Caracterización de los sRNAs reguladores NsrR1 y NsiR3 de la cianobacteria Nostoc sp. PCC 7120

Caracterización de los sRNAs reguladores NsrR1 y NsiR3 de la cianobacteria Nostoc sp. PCC 7120 Isidro Álvarez Escribano Sevilla, 2019 TESIS DOCTORAL Portada: Modelo de la estructura 3D de los sRNAs NsrR1 (izquierda) y NsiR3 (derecha). Los modelos fueron generados con RNAComposer (Popenda et al. 2012. Nucleic Acids Research, 40:e112. doi: 10.1093/nar/gks339). Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular Consejo Superior de Investigaciones Científicas – Universidad de Sevilla TESIS DOCTORAL Caracterización de los sRNAs reguladores NsrR1 y NsiR3 de la cianobacteria Nostoc sp. PCC 7120 Trabajo presentado por Isidro Álvarez Escribano para optar al grado de Doctor Isidro Álvarez Escribano Sevilla, 2019 Directora Director Dra. Alicia María Muro Pastor Dr. Agustín Vioque Peña Científica Titular del Consejo Superior Catedrático de la Universidad de Sevilla de Investigaciones Científicas FINANCIACIÓN PARA LA REALIZACIÓN DE ESTA TESIS DOCTORAL Agradezco a las instituciones y fondos de financiación que han hecho posible la realización de esta Tesis Doctoral, que se ha llevado a cabo en el Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF, CSIC-US). La Tesis Doctoral ha sido financiada por un contrato predoctoral FPI del Ministerio de Economía y Competitividad, con referencia BES-2014-068488, adscrito a los proyectos BFU2013-48282-C2-1-P (RNAs no codificantes implicados en la adaptación al estrés de nitrógeno y la diferenciación celular en cianobacterias) del Ministerio de Economía y Competitividad y BFU2016-74943-C2-1-P (Participación de RNAs no codificantes en circuitos reguladores controlados por disponibilidad de nitrógeno en cianobacterias) de la Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, cuya Investigadora Principal es la Doctora Alicia María Muro Pastor. Ambos proyectos están cofinanciados por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A mis padres y mis hermanos, por vuestro apoyo A Celia, otro reto más que superamos juntos Índice iv 2.2. Métodos de manipulación y análisis de DNA ................................................................ 47 2.2.1. Plásmidos utilizados .................................................................................................... 47 2.2.1.1. Plásmidos no construidos en este trabajo .............................................................. 47 2.2.1.2. Plásmidos construidos en este trabajo ................................................................... 49 2.2.2. Aislamiento de DNA ..................................................................................................... 51 2.2.2.1. Aislamiento de DNA plasmídico de E. coli .............................................................. 51 2.2.2.2. Aislamiento de DNA total de cianobacterias .......................................................... 52 2.2.3. Electroforesis de DNA en geles de agarosa ................................................................. 52 2.2.4. Purificación de fragmentos de DNA ............................................................................. 52 2.2.5. Determinación de la concentración de DNA ............................................................... 53 2.2.6. Reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR) ........................................................ 53 2.2.6.1. Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa ............. 53 2.2.6.2. Procedimiento del “Megacebador” ........................................................................ 56 2.2.7. Secuenciación del DNA ................................................................................................ 58 2.2.8. Tratamientos enzimáticos del DNA ............................................................................. 58 2.2.8.1. Restricción del DNA ................................................................................................ 58 2.2.8.2. Desfosforilación del DNA ........................................................................................ 58 2.2.8.3. Ligación del DNA ..................................................................................................... 58 2.2.9. Transferencia de DNA a bacterias ............................................................................... 59 2.2.9.1. Transferencia de DNA a E. coli mediante transformación ...................................... 59 2.2.9.2. Transferencia de DNA a E. coli mediante electroporación ..................................... 59 2.2.9.3. Transferencia de DNA a Nostoc sp. PCC 7120 mediante conjugación triparental ............................................................................................................... 60 2.3. Métodos de manipulación y análisis de RNA ................................................................ 62 2.3.1. Aislamiento de RNA total de cianobacterias ............................................................... 62 2.3.2. Electroforesis de RNA en geles desnaturalizantes de urea-poliacrilamida y transferencia a membranas de nailon ......................................................................... 63 2.3.3. Electroforesis de RNA en geles desnaturalizantes de agarosa con formaldehído y transferencia a membranas de nailon ...................................................................... 64 2.3.4. Detección de RNA mediante hibridación en membrana con sondas radiactivas (Northern blot) ............................................................................................................ 65 2.3.5. Síntesis in vitro y marcaje radiactivo de RNA .............................................................. 66 2.3.6. Análisis de la estructura del RNA NsrR1 ...................................................................... 67 2.3.7. Análisis de la interacción de NsrR1 y las regiones 5´UTR de los mRNAs de nblA y all1871 ......................................................................................................................... 68 Índice v 2.4. Métodos de manipulación y análisis de proteínas ........................................................ 68 2.4.1. Preparación de extractos celulares cianobacterianos ................................................. 68 2.4.2. Métodos de cuantificación de proteínas ..................................................................... 69 2.4.3. Electroforesis de proteínas en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) ..................... 69 2.4.4. Expresión en E. coli y purificación de las proteínas All1871 y NblA recombinantes para la producción de anticuerpos ..................................................... 70 2.4.4.1. Expresión de las proteínas All1871 y NblA recombinantes y ..................................... preparación del extracto ........................................................................................ 70 2.4.4.2. Purificación de las proteínas All1871 y NblA recombinantes ................................. 71 2.4.5. Producción y purificación de anticuerpos frente a las proteínas All1871 y NblA ............................................................................................................. 73 2.4.6. Transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa y detección inmunológica (Western blot) ............................................................................................................. 73 2.4.7. Ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) ....................................... 74 2.5. Determinación del contenido de pigmentos fotosintéticos ........................................... 75 2.5.1. Determinación del contenido de clorofila ................................................................... 75 2.5.2. Espectros de absorción de células enteras de Nostoc sp. PCC 7120 ........................... 75 2.6. Ensayos para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y ............................... los mRNAs diana .......................................................................................................... 76 2.7. Ensayo de la actividad nitrogenasa ............................................................................... 79 2.8. Microscopía confocal láser para la detección de la proteína GFP en Nostoc sp. PCC 7120 ..................................................................................................... 80 2.9. Tinción de proheterocistos y heterocistos con azul Alcian ............................................ 80 2.10. Análisis bioinformático de secuencias de DNA y proteínas ......................................... 80 RECETARIO .......................................................................................................................... 83 3. RESULTADOS ................................................................................................................... 89 3.1. CAPÍTULO I .................................................................................................................... 91 NsiR3, un sRNA cuya expresión se induce en condiciones de carencia de nitrógeno combinado .......................................................................................................................... 91 3.1.1. Identificación de NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120 ......................................................... 93 3.1.2. Regulación de la expresión de nsiR3 por NtcA ............................................................ 95 3.1.3. Selección de posibles mRNAs diana de NsiR3 ............................................................. 96 3.1.4. Validación de la interacción entre NsiR3 y los mRNAs seleccionados ....................... 102 3.1.5. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 ................... 108 3.1.6. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de putA en Nostoc sp. PCC 7120 ....................... 109 Índice vi 3.2. CAPÍTULO II ................................................................................................................. 113 NsrR1, un sRNA cuya expresión se reprime en condiciones de carencia de nitrógeno combinado ........................................................................................................................ 113 3.2.1. Identificación de NsrR1 en Nostoc sp. PCC 7120 ....................................................... 115 3.2.2. Regulación de la expresión de nsrR1 por NtcA .......................................................... 118 3.2.3. Selección de posibles mRNAs diana de NsrR1 ........................................................... 119 3.2.4. Validación de la interacción entre NsrR1 y los mRNAs seleccionados ...................... 122 3.2.5. Regulación ejercida por NsrR1 sobre el mRNA de nblA ............................................. 125 3.2.5.1. Verificación de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA .................. 125 3.2.5.2. Efecto de NsrR1 sobre la expresión de nblA en Nostoc sp. PCC 7120 .................. 131 3.2.6. Regulación ejercida por NsrR1 sobre el mRNA de all1871 ........................................ 135 3.2.6.1. Verificación de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de all1871 ............. 135 3.2.6.2. Efecto de NsrR1 sobre la expresión de all1871 en Nostoc sp. PCC 7120 ............. 140 3.2.7. Caracterización funcional de la proteína All1871 ...................................................... 144 3.2.7.1. Localización de la expresión de all1871 en los filamentos de ................................... Nostoc sp. PCC 7120 durante el proceso de diferenciación de ................................. los heterocistos .................................................................................................... 144 3.2.7.2. Caracterización de un mutante de Nostoc sp. PCC 7120 carente de proteína All1871 .................................................................................................................. 145 3.2.7.3. Expresión de all1871 en relación con la disponibilidad de carbono ..................... 151 4. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 155 4.1. NsiR3, un sRNA inducible en condiciones de carencia de nitrógeno combinado y regulado por NtcA ...................................................................................................... 159 4.1.1. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 ................... 162 4.1.2. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de putA en Nostoc sp. PCC 7120 ....................... 163 4.2. NsrR1, un sRNA reprimible en condiciones de carencia de nitrógeno combinado y regulado por NtcA ...................................................................................................... 166 4.2.1. Efecto de NsrR1 sobre la expresión de nblA en Nostoc sp. PCC 7120 ....................... 167 4.2.2. Efecto de NsrR1 sobre la expresión de all1871 en Nostoc sp. PCC 7120 ................... 172 5. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 179 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 183 Índice vii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Estirpes de cianobacterias representativas de las secciones establecidas en la clasificación morfológica de Rippka et al., 1979 ......................................................... 5 Figura 1.2. Árbol filogenético de las cianobacterias según Shih et al., 2013 ................................ 6 Figura 1.3. Representación esquemática de la degradación de los ficobilisomas durante la deficiencia de nitrógeno combinado .................................................................... 16 Figura 1.4. Diferenciación de heterocistos y relaciones funcionales entre heterocistos y células vegetativas .................................................................................................... 17 Figura 1.5. Biogénesis de los RNAs reguladores ......................................................................... 21 Figura 1.6. Circuitos reguladores mixtos que involucran un sRNA y un factor de transcripción ............................................................................................................. 22 Figura 1.7. Representación esquemática de algunos mecanismos de acción de los asRNAs ...................................................................................................................... 23 Figura 1.8. Representación esquemática de algunos mecanismos de acción de los ribointerruptores ...................................................................................................... 24 Figura 1.9. Representación esquemática de algunos mecanismos de acción de los sRNAs codificados en trans ....................................................................................... 26 Figura 2.1 Procedimiento del “Megacebador” ........................................................................... 57 Figura 2.2. Sistema de transferencia por capilaridad de RNA en geles de agarosa a membranas de nailon ............................................................................................... 64 Figura 2.3. Purificación de las proteínas All1871 y NblA recombinantes mediante cromatografía de afinidad por níquel ....................................................................... 72 Figura 2.4. Esquema del sistema heterólogo implementado en E. coli utilizado para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y sus mRNAs diana .................... 77 Figura 2.5. Representación esquemática de la construcción de un plásmido derivado de pXG-30 para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y una secuencia correspondiente al interior de una región de un mRNA policistrónico ............................................................................................................ 78 Figura 3.1. Representación esquemática de la región que codifica NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120 ................................................................................................. 93 Figura 3.2. Alineamiento de los homólogos de NsiR3 identificados en Brenes-Álvarez et al., 2016 y modelo de la estructura secundaria de NsiR3 según Mfold ............................................................................ 94 Figura 3.3. Análisis de la expresión de NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120 ....................................... 94 Figura 3.4. Comparación de las secuencias promotoras de los homólogos de NsiR3 identificados en Brenes-Álvarez et al., 2016 ............................................................ 95 Figura 3.5. Unión de la proteína NtcA a la región promotora de NsiR3 ..................................... 96 Figura 3.6. Comparación entre la estirpe Nostoc sp. PCC 7120 y la estirpe mutante ΔnsiR3 de los cambios transcripcionales que ocurren tras 8 horas (N2) en condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado .......................................... 97 Figura 3.7. Interacciones entre NsiR3 y los mRNAs seleccionados para su estudio ................. 101 Índice viii Figura 3.8. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsiR3 y la región 5´UTR de los mRNAs seleccionados ................ 104 Figura 3.9. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de las interacciones entre NsiR3 y la región 5´UTR de putA y de alr2431 ........................ 107 Figura 3.10. Identificación mediante Northern blot del transcrito de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 y efecto de NsiR3 sobre la acumulación del mismo ............ 109 Figura 3.11. Análisis de la regulación del transcrito de putA en Nostoc sp. PCC 7120 ............. 110 Figura 3.12. Efecto de NsiR3 sobre la acumulación del transcrito de putA en estirpes con niveles alterados de NsiR3 .................................................................................... 111 Figura 3.13. Representación esquemática de la región que codifica NsrR1 en Nostoc sp. PCC 7120 .............................................................................................. 115 Figura 3.14. Alineamiento de los homólogos de NsrR1 identificados en Brenes-Álvarez et al., 2016 ................................................................................... 116 Figura 3.15. Análisis de la expresión de NsrR1 en Nostoc sp. PCC 7120 y en las estirpes mutantes CSE2 y 216 ............................................................................................. 116 Figura 3.16. Análisis de la expresión de NsrR1 en Nostoc sp. PCC 7120 tras la adición de amonio .................................................................................................................. 117 Figura 3.17. Comparación de las secuencias promotoras de los homólogos de NsrR1 identificados en Brenes-Álvarez et al., 2016 ......................................................... 118 Figura 3.18. Unión de la proteína NtcA a la región promotora de NsrR1 ................................. 119 Figura 3.19. Interacciones entre NsrR1 y los mRNAs diana seleccionados para su estudio ..... 121 Figura 3.20. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de los mRNAs seleccionados .............. 124 Figura 3.21. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA ............................................... 127 Figura 3.22. Identificación de la zona de interacción de NsrR1 con la región 5´UTR del mRNA de nblA y modelo de estructura secundaria de NsrR1 ............................... 129 Figura 3.23. Conservación de la interacción predicha entre NsrR1 y el mRNA de nblA en cianobacterias ....................................................................................................... 130 Figura 3.24. Crecimiento de la estirpe ΔnsrR1 en medio sólido con distintas fuentes de nitrógeno ............................................................................................................... 131 Figura 3.25. Identificación mediante Northern blot de los transcritos de nblA regulados por nitrógeno en Nostoc sp. PCC 7120 ................................................................. 132 Figura 3.26. Efecto de NsrR1 sobre la acumulación de los transcritos de nblA regulados por nitrógeno ........................................................................................................ 133 Figura 3.27. Detección de NblA en células de E. coli ................................................................ 134 Figura 3.28. Análisis del contenido de pigmentos celulares en células de Nostoc sp. PCC 7120 .............................................................................................. 135 Figura 3.29. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de all1871 .......................................... 137 Figura 3.30. Identificación de la zona de interacción de NsrR1 con la región 5´UTR del mRNA de all1871 .................................................................................................. 138 Índice ix Figura 3.31. Conservación de la interacción entre NsrR1 y el mRNA de all1871 en cianobacterias ....................................................................................................... 139 Figura 3.32. Regulación por nitrógeno del transcrito de all1871 en Nostoc sp. PCC 7120 y en las estirpes mutantes 216 y CSE2 ..................................................................... 140 Figura 3.33. Detección de All1871 en Nostoc sp. PCC 7120 ..................................................... 141 Figura 3.34. Efecto de NsrR1 sobre la acumulación del transcrito de all1871 en Nostoc sp. PCC 7120 .............................................................................................. 142 Figura 3.35. Detección de All1871 en Nostoc sp. PCC 7120 y en la estirpe ∆nsrR1 .................. 143 Figura 3.36. Expresión de la fusión traduccional all1871::gfp en filamentos de Nostoc sp. PCC7120 .............................................................................................. 145 Figura 3.37. Comprobación de la estructura cromosómica de la estirpe all1871::CK3 ............ 146 Figura 3.38. Representación esquemática de la construcción del plásmido pIAE65, utilizado para la generación de la estirpe all1871::CK3 + Ptrc::all1871 ................. 147 Figura 3.39. Crecimiento de las estirpes all1871::CK3 y all1871::CK3 + Ptrc::all1871 en medio sólido con distintas fuentes de nitrógeno .................................................. 148 Figura 3.40. Presencia de heterocistos en la estirpe all1871::CK3 ........................................... 148 Figura 3.41. Expresión del operón nifHDK en Nostoc sp. PCC 7120 y en las estirpes mutantes all1871::CK3 y all1871::CK3 + Ptrc::all1871 ........................................... 150 Figura 3.42. Expresión de los transcritos all1871 y NsrR1 en respuesta a la disponibilidad de carbono en Nostoc sp. PCC 7120 ..................................................................... 151 Figura 3.43. Efecto de la disponibilidad de CO2 en el crecimiento de la estirpe all1871::CK3 .......................................................................................................... 152 Figura 3.44. Crecimiento de las estirpes all1871::CK3 y all1871::CK3 + Ptrc::all1871 en condiciones de limitación de carbono .................................................................. 153 Figura 4.1. Circuitos reguladores coherentes que combinan factores de transcripción y sRNAs en cianobacterias ......................................................................................... 158 Figura 4.2. Modelo de la regulación de putA por NsiR3 ........................................................... 165 Figura 4.3. Sitios de unión de NtcA en algunos promotores reprimidos por NtcA ................... 166 Figura 4.4. Modelo propuesto para la función de NsrR1 en la regulación de nblA .................. 171 Figura 4.5. Modelo propuesto para la regulación transcripcional que NtcA opera sobre NsiR3 y NsrR1, y la regulación postranscripcional que estos sRNAs ejercen sobre sus mRNAs diana según la disponibilidad de nitrógeno combinado ............ 176 Índice x ÍNDICE DE TABLAS Tabla 2.1. Estirpes derivadas de Nostoc sp. PCC 7120 ................................................................ 43 Tabla 2.2. Estirpes de E. coli utilizadas ....................................................................................... 46 Tabla 2.3. Plásmidos utilizados no construidos en este trabajo ................................................. 47 Tabla 2.4. Plásmidos utilizados construidos en este trabajo ...................................................... 49 Tabla 2.5. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo ............................................................... 53 Tabla 2.6. Oligonucleótidos empleados para la generación de sondas radiactivas .................... 66 Tabla 3.1. mRNAs candidatos a interaccionar con NsiR3 según la predicción de CopraRNA ................................................................................................................... 99 Tabla 3.2. Información de aquellos genes candidatos a interaccionar con NsiR3 que presentan cambios significativos en el análisis del microarray ............................... 100 Tabla 3.3. Secuencias de los insertos clonados para la validación, mediante el sistema heterólogo en E. coli, de la interacción entre NsiR3 y los mRNAs seleccionados como posibles dianas ............................................................................................... 102 Tabla 3.4. mRNAs candidatos a interaccionar con NsrR1 según la predicción de CopraRNA ................................................................................................................. 120 Tabla 3.5. Secuencias de los insertos clonados para la validación, mediante el sistema heterólogo en E. coli, de la interacción entre NsrR1 y los mRNAs seleccionados como posibles dianas ............................................................................................... 123 Tabla 3.6. Actividad nitrogenasa de las estirpes Nostoc sp. PCC 7120, all1871::CK3 y all1871::CK3 + Ptrc::all1871 ....................................................................................... 149 1. INTRODUCCIÓN Introducción 8 1.1.2. Aspectos metabólicos de las cianobacterias En contraste con su diversidad morfológica, las cianobacterias constituyen un grupo de organismos muy homogéneo desde el punto de vista de su metabolismo, que se caracteriza por la capacidad de realizar la fotosíntesis oxigénica, aunque algunas especies, como Oscillatoria limnetica, en determinadas condiciones, pueden llevar a cabo una fotosíntesis anoxigénica, oxidando SH2 y liberando S. Aunque generalmente las cianobacterias se han considerado bacterias autótrofas estrictas, algunas cianobacterias también son capaces de asimilar fuentes reducidas de carbono (Rippka, 1972), como la sacarosa, glucosa o fructosa, necesitando o no iluminación para ello. Esta capacidad depende, al menos en parte, de la existencia en estas cianobacterias de transportadores o permeasas específicas que facilitan la entrada de los azúcares en la célula (Ungerer et al., 2008). Así, además del metabolismo foto-lito-autótrofo de todas las cianobacterias, en la actualidad se conocen numerosos ejemplos de cianobacterias capaces de llevar a cabo un metabolismo foto-quimio-heterótrofo, quimio-heterótrofo e incluso mixótrofo (Stebegg et al., 2012; Muñoz-Marín et al., 2013). La fijación de carbono tiene lugar mediante la vía reductiva de las pentosas fosfato o ciclo de Calvin-Benson. Parte del CO2 fijado se acumula en forma de glucógeno como material de reserva que se utiliza en los períodos de oscuridad, cuando no tiene lugar la fotosíntesis. Para el metabolismo respiratorio, que se realiza principalmente en condiciones de oscuridad, las cianobacterias utilizan la vía oxidativa de las pentosas fosfato. En el metabolismo respiratorio, la cadena de transporte respiratoria comparte parte de sus componentes con la cadena de transporte de electrones fotosintética (Schmetterer, 1994). Se ha considerado que las cianobacterias presentaban un ciclo de Krebs incompleto al carecer de la enzima 2-oxoglutarato deshidrogenasa (Stanier y Cohen-Bazire, 1977). De este modo, estaba bien establecido que el ciclo de Krebs de las cianobacterias tenía una función anabólica, suministrando el 2-oxoglutarato necesario para la incorporación del nitrógeno inorgánico en esqueletos carbonados (Stanier y Cohen-Bazire, 1977), la síntesis de aminoácidos de la familia del glutamato, y la síntesis de δ-aminolevulinato, un precursor inmediato para la síntesis de porfirinas, ficobilinas y clorofila (Beale, 1994). No obstante, estudios recientes sugieren la existencia de rutas alternativas que completarían el ciclo de Krebs en cianobacterias (Zhang y Bryant, 2011; Xiong et al., 2014). Introducción 9 1.1.2.1. Asimilación de carbono en cianobacterias: la fotosíntesis oxigénica Como se ha mencionado, la característica más relevante de las cianobacterias es su capacidad de emplear energía lumínica para fijar CO2 mediante fotosíntesis. Las cianobacterias fueron los primeros organismos en utilizar dos fotosistemas en serie, lo cual les permitió generar el potencial electroquímico suficiente para utilizar agua como donador de electrones, produciendo oxígeno como subproducto de la fotosíntesis (Hohmann-Marriott y Blankenship, 2011). En la Biosfera actual, realizan la fotosíntesis oxigénica las cianobacterias, algas y plantas superiores. En todos estos organismos, el proceso fotosintético ocurre, en esencia, del mismo modo, aunque las cianobacterias cuentan con algunas características particulares. Como ya se ha mencionado, una de estas características radica en la composición del aparato fotosintético, pues cuentan con ficobilisomas asociados a las membranas tilacoidales. Los ficobilisomas son macrocomplejos compuestos mayoritariamente de ficobiliproteínas, pigmentos antena cuya función consiste en captar la luz y transferir la energía lumínica a los fotosistemas I y II (Bailey y Grossman, 2008; Liu et al., 2013). Las ficobiliproteínas pueden llegar a representar el 40-50% de la proteína celular, por lo que constituyen importantes reservas de nitrógeno y carbono. Otra singularidad de las cianobacterias es la capacidad de adaptar la composición de su aparato fotosintético a las condiciones lumínicas mediante un proceso denominado fotomorfogénesis. Este proceso engloba distintos fenómenos que permiten a las cianobacterias regular la cantidad de clorofila y la proporción entre los fotosistemas I y II, o modificar la composición de pigmentos de los ficobilisomas en función de la longitud de onda o de la intensidad de la luz. Este último fenómeno se conoce como “adaptación cromática” (Gutu y Kehoe, 2012; Montgomery, 2016). Durante la fotosíntesis, la enzima responsable de la fijación de CO2 es la RuBisCO (ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa), considerada la enzima más abundante en la Tierra. La RuBisCO es una enzima bifuncional que puede usar CO2 (carboxilasa) u O2 (oxigenasa) como sustrato. Como carboxilasa, la RuBisCO cataliza el primer paso del ciclo de Calvin-Benson, esto es, la incorporación del CO2 a la molécula de ribulosa 1,5-bisfosfato para generar dos moléculas de 3-fosfoglicerato. Este fotosintato sigue reduciéndose hasta dar lugar a azúcares que sirven a la cianobacteria como esqueletos carbonados en sus procesos de biosíntesis. Sin embargo, la RuBisCO presenta mayor afinidad por el O2 que por el CO2, de forma que, como oxigenasa, puede catalizar la incorporación de una molécula de O2 a la ribulosa 1,5-bisfosfato para generar 2-fosfoglicolato. Este compuesto se metaboliza por fotorrespiración empleando grandes cantidades de energía y liberando CO2, lo que reduce de forma significativa la eficiencia de la fotosíntesis (Kroth, 2015). La concentración de O2 en la atmósfera es muy superior a la Introducción 10 de CO2. Además, durante la fotosíntesis las cianobacterias generan O2. Este ambiente aeróbico favorecería la actividad oxigenasa de la RuBisCO, con la consiguiente pérdida de eficacia. Para solventar este problema e incrementar la eficiencia de la fijación de CO2, las cianobacterias han desarrollado distintos sistemas de concentración de CO2 en las inmediaciones de la RuBisCO (Burnap et al., 2015). Estos mecanismos, denominados CCM (CO2 Concentrating Mechanism) son tres: la existencia de transportadores de CO2 y HCO3-, que llegan a concentrar hasta 1.000 veces los niveles de carbono inorgánico en el citosol (Kaplan y Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005); la actividad de las anhidrasas carbónicas, que catalizan la interconversión de HCO3- y CO2; y el confinamiento de la RuBisCO y la anhidrasa carbónica en el carboxisoma (Kerfeld y Melnicki, 2016). El carbono inorgánico resulta ser limitante en la mayoría de los ambientes habitados por las cianobacterias. En estas condiciones, se inducen genes de los sistemas CCM y de las proteínas estructurales de la RuBisCO (Price et al., 2008; Jiang et al., 2018). En Synechocystis PCC 6803, los elementos del CCM están principalmente bajo el control de dos reguladores de la transcripción de tipo LysR (LTTR), la proteína CmpR, y el regulador NdhR (Jiang et al., 2018). En condiciones de limitación de carbono inorgánico, la proteína CmpR actúa como un activador transcripcional de la expresión del operón cmp, que codifica las subunidades de un transportador de HCO3- tipo ABC (Omata et al., 2001). En contraste, y a pesar de compartir una identidad de secuencia del 54% con CmpR, en estas condiciones NdhR funciona como un represor transcripcional para controlar globalmente la expresión de varios genes relacionados con el CCM, como los sistemas ndh, que codifican las proteínas del sistema de captación de alta afinidad de CO2 (Wang et al., 2004). Este mecanismo también ha sido descrito en Nostoc sp. PCC 7120 (López-Igual et al., 2012), donde la expresión de la agrupación génica alr2877-alr2880, que codifica el sistema de transporte de HCO3- tipo ABC Cmp, se induce en condiciones de limitación de carbono inorgánico. Además, el gen all0862, que codifica un regulador transcripcional de tipo LysR, también se expresa bajo condiciones de limitación de carbono inorgánico y en unos niveles más elevados en ausencia que en presencia de nitrógeno combinado, con un efecto positivo del factor de transcripción NtcA, el regulador global de la asimilación de nitrógeno en cianobacterias. De este modo, la proteína All0862 es requerida para la inducción del transportador Cmp de HCO3-, representando así un regulador CmpR en Nostoc sp. PCC 7120. Este sistema supone un nuevo modo de coregulación por la disponibilidad de C y N a través de la acción concertada de los factores de transcripción que responden a estos nutrientes. Además, recientemente se ha caracterizado la proteína PacR como el regulador global de la asimilación fotosintética de carbono en Nostoc sp. PCC 7120 (Picossi et al., 2015). Introducción 11 Dependiendo de la disponibilidad de carbono inorgánico, este factor de transcripción tipo LysR regula la expresión de genes que codifican las subunidades de la RuBisCO, transportadores Ndh, transportadores de HCO3-, y otras proteínas implicadas en los mecanismos CCM. Asimismo, PacR participa en la regulación de la expresión de proteínas de los fotosistemas, así como de proteínas involucradas en la defensa del aparato fotosintético frente a daños oxidativos (Picossi et al., 2015; Herrero y Flores, 2019). El carbono y el nitrógeno son los nutrientes más abundantes en los organismos vivos. Por lo tanto, los metabolismos del carbono y el nitrógeno, que son esenciales para que las bacterias se adapten a las variaciones nutricionales del medio ambiente, deben estar estrechamente controlados (Jiang et al., 2018). En microorganismos autótrofos como las cianobacterias, el control del metabolismo del carbono es particularmente importante debido a las limitadas fuentes de carbono disponibles para mantener el ritmo de la asimilación del nitrógeno (Jiang et al., 2018). Como se ha mencionado, los niveles elevados de CO2 favorecen la actividad carboxilasa de la RuBisCO, generando 3-fosfoglicerato, mientras que los niveles altos de O2, o bajos de CO2, promueven la actividad oxigenasa, produciendo 2-fosfoglicolato. Así, el nivel de 2-fosfoglicolato se correlaciona de manera inversa con el de 2-oxoglutarato, que se acumula bajo una alta ratio C/N, y actúa como una señal de limitación de nitrógeno en el medio (Forchhammer, 2004; Herrero et al., 2004; Zhang et al., 2018). De este modo, estos dos metabolitos, que funcionan juntos como indicadores del estado intracelular C/N, representan un sensor fino para la coordinación del metabolismo del carbono y del nitrógeno en las cianobacterias (Jiang et al., 2018; Zhang et al., 2018). 1.1.2.2. Asimilación de nitrógeno en cianobacterias Las cianobacterias son capaces de utilizar diversas fuentes inorgánicas y orgánicas de nitrógeno, tales como amonio, nitrato, nitrito, urea, algunos aminoácidos como la glutamina y la arginina, y bases nitrogenadas (Flores y Herrero, 1994). Existe una jerarquía a la hora de emplear las distintas fuentes inorgánicas de nitrógeno, de manera que se utilizan preferentemente aquellas que implican un menor consumo energético. El mecanismo regulatorio mediante el cual las cianobacterias utilizan una ruta de asimilación de nitrógeno en detrimento de otras más costosas energéticamente recibe el nombre de “control por nitrógeno”, y consiste en la represión de las vías de asimilación de algunas fuentes de nitrógeno cuando otras, más fácilmente asimilables, están disponibles para las células (Herrero et al., 2001; Herrero y Flores, 2019). Introducción 12 El control por nitrógeno en cianobacterias está mediado por la proteína NtcA, un regulador transcripcional que activa o reprime genes implicados en la asimilación de nitrógeno en función de la disponibilidad de N. La fuente preferencial de nitrógeno, más fácilmente asimilable por las cianobacterias, es el amonio (Herrero et al., 2001; Herrero y Flores, 2019). Así, en presencia de concentraciones no limitantes de amonio los sistemas de transporte y asimilación de fuentes de nitrógeno alternativas, como por ejemplo el nitrato, se mantienen reprimidos. Por el contrario, en ausencia de amonio, NtcA promueve la expresión de transportadores y enzimas de rutas de asimilación de fuentes alternativas de nitrógeno. La asimilación de estas sustancias requiere su incorporación al interior celular y su posterior metabolización para generar amonio, que se incorpora a esqueletos carbonados para dar lugar a compuestos nitrogenados orgánicos. La incorporación del amonio a esqueletos carbonados se realiza fundamentalmente mediante el ciclo de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa, GS-GOGAT (Wolk et al., 1976; Meeks et al., 1978; Flores y Herrero, 1994), el cual constituye la conexión entre el metabolismo del carbono y el nitrógeno (Zhang et al., 2018). El primer paso del ciclo GS-GOGAT lo realiza la enzima glutamina sintetasa (GS), que cataliza la síntesis de glutamina dependiente de ATP a partir de amonio y glutamato. El segundo paso es llevado a cabo por la enzima glutamato sintasa (GOGAT), que cataliza la transferencia del grupo amido de la glutamina a una molécula de 2-oxoglutarato, produciéndose dos moléculas de glutamato, en una reacción que requiere poder reductor (van den Heuvel et al., 2004). Una de las moléculas de glutamato se recicla para la síntesis de glutamina. A diferencia de la GS, que está fuertemente regulada a nivel de expresión y actividad, y que se encuentra en todas las células de los filamentos, la enzima GOGAT no está regulada por la fuente de nitrógeno y no está presente en los heterocistos (Thomas et al., 1977; Martín-Figueroa et al., 2000). Como ya se ha mencionado, la regulación global de la asimilación de nitrógeno en cianobacterias está controlada a nivel transcripcional por NtcA, un factor de transcripción de la familia CRP/FNR, también necesario para que tenga lugar el proceso de diferenciación de los heterocistos (véase apartado 1.1.2.3.2) (Herrero et al., 2001). La actividad de NtcA está modulada por la cantidad de 2-oxoglutarato, que refleja el estado nitrogenado de las células (Muro-Pastor et al., 2001). En presencia de nitrógeno combinado el nivel de 2-oxoglutarato es bajo, y NtcA tiene baja afinidad por los promotores que regula. Los niveles elevados de 2-oxoglutarato que se acumulan en condiciones de limitación de nitrógeno estimulan la unión de NtcA a las regiones promotoras de los genes que regula (Zhao et al., 2010). Esta regulación tiene lugar mediante la unión de NtcA a secuencias específicas conservadas en dichos promotores. La secuencia de unión de NtcA, inicialmente definida como GTAN8TAC en Introducción 13 base a unos pocos promotores (Luque et al., 1994), se ha redefinido como GTN10AC tras acercamientos que analizan globalmente todos los promotores regulados por este factor de transcripción (Mitschke et al., 2011b; Picossi et al., 2014; Giner-Lamia et al., 2017). Se ha descrito que NtcA puede actuar como un activador o como un represor de la transcripción dependiendo de la ubicación del sitio de unión con respecto al sitio de inicio de la transcripción regulado (TSS, Transcription Start Site) (Mitschke et al., 2011b; Picossi et al., 2014). La mayoría de los promotores activados por NtcA contienen un sitio de unión de NtcA centrado alrededor de la posición -41,5 con respecto al TSS, similar a la posición de los sitios de unión de CRP en promotores activados de Clase II (Herrero et al., 2001; Browning y Busby, 2004). Por el contrario, los genes reprimidos por NtcA presentan sitios de unión de NtcA que pueden solapar con alguno de los elementos críticos del promotor, como la caja -35, la caja -10 o el TSS, interfiriendo de esta forma en la unión de la RNA polimerasa al mismo (Herrero et al., 2001). En el contexto de la regulación del metabolismo del nitrógeno, las cianobacterias cuentan con mecanismos que modulan la actividad de NtcA, como el sistema conformado por la proteína transductora de señales PII, y la proteína de unión a PII, PipX (PII interacting protein X). La proteína PII, muy extendida en bacterias, algas y plantas, transmite señales de abundancia o escasez de carbono, energía y disponibilidad de nitrógeno, convirtiendo estas señales en cambios en la expresión génica, o en las actividades de transportadores o enzimas (Forcada- Nadal et al., 2018). Esta proteína, que fue la primera proteína reconocida como un sensor de los niveles de 2-oxoglutarato en Escherichia coli (Adler et al., 1975), actúa interaccionando con distintas dianas proteicas, activando o reprimiendo algunos procesos en función del estado nitrogenado celular. En cianobacterias se han identificado tres procesos en los que PII actuaría como regulador: el transporte de nitrato y nitrito, la biosíntesis de arginina, y la expresión de genes dependientes de NtcA (Luque y Forchhammer, 2008). Al contrario que PII, PipX está presente exclusivamente en cianobacterias (Espinosa et al., 2006), y fue identificada inicialmente como una proteína que interacciona con PII, aunque posteriormente, se demostró además su interacción con NtcA de forma dependiente de 2-oxoglutarato (Espinosa et al., 2006). En Nostoc sp. PCC 7120, el gen pipX (asr0485) se expresa principalmente en condiciones de carencia de nitrógeno combinado, y no solo requiere NtcA, sino también HetR, el regulador específico de la diferenciación celular (véase apartado 1.1.2.3.2). Se ha demostrado que PipX contribuye a la correcta función del heterocisto, incluyendo la activación completa de los genes estructurales de la nitrogenasa, y de los genes encargados de proteger a la nitrogenasa frente al oxígeno (Valladares et al., 2011; Herrero y Flores, 2019). De este modo, la compleja red de interacción entre NtcA y las proteínas PII y PipX es clave en la regulación del Introducción 14 metabolismo del nitrógeno. En condiciones de limitación de nitrógeno, los niveles elevados de 2-oxoglutarato estimulan la acción de NtcA y PipX. Éste último se une a NtcA estabilizando su conformación activa, actuando por tanto como un coactivador (Espinosa et al., 2006; Zhang et al., 2018). Además, PipX cuenta con un sitio de unión para PII, pero, mientras que el complejo PipX-NtcA es estabilizado a elevadas concentraciones de 2-oxoglutarato, la interacción entre PipX- PII se ve reducida en presencia de 2-oxoglutarato, de manera que PipX se une a PII cuando los niveles de 2-oxoglutarato son bajos, es decir, en condiciones de suficiencia de nitrógeno. Cuando se produce esta unión, PII secuestra a PipX, impidiendo su unión a NtcA, y evitando así su activación. Por su parte, PII también une 2-oxoglutarato, lo que genera un cambio conformacional que impide su unión a PipX, por lo que PipX estaría libre para unirse a NtcA e incrementar su actividad en condiciones de limitación de nitrógeno (Espinosa et al., 2006; Zhang et al., 2018). De esta forma, el 2-oxoglutarato actúa a varios niveles, incrementando así la respuesta mediada por NtcA. Esto sugiere un modelo en el cual PipX se une a PII en condiciones de suficiencia de nitrógeno, y por tanto bajos niveles de 2-oxoglutarato, y coactiva a NtcA en condiciones de deficiencia de nitrógeno, cuando los niveles de 2-oxoglutarato son elevados (Forcada-Nadal et al., 2018). 1.1.2.3. Adaptación de Nostoc sp. PCC 7120 a la carencia de nitrógeno combinado La adaptación de las cianobacterias a la carencia de nitrógeno combinado implica la activación de un programa transcripcional encaminado a la utilización de fuentes alternativas de nitrógeno, incluyendo la degradación de complejos proteicos para la reutilización de los aminoácidos. Además, en el caso de numerosas cianobacterias capaces de fijar nitrógeno atmosférico mediante la enzima nitrogenasa, se inicia la diferenciación de un tipo celular especializado, los heterocistos, en los que se genera una atmósfera microaeróbica apropiada para el funcionamiento de dicha enzima. Todos estos procesos están en última instancia bajo el control del regulador global NtcA, si bien implican también el concurso de algunos reguladores específicos. Se describen a continuación con más detalle algunos aspectos de estos fenómenos de adaptación que son relevantes en el contexto de este trabajo. Introducción 15 1.1.2.3.1. Degradación de los ficobilisomas. Papel de NblA Las cianobacterias no diazotróficas responden al estrés nutricional por déficit de nitrógeno mediante un proceso llamado clorosis (o bleaching), que implica la degradación de los pigmentos fotosintéticos, incluidos los ficobilisomas (Grossman et al., 1993a; 1993b). En cianobacterias unicelulares el proceso de clorosis es una respuesta frente a diferentes estreses, que en algunas especies como Synechococcus elongatus sp. PCC 7942, incluyen además de la deficiencia de nitrógeno la carencia de azufre (Collier y Grossman, 1992). La degradación de los ficobilisomas, además de proteger el aparato fotosintético en condiciones de exposición a alta luz, también proporciona aminoácidos como fuente de nitrógeno en situaciones de deficiencia de nitrógeno combinado. De este modo, las cianobacterias responden a la situación de carencia de nitrógeno combinado activando la degradación de proteínas (Fleming y Haselkorn, 1974) por la acción de enzimas proteolíticas (Wood y Haselkorn, 1976). Esta respuesta supone la movilización en todas las células vegetativas de los productos nitrogenados de almacenamiento, como son los gránulos de cianoficina (Lang et al., 1972) y las ficobiliproteínas (Glazer, 1987). Mientras que las ficobiliproteínas son, como se ha mencionado anteriormente, pigmentos fotosintéticos de naturaleza proteica, la cianoficina (multi-L-arginil-poli-L-aspartato) es un polímero de almacenamiento sintetizado no ribosómicamente. La proteína NblA (non-bleaching phenotype A) funciona como un adaptador implicado en el proceso de degradación de los ficobilisomas, facilitando la interacción del ficobilisoma con el complejo proteolítico encargado de su degradación en diferentes situaciones de estrés (Collier y Grossman, 1994; Karradt et al., 2008; Sendersky et al., 2014). En Nostoc sp. PCC 7120 se ha demostrado que el gen nblA tiene varios promotores y está sujeto tanto a regulación a través de NtcA, que incluye la inducción de su transcripción en condiciones de carencia de nitrógeno combinado (Mitschke et al., 2011b), como a una regulación por FurA en condiciones de deficiencia de hierro (González et al., 2016). Aunque las cianobacterias formadoras de heterocistos sean capaces, en última instancia, de revertir la situación de deficiencia de nitrógeno mediante la fijación de nitrógeno atmosférico, su respuesta transitoria a la situación de carencia de nitrógeno combinado también incluye, como ya se ha comentado, la inducción del gen nblA y la degradación parcial de los ficobilisomas (Baier et al., 2004). Introducción 16 Figura 1.3. Representación esquemática de la degradación de los ficobilisomas durante la deficiencia de nitrógeno combinado. Los ficobilisomas se muestran anclados a la membrana tilacoidal (gris), asociados al fotosistema II (PSII, verde). El proceso de degradación es secuencial, comenzando con la pérdida de los cilindros periféricos de ficoeritrina (rectángulos rojos) y ficocianina (rectángulos azules), y concluyendo con la degradación del núcleo de aloficocianina (círculos celestes). Imagen adaptada de (Grossman et al., 1993b). Los ficobilisomas de Nostoc sp. PCC 7120 están compuestos por 8 cilindros periféricos de ficocianina (Magnuson y Cardona, 2016) y no tienen ficoeritrina, que se representa en este esquema por estar presente en otras cianobacterias formadoras de heterocistos. Sólo se representan seis cilindros por claridad. El proceso de degradación de los ficobilisomas es secuencial, comenzando con la pérdida de los cilindros compuestos por ficoeritrina y ficocianina, y concluyendo con la degradación del núcleo de aloficocianina (Figura 1.3) (Yamanaka y Glazer, 1980; Collier y Grossman, 1992). En Nostoc sp. PCC 7120, el gen nblA codifica una proteína dimérica pequeña, de 7 kDa y 65 aminoácidos, que presenta una identidad relativamente baja, aproximadamente del 30%, con la de otras cianobacterias. No obstante, la estructura de NblA sí está muy conservada en todas las cianobacterias (Bienert et al., 2006). La proteína NblA consta de una región N-terminal y de una región C-terminal muy conservadas, que juegan un papel clave en el proceso de degradación de los ficobilisomas. El modelo más aceptado de la degradación de los ficobilisomas propone la participación conjunta de NblA, la chaperona ClpC, y la proteasa cianobacteriana Clp. Así, los residuos conservados en la región N-terminal de NblA intervienen en la unión con ClpC (Karradt et al., 2008), mientras que la región C-terminal se une específicamente a las subunidades alfa de la ficoeritrina y ficocianina de los ficobilisomas (Bienert et al., 2006). De este modo, NblA forma un complejo ternario in vivo con la chaperona ClpC y los ficobilisomas (Karradt et al., 2008). La proteína ClpC es una chaperona dependiente de ATP de la familia HSP100 (Heat Shock Protein). Esta chaperona es responsable del reconocimiento, despliegue y translocación del sustrato (ficobiliproteínas) a la proteasa Clp, encargada en última instancia de la degradación de los ficobilisomas (Karradt et al., 2008). La especificidad del sustrato puede producirse mediante la unión de la proteasa Clp a la chaperona, o como en este caso en particular, por la unión simultánea de una proteína adaptadora (NblA) al sustrato y a la chaperona. Por lo tanto, NblA modula la especificidad de la proteasa por el sustrato (ficobiliproteínas), permitiendo la degradación de éstas a la velocidad adecuada. Dicho de otro modo, NblA funciona como un adaptador de la chaperona ClpC, que guía la proteasa Clp a los ficobilisomas. Así, la regulación de los niveles de NblA constituye un mecanismo rápido y efectivo para controlar la degradación de ficobiliproteínas por la proteasa Clp sin afectar al resto de sus actividades, significando esto que la degradación de los ficobilisomas está exclusivamente regulada por la expresión de nblA (Karradt et al., 2008). Introducción 17 1.1.2.3.2. Diferenciación celular: el heterocisto En ausencia de nitrógeno combinado, algunas cianobacterias son capaces de fijar el nitrógeno atmosférico a través de la enzima nitrogenasa, un complejo multiproteico que cataliza la reducción de N2 hasta amonio en una reacción muy costosa energéticamente (Seefeldt et al., 2009). La nitrogenasa es extremadamente sensible al oxígeno, por lo que la fijación de nitrógeno y la fotosíntesis oxigénica son dos procesos incompatibles. Las cianobacterias han desarrollado distintas estrategias para proteger la maquinaria de fijación de nitrógeno frente al oxígeno (Fay, 1992; Flores y Herrero, 1994). La estrategia más común en las cianobacterias no formadoras de heterocistos es la separación temporal de los dos procesos, realizando la fotosíntesis oxigénica durante las horas de luz, y la fijación de nitrógeno atmosférico en oscuridad (Huang et al., 1999; Reade et al., 1999; Misra y Tuli, 2000). Por su parte, las cianobacterias formadoras de heterocistos llevan a cabo una separación espacial de ambos procesos mediante la diferenciación, a partir de células vegetativas, de células terminalmente diferenciadas denominadas heterocistos, en las que tiene lugar la fijación de nitrógeno, dando lugar a un organismo multicelular compuesto por dos tipos celulares interdependientes. De este modo, cada proceso queda confinado en un tipo celular, la fotosíntesis oxigénica en las células vegetativas, y la fijación de nitrógeno en los heterocistos (Figura 1.4) (Muro-Pastor y Hess, 2012). Figura 1.4. Diferenciación de heterocistos y relaciones funcionales entre heterocistos y células vegetativas. (A) Los filamentos creciendo a expensas de nitrógeno atmosférico diferencian nuevos heterocistos (triángulos blancos) entre heterocistos maduros preexistentes (triángulos negros) en un proceso que se completa en unas 24 horas (B). (C) Relaciones funcionales entre los heterocistos (fijadores de nitrógeno) y las células vegetativas (que realizan la fotosíntesis oxigénica). Imagen adaptada de (Muro-Pastor y Hess, 2012). Introducción 24 Dentro del grupo de RNAs reguladores codificados en cis también se encuentran los ribointerruptores, que como ya se ha mencionado, forman parte de la región 5´UTR de los mRNAs que regulan (Garst et al., 2011). La estructura básica de los ribointerruptores consiste fundamentalmente en dos dominios: un aptámero o domino sensor, que es reconocido por un ligando concreto, y una plataforma de expresión o dominio efector, que cambia su estructura en respuesta a dicha unión (Breaker, 2012; Serganov y Nudler, 2013). Estas modificaciones estructurales están relacionadas con variaciones en las concentraciones de los metabolitos que son detectados por estos elementos (Serganov, 2009). De este modo, la unión del ligando correspondiente al dominio sensor provoca un cambio en la estructura secundaria del dominio efector, haciendo que la transcripción o la traducción del mRNA diana se vean afectadas (Figura 1.8) (Garst et al., 2011). En ocasiones, una parada prematura en la transcripción genera un sRNA. Se ha demostrado que los sRNAs derivados de los ribointerruptores también pueden actuar en trans regulando otros genes (Loh et al., 2009). Figura 1.8. Representación esquemática de algunos mecanismos de acción de los ribointerruptores. Los ribointerruptores se componen de un aptámero (rosa) y de una plataforma de expresión (naranja) en la región 5´UTR del mRNA que regulan (azul). La unión del ligando al dominio sensor puede afectar a la transcripción o traducción del mRNA. (A) En ausencia de ligando, la plataforma de expresión asume una conformación que permite la transcripción del mRNA. Cuando el ligando se une a la región del aptámero se produce un cambio conformacional en la plataforma de expresión, que conduce a la formación de una horquilla alternativa seguida por una cadena de residuos de Us. Esta horquilla alternativa actúa como un terminador transcripcional, inhibiendo la expresión del gen. (B) En ausencia de ligando, el ribointerruptor inicialmente forma un terminador. Tras la unión del ligando, este terminador se interrumpe, lo que permite que la transcripción continúe. (C) En ausencia de ligando, el sitio de unión al ribosoma (RBS, “Ribosome Binding Site”) es accesible, pero, al unirse el ligando, es secuestrado generando una horquilla, lo que impide la traducción. (D) En ausencia de ligando, la plataforma de expresión forma una estructura secundaria que ocluye el sitio de unión al ribosoma. Cuando el ligando se une a la región del aptámero, se libera el sitio de unión al ribosoma y se inicia la traducción. Imagen adaptada de (Waters y Storz, 2009). 1.2.1.2. RNAs reguladores codificados en trans Se denominan RNAs reguladores codificados en trans aquellos que se transcriben en regiones genómicas distintas a los genes que regulan. En la mayoría de los casos se trata de sRNAs cuyo mecanismo de acción más común está basado en la interacción por complementariedad con su mRNA diana. Al transcribirse las dos especies de RNA desde Introducción 25 secuencias genómicas diferentes, las interacciones entre ambas moléculas de RNA suelen implicar regiones cortas de complementariedad discontinua (Bobrovskyy y Vanderpool, 2013), con una región de unión de 10 a 25 nucleótidos (Peer y Margalit, 2011). Como ya se ha mencionado, a pesar de que muchos RNAs reguladores codificados en trans se transcriben de forma aislada desde regiones intergénicas (Figura 1.5D), algunos derivan del procesamiento de RNAs de mayor tamaño (Figura 1.5E), y otros se generan desde las regiones 5´UTR o 3´UTR, o desde la región codificante de un mRNA (Figura 1.5F) (Miyakoshi et al., 2015; Wagner y Romby, 2015). Al contrario de lo que ocurre con la mayoría de los RNAs reguladores codificados en cis, una característica común de los RNAs reguladores codificados en trans es que suelen regular múltiples mRNAs, incluso con efectos diferentes sobre la traducción o estabilidad de cada uno de ellos. Por otro lado, un mismo mRNA puede ser regulado por diversos sRNAs en respuesta a distintas señales. Esta peculiaridad, que contribuye a su versatilidad funcional, es consecuencia directa de la hibridación imperfecta entre los sRNAs y los mRNAs a los que regulan. Por lo tanto, podría decirse que este tipo de RNAs reguladores pueden modular globalmente una respuesta fisiológica particular, de una manera muy similar a un factor de transcripción, pero a nivel postranscripcional (Gottesman y Storz, 2011). Los efectos de la interacción entre los sRNAs y sus mRNAs diana pueden tener consecuencias tanto positivas como negativas sobre la expresión génica. En muchos casos, la interacción entre el sRNA y el mRNA tiene lugar en la región 5’UTR del mRNA, cerca de o en el sitio de unión al ribosoma, afectando a la traducción del mensajero (Figura 1.9A) (Wagner y Romby, 2015). Además, el bloqueo de la traducción suele ir acompañado de un efecto negativo sobre la estabilidad del mRNA, dado que la unión del sRNA puede promover la degradación del mRNA a través del reclutamiento de RNasas, como la RNAsa E o la RNasa III (Figura 1.9B) (Waters y Storz, 2009). Sin embargo, en ocasiones la región 5´UTR de los mRNAs está estructurada de tal forma que el sitio de unión al ribosoma no está accesible. En estos casos, la unión del sRNA podría generar un cambio en la estructura secundaria del mRNA, provocando que la secuencia de unión al ribosoma quede accesible, y permitiendo el inicio de la traducción (Figura 1.9C) (Fröhlich y Vogel, 2009). Aparte de la interacción con regiones 5´UTR de transcritos monocistrónicos o del primer gen de un operón, los sRNAs también pueden reconocer secuencias complementarias en mensajeros policistrónicos para inhibir o activar selectivamente la síntesis de algunas proteínas codificadas por el operón. Es el caso por ejemplo del RNA denominado Spot42, determinante en la descoordinación de la expresión de los genes del operón galETKM de utilización de galactosa en E. coli (Møller et al., 2002). Asimismo, se han descrito casos en los que la interacción ocurre en la zona codificante o en la región 3’UTR del mRNA (Jagodnik et al., 2017). Introducción 26 Figura 1.9. Representación esquemática de algunos mecanismos de acción de los sRNAs codificados en trans. Los sRNAs codificados en trans (rojo) se transcriben en una región genómica distinta a los mRNAs que regulan (azul), y sólo presentan una complementariedad de bases limitada con los mismos. (A) La unión del sRNA a la región 5´UTR del mRNA bloquea el sitio de unión al ribosoma, impidiendo que la traducción tenga lugar. El ribosoma se representa en gris, y la región Shine-Dalgarno (SD) en verde. (B) La interacción de los dos RNAs puede dirigir una RNasa (naranja) al dúplex sRNA-mRNA y causar la degradación del mRNA. (C) El sRNA también puede tener un efecto positivo en la traducción del mRNA. En estos casos la interacción genera un cambio en la estructura secundaria del mRNA, provocando que el sitio de unión al ribosoma quede accesible, y permitiendo el inicio de la traducción. Imagen adaptada de (Waters y Storz, 2009). Además de estos mecanismos de acción, se han descrito sRNAs que pueden actuar uniéndose a proteínas reguladoras, evitando que éstas lleven a cabo su función. En este caso, el sRNA contiene secuencias que mimetizan el sitio de unión de la proteína reguladora a una molécula de RNA, de forma que es capaz de secuestrar al regulador, y evitar que éste se una a la secuencia de RNA donde ejercería su función. Un ejemplo de este mecanismo de acción son los sRNAs CrcZ y CrcY en Pseudomonas putida, que secuestran al regulador Crc. La proteína Crc es un represor traduccional que reconoce una secuencia específica en algunos mRNAs y evita su traducción. En condiciones de represión catabólica los niveles de CrcZ y CrcY son muy bajos, por lo que queda disponible suficiente Crc para bloquear la traducción de los genes implicados en el catabolismo de las fuentes de carbono no preferenciales. Por el contrario, en ausencia de represión catabólica los niveles de CrcZ y CrcY aumentan y secuestran a Crc, permitiendo de este modo la expresión de los genes implicados en el consumo de fuentes de carbono no preferenciales (Moreno et al., 2012). En algunas bacterias como E. coli, la función de muchos RNAs reguladores codificados en trans depende de la proteína de unión a RNA Hfq, que facilita y estabiliza la interacción discontinua entre los sRNAs y sus dianas (Waters y Storz, 2009; Updegrove et al., 2016), mientras que los sRNAs codificados en cis no requieren, generalmente, la intervención de Hfq para interaccionar con su diana (Brantl, 2007). No todas las bacterias codifican la proteína Hfq (Sun Introducción 27 et al., 2002), aunque recientemente se han identificado otras proteínas con funciones análogas a Hfq con un papel global en la interacción con sRNAs (Pandey et al., 2011; Attaiech et al., 2017; Holmqvist y Vogel, 2018). Estudios recientes han mostrado que las proteínas que contienen un dominio ProQ/FinO constituyen una nueva clase de chaperonas de RNA que podrían desempeñar un papel clave en la regulación génica postranscripcional en la mayoría de las especies bacterianas (Attaiech et al., 2017; Olejniczak y Storz, 2017). Un ejemplo muy bien descrito de este grupo de proteínas es ProQ, una proteína de unión a RNA de tipo FinO, que fue identificada mediante Grad-Seq (gradient profiling by sequencing) en Salmonella enterica (Smirnov et al., 2016). Esta proteína conservada de unión a RNA reconoce sus dianas a través de motivos estructurales encontrados en sRNAs y en el extremo 3´de los mRNAs (Holmqvist et al., 2018). En Nostoc sp. PCC 7120 se ha demostrado que la ausencia de Hfq afecta a la asimilación de nitrato (Puerta-Fernández y Vioque, 2011), si bien el mecanismo de esta regulación, como la capacidad de Hfq para regular la expresión de genes mediante la interacción con sRNAs es desconocida. Además, en Synechocystis sp. PCC 6803 se ha demostrado que la ausencia de Hfq afecta a la motilidad (Dienst et al., 2008). Un análisis de las estructuras cristalinas de las proteínas Hfq de Nostoc sp. PCC 7120 y Synechocystis sp. PCC 6803 reveló que las Hfq cianobacterianas son bastante similares en estructura a otras proteínas Hfq bacterianas conocidas, a pesar de que carecen de varios elementos de secuencia clave. Las Hfq cianobacterianas poseen una variante de sitios de unión a RNA, presentando in vitro una afinidad significativamente menor por los sRNAs de E. coli conocidos, y no siendo capaces de mediar in vivo la regulación dependiente de Hfq en E. coli (Bøggild et al., 2009). En cuanto a la interacción de los RNAs reguladores codificados en trans con sus mRNAs diana, se han descrito elementos en la estructura y la secuencia de los sRNAs que afectan a la interacción con sus dianas. La gran mayoría de este tipo de sRNAs contiene una región 3´UTR estructurada seguida de una secuencia de múltiples uracilos (poli U), lo cual promueve una terminación de la transcripción independiente de Rho, y protege al sRNA frente a 3’-exonucleasas. En los sRNAs que interaccionan con Hfq, el domino de unión a la misma suele coincidir con regiones ricas en As/Us próximas a esta estructura terminadora. Además, aunque las interacciones entre sRNAs y mRNAs diana implican complementariedad en regiones cortas y discontinuas, siempre suele haber un segmento de 6-7 pares de bases (pb) consecutivos que se denomina seed (Storz et al., 2011). Cabe destacar que la hibridación en la región seed contribuye a que se mantenga la especificidad regulatoria, ya que un solo cambio en dicha secuencia podría afectar a la unión con el mRNA (Papenfort et al., 2012). Curiosamente, la región seed de muchos sRNAs se localiza cerca de su extremo 5’ (Guillier y Gottesman, 2008; Papenfort et al., 2010), lo cual sugiere que esta zona 5´ podría ser relevante para la función de los sRNAs. Introducción 28 1.2.2. Métodos de identificación de RNAs reguladores y sus dianas Hasta la década de los noventa los pocos RNAs reguladores conocidos se habían encontrado de forma fortuita debido a su abundancia o a la aparición de fenotipos asociados a la sobreexpresión de los mismos. En los primeros años de este siglo, las búsquedas globales computacionales basadas en la predicción de señales de transcripción o en patrones de conservación de secuencias en regiones intergénicas, permitieron la identificación de posibles sRNAs reguladores en E. coli (Argaman et al., 2001; Rivas et al., 2001). Sin embargo, las herramientas bioinformáticas disponibles en aquel entonces presentaban una alta tasa de falsos positivos (Richter y Backofen, 2012). Posteriormente han ido surgiendo nuevas alternativas para la identificación de RNAs reguladores, como las búsquedas computacionales sistemáticas, o la detección directa utilizando técnicas basadas en clonación o en microarrays con sondas en regiones intergénicas (Altuvia, 2007; Livny y Waldor, 2007), que permitieron el descubrimiento de nuevos RNAs reguladores. La creciente disponibilidad de secuencias de genomas bacterianos, así como la aplicación de nuevas tecnologías al análisis del transcriptoma, fundamentalmente RNA-Seq, han permitido recientemente la predicción e identificación de cientos de posibles RNAs reguladores en bacterias (Sorek y Cossart, 2010; Sharma y Vogel, 2014), así como de sus mRNAs diana. De entre todos los métodos para la predicción e identificación de RNAs reguladores, una variante del RNA-Seq, denominada RNA-Seq diferencial (dRNA-Seq) (Sharma y Vogel, 2014), que permite la identificación precisa de todos los sitios de inicio de la transcripción (TSS), ha demostrado ser un enfoque muy exitoso. La metodología dRNA-Seq incluye el tratamiento de las muestras de RNA con la exonucleasa TEX (Terminator 5ʹ-Phosphate-dependent Exonuclease), que es específica de extremos 5’-monofosfato eliminando aquellos RNAs que no son transcritos primarios. De este modo, las lecturas de secuenciación obtenidas corresponden sólo a transcritos con extremos 5’-trifosfato, es decir, extremos primarios no procesados. Así, y a diferencia de lo que ocurre en los procedimientos convencionales de RNA-Seq, el resultado proporciona información precisa sobre los TSS, y en consecuencia sobre las secuencias promotoras de cada transcrito, incluyendo todos los transcritos que no están asociados a zonas codificantes. Este acercamiento es además muy valioso para el análisis de transcriptomas complejos, como el de Nostoc sp. PCC 7120 (Mitschke et al., 2011b), un organismo en el que coexisten en los filamentos dos tipos celulares (células vegetativas y heterocistos). Como se ha mencionado, las interacciones de los RNAs reguladores codificados en trans con sus dianas tienen lugar en segmentos cortos y discontinuos, lo que dificulta la identificación de los posibles mRNAs diana mediante medios predictivos (Bobrovskyy y Vanderpool, 2013). Introducción 29 Así pues, la identificación de dianas debe abordarse mediante una combinación de metodologías. Uno de los acercamientos más avanzados está basado en predicciones computacionales realizadas con el algoritmo CopraRNA (Wright et al., 2013; Wright et al., 2014), que analiza las posibles interacciones de un sRNA con todo el transcriptoma de un organismo. Este algoritmo implementa información relativa a la conservación filogenética del sRNA y de sus posibles dianas en organismos relacionados, y combina las predicciones con homólogos de otros organismos. Además, CopraRNA tiene en cuenta el plegamiento de ambas moléculas y la energía de hibridación en la predicción de la zona de interacción. Alternativamente, se puede realizar un análisis transcriptómico de estirpes con niveles alterados del sRNA en cuestión, ya sea por mutación o sobreexpresión. La comparación de los niveles de mRNAs en una estirpe silvestre y en una estirpe que carece del sRNA o que lo sobreexpresa, puede sugerir que algunos de los cambios observados sean atribuibles a una posible interacción entre el sRNA y los correspondientes mRNAs. Cualquier predicción, en todo caso, debe ser verificada experimentalmente mediante metodologías adicionales. Por otro lado, recientemente se han desarrollado diversos métodos para la identificación directa in vivo de dianas. Entre estas técnicas se incluye MAPS (MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing), un protocolo basado en la purificación de sRNAs etiquetados con MS2 mediante cromatografía de afinidad por MS2, y que combinado con análisis de RNA-Seq ha permitido ensamblar los “targetomas” completos de algunos sRNAs bacterianos (Carrier et al., 2016). Otro acercamiento para la identificación directa in vivo de dianas es GRIL-Seq (Global sRNA Target Identification by Ligation and Sequencing), una metodología basada en la ligación preferencial de los sRNAs con los extremos de sus mRNAs diana en bacterias que coexpresan la RNA ligasa del bacteriófago T4, seguida posteriormente de secuenciación para identificar las quimeras formadas por la ligación del sRNA al mRNA diana (Han et al., 2016). 1.2.3. RNAs reguladores en cianobacterias 1.2.3.1. Identificación de RNAs reguladores en cianobacterias Los acercamientos globales para la identificación de secuencias que pudieran codificar RNAs reguladores en los genomas de cianobacterias se han llevado a cabo mediante procedimientos que incluyen la predicción computacional seguida de validación experimental (Axmann et al., 2005; Voß et al., 2009; Ionescu et al., 2010; Brenes-Álvarez et al., 2016), el análisis de microarrays (Steglich et al., 2008; Georg et al., 2009; Gierga et al., 2012) o la secuenciación global de transcriptomas (RNA-Seq) (Mitschke et al., 2011a; Mitschke et al., 2011b; Voß et al., 2013; Pfreundt et al., 2014). Introducción 30 Al igual que en otros grupos de bacterias, en los transcriptomas de cianobacterias analizados hasta ahora, entre las que se incluyen las cianobacterias modelo unicelulares Synechocystis sp. PCC 6714 (Kopf et al., 2014a; Kopf et al., 2014c), Synechocystis sp. PCC 6803 (Mitschke et al., 2011a; Billis et al., 2014; Kopf et al., 2014b), Synechococcus elongatus sp. PCC 7942 (Vijayan et al., 2011; Billis et al., 2014), o la cianobacteria formadora de heterocistos Nostoc sp. PCC 7120 (Flaherty et al., 2011; Mitschke et al., 2011b), así como especies particularmente relevantes en entornos naturales, como Trichodesmium erythraeum (Pfreundt et al., 2014), Nodularia spumigena CCY9414 (Voß et al., 2013; Kopf et al., 2015), Synechococcus marino (Gierga et al., 2012) o Prochlorococcus (Steglich et al., 2008; Thompson et al., 2011; Waldbauer et al., 2012; Voigt et al., 2014), la transcripción no codificante representa más del 10% de los promotores activos. En nuestro laboratorio se había llevado a cabo un análisis transcriptómico en Nostoc sp. PCC 7120, realizado mediante dRNA-Seq, proporcionando información relativa a todos los TSS del genoma, así como de su dinámica de uso en respuesta a la deficiencia de nitrógeno combinado (Mitschke et al., 2011b). Debido a que la adaptación a la deficiencia de nitrógeno incluye en este organismo la diferenciación de heterocistos, se comparó el transcriptoma tras 8 horas en ausencia de nitrógeno combinado con el transcriptoma en presencia de amonio, tanto en la estirpe silvestre Nostoc sp. PCC 7120 como en un mutante hetR, incapaz de diferenciar heterocistos. De este modo, se definieron dos categorías principales de transcritos cuya expresión responde a la disponibilidad de nitrógeno, aquellos que dependen exclusivamente de NtcA, el regulador global de la asimilación de nitrógeno, y aquellos que dependen adicionalmente de HetR, el regulador específico de la diferenciación de heterocistos (Mitschke et al., 2011b). A partir de estos datos de dRNA-Seq se pueden identificar posiciones intergénicas cuya transcripción exhibe una clara regulación en respuesta a la carencia de nitrógeno combinado. La conservación filogenética de las secuencias que se transcribirían desde estas posiciones, así como la conservación de sus secuencias promotoras, sugiere en algunos casos que podría tratarse de RNAs reguladores funcionales. La regulación de la transcripción de estos posibles RNAs reguladores en función de la disponibilidad de nitrógeno sugiere que algunos de ellos podrían estar implicados en la regulación de la respuesta general de adaptación a la deficiencia de nitrógeno o específicamente en la diferenciación de heterocistos. También en nuestro laboratorio se ha diseñado una estrategia computacional que permite la identificación global de secuencias que pudieran transcribirse como sRNAs conservados filogenéticamente en cianobacterias (Brenes-Álvarez et al., 2016). Este estudio combina la información transcriptómica previa disponible en Nostoc sp. PCC 7120 (Mitschke et al., 2011b), con una predicción de terminadores independientes de Rho, y un Introducción 31 análisis filogenético de 89 genomas cianobacterianos (27 de ellos correspondientes a estirpes formadoras de heterocistos). El análisis filogenético muestra que alguno de los sRNAs predichos por el algoritmo presenta una distribución universal en todos los genomas cianobacterianos, mientras que otros están conservados únicamente en los genomas de cianobacterias con capacidades concretas, como la diferenciación de heterocistos, por lo que estos sRNAs podrían estar asociados a la regulación de dichas funciones (Brenes-Álvarez et al., 2016). 1.2.3.2. Procesos regulados por RNAs en cianobacterias A diferencia de los mecanismos de regulación empleados por RNAs reguladores bien descritos desde hace años en enterobacterias, como E. coli o Salmonella (Papenfort y Vogel, 2014; Kopf y Hess, 2015), se desconocen todavía la mayoría de las funciones asociadas a este tipo de moléculas en cianobacterias (Kopf y Hess, 2015). Uno de los primeros RNAs reguladores descritos en cianobacterias fue el asRNA identificado en Nostoc sp. PCC 7120 para el gen furA (all1691), que se transcribe entre sigC y alr1690 desde la hebra complementaria (Hernández et al., 2006). Este asRNA se origina por la transcripción de alr1690, que se extiende a secuencias complementarias a furA, y participa en su regulación postranscripcional contribuyendo a determinar los niveles celulares de la proteína FurA, una proteína autorregulada cuya expresión aumenta ligeramente en deficiencia de hierro (Hernández et al., 2006). Entre otras funciones, en Nostoc sp. PCC 7120 se ha demostrado que FurA está involucrada en la regulación de la expresión de isiA, cuyo producto participa en la respuesta a la deficiencia de hierro (Leonhardt y Straus, 1994), y que también está regulado a nivel postranscripcional por un asRNA en Synechocystis sp. PCC 6803 (ver más adelante) (Dühring et al., 2006). Más recientemente, se han descrito en cianobacterias algunos ejemplos de regulación postranscripcional mediada por este tipo de moléculas en el contexto de procesos clave como la fotosíntesis (Wilde y Hihara, 2016), o la asimilación de nitrógeno, el aspecto del metabolismo en el que se centra esta Tesis Doctoral. En la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC 6803 se ha descrito un sRNA implicado en el control de la fotosíntesis, PsrR1 (photosynthesis regulatory RNA 1). La transcripción de este sRNA se induce en condiciones de alta intensidad de luz (Georg et al., 2014). La interacción de este sRNA con los mRNAs de psaL, psaJ, chlN y cpcA tiene lugar en las regiones de unión al ribosoma. Se ha caracterizado específicamente el efecto de PsrR1 sobre el mRNA de psaL, que codifica la subunidad XI del fotosistema I. De este modo, en intensidades elevadas de luz se reduce la acumulación del mRNA de psaL, que es procesado por la RNasa E en presencia de Introducción 32 PsrR1 (Georg et al., 2014). En un estudio posterior se demostró que PsrR1 participa, a nivel postranscripcional, en un circuito de regulación de la respuesta a situaciones cambiantes de luz (Kadowaki et al., 2016). En condiciones de baja intensidad lumínica, el regulador transcripcional RpaB activa de forma directa la expresión de los genes del fotosistema I y se une a la región promotora de PsrR1, provocando una disminución de la expresión de psrR1. No obstante, la activación de los genes del fotosistema I y la unión con PsrR1 no tiene lugar en condiciones de alta intensidad lumínica, por lo que se produce una acumulación de moléculas de PsrR1, cuya función es evitar la traducción de los transcritos de los genes del fotosistema I preexistentes. De este modo, RpaB y PsrR1 constituyen un circuito regulador coherente de tipo IV (Figura 1.6). Mediante esta doble represión a nivel transcripcional (mediada por RpaB) y postranscripcional (mediada por PsrR1), se garantiza una regulación rápida y estricta del contenido del fotosistema I bajo situaciones cambiantes de luz (véase Figura 4.1 en el apartado Discusión) (Kadowaki et al., 2016). Además, en Synechocystis sp. PCC 6803 también se ha descrito un sRNA ampliamente conservado en cianobacterias, cuya expresión está inversamente correlacionada con la intensidad lumínica. Este sRNA, inicialmente denominado Ncr0700, y actualmente renombrado como PmgR1 (photomixotrophic growth RNA 1), es necesario para el crecimiento fotomixotrófico y la regulación de la acumulación de glucógeno (de Porcellinis et al., 2016). En Synechocystis sp. PCC 6803 también se han descrito varios asRNAs implicados en la regulación de la fotosíntesis. Se ha caracterizado el asRNA IsrR (iron stress-repressed RNA), cuya transcripción se reprime en condiciones de deficiencia de hierro. Este asRNA se acumula en presencia de hierro en el medio, interaccionando con la región codificante del transcrito isiAB, y provocando una disminución de los niveles de transcrito isiA, que codifica la proteína IsiA (iron stress-induced protein A). Esta proteína participa en la respuesta a la deficiencia de hierro formando una estructura de anillo alrededor del fotosistema I (Dühring et al., 2006). Otro asRNA que actúa negativamente en Synechocystis sp. PCC 6803 es As1-flv4, que previene la expresión prematura del operón flv4-2 ante un cambio en el suministro de carbono inorgánico (Eisenhut et al., 2012). Las proteínas codificadas por el operón flv4-2 tienen una función fundamental en la fotoprotección del fotosistema II contra el estrés oxidativo (Zhang et al., 2012). Por el contrario, dos asRNAs, PsbA2R y PsbA3R, parecen tener una función reguladora positiva, al proteger las secuencias 5´UTR de los genes psbA2 y psbA3 de la degradación prematura por la RNasa E (Sakurai et al., 2012). Introducción 33 En cianobacterias también se han identificado varios sRNAs regulados por la disponibilidad de nitrógeno, como NsiR4 (nitrogen stress induced RNA 4) en Synechocystis sp. PCC 6803 (Kopf et al., 2014b), o NsiR1, NsiR2, NsiR3 y NsrR1 (nitrogen stress repressed RNA 1) en Nostoc sp. PCC 7120 (Ionescu et al., 2010; Mitschke et al., 2011b; Brenes-Álvarez et al., 2016; Álvarez-Escribano et al., 2018). Se ha descrito que NsiR4 está directamente involucrado, a nivel postranscripcional, en la regulación de la asimilación primaria de nitrógeno a través de la glutamina sintetasa (Klähn et al., 2015). Esta enzima está estrechamente regulada, y en cianobacterias su actividad se controla mediante la interacción con los factores inactivantes IF7 e IF17, codificados por los genes gifA y gifB respectivamente (García-Domínguez et al., 1999). La transcripción de NsiR4 se induce fuertemente en respuesta a la carencia de nitrógeno combinado, y está mediada por NtcA. Se ha demostrado que NsiR4 interacciona con la región 5´UTR del mRNA de gifA. La interacción con esta región del mRNA dificulta el acceso del ribosoma a la región de inicio de la traducción, provocando una reducción de la expresión de IF7, lo que, por extensión, afecta a la actividad de la glutamina sintetasa, cuya regulación transcripcional también depende directamente de NtcA. De este modo, NtcA y NsrR1 constituyen un circuito regulador coherente de tipo IV (Figura 1.6), que involucra a NtcA como el regulador principal, y a NsiR4, que constituye un nuevo elemento en el esquema de regulación de la actividad glutamina sintetasa (véase Figura 4.1 en el apartado Discusión), una enzima clave para el control de la asimilación de nitrógeno (Klähn et al., 2015). Además, recientemente se ha caracterizado un ribointerruptor de glutamina en Synechocystis sp. PCC 6803 que ha resultado ser otro elemento clave para la regulación de la actividad glutamina sintetasa (Klähn et al., 2018). En dicho trabajo se ha demostrado que un aptámero de unión a glutamina en la región 5´UTR de gifB es crítico para la expresión de IF17. La unión de glutamina induce cambios estructurales en la plataforma de expresión de este ribointerruptor, que derivan en aumento en los niveles de IF17. Los análisis bioinformáticos han revelado que los ribointerruptores de glutamina se encuentran de forma exclusiva, aunque frecuente, en los genomas cianobacterianos, asociados principalmente con homólogos de gifB. Así, este mecanismo común en las cianobacterias establece un complejo circuito regulador de retroalimentación, que acopla la inactivación de la actividad glutamina sintetasa, mediada por IF17, a los niveles de glutamina intracelular. Estas observaciones, junto con el mecanismo de acción de NsiR4 descrito anteriormente, muestran que la regulación mediada por RNAs reguladores es un componente importante en el control de la asimilación de nitrógeno en cianobacterias (Klähn et al., 2018). 2. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 43 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Organismos y condiciones de cultivo 2.1.1. Cianobacterias 2.1.1.1. Estirpes de cianobacterias utilizadas El material biológico de estudio utilizado en este trabajo ha sido la cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos Nostoc sp. PCC 7120 (=Anabaena sp. PCC 7120). También se han empleado diversas estirpes derivadas de Nostoc sp. PCC 7120 que han sido generadas durante este trabajo, o que estaban disponibles en la colección del laboratorio (Tabla 2.1). Tabla 2.1. Estirpes derivadas de Nostoc sp. PCC 7120. Estirpe Descripción Resistencia Referencia CSE2 ntcA::CS3 Sm Sp (Frías et al., 1994) 216 hetR (S179N) - (Buikema y Haselkorn, 1991) ΔnsiR3 Estirpe que carece de nsiR3 generada por doble recombinación tras la integración del plásmido pELV17 en la región de nsiR3. - E. Olmedo-Verd (nuestro laboratorio) ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3 Estirpe en la que, tras la integración del plásmido pIAE24 en un fondo ΔnsiR3, nsiR3 se expresa bajo el control del promotor inducible por cobre del gen de la plastocianina (PpetE). Sm Sp Este trabajo ΔnsrR1 Estirpe que carece de nsrR1 generada por doble recombinación tras la integración del plásmido pSAM325 en la región de nsrR1. - (Álvarez-Escribano et al., 2018) ΔnsrR1 + PpetE::nsrR1 Estirpe en la que, tras la integración del plásmido pIAE17 en un fondo ΔnsrR1, nsrR1 se expresa bajo el control del promotor inducible por cobre del gen de la plastocianina (PpetE). Sm Sp (Álvarez-Escribano et al., 2018) all1871::CK3 Estirpe en la que la parte central del marco abierto de lectura del gen all1871 ha sido delecionada y sustituida por la casete CK3, que confiere resistencia a neomicina, tras la integración del plásmido pSAM326. Nm Este trabajo all1871::CK3 + Ptrc::all1871 Estirpe en la que, tras la integración del plásmido pIAE65 en la región nucA-nuiA (all7362-alr7361) del plásmido alfa de la estirpe all1871::CK3, all1871 se expresa bajo el control del promotor trc diseñado para E. coli (Amann et al., 1988). Sm Sp Nm Este trabajo all1871::gfp Estirpe en la que, tras la integración del plásmido pELV75, se expresa una fusión traduccional de all1871 con el gen gfp-mut2. Sm Sp Este trabajo Las resistencias a los distintos antibióticos se indican como Sm (estreptomicina), Sp (espectinomicina) y Nm (neomicina). Materiales y Métodos 44 2.1.1.2. Medios y condiciones de cultivo Las cianobacterias se cultivaban en condiciones axénicas en medio BG11* (* véase recetario, página 83) (Rippka et al., 1979). Este medio de cultivo se preparaba a partir de una disolución 100 veces concentrada que contiene todos los componentes excepto el K2HPO4, que se añadía antes de autoclavar el medio a una concentración final de 0,2 mM, y la fuente de nitrógeno. Como fuentes de nitrógeno se utilizaban NaNO3 a una concentración final de 17,6 mM, o NH4Cl a una concentración final de 3 mM en medio sólido, 4 mM en medio líquido, o 6 mM cuando las células se cultivaban en medio líquido burbujeando con una mezcla de aire enriquecida en CO2 al 1% (v/v). En los casos en los que se incluía NH4Cl como fuente de nitrógeno, el medio se tamponaba con TES-NaOH (pH 7,5) a una concentración final del doble de la usada para el NH4Cl. Las disoluciones de NH4Cl y TES-NaOH se esterilizaban mediante filtración, y se añadían al medio después de que éste hubiera sido autoclavado. Las células se cultivaban a 30°C bajo iluminación continua de intensidad 75 μE·m-2·s-1 en distintos formatos. Para cultivos líquidos que no requerían del aporte de CO2, se utilizaban matraces Erlenmeyer de 100 ml de capacidad conteniendo 30 ml de cultivo con agitación orbital continua a 100 rpm. Los cultivos burbujeados con una mezcla estéril de aire enriquecida en CO2 al 1% (v/v) se llevaban a cabo en cilindros de vidrio de 240 ml de capacidad conteniendo 180 ml de cultivo, o en frascos de Roux de 900 ml de capacidad conteniendo 800 ml de cultivo. En estas condiciones, el medio se suplementaba además con NaHCO3 a una concentración final de 10 mM. Para los cultivos en medio sólido se añadía al medio Bacto-agar (Difco) al 1% (p/v), esterilizado en autoclave separadamente de los nutrientes, y mezclado con los mismos antes de verter en cajas de Petri. Los cultivos en caja de Petri se incubaban a 30°C con iluminación superior continua de intensidad 30 μE·m-2·s-1. En caso de ser necesaria la presencia de antibióticos en el medio, éstos se suplementaban a las siguientes concentraciones finales: estreptomicina (Sm) 2 μg·ml-1 en medio líquido y 5 μg·ml-1 en medio sólido; espectinomicina (Sp) 2 μg·ml-1 en medio líquido y 5 μg·ml-1 en medio sólido; neomicina (Nm) 5 μg·ml-1 en medio líquido y 25 μg·ml-1 en medio sólido. Todos los antibióticos se esterilizaban previamente por filtración. Para cultivar las estirpes mutantes de Nostoc sp. PCC 7120 en las que se expresan distintos genes bajo el control del promotor de petE, un promotor inducible por cobre, se usaba una versión modificada del medio BG11*, denominada BG11-Cu2+, que carece de sales de cobre. Este medio se preparaba con agua ultrapura a partir de un concentrado de sales sin cobre. Para inducir la transcripción desde el promotor de petE, se añadía 1,5 µM de CuSO4 al medio. Materiales y Métodos 45 2.1.1.3. Métodos de recogida y lavado de células Las células de Nostoc sp. PCC 7120 o de las estirpes mutantes derivadas se recogían mediante centrifugación a temperatura ambiente en una centrífuga Eppendorf modelo 5804-R a 4.000 rpm durante 5 minutos cuando se trataba de volúmenes inferiores a 50 ml. Para cultivos de mayor volumen, las células se recogían mediante filtración por vacío a través de filtros de nitrocelulosa de 0,45 μm de diámetro de poro (Millipore HA). Cuando por razones experimentales se requería transferir las células a un medio suplementado con una fuente de nitrógeno diferente a la utilizada para su cultivo, las células recogidas mediante alguno de los métodos descritos anteriormente se lavaban con medio BG11* carente de fuente nitrogenada (BG110). En el caso de las células recogidas por centrifugación, éstas se resuspendían en medio BG110, se centrifugaban y se descartaba el sobrenadante, repitiéndose el proceso dos veces. Las células recogidas por filtración se lavaban en el filtro haciendo pasar por el mismo el doble del volumen de cultivo de medio BG110. 2.1.1.4. Experimentos de inducción del desarrollo de heterocistos El desarrollo de heterocistos se inducía mediante la eliminación de la fuente de nitrógeno combinado del medio de cultivo en el que estuviesen creciendo las cianobacterias. En este tipo de experimentos, las células de Nostoc sp PCC 7120 o de las estirpes mutantes derivadas se cultivaban a 30°C en presencia de NH4Cl 6 mM y TES-NaOH 12 mM (pH 7,5), con los antibióticos correspondientes, en condiciones de gaseo con una mezcla de aire enriquecida en CO2 al 1% (v/v), y bajo iluminación continua de intensidad 75 μE·m-2·s-1. Cuando el cultivo alcanzaba 3-6 µg Chl·ml-1, se recogía una muestra de 50 ml de células, que correspondía al tiempo 0 horas. A continuación, el resto de células del cultivo se recogían por filtración a temperatura ambiente, se lavaban con medio BG110, y se reinoculaban en un volumen de BG110, suplementado con NaHCO3 10 mM, similar al volumen del que procedían. Posteriormente, se recogían muestras de 50 ml a varios tiempos hasta alcanzar las 24 horas, tiempo en el que el proceso de diferenciación de heterocistos se ha completado en estas condiciones de laboratorio. Materiales y Métodos 46 2.1.2. Escherichia coli 2.1.2.1. Estirpes de Escherichia coli utilizadas Las estirpes de Escherichia coli (E. coli) empleadas en este trabajo y las características más relevantes de su genotipo se muestran en la Tabla 2.2. Tabla 2.2. Estirpes de E. coli utilizadas. Estirpe Genotipo Referencia DH5α F- supE44 hsdR17 (rk-mk+) recA1 girA96 (Nalr) endA1 thi-1 relA1 D(lacZYA-argF) (Æ80lacZ D M15) U169. (Hanahan, 1983) BL21-(DE3)-RIL E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU ileY leuW CmR] Agilent Technologies HB101 F- hsdS20(rB-mB-) leu supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 recA13 mcrB. (Boyer y Roulland- Dussoix, 1969) ED8654 lac-3 o lacY1 supE44 supF58 hsdR514 (rkmk-) recA56 mcrA1 metB1 lacY galk2 galT22 trpR55. (Murray et al., 1977) 2.1.2.2. Medios y condiciones de cultivo Las estirpes de E. coli se cultivaban en medio rico Luria-Bertani (LB*) (Sambrook y Russell, 2001). Para la preparación de medio sólido se añadía agar a una concentración final de 1,5% (p/v). El medio se esterilizaba en autoclave. Para cultivos líquidos a pequeña escala se utilizaban tubos de 20 ml de capacidad conteniendo 3 ml de cultivo, y se incubaban a 37°C con agitación orbital a 200 rpm. Por su parte, los cultivos en medio sólido se incubaban a 37°C en cajas de Petri. En caso de ser necesaria la presencia de antibióticos en el medio, éstos se suplementaban a las siguientes concentraciones finales: estreptomicina (Sm) 25 μg·ml-1, espectinomicina (Sp) 100 μg·ml-1, kanamicina (Km) 50 μg·ml-1, ampicilina (Ap) 50 μg·ml-1 y cloranfenicol (Cm) 30 μg·ml-1. 2.1.2.3. Métodos de recogida y lavado de células Para la recogida de volúmenes hasta 1,5 ml, las células se centrifugaban en una microcentrífuga Labnet modelo spectrafuge-24D a 13.000 rpm durante un minuto. Para volúmenes de 1,5 a 50 ml, las células se centrifugaban en una centrífuga Eppendorf modelo 5804-R a 4.000 rpm durante 5 minutos, y para volúmenes superiores a 50 ml se utilizaba la centrifuga Beckman Coulter Avanti J-25 con rotor JA 25.50 a 6.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado de células obtenido se lavaba varias veces con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se procesaba inmediatamente, o se congelaba en nitrógeno líquido y se guardaba a -20°C. Materiales y Métodos 47 2.2. Métodos de manipulación y análisis de DNA 2.2.1. Plásmidos utilizados 2.2.1.1. Plásmidos no construidos en este trabajo En este trabajo se han utilizado una serie de plásmidos que no han sido generados durante el desarrollo del mismo (Tabla 2.3). Tabla 2.3. Plásmidos utilizados no construidos en este trabajo. Plásmido Descripción Resistencia Referencia pAVN1 Fragmento de DNA conteniendo nsrR1, obtenido por PCR con los cebadores 197 y 198 (véase Tabla 2.5), digerido con XbaI, y clonado en pZE12-luc. Ap (Álvarez-Escribano et al., 2018) pCSRO Vector movilizable derivado de pCSV3 conteniendo el gen sacB de Bacillus subtilis. Sm Sp (Merino-Puerto et al., 2010) pCSV3 Vector movilizable por conjugación. Sm Sp (Olmedo-Verd et al., 2006) pELV16 Fragmento de DNA conteniendo un segmento de la región de nsiR3 con nsiR3 delecionado, obtenido por PCR con los cebadores 127 y 128, y clonado en pSpark. La deleción de nsiR3 se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador” (apartado 2.2.6.2), utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 127 y 128, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 129 y 130. Ap E. Olmedo-Verd (nuestro laboratorio) pELV17 Fragmento de DNA conteniendo un segmento de la región de nsiR3 con nsiR3 delecionado, obtenido por digestión de pELV16 con BamHI, y clonado en pCSRO digerido con la misma enzima. Sm Sp E. Olmedo-Verd (nuestro laboratorio) pELV73 Plásmido derivado de pCSAM147 (Muro-Pastor et al., 2009), un derivado de pCSEL21 (Olmedo-Verd et al., 2006), en el que se ha clonado entre los sitios únicos ClaI y EcoRV un fragmento de 700 pb (amplificado utilizando los oligonucleotidos 451 y 596) que comprende desde la posición –200 con respecto al TSS de all1871 hasta el último codón de este gen que fue sustituido por el sitio de restricción EcoRV, quedando la traducción de All1871 en fase con la proteína GFPmut2. Ap E. Olmedo-Verd (nuestro laboratorio) pELV75 Plásmido movilizable derivado de pCSV3, conteniendo en el sitio único EcoRI la fusión de all1871 con el gen gfp-mut2 de pELV73. Sm Sp E. Olmedo-Verd (nuestro laboratorio) pET-28a(+) Vector para la expresión de proteínas con etiquetas de histidinas. Km Novagen pJV300 Plásmido de bajo número de copias derivado de pZE12-luc, a partir del que se transcribe un RNA de 50 nucleótidos. Ap (Sittka et al., 2007) pMBA37 Plásmido derivado de pCSEL24 (Olmedo-Verd et al., 2006), para la expresión de transcritos desde el promotor trc (Amann et al., 1988). Contiene sitios únicos NsiI y XhoI, para clonación, seguidos del terminador T1 del gen rrnB de E. coli. Este plásmido contiene aproximadamente 2 kb de DNA de la región nucA-nuiA (all7362-alr7361) del plásmido alfa de Nostoc sp. PCC 7120. Todos los plásmidos derivados de pCSEL24 se integran en el plásmido alfa mediante recombinación homóloga. ApSmSp M. Brenes-Álvarez (nuestro laboratorio) Materiales y Métodos 48 Plásmido Descripción Resistencia Referencia pRL278 Vector movilizable por conjugación utilizado para la selección positiva de dobles recombinantes en Nostoc sp. PCC 7120. Contiene el gen sacB de Bacillus subtilis. Km (Black et al., 1993) pRL443 Plásmido conjugativo de amplio espectro, derivado de RP4, capaz de movilizar plásmidos derivados de ColE1. Ap (Elhai y Wolk, 1988a) pRL623 Vector derivado de ColK, portador de los genes mob y los genes de metilasas que metilan sitios AvaI, AvaII y AvaIII. Cm (Elhai et al., 1997) pSAM221 Plásmido replicativo en Nostoc sp. PCC 7120 derivado de pSAM200 (Ionescu et al., 2010). Contiene un polylinker con sitios únicos ClaI y XhoI insertado en el único sitio EcoRI de pSAM200. Sm Sp (Álvarez-Escribano et al., 2018) pSAM303 Plásmido derivado de pCSEL24 (Olmedo-Verd et al., 2006), conteniendo sitios únicos EcoRI, ClaI, XhoI y SacI. Este plásmido contiene aproximadamente 2 kb de DNA de la región nucA-nuiA (all7362-alr7361) del plásmido alfa de Nostoc sp. PCC 7120. Todos los plásmidos derivados de pCSEL24 se integran en el plásmido alfa mediante recombinación homóloga. Ap Sm Sp A.M. Muro-Pastor (nuestro laboratorio) pSAM318 Plásmido conteniendo un segmento de la región de all1871 con la parte central del gen all1871 delecionada, obtenido por PCR con los cebadores 162 y 165, y clonado en pSpark. La deleción de la parte central de all1871 se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador”, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 162 y 165, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 163 y 164, que generan un sitio único XhoI. Ap A.M. Muro-Pastor (nuestro laboratorio) pSAM319 Plásmido conteniendo un segmento de la región de nsrR1 con nsrR1 delecionado, obtenido por PCR con los cebadores 170 y 173, y clonado en pSpark. La deleción de nsrR1 se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador”, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 170 y 173, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 171 y 172. Ap (Álvarez-Escribano et al., 2018) pSAM324 Plásmido conteniendo un segmento de la región de all1871 con la parte central del gen all1871 delecionada, obtenido por digestión de pSAM318 con BamHI, y clonado en pCSRO digerido con la misma enzima. Sm Sp A.M. Muro-Pastor (nuestro laboratorio) pSAM325 Plásmido conteniendo un segmento de la región de nsrR1 con nsrR1 delecionado, obtenido por digestión de pSAM319 con BamHI, y clonado en pCSRO digerido con la misma enzima. Sm Sp (Álvarez-Escribano et al., 2018) pSAM326 Plásmido derivado de pSAM324 con la casete CK3, que confiere resistencia a neomicina, clonada en el sitio único XhoI generado en la deleción de la parte central del gen all1871. Sm Sp Km A.M. Muro-Pastor (nuestro laboratorio) pSAM329 Plásmido conteniendo nsrR1 bajo el control del promotor de petE, obtenido por PCR con los cebadores 184 y 299, y clonado en pSpark. La fusión entre el promotor de petE y nsrR1 se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador”, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 184 y 299, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 185 y 186. Ap (Álvarez-Escribano et al., 2018) pSpark Vector para la clonación de fragmentos obtenidos por PCR. Ap Canvax Biotech Materiales y Métodos 49 Plásmido Descripción Resistencia Referencia pT7-7120 Plásmido que contiene el gen rnpB de Nostoc sp. PCC 7120 clonado bajo el control de un promotor dependiente de la RNA polimerasa del fago T7 en pUC19. Ap (Vioque, 1997) pXG-0 Plásmido derivado de pXG-10-SF pero con el gen sfgfp delecionado. Cm (Urban y Vogel, 2007) pXG-10-SF Plásmido de bajo número de copias para la generación de fusiones sfgfp con genes monocistrónicos o con el primer gen de un operón de promotor conocido. Cm (Corcoran et al., 2012) pXG-30-SF Plásmido de bajo número de copias para la generación de fusiones sfgfp con genes pertenecientes a una región de mRNA policistrónico. Cm (Corcoran et al., 2012) pZE12-luc Plásmido de alto número de copias para la clonación de genes que codifican sRNAs. Ap (Lutz y Bujard, 1997) 2.2.1.2. Plásmidos construidos en este trabajo Para la realización de este trabajo se construyeron una serie de plásmidos (Tabla 2.4). Tabla 2.4. Plásmidos utilizados construidos en este trabajo. Plásmido Descripción Resistencia pIAE2 Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR (UTR, “Untranslated región”) y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína All1318, obtenido por PCR con los cebadores 203 y 204, digerido con NsiI y NheI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-10-SF digerido con las mismas enzimas. Cm pIAE6 Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína All1873, obtenido por PCR con los cebadores 211 y 212, digerido con NsiI y NheI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-10-SF digerido con las mismas enzimas. Cm pIAE8 Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína Alr2933, obtenido por PCR con los cebadores 238 y 210, digerido con NsiI y NheI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-30-SF digerido con las mismas enzimas. Cm pIAE9 Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína All1871, obtenido por PCR con los cebadores 247 y 248, digerido con NsiI y XbaI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-10-SF digerido con NsiI y NheI. Cm pIAE10 Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína Asl4325, obtenido por PCR con los cebadores 251 y 252, digerido con NsiI y NheI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-10-SF digerido con las mismas enzimas. El cebador 251 introduce una mutación puntual, G a A, en dicho fragmento para cambiar el codón de inicio de la traducción GTG a ATG. Cm pIAE11 (Álvarez-Escribano et al., 2018) Fragmento de DNA conteniendo la región 5´UTR y la secuencia que codifica los primeros 20 aminoácidos de la proteína NblA, obtenido por PCR con los cebadores 253 y 254, digerido con NsiI y NheI, y clonado en fase con el gen sfgfp en el plásmido pXG-10-SF digerido con las mismas enzimas. Cm Materiales y Métodos 56 # Secuencia 5´- 3´ Uso 645 646 647 648 GTTTTATGCATGTCACAATAGAAAACACGG GTTTTTGCTAGCTTGTCTAGCAATTTCTTGAG TATCAATGGTATTACAAGTACAAACC GTAATACCATTGATAGGAACTCCTG Cambio del codón de inicio de la traducción GTG a ATG en putA. Se usaron como cebadores externos los oligonucleótidos 645 y 646, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 647 y 648. Los cebadores 645 y 646 también fueron utilizados para amplificar la región de putA para su clonación en pXG-10-SF. 649 650 GTTTTATGCATATTGCTGTGACTTTCCCAGG GTTTTTGCTAGCCCCTTCATTTTCCGTATTAGCG Amplificación de la región de alr2431 para su clonación en pXG-10-SF. 651 652 GTTTTATGCATATATAAAGAATAAACATCACTAATTTTAG GTTTTTGCTAGCGGAAAAAGGTAGCTTTTCAC Amplificación de la región de all2806 para su clonación en pXG-10-SF. 653 654 GTTTTATGCATAATTGTTGCATTTGACACAATCTGG GTTTTTGCTAGCAAATTCAAGAATGTAGCGTTGC Amplificación de la región de all3327 para su clonación en pXG-10-SF. 655 656 GTTTTATGCATATGTAAGCGATTGGCAACTATCAGC GTTTTTGCTAGCAGGATTTAAGGCTACACGTCG Amplificación de la región de all3410 para su clonación en pXG-10-SF. 659 660 GTTTTATGCATATCGAAATCGTTACATAAACATTC GTTTTTGCTAGCGGCTTTGAATTTCTCAAAC Amplificación de la región de alr0607 para su clonación en pXG-10-SF. 661 662 GTTTTATGCATAGATATTGTTGAGAATTGTATAG GTTTTTGCTAGCGACGGCTTCAACAGTACCG Amplificación de la región de alr2372 para su clonación en pXG-10-SF. 665 664 GTTTTATGCATAATCGGGCTTTAGTCAGCGTGC GTTTTTGCTAGCCTGACAACGAAAATTGCAGCG Amplificación de la región de all3865 para su clonación en pXG-30-SF. 689 690 704 CTACCTGGCAAATCTGAAGTGGCTTTGCC GATTTGCCAGGTAGAACCTGTGCTCAG 5´P-AGGTTCTACCTGGCAAATCTG Mutación puntual (Mut-14) en NsiR3 mediante el procedimiento del “Megacebador”. Se usaron como cebadores externos los oligonucleótidos 704 y 283, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 689 y 690. 718 719 CTGAAATTAAGTCAGGAGTTCCTATC CCTGACTTAATTTCAGACTTTATATATAAAG Mutación puntual (Comp-14*17) en la región 5´UTR del mRNA de putA mediante el procedimiento del “Megacebador”. Se usaron como cebadores externos los oligonucleótidos 645 y 646, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 718 y 719. 720 721 728 GACTTTGCCAGGTACACGGTCTAGAAC GTACCTGGCAAAGTCACAGCAATATGCATG GTTTTATGCATATTGCTGTGACTTTGCCAGG Mutación puntual (Comp-14*53) en la región 5´UTR del mRNA de alr2431 mediante el procedimiento del “Megacebador”. Se usaron como cebadores externos los oligonucleótidos 728 y 650, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 720 y 721. 735 GTTTTCTCGAGTCATTGCACCAGATGGTTAC Clonación de all1871 bajo el promotr trc. Los sitios de restricción introducidos en los oligonucleótidos aparecen subrayados. Los nucleótidos que han sido cambiados con respecto a la secuencia silvestre se señalan en rojo. La secuencia del promotor dependiente de la polimerasa del fago T7 en los oligonucleótidos 569, 571 y 597 se resalta en negrita. La fosforilación en el extremo 5´monofosfato de los oligonucleótidos 195, 197 y 704 se indica con 5´P. 2.2.6.2. Procedimiento del “Megacebador” Para los experimentos desarrollados en este trabajo en los que fue necesario introducir alteraciones de secuencia en el DNA mediante mutagénesis dirigida, o fusionar dos fragmentos de DNA, se usó el procedimiento del “Megacebador” (Ausubel et al., 2006), que consta de tres reacciones de PCR. En los casos en los que se desea introducir alteraciones de secuencia en el DNA (Figura 2.1A), en las dos primeras reacciones de PCR, independientes entre sí, se utiliza como molde DNA conteniendo la secuencia en la que se pretende introducir el cambio. Materiales y Métodos 57 Como cebadores, en cada una de estas reacciones se utiliza un oligonucleótido que incorpora la mutación deseada, y un oligonucleótido externo situado en un extremo del fragmento. Los oligonucleótidos mutagénicos, que se denominan solapantes, utilizados en estas reacciones son parcialmente complementarios entre sí, y los externos están situados en los extremos del fragmento de DNA que se va a clonar. Los productos de estas dos reacciones de PCR se resuelven mediante electroforesis en geles de agarosa (apartado 2.2.3) y se purifican (apartado 2.2.4). En la tercera reacción de PCR se emplea como molde una mezcla de los productos purificados de las dos reacciones anteriores, denominados “Megacebadores”, y como cebadores los dos oligonucleótidos externos. Las secuencias de los fragmentos amplificados con este procedimiento se comprueban mediante secuenciación (apartado 2.2.7). Por su parte, en los casos en los que se desea fusionar dos fragmentos de DNA (Figura 2.1B), en las dos primeras reacciones de PCR se utiliza como molde DNA conteniendo las secuencias a fusionar. De este modo, cada una de estas dos reacciones de PCR independientes se realiza con cada uno de los moldes, usando como cebadores un oligonucleótido del extremo de la región a fusionar, que contiene una extensión complementaria al extremo de la región del otro fragmento de DNA a fusionar, y un oligonucleótido externo situado en el extremo del fragmento utilizado como molde. La tercera reacción de PCR se lleva a cabo como en el caso anterior. Figura 2.1 Procedimiento del “Megacebador”. (A) Esquema de la estrategia utilizada para introducir mutaciones puntuales en el DNA. La secuencia de DNA se amplifica con dos parejas de cebadores, cada una de las cuales amplifica desde un extremo del fragmento hasta la región a mutar, que se representa con un punto rojo. Los dos productos de amplificación obtenidos, que se solapan parcialmente, se mezclan, y se usan como molde para la tercera reacción de PCR con los cebadores externos. (B) Esquema de la estrategia utilizada para la fusión de dos fragmentos de DNA. Los dos fragmentos de DNA a fusionar, representados en rojo y negro, se amplifican con dos parejas de cebadores. Cada uno de los cebadores de la región a fusionar contiene una extensión complementaria a la región del otro fragmento de DNA a fusionar. Los dos productos de amplificación obtenidos, que se solapan parcialmente, se mezclan, y se usan como molde para la tercera reacción de PCR con los cebadores externos. Materiales y Métodos 58 2.2.7. Secuenciación del DNA Para la secuenciación de fragmentos de DNA, las muestras se enviaban a un servicio de secuenciación externo perteneciente a la empresa Secugen S.L. siguiendo las instrucciones proporcionadas por el mismo. 2.2.8. Tratamientos enzimáticos del DNA 2.2.8.1. Restricción del DNA Para hidrolizar el DNA por secuencias específicas se empleaban endonucleasas de restricción suministradas por New England Biolabs. Habitualmente, las reacciones de digestión se llevaban a cabo a 37°C en un volumen de 20 μl, conteniendo 100-500 ng del DNA sustrato y 1 µl de enzima en el tampón recomendado por el fabricante, durante 12-15 horas, o durante 2 horas si las enzimas eran de calidad High Fidelity. Cuando era necesario, las enzimas se inactivaban por calor incubando la muestra 20 minutos a 65°C o 80°C, dependiendo de la enzima, o bien se eliminaban separándolas del producto de la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa. 2.2.8.2. Desfosforilación del DNA Para evitar la religación del vector en aquellas clonaciones en las que se insertaba un fragmento de DNA no seleccionable, era necesario eliminar el grupo fosfato de los extremos 5' del vector lineal. Para ello, se llevaba a cabo la desfosforilación del DNA en una reacción de 20 μl de volumen, añadiendo a 200-500 ng del DNA sustrato, procedente de una reacción de restricción, 1 unidad de fosfatasa alcalina rAPid alkaline phosphatase (Roche), e incubando la mezcla a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, la enzima se inactivaba por calor incubando a 75°C durante 2 minutos. 2.2.8.3. Ligación del DNA Para la ligación de fragmentos de DNA se utilizaba la DNA ligasa del bacteriófago T4, proporcionada por New England Biolabs. La reacción se llevaba a cabo en un volumen de 10 μl, conteniendo 20 ng de vector, y una cantidad de DNA inserto tal que la relación molar vector:inserto fuera de 1:5. La mezcla de reacción se suplementaba con el tampón proporcionado por el fabricante y con 1 unidad de DNA ligasa. A continuación, la mezcla de ligación se incubaba a 22°C durante 2 horas, tras lo cual se utilizaba para la transformación de E. coli mediante choque térmico (apartado 2.2.9.1). Materiales y Métodos 59 2.2.9. Transferencia de DNA a bacterias 2.2.9.1. Transferencia de DNA a E. coli mediante transformación Las células transformables de E. coli se prepararon según el método descrito en (Hanahan, 1983). Las células transformables de la estirpe DH5a fueron adquiridas al Servicio de Cultivos Biológicos del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (cicCartuja). Para la transformación genética por choque térmico se mezclaban 100 μl de células transformables, previamente descongeladas en hielo, con un volumen de 1-5 μl conteniendo 20-50 ng de la preparación de DNA transformante. La mezcla se incubaba 15 minutos en hielo, se sometía a un choque térmico durante 2 minutos a 42°C, y volvía a incubarse en hielo 5 minutos. A continuación, se añadía a las células 1 ml de medio LB* y se incubaban a 37°C durante 1 hora. Finalmente, la suspensión celular se sembraba en cajas de Petri que contenían medio LB* sólido suplementado con los antibióticos adecuados para la selección de transformantes. Para la identificación de transformantes que hubieran incorporado el plásmido con inserto mediante ensayos de “complementación α”, el medio se suplementaba además con 40 μg·ml-1 de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido) (Fermentas) (Sambrook y Russell, 2001). En este caso, las colonias que contenían un plásmido con inserto aparecían de color blanco, mientras que las que incorporaban un plásmido sin inserto eran de color azul. 2.2.9.2. Transferencia de DNA a E. coli mediante electroporación Las células electroporables eran adquiridas al Servicio de Cultivos Biológicos del Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja (cicCartuja). Para la transferencia de material genético a E. coli por electroporación se mezclaban 100 µl de células electroporables, previamente descongeladas en hielo, con un volumen de 1-5 μl conteniendo 20-50 ng de la preparación de DNA transformante. La mezcla se transfería a cubetas de electroporación de 2 mm de separación entre electrodos (Cell Projects), previamente enfriadas en hielo, y se procedía a la electroporación utilizando un electroporador MicroPulser (Bio-Rad). Inmediatamente, se añadía a las células 1 ml de LB* y se incubaban a 37°C durante 1 hora. Finalmente, la suspensión celular se sembraba en cajas de Petri que contenían medio LB* sólido suplementado con los antibióticos adecuados para la selección de transformantes. Materiales y Métodos 60 2.2.9.3. Transferencia de DNA a Nostoc sp . PCC 7120 mediante conjugación triparental La transferencia de DNA a Nostoc sp. PCC 7120 se realizaba siguiendo un protocolo de conjugación triparental, basado en el uso de un plásmido conjugativo de amplio espectro (Elhai y Wolk, 1988a). En este proceso intervienen dos estirpes de E. coli y la cianobacteria receptora Nostoc sp. PCC 7120. Una de las estirpes de E. coli (HB101) porta el plásmido a transferir, también llamado plásmido cargo, que contiene el fragmento de DNA que se desea introducir en la cianobacteria, y que posee un origen de transferencia conjugativa denominado sitio bom (basis of mobilization). Además, esta estirpe porta el vector auxiliar pRL623, que contiene el gen mob, que determina la endonucleasa que corta el plásmido cargo en el sitio bom, proceso esencial para que se produzca la movilización. El vector pRL623 también contiene genes que codifican metilasas que metilan sitios AvaI, AvaII y AvaIII (Elhai et al., 1997). Las metilaciones catalizadas por estas enzimas protegen al plásmido cargo frente a las endonucleasas de restricción de Nostoc sp. PCC 7120, evitando así su degradación una vez introducido en la cianobacteria receptora. Por su parte, una segunda estirpe de E. coli (ED8654) porta el plásmido conjugativo pRL443 (Elhai y Wolk, 1988a), que contiene los genes necesarios para la movilización del plásmido cargo a la cianobacteria receptora. Para realizar la conjugación, la estirpe de E. coli HB101 (pRL623) se transformaba con el plásmido cargo mediante el proceso de transformación descrito en el apartado 2.2.9.1. Tras ello, se inoculaban cultivos de las dos estirpes de E. coli, que se incubaban a 37°C con agitación a 200 rpm durante 12-15 horas. Dado que en el momento de la conjugación las células deben estar en fase exponencial, alícuotas de 350 μl de cultivo de cada una de las estirpes de E. coli se utilizaban para inocular nuevos cultivos de 10 ml de medio LB* estéril suplementado con los antibióticos adecuados, que se incubaban a 37°C con agitación a 200 rpm durante 2,5 horas. Posteriormente, las células se recogían y se lavaban dos veces mediante centrifugación y resuspensión suave con 10 ml de medio LB* estéril para eliminar los antibióticos. A continuación, los precipitados celulares se resuspendían suavemente en 5 ml de medio LB*, se combinaban ambas estirpes de E. coli, y las células se volvían a recoger por centrifugación, resuspendiendo el precipitado suavemente en 60 μl de medio LB*. Esta mezcla se incubaba a 30°C durante 2,5 horas sin agitación. Tras la incubación, la mezcla de estirpes de E. coli se combinaba en un volumen máximo de 200-300 μl con una suspensión celular de Nostoc sp. PCC 7120 que contenía 10 μg de clorofila si el plásmido cargo era integrativo, o 1 μg de clorofila si el plásmido cargo era replicativo. La mezcla resultante se extendía sobre un filtro estéril de nitrocelulosa de 0,45 μm (Millipore) dispuesto sobre una caja de Petri con medio BG11* suplementado con LB* al 5% (v/v). Las cajas de Petri se incubaban a 30°C con baja intensidad de luz durante 2 horas, y posteriormente en condiciones habituales de cultivo durante 18 horas. Transcurrido este tiempo, los filtros se transferían a cajas Materiales y Métodos 61 de Petri con medio BG11*, que se incubaban durante 24 horas en las mismas condiciones. Tras estas 24 horas, los filtros se transferían a cajas de Petri con medio BG11* suplementado con los antibióticos adecuados. Las cajas de Petri se incubaban en las mismas condiciones, y cada 2-3 días se cambiaban los filtros a una nueva caja de Petri con medio BG11* suplementado con los antibióticos adecuados. Este proceso se repetía hasta que desaparecía el fondo de células de Nostoc sp. PCC 7120 sensibles a los antibióticos, y comenzaban a aparecer, normalmente tras 7-10 días, colonias resistentes a los antibióticos. Por último, al objeto de aislar colonias de cianobacterias limpias de las células de E. coli empleadas en la conjugación, las células de Nostoc sp. PCC 7120 resultantes se sembraban para aislar colonias en cajas de Petri con medio BG11* suplementado con los antibióticos adecuados. Este proceso se repetía dos veces más a partir de las colonias aisladas obtenidas en cada resiembra. La generación de estirpes mutantes de Nostoc sp. PCC 7120 consiste en la sustitución mediante doble recombinación homóloga de un fragmento del cromosoma por una versión alterada, ya sea interrumpida por una casete de resistencia a antibiótico o con una deleción. Los vectores que se utilizan para introducir las versiones mutadas se basan en el plásmido pCSRO (Merino-Puerto et al., 2010), que deriva del plásmido pRL500 (Elhai y Wolk, 1988b). Para la selección de clones de las estirpes mutantes de Nostoc sp. PCC 7120, que han incorporado el DNA transferido en la conjugación mediante doble recombinación con su genoma, se utilizaba un sistema basado en la letalidad condicional del gen sacB (Cai y Wolk, 1990). El gen sacB, presente en el plásmido cargo, determina una levansacarasa que en presencia de sacarosa genera un producto letal para numerosas bacterias, entre ellas Nostoc sp. PCC 7120. De este modo, los recombinantes simples, en los que el vector se ha integrado en el cromosoma como consecuencia de un único evento de recombinación, portarían el gen sacB, por lo que mueren en presencia de sacarosa. Por su parte, los recombinantes dobles, en los que el fragmento de DNA mutado ha sustituido al silvestre por doble recombinación, pierden la porción del vector que incluye el gen sacB, y por tanto son resistentes a la sacarosa. Para seleccionar dobles recombinantes, las colonias resultantes de la conjugación, que en su mayoría corresponden a clones en los que el plásmido se ha integrado mediante recombinación simple, se sembraban por agotamiento en cajas de Petri con medio BG11* con antibióticos, que se incubaban en condiciones habituales de cultivo hasta que aparecían nuevas colonias aisladas. Este proceso se repetía 3 veces, de manera que la integración del vector mediante recombinación se homogeniza en todos los cromosomas y en todas las células de los filamentos. A continuación, se inoculaban colonias aisladas en medio BG11* líquido y se cultivaban durante una semana en condiciones estándar de cultivo, sin antibióticos en el caso en el que se esté llevando a cabo una mutación por deleción, o con el antibiótico de la casete de Materiales y Métodos 62 resistencia en el caso de mutaciones que impliquen esta estrategia. Para favorecer la segregación cromosómica de la mutación, alícuotas de 1 ml de los cultivos anteriores se sometían a un proceso de sonicación suave hasta obtener filamentos de 3-5 células. Posteriormente, se sembraban diluciones seriadas de dichas suspensiones en cajas de Petri con medio BG11* suplementado con NH4Cl 3 mM, sacarosa 5% (p/v), y el antibiótico correspondiente en caso de ser necesario. Para distinguir los dobles recombinantes de aquellos clones resistentes a sacarosa que resultan de una mutación que inactiva el gen sacB, se ensayaba la capacidad de crecimiento de las colonias resistentes a sacarosa en un medio suplementado con el antibiótico correspondiente al gen de resistencia del plásmido cargo (que se habría perdido en los dobles recombinantes, pero no en los posibles mutantes del gen sacB), y se seleccionaban aquellos clones sensibles al antibiótico. 2.3. Métodos de manipulación y análisis de RNA 2.3.1. Aislamiento de RNA total de cianobacterias Para el aislamiento de RNA total de Nostoc sp. PCC 7120 se utilizaba una adaptación del protocolo basado en el uso del fenol caliente descrito en (Mohamed y Jansson, 1989). Las células procedentes de cultivos de 25 ml se recogían mediante filtración por vacío a través de filtros de nitrocelulosa. Posteriormente, las células se lavaban en el mismo filtro con 10 ml de tampón T50E100*, se resuspendían en 3 ml de este tampón, y se repartían en dos tubos de microcentrífuga, donde se centrifugaban a 16.000 x g durante 2 minutos. Tras la centrifugación se descartaba el sobrenadante, y el precipitado celular se congelaba en nitrógeno líquido y se guardaba a -20°C hasta que se realizase la extracción del RNA. Para el aislamiento de RNA total, el precipitado celular se resuspendía en 300 μl de Tampón de Resuspensión TR*, y se añadían 100 μl de Na2-EDTA 250 mM (pH 8), y 400 μl de Tampón de Lisis TL*. Esta mezcla se transfería a un tubo de 2 ml que contenía 1 ml de fenol ácido (pH 4,5) precalentado a 65°C, se agitaba vigorosamente, y se incubaba 2,5 minutos a 65°C. El proceso de agitación e incubación se repetía dos veces. A continuación, la mezcla se centrifugaba a 16.000 x g durante 5 minutos a 4°C, y se recogía la fase acuosa, que se sometía a tres procesos de extracción. La primera de estas tres extracciones se realizaba con 1 ml de fenol ácido a 65°C, seguida de una extracción con una mezcla de 1 ml de fenol ácido:cloroformo (1:1, [v:v]) a 65°C, y de una última extracción con 1 ml de cloroformo. Para cada una de las extracciones, tras añadir la fase orgánica, la muestra se agitaba en vórtex, se centrifugaba a 16.000 x g durante 2 minutos a 4°C, y se recuperaba la fase acuosa para someterla a la siguiente extracción. Tras esta serie de extracciones los ácidos nucleicos contenidos en la fase acuosa se precipitaban añdiendo 2 volúmenes de isopropanol. Para facilitar la precipitación, los tubos se sumergían en nitrógeno líquido, tras lo cual se centrifugaban a 16.000 x g durante 30 minutos a 4°C. Los ácidos nucleicos Materiales y Métodos 63 precipitados se lavaban con etanol al 70% (v/v) y se secaban a temperatura ambiente. Finalmente, el precipitado de ácidos nucleicos se resuspendía en 30 μl de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1% (v/v). En aquellos casos en los que las muestras de RNA iban a ser utilizadas para análisis de Northern blot en geles de agarosa, se eliminaba el DNA presente en la muestra mediante el uso de los reactivos del kit Turbo DNA-free (AmbionTM). Por último, se determinaba la concentración de RNA extraído midiendo la absorbancia a 260 nm (Sambrook y Russell, 2001) en un espectrofotómetro NanoDrop modelo ND-100, y se analizaba su integridad mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. 2.3.2. Electroforesis de RNA en geles desnaturalizantes de urea-poliacrilamida y transferencia a membranas de nailon La electroforesis para fraccionar RNAs de pequeño tamaño (<1 kb) se llevaba a cabo en geles de urea-poliacrilamida (acrilamida/bis-acrilamida 19:1). Los geles se preparaban con distintos porcentajes de acrilamida total (4-8%) en función del tamaño de las moléculas a analizar en TBE* 1X, y con urea 7 M como agente desnaturalizante. A la mezcla resultante se le añadía persulfato amónico (APS) 0,08% (p/v), y N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,1% (v/v) como catalizadores de la reacción de polimerización. Antes de cargar las muestras, el gel se sometía a una corriente eléctrica de 25 mA durante 30 minutos en TBE* 1X, y se limpiaban los pocillos con TBE* 1X para evitar que quedasen restos de urea en los mismos. Las muestras se preparaban en un volumen final de 10 μl, conteniendo 5-10 μg de RNA total y 5 μl de tampón de carga Urea Dye* 2X, se incubaban 5 minutos a 100°C, se enfriaban en hielo, y se sometían a electroforesis en TBE* 1X a 25 mA durante 1-2 horas. Para determinar el tamaño de los transcritos sometidos a análisis se empleaba el marcador de DNA comercial 2-log DNA ladder (New England Biolabs). Tras la electroforesis, el RNA se transfería a una membrana de nailon Hybond N+ (GE Healthcare) mediante un sistema de transferencia eléctrica semiseca TE77XP (Hoefer) durante 75 minutos con un amperaje de 1,2 mA por cada cm2 de gel. Para ello, sobre la base del aparato de transferencia se colocaban cuatro rectángulos de papel de filtro y dos de papel Whatman 3MM, recortados del tamaño del gel a transferir y previamente empapados en tampón TBE* 1X. Encima de esta capa de papeles se disponía la membrana de nailon, previamente empapada en tampón TBE* 1X, y sobre ella se colocaba el gel. Por último, sobre el gel se colocaban dos rectángulos de papel Whatman 3MM y cuatro de papel de filtro previamente empapados en tampón TBE* 1X. Tras la transferencia, la membrana se irradiaba 2 minutos con luz UV de 302 nm, y se dejaba secar en una estufa a 80°C durante 1-2 horas para fijar el RNA. Materiales y Métodos 64 2.3.3. Electroforesis de RNA en geles desnaturalizantes de agarosa con formaldehído y transferencia a membranas de nailon La electroforesis de RNA para fraccionar transcritos de mayor tamaño (> 1kb) se llevaba a cabo en geles de agarosa al 1% (p/v) en tampón MOPS* 1X con formaldehído al 2% (v/v). Las muestras se preparaban en un volumen final de 20 μl, conteniendo 10 μg de RNA total y 15 μl de tampón de carga TCRNA*, se incubaban 3 minutos a 80°C, se enfriaban en hielo, y se sometían a electroforesis a 100 V durante 1-2 horas. Para determinar el tamaño de los transcritos sometidos a análisis se empleaba el marcador de RNA comercial Riboruler High Range RNA Ladder (Thermo Scientific). Tras la separación del RNA en la electroforesis, el gel se sometía a tres lavados de 5 minutos en agitación con abundante agua desionizada para eliminar el formaldehído, y se visualizaba con luz ultravioleta. Posteriormente, tanto el gel como la membrana de nailon a la que se va a transferir el RNA se equilibraban con tampón SSC* 10X, el tampón de transferencia, durante 10 minutos en agitación. A continuación, el RNA se transfería durante 16 horas por capilaridad (Figura 2.2) a la membrana de nailon Hybond N+ (GE Healthcare). Tras la transferencia, la membrana se lavaba brevemente con tampón SSC 2X, se irradiaba 2 minutos con luz UV de 302 nm, y se dejaba secar en una estufa a 80°C durante 1-2 horas para fijar el RNA. Figura 2.2. Sistema de transferencia por capilaridad de RNA en geles de agarosa a membranas de nailon. Se muestra un esquema del sistema construido para la transferencia por capilaridad. Este sistema está compuesto de un recipiente que contiene tampón de transferencia SSC* 10X. Sobre este recipiente se apoya una plataforma rígida, en la que se coloca una hoja de papel Whatman 3MM, previamente empapado en el tampón de transferencia, que permanece siempre en contacto con el tampón del recipiente. Encima de esta hoja se coloca el gel de agarosa orientado hacia abajo, y en contacto con él, evitando que queden burbujas, la membrana de nailon. Sobre la membrana se disponen dos rectángulos de papel Whatman 3MM del mismo tamaño que la membrana, previamente empapados en la solución de transferencia y, encima de ellos, una pila de >1 cm de altura de papel de filtro seco. Sobre esta pila se coloca un peso de aproximadamente 1 Kg. De esta manera, al ascender el tampón de transferencia por capilaridad, el RNA es arrastrado hacia arriba desde el gel hasta la membrana que está en contacto con él. Materiales y Métodos 65 2.3.4. Detección de RNA mediante hibridación en membrana con sondas radiactivas (Northern blot) En los análisis de Northern blot, la sonda marcada radiactivamente se generaba mediante reacciones de PCR de una hebra, en las que se amplificaba un molde de DNA usando sólo un oligonucleótido como cebador (Tabla 2.6). En estos casos, la reacción se llevaba a cabo en un volumen final de 50 µl, en una mezcla de reacción que contenía 200 ng de DNA molde obtenido previamente mediante PCR; 0,2 mM de dNTPs exceptuando dCTP; 0,4 µM de un oligonucleótido complementario a la hebra que codifica el gen de estudio; 2 mM de MgCl2; 2,5 unidades de DNA polimerasa BioTaqTM (Bioline) con su tampón correspondiente, y 25 µCi de [α-32P]dCTP (3.000 Ci·mmol-1). El programa de amplificación utilizado constaba típicamente de una etapa de desnaturalización inicial de 5 minutos a 95°C, seguida de 45 ciclos de amplificación. Cada uno de estos ciclos tenía una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 95°C, una etapa de apareamiento de 40 segundos a una temperatura variable que dependía del oligonucleótido utilizado, y una etapa de extensión a 72°C durante un tiempo variable que dependía del tamaño del fragmento a amplificar. El programa terminaba con una incubación de 5 minutos a 72°C. Finalmente, el [α-32P]dCTP no incorporado se eliminaba por filtración de la muestra en columnas de Sephadex G-25, y se cuantificaba la radiactividad incorporada. Para la hibridación del RNA fijado en las membranas de nailon con sondas de DNA radiactivas, la membrana se introducía en un rodillo de vidrio con la superficie a la que está adherido el RNA hacia la zona central, y se incubaba en un horno de hibridación a 65°C durante 2 horas con 15-30 ml de solución de prehibridación*. Tras la prehibridación, se añadía la sonda de DNA marcada radiactivamente, previamente desnaturalizada a 95°C durante 3 minutos, y se incubaba en el horno de hibridación a 65°C durante 12-16 horas. Posteriormente, la membrana se lavaba a 65°C durante 10 minutos dos veces con 30-50 ml de la solución de lavado 1*, y una vez con 30-50 ml de la solución de lavado 2*. Todos los procesos se llevaban a cabo con giro constante del rodillo para exponer la superficie de la membrana a las distintas soluciones. Tanto la detección como el análisis de las señales de hibridación en las membranas se llevaban a cabo con el sistema Cyclone Storage Phosphor System (Perkin Elmer) y el programa de análisis de imágenes Optiquant (Packard). Las sondas utilizadas en este trabajo se describen en la Tabla 2.6. Como control de la cantidad de RNA cargada en cada calle del gel, y de la transferencia del RNA a la membrana, las membranas se hibridaban además con una sonda para el gen rnpB, que determina el RNA de la ribonucleasa P (un RNA de 460 nt), o con una sonda para el RNA ribosómico 5S (un RNA de 119 nt), ambos de expresión constitutiva. Materiales y Métodos 72 A continuación, se realizó un segundo paso de purificación mediante cromatografía de filtración en gel. Para ello, las fracciones 58-70 de All1871, y 30-44 de NblA (Figura 2.3), resultado de la elución de la columna His-Trap, se combinaron y se concentraron en un volumen final de 2 ml mediante centrifugación a 4.000 g en Amicon Ultra-4, Ultracel-3, 3 kDa (Merck). Las fracciones concentradas se inyectaron en una columna Hi-Load 16/60 Superdex 75 de 120 ml (Pharmacia Biotech) en un sistema de FPLC ÄKTA purifier. Los tampones usados para la filtración en gel de la proteína All1871 estaban suplementados con urea 2 M. El método utilizado consistía en el equilibrado de la columna a un flujo de 0,5 ml/min con 240 ml de tampón F*, seguido de la inyección de la muestra. Durante la elución se recogieron fracciones de 1,5 ml. Las proteínas presentes en las diferentes fracciones se visualizaban mediante electroforesis desnaturalizante en geles de SDS-poliacrilamida (apartado 2.4.3) (Figura 2.3). Las fracciones 44-50 de All1871, y 43-53 de NblA, resultado de la elución de la columna Hi-Load 16/60 Superdex 75, se combinaron y se concentraron en un volumen final de 2 ml mediante centrifugación a 4.000 x g en Amicon Ultra-4, Ultracel-3, 3 kDa (Merck). Las fracciones concentradas se guardaron a -20°C, y en el caso de NblA se añadió glicerol al 10% a la mezcla antes de congelarla. Figura 2.3. Purificación de las proteínas All1871 (A) y NblA (B) recombinantes mediante cromatografía de afinidad por níquel (paneles de la izquierda) seguida de cromatografía de filtración en gel (paneles de la derecha). Geles de SDS-poliacrilamida al 15% (All1871) o al 17% (NblA) con 5 µl de algunas de las fracciones obtenidas mediante los distintos procesos de cromatografía. El significado de las abreviaturas utilizado en la parte superior de los paneles es el siguiente: EC, fracción soluble del extracto crudo libre de células; M, patrones de tamaño Page RulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific); los números indican la fracción del gradiente analizada. Los marcadores de tamaño están indicados a la izquierda (en kDa). Se señalan con un triángulo negro las proteínas All1871 (A) o NblA (B) recombinantes, y con una barra negra las fracciones que se combinaron en cada caso. Materiales y Métodos 73 2.4.5. Producción y purificación de anticuerpos frente a las proteínas All1871 y NblA Para la producción de los anticuerpos frente a las proteínas All1871 y NblA, se inyectaron en cada caso a sendos conejos un total de 3,5 mg de la proteína recombinante purificada correspondiente (apartado 2.4.4.2) mediante 7 inyecciones subcutáneas en el Servicio de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Se obtuvieron sueros varias veces hasta 5 meses después de la primera inyección, y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Los anticuerpos específicos frente a All1871 y NblA se purificaron a partir del suero de los conejos inmunizados mediante cromatografía de afinidad utilizando el kit AminoLinkR Plus Immobilization Kit (Thermo Fisher). Este sistema está basado en la inmovilización de la proteína purificada, utilizada como antígeno, mediante la unión covalente de sus grupos amino primarios a los grupos aldehído que contiene la resina de agarosa proporcionada en el kit tras una reducción con cianoborohidruro de sodio. Las columnas para la purificación de ambos anticuerpos se prepararon con 2,5 mg de la proteína All1871 purificada, o con 5 mg de la proteína NblA purificada. En ambos casos, se aplicaron 3 ml de suero sobre la columna, se lavó con el tampón de lavado incluido en el kit, y los anticuerpos unidos se eluyeron con el tampón de elución, también suministrado en el kit, recogiendo por gravedad fracciones de 250 µl. Las fracciones que contenían anticuerpo se identificaron mediante análisis de Western blot (apartado 2.4.6), se combinaron, y guardaron a -20°C hasta su uso. 2.4.6. Transferencia de proteínas a filtros de nitrocelulosa y detección inmunológica (Western blot) Para la detección de proteínas con anticuerpos, tras la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (apartado 2.4.3), las proteínas del gel se transferían a membranas de nitrocelulosa de 0,45 µm de diámetro de poro, incluidas en el kit de transferencia Trans-Blot® Turbo™ RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit (Bio-Rad), mediante el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad). Habitualmente, la transferencia se llevaba a cabo siguiendo el protocolo Mixed MW, predefinido en el aparato de transferencia, a una intensidad de corriente continua de 1,3 A durante 7 minutos. Tras la transferencia, la membrana se incubaba en solución de bloqueo* durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación orbital. Posteriormente, la membrana se incubaba con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo* nueva a razón 1:10.000 para el anticuerpo frente a GFP (Roche), 1:50.000 para el anticuerpo frente a GroEL de E. coli (Sigma Aldrich), 1:500 para el anticuerpo frente a NblA, y 1:10.000 para el anticuerpo frente a All1871, Materiales y Métodos 74 durante 15 horas a 4°C con agitación orbital. El anticuerpo frente a GroEL de E. coli detecta también a la proteína GroEL de Nostoc sp. PCC 7120 (Jager y Bergman, 1991). Tras ello, la membrana se lavaba 3 veces durante 10 minutos con tampón PBS* suplementado con 0,1% Tween-20, y una vez durante 10 minutos con tampón PBS*. Una vez lavada, la membrana se incubaba con agitación orbital durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo* a razón 1:20.000 para el anticuerpo secundario Goat Anti-Rabbit IgG HRP Conjugate (Sigma Aldrich), utilizado en los casos en los que el anticuerpo primario usado había sido el anticuerpo frente a GroEL, NblA o All1871 o a razón 1:3.000 para el anticuerpo secundario Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate (Bio-Rad), en los casos en los que el anticuerpo primario usado había sido el anticuerpo frente a GFP. Tras la incubación con el anticuerpo secundario correspondiente, la membrana se lavaba 3 veces durante 10 minutos con tampón PBS* suplementado con 0,1% Tween-20, y una vez durante 10 minutos con tampón PBS. Finalmente, para el proceso de revelado de la membrana se empleaba el juego de reactivos comercial ECL-Plus (Amersham). La visualización de la señal se llevaba a cabo exponiendo la membrana en un aparato de captación de imágenes, ChemiDoc™ Imaging System (BioRad), durante un tiempo variable entre 1-15 minutos. El tratamiento de las imágenes se realizaba con el software Image Lab (BioRad). 2.4.7. Ensayos de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) Para el análisis de la interacción de la proteína NtcA con fragmentos de DNA, se llevaron a cabo ensayos de retardo de la movilidad electroforética con la proteína NtcA recombinante de Nostoc sp. PCC 7120 purificada. Los fragmentos de DNA usados se obtenían mediante PCR y se marcaban en los extremos 5´ con [γ-32P]ATP. El marcaje de los fragmentos de DNA se realizaba con 15 U de T4 polinucleótido quinasa (Fermentas) en un volumen final de 15 µl, en una mezcla de reacción conteniendo 100 fmol de fragmento de DNA en un volumen de 2,5 µl, 1,5 µl de buffer A proporcionado con la enzima, 2 µl de [g-32P]ATP conteniendo 6,6 pmol, 1,5 µl de polinucleótido quinasa del fago T4, y 7,5 µl de agua. La mezcla se incubaba a 37°C durante 30-45 minutos, y el [g-32P]ATP no incorporado se eliminaba por filtración de la muestra en columnas de Sephadex G-25. Por último, la eficiencia del marcaje se estimaba cuantificando 1 µl de la muestra radiactiva obtenida en un contador de centelleo Beckman LS 2800. Materiales y Métodos 75 La mezcla de ensayo contenía, en un volumen final de 15 µl, 6 µl de tampón de unión* 2,5X, 2 µl de poly(dI-dC) conteniendo 10 U A260/500 µl, 1 µl de seroalbúmina bovina (BSA) a una concentración de 0,1 µg/µl, 1 µl de 1,4-ditiotreitol (DTT) 15 mM, 1 µl de 2-oxoglutarato 9 mM, 1 µl de DNA marcado correspondiente a 5.000 cpm, y una cantidad variable de proteína NtcA recombinante purificada en un volumen final de 3 µl de tampón P*. Tras incubar la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadía 1,5 µl de tampón de unión* 2,5X, y se analizaba mediante electroforesis en condiciones no desnaturalizantes en un gel de acrilamida al 6% (p/v) (acrilamida:bis-acrilamida, 30:0,36) preparado en tampón TBE* 0,25X con glicerol 10% (v/v). Antes de cargar las muestras, los geles se sometían a una corriente eléctrica de 100 V durante 30 minutos a 4°C, y se limpiaban los pocillos con TBE* 0,25X. Finalmente, se cargaban las muestras directamente, y se sometían a electroforesis en TBE* 0,25X a 200 V durante 1-2 horas, dependiendo del tamaño del fragmento de DNA utilizado. La detección de la posición de los fragmentos de DNA en el gel se llevaba a cabo con el sistema Cyclone Storage Phosphor System (Perkin Elmer) y el programa de análisis de imágenes Optiquant (Packard). 2.5. Determinación del contenido de pigmentos fotosintéticos 2.5.1. Determinación del contenido de clorofila El contenido de clorofila a de las suspensiones celulares se determinaba espectrofotométricamente en extractos metanólicos (Mackinney, 1941). Las células de 1 ml de cultivo se recogían por centrifugación, y tras eliminar el sobrenadante, el precipitado celular se resuspendía en 1 ml de metanol y se agitaba con vórtex durante 1 minuto. La suspensión resultante se centrifugaba a 16.000 x g durante 2 minutos. La concentración de clorofila en el sobrenadante se estimaba en base a su absorbancia a 665 nm, utilizándose un coeficiente de extinción ε=74,46 mg-1·ml·cm-1. 2.5.2. Espectros de absorción de células enteras de Nostoc sp. PCC 7120 Para la realización de espectros de absorción de células enteras se medía la absorbancia entre 500 y 750 nm de 0,5 ml de cultivo mezclados con 0,5 ml de glicerol 50% en un espectrofotómetro JASCO V-650. Los espectros se normalizaban por el contenido de clorofila a 680 nm después de restar la absorbancia a 750 nm. Los valores de absorbancia a 635 nm y 680 nm se usaron para estimar el contenido de ficocianina y clorofila respectivamente. Materiales y Métodos 76 2.6. Ensayos para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y los mRNAs diana Para verificar la interacción entre un sRNA y cualquiera de sus posibles mRNAs diana se utilizó un sistema heterólogo in vivo implementado en E. coli (Urban y Vogel, 2007), basado en la coexpresión constitutiva del sRNA y el mRNA diana (Figura 2.4). Para ello se utilizaban dos plásmidos compatibles, un plásmido de alto número de copias (derivado de pZE12-luc) en el que se clonaba el gen que codifica el sRNA a estudiar, y un plásmido de bajo número de copias (derivado de pXG-10-SF o pXG-30-SF) en el que se clonaba una fusión de la región 5´UTR y los primeros aminoácidos de la zona codificante del mRNA en cuestión con el gen de la variante “superfolder” de la proteína verde fluorescente (sfgfp) (Corcoran et al., 2012). Se ha demostrado que esta variante de la proteína GFP proporciona señales más intensas, así como una mejor diferencia entre la autofluorescencia de las células de E. coli y la fluorescencia derivada de la expresión de la fusión que contiene el gen sfgfp, generando de este modo unos datos más fiables (Corcoran et al., 2012). La interacción del sRNA con el mRNA diana se evaluaba a partir de los cambios en la fluorescencia GFP que se observaban cuando se comparaban los niveles de fluorescencia de cultivos que portaban diferentes combinaciones de los plásmidos desde los que se transcriben el sRNA y el mRNA diana. Los genes que codifican NsrR1 o NsiR3 se amplificaron por PCR, y se clonaron en pZE12-luc según se recoge en (Urban y Vogel, 2007). Para ello, se utilizaron como cebadores un oligonucleótido 5’-fosforilado correspondiente al inicio de la secuencia que codifica el sRNA, y un oligonucleótido, que introduce un sitio XbaI, complementario a una secuencia situada 50 nucleótidos aguas abajo del extremo 3’ de la secuencia que codifica el sRNA. Si el mRNA correspondía a un gen monocistrónico o al primer gen de un operón del que se conoce su promotor se utilizaba el plásmido pXG-10-SF, mientras que si la secuencia a analizar correspondía al interior de una región de un mRNA policistrónico se utilizaba el plásmido pXG-30-SF (Urban y Vogel, 2007). En el primero de estos casos, la región del mRNA utilizada para la fusión con el gen sfgfp se extiende desde el TSS (Mitschke et al., 2011b) hasta los primeros 60 nucleótidos de la secuencia codificante del mRNA. Para la generación de dicha fusión, la secuencia del mRNA se amplificaba con una pareja de cebadores externos que agregan un sitio de restricción NsiI justo delante del TSS, y un sitio de restricción NheI justo detrás del nucleótido 60 de la región codificante del mRNA. Posteriormente, este fragmento se clonaba de forma dirigida en el plásmido pXG-10-SF, que porta el gen sfgfp justo detrás del sitio de restricción NheI, generándose de este modo la fusión del mRNA con el gen sfgfp (Figura 2.4) (Urban y Vogel, 2007). Materiales y Métodos 77 Figura 2.4. Esquema del sistema heterólogo implementado en E. coli utilizado para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y sus mRNAs diana. Se representa un ejemplo concreto en el que el mRNA diana corresponde a un gen monocistrónico o al primer gen de un operón del que se conoce su promotor. En estos casos, la región del mRNA utilizada para la fusión con el gen sfgfp se extiende desde el TSS (flecha negra) hasta los primeros 60 nucleótidos de la secuencia codificante del mRNA (azul). Este fragmento se clona de forma dirigida en el plásmido pXG-10-SF. La clonación del gen que codifica el sRNA (rojo) en el plásmido pZE12-luc se representa arriba a la derecha. Se señalan los sitios de restricción más relevantes para dichas clonaciones. Arriba a la izquierda se representa el plásmido pJV300, que expresa un sRNA control (violeta) (Tabla 2.3). Tras la combinación de los plásmidos en E. coli, se muestran las diferentes posibilidades que pueden tener lugar tras la expresión de los transcritos del mRNA diana y el sRNA. (Izquierda) El mRNA diana no interacciona con el sRNA control, observándose los niveles de fluorescencia GFP (círculos verdes y azules) propios del mRNA diana. (Centro) Si no hay interacción entre el sRNA y el mRNA diana, los niveles de fluorescencia GFP permanecen similares a los del control. (Derecha) Si ambos transcritos interaccionan, los niveles de fluorescencia GFP se ven alterados con respecto al control, reducidos en este ejemplo concreto, en el que la interacción tiene lugar en la región Shine-Dalgarno (SD) del mRNA, impidiendo la unión del ribosoma (gris) e inhibiendo la traducción. En las ocasiones en los que la secuencia a analizar correspondía al interior de una región de un mRNA policistrónico, la clonación del mRNA para generar la fusión con el gen sfgfp se llevaba a cabo en el vector para la fusión de operones pXG-30-SF. En estos casos, la secuencia del mRNA se amplificaba desde una posición situada 60 nucleótidos dentro del gen anterior. El procedimiento para la amplificación de la secuencia del mRNA es similar al descrito para el caso de genes monocistrónicos. Así, la secuencia del mRNA se amplificaba con una pareja de cebadores externos, que agregan un sitio de restricción NsiI justo delante del primer nucleótido de la región del mRNA seleccionada para la clonación, y un sitio de restricción NheI justo detrás del nucleótido 60 de la región codificante del mRNA. Posteriormente, este fragmento se clonababa de forma dirigida en el plásmido pXG-30-SF, que porta un epítopo FLAG con el gen lacZ truncado justo delante del sitio de restricción NsiI, y el gen sfgfp justo detrás del sitio de restricción NheI (Urban y Vogel, 2007). De este modo, se genera una fusión C-terminal que Materiales y Métodos 78 permite simular la composición de un operón. Dicha fusión está compuesta de un marco de lectura artificial corto (formado por el epítopo FLAG con el gen lacZ truncado), de la región del mRNA clonada, y del gen sfgfp (Figura 2.5). Figura 2.5. Representación esquemática de la construcción de un plásmido derivado de pXG-30 para la validación in vivo de la interacción entre un sRNA y una secuencia correspondiente al interior de una región de un mRNA policistrónico. En estos casos, la región del mRNA utilizada para la fusión con el gen sfgfp se extiende desde una posición en fase con la región C-terminal del marco abierto de lectura situado aguas arriba del gen de interés, hasta los primeros 60 nucleótidos de la secuencia codificante del mRNA (azul). Este fragmento se clona de forma dirigida en el plásmido pXG-30-SF. Se señalan los sitios de restricción más relevantes. El epítopo FLAG y el gen lacZ truncado se representan en gris y rosa respectivamente. Una vez que se habían clonado los genes que codifican el sRNA y el mRNA a estudiar en los plásmidos correspondientes, éstos se cotransformaban en la estirpe DH5α de E. coli mediante choque térmico (apartado 2.2.9.1). La fluorescencia de los diferentes cultivos se determinó mediante citometría de flujo, fluorimetría, o en placas con medio sólido LB* (Urban y Vogel, 2007). Las medidas de fluorescencia mediante citometría de flujo se llevaban a cabo en el citómetro de flujo BD Influx disponible en el Servicio de Citometría de Flujo del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Las muestras se preparaban diluyendo 15 µl de cultivo líquido en estado estacionario en 3 ml de PBS*, y las medidas se realizaban a una longitud de onda de excitación de 488 nm, y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Para la interpretación de los resultados se utiliza el software BD FACSTM 1.0.0.650. Por su parte, las medidas mediante fluorimetría se llevaban a cabo en un lector de microplacas Varioskan LUX Multimode Microplate Reader (Thermo Fisher). Las muestras se preparaban recogiendo por centrifugación 0,5 ml de cultivo líquido en estado estacionario. A continuación, se eliminaba todo el sobrenadante, se resuspendían las células en 1 ml de PBS, y se cargaban 200 µl de la suspensión resultante en cada pocillo de la microplaca. Las medidas de fluorescencia se realizaban a una longitud de onda de excitación de 488 nm, y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Además, se medía la absorbancia de cada muestra a 600 nm para normalizar los valores de fluorescencia obtenidos en función de la densidad celular. Por último, en los casos en los que se analizó la fluorescencia en medio sólido LB, las placas se escanearon con el detector de fluorescencia FLA-5000 Imaging System (Fujifilm). Materiales y Métodos 79 2.7. Ensayo de la actividad nitrogenasa Para la determinación de la actividad nitrogenasa en células de Nostoc sp. PCC 7120 y de las estirpes all1871::CK3 y all1871::CK3 + Ptrc::all1871 (Tabla 2.1) se utilizó el método de reducción de acetileno descrito en (Stewart et al., 1967). Este método se basa en la estimación de la actividad nitrogenasa mediante la determinación de la tasa de producción de etileno a partir de acetileno. El ensayo se llevaba a cabo tanto en condiciones óxicas como anóxicas. En ambos casos, cultivos celulares establecidos en amonio se sometían a condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado durante 20-24 horas. Para favorecer el crecimiento de las células el medio en cuestión se suplementaba con NaHCO3 a una concentración final de 10 mM. Tras la incubación en condiciones de limitación de nitrógeno se transferían 2 ml de cada suspensión celular, a una concentración de 5 µg·ml-1 de clorofila, a dos matraces Erlenmeyer de 17 ml de capacidad, uno para realizar el experimento en condiciones óxicas, y otro para realizarlo en condiciones anóxicas. Para realizar el ensayo en condiciones óxicas los matraces se cerraban herméticamente con un tapón de goma y se agitaban en las mismas condiciones de cultivo durante 30 minutos. Por su parte, para realizar el ensayo en condiciones anóxicas, a los matraces se les añadían 5 µl de DCMU (3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetillurea) a una concentración final de 10 mM, se cerraban herméticamente con un tapón de goma, y se les sustituía toda la fase gaseosa por argón. Posteriormente, se agitaban en las mismas condiciones de cultivo durante 1 hora. Transcurrido el tiempo de incubación en cada caso, se inyectaban 2 ml de acetileno a cada matraz, resultando una atmósfera con un 13,3% (v/v) de acetileno en aire. A continuación, se tomaban muestras de 1 ml de la fase gaseosa cada 15 minutos, entre los 0 y los 90 minutos de incubación en presencia de acetileno, y se determinaba mediante cromatografía de gases la aparición de etileno en la fase gaseosa. Las medidas de etileno mediante cromatografía de gases se llevaron a cabo en el cromatógrafo de gases GC-2010 (Shimadzu) disponible en el Servicio de Cromatografía del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Finalmente, para normalizar la concentración de etileno producido se determinaba la concentración de clorofila de cada cultivo (apartado 2.5.1). Para el análisis de los datos se representaba la concentración de etileno/concentración de clorofila frente al tiempo. La pendiente de la recta corresponde a la actividad nitrogenasa de cada muestra en µmol de etileno producido·h-1·mg·Chl-1. Materiales y Métodos 80 2.8. Microscopía confocal láser para la detección de la proteína GFP en Nostoc sp. PCC 7120 La acumulación de la proteína testigo GFP en células de Nostoc sp. PCC 7120 se analizaba mediante microscopía confocal láser. Para ello, en este trabajo se ha utilizado la proteína GFPmut2, una versión modificada de la proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack et al., 1996). Las muestras se visualizaban con un objetivo de inmersión en aceite HCX PLAN-APO 63x 1.4 NA, en un microscopio confocal láser Leica TCS SP2. La proteína GFP se excitaba con una longitud de onda de 488 nm proporcionada por un láser de argón, y la fluorescencia emitida se monitorizaba en el rango de 500-538 nm (GFP), y en el rango de 630-700 nm para la fluorescencia inherente a los pigmentos cianobacterianos (autofluorescencia). Las muestras analizadas se disponían en medio sólido con el objetivo de visualizar todos los filamentos en el mismo plano. Los niveles de fluorescencia de la proteína GFP y de autofluorescencia fueron cuantificados mediante el tratamiento de las imágenes de microscopía confocal con el programa Leica Confocal Software. 2.9. Tinción de proheterocistos y heterocistos con azul Alcian El azul Alcian (Alcian Blue 8GX, Sigma Aldrich) tiñe los polisacáridos de la envuelta de los proheterocistos y heterocistos (McKinney, 1953). Para visualizarlos en el microscopio óptico, la muestra se preparaba mezclando en proporción 5:1 (v/v) la suspensión de las cianobacterias y una disolución de azul Alcian al 1% en (p/v) agua. 2.10. Análisis bioinformático de secuencias de DNA y proteínas Para el manejo rutinario de secuencias de DNA, incluyendo la búsqueda de pautas abiertas de lectura, localización de dianas de restricción, o traducción de secuencias nucleotídicas, se utilizaba el programa ApE (A plasmid Editor) diseñado por M. Wayne Davis, y disponible en (http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/). La secuencia del genoma completo de Nostoc sp. PCC 7120 (Kaneko et al., 2001), disponible en la base de datos Cyanobase (http://bacteria.kazusa.org.jp/cyanobase/), se utilizó para consultar secuencias de pautas abiertas de lectura y sus correspondientes contextos genómicos. Materiales y Métodos 81 Para el diseño de oligonucleótidos se utilizó la herramienta Oligo Calculator (http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/oligo-evaluator.html), del Web Toolbox de Sigma. Las secuencias de los sRNAs estudiados en este trabajo, así como sus secuencias homólogas, se obtuvieron de (Brenes-Álvarez et al., 2016). Para la predicción de la estructura secundaria de los sRNAs se utilizó Mfold (Zuker, 2003), disponible en (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form). Para el alineamiento de secuencias nucleotídicas y aminoacidicas se empleó la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), proporcionada por el National Center for Biotechnology Information (NCBI), así como el software MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), diseñado por Koichiro Tamura, Glen Stecher, Daniel Peterson, y Sudhir Kumar, y disponible en (https://www.megasoftware.net/). Este software usa el programa CLUSTALW2 (Chenna et al., 2003), proporcionado por el European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI). Para la identificación de posibles mRNAs regulados por los sRNAs de estudio, en este trabajo se empleó el algoritmo CopraRNA (Wright et al., 2013; Wright et al., 2014). Las predicciones de las posibles interacciones entre estos sRNAs y sus posibles mRNAs diana se llevaron a cabo con el algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017). Ambas herramientas se encuentran disponibles en la plataforma web RNA Tools (http://rna.informatik.uni-freiburg.de/) de la Universidad de Freiburg (Alemania). 3. RESULTADOS 3.1. CAPÍTULO I NsiR3, un sRNA cuya expresión se induce en condiciones de carencia de nitrógeno combinado Resultados Capítulo I 93 3. RESULTADOS 3.1. NsiR3, un sRNA cuya expresión se induce en condiciones de carencia de nitrógeno combinado 3.1.1. Identificación de NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120 En el análisis de dRNA-Seq realizado en Nostoc sp. PCC 7120 (Mitschke et al., 2011b), se identificó un TSS (Transcription Start Site) en la posición 5452083f que corresponde a un transcrito que se induce significativamente en ausencia de nitrógeno combinado. Este TSS se encuentra situado en la región intergénica, de 319 pb, comprendida entre dos marcos abiertos de lectura anotados, asl4557 y all4558. Asimismo, en otro experimento de RNA-Seq disponible en Nostoc sp. PCC 7120 (Flaherty et al., 2011), también se observó una transcripción regulada por nitrógeno en dicha región. La transcripción regulada a partir de este TSS se verificó experimentalmente mediante Northern blot, y el sRNA correspondiente se denominó NsiR3 (nitrogen stress-induced RNA 3) (Mitschke et al., 2011b). En la Figura 3.1 se muestra una representación esquemática de nsiR3 y su entorno genómico. Figura 3.1. Representación esquemática de la región que codifica NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120. Se indican en gris los dos marcos de lectura abiertos que flanquean nsiR3 (en rojo), junto con la región utilizada como sonda en los análisis de Northern blot. La flecha negra indica el inicio de la transcripción en la posición 5452083f (Mitschke et al., 2011b). Los lazos indican posibles terminadores transcripcionales para nsiR3. Por otro lado, a través de un acercamiento realizado en nuestro laboratorio para la identificación global de sRNAs conservados filogenéticamente en cianobacterias (Brenes- Álvarez et al., 2016), se identificó a NsiR3 como un sRNA filogenéticamente conservado en todos los genomas de las cianobacterias formadoras de heterocistos. El alineamiento de las secuencias que codifican homólogos de NsiR3 identificados en (Brenes-Álvarez et al., 2016), así como la predicción de la estructura secundaria de los sRNAs correspondientes (Figura 3.2), permite la identificación de dos posibles terminadores transcripcionales independientes de Rho. Uno de estos terminadores se encuentra entre las posiciones 5452104 y 5452127 del genomio de Nostoc sp. PCC 7120, generando un sRNA de aproximadamente 45 pb, al que hemos denominado NsiR3S. Además, en Nostoc sp. PCC 7120 y algunas cianobacterias muy cercanas filogenéticamente a ella, la región conservada se extiende hasta otro posible terminador transcripcional independiente de Rho, situado entre las posiciones 5452149 y 5452182, de manera que se podría producir una versión extendida de NsiR3, de aproximadamente 100 pb, a la que hemos denominado NsiR3L. Este segundo terminador está constituido por secuencias STRR (short tandemly repeated repetitive), repeticiones imperfectas de 7 nucleótidos que se encuentran en los genomas de cianobacterias filamentosas (Mazel et al., 1990; Vioque, 1997). Resultados Capítulo I 94 Figura 3.2. (A) Alineamiento de los homólogos de NsiR3 identificados en (Brenes-Álvarez et al., 2016). La secuencia de Nostoc sp. PCC 7120 se muestra en negrita. Los nucleótidos sombreados en gris indican una conservación de la secuencia de más del 90% hasta el terminador T1, y de al menos un 75% hasta el terminador T2. El TSS verificado en Nostoc sp. PCC 7120 (Mitschke et al., 2011b) aparece marcado con un círculo rojo. Los posibles lazos terminadores conservados en NsiR3S o NsiR3L se indican con una barra negra. Las secuencias STRR aparecen señaladas con recuadros azules. (B) Modelo de la estructura secundaria de NsiR3 según Mfold. Se señalan los dos posibles terminadores de la transcripción, así como las secuencias STRR que forman el lazo terminador T2. Al objeto de validar experimentalmente la transcripción de ambas versiones de NsiR3, se realizó un análisis Northern blot (Figura 3.3) con RNA extraído de células de Nostoc sp. PCC 7120 cultivadas en presencia de amonio o en ausencia de nitrógeno combinado durante distintos periodos de tiempo, usando como sonda un fragmento de DNA que corresponde a la región intergénica entre asl4557 y all4558 (véase Figura 3.1). Figura 3.3. Análisis de la expresión de NsiR3 en Nostoc sp. PCC 7120. (A) Northern blot con 7,5 µg de RNA total procedente de células de Nostoc sp. PCC 7120 cultivadas en presencia de amonio (0), y posteriormente transferidas a un medio sin nitrógeno combinado durante el número de horas indicado. El panel superior muestra la hibridación con una sonda complementaria a NsiR3. Se utilizó como sonda un fragmento de 403 nt (Figura 3.1) obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 125 y 126. Se indican con triángulos negros las dos bandas detectadas, correspondientes a NsiR3L y NsiR3S. El panel inferior muestra la hibridación de la misma membrana con una sonda complementaria al RNA 5S (Tabla 2.6), utilizado como control de carga y transferencia. Los tamaños aproximados de los transcritos se indican a la izquierda (en nt). (B) Cuantificación de la acumulación del transcrito NsiR3L. Se representa la cantidad de transcrito NsiR3L normalizada por la cantidad de RNA 5S en unidades arbitrarias (u.a.). Se muestra un experimento representativo. Resultados Capítulo I 95 En la Figura 3.3 puede observarse la expresión de dos transcritos de aproximadamente 45 y 100 nucleótidos, que corresponderían a las dos versiones de NsiR3 descritas anteriormente, cuya transcripción se induce en condiciones de carencia de nitrógeno combinado. Se observa que la versión larga de NsiR3 es la más abundante en Nostoc sp. PCC 7120, motivo por el que se decidió utilizar dicha versión a lo largo de este trabajo. 3.1.2. Regulación de la expresión de nsiR3 por NtcA Como se ha descrito en la Introducción, en las cianobacterias la regulación transcripcional de la respuesta al estrés nutricional por carencia de nitrógeno está comúnmente operada de forma directa a través de la unión de NtcA, el regulador global de la asimilación de nitrógeno, a secuencias específicas conservadas en los promotores de los genes regulados. Dado que la transcripción de NsiR3 depende de NtcA (Mitschke et al., 2011b; Brenes-Álvarez et al., 2016) , se decidió analizar si NtcA actúa directamente sobre el promotor de este sRNA. En primer lugar, se comparó la secuencia del promotor de nsiR3 de Nostoc sp. PCC 7120 con las secuencias promotoras de los homólogos de NsiR3 identificados (Figura 3.4). En todos los promotores de los genomas analizados se encontró un posible motivo de unión de NtcA (GTN10AC) conservado (Mitschke et al., 2011b; Picossi et al., 2014; Giner-Lamia et al., 2017), que en este promotor en concreto corresponde a GTKN8YAC. Este posible motivo de unión de NtcA conservado está situado 22 nucleótidos aguas arriba de una posible caja -10, una posición descrita en varios promotores activados por NtcA (Mitschke et al., 2011; Picossi et al., 2014). Figura 3.4. Comparación de las secuencias promotoras de los homólogos de NsiR3 identificados en (Brenes-Álvarez et al., 2016). La secuencia de Nostoc sp. PCC 7120 se muestra en negrita. El TSS verificado en Nostoc sp. PCC 7120 (Mitschke et al., 2011b) aparece marcado con un círculo rojo, mientras que el TSS verificado en Nodularia spumigena CCY9414 (Voß et al., 2013) se señala con un círculo azul. Se resaltan en gris los posibles sitios de unión de NtcA. La posible caja -10 se enmarca en un recuadro. Sitio de unión a NtcA Nostoc sp.PCC 7120 AAAATAATT---GGTGTCAATTTATACTATTTTAATTTTTTTTAGTCGTTATACTCATTTCT-A Nostoc sp.PCC 7524 CAATAAATT---GGTGTCAATTTATACGATTTTAATTCTCTCTAGTCGTTATACTCATTTCT-A Anabaena variabilis ATCC 29413 AAAATAATT---GGTGTCAATTTATACGATTTTAATTTTTTTTAGTCGTTATACTCATTTCT-A Nostoc punctiforme PCC 73102 CAGCTAATT---GGTGTTTGTTTATACTATTTCAAATTTTTGTAGTCGTTATACTCATAACTTA Fischerella sp.JSC-11 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTATTATGCCCGTTATACTGTTTTTC-A Fischerella thermalis PCC 7521 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTATTATGCCCGTTATACTGTTTTTC-A Fischerella muscicola PCC 7414 AGGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTATTATGCCAGTTATACTGTTTTTC-A Fischerella sp.PCC 9431 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTCTTATGACCGTTATACTGTTTTTC-A Fischerella muscicola PCC 73103 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTCTTATGACCGCTATACTGTTTT-C-A Fischerella sp.PCC 9339 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTATATTTCTTATGACCGCTATACTGTTTT-C-A Fischerella sp.PCC 9605 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTGAATTTATTATAAACGTTATACTATTTCTC-A Cyanobacterium PCC 7702 CAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTGAAGATTTTCTGCCCGTTATACTAGATTTTCA Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTGAATATTTTCTGCCCGTTATACTATCTTTC-A Chlorogloeopsis sp.PCC 9212 AAGTTAATA---AGTGTTACTTTATACTATTTGAATATTTTCTGCCCGTTATACTATCTTTC-A Mastigocladopsis repens PCC 10914 AACTTAATA---AGTGTAGAATTATACTATTTAAATTTCTTATAAAAGTTATACTTGTTCTT-A Calothrix sp.PCC 7103 TTTCTGAAC---AGTGTAGGTTTATACTATTTGAAAATTGTATAAGCAATATACTAACTTTT-A Calothrix sp.PCC 6303 CTACAAATC----GTGTCAGCTGATACGATTTGAAAACTATGTGGATCTTATACTTGACTTT-A Nostoc sp.PCC 7107 AGATTAATC---AGTGTCTATTTATACCATTTTCTATTTCGGAAATCGCTATACTTATCTCT-A Cylindrospermum stagnale PCC 7417 AAAATTTTC---AGTGTTAAATTATACTTTTTTAAAAGTTCATAGTCGTTATACTCATTTCT-A Anabaena cylindrica PCC 7122 TACCAGAGATTTAGTGTTAAATTATACAATTTTAAATTTGGACAGTCGTTATACTCATTCCAAA Anabaena sp.PCC 7108 TTGAAATTC----GTGTTAATTTATACGATTTTAAATTCCGACAGTGGTTATACTCATTGCTTA Nostoc azollae 0708 TTTAAAGTT---TGTTCTATTGTATACATTTTTAAATATTGCTAGTCGTTATACTCATTGCTAA Calothrix sp.PCC 7507 CACTGATTT---AGTGTCAGTTTATACGATTTTAAACCTGTTTAGTAGTTATACTCTTTCTT-A Microchaete sp.PCC 7126 CAGCCATTT---AGTGTCAGTTTATACGATTTTCAACTTGTTTAGTAGTTATACTCTTTCTT-A Nodularia spumigena CCY9414 CTATGAATT---AGTGTTAATTTATACTATTTATAATTTGGATAGTCGTTATACTCATTTTT-A Scytonema hofmanni UTEX 2349 AAA--AAAC---AGTGTCACTTTACACCATTTTAAATTTTAATTTTACTTATAATAATTCTC-A Rivularia sp.PCC 7116 TAATAAATC---AGTTTCAATTTATACGATTTTTGGTTTATATAGTCGCTATACTTTTCT-C-A Caja -10 Resultados Capítulo I 96 Al objeto de verificar la posible interacción entre NtcA y la región promotora de NsiR3, se llevó a cabo un ensayo in vitro de retardo de la movilidad electroforética con proteína NtcA purificada, y un fragmento de DNA, que se extiende desde -118 a +31 con respecto al TSS de nsiR3, que incluye la posible secuencia de unión de NtcA. Como se observa en la Figura 3.5, en presencia de la proteína NtcA se produce un retardo del fragmento de DNA que contiene la secuencia promotora de nsiR3. Sin embargo, la cantidad de fragmento unido a NtcA es significativamente menor cuando el ensayo se realiza con un fragmento de DNA que contiene una versión del promotor de nsiR3 con el posible sitio de unión de NtcA mutado (GTG se cambió a CAC). La mutagénesis se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 469 y 23, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 420 y 421 (Tabla 2.5). Estos resultados demuestran la unión de NtcA a una secuencia específica del promotor de NsiR3 centrada alrededor de la posición -41,5 con respecto al TSS. Estas observaciones son compatibles con la activación directa de la transcripción del promotor de NsiR3 por NtcA en condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado. Figura 3.5. Unión de la proteína NtcA a la región promotora de NsiR3. Ensayo de retardo de la movilidad electroforética con proteína NtcA purificada. Se utilizó como sonda un fragmento de DNA de 149 pb, obtenido por PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos 469 y 23, que contiene el promotor de NsiR3 de Nostoc sp. PCC 7120, y que está marcado en los extremos 5’ con [g-32P]-ATP. En el panel de la izquierda se muestra el experimento realizado con la versión silvestre del promotor. En el panel de la derecha se muestra el experimento realizado con una versión mutada del promotor, alterada en las posiciones señaladas en rojo. La posición de los fragmentos de DNA retardados se indica con un triángulo negro, mientras que los fragmentos libres se indican con triángulos vacíos. 3.1.3. Selección de posibles mRNAs diana de NsiR3 Para la identificación de posibles mRNAs regulados por NsiR3 se utilizaron varios acercamientos. En primer lugar, en nuestro laboratorio está disponible un análisis global del transcriptoma de Nostoc sp. PCC 7120 y de una estirpe mutante que carece de NsiR3 (ΔnsiR3). Esta estirpe (proporcionada por la Doctora Elvira de Olmedo-Verd) fue generada mediante el proceso de doble recombinación por deleción descrito en el apartado 2.2.9.3, procedimiento Resultados Capítulo I 97 mediante el cual se eliminó la región de DNA que contiene nsiR3. El análisis global del transcriptoma de estas estirpes fue llevado a cabo mediante un experimento de hibridación de microarrays (datos no publicados) en el que se compararon, en la estirpe silvestre y el mutante ΔnsiR3, los cambios transcripcionales que ocurren cuando células cultivadas en presencia de amonio se transfieren a un medio sin nitrógeno combinado durante 8 horas. A partir de los resultados se identificaron siete genes, alr2346, all3327, all2740, alr3410, all2806, all0298 y alr0607 (nirA), cuya expresión era significativamente mayor en el mutante ΔnsiR3 que en la estirpe silvestre (Figura 3.6), lo que podría sugerir que estuvieran regulados negativamente por NsiR3. De entre todos ellos se seleccionaron para su estudio cuatro genes, alr3410, all2806, alr0607 (nirA) y all3327, para los que la aplicación del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017) predice una posible interacción con NsiR3 en una zona próxima al codón de inicio de la traducción del mRNA (Figura 3.7). La información obtenida del análisis de los datos del experimento de microarray para estos cuatro genes se recoge en la Tabla 3.2. Figura 3.6. Comparación entre la estirpe Nostoc sp. PCC 7120 y la estirpe mutante ΔnsiR3 de los cambios transcripcionales que ocurren tras 8 horas (N2) en condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado. Cada punto representa un gen o elemento del experimento de hibridación de microarrays con p-value <0,005. En el eje x se representa, para la estirpe silvestre, la diferencia (log2) en la señal detectada cuando el microarray se hibrida con RNA extraído tras 8 horas (N2) en ausencia de nitrógeno combinado con respecto a la señal detectada con RNA extraído de células cultivadas en amonio (NH4+). En el eje y se representan los mismos datos para la estirpe ∆nsiR3. Los elementos situados sobre la línea discontinua tienen una expresión significativamente mayor (∆log2 del cambio de expresión > 1,5) en el mutante ΔnsiR3 que en el silvestre. Se resaltan en rojo aquellos genes seleccionados para su análisis posterior en base a este criterio. Se muestran también los genes seleccionados en base a otros criterios (ver más adelante), como la correlación con NsiR3 en la red de coexpresión (en verde) o la predicción de dianas por parte del algoritmo CopraRNA (en azul) (Tabla 3.1). Resultados Capítulo I 104 expresa NsiR3, se analizó la acumulación de la proteína sfGFP mediante Western blot utilizando un anticuerpo frente a GFP (Figura 3.8B), tal y como se describe en el apartado 2.4.6. Se espera que la interacción entre NsiR3 y el mRNA que se esté analizando en cada caso produzca una alteración de los niveles de fluorescencia o de la acumulación de proteína sfGFP con respecto a las células control, portadoras de la fusión mRNA::sfgfp correspondiente y pJV300. Figura 3.8. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsiR3 y la región 5´UTR de los mRNAs seleccionados. (A) Cuantificación de sfGFP mediante fluorescencia. Se representan los niveles de fluorescencia relativa de cultivos de E. coli que portan un plásmido con la fusión mRNA::sfgfp combinado con el plásmido control pJV300, o con el plásmido pIAE19, que codifica NsiR3. Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar de las medidas de fluorescencia de ocho cultivos provenientes de colonias independientes. Para el cálculo de estos valores de fluorescencia se normalizó por la cantidad de células (A600 nm), y se restaron los niveles de fluorescencia de células que portan pXG-0, un plásmido control sin sfgfp. La fluorescencia de las células portadoras de las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido pJV300 se ha considerado en cada caso como 100%. Se indica el p-value correspondiente al test de Student en los casos en los que la diferencia de fluorescencia es significativa. La tabla muestra los valores de fluorescencia absolutos en unidades arbitrarias (u.a.) de las células que portan las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300. (B) Cuantificación de sfGFP mediante Western blot. Western blot de células de E. coli que portan un plásmido con la fusión mRNA::sfgfp combinado con el plásmido control pJV300, o con el plásmido pIAE19, que codifica NsiR3. El análisis se realizó con anticuerpos comerciales frente a GFP o proteína GroEL, que se usó como control de carga y transferencia. Los números en la parte inferior de la imagen indican los niveles relativos de sfGFP con respecto al control, después de la normalización con la señal para GroEL. Los datos se representan como la media ± la desviación estándar de los resultados obtenidos a partir de cuatro cultivos provenientes de colonias independientes. Resultados Capítulo I 105 En la Figura 3.8A sólo se observa una reducción significativa en los niveles de fluorescencia sfGFP en las células de E. coli en las que se coexpresa NsiR3 (pIAE19) en combinación con las fusiones traduccionales putA::sfgfp (pIAE48) o alr2431::sfgfp (pIAE49) (Tabla 2.4). La disminución de los niveles de fluorescencia en las células que portan estas dos fusiones traduccionales en presencia de NsiR3 con respecto a las células control es de un 40% en el caso de putA, y de un 30% en el caso de alr2431. Estos resultados sugieren una interacción directa entre NsiR3 y la región 5´UTR de putA y alr2431, que tendría como resultado en ambos casos una represión de su traducción. Como puede observarse en la Figura 3.8B, todas las fusiones traduccionales mRNA::sfgfp analizadas mediante Western blot mostraron unos niveles de proteína sfGFP detectables, lo que demuestra que la región del inicio de la traducción de estos mRNAs es funcional en E. coli. Sin embargo, en ninguna de estas fusiones se apreció una alteración de la acumulación de proteína sfGFP en presencia de NsiR3 con respecto a las células control. Al objeto de verificar que la interacción entre NsiR3 y la región 5´UTR de putA y alr2431 tiene lugar en la región predicha por IntaRNA (Figura 3.7), se introdujeron mutaciones puntuales mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2 en la región de la secuencia de NsiR3 que se predice que está implicada en la interacción con estos dos transcritos. El diseño de estas mutaciones puntuales se realizó con el apoyo del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017). De este modo, una vez seleccionado el nucleótido a mutar, y antes de proceder con la mutación propiamente dicha, se repetía in silico la predicción de la interacción con el algoritmo IntaRNA, utilizando la secuencia de NsiR3 mutada. Se consideraba que un nucleótido era un buen candidato a mutar, si tras su mutación, la zona de interacción predicha cambiaba de posición, o su estabilidad se veía reducida con respecto a la predicción realizada con la secuencia silvestre. Por lo tanto, con la realización de estas mutaciones puntuales en la secuencia de NsiR3 se espera que la interacción entre este sRNA y los mRNAs se vea afectada, lo que se reflejaría en la supresión de la reducción en los niveles de fluorescencia observados. Además, se realizaron las correspondientes mutaciones compensatorias en la región 5´UTR de los mRNAs, evaluando con IntaRNA que la interacción volviera a ocurrir en las mismas posiciones y con una estabilidad similar a la de la interacción predicha entre las secuencias silvestres. Las predicciones realizadas con el algoritmo IntaRNA (Figura 3.7) sugieren que la posible región de NsiR3 que interacciona con la región 5´UTR de estos dos mRNAs está comprendida entre los nucleótidos 1-15, en el caso de putA, y 6-18 en el caso de alr2431. Como puede observarse, existe una región de NsiR3, comprendida entre los nucleótidos 6-15, Resultados Capítulo I 106 que estaría implicada en ambas interacciones. Teniendo en cuenta estas predicciones, se introdujo una mutación puntual, cambio de G a C, en el nucleótido 14 de la secuencia de NsiR3 (Figura 3.9A). La mutagénesis se realizó mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 704 y 283, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 689 y 690 (Tabla 2.5). Esta versión mutada se denominó Mut-14, y el plásmido que contiene esta versión mutada en lugar de la versión silvestre se denominó pIAE61 (Tabla 2.4). Además, se introdujeron las correspondientes mutaciones compensatorias, cambio de C a G, en el nucleótido -17 de la región 5´UTR de putA (versión Comp-14*17), y en el nucleótido -53 de la región 5´UTR de alr2431 (versión Comp-14*53) (Figura 3.9A). De nuevo, las mutagénesis se realizaron mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 645 y 646, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 718 y 719, en el caso de putA. En el caso de alr2431, se utilizaron como cebadores externos los oligonucleótidos 649 y 650, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 720 y 721 (Tabla 2.5). Los plásmidos que portaban estas versiones mutadas se denominaron pIAE62 (versión Comp-14*17) y pIAE63 (versión Comp-14*53) (Tabla 2.4). Una vez realizadas estas mutaciones, se evaluaron los cambios en los niveles de fluorescencia de las células de E. coli que portaban diferentes combinaciones de estos plásmidos. Las medidas de fluorescencia de los cultivos líquidos de E. coli se llevaron a cabo mediante fluorimetría (Figura 3.9B) y citometría de flujo (Figura 3.9C) según se describe en el apartado 2.6. Los niveles de fluorescencia de las células que portan las fusiones a sfgfp de la región 5´UTR silvestre de putA o de alr2431 combinada con la versión mutada de NsiR3 (Mut-14), son similares a los de las células portadoras de dichas fusiones combinadas con el plásmido pJV300 (control). Esta observación sugiere que la mutación de este nucleótido de NsiR3 reduce drásticamente la interacción entre este sRNA y la región 5´UTR de estos dos mRNAs. Además, cuando se combina la versión mutada de NsiR3 con la fusión portadora de una mutación compensatoria en la región 5´UTR de putA, se observa de nuevo una reducción significativa en los niveles de fluorescencia, similar a la obtenida con la combinación de los transcritos silvestres, confirmándose que la interacción de NsiR3 con la región 5´UTR del mRNA de putA tiene lugar a través de los nucleótidos predichos por IntaRNA, así como el efecto de dicha interacción sobre la traducción de la proteína PutA. Sin embargo, cuando se combina la versión mutada de NsiR3 con la correspondiente versión con una mutación compensatoria en la región 5´UTR de alr2431, no se aprecia una reducción en los niveles de fluorescencia. Estos datos sugieren que estos dos nucleótidos no interaccionarían entre sí, aunque si estarían implicados en la interacción entre estas dos moléculas de RNA. Resultados Capítulo I 107 Figura 3.9. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de las interacciones entre NsiR3 y la región 5´UTR de putA y de alr2431. (A) Interacciones entre NsiR3 y la región 5´UTR de putA (izquierda) y de alr2431 (derecha) según las predicciones del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017). Los nucleótidos de putA y alr2431 se numeran con respecto al inicio de la traducción. El codón AUG aparece señalado en rojo. El codón de inicio de la traducción de putA es GUG. Se resalta en amarillo la mutación, cambio de G a A, llevada a cabo en el codón de inicio de putA para mejorar la eficiencia de la traducción en E. coli. La mutación introducida en NsiR3 en la posición 14 (Mut-14) está indicada en rojo. Las correspondientes mutaciones compensatorias, Comp-14*17 (izquierda) y Comp-14*53 (derecha), en las posiciones -17 y -53 de la región 5´UTR de putA y de alr2431 respectivamente, están indicadas en azul. (B) Cuantificación de sfGFP mediante fluorescencia. Se representan los niveles de fluorescencia relativa de cultivos de E. coli que portan un plásmido con la versión silvestre, o con las versiones Comp-14*17 o Comp-14*53 de las fusiones putA::sfgfp y alr2431::sfgfp respectivamente, combinado con un plásmido que codifica la versión silvestre de NsiR3, la versión Mut-14 de NsiR3, o un RNA no relacionado usado como control (pJV300). Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar de las medidas de fluorescencia de ocho cultivos provenientes de colonias independientes. Para el cálculo de estos valores de fluorescencia se normalizó por la cantidad de células (A600 nm), y se restaron los niveles de fluorescencia de células que portan pXG-0, un plásmido control sin sfgfp. La fluorescencia de las células portadoras de las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300 se considera en cada caso como 100%. Se indica el p-value correspondiente al test de Student en los casos en los que la diferencia de fluorescencia es significativa. La tabla muestra los valores de fluorescencia absolutos en unidades arbitrarias (u.a.) de las céluas conteniendo las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300. (C) Cuantificación de sfGFP mediante citometría de flujo. Los ensayos se realizaron con cultivos en estado estacionario de las estirpes de E. coli que portan un plásmido con la versión silvestre, o con las versiones Comp-14*17 o Comp-14*53 de las fusiones putA::sfgfp y alr2431::sfgfp respectivamente, combinado con un plásmido que codifica la versión silvestre de NsiR3, la versión Mut-14 de NsiR3, o un RNA no relacionado usado como control (pJV300). Se adquirieron datos de 50.000 células por muestra. mRNA::sfgfp Fluorescencia (u.a.) (pJV300) putA::sfgfp 310 putA::sfgfp (Comp-14*17) 240 mRNA::sfgfp Fluorescencia (u.a.) (pJV300) alr2431::sfgfp 9,5 alr2431::sfgfp (Comp-14*53) 7 AG putA (Comp-14*17) -18 -4 | | 5'-AUUAA UU AUCAGUG-3' CUCAGG AG CCU |:|||| || ||| GGGUCC UC GGA-5' 3'-CUAAA A UU | | | 15 1 mRNA putA NsiR3 C NsiR3 (Mut-14) -57 -45 | | 5'-GUGAC CACGG...AUG-3' UUUCCCAGGUA ||||||||||| AAAGGGUCCAU 3'-AGUCU CUUGGA-5' | | 18 6 mRNA alr2431 NsiR3 G alr2431 (Comp-14*53) C NsiR3 (Mut-14) B 0 20 40 60 80 100 120 140 Fluorescencia relativa (%) alr2431::sfgfp alr2431::sfgfp (Comp-14*53) 0 20 40 60 80 100 120 140 Fluorescencia relativa (%) putA::sfgfp putA::sfgfp (Comp-14*17) Control NsiR3 NsiR3 (Mut-14) P<0,0001 P<0,0001 P=0,003 P=0,004 C Número de células Fluorescencia putA::sfgfp + Control putA::sfgfp + NsiR3 (Mut-14) putA::sfgfp + NsiR3 alr2431::sfgfp (Comp-14*53) + Control alr2431::sfgfp (Comp-14*53) + NsiR3 (Mut-14) alr2431::sfgfp (Comp-14*53) + NsiR3 putA::sfgfp (Comp-14*17) + Control putA::sfgfp (Comp-14*17) + NsiR3 (Mut-14) putA::sfgfp (Comp-14*17) + NsiR3 Número de células Fluorescencia alr2431::sfgfp + Control alr2431::sfgfp + NsiR3 (Mut-14) alr2431::sfgfp + NsiR3 Número de células Fluorescencia Número de células Fluorescencia Control NsiR3 NsiR3 (Mut-14) Resultados Capítulo I 108 Los resultados obtenidos confirman la interacción entre NsiR3 y la región 5´UTR de los mRNAs de putA y alr2431. Al objeto de comprobar si dichas interacciones están conservadas en la mayoría de las cianobacterias que contienen NsiR3, se realizó una predicción con el algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017) para cada uno de los organismos de la Figura 3.2. Al analizar los datos obtenidos se observó que las interacciones predichas por el algoritmo IntaRNA en Nostoc sp. PCC 7120 no estaban conservadas en el resto de cianobacterias. Estos resultados son congruentes con el hecho de que putA y alr2431 no apareciesen en el análisis de CopraRNA, un acercamiento que tiene en cuenta, entre otros factores, la conservación filogenética del sRNA y de sus posibles dianas. Como ya se ha mencionado anteriormente, la identificación de estos mRNAs diana se basó únicamente en el análisis de la red de coexpresión disponible en el laboratorio. 3.1.5. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 Para estudiar in vivo en Nostoc sp. PCC 7120 el posible efecto de NsiR3 sobre la expresión de alr2431 se utilizó la estirpe ΔnsiR3, y se generó una estirpe, ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3 (Tabla 2.1), en la que la expresión de NsiR3 está bajo el control del promotor de petE, un promotor inducible mediante la adición de cobre (Buikema y Haselkorn, 2001). De este modo, la transcripción de NsiR3 pasa a estar regulada por cobre, de forma independiente a la fuente de nitrógeno disponible. Para la generación de esta estirpe, se fusionó el promotor de petE a la secuencia que codifica NsiR3L mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, y el fragmento resultante se clonó en el plásmido replicativo pSAM221, generando el plásmido pIAE24 (Tabla 2.4), que se introdujo en la estirpe ΔnsiR3 de Nostoc sp. PCC 7120 por conjugación (apartado 2.2.9.3). Los datos de dRNA-Seq (Mitschke et al., 2011b) indican que alr2431 se transcribe a partir de un TSS cuya expresión se reprime aproximadamente un 50% en respuesta a la carencia de nitrógeno combinado. Al objeto de analizar in vivo el posible efecto de NsiR3 sobre la regulación de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120, se comparó la acumulación del transcrito alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 y en las dos estirpes con niveles alterados de NsiR3, ΔnsiR3 y ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3. Para ello, se analizó mediante Northern blot la expresión del transcrito alr2431 en células de estas estirpes sometidas a distintos periodos de carencia de nitrógeno combinado (Figura 3.10). Para la realización de estos experimentos, a los cultivos de estas estirpes establecidos en amonio se les retiró el nitrógeno combinado del medio, situación en la que la transcripción del mRNA de alr2431 se reprimiría en la estirpe silvestre. Simultáneamente se les añadió 1,5 µM de CuSO4, lo que induciría la expresión de NsiR3 a partir Resultados Capítulo I 109 del promotor de petE en la estirpe ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3. Los análisis de Northern blot realizados en la estirpe silvestre de Nostoc sp. PCC 7120 muestran la expresión de un transcrito de 1,5 kb cuya acumulación se reprime en ausencia de nitrógeno combinado, confirmando los datos de dRNA-Seq. Además, a diferencia de lo que ocurre en la estirpe silvestre, se observa que la acumulación del transcrito alr2431 no se reprime en la estirpe ∆nsiR3 cuando se retira el nitrógeno combinado del medio, permaneciendo en unos niveles similares a los existentes en presencia de nitrógeno combinado. Sin embargo, la acumulación del transcrito alr2431 sí se reduce fuertemente en la estirpe ∆nsiR3 + PpetE::nsiR3, en la que NsiR3 se expresa a partir del promotor de petE. Estos resultados sugieren que NsiR3 tiene un significativo efecto negativo sobre la acumulación del mRNA de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120. Figura 3.10. Identificación mediante Northern blot del transcrito de alr2431 en Nostoc sp. PCC 7120 y efecto de NsiR3 sobre la acumulación del mismo. (A) Representación esquemática del operón formado por los genes alr2431-alr2432 en Nostoc sp. PCC 7120. Se indica con una barra negra la región utilizada como sonda en los análisis de Northern blot. La posición del TSS de alr2431 definido en (Mitschke et al., 2011b) se representa con una flecha negra. (B) Efecto de NsiR3 sobre la acumulación del transcrito de alr2431 en estirpes con niveles alterados de NsiR3. Northern blot con 8,5 µg de RNA total procedente de células de Nostoc sp. PCC 7120 y de las estirpes ∆nsiR3 y ∆nsiR3 + PpetE::nsiR3. Las células se cultivaron en presencia de amonio en un medio en ausencia de cobre (0), para evitar la expresión del promotor de petE, y posteriormente se transfirieron a un medio sin nitrógeno combinado al que se añadió 1,5 µM de CuSO4, recogiendo muestras para su análisis tras el número de horas indicado. El panel superior muestra la expresión del transcrito de alr2431. Se utilizó como sonda un fragmento de 499 nt obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 649 y 802. Los marcadores de tamaño (en kb) están indicados a la izquierda. El panel central muestra la expresión del transcrito NsiR3 en la misma membrana. Se utilizó como sonda un fragmento de 403 nt (Figura 3.1) obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 125 y 126. El panel inferior muestra la hibridación de la misma membrana con la sonda para el gen rnpB (Tabla 2.6), utilizado como control de carga y transferencia. Se muestra un experimento representativo. 3.1.6. Efecto de NsiR3 sobre la expresión de putA en Nostoc sp. PCC 7120 Los datos de dRNA-Seq (Mitschke et al., 2011b) indican que putA se expresa a partir de dos TSS muy próximos, separados sólo 15 nucleótidos, cuya transcripción se reprime en respuesta a la carencia de nitrógeno combinado. Los análisis de Northern blot realizados con la estirpe silvestre de Nostoc sp. PCC 7120 muestran una represión transitoria del transcrito de Resultados Capítulo I 110 putA durante las primeras horas de exposición a la situación de carencia de nitrógeno combinado, mientras tiene lugar la diferenciación de los heterocistos (Figura 3.11). Una vez diferenciados, los heterocistos maduros comienzan a fijar nitrógeno atmosférico, por lo que la deficiencia de nitrógeno combinado se revierte en torno a las 24 horas, apreciándose una recuperación parcial del nivel de expresión de putA. Además, se observa que la dinámica de expresión del transcrito putA en Nostoc sp. PCC 7120 en respuesta a la carencia de nitrógeno combinado es complementaria a la observada para NsiR3. Esta observación sería consistente con la implicación de NsiR3 en la regulación de putA. Figura 3.11. (A) Análisis de la regulación del transcrito de putA en Nostoc sp. PCC 7120. Northern blot con 8 µg de RNA total procedente de células de Nostoc sp. PCC 7120 cultivadas en presencia de amonio (0), y posteriormente transferidas a un medio sin nitrógeno combinado durante el número de horas indicado. El panel superior muestra la expresión del transcrito de putA. Se utilizó como sonda un fragmento de 122 nt obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 645 y 646. La posición del rRNA 23S (2,8 kb) se indica a la izquierda. El panel central muestra la expresión del transcrito NsiR3 en la misma membrana. Se utilizó como sonda un fragmento de 403 nt (Figura 3.1) obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 125 y 126. El panel inferior muestra la hibridación de la misma membrana con la sonda para el gen rnpB (Tabla 2.6), utilizado como control de carga y transferencia. (B) Cuantificación de la acumulación de los transcritos de putA y nsiR3. Se representa la cantidad de cada transcrito normalizada por la cantidad de rnpB como porcentaje del máximo. Se muestra un experimento representativo. Al objeto de analizar in vivo el posible efecto de NsiR3 sobre la regulación de putA en Nostoc sp. PCC 7120, se comparó la acumulación del transcrito putA en las dos estirpes con niveles alterados de NsiR3, ΔnsiR3 y ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3. Para ello, se analizó mediante Northern blot la expresión del transcrito putA en células de estas estirpes sometidas a distintos periodos de carencia de nitrógeno combinado (Figura 3.12). Para la realización de estos experimentos, a los cultivos de estas estirpes establecidos en amonio se les retiró el nitrógeno combinado del medio, situación en la que la transcripción del mRNA de putA se reprime. Simultáneamente se les añadió 1,5 µM de CuSO4 para inducir la expresión de NsiR3 a partir del promotor de petE en la estirpe ΔnsiR3 + PpetE::nsiR3. Resultados Capítulo I 111 Figura 3.12. Efecto de NsiR3 sobre la acumulación del transcrito de putA en estirpes con niveles alterados de NsiR3. Northern blot con 8,5 µg de RNA total procedente de células de las estirpes ∆nsiR3 y ∆nsiR3 + PpetE::nsiR3. Las células se cultivaron en presencia de amonio en un medio en ausencia de cobre (0), para evitar la expresión del promotor de petE, y posteriormente se transfirieron a un medio sin nitrógeno combinado al que se añadió 1,5 µM de CuSO4, recogiendo muestras para su análisis tras el número de horas indicado. El panel superior muestra la expresión del transcrito de putA. Se utilizó como sonda un fragmento de 122 nt obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 645 y 646. Los marcadores de tamaño (en kb) están indicados a la izquierda. El panel central muestra la expresión del transcrito NsiR3 en la misma membrana. Se utilizó como sonda un fragmento de 403 nt (Figura 3.1) obtenido a partir de un producto de PCR generado utilizando como cebadores los oligonucleótidos 125 y 126. El panel inferior muestra la hibridación de la misma membrana con la sonda para el gen rnpB (Tabla 2.6), utilizado como control de carga y transferencia. Se muestra un experimento representativo. Se observa que la acumulación del transcrito putA, a diferencia de lo que ocurre en la estirpe silvestre, no se reprime en la estirpe ∆nsiR3 cuando se retira el nitrógeno combinado del medio, permaneciendo en unos niveles similares a los existentes en presencia de nitrógeno combinado. Sin embargo, la acumulación del transcrito putA sí se reduce fuertemente en la estirpe ∆nsiR3 + PpetE::nsiR3, que expresa NsiR3 a partir del promotor de petE. Estos resultados sugieren que NsiR3 tiene un significativo efecto negativo sobre la acumulación del mRNA de putA en Nostoc sp. PCC 7120. 3.2. CAPÍTULO II NsrR1, un sRNA cuya expresión se reprime en condiciones de carencia de nitrógeno combinado Resultados Capítulo II 120 En la Tabla 3.4 se presenta una lista de los genes con mayor puntuación predichos por CopraRNA como posibles candidatos a interaccionar con NsrR1. A partir de esta lista, se seleccionaron para su estudio el gen all1871, que codifica una proteína de función desconocida, pero que aparece como el mejor candidato a interaccionar con NsrR1, así como el grupo de genes formado por asr4517 (nblA), alr3684 (clpX), asl4325 (clpS) y alr1238 (clpP), cuya función está relacionada con el proceso de degradación de los ficobilisomas, un mecanismo implicado en la respuesta a la disponibilidad de nitrógeno combinado. Tabla 3.4. mRNAs candidatos a interaccionar con NsrR1 según la predicción de CopraRNA. Posición p-value Gen Anotación 1 6,09x10-07 all1871 2 1,79x10-05 all1043 3 3,46x10-05 alr0309 4 6,17x10-05 asl4014 5 1,01x10-04 all4613 Subunidad catalítica de la acetolactato sintasa 3 6 1,82x10-04 asr4517 NblA; degradación de los ficobilisomas 7 2,34x10-04 all1395 8 3,60x10-04 alr3684 ClpX; proteasa Clp dependiente de ATP; subunidad de unión a ATP 9 8,50x10-04 alr4814 10 8,76x10-04 alr4380 Deshidratasa del ácido ∆-aminolevulínico 11 9,13x10-04 all4102 12 1,01x10-03 all1043 13 1,07x10-03 alr3594 Regulador de respuesta de dos componentes 14 1,23x10-03 alr0972 Transportador ABC, proteína de unión a ATP 15 1,26x10-03 alr1302 Acetiltransferasa 16 1,59x10-03 all7598 17 1,78x10-03 alr1462 Escisión del elemento fdxN 18 1,99x10-03 alr3099 19 2,24x10-03 asl4325 ClpS; proteasa Clp dependiente de ATP; proteína adaptadora 20 2,32x10-03 alr1808 66 1,08x10-02 alr1238 ClpP; proteasa Clp dependiente de ATP; subunidad proteolítica Se muestran genes predichos por el algoritmo CopraRNA como posibles mRNAs diana de NsrR1 con mayor puntuación. El algoritmo CopraRNA (Wright et al., 2013; Wright et al., 2014) está implementado en el servidor de Freiburg RNA Tools (apartado 2.10). Para el análisis se utilizó como referencia la secuencia de NsrR1 de Nostoc sp. PCC 7120, junto con las secuencias de NsrR1 de Anabaena cylindrica PCC 7122, Anabaena variabilis ATCC 29413, Nostoc azollae 0708, Cylindrospermum stagnale PCC 7417, Nostoc punctiforme PCC 73102, Rivularia sp. PCC 7116 y Calothrix sp. PCC 7507. Aparecen resaltados en negrita aquellos genes que se han analizado en este trabajo. Resultados Capítulo II 121 Para cada uno de estos genes se llevó a cabo la predicción de la interacción de sus mRNAs con NsrR1 mediante IntaRNA (Mann et al., 2017) (Figura 3.19). En todos los casos, a excepción de asl4325, la zona de la posible interacción predicha por este algoritmo está conservada en la mayoría de las cianobacterias que contienen NsrR1, y tendría lugar en la región 5´UTR (UTR, “Untranslated región”) de los mRNAs diana. En el caso concreto del mRNA de asl4325, la interacción predicha tendría lugar en la región codificante, 30 nucleótidos tras el codón de inicio de la traducción. La observación de que las interacciones predichas estén conservadas y tengan lugar en las regiones 5´UTR de los mRNAs diana, o en la zona codificante pero muy cerca del inicio de la traducción, sugiere que dichos mRNAs podrían estar sometidos a una regulación postranscripcional por NsrR1. Figura 3.19. Interacciones entre NsrR1 y los mRNAs diana seleccionados para su estudio. Las interacciones que se muestran derivan de la aplicación del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017), que está implementado en el servidor de Freiburg RNA Tools (apartado 2.10). Al objeto de limitar la búsqueda a interacciones específicas en la región cercana al codón de inicio de los mRNAs diana, la predicción se realizó con la secuencia completa de NsrR1 y la región comprendida entre -200 y +100 de los mRNA diana. Los nucleótidos de los mRNAs diana se numeran con respecto al inicio de la traducción. El codón AUG, GUG en el caso de asl4325, aparece señalado en rojo, y las posibles secuencias Shine-Dalgarno resaltadas en verde. Resultados Capítulo II 122 3.2.4. Validación de la interacción entre NsrR1 y los mRNAs seleccionados Para verificar la interacción entre NsrR1 y los mRNAs seleccionados se usó de nuevo el sistema heterólogo implementado en E. coli descrito en el apartado 2.6. En el caso de asl4325, que tiene GTG como codón de inicio de la traducción, y al objeto de mejorar la eficiencia de la traducción en E. coli, el codón de inicio GTG se reemplazó por ATG mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2. La Tabla 3.5 muestra la información relativa a las construcciones utilizadas para la validación en E. coli de la interacción de NsrR1 con los mRNAs seleccionados como posibles dianas. La estrategia de clonación seguida para insertar la región 5´UTR de los mRNAs en los plásmidos pXG-10-SF o pXG-30-SF fue similar a la descrita en el apartado 2.6. Sin embargo, cabe resaltar que la secuencia de all1871 utilizada, comprendida entre el TSS, situado a 137 nucleótidos aguas arriba del inicio de la traducción, y los primeros 60 nucleótidos de la secuencia codificante, contiene dos sitios NheI. Por este motivo, hubo que modificar ligeramente la estrategia habitual. En este caso en particular, para la amplificación de esta secuencia, el cebador situado aguas abajo incluía un sitio XbaI, que es compatible con NheI. Así se hace posible la ligación de este inserto, con el sitio XbaI, en el sitio NheI del plásmido pXG-10-SF. Por su parte, el gen nblA se transcribe desde cinco TSS validados mediante análisis de extensión del cebador (Mitschke et al., 2011b). Para la fusión de la región 5´UTR de este mRNA con el gen sfgfp de pXG-10-SF se eligió el TSS más próximo al codón de inicio de la traducción, situado 106 nucleótidos aguas arriba del mismo. Resultados Capítulo II 123 Tabla 3.5. Secuencias de los insertos clonados para la validación, mediante el sistema heterólogo en E. coli, de la interacción entre NsrR1 y los mRNAs seleccionados como posibles dianas. Gen TSS Secuencia clonada Plásmido Plásmido resultante all1871 -137 atgcaTTCCCTGCTAACCCAGGGGGAAAGGCTAGCCA ACAAAAGCTAGCAGTTACGAGAAAAAAGCCGCTCCCA CATTATGCGCGGCTTCCCTGAAAACAAACGTTGTCCT TTTTCTCAATCTTCTCATTGGAGGAAACCCAAATGTC TCACTTTAGCACTCTCCGCACCAAAATCACCGATGCC GAAATCCTCAAAGCTTCCTctagc pXG-10-SF pIAE9 asr4517 (nblA) -106 atgcATACAGAGGAATAATCAACAATATGGGGCAGGT ACTAACTAAAGTCCTATGCCTGTGGGGCTTCTGTAAC CGACATAACCTTTACGCGTTGTCTTTTAGGAGTCTGT TATGAACCAACCAATCGAATTGTCATTAGAACAACAA TTCAGCATTCGCTCATTTGCCACCgctagc pXG-10-SF pIAE11 alr3684 - atgcATCAAGTCATCTCCAGACAAAATCTTCCCACAG CAGGGGAAAACGTCACCATCGTGAAATAAGAGGCTGG TATGTCTAAGTACGACTCCCATTTAAAATGTTCTTTC TGTGGCAAGTCTCAAGAGCAGGTGgctagc pXG-30-SF pIAE18 asl4325 -47 atgcatGTACAGAGCCTGTGTTGTAGTAACTCCAAAA ACCAAGAGCAAAAGCTATGTCAGTCGAAACCATTGAG AAGCGTTCCACATCCCGCAAGCTCGCGCCTCGGTATC GCGctagc pXG-10-SF pIAE10 alr1238 -398 atgcATATTCAGGATGCAGAACTGATTTAGGTCAAGA TGGTATTCCGTCCACATTTGGCGACGGCATTCCGCCC ACCGTAGGCGATCGCCAAGCTACATAATTGAATAGCG AGCCTGAAAATCAGGTGGGCAATTGTCAATAAAGGTT GATTTTTCTTTCTCTAACTAGAAGAGCCATTTCTCTA GACGCATCTCACTATCAAAAGTGCCAAGAGGATGATG TGCATCTGCACTAGGAGGGACTGGGGACTGGGGACTG GGGATTGGGGGAGCAGGGGCAGCAGAGGAAGCAGGGG AAACAGGGGAAACAGGGAGTAAATGTCATTCCCAATA CCCAATACCCAATACCCAATACCCAATACCCAATTGA TAAGATGGATGTAAATTAGCTACAAGCACGCTGCATG ACTATTCCTATCGTTATTGAACAATCAGGTCGAGGCG AACGCGCCTTTGATATTTACGCTAGC pXG-10-SF pIAE13 nsrR1 - AAGAAAAGTTGCCCGTTGCATTTTGGGAATACGCAGC CGGGTTTTAACTCTATATGAGAAGACAACGCTAAAAG AATCAACTAGACCAGCTGTGGGAAGCTGGTCTTTTTT TCCGTACATACACGTTTGACCAATAGTCGTTTTACGT GGTGTCTCTGTCTAGA pZE12-luc pAVN1 Se indica la posición del TSS (resaltado en rojo) identificado en (Mitschke et al., 2011b), numerado con respecto al inicio de traducción, desde el que se realizan las fusiones de la región 5´UTR de los mRNAs con el gen sfgfp en pXG-10-SF. Nótese que las fusiones correspondientes a transcritos policistrónicos en el plásmido pXG-30-SF no se realizan desde el TSS, sino desde desde una posición situada 60 nucleótidos dentro del gen anterior (véase apartado 2.6). Las secuencias pertenecientes al cromosoma de Nostoc sp. PCC 7120 están en mayúscula. En negro se indican los nucleótidos de la secuencia que corresponden a la región 5´UTR del mRNA, mientras que en verde se señalan los primeros 60 nucleótidos de la secuencia codificante del mRNA. El nucleótido en rojo y subrayado indica la mutación puntual realizada en asl4325 para reemplazar el codón de inicio de la traducción GTG por un codón ATG. Por su parte, en azul se indica la secuencia clonada en pZE12-luc, que contiene el gen nsrR1, resaltado en gris. Los sitios NsiI, NheI y XbaI se resaltan en celeste, amarillo y rosa respectivamente. Por último, se indica el plásmido en el que se clona cada inserto, así como el plásmido resultante generado (Tabla 2.4). Resultados Capítulo II 124 Al objeto de analizar la posible regulación ejercida por NsrR1 sobre los mRNAs seleccionados, se evaluaron los cambios en los niveles de proteína sfGFP de las células de E. coli que portaban diferentes combinaciones de estos plásmidos mediante fluorimetría (Figura 3.20A), tal y como se describe en el apartado 2.6, y mediante Western blot utilizando un anticuerpo frente a GFP (Figura 3.20B), tal y como se describe en el apartado 2.4.6. El plásmido pJV300 (Sittka et al., 2007), que codifica un sRNA no relacionado, se usó como control. Se espera que la interacción entre NsrR1 y el mRNA que se esté analizando en cada caso produzca una alteración de los niveles de fluorescencia o de la acumulación de proteína sfGFP con respecto a las células control, portadoras de la fusión mRNA::sfgfp correspondiente y pJV300. Figura 3.20. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de los mRNAs seleccionados. (A) Cuantificación de sfGFP mediante fluorescencia. Se representan los niveles de fluorescencia relativa de células de E. coli que portan un plásmido con la fusión mRNA::sfgfp combinado con el plásmido control pJV300, o con el plásmido pAVN1, que codifica NsrR1. Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar de las medidas de fluorescencia de ocho cultivos provenientes de colonias independientes. Para el cálculo de estos valores de fluorescencia se normalizó por la cantidad de células (A600 nm), y se restaron los niveles de fluorescencia de células que portan pXG-0, un plásmido control sin sfgfp. La fluorescencia de las células portadoras de fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300 se considera en cada caso como 100%. Se indica el p-value correspondiente al test de Student en los casos en los que la diferencia de fluorescencia es significativa. La tabla muestra los valores de fluorescencia absolutos en unidades arbitrarias (u.a.) de las células que portan fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300. (B) Cuantificación de sfGFP mediante Western blot. Western blot de células de E. coli que portan un plásmido con la fusión mRNA::sfgfp combinado con el plásmido control pJV300, o con el plásmido pAVN1, que codifica NsrR1. El análisis se realizó con anticuerpos frente a GFP, o con anticuerpos comerciales frente a la proteína GroEL, que se usó como control de carga y transferencia. Los números en la parte inferior de la imagen indican los niveles relativos de sfGFP con respecto al control, después de la normalización con la señal para GroEL. Los datos se representan como la media ± la desviación estándar de los resultados obtenidos a partir de cuatro cultivos provenientes de colonias independientes. Resultados Capítulo II 125 Como puede observarse, todas las fusiones traduccionales mRNA::sfgfp analizadas mediante Western blot mostraron unos niveles de proteína sfGFP detectables, lo que demuestra que la región del inicio de la traducción de estos mRNAs es funcional en E. coli. Sin embargo, sólo se observa una reducción significativa en los niveles de fluorescencia sfGFP, y en la cantidad de proteína sfGFP acumulada, en las células de E. coli en las que se expresa NsrR1 (pAVN1) en combinación con las fusiones traduccionales all1871::sfgfp (pIAE9) y nblA::sfgfp (pIAE11) (Tabla 2.4). La disminución de los niveles de fluorescencia de estas dos fusiones traduccionales en presencia de NsrR1 con respecto a las células control, que portan el plásmido pJV300, es de un 85% en el caso de all1871 y de un 55% en el caso de nblA. Estos resultados sugieren una interacción directa entre NsrR1 y la región 5´UTR de estos dos mRNAs, que tendría como resultado en ambos casos una represión de su traducción. 3.2.5. Regulación ejercida por NsrR1 sobre el mRNA de nblA 3.2.5.1. Verificación de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA Con el fin de verificar que la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA tiene lugar en la región predicha por IntaRNA (Figura 3.19), mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, se introdujeron mutaciones puntuales en la región de la secuencia de NsrR1 que se predice que está implicada en la interacción con el mRNA de nblA, y se realizaron además las correspondientes mutaciones compensatorias en la región 5´UTR de este mRNA. El método seguido para el diseño de estas mutaciones fue el mismo que el descrito en el apartado 3.1.4. Así, con el apoyo del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017), se seleccionaron los nucleótidos de la secuencia de NsrR1 cuya mutación afectaría más drásticamente a la interacción predicha entre este sRNA y el mRNA de nblA, lo que se reflejaría en la supresión de la reducción en los niveles de fluorescencia observados. Igualmente, se llevaron a cabo mutaciones compensatorias en el mRNA, con las que se espera que la interacción se restablezca, produciéndose de nuevo una reducción en los niveles de fluorescencia. Las predicciones realizadas con el algoritmo IntaRNA (Figura 3.19) sugieren que la posible región de NsrR1 que interacciona con la región 5´UTR de nblA está comprendida entre los nucleótidos 58-69. Teniendo en cuenta esta predicción, se introdujeron dos mutaciones puntuales, cambio de C a G, en los nucleótidos 63 y 66 de la secuencia de NsrR1 (Figura 3.21A). Las mutagénesis se realizaron mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 197 y 198, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 315 y 316, para la mutación en el nucleótido 63, y los oligonucleótidos 317 y 318 para la mutación en el nucleótido 66 (Tabla 2.5). Resultados Capítulo II 126 Estas versiones mutadas se denominaron Mut-63 y Mut-66 respectivamente, y los plásmidos que las contienen en lugar de la versión silvestre se denominaron pIAE26 (versión Mut-63) y pIAE27 (versión Mut-66) (Tabla 2.4). Además, se introdujeron las correspondientes mutaciones compensatorias, cambio de G a C, en los nucleótidos -18 y -21 de la región 5´UTR de nblA (Figura 3.21A). De nuevo, las mutagénesis se realizaron mediante el procedimiento del “Megacebador” descrito en el apartado 2.2.6.2, utilizando como cebadores externos los oligonucleótidos 253 y 254, y como cebadores solapantes los oligonucleótidos 329 y 330, para la mutación en el nucleótido -18, y los oligonucleótidos 331 y 332 para la mutación en el nucleótido -21 (Tabla 2.5). Estas versiones mutadas se denominaron Comp-63 y Comp-66 respectivamente, y los plásmidos que las contienen se denominaron pIAE28 (versión Comp-63) y pIAE29 (versión Comp-66) (Tabla 2.4). Una vez realizadas estas mutaciones, se evaluaron los cambios en los niveles de fluorescencia de las células de E. coli que portaban diferentes combinaciones de estos plásmidos. Las medidas de fluorescencia de los cultivos líquidos de E. coli se llevaron a cabo mediante fluorimetría (Figura 3.21B), y mediante citometría de flujo (Figura 3.21C) según se describe en el apartado 2.6. Los niveles de fluorescencia de las células que portan la fusión a sfgfp de la 5´UTR silvestre de nblA combinada con una de las versiones mutadas de NsrR1, Mut-63 o Mut-66, son similares a los de las células portadoras de dicha fusión combinada con el plásmido pJV300 (control). Esta observación sugiere que la mutación de cualquiera de estos dos nucleótidos de NsrR1 reduce drásticamente la interacción entre este sRNA y la región 5´UTR de nblA. Además, cuando se combina cada una de las versiones mutadas de NsrR1 con las correspondientes fusiones portadoras de las mutaciones compensatorias en la región 5´UTR de nblA, se observa de nuevo una reducción significativa en los niveles de fluorescencia, similar a la obtenida con la combinación de los transcritos silvestres. Estos resultados confirman que la interacción de NsrR1 con la región 5´UTR del mRNA de nblA tiene lugar a través de los nucleótidos predichos por IntaRNA, así como el efecto de dicha interacción sobre la traducción de la proteína NblA. Resultados Capítulo II 127 Figura 3.21. Verificación in vivo mediante un sistema heterólogo en E. coli de la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA. (A) Interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR de nblA según la predicción del algoritmo IntaRNA (Mann et al., 2017). Los nucleótidos de nblA se numeran con respecto al inicio de la traducción. El codón AUG aparece señalado en rojo. Las mutaciones introducidas en NsrR1 en las posiciones 63 (Mut-63) y 66 (Mut-66), así como sus correspondientes mutaciones compensatorias, Comp-63 y Comp-66, en las posiciones -18 y -21 de la región 5´UTR de nblA, están indicadas en rojo y azul respectivamente. (B) Cuantificación de sfGFP mediante fluorescencia. Se representan los niveles de fluorescencia relativa de cultivos de E. coli que portan un plásmido con la versión silvestre, o con las versiones Comp-63 o Comp-66 de la fusión nblA::sfgfp, combinado con un plásmido que codifica la versión silvestre de NsrR1, la versión Mut-63 o Mut-66 de NsrR1, o un RNA no relacionado usado como control (pJV300). Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar de las medidas de fluorescencia de ocho cultivos provenientes de colonias independientes. Para el cálculo de estos valores de fluorescencia se normalizó por la cantidad de células (A600 nm), y se restaron los niveles de fluorescencia de células que portan pXG-0, un plásmido control sin sfgfp. La fluorescencia de las células portadoras de las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300 se considera en cada caso como 100%. Se indica el p-value correspondiente al test de Student en los casos en los que la diferencia de fluorescencia es significativa. La tabla muestra los valores de fluorescencia absolutos en unidades arbitrarias (u.a.) de las células conteniendo las fusiones mRNA::sfgfp combinadas con el plásmido control pJV300. (C) Cuantificación de sfGFP mediante citometría de flujo. Los ensayos se realizaron con cultivos en estado estacionario de las estirpes de E. coli que portan un plásmido con la versión silvestre, o con la versión Comp-63 de la fusión nblA::sfgfp, combinado con un plásmido que codifica la versión silvestre de NsrR1, la versión Mut-63 de NsrR1, o un RNA no relacionado usado como control (pJV300). Se adquirieron datos de 50.000 células por muestra. Resultados Capítulo II 128 Para verificar los nucleótidos implicados en la interacción entre NsrR1 y el mRNA de nblA se realizaron ensayos de protección in vitro (apartado 2.3.7). Para ello, NsrR1 silvestre o su versión mutada Mut-63 se marcaron en su extremo 5’ con [γ-32P]ATP, y se determinó la sensibilidad a la hidrólisis por RNasa T1 (Figura 3.22A) o acetato de plomo (Figura 3.22.B) en presencia o ausencia de un fragmento del mRNA de nblA, o de su versión mutada Comp-63, que se extiende desde el TSS hasta 60 nucleótidos dentro de la región codificante de nblA. Además, se estudió el patrón de sensibilidad que presenta NsrR1 al tratamiento con RNasa T1 y RNasa A (Figura 3.22C) para desarrollar un modelo de la estructura secundaria de NsrR1 (Figura 3.22D). OH T1* C – + nblA + nblA (Comp-63) 94-96 27 26 25 18 15 11 8 3 33 36 41 56 58 61 67 74 84 89 40 39 92 OH T1*C – + nblA + nblA (Comp-63) C 94-96 27 26 25 18 15 11 8 33 36 41 56 58 61 67 74 84 89 40 39 92 63 OH T1* C – + nblA + nblA (Comp-63) 94-96 27 26 25 18 15 11 8 3 33 36 41 56 58 61 67 74 84 89 40 39 92 94-96 27 26 25 18 15 11 8 3 33 36 41 56 58 61 67 74 84 89 40 39 92 OH T1* C – + nblA + nblA (Comp-63) NsrR1 NsrR1NsrR1 (Mut-63) NsrR1 (Mut-63) 63 A B Resultados Capítulo II 129 Figura 3.22. Identificación de la zona de interacción de NsrR1 con la región 5´UTR del mRNA de nblA y modelo de estructura secundaria de NsrR1. El extremo 5’ de NsrR1 silvestre, o de su versión mutada Mut-63, se marcó con [γ-32P]ATP. Las posiciones de los nucleótidos de NsrR1 se muestran a la izquierda. El área protegida se indica mediante barras verticales. El significado de las abreviaturas utilizado en la parte superior de los paneles es el siguiente: C, control no tratado; OH, escalera obtenida mediante hidrólisis alcalina; T1*, escalera obtenida tras el tratamiento con RNasa T1 en condiciones desnaturalizantes; T1, tratamiento con RNasa T1; A, tratamiento con RNasa A. Ensayo de protección frente a RNasa T1 (A) y acetato de plomo (B). Se estudió la interacción entre NsrR1 silvestre (izquierda) o su versión mutada Mut-63 (derecha) y la región 5´UTR de nblA silvestre o de su versión mutada Comp-63. Los experimentos se llevaron a cabo en ausencia (-) y en presencia de 100 y 200 nM del fragmento de RNA correspondiente a la región 5´UTR de nblA. (C) Análisis del patrón de sensibilidad a RNasa T1 y RNasa A. Gel de urea-poliacrilamida al 8% en el que se separaron los fragmentos generados a partir de NsrR1 silvestre tras el tratamiento con RNasa T1 o RNasa A durante 5, 10 o 15 minutos (apartado 2.3.6). (D) Modelo de la estructura secundaria de NsrR1 de Nostoc sp. PCC 7120 basado en el ensayo de estructura in vitro. Los triángulos blancos y negros indican las posiciones sensibles a la hidrólisis por RNasa T1 y RNasa A respectivamente. Las zonas sombreadas en gris destacan los nucleótidos más resistentes a la hidrólisis inducida por el tratamiento con acetato de plomo mostrado en (B). El área protegida por el mRNA de nblA está sombreada en amarillo. El nucleótido mutado, Mut-63, también está indicado. En minúscula se muestran las tres Gs que se añaden en el extremo 5' de NsrR1 para garantizar una transcripción eficiente in vitro por la polimerasa del fago T7. Cuando los ensayos de protección in vitro (Figura 3.22A-B) se realizan con las moléculas de NsrR1 y nblA silvestres, se observa protección a la hidrólisis por RNasa T1 o acetato de plomo entre las posiciones 59 y 68 de NsrR1 (Figura 3.22D). Esta zona protegida coincide exactamente con la zona de interacción predicha in silico (Figura 3.19). Esta protección no se produce cuando se combina NsrR1 silvestre con la versión mutada del mRNA de nblA Comp-63, si bien vuelve a observarse cuando los experimentos se llevan a cabo con la versión mutada de NsrR1 (Mut-63) y la correspondiente versión con la mutación compensatoria en nblA (Comp-63). Todos los resultados obtenidos confirman la interacción entre NsrR1 y la región 5´UTR del mRNA de nblA. En la Figura 3.23 se muestra cómo la interacción entre las secuencias que codifican homólogos de NsrR1 y los mRNAs correspondientes a los homólogos de nblA está conservada en la mayoría de las cianobacterias que contienen NsrR1. Este resultado es congruente con el hecho de que nblA apareciese en el análisis de CopraRNA (Tabla 3.4), el algoritmo que como ya se ha comentado, tiene en cuenta entre otros factores, la conservación filogenética del sRNA y de sus posibles dianas. C OH T1* 94-96 27 26 25 18 15 11 8 3 33 36 41 56 58 61 67 74 84 89 40 39 92 T1 5’ 10’ 15’5’ 10’ 15’C A NsrR1 D G (Mut-63) ggg