Caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario con correlación clínica y pronóstica

DIRECTORES DR. JUAN JOSÉ RÍOS MARTÍN DRA. LAURA MACÍAS GARCÍA TUTOR DR. MANUEL DE MIGUEL RODRÍGUEZ CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE UNA SERIE DE CASOS DE MELANOMA UVEAL PRIMARIO CON CORRELACIÓN CLÍNICA Y PRONÓSTICA MANUEL PÉREZ PÉREZ TESIS DOCTORAL UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA NORMAL Y PATOLÓGICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Citología e Histología Normal y Patológica CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE UNA SERIE DE CASOS DE MELANOMA UVEAL PRIMARIO CON CORRELACIÓN CLÍNICA Y PRONÓSTICA TESIS DOCTORAL Manuel Pérez Pérez DIRECTORES Dr. Juan José Ríos Martín Dra. Laura Macías García TUTOR Dr. Manuel De Miguel Rodríguez A mis padres. AGRADECIMIENTOS Me gustaría que estas líneas sirvieran para expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que, con su ayuda, han colaborado en la realización del presente trabajo. Al Doctor Juan José Ríos Martin, por su confianza, su apoyo y su dedicación durante todo el proceso de elaboración de mi tesis. Sin su ayuda nada de esto hubiera sido posible. A los Doctores Manuel De Miguel Rodríguez y Laura Macías García por estar disponibles siempre cuando lo he necesitado. Al Doctor Alessandro Agostino por su imprescindible ayuda con el análisis molecular. Al Doctor Ángel Vilches Arenas por su gran ayuda con el análisis estadístico. Quiero agradecer a todo Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Virgen Macarena de Sevilla por todo lo que he aprendido gracias a ellos, y muy especialmente a los Doctores Sebastián Umbría Jiménez, Ana Vallejo Benítez y Antonio García Escudero, quienes me han enseñado prácticamente todo lo que sé de esta especialidad, y quienes además de auténticos maestros son verdaderos amigos. Y por supuesto quiero destacar a Doña Juana Correa Serrano, TEAP del Servicio, tanto por su impecable labor técnica, como por su incansable ejemplo de compañerismo y sus sabios consejos. A mis amigos por creer siempre en mí sin un solo atisbo de duda. A Carmen por acompañarme en este proceso y en la vida. 8 / Al Doctor Ricardo Ramos Suria por la ilusión con la que ha esperado que llegue este momento. A mi familia, porque jamás me ha permitido pensar que algo es imposible. / 9 RESUMEN Introducción: El melanoma uveal (MU) es la neoplasia maligna primaria más frecuente del ojo, para la que no existen terapias eficaces cuando la enfermedad se disemina y en la que es muy importante conocer su pronóstico. El propósito de este trabajo es caracterizar mediante técnicas de secuenciación masiva (NGS) el perfil mutacional de una serie de MUs para buscar marcadores de utilidad pronóstica y terapéutica. Material y métodos: Hemos realizado un estudio retrospectivo observacional de 69 casos de MU diagnosticados en el Hospital Universitario Virgen Macarena. Para la captura híbrida de las regiones objetivo del estudio, en los primeros 38 casos, se empleó un panel de 519 genes basado en SureSelect HS2 (Agilent Technologies). Para la captura de las zonas dianas en los siguientes 31 casos se utilizó un Kit personalizado con un panel que incluía los 28 genes más frecuentemente mutados en la primera serie. Resultados: Se valoraron un total de 231 variantes genéticas que afectaban a la función de la proteína. Las mutaciones secundarias más frecuentes se produjeron en SF3B1 (en el 26%), seguido de BAP1 (en el 23%), LRP1B (22%) y FGFR4 (20%). La mutación de BAP1 se asoció con una mayor probabilidad de metástasis y con una mayor presencia de células epitelioides. LRP1B también se asoció con la presencia de células epitelioides. La mutación de SF3B1 se asoció significativamente con una morfología fusiforme. Encontramos variantes en RAD51B, TOP2A, PTPRD, TSC2, DHX9, PDK1 y MTOR que no se habían notificado previamente en las bases de datos consultadas. Los MUs que presentaron un subtipo histológico epitelioide, infiltración extraescleral o de cuerpo ciliar, mutación en BAP1, CHEK2, TSC2, DICER o IDO1 tienen más riesgo de producir metástasis en cualquier momento del seguimiento. 16 / ÍNDICE MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................... 113 1. ESTUDIO CLÍNICO ...................................................................... 116 2. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO ..................................................... 117 3. SECUENCIACIÓN MASIVA DIRIGIDA (NGS) ................................. 119 3.1 Extracción de ADN .................................................................. 119 3.2 Control de calidad de las muestras ......................................... 119 3.3 Preparación de bibliotecas y enriquecimiento de dianas ....... 120 3.4 Análisis de los datos de secuenciación ................................... 126 3.5 Limitaciones del análisis ......................................................... 127 4. ORGANIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS DATOS ............................... 128 4.1 Análisis exploratorio de datos ................................................. 128 4.2 Análisis descriptivo ................................................................. 128 4.3 Análisis inferencial bivariante ................................................ 128 4.4 Análisis de regresión logística ................................................ 129 4.5 Análisis de supervivencia ....................................................... 130 RESULTADOS ................................................................................... 133 1. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA .......................................... 135 2. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA EN FUNCIÓN DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE METÁSTASIS .................................. 145 3. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA EN FUNCIÓN DEL SUBTIPO HISTOLÓGICO ........................................................................... 148 4. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA HASTA EL DESARROLLO DE METÁSTASIS ............................................................................ 152 5. IDENTIFICACIÓN DE HIPOTÉTICAS VARIABLES QUE PODRÍAN ACTUAR COMO FACTORES DE RIESGO PARA LA APARICIÓN DE METÁSTASIS ............................................................................. 157 6. IDENFITICACIÓN DE HIPOTÉTICAS VARIABLES PREDICTORAS DEL SUBTIPO HISTOLÓGICO ...................................................... 163 7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA A PARTIR DEL MOMENTO DE DESARROLLO DE METÁSTASIS ................................................... 168 DISCUSIÓN 171 / 17 DISCUSIÓN ...................................................................................... 171 1. DATOS CLÍNICOS Y MORFOLÓGICOS .......................................... 175 2. DATOS MOLECULARES .............................................................. 180 3. PAPEL DE GNAQ Y GNA11 .......................................................... 181 4. PAPEL DEL GEN BAP1................................................................. 183 5. DATOS DEL GENS CHEK2 ........................................................... 185 6. DATOS DE DICER1 Y LRP1B......................................................... 186 7. DATOS DE EIF1AX ...................................................................... 188 8. DATOS DE SF3B1 ........................................................................ 189 9. DATOS DE IDO1 ......................................................................... 191 10. OTROS DATOS DE GENES NO DESCRITOS EN MU ...................... 192 CONCLUSIONES ............................................................................... 197 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................. 201 ANEXOS ........................................................................................... 227 ANEXO 1. Informe favorable del Comité de Ética de la Investigación de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío. ...................................................................................... 229 ANEXO 2. Documento de información para donación de muestras biológicas e información asociada al biobanco para investigación biomédica .......................................................... 233 / 19 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Resumen de las opciones terapéuticas disponibles para MU. 52 Tabla 2. Categoría T (tamaño) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. ................................................................................................ 64 Tabla 3. Categoría N (ganglios linfáticos regionales) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. ............................................................. 65 Tabla 4. Categoría M (metástasis) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. ................................................................................... 65 Tabla 5. Estadio clínico-patológico para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. .................................................................................... 65 Tabla 6. Clasificación del MU según sus correspondientes aberraciones cromosómicas. .......................................................... 80 Tabla 7. Genes frecuentemente mutados en el melanoma uveal. ....... 101 Tabla 8. Uniformidad, métrica e índice de degradación del ADN en la primera serie de casos secuenciados. ............................................. 122 Tabla 9. Uniformidad, métrica e índice de degradación del ADN en la segunda serie de casos secuenciados. ............................................. 125 Tabla 10. Variables cuantitativas. Análisis descriptivo. ......................... 137 Tabla 11. Variables cualitativas. Análisis descriptivo. ............................ 138 Tabla 12. Resumen de los genes mutados con mayor frecuencia. ........ 140 Tabla 13. Resumen de las proteínas expresadas por las variantes más frecuentemente encontradas*. ....................................................... 142 Tabla 14. Caracterización clínica y patológica en función de la presencia de metástasis. ................................................................. 145 Tabla 15. Caracterización de las variantes genéticas en función de la presencia de metástasis. ................................................................. 146 Tabla 16. Caracterización clínica y patológica en función del subtipo histológico. ...................................................................................... 148 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 20 / Tabla 17. Caracterización de las variantes genéticas patológicas en función del subtipo histológico........................................................ 150 Tabla 18. Análisis univariante de factores de riesgo clínicos e histológicos para la aparición de metástasis. .................................. 158 Tabla 19. Análisis univariante de factores de riesgo clínicos e histológicos para la aparición de metástasis. .................................. 159 Tabla 20. Modelo multivariante de factores de riesgo para la aparición de metástasis. .................................................................. 162 Tabla 21. Análisis univariante de regresión logística. Relación entre el subtipo histológico y las variables estudiadas. ................................ 164 Tabla 22. Análisis univariante de regresión logística. Relación entre el subtipo histológico y las mutaciones estudiadas. ............................ 165 Tabla 23. Modelo de regresión logística multivariante. Relación entre el subtipo histológico y las variables estudiadas. ............................ 167 Tabla 24. Diferencias en los tiempos de supervivencia desde la detección de metástasis para los genes GNA11, SF3B1 y DICER1. .. 169 / 21 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Anatomía del del globo ocular. .............................................. 34 Figura 2. Modalidades terapéuticas para el tratamiento del MU. ........ 48 Figura 3. Melanoma de coroides con patrón de crecimiento focal. ...... 61 Figura 4. Clasificación para melanomas de coroides y cuerpo ciliar basada en el grosor y el diámetro (mm). ........................................ 64 Figura 5. A) MU de células fusiformes, B) MU de células epitelioides. . 68 Figura 6. MU pigmentado. .................................................................... 70 Figura 7. Evolución genética del MU. ................................................... 95 Figura 8. Porcentajes de profundidad de lectura (50X y 100X) de la secuenciación de la primera serie de casos. .................................... 124 Figura 9. Porcentajes de profundidad de lectura (100X y 200x) de la secuenciación de la segunda serie de casos. ................................... 126 Figura 10. Distribución de las mutaciones encontradas ........................ 141 Figura 11. Representación gráfica de las mutaciones encontradas en nuestra cohorte. ............................................................................. 144 Figura 12. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de BAP1. ..................................................... 153 Figura 13. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de CHEK2.................................................... 153 Figura 14. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de DICER1. ................................................. 154 Figura 15. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de DHX9. .................................................... 154 Figura 16. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de PDK1...................................................... 155 Figura 17. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de IDO1. ..................................................... 155 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 22 / Figura 18. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de EIF1AX. .................................................. 156 Figura 19. Curva Kaplan Meier de supervivencia desde la aparición de metástasis en función de la mutación de GNA11. ........................... 169 Figura 20. Curva Kaplan Meier de supervivencia desde la aparición de metástasis en función de la mutación de SF3B1. ............................ 170 Figura 21. Curva Kaplan Meier de supervivencia desde la aparición metástasis en función de la mutación de DICER1. ........................... 170 / 23 SIGLAS Y ABREVIATURAS MU Melanoma Uveal. UV Ultravioleta PF Fotografía del fondo de ojo UBM Biomicroscopía ecográfica COMS Estudio Colaborativo del Melanoma Ocular BAAF Biopsia por aspiración con aguja fina TTT Termoterapia transpupilar ICI Inhibidores de los puntos de control inmunitarios CTLA Linfocitos T citotóxicos 4 GEM Grupo Español de Melanoma ImmTAC Receptores monoclonales inmunomóviles de células T contra el cáncer AJCC American Joint Committee on Cancer CAP Colegio Americano de Patólogos CGA Campo de gran aumento TILs Linfocitos infiltrantes tumorales VNC Variación del número de copias GEP Perfil de expresión génica PCR Reacción en cadena de la polimerasa NCCN Red Nacional Integral del Cáncer TCGA The Cancer Genome Atlas TMB Carga mutacional tumoral GDP Difosfato de guanosina GTP Trifosfato de guanosina 24 / SIGLAS Y ABREVIATURAS EDNRA y EDNRB Receptores de endotelina tipos A y B PLCα f Fosfolipasa C PKC Proteína quinasa C IP3 Inositol 1,4,5-trifosfato DAG Diacilglicerol MAPK Proteínas activadas por mitógeno quinasas CCND1 Proteína reguladora del ciclo celular ciclina D1 GNAQ Subunidad alfa Q de la proteína G GNA11 Subunidad alfa 11 de la proteína G RAF Fibrosarcoma de aceleración rápida MEK Proteína quinasa activada por mitógenos ERK Proteína quinasa activada por mitógenos PI3K Fosfatidilinositol 3-cinasa AKT Proteína quinasa B mTOR Diana de la rapamicina quinasa PIP3 Fosfoinositol trifosfato Trio Triple dominio funcional RhoA Miembro A de la familia homóloga Rac1 Sustrato 1 de la toxina botulínica C3 relacionado con RAS Cdc42 Ciclo de división celular 42 YAP Proteína asociada a Yes CYSLTR2 Receptor 2 de cisteinil leucotrieno PLCB4 Fosfolipasa Cβ4 BAP1 Proteína 1 asociada a BRCA HCFC1 Dominio de unión para el factor de célula huésped-1 IP3R3 Inositol-1,4,5-trifosfato de tipo 3 AMPK Proteína Quinasa Activada por Adenosin Monofosfato SIGLAS Y ABREVIATURAS / 25 snARN Pequeños ARN nucleares snRNP Pequeñas ribonucleoproteínas nucleares SF3B1 Subunidad 1 del factor de spilicing 3b PRAME Antígeno expresado preferentemente en el melanoma EIF1AX Factor de iniciación de la traducción eucariota 1ª del cromosoma X TERT Transcriptasa inversa telomerasa PRC2 Complejo represivo Polycomb 2 NGS Secuenciación masiva de próxima generación WGS Secuenciación de genoma completo WES Secuenciación de exoma completo SNP Polimorfismos de nucleótido único DIN Degradation index value VAF Frecuencias alélicas de variantes MSI Inestabilidad de microsatélites OR Odds Ratio HR Hazard Ratio IC95% Intervalo de confianza al 95% CHEK2 Quinasa de punto de control 2 DICER1 Ribonucleasa tipo III LRP1B Receptor de lipoproteínas de baja densidad IDO1 Indolamina 2, 3-dioxigenasa 1 TOP2A Topoisomerasa 2 alfa DHX9 DExH-Box Helicasa 9 PTPRD Receptor tipo D de la proteína tirosin fosfatasa TSC2 Gen de la esclerosis tuberosa 2 PDK1 Proteína cinasa dependiente de 3-fosfoinositido caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 32 / - La pars plicata contiene los procesos ciliares, que son rebordes o pliegues de 2mm de longitud, cada uno de ellos con un centro de estroma y vasos sanguíneos y recubierto por dos capas de epitelio columnar. La capa externa está pigmentada, mientras que la interna en contacto con el humor acuoso carece de pigmento. Las células epiteliales no pigmentadas existentes en los surcos entre los procesos ciliares dan origen a las fibras suspensorias del cristalino, compuesta principalmente por la proteína fibrilina. Estas células no pigmentadas secretan el humor acuoso y presentan la estructura característica de las células implicadas en el bombeo de iones. - La pars plana es un área aplanada posterior que mide 4mm de longitud. Su estroma se continua con la coroides, mientras que el epitelio pigmentado externo del cuerpo ciliar se continúa con el de la retina en la ora serrata. • Iris El iris constituye la porción más anterior de la úvea. Forma un diafragma que se extiende por delante del cristalino a partir del cuerpo ciliar de forma que divide de forma incompleta el compartimento anterior del ojo en las dos cámaras mencionadas previamente, la cámara anterior y la posterior. El iris se encuentra fuertemente pigmentado y presenta una abertura central que delimita la papila. El tamaño pupilar está controlado por fibras de músculo liso que se encuentran en el interior del iris. El iris contiene células pigmentadas y músculo y está compuesto por cuatro capas: - La capa limitante anterior o lámina marginal anterior se compone de fibroblastos y melanocitos. Esta capa cubre la superficie anterior del iris, desde el margen pupilar hasta la raíz del iris. Las prolongaciones de los fibroblastos se entrecruzan entre sí, dejando espacio para la comunicación directa desde la cámara anterior hacia el estroma del iris pudiendo atravesar partículas de hasta 200 µm. INTRODUCCIÓN / 33 - El estroma del iris contiene melanocitos, células nerviosas, vasos sanguíneos, y músculo liso en un fondo de tejido conectivo laxo. Los individuos de piel clara con iris azules tienen relativamente pocos melanocitos estromales. Un grueso collar de fibras de colágeno rodea normalmente los vasos sanguíneos dentro del estroma del iris. El estroma se encuentra muy vascularizado. Los vasos sanguíneos del iris corren en general en dirección radial y son frecuentes los canales de anastomosis que forman plexos vasculares circunferenciales. En el estroma a nivel de la porción pupilar se emplaza el músculo constrictor de la pupila. - El epitelio anterior está compuesto por prolongaciones contráctiles de las células mioepiteliales de la capa interna del epitelio posterior; se extiende desde la base del iris hasta el músculo del esfínter. - El epitelio posterior pigmentado del iris está formado de una monocapa de células cilíndricas que contienen gran cantidad de gránulos de melanina. En la parte periférica del iris hay una disminución progresiva de estos gránulos, hasta desaparecer por completo, puesto que el epitelio posterior se continúa en el epitelio ciliar no pigmentado. La capa del epitelio pigmentario del iris posterior está en contacto directo con el líquido acuoso de la cámara posterior. El número de melanosomas en las capas epiteliales del iris no varía significativamente entre los individuos de piel clara y oscura. Túnica interna: retina La retina es una capa estratificada de células nerviosas formadas por dos capas: el epitelio pigmentado retiniano externo, un epitelio cúbico simple con gránulos de melanina y la retina sensitiva interna. La retina deriva del neuroectodermo y se considera una prolongación del encéfalo. caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 34 / Figura 1. Anatomía del del globo ocular. Adaptado de Kumar V, Abbas AK, Aster JC, Perkins JA. Robbins y Cotran, patología estructural y funcional [Internet]. 10th ed. Kumar V, Abbas AK, Aster JC, editors. Elsevier Wordmark. 2021 Irrigación del globo ocular El globo ocular recibe irrigación a través de distintas fuentes: • Las arterias ciliares posteriores cortas se originan como ramas colaterales la arteria oftálmica. Atraviesan la esclera alrededor del nervio óptico y penetran en la capa coroidea. Algunas ramas de las arterias ciliares posteriores cortas irrigan el disco óptico a través de un anillo anastomótico, el círculo de Zinn-Haller, conformado por estas, vasos provenientes de la piamadre, vasos de la arteria central de la retina y vasos recurrentes de las ciliares posteriores. INTRODUCCIÓN / 35 • Las arterias ciliares posterior largas, entran en la esclera dirigiéndose anteriormente en la capa coroidea hasta anastomosarse con las arterias ciliares anteriores. • Las arterias ciliares anteriores son ramas de las arterias musculares. Estas arterias atraviesan la esclera en las zonas de inserción muscular y se anastomosan con las arterias ciliares posteriores largas en la capa coroidea. • La arteria central de la retina que a través del nervio óptico alcanza la papila óptica y la retina. El drenaje venoso del globo ocular se realiza principalmente a través de la capa coroidea. Las venas oftálmicas son dos, superior e inferior respectivamente. Recogen las ramas satélites de las arterias antes descritas. Además, reciben a las cuatro singulares venas vorticosas que drenan la sangre intraocular de la coroides. Las venas vorticosas, dos superiores y dos inferiores (medial y lateral, respectivamente), emergen del globo ocular por detrás del ecuador, a 13 mm de la inserción anatómica escleral de los músculos rectos y en los cuatro cuadrantes oblicuos. Las venas superiores drenan en la vena oftálmica superior y las inferiores en la inferior (1–3). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 36 / 2. TUMORES MELANOCÍTICOS DEL OJO Son las lesiones que surgen de los melanocitos derivados de la cresta neural que pueblan la coroides, el cuerpo ciliar y el estroma del iris. Se clasifican en nevus, melanomas uveales y el raro síndrome de proliferación melanocítica uveal difuso bilateral. • Los nevus melanocíticos de la úvea son proliferaciones benignas de melanocitos usualmente pigmentados. Los nevus pueden ser adquiridos o congénitos. Existen algunas diferencias entre los nevus melanocíticos del iris y los del cuerpo ciliar y la coroides. Los melanocitomas se consideran un tipo específico de nevus. Los nevus del iris son mucho más frecuentes en ojos claros que en los oscuros, presentándose aproximadamente en un 4% de la población (4). La prevalencia del nevus del cuerpo ciliar es desconocida. La mayor prevalencia estimada del nevus de coroides en adultos es del 4-7% en la población blanca (5). La inmensa mayoría de los nevus melanocíticos del iris son pigmentados, pero algunos son amelanóticos. Las efélides o pecas del iris son lesiones pigmentadas (posiblemente un marcador de exposición solar crónica y se distingue del nevus porque en este último existe una distorsión del estroma del iris. Las células de los nevus pueden ser fusocelulares, tener una apariencia más epitelioide o un citoplasma vacuolado (células balonizadas). Un sistema de clasificación categoriza los nevus del iris como, melanocitomas, nevus de células fusiformes con placa superficial, nevus fusocelular con componente estromal y nevus de células epitelioides. La etiología de los nevus melanocíticos del iris es multifactorial. Su desarrollo puede estar relacionado con la migración y la maduración de melanoblastos durante la embriogénesis. Estudios INTRODUCCIÓN / 37 genéticos recientes de nevus del iris han identificado mutaciones de EIF1AX, NRAS, PTEN, KIT y TP53; así como de GNAQ y GNA11. Incluso algunos nevus del iris portan mutaciones de BAP1; esos casos se han designado como “tumores del iris con potencial maligno incierto” (6,7). Los nevus de del cuerpo ciliar y la coroides están compuestos de células névicas o nevocitos sin atipia generalmente mayores que los melanocitos normales. Se pueden identificar cuatro tipos de células névicas: células poliédricas, fusiformes finas, células dendríticas y fusiformes gruesas y células balonizadas. Las células névicas tienen un núcleo ovalado y usualmente carecen de nucleolo y de hendidura de la membrana nuclear. El grado de pigmentación es variable. La atipia citológica y las mitosis están ausentes. Se han detectado mutaciones mutuamente excluyentes entre sí de GNAQ y GNA11, en nevus de cuerpo ciliar y coroides (8). • El melanocitoma uveal es un subtipo, intensamente pigmentado, de nevus de iris, cuerpo ciliar y coroides. Se encuentra compuesto de células grandes, y poliédricas. La etiología y la incidencia del melanocitoma uveal son desconocidas, pero se cree que se trata de una lesión congénita. Los tumores del cuerpo ciliar pueden ser mayores que otros melanocitomas debido al retraso diagnóstico (9,10). • La melanocitosis ocular se define como el aumento congénito de melanocitos hiperpigmentados no proliferantes. Puede considerarse una variante de nevus congénito o una lesión hamartomatosa. La esclera presenta un color gris-azulado debido a la presencia de melanocitos pigmentados por debajo de la superficie del ojo, junto a hiperpigmentación de la úvea subyacente. La pigmentación del iris y la coroides es consecuencia del incremento de melanocitos poliédricos con melanina. (9,10). La melanocitosis ocular congénita presenta algunas semejanzas con el melanocitoma ya que mutaciones somáticas de GNA11 o GNAQ se han descrito en algunos casos (11). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 38 / • La hiperplasia melanocítica uveal difusa bilateral es un síndrome paraneoplásico caracterizado por una proliferación difusa de melanocitos benignos en pacientes con un tumor maligno extraocular. Los tumores más frecuentemente relacionados con esta entidad son el carcinoma de ovario y endometrio en mujeres y el de pulmón en hombres (12). Los melanocitos hiperplásicos son fusiformes con núcleo elongado, sin nucleolo y escaso pigmento melánico intracitoplásmico (9,10). INTRODUCCIÓN / 39 3. EL MELANOMA UVEAL 3.1 Epidemiología El melanoma uveal (MU) es la denominación común que reciben los melanomas de coroides, cuerpo ciliar e iris (13). Es la neoplasia maligna primaria más frecuente del ojo, de modo que hasta el 90% de las neoplasias primarias malignas del ojo son melanomas (14). La mayoría de los MUs se localizan en la coroides y pueden simular una gran variedad de lesiones, entre ellas nevus, tumores metastásicos, osteomas, desprendimiento hemorrágico de coroides, hipertrofia epitelial pigmentada congénita de la retina y lesiones inflamatorias como la escleritis posterior (15). La incidencia anual de MU se estima entre 5,9 a 10,9 casos por millón de habitantes en función de los criterios de inclusión y diagnósticos empleados en el cálculo. La frecuencia del MU se ha mantenido estable durante años (15). La incidencia es similar en EE. UU. que en los países europeos (16). En Europa, la incidencia varía por regiones, mostrando un gradiente ascendente de sur a norte. Este gradiente se ve reflejado en un mínimo de incidencia de < 2 casos por millón de habitantes en España y el sur de Italia, y en un máximo de > 8 casos por millón de habitantes en Irlanda, Noruega y Dinamarca (17). En Australia y Nueva Zelanda la incidencia es similar a la europea, a pesar de la mayor exposición a radiación ultravioleta (UV), en la población de los países oceánicos (16). El MU ha sido diagnosticado en pacientes de todas las edades, pero menos del 1% de los casos ocurren en pacientes menores de 18 años (18). El pico de incidencia se encuentra entre los 70-80 años, teniendo en este grupo etario peor pronóstico (19). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 40 / La incidencia en función del género es objeto de debate en la epidemiología del MU. Existe una creciente evidencia que apoya que hay un incremento ajustado por edad de la incidencia del MU en hombres a partir de los 65 años. Sin embargo, no hay diferencias significativas en la incidencia entre hombres y mujeres menores de 65 años. No se han comunicado diferencias significativas respecto al género en tasas de incidencia ajustada por edad (20,21). Sin embargo, Damato et al. han descrito diferencias de género en la localización de los melanomas dentro de la úvea. Sus datos apuntan hacia tumores de mayor tamaño y localización posterior en hombres. Paradójicamente, las mujeres presentan una mayor afectación del cuerpo ciliar asociada con un peor pronóstico, pero también presentan más frecuentemente tumores en el iris asociados con un pronóstico favorable (22). La asociación del género masculino como factor independiente con supervivencia pobre se ha intentado relacionar con una potencial peor salud general de los hombres, siendo más vulnerables que las mujeres a las metástasis en el caso de MU con grados de malignidad comparables (23). Se ha teorizado que la causa de este peor pronóstico puede ser la existencia de receptores de testosterona en el tumor (24). El embarazo, los contraceptivos orales y los estrógenos postmenopáusicos no parecen influir en el riesgo de desarrollo de MU, y los estudios realizados no apoyan la hipótesis de una influencia hormonal en la carcinogénesis (25–27). Existen notables diferencias en la incidencia según los distintos grupos étnicos: la incidencia anual ajustada por edad es 0,31 para los afroamericanos, 0,38 para los asiáticos, 1,67 para los hispanos y 6,02 para los caucásicos (28). El grupo étnico presenta una fuerte relación con otro factor que se ha visto igualmente asociado al MU, el color del iris. En un metaanálisis realizado por Weis et al., se describe una relación estadísticamente significativa entre el color claro del iris y un mayor riesgo de padecer MU. Ante estos hallazgos presentan dos hipótesis alternativas: que una mayor cantidad de melanina uveal tenga un efecto protector o que el factor protector dependiente de la etnia no esté relacionado con la INTRODUCCIÓN / 41 cantidad de melanina y que el color claro de los ojos actúe como un factor de confusión en aquellas etnias que presentan un mayor riesgo de MU por otros factores desconocidos (29). También se ha planteado la posibilidad que la tradicional correlación entre raza y nivel socioeconómico pueda tener un impacto en la epidemiología del MU (30). Shildkrot et al. en un estudio en función de áreas geográficas basadas en medidas socioeconómicas en EE.UU. planteó que el MU, al igual que el cáncer de próstata o de mama, puede estar infradiagnosticado en poblaciones vulnerables (31). A pesar de estas diferencias en la incidencia entre los distintos grupos raciales, un estudio de Shield et al. de una serie de 8100 pacientes de distintas razas, no encontró diferencias significativas en la mortalidad del MU en función del origen étnico de los pacientes (32). Se han estudiado diversos factores ambientales posiblemente relacionados con la aparición de MU. A diferencia del melanoma cutáneo, no se ha definido una asociación clara entre la luz ultravioleta y el riesgo de desarrollo de dicha neoplasia (15). Sin embargo, las diferencias de incidencia entre grupos raciales, incluso entre miembros del mismo grupo étnico, asociadas a la coloración del iris, sugieren un posible rol protector del aumento de la pigmentación. Este papel apoyaría indirectamente un papel casual de la exposición a los rayos UV en la génesis tumoral. Esta conclusión se basa en la asunción que los iris de color más claro transmiten más luz UV al segmento posterior del ojo. El espectro de luz UV más carcinogénica es la luz UV-B, que es absorbida en gran medida por los filtros desarrollados en las lentes intraoculares adultas; por ello, el polo posterior ocular infantil está sometido a una mayor radiación. Aunque también los pacientes mayores presentan una mayor probabilidad de perder estos filtros oculares debido a una intervención por cataratas. No obstante, existen estudios con resultados contradictorios sobre la frecuencia de desarrollo de tumores en las regiones del ojo con mayor exposición UV (33). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 48 / El tratamiento del MU localizado puede realizarse de modo conservador o con la enucleación, siendo ésta última la técnica más utilizada en el pasado para el tratamiento del MU primario. Sin embargo, en la actualidad el objetivo del tratamiento de los MUs, siempre que sea posible, es conservar el globo ocular, y la función visual, además de reducir la probabilidad de aparición de metástasis. Figura 2. Modalidades terapéuticas para el tratamiento del MU. Adaptado de Bai H, Bosch JJ, Heindl LM. Current management of uveal melanoma: A review. Clin Exp Ophthalmol. 2023; (November 2022):1–11. En cuanto a la supervivencia, la mayoría de los estudios no han demostrado diferencias significativas en la mortalidad entre los enfoques de tratamiento conservador del ojo y los quirúrgicos más radicales. La comparación de los pacientes con MU del COMS tratados con braquiterapia en placa y los sometidos a enucleación no reveló diferencias significativas en la supervivencia a largo plazo. Por lo tanto, en los últimos años los tratamientos conservadores del ojo han ganado adeptos frente a la enucleación. En la actualidad la extirpación del globo ocular se ha sustituido en primera línea por una combinación de fototerapia, radioterapia y resección local del tumor (15). INTRODUCCIÓN / 49 La fotocoagulación o la termoterapia transpupilar (TTT) utiliza energía térmica focalizada para destruir las células tumorales. Se emplea en melanomas uveales pequeños, de hasta 4 mm de grosor (47,54). La terapia fotodinámica, que consiste en la inyección de un compuesto fotosensible como la verteporfina seguida de exposición a la luz para generar radicales libres de oxígeno dañinos, también se utiliza para el tratamiento de melanomas pequeños, pero el control de la enfermedad a largo plazo y la supervivencia sin recidivas siguen sin evidencia científica demostrada (54). En la actualidad pequeño tumores de menos de 3 mm de grosor y localizados a más de 3mm de la fóvea se tratan con esta terapia (15,55). La radioterapia es actualmente el tratamiento más común para el MU, especialmente el MU posterior (15). Existen diferentes modalidades de radioterapia. La mayoría de los melanomas uveales se tratan con braquiterapia en placa basándose en los resultados del ensayo COMS, que asignó aleatoriamente a pacientes con melanomas coroideos de tamaño medio a un tratamiento primario con braquiterapia de 125I o a enucleación. No se observaron diferencias en la mortalidad entre los dos grupos hasta los 15 años de seguimiento (15,51). • La braquiterapia consiste en la irradiación directa de un tumor mediante la aplicación de una fuente radiactiva (radioisótopo) en la superficie o el interior del tumor. Existen dos tipos de fuentes radiactivas utilizadas en braquiterapia, los isótopos emisores de rayos gamma o X y los isótopos emisores de partículas beta. De los isótopos más utilizados en radioterapia oftálmica el Yodo-125 (I- 125) son fuente de partículas gamma y el Rutenio-106 (Ru-106) es una fuente de partículas beta (15). La braquiterapia con I-125 es un tratamiento eficaz con baja morbilidad en los melanomas de tamaño mediano y pequeño. Es una alternativa a la enucleación segura y eficaz con respecto a la supervivencia y al control local de la enfermedad y proporciona una alta probabilidad de conservar el globo ocular, caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 50 / y visión útil. La braquiterapia con Ru-106 es un tratamiento eficaz en los melanomas de tamaño mediano (hasta 7 mm de altura) y pequeños, siendo una alternativa segura y eficaz con respecto a la supervivencia, el control local del tumor y con alta probabilidad de conservar el globo ocular y la visión útil. El isótopo Ru-106 conlleva un mayor riesgo de recidiva local con tumores de más de 5 mm de grosor. Para tumores de entre 5 y 8 mm de grosor (con un diámetro basal no superior a 16 mm), puede utilizarse la braquiterapia con placas de Ru-106, pero debe apoyarse con la aplicación de TTT (56). • La radioterapia externa es la irradiación de un tumor con partículas cargadas, como haces de protones o iones de helio, o con métodos estereotácticos. Esta modalidad puede utilizarse para tratar tumores de hasta 14 mm de grosor con un diámetro basal de hasta 28 mm (15). • La terapia estereotáctica con haz de protones es otra opción para tumores grandes y puede ayudar a evitar la necesidad de enucleación y la pérdida de visión. Un amplio estudio retrospectivo de 492 pacientes con melanomas coroideos T3 y T4 demostró una tasa de control local a 5 años del 94% y una tasa de enucleación del 19,5% que disminuyó con el tiempo (15). La resección local es una opción de tratamiento alternativa para los pacientes con melanoma coroideo que preserva el ojo y, lo que es más importante, permite un análisis histopatológico y citogenético detallado (15). Este procedimiento, durante muchos años, ha estado restringido a pequeños melanomas de iris o cuerpo ciliar, principalmente por la complejidad de la técnica asociada a la escisión de tumores de mayor tamaño y localización posterior; y también por el temor de inducir enfermedad metastásica. En la actualidad, para tumores posteriores la técnica de resección local más utilizada es la esclerouvectomía lamelar parcial. Esta técnica consiste en realizar un colgajo escleral superficial en la zona suprayacente al tumor y una descompresión ocular limitada mediante INTRODUCCIÓN / 51 vitrectomía vía pars plana, seguida de la escisión en bloque de la masa tumoral junto con un colgajo escleral lamelar profundo, sutura del colgajo escleral superficial, y la posterior realización de una vitrectomía completa en caso de roturas retinianas para prevenir el desprendimiento de retina, además de braquiterapia adyuvante (56). La enucleación ha ido adquiriendo cada vez un menor protagonismo. Las indicaciones actuales incluyen: • Melanomas no susceptibles de tratamiento conservador (o fracaso de estos), que por su elevado tamaño ocupan la mayor parte de las estructuras oculares. • Ojos ciegos o dolorosos, por glaucoma secundario grave. • Invasión del nervio óptico (si no es suficiente aplicar braquiterapia con escotadura, por su extensión). • Extensión extraescleral, porque terapias más agresivas no han demostrado mejorar el pronóstico. En estos casos se puede valorar asociar radioterapia externa previa o posterior a la cirugía (57). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 52 / Tabla 1. Resumen de las opciones terapéuticas disponibles para MU. Tratamiento Usado para Comentarios Radioterapia Braquiterapia 106Ru MU pequeño/mediano/ grande - Braquiterapia 125I < 20 mm de diámetro basal - Terapia con haz de protones MU mediano-grande, que no puede ser tratado con braquiterapia o resección - Radiocirugía estereotática MU yuxtapapilar; pacientes no candidatos a braquiterapia o cirugía Menor disponibilidad Fototerapia Terapia térmica transpupilar Recurrencia local y como terapia adyuvante de MU Usado de forma muy ocasional; cuando se considere la preservación de la visión (ya que evita las complicaciones de la radioterapia), no está recomendado de rutina como tratamiento único de primera línea Terapia fotodinámica MU pequeño Evita las complicaciones de la radioterapia Cirugía Exoresección ± placa MU mediano-grande de estrecho diámetro Raramente usado; siempre realizado junto a braquiterapia para reducir el riesgo de recurrencia Endoresección ± radioterapia MU de mediano tamaño - Enucleación MU de gran tamaño - Adaptada de Souto EB, Zielinska A, Luis M, Carbone C, Martins-Gomes C, Souto SB, et al. Uveal melanoma: physiopathology and new in situ-specific therapies. Cancer Chemother Pharmacol. 2019;84 (1):15–32 A pesar de los excelentes resultados en el control de la enfermedad local con cirugía o radioterapia, cerca del 50% de los pacientes finalmente desarrollan enfermedad metastásica, siendo los lugares más frecuentes de inicio el hígado (60,5-89%), el pulmón (24,4-29%) la piel/tejidos blandos (10,9%) y el hueso (17-8,4%). INTRODUCCIÓN / 53 La tasa total de supervivencia desde el diagnóstico de la neoplasia primaria es del 69% a los 5 años, 55% a los 15 años y del 51% a los 25 años. Sin embargo, una vez desarrollada la enfermedad metastásica, la supervivencia media es aproximadamente de 13,4 meses desde la detección de la metástasis, con solo un 8% de supervivencia a los 2 años (58,59). En un estudio con 8033 casos de MU se describieron tasas de metástasis del 8%, 15% y 25% a los 3, 5 y 10 años respectivamente (15). Las tasas de respuesta del MU metastásico a los tratamientos sistémicos son pobres y las tasas de supervivencia del MU metastásico prácticamente no han variado en los últimos 40 años. A pesar de esto existen esfuerzos por alcanzar nuevos tratamientos y potenciales dianas terapéuticas que permitan una mejora de la supervivencia global de estos pacientes (60). Cuando el MU metastásico está restringido a una región anatómica limitada pueden utilizarse modalidades de tratamiento locorregional, como la resección quirúrgica, la quimioterapia intraarterial, la quimioembolización percutánea transarterial, la radioterapia interna selectiva y la ablación por radiofrecuencia para controlar la enfermedad. Se ha investigado el uso de diversos agentes citotóxicos, como dacarbazina, treosulfán, temozolomida, fotemustina, cisplatino y terapias combinadas como bleomicina, vincristina, lomustina y dacarbazina, gemcitabina/treosulfán y dacarbazina/treosulfán. Sin embargo, en la práctica clínica rara vez se observan respuestas y la supervivencia global es cuestionable (61). Las terapias inmunológicas novedosas han mostrado una actividad alentadora en estudios de fase inicial y existen múltiples líneas de investigación actualmente. Los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICI), como los inhibidores de CTLA4 y PD-1, se utilizan ahora con frecuencia como tratamiento sistémico de primera línea de las metástasis cutáneas y caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 54 / mucosas del melanoma. Aunque los anticuerpos inmunomoduladores contra el antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA 4) y PD-1/ PD-L1 han mejorado significativamente la evolución del melanoma cutáneo metastásico, han fracasado cuando se han trasladado a pacientes con MU (62). El Ipilimumab (anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA-4), está aprobado en EE.UU. y Europa para el tratamiento del melanoma uveal avanzado irresecable. Se han notificado tasas de respuesta de aproximadamente el 5% o 10% en MU metastásico, pero la mediana de supervivencia global de 6,0-9,7 meses en estos ensayos sugiere que las respuestas podrían ser tardías y duraderas sólo en una minoría de pacientes (61). El primer estudio retrospectivo en el que participaron 20 pacientes con MU metastásico mostró una mediana de supervivencia global de 5 meses tras el tratamiento con ipilimumab (63). Tremelimumab (CP 675206) es otro anticuerpo monoclonal humano que se dirige contra CTLA-4. Un estudio de fase II de 11 pacientes con MU que recibieron tremelimumab mostró una mediana de supervivencia libre de progresión de 2,9 meses y una mediana de supervivencia de 12,8 meses (64). La vía PD-1/PD-L1 es responsable de inhibir la activación de las células T en la periferia. Hasta la fecha, el mayor ensayo clínico con anticuerpos monoclonales contra el receptor PD-1 se realizó en 58 pacientes con MU metastásico tratados con pembrolizumab, nivolumab o atezolizumab. De los 56 pacientes evaluables, sólo el 3,6% obtuvo respuestas parciales y el 8,9% presentó una enfermedad estable (65). Asimismo, en un estudio prospectivo observacional de cohortes en el que se investigó la eficacia y la seguridad de pembrolizumab como tratamiento de primera línea para pacientes con MU metastásico, Rossi et al. hallaron que la eficacia de pembrolizumab no parece mejor en comparación con otros agentes para el MU metastásico, aunque los pacientes que respondieron tuvieron un control de la enfermedad notable (66,67). INTRODUCCIÓN / 55 Varios estudios retrospectivos investigaron el tratamiento con anti-PD-1 en combinación con anticuerpos anti-CTLA-4 y mostraron resultados clínicos similares (62,68). La combinación de fármacos antiangiogénicos con otras terapias es otro enfoque terapéutico. La angiogénesis tumoral es esencial para el crecimiento, la progresión y la metástasis de los tumores. El VEGF es una de las principales citocinas que influyen en la angiogénesis tumoral y puede servir como biomarcador del MU metastásico, ya que parece aumentar significativamente tras el desarrollo de enfermedad diseminada. El bevacizumab es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF que ha demostrado suprimir las micrometástasis hepáticas in vivo (61). El Grupo Español de Melanoma (GEM), un grupo colaborativo español, ha diseñado recientemente un estudio de fase II, de un solo brazo, en pacientes con MU metastásico que serán tratados con la combinación de durvalumab, un inhibidor antiPD-L1, y cediranib, un inhibidor multiquinasa de VEGFR, PDGFRβ, KIT y FLT-1 y -2. Dada la estrecha relación entre la angiogénesis y el microentorno inmunitario, la combinación de terapias antiangiogénicas e inhibidores de puntos de control ofrece una estrategia potencialmente innovadora (69). Los receptores monoclonales inmunomóviles de células T contra el cáncer (ImmTAC) son una nueva clase de células T que redirigen fármacos biológicos específicos y reactivos antitumorales. Estas moléculas, que contienen un TCR soluble de afinidad mejorada conectado a un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 optimizado, tienen una semivida de unión larga y son capaces de redirigir las células T a células tumorales con una baja densidad de dianas. Como primer y único fármaco que ha demostrado beneficios clínicos en un estudio de fase III, tebentafusp (también llamado IMCgp100), es una molécula ImmTAC avanzada dirigida al péptido gp100 restringido a HLA-A*02:01, que puede destruir las células tumorales diana por sinapsis inmunitaria. Actualmente está en marcha un programa de acceso ampliado caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 56 / (NCT04960891) para proporcionar acceso a tebentafusp a pacientes con MU metastásico (62,70). Los inhibidores de MEK suponen un intento de frenar efectores de la vía MAPK activada en la mayoría de los melanomas uveales (61). La reducción de la viabilidad de las células de MU con selumetinib (AZD6244, ARRY- 142886), un inhibidor alostérico oral, potente y altamente selectivo de MEK1/260 con una semivida corta, se correlacionó con una firma génica dependiente de MEK y se observó que era mayor en las células tumorales con mutaciones GNAQ o BRAF (71). La AKT fosforilada se observa en más del 50% de los melanomas uveales y se asocia a un riesgo mayor de enfermedad metastásica. Está en curso un ensayo de fase II que evalúa prospectivamente la eficacia de trametinib (otro inhibidor de MEK) con o sin un inhibidor de AKT en pacientes con MU metastásico (NCT01979523). Dado además que selumetinib en combinación con el inhibidor de AKT MK2206 redujo la viabilidad celular en >50% en múltiples líneas celulares de MU con mutación de GNAQ y redujo la masa tumoral en modelos de xenoinjerto en ratón, la combinación de la inhibición de MEK y AKT es una estrategia de tratamiento de interés (72). Las disregulaciones epigenéticas se encuentran entre las dianas más alentadoras en el MU, especialmente en los tumores con mutación BAP1, debido al papel de este gen en la remodelación de la cromatina. Varios ensayos están evaluando actualmente inhibidores de HDAC e inhibidores de BET, aunque los resultados preliminares fueron decepcionantes. La vía YAP constituye otra diana prometedora. Varios artículos han demostrado la implicación de la señalización de YAP a través de una vía independiente de Hippo, con la inhibición de YAP dando lugar a resultados impresionantes in vitro y en modelos animales. Desgraciadamente, todavía no se dispone de fármacos dirigidos a esta vía para los pacientes (73). INTRODUCCIÓN / 57 3.3 Factores pronósticos clínicos y morfológicos en el melanoma uveal El momento en el que la enfermedad diseminada es detectada difiere considerablemente entre pacientes. El 1,5% de los pacientes con MU tienen metástasis detectables en el momento del diagnóstico, mientras que la tasa acumulada de desarrollo de metástasis es de 25% a los 10 años tras el diagnóstico (23). Las cifras de aparición de enfermedad a distancia, a pesar del correcto manejo local de la lesión, pueden deberse a la diseminación neoplásica en estadios precoces del desarrollo tumoral. Debido a estas diferencias en la evolución de la enfermedad a lo largo del tiempo, se han estudiados diversas características de estos tumores que permitieran prever la evolución de la enfermedad. Las características clínicas asociadas con un mal pronóstico en pacientes con MU incluyen: edad avanzada en el momento de la presentación, sexo masculino, localización en el cuerpo ciliar, asociación con melanocitosis ocular/oculodérmica, mayor diámetro y grosor basal del tumor, extensión extraocular del tumor y estadificación avanzada del tumor según la clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC). Las características histopatológicas que sugieren un mal pronóstico incluyen: el tipo celular epitelioide, una elevada actividad mitótica, una mayor densidad microvascular, patrones de matriz extravascular, linfocitos que infiltran el tumor, macrófagos que infiltran el tumor, una mayor expresión del receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina y una mayor expresión del antígeno leucocitario humano de clase I y II (17,20,23,32,58,59,74–77). Edad La mediana de edad en el momento del diagnóstico del MU metastásico es de 61-65 años (23). Algunos estudios han concluido que la edad de presentación no influye en el pronóstico del MU, ya que la supervivencia a largo plazo para pacientes de mayor y menor edad parece ser similares. Estos resultados sugerirían que las tasas de curación para ambos grupos son parecidas y las diferencias en tasa de supervivencia se basan en que los pacientes de caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 64 / Tabla 2. Categoría T (tamaño) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. MELANOMA DE COROIDES Y CUERPO CILIAR TX El tumor primario no puede ser evaluado T0 No hay evidencia de tumor primario T1 Tamaño tumoral de categoría 1 T1a Sin afectación del cuerpo ciliar ni extensión extraocular T1b Afectación del cuerpo ciliar T1c Sin afectación del cuerpo ciliar y con extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T1d Afectación del cuerpo ciliar y extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T2 Tamaño tumoral de categoría 2 T2a Sin afectación del cuerpo ciliar ni extensión extraocular T2b Afectación del cuerpo ciliar T2c Sin afectación del cuerpo ciliar y con extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T2d Afectación del cuerpo ciliar y extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T3 Tamaño tumoral de categoría 3 T3a Sin afectación del cuerpo ciliar ni extensión extraocular T3b Afectación del cuerpo ciliar T3c Sin afectación del cuerpo ciliar y con extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T3c Afectación del cuerpo ciliar y extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T4 Tamaño tumoral de categoría 4 T4a Sin afectación del cuerpo ciliar ni extensión extraocular T4b Afectación del cuerpo ciliar T4c Afectación del cuerpo ciliar y con extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T4d Afectación del cuerpo ciliar y extensión extraocular ≤ de 5 mm de diámetro T4e Cualquier tamaño tumoral con extensión extraocular > de 5 mm de diámetro Adaptado de TNM Classification of Malignant Tumours, edited by James D. Brierley, et al., John Wiley & Sons, Incorporated, 2017. Figura 4. Clasificación para melanomas de coroides y cuerpo ciliar basada en el grosor y el diámetro (mm). Adaptado de TNM Classification of Malignant Tumours, edited by James D. Brierley, et al., John Wiley & Sons, Incorporated, 2017. INTRODUCCIÓN / 65 Tabla 3. Categoría N (ganglios linfáticos regionales) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. GANGLIOS LINFÁTICOS REGIONALES NX No se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales N0 No hay metástasis en los ganglios linfáticos regionales N1 Metástasis en los ganglios linfáticos regionales Adaptado de TNM Classification of Malignant Tumours, edited by James D. Brierley, et al., John Wiley & Sons, Incorporated, 2017. Tabla 4. Categoría M (metástasis) para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. METÁSTASIS A DISTANCIA M0 No hay metástasis a distancia M1 Metástasis a distancia M1a Metástasis de mayor tamaño con diámetro ≤ de 3 cm M1b Metástasis de mayor tamaño con diámetro entre 3,1-8 cm M1c Metástasis de mayor tamaño con diámetro ≥ de 8 cm Adaptado de TNM Classification of Malignant Tumours, edited by James D. Brierley, et al., John Wiley & Sons, Incorporated, 2017. Tabla 5. Estadio clínico-patológico para melanomas de coroides y cuerpo ciliar. ESTADIO T N M IT1a N0 M0 IIA T1b-d N0 M0 T2a N0 M0 IIB T2b N0 M0 T3a N0 M0 IIIA T2c-d N0 M0 T3b-c N0 M0 T4a N0 M0 IIIB T3d N0 M0 T4b-c N0 M0 IIIC T4d-e N0 M0 IV Cualquier T N1 M0 Cualquier T Cualquier N M1 Adaptado de TNM Classification of Malignant Tumours, edited by James D. Brierley, et al., John Wiley & Sons, Incorporated, 2017. caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 66 / Tipo celular En 1931 Callender describió seis tipos de melanomas uveales basándose en su composición celular: • Melanomas fusocelulares tipo A. • Melanomas fusocelulares tipo B. • Melanomas fusocelulares tipo schwannomas. • Melanomas epitelioides puros. • Melanomas mixtos (epitelioides y fusocelulares). • Melanomas necróticos inclasificables. Actualmente se utiliza en práctica clínica una clasificación de Callender modificada que divide a los MU en fusocelulares A o B, epitelioides o mixtos (87). La clasificación de Callender modificada tiene una mejor correlación entre el tipo de célula y la mortalidad (20). Las células fusiformes tienen un núcleo alargado, citoplasma escaso y un patrón cohesivo. Las que carecen de nucleolo y presentan un núcleo con una hendidura central a largo del eje longitudinal se clasifican como células fusiformes A. Las que contienen nucleolo prominente y presentan mayor pleomorfismo se denominan células fusiformes B. Las células epitelioides se caracterizan por tener un abundante citoplasma acidófilo, con núcleos grandes y ovalados, una elevada relación núcleo/ citoplasma y nucleolo irregular. Son grandes, polimorfas y tienen tendencia a la discohesión. Los tumores compuestos exclusivamente por células fusiformes A son clasificados por muchos patólogos como nevus. Tumores compuestos de células fusiformes B, con o sin células fusiformes A, pero sin células epitelioides, se clasifican como melanomas fusocelulares. Tumores compuestos exclusivamente, o casi exclusivamente, por células epitelioides se clasifican como melanomas epitelioides. Tumores compuestos de una mezcla de células fusiformes y INTRODUCCIÓN / 67 epitelioides se clasifican como melanomas de células mixtas, con un mínimo del 10% de cualquiera de los dos tipos. A mayor número de células epitelioides, peor curso clínico. Por tanto, los melanomas fusocelulares se asocian con un curso relativamente indolente comparados con los epitelioides y los melanomas mixtos se asocian con un curso clínico intermedio. Algunos melanomas son completamente necróticos, y según la clasificación modificada de Callender se describen como melanomas necróticos. El pronóstico de los melanomas necróticos es intermedio entre el melanoma fusocelular y el epitelioide (9). La clasificación de Callender modificada, aunque es útil, está sujeta a limitaciones. Por ejemplo, aun se debate el porcentaje de células epitelioides que desplazaría el diagnóstico de melanoma fusocelular a melanoma de tipo mixto; secciones transversales de células fusiformes B pueden ser confundidas con células epitelioides. Es un hecho que la reproducibilidad intraobservador e interobservador es limitada. El Colegio Americano de Patólogos (CAP), en la edición del 2017 de su protocolo para el diagnóstico de muestras de pacientes con MU, basándose en la categorización del grado histológico de la AJCC, recomienda el empleo de la clasificación de Callender modificada y asigna al subtipo fusocelular un grado histológico 1 (G1), al subtipo mixto (>10% de células epitelioides y < 90% de células fusocelulares) un grado histológico 2 (G2) y al subtipo epitelioide un grado histológico 3 (G3), aunque especifica que, debido a la falta de acuerdo universal en la proporción de células epitelioides que clasifica un tumor como mixto, algunos patólogos optan por unificar los dos últimos tipos en uno solo, es decir, en función de la presencia o no de células epitelioides (88). El tipo epitelioide compromete aproximadamente el 3-5% de todos los MU y se encuentra asociado con un pronóstico menos favorable. La mortalidad a los 15 años es del 75%. El tipo fusocelular supone aproximadamente el 40% de todos los MU y su tasa de mortalidad a los caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 68 / 15 años es del 20%. El tipo mixto es el más frecuente, con un porcentaje cercano al 50% y una mortalidad a los 15 años próxima al 60% pero con diferencias considerables en función del porcentaje de células epitelioides y fusocelulares (59). En un estudio de 232 ojos enucleados de pacientes con MU, la supervivencia a 10 años fue del 82% en pacientes con <0,5 células epitelioides por campo de gran aumento (CGA), el 55% para 0,5 a 4,9 células epitelioides/CGA, y del 33% en pacientes con >5 células epitelioides/CGA (21,89). La gran mayoría de las metástasis (92%) contienen células epitelioides en mayor cantidad que los tumores primarios respectivos, lo que limita las posibilidades de confirmar una asociación estadística con la supervivencia global (86). Figura 5. A) MU de células fusiformes, B) MU de células epitelioides. INTRODUCCIÓN / 69 Actividad mitótica Se ha sugerido el valor pronóstico del conteo de figuras de mitosis en 40 CGA. Damato et al. obtuvieron una correlación estadísticamente significativa entre los tumores con una actividad mitótica superior a 4/40 CGA y el desarrollo de metástasis y la mortalidad (90). Los tumores de baja actividad mitótica (0-1/40 CGA) se han asociado con una mortalidad a 6 años del 15- 23%, los de actividad media (2-8/40 CGA) del 40-47%, y los de actividad alta (9-48/40 CGA) del 56% (59). No existe un sistema uniforme de contar mitosis y de preparar las muestras, por lo que los resultados entre los distintos centros varían considerablemente (90). En tumores de gran tamaño, es necesario buscar múltiples campos hasta encontrar una mitosis y empezar a contar desde ese punto. Angi et al. demostraron que el recuento convencional de la actividad mitótica, que consiste en contar las figuras mitóticas en una tinción rutinaria con hematoxilina y eosina, depende de la experiencia de la persona que realiza el recuento y conlleva un error de subestimación. Según estos autores el uso del marcador mitótico fosfo-histona H3 (Ser10) hace que se reconozca un mayor número de mitosis en el material analizado, lo que aumenta la reproducibilidad del recuento y lo hace más independiente de la experiencia del examinador. (91) En cuanto al uso de un marcador inmunohistoquímico de proliferación celular, como puedes ser la expresión nuclear de Ki67, no suele ser rutinario, a pesar de que presenta mejor sensibilidad que el conteo de figuras de mitosis. En tumores muy pigmentados es necesario usar un cromógeno que no sea marrón y/o eliminar la melanina de la sección, lo cual en muchas ocasiones no resulta práctico. No obstante, la comparación del índice de mitosis y la tinción de ki67 en melanomas amelanóticos ilustra la realidad que la detección de mitosis puede subestimar la población de células en proliferación (10). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 70 / Figura 6. MU pigmentado. * Figura de mitosis. Densidad microvascular La angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes) ha sido ampliamente reconocida como un indicador biológico de la carcinogénesis tumoral (92). La densidad microvascular, una medida cuantitativa de la vascularización tumoral, es un factor pronóstico del MU. Se evalúa contando los vasos tumorales (inmunoteñidos con CD34, Factor VIII y actina de músculo liso) a partir de las zonas de mayor densidad vascular (93). No se sabe con certeza si todos los elementos marcados con estos anticuerpos, en particular el CD34, son realmente células endoteliales (94) ya que las células neoplásicas pueden expresarlo cuando existe un aumento de la densidad microvascular (95). La expresión de marcadores de células endoteliales por las células tumorales parece tener implicaciones prácticas. La densidad microvascular puede que no sea una medida de la dependencia del tumor de la angiogénesis, lo que sugiere que la asociación con el pronóstico puede reflejar, al menos en parte, la presencia de células tumorales más agresivas que comparten características con las endoteliales (94). INTRODUCCIÓN / 71 Mimetismo vasculogénico Se refiere a la formación de una microcirculación por células tumorales agresivas. Fue descrito por primera vez en melanomas uveales y posteriormente identificado en otros tumores como melanomas cutáneos y de la mucosa oral, carcinomas inflamatorios y ductales de mama y carcinomas prostáticos, carcinomas ováricos, rabdomiosarcomas o feocromocitomas. La formación de estos canales no es un acontecimiento angiogénico. No surgen de vasos preexistentes, y aunque se desarrollan de novo (una característica compartida con la vasculogénesis) los canales no son vasos sanguíneos, ya que no se encuentran recubiertos por células endoteliales, a pesar de que distribuyen plasma y pueden contener glóbulos rojos (95). Según la definición original de Folberg et al. un bucle microvascular es un patrón curvo completamente cerrado. Las redes se definen como al menos tres bucles cerrados espalda con espalda. Si las redes están presentes, los bucles, por definición, también lo están (96). Estos patrones son ricos en laminina, fibronectina, colágenos IV y VI, y una variedad de glicosaminoglicanos. En el tejido del MU humano, los patrones de imitación vasculogénico sólo contienen trazas de colágeno I y se diferencian claramente de los septos fibrovasculares (97). La tinción con PAS sin hematoxilina como contratición se utiliza para ponerlos de manifiesto. Se descubrió que la presencia histológica de estos patrones de mimetismo vasculogénico estaba muy fuertemente asociada con la muerte por melanoma metastásico, asociación que fue confirmada por múltiples grupos independientes (95). Los patrones de mimetismo vasculogénico que funcionan como una “malla conductora de fluidos”, también pueden proporcionar una vía alternativa para administrar agentes terapéuticos al MU (97). No debe confundirse el mimetismo vasculogénico con las llamadas “lagunas vasculares”, que han sido bien reconocidas en estudios morfológicos de los melanomas. Las lagunas aparecen como vasos sanguíneos intratumorales inmaduros irregulares, pero carecen de revestimiento endotelial. Las lagunas caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 72 / vasculares difieren del mimetismo vasculogénico en que no forman bucles y aparecen como estructuras independientes formadas por acumulaciones de plasma y glóbulos rojos. Se sabe muy poco actualmente sobre ellas en el MU, pero un estudio sugiere que estas lagunas están relacionadas con indicadores de mal pronósticos (98). Infiltrado inflamatorio linfocítico El ojo es una ubicación anatómica inmunoprivilegiada, esto implica que el ojo limita la respuesta inflamatoria inmune en un esfuerzo para proteger la visión. Dentro del microambiente tumoral ocular sí puede establecerse inflamación. Los melanomas uveales son bastante homogéneos, sin mucho tejido estromal, por lo que pueden ser las propias células tumorales las que presenten mayor influencia en la presencia de linfocitos infiltrantes tumorales (TILs) (99). Para comprender la causa de la afluencia de células inflamatorias, hay que estudiar la composición y la función del infiltrado inmunitario, en el contexto de distintos factores microambientales, como la hipoxia. Los TILs suponen un factor de buen pronóstico en muchos tipos de cáncer, como el melanoma cutáneo, el linfoma no Hodgkin, el cáncer de pulmón no microcítico y el cáncer de mama. Aunque se pensaba que la presencia de células inflamatorias infiltrantes ayudaría a estimular las respuestas inmunitarias antitumorales también en el MU, los datos actuales sugieren que la presencia de macrófagos y TILs se asocia a una peor supervivencia (100,101). Esto puede estar relacionado con la influencia inmunorreguladora del microentorno intraocular, de forma similar a la situación en la desviación inmunitaria experimental asociada a la cámara anterior (ACAID), las células tumorales pueden escapar del ojo e inducir células T reguladoras intratumorales que posteriormente suprimen la respuesta inmunitaria local y sistémica contra la neoplasia. Las células T reguladoras, un subconjunto de células T CD4þ, son necesarias para el mantenimiento de la autotolerancia, y se caracterizan ampliamente por su expresión del factor de transcripción nuclear forkhead INTRODUCCIÓN / 73 box p3 (Foxp3). Se ha detectado un aumento del número de estos linfocitos inmunosupresores en diversos tumores malignos. En el MU, se han descrito células T reguladoras en el 12%-24% de los casos. Las altas densidades de células inflamatorias aparecen con mayor frecuencia en los tumores de tipo celular epitelioide, que son especialmente los que presentan pérdida del cromosoma 3 (102,103). Macrófagos asociados a tumor La presencia de macrófagos puede desempeñar un papel fisiopatológico importante. Pueden identificarse dos tipos diferentes de macrófagos, de los cuales el fenotipo M1 es proinflamatorio y el fenotipo M2 está asociado a la reparación de tejidos y a la producción de citocinas antiinflamatorias. Los anticuerpos anti CD68 y CD163 son los marcadores utilizados para identificar macrófagos en el tejido. La proteína del receptor scavenger de hemoglobinahaptoglobina (CD163/HbSR) es una glicoproteína transmembrana restringida a monocitos/macrófagos de la familia rica en receptores scavenger. Reacciona con monocitos y macrófagos maduros y con células neoplásicas de origen monocítico/histiocítico. Los macrófagos M2 se caracterizan por una mayor expresión de CD163. La razón de la importancia de los macrófagos radica en su función promotora de la angiogénesis y en su capacidad para suprimir las respuestas inmunitarias contra el melanoma. Se sabe que los macrófagos M2 son capaces de inducir directamente las células T reguladoras, lo que provoca la supresión de las células T citotóxicas específicas del tumor. Los macrófagos tipo M2 son los predominantes en el MU y además existe una fuerte correlación entre la presencia de células T reguladoras y macrófagos M2 (103,104). Esta correlación también se ha observado en el colangiocarcinoma intrahepático y en los tumores del estroma gastrointestinal. Un mayor número de macrófagos asociados a tumor en el MU se ha asociado a mortalidad por metástasis y a mayores dimensiones basales del tumor, tipo de célula epitelioide, y elevada densidad microvascular (105). También se ha observado una asociación entre la presencia de un número elevado de macrófagos asociados a tumor y una elevada densidad microvascular en caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 80 / Cada clase supone un aumento progresivo del riesgo de desarrollo de metástasis y, por tanto, un aumento del riesgo de mal pronóstico (127). Posteriormente Jager et al. modificaron la clasificación del TCGA, proponiendo la sustitución de la nomenclatura numérica por una alfabética, y así diferenciarla de la del test 15-GEP, e integrando ambas clasificaciones. Además, incluyeron datos del estado de cromosoma 6, de la inflamación intratumoral y del pronóstico (Tabla 6) (128). Tabla 6. Clasificación del MU según sus correspondientes aberraciones cromosómicas. A B C D Clase ARNm 1 1 2 2 Aberración cromosómica Infrecuente Infrecuente Frecuente Frecuente Cromosoma 3 Disomía 3 Disomía 3 Monosomía 3 Monosomía 3 Cromosoma 6 Extra 6p Extra 6p Cromosoma 8 8q normal Extra 8q parcial Extra 8q Extra 8q Inflamación No No Algo Mucha Pronóstico Bueno Metástasis tardías Pobre Pobre Adaptado de Jager MJ, Brouwer NJ, Esmaeli B. The Cancer Genome Atlas Project: An Integrated Molecular View of Uveal Melanoma. Ophthalmology. 2018;125 (8):1139–42. Esta nueva clasificación molecular es superior a la actual estadificación TNM, o de la AJCC, a la hora de predecir el riesgo de metástasis a los 5 y 10 años (129,130). Mientras que en Estados Unidos predomina el uso clínico de las pruebas de GEP (Castle Biosciences), en Europa lo hace el análisis cromosómico. Como se aprecia en la clasificación TCGA modificada, la segregación de los tumores en dos grandes grupos pronósticos puede lograrse indistintamente analizando el estado del cromosoma 3 (disomía 3 frente a monosomía 3) o analizando el transcriptoma (GEP). En otras palabras, las categorías C y D (GEP clase 2) reflejan el transcriptoma de los tumores con monosomía 3 (131). INTRODUCCIÓN / 81 3.5 Principales mutaciones descritas en el melanoma uveal Aunque la genómica es una disciplina científica relativamente nueva, el avance de la tecnología en estas últimas décadas ha permitido que se alcancen grandes logros en la identificación de mutaciones relacionadas con distintos tumores. La teoría actual de cómo se desarrolla el cáncer se basa en tres conceptos: (i) la hipótesis del doble hit postula que la transformación de una célula normal en una célula cancerosa necesita al menos dos pasos irreversibles, normalmente mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores; (ii) el modelo de carcinogénesis multifase, que predice distintos cambios morfológicos durante el desarrollo del tumor en función de lesiones moleculares específicas adquiridas; y (iii) el concepto de los sellos distintivos del cáncer. (18). Todas las neoplasias despliegan ocho cambios fundamentales en la fisiología celular que se consideran característicos del cáncer. Estos cambios son los siguientes: autosuficiencia de las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibidoras del crecimiento, alteración del metabolismo celular, evasión de la apoptosis, potencial ilimitado de replicación (inmortalidad), angiogénesis sostenida, capacidad para invadir y metastatizar y por último, capacidad para evadir la respuesta inmunitaria del huésped (132). La secuenciación del exoma completo de los MUs muestra que, a diferencia de otros tumores, como el melanoma cutáneo o el adenocarcinoma de pulmón, la carga mutacional tumoral de los MUs (TMB; definida como el número de mutaciones no heredadas por millón de bases de la secuencia genómica investigada) baja. De hecho, el proyecto TCGA (http://cancergenome.nih. gov) demostró que la TMB del MU era de 1,1 por Mb, mientras que para el melanoma cutáneo era de 18 por Mb (133). Los genes con mutaciones relevantes para el desarrollo del MU pueden agruparse fundamentalmente en genes con mutaciones iniciadoras de tumores y genes que albergan mutaciones con un impacto relevante en el pronóstico de los pacientes (18,133). Algunas de las alteraciones moleculares caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 82 / más prevalentes en el MU han sido bien caracterizadas, entre ellas las mutaciones de los siguientes genes driver: GNAQ, GNA11, CYSLTR2, PCLB4, BAP1, EIF1AX y SF3B1 (134–139). Además, la presencia o ausencia de estas mutaciones presenta o puede presentar valor pronóstico en la enfermedad del paciente (140). GNAQ (cromosoma 9q21.2) y GNA11 (cromosoma 19p13.3;) son genes que codifican la subunidad α de la proteína G, actuando con los receptores acoplados a dicha proteína. Las subunidades alfa sirven de interruptor entre el estado activo de las proteínas G (cuando se unen al trifosfato de guanosina [GTP]) y el estado inactivo (cuando el GTP se hidroliza a difosfato de guanosina). Son genes parálogos con una homología de secuencia de aproximadamente el 90% y con una región codificante que comprende siete exones. Las proteínas codificadas por estos genes tienen pesos moleculares similares (42.142 y 42.123 Da, respectivamente), y constan de 359 aminoácidos que comprenden las subunidades de unión a nucleótidos αq y α11 de las proteínas G heterotriméricas (141). GNAQ y GNA11 son activados por los receptores de serotonina (5-HT) 2A y 2B (HTR2A y HTR2B). Se desconoce el papel de la serotonina en los melanocitos uveales, pero se ha descrito la implicación del neurotransmisor en la regulación de la proliferación, la morfología celular y la migración de los melanocitos en la piel de rana. Curiosamente, HTR2B, el gen que codifica el receptor de serotonina 5-HT2B, se ha encontrado sobrexepresado en MU con alto riesgo metastásico, a pesar de que las mutaciones GNAQ y GNA11 ya activan la vía de forma autónoma. Los receptores de endotelina tipos A y B (EDNRA y EDNRB) también señalizan a través de GNAQ y GNA11. La endotelina 2 se expresa de forma diferencial en el MU, y su receptor EDNRB está regulado a la baja en el MU metastásico. Las pruebas obtenidas en ratones indican que la señalización de la endotelina podría ser específica de los melanocitos derivados de precursores de células de Schwann que también pueblan la úvea (18). INTRODUCCIÓN / 83 En el 85-92% de los MUs se producen mutaciones mutuamente excluyentes en GNAQ y GNA11 y se encuentran casi exclusivamente en el codón 209 y, en algunos casos, en el codón 183 (21,58,126,131,142–144). Los estudios pioneros de secuenciación de GNAQ y GNA11 en el MU mostraron un patrón exclusivo de mutaciones somáticas en ambos genes. Estudios posteriores han descrito casos aislados de mutaciones que afectan a estos genes simultáneamente. La transducción de señales de las proteínas G se produce de manera aberrante cuando GNAQ y GNA11 se encuentran mutados. Se han descrito puntos calientes mutacionales (hotspot) en ambos genes, caracterizados por la presencia de variantes Missense activadoras que afectan exclusivamente a los exones 4 y 5 y, más concretamente, a los codones arginina 183 (R183) y glutamina 209 (Q209). La mayoría de las mutaciones del GNA11 en el codón 209 dan lugar a sustituciones de glutamina por leucina (p.Q209L) y prolina (p.Q209P). Estas mutaciones se producen por sustituciones de una base en el codón 209 (CAG), siendo las sustituciones más comunes A > T (94,5%) y A > C (2,7%). Por el contrario, en el gen GNAQ, un cambio de una base en el codón 209 (CAA) puede predecir la sustitución de glutamina por leucina (A > T, p.Q209L) y prolina (A > C, p.Q209P), en la mayoría de los casos (141). Además de p.Q209 y p.R183, en la cohorte TCGA se identificaron la mutación Missense p.G48V, que codifica el dominio helicoidal situado en el segundo exón, y la mutación truncating G48* que provocó la formación de un codón de parada en el codón 48 de un polipéptido de 359 aminoácidos de longitud. Las mutaciones p.G48* y p.G48V se detectaron en un mismo paciente, pero se observó que este paciente no era portador de las mutaciones impulsoras p.G209 y p.R183. Específicamente en este paciente, la asociación de las mutaciones p.G48* y p.G48V puede haber mostrado una característica de mutación iniciadora para la patogénesis del MU (145). En el exón 5, también se han descrito otras mutaciones, incluyendo p.Q209M, p.Q209H, p.Q209I, p.F228L, y p.M203V en GNAQ y p.Q209Y, p.E234K, p.E221D en GNA11. En general, la frecuencia de mutaciones en el exón 4 de GNAQ y GNA11 es menor. La mayoría de las mutaciones en GNA11 están inducidas por transiciones C>T en el codón caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 84 / 183 (CGC) y transiciones CC>TT en los codones 182-183, que provocan la sustitución de arginina por cisteína (p.R183C) o histidina (p.R183H). Del mismo modo, las escasas mutaciones conocidas que afectan al codón 183 de GNAQ (CGA) son todas inducidas por transiciones G>A. Otras mutaciones del exón 4 de GNAQ son p.P170S, p.I189T, p.Q176R y p.P193L, que tienen una recurrencia global del 8,9% en algunas cohortes. Excepcionalmente, la mutación se ha observado en el codón glutamina 48 (17,144). Las mutaciones de GNAQ y GNA11 son un acontecimiento temprano en la oncogénesis del MU (60). Estas mutaciones se encuentran tanto en lesiones melanocíticas malignas como benignas, lo que sugiere un papel inicial en los acontecimientos mutacionales que conducen a la tumorogénesis (21). Las mutaciones en GNAQ o GNA11 también se encuentran con frecuencia en nevos benignos oculares o cutáneos como los nevos azules. En realidad, GNAQ Q209 se encontró con mayor frecuencia en los nevos azules, observándose en el 55% de los mismos, mientras que el 45% de los MUs primarios y el 22% de metastásicos, son portadores de esta mutación. Se observó una relación inversa para la mutación GNA11 Q209, en la que las lesiones metastásicas mostraron el mayor número (56%), seguidas de los MUs (32%) y, por último, los nevus azules (6%). Las mutaciones que afectan al codón R183 son menos frecuentes. Están presentes en el 2% de los nevos azules y en el 5% de los Mus (146). La expresión ectópica de la mutación activadora GNAQ/11.Q209L en el pez cebra junto con la inactivación del supresor tumoral TP53 condujo a la formación de tumores, mientras que la expresión de GNAQ/11.Q209L por sí sola produjo profundos defectos de pigmentación sin transformación oncogénica, lo que apoya la hipótesis de que las mutaciones activadoras GNAQ/11 son eventos precursores que requieren un “segundo golpe” para conducir a la transformación maligna (131). Las proteínas Gα mutadas median en la activación de la vía de la fosfolipasa C/proteína quinasa C (PLCα/PKC) y de múltiples vías de señalización INTRODUCCIÓN / 85 descendentes, incluidas las vías RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT/MTOR y Trio/Rho/ Rac/YAP1 (147). • Las isoenzimas de la PKC son una clase prototípica de serina/treonina quinasas que se conservan a lo largo de la evolución y se expresan ampliamente en casi todos los tipos de células. La vía de señalización de la PKC tiene funciones críticas en la regulación de la expresión génica, así como en la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia y muerte celular. El evento de señalización descendente más conocido iniciado por Gαq implica su capacidad para activar la PLCβ y el consiguiente aumento de la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5-bifosfato para producir dos segundos mensajeros: el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). El IP3 eleva los niveles citoplásmicos de Ca2+, lo que estimula múltiples vías reguladas por el calcio y, junto con el DAG, activa las isoformas clásicas de la proteína cinasa C (147–149). • Las cascadas de proteínas activadas por mitógeno quinasas (MAPK) son vías de señalización de membrana a núcleo que se conservan desde la levadura hasta los vertebrados. Están implicadas en múltiples procesos fisiológicos e integra señales de complejas redes intracelulares en la realización de funciones celulares. Entre las diferentes cascadas MAPK identificadas hasta ahora en eucariotas, la vía del fibrosarcoma de aceleración rápida/proteína quinasa activada por mitógenos/quinasa regulada por señales extracelulares (vía RAF/ MEK/ERK) sólo se ha encontrado en metazoos. En esta cascada, las proteínas de la familia RAF fosforilan y activan las quinasas denominadas MEK que, a su vez, fosforilan y activan las denominadas ERK. Una vez activadas, las ERK pueden translocarse al núcleo, donde fosforilan los factores de transcripción, regulando así su actividad. La cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK es esencial para la comunicación intercelular e intracelular celular, que regula funciones caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 86 / celulares fundamentales como el crecimiento, la supervivencia y la diferenciación. Cuando las mutaciones de GNAQ y GNA11 activan constitutivamente la vía RAF/MEK/ERK, se sobreexpresa la proteína reguladora del ciclo celular ciclina D1 (CCND1), lo que conduce a la inactivación del supresor tumoral RB1 (RB transcriptional corepressor 1); de este modo, la célula recibe señales continuas de crecimiento en ausencia de estímulos extracelulares, lo que da lugar a la proliferación celular (144,149–151). • La vía fosfatidilinositol 3-cinasa/proteína quinasa B/diana de la rapamicina quinasa (PI3K/AKT/mTOR) es muy importante en la regulación celular de muchos procesos fundamentales para la célula: crecimiento, proliferación, apoptosis, metabolismo, entre otros, cuyas alteraciones conllevan a una amplia gama de enfermedades humanas y, dentro de ellas, el cáncer. La activación del fosfoinositol trifosfato (PIP3) ocurre a través de los receptores tirosina quinasa (como los receptores de insulina o del factor de crecimiento epidérmico humano), que son puntos referenciales de alteraciones oncogénicas y, por tanto, fuentes de investigación para nuevos medicamentos anticancerígenos. La vía de señalización PI3K/AKT/mTOR es muy compleja, con muchos componentes e interacciones, y regula cerca de 17 procesos celulares importantes (61,147,148). • El triple dominio funcional (Trio), miembro de la familia DBL, alberga tres dominios con actividad enzimática, dos GEF y un dominio de serina quinasa. El Trío es bien conocido por su papel central en el desarrollo neuronal. Además, Trio también desempeña un papel destacado en la formación del músculo esquelético fetal y en el desarrollo embrionario. La familia RHO de GTPasas, una subfamilia de la superfamilia RAS, está formada por proteínas G pequeñas. El miembro A de la familia homóloga RAS (RhoA), el sustrato 1 de la toxina botulínica C3 relacionado con RAS (Rac1) y el ciclo de división INTRODUCCIÓN / 87 celular 42 (Cdc42) son los mejor caracterizados y se han establecido como reguladores de la dinámica y la morfología del citoesqueleto. Trio y las Rho-GTPasas se sobreexpresan en numerosos cánceres, como los de mama, pulmón, colon, cabeza y cuello, vejiga, tumores gástricos o sarcomas. El dominio GEFD1 puede activar tanto a Rac1 como a RhoG, mientras que el dominio GEFD2 activa específicamente a RhoA. Además, el RhoG activado puede activar aún más al Cdc42. La proteína asociada a Yes (YAP) es un coactivador transcripcional que actúa como un potente promotor tumoral. Se cree que la vía Hippo es el principal regulador de la actividad y el potencial oncogénico de YAP. La vía Hippo ha sido identificada como un importante regulador del tamaño de los órganos, y recientemente se ha apreciado su implicación en varios tipos de cáncer incluidos los de pulmón, colorrectal, ovario, hígado y próstata. Cuando se activa, YAP actúa como una oncoproteína, promoviendo la proliferación celular a través de factores de transcripción nuclear. A pesar de ello, las mutaciones de los genes de la vía Hippo son poco frecuentes, lo que impulsa a explorar otro mecanismo subyacente a la activación de YAP en cada tipo de tumor. Se sabe que YAP integra muchas vías de entradas diferentes (señalización Hippo, E-Cadherina, señales mecánicas...) para orquestar diversas funciones celulares, como el crecimiento, la apoptosis y la migración, así como la invasión y la metástasis de las células cancerosas. La activación de YAP por GαQ activado implica un circuito de señalización Trio-Rho/Rac, que estimula la polimerización de actina independientemente de la activación de PLCβ o de la vía Hippo. Por tanto, la señalización Trio- Rha/Rac gobierna la dinámica del citoesqueleto de actina y afecta a la vía Hippo promoviendo liberación de YAP, y permitiéndole entrar en el núcleo e iniciar la transcripción de genes implicados en la proliferación, la antiapoptosis y la supervivencia celular (61,72,152,153). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 88 / Por lo tanto, las proteínas Gα mutadas o las moléculas de señalización corriente abajo representan objetivos potenciales para la terapia. Dado que la mayoría de los MUs presentan mutaciones en GNAQ o GNA11, terapias dirigidas a las moléculas de señalización están siendo en la actualidad investigadas. Desgraciadamente, los resultados han sido decepcionantes, con tasas de respuesta generalmente inferiores al 10% (54,147). Se sabe menos sobre el papel de las mutaciones de GNAQ y GNA11 en el MU metastásico (144). En primer lugar, se sugirió que las mutaciones en GNA11 pudieran presentar un efecto mayor en los melanocitos que las mutaciones en GNAQ (154). Van Raamsdonk et al. especularon con la posibilidad de que las diferencias observadas fueran una consecuencia determinada por diferentes socios de interacción, más que una diferencia real en la función entre ambos genes (142). Onken et al. indicaron que las mutaciones en GNAQ presentaban frecuencias similares en diferentes estadios clínicos de la progresión de la enfermedad, y eran independientes de las aberraciones cromosómicas, actuando como hemos referido anteriormente como un evento oncogénico temprano (155). Staby et al. tampoco hallaron diferencias estadísticamente significativas en la prevalencia de las mutaciones GNAQ y GNA11 entre los pacientes con o sin enfermedad metastásica. A pesar de ello, estos autores observaron que la presencia de mutaciones GNAQ mostraba una tendencia inversamente proporcional a la progresión metastásica (156). Terai et al. estudiaron en 87 pacientes con MU metastásico la existencia de una relación entre metástasis-muerte y la frecuencia de mutaciones GNAQ y GNA11. Los autores informaron de una tasa de mutaciones similar para ambas mutaciones. Este resultado fue coherente con hallazgos descritos previamente. Además, concluyeron que eran las diferencias en el tipo de mutación (p.Q209 frente a p.Q209L) más que los propios genes GNAQ y GNA11 las que podían presentar valor pronóstico en la supervivencia de los pacientes con MU (157). Como puede deducirse, en la mayoría de los estudios publicados no se ha podido demostrar ninguna correlación entre la presencia de mutaciones en GNAQ y GNA11 y la supervivencia de las pacientes. Esto INTRODUCCIÓN / 89 se debe a que, aunque la mayoría de ellos mostraban una tendencia que apoyaba que las mutaciones en el gen GNA11 probablemente conducen a un desarrollo más agresivo de la enfermedad, esta tendencia rara vez ha ido acompañada de resultados estadísticamente significativos. No obstante, muy recientemente, Piaggio et al. demostraron, que los MUs de su serie con GNA11 mutado tenían peor pronóstico que los que presentaban mutaciones en GNAQ (CRI = 1,97, p = 0,02). Este es el único estudio publicado en el que los resultados estadísticos apoyan la existencia de una asociación entre las mutaciones en el gen GNA11 y un peor pronóstico de la enfermedad (158). Por lo tanto, si estos datos fueran extrapolables, cabe suponer que la ausencia de resultados estadísticamente significativos en los estudios previos, podría deberse a un número reducido de muestras analizadas o al insuficiente tiempo de seguimiento de los pacientes (141). CYSLTR2 (gen del receptor 2 de cisteinil leucotrieno) codifica un receptor acoplado a la proteína G implicado en la señalización mediada por leucotrieno en la inflamación y la fibrosis. La mutación en CYSLTR2 que provoca una sustitución p.Leu129Gln conduce a la activación constitutiva de la vía de señalización GNAQ/11. Tras la unión del ligando a CYSTLR2, las proteínas G se activan intercambiando GDP por GTP. La unión del GTP inicia un cambio de conformación en la proteína G, lo que permite que ésta se libere del receptor CYSTLR2 y active un gran número de efectores corrientes abajo, como PLCB4 y ARF6 (149). Se han encontrado mutaciones en CYSLTR2 en el 4% de los tumores que no albergaban mutaciones de GNAQ ni GNA11 (131). Estos hallazgos revelan un papel oncogénico de CYSLTR2 en el MU a través de la activación de la señalización Gαq, y sugieren además que Leu129Gln CYSLTR2 puede ser una potencial diana terapéutica en el MU (149). La mutación PLCB4 (gen de la fosfolipasa Cβ4) se ha observado en varios casos de MU sin mutación de GNAQ y GNA11. La mutación de ganancia de función PLCB4 D630Y es mutuamente excluyente con las mutaciones GNA11 y GNAQ, lo que parece indicar que PLCB4 es una diana corriente abajo de caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 96 / eliminación de secuencias no codificantes (intrones) del ARNprem y la ligadura de secuencias codificantes (exones) para formar el ARNm. El splicing del ARNprem está catalizado por el spliceosoma, un complejo formado por 5 pequeños ARN nucleares (snARN) que se asocian con proteínas para formar partículas denominadas pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP). Se han caracterizado dos tipos de spliceosomas: los spliceosomas dependientes de U2 (mayores) y los spliceosomas dependientes de U12 (menores). Aunque los spliceosomas dependientes de U2 y U12 difieren en su composición de snARN, comparten muchas proteínas. Por ejemplo, todas las subunidades del complejo proteico SF3B, a saber, SF3B155/SF3B1, SF3B145, SF3B130, SF3B49, SF3B14a/p14, SF3B14b y SF3B10. SF3B aporta una masa molecular de 450 kDa a cada snRNP, y se ha demostrado que desempeña un papel clave en el reconocimiento y la selección del sitio de ramificación (BS) durante el splicing al interactuar con el ARNprem del sitio de ramificación de forma independiente de la secuencia, reforzando la estabilidad durante la interacción ARNsn U2/BS. Así, aunque tradicionalmente se considera que el splicing de ARNprem implica procesos separados y secuenciales, es difícil para los spliceosomas, y las proteínas asociadas, detectar sitios de splicing específicos en un vasto conjunto de ARN. Esta complejidad hace que la maquinaria de splicing del ARNprem sea susceptible a polimorfismos de secuencia y mutaciones deletéreas, algunas de las cuales acaban dando lugar a enfermedades, cuyo número va en aumento. Por ello, algunas mutaciones o polimorfismos específicos de los factores de splicing del ARNprem se han convertido en importantes marcadores diagnósticos y dianas terapéuticas en las enfermedades humanas (167,168). El gen SF3B1 (subunidad 1 del factor de spilicing 3b) codifica la subunidad más grande del complejo SF3B y funciona sirviendo como componente central del snRNP U2, que es crítico para el reconocimiento del BS y para las primeras etapas del ensamblaje del spliceosoma. La estructura de SF3B1 consiste en un N-terminal hidrofílico que alberga un motivo de unión a U2AF y un C-terminal con 22 repeticiones diferentes HEAT (Huntingtina, factor de elongación 3, proteína fosfatasa 2A, dianas de rapamicina 1) cuya función INTRODUCCIÓN / 97 está aún por dilucidar. Las mutaciones en SF3B1 representan mutaciones recurrentes en neoplasias hematológicas y tumores sólidos, entre los que se incluye el MU (165). Las mutaciones de SF3B1 se producen en estado heterocigoto y son mutaciones de cambio de función que dan lugar a una amplia gama de transcritos aberrantes debido a la proteína SF3B1 mutada, codificada por el alelo mutante. El alelo no mutado permanece activo para producir los transcritos canónicos. Los transcritos aberrantes son el resultado del uso de sitios de reconocimiento alternativos por parte del complejo spliceosoma mutado y, por tanto, de la utilización (o preferencia) de un sitio splicing no canónico (169). El gen SF3B1 se encuentra mutado en una minoría de casos de MU (10-24%). (146) Las mutaciones en SF3B1 en el MU ocurren principalmente en la posición del gen que codifica los residuos de aminoácidos 625 en el exón 14, y más raramente se encuentran afectados los residuos 666, 700, 783, 781, 742, y 1123 que representan el 22% de las mutaciones de SF3B1 no R625 (169). Estas mutaciones específicas podrían ser explicadas por varios factores, como los socios de interacción específicos del tejido, la tasa de mutación del gen y la actividad de varias vías en un tejido específico que podrían conferir una ventaja de supervivencia. Sin embargo, dado que estos residuos están espacialmente cerca unos de otros, no es sorprendente que estas mutaciones tengan un impacto funcional similar en la transcripción. Los datos de secuenciación de ARN de muestras de cáncer de mama y de MU con mutaciones en SF3B1 muestran algunas transcripciones aberrantes únicas, pero la mayoría de las transcripciones aberrantes se observan en ambos tumores malignos (119). Las mutaciones en SF3B1 se han asociado con características pronósticas favorables, incluyendo una edad más joven del paciente y menos células epitelioides indiferenciadas. El 29% de los tumores con disomía 3 portan una mutación heterocigota en SF3B1, en comparación con sólo el 3% de los tumores con monosomía 3. Además, el 54% de los tumores con monosomía 3 parcial caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 98 / (preferentemente con pérdida de 3q y preservación de 3p) portan la mutación Arg625 en SF3B1. Las mutaciones en SF3B1 se encuentran con frecuencia en tumores que expresan el oncogén PRAME (antígeno expresado preferentemente en el melanoma) que actúa como represor dominante de la señalización del receptor de ácido retinoico. La expresión de PRAME se ha relacionado con tumores de clase 1 con un riesgo intermedio de metástasis (146). Dada la asociación con características pronósticas favorables, resulta tentador sugerir que la mutación en SF3B1 pueda ser una mutación protectora en el MU, sin embargo, actualmente se piensa que esta mutación puede estar asociada MUs que desarrollan metástasis tardías. La enfermedad metastásica de aparición tardía se produce asociada a la mutación de SF3B1, pero sólo cuando el seguimiento del estudio es suficiente, lo que implica que las micrometástasis con mutación SF3B1 permanecen más tiempo en estado latente que las micrometástasis con mutación BAP1 (119). Yavuzyigitoglu et al. observaron que los MUs con disomía 3 y mutación en SF3B1 tenían un pronóstico significativamente peor y un desarrollo más frecuente de metástasis tardías que los tumores con disomía 3 y sin mutación del SF3B1 (138). Los pacientes de este subconjunto particular de disomía 3 desarrollaron metástasis en una mediana de 8,2 años tras el diagnóstico (119). No está claro qué causa esta diferencia en el potencial metastásico; por ejemplo, se piensa que SF3B1 está implicado en el splicing de genes apoptóticos claves, como MCL1 y BCL2/xL, sin embargo, se necesitan más estudios para relacionar las aberraciones de splicing con la oncogénesis (165). El EIF1AX, ubicado en el cromosoma Xp22, codifica el factor de iniciación de la traducción eucariota 1A (EIF1A). Regula la iniciación de la traducción de proteínas mediante una combinación del proceso de estabilización del ribosoma y reconocimiento del ARNm diana, preparando así el ARNm para la traducción. EIF1AX es necesario para la transferencia del tRNA metionil iniciador a la unidad ribosomal pequeña (40S) durante la fase de iniciación INTRODUCCIÓN / 99 de la traducción en células eucariotas (144). La unidad ribosomal pequeña se mueve a lo largo de la secuencia del ARNm hasta encontrar el codón de inicio, AUG, que codifica el aminoácido metionina, el cual es localizado gracias al anticodón del RNAt que se encuentra unido a la subunidad menor en el sitio P de ésta. EIF1A consta de un dominio globular y dos colas no estructuradas, la N- y la C-terminal, que intervienen en el análisis del ARNm y el reconocimiento preciso del codón de inicio (149). El gen EIF1AX se identificó como un gen impulsor del MU mediante secuenciación del exoma completo. La tinción inmunohistoquímica de EIF1AX en muestras que albergan una mutación mostró una tinción positiva en todo el citoplasma de la célula, lo que demuestra que las mutaciones en el gen EIF1AX no causan la pérdida de la proteína (149). Aproximadamente el 14-20% de los melanomas uveales portan mutaciones en este gen, siendo casos no metastásicos asociados con un buen pronóstico. La mayoría de las mutaciones se encuentran en los exones 1 y 2 (144). Las mutaciones asociadas a MU en EIF1AX se producen exclusivamente en la cola N-terminal de la proteína, una región muy conservada en los eucariotas. Las mutaciones en la cola N-terminal inhiben el proceso de escaneo en busca del codón de inicio de la traducción. Esto promueve la utilización de codones de inicio óptimos y, por tanto, altera la expresión génica en el MU. Se plantea la cuestión de si la región N-terminal de EIF1AX ejecuta funciones específicas o se relaciona con dominios de unión específicos en el MU. Las mutaciones de cambio de función en el gen EIF1AX podrían hacer que los melanocitos malignizaran estimulando su división, pero no lo suficiente como para iniciar la metástasis. Se desconoce si los melanocitos con mutación EIF1AX no se diseminan en absoluto o si existen micrometástasis en órganos distantes que permanecen latentes (149). Esta mutación también se ha descrito en cáncer de tiroides, ovario y en las raras neoplasias melanocíticas leptomeningeas primarias. A diferencia de en el MU, las mutaciones en estos tumores se encuentran en todo el ADN que codifica la proteína (146). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 100 / La mutación de EIF1AX, que es casi mutuamente excluyente con las mutaciones de BAP1 y SF3B1, se encontró asociada a la disomía del cromosoma 3. La mayoría de las mutaciones de EIF1AX se observan en tumores con disomía 3 (48%), y sólo raramente en tumores con monosomía 3 (3%). Las mutaciones de EIF1AX se encuentran comúnmente en células tumorales en heterocigosis, lo que indica que EIF1AX funciona como un oncogén de acción dominante. Sin embargo, los MUs con una mutación en EIF1AX sólo expresan el alelo mutante, lo que sugiere que EIF1AX también puede funcionar de forma recesiva (111,144). Ewens et al. observaron un riesgo metastásico 10 veces menor en pacientes con disomía 3 y mutación de EIF1AX. Se ha demostrado que las mutaciones de EIF1AX y RAS cooperan para inducir la tumorigénesis en líneas celulares isogénicas y en ratones (170). Las variantes de splicing EIF1AX-A113, recurrentes en el cáncer de tiroides avanzado, permiten un aumento general de la síntesis proteica a través de la desfosforilación de EIF2α inducida por ATF4. RAS estabiliza c-MYC, que coopera con ATF4 para sensibilizar mTOR al suministro de aminoácidos. Estos eventos combinados generan vulnerabilidades terapéuticas a los inhibidores de MEK, BRD4 y mTOR quinasa (165). El mecanismo molecular que implica a EIF1AX en el MU no se conoce por completo. Recientemente, Johnson et al. sugirieron que un proceso de traducción anormal podría ser responsable de una ventaja selectiva clonal en las células con esta alteración (171). Las mutaciones en BAP1, SF3B1 y EIF1AX son casi siempre mutuamente excluyentes entre sí y a diferencia de las mutaciones en genes implicados en la señalización de la proteína G, se asocian con pronósticos marcadamente distintos: metástasis tempranas (BAP1), tardías (SF3B1) o ausencia de metástasis (EIF1AX) (18). Por tanto, tienen un pronóstico intermedio en comparación con los pacientes con MU con mutaciones en EIF1AX (bajo riesgo) y pérdida de BAP1 (alto riesgo) (133,172). INTRODUCCIÓN / 101 Tabla 7. Genes frecuentemente mutados en el melanoma uveal. Gen Porcentaje de muestras con mutaciones Alelos Recurrentes–Cambio proteico (frecuencia) GNAQ 50% Q209P/L (90%) R183Q (5%) G48*/V (5%) GNA11 45% Q209L (94%) R183C (3%) R166H (3%) BAP1 33% Múltiples* SF3B1 23% R625H/C (78%) K666T (11%) H662R (5%) T663P (5%) EIF1AX 13% G6D (20%) G8R (20%) G9R/D (20%) G15D (20%) W70R (15%) CYSLTR2 4% L129Q (100%) SRSF2 4% Múltiples PLCB4 2.5% D630N/V/Y (100%) MAPKAPK5 2.5% Mutaciones truncating *Mutaciones missense, frameshift y truncating. Adaptado de Bakhoum MF, Esmaeli B. Molecular characteristics of uveal melanoma: Insights from the cancer genome atlas (TCGA) project. Cancers (Basel). 2019;11 (8). 3.5.1 Otras mutaciones descritas en el melanoma uveal SF3B1 es el gen del spliceosoma mutado con mayor frecuencia en el MU. También se han descrito mutaciones en U2AF1 y SRSF2. Tanto U2AF1 como SRSF2 participan en el ensamblaje del spliceosoma. SRSF2 pertenece a la familia de proteínas ricas en serina/arginina que ayudan al splicing mediante la unión de potenciadores de splicing exónico. SRSF2 se une al elemento potenciador del splicing en el ARNprem y se sabe que desempeña un papel en la elongación de la transcripción y la estabilidad genómica, así como en los mecanismos de splicing estructural y alternativo del ARNprem (145). El SRSF2 está mutado con mayor frecuencia en la leucemia mielomonocítica caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 102 / crónica (47%) y en los síndromes mielodisplásicos (15%). SRSF2 está mutado en el 4% de los MUs. Aunque la tasa de mutación de SRSF2 es baja en el MU, puede ser un acontecimiento significativo, dado el efecto en cascada del reconocimiento erróneo de potenciadores de splicing exónico en un gran número de genes diana (165). PHF10 es un gen supresor tumoral que se encuentra en una región de Chr 6q. Se ha descrito en tres melanomas uveales con mutaciones de pérdida de función: dos tumores con deleción homocigota superpuesta y uno con una mutación frameshift y pérdida concomitante del alelo no mutado (115). La transcriptasa inversa telomerasa (TERT) es un componente de la enzima telomerasa que añade la repetición telomérica TTAGGG a los extremos de los telómeros. La sobreexpresión de TERT consecuencia de la mutación de su gen promotor a la inmortalización de las células somáticas. Este mecanismo es crucial para la transformación neoplásica, ya que en las células normales el acortamiento de los telómeros reduce su potencial replicativo. La mutación del promotor de TERT se describe en el 1% de los MU, siendo más común en el conjuntival (41%) y en la melanosis adquirida primaria con atipia (8%). Sin embargo, se ha observado un nivel elevado de expresión de TERT en un grupo de MUs con promotores de TERT de tipo salvaje lo que sugiere que el mantenimiento de los telómeros podría ser un factor importante también en su etiología, aunque con menor impacto en la oncogénesis (111,146). Otro acontecimiento genético infrecuente en el MU es la inactivación de MBD4. El gen MBD4 codifica una glicosilasa responsable de la reparación de la desaminación espontánea de la metilcitosina. En consonancia con esta actividad, la inactivación de MBD4 se asocia a un fenotipo de hipermutación CpG>TpG, como SMARCA4 T910M, GNAS R201C o TP53 R175H. MBD4 suele estar presente en una sola copia, por lo que una sola mutación es suficiente para su inactivación. Por tanto, MBD4 puede actuar como supresor tumoral en el MU (144). INTRODUCCIÓN / 103 Se han observado mutaciones en otros factores de remodelación de la cromatina, incluidas mutaciones de pérdida de función en PBRM1 y mutaciones de ganancia de función en EZH2. PBRM1 codifica una subunidad crítica del complejo de remodelación de la cromatina SWI/SNF, y EZH2 codifica la subunidad enzimática del complejo represivo Polycomb 2 (PRC2). Las alteraciones en PBRM1 y EZH2 probablemente desplazan el equilibrio de la actividad de remodelación de la cromatina aún más hacia la dominancia de PRC2. (116) El TP53 es un gen supresor de tumores frecuentemente suprimido o mutado en diferentes neoplasias, lo que da lugar a la no producción de p53 o a la expresión de una proteína truncada e inestable. Se ha informado de una elevada expresión de p53 en algunos MUs, a menudo asociada a características histológicas y clinicopatológicas asociadas a mal pronóstico, pero no se ha evaluado la posible base genética de estas observaciones (173). El espectro de unas pocas mutaciones Missense altamente recurrentes, ha dado lugar a la hipótesis de que estas mutaciones hotspot se traducen en una p53 mutante con funciones oncogénicas adquiridas (174). Por ejemplo, se ha demostrado en un modelo in vitro que la mutación p.R248Q aumenta el potencial migratorio de las células (175). El gen RPL5, localizado en el cromosoma 1p, se ha encontrado mutado en MU, sin embargo, ningún MU presentaba una doble coincidencia en RPL5, en consonancia con estudios previos que sugieren que RPL5 es un supresor tumoral haploinsuficiente, con inactivación heterocigota en glioblastoma (11%), cáncer de mama (34%) y melanoma cutáneo (28%). En el MU, la mayoría de las pérdidas de la homocigosis de RPL5 se produjo por pérdida del cromosoma 1p, pero en cuatro casos la pérdida era focal, sugiriendo que RPL5 podría impulsar la selección positiva para la pérdida de 1p. RPL5 codifica la proteína ribosómica L5, que forma complejos con el ARNr 5S y constituye una parte importante del punto de control de la biogénesis ribosómica alterada (IRBC). Junto con RPL11 y ARF, RPL5 se une a MDM2 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 104 / inhibiéndola, lo que resulta en la estabilización de p53 en respuesta a los bloqueos en la biogénesis de los ribosomas y el estrés nucleolar. Dado el vínculo entre RPL5 y p53, se ha comprobado si existe una asociación entre las aberraciones en RPL5 y TP53. Las mutaciones en estos genes se han presentado como mutuamente excluyentes, pero al considerar también la pérdida del número de copias no se observó ninguna asociación. Sin embargo, como p53 funciona en múltiples vías, podría estar inactivada en algunos tumores con RPL5 defectuoso debido a presiones selectivas ajenas a la respuesta IRBC (173). El cromosoma 8q alberga varios oncogenes potenciales, entre ellos MYC, DDEF1/ASAP1 y NSB1/NBN. Aunque se ha demostrado que la señalización de MYC está implicada en el desarrollo del MU, no se ha observado ninguna asociación directa entre la expresión de MYC y la muerte metastásica (127). Onken et al. identificaron el LZT1 como un probable “supresor de la metástasis” del 8q y demostraron que la modulación de la expresión del ARNm de LZT1 en líneas celulares de MU repercutía en la capacidad de invasión de las células tumorales (176). Además, el MU se ha relacionado con variantes patogénicas en genes hereditarios de predisposición al cáncer: PALB2, MLH1, MSH6, CHEK2, SMARCE1, ATM, BRCA1 y CTNNA1. En la serie de 154 pacientes de Abdel- Rahman et al. se detectaron variantes patogénicas en genes de predisposición hereditaria en pacientes con MU familiar y en pacientes con MU y fuertes antecedentes personales y/o familiares de cáncer. Esto sugiere la importancia del consejo genético en estos pacientes y sus familiares (177). También se ha informado de la implicación de otras mutaciones genéticas raras como PTEN, DDEF1, MDM2, BCL-2, Cadherina, CCND1, HDM2, APITDI, WNT5A, PTP4A3/ PRL3, TP53BP1, CSMD1, TTC28, DLK2, KTN o CDKN2A que posiblemente desempeñen un papel en la oncogénesis del MU (149,178). INTRODUCCIÓN / 105 4. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA DE PRÓXIMA GENERACIÓN La elaboración de perfiles moleculares de tumores sólidos se está convirtiendo rápidamente en el estándar de atención para una gama cada vez más amplia de indicaciones oncológicas. Los resultados tienen fuertes implicaciones en el diagnóstico, pronóstico y en las decisiones clínicas y terapéuticas. Uno de los grandes avances técnicos en el campo de la genómica ha sido la implementación de las técnicas de secuenciación masiva de próxima generación (NGS), término que engloba a todos los métodos destinados a llevar a cabo secuenciación masiva de ácidos nucleicos, incluyendo su representación gráfica y el análisis de los datos obtenidos de la misma. La reducción de costes y el aumento de la precisión de estas nuevas tecnologías ha permitido desarrollar nuevos campos de estudio para su uso en la práctica médica, incluido el MU, objeto del presente trabajo. El factor fundamental que distingue la NGS de la secuenciación de Sanger tradicional lo constituyen sus requerimientos de obtención de muestras. En tanto que la secuenciación de Sanger necesita un ADN plantilla único simple y homogéneo, la NGS no plantea tal necesidad, puesto que se puede utilizar ADN de casi cualquier procedencia. Dado que la que la primera básicamente aporta un resultado “promedio” de la muestra de ADN, las muestras muy heterogéneas producen resultados no interpretables. En cambio, las técnicas de NGS se ajustan bien a las muestras heterogéneas de ADN gracias a la aplicación de los siguientes procesos básicos: separación espacial, amplificación local y secuenciación en paralelo. caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 112 / Objetivo 3: Describir y analizar las mutaciones genéticas encontradas mediante secuenciación masiva dirigida. 3.1. Realizar un análisis descriptivo de las variantes encontradas durante la secuenciación. 3.2. Correlacionar estos hallazgos con las características histológicas y clínicas previamente descritas. 3.3 Proponer potenciales factores pronósticos y dianas terapéuticas. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS / 115 Hemos realizado un estudio retrospectivo observacional de 69 casos de melanoma uveal primario diagnosticados histológicamente (a partir de piezas de enucleación o exenteración y de tumorectomía), entre el 1 de noviembre de 2000 y el 1 de diciembre de 2015, en la Unidad de Gestión Clínica de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla. El tiempo de seguimiento, definido como el periodo de tiempo entre la enucleación primaria y la muerte o la fecha del último seguimiento, se actualizó en diciembre de 2022. Las muestras tumorales procedentes de enucleaciones oculares se obtuvieron a través del circuito asistencial establecido, previa firma de los pacientes del consentimiento informado del biobanco (CI-BBSSPA). El ‘Comité Ético de Investigación’ del ‘Hospital Universitario Virgen Macarena y Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla’ aprobó la realización de este estudio, que cumple con la Ley 14/2007, del 3 de julio, de Investigación Biomédica. Los criterios de inclusión fueron: • Pacientes mayores de 18 años. • Pacientes diagnosticados de melanoma uveal primario. • Seguimiento mínimo de 5 años desde la cirugía inicial. Los criterios de exclusión fueron: • Pacientes menores de 18 años. • Melanomas primarios de otras estructuras o anejos oculares (conjuntiva, párpados...). • Ausencia de seguimiento clínico o que este sea menor de 5 años. caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 116 / 1. ESTUDIO CLÍNICO La fuente principal de información clínica fue la Historia de Salud Única Digital del Sistema Sanitario Público de Andalucía (DIRAYA), de las que se obtuvieron los siguientes datos: • Edad del paciente en el momento de la operación (en años). • Sexo. • Fecha de cirugía. • Desarrollo de enfermedad metastásica durante el tiempo de seguimiento. • Localización de las metástasis. • Tiempo hasta la primera progresión de la enfermedad (expresado en meses) y supervivencia global (expresado en meses). MATERIAL Y MÉTODOS / 117 2. ESTUDIO HISTOPATOLÓGICO Las muestras estudiadas fueron fijadas en formol tamponado al 10%, incluidas en parafina y teñidas con hematoxilina-eosina. De cada caso, se revisaron todas las preparaciones histológicas disponibles (entre 3 y 10), seleccionando la muestra más representativa para el estudio de las características tumorales. Se registraron las siguientes características histológicas: • Localización del tumor: todos los melanomas seleccionados se ubicaban en la coroides. • Tamaño del tumor (en cm): se equiparó al diámetro mayor tras la fijación de la muestra en formol. • Número de mitosis: se cuantificó el número de mitosis por 40 campos de gran aumento (40X) con un área de campo de 0,152 mm². • Invasión tumoral local: se evaluó de la siguiente forma: - Invasión ausente. - Invasión intraescleral: si las células tumorales se encontraban presentes dentro del espesor de la esclera. - Invasión extraescleral y/o del cuerpo ciliar: cuando el tumor sobrepasaba la esclera o afecta al cuerpo ciliar. • Tipo histológico: se realizó siguiendo los criterios establecidos por la AJCC: - Melanoma de células fusiformes (>90% de células fusiformes). - Melanoma de células epitelioides (>90% de células epitelioides). - Melanoma de células mixtas (>10% de células epitelioides y <90% de células fusiformes). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 118 / Dado el pequeño tamaño de nuestra cohorte, el estudio estadístico incluyó los subtipos que contenían un mayor número de células epitelioides (melanoma de células epitelioides y melanoma de células mixtas). MATERIAL Y MÉTODOS / 119 3. SECUENCIACIÓN MASIVA DIRIGIDA (NGS) 3.1 Extracción de ADN Se empleó el tejido tumoral, fijado en formol y conservado en bloques de parafina, realizándose cortes seriados que fueron revisados para estimar la celularidad tumoral. La fracción tumoral estaba comprendida entre el 60%-90%. El ADN genómico (gADN) del tumor y del tejido control fue extraído usando el kit comercial QIAams DNA Investigator Kit (Quiagen). La concentración se midió por cuantificación fluorométrica usando Qubit Fluorimetro (Thermo Fisher Scientific) con Qubit dsDNA BR Assay Kit y Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). Todas las muestras de ADN se registraron correctamente y fueron almacenadas a -20ºC. 3.2 Control de calidad de las muestras Las muestras de ADNg se sometieron a un control de calidad con el sistema 4200 TapeStation (Agilent Technologies, PN G2991BA) utilizando Genomic DNA ScreenTape (Agilent Technologies, PN 5067-5366 y PN 5067-5365). La TapeStation Agilent 4200 (G2991AA y G2991BA) es una plataforma automatizada para la electroforesis de ácidos nucleicos, que es escalable, flexible, rápida y fiable. El ensayo Genomic DNA ScreenTape está diseñado para evaluar la integridad de muestras de ADN genómico y analizar moléculas de ADN bicatenario de 200 a > 60000 pares de bases. La evaluación objetiva de la integridad del ADN se proporciona con una medida numérica, el número de integridad del ADNg, degradation index value, (DIN) (Tabla 1 y 2). El análisis del ADN reveló un marcado nivel de degradación. Todas las muestras de ADN extraídas a menudo de bloques FFPE muy antiguos tenían caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 120 / un DIN muy bajo, lo que indicaba una degradación grave. Se descartaron las muestras con valores subóptimos para la preparación de bibliotecas debido a un nivel de degradación excesivo (anteriormente DIN 1,3) o a una concentración insuficiente. 3.3 Preparación de bibliotecas y enriquecimiento de dianas Se emplearon hasta 50 ng de cada ADNg para preparar las bibliotecas. El ADNg se fragmentó en primer lugar utilizando el kit de fragmentación enzimática SureSelect (Agilent Technologies, PN 191-4080), siguiendo las indicaciones del proveedor para ADN extraído de muestras fijadas en formol e incluidas en parafina. Para la captura híbrida de las regiones objetivo del estudio, en los primeros 38 casos se empleó un panel de 519 genes basado en SureSelect HS2 (Agilent Technologies) capaz de detectar simultáneamente variaciones de un solo nucleótido e inestabilidad de microsatélites siguiendo el protocolo básico recomendado para la preparación de bibliotecas de muestras de ADN altamente degradadas. Los genes estudiados en el panel fueron: ABL1; AKT1; ALK; ATM; BAP1; BRAF; BRCA1; BRCA2; CCND1; CCE1; CDK4; CDK6; CDKN2A; DNMT3A; EGFR; ERBB2; ERBB4; ESR1; FGFR1; FGFR2; FGFR3; FLT3; IDH1; IDH2; JAK2; KIT; KRAS; MAP2K1; MET; NOTCH1; NPM1; NRAS; PDGFRA; PIK3CA; PTEN; RET; ROS1; SF3B1; TP53; U2AF1; VHL; AKT2; AKT3; APC; ARAF; BCL2; BCOR; CBL; CCND2; CCND3; CDH1; CHEK2; CTNNB1; DDR2; ERBB3; ERCC2; EZH2; FBXW7; FGFR4; GNA11; GNAQ ; GNAS; HRAS; JAK1; JAK3; KDR; MAP2K2; MDM2; MDM4; MITF; MLH1; MPL; MTOR; MYC; MYCN; NF1; NF2; PBRM1; PIK3R1; PTCH1; RAF1; RB1; SMARCA4; SMARCB1; SMO; STK11; TSC1; TSC2; AR; ASXL1; ATR; AURKA; BCL6; CBFB; CD274; CDK12; CDKN1A; CDKN1B; CDKN2C; CEBPA; CREBBP; EPHA3; FANCA; FANCC; FLT1; GATA3; HNF1A; IGF1R; IKZF1; MAP2K4; MAPK1; MCL1; MEN1; MSH2; MSH6; MYD88; NOTCH2; NTRK1; NTRK3; MATERIAL Y MÉTODOS / 121 PALB2; PAX5; PDGFRB; POLE; PTPN11; RAC1; RARA; RICTOR; RNF43; RUNX1; SETD2; SMAD2; SMAD4; STAG2; TET2; WT1; ARID1A; ATRX; AURKB; BARD1; BRD4; BRIP1; BTK; CARD11; CDC73; CDK8; CDKN2B; CIC; CRLF2; CSF1R; CTCF; EP300; ERCC4; ERG; ETV6; FAT1; FGF3; FH; FLCN; FOXA1; FOXL2; GATA2; IL7R; KDM5A; KDM6A; KEAP1; MAP3K1; MED12; MUTYH; NBN; NFE2L2; PMS2; PPP2R1A; PRDM1; PTPRD; RAD51C; RBM10; SDHB; SPOP; SRC; SRSF2; SUFU; TERT; TGFBR2; TMPRSS2; XPO1; ARID1B; ARID2; AXIN1; AXIN2; AXL; B2M; BCL2L1; BLM; CASP8; CD79B; CHEK1; DAXX; DICER1; FAM46C; FGF4; FLT4; FUBP1; GRIN2A; H3F3A; INPP4B; KDM5C; KMT2D; MEF2B; MRE11A; NKX2- 1; NSD1; NTRK2; PIK3CB; PMS1; PRKAR1A; RAD21; RAD51D; RHOA; SDHC; SDHD; SMAD3; SOCS1; SOX2; SOX9; SPEN; STAT3; SUZ12; SYK; TNFAIP3; VEGFA; BCORL1; BMPR1A; CALR; CRKL; CSF3R; CUL3; DIS3; EED; EPCAM; ERCC3; EWSR1; FGF19; FOXP1; GATA1; GLI1; HGF; HIST1H3B; IGF2; IKBKE; IRF4; JUN; KLF4; MAX; NCOR1; NFKBIA; NOTCH3; PARK2; PHOX2B; PIK3R2; PIM1; POLD1; RAD50; RAD51; RAD51B; REL; RIT1; RPTOR; SDHA; SH2B3; TBX3; TCF7L2; TNFRSF14; TOP1; TSHR; YAP1; ZRSR2; ACVR1; ASXL2; BCL2L11; BTG1; CD79A; CXCR4; DOT1L; EIF1AX; EPHA5; EPHB1; ERCC1; ERCC5; ERRFI1; ETV1; FANCG; FOXO1; GRM3; GSK3B; ID3; IRS2; KAT6A; KMT2A; LMO1; LRP1B; MSH3; PAK1; PAX8; PDCD1LG2; PPM1D; PTPRT; RAD54L; RASA1; RECQL4; RHEB; SDHAF2; TET1; TMEM127; TP63; TRAF7; XRCC2; ABL2; AMER1; ARID5B; CTLA4; CTNNA1; CYLD; DNAJB1; EPHA7; FAM175A; FANCD2; FANCE; FANCF; FANCL; FAS; GREM1; H3F3B; HOXB13; KMT2C; MAP3K13; MGA; MYB; MYOD1; NRG1; NT5C2; NUP93; PARP1; PHF6; PIK3CD; PIK3CG; PLCG2; PPARG; PPP6C; QKI; RAD52; RUNX1T1; SETBP1; SH2D1A; TCF3; ZFHX3; ZNF217; ACVR1B; ALOX12B; ARFRP1; BCL10; BCL2L2; BCR; BIRC3; CBLB; CHD2; CHD4; CUX1; DCUN1D1; DNMT3B; EML4; FGF10; FGF14; FGF23; FGF6; FRS2; GATA4; GATA6; GNA13; HIST1H1C; INHBA; KIF5B; KLHL6; KMT2B; LATS1; LATS2; LZTR1; MST1R; NUTM1; PAX3; PAX7; PDCD1; PDK1; PDPK1; PIK3C2B; PIK3C2G; PIK3R3; PML; PREX2; PRKCI; PRKDC; RFWD2; RYBP; SHQ1; SMARCD1; SMC1A; SMC3; SNCAIP; SOS1; SOX17; STAT5B; TCEB1; TFE3; TGFBR1; TOP2A; WHSC1; YES1; ZNF703; DDX3X; DNMT1; EIF4A2; ETV4; ETV5; FANCI; GEN1; GPC3; H3F3C; HIF1A; HIST1H3C; IFNGR1; LYN; MDC1; caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 128 / 4. ORGANIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS DATOS 4.1 Análisis exploratorio de datos En primer lugar, se realizó una exploración de los datos, generando estadísticos de resumen y representaciones gráficas para todos los casos, así como para grupos de casos. Este procedimiento se utilizó para identificar valores atípicos y caracterizar diferencias entre grupos e identificar la existencia de valores inusuales o extremos en las observaciones. 4.2 Análisis descriptivo Para el análisis de las variables de tipo cualitativo se han realizado tablas de distribución de frecuencias y porcentajes. Para las variables cuantitativas se han calculado medidas de centralización y de dispersión. Estas medidas se han determinado globalmente y para grupos de casos. Se obtuvieron estimadores puntuales e intervalos de confianza al 95% para promedios y porcentajes. 4.3 Análisis inferencial bivariante • Relación entre variables numéricas: Para medir la relación lineal entre pares de variables numéricas, se calcularon coeficientes de correlación de Pearson, o Rho-Spearman, según criterio de aplicación. Se aplicó la prueba de correlación o independencia para ver la significación de la asociación. • Relación entre variables categóricas: Para valorar la relación entre dos variables de tipo cualitativo, se realizaron tablas de contingencias y se aplicó la prueba de Chi-cuadrado, Chi-cuadrado con corrección de continuidad o el test de Fisher. Los resultados se completaron con la MATERIAL Y MÉTODOS / 129 realización de la prueba de Tendencia con Proporciones, para confirmar la relación lineal entre dichas variables no numéricas, si procedía. Los resultados significativos de estas pruebas de hipótesis se presentaron con intervalos de confianza al 95% para diferencia de proporciones. • Comparación de medias: Para analizar la relación entre una variable cualitativa dicotómica y una cuantitativa, se realizó la prueba de la T de Student una vez validados los requisitos de aleatoriedad, independencia, normalidad e igualdad de varianza. En el caso de no cumplirse el requisito de igualdad de varianza (test de Levene) se realizó la T de Student con la corrección de Welch. En caso de no cumplir el requisito de normalidad (prueba de Kolmogorov o Shapiro- Wilis en función de los tamaños de los subgrupos) se realizó la U-de Mann Whitney. En caso de detectarse diferencias significativas, se determinaron los intervalos de confianza para diferencias de medias al 95% que cuantifiquen dichas diferencias. • Comparación de variables numéricas entre más de dos grupos, una vez comprobados los supuestos de aleatoriedad, independencia de las observaciones, homocedasticidad y normalidad de las distribuciones, se realizó la prueba ANOVA (análisis de la varianza) o en su defecto la prueba de Kruskal-Walis. En caso de encontrarse diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes subgrupos comparados se efectuó pruebas de comparación “a posteriori” (prueba de Bonferroni o U de MannWihtney, según criterios de aplicación) con el nivel de significación corregido en función del número de comparaciones que se efectúen. 4.4 Análisis de regresión logística Para valorar la relación de una variable dependiente dicotómica y un conjunto de hipotéticas variables predictoras, se realizó un análisis de regresión logística multivariante. Dado el carácter cualitativo de alguna caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 130 / variable, para su inclusión como covariables, se procedió a la creación de variables dummy o variables de diseño. En primer lugar, se realizó un análisis univariante, seleccionando como variables significativamente relacionadas con la variable dependiente aquellas que alcanzaron un nivel de significación de 0,15. Con aquellas variables que resultaron significativas en el análisis univariante se realizó un modelo de regresión logística multivariante. Para las variables incluidas en el modelo resultante, se han calculado razones de ventaja (odds ratio) y sus respectivos intervalos de confianza al 95%. En todos los contrastes de hipótesis se ha considerado un nivel de significación α del 5% (p< 0,05) 4.5 Análisis de supervivencia Se efectuó un análisis de supervivencia mediante curvas de Kaplan Meier, prueba Log-Rank (Mantel-Cox), en el que se comparó la igualdad de las distribuciones del tiempo hasta que se desarrolla la enfermedad metastásica en función de las diferentes características tumorales como el tipo histológico o la presencia de diferentes mutaciones encontradas en el estudio. De igual modo, se realizó un análisis de supervivencia en el que se comparó la igualdad de las distribuciones del tiempo de supervivencia desde el momento de la detección de la enfermedad metastásica en función de las diferentes mutaciones estudiadas La regresión de Cox o riesgo proporcional se utilizó para crear modelos de tiempos hasta la aparición de metástasis, incluyendo hipotéticas variables predictoras (covariables) tanto categóricas como continuas. Se ha construido un modelo de regresión de Cox de riesgo proporcionales una vez validados los requisitos de aplicación. Para ello, inicialmente se realizó un análisis univariante previo que identificó las variables relacionadas con el tiempo hasta la aparición de metástasis con un nivel de significación de 0,15. Posteriormente, se efectuó un análisis multivariante para la selección del MATERIAL Y MÉTODOS / 131 modelo final, de forma que fuera posible valorar la relación entre el tiempo hasta la aparición de metástasis y cada variable, controlando por el resto de las variables incluidas en el modelo. Para las variables seleccionadas, se calcularon hazard ratio e intervalos de confianza al 95%, una vez validados los requisitos de aplicación. En caso de no verificarse dichos requisitos se realizó un modelo de Cox tiempo-dependiente. En todas las pruebas se consideró un nivel de significación de 0,05. RESULTADOS RESULTADOS / 135 1. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA Se han estudiado 69 pacientes de edades comprendidas entre 14 y 84 años (media de 58±2 años), siendo el 56,5% [IC95% (44,8;67,8)] hombres y el 43,5% [IC95% (32,2;55,2)] mujeres, diagnosticados e intervenidos por melanoma uveal. Durante el periodo de seguimiento que abarca el estudio el 39,1% [IC95% (28,3;50,9)] de los pacientes desarrollaron metástasis. Estas metástasis presentaron la siguiente distribución: exclusivamente hepáticas 63% [IC95% (44,2;79,1)]; pulmonares 3,7% [IC95% (0,4;16)]; hepáticas y pulmonares 7,4% [IC95% (1,6;21,7)]; hepáticas y otras localizaciones distintas a la pulmonar 11,1% [IC95% (3,20;26,8)]; hepáticas, pulmonares y otras localizaciones 11,1% [IC95% (3,20;26,8)] y pulmonar y otras 3,7% [IC95% (0,4;16)]. Estas otras localizaciones incluyen: huesos, músculo, peritoneo, bazo o mama. El 46,4% [IC95% (35;58,1)] de los pacientes fallecieron durante el seguimiento, siendo en un 85,7% la causa de la muerte la enfermedad metastásica. El tiempo medio de aparición de la enfermedad diseminada desde la fecha de la cirugía fue de 91,45±7,62 meses. La supervivencia desde la cirugía fue de 98,58±7,16 meses, sin embargo, la supervivencia desde el momento de detección de la enfermedad diseminada fue de 16,22±3,36 meses. Todos los pacientes fueron intervenidos de melanoma uveal histológicamente confirmado, todos ellos localizados en la coroides. La distribución de los tipos histológicos entre los casos seleccionados fue la siguiente: 21,7% [IC95% (13,3;32,5)] eran MU de células epitelioides, 40,6% [IC95% (29,6;52,4)] eran MU de células fusiformes y 37,7% [IC95% (26,9;49,4)] eran MU mixtos. El tamaño medio tumoral fue de 1,5±0,1 cm. El 34% [IC95% (37,7;60,9)] de los casos no presentaban infiltración local caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 136 / de ninguna estructura adyacente; el 29% [IC95% (19,3;40,4)] mostraban infiltración intraescleral y en el 21,7% [IC95% (13,3;32,5)] la infiltración era de estructuras extraesclerales, del nervio óptico y/o del cuerpo ciliar. El número de mitosis/CGA oscilaba entre 0 y 15 siendo el número medio 1,94± 0,29 mitosis/CGA. En cuanto a otras características histológicas: 73,5% [IC95% (62,2;82,9)] estaban pigmentados, 8,7% [IC95% (3,7;17)] tenían áreas de necrosis y en un 10,1% [IC95% (4,7;18,9)] existía infiltrado inflamatorio linfocitario significativo. La correlación entre las variables cuantitativas identificó correlación positiva entre el tamaño y el número de mitosis (r= 0,39; p= 0,01) y correlación negativa entre el tamaño y el tiempo hasta la aparición de metástasis (r = -0,31; p= 0,008) y el tamaño y la supervivencia (r = -0,28; p= 0,021). También se identificó correlación negativa entre la edad y la supervivencia desde el momento de detección de metástasis (r=-609; p=0,001). En las tablas 10 y 11 se recogen las principales características clínicas e histológicas estudiadas. RESULTADOS / 137 Tabla 10. Variables cuantitativas. Análisis descriptivo. n Min Max X (DE) IC95 Med. Percentil 25 Percentil 75 Edad (años) 69 14 84 58 (2) 55;62 59 48 70 Tamaño (cm) 69 0,5 3,2 1,5 (0,1) 1,3;1,6 1,4 1,2 1,7 Índice mitótico (mitosis/CGA) 69 0 15 1,94 (0,29) 1,37;2,51 1 1 3 Total de mutaciones (nº mutaciones/caso) 69 1 20 4,2 (0,4) 3,4;5,01 3 2 4 Tiempo hasta el desarrollo de metástasis (meses) 69 3 221 91,45 (7,62) 76,25;106,65 81 37 159 Supervivencia (meses) 69 9 221 98,58 (7,16) 84,29;112,87 90 51 159 Supervivencia desde desarrollo de metástasis (meses) 69 0 79 16,86 (3,512) 9,976;23,744 11 5 23 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 144 / Mixto Fusocelular Fusocelular Mixto Epitelioide Fusocelular Fusocelular Mixto Mixto Fusocelular Fusocelular Epitelioide Epitelioide Fusocelular Fusocelular Mixto Epitelioide Mixto Mixto Fusocelular Fusocelular Mixto Epitelioide Mixto Fusocelular Epitelioide Fusocelular Fusocelular Mixto Mixto Fusocelular Fusocelular Fusocelular Mixto Mixto Epitelioide Fusocelular Fusocelular Epitelioide Mixto Fusocelular Fusocelular Mixto Mixto Fusocelular Fusocelular Epitelioide Mixto Mixto Mixto Epitelioide Fusocelular Fusocelular Epitelioide Fusocelular Fusocelular Mixto Epitelioide Fusocelular Mixto Mixto Fusocelular Mixto Mixto Epitelioide Epitelioide Mixto Mixto Epitelioide Metastasis SI NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO SI SI NO NO SI NO NO SI SI NO NO NO NO NO SI SI SI SI NO NO NO SI SI SI SI SI NO NO SI NO NO SI NO NO NO SI NO NO SI NO NO SI SI NO NO SI NO SI SI NO NO NO SI NO SI NO SI NO Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5 Caso 6 Caso 7 Caso 8 Caso 9 Caso 10 Caso 11 Caso 12 Caso 13 Caso 14 Caso 15 Caso 16 Caso 17 Caso 18 Caso 19 Caso 20 Caso 21 Caso 22 Caso 23 Caso 24 Caso 25 Caso 26 Caso 27 Caso 28 Caso 29 Caso 30 Caso 31 Caso 32 Caso 33 Caso 34 Caso 35 Caso 36 Caso 37 Caso 38 Caso 39 Caso 40 Caso 41 Caso 42 Caso 43 Caso 44 Caso 45 Caso 46 Caso 47 Caso 48 Caso 49 Caso 50 Caso 51 Caso 52 Caso 53 Caso 54 Caso 55 Caso 56 Caso 57 Caso 58 Caso 59 Caso 60 Caso 61 Caso 62 Caso 63 Caso 64 Caso 65 Caso 66 Caso 67 Caso 68 Caso 69 Mut. Totales 363233333423313144611 522133617122111 315333433221336323324345 64524423522 GNAQ GNA11 SF3B1 BAP1 LRP1B FGFR4 CHEK2 EIF1AX ATM TSC2 FANCM PTPRD RAD51B TOP2A BRCA2 DICER1 MTOR DHX9 EPHA3 PDK1 WRN ATRX CHD2 DNMT1 IDO1 MSH2 TBX3 VHL Figura 11. Representación gráfica de las mutaciones encontradas en nuestra cohorte. RESULTADOS / 145 2. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA EN FUNCIÓN DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE METÁSTASIS Solamente se han encontrado diferencias entre las características clínicas e histopatológicas en dos criterios: tamaño y mitosis (tabla 14). Así, los casos del grupo metastásico tenían un mayor tamaño (p=0,013) y un mayor índice de mitosis (p=0,005). Tabla 14. Caracterización clínica y patológica en función de la presencia de metástasis. METÁSTASIS NO (n=42) SI (n=27) n (%) / X (DE) IC 95% n (%) / X (DE) IC 95% p Sexo Mujer 18 (42,9) 28,8;57,9 12 (44,4) 27,1;62,9 0,897 Hombre 24 (57,1) 42,1;71,2 15 (55,6) 37,1;72,9 Edad 57 (2,38) 52,38;62 59,85 (2,76) 54,19;66,52 0,475 Tamaño 1,35 (0,07) 1,2;1,5 1,67 (0,11) 1,45;1,88 0,013 Tipo histológico Fusocelular 21 (50) 50;35,3 7 (25,9) 12,4;44,3 0,136Mixto 13 (31) 31;18,6 20 (74,1) 55,7;87,6 Epitelioide 8 (19) 19;9,4 3 (0,62) 1,73;4,27 Índice mitótico 1,26 (0,19) 0,87;1,65 3 (0,62) 1,73;4,27 0,005 Infiltración local Ausente 24 (57,1) 42,1;71,2 10 (37) 20,9;55,8 0,129 Intraescleral 12 (28,6) 16,7;43,3 8 (29,6) 15,1;48,2 Extraescleral o cuerpo ciliar 6 (14,3) 6,2;27,1 9 (33,3) 17,9;52,1 Pigmentación del tumor No 10 (24,4) 13,3;39 8 (29,6) 15,1;48,2 0,632 Si 31 (75,6) 61;86,7 19 (70,4) 51,8;84,9 Necrosis tumoral No 40 (95,2) 85,6;99 23 (85,2) 68,5;94,8 0,201 Si 2 (4,8) 1;14,4 4 (14,8) 5,2;31,5 Infiltrado linfoide No 37 (88,1) 75,9;95,3 25 (92,6) 78,3;98,4 0,697 Si 5 (11,9) 4,7;24,1 2 (7,4) 1,6;21,7 Total de mutaciones 3,5 (0,29) 2,91;4,09 5,3 (0,89) 3,46;7,13 0,153 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 146 / Entre las mutaciones estudiadas hemos encontrado una significativa mayor presencia de mutaciones de BAP1 (p=0,001) en el grupo de casos metastásicos. EIF1AX se encontró mutado con más frecuencia (p=0,026) en el grupo de casos que no desarrollaron metástasis. Las diferencias en las mutaciones de DHX9 y PDK1 presentaban valores próximos a la significación estadística (p=0,0056) (tabla 15). Tabla 15. Caracterización de las variantes genéticas en función de la presencia de metástasis. METÁSTASIS NO (n=42) SI (n=27) n (%) IC 95% n (%) IC 95% p GNAQ No mutado 21 (50) 35,3;64,7 11 (40,7) 23,9;59,4 0,452 Mutado 21 (50) 35,3;64,7 16 (59,3) 40,6;76,1 GNA11 No mutado 22 (52,4) 37,5;66,9 16 (59,3) 40,6;76,1 0,575 Mutado 20 (47,6) 33,1;62,5 11 (40,7) 23,9;59,4 SF3B1 No mutado 30 (71,4) 56,7;83,3 21 (77,8) 59,8;90,2 0,558 Mutado 12 (28,6) 16,7;43,3 6 (22,2) 9,8;40,2 BAP1 No mutado 38 (90,5) 78,9;96,7 15 (55,6) 37,1;72,9 0,001 Mutado 4 (9,5) 3,3;21,1 12 (44,4) 27,1;62,9 LRP1B No mutado 35 (83,3) 70;92,2 19 (70,4) 51,8;84,9 0,203 Mutado 7 (16,7) 7,8;30 8 (29,6) 15,1;48,2 FGFR4 No mutado 32 (76,2) 61,9;87,1 23 (85,2) 68,5;94,8 0,365 Mutado 10 (23,8) 12,9;38,1 4 (14,8) 5,2;31,5 CHEK2 No mutado 37 (88,1) 75,9;95,3 19 (70,4) 51,8;84,9 0,066 Mutado 5 (11,9) 4,7;24,1 8 (29,6) 15,1;48,2 EIF1AX No mutado 32 (76,2) 61,9;87,1 26 (96,3) 84;99,6 0,026 Mutado 10 (23,8) 12,9;38,1 1 (3,7) 0,4;16 ATM No mutado 36 (85,7) 72,9;93,8 24 (88,9) 73,2;96,8 0,702 Mutado 6 (14,3) 6,2;27,1 3 (11,1) 3,2;26,8 TSC2 No mutado 38 (90,5) 78,9;96,7 22 (81,5) 64,1;92,6 0,299 Mutado 4 (9,5) 3,3;21,1 5 (18,5) 7,4;35,9 FANCM No mutado 40 (95,2) 85,6;99 24 (88,9) 73,2;96,8 0,373 Mutado 2 (4,8) 1;14,4 3 (11,1) 3,2;26,8 RESULTADOS / 147 METÁSTASIS NO (n=42) SI (n=27) n (%) IC 95% n (%) IC 95% p PTPRD No mutado 38 (90,5) 78,9;96,7 26 (96,3) 84;99,6 0,641 Mutado 4 (9,5) 3,3;21,1 1 (3,7) 0,4;16 RAD51B No mutado 37 (88,1) 75,9;95,3 27 (100) 0,148 Mutado 5 (11,9) 4,7;24,1 0 (0) TOP2A No mutado 39 (92,9) 82,1;97,9 25 (92,6) 78,3;98,4 1 Mutado 3 (7,1) 2,1;17,9 2 (7,4) 1,6;21,7 BRCA2 No mutado 40 (95,2) 85,6;99 25 (92,6) 78,3;98,4 0,641 Mutado 2 (4,8) 1;14,4 2 (7,4) 1,6;21,7 DICER1 No mutado 41 (97,6) 89,4;99,7 24 (88,9) 73,2;96,8 0,292 Mutado 1 (2,4) 0,3;10,6 3 (11,1) 3,2;26,8 MTOR No mutado 41 (97,6) 89,4;99,7 24 (88,9) 73,2;96,8 0,292 Mutado 1 (2,4) 0,3;10,6 3 (11,1) 3,2;26,8 DHX9 No mutado 42 (100) 24 (88,9) 73,2;96,8 0,056* Mutado 0 (0) 3 (11,1) 3,2;26,8 EPHA3 No mutado 40 (95,2) 85,6;99 26 (96,3) 84;99,6 0,663 Mutado 2 (4,8) 1;14,4 1 (3,7) 0,4;16 PDK1 No mutado 42 (100) 24 (88,9) 73,2;96,8 0,056* Mutado 0 (0) 3 (11,1) 3,2;26,8 WRN No mutado 40 (95,2) 85,6;99 26 (96,3) 84;99,6 0,663 Mutado 2 (4,8) 1;14,4 1 (3,7) 0,4;16 ATRX No mutado 41 (97,6) 89,4;99,7 26 (96,3) 84;99,6 0,663 Mutado 1 (2,4) 0,3;10,6 1 (3,7) 0,4;16 CHD2 No mutado 42 (100) 25 (92,6) 78,3;98,4 0,15 Mutado 0 (0) 2 (7,4) 1,6;21,7 DNMT1 No mutado 40 (95,2) 85,6;99 27 (100) 0,367 Mutado 2 (4,8) 1;14,4 0 (0) IDO1 No mutado 42 (100) 25 (92,6) 78,3;98,4 0,15 Mutado 0 (0) 2 (7,4) 1,6;21,7 MSH2 No mutado 41 (97,6) 89,4;99,7 26 (96,3) 84;99,6 1 Mutado 1 (2,4) 0,3;10,6 1 (3,7) 0,4;16 TBX3 No mutado 41 (97,6) 89,4;99,7 26 (96,3) 84;99,6 1 Mutado 1 (2,4) 0,3;10,6 1 (3,7) 0,4;16 VHL No mutado 42 (100) 25;92,6 0,15 Mutado 0 (0) 2;7,4 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 148 / 3. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA EN FUNCIÓN DEL SUBTIPO HISTOLÓGICO Para este análisis estadístico hemos incluido los subtipos que contenían un mayor número de células epitelioides (melanoma de células epitelioides y melanoma de células mixtas) en una misma categoría, dado el tamaño reducido de la muestra de nuestra cohorte. Entre las características clínicas e histológicas, hemos encontrado una mayor presencia de metástasis en los tumores ricos en células epitelioides (p=0,047). No se han encontrado otras diferencias estadísticamente significativas entre las características estudiadas (tabla 16). Tabla 16. Caracterización clínica y patológica en función del subtipo histológico. SUBTIPO HISTÓGICO FUSIFORME (n=28) EPITELIOIDE O MIXTO (n= 41) n (%) IC 95% n (%) IC 95% p Sexo Mujer 14 (50) 32,2;67,8 16 (39) 25,3;54,3 0,366 Hombre 14 (50) 32,2;67,8 25 (61) 45,7;74,7 Edad 57 (3) 51;63 59 (2) 54;64 0,635 Metástasis Ausentes 21 (75) 57,1;88,1 21 (51,2) 36,3;66 0,047 Presentes 7 (25) 11,9;42,9 20 (48,8) 34;63,7 Tamaño 1,4 (0,1) 1,2;1,6 1,5 (0,1) 1,3;1,7 0,44 Índice mitótico 2 (0) 1;2 2 (0) 1;3 0,388 Infiltración local Ausente 16 (57,1) 38,9;74 18 (43,9) 29,6;59,1 0,184 Intraescleral 9 (32,1) 17,2;50,5 11 (26,8) 15,2;41,6 Extraescleral o cuerpo ciliar 3 (10,7) 3,1;25,9 12 (29,3) 17,1;44,2 RESULTADOS / 149 SUBTIPO HISTÓGICO FUSIFORME (n=28) EPITELIOIDE O MIXTO (n= 41) n (%) IC 95% n (%) IC 95% p Pigmentación del tumor No 7 (25) 11,9;42,9 11 (27,5) 15,6;42,5 0,818 Si 21 (75) 57,1;88,1 29 (72,5) 57,5;84,4 Necrosis tumoral No 26 (92,9) 79;98,5 37 (90,2) 78,5;96,6 0,705 Si 2 (7,1) 1,5;21 4 (9,8) 3,4;21,5 Infiltrado linfoide No 25 (89,3) 74,1;96,9 37 (90,2) 78,5;96,6 0,897 Si 3 (10,7) 3,1;25,9 4 (9,8) 3,4;21,5 Total de mutaciones 4 (1) 3;6 4 (1) 3;5 0,69 En cuanto a las mutaciones detectadas, encontramos que mutaciones en BAP1 y LRP1B se asociaron con una mayor probabilidad de una histología con mayor presencia de células epitelioides (subtipos mixtos o epitelioides) (p=0,01 y p=0,015), mientras que la mutación en SF3B1 se asoció significativamente con una morfología de células fusiformes (p=0,01) (tabla 17). caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 150 / Tabla 17. Caracterización de las variantes genéticas patológicas en función del subtipo histológico. SUBTIPO HISTÓGICO FUSIFORME (n=28) EPITELIOIDE O MIXTO (n= 41) n (%) / X (DE) IC 95% n (%) / X (DE) IC 95% p GNAQ No mutado 11 (39,3) 39,3;23 21 (51,2) 36,3;66 0.329 Mutado 17 (60,7) 60,7;42,3 20 (48,8) 34;63,7 GNA11 No mutado 17 (60,7) 60,7;42,3 21 (51,2) 36,3;66 0.436 Mutado 11 (39,3) 39,3;23 20 (48,8) 34;63,7 SF3B1 No mutado 15 (53,6) 53,6;35,5 36 (87,8) 75,3;95,2 0.01 Mutado 13 (46,4) 46,4;29,1 5 (12,2) 4,8;24,7 BAP1 No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 26 (63,4) 48,2;76,8 0.01 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 15 (36,6) 23,2;51,8 LRP1B No mutado 26 (92,9) 92,9;79 28 (68,3) 53,2;80,9 0.015 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 13 (31,7) 19,1;46,8 FGFR4 No mutado 24 (85,7) 85,7;69,5 31 (75,6) 61;86,7 0.305 Mutado 4 (14,3) 14,3;5 10 (24,4) 13,3;39 CHEK2 No mutado 24 (85,7) 85,7;69,5 32 (78) 63,8;88,5 0.424 Mutado 4 (14,3) 14,3;5 9 (22) 11,5;36,2 EIF1AX No mutado 25 (89,3) 89,3;74,1 33 (80,5) 66,5;90,3 0.505 Mutado 3 (10,7) 10,7;3,1 8 (19,5) 9,7;33,5 ATM No mutado 24 (85,7) 85,7;69,5 36 (87,8) 75,3;95,2 1 Mutado 4 (14,3) 14,3;5 5 (12,2) 4,8;24,7 TSC2 No mutado 24 (85,7) 85,7;69,5 36 (87,8) 75,3;95,2 1 Mutado 4 (14,3) 14,3;5 5 (12,2) 4,8;24,7 FANCM No mutado 26 (92,9) 92,9;79 38 (92,7) 81,7;97,9 1 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 3 (7,3) 2,1;18,3 PTPRD No mutado 24 (85,7) 85,7;69,5 40 (97,6) 89,2;99,7 0.150 Mutado 4 (14,3) 14,3;5 1 (2,4) 0,3;10,8 RAD51B No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 37 (90,2) 78,5;96,6 0.641 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 4 (9,8) 3,4;21,5 TOP2A No mutado 26 (92,9) 92,9;79 38 (92,7) 81,7;97,9 1 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 3 (7,3) 2,1;18,3 RESULTADOS / 151 SUBTIPO HISTÓGICO FUSIFORME (n=28) EPITELIOIDE O MIXTO (n= 41) n (%) / X (DE) IC 95% n (%) / X (DE) IC 95% p BRCA2 No mutado 25 (89,3) 89,3;74,1 40 (97,6) 89,2;99,7 1 Mutado 3 (10,7) 10,7;3,1 1 (2,4) 0,3;10,8 DICER1 No mutado 26 (92,9) 92,9;79 39 (95,1) 85,3;99 1 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 2 (4,9) 1;14,7 MTOR No mutado 26 (92,9) 92,9;79 39 (95,1) 85,3;99 1 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 2 (4,9) 1;14,7 DHX9 No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 39 (95,1) 85,3;99 1 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 2 (4,9) 1;14,7 EPHA3 No mutado 25 (89,3) 89,3;74,1 41 (100) 0.595 Mutado 3 (10,7) 10,7;3,1 0 (0) PDK1 No mutado 28 (100) 38 (92,7) 81,7;97,9 0.232 Mutado 0 (0) 3 (7,3) 2,1;18,3 WRN No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 39 (95,1) 85,3;99 1 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 2 (4,9) 1;14,7 ATRX No mutado 26 (92,9) 92,9;79 41 (100) 0.218 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 0 (0) CHD2 No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 40 (97,6) 89,2;99,7 1 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 1 (2,4) 0,3;10,8 DNMT1 No mutado 26 (92,9) 92,9;79 41 (100) 0.218 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 0 (0) IDO1 No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 40 (97,6) 89,2;99,7 1 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 1 (2,4) 0,3;10,8 MSH2 No mutado 26 (92,9) 92,9;79 41 (100) 0.218 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 0 (0) TBX3 No mutado 26 (92,9) 92,9;79 41 (100) 0.218 Mutado 2 (7,1) 7,1;1,5 0 (0) VHL No mutado 27 (96,4) 96,4;84,5 40 (97,6) 89,2;99,7 1 Mutado 1 (3,6) 3,6;0,4 1 (2,4) 0,3;10,8 caracterización histológica y molecular de una serie de casos de melanoma uveal primario, con relación clínica y pronóstica 152 / 4. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA HASTA EL DESARROLLO DE METÁSTASIS En el análisis de supervivencia univariado realizado mediante curvas de Kaplan-Meier, se estudiaron las diferencias en la distribución de la incidencia acumulada hasta el desarrollo de metástasis en función de las distintas mutaciones genéticas encontradas. Se han detectado diferencias en el tiempo hasta el desarrollo de metástasis en los casos que presentaban mutación de los genes BAP1 [test de log Rank 24,08, (p, <0,001); figura 12]; CHEK2 [test de log Rank 4,61, (p, 0,032); figura 13]; DICER1 [test de log Rank 4,54, (p, 0,0323; figura14]; DHX9 [test de log Rank 7,47, (p, 0,006); figura15]; PDK1 [test de log Rank 7,16, (p, 0,007); figura16] e IDO1 [test de log Rank 5,54, (p, 0,019); figura17] frente a los casos que no la presentaba. Además, se han demostrado diferencias en el tiempo hasta el desarrollo de metástasis en los casos con mutación de EIF1AX que se encuentran próximas a la significación estadística [test de log Rank 3,77, (p, 0,052); figura 18]. RESULTADOS / 153 Figura 12. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de BAP1. Figura 13. Curva Kaplan Meier de supervivencia para metástasis en función de la mutación de CHEK2.