Efecto de la creatina sobre la neuroinflamación

EFECTO DE LA CREATINA SOBRE LA NEUROINFLAMACIÓN FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA ANA ROCÍO INFANTES GALLARDO 2 FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA TRABAJO DE FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA EFECTO DE LA CREATINA SOBRE LA NEUROINFLAMACIÓN TRABAJO EXPERIMENTAL Sevilla, 1 de julio de 2021 ANA ROCÍO INFANTES GALLARDO TUTORES: PABLO GARCÍA MIRANDA Y MARIA JOSE PERAL RUBIO DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA 3 ÍNDICE RESUMEN ......................................................................................................................... 4 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 5 1. Enfermedad inflamatoria intestinal ..................................................................... 5 2. Eje intestino-cerebro ............................................................................................ 8 3. Inflamación intestinal y neuroinflamación .......................................................... 9 4. La creatina ............................................................................................................. 9 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 13 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 14 1. Aparatos .............................................................................................................. 14 2. Animales de experimentación y material biológico .......................................... 14 3. Inducción de la inflamación mediante DSS ........................................................ 15 4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real ............................. 16 5. Diseño experimental ........................................................................................... 17 6. Presentación de los resultados y análisis estadístico ........................................ 18 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 19 1. Efecto de la creatina sobre el peso en el desarrollo de la colitis crónica ......... 19 2. Efecto de la creatina sobre la neuroinflamación en hipocampo y corteza prefrontal .................................................................................................................... 22 CONCLUSIÓN .................................................................................................................. 28 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 29 4 RESUMEN La colitis ulcerosa es una enfermedad intestinal inflamatoria (EII) que cursa con pérdida de peso, diarrea y sangrado rectal. Cuando se daña la barrera intestinal, se van a producir mediadores proinflamatorios en la zona, los cuales llegarán, vía nervio vago o vía sanguínea, al sistema nervioso central (SNC) dando lugar a neuroinflamación. Esta neuroinflamación podría derivar en enfermedades neurodegenerativas, trastornos cognitivos o de comportamiento. El objetivo de este trabajo fue estudiar si la colitis crónica produce neuroinflamación y cómo la creatina puede servir como neuroprotector o disminuir la sintomatología. Para ello, se utilizó un modelo de colitis crónica en ratas mediante la administración de tres ciclos de dextrano sulfato sódico (DSS) al 5%. Se evaluó diariamente la progresión de la enfermedad y, al finalizar el tratamiento, marcadores inflamatorios en el hipocampo y la corteza prefrontal mediante PCR en tiempo real. Los resultados muestran que el DSS produjo colitis debido a las manifestaciones clínicas que mostraron los animales. También se observó neuroinflamación, un aumento de la expresión de marcadores inflamatorios como la interleuquina 6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleuquina 1β (IL-1β) y la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). La suplementación con creatina atenuó las manifestaciones clínicas y disminuyó la expresión de TNF-α, IL-1β e iNOS en el hipocampo. Sin embargo, en la corteza prefrontal solo se observó una tendencia de la creatina a disminuir la iNOS. Las conclusiones obtenidas en este estudio son preliminares pero los datos apuntan a que la creatina podría proteger del desarrollo de la colitis crónica y de la neuroinflamación, principalmente en el hipocampo. PALABRAS CLAVE: Creatina, colitis ulcerosa, neuroinflamación, neuroprotección 5 INTRODUCCIÓN 1. Enfermedad inflamatoria intestinal Las enfermedades inflamatorias intestinales son unas afecciones crónicas e idiopáticas caracterizadas por periodos de remisión y recaídas donde se destruye el tejido intestinal (Ramos and Papadakis, 2018). Dentro de esta, se incluye la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La colitis ulcerosa cursa con inflamación sobre la mucosa del colon y el recto, la cual puede llegar a extenderse por todo el intestino grueso con el paso del tiempo (Figura 1). Los síntomas clínicos que se manifiestan son la pérdida de peso, diarrea, sangrado rectal, fiebre, dolor abdominal, anemia y pérdida del apetito. La patogénesis es multifactorial e incluye factores etiopatogénicos medioambientales, la microbiota intestinal, la genética y el factor principal, la desregulación de la respuesta inmune. El tratamiento principal para la colitis ulcerosa son los ácidos 5-aminosalicilicos, esteroides e inmunosupresores. A veces, se requiere de colostomía cuando la patología es muy refractaria (Ungaro et al., 2018). Figura 1. Localización de la inflamación en la colitis ulcerosa (Duelo, 2020). Cuando existe esta patología, aumenta la permeabilidad de la barrera produciendo una infiltración de células inmunes innatas (macrófagos, neutrófilos, células dendríticas y natural killer) y adaptativas (linfocitos B y T) a la lámina propia. Los macrófagos y las células dañadas van a interaccionar, provocando una respuesta inmune excesiva y haciendo que se secreten mediadores proinflamatorios como las interleuquinas (IL-6, IL- 1β), TFN-α, etc… (Lertnimitphun et al., 2019). 6 El tracto gastrointestinal es una amplia área de exposición a antígenos. La barrera intestinal (Figura 2) tiene como función evitar la entrada de sustancias nocivas o patógenos, asegurando, al mismo tiempo, la entrada de nutrientes para que la homeostasis interna no se vea afectada. Figura 2. Componentes de la barrera intestinal. Dibujo esquematizado de los componentes de la barrera intestinal. Realizado en BioRender.com. Esta barrera está compuesta por varias capas. El primer contacto con los antígenos se produce en las capas de moco, donde se encuentra, entre otras, la microbiota intestinal que ayuda a mantener el epitelio y limita la colonización de microorganismo patogénicos. Tras esta, se localizan los colonocitos o células epiteliales intestinales que se sitúan en una sola capa de células polarizadas que se renuevan continuamente ejerciendo función de revestimiento e inmunológica. En esta misma capa hay presente otras células: Células de Goblet que secretan el moco, células Paneth que secretan defensinas, células cromafines que secretan hormonas y neuropéptidos, células M especializadas en la captación de antígenos y las células madre, progenitoras de las 7 células epiteliales. Otro componente importante del epitelio son las uniones intracelulares, cuya función es controlar el paso de moléculas. Bajo el epitelio, se sitúa la lámina propria, donde se encuentran tanto las células linfoides inductoras como células dendríticas, mastocitos o macrófagos y poblaciones de leucocitos, que son los efectores. Le sigue el tejido conectivo y el sistema nervioso entérico (SNE). El SNE permite el control de la homeostasis intestinal, entre otras formas, gracias a la actividad inmunológica y la microcirculación de neurotransmisores, citoquinas, factores de crecimiento y diferentes moléculas reguladoras (Salvo-Romero et al., 2015). La colitis ulcerosa es una enfermedad inflamatoria intestinal pero que, además, puede manifestar síntomas extraintestinales con una prevalencia del 6-47% de los casos de EII. Estas manifestaciones son problemas asociados a la actividad intestinal (artritis, aftas bucales, … ) o a la no actividad (uveítis, pioderma gangrenoso, … ), enfermedades autoinmunes no específicas de las EII (tiroides, anemia, vitíligo, diabetes mellitus, … ), complicaciones atribuidas a alteraciones metabólicas y anatómicas (osteopatía, tromboembolismos, nefrolitiasis, … ) (Vavricka et al., 2015) y por último, alteraciones en el cerebro, dando como resultado un aumento del riesgo de padecer depresión, ansiedad, estrés o déficits cognitivos (Abautret-Daly et al., 2017). Para estudiar la colitis ulcerosa, existe un modelo animal de colitis inducido por la administración al 5% de DSS en agua. Este modelo es el más utilizado y la enfermedad transcurrirá con una sintomatología bastante similar a la de los humanos. El mecanismo de acción de este compuesto se basa en el daño al epitelio intestinal permitiendo así la diseminación de elementos proinflamatorios. La utilización del modelo de colitis inducido por DSS tiene como ventaja sobre otros modelos la rapidez de la inducción, que es un modelo simple, bastante reproducible y además fácil de controlar (Eichele and Kharbanda, 2017). De acuerdo con lo observado en humanos, la comunicación intestino-cerebro también explicaría que en modelos animales de colitis aguda hay alteraciones en la conducta en estos animales (Chen et al., 2015; Hassan et al., 2014; Matisz et al., 2020; Nyuyki et al., 2018). 8 2. Eje intestino-cerebro Entre el sistema nervioso central y el tracto gastrointestinal existe una comunicación bidireccional denominada “eje intestino-cerebro” (Figura 3) que va a tener relevante efecto en el SNC sobre comportamientos y patologías de la función cognitivas. En esta comunicación participa el sistema nervioso entérico, sistema nervioso autónomo, la médula espinal y el eje HPA (hipotálamo-pituitaria-glándula adrenal) (Maqsood and Stone, 2016). La señal eferente al intestino es mediada a través del sistema nervioso autónomo y el eje HPA, modificando las secreciones, la motilidad del tracto digestivo o la permeabilidad de la barrera intestinal, entre otras (Abautret-Daly et al., 2017). Las señales aferentes del intestino se producen por dos vías: una neuronal, donde participa el nervio vago, y una hormonal por circulación sanguínea (Maqsood and Stone, 2016). Los síntomas extraintestinales como los trastornos de la conducta observados en pacientes con EII podrían explicarse por esta comunicación intestino-cerebro. Los mediadores inflamatorios que se liberan en el intestino podrían llegar al SNC por vía vago o sanguínea (Do and Woo, 2018). Figura 3. Eje intestino-cerebro esquematizado. Se muestran la interacción del eje en caso de daño en la barrera intestinal. Dibujo realizado en BioRender.com. 9 3. Inflamación intestinal y neuroinflamación Si se produce una alteración de la barrera intestinal, es necesaria una rápida respuesta inflamatoria. El primer paso tras esto es la activación del sistema inmune innato, dando lugar a la respuesta inmune inespecífica llevada a cabo por las células epiteliales, células dendríticas, macrófagos y células Natural Killer (Salvo-Romero et al., 2015). En el caso de que se produzca un proceso inflamatorio intestinal, las moléculas mediadoras de la inflamación viajarán a través del nervio vago o la sangre (Figura 3) hacia la barrera hematoencefálica, para llegar al cerebro. En un modelo animal de colitis crónica se ha observado un aumento de la expresión de IL-6, IL-1β, iNOS o TNF-α, en hipocampo (Zonis et al., 2015). Cuando estos mediadores proinflamatorios llegan al cerebro, se va a producir la activación de los macrófagos del SNC, la microglía y los astrocitos, los cuales producirán sobre todo IL-6 e iNOS, dando lugar a neuroinflamación. Si este mecanismo de defensa sufre una activación continuada, se produce un estado de neurotoxicidad que conducirá a daño cerebral. Esta lesión podría derivar en alteraciones del sistema nervioso o enfermedades neurodegenerativas como es el caso del Alzheimer o la enfermedad de Parkinson entre otras (Kempuraj et al., 2017). 4. La creatina (Cr) La creatina es un compuesto orgánico nitrogenado que está presente en el músculo esquelético en mayor parte, pero también en el cerebro, órgano de alta actividad metabólica (Roschel et al., 2021). Los niveles de creatina corporal se mantienen mediante síntesis endógena o se obtienen de la dieta (Figura 4): El primer paso de la síntesis endógena de creatina se produce mayoritariamente en el riñón, donde la enzima glicina-amidinotransferasa (AGAT) transfiere el grupo amino de una arginina a una glicina, dando lugar a guanidinoacetato (GAA) y L-ornitina. A continuación, la enzima N-guanidinoacetato metiltransferasa (GAMT) cataliza en el hígado la reacción de metilación de GAA, cuyo grupo metilo es cedido por S-adenosilmetionina. Esta reacción dará lugar a la creatina (Brosnan and Brosnan, 2016). Por otro lado, la mayor fuente de creatina en la dieta se encuentra en la carne roja y el pescado. La creatina que llegue en esta forma se absorberá en el 16 4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real Se extrae el ARN total del hipocampo y la corteza prefrontal mediante el kit comercial “RNeasy® Mini” (Método Quiagen). Mediante espectrofotometría con absorbancia 260 nm y 280 nm y electroforesis en gel de agarosa al 1% se obtiene la pureza, concentración e integridad del ARN total. Este ARN se somete a una transcripción reversa. Para ello se utilizará 1 µg de ARN total y el kit comercial “QuantiTect® Reverse Transcription” (Método Quiagen), obteniendo así el ADN complementario (ADNc). Para la amplificación se usó 1 µl de ADNc problema, 0,4 µM de cebadores específicos y 10 µl de la enzima SsoFastTM EvaGreen® Supermix (Bio-Rad). Se van a utilizar en todos los casos blancos sin ADNc. El gen de referencia utilizado para normalizar los valores de ARNm en las muestras fue la β-actina. Utilizando el programa informático PerlPrimer v1.1.14 (Parkville, Vic., Australia) y de acuerdo con la secuencia de ADNc disponible en la base de datos Genbank, se diseñaron los cebadores resumidos en la tabla 2. Gen Sentido (5’ … 3’) Antisentido (5’… 3’) IL-6 ACAAGTCGGAGGCTTAATTACA GAAAAGAGTTGTGCAATGGCAA IL-1β CTTTCGACAGTGAGGAGAATGAC CCACAGCCACAATGAGTGAC TNF- α CTCACACTCAGATCATCTTCTC TGGTATGAAATGGCAAATCGG iNOS GATGTTGAACTACGTCCTATCTCC GTCTTGGTGAAAGCGGTGTTC β-actina ACCCACACTGTGCCCATCTACGGAACCGCTCATTGCC Tabla 2. Cebadores específicos para PCR en tiempo real. El gen de β-actina se utiliza como gen de referencia. La amplificación realizada en el termociclador MiniOpticonTM (Bio-Rad) va a seguir el siguiente protocolo: ▪ 3 minutos a 95ºC para desnaturalizar el ADN ▪ 35 ciclos de 40 segundos a 95ºC ▪ 40 segundos a 58ºC 17 ▪ 40 segundos a 72ºC ▪ 3 minutos a 72ºC (etapa de elongación). Tras esto, se procede al análisis de curvas de disociación. Se calentó la muestra desde los 65ºC hasta los 95ºC en intervalos de 1ºC y se monitorizó la fluorescencia. Esta curva representa la temperatura de separación de las cadenas de ADN o temperatura de fusión frente a la fluorescencia emitida por el producto de PCR. Cada fragmento de ADN amplificado tiene una temperatura de fusión especifica. Si solo se obtiene un pico durante este ensayo, corresponde con un único producto de PCR. La PCR se hace por triplicado para cada ADNc. Se determinó para cada muestra el número de ciclos necesarios para alcanzar el nivel de fluorescencia umbral (Ct). Los resultados se analizan usando el método comparativo de Ct en una hoja de cálculo (Gene Expressión Macro) proporcionada por BioRad. 5. Diseño experimental Las ratas fueron separadas en cuatro grupos (figura 6) de forma aleatoria: ➢ Grupo agua, donde solo se administra agua. ➢ Grupo agua + creatina. A este grupo se le administra a diario una cantidad de 0,5 g de creatina por cada kilogramo de peso. Esto se calcula según el peso de las ratas y el volumen bebido por estas. ➢ Grupo DSS. Este recibirá tratamiento con DSS al 5% en agua. El día 14 empiezan con el tratamiento y se completan tres ciclos intercalándolos con una semana de descanso. ➢ Grupo DSS + creatina. Este recibirá tratamiento con DSS al 5% en agua. El día 14 empiezan a tomar el tratamiento y se completan tres ciclos intercalándolos con una semana de descanso a la vez que ingiere creatina a dosis de 0,5 g/kg/día durante todo el periodo. La ingesta de agua fue controlada a diario para realizar el cálculo exacto de la dosis de creatina y DSS. 18 H2O Creatina H2O DSS H2O DSS H2O DSS Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Figura 6. Procedimiento del ensayo. Imagen creada en BioRender.com. 6. Presentación de los resultados y análisis estadístico Los resultados fueron presentados como la media, acompañada de su error estándar. La comparación estadística entre los diferentes grupos experimentales fue realizada mediante un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías y el test de Tukey (p<0.05). Para el análisis estadístico se ha utilizado el programa informático GraphPad Prism 8.4.2. 19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para llevar a cabo los objetivos planteados, se ha valorado: 1º - la evolución de la colitis ulcerosa inducida por el tratamiento con DSS al 5% en ratas ; 2º - el efecto de la creatina sobre el desarrollo de la colitis ulcerosa inducida por la administración de DSS ; 3º - el efecto de la inflamación del colon sobre la expresión de IL-6, TNF-α, IL-1β y iNOS en hipocampo y corteza prefrontal y 4º - el efecto neuroprotector de la creatina frente a la neuroinflamación provocada por la inflamación intestinal. 1. Efecto de la creatina sobre el peso en el desarrollo de la colitis crónica La evolución de la colitis crónica se analizó mediante un registro de síntomas característicos de la inflamación y con el cálculo del índice de actividad de la enfermedad (DAI). Este índice incluye la evaluación de la ganancia de peso corporal junto con la consistencia de las heces y el sangrado rectal. A continuación, primero se representan los pesos relativos en la siguiente gráfica (figura 7), que indican la ganancia de peso a lo largo de todo el periodo de suplementación con creatina y/o tratamiento con DSS. H2O Creatina H2O DSS H2O DSS H2O DSS Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Figura 7. Evolución del peso corporal de cada grupo experimental. Los datos se expresan como ganancia de peso en % del peso corporal inicial (100%) de cada rata. Media ± EEM (n=6). El 0 100 200 300 400 500 600 010 20 30 40 50 PESO CORPORAL (%) DÍAS Agua Agua+creatina DSS DSS+creatina ab ab ab ab ab ab ab ab ab 20 ANOVA reveló un efecto del DSS sobre la ganancia de peso (p<0,001). Test de Tukey: p< 0,05, a vs agua, b vs. agua+Creatina. Según la figura 7, en las ratas sin tratamiento de DSS, se observa que la suplementación con creatina no ha afectado a la ganancia de peso de las ratas. Comparando el grupo agua, al cual solo se le suministra agua, frente al grupo con suplementación con creatina, se ve que ambos han ido aumentando su peso de forma constante hasta casi seis veces su peso inicial (aproximadamente el 550%). Solo se podría destacar una ligera diferencia en la última semana del tratamiento, donde se aprecia que el grupo agua+creatina está muy levemente por encima del grupo agua, aunque de forma no significativa. Hay algunos estudios donde la suplementación con creatina a corto plazo produce un aumento extra de peso (Ferrante et al., 2000; Roy and Lee, 2016). No obstante, y de acuerdo con nuestros resultados, Wallimann and Harris (2016), no observan ninguna variación en el peso corporal. La primera semana, los cuatro grupos tienen un aumento prácticamente similar. A partir del día catorce (cuando se comienza a tratar con DSS), empiezan a variar, haciéndose notable la diferencia entre los grupos control (agua y agua+creatina) y los dos grupos tratados con DSS. Si el aumento de peso en los grupos agua y agua+creatina es alrededor del 550%, en los animales tratados con DSS solo llegará al 400% como pico máximo. Esto se debe a que las ratas tratadas con DSS no ganan peso al nivel de los grupos control debido a la colitis inducida. Además de que no existe tal ganancia normal de peso, se puede observar una leve pérdida tras dos ciclos de tratamiento con DSS. Según describe Zaremba and Smoleński (1999), la menor ratio de ganancia de peso se observa después del inicio de los síntomas. Cuando los síntomas desaparecen, el ritmo de ganancia de peso será algo mayor, pero seguirán siendo más bajo que el de los grupos control. En el caso de los grupos de animales tratados con DSS, se observa una evolución del peso similar en ambos, siendo esta siempre inferior a los grupos control. Sin embargo, la última semana (cuando la enfermedad ya se hace crónica) se aprecia una leve diferencia en el peso, donde el grupo DSS+creatina se encuentra ligeramente por encima 21 del grupo DSS, aunque estos datos no fueron significativos. En modelos de colitis aguda se ha visto que la suplementación con creatina disminuye la pérdida de peso (Glover et al., 2013; Turer et al., 2017). En relación con el DAI, se obtienen los siguientes datos, donde se puede apreciar el desarrollo de la patología intestinal inducida (figura 8). H2O Creatina H2O DSS H2O DSS H2O DSS Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Cr DSS + Cr Figura 8. Índice de Actividad de la Enfermedad durante el procedimiento. Media ± EEM (n=6). El ANOVA reveló un efecto del DSS y de la creatina en relación con la sintomatología (p<0,001). Test de Tukey: p< 0,05, a vs agua, b vs. agua+Creatina, c vs. DSS. Se diferencian claramente tres picos donde se observa un aumento de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Esto sucede durante los tres ciclos de tratamiento con DSS, más concretamente, alcanzando máximos en los días 21, 35 y 47 del tratamiento. Si comparamos la figura 7 con la figura 8, se aprecia que los puntos donde existe pérdida de peso coinciden con aquellos días en los que se alcanza un pico máximo de sintomatología de cada ciclo. El segundo pico que corresponde al segundo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 010 20 30 40 50 DAI DÍAS Agua Agua+creatina DSS DSS+creatina ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab c c c 22 ciclo de tratamiento es el que alcanza mayor valor, lo que indica que se produjeron síntomas más severos. Tras el primer ciclo, se van a recuperar rápidamente, volviendo a un DAI = 0 en dos días. Sin embargo, después de los siguientes ciclos, la recuperación fue bastante más lenta. Durante la mayoría del periodo de tiempo que dura el ensayo, las ratas suplementadas con creatina (grupo DSS+Creatina) van a tener un DAI o una manifestación de la sintomatología menor que las no suplementadas (grupo DSS), siendo la diferencia significativa en los días 21, 35 y 47. Por tanto, se podría razonar que la suplementación con creatina disminuyó la severidad de los síntomas de la colitis crónica inducida con DSS. La atenuación de los síntomas debida a la suplementación con creatina es descrita por Roy and Lee (2016) en un caso clínico, y en Wallimann et al. (2021) donde muestran que además, disminuye el dolor abdominal y la inflamación en el colon. 2. Efecto de la creatina sobre la neuroinflamación en hipocampo y corteza prefrontal Para evaluar el efecto de la creatina sobre el SNC, se realiza un análisis de PCR a tiempo real para medir la expresión relativa de las citoquinas IL-6, IL-1β, TNF-α y el marcador inflamatorio iNOS en hipocampo y corteza prefrontal. En la medida de expresión de la IL-6 en el hipocampo (figura 9) no se observan diferencias significativas entre los grupos. Es decir, no hay diferencias entre grupos control y DSS, ni la creatina ha producido ningún efecto frente a la neuroinflamación. Sin embargo, en la corteza prefrontal, sí se aprecian diferencias en la expresión de esta citoquina. En el grupo DSS la expresión de IL-6 es aproximadamente el doble que la expresión en el grupo agua y el grupo agua+creatina. Tampoco se observa un efecto de la creatina. 23 Figura 9. Expresión relativa de ARNm de la citoquina proinflamatoria IL-6 en el hipocampo y corteza prefrontal. Media ± EMM (n=6). El ANOVA reveló un efecto del DSS sobre la abundancia relativa del ARNm de la IL-6 en la corteza prefrontal (p<0,001). Test de Tukey: p< 0,05, a vs agua, b vs. agua+Creatina, c vs. DSS. Al analizar el gen para la citoquina TNF-α en el hipocampo (figura 10), se detectan diferencias significativas. Se observa un aumento en la expresión de esta citoquina en el grupo DSS, indicativo de un proceso inflamatorio, que no se da en el caso de los grupos controles (agua y agua+creatina). También se podría sugerir que la creatina ha prevenido la neuroinflamación derivada de la colitis inducida por DSS, ya que los niveles de expresión relativa en el grupo DSS+creatina son significativamente inferiores al grupo DSS. Además, a pesar de que el grupo DSS+creatina esta levemente por encima los niveles de expresión respecto a los grupos en los que no se ha inducido la colitis, no existen diferencias significativas. En cambio, en la expresión relativa de TNF-α para la corteza prefrontal no hay ninguna diferencia significativa respecto a ninguno de los grupos. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 HIPOCAMPO 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 CORTEZA PREFRONTAL a,b Expresión relativa de ARNm de IL-6 24 Figura 10. Expresión relativa de ARNm de la citoquina proinflamatoria TNF-α en el hipocampo y corteza prefrontal. Media ± EMM (n=6). El ANOVA reveló un efecto del DSS y de la creatina sobre la abundancia relativa del ARNm de TNF-α en el hipocampo (p<0,001). Test de Tukey: p< 0,05, a vs agua, b vs. agua+Creatina, c vs. DSS. Por otro lado, en el análisis de IL-1β en hipocampo, se van a detectar diferencias significativas entre varios grupos (Figura 11). En el grupo DSS se observa una expresión relativa mayor que en el resto de los grupos. La expresión en el grupo DSS+creatina es similar a los grupos controles indicando un efecto neuroprotector por parte de la creatina. Respecto a la expresión de IL-1β en la corteza prefrontal, no se aprecian diferencias significativas entre los grupos experimentales. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 a,b c HIPOCAMPO 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 CORTEZA PREFRONTAL Expresión relativa de ARNm de TNF-α 25 Figura 11. Expresión relativa de ARNm de la citoquina proinflamatoria IL1-β en el hipocampo y corteza prefrontal. Media ± EMM (n=6). El ANOVA reveló un efecto del DSS y de la creatina sobre la abundancia relativa de IL1-β en el hipocampo (p<0,001). Test de Tukey: p< 0,05, a vs agua, b vs. agua+Creatina, c vs. DSS. Por último, se midió la expresión del marcador inflamatorio y de estrés oxidativo iNOS (Figura 12). Como se muestra en la gráfica, la expresión de iNOS en hipocampo y corteza prefrontal en el grupo DSS es significativamente superior al resto de grupos. Además, en el hipocampo, la expresión relativa en el caso de las ratas del grupo DSS+creatina es menor que en el grupo DSS y semejante a los grupos control, e incluso, levemente inferior (aunque no es significativo). Esto supondría una protección por parte de la creatina sobre la inflamación, bajando la expresión a los niveles normales. Sin embargo, a nivel de corteza prefrontal no existe esa diferencia. Solo hay una tendencia a disminuir la expresión de iNOS y, por tanto, no permite afirmar que la creatina sea neuroprotectora en esta zona del cerebro. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 a,b c HIPOCAMPO 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 CORTEZA PREFRONTAL Expresión relativa de ARNm de IL-1β 32 Vavricka SR, Rogler G, Gantenbein C, Spoerri M, Vavricka MP, Navarini AA, et al. Chronological Order of Appearance of Extraintestinal Manifestations Relative to the Time of IBD Diagnosis in the Swiss Inflammatory Bowel Disease Cohort. Inflamm Bowel Dis 2015;21:1794–800. https://doi.org/10.1097/MIB.0000000000000429. Wallimann T, Hall CHT, Colgan SP, Glover LE. Creatine supplementation for patients with inflammatory bowl diseases: A scientific rationale for a clinical trial. Nutrients 2021;13:1–14. https://doi.org/10.3390/nu13051429. Wallimann T, Harris R. Creatine: a miserable life without it. Amino Acids 2016;48:1739– 50. https://doi.org/10.1007/s00726-016-2297-x. Wang J, Zhang C, Guo C, Li X. 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