ya loop los índices de simili ud son bajos espec o a los es an es cul i a es, lo que es á de acue do con lo encon- ado po los au o es ya nomb ados, que lo incluyen en la ssp. yaiinini- ciim y ambién con los c uzamien os ealizados po ellos. Un hecho que pa ece opo uno esal a es la epe ibilidad de los esul ados den o de cada cul i a , aun usando semillas de dis in a p o- cedencia ob enidas en di e en e época, en compa ación con la ma cada di e encia en e cul i a es. Es o concue da con lo obse ado po Fox y col. (9) en Cy isns scopa ius (L.) Link p oceden es de dos localidades. También Ad iaanse y col. (1), en un es udio e ec uado en 32 cul i a es de Pl aseohis ulga ís L.. es ablecie on que los elec o o eg amas de p o eína no pa ecían a ec ados po las condiciones ex e nas, ales como la e ilización con ni ógeno, condiciones climá icas y p opiedades del suelo. La sen (15) es udió 61 a iedades de soja, encon ando modelos de banda muy ep oduc ibles y uni o mes den o de cada a iedad, que no se eían a ec adas po año, localidad o se ie de sepa ación elec o- o é ica. El g an núme o de bandas y el hecho de que los índices de simili ud en e los cul i a es no sob epasen el alo del 50 po 100 e leja la g an he e ogeneidad de la especie ya comen ada po di e sos au o es. Los esul ados ob enidos es án de acue do con las subespecies 798 ANALES DE EDAFOLOGÍA Y AGROBIOLOGÍA que Ka znelson y Mo le n asociando cie as ba e as de es e ilidad con de e minadas ca ac e ís icas mo ológicas ; sin emba go, es as ba e as exis en ambién y además muy di undidas en e nume o- sas poblaciones que no se pueden sepa a po los ca ac e es mo o- lógicos. Un hecho impo an e en los p ocesos de subespeciación ha sido la au ogamia casi absolu a de odas las o mas de ébol sub e áneo, lo que acili a la ijación de las al e aciones c omosómicas y los cambios gené icos. Es o causa una di e gencia p og esi a y da ca ac e ís icas de mosaico a la es uc u a de la a iación de la especie. Concluyendo, el mé odo u ilizado pa ece muy adecuado pa a la 'den- i icación de cul i a es de ébol sub e áneo a pa i de las semillas. Iden i icación que es di ícil sin es e sis ema, pues exige en algunos de ellos la obse ación de la plan a en a ios es adios de su ciclo y una des- c ipción muy de allada que no puede se obje i a y además con ecuencia di ícil de in e p e a . Es a aplicación puede ene in e és inmedia o, siendo ácil la com- pa ación de los esul ados; las posibilidades de con usión en e cul i a- es son pequeñas, dadas las ca ac e ís icas muy indi iduales de cada p o einog ama, Ag adecimien o El au o ag adece al P o . D . F. González Be náldez, ca ed á ico de Ecología de la Uni e sidad de Se illa, la ayuda p es ada pa a la ealización de es e abajo. R K ? U M K N Las p o eínas de las semillas oe ocho cul i a es pe enecien es a las es subespecies de T i olium sub e aneiim L. se sepa a on median e elec o o esis en ge!es de poliac i- lamida. El núme o de bandas de ec adas po es e p ocedimien o e a ele ado, como e leja el diag ama adjun o. Todos los cul i a es pudie on di e encia se po sus bandas. Los esul ados e an ep oducibles incluso en cul i a es en los que se usa on semillas de dis in a p ocedencia y ob enidas en época di e en e. Es no able el con as e en e la cons ancia del elec o o eg ama ob enido den o de cada es i pe con la a iabilidad de dicho elec o o eg ama en e es i pes. Se es ablecie on los índices ¿e simili ud de las bandas de p o eína en e los di e- en es cul i a es. Los esul ados ob enidos se discu ie on con los p opo cionados po es udios mo o- lógicos y gené icos de o os au o es. Finalmen e se señala el in e és del 7iié odo pa a la ápida iden i icación de cul i a es. Sección de Kco isiología l'egc al. Ins i u o de I-'ila olagia y Biología Vege al. Mad id.