Estudio de la viabilidad de los xenoinjertos de adenocarcinomas y tumores periampulares de páncreas

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TESIS DOCTORAL ANÁLISIS DE LA VIABILIDAD DE LOS XENOINJERTOS DE ADENOCARCINOMAS Y TUMORES PERIAMPULARES DE PÁNCREAS MERCEDES RUBIO-MANZANARES DORADO SEVILLA, 2017 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Dedicada a mi padre Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Agradecimientos AGRADECIMIENTOS Es para mí un privilegio el presentarles esta tesis doctoral que tras tanto esfuerzo ve la luz. No sería fiel a la realidad si me atribuyera todo el mérito de este trabajo. Tras el mismo han colaborado en su realización múltiples profesionales sin los cuales, este trabajo no sería posible. En primer lugar, quiero agradecer a mis directores toda la ayuda brindada. Gracias al Dr. Jordi Muntané Relat por supervisarme y poner a mi disposición todos los recursos del IBiS. Al Dr. Francisco Javier Padillo Ruíz artífice de esta investigación. Gracias por creer en mí y darme la oportunidad de embarcarme en este proyecto apasionante. Mi especial agradecimiento al Dr. Luis Miguel Marín Gómez siempre presente cuando más lo he necesitado. Sin él no hubiera alcanzado la meta. También quiero agradecer la infinita paciencia del Dr. Ángel de la Rosa (antiguo investigador del servicio de del IBiS) al enseñarme a procesar las muestras de inmunohistoquímica y a interpretarlas, así como a la Dr. Sheila Pereira por colaborar conmigo en el procesado de las muestras inmunohistoquímicas y al ofrecerme su ayuda. A Juan Manuel Praena Fernández (Servicio de apoyo estadístico y Metodológico del HUVR) por supervisar la estadística. No quiero olvidar la imprescindible ayuda prestada por el Servicio de Anatomía Patológica dirigido por el Dr. Juan José Borrego, y a los dos anatomopatólogos encargados de revisar las muestras obtenidas (Francisco Farfán López y José Ramírez Santos). Y por su puesto a mi compañero de fatigas el Dr. Daniel Aparicio Sánchez que codo con codo con el Dr. Marín y conmigo ha implantado, sacrificado y realizado el seguimiento de los ratones desnudos. Finalmente, agradecer a Alejandro Moral Laguna la edición y supervisión de la maquetación y a Alejandra Moral Rubio-Manzanares por todo el tiempo robado. “Donde quiera que el arte de la medicina es amado, tambien hay un amor por la humanidad” Hipócrates Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Índice y abreviaturas ÍNDICE I. RESUMEN 1 II. INTRODUCCIÓN 11 1. EPIDEMILOGÍA, FACTORES DE RIESGO Y MORTALIDAD 12 1.1. Epidemiología 12 1.2. Factores de riesgo 13 1.2.1. Tabaquismo 13 1.2.2. Aminas aromáticas 14 1.2.3. Dieta 14 1.2.4. Lesiones premalignas y pancreatitis crónicas 14 1.2.5. Diabetes 15 1.2.6. Lugar de nacimiento 15 1.2.7. Genética 15 1.2.8. Síndromes hereditarios 16 1.3. Mortalidad 17 2. HISTOLOGÍA, PATRONES DE DISEMINACIÓN Y MARCADORES TUMORALES 19 2.1. Histología del cáncer de páncreas 19 2.2. Histología de los tumores periampulares 22 2.3. Patrones de diseminación 22 2.4. Marcadores tumorales 24 3. BIOLOGÍA MOLECULAR: GENES, ONCOGENES, FACTORES DE CRECIMIENTO Y SUS RECEPTORES. 26 3.1. Oncogenes 27 3.2. Genes supresores 27 3.3. Genes mantenedores del genoma 29 3.4. Otros genes favorecedores de tumorogénesis 29 3.5. Factores de crecimiento y sus receptores 30 4. LA IMPORTANCIA DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES 32 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Índice y abreviaturas 5. TIPOS DE MODELOS ANIMALES 35 5.1. Tumores inducidos con sustancias carcinógenas 35 5.2. Ratones genéticamente modificados: GEMM 37 5.3. Injertos tumorales 38 5.3.1. Aloinjertos 38 5.3.2. Xenoinjertos 38 5.3.2.1. Dependiendo del lugar de implante 39 5.3.2.1.1. Xenoinjertos heterotópicos 39 5.3.2.1.2. Xenoinjertos ortotópicos 40 5.3.2.2. Dependiendo del origen de las células implantadas 41 5.3.2.2.1. Implante de tumores cultivados in vitro 41 5.3.2.2.2. Implantes de tumores primarios humanos 41 6. ÉTICA Y MODELOS ANIMALES. 43 III. JUSTIFICACIÓN 44 IV. HIPÓTESIS 46 V. OBJETIVOS 48 VI. MATERIAL Y MÉTODOS 50 1. TIPO DE ESTUDIO 51 2. PACIENTES 51 3. ANIMAL DE EXPERIMENTACIÓN 54 3.1. Origen 54 3.2. Taxonomia y características 55 4. IMPLANTES DEL XENOINJERTO 57 4.1. Pase 0 59 4.2. Pase 1 60 4.3. Pase 2 60 4.4. Técnica quirúrgica y anestésica 61 4.4.1. Lista de materiales empleados 61 4.4.2. Anestesia 61 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Índice y abreviaturas 4.4.3. Técnica quirúrgica 62 4.5. Seguimiento y sacrificio 64 5. VARIABLES DEL ESTUDIO 66 6. PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LAS MUESTRAS 67 6.1. Preservación del tejido tumoral 67 6.2. Preparación del tejido estudiado 68 6.3. Tinción con hematoxilina-eosina 69 6.4. Tinción con tricrómico de masson 69 6.5. Valoración histológica de las muestras 70 6.6. Inmuhistoquímica 71 6.7. Valoración inmunohistoquímica de las muestras 74 6.7.1. Ki67 78 6.7.2. -SMA 79 6.7.3. CD31 80 6.7.4. TUNEL 80 7. SOPORTE BIBLIOGRÁFICO 81 8. TRATAMIENTO INFORMÁTICO 82 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS 82 10. ETICA Y LEGISLACIÓN 84 VII. RESULTADOS 85 1. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LOS IMPLANTES EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES 86 1.1. Resultados globales del implante del xenoinejrto 86 1.2. Mortalidad 92 1.2.1. Análisis de la Mortalidad por pases 92 1.3. Tiempo libre de enfermedad 94 1.3.1. Tiempo libre de enfermedad en los Pases 94 1.4. Impacto del porcentaje de ganancia de peso en el murino 96 1.5. Factores relacionados con el desarrollo tumoral 97 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Índice y abreviaturas 1.5.1. Impacto de las características clínicas y epidemiológicas del humano en el desarrollo tumoral 97 1.5.2. Impacto de la anatomía patológica y de la inmunohistoquímica de las muestras humanas en el desarrollo tumoral. 99 1.6. Resultados según el modelo experimental 100 1.6.1. Resultados en el modelo subcutáneo 100 1.6.2. Resultados en el modelo intraabdominal 101 1.6.3. Resultados en el modelo pancreático 102 1.7. Análisis comparativo del desarrollo tumoral en los modelos experimentales 103 1.7.1. Análisis comparativo del desarrollo tumoral por pase y modelo 103 1.7.2. Mortalidad por modelo animal 105 1.7.3. Morbilidad 107 1.7.4. Tiempo libre de enfermedad en los modelos animales 111 1.7.5. Evolución del peso 112 2. EVALUACIÓN HISTOLÓGICA DE LOS IMPLANTES EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES Y EN LOS PASES. 114 2.1. Hematoxilina & eosina: grado de diferenciación 114 2.1.1. Grado de diferenciación a lo largo de los modelos 114 2.1.2. Grado de diferenciación a lo largo de los pases 115 2.1.2.1.Análisis de la diferenciación de los modelos a lo largo de los pases 116 2.2. Número de mitosis por campo 118 2.2.1. Número de mitosis y los modelos animales 118 2.2.2. Número de mitosis a lo largo de los pases 119 2.3. Tricrómico de masson: grado de fibrosis 120 2.3.1. Masson a lo largo de los modelos 120 2.3.2. Masson a lo largo de los pases 121 2.3.2.1. Análisis del grado de fibrosis de los modelos a lo largo de los pases 122 3. EVALUACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LOS IMPLANTES EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES Y EN LOS PASES 125 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado Índice y abreviaturas 3.1. KI67: Proliferación celular 125 3.1.1. Ki67 y modelos animales 125 3.1.2. Ki67 a lo largo de los pases 126 3.2. ALFASMA: Fibrogénesis 127 3.2.1. AlfaSMA y los modelos animales 127 3.2.2. AlfaSMA a lo largo de los pases 128 3.2.2.1.Análisis de la fibrogénesis de los modelos a lo largo de los pases 130 3.3. CD31: Angiogénesis 132 3.3.1. CD31 y los modelos animales 132 3.3.2. CD31 a lo largo de los pases 134 3.3.2.1. Análisis de la angiogénesis de los modelos a lo largo de los pases 135 3.4. TUNEL: Apoptósis 137 3.4.1. TUNEL y los modelos animales. 137 3.4.2. TUNEL a lo largo de los pases 139 3.4.2.1.Análisis de la apoptosis en los modelos experimentales a lo largo de los pases 140 VIII. DISCUSIÓN 143 1. MOTIVO POR EL QUE REALIZAMOS ESTE TRABAJO 145 2. DISCUSIÓN SOBRE EL MODELO ANIMAL UTILIZADO: EL ROEDOR. 145 3. DISCUSIÓN SOBRE LA METODOLOGÍA EMPLEADA 147 3.1. Elección del murino: ratón hsd athymic nude-foxn1nu 147 3.2. Elección del modelo experimental: xenoinjertos 148 3.3. Elección de la vía de implante: subcutanea, intraabdominal y pancreática 149 4. DISCUSIÓN SOBRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 151 4.1. Desarrollo de los xenoinjertos 152 4.1.1. Desarrollo tumoral a lo largo de los pases 153 4.1.2. Desarrollo tumoral en los modelos experimentales 153 4.2. Tiempo libre de enfermedad 154 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 1 I. RESUMEN Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 2 INTRODUCCIÓN Debido al mal pronóstico de los tumores del área periampular y especialmente de adenocarcinoma de páncreas (ADCP), resulta fundamental la búsqueda de biomarcadores para su detección precoz y de moléculas que permitan el desarrollo urgente de nuevas estrategias terapéuticas. Para ello, los modelos animales han demostrado ser muy útiles en la evolución de los avances en el cáncer de páncreas. Han contribuido al estudio de nuevos quimioterápicos que posteriormente han sido trasladados a ensayos clínicos con humanos que han demostrado un aumento en la supervivencia. El desarrollo de los quimioterápicos y otras moléculas antitumorales se encuentra íntimamente relacionado con los modelos experimentales. Durante los últimos 50 años, los xenoinjertos subcutáneos derivados de líneas celulares cultivadas in vitro han sido ampliamente utilizados. Multitud de quimioterápicos han sido testados utilizando estos modelos. Sin embargo, fármacos que funcionan bien en el ratón no son necesariamente efectivos en el ser humano. Desde los años 70, se han utilizado muestras de cánceres humanos tomados mediante biopsia o mediante cirugía que posteriormente han sido implantados directamente en ratones. Estos xenoinjertos, también conocidos como “tumorgraft” mantienen la morfología tumoral inicial, así como las mutaciones genéticas que le acompañan. Sin embargo, estos modelos fueron inicialmente desechados debido a su alto índice de rechazos. Recientemente, se ha retomado esta línea de investigación gracias al desarrollo de nuevas cepas de ratones inmunodeprimidos modificadas genéticamente que han minimizado las tasas rechazo. De esta manera, ha sido posible que este modelo sea competitivo a la hora de analizar la eficacia de las distintas drogas para el estudio de ADCP. Siguiendo esta línea de trabajo hemos desarrollados tres modelos experimentales mediante el uso de xenoinjertos: subcutáneo, intraabdominal y pancreático. El objetivo principal de este estudio es valorar la viabilidad de los xenoinjertos ortotópicos (intrapancreático) y heterotópicos (intraabdominal y subcutáneo) de cánceres de páncreas humanos implantados en ratones desnudos. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 3 MATERIAL Y MÉTODOS Estudio prospectivo analítico experimental con muestras humanas obtenidas quirúrgicamente de pacientes con diagnóstico de ADCP o tumores periampulares que se implantaron como xenoinjertos en tres modelos experimentales. Pacientes Se incluyeron pacientes diagnosticados de carcinoma periampular o ADCP que fueron sometidos a una laparotomía exploradora desde el 17 de mayo de 2012 hasta 13 de febrero de 2014 en el Hospital Universitario “Virgen del Rocío” (Sevilla). Se han excluido del estudio los pacientes menores de edad, neoplasias no identificadas como ADCP o carcinomas periampulares, y no dar su consentimiento por escrito para la utilización de la muestra. Se obtuvieron 11 muestras tumorales en fresco de un total de 10 pacientes. Éstas fueron extraídas de la pieza quirúrgica por un anatomopatólogo inmediatamente después de su exéresis. La mayoría de las muestras se obtuvieron mediante duodenopancreatectomía cefálica (n=8). Dos muestras fueron obtenidas de un mismo paciente (Humano 4) que correspondieron a una metástasis ganglionar interaortocava y una muestra extraída del tumor pancreático. El diagnóstico anatomopatológico más frecuente fue ADCP (n=8). También se registraron dos adenocarcinomas ampulares. Animales de Experimentación Se han utilizado animales de experimentación de la cepa Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu. Esta cepa es un tipo de ratón atímico e inmunodeprimido que permite el crecimiento de los injertos sin rechazo inmunitario. La muestra obtenida de cada paciente (Hx), se dividió en cinco porciones de 3x3x3 mm. De éstas, tres fueron destinadas a los xenoinjertos implantadas a nivel subcutáneo, pancreático e intraperitoneal, y las otras dos restantes se destinaron para estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 4 El implante del tumor humano al ratón o del ratón a un nuevo murino se llama “Pase”. En nuestro estudio hemos realizado tres pases: Pase 0, Pase 1, Pase 2. Variable principal del estudio: - Desarrollo tumoral (%): Evidencia durante la vida del ratón o en la autopsia de un crecimiento tumoral mayor de 1-1,5 cm o presencia de metástasis. Variables secundarias: ❖ Determinadas en los animales de experimentación - Tiempo libre de enfermedad (semanas): Tiempo desde el implante del tumor hasta el desarrollo tumoral o hasta la evidencia de ausencia de tumor en la autopsia. - Mortalidad (%): Ratones fallecidos de manera espontánea sin intervención de los investigadores. - Mortalidad postoperatoria (%): Muerte durante las primeras 24 horas tras la cirugía o en los días consecutivos como consecuencia de un fallo directo de la técnica quirúrgica. - Morbilidad (%): Aparición de complicaciones derivadas de la cirugía. - Peso (gr): Peso en gramos de los ratones implantados. ❖ Histología e inmunohistoquímica de las muestras - Grado de diferenciación (%): Determinado con las muestras de hematoxilina-Eosina mediante la observación de la morfología de las glándulas, núcleos celulares tumorales y el número de mitosis. Se dividen en bien diferenciados (G1), moderadamente diferenciados (G2), poco diferenciados (G3). - Grado de fibrosis (%): Espesor del estroma tumoral determinado mediante la tinción de Tricrómico de Masson, correspondiendo 1 a la mínima fibrosis alrededor de las glándulas tumorales y 4, al grado máximo de fibrosis entre las glándulas tumorales. - Grado de proliferación celular (%): Determinado mediante el número de mitosis y la expresión de Ki67 en los ribosomas de los núcleos celulares, clasificada como baja/alta en función del punto de corte 2,97%. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 5 - Fibrogénesis (%): Expresión de alfaSMA en fibroblastos y mioblasto. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 1,84%. - Angiogénesis (%): Expresión de CD31 en las células endoteliales del tumor. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 0,2%. - Apoptosis (%): Expresión de TUNEL en las células con ADN fragmentado o degradado. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 27,11%. Análisis estadístico Se ha empleado el test de ji-cuadrado (2) o el test exacto de 2 cuadrado/Test exacto de Fisher para la valoración del desarrollo tumoral, la anatomía patológica y la inmunohistoquímica mediante el programa SPSS® versión 21.0. Una p<0,05 ha sido considerada significativa. Para el análisis postHoc se ha aplicado la corrección de Bonferroni. Para el análisis del tiempo libre de enfermedad se ha utilizado la prueba de Kaplan-Meir. RESULTADOS Hemos observado que 58 de los 95 xenoinjertos se han desarrollado a lo largo de los tres pases. Lo que supone una tasa de desarrollo tumoral global del 61,1 %. Analizamos el desarrollo de los xenoinjertos a lo largo del pase 0, pase 1 y pase 2. El desarrollo en el pase 0 (desde el humano al ratón) fue significativamente menor (p<0,05) que en los pases consecutivos en los que se realizó el reimplante desde ratón a ratón (pase 1 y pase 2). A pesar de que no existe significación estadística para el desarrollo de un modelo a lo largo de los distintos pases, existe una mayor tendencia en el desarrollo del xenoinjerto tumoral en el modelo subcutáneo. Tiempo libre de enfermedad Cuando analizamos el tiempo libre de tumor en los tres modelos (subcutáneo, intraabdominal y páncreas) observamos que el tiempo de libre de tumor es menor en el Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 6 modelo subcutáneo. Aunque no existe diferencias estadísticamente significativas, la “p” se encuentra muy próxima a 0,05 (p =0,063). Cuando analizamos el tiempo libre de enfermedad en los 3 pases se observa un menor tiempo libre de tumor en el pase 1 y en el pase 2 respecto al pase 0. Se observa un desarrollo tumoral más rápido y mayor número de casos en los pases entre ratón-ratón, respecto al pase entre humano-ratón con una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,000004). Mortalidad La mortalidad global en la serie de los 95 ratones a los que se les implantó un xenoinjerto ha sido del 13,6% (13/95). La mortalidad postoperatoria ha sido del 4,2% (4/95). Analizamos la mortalidad por pases y observamos que, aunque no existen diferencias significativas la “p” se encuentra muy cercana a 0,05 (p=0,069). Hemos apreciado una mortalidad global para los modelos subcutáneos del 3,16% (3/95), del 5,26% en modelos intraabdominales (5/95) y del 5,26% en los xenoinjertos pancreáticos (5/95). No hemos apreciado diferencias estadísticamente significativas en favor de ningún modelo. Evolución del peso Tras aplicar la prueba no paramétrica del test de Friedman, observamos que existe un aumento progresivo del peso en los tres modelos siendo en todos los modelos un aumento estadísticamente significativo. Analizamos el % de ganancia de peso de los ratones a las 10 semanas y se correlacionó con el desarrollo del tumor. En la semana 10 los ratones que desarrollan tumor presentaron una ganancia media de peso del 20,38 ±3,51 % (IC al 95%=13,2-27,56) respecto a los ratones que no desarrollan tumor que presentaron una ganancia media de peso del 11,51±2,38 % (IC al 95%=6,63-11,51). Observamos una mayor ganancia de peso a favor de los ratones con desarrollo de tumor existiendo una diferencia estadísticamente significativa (p=0,021). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 7 Análisis anatomopatológico Hematoxilina y Eosina Se ha analizado el grado de diferenciación de los tumores mediante la tinción de hematoxilina y eosina en los tres modelos. Tras aplicar el Test exacto de χ2 no hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas entre el grado de diferenciación de las muestras humanas y los modelos experimentales (p=0,20). Tampoco apreciamos diferencias estadísticamente significativas en el grado de diferenciación a lo largo de los pases (p=0,25). Tricómico de Masson Apreciamos que las muestras humanas presentan una fibrosis más elevada que las muestras de los roedores. El 36,3% de las muestras humanas presentaban una fibrosis muy elevada. Tras aplicar el test exacto de χ2 hemos observado diferencias estadísticamente significación entre el grado de fibrosis de las muestras humanas y los modelos experimentales (p=0,044). Cuando se analiza de forma individual cada uno de los modelos desarrollados no se aprecian diferencias estadísticamente significativas, aunque el modelo intraabdominal parece tender hacia un menor grado de fibrosis. Finalmente, tras comparar las muestras a lo largo de los pases, no apreciamos diferencias estadísticamente significativas en el grado de fibrosis (p=0,26). Observamos que la mayoría de las muestras presentan un grado de fibrosis leve o moderada y que este se mantiene a lo largo de los pases. Se aprecia una disminución a lo largo de los pases de las muestras con una fibrosis muy elevada. Inmunohistoquímica Expresión de Ki67 No hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas en la expresión de Ki67 (p=0,59) a lo largo de los pases. Tampoco hemos apreciado diferencias en el grado de expresión de Ki67 celular en ninguno de los 3 modelos. No existen diferencias estadísticamente significativas (p=0,65). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 8 Expresión de α-SMA A medida que avanzan los pases se aprecia un descenso significativo de la fibrogénesis Las diferencias encontradas son estadísticamente significativas (p= 0,00001). Analizamos el grado de fibrogénesis en los modelos experimentales. Hemos apreciado diferencias estadísticamente significativas entre el grado de fibrogénesis en el humano y el resto de modelos animales (p=0,000045). Todas las muestras humanas presentaron una fibrogénesis alta (n=11) lo que contrasta con los modelos experimentales en los que la mayoría de las muestras presentaron una fibrogénesis baja. Además, destaca el modelo pancreático en el que hasta el 87,5% de las muestras presentaron una expresión de alfa- SMA baja. Finalmente, hemos analizado la evolución de la fibrogénesis de cada modelo a lo largo de los tres pases de manera individual. Se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de AlfaSMA a medida que avanzan los pases en todos los modelos siendo especialmente llamativa en el modelo pancreático. Expresión de CD31 Se aprecia un descenso de la angiogénesis en los tres pases siendo más acusado en el Pase 1 (p=0,008). También se aprecia un descenso de la angiogénesis en todos los modelos siendo más acusado en el modelo pancreático (p=0,003). En el análisis de cada modelo a lo largo de los pases, se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de CD31 a medida que avanzan los pases en todos los modelos. Pero tan sólo en el modelo pancreático se aprecia una disminución significativa de las muestras con alta expresión de CD31 a lo largo de los pases, es decir, se aprecia una disminución significativa de la angiogénesis. Expresión de TUNEL A medida que avanzan los pases se aprecia un descenso significativo de la apoptosis Las diferencias encontradas son estadísticamente significativas (p=0,0042). También hemos apreciado diferencias estadísticamente significativas entre el grado de apoptosis en el humano y el resto de modelos animales (p=0,0018). La mayoría de las muestras humanas Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 9 presentaron una apoptosis elevada (n=8; 72,7%) lo que contrasta con los modelos experimentales en los que la mayoría de las muestras presentaron una apoptosis leve. Además, destaca el modelo pancreático en el que hasta el 93,8% de las muestras presentaron un a apoptosis leve. En el análisis de cada modelo a lo largo de los pases, se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de TUNEL a medida que avanzan los pases en todos los modelos. Pero es en el modelo intraabdominal y pancreático donde se aprecia una disminución significativa de las muestras con alta expresión de TUNEL a lo largo de los pases. DISCUSIÓN A medida que avanzan los pases se aprecia un aumento progresivo de la tasa de implantes exitosos en los tres modelos experimentales y un desarrollo más precoz de los xenoinjertos. De esta forma, queda patente la viabilidad de los xenoinjertos de los tumores periampulares en los modelos experimentales con ratones inmunodeprimidos. Análisis por modelos El modelo subcutáneo es el que mayor número de xenoinjertos viables presenta a lo largo de los tres pases y el que ofrece una detección más precoz del desarrollo del implante. Aunque no existen diferencias significativas, la mayor morbimortalidad del modelo intraabdominal y pancreático junto con la detección más tardía debido al implante del xenoinjerto en una cavidad distensible, podrían justificar la menor tasa de desarrollo tumoral en estos dos modelos. Aunque todos los modelos (subcutáneo, intraabdominal y páncreas) presentan características anatomopatológicas e inmunohistoquímicas similares. En contra de lo esperado al inicio del estudio el modelo pancreático presenta una mayor tendencia hacia la disminución de la fibrogénesis, la vascularización y de la apoptosis. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado I. Resumen Pág. 10 ¿En qué modelo se observan los mejores resultados? La detección del desarrollo tumoral es más precoz en el modelo subcutáneo lo que supone un coste inferior respecto a los otros modelos. Además el modelo subcutáneo es el que mayor número de xenoinjertos viables desarrolla a lo largo de los tres pases. De esta forma, teniendo en cuanta que los tres modelos presentan características similares en cuanto a diferenciación, fibrosis, proliferación celular, fibrogénesis, angiogénesis y apoptosis, el modelo subcutáneo puede ser la mejor opción para la investigación de fármacos anticancerosos con xenoinjertos. Análisis por Pases A medida que avanzan los pases se aprecia un aumento progresivo de la tasa de implantes exitosos en los tres modelos murinos que resulta especialmente llamativa en el Pase 1 (T1→ T2). Cuando analizamos las muestras de los xenoinjertos por pases no se aprecian diferencias en la diferenciación, la proliferación celular ni la fibrosis entre pases, sin embargo si se aprecia una disminución progresiva de la fibrogénesis, de la vascularización tumoral y de la apoptosis. Todas estas características explican el mayor desarrollo tumoral en los últimos pases. ¿En qué momento se observan los mejores resultados? Por ello, debemos buscar el pase que presente mayor desarrollo tumoral y con las características inmunohistoquímicas más parecido al humano que en nuestra serie se correspondería al Pase 1 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 17 1.3. MORTALIDAD Tanto en EEUU como en la UE, si observamos los últimos datos de World Health Organization database y Eurostat, el cáncer de páncreas es la única neoplasia que no muestra una tendencia hacia la mejoría en las tasas de mortalidad en ambos sexos. Figura 1. Tendencia de la mortalidad para el cáncer en hombres y mujeres de la UE en quinquenios desde 1970- 1975 hasta 2005-2009. Las flechas señalan la tendencia ascendente del cáncer de páncreas (Curva azul con triángulos) (1) En el 2014 la tasa de mortalidad fue de 8,13/100.000 habitantes para los varones y 5,56/100.000 habitantes en las mujeres. Según la American Cancer Society se estima que para el 2015 se diagnosticaran 48.960 casos nuevos de cáncer de páncreas en EEUU y aproximadamente unas 40.560 personas fallecerán como consecuencia del mismo (16) A pesar de que en los grupos de edad más jóvenes (25-45 años) parece existir una mejor supervivencia en los varones, en el género femenino no ocurre esto (1). El cáncer de páncreas en las mujeres y a cualquier edad presenta una mayor tendencia hacia el ascenso de la mortalidad desde los años 70, mientras que en los hombres, parece haber alcanzado una fase de estabilización desde finales de la década de los 80. Estos datos probablemente reflejan las tendencias de las últimas generaciones de mujeres y hombre europeos en el Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 18 hábito tabáquico (1). Por otro lado, a pesar de las mejoras en las pruebas de imagen que permiten diagnosticar la presencia del cáncer de páncreas a lo largo de los distintos países, la ausencia de síntomas de la enfermedad y de un test de cribaje que permita una detección precoz hace que el diagnóstico continúe siendo tardío. Esta situación dificultaría la tendencia hacia la mejoría en la curva de supervivencia de estos pacientes. Incluso en el escenario más favorable la supervivencia media no supera los 6-10 meses (17). En caso del cáncer de páncreas metastásico la supervivencia es aún menor estimándose en 3-6 meses desde el diagnóstico, aunque el uso de la quimioterapia ha demostrado un beneficio en la supervivencia y en la calidad de vida de estos pacientes en comparación con el tratamiento paliativo (19,20). En la actualidad, a supervivencia actuarial para el adenocarcinoma de páncreas intervenido en centros con experiencia es de aproximadamente el 20%. De todos los factores que influyen en la supervivencia, la resecabilidad es el que más afecta. Sin embargo, la realización de intervenciones quirúrgicas con mayor agresividad no aporta un mayor beneficio, y sí un aumento de complicaciones (2). En cuanto a los adenocarcinomas del cuerpo y la cola el pronóstico es francamente peor. En estos se produce un retraso en el diagnóstico, debido a lo inespecífico de los síntomas. Generalmente el tumor ya presenta un gran tamaño tumoral, o su crecimiento ha provocado dolor por extensión perineural. El resultado es que la mayoría de estos pacientes presentan tumores irresecables. La supervivencia a los 5 años es rara y la media es inferior al año (2). En el resto de tumores del área ampular, las expectativas son afortunadamente diferentes. En los adenocarcinomas de la ampolla de Vater, las posibilidades de curación tras la duodenopancreatectomía cefálica se aproximan al 50% con una supervivencia media en casos de R0 de 45 meses (2). Los colangiocarcinomas distales presentan una supervivencia actuarial a los 5 años algo inferior al 28%. En cuanto a los adenocarcinomas de duodeno, son poco frecuentes, y su comportamiento biológico se asemeja más al del adenocarcinoma gástrico que al pancreático (2). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 19 2. HISTOLOGÍA, PATRONES DE DISEMINACIÓN Y MARCADORES TUMORALES 2.1. HISTOLOGÍA DEL CÁNCER DE PÁNCREAS Las lesiones tumorales que se desarrollan en el páncreas se pueden dividir tomando como referencia múltiples características (21,22,23,24,25). Los tumores pancreáticos se pueden dividir en dos grandes grupos: endocrinos y exocrinos. Los tumores exocrinos se dividen a su vez en tumores sólidos y tumores quísticos. Cada uno de estos grupos tiene a su vez varios tipos diferentes. Los tumores sólidos exocrinos comprenden el adenocarcinoma ductal infiltrante, el carcinoma de células acinares y el pancreatoblastoma (Figura 2). El primero representa el 90% de los tumores sólidos exocrinos y se caracteriza por un patrón de crecimiento agresivo, con infiltración precoz retroperitoneal, vascular y perineural, y tendencia a la diseminación por vía ganglionar, intraperitoneal (carcinomatosis) y venosa (metástasis hepáticas). Figura 2. Clasificación histopatológica de los tumores de páncreas Los Tumores quísticos son raros (3% de los tumores pancreáticos y 10% de los malignos). Los adquiridos que pueden ser benignos como los cistoadenomas (seroso y Neoplasias páncreas Quísticos Congénitos Adquiridos Benignos (Cistoadenoma) Seroso Mucinoso Malignidad intermedia Cistoadenoma mucinoso papilar intraductal Malignos Cistoadenocarcinoma Sólidos Benignos Seudopapilar sólido Adenoma Acinar Malignos Carcinoma acinar ADENOCARCINOMA DUCTAL Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 20 mucinoso), de malignidad intermedia (Cistoadenoma mucinoso papilar intraductal) y malignos como el cistoadenocarcinoma que es muy infrecuente. El Adenocarcinoma ductal que es el más frecuente de los tumores sólidos exocrinos fue descrito en 1760 por Morgagni en sus estudios histológicos (26). Es el tumor sólido maligno de páncreas más frecuente. Este tipo de tumor y sus variantes suponen el 80-90% de las neoplasias pancreáticas y una proporción mayor de las neoplasias malignas. El 70% se desarrolla en la cabeza de páncreas. A nivel macroscópico los tumores suelen ser grandes (tamaño medio de 3 cm) irregulares y mal delimitados. Una elevada proporción de casos se diagnostican cuando tienen metástasis a distancia (ganglionares y hematológicas). Los que aparecen en cuerpo y cola alcanzan diámetros mayores porque son asintomáticos durante mucho tiempo. En la microscopía óptica existen dos características fundamentales: la intensa reacción desmoplásica (compuesta de fibras de colágeno, fibroblastos y células inflamatorias) y células neoplásicas muy bien diferenciadas que no se corresponden con la alta letalidad de este tumor. En la inmunohistoquímica expresan citoqueratinas (7, 8, 18, 19 y de forma variable 20), mucina (MUC1, MUC4 y MUC5A), marcadores oncológicos (CEA, B72.3, CA 125 y CA 19.9) y marcadores específicos de cáncer de páncreas (mesotelina, S100A4, etc.). En cuanto a la secuenciación genética de los tumores, se incluye el oncogén KRAS y tres genes supresores de tumores (p53, p16/CDKN2A y SMAD4) (26). Existen variantes que suelen ser tumores degenerados: • Carcinoma coloidal: Degeneración de neoplasias quísticas mucinosas. • Carcinoma adenoescamoso: Subtipo de peor pronóstico del adenocarcinoma ductal. • Carcinoma de células en anillo de sello: Derivado de los ampulomas. • Carcinoma anaplásico: Subtipo del adenocarcinoma ductal, más infrecuente y de peor pronóstico. • Carcinoma de células gigantes: La existencia de células con marcadores epiteliales o mesenquimales, y de otras con expresión de ambos tipos (Vimentina y EMA), hacen pensar que es un tumor de origen epitelial con diferenciación mesenquimal. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 21 • Carcinoma sarcomatoide: Carcinoma anaplásico que simula un sarcoma a nivel histológico. La historia natural de los ADCP comienza con un epitelio ductal sano que sufre una displasia para transformarse en una Neoplasia Intraductal de Páncreas (PanNI). A su vez, ésta se desarrolla en tres etapas: displasia leve (PanNI-1), moderada (PanNI-2) y severa (PanNI-3). Histológicamente son pequeñas (<0.5cm), papilares y que crecen dentro de los ductos pancreáticos. En cada una de estas etapas se activan una serie de oncogenes y factores de crecimiento que desarrollaremos con más detalle en el punto 3 de esta introducción. Solo un 1% de los PanNI desarrollarán un cáncer invasivo (26). Figura 3. Desarrollo evolutivo del adenocarcinoma de páncreas (26) Posteriormente desarrollan una reacción desmoplásica intensa del estroma y fibrosis. La "desmoplasia tumoral" se forma por un incremento en el tejido conectivo que infiltra y envuelve el tumor. Las células estrelladas pancreáticas que participan en la desmoplasia tumoral se caracterizan por expresar -SMA (actina de músculo liso) y por la síntesis de procolágeno α-1T que son los principales componentes de la matriz extracelular que constituyen la desmoplasia. Las células estromales de estos tumores evidencian un aspecto morfológico dendrítico, expresan citofilamentos y una capacidad de síntesis de sustancias de matriz extracelular idénticos a los hallados en casos de pancreatitis crónica inducida por alcohol, lo cual sugiere unos mecanismos similares subyacentes al desarrollo de la fibrosis en la pancreatitis crónica y de la desmoplasia en el adenocarcinoma pancreático. Existe además evidencia creciente de la relación que existe entre las células Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 22 estrelladas pancreáticas y las células tumorales; por mecanismos parcialmente entendidos las células estrelladas pueden estimular el crecimiento tumoral, además pueden promover la invasión tumoral y posiblemente la angiogénesis (27). Esta zona de pancreatitis crónica que rodea el tumor se debe teóricamente a la obstrucción de esos conductos adyacentes por las células tumorales (21,22,23,24,25). 2.2. HISTOLOGÍA DE LOS TUMORES PERIAMPULARES Los tumores que asientan en esta zona pueden originarse de cualquiera de los tres epitelios pancreático, biliar o duodenal, pero a veces es muy difícil distinguirlos histológicamente y se conocen como “tumores periampulares” o “ampulomas”. La mayoría son adenomas, pero un 25% son carcinomas. El tratamiento de estos tumores va desde la resección endoscópica a la duodenopancreatectomía cefálica, dependiendo tanto del tipo de tumor como de las características del paciente (2). 2.3. PATRONES DE DISEMINACIÓN • Invasión local: Es la primera fase de la diseminación del tumor. Depende de la localización del mismo, ya que se van a ver afectadas las estructuras anatómicas adyacentes. Los que afectan a la cabeza del páncreas pueden infiltrar el antro gástrico y el duodeno produciendo obstrucciones altas del tránsito o hematemesis. Los de cuerpo y cola de páncreas afectan al cuerpo gástrico, bazo, primer asa yeyunal, hígado y peritoneo principalmente. • Diseminación linfática: Es la que realiza el tumor a través de los conductos y ganglios linfáticos locorregionales que drenan la zona pancreática donde se localiza. Esta diseminación afecta al pronóstico. Si las lesiones son cercanas al páncreas (primera estación, adenopatías del hilio hepático e incluso del tronco celíaco) el tumor se considerará resecable, pero con una afectación negativa en la supervivencia del paciente. Si las adenopatías afectas se encuentran lejos del tumor, como los ganglios interaortocavos se considerará igual que si tuviese metástasis Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 23 hepáticas. Sin embargo, la diseminación linfática no contraindica “per se” la resección del tumor. • Diseminación perineural: Este tipo de diseminación es característica del adenocarcinoma de páncreas. Los estudios muestran una incidencia del 51-100% y se encuentra presente en los estadios incipientes y es posible que se disemine a través de la longitud del nervio. En algunos casos es causa de dolor intratable y de recidiva tumoral por lo que se considera un factor pronóstico independiente. El mecanismo molecular se desconoce y no se han creado dianas terapéuticas para este tipo de diseminación (28). Los mecanismos moleculares no están bien definidos. Parece ser que el factor derivado del estroma 1α/CXCL12/CXCR4 está relacionado con un mayor neurotropismo de las células tumorales en los nervios periféricos (29). • Diseminación hemática: Consiste en la liberación de células tumorales al torrente sanguíneo y su crecimiento a distancia del tumor primario. La glicosilación alterada es una de las características del adenocarcinoma ductal de páncreas. La expresión de los antígenos sialil-Lewis (SLe) se encuentra incrementada en la superficie de glicoproteínas o glicoesfingolípidos de las células del ADCP y la expresión de estos ligandos presenta una correlación negativa con la supervivencia del paciente. Estos antígenos glucídicos, ligandos de interacción específicos para la molécula de adhesión E-Selectina, se encuentran involucrados en la extravasación de las células tumorales (30). Los órganos que más frecuentemente se afectan por este tipo de lesiones son: o Hígado: Sobre todo en tumores de cuerpo y cola. o Plexo celiaco: Son causa de dolor de espalda severo en estos pacientes. o Vena porta y vasos mesentéricos superiores: Una obstrucción de estas estructuras vasculares produciría defectos de perfusión o retorno venoso a nivel de las asas intestinales y/o hepático. o Ligamento de Treitz: La afectación de este ligamento puede llevar a una obstrucción intestinal. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 24 2.4. MARCADORES TUMORALES No hay marcadores tumorales específicos para valorar la evolución del adenocarcinoma de páncreas. Los marcadores como el CA 19-9 sérico tienen una especificidad baja porque también lo producen otros tumores como el cáncer colorrectal, cáncer del pulmón, y cáncer de la vesícula biliar. Niveles altos de CA 19-9 también pueden ser causados por otras afecciones no cancerosas como cálculos biliares, pancreatitis, fibrosis quística y enfermedad del hígado. Durante la radioterapia, los niveles de CA 19-9 se pueden elevar debido a que las células cancerosas secretan el CA 19-9. La mayoría de los pacientes de cáncer de páncreas tienen un CA 19-9 elevado en el momento del diagnóstico. Después del tratamiento definitivo o durante este, el aumento de las concentraciones de CA 19-9 puede identificar a los pacientes con crecimiento tumoral evolutivo. Sin embargo, la presencia de CA 19-9 normal no previene la recidiva (31). La Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) también llamada osteonectina o BM-40 es una proteína de la matriz celular de grandes invertebrados y vertebrados que participa en procesos biológicos como: remodelación ósea, fibrinogénesis, cicatrización, migración, proliferación, angiogénesis, etc. La deleción del gen que codifica SPARC supone un aumento en el crecimiento tumoral en ratones (32). En condiciones normales, cuando gen que codifica SPARC funciona adecuadamente, se dan las siguientes acciones: • Induce apoptosis: Activando la vía extrínseca de la apoptosis. • Inhibe la invasión celular: Disminuye MMP-2, MMP-9 y aumenta las integrinas. • Inhibe la proliferación: Inhibe FAK, Src, Akt y MAPK. • Inhibe la angiogénesis: Se une y bloquea el PDGF, VEGF, y Factor fibroblástico básico. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 25 Figura 4. Dianas potenciales de la actividad de la SPARC (32) Los tumores pancreáticos en ratones SPARC (-/-) desarrollan un crecimiento más rápido y metástasis precoces. Algunas investigaciones sugieren que SPARC actúa como agente quimiosensibilizador induciendo la regresión tumoral en ratones. El efecto oncogénico de SPARC depende del tipo celular y el ambiente extracelular de las células tumorales (33). Existen otros marcadores tumorales menos frecuentes pero que se pueden encontrar elevados como: CA15-3, CA27-29, CA125 y CEA. Hay marcadores tumorales que se encuentran en la misma pieza tumoral, como los miembros de la familia del “Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico” (EGFR) también conocido como HER1 o ErbB-1, que ejercen como receptores localizados en la célula y fomentan su crecimiento. Las pruebas realizadas en una muestra de tejido tumoral pueden cuantificar la cantidad de este receptor. En el caso de estar aumentada, puede indicar que el cáncer sea de rápido crecimiento y propagación, al igual que más difícil de tratar. Los pacientes con un nivel elevado de EGFR puede que tengan resultados menos favorables y requieran de un tratamiento más agresivo, especialmente con medicamentos que bloqueen (o inhiban) los receptores de EGFR. (34). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 26 3. BIOLOGÍA MOLECULAR: GENES, ONCOGENES, FACTORES DE CRECIMIENTO Y SUS RECEPTORES. La mayoría de los tumores del tracto digestivo se originan por la acumulación de mutaciones: adquiridas o heredadas. Los mecanismos oncogénicos se dividen en tres grupos: • Activación de oncogenes. • Inhibición de genes supresores (Su función es restringir la proliferación celular descontrolada) • Interacción con genes. Esta serie de cambios son acompañados de un proceso conocido como inestabilidad cromosómica global, el cual persiste a lo largo de la vida del tumor. La identificación de las alteraciones genéticas ha aumentado el conocimiento de la naturaleza fundamental del cáncer de páncreas, con implicaciones en la precoz detección y tratamiento, pero su extrapolación a la práctica clínica es todavía incierta (35,36). (Tabla 1). Tabla 1. Genes más frecuentemente mutados en el carcinoma ductal pancreático La revolución tecnológica nos ha permitido comprender el adenocarcinoma pancreático en tres importantes vías (35): • Identificación de más de 100 genes expresados en el carcinoma pancreático pero no en el tejido normal lo cual lleva al desarrollo de test diagnósticos o nuevas terapias. Genes Localización Frecuencia % K-ras Cr. 12p 95 P16/CDKN2A Cr. 9p 90 P53/TP53 Cr. 17p 50-75 DPC 4/SMAD4 Cr. 18q 55 AKT2 Cr. 19p 10-20 MYB Cr. 6q 10 BRCA2 Cr. 13q 7-10 MKK4 Cr. 17p 4 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 33 Dado que cada especie animal tiene su dotación genética (que es, precisamente, la que hace que un individuo pertenezca a una especie determinada y no a otra), podría parecer contradictorio intentar reproducir en un animal de experimentación una enfermedad provocada por las alteraciones de los genes de un ser humano. Sucede, sin embargo, que aunque nuestros cromosomas sean distintos a los de los animales, tenemos infinidad de genes idénticos, muchos de los cuales, además, realizan funciones bioquímicas parecidas a las que realizan en la especie humana. Bien es verdad que pueden estar situados y repartidos por el conjunto de cromosomas de una manera completamente diferente. Y, por supuesto, la función conjunta que desarrollan es diferente en cada especie: por eso el gato es gato y no es perro, y la mosca es mosca y no es un ratón. Es muy frecuente, en la investigación con animales, intentar trabajar con especies de reproducción rápida (como el ratón), cuyos individuos sean bien manejables, y cuyas variables genéticas y ambientales puedan ser estrictamente controlables. En este sentido el ratón es un animal ideal (49). Recordemos que, para la medicina experimental, el ratón es un organismo modelo que ofrece muchas ventajas con respecto a otros modelos genéticos como la mosca Drosophila, el nematodo Caenorhabditis Elegans e inclusive la rata. Estas ventajas son: (50) • Al tratarse de un mamífero, una gran parte de sus procesos bioquímicos son similares al hombre, aunque no hay que perder de vista que no se trata de un humano en miniatura. • Tienen un tiempo generacional muy corto, son muy prolíficos y se adaptan fácilmente a la vida en cautividad (bioterios), lo que permite controlar las variables ambientales en las experimentaciones. • Comparte con el hombre el privilegio de ser las especies de mamífero mejor estudiadas desde el punto de vista genético. • Existe una gran cantidad de líneas genéticamente definidas, como las consanguíneas y congénitas, además de cientos de mutaciones y un gran número de reordenamientos cromosómicos disponibles. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 34 • Es el único animal que posee sistemas eficientes de cultivo de células embrionarias pluripotenciales, lo que permite la realización de mutaciones dirigidas. • Finalmente, el trabajo acumulado durante un siglo de investigaciones ha resultado en una inmensa cantidad de documentación sobre los fenotipos mutantes, las características de las líneas, los mapas genéticos y la secuencia completa del genoma. El desarrollo de los quimioterápicos y otras moléculas antitumorales se encuentra íntimamente relacionado con los modelos experimentales. Multitud de quimioterápicos han sido testados utilizando estos modelos. Sin embargo, fármacos que funcionan bien en el ratón no son necesariamente efectivos en el ser humano. Durante los últimos 50 años, los xenoinjertos subcutáneos derivados de líneas celulares han sido ampliamente utilizados (51,52). Desde los años 70, se han utilizado muestras de cánceres humanos tomados mediante biopsia o mediante cirugía que posteriormente han sido implantados directamente en ratones. Estos xenoinjertos mantienen la morfología tumoral inicial así como las mutaciones genéticas que le acompañan. Sin embargo, estos modelos fueron inicialmente desechados debido a su alto índice de rechazos. Recientemente, se ha retomado esta línea de investigación gracias al desarrollo de nuevas cepas de ratones inmunodeprimidos modificadas genéticamente que han minimizado las tasas de rechazo. De esta manera, ha sido posible que este modelo sea competitivo a la hora de analizar la eficacia de las distintas drogas para el estudio de ADCP. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 35 5. TIPOS DE MODELOS ANIMALES Los modelos experimentales existentes en la actualidad son: • Tumores inducidos con sustancias carcinógenas • Tumores inducidos mediante ingeniería genética • Injerto tumoral o Aloinjertos ▪ Dependiendo del lugar del implante • Heterotópico • Ortotópico ▪ Dependiendo del origen de las células implantadas • Inyección de células cancerígenas murinas • Implante de tumores murinos o Xenoinjertos ▪ Dependiendo del lugar del implante • Heterotópico • Ortotópico ▪ Dependiendo del origen de las células implantadas • Inyección de células cultivadas “in vitro” • Implante de tumores humanos o “tumorgraft” 5.1. TUMORES INDUCIDOS CON SUSTANCIAS CARCINÓGENAS Múltiples sustancias cancerígenas han sido estudiadas, comprobándose que inducían desde lesiones focales proliferativas y cambios degenerativos hasta carcinomas en el páncreas de distintas especies animales. La mayoría de estas sustancias son también mutagénicas. Suelen alcanzar el páncreas a través del torrente sanguíneo tras absorción digestiva. Estos agentes químicos pueden iniciar la aparición de lesiones preneoplásicas como la metaplasia ductal o acinar. Sin embargo, una mutación genética es necesaria para Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 36 la progresión celular desde un estado preneoplásico hasta el desarrollo de un fenotipo tumoral maligno. Parece que ciertas especies de animales presentan más tendencia a desarrollar estas lesiones malignas en comparación con otras. Por ejemplo, el desarrollo de carcinoma de células acinares es más probable en ratas tras el empleo de sustancias químicas carcinogénicas. Por el contrario, los hámster tienden a desarrollar tumores ductales tras la administración de las mismas sustancias y el desarrollo de carcinomas acinares es extremadamente raro en estas especies. Pocas sustancias carcinogénicas han sido estudiadas para la inducción de ADCP en el ratón, pero se ha comprobado que con las mismas se producía el desarrollo tanto de carcinomas acinares como ductales (53,54). El modelo más extendido y estudiado es el Hámster Sirio Dorado con inyección intraperitoneal con N-nitrosobis-(2-oxoprolol)-amina (BOP) (55,56,57). Desde el año 2010 este modelo ha sido utilizado por el grupo de Padillo-Ruiz et al (58,59,60) para estudiar de forma experimental la etiopatología del ADCP así como la identificación de moléculas con actividad antitumoral en monoterapia o en tratamientos combinados con algunas sustancias como Capacitabina, Celecoxib y Melatonina, encontrándose en esta última una mejoría en la supervivencia de los hámster tratados. Estudios más recientes emplean la azaserina en ratas (61,62) y el 7,12- dimertilbenzaraceno en ratones (63). Algunos de estos modelos parecen asemejarse a la histología del ADCP humano. Sin embargo el perfil genético del ADCP inducido por estas sustancias en el ratón no se encuentra bien definido, limitando la aplicación de estos modelos en estudios que abarquen la genética molecular y el estudio de las vías de señalización tumoral. Además, los carcinógenos producen a menudo efectos colaterales en otros tejidos, lo que reduce su valor como modelo animal en los estudios preclínicos. Por esta razón nuestro grupo de investigación se ha inclinado en los últimos tiempos hacia el empleo de xenoinjertos procedentes del humano. En cualquier caso, la tumorogénesis inducida químicamente puede simular el proceso de la carcinogénesis espontanea en humanos iniciando el daño celular y culminando con la Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 37 producción de mutaciones genéticas que permiten el desarrollo de un tumor. Así, este modelo puede ser una herramienta valiosa para evaluar el impacto de los factores de riesgo ambientales incluyendo la dieta y sustancias químicas en la tumorogénesis del páncreas (64). 5.2. RATONES GENÉTICAMENTE MODIFICADOS: GEMM Recientemente, varios modelos de ratones genéticamente modificados (GEMM) han sido validados para recapitular sobre todo el espectro de la tumorogénesis pancreática en humanos (19,65,66). Los tumores pancreáticos invasores de estos modelos de ratón pueden ser una buena fuente para la generación de modelos experimentales de ADCP ortotópico y tumores periampulares en un ratón inmunocompetente. Alternativamente, ofrecen varias ventajas sobre la línea celular establecida a base de modelos de xenoinjertos (67). Los modelos GEMM son establecidos por la introducción de sustituciones de aminoácidos en oncogenes, lo que se traduce en la producción de tumores sólidos específicos. Las mutaciones en KRAS, p53, p16, o SMAD4 producen un espectro de lesiones premalignas pancreáticas hasta adenocarcinomas totalmente invasivos (68,69,70). En el estudio de Yamaguchi et al, se empleó una oncoproteína viral conocida como SV40 (tsTAg) para determinar si dicha oncoproteína promovía la carcinogénesis del conducto pancreático iniciado por KRAS. De esta forma generaron ratones que expresaban tsTAg en las células epiteliales pancreáticas. Los ratones con expresión tsTAg-páncreas específica desarrollaron displasia acinar en 22 semanas sin neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanIN). Mientras que los ratones que presentaban ambas mutaciones tsTAg y KRAS desarrollaban adenocarcinomas ductales infiltrantes y morían en un periodo de 3 semanas (70). Estos modelos son útiles para el estudio de la progresión de la enfermedad, así como la relación del desarrollo de tumores de páncreas dentro de su microambiente. Sin embargo, una desventaja importante de los modelos GEMM, es que los tumores producidos en estos Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 38 modelos son de origen murino; y es difícil determinar cómo se asemejan estos tumores a los de origen humano. Tampoco se conoce si estos modelos reflejan la heterogeneidad celular de los tumores primarios de páncreas, así como la heterogeneidad del estroma asociado al tumor pancreático visto en humanos. Además, los tumores GEMM resultan de una mutación específica introducida en el genoma del ratón, a diferencia de los tumores humanos que son el resultado de múltiples alteraciones genéticas (70). 5.3. INJERTOS TUMORALES 5.3.1. Aloinjertos Dependiendo del origen de las células implantadas se obtendrán xenotrasplantes o alotrasplantes. El primer caso se define como el trasplante de órganos, tejidos o células de una especie a otra (usualmente se introducen injertos de origen humano en los murinos). A diferencia de los primeros, encontramos los modelos alotrasplantados en los que se le introducen células tumorales de origen murino. Uno de los principales problemas de los xenoinjertos es la activación de la respuesta inmune contra los tejidos implantados, desencadenando una reacción inflamatoria conocida como rechazo. Por ello hasta la llegada en los años 80-90 de los animales genéticamente modificados o mutados, el alotrasplante ha sido fundamental en el estudio del cáncer. Aunque los resultados obtenidos no son extrapolables directamente al humano permite la posibilidad de llevar a cabo todo tipo de estudios básicos y ensayos terapéuticos in vivo, ya que al tratarse de un mamífero y salvando las diferencias lógicas, gran parte de los procesos bioquímicos y fisiológicos son muy similares. 5.3.2. Xenoinjertos Se entiende como xenoinjerto al implante de líneas celulares o muestras humanas implantadas en un ratón para el estudio del cáncer. Dependiendo de la localización del tumor o de las células tumorales los xenoinjertos en modelos experimentales son clasificados en dos tipos: heterotópicos u ortotópicos según la localización del implante en el ratón reproduzca anatómicamente la de su origen en el humano. Ambos modelos son comúnmente usados en el campo de la investigación. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 39 5.3.2.1. Dependiendo del lugar de implante 5.3.2.1.1. Xenoinjertos heterotópicos Hablamos de xenoinjerto heterotópico, cuando se inoculan o trasplantan células, un tejido o un órgano en un organismo receptor en una posición anatómica que no le corresponde. En el caso de los xenoinjertos de los modelos experimentales, uno de los lugares heterotópicos más empleados es el implante subcutáneo. • Xenoinjertos subcutáneos Los modelos experimentales con xenoinjerto subcutáneo son rápidos, con un coste bajo y requieren técnica asequibles y de fácil manejo. Es una de las mejores formas para expandir especímenes de tumores humanos, lo que permite convertir especímenes de tumores humanos en líneas celulares o facilitar estudios sobre angiogénesis (52). Figura 5. Xenoinjerto subcutáneo de cáncer de páncreas en ratón inmunodeprimido A pesar de los resultados prometedores demostrados por los distintos regímenes terapéuticos en los modelos experimentales con injerto subcutáneo a menudo estas líneas de tratamiento tienen poco efecto en pacientes humanos. Por ello, los estudios preclínicos con drogas se inclinan hacia el empleo de la ingeniería genética o el uso de modelos experimentales con injerto ortotópico (52,71). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 40 5.3.2.1.2. Xenoinjertos ortotópicos En los modelos con xenoinjertos ortotópicos, los tumores o las células tumorales son implantados o inyectados en el órgano en el que se origina el cáncer. Los xenoinjertos ortotópicos presentan el mismo microambiente que los tumores originales, por lo que son considerados más próximos al proceso de tumorogénesis en humanos. Además, parecen ser más adecuados para el estudio de las metástasis ya que los modelos de xenoinjerto subcutáneo rara vez las desarrollan (52,71). Sin embargo a pesar de las ventajas, la generación de modelos experimentales supone una labor intensa y técnicamente exigente. Además, la implantación de células tumorales o de masas en el páncreas mediante cirugía puede generar un trauma importante al animal receptor que requiera un periodo de convalecencia largo. Otra modalidad es la inyección directa de células tumorales diseminadas en el páncreas tras la exposición quirúrgica del mismo. Ésta se ha asociado a un aumento local de la presión en la zona del páncreas donde se realizó la inyección. Debido a que el parénquima pancreático es muy fino, las células infundidas pueden extravasar con facilidad resultando en una reducción de la formación tumoral y en una mayor diseminación intraabdominal. Por esta razón algunos autores han utilizado Matrigel, que es una matriz biológica con factores de crecimiento que a bajas temperaturas permanece liquida, y que cuando supera los 22ºC se transforma en un gel semisólido. Actúa como una matriz en tres dimensiones que contiene células cancerígenas pancreáticas para la inyección directa previniendo fugas de células neoplásicas y mejorando las tasa de formación tumoral. Sin embargo, esto también puede ser una desventaja ya que la matriz que se forma alrededor del tumor puede evitar la diseminación metastásica de las células así como la correcta llegada de los antineoplásicos estudiados (33,72). Para reducir la morbimortalidad intrínseca al procedimiento, algunos autores han desarrollado otros métodos menos invasivos como la inyección en el páncreas de células tumorales guiadas por ultrasonidos (33). Los ratones inmunodeprimidos con xenoinjertos ortotópicos no replican exactamente igual el proceso natural de la tumorogénesis humana debido a la falta de un microambiente tumoral parecido. Se piensa que las células inmunes en el microambiente del tumor juegan un papel fundamental en la progresión y en las metástasis del cáncer de páncreas. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 41 5.3.2.2. Dependiendo del origen de las células implantadas 5.3.2.2.1. Implante de tumores cultivados in vitro La mayoría de los trabajos focalizados en mejorar el entendimiento del cáncer de páncreas se basan en líneas celulares y xenoinjertos derivados de líneas celulares cultivados “in vitro”. Estos sistemas de modelos tienen múltiples deficiencias, en gran medida resultado de haber sido cultivadas in vitro durante muchas generaciones. Prácticamente todas estas líneas celulares establecidas acumulan cambios genotípicos o fenotípicos que les confieren una ventaja de supervivencia in vitro, presentan expansión clonal, y sufren alteraciones en las características que dependen de la interacción de las células tumorales con el tejido del estroma adyacente en vivo. En consecuencia, el grado en el que estas líneas celulares y los xenoinjertos derivados de los mismos reflejan características de los tumores primarios de los que se derivaron es controvertido (52). 5.3.2.2.2. Implantes de tumores primarios humanos Como alternativa algunos grupos plantean el implante de muestras heterogéneas de tumores primarios humanos de ADCP con una limitación de pases en ratones inmunodeprimidos que pueden retener el genotipo y fenotipo de los tumores de origen. Estos modelos podrían utilizarse para caracterizar tumores individuales del ADCP, identificar las características comunes a los tumores de páncreas, y evaluar nuevos agentes quimioterapéuticos. Aunque este tipo de xenoinjerto derivado del paciente se encuentra descrito en la literatura ya en las décadas de los 60 y 70 (22,52), las ventajas de estos modelos y su uso en medicamentos han sido recientemente reconocido e implementados (46,71). En el establecimiento de modelos de xenoinjertos derivado del paciente, las muestras de tumores primarios se implantan en los ratones por vía subcutánea u ortotópica, sin paso intermedio de propagación in vitro. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado II. Introducción Pág. 42 Figura 6. Injerto de cáncer de páncreas humano extraído tras resección pancreática implantado en la cola del páncreas de un ratón inmunodeprimido. El xenoinjerto consiste en el implante de especímenes heterogéneos de tumores primarios humanos por vía subcutánea u ortotópica en ratones inmunocomprometidos inmediatamente después de la cirugía de resección de los tumores humanos (52). Múltiples laboratorios han establecido modelos de xenoimplantes procedentes cáncer de mama, renal, cabeza y cuello, y los tumores hepatocelulares. Algunos de estos modelos han predicho la respuesta clínica de un tipo específico de tumor a distintos agentes quimioterapéuticos (33,45,71,73,74,75,76). Sin embargo, el grado en que los implantes de ADCP y de tumores periampulares reflejan la histología o el comportamiento del tumor han sido escasamente estudiados. Algunos autores como García et al. (77) describen que este tipo de modelos experimentales mantienen las características histopatológicas y los rasgos genéticos de los tumores primarios de los que derivan con un máximo de dos pases en dos generaciones de ratones. El hecho de que sean capaces de mantener las características histopatológicas del tumor humano puede ser usado para predecir el crecimiento tumoral en el ratón. En cualquier caso, el grado en el que los implantes de ADCP refleja las características morfológicas e histológicas de sus tumores de origen ha sido escasamente estudiado y existen pocas publicaciones al respecto. Por esta razón, nuestro grupo que cuenta con una amplia experiencia en el campo de los modelos experimentales inducidos por medio de sustancias químicas como el BOP, ha iniciado los estudios en base a los implantes de ADPC, con el fin de poder alcanzar modelos más similares al humano con el que poder experimentar con nuevos fármacos quimioterápico. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Objetivos Pág. 49 1. GENERAL Valorar la viabilidad de los xenoinjertos de los tumores periampulares humanos implantados en ratones desnudos. 2. ESPECÍFICOS 1. Evaluar la viabilidad de los xenoinjertos de los ADCP y tumores periampulares humanos implantados en tres modelos experimentales: a. Subcutáneo b. Intraabdominal c. Pancreático 2. Caracterizar los implantes de cáncer de páncreas derivados de tumores humanos (anatomía patológica e inmunohistoquímica) en los 3 modelos experimentales generados. 3. Comparar los rasgos histopatológicos e inmunohistoquímicos de los modelos experimentales. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 50 VI. MATERIAL Y MÉTODOS Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 51 1. TIPO DE ESTUDIO Estudio prospectivo analítico experimental con muestras humanas obtenidas quirúrgicamente de pacientes con diagnóstico de ADCP o tumores periampulares que se implantaron como xenoinjertos en tres modelos experimentales. 2. PACIENTES Se incluyeron pacientes diagnosticados de carcinoma periampular y ADCP que fueron sometidos a una laparotomía exploradora desde el 17 de Mayo de 2012 hasta 13 de Febrero de 2014 en el Hospital Universitario “Virgen del Rocío” (Sevilla) intervenidos por la Unidad de Cirugía Hepatobiliar y de Trasplante Hepático. La utilización de las muestras humanas fue aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Sevilla de acurdo con los principios éticos de esta Institución. (CEEA-US2014-013/5). (Anexo 1) Se han excluido del estudio los pacientes menores de edad, neoplasias no identificadas como adenocarcinomas de páncreas o carcinomas periampulares, y no dar su consentimiento por escrito para la utilización de la muestra. (Tabla 3). Tabla 3. Criterios de inclusión y exclusión del estudio DPC: Duodenopancreatectomía Cefálica; DPT: Duodenopancreatectomía Total En todos los casos, se obtuvo el consentimiento informado escrito de los pacientes para la obtención de muestras de tejido tumoral y su utilización en el marco del presente proyecto de investigación. (Anexo 2). Criterios de inclusión Criterios de exclusión Laparotomía exploradora, DPC*, DPT* o pancreatectomía distal (con o sin esplenectomía) Laparoscopia exploradora >18 años <18 años ADCP o tumores periampulares (Colangiocarcinoma, adenocarcinoma duodenal, ampuloma) Tumores benignos, tumores quísticos (cistoadenocarcinoma seroso, tumores mucinosos, tumor mucinoso papilar intraductal, tumor papilar intraductal, tumor quístico de los islotes), tumores neuroendocrinos, pancreatoblastoma, carcinoma sólido pseudopapilar Consentimiento informado firmado por escrito Ausencia de consentimiento Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 52 Aplicando los criterios mencionados, se obtuvieron 11 muestras tumorales en fresco de un total de 10 pacientes. Éstas fueron extraídas de la pieza quirúrgica por un anatomopatólogo inmediatamente después de su exéresis. Las muestras obtenidas en la mayoría de los casos se obtuvieron mediante duodenopancreatectomía cefálica (n=8), excepto en una paciente que correspondió a una laparotomía exploradora por carcinomatosis peritoneal y otro obtenido mediante pancreatectomía distal. Además, se debe de tener en cuenta que uno de los humanos generó dos muestras (Humano 4): la metástasis ganglionar interaortocava y la muestra extraída del tumor pancreático. La edad media de los pacientes fue de 70 años (50–81 años). El 80% de los pacientes eran pacientes >70 años. La mitad de los pacientes incluidos en la serie eran varones (n=5) y la otra mitad mujeres (n=5). La localización del tumor más frecuente en nuestra serie fue la cabeza del páncreas (n=8). Hemos apreciado un caso en la cola del páncreas y otro derivado de una metástasis ganglionar. El diagnóstico anatomopatológico más frecuente fue ADCP (n=8). También se registraron dos adenocarcinomas ampulares. Todos los pacientes presentaron un grado histológico G2 en el análisis de la pieza quirúrgica. Las muestras fueron nuevamente revisadas por 2 patólogos observando discrepancias con la primera revisión del grado histológico. Se evidenció un 72,7% de tumores moderadamente diferenciados, un 18,2% de tumores bien diferenciados y un 9% de tumores indiferenciados. Para clasificar el estadio tumoral hemos empleado la clasificación TNM del Comité Americano para el Cáncer del 2010 (Anexo 3) (79). De los 10 pacientes, 7 tenían un estadio II (4 fueron estadio IIA y 3 estadios IIB), 1 estadio III y 2 estadios IV. De estos dos últimos pacientes, uno se correspondió con una laparotomía exploradora. La otra paciente (Humano 4) recibió quimioterapia y radioterapia preoperatoria consiguiendo la práctica desaparición del tumor primario pero persistiendo una adenopatía interaortocava infiltrada por ADCP de la que se tomó muestra para un xenoinjerto. Un 30 % de los pacientes presentaron invasión perineural y en un 60% se evidenció afectación ganglionar. En 3 pacientes se evidenció metástasis a distancia. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 53 Las características epidemiológicas y el diagnostico anatomoclínico de los 10 pacientes se encuentran reflejadas en la Tabla 4. Tabla 4. Características epidemiológicas y diagnóstico anatomoclínico Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 54 3. ANIMAL DE EXPERIMENTACIÓN Se han utilizado animales de experimentación de la especie Mus musculus y la cepa Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu. Esta cepa es un tipo de ratón atímico e inmunodeprimido por lo cual permite el crecimiento de los injertos sin rechazo inmunitario. El ratón presenta actividad de células linfocíticas B y células NK pero no de células linfocíticas T. Todos los animales eran machos para evitar las interferencias de las hormonas femeninas con el tumor y en fase adulta de la vida (6 semanas de edad). El peso medio inicial era de 20-25g. Figura 7. Ratón desnudo 3.1. ORIGEN La mutación “nu” fue descubierta en 1962 por el Dr. N. R. Grist en una población exogámica cerrada de ratones albinos en el laboratorio de Virus del Hospital Ruchill, (Glasgow, Reino Unido). Este modelo de ratones desnudos atímicos se mantiene como una colonia aislada y dada sus características especiales son adecuados para su uso en oncología, inmunología, y otros campos de la investigación biomédica. Debido a que carecen de timo, no pueden generar linfocitos T maduros. Por lo tanto no son capaces de producir muchos tipos de respuestas inmunitarias adaptativas, incluyendo: • La formación de anticuerpos que requiere de células T helper CD4+ • Las respuestas inmunes mediadas por células, que requieren las células T CD4 + y / o CD8 + Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 55 • Respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (requieren células T CD4 +) • Destrucción de células infectadas por virus o células malignas (requiere linfocitos T CD8 + citotóxicos) • Rechazo de injerto (requiere tanto las células T CD4 + y CD8 +) Es por ello que los ratones desnudos han servido en el laboratorio para obtener información sobre el sistema inmunológico, leucemias, tumores sólidos, el SIDA y otras formas de deficiencia inmune, así como la lepra. Por otra parte, la ausencia de funcionamiento de las células T impide a los ratones desnudos rechazar aloinjertos y xenoinjertos. 3.2. TAXONOMIA Y CARACTERÍSTICAS • Nombre común: Ratón desnudo o atímico o knock-out (Nude mice o Athimic mice) • Fenotipo: Albino. Fenotípicamente sin pelo. Es posible el crecimiento intermitente y escaso del cabello. • Camada media: 7 ratones. • El alelo nu en el cromosoma 11 es una mutación autosómica recesiva • Presenta un timo rudimentario disfuncional o ausencia del mismo. • Deficiencia de los linfocitos T • Los linfocitos B presentan una función normal CEPA: Athymic Nude- Foxn1nu ESPECIE: Mus Musculus GÉNERO: Mus FAMILIA: Muridae ORDEN: Rodentia CLASE: Mammalia FILO: Choradata REINO: Animalia Figura 8. Taxanomía Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 56 • No pueden generar células efectoras citotóxicas • Sin respuesta de injerto contra huésped • Foxn1nu/Foxn1 + heterocigoto; no muestran expresión parcial del fenotipo nu • Peso: o Macho: 24,2-28,9 g. o Hembra: 21-28,1 g. • Esperanza de vida: Normalmente es de 6 meses a un año. En ambientes libres de gérmenes y controlados con los tratamientos con antibióticos que se encuentran en muchos laboratorios pueden vivir casi tanto tiempo como los ratones normales (18 meses a dos años). • Número de cromosomas: 40 (22500 a 30000 genes). • Consumo de agua: 15 ml/día. • Consumo de alimento: 5-10 g/día (adulto). • Temperatura corporal: 36.2-37.5 C (rectal). • Frecuencia cardíaca: 280-412 latidos/min. • Frecuencia respiratoria: 74 (33-127) respiraciones/min. Los ratones atímicos fueron adquiridos a Laboratorios Harlan (Barcelona, España) y se mantuvieron en condiciones de estabulación en el servicio de experimentación del IBiS que está registrado según los estándares del Decreto 142/2002, BOJA de 7 de Mayo. La descripción de sus instalaciones queda recogida en la Resolución 151/2008, BOJA de 30 de Julio. Permiten estabular en jaulas individuales aisladas con microambiente controlado, entre otros animales de experimentación, ratones desnudos bajo las condiciones ambientales que determina la Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural (Anexo 4). Los animales de experimentación fueron mantenidos en condiciones estandarizadas de estabulación (Temperatura: 21+/- 5 º C y humedad: 70%). con un ciclo estable de luz (12 horas de luz y 12 horas de oscuridad), acceso a una dieta estándar y a reservorios de agua a los que pudieron acceder libremente y que fueron renovados diariamente (Figura 9).Los animales fueron evaluados semanalmente controlándose tanto el peso como la situación Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 57 de salud de los mismos. En este sentido, el proyecto cumple la legislación actual en esta materia, en particular, el Real Decreto 53/2013 (1 de febrero 2013), por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. Estos procedimientos han sido revisados, y corregidos en su caso, por el Comité de Investigación Biomédica del Centro. (ES410910008015; SE15/CS/U) Figura 9. Animalario. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) 4. IMPLANTES DEL XENOINJERTO Las muestras fueron obtenidas en condiciones estériles, evitando tejido necrótico tumoral y áreas de tejido pancreático sano. Las muestras fueron cortadas en fragmentos de 2x2x2 cm y conservadas en medio de cultivo a temperatura ambiente hasta su implante. El periodo de latencia para el implante osciló entre 15 minutos y 2 horas. El medio de cultivo referido fue SIGMA-Life Science NUTRIENT MIXTURE F-10 HAM (SIGMAALDRICH. St Louis, MO. USA), con un 20% de suero bovino fetal y previamente almacenada entre 2 y 8 º C. La muestra obtenida de cada paciente (Hx), se dividió en cinco porciones de 3x3x3 mm. De éstas, tres fueron destinadas a los xenoinjertos implantadas a nivel subcutáneo, pancreático e intraperitoneal según la técnica descrita a continuación en al apartado 4.5. y las otras 2 restantes se destinaron para estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 58 El implante del tumor humano al ratón o del ratón a un nuevo murino se llama Pase. En nuestro estudio hemos realizado tres pases: Pase 0, Pase 1, Pase 2. (Figura 10). Figura 10. Desarrollo del proceso del implante tumoral en el modelo animal Pase 0: El color azul marca el desarrollo de esta fase; (Hx): Muestra humana; (T1): Injerto desarrollado en el ratón procedente de Hx; Pase 1: El color verde muestra el desarrollo de esta fase; (T2): Injerto desarrollado en ratón procedente de T1; Pase 2: El color naranja muestra el desarrollo de esta fase; (T3): Injerto desarrollado en ratón procedente de T2. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 65 inmovilidad. En caso de que el animal requiriera analgesia postoperatoria se procedió a la administración de 0,1 ml de Ketoprofeno (Ketofeno al 1%, Merial, Francia) cada 12 horas hasta reducción de los signos de sufrimiento. Así, se ha valorado la morbilidad de cada modelo experimental. Hemos analizado la infección del sitio quirúrgico, la infección intraabdominal o peritonitis, la hemorragia, la sepsis, la aparición de ascitis o úlceras, la sobredosis y la dehiscencia de la laparotomía media o subcostal. Los ratones se han pesado una vez por semana hasta su sacrificio para observar si existe una disminución o un aumento del peso relacionado con el desarrollo tumoral. Para valorar la evolución del peso del ratón a lo largo del tiempo hemos tomado como punto de corte la semana 10. En esta semana los ratones ya han alcanzado la madurez y la mayoría continúan vivos, además de que un porcentaje importante de los mismos todavía no presentan signos de tumor visible, sin embargo es probable que ya lo hayan desarrollado. A la 20 semanas del implante o cuando se evidencia un crecimiento rápido del tumor mayor de 1,5 cm se sacrifica al ratón para determinar el volumen tumoral y obtener las diferentes piezas para el estudio. De esta forma, analizamos el tiempo libre de enfermedad, es decir, el tiempo que tarda en desarrollarse el xenoinjerto desde el implante hasta la aparición manifiesta de tumor. Para valorar los casos que no desarrollaron tumor hemos empleado como fecha de fin de seguimiento el día de sacrificio o en su caso la fecha del éxitus (si la muerte fue fortuita). En los casos que desarrollaron tumor pero su crecimiento no era evidente debido a su localización en el abdomen, se ha tomado como fecha de detección del tumor el día del sacrificio. Por últimos hemos evaluado la mortalidad de cada modelo experimental. Hemos considerado éxitus todos aquellos ratones que murieron sin ser sacrificados bien por morbilidad de la técnica o por un desarrollo tumoral desapercibido. Hemos considerado mortalidad postoperatoria aquellos murinos que murieron en las primeras 24 horas tras el implante o que murieron semanas después como consecuencia directa de un fallo en la técnica quirúrgica (ej.: perforación encubierta). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 66 5. VARIABLES DEL ESTUDIO • Variable principal: - Desarrollo tumoral (%): Evidencia durante la vida del ratón o en la autopsia de un crecimiento tumoral mayor de 1-1,5 cm o presencia de metástasis. • Variables secundarias: ❖ Determinadas en los animales de experimentación - Tiempo libre de enfermedad (semanas): Tiempo desde el implante del tumor hasta el desarrollo tumoral o hasta la evidencia de ausencia de tumor en la autopsia. - Mortalidad (%): Ratones fallecidos de manera espontánea sin intervención de los investigadores. - Mortalidad postoperatoria (%): Muerte durante las primeras 24 horas tras la cirugía o en los días consecutivos como consecuencia de un fallo directo de la técnica quirúrgica. - Morbilidad (%): Aparición de complicaciones derivadas de la cirugía. Se han incluido infección del sitio quirúrgico, infección intraabdominal o peritonitis, hemorragia, la sepsis, aparición de ascitis o úlceras, la sobredosis y la dehiscencia de la laparotomía media o subcostal. - Peso (gr): Peso en gramos de los ratones implantados. ❖ Histología e inmunohistoquímica de las muestras - Grado de diferenciación (%): Determinado con las muestras de hematoxilina-Eosina mediante la observación de la morfología de las glándulas, núcleos celulares tumorales y el número de mitosis (Apartado 6.5). Se dividen en bien diferenciados (G1), moderadamente diferenciados (G2), poco diferenciados (G3). - Grado de fibrosis (%): Espesor del estroma tumoral determinado mediante la tinción de Tricrómico de Masson (Apartado 6.5), correspondiendo el grado 1 a la mínima fibrosis alrededor de las glándulas tumorales y 4, al grado máximo de fibrosis entre las glándulas tumorales. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 67 - Grado de proliferación celular (%): Determinado mediante el número de mitosis y la expresión de Ki67 en los ribosomas de los núcleos celulares, clasificada como baja/alta en función del punto de corte 2,97% (Apartado 6.7). - Fibrogénesis (%): Expresión de alfaSMA en fibroblastos y mioblasto. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 1,84%. - Angiogénesis (%): Expresión de CD31 en las células endoteliales del tumor. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 0,2%. - Apoptosis (%): Expresión de TUNEL en las células con ADN fragmentado o degradado. Se clasificó como baja/alta en función del punto de corte 27,11%. • Variables complementarias ❖ Determinadas en los pacientes - Características epidemiológicas: Edad (Años), sexo (Hombre/Mujer), estadio tumoral (Clasificación TNM), anatomía patológica, localización del tumor en el páncreas (Cabeza, cuello y cola), neoadyuvancia (Si/No), metástasis ganglionares (Si/No) e invasión perineural (Si/No). 6. PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LAS MUESTRAS 6.1. PRESERVACIÓN DEL TEJIDO TUMORAL El tejido recogido a partir del tumor primario (Hx) o posteriores generaciones de especímenes tumorales (T1 y T2) que no eran necesarias para la implantación, se conservó en el Biobanco para su uso futuro en otros proyectos de investigación, así como los análisis incluidos en el presente proyecto de investigación. Las muestras se preservaron mediante los siguientes métodos: • Criopreservación Se fraccionó cada tumor colocando 5 fragmentos/vial con 1 ml de medio MEM conteniendo DMSO (10%) y suero bovino fetal (10%) en un contenedor en contacto Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 68 indirecto con una solución de isopropanol puro que es mantenido a -80ºC durante 24 horas, para ser los criotubos transferidos posteriormente a un contenedor de nitrógeno líquido para su almacenamiento. • Fijación en una solución de Paraformaldehído El tejido tumoral se fija con una solución de formalina al 10% para su posterior inclusión en parafina. Posteriormente, son cortados en muestras de 5 µ, útiles para los estudios de histología y medición de las variables por procedimiento de inmunohistoquímica. 6.2. PREPARACIÓN DEL TEJIDO ESTUDIADO Los cortes realizados en los bloques de parafina se colocaron de forma seriada en portas con base de poli-lisina adecuado para los estudios histológicos. Las muestras fueron desparafinadas y rehidratas siguiendo el procedimiento de rutina. • Desparafinado • Las muestras fueron colocadas en cestillos de vidrio y calentadas durante 1 hora a 60ºC. Esta es la temperatura a la que la parafina se vuelve líquida. • Hidratación • Bañamos las muestras tres veces en Xileno durante 5 minutos. El xileno (C6H4(CH3)2) es un benceno que disuelve los restos de parafina. • Hidratamos las muestras en orden decreciente de concentración de alcohol. Desde alcohol absoluto (100%) hasta agua destilada. Se meten las muestras 2 minutos en cada uno. Figura 20. Cubetas con alcohol en orden creciente de concentración Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 69 6.3. TINCIÓN CON HEMATOXILINA-EOSINA Tras la rehidratación de los cortes histológicos, el tejido se tiñó con Hematoxilina de Harris (Fischer-Científico, Suwannee, GA). Las muestras fueron luego procesados en alcohol ácido al 0,25%, pavonado de litio carbonato, y se contratiñeron con una solución de eosina (Acros Organics-Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, Nueva Jersey). Finalmente, el tejido fue deshidratado en dos baños de etanol al 95% y etanol absoluto y se fijó en xileno. La hematoxilina al ser una sustancia básica o catiónica tiñe los núcleos, mientras que la eosina al ser un componente ácido facilita la tinción del citoplasma. Figura 21. Hematoxilina y Eosina del Humano 2. Ampuloma 6.4. TINCIÓN CON TRICRÓMICO DE MASSON La tinción tricrómica de Masson se emplea para teñir fibras de Colágeno tipo I y algunas fibras reticulares. Permite el estudio del estroma tumoral. Para ello, las muestras se tiñeron con hematoxilina férrica durante 10 minutos. Posteriormente, se lavaron sucesivamente con agua corriente y con agua destilada, y se procedió a la tinción con la escarlata-fucsina ácida. Tras un nuevo lavado con agua Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 70 destilada, la muestra se trató con una solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 15 minutos y se coloreó la pieza con azul de anilina. Se realiza un último lavado en agua destilada y se diferencia la muestra en la solución de ácido acético al 1%. Finalmente, la muestra se deshidrata y se aclara. Figura 22. Tricrómico de Masson. Humano 10. Adenocarcinoma 6.5. VALORACIÓN HISTOLÓGICA DE LAS MUESTRAS Para la valoración de las muestras tanto de hematoxilina-eosina como Tricrómico de Masson, se han valorado 2 veces todas las muestras, con una semana de tiempo entre ambas mediciones. Siempre al inicio de la mañana, de cada muestra, primero la hematoxilina-eosina y posteriormente el tricrómico. El grado de diferenciación se ha clasificado en bien diferenciado (glándulas tumorales bien formadas con núcleo pequeño en comparación con el citoplasma), moderadamente diferenciado (glándulas tumorales irregulares, con mayor atipia celular y núcleos pleomórficos). Poco diferenciado (glándulas tumorales muy mal definidas, que a veces adquieren un patrón sólido, mayor atipia arquitectural y celular, núcleos pleomórficos y grandes en relación al citoplasma y nucléolo visible). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 71 La WHO establece que en los tumores bien diferenciados hay menos de 5 mitosis en 10 campos de gran aumento, entre 5 y 10 mitosis para los tumores moderadamente diferenciados y más de 10 para los poco diferenciados. El número de mitosis se ha calculado contando mitosis en 10 campos de gran aumento con 40x. Realizando previamente un examen de la muestra a 10x, empezando a contar en la zona donde se concentran más mitosis. De las 2 mediciones de mitosis en cada muestra se ha tomado el resultado mayor. El grado de fibrosis se ha valorado en las zonas intra y peritumorales, con tinción tricrómico de Masson en grados de 1 a 4, correspondiendo 1 a la mínima fibrosis alrededor de las glándulas tumorales y 4, al grado máximo de fibrosis entre las glándulas tumorales. No existe ninguna clasificación objetiva para valorar grado de fibrosis en tumores pancreáticos. En el caso de la cirrosis hepática sí hay una clasificación, también de 1 a 4, bien establecida y objetivable, pero hay unas estructuras de referencia en la arquitectura hepática. En los casos a valorar se aprecian glándulas tumorales al azar y desmoplasia (reacción del estroma ante el tumor) distribuidas de forma caótica. En otras palabras, al no haber unos criterios objetivos para valorar fibrosis en el estroma desmoplásico, hay un cierto componente de subjetividad en la valoración que podría dar lugar a un grado de variabilidad interobservador (80). 6.6. INMUHISTOQUÍMICA La medición de la expresión de las proteínas en estudio se realizó por inmunohistoquímica. Las variables incluidas en el proyecto se relacionaron con la proliferación celular (Ki-67), muerte celular (TUNEL), angiogénesis (CD31), y fibrogénesis (α-smooth muscle actin). El procedimiento se basa en la utilización de anticuerpos primarios específicos para la detección de Ki-67 (FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, Clon MIB-1, Ref IR626, DAKO), CD31 (polyclonal anti- CD31, ab28364, Abcam), alfa-SMA (polyclonal anti-alfa-SMA, ab5694, Abcam) y TUNEL (TACSTM TdT Kit, TA4625, R&D). Los cortes de las muestras previamente desparafinadas y rehidratadas según se ha descrito previamente, se sometieron al procedimiento denominado de “Exposición antigénica” Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 72 que persigue facilitar la exposición de los antígenos de la muestra a los anticuerpos primarios. Para ello, las muestras fueron colocadas dentro del recipiente de plástico de color blanco (Figura 23) que contiene Citrato Sódico a 10 mm con pH 6. Las muestras fueron calentadas al baño maría en el microondas durante 15 minutos a máxima potencia. Figura 23. Citrato de sodio al baño maría durante 15 minutos La unión inespecífica del anticuerpo primario a las proteínas se previno, con la incubación durante 1 hora con un volumen (80 ml) de una solución de bloqueo o tampón TBSABSAT (0.12 g Tris-hidroximetil-aminometano, 0,9 g NaCl, 1 ml de azida sódica al 2%, 2 g albúmina bovina, 0,1 ml de Tritón X-100) (Figura 24). Figura 24. Muestras bañadas en TBSA-BSAT Tras el bloqueo de la muestra, se procedió a su incubación con el anticuerpo primario en una cámara húmeda que se prepara mediante la colocación de un papel secante mojado en un contenedor de plástico de dimensiones adecuadas (Figura 25). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 73 Figura 25. Cámara húmeda Para evitar que la solución de anticuerpo se extienda en exceso en la muestra, ésta se delimita con un bolígrafo (Super PAP pen), facilitando que se concentre sobre la muestra. Se deposita un volumen adecuado sobre cada muestra (25 µl) de anticuerpo primario a la dilución indicado en el informe comercial para los estudios de inmunohistoquímica que son de 1/50 (anti-CD31), 1:250 (α-SMA) y 1/500 (anti-ki67). La reacción de TUNEL se desarrolla siguiendo las condiciones del ensayo comercial. Las muestras fueron incubadas en la cámara fría de a 4ºC durante la noche. Figura 26. Muestras listas para incubación con el anticuerpo Tras la incubación de la muestra con el anticuerpo primario, este se retiró y se procedió a realizar dos lavado con TBSA-BSAT de 5 minutos, tras lo cual se procedió a la incubación durante 1:30 minutos con el anticuerpos secundario marcado con un fluoróforo (Alexa 488 Anti-rabbit/goat/mouse IgG) y a la concentración de 1/500 siguiendo las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). Se evitó exponer el anticuerpo secundario a la luz solar o debajo de un fluorescente. Se trabajó en un sitio en penumbra para conservar la fluorescencia de anticuerpo secundario. Tras la incubación de la muestra Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 74 con el anticuerpo secundario, este se retiró y se procedió a realizar tres lavados con TBSA-BSAT de 5 minutos. Tras las incubaciones se procedió al montaje de las muestras que consiste en su preservación mediante la colocación de un cubre de cristal entre los que se dispone una gota de solución adhesiva que contiene un marcador de DNA para localizar los núcleos celulares (ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI). 6.7. VALORACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LAS MUESTRAS La expresión de las proteínas en estudio se evaluó mediante la captación de la imagen de fluorescencia emitida por la muestra mediante el microscopio de fluorescencia Olympus BX61, y su análisis se realizó mediante los programas Application Suite Advanced Fluorescence. El análisis cuantitativo se realizó mediante el programa Cell Sens Dimensions. La captación de fluorescencia de la imagen entendida como la expresión de la proteína estudiada (Ki67, -SMA, CD31 y TUNEL) se realiza en una habitación en penumbra para evitar perdida de la fluorescencia. Los pasos a realizar para la captación de la imagen en el rango de la luz verde por utilización de un anticuerpo secundario (Alexa 488 Antirabbit/goat/mouse IgG) común a todas las proteínas en estudio fueron los siguientes: • Seleccionamos el modo FITC en el ordenador que hace que el microscopio emita una luz verde. que marca los núcleos en división. • Seleccionar el objetivo x4 que nos permite buscar la muestra. Una vez encontrada cambiamos al objetivo x 20. • Enfocamos. • Aumentamos el tiempo de exposición. Todas las fotos de FITC tienen el mismo tiempo de exposición: 50,9 milisegundos. • Seleccionamos AUTOFOCUS. Enfoca automáticamente la imagen • Se toma la foto (Figura 27) Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 81 La expresión de TUNEL de al menos 27,11 % de las células tumorales de cada muestra ha sido considera como una expresión alta, basándonos en la determinación del punto de corte 0,0424 determinado mediante el software Cutoff Finder. Figura 33. Histograma para TUNEL. La barra roja indica el punto de corte para la expresión alta de TUNEL 7. SOPORTE BIBLIOGRÁFICO La búsqueda bibliográfica fue realizada en Junio del 2015 a través de la Base de datos como MEDLINE (National Library of Medicine, NLM), Embase, PubMed y Cochrane Central Register of Controlled Trials. Los términos de búsqueda fueron “Tumorgraft”, “pancreas cancer”, “adenocarcinoma”, “murine model” y “mouse/mice”. Seleccionamos aquellos artículos escritos en español o en inglés independientemente del tipo de estudio y de estatus de publicación. Los artículos originales fueron obtenidos a través del Servicio de Biblioteca del Hospital Universitario “Virgen del Rocío” de Sevilla y a través de la biblioteca virtual del Sistema Sanitario Público de la Junta de Andalucía. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 82 8. TRATAMIENTO INFORMÁTICO Todos los datos referentes al estudio se trataron en un ordenador PC con microprocesador IntelCore i3-4012Y utilizando el siguiente software: • Como sistema operativo: Windows 8 • Como procesador de textos: Microsoft Word 2013 • Como editor de hojas de cálculo: Microsoft Excel 2013 • Como gestor de base de datos: SPSS® versión 21.0 para Windows • Como programas estadísticos para tratamiento y análisis posterior de los datos: SPSS 21.0 para Windows. 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS Realizado bajo la supervisión de la Unidad de Metodología de la Investigación del Hospital Universitario Virgen del Rocío y consistió en: 1. Análisis descriptivo para variables cuantitativas mediante el cálculo de la media como medida de tendencia central y la desviación típica o estándar como medida de dispersión; y para las variables cualitativas mediante el cálculo de porcentajes o proporciones (%) e intervalos de confianza (IC) al 95% de seguridad. 2. Determinación de la bondad de ajuste a una distribución normal (datos normales) mediante la prueba de Kolmorogov. También se comprobó la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene. Si las muestras seguían una distribución normal y las varianzas eran homogéneas se aplicaban tests paramétricos, en caso contrario se utilizaban test no paramétricos. 3. Comparación de los valores medios del número de mitosis entre los pases, así como entre los diferentes modelos animales (subcutáneo, intraabdominal y pancreático) mediante la prueba de Kruskal-Wallis (prueba no paramétrica). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 83 4. Comparación de proporciones en los distintos grupos mediante pruebas jicuadrado (2) para tablas de contingencia; en el caso de tablas 2 x 2 se utilizó el estadístico  2 con corrección de Yates, y cuando alguna frecuencia esperada fue menor o igual a 5 se aplicó la prueba exacta de Fisher. En el caso de tablas de 2 x 3 ó 3 x 4 se utilizó el test exacto de  2 cuando alguna frecuencia esperada fue menor o igual a 5. Para el análisis post-hoc se ha aplicado la corrección de Bonferroni. 5. Cálculo del tiempo trascurrido hasta la aparición del tumor o tiempo libre de enfermedad mediante la prueba no paramétrica de Kaplan-Meier. Comparación entre los tres modelos animales, así como los diferentes pases y el tiempo transcurrido hasta la aparición del tumor mediante el test de log- Rank. 6. Calculo de la progresión del peso en los ratones hasta la semana 10 mediante la prueba no paramétrica test de Friedman. Comparación del peso en la semana 10 entre los roedores con y sin desarrollo tumoral mediante la prueba U de Mann-Whitney (prueba no paramétrica) Todos los contrastes de hipótesis fueron bilaterales. Y en todas las pruebas estadísticas se consideran valores “significativos" aquellos cuyo nivel de confianza fue del 95% (p<0,05). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado V. Material y métodos Pág. 84 10. ETICA Y LEGISLACIÓN Durante el presente trabajo experimental se han tenido en cuenta los principios rectores básicos, de carácter internacional, aplicables a las investigaciones biomédicas con animales. Estas directrices están recogidas en la normativa española Real Decreto 223/1988 del 14 de Marzo, normativa incluida en éste decreto según la directiva 86/609 de la Comunidad Europea para la utilización de animales de experimentación. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 85 VII. RESULTADOS Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 86 1. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LOS IMPLANTES EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES 1.1. RESULTADOS GLOBALES DEL IMPLANTE DEL XENOINEJRTO RESULTADOS AGREGADOS De los 95 xenoinjertos implantados, 58 (61,1%) se han desarrollado a lo largo de los tres pases (Tabla 5). El desarrollo en el Pase 0, (desde el humano al ratón) fue significativamente menor (p=0,000013) que en los pases consecutivos en los que se realizó el reimplante desde ratón a ratón (pase 1 y pase 2). (Figura 34) Tabla 5. Tabla de contingencia. Impacto de los pases en el desarrollo del xenoinjerto PASES (%) p PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,000013 Desarrollo Tumoral GLOBAL SI 9 (28,1%) 15 (71,4%) 34 (80,9%) 58 (61,1 %) NO 23 (71,9%) 6 (28,6%) 8 (19%) 37 (38,9%) Total 33 (100%) 33 (100%) 29 (100%) 95 (100%) Test de exacto de χ2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 34. Desarrollo tumoral a lo largo de los pases independiente del modelo murino 28,13% 71,43% 80,95% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,000013 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 87 De los 11 xenoinjertos procedentes de humanos, 5 desarrollaron tumor en los distintos modelos del ratón, lo que supone que el 45,5% de los tumores humanos se desarrollaron en alguno de los modelos experimentales empleados. A continuación desglosaremos los resultados globales a los largo de cada pase PASE 0 (HXT1) Durante el Pase 0 se han implantado 11 especímenes de cáncer periampular y ADCP procedentes de 10 pacientes diferentes en 32 animales de experimentación (11 subcutáneos, 11 intraabdominales y 10 en el páncreas). Figura 35. Desarrollo tumoral en el Pase 0; (S): Subcutáneo; (I): Intraabdominal; (P): Páncreas Todas las muestras fueron obtenidas de tumores primarios, excepto en un caso en el que además de la muestra recogida en el parénquima pancreático, se obtuvo un xenoinjerto de una metástasis ganglionar paraaórtica (humano 4). Cada tumor extraído de los humanos (n=11), se dividió en tres porciones que se implantaron en los tres modelos descritos, a excepción del humano 5 que sólo se implantó en dos modelos: subcutáneo e intraabdominal. De los 32 xenoinjertos humanos implantados en el Pase 0, nueve (28,1%) se han desarrollado en el ratón independientemente del modelo (Figura 35). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 88 PASE 1(T1T2) De los 9 xenoinjertos extraídos, sólo se reimplantaron 7 debido a que el éxitus inesperado de dos ratones hizo que pasaran varias horas desde el fallecimiento hasta la autopsia haciendo inviable el reimplante de los xenoinjertos. Cada uno de los 7 xenoinjertos extraídos de los ratones T1 se dividió nuevamente en tres porciones que se implantaron en los tres modelos. De esta forma se reimplantaron 21 xenoinjertos en el pase 1. (7 subcutáneos, 7 intraabdominales y 7 en el páncreas). Figura 36. Desarrollo tumoral en el Pase 1. (S): Subcutáneo; (I): Intraabdominal; (P): Páncreas De los 21 xenoinjertos extraídos de los ratones T1, 15 (71,4%) se han desarrollado en el ratón T2 independientemente del modelo aplicado (Figura 36). PASE 2 (T2T3) Cada uno de los 15 xenoinjertos extraídos de los ratones T2 se dividió nuevamente en tres porciones y se reimplantaron en los tres modelos a excepción de los xenoinjertos procedentes de los ratones T2.S.P.1; T2.S.S.4A y T2.P.S.4A que sólo se implantaron en dos modelos: subcutáneo e intraabdominal. De esta forma, se implantaron 42 xenoinjertos en el Pase 2 (15 subcutáneos, 15 intraabdominales y 12 en el páncreas). Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 89 Figura 37. Desarrollo tumoral en el Pase 2. (S): Subcutáneo; (I): Intraabdominal; (P): Páncreas De los 42 xenoinjertos extraídos de los ratones T2, treinta y cuatro (81%) se han desarrollado en el ratón T3 independientemente del modelo. Tras el sacrificio de los ratones T3 no se realizaron nuevos reimplantes. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 90 Figura 38. Ratones implantados a lo largo de los tres pases H1 T1.S1 T1.I1 T1.P1 T2.S.P1 T3.S.S.P1 T3.I.S.P1 T3.P.S.P.1 T2.I.P.1 T2.S.P.1 T3.S.S.P.1 T3.I.S.P.1 T3.P.S.P.1 H2 T1.S2 T2.S.S2 T3.S.S.S.2 T3.I.S.S.2 T3.P.S.S.2 T2.I.S.2 T3.S.I.S.2 T3.I.I.S.2 T3.P.I.S.2 T2.P.S.2 T1.I2 T2.S.I.2 T3.S.S.I.2 T3.I.S.I.2 T3.P.S.I.2 T2.I.I.2 T3.S.I.I.2 T3.I.I.I.2 T3.P.I.I.2 T2.P.I.2 T3.S.P.I.2 T3.I.P.I.2 T3.P.P.I.2 T1.P2 T2.S.P.2 T2.I.P.2 T3.S.I.P.2 T3.I.I.P.2 T3.P.I.P.2 T2.P.P.2 H3 T1.S3 T1.I3 T1.P3 H4.A T1.SA4 T2.S.S.A4 T3.S.S.S.A4 T3.I.S.S.A4 T2.I.S.A4 T3.S.I.S.A4 T3.I.I.SA4 T3.P.I.S.A4 T2.P.S.A4 T3.S.P.S.A4 T3.I.P.S.A4 T1.I4A T1.P4A H4.B T1.S4B T1.I4B T1.P4B H5 T1.S5 T2.S.S5 T3.S.S.S.5 T3.I.S.S.5 T3.P.S.S.5 T2.I.S5 T2.P.S5 T1.I5 H6 T1.S6 T1.I6 T1.P6 H7 T1.S7 T1.I7 T1.P7 H8 T1.S8 T2.S.S.8 T3.S.S.S.8 T3.I.S.S.8 T3.P.S.S.8 T2.I.S.8 T3.S.I.S.8 T3.I.I.S.8 T3.P.I.S.8 T2.P.S.8 T3.S.P.S.8 T3.I.P.S.8 T3.P.P.S.8 T1.I8 T1.P8 H9 T1. S9 T1.I9 T1.P9 H10 T1.S10 T1.I10 T1.P10 P2: 81% P1: 71,4% P0: 28,1% Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 97 1.5. FACTORES RELACIONADOS CON EL DESARROLLO TUMORAL 1.5.1. Impacto de las características clínicas y epidemiológicas del humano en el desarrollo tumoral Se ha analizado la probabilidad de que una determinada característica de los pacientes estuviera relacionada o no con el implante exitoso en ratones (Tabla 10). Nuestro análisis no identificó una correlación entre la tasa de implante con la edad o el sexo del paciente, el estadio tumoral, la localización del tumor (cabeza, cuerpo o la cola del páncreas o metástasis), presencia de ganglios linfáticos, metástasis a distancia o invasión perineural. Los dos únicos tumores humanos con una anatomía patológica de adenocarcinoma ampular (H2 y H8) y los xenoinjertos derivados de los mismos presentan una tasa de desarrollo tumoral muy elevada, aunque no existen diferencias estadísticamente significativas respecto al ADCP. Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 98 Tabla 10. Impacto de las característica clínicas en el desarrollo del xenoinjerto en el ratón VARIABLES Nº de Pacientes Generan tumores (%) Impacto de las características clínicas Edad <70 años 2 0 (0%) p=0,444 ≥70 años 8 5 (62,5%) Sexo Hombre 5 2 (40%) p=1,0000 Mujer 5 3 (60%) Anatomía Patológica ADCP 9 3 (33,3%) p=0,18 Ampuloma 2 2 (100%) Histología G1 0 0 No es posible su aplicación G2+G3 10 5 (50%) . Estadio ≤Estadio I o II 7 2 (28,6%) p=0,16 >Estadio III o IV 3 3 (100%) Localización del tumor Cabeza 8 4 (50%) p=0,3 Cola 1 0 (0%) Metástasis 1 1 (100%) Invasión Perineural Si 3 1 (33,3%) p=1,0000 No 7 4 (57,1%) Metástasis ganglionares Si 6 3 (50%) p=1,0000 No 4 2 (50%) Metástasis a distancia Si 2 1 (50%) P=1,00000 No 8 4 (50%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 99 1.5.2. Impacto de la anatomía patológica y de la inmunohistoquímica de las muestras humanas en el desarrollo tumoral. Se ha analizado la probabilidad de que una determinada característica de la anatomía patológica (grado de diferenciación, fibrosis, número de mitosis) o de la inmunohistoquímica (Ki67, α-SMA, CD31 o TUNEL) de las muestras humanas estuviera relacionada o no con el desarrollo exitoso del xenoinjerto en ratones. (Tabla 11) Tabla 11. Impacto de las características anatomopatológicas e inmunohistoquímicas de la muestra humana en el desarrollo del xenoinjerto en el ratón VARIABLES Nº de Muestras humanas Generan tumores (%) Impacto ANATOMÍA PATOLÓGICA H&E* (Diferenciación) Bien 2 0 (0%) p=0,45 Moderado 8 4 (50%) Indiferenciado 1 1(100%) Masson (Fibrosis) Leve 4 3 (75%) p=0,24 Moderado 3 1 (33,3%) Elevado 1 1 (100%) Muy elevado 3 0 Nº mitosis (Proliferación) 0 4 0 (0%) p=0,24 1 1 1 (20%) 2 3 1 (20%) 3 2 2 (40%) 4 1 1 (20%) INMUNOHISTOQUÍMICA Ki67 (Proliferación) Baja 4 1 (25%) p=0,54 Alta 7 4 (57,1%) AlfaSMA(Fibrogénesis) Baja 0 0 (0%) No es posible su aplicación Alta 11 5 (45,4%) CD31(Angiogénesis) Baja 2 1 (50%) p=0,72 Alta 9 4 (44,4%) TUNEL (Apoptosis) Baja 3 1 (33,3%) p=0,54 Alta 8 4 (50%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 No hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas entre el desarrollo tumoral en los murinos y las características anatomopatológicas estudiadas en las Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 100 muestras humanas. Tampoco hemos observado diferencias significativas en relación con la expresión de las proteínas estudiadas en la inmunohistoquímica. 1.6. RESULTADOS SEGÚN EL MODELO EXPERIMENTAL 1.6.1. Resultados en el modelo subcutáneo En el modelo subcutáneo se han implantado 33 xenoinjertos de los cuales se han desarrollado 23 tumores (69,9%) (Tabla 12 y Figura 45). Se observa un aumento significativo de los tumores desarrollados en este modelo a medida que avanzan los pases. En el P0 tan sólo 36,4% de los ratones implantados han desarrollado el tumor (4/11), mientras que en el P1 y P2 el 85,7% y el 86,6% desarrollaron tumor (p=0,01). Tabla 12. Tabla de contingencia. Impacto de los pases en el desarrollo del xenoinjerto subcutáneo PASES (%) p PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,010 Desarrollo Tumoral SUBCUTANEO SI 4 (36,4%) 6 (85,7%) 13 (86,7%) 23 (69,7 %) NO 7 (71,9%) 1 (14,3%) 2 (13,3%) 10 (30,3%) Total 11 (100%) 7 (100%) 15 (100%) 33 (100%) Test de exacto de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,0166 Figura 45. Desarrollo de los injertos en el modelo subcutáneo 36,40% 85,70% 86,60% 0% 20% 40% 60% 80% 100% PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,010 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 101 1.6.2. Resultados en el modelo intraabdominal En el modelo intraabdominal se han implantado 34 xenoinjertos de los cuales se han desarrollado 19 tumores (57,6%). (Tabla 13). Nuevamente se aprecian un aumento de los xenoinjertos a medida que avanzan los pases. Aunque la diferencia no es estadísticamente significativa, se encentra muy próximo a la significación. En P0 tan sólo 27,2% de los ratones implantados han desarrollado el tumor (3/11), mientras que en el P1 y P2 el 71,4% y el 73,3% desarrollaron tumor (p=0,058). (Tabla 13 y Figura 46). Tabla 13. Tabla de contingencia. Impacto de los pases en el desarrollo del xenoinjerto intraabdominal PASES (%) p PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,058 Desarrollo Tumoral INTRAABDOMINAL SI 3 (27,3%) 5 (71,4%) 11 (73,3%) 19 (57,6 %) NO 8 (72,7%) 2 (28,6%) 4 (26,7%) 14 (42,4%) Total 11 (100%) 7 (100%) 15 (100%) 33 (100%) Test de exacto de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,0166 Figura 46. Desarrollo de los injertos en el modelo intraabdominal 27,20% 71,40% 73,30% 0% 20% 40% 60% 80% 100% PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,058 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 102 1.6.3. Resultados en el modelo pancreático En el modelo pancreático se han implantado 29 xenoinjertos de los cuales se han desarrollado 16 tumores (55%). (Figura 47). En este modelo se aprecia un aumento significativo del desarrollo tumoral a medida que avanzan los pases. En P0 sólo 20% de los ratones implantados han desarrollado tumor (2/11), mientras que en el P1 y P2 el 57,1% y el 83,3% desarrollaron tumor (p=0,009). (Tabla 14 y Figura 47). Tabla 14. Tabla de contingencia. Impacto de los pases en el desarrollo del xenoinjerto pancreático. PASES (%) p PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,009 Desarrollo Tumoral PÁNCREAS SI 2 (20%) 4 (57,1%) 10 (83,3%) 16 (55,2) NO 8 (80%) 3 (42,9%) 2 (16,7%) 13 (44,8%) Total 11 (100%) 7 (100%) 12 (100%) 29 (100%) Test de exacto de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,0166 Figura 47. Desarrollo del modelo pancreático 20,00% 57,10% 83,00% 0% 20% 40% 60% 80% 100% PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,009 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 103 1.7. ANÁLISIS COMPARATIVO DEL DESARROLLO TUMORAL EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES El análisis global el número de injertos desarrollados en los tres modelos evidenció que el modelos subcutáneo es el más prolífico (69% de los tumores injertados) seguido por el modelo intraabdominal (57,6% desarrollaron tumor) y el modelos pancreático (55% desarrollo tumor). Aunque el modelo subcutáneo es el más desarrollado en los murinos no apreciamos diferencias estadísticamente significativas (p=0,443). (Figura 48 y Tabla 15) Tabla 15. Tabla de contingencia. Impacto de los modelos animales en el desarrollo del xenoinjerto. Modelos Experimentales (%) p SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PANCREAS TOTAL 0,443 Desarrollo Tumoral GLOBAL SI 23 (69,6%) 19 (57,6%) 16 (55%) 58 (61,1 ) NO 10 (30,3%) 14 (42,4%) 12 (41,4%) 37 (38,9%) Total 33 (100%) 33 (100%) 29 (100%) 95 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de χ 2. Figura 48. Desarrollo global de los xenoinjertos en los tres modelos animales 1.7.1. Análisis comparativo del desarrollo tumoral por pase y modelo El análisis del desarrollo tumoral por pase y modelo animal, nuevamente evidencia una tendencia hacia un mayor desarrollo del modelo subcutáneo. Sin embargo no existen diferencias estadísticamente significativas a favor del desarrollo tumoral de este modelo con respecto a los otros dos. (Figura 49 y Figura 50). Se observa en todos los modelos un 69,90% 57,60% 55,00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS p=0,443 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 104 aumento progresivo de los injertos desarrollados a medida que avanzan los pases. (Tabla 16) Tabla 16. Análisis del desarrollo de los xenoinjertos en los tres modelos a lo largo de los pases VARIABLES (Modelos) Nº total de xenoinjertos implantados Nº xenoinjertos desarrollados (%) Impacto PASE 0 Subcutáneo 11 4 (36,4%) p=0,63 Intraabdominal 11 3 (27,3%) Páncreas 10 2(20%) PASE 1 Subcutáneo 7 6 (85,7%) p=0,49 Intraabdominal 7 4 (71,4%) Páncreas 7 4 (57,1%) PASE 2 Subcutáneo 15 13 (86,6%) p=0,17 Intraabdominal 11 11 (73,3%) Páncreas 10 10 (83,3%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,0166 Figura 49. Desarrollo tumoral de los tres modelos a lo largo de los pases Figura 50. Desarrollo tumoral en los tres modelos 36,36% 85,71% 86,67% 27,27% 71,43% 68,75% 20,00% 57,14% 83,33% 0% 20% 40% 60% 80% 100% PASE 0 PASE 1 PASE 2 SUBCUTANEO SI INTRAABDOMINAL SI PÁNCREAS SI 0 2 4 6 8 10 12 14 SUBCUTÁNEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,63 p=0,49 p=0,17 P0 P1 P2 P2 P1 P1 P0 P0 P2 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 105 Como resumen del apartado 1.5. podemos decir que a medida que avanzan los pases se aprecia un aumento progresivo de la tasa de implante exitosos en los tres modelos experimentales. A pesar de que no existe significación estadística para el desarrollo de un modelo a lo largo de los distintos pases se observa una mayor tendencia en el desarrollo del xenoinjerto tumoral en el modelo subcutáneo. (Figura 51). Figura 51. Desarrollo tumoral en los tres modelos a lo largo de los pases 1.7.2. Mortalidad por modelo animal Hemos apreciado una mortalidad global para los modelos subcutáneos del 3,16% (3/95), del 5,26% en modelos intraabdominales (5/95) y del 5,26% en los xenoinjertos pancreáticos (5/95). (Figura 52). Figura 52. Mortalidad global en los tres modelos animales desarrollados. *Naranja: Ratones que fueron éxitus de forma espontánea. *Azul: Ratones que han sido sacrificados 4 6 13 3 5 11 2 4 10 SUBCUTÁNEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS PASE 0 PASE 1 PASE 2 3,16% 5,26% 5,26% 31,58% 29,47% 25,26% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PANCREATICO p=0,63 p=0,17 p=0,49 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 106 También se ha analizado la mortalidad dentro de cada modelo apreciando una mortalidad del 9,1% en el modelo subcutáneo (3/33), 15,2% en el modelo intraabdominal (5/33) y 17,2% en el modelo pancreático (5/29). (Figura 53). El modelo pancreático seguido del intraabdominal es el que presenta mayor mortalidad, aunque tras aplicar el test exacto de χ2 no hemos apreciado una mayor mortalidad en ninguno de los tres modelos (Tabla 17). Tabla 17. Tabla de contingencia. Impacto de la mortalidad en los tres modelos animales desarrollados Mortalidad p SI NO TOTAL 0,619 Modelos (%) Subcutáneo 3 (9,1%) 30 (90,9%) 33 (100%) Intraabdominal 5 (15,2%) 28 (84,8%) 33 (100%) Pancreático 5 (17,2%) 24 (82,8%) 29 (100%) Total 13 (13,6%) 82 (86,3%) 95 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test exacto de χ 2 Figura 53. Mortalidad dentro de cada modelo animal. *Naranja: Ratones que fueron éxitus de forma espontánea. *Azul: Ratones que han sido sacrificados. A continuación se describen las causas de mortalidad por modelos: Tabla 18. Mortalidad en el modelo subcutáneo 9,09% 15,15% 17,24% 90,91% 84,85% 82,76% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PANCREATICO Ratón Supervivencia Causa de la muerte Pase T1.S6 19 semanas Desconocida Pase 0 T2.S.P.2 5 días Sepsis Pase 1 T3.S.I.4A 14 semanas Desconocida Pase 2 p=0,619 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 113 Figura 60. Evolución del peso en los tres modelos empleados (Prueba de Friedman) . Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 114 2. EVALUACIÓN HISTOLÓGICA DE LOS IMPLANTES EN LOS MODELOS EXPERIMENTALES Y EN LOS PASES. 2.1. HEMATOXILINA & EOSINA: GRADO DE DIFERENCIACIÓN 2.1.1. Grado de diferenciación a lo largo de los modelos No hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas entre el grado de diferenciación de las muestras humanas y los modelos experimentales (p=0,20). La mayor parte de las muestras humanas eran moderadamente diferenciadas (72,7%) al igual que las muestras obtenidas de los modelos pancreáticos (50%). En los modelos subcutáneos e intraabdominales, parece existir una mayor tendencia (no significativa) hacia la indiferenciación. (Tabla 24 y Figura 61). Los xenoinjertos de los tres modelos conservan los rasgos de diferenciación histológica provenientes de los humanos. Tabla 24. Tabla de contingencia. Impacto del grado de diferenciación en los modelos animales. Modelos (%) p HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS TOTAL 0,205 H&Eo (grado de diferenciación) Bien 2 (18,2%) 7% (30,4%) 5 (29,4%) 3 (18,8%) 17 (34,3%) Moderado 8 (72,7%) 7 (30,4%) 4 (23,5%) 8 (50%) 27 (40,3%) Poco 1 (9,1%) 9 (39,1%) 8 (47,1%) 5 (31,3%) 23 (34,3%) Total 11 (100%) 23 (100%) 17 (100%) 16 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de χ 2. Figura 61. Grado de diferenciación en los modelos animales. Línea de tendencia morada: refleja la progresión de las muestras indiferenciadas en los tres modelos y el humano 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO SUBCUTÁNEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS BIEN MODERADO INDIFERENCIADO Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 115 2.1.2. Grado de diferenciación a lo largo de los pases No apreciamos diferencias significativas en el grado de diferenciación a lo largo de los pases (p=0,25), por tanto, las muestras mantiene el grado de diferenciación a lo largo de los mismos. Observamos que en el humano la mayoría de las muestras son moderadamente o bien diferenciadas (72,7% moderadas y 18,2% bien diferenciadas) y que a medida que avanzan los pases existe una leve tendencia no significativa hacia la indiferenciación de las muestras murinas (Tabla 25, Figura 62 y Figura 63) Tabla 25. Tabla de contingencia. Impacto del grado de diferenciación a lo largo de los pases. Pases (%) p HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,252 Hematoxilina- Eosina (grado de diferenciación) Bien 2 (18,2%) 1 (12,5%) 5 (33,3%) 9 (27,3%) 17 (25,4%) Moderado 8 (72,7%) 4 (50%) 5 (33,3%) 10 (30,3%) 27 (40,3%) Poco 1 (9,1%) 3 (37,5%) 5 (33,3%) 14 (42,4%) 23 (34,3%) Total 11 (100%) 8 (100%) 15 (100%) 17 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de χ 2. Figura 62. Tendencia del grado de diferenciación a lo largo de los pases. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 BIEN MODERADO INDIFERENCIADO p=0,25 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 116 Figura 63. Grado de diferenciación a lo largo de los pases. Línea de tendencia: Muestra el grado de indiferenciación a lo largo de los pases 2.1.2.1. Análisis de la diferenciación de los modelos a lo largo de los pases No se aprecian diferencias significativas con las muestras humanas. (Figura 64, Figura 65 y Figura 66). Es decir, los tres modelos mantienen el grado de diferenciación a lo largo de los pases. Figura 64. Grado de diferenciación del modelo subcutáneo. Test de exacto de χ 2. La “p” es considerada significativa si p<0,016 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 BIEN MODERADO INDIFERENCIADO Lineal (INDIFERENCIADO) HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BIEN 18,20% 25,00% 33,30% 30,80% MODERADO 72,70% 25,00% 33,30% 30,80% INDIFERENCIADO 9,10% 50,00% 33,30% 38,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% BIEN MODERADO INDIFERENCIADO p=0,45 p=0,25 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 117 Figura 65. Grado de diferenciación del modelo intraabdominal. Test de exacto de χ 2. La “p” es considerada significativa si p<0,016 Figura 66. Grado de diferenciación del modelo pancreático a lo largo de los pases. Test de exacto de χ 2. La “p” es considerada significativa si p<0,016 HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BIEN 18,20% 0,00% 40,00% 30,00% MODERADO 72,70% 50,00% 40,00% 10,00% INDIFERENCIADO 9,10% 50,00% 20,00% 60,00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BIEN 18,20% 0,00% 25,00% 20,00% MODERADO 72,20% 100,00% 25,00% 50,00% INDIFERENCIADO 9,10% 0,00% 50,00% 30,00% -10% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% p=0,53 p=0,085 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 118 2.2. NÚMERO DE MITOSIS POR CAMPO 2.2.1. Número de mitosis y los modelos animales No se observan variaciones en el número de mitosis y los distintos modelos y el humano. No existen diferencias estadísticamente significativas (p=0,086). (Tabla 26 y Figura 67). Sin embargo la “p” se encuentra cercana a la significación y se aprecia un aumento de las mitosis por campo del modelo intraabdominal. Los datos descriptivos aparecen reflejados en la Tabla 26. Tabla 26. Rango promedio del número de mitosis a lo largo de los modelos PASE n Rango Promedio p Nº de mitosis HUMANO 11 24,00 0,086 SUBCUTANEO 23 35,48 INTRAABDOMINAL 16 38,44 PÁNCREAS 16 32,25 El valor de la “p” fue generado a partir del Test de Kruskal-Wallis. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 67. Medianas del nº de mitosis/Modelo Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 119 Tabla 27. Resumen descriptivo del número de mitosis por modelo. Modelos Experimentales Nº de mitosis por modelo SUBCUTANEO (n=33) INTRAABDOMINAL (n=33) PANCREÁTICO (n=29) Media ± error típico 10 ± 2 10± 2 6±2 Desviación típica 12 8 7 Mediana 6 10 3 Percentil 25 1 4 2 Percentil 75 13 14 11 2.2.2. Número de mitosis a lo largo de los pases No se aprecian diferencias estadísticamente significativas (p=0,118) por lo que se mantiene el número de mitosis por campo entre los distintos pases y el humano, aunque parece existir una tendencia al alza no significativa en el número de mitosis a medida que avanzan los pases (Tabla 28 y Figura 68). Los datos descriptivos aparecen reflejados en la Tabla 29. Tabla 28. Rango promedio del número de mitosis a lo largo de los pases. PASE n Rango Promedio p Nº de mitosis HUMANO 11 24,00 0,118 PASE 0 8 36,38 PASE 1 15 32,80 PASE 2 32 36,38 El valor de la “p” fue generado a partir del Test de Kruskal-Wallis. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 68. Medianas del nº de mitosis/Pase Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 120 Tabla 29. Resumen descriptivo del número de mitosis por pases. Pases Nº de mitosis por campo HUMANO (n=11) PASE 0 (n=8) PASE 1 (n=15) PASE 2 (n=33) Media ± error típico 2 ± 0 13 ± 6 7±1 8±2 Desviación típica 1 16 5 9 Mediana 2 9 7 4 Percentil 25 0 2 3 1 Percentil 75 3 15 11 14 Como resumen del apartado 2.2 podemos decir que las muestras murinas mantienen las mitosis por campo respecto a las muestras humanas a lo largo de los pases. Tampoco se aprecia un aumento de las mitosis en ninguno de los tres modelos desarrollados. 2.3. TRICRÓMICO DE MASSON: GRADO DE FIBROSIS 2.3.1. Masson a lo largo de los modelos En los tres modelos se aprecia una disminución de las muestras con fibrosis muy elevada respecto a las muestras humanas (Figura 69). Tras aplicar el test exacto de χ 2 se observan diferencias estadísticamente significación entre el grado de fibrosis de las muestras humanas y los modelos experimentales (p=0,044). (Tabla 30) Las muestras humanas presentan una fibrosis más elevada que el resto de muestras de los modelos animales. El 36,3% de las muestras humanas presentaban una fibrosis muy elevada. Mientras que la mayoría de las muestras obtenidas de los ratones, presentaban un grado de fibrosis leve o moderada. (Figura 69). Tabla 30. Tabla de contingencia. Impacto del grado de diferenciación en los modelos animales Modelos (%) p HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS TOTAL 0,044 Masson (grado de fibrosis) Leve 4 (36,3%) 12 (52,1 %) 6 (35,2 %) 6 (37,5%) 28 (41,8%) Moderado 3 (27,2 %) 5 (21,7%) 9 (52,9%) 3 (18,8 %) 20 (29,9%) Elevado 0 (0%) 4 (17,3%) 2 (11,7%) 5 (31,3%) 11 (16,4%) Muy elevado 4 (36,3%) 2 (8,6%) 0 (0%) 2 (12,5%) 8 (11,9%) Total 11 (100%) 23 (100%) 17 (100%) 16 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 121 Figura 69. Grado de fibrosis en los modelos animales. La línea de tendencia azul representa las muestras con fibrosis muy elevada Debido a la significación estadística alcanzada, se ha analizado de forma individual la fibrosis en cada modelo en comparación con los humanos, para determinar que modelos presentaban diferencias. La “p” se consideró significativa si <0,01667 (Corrección de Bonferroni). No hemos observado diferencias significativas entre el grado de fibrosis en el humano y ninguno de los modelos empleados (subcutáneo p=0,15, intraabdominal p=0,03, páncreas p=0,17), aunque el modelo intraabdominal presenta un valor cercano a la significación (p=0,03). Podemos decir que existe una diferencias estadísticamente significativa entre el grado de fibrosis de las muestras humanas y las murinas (p=0,044). (Tabla 30). Cuando analizamos de forma individual cada uno de los modelos desarrollados, no apreciamos diferencias estadísticamente significativas entre el grado de fibrosis observado en las muestras humanas y cada uno de los modelos analizado individualmente, aunque nuevamente en el modelo intraabdominal se aprecia una “p” cercana a la significación (p=0,03. “p” es considerada significativa si p<0,016). 2.3.2. Masson a lo largo de los pases Tras comparar las muestras a lo largo de los pases, no apreciamos diferencias estadísticamente significativas en el grado de fibrosis (p=0,26). Observamos que la 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO SUBCUTÁNEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS LEVE MODERADO ELEVADO MUY ELEVADO p=0,044 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 122 mayoría de las muestras presentan un grado de fibrosis leve o moderada y que este se mantiene a lo largo de los pases. Se aprecia una disminución no significativa a lo largo de los pases de las muestras con una fibrosis muy elevada. (Figura 70 y Tabla 31). Tabla 31. Tabla de contingencia. Impacto del grado de fibrosis en los pases Pases (%) p HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,26 Masson (grado de fibrosis) Leve 4 (36,3%) 4 (50%) 7 (46,7 %) 13 (39,4%) 28 (41,8%) Moderado 3 (27,3 %) 3 (37,5%) 4 (26,7%) 10 (30,3%) 20 (29,9%) Elevado 0 (0%) 1 (12,5%) 2 (13,3%) 8 (24,2%) 11 (16,4%) Muy elevado 4 (36,3%) 0 (0,0%) 2 (13,3%) 2 (6,1%) 8 (11,9%) Total 11 (100%) 8 (100%) 15 (100%) 33 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 70. Grado de fibrosis a lo largo de los pases La muestras murinas mantienen la fibrosis a lo largo de los pases, aunque existe una tendencia no significativa hacia la disminución de la muestras con un fibrosis muy elevada. 2.3.2.1. Análisis del grado de fibrosis de los modelos a lo largo de los pases Finalmente, el análisis del grado de fibrosis de las muestras de cada uno de los modelos experimentales desarrollados a lo largo de los pases, no evidencia diferencias a lo largo 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% LEVE MODERADO ELEVADO MUY ELEVADO HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 p=0,26 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 129 Tabla 35. Tabla de contingencia. Impacto de la fibrosis en los pases Pases (%) p HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,00001 Fibrogénesis (AlfaSMA) Baja 0 (0%) 4 (50%) 11 (73,3 %) 26 (78,8%) 41 (61,2%) Alta 11 (100%) 4 (50%) 4 (26,7%) 7 (21,2%) 26 (38,8%) Total 11 (100%) 8 (100%) 15 (100%) 33 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 78. Tendencia de la fibrosis a lo largo de los pases La Tabla 35 muestra como a medida que avanzan los pases, la expresión de α-SMA disminuye. La línea de tendencia naranja muestra como en cada pase los xenoinjertos presentan una menor expresión de α-SMA. Para comprobar qué pases presentaban diferencias respecto al humano, comparamos de manera independiente el grado de expresión de α-SMA de cada uno de los pases con los humanos. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,01667 Tras aplicar el test de χ2 o el Test exacto de Fisher, se comprueba que existe una disminución significativa de la fibrogénesis entre el humano y el Pase y el Pase 2. (Pase 1vs humano p=0,00019; Pase 2 vs humano p= 0,000004). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 BAJA ALTA p=0,00001 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 130 En el Pase 0 aunque no se aprecian diferencias estadísticamente significativas la “p” se encuentra cercan a la significación (Pase 0 vs humano p=0,0180). (Figura 79) Figura 79. Análisis de la fibrogénesis entre el humano y los tres pases 3.2.2.1. Análisis de la fibrogénesis de los modelos a lo largo de los pases El análisis de la fibrogénesis de cada modelo desarrollado a lo largo de los tres pases evidenció que existen diferencias estadísticamente significativas en la fibrogénesis en todos los modelos a lo largo de los pases. (Subcutáneo: p=0,000331; Intraabdominal=0,000527; Páncreas=0,000006). (Figura 80, Figura 81 y Figura 82) Se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de α-SMA a medida que avanzan los pases en todos los modelos siendo especialmente llamativa en el modelo pancreático. Figura 80. Expresión de α-SMA del modelo subcutáneo a lo largo de los pases. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016 0,00% 50,00% 100,00% 50,00% HUMANO PASE 0 BAJO ALTO 0,00% 73,30% 100,00% 26,70% HUMANO PASE 1 BAJO ALTO 0,00% 78,80% 100,00% 21,20% HUMANO PASE 2 BAJO ALTO HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 0,00% 50,00% 83,30% 69,20% ALTA 100,00% 50,00% 16,70% 30,80% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% p=0,000004 p=0,00019 p=0,000331 p=0,0180 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 131 Figura 81. Expresión de α-SMA del modelo intraabdominal a lo largo de los pases. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016 Figura 82. Expresión de α-SMA del modelo pancreático a lo largo de los pases. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016 Como resumen del apartado 3.2. (α-SMA: Fibrogénesis) podemos decir que aunque no se aprecian diferencias estadísticamente significativas entre los modelos experimentales en cuanto a la expresión de α-SMA, cuando se comparan con las muestras humanas sí se HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 0,00% 100,00% 40,00% 70,00% ALTA 100,00% 0,00% 60,00% 30,00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 0,00% 0,00% 100,00% 100,00% ALTA 100,00% 100,00% 0,00% 30,80% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% p=0,000527 p=0,000006 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 132 observa una disminución de la fibrogénesis en todos los modelos. Destaca el modelo pancreático, en el que hasta el 87,5% de las muestras presentaron una expresión de α- SMA baja. Por otro lado, hemos apreciado un descenso progresivo de la fibrogénesis entre los distintos pases y el humano, existiendo diferencias estadísticamente significativas (p=0,00035). Cuando analizamos de forma individual cada pase con el humano apreciamos que en el Pase 0 no se aprecian diferencias estadísticamente significativas aunque se acerca a la significación. A lo largo del Pase 1 se alcanza la significación (p=0,001) y en el Pase 2 la disminución de la fibrogénesis es franca (p=0,00001). Finalmente hemos analizado la evolución de la fibrogénesis de cada modelo desarrollado a lo largo de los tres pases desde las muestras humanas de manera individual. Se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de α-SMA a medida que avanzan los pases en todos los modelos siendo especialmente llamativa en el modelo pancreático. 3.3. CD31: ANGIOGÉNESIS 3.3.1. CD31 y los modelos animales Se observa un aumento significativo de las muestras con baja expresión de CD31 en todos los modelos (Tabla 36 y Figura 83). Es decir, se aprecia un descenso de la angiogénesis en todos los modelos siendo más acusado en el modelo pancreático (p=0,0034). Tabla 36. Tabla de contingencia. Impacto de la angiogénesis en los modelos Modelos (%) p HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PANCREÁS TOTAL 0,0034 CD31 Bajo 2 (18,2%) 15 (65,2%) 11 (64,7%) 14 (87,5%) 42 (62,7%) Alto 9 (81,8%) 8 (34,8%) 6 (35,3%) 2 (12,5%) 25 (37,3%) Total 11 (100%) 23 (100%) 17 (100%) 16 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de χ 2. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 133 Figura 83. Grado de angiogénesis en los modelos animales Debido a que apreciamos diferencias estadísticamente significativas entre la angiogénesis en los distintos modelos y el humano, comparamos la expresión de CD31 de cada modelo murino de forma independiente con los humanos. La “p” fue considera significativa si era < 0,01667. Tras aplicar Test de χ 2/ Test exacto de Fisher se aprecia una disminución de la expresión de CD31 estadísticamente significativa en todos los modelos con respecto a las muestras humanas. Es especialmente llamativa en el caso de los modelos pancreáticos en el que se observa una mayoría de muestras con baja expresión de CD31. (Modelo subcutáneo vs humano p=0,0102; Modelo intraabdominal vs humano p=0,0159; Modelo pancreático vs humano p= 0,0008) (Figura 84). Figura 84. Análisis de la angiogénesis de cada modelo con el humano 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS LEVE ELEVADA Lineal (LEVE) 18,20% 65,20% 81,80% 34,80% HUMANO SUBCUTANEO BAJO ALTO 18,20% 64,70% 81,80% 35,30% HUMANO INTRAABDOMINAL BAJO ALTO 18,20% 87,50% 81,80% 12,5% HUMANO PÁNCREAS BAJO ALTO p=0,0034 p=0,0102 p=0,0159 p=0,0008 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 134 3.3.2. CD31 a lo largo de los pases Se aprecia un descenso de la angiogénesis en los tres pases siendo más acusado en P1 (p=0,008). En el humano la mayoría de las muestras presentaban una expresión de CD31 alta, presentando una disminución de la angiogénesis significativa especialmente durante el P1 y el P2 (Tabla 37 y Figura 85). Tabla 37. Tabla de contingencia. Impacto de la angiogénesis en los pases Pases (%) p HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 TOTAL 0,008 CD31 Baja 2 (18,2%) 5 (62,5%) 12 (80 %) 23 (69,7%) 42 (62,7%) Alta 9 (81,8%) 3 (37,5%) 3 (20%) 10 (30,3%) 25 (37,3%) Total 11 (100%) 8 (100%) 15 (100%) 33 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 85. Tendencia de la expresión de CD31 a lo largo de los pases Debido a la significación estadística entre el descenso de la angiogénesis a la lo largo de los pases (p=0,008), para determinar que pases presentaban diferencias respecto al humano, comparamos la expresión de CD31 en cada pase de forma independiente con los humanos. Aplicamos el test de χ 2 o el test exacto de Fisher. La correlación se consideró significativa si la p<0,01667. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE 1 PASE 2 LEVE ELEVADA p=0,008 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 135 Se aprecia que en el Pase 0 se mantienen características similares al humano aunque existe una tendencia hacia el aumento de la muestras con una expresión de CD31 baja (p=0,073). Sin embargo tanto en el Pase 1 como en el Pase 2 existen diferencias estadísticamente significativas que ponen de manifiesto una menor expresión de CD31 en las muestras murinas respecto al humano (p=0,0017 en el Pase 1 y p= 0,0045 en el Pase 2) (Figura 86). Figura 86. Análisis de la angiogénesis de cada pase con el humano 3.3.2.1. Análisis de la angiogénesis de los modelos a lo largo de los pases Se observa que no existen diferencias estadísticamente significativas en la angiogénesis a lo largo de los pases en el modelo subcutáneo e intraabdominal. (Subcutáneo: p=0,049 e Intraabdominal p=0,069). Sin embargo estas se encuentran cerca de la significación estadística. Se consideró significativo si p < 0,016. (Figura 87 y Figura 88) Por el contrario el modelo pancreático, presenta diferencias significativas a lo largo de pases observando un aumento de las muestras con baja expresión de CD31 a medida que avanzan los pases (p=0,001601) (Figura 89). 18,20% 62,50% 81,80% 37,50% HUMANO PASE 0 BAJO ALTO 18,20% 80,00% 81,80% 20,00% HUMANO PASE 1 BAJO ALTO 18,20% 69,70% 81,80% 30,30% HUMANO PASE 2 BAJO ALTO Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 136 Figura 87. Expresión de CD31 a lo largo de los pases en el modelo subcutáneo. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016 Figura 88. Expresión de CD31 en el modelo intraabdominal a lo largo de los pases. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016 HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 18,20% 50,00% 83,30% 61,50% ALTA 81,80% 50,00% 16,70% 38,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 18,20% 50,00% 80,00% 60,00% ALTA 81,80% 50,00% 20,00% 38,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% p=0,0049 p=0,069 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 137 Figura 89. Expresión de CD31 del modelo pancreático a lo largo de los pases. Línea intermitente azul: tendencia de la muestras con expresión alta. Test de exacto de Fisher. Se consideró significativo si p < 0,016. Se observa una tendencia hacia la disminución de la expresión de CD31 a medida que avanzan los pases en todos los modelos. Pero tan sólo en el modelo pancreático se aprecia una disminución significativa de las muestras con alta expresión de CD31 a lo largo de los pases, es decir, se aprecia una disminución significativa de la angiogénesis. 3.4. TUNEL: APOPTÓSIS 3.4.1. TUNEL y los modelos animales. Hemos apreciado diferencias estadísticamente significativas entre el grado de apoptosis en el humano y el resto de modelos animales (p=0,0018). La mayoría de las muestras humanas presentaros una apoptosis elevada (n=8; 72,7%) lo que contrasta con los modelos experimentales en los que la mayoría de las muestras presentaron una apoptosis leve. Además, destaca el modelo pancreático en el que hasta el 93,8% de las muestras presentaron un a apoptosis leve (Tabla 38 y Figura 90). HUMANO PASE 0 PASE1 PASE 2 BAJA 18,20% 100,00% 75,00% 90,00% ALTA 81,80% 0,00% 25,00% 10,00% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% p=0,00160 Mercedes Rubio-Manzanares Dorado VII. Resultados Pág. 138 Tabla 38. Tabla de contingencia. Impacto de la apoptosis en los modelos Modelos (%) p HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PANCREÁS TOTAL 0,0018 TUNEL Bajo 3 (27,3%) 16 (69,6%) 14 (82,4%) 15 (93,8%) 48 (71,6%) Alto 8 (72,7%) 7 (30,4%) 3 (17,6%) 1 (6,3%) 19 (28,4%) Total 11 (100%) 23 (100%) 17 (100%) 16 (100%) 67 (100%) El valor de la “p” fue generado a partir del Test de exacto de Fisher. Se alcanzó la significación estadística con una p<0,05 Figura 90. Grado de apoptosis en los modelos animales Debido a que apreciamos diferencias estadísticamente significativas entre la apoptosis en los distintos modelos y el humano, comparamos la expresión de TUNEL de cada modelo de forma independiente con los humanos. La “p” fue significativa si era < 0,01667. Tras aplicar Test de χ2/ Test exacto de Fisher se aprecia una disminución de la expresión de TUNEL estadísticamente significativa en los modelos intraabdominales y pancreáticos con respecto a las muestras humanas. Es especialmente llamativa en el caso de los modelos pancreáticos en el que se observa una mayoría de muestras con baja expresión de TUNEL. (Modelo subcutáneo vs humano p=0,03; Modelo intraabdominal vs humano p=0,006; Modelo pancreático vs humano p= 0,0005) (Figura 91). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% HUMANO SUBCUTANEO INTRAABDOMINAL PÁNCREAS BAJO ALTO Lineal (BAJO) p=0,0018