Papel de Reelina y ADAMTS2 en modelos experimentales de esquizofrenia en ratón

TESIS DOCTORAL Papel de Reelina y ADAMTS2 en modelos experimentales de esquizofrenia en ratón Memoria presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla por Celia Martín Cuevas Directores: Prof. Benedicto Crespo Facorro Dra. Ana Carmen Sánchez Hidalgo Tutor: Prof. José López Barneo Universidad de Sevilla Sevilla, 2024 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Prof. Benedicto Crespo Facorro, Catedrático de Universidad, adscrito al Departamento de Psiquiatría de la Universidad de Sevilla, Dra. Ana Carmen Sánchez Hidalgo y Prof. José López Barneo, Catedrático de Universidad, adscrito al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: Que el trabajo que presenta Doña Celia Martín Cuevas, con el título “Papel de Reelina y ADAMTS2 en modelos experimentales de esquizofrenia en ratón”, ha sido realizado en el laboratorio del grupo de investigación de Psiquiatría Traslacional del Instituto de Biomedicina de Sevilla, bajo nuestra DIRECCIÓN y TUTORIZACIÓN, y consideramos que tiene el contenido y rigor científico necesario para ser sometido a juicio del tribunal que ha nombrado la Universidad de Sevilla para optar al grado de Doctor. Y, para que así conste, firmamos en Sevilla, a 3 de mayo de 2024. Fdo.: Prof. Benedicto Crespo Facorro Fdo.: Dra. Ana Carmen Sánchez Hidalgo Fdo.: Prof. José López Barneo Sevilla, 2024 Celia Martín Cuevas ha recibido financiación de CIBERSAM (CB07/09/2001). El proyecto de investigación ha recibido financiación de la Agencia Estatal de Investigación (PID2019- 109405RB-100) y la Consejería de Transformación Económica, Industrial, Conocimiento y Universidades de la Junta de Andalucía (P20_00811). Agradecimientos En primer lugar, me gustaría agradecer a mis directores de Tesis, Benedicto Crespo Facorro y Ana Carmen Sánchez Hidalgo, así como a mi tutor, José López Barneo, la oportunidad de aprender y trabajar en unos proyectos que ilusionan y que dan ganas de seguir en esto. Su guía y apoyo me han hecho crecer como científica y como persona. Quiero dar las gracias a los distintos servicios del IBiS por su asesoramiento y contribución a esta Tesis Doctoral. En concreto, a los Servicios de Microscopía óptica y confocal, Instrumentación científica, Proteómica e Histología. A todo el Servicio de Producción y Experimentación animal y, en especial, a su responsable Cristina Pichardo, por su apoyo en el seguimiento y mantenimiento de los animales. Al Servicio de Transgénesis del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, por su gran contribución en la difícil tarea de la generación del ratón transgénico. A Malu Martínez Chantar y a su equipo del CIC bioGUNE, por prestarnos su ayuda y asesoramiento como expertos en el análisis de los resultados del estudio de proteómica. A Agnès Gruart i Massó y José María Delgado, por apostar por mí en mis inicios y hacer que me ilusionara la Neurociencia. A Francisco Gómez Scholl y Amalia Martínez Mir, por ayudar a mi formación previa a esta Tesis Doctoral. A la parte clínica del grupo, por ayudarme a ampliar mis conocimientos sobre las enfermedades psiquiátricas. A Susana y Ana, por prestarme su ayuda cuando me ha hecho falta y hacer piña al final. A Amanda, por hacer que las horas del viernes cundan y ayudarme a genotipar ratoncitos. A aquellas personas de fuera del laboratorio que me han aguantado y apoyado a lo largo de esta etapa, Jesús, Fernando, Carlos, Elisa, Bea, Irene y Ana. Aunque nos veamos poquito por la distancia o el escaso tiempo libre, siempre se puede contar con vosotros. A mi gente nueva del 107, Ángela, Claudia y Sonia. Aunque hemos compartido pocos meses pared con pared, han sido los más intensos. Gracias por ayudarme en los momentos de agobio con risas y cachondeo y prestarme las cosas para los Western. A todas las personas con la que he compartido tantos momentos en el laboratorio. A Marifé, por contarme sus historias y hacerme reír con esos filtros. Nunca olvidaré la foto de la niña de la curva. A Isa, la mejor pecerreadora de la historia. Al doctorcito Fran, por enseñarme a preparar sacarosa, por los ratitos de pánico, estrés y risas en el 107 y por seguir ayudándome fuera del laboratorio. A Alvarito, por ese bucle infinito de correos, los jueves de lolailan y los breves momentos de tranquilidad en sótano. Por estar siempre dispuesto a darme consejos. A Víctor, por llenar el laboratorio de sarcasmo y botellas de vidrio. Por enseñarme a usar los microscopios 20 veces si me hacía falta y por aguantarme, aun ya sin formar parte del grupo. Por ser el mejor caVICfy del mundo. A mi amiga y directora Ana. Por aguantarme en los momentos de “no llego” y calmarme en los de “quiero hacerlo todo ya”. Por sacarme de paseíto (andando o en su coche por supuesto) a por un gofre o a comprar manualidades. Por ayudarme a conseguir hacer el trabajo del último año en cuatro meses. Por enseñarme a pensar y a contar hasta 10. Por tus chistes malos (pero malos de verdad) y el flow de la cucaracha. Tienes el cielo ganao’. A Enriquillo, por su paciencia infinita y esos “legos” de emergencia. Por tenerme siempre heladitos en el congelador y refresco fresquito en el frigo. Por aguantar siempre mis quejas y enfados y hacer que todo sea más llevadero. A mi familia, por supuesto, por acompañarme en todo y darme ánimos para tirar para adelante. A mis tíos y mi abuela, por apoyarme siempre. A mis padres, por su paciencia y ayuda incondicional, por estar siempre ahí y tranquilizarme cuando volvía cabreada a casa. A mi Ale, por ser tan pesado y mandarme gifs absurdos. Y, por último, y no menos importante, a mi perrito, por alegrarme el día al llegar a casa con saltos y lametones. Merci, Celia A mi familia 2. Modelo transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 .....................................95 2.1 Generación del modelo transgénico ADAMTS2-Cre .........................................................95 2.2 Caracterización de la expresión de ADAMTS2 en el modelo transgénico ........................95 2.3 Caracterización general del ratón transgénico ADAMTS2-Cre ...................................... 100 2.3.1 Frecuencia genotípica en la línea ADAMTS2-GFP y ADAMTS2-Cre .......................... 100 2.3.2 Índice de mortalidad ................................................................................................ 101 2.3.3 Curva de crecimiento de la línea ADAMTS2-Cre ...................................................... 102 2.4 Caracterización conductual del modelo transgénico ADAMTS2-Cre ............................. 102 2.4.1 Población de ratones para comportamiento ........................................................... 103 2.4.2 Evaluación general del estado de los animales ........................................................ 103 2.4.3 Evaluación de síntomas positivos ............................................................................. 103 2.4.3.1 Test de campo abierto ..................................................................................... 103 2.4.3.2 Test de acicalamiento ...................................................................................... 105 2.4.3.3 Respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso ......................................... 106 2.4.3.4 Test de enterramiento de canicas .................................................................... 107 2.4.3.5 Test de placa caliente ....................................................................................... 109 2.4.4 Evaluación de síntomas negativos ........................................................................... 110 2.4.4.1 Test de las tres salas ......................................................................................... 110 2.4.4.2 Test del tubo .................................................................................................... 112 2.4.4.3 Test de suspensión por la cola ......................................................................... 113 2.4.5 Evaluación de síntomas cognitivos ........................................................................... 113 2.4.5.1 Reconocimiento de objeto nuevo .................................................................... 113 2.4.5.2 Laberinto en Y .................................................................................................. 114 2.4.6 Resumen del comportamiento del modelo transgénico ADAMTS2-Cre .................. 115 2.5 Análisis de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la enfermedad de esquizofrenia ....................................................................................................................... 116 2.5.1 Alteración en la microglía y astrocitos del ratón ADAMTS2-Cre .............................. 116 2.5.2 Reelina y marcadores relacionados con la sinapsis.................................................. 118 2.5.2.1 Cuantificación de la densidad de células positivas para Reelina ..................... 122 2.6 Cuantificación del grosor de corteza y sus capas .......................................................... 124 2.7 Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas en el modelo ............................. 125 VI. Discusión ................................................................................................. 129 1. Generación de modelos de ratón relacionados con la enfermedad de esquizofrenia ....... 131 1.1 Establecimiento de un modelo de ratón de “doble impacto” mediante una infección prenatal con Poly(I:C) y una exposición postnatal a THC .................................................... 132 1.2 Generación de un modelo de ratón transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 en regiones cerebrales .............................................................................................................. 135 2. Caracterización comportamental de los fenotipos asociados a la enfermedad de esquizofrenia ....................................................................................................................... 138 2.1 Modelo de “doble impacto” .......................................................................................... 138 2.2 Modelo transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 .................................................. 141 3. Estudio de la expresión de Reelina y marcadores relacionados .......................................... 142 3.1 Modelo de “doble impacto” .......................................................................................... 142 3.2 Modelo transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 .................................................. 144 4. Evaluación de marcadores morfológicos alterados en la enfermedad de esquizofrenia ... 148 4.1 Grosor de corteza y sus capas........................................................................................ 148 4.2 Densidad de espinas dendríticas ................................................................................... 149 5. Relevancia del dimorfismo sexual en los modelos .............................................................. 150 5.1 Modelo de “doble impacto” .......................................................................................... 151 5.2 Modelo transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 .................................................. 152 VII. Limitaciones ............................................................................................ 153 1. Modelo de “doble impacto” ................................................................................................ 155 2. Modelo transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 .................................. 156 VIII. Conclusiones .......................................................................................... 159 IX. Bibliografía .............................................................................................. 163 X. Anexos ..................................................................................................... 181 1. Resultados no significativos del modelo de “doble impacto” ............................................. 183 2. Resultados no significativos del modelo transgénico .......................................................... 186 3. Rutas alteradas mediante estudio IPA en el modelo de “doble impacto” .......................... 188 4. Publicaciones ....................................................................................................................... 202 4.1 Reelin alterations, behavioral phenotypes and brain anomalies in schizophrenia: a systematic review of insights from rodent models .............................................................. 203 4.2 Prenatal risk factors and postnatal cannabis exposure: assessing dual models of schizophrenia-like rodents ................................................................................................... 224 5. Listado de abreviaturas ....................................................................................................... 239 I. INTRODUCCIÓN 3 I INTRODUCCIÓN 1. La esquizofrenia La esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico crónico y grave cuya presentación y evolución clínica son heterogéneas, pudiendo ocasionar un marcado impacto en el funcionamiento tanto a nivel individual como social de la persona afectada (Crespo- Facorro et al., 2021). Dicha heterogeneidad se refleja en el reconocimiento del DSM-5 de numerosos diagnósticos relacionados en todo el denominado “espectro de la esquizofrenia”, como el trastorno esquizotípico de la personalidad, el trastorno psicótico breve, el trastorno esquizofreniforme, la esquizofrenia, el trastorno esquizoafectivo, el trastorno psicótico inducido por sustancias o medicamentos, el trastorno psicótico debido a otra afección médica o el trastorno delirante (McGorry, 2011; Heckers et al., 2013; Tamminga et al., 2014). Además, algunas autoridades en la materia consideran que los individuos “sanos” pueden experimentar transitoriamente episodios psicóticos “menores”, sin asociar la ruptura vital ni la angustia propia de los cuadros psicóticos que alcanzan un rango patológico (Lieberman et al., 2019). Por otra parte, episodios psicóticos graves pueden ocurrir en el trastorno bipolar o la depresión con síntomas psicóticos, y ciertos episodios también están asociados con el uso recreativo de agentes que provocan o imitan ciertos síntomas similares a la esquizofrenia, como es el caso del cannabis, los derivados anfetamínicos, la cocaína, determinados alucinógenos o la ketamina (Millan et al., 2016). La esquizofrenia afecta aproximadamente al 0.6-0.8% de la población mundial, y se caracteriza por una combinación heterogénea de síntomas (Patel et al., 2014; Haddad y Correll, 2018; American Psychiatric Association, 2021). Por lo general, se inicia durante la adolescencia o la adultez temprana y conlleva un alto coste personal, económico y social (Kahn et al., 2015; McCutcheon et al., 2020; American Psychiatric Association, 2021). El tratamiento normalmente implica una combinación de fármacos antipsicóticos (AP) e intervenciones terapéuticas (NICE, 2014; American Psychiatric Association, 2021). Sin embargo, la heterogeneidad de la enfermedad dificulta tanto su diagnóstico como el establecimiento de un consenso en relación con su etiología y patofisiología (Patel et al., 2014). Además, se observa una incidencia ligeramente superior en hombres que en mujeres, con una mayor gravedad en los primeros y una aparición más temprana (Aleman et al., 2003; Eranti et al., 2013; Mendrek y Mancini-Marïe, 2016; Shangase et al., 2023). 4 I INTRODUCCIÓN En conjunto, estos datos resaltan la necesidad de investigar nuevas dianas terapéuticas que permitan el desarrollo de tratamientos personalizados. 1.1. Clínica de la enfermedad Los síntomas de las personas con esquizofrenia se pueden categorizar en positivos, negativos, desorganizados y cognitivos. Los positivos son aquellos que implican alteraciones de la sensopercepción y un comportamiento o pensamiento que no suelen estar presentes en ausencia de la enfermedad y dan lugar a la pérdida de contacto con la realidad, como los delirios y las alucinaciones (Patel et al., 2014; Kahn et al., 2015; McCutcheon et al., 2020; American Psychiatric Association, 2021; Crespo- Facorro et al., 2021). Los síntomas negativos son más complejos de identificar y de diagnosticar, aunque los más comunes son el aislamiento social, la disminución de la expresión de emociones, la abulia (falta de voluntad o energía para llevar a cabo una tarea) y la anhedonia (carencia de la capacidad para experimentar placer) (Patel et al., 2014; Kahn et al., 2015; McCutcheon et al., 2020; American Psychiatric Association, 2021). Los síntomas desorganizados engloban un pensamiento, lenguaje y comportamiento desorganizados (carecen de sentido o difícil de entender o justificar). Por último, los síntomas cognitivos comprenden un conjunto no específico de alteraciones cognitivas, como pueden ser la alogia (incapacidad para razonar de forma lógica) (Patel et al., 2014; Kahn et al., 2015; American Psychiatric Association, 2021) y los déficits en la memoria de trabajo y en la velocidad de procesamiento de la información (Rodríguez-Sánchez et al., 2007; McCutcheon et al., 2020). Estos síntomas se pueden agrupar como alteraciones de las funciones ejecutivas, las cuales están principalmente controladas por la corteza prefrontal (Negrón-Oyarzo et al., 2016), región cerebral estrechamente relacionada con la enfermedad de esquizofrenia. Los primeros síntomas de la enfermedad suelen aparecer durante la adolescencia tardía o la adultez temprana, siendo en muchos casos un comienzo insidioso con aumento de los síntomas de manera progresiva. A pesar de que más del 60% de los casos responderán adecuadamente a los AP, algunas de estas características clínicas permanecen presentes en el paciente tras la remisión de los síntomas positivos, 5 I INTRODUCCIÓN dificultando que la persona afectada desarrolle una vida plena a nivel personal, social y laboral (Kahn et al., 2015). Estos pacientes suelen presentar una mayor tendencia al consumo de drogas, incluyendo alcohol, tabaco o cannabis (Patel et al., 2014; American Psychiatric Association, 2021). El principal tratamiento de estos síntomas consiste en la administración de AP con un efecto sobre los síntomas positivos, ejerciendo un bloqueo de receptores dopaminérgicos postsinápticos tipo 2 (D2) (Carlsson y Carlsson, 2006). Sin embargo, solo el 60% de los pacientes responden positivamente de manera significativa, mientras que alrededor del 30% permanecen resistentes al tratamiento (Crespo-Facorro et al., 2007; Moreno-Sancho et al., 2022). La mejoría tiene efecto principalmente en los síntomas positivos de la enfermedad, pero los AP provocan una escasa mejoría de los síntomas negativos y cognitivos (Ruso- Julve et al., 2019). 1.2. Factores de riesgo de la esquizofrenia La esquizofrenia es una enfermedad multifactorial causada por alteraciones tanto genéticas como ambientales, especialmente durante las etapas prenatales (Patel et al., 2020; American Psychiatric Association, 2021; Martín-Cuevas et al., 2023). Numerosos estudios han destacado la estrecha relación entre estos factores prenatales y un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad (King et al., 2010; Guerrin et al., 2021). Estas alteraciones incluyen la activación inmune materna (AIM) (Meyer et al., 2011; Saunders et al., 2022), el estrés (Fineberg et al., 2016), la dieta materna (Kirkbride et al., 2012) o la exposición prenatal a drogas (Khokhar et al., 2018), junto a complicaciones obstétricas, diabetes gestacional y bajo peso al nacer (Patel et al., 2014; Kahn et al., 2015). Aparte de las alteraciones prenatales, otros factores ambientales también pueden influir en el riesgo de padecer esquizofrenia, como pertenecer a una minoría étnica, residir en áreas socioeconómicamente marginales y experimentar aislamiento social (Patel et al., 2014; Kahn et al., 2015; American Psychiatric Association, 2021). Otro factor significativo relacionado con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad es el consumo de drogas. En concreto, numerosos estudios han señalado el consumo de 6 I INTRODUCCIÓN cannabis como una posible causa de la enfermedad (Johnson-Ferguson y Di Forti, 2023), además de exacerbar los síntomas (Pelayo‐Terán et al., 2008; Kahn et al., 2015). Las alteraciones genéticas juegan un papel importante en la génesis de la enfermedad y han sido ampliamente descritas en las últimas décadas (Tsuang, 1994; Sekar et al., 2016; Trubetskoy et al., 2022), ya que se ha observado un aumento del 10% del riesgo entre parientes de primer grado y un 3% entre parientes de segundo grado. El porcentaje de que desarrolle la enfermedad un hijo nacido de padres diagnosticados con esquizofrenia es del 40% (Patel et al., 2014). Sin embargo, una revisión exhaustiva del componente genético y genómico de la enfermedad está fuera del objetivo del presente trabajo de investigación. 1.3. Biomarcadores de la esquizofrenia Los mecanismos biológicos asociados a la etiopatogenia de la esquizofrenia aún no están establecidos, a pesar de que son muchas las investigaciones que en estas dos últimas décadas han aportado datos y conocimientos muy relevantes en el campo. Una de las primeras teorías propuestas defiende la existencia de una alteración en el funcionamiento de los sistemas de neurotransmisión, y actualmente es la más aceptada. Esta teoría propone que existen principalmente alteraciones en los niveles y sistemas de actuación de diferentes neurotransmisores como dopamina, glutamato o ácido gamma-aminobutírico (GABA) (Patel et al., 2014; McCutcheon et al., 2020; Zahid et al., 2023; Gillespie et al., 2024). A pesar de que las causas exactas de la esquizofrenia aún no están completamente descritas, numerosos estudios han identificado varios factores relacionados con su patofisiología (Bromet y Fennig, 1999; Gillespie et al., 2024). 1.3.1 Marcadores morfológicos Se han descrito alteraciones celulares y neurofisiológicas, principalmente en la corteza prefrontal de los pacientes, que podrían explicar los defectos en funciones cognitivas dependientes de esta región (Negrón-Oyarzo et al., 2016). Un ejemplo de 7 I INTRODUCCIÓN ello es la menor densidad de espinas dendríticas descrita en las neuronas glutamatérgicas piramidales de los pacientes, las cuales son importantes para las funciones cognitivas superiores que están alteradas en esquizofrenia (Garey, 2010). Este hallazgo respalda la hipótesis glutamatérgica de esquizofrenia (Hirsch et al., 1997), ya que el receptor NMDA (N-metil-D-aspartato) está presente en las dendritas y las espinas, y el bloqueo de este receptor mediante antagonistas como la fenciclidina provoca síntomas similares a aquellos relacionados con la enfermedad (Jentsch, 1999). Otro marcador patológico comúnmente encontrado en pacientes de la enfermedad, tanto crónicos como de primer episodio de psicosis, es la reducción del grosor de corteza en diferentes áreas cerebrales como la corteza prefrontal, según análisis de neuroimagen (Nenadic et al., 2015; Yan et al., 2019; Rodríguez-Pérez et al., 2021). Este fenotipo está relacionado con un empeoramiento del estado clínico del paciente (Rodríguez-Pérez et al., 2021), aunque estos resultados difieren entre estudios. Un trabajo reciente ha señalado además no solo la reducción del grosor de corteza, sino la aceleración de dicha reducción, como un fenotipo de la enfermedad (González-Peñas et al., 2024). 1.3.2 Matriz extracelular e inflamación Se han hallado altos niveles de citoquinas proinflamatorias tanto en suero (Crespo- Facorro et al., 2008; Pardo-de-Santayana et al., 2021) como en líquido cefalorraquídeo de personas con esquizofrenia (Müller et al., 2015; Warren et al., 2024). El sistema inmune juega un papel esencial en las funciones del sistema nervioso central, regulando el desarrollo neuronal y glial y la plasticidad sináptica (Comer et al., 2020; Pardo-de-Santayana et al., 2021; González-Castro et al., 2024). En este contexto, se ha observado un aumento de la activación de la microglía en los cerebros de las personas con la enfermedad, lo que podría estar relacionado con su deterioro cognitivo debido a la liberación de las citoquinas proinflamatorias causada por la activación de la microglía (Zhuo et al., 2023). Por otra parte, se han estudiado las alteraciones de los astrocitos en los pacientes, debido a sus funciones 14 I INTRODUCCIÓN continúan su consumo tras la aparición del primer episodio de psicosis muestran un mayor tiempo de hospitalización y síntomas más graves (Johnson-Ferguson y Di Forti, 2023), mientras que aquellos que interrumpen su consumo experimentan una mejora de los mismos (Setién‐Suero et al., 2019). Sin embargo, otros estudios epidemiológicos han descrito que un consumo temprano de cannabis no tiene efectos significativos en los síntomas cognitivos (Setién-Suero et al., 2018). Los posibles mecanismos por los que el cannabis aumenta el riesgo de padecer esquizofrenia se han estudiado en modelos animales, en los que se han establecido modelos de exposición tanto agudos, como subcrónicos y crónicos. En general, los modelos administrados con cannabis suelen presentar alteraciones en locomoción (Harte y Dow-Edwards, 2010; Chesworth y Karl, 2017; Kasten et al., 2019), una interacción social disminuida y déficits de memoria, tanto memoria de trabajo como memoria de reconocimiento a corto plazo (Abush et al., 2018; Chesworth y Karl, 2017). Además, se ha observado en distintos modelos murinos que el consumo crónico de cannabis produce una reducción de la expresión de CB1R, especialmente en las regiones cerebrales de corteza prefrontal e hipocampo, y en menor medida en estriado. Asimismo, se han descrito alteraciones del sistema dopaminérgico, GABAérgico y glutamatérgico en estos modelos (Chesworth y Karl, 2017). Los resultados obtenidos tanto en estudios en humanos como en modelos animales pueden variar en función de la edad de consumo (Khokhar et al., 2018). El cerebro adolescente es especialmente sensible al cannabis en comparación con el cerebro adulto (Khokhar et al., 2018; Patel et al., 2020). Su consumo en esta etapa provoca alteraciones a largo plazo en la cognición (Patel et al., 2020), alteraciones del grosor cortical (Abush et al., 2018) y una disminución de la densidad y complejidad de las espinas dendríticas en corteza prefrontal e hipocampo (Chesworth y Karl, 2017). Sin embargo, el consumo de cannabis en edad adulta no tiene efectos en las funciones cognitivas (Fearby et al., 2022), A pesar de la estrecha relación entre el consumo de cannabis y el desarrollo de esquizofrenia, no todas las personas que lo consumen la desarrollan. Numerosos estudios han descrito que las personas predispuestas al desarrollo de enfermedades 15 I INTRODUCCIÓN psiquiátricas por otros factores previos son más vulnerables a los efectos psicóticos del cannabis y, específicamente, del THC (Patel et al., 2020). 3. Papel de Reelina en la enfermedad Como se ha mencionado en el apartado 1.3.2 de la Introducción, las alteraciones de la MEC han sido relacionadas con la esquizofrenia, debido a las alteraciones de diferentes componentes de la misma descritas en los pacientes de la enfermedad. Uno de los componentes de la MEC ampliamente descrito en personas con esquizofrenia por presentar unos niveles de expresión reducidos es Reelina (Berretta, 2012). Reelina es una glicoproteína de la MEC y es crucial para la migración neuronal y el posicionamiento laminar durante el desarrollo cerebral (Alexander et al., 2023). Asimismo, regula el crecimiento y la formación de espinas dendríticas, la sinaptogénesis, la plasticidad sináptica (Wasser y Herz, 2017; Yamakage et al., 2019; Jossin, 2020) y la neurogénesis adulta (Bosch et al., 2016). Se identificó por primera vez en una cepa de ratón con una mutación autosómica recesiva denominada reeler (ratón reeler heterocigoto) (Falconer, 1951). Es una proteína de aproximadamente 400kDa codificada por el gen RELN, ubicado en el cromosoma humano 7q22 y el cromosoma murino 5. Su expresión durante el desarrollo tiene lugar principalmente en las neuronas de Cajal- Retzius, ubicadas en la zona marginal (capa más superficial) de la corteza cerebral (Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021), mientras que, en etapas postnatales, se produce principalmente en interneuronas en la corteza cerebral y el hipocampo (Negrón-Oyarzo et al., 2016; Wasser y Herz, 2017; Yamakage et al., 2019; Jossin, 2020; Tsuneura et al., 2021; Alexander et al., 2023). En cuanto a su ruta de señalización, Reelina se une al receptor 2 de apolipoproteína E (ApoER2) y al receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR), induciendo así la fosforilación del adaptador intracelular Disabled homolog-1 (Dab1) (Bosch et al., 2016; Wasser y Herz, 2017; Ogino et al., 2017; Alexander et al., 2023). Este proceso está mediado por las quinasas Stored response chain (Src) (Hattori y Kohno, 2021). Dicha fosforilación inicia una posterior cascada de señalización que modula los citoesqueletos 16 I INTRODUCCIÓN de actina y los microtúbulos (Negrón-Oyarzo et al., 2016; Tsuneura et al., 2021; Hattori y Kohno, 2021). Tras su fosforilación, Dab1 se degrada rápidamente (Ogino et al., 2017). 3.1 Estructura y procesamiento proteolítico de Reelina Reelina está compuesta por 3461 y 3460 aminoácidos en ratones y humanos respectivamente (D’Arcangelo et al. 1995; Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021). Su estructura se compone principalmente por un péptido señal, seguido de un dominio de homología F-espondina y una región única y, a continuación, el cuerpo principal compuesto de ocho repeticiones específicas de Reelina, nombradas R1 a R8. Estas repeticiones están formadas por dos sub-repeticiones (A y B) que flanquean un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y termina con una extensión básica de 33 aminoácidos (D’Arcangelo et al. 1995; Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021) (Figura 3). Tras ser secretada, Reelina es procesada en dos lugares, entre las repeticiones 2 y 3, y entre las repeticiones 6 y 7, creando así 5 fragmentos, denominados N-R2, R3-6, R7-8, N-R6 y R3-8 (Jossin et al., 2004, 2007; Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021). Estos procesamientos pueden llevarse a cabo por diferentes enzimas, las cuales pueden procesar el extremo N-terminal, el C-terminal, o ambos. El procesamiento puede estar mediado por metaloproteasas de la familia de desintegrinas y metaloproteinasas con motivos de trombospondina (TSR) denominadas ADAMTS, como ADAMTS4 y ADAMTS5, las cuales realizan el corte en ambos sitios de procesamiento. También puede estar mediado por metaloproteinasas como MMP9, aunque actúa indirectamente a través de ADAMTS4. Por otro lado, estudios recientes han sugerido que ADAMTS2 y ADAMTS3 pueden participar en el corte del extremo N-terminal y otros estudios han propuesto que Meprina α y β realizan el procesamiento del extremo C-terminal (Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021). La región central (R3-6) es la necesaria para la unión a los receptores de Reelina ApoER2 y VLDLR, siendo las regiones R5-6 los sitios mínimos de unión para estos receptores y las encargadas de la dimerización de Reelina a través de la formación de enlaces disulfuro (Hattori y Kohno, 2021). Recientemente, se ha descrito un tercer 17 I INTRODUCCIÓN lugar de procesamiento de Reelina en los últimos 6 aminoácidos en el extremo C- terminal. Este procesamiento no tiene influencia en la migración neuronal durante el desarrollo, pero participa en el mantenimiento de la zona marginal en la corteza cerebral postnatal (Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021). Figura 3. Estructura y procesamiento proteolítico de Reelina. La estructura de Reelina está formada por un péptido señal (PS), seguido de un dominio de homología F-espondina (F-Esp), una región única y ocho repeticiones específicas (R1-8), formadas por dos sub-repeticiones (A y B) flanqueando un motivo EGF y finalizando con una extensión de 33 aminoácidos (aa). Reelina es procesada en los sitios N- terminal o C-terminal por diferentes metaloproteasas (ADAMTS2, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP o Meprina α y β, dando lugar a 5 fragmentos (N-R6, R3-8, R3-6, N-R2 y R7-8). La región central R3- 6 es la encargada de la unión a los receptores ApoER2 y VLDLR, y de la dimerización mediante enlaces disulfuro (creado mediante Biorender.com). 3.2 Reelina y esquizofrenia Numerosos estudios han descrito una alteración de la señalización de Reelina en el cerebro adulto que puede contribuir a la patogénesis y el empeoramiento de enfermedades psiquiátricas como la esquizofrenia (Jossin, 2020; Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Se han hallado alteraciones genéticas de Reelina y, por tanto, sus consecuentes alteraciones de señalización, asociadas con la esquizofrenia 18 I INTRODUCCIÓN (Impagnatiello et al., 1998; Fatemi et al., 2005; Imai et al., 2017; Arioka et al., 2018; Marzan et al., 2021). Asimismo, se ha observado una disminución de la expresión de Reelina en cerebros post-mortem de pacientes de esta enfermedad (Guidotti et al., 2000; Eastwood y Harrison, 2006; Nullmeier et al., 2011; Howell y Pillai, 2016) y una hipermetilación del promotor de Reelina en neuronas GABAérgicas de la corteza prefrontal (Negrón-Oyarzo et al., 2016), recalcando así la relación entre las alteraciones de Reelina y el aumento del riesgo de desarrollar esquizofrenia (Folsom y Fatemi, 2013). Los modelos animales que tienen una reducción de la expresión de Reelina mediante una alteración genética presentan síntomas similares a los hallados en las personas con esquizofrenia, como comportamiento estereotipado, mayor ansiedad y déficits cognitivos (Negrón-Oyarzo et al., 2016). Por tanto, Reelina se ha descrito como un biomarcador alterado en la mayoría de los modelos animales relacionados con la enfermedad de esquizofrenia, principalmente en aquellos basados en alteraciones genéticas o prenatales, y contribuye en consecuencia a la validez del modelo (Sánchez- Hidalgo et al., 2022). 4. Papel de la metaloproteasa ADAMTS2 en la enfermedad Las ADAMTS son metaloproteasas secretadas y multi-dominio que están asociadas a la MEC, y desempeñan diversas funciones como morfogénesis de tejidos, remodelación fisiopatológica y regulación de procesos inflamatorios y vasculares (Kelwick et al., 2015). En humanos, la familia ADAMTS está formada por 19 miembros, los cuales se agrupan en función de sus sustratos conocidos, dando lugar a las proteoglicanasas o agrecanasas (ADAMTS1, 4, 5, 8, 9, 15 y 20), las N-propeptidasas de procolágeno (ADAMTS2, 3 y 14), las enzimas que procesan el cartílago oligomérico de matriz (ADAMTS7 y 12), la proteinasa del factor von Willebrand (ADAMTS13) y las denominadas como huérfanas (ADAMTS6, 10, 16, 18, 17 y 19) por no conocer sus sustratos fisiológicos. El término ADAMTS11 no se emplea debido a que se demostró posteriormente que era idéntica a ADAMTS5 (Kelwick et al., 2015; Bekhouche y Colige, 2015). ADAMTS1 fue la primera en ser descubierta (Kuno et al., 1997). 19 I INTRODUCCIÓN Figura 4. Estructura de las ADAMTS2, 3 y 14, N-propeptidasas de procolágeno. La estructura las N- propeptidasas de procolágeno ADAMTS2, 3 y 14 se compone de un péptido señal, una pro-región, un dominio metaloproteasa dependiente de zinc, un dominio similar a una desintegrina, una región rica en cisteína, una región espaciadora, el dominio N-propeptidasa de procolágeno, una región PLAC y 4 motivos de trombospondina de tipo 1 (creado mediante Biorender.com). La estructura básica de las ADAMTS se compone de un péptido señal seguido de una pro-región de longitud variable, un dominio metaloproteasa dependiente de zinc, un dominio similar a una desintegrina, una secuencia central de TSR de tipo 1 y un dominio rico en cisteína, seguido por una región espaciadora. Por último, el C-terminal finaliza con un dominio auxiliar o secundario, que varía en función del tipo de ADAMTS y que se encarga de la unión de la MEC a las proteínas (Kelwick et al., 2015; Bekhouche y Colige, 2015; Mohamedi et al., 2020). El grupo de las denominadas N-propeptidasas de procolágeno, compuesto por ADAMTS2, 3 y 14, se caracteriza inicialmente por sus funciones relacionadas con la maduración de las fibras de colágeno de triple hélice, uno de los principales constituyentes de la MEC (Kelwick et al., 2015; McCorkindale et al., 2022). Estas metaloproteasas también presentan una potente actividad antiangiogénica (Bekhouche y Colige, 2015). Se caracterizan por tener 4 TSR de tipo 1, un dominio C-terminal de tipo 20 I INTRODUCCIÓN N-propeptidasa de procolágeno y una región PLAC (protease and lacunin), que contiene 6 residuos de cisteína (Kelwick et al., 2015; Bekhouche y Colige, 2015) (Figura 4). A pesar de ser secretadas, son inmovilizadas en la superficie celular o muy próximas a ella, ya que ahí tiene lugar el procesamiento del procolágeno. El segundo TSR tipo 1 está especialmente implicado en la interacción celular y con otros componentes de la MEC (Bekhouche y Colige, 2015). La más caracterizada de este grupo es ADAMTS2, la cual se sintetiza como una proenzima inactiva, y es activada tras su procesamiento entre el pro-dominio y el dominio metaloproteasa. Se compone de 1211 aminoácidos, aunque existe una isoforma corta de 543 aminoácidos que posee el dominio metaloproteasa, pero no presenta ninguna actividad peptidasa de procolágeno (Bekhouche y Colige, 2015). ADAMTS2 se expresa principalmente en fibroblastos y células de origen mesenquimal (Bekhouche y Colige, 2015). Se ha descrito una mutación de ADAMTS2 asociada al síndrome de Ehlers-Danlos tipo VIIC, cuyo principal síntoma es la fragilidad extrema de la piel (Kelwick et al., 2015; Mead y Apte, 2018). 4.1 ADAMTS2 en el sistema nervioso central A pesar de haber sido descrita principalmente por su función como N-propeptidasa de procolágeno, recientemente se han comenzado a investigar otros papeles de ADAMTS2 en el sistema nervioso central y en la MEC, por su relación con diversas enfermedades psiquiátricas, como la enfermedad de Alzheimer (Gurses et al., 2016; McCorkindale et al., 2022) o la esquizofrenia (Yamakage et al., 2019; Thiagarajan et al., 2022). Se ha observado la expresión de ADAMTS2 en el sistema nervioso central (Gottschall y Howell, 2015; Mohamedi et al., 2020), principalmente en las regiones de corteza y estriado, las neuronas piramidales y granulares del hipocampo, las células de Purkinje y las células granulares del cerebelo, y una menor expresión en el tálamo, el mesencéfalo, el tronco cerebral y la médula (Yamakage et al., 2019). También se ha descrito una expresión de ADAMTS2 en la microglía (Thomas et al., 2022), aunque existen pocos estudios al respecto. 21 I INTRODUCCIÓN La MEC ocupa aproximadamente el 20% del sistema nervioso central (Gottschall y Howell, 2015), y se compone estructuralmente de una red densa de proteínas y glicanos. Esta red proporciona a las células neurales puntos de anclaje esenciales y facilita su organización en diferentes regiones cerebrales, las cuales han sido vinculadas a enfermedades del sistema nervioso central (Muri et al., 2019). La MEC actúa como fuente de diversas señalizaciones moleculares que sirven como guía temporal y estructural para el crecimiento, la actividad y la supervivencia celular (Bandtlow y Zimmermann, 2000). En el cerebro adulto, la MEC experimenta cambios con respecto a su composición, desempeñando así un papel crucial como estabilizador de la sinapsis y contribuyendo a diversas funciones cognitivas como la memoria o el aprendizaje (Dityatev et al., 2010). Estudios recientes han señalado el papel de la MEC en la patofisiología de la esquizofrenia (Pantazopoulos et al., 2021). Durante situaciones patológicas o de estrés, las agresiones al sistema nervioso central provocan alteraciones de la MEC, lo que puede conllevar el desarrollo de esta patología psiquiátrica (Berretta, 2012). También se han identificado niveles reducidos de las redes perineuronales, estructuras perisinápticas de la MEC, en pacientes de la enfermedad. Estas redes perineuronales están involucradas en la regulación de la transmisión y plasticidad sináptica (Pantazopoulos et al., 2021). Por otro lado, como se ha descrito en el punto 3 de la Introducción, otro componente de la MEC cuyos niveles se han hallado reducidos en personas con esquizofrenia es Reelina (Folsom y Fatemi, 2013; Ogino et al., 2017; Yamakage et al., 2019; Jossin, 2020). Varios autores han comenzado a estudiar la capacidad de ADAMTS2 para llevar a cabo el procesamiento de Reelina del extremo N-terminal (Yamakage et al., 2019; Jossin, 2020; Hattori y Kohno, 2021; McCorkindale et al., 2022), llegando a demostrar que el dominio desintegrina de ADAMTS2 es necesario para llevar a cabo dicho procesamiento in vitro (Yamakage et al., 2019). Esto ha sido corroborado mediante la generación de un modelo knockout de ADAMTS2, donde se mostraron los primeros indicios in vivo de que esta metaloproteasa participa en el procesamiento proteolítico de Reelina en etapas adultas en la corteza y el hipocampo, y en menor medida en el cerebelo (Yamakage et al., 2019). Estos estudios contribuyen 22 I INTRODUCCIÓN a la asociación de ADAMTS2 con el procesamiento de Reelina y alteraciones de la MEC y, por consiguiente, con la enfermedad de esquizofrenia. 4.2 Antecedentes del grupo Con el fin de buscar nuevos marcadores biológicos diferenciadores que permitieran avanzar en el tratamiento de la enfermedad de esquizofrenia, nuestro grupo ha comparado los perfiles de expresión génica asociados a la enfermedad. Se halló un grupo de 200 genes, asociados biológicamente al procesamiento y maduración de proteínas, la respuesta inmune innata, la respuesta inflamatoria aguda y la respuesta a heridas, específicamente alterados en los pacientes en comparación con los controles sanos a nivel basal, por lo que se estableció la hipótesis de que estos genes podrían tener un papel en los mecanismos biológicos afectados de la enfermedad (Sainz et al., 2013). En un trabajo posterior, se investigó cómo esos patrones de expresión, diferencialmente alterados en los pacientes, cambiaban tras ser tratados con AP. Este estudio se realizó en muestras de células mononucleares de sangre periférica de personas con esquizofrenia caracterizados como respondedores clínicos, mediante secuenciación del transcriptoma. Se encontraron 17 genes con una expresión diferencial significativa entre los 21495 genes humanos analizados. De manera llamativa, 6 de estos genes aparecían también en el grupo de 200 genes asociados a la enfermedad y, además, revertían a niveles de expresión normales después del tratamiento. Se halló un enriquecimiento de estos genes (ADAMTS2, CD177, CNTNAP3, ENTPD2, RFX2 y UNC45B). Aparte de ser modulados por los fármacos, estos se asociaban a una respuesta clínica favorable (Crespo-Facorro et al., 2015). En un estudio in vivo posterior, se demostró que 5 de los 6 genes (Adamts2, Cd177, Cntnap3, Entpd2 y Rfx2) estaban sobreexpresados en muestras de corteza prefrontal de ratones adultos nacidos de madres expuestas a influenza durante el embarazo (modelo de la enfermedad de esquizofrenia) (López-Giménez et al., 2017). Esto demostró la implicación de estos genes en modelos murinos de la enfermedad. 23 I INTRODUCCIÓN Utilizando una nueva cohorte de pacientes sin tratamiento, se reportó que ADAMTS2 era el gen más significativamente sobreexpresado en las muestras de pacientes de primeros episodios de psicosis y, además, era moderado a niveles de los controles tras el tratamiento con AP atípicos en estos mismos pacientes respondedores (Figura 5) (Ruso-Julve et al., 2019). Figura 5. Expresión de ADAMTS2 en pacientes sin tratamiento y tras 3 meses de tratamiento con AP. Niveles relativos de expresión de ARN mensajero de ADAMTS2 en células de sangre periférica de pacientes sanos (Control), pacientes de primeros episodios de psicosis sin tratar (SCZ untreated) y pacientes tratados durante 3 meses (SCZ treated). ***p<0.001 (pacientes control comparados con pacientes sin tratar); ###p<0.001 (pacientes sin tratar comparados con pacientes tratados). Los datos son la media + SEM. Adaptado de Ruso-Julve et al. 2019. En los últimos años, nuestro grupo se ha centrado en el estudio de los mecanismos moleculares relacionados con la regulación de ADAMTS2 a partir de líneas celulares y modelos animales, debido a la necesidad de investigar nuevas vías de tratamiento de AP independientes de los receptores D2. La observación de la modulación de ADAMTS2 mediante AP y su asociación a la mejoría clínica lo señalan como candidato idóneo para investigar los mecanismos por los cuales los AP regulan su expresión, y su relación con la patología de la enfermedad. Se analizó el efecto del tratamiento con AP en una línea celular que expresa receptores en superficie dianas de los AP (línea SK-N-SH), además de presentar una expresión basal detectable de ADAMTS2. La incubación de estas III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 33 III HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 1. Hipótesis La esquizofrenia es una enfermedad multifactorial que requiere el desarrollo de modelos animales que permitan el estudio de los procesos biológicos alterados en la enfermedad y la identificación de nuevas dianas terapéuticas. La presente investigación se fundamenta en dos hipótesis: El modelo de “doble impacto” en ratón se ha basado en la hipótesis del “doble impacto” como modelo de la enfermedad en humanos, la cual describe que una infección materna durante el periodo prenatal predispone a un individuo a un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad. Así, un posterior consumo de cannabis en la adolescencia o adultez temprana provoca que dicho riesgo aumente por encima de cierto umbral para la esquizofrenia. Además, dado que los modelos animales de un solo impacto no logran replicar todos los fenotipos asociados con la clínica de la enfermedad, se postula que un paradigma de “doble impacto” podría ser más efectivo en reproducir los síntomas de la esquizofrenia. La generación del modelo de ratón transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 se basa en la hipótesis de que ADAMTS2 está implicado en el procesamiento proteolítico de Reelina, un biomarcador alterado en pacientes con esquizofrenia, y que, por tanto, podría revelar nuevas dianas terapéuticas para futuros tratamientos. Además, la hipótesis se basa en la observación de la alteración de esta proteína en muestras de pacientes de primeros episodios de psicosis, así como en su reversión a niveles de expresión normales tras el tratamiento con AP, por lo que ADAMTS2 podría estar implicado en la alteración de los síntomas positivos, negativos y cognitivos de la enfermedad. 2. Objetivos Objetivos principales: La presente investigación ha tenido como objetivo estudiar nuevas dianas terapéuticas que permitan avanzar en el conocimiento de la enfermedad de la esquizofrenia, con un enfoque especialmente en el estudio de Reelina. Para ello, se han establecido dos objetivos principales: 34 III HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 1. Estudiar los mecanismos biológicos cerebrales alterados relacionados con la MEC en un paradigma de “doble impacto” mediante un modelo de ratón y evaluar su eficacia para reproducir fenotipos asociados a los síntomas de la enfermedad de esquizofrenia, tanto a nivel conductual como a nivel de expresión de proteínas alteradas en la enfermedad. 2. Analizar el papel de ADAMTS2 en la esquizofrenia mediante la generación de un modelo de ratón de sobreexpresión de dicha proteína en regiones cerebrales, así como su implicación en el procesamiento de Reelina y su relación con los síntomas de la enfermedad. Objetivos secundarios: 1. Establecer un modelo de esquizofrenia en ratón usando un paradigma de “doble impacto” consistente en una AIM y una exposición postnatal a THC. 2. Generar un modelo de ratón transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 humano en el cerebro. 3. Caracterizar y analizar los fenotipos conductuales asociados a la enfermedad de esquizofrenia en los dos modelos. 4. Analizar la expresión de Reelina y marcadores relacionados en los dos modelos. 5. Evaluar los marcadores morfológicos alterados en la enfermedad de esquizofrenia relacionados con el grosor cortical y la densidad de espinas dendríticas. 6. Estudiar la relevancia del dimorfismo sexual en los dos modelos. IV. MATERIALES Y MÉTODOS 37 IV MATERIALES Y MÉTODOS 1. Establecimiento del modelo de “doble impacto” La hipótesis del “doble impacto” de la enfermedad de esquizofrenia defiende que un primer insulto en etapas prenatales predispone al paciente al desarrollo de la enfermedad, y un posterior consumo de THC aumenta dicho riesgo, superando así el umbral necesario para el desencadenamiento de la enfermedad (Malaspina, 1999; Lecca et al., 2019; Guma et al., 2023; Martín-Cuevas et al., 2023). Con el objetivo de testar esta hipótesis, se ha establecido un modelo de ratón de “doble impacto” que consiste en desencadenar una AIM durante la gestación de las crías mediante una inyección con Poly(I:C) y, posteriormente, en el tratamiento de dichas crías con THC en etapas postnatales. 1.1 Activación inmune materna mediante Poly(I:C) Para la generación del modelo de “doble impacto”, se adquirieron machos y hembras de la cepa C57BL/6J de dos meses de edad (Charles River). Se estabularon en bateas en el Área de Convencional del Servicio de Animalario IBiS en grupos de 4-5 animales. Los ratones se aclimataron durante 2 semanas al área y se cruzaron entre sí en parejas para obtener la población de estudio. Tras la observación del tapón mucoso, se determinó el inicio de la gestación, momento en el cual se separó a la hembra del macho en jaulas independientes. En el noveno día de gestación (G9), se les inyectó intraperitonealmente a las hembras gestantes una dosis de 5 mg/kg de Poly(I:C) (Sigma-Aldrich, lote #0000125513) o suero salino (0.9% NaCl). El Poly(I:C) se disolvió en suero salino mediante agitación suave y se preparó el mismo día de inyección para cada hembra. Tanto la dosis como el día de inyección escogidos se seleccionaron en base a la bibliografía (Meyer et al., 2006; Reisinger et al., 2015; Haddad et al., 2020; Guma et al., 2023; Martín-Cuevas et al., 2023). Para evaluar la respuesta inmune materna y validar el protocolo seleccionado para inducir la AIM, se controló el peso y la temperatura corporal de las hembras gestantes a las 3, 6, 24 y 48 horas tras la inyección, ya que se ha descrito la alteración de ambos factores tras la exposición a Poly(I:C) (Chow et al., 2016; Lecca et al., 2019; Mueller 38 IV MATERIALES Y MÉTODOS et al., 2019). La temperatura corporal se midió con un termómetro infrarrojo a 1 cm de la piel del ratón en la región abdominal. También se realizó la evaluación por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, en sus siglas en inglés) de los marcadores de inflamación IL-6 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα, en sus siglas en inglés) en bazo materno y en embriones con placenta (apartados 7 y 8 de Materiales y Métodos) (Meyer et al., 2006). Los ratones nacidos de dichas madres gestantes fueron destetados en el día postnatal 30 (P30) y estabulados en grupos de 4-5 ratones del mismo sexo y camada. 1.2 Exposición a THC El THC (T2386, Sigma-Aldrich) se adquirió a Sigma-Aldrich y se diluyó en vehículo (5% etanol, 5% cremofor (Sigma-Aldrich) y 90% suero salino (0.9% NaCl)). La solución se preparó cada día de inyección. Los ratones nacidos de madres gestantes tratadas con Poly(I:C) o suero salino se inyectaron con THC o vehículo (10 mg/kg) intraperitonealmente durante 6 días consecutivos entre P55 y P60. 1.3 Población experimental del modelo de “doble impacto” Los estudios se realizaron en 107 ratones de la cepa C57BL/6J. Éstos se repartieron entre los cuatro grupos experimentales de la siguiente forma: ratones nacidos de madres inyectadas con suero salino y tratados en etapas adultas con el vehículo de THC (en adelante nombrados como Salino + Vehículo o controles, siendo 14 machos y 12 hembras), ratones nacidos de madres inyectadas con Poly(I:C) y tratados con el vehículo de THC (Poly(I:C) + Salino, de los cuales 13 fueron machos y 13 hembras), ratones nacidos de madres inyectadas con suero salino y tratados con THC (Salino + THC, divididos en 15 machos y 14 hembras) y por último ratones nacidos de madres inyectadas con Poly(I:C) y tratados con THC (Poly(I:C) + THC o grupo de “doble impacto”, siendo 14 machos y 12 hembras). Se registró el peso en ratones adultos y los ratones se sacrificaron en P75 (Figura 7). 39 IV MATERIALES Y MÉTODOS Figura 7. Esquema del diseño experimental del modelo de “doble impacto”. Abreviaturas: control de calidad (CC), tapón mucoso (TM), día de gestación (G), día postnatal (P) (creado mediante Biorender.com). 2. Generación del modelo transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 En trabajos previos del grupo, se ha descrito una sobreexpresión del gen ADAMTS2 en sangre periférica de pacientes de primeros episodios de psicosis, y una normalización de la expresión tras el tratamiento con AP (Crespo-Facorro et al., 2015; Ruso-Julve et al., 2019). Asimismo, se ha descrito que ADAMTS2 participa en el procesamiento de Reelina, una proteína estrechamente relacionada con la esquizofrenia (Yamakage et al., 2019). Con el fin de profundizar en la relación entre ADAMTS2 y esta enfermedad, se ha generado un modelo de ratón transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 en regiones cerebrales. 2.1 Generación del transgén CAG-ADAMTS2-GFP La construcción CAG-ADAMTS2-GFP se creó para la generación de un modelo transgénico de ratón (Figura 8). El transgén se generó a partir del vector pR26 CAG/GFP Dest (Chu et al., 2016) adquirido a Addgene. Este vector contiene un promotor CAG, un codón de STOP flanqueado por dos secuencias loxP, una región de destino con secuencias attR para permitir el clonaje y un reportero GFP (proteína fluorescente verde, en sus siglas en inglés). 46 IV MATERIALES Y MÉTODOS Parámetro analizado Procedimiento a evaluar Reflejo de enderezamiento Capacidad de volver a postura normal tras ser colocado en decúbito prono Postura Suspensión por la cola Posición corporal y actividades espontáneas Temblores, espasmos, saltos Visión Estiramiento de extremidades anteriores al ser acercado a una superficie suspendido por la cola Fuerza de agarre Capacidad de agarre a una rejilla horizontal tras ser volteada para colocarlos boca abajo durante 1 minuto Reflejos faciales Movimiento de oreja, bigotes o cierre del ojo tras estimulación táctil Reflejo auricular o de sobresalto auditivo Sobresalto tras oír un ruido fuerte y seco Tabla 2. Ensayos de evaluación del protocolo SHIRPA realizados. 4.3 Evaluación de síntomas positivos 4.3.1 Test de campo abierto El test de campo abierto se utilizó para evaluar locomoción y ansiedad y se llevó a cabo en una caja de metacrilato opaco gris de 50 cm de lado (Panlab Harvard Apparatus). El ensayo tuvo una duración total de 15 minutos, durante los cuales se permitió al ratón explorar libremente el espacio mientras se grabó su movimiento con una cámara cenital. Se delimitaron dos zonas dentro del campo abierto: el centro (cuadrado central de 30 cm de lado) y la periferia (resto del área) (Figura 11) (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Se analizó la distancia recorrida, el tiempo en cada zona, el número de entradas al centro y la velocidad mediante el software Smart Video Tracking (Panlab Harvard Apparatus). 47 IV MATERIALES Y MÉTODOS Figura 11. Esquema cenital del test de campo abierto (creado mediante Biorender.com). 4.3.2 Test de acicalamiento El test de acicalamiento se realizó para la evaluación de comportamiento repetitivo o estereotipias. El ratón fue habituado a una jaula de estabulación con tapadera, limpia y sin serrín durante 10 minutos. Su comportamiento posterior fue grabado durante los siguientes 10 minutos (Figura 12) (Lan et al., 2023). El tiempo de acicalamiento y número de eventos (tiempo mínimo de acicalamiento de 2 segundos) se cuantificaron manualmente por el experimentador. Figura 12. Esquema lateral del test de acicalamiento (creado mediante Biorender.com). 4.3.3 Respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso El ensayo de respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso se realizó para analizar el filtrado sensorimotor involucrado en el procesamiento selectivo de información. El aparato consistió en una cámara negra de 25 x 25 x 25 cm colocada dentro de una caja de insonorización de 67 x 53 x 55 cm. El suelo de la cámara negra consistía en una rejilla que registraba el peso y movimiento del ratón. El ratón se colocó en un cilindro de inmovilización durante el ensayo bajo un ruido blanco constante de 65 dB. Se realizaron protocolos diferentes para cada modelo de ratón. 48 IV MATERIALES Y MÉTODOS Para el modelo de “doble impacto”, el protocolo consistió en una primera fase de exploración de 5 minutos, seguida de un bloque de 6 pulsos en un orden pseudoaleatorio de 3 intensidades (100, 110 y 120 dB). Tras un periodo de 100 ms, el ratón se sometió a otro bloque de 160 estímulos en un orden pseudoaleatorio distribuidos entre los siguientes tipos: no estímulo, pulso (100, 110 o 120 dB), prepulso (71, 77 u 83 dB) o las 9 combinaciones posibles de prepulso-pulso) (Li et al., 2009). En cuanto al modelo transgénico, el protocolo comenzó con la misma fase de exploración, seguida de cinco pulsos de 120 dB. A continuación, se sometió al ratón a un bloque de 25 combinaciones de 5 tipos de prepulsos (0, 69, 73, 77 y 81 dB) y pulsos de 120 dB. La última fase consistió en un bloque de 25 pulsos de distintas intensidades (0, 90, 100, 110 y 120 dB). El orden de los estímulos dentro de cada fase fue pseudoaleatorio (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). En ambos protocolos, los pulsos tuvieron una duración de 40 ms y los prepulsos de 20 ms. Los intervalos entre estímulos fueron de 10, 15 o 20 segundos. La respuesta de sobresalto se cuantificó automáticamente mediante el software Packwin (Panlab Harvard Apparatus) (Figura 13). El porcentaje de inhibición se calculó como [(media de respuesta de sobresalto al pulso – media de respuesta de sobresalto a la combinación prepulso-pulso) / media de respuesta de sobresalto al pulso] x 100 (Li et al., 2009; Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 13. Esquema frontal del test de respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso (creado mediante Biorender.com). 49 IV MATERIALES Y MÉTODOS 4.3.4 Test de enterramiento de canicas El test de enterramiento de canicas se realizó para evaluar comportamiento repetitivo y ansiedad. El ratón se colocó en una jaula con 4 cm de profundidad de serrín y 20 canicas distribuidas en 5 filas de 4 canicas cada una (Figura 14). El comportamiento del ratón fue grabado cenitalmente y el experimentador cuantificó el tiempo excavando durante 30 minutos. Al finalizar el test, se anotó el número de canicas enterradas. La canica debía tener dos tercios de su superficie cubiertos de serrín para considerarse enterrada (Simmons et al., 2021). Figura 14. Esquema cenital del test de enterramiento de canicas (creado mediante Biorender.com). A, Representación inicial del test. B, Representación final del test. 4.3.5 Test de placa caliente El test de placa caliente (Panlab Harvard Apparatus) sirvió para evaluar la sensibilidad al calor estableciendo una temperatura de 55 °C (Figura 15). El test consistió en un cilindro de 20 cm de diámetro cuya base se calentaba a 55 °C. El experimentador cuantificó el tiempo en lamerse las patas delanteras o traseras (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 15. Esquema frontal del test de placa caliente (creado mediante Biorender.com). 50 IV MATERIALES Y MÉTODOS 4.3.6 Test de Rotarod El Rotarod (Panlab Harvard Apparatus) se utilizó para evaluar coordinación y aprendizaje motor mediante un protocolo de 3 días de duración en total. El aparato consistía en un eje cilíndrico motorizado capaz de girar a una velocidad constante o creciente determinada por el experimentador (Figura 16). Figura 16. Esquema frontal del test Rotarod (creado mediante Biorender.com). Durante el primer día, el experimentador enseñó al ratón a caminar sobre el cilindro hacia adelante a una velocidad de 4 rpm durante 3 minutos (fase de habituación). Esta habituación se repitió 3 veces al día durante el test con una duración de 1 minuto por repetición. A continuación, la fase de test consistió en 3 repeticiones al día durante 3 días consecutivos. En esta etapa, el aparato se programó para acelerar de 4 a 40 rpm a lo largo de 5 minutos (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). La latencia en caer fue analizada de forma automática por el aparato (Panlab Harvard Apparatus). 4.4 Evaluación de síntomas negativos 4.4.1 Test de las tres salas El test de las tres salas se realizó para evaluar preferencia y novedad social. El test estaba dividido en tres compartimentos de plexiglás transparente, cada uno con unas medidas de 42 x 20 cm (medidas totales de 42 x 60 cm) y comunicados entre sí por 51 IV MATERIALES Y MÉTODOS puertas (Panlab Harvard Apparatus) (Figura 17). Una jaula de base circular fue colocada en las salas de los extremos. El test consistió en tres fases de 10 minutos cada una. Durante la primera, se permitió al ratón explorar libremente las 3 salas con las jaulas vacías como fase de exploración. Posteriormente, durante la fase de preferencia social, se colocó un objeto en una de las jaulas y un ratón de la misma edad y sexo en la otra como señuelo y se permitió al ratón interaccionar con ambos. El tiempo de interacción con el objeto y con el ratón fueron cuantificados manualmente por el experimentador. Por último, en la fase de novedad social, el ratón pudo interaccionar con el señuelo de la fase anterior (ahora denominado ratón familiar) y otro ratón señuelo (denominado ratón nuevo). El tiempo de interacción con ambos señuelos fue cuantificado manualmente por el experimentador. La localización de las jaulas fue alternada aleatoriamente entre ratones durante las dos últimas fases del ensayo. El índice social y el de memoria fueron calculados como [(tiempo de interacción con ratón o ratón nuevo - tiempo de interacción con objeto o ratón familiar) / (tiempo de interacción con ratón o ratón nuevo + tiempo de interacción con objeto o ratón familiar)] (adaptado de Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 17. Esquema lateral del test de las tres salas (creado mediante Biorender.com). A, Fase de exploración. B, Fase de preferencia social. C, Fase de novedad social. 52 IV MATERIALES Y MÉTODOS 4.4.2 Test del tubo El test del tubo se realizó para evaluar dominancia. Se establecieron parejas de ratones de distintos grupos experimentales, pero del mismo sexo y se colocaron a cada extremo de un tubo de plexiglás transparente de 3 cm de diámetro durante un tiempo máximo de 2 minutos (Figura 18). En cada ensayo, el experimentador anotó cuál de los dos ratones salió primero completamente del tubo. Cada ratón se enfrentó a dos animales de los distintos grupos experimentales. El porcentaje de vencimiento se calculó como [(ensayos vencidos / ensayos totales) x 100] (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 18. Esquema lateral del test del tubo (creado mediante Biorender.com). 4.4.3 Suspensión por la cola El test de suspensión por la cola sirvió para analizar apatía y comportamiento depresivo (Can et al., 2011). El ratón se suspendió por la cola durante un tiempo de 6 minutos y se cuantificó manualmente el tiempo de actividad (Figura 19). Se consideró como actividad cualquier movimiento voluntario del ratón (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 19. Esquema del test de suspensión por cola (creado mediante Biorender.com). 53 IV MATERIALES Y MÉTODOS 4.5 Evaluación de síntomas cognitivos 4.5.1 Reconocimiento de objeto nuevo El ensayo de reconocimiento de objeto nuevo se llevó a cabo para evaluar la memoria a corto plazo. En el test de campo abierto, el ratón pudo explorar libremente durante 10 minutos dos objetos idénticos colocados a la misma distancia entre ellos y de las paredes (fase de retención). Tras un periodo de 3 horas, se sustituyó uno de los objetos por otro nuevo de diferente forma, textura y color, y se grabó de forma cenital el comportamiento del ratón durante otros 10 minutos (fase de memoria) (Figura 20). Esta última fase se realizó tras un periodo de 3 horas para evaluar la memoria a corto plazo. El tiempo de interacción con los objetos familiar y nuevo fueron cuantificados manualmente por el experimentador. Los dos objetos utilizados fueron asociados como familiar o nuevo para cada ratón de forma aleatoria. El índice de memoria fue calculado como [(tiempo de interacción con objeto nuevo - tiempo de interacción con objeto familiar) / (tiempo de interacción con objeto nuevo + tiempo de interacción con objeto familiar)] (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 20. Esquema del test de reconocimiento de objeto nuevo (creado mediante Biorender.com). A, Fase de retención. B, Fase de memoria. C, Objetos utilizados. 4.5.2 Laberinto en Y El laberinto en Y se realizó para evaluar memoria de alternancia. El test estaba formado por 3 brazos (denominados A, B y C) de 6 x 30 cm cada uno de metacrilato opaco gris colocados en un ángulo de 120° (Figura 21). Se permitió al ratón explorar 54 IV MATERIALES Y MÉTODOS libremente el laberinto durante 5 minutos y se grabó cenitalmente. Se evaluó la distancia recorrida, el número de entradas a cada brazo y el tiempo en cada uno de ellos mediante el software Smart Video Tracking (Panlab Harvard Apparatus). El número total de tríadas, definidas como entradas consecutivas en brazos diferentes, se calculó como [número total de entradas – 2]. El porcentaje de alternancia se determinó como [(número de alternancias / total de tríadas) x 100] (Behavioral and Functional Neuroscience Laboratory, Stanford Medicine). Figura 21. Esquema del test de laberinto en Y (creado mediante Biorender.com). 5. Técnicas bioquímicas para análisis de proteínas 5.1 Obtención de muestras de tejido fresco Los ratones destinados a la obtención de tejido fresco se sacrificaron mediante dislocación cervical y el experimentador extrajo el cerebro con una espátula. El cerebro se colocó en una placa de 6 cm de diámetro con tampón fosfato salino frío (PBS) para su disección bajo la lupa. Se anotó el peso del cerebro y se colocó sobre una matriz de corte (Agnthos) en la que se cortó la corteza prefrontal (2 mm de grosor). El resto del cerebro se diseccionó mediante pinzas de punta fina Dumont #5 (Fine Scientific Tools) en las regiones de interés (resto de corteza, hipocampo y estriado). Las muestras se congelaron inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. 55 IV MATERIALES Y MÉTODOS 5.2 Análisis de proteínas mediante Western blot 5.2.1 Obtención de lisados a partir de tejido Las proteínas de las regiones de interés diseccionadas fueron extraídas mediante tampón de lisis TPER (Thermofisher Scientific) con inhibidores de fosfatasas (Sigma- Aldrich) y proteasas (Sigma-Aldrich). El volumen de tampón fue de 800 µl para corteza y 200 µl para el resto de regiones cerebrales (corteza prefrontal, hipocampo y estriado). El tejido se disgregó mecánicamente mediante 10 pulsos con un pistilo unido a un homogeneizador portátil a motor (VWR) y, tras un intervalo de 10 minutos en hielo, las muestras se disgregaron mediante 6 pases con jeringuilla de insulina (BD Micro-Fine). Todo el protocolo se realizó con las muestras en hielo. El lisado se centrifugó durante 10 minutos a 10000 x g a 4 °C y se almacenó el sobrenadante en tubos de 1.5 ml. Se usaron 25-40 µg de muestra en función de la proteína analizada. La concentración de proteínas se cuantificó mediante el BCA protein assay kit (Thermofisher Scientific). 5.2.2 Técnica de Western blot El volumen de muestra necesario para obtener la cantidad de proteína deseada se diluyó en tampón de lisis TPER y se añadió tampón de carga (Bio-Rad) con βmercaptoetanol (Sigma-Aldrich). Las muestras se hirvieron durante 5 o 10 minutos a 95 °C. Se prepararon los geles de SDS-Bis-Acrilamida con un grosor de 1 mm y 10 o 15 carriles. Se usaron mezclas de acrilamida: bis-acrilamida de 37.5:1 (Bio-Rad). Los geles contenían dos partes, la superior (stacking, solución apiladora) y la inferior (running, solución separadora). Los geles fueron de porcentajes de 6-12% en función de la proteína a separar. La electroforesis se llevó a cabo en el sistema mini-Protean (Bio- Rad) con el tampón Tris-Glicina-SDS (25 mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS). En el primer pocillo del gel se colocó el marcador de peso molecular (Thermofisher Scientific) y en el resto las muestras a testar. La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 100 V. La transferencia de las proteínas separadas se realizó a una 62 IV MATERIALES Y MÉTODOS Anticuerpo Especie de origen Dilución de uso Casa comercial anti-ratón-HRP Cabra 1:5000 Amersham anti-conejo-HRP Burro 1:5000 Amersham anti-pollo-HRP Conejo 1:5000 Jackson ImmunoResearch anti-ratón-594 Cabra 1:500 Life Technologies anti-ratón-647 Cabra 1:800 Invitrogen anti-conejo-594 Burro 1:500 Life Technologies anti-pollo-488 Cabra 1:800 Invitrogen Tabla 4. Anticuerpos secundarios utilizados. Sonda Taqman Especie Casa comercial IL-6 Ratón Thermofisher TNFα Ratón Thermofisher GADPH Ratón Thermofisher Tabla 5. Sondas Taqman utilizadas. 9. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism. Todos los datos están representados como la media ± la desviación estándar. La significancia se estableció en p < 0.05. Los tests estadísticos realizados fueron Student’s t-test, one-way ANOVA o twoway ANOVA en función del parámetro analizado y el número de grupos experimentales. V. RESULTADOS 65 V RESULTADOS 1. Modelo de “doble impacto” 1.1 Evaluación de la activación inmune materna mediante Poly(I:C) 1.1.1 Control de calidad del efecto del Poly(I:C) mediante la evaluación del peso y la temperatura maternos El Poly(I:C) es un análogo sintético de ARN de doble cadena que provoca una respuesta de AIM al ser inyectado en hembras gestantes. Estas hembras se sometieron a dos controles de calidad para evaluar la respuesta inflamatoria provocada. Se registró tanto la temperatura como el peso de las hembras gestantes en varios puntos temporales: previo a la infección (basal), a las 3, 6, 24 y 48 horas tras la inyección (control: n=52; Poly(I:C): n=53). En relación al peso, en la literatura se ha descrito que las hembras control aumentan de peso a las 24 horas, mientras que las hembras inyectadas con Poly(I:C) mantienen un peso estable o presentan una disminución del mismo (Chow et al., 2016; Lecca et al., 2019). Las hembras control aumentaron un 2.75% de peso a las 24 horas con respecto a su peso basal, mientras que las hembras inyectadas con Poly(I:C) disminuyeron su peso corporal un 5.37%, por lo que el grupo Poly(I:C) mostró un peso significativamente menor con respecto al grupo control (control: 102.75 ± 0.43; Poly(I:C): 94.63 ± 0.59; p<0.0001. Unidades: porcentaje de peso con respecto al peso basal). A las 48 horas tras la inyección, las hembras inyectadas con Poly(I:C) aumentaron de peso un 1.47% con respecto a su peso basal, pero mantuvieron un peso significativamente menor en comparación con las hembras control (control: 104.64 ± 0.69; Poly(I:C): 101.47 ± 0.76; p<0.0001. Unidades: porcentaje de peso con respecto al peso basal) (Figura 22A). En segundo lugar, se ha descrito que la temperatura de las hembras inyectadas con Poly(I:C) disminuye entre 0.5 y 1 °C a las 3 horas y aumenta progresivamente a las 6 y 24 horas, hasta finalmente volver a la temperatura basal a las 48 horas (Chow et al., 2016; Mueller et al., 2019). Las hembras control mantuvieron una temperatura constante en todos los puntos temporales analizados. Sin embargo, las hembras inyectadas con Poly(I:C) mostraron una curva de temperatura similar a la descrita en la literatura, mostrando diferencias significativas con respecto al grupo control a las 66 V RESULTADOS 3 (control: 36.43 ± 0.01; Poly(I:C): 36.28 ± 0.03. Unidades: °C) y a las 24 horas (control: 36.46 ± 0.01; Poly(I:C): 36.72 ± 0.05. Unidades: °C) (Figura 22B). En resumen, se ha validado la AIM provocada con la inyección con Poly(I:C) en las hembras gestantes mediante la evaluación del peso y la temperatura de las mismas. Figura 22. Control de calidad de la infección provocada mediante la inyección con Poly(I:C). A, Curva de peso de hembras gestantes. B, Curva de temperatura de hembras gestantes (Control: n=52; Poly(I:C): n=53). Análisis estadístico utilizado: two-way ANOVA con post-hoc Sidak. p-value: ***p<0.001; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. 1.1.2 Niveles de citoquinas en bazo materno y embriones La respuesta inflamatoria aguda se estudió tanto en el bazo de las hembras gestantes (n=2 por grupo) como en los embriones (con placenta) (n=6 por grupo) mediante qPCR a las 3 horas tras la inyección en G9 (protocolo descrito en el apartado 7 de Materiales y Métodos). Las hembras gestantes inyectadas con Poly(I:C) mostraron unos niveles significativamente mayores en el bazo de IL-6 (Salino: 1.00 ± 0.15; Poly(I:C): 98.91 ± 2.64. Unidades: expresión génica relativa) y TNFα (Salino: 1.00 ± 0.04; Poly(I:C): 6.66 ± 0.16. Unidades: expresión génica relativa) con respecto a las hembras control (Figura 23A). Se obtuvieron unos resultados similares en embriones, tanto en IL-6 (Salino: 1.00 ± 0.09; Poly(I:C): 24.70 ± 3.32. Unidades: expresión génica relativa) como en TNFα (Salino: 1.00 ± 0.05; Poly(I:C): 2.27 ± 0.31. Unidades: expresión génica relativa) (Figura 23B). En conjunto, la sobreexpresión de estas citoquinas proinflamatorias tanto en bazo materno como en los embriones a las 3 horas tras la inyección con Poly(I:C) va en la línea de los resultados descritos en la 67 V RESULTADOS literatura (Chow et al., 2016; Hameete et al., 2021) y se corrobora, por tanto, la respuesta inmune materna provocada en los animales. Figura 23. Expresión de citoquinas proinflamatorias a las 3 horas tras la inyección. A, Niveles de IL-6 y TNFα en bazo de hembras gestantes (n=2 por grupo). B, Niveles de IL-6 y TNFα en embriones con placenta (n=6 por grupo). La expresión se normalizó a GADPH. Análisis estadístico utilizado: t-test. pvalue: **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. 1.2 Efecto de THC en el peso El consumo de cannabis está relacionado con alteraciones tanto en el apetito como en el peso corporal (Williams y Kirkham, 2002; Farrimond et al., 2012; Fearby et al., 2022). Los resultados no mostraron diferencias significativas en el peso corporal antes del tratamiento con THC (P55) o al finalizar el tratamiento (P60) entre grupos de tratamiento o sexo (Figura 69 de Anexo 1). También se registró el peso del ratón y el cerebro en el momento del sacrificio (P75) para evaluar el efecto del tratamiento con THC tras el comportamiento. Los ratones machos del grupo Salino + THC mostraron un peso corporal reducido con respecto a los Poly(I:C) + Vehículo (Salino + Vehículo: 23.68 68 V RESULTADOS ± 0.55; Poly(I:C) + Vehículo: 24.03 ± 0.55; Salino + THC: 22.25 ± 0.26; Poly(I:C) + THC: 22.63 ± 0.41. Unidades: g). No presentaron diferencias de peso del cerebro completo. Al normalizar el peso del cerebro al peso corporal, se observó una mayor ratio en el grupo de “doble impacto” (Salino + Vehículo: 0.019 ± 0.0003; Poly(I:C) + Vehículo: 0.018 ± 0.0003; Salino + THC: 0.019 ± 0.0002; Poly(I:C) + THC: 0.020 ± 0.0002), debido a la reducción de peso corporal. Por lo tanto, la combinación de ambos impactos causa una reducción del peso corporal en machos sin afectar al peso del cerebro (Figura 24). En cuanto a las hembras, no se observaron diferencias entre grupos en el peso corporal. Sin embargo, las hembras del grupo Poly(I:C) + THC mostraron un aumento del peso del cerebro en comparación con el grupo Salino + THC (Salino + Vehículo: 0.45 ± 0.004; Poly(I:C) + Vehículo: 0.44 ± 0.005; Salino + THC: 0.44 ± 0.003; Poly(I:C) + THC: 0.45 ± 0.004. Unidades: g). Al normalizar el peso del cerebro con el peso corporal, estas diferencias no fueron significativas. Por lo tanto, se observa una disminución del peso corporal en machos tratados con THC, mientras que las hembras no presentan una alteración significativa de este parámetro. Figura 24. Peso del cuerpo y cerebro de los ratones del modelo de “doble impacto”. La ratio se calcula como el peso del cerebro normalizado al peso corporal del ratón. N=9-12/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. 69 V RESULTADOS 1.3 Caracterización conductual del modelo de “doble impacto” Gran parte del diagnóstico de las enfermedades psiquiátricas como la esquizofrenia se basa en la evaluación de los síntomas positivos, negativos y cognitivos del paciente. Para evaluar si la infección prenatal con Poly(I:C) y el tratamiento con THC postnatal provocaba defectos asociados a la enfermedad de esquizofrenia, se llevó a cabo una batería conductual en los ratones del modelo de “doble impacto”. Los pacientes de esquizofrenia presentan síntomas diversos como delirios, alucinaciones, lenguaje o comportamiento desorganizado y deterioro cognitivo. Estos síntomas se pueden categorizar como positivos, negativos y cognitivos (Patel et al., 2014; American Psychiatric Association, 2021). Por ello, se realizaron los tests de campo abierto, acicalamiento, respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso, test de placa caliente y Rotarod para evaluar los síntomas positivos. Por otro lado, se incluyeron los tests de las tres salas y el test del tubo para evaluar el comportamiento social relacionado con los síntomas negativos de la enfermedad. También se evaluaron los síntomas cognitivos mediante el test de reconocimiento de objeto nuevo y el laberinto en Y. 1.3.1 Población de ratones para comportamiento En todas las pruebas conductuales descritas a continuación, se han utilizado 107 ratones del modelo de “doble impacto”, nacidos de madres tratadas con Poly(I:C) o suero salino en G9 e inyectados con THC o vehículo intraperitonealmente durante 6 días consecutivos entre P55 y P60. Se utilizaron tanto machos (Salino + Vehículo: n=14; Poly(I:C) + Vehículo: n=13; Salino + THC: n=15; Poly(I:C) + THC: n=14) como hembras (Salino + Vehículo: n=12; Poly(I:C) + Vehículo: n=13; Salino + THC: n=14; Poly(I:C) + THC: n=12). Las pruebas de comportamiento se realizaron entre P61 y P74 y se ordenaron de menos a más estresantes. 70 V RESULTADOS 1.3.2 Evaluación general del estado de los animales La evaluación de las funciones sensoriales y musculares de los ratones se llevó a cabo mediante el análisis SHIRPA (Rogers et al., 1997) descrito en el apartado 4.2 de Materiales y Métodos de esta Tesis Doctoral. No se detectaron diferencias en dicho análisis entre grupos ni entre sexos (no mostrado), por lo que todos los animales disponibles fueron aptos para la caracterización conductual realizada. 1.3.3 Evaluación de síntomas positivos Los síntomas positivos presentes en los pacientes con esquizofrenia incluyen delirios, alucinaciones y comportamiento motor alterado con distintos grados de gravedad (Patel et al., 2014; American Psychiatric Association, 2021). Para evaluar los posibles defectos relacionados con los síntomas positivos de la enfermedad de esquizofrenia en el modelo de “doble impacto”, se realizaron los tests de campo abierto, acicalamiento, respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso, test de placa caliente y Rotarod. 1.3.3.1 Test de campo abierto El test de campo abierto permitió la evaluación de parámetros relacionados con la locomoción y la ansiedad de los ratones, mediante el análisis de la distancia recorrida total y por zonas, la velocidad media, el tiempo de estancia en cada área y el número de entradas al centro (protocolo descrito en el apartado 4.3.1 de Materiales y Métodos) (Figura 25A). Estos parámetros no suelen estar afectados tras un periodo prolongado tras la última exposición a THC (Harte y Dow-Edwards, 2010; Kasten et al., 2019), pero un tratamiento agudo con THC puede alterar la ansiedad y la locomoción general en ratones (Kasten et al., 2019). 71 V RESULTADOS Figura 25. Test de campo abierto en el modelo de “doble impacto”. A, Vista cenital del test. B, Recorrido representativo de un ratón de cada grupo experimental. C, Distancia total recorrida. D, Distancia recorrida por zonas. E, Velocidad media. N=12-15/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. p-value: *p<0.05; **p<0.01. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. 78 V RESULTADOS Figura 30. Fase de preferencia social del test de las tres salas en el modelo de “doble impacto”. A, Vista cenital del test (fase de preferencia social). B, Índice social. C, Cuantificación del tiempo de interacción con el ratón señuelo y el objeto. D, Tiempo total de interacción. N=12-15/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. p-value: *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. En cuanto a la fase de novedad social (Figura 31A), los machos de los grupos de un solo impacto mostraron un índice de memoria reducido con respecto a los controles. Esta reducción se vio incrementada en el grupo de “doble impacto” (Salino + Vehículo: 0.33 ± 0.07; Poly(I:C) + Vehículo: 0.14 ± 0.06; Salino + THC: 0.09 79 V RESULTADOS ± 0.08; Poly(I:C) + THC: -0.04 ± 0.08) (Figura 31B). Estos resultados se corroboraron al analizar el tiempo de interacción con los ratones señuelos nuevo y familiar (Figura 31C). El grupo Poly(I:C) + THC mostró un tiempo total de interacción menor en comparación con el grupo control (Salino + Vehículo: 82.79 ± 6.46; Poly(I:C) + Vehículo: 84.85 ± 5.89; Salino + THC: 73.23 ± 5.23; Poly(I:C) + THC: 58.44 ± 4.93. Unidades: s) (Figura 31D). Se observó una tendencia similar en hembras en el índice de memoria (Salino + Vehículo: 0.36 ± 0.05; Poly(I:C) + Vehículo: 0.09 ± 0.12; Salino + THC: 0.06 ± 0.08; Poly(I:C) + THC: 0.03 ± 0.09) (Figura 31B) y el tiempo de interacción con los ratones señuelos nuevo y familiar (Figura 31C). Figura 31. Fase de novedad social del test de las tres salas en el modelo de “doble impacto”. A, Vista cenital del test (fase de novedad social). B, Índice de memoria. C, Cuantificación del tiempo de 80 V RESULTADOS interacción con los ratones señuelos nuevo y familiar. D, Tiempo total de interacción. N=12- 15/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. p-value: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. En resumen, mientras que no se observan diferencias significativas en relación a la preferencia social, se hallaron defectos en la evaluación de la novedad social en los tres grupos experimentales con respecto a los controles, siendo estas diferencias más acusadas en el grupo de “doble impacto” en ambos sexos. 1.3.4.2 Test del tubo El test del tubo se realizó para analizar la dominancia social en el modelo (protocolo descrito en el apartado 4.4.2 de Materiales y Métodos) (Figura 32A). Al analizar el porcentaje de victorias, se observó en machos que el grupo de “doble impacto” presentó un porcentaje de victorias significativamente menor con respecto a los grupos control y Salino + THC (Salino + Vehículo: 57.69 ± 4.92; Poly(I:C) + Vehículo: 54.43 ± 8.44; Salino + THC: 55.65 ± 7.12; Poly(I:C) + THC: 29.72 ± 6.62. Unidades: porcentaje de victorias) (Figura 32B). En cuanto a las hembras, el grupo Poly(I:C) + THC mostró un porcentaje de victorias similar al grupo control. Sin embargo, se observó un porcentaje significativamente menor en el grupo Salino + THC con respecto al grupo Poly(I:C) + Vehículo (Salino + Vehículo: 49.35 ± 9.13; Poly(I:C) + Vehículo: 72.15 ± 7.05; Salino + THC: 21.21 ± 3.95; Poly(I:C) + THC: 48.75 ± 9.84. Unidades: porcentaje de victorias) (Figura 32B). Al analizar los enfrentamientos por parejas de grupos experimentales, se observó una menor dominancia significativa en el grupo Poly(I:C) + THC en machos con respecto al grupo control (Salino + Vehículo: 72.57 ± 8.49; Poly(I:C) + THC: 26.92 ± 9.16. Unidades: porcentaje de victorias), el grupo Poly(I:C) + Vehículo (Poly(I:C) + Vehículo: 63.67 ± 11.22; Poly(I:C) + THC: 29.46 ± 11.96. Unidades: porcentaje de victorias) y el grupo Salino + THC (Salino + THC: 73.33 ± 8.26; Poly(I:C) + THC: 28.85 ± 10.53. Unidades: porcentaje de victorias) (Figura 32C). En el resto de comparaciones entre grupos, no se observaron diferencias (Figura 72 de Anexo 1). 81 V RESULTADOS En cuanto a las hembras, el análisis por parejas corroboró también la mayor dominancia significativa del grupo Poly(I:C) + Vehículo con respecto a los Salino + THC (Poly(I:C) + Vehículo: 88.75 ± 7.43; Salino + THC: 18.18 ± 10.16. Unidades: porcentaje de victorias) y el grupo de “doble impacto”, aunque, en este caso, las diferencias no fueron significativas (Poly(I:C) + Vehículo: 63.64 ± 11.85; Poly(I:C) + THC: 33.33 ± 9.40. Unidades: porcentaje de victorias). Asimismo, se observó una menor dominancia significativa con el grupo de “doble impacto” (Salino + THC: 13.64 ± 7.04; Poly(I:C) + THC: 88.89 ± 6.05. Unidades: porcentaje de victorias) (Figura 32D). 82 V RESULTADOS Figura 32. Test del tubo en el modelo de “doble impacto”. A, Vista lateral del test. B, Cuantificación del porcentaje de victorias general. C, Cuantificación del porcentaje de victorias en machos entre parejas de grupos experimentales. D, Cuantificación del porcentaje de victorias en hembras entre parejas de grupos experimentales. N=12-15/grupo/sexo. Análisis estadísticos utilizados: one-way ANOVA post-hoc Tukey y t-test. p-value: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. No se obtuvieron diferencias entre grupos en las demás comparativas en hembras (Figura 72 de Anexo 1). En conjunto, estos resultados muestran que existe un fenotipo de menor dominancia de forma exclusiva en el grupo de “doble impacto” en machos, mientras que las hembras presentan una mayor dominancia en el grupo Poly(I:C) + Vehículo y menor en el grupo Salino + THC. 1.3.5 Evaluación de síntomas cognitivos Los síntomas cognitivos implican alteraciones en atención y memoria de trabajo, discurso y pensamiento desorganizado y alteraciones en la comunicación (Patel et al., 2014; Yan et al., 2019). Para evaluar las posibles alteraciones cognitivas en el modelo de “doble impacto”, se llevó a cabo el test de reconocimiento de objeto nuevo y el laberinto en Y. 1.3.5.1 Reconocimiento de objeto nuevo La exposición a THC en modelos murinos provoca alteraciones en la memoria de reconocimiento a corto plazo; (Kirschmann et al., 2017; Abush et al., 2018), así como la infección prenatal con Poly(I:C) (Ratnayake et al., 2012; Gray et al., 2019; Sánchez-Hidalgo et al., 2022). El efecto de la AIM por medio de la inyección prenatal en las madres con Poly(I:C) y la exposición postnatal con THC en la memoria de reconocimiento de objeto nuevo se evaluaron a las 3 horas tras la presentación de los objetos familiares (protocolo descrito en el apartado 4.5.1 de Materiales y Métodos) (Figura 33A). Este test tiene una alta relevancia traslacional para los 83 V RESULTADOS síntomas cognitivos de la enfermedad (Shangase et al., 2023). Los machos no mostraron diferencias entre grupos de tratamiento, excepto una tendencia a un menor índice de memoria en el grupo Poly(I:C) + THC (Salino + Vehículo: 0.25 ± 0.03; Poly(I:C) + Vehículo: 0.17 ± 0.06; Salino + THC: 0.27 ± 0.06; Poly(I:C) + THC: 0.11 ± 0.09) (Figura 33B). Sin embargo, las hembras Poly(I:C) + Vehículo sí presentaron una reducción significativa de este parámetro con respecto al resto de grupos (Salino + Vehículo: 0.24 ± 0.05; Poly(I:C) + Vehículo: -0.03 ± 0.10; Salino + THC: 0.35 ± 0.05; Poly(I:C) + THC: 0.26 ± 0.06) (Figura 33B). No se observaron diferencias significativas entre grupos en el tiempo de interacción total (Figura 73 de Anexo 1). En resumen, no se observan defectos cognitivos en el modelo de “doble impacto”, a excepción del grupo Poly(I:C) + Vehículo en hembras. Figura 33. Test de reconocimiento de objeto nuevo en el modelo de “doble impacto”. A, Vista cenital del test (fase de retención y fase de memoria). B, Índice de memoria. N=12-15/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. p-value: *p<0.05; **p<0.01. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. 1.3.5.2 Laberinto en Y El test del laberinto en Y se realizó para estudiar los posibles defectos en memoria de alternancia en el modelo de “doble impacto” (protocolo descrito en el apartado 4.5.2 de Materiales y Métodos) (Figura 34A). No se encontraron diferencias entre grupos de tratamiento independientemente del sexo (Figura 34B). 84 V RESULTADOS Figura 34. Test del laberinto en Y en el modelo de “doble impacto”. A, Vista cenital del test. B, Porcentaje de alternancia. N=12-15/grupo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA posthoc Tukey. Todas las barras de error son SEM. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. 1.3.6 Resumen del comportamiento del modelo de “doble impacto” A continuación, se resumen en la siguiente tabla los tests de comportamiento realizados en el modelo y los grupos experimentales en los que se hallaron defectos, así como los tests en los que la exposición a THC ha provocado un empeoramiento de los efectos provocados por la infección mediante Poly(I:C) (Tabla 6). Grupo experimental Test Machos Hembras ¿Doble impacto? P+V S+T P+T P+V S+T P+T Campo abierto Acicalamiento ♂ Respuesta de sobresalto Placa caliente Rotarod Tres salas ♂ y ♀︎ Tubo ♂ Reconocimiento de objeto nuevo Laberinto en Y Tabla 6. Tabla resumen de los efectos en comportamiento hallados en los grupos experimentales del modelo de “doble impacto” en machos y hembras. Abreviaturas: P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC; ♂: Machos; ♀︎: Hembras. El color gris indica el grupo experimental en el que se han observado diferencias en cada test. 85 V RESULTADOS 1.4 Estudio de proteómica El estudio de proteómica se realizó en lisados de corteza prefrontal del modelo de “doble impacto”, tanto en machos como en hembras (protocolo descrito en el apartado 5.3 de Materiales y Métodos). Se llevaron a cabo las comparaciones entre todos los grupos de tratamiento con respecto a los controles, así como la comparación entre los grupos de un solo impacto (Poly(I:C) + Vehículo y Salino + THC) con respecto al grupo Poly(I:C) + THC. El número total de proteínas con una expresión significativamente distinta entre grupos de tratamiento aparece en la Tabla 7. Destaca especialmente el elevado número de marcadores diferentes en las comparaciones en hembras en contraste con los machos, lo que recalca la influencia de los ciclos hormonales en hembras en numerosos mecanismos. Sexo Comparación Marcadores diferentes Machos S+V / P+V 63 S+V / S+T 157 S+V / P+T 73 P+V / P+T 49 S+T / P+T 84 Hembras S+V / P+V 423 S+V / S+T 135 S+V / P+T 618 P+V / P+T 114 S+T / P+T 243 Tabla 7. Número total de proteínas con expresión significativamente diferente entre grupos de tratamiento del modelo de “doble impacto”. Abreviaturas: S+V: Salino + Vehículo; P+V: Poly(I:C) + Vehículo; S+T: Salino + THC; P+T: Poly(I:C) + THC. La realización del estudio IPA permitió observar las posibles rutas de señalización alteradas, definidas como aquellas con un Z-score superior a 2 o inferior a -2. La lista completa de las vías alteradas para cada comparación está detallada en el Anexo 3 de esta Tesis Doctoral. De entre las alteradas de mayor relevancia para la esquizofrenia, 86 V RESULTADOS se encontraron las rutas de señalización de las interleuquinas (IL-) IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL17A e IL-33, así como de receptores glutamatérgicos y serotoninérgicos. También se obtuvieron alteraciones de las vías de maduración de células dendríticas, sinaptogénesis, potenciación y depresión sináptica a largo plazo y sinapsis neuronal endocannabinoide. Una de las rutas que más destacó debido a su interés en el contexto de la enfermedad de la esquizofrenia, y de esta Tesis Doctoral, fue la ruta de señalización de Reelina en neuronas, la cual apareció alterada significativamente en los ratones Salino + THC con respecto a sus controles en machos, y al comparar los tres grupos de tratamiento (Poly(I:C) + Vehículo, Salino + THC y Poly(I:C) + THC) con respecto a sus controles en hembras. Debido a la relevancia de este marcador tanto en modelos animales establecidos de la enfermedad como en pacientes de la misma, se decidió corroborar su alteración en el modelo de “doble impacto”. Por consiguiente, se procedió a validar la alteración de Reelina en la región de corteza prefrontal para evaluar su expresión a nivel de proteínas (apartado 1.5 de Resultados), así como a realizar la cuantificación de la densidad de células positivas para Reelina en dicha región (apartado 1.6 de Resultados). 1.5 Análisis de la expresión de Reelina Los resultados obtenidos en el estudio de proteómica con respecto a la alteración de la ruta de señalización de Reelina se comprobaron mediante Western blot en lisados de muestras de corteza prefrontal de los ratones del modelo de “doble impacto” de ambos sexos (protocolo descrito en el apartado 5.2 de Materiales y Métodos) (Figura 35A). Se estudiaron los niveles de expresión de Reelina (tanto proteína completa como su fragmento N-R2) y de Dab1. En machos, se observó una reducción de la expresión de Reelina completa en el grupo Salino + THC con respecto al resto de grupos de tratamiento, siendo significativa con respecto al grupo de “doble impacto” (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.11; Poly(I:C) + Vehículo: 0.94 ± 0.18; Salino + THC: 0.52 ± 0.06; Poly(I:C) + THC: 1.32 ± 0.10). El 87 V RESULTADOS fragmento N-R2, sin embargo, tuvo una menor expresión en los grupos tratados con THC, independientemente del primer impacto (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.21; Poly(I:C) + Vehículo: 0.98 ± 0.14; Salino + THC: 0.55 ± 0.09; Poly(I:C) + THC: 0.76 ± 0.05). Con respecto a Dab1, no se observaron diferencias significativas entre grupos, aunque hubo una mayor expresión en los animales Poly(I:C) + Vehículo, y una menor expresión en los ratones de “doble impacto” con respecto al grupo control (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.23; Poly(I:C) + Vehículo: 1.53 ± 0.55; Salino + THC: 0.99 ± 0.08; Poly(I:C) + THC: 0.60 ± 0.24) (Figura 35B). Asimismo, también se observó una reducción no significativa de Reelina completa en los tres grupos de tratamiento con respecto a los controles en hembras, siendo más marcada esta reducción en el grupo Salino + THC (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.26; Poly(I:C) + Vehículo: 0.80 ± 0.11; Salino + THC: 0.41 ± 0.07; Poly(I:C) + THC: 0.64 ± 0.15). Con respecto al fragmento N-R2, se obtuvieron resultados similares (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.40; Poly(I:C) + Vehículo: 0.52 ± 0.18; Salino + THC: 0.12 ± 0.02; Poly(I:C) + THC: 0.40 ± 0.09) (Figura 35C). Se obtuvo, por tanto, una reducción de los niveles de Reelina completa y de su fragmento, y no una acumulación del mismo. Por consiguiente, la disminución de expresión de Reelina no parece deberse a un aumento del procesamiento proteolítico del extremo N-terminal de Reelina. Por otro lado, Dab1 tuvo una mayor expresión en los tres grupos de tratamiento con respecto a los controles en hembras (Salino + Vehículo: 1.00 ± 0.11; Poly(I:C) + Vehículo: 1.25 ± 0.025; Salino + THC: 3.15 ± 0.66; Poly(I:C) + THC: 5.42 ± 1.40) (Figura 35C). La expresión de Dab1 ha sido utilizada por algunos autores como indicador de la potencia de señalización de Reelina, ya que la unión de esta proteína a sus receptores ApoER2 y VLDLR induce la fosforilación de Dab1 y la posterior cascada de señalización (Ogino et al., 2017). Por tanto, el aumento de los niveles de Dab1 va en consonancia con la reducción de Reelina. En conjunto, la reducción de los niveles de expresión tanto de Reelina completa como de su fragmento N-R2 en el grupo Salino + THC en machos y los tres grupos experimentales en hembras corroboran la alteración de la vía de señalización de Reelina observada en el estudio de proteómica. 94 V RESULTADOS 0.40; Poly(I:C) + Vehículo: 7.41 ± 0.30; Salino + THC: 8.41 ± 0.41; Poly(I:C) + THC: 6.64 ± 0.24. Unidades: µm) (Figura 39B). Figura 39. Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas en corteza prefrontal en el modelo de “doble impacto”. A, Imagen representativa de una dendrita analizada de ratones de cada grupo experimental. Escala: 10μm. B, Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas. N=5-16/grupo experimental. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey. **p<0.01. Todas las barras de error son SEM. En conjunto, estos resultados indican que la densidad de espinas dendríticas se ve afectada por el primer impacto, es decir, la infección mediante Poly(I:C) en la etapa prenatal, y este resultado se ve afectado de forma significativa por el tratamiento con THC, por lo que el paradigma de “doble impacto” influye en la densidad de espinas dendríticas en ambas regiones analizadas. 95 V RESULTADOS 2. Modelo transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 2.1 Generación del modelo transgénico ADAMTS2-Cre En estudios previos del grupo, se describieron un conjunto de 200 genes asociados a procesos inflamatorios e inmunitarios que diferenciaban a los pacientes de primeros episodios de psicosis de los controles sanos a nivel basal, y por tanto podían estar asociados a la enfermedad (Sainz et al., 2013). Los niveles de seis de estos genes (ADAMTS2, CD177, CNTNAP3, ENTPD2, RFX2 y UNC45B) revertían a niveles normales de expresión después del tratamiento con AP (Crespo-Facorro et al., 2015; Ruso-Julve et al., 2019). ADAMTS2 fue el gen más significativamente sobreexpresado y, además, moderado a niveles similares a los pacientes sanos tras el tratamiento, recalcando así la asociación entre ADAMTS2 y la esquizofrenia. Asimismo, ADAMTS2 tiene un papel relevante en el procesamiento de Reelina (Yamakage et al., 2019), un biomarcador de la enfermedad de esquizofrenia (Negrón-Oyarzo et al., 2016; Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Con el objetivo de evaluar el papel de ADAMTS2 in vivo, se diseñó un modelo de ratón transgénico de sobreexpresión del gen humano ADAMTS2 bajo un promotor CaMKIIα, mediante el cruce de la línea ADAMTS2-GFP generada y la línea comercial CaMKIIα-Cre (apartado 2 de Materiales y Métodos). El promotor CaMKIIα dirige la expresión de la enzima Cre recombinasa a regiones cerebrales del prosencéfalo, principalmente a la capa de células piramidales (CA1, hipocampo) durante la tercera semana postnatal. Dicha proteína Cre escinde el codón de STOP, permitiendo así la expresión de ADAMTS2 en la línea de ratón resultante, ADAMTS2-Cre. 2.2 Caracterización de la expresión de ADAMTS2 en el modelo transgénico La presencia del transgén ADAMTS2-GFP en las crías de la línea ADAMTS2-Cre se estudió mediante genotipado por PCR con tres oligonucleótidos que amplifican secuencias específicas dentro del transgén, dando lugar a un amplicón resultante de 603 pb para la banda wt y 300 pb para la banda transgénica (Figura 40A). La presencia de Cre también se realizó mediante genotipado con cuatro oligonucleótidos, dando 96 V RESULTADOS lugar a un amplicón de 324 pb para la banda wt y 100 pb para la banda transgénica (Figura 40B). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados están contenidas en la Tabla 1 del apartado 2.5 de Materiales y Métodos. Figura 40. Genotipado del ratón transgénico. A, Genotipado con un gel de agarosa al 1% de un ratón ADAMTS2-Cre (carril 1) y un ratón wt-Cre (carril 2) para el transgén ADAMTS2-GFP. B, Genotipado con un gel de agarosa al 1% de un ratón ADAMTS2-Cre (carril 1) para Cre. Abreviaturas: M: Marcador; pb: pares de bases. Se generaron 7 quimeras positivas para el transgén (ratonas fundadoras de la línea ADAMTS2-GFP). De entre ellas, 2 se cruzaron con ratones C57Bl6/J para obtener la primera camada (F1) de la línea ADAMTS2-GFP, formada por un total de 11 ratones positivos para el transgén. A continuación, estos se cruzaron con ratones de la línea comercial CaMKIIα-Cre para la generación de la línea ADAMTS2-Cre, en la que se han realizado todos los experimentos de caracterización del modelo transgénico. Para analizar la expresión de la proteína ADAMTS2 en el modelo transgénico, se realizaron experimentos de Western blot (protocolo descrito en el apartado 5.2 de Materiales y Métodos) de lisados de regiones cerebrales en las que es activo el promotor CaMKIIα (corteza prefrontal, hipocampo, resto de corteza y estriado). La expresión se analizó con el anticuerpo anti-ADAMTS2 (apartado 8 de Materiales y Métodos) a los 3 meses de edad. Los experimentos confirmaron la presencia del transgén en la expresión de ADAMTS2 en corteza prefrontal, hipocampo, resto de corteza y estriado, tanto en machos como en hembras (Figura 41). Se observó una 97 V RESULTADOS mayor expresión de ADAMTS2 en las primeras tres regiones analizadas (corteza prefrontal, hipocampo y resto de corteza), con respecto a los niveles de expresión presentes en estriado. Figura 41. Expresión de ADAMTS2 en el ratón transgénico mediante Western blot. Expresión de ADAMTS2 en corteza prefrontal (CPF), hipocampo (HP), resto de corteza (CTX) y estriado (STR) en ratones wt-Cre y ratones ADAMTS2-Cre de 3 meses de edad. Como control de carga se utilizó β-actina. Para evaluar si la expresión del transgén cambiaba temporalmente, se llevaron a cabo experimentos de Western blot para comparar la expresión de ADAMTS2 en muestras de ratones ADAMTS2-Cre y sus controles de 1, 2 y 3 meses de edad en las regiones detalladas anteriormente (Figura 42). Los resultados confirmaron la expresión de ADAMTS2 en corteza prefrontal, hipocampo y resto de corteza y no se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de ADAMTS2 a 1, 2 y 3 meses de edad. Por tanto, se realizaron los experimentos restantes de Western blot con muestras de ratones de 2-3 meses de edad. En cuanto a la expresión de ADAMTS2 en estriado, se observó un aumento de la expresión en el tercer mes de edad. Sin embargo, tras evaluar la presencia de buenos niveles de expresión de ADAMTS2 en el modelo transgénico ADAMTS2-Cre y debido a la importancia de las regiones de corteza prefrontal e hipocampo en la enfermedad de esquizofrenia y en los modelos animales establecidos relacionados con la enfermedad, se decidió centrar los experimentos restantes de expresión mediante Western blot en estas regiones. 98 V RESULTADOS Figura 42. Expresión de la proteína ADAMTS2 en el ratón transgénico mediante Western blot a 1, 2 y 3 meses de edad. Expresión de ADAMTS2 en corteza prefrontal (CPF), hipocampo (HP), resto de corteza (CTX) y estriado (STR) en ratones wt-Cre y ratones ADAMTS2-Cre de 1, 2 y 3 meses de edad. Como control de carga se utilizó β-actina. A continuación, se realizaron experimentos de Western blot para comparar los niveles de expresión del transgén en machos y hembras ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad tanto en corteza prefrontal como en hipocampo (Figura 43). Se observaron unos niveles de expresión similares en ambos sexos y regiones, tanto de ADAMTS2 como del reportero incluido en el modelo transgénico, GFP. Figura 43. Expresión de las proteínas ADAMTS2 y GFP en machos y hembras del ratón transgénico mediante Western blot. Expresión de ADAMTS2 y GFP en corteza prefrontal (CPF) e hipocampo (HP) en ratones wt-Cre y ratones ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad de ambos sexos. Como control de carga se utilizó β-actina. 99 V RESULTADOS Con el fin de regionalizar la localización cerebral de la expresión de ADAMTS2 y GFP en el modelo transgénico, se realizaron experimentos de inmunofluorescencia en tejido con ambos anticuerpos (protocolo descrito en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos) (Figura 44). La tinción con ambos marcadores reveló una expresión de los mismos en las regiones de corteza prefrontal, corteza e hipocampo (Figura 45), y una menor expresión en estriado. En concreto, se observó expresión en las siguientes regiones: corteza orbital, infralímbica, prelímbica, cingulada, motora, piriforme, somatosensorial, retrosplenial ectorrinal, perirrinal, entorrinal, auditiva y visual, caudado putamen, Globus pallidus, las capas CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, así como el giro dentado y la amígdala. Figura 44. Expresión de las proteínas GFP y ADAMTS2 a través del eje antero-posterior del cerebro en el ratón transgénico mediante inmunofluorescencia en tejido. Expresión de ADAMTS2 y GFP en corteza prefrontal (CPF) e hipocampo (HP) en ratones wt-Cre y ratones ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad de ambos sexos. Cortes coronales de 20μm de grosor. Escala: 500μm. 100 V RESULTADOS Figura 45. Expresión de la proteína ADAMTS2 en el ratón transgénico mediante inmunofluorescencia en tejido. A, Visión general de un corte de tejido de corteza prefrontal de ratón ADAMTS2-Cre. Escala: 500μm. B, Visión magnificada del área prelímbica de la corteza prefrontal. Escala: 250μm. C, Visión general de un corte de tejido de hipocampo de ratón ADAMTS2-Cre. Escala: 500μm. D, Visión magnificada del hipocampo. Escala: 250μm. En resumen, los experimentos de expresión de Western blot e inmunofluorescencia demuestran la sobreexpresión de ADAMTS2 en el ratón transgénico en regiones cerebrales, siendo mayor en corteza e hipocampo. Esta expresión no varía entre sexos o hasta la edad analizada. 2.3 Caracterización general del ratón transgénico ADAMTS2-Cre 2.3.1 Frecuencia genotípica en la línea ADAMTS2-GFP y ADAMTS2-Cre Como se ha descrito anteriormente en el apartado 2.5 de Materiales y Métodos, la presencia del transgén se analizó por PCR con 3 parejas de oligonucleótidos (Tabla 1 del apartado 2.5 de Materiales y Métodos) en los ratones obtenidos de 4 cruces (12 camadas) de la línea ADAMTS2-GFP y en los ratones resultantes de 5 cruces (16 101 V RESULTADOS camadas) de la línea ADAMTS2-Cre. Esto permitió evaluar la frecuencia genotípica en los ratones de ambas líneas. En el caso de la línea ADAMTS2-GFP, donde no tiene lugar la sobreexpresión de ADAMTS2 debido a la ausencia de la proteína Cre recombinasa, se obtuvo un porcentaje del 58.33% de wt y del 41.67% de ADAMTS2 en machos, así como un 52.78% de wt y un 47.22% de ADAMTS2 en hembras (Tabla 8). Por tanto, la frecuencia genotípica no está alterada en esta línea. Línea ADAMTS2-GFP Machos Hembras wt 21 (58.33%) 19 (52.78%) ADAMTS2 15 (41.67%) 17 (47.22%) Nº de ratones totales 36 36 Tabla 8. Tabla de la frecuencia genotípica de la línea ADAMTS2-GFP. En cuanto a la línea ADAMTS2-Cre, se obtuvo un 44.93% de ratones wt-Cre y 55.07% de ADAMTS2-Cre en machos. Con respecto a hembras, los resultados fueron similares, con un 55.56% de wt-Cre y un 44.44% de ADAMTS2-Cre (Tabla 9). Con respecto al total de ratones, se obtuvo un 52.27% de machos y un 47.73% de hembras. En esta línea, la frecuencia genotípica tampoco se ve afectada. Línea ADAMTS2-Cre Machos Hembras wt-Cre 31 (44.93%) 35 (55.56%) ADAMTS2-Cre 38 (55.07%) 28 (44.44%) Nº de ratones totales 69 63 Tabla 9. Tabla de la frecuencia genotípica de la línea ADAMTS2-Cre. 2.3.2 Índice de mortalidad A pesar de no encontrar diferencias en la frecuencia genotípica, se estudió la posible tasa de mortalidad tras el nacimiento tanto en machos como en hembras hasta los 2.5 meses de edad. Las tasas de mortalidad obtenidas fueron mínimas en ambos genotipos y ambos sexos (Machos: wt-Cre: 0%; 1.5% ADAMTS2-Cre: 1.5%; 102 V RESULTADOS Hembras: wt-Cre: 1.59%; ADAMTS2-Cre: 1.59%), por lo que se concluye que la sobreexpresión de ADAMTS2 no es letal en el modelo transgénico. 2.3.3 Curva de crecimiento de la línea ADAMTS2-Cre Se realizó una monitorización del peso corporal de los ratones de la línea transgénica para evaluar si la sobreexpresión de ADAMTS2 provoca alteraciones en este parámetro morfológico. Se midió el peso de los ratones una vez por semana, desde P30 hasta los 3 meses de edad, tanto en ratones machos (Figura 46A) como en hembras (Figura 46B). No se encontraron diferencias entre genotipos en ningún sexo, por lo que el ratón transgénico no presenta una alteración de este parámetro. Figura 46. Curva de peso de los ratones de la línea ADAMTS2-Cre desde P30 hasta P93. A, Curva de peso de los ratones machos wt-Cre y ADAMTS2-Cre. B, Curva de peso de los ratones hembras wt- Cre y ADAMTS2-Cre. N=28-38/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: two-way ANOVA posthoc Sidak. Todas las barras de error son SEM. 2.4 Caracterización conductual del modelo transgénico ADAMTS2-Cre Los pacientes de la enfermedad de esquizofrenia pueden presentar una amplia variedad de síntomas como alucinaciones, delirios, ausencia de motivación, depresión o alteraciones cognitivas que se evalúan para realizar el diagnóstico (American Psychiatric Association, 2021). Para evaluar los posibles fenotipos relacionados con la enfermedad de esquizofrenia en el modelo transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2, se realizó una caracterización comportamental para analizar la posible sintomatología positiva, negativa y cognitiva. Se evaluaron los síntomas positivos 103 V RESULTADOS mediante el test de campo abierto, el test de acicalamiento, la respuesta de sobresalto e inhibición por prepulso, el enterramiento de canicas y el test de placa caliente. Por otro lado, los síntomas negativos se estudiaron mediante los tests de las tres salas, del tubo y de suspensión por cola. Por último, los síntomas cognitivos se analizaron mediante el test de reconocimiento de objeto nuevo y el laberinto en Y. 2.4.1 Población de ratones para comportamiento Los tests comportamentales descritos a continuación se llevaron a cabo en 55 ratones del modelo transgénico, tanto machos (wt-Cre: n=15; ADAMTS2-Cre: n=16) como hembras (wt-Cre: n=12; ADAMTS2-Cre: n=12). Las pruebas se realizaron entre 2.5 y 3.5 meses de edad y se ordenaron de menos a más estresantes para el animal. 2.4.2 Evaluación general del estado de los animales La evaluación de las funciones sensoriales autonómicas y musculares de los ratones se llevó a cabo mediante el análisis SHIRPA (Rogers et al., 1997) descrito en el apartado 4.2 de Materiales y Métodos de esta Tesis Doctoral. No se detectaron alteraciones relevantes en dicho análisis en los animales ADAMTS2-Cre con respecto a sus controles, ni tampoco entre sexos (no mostrado), por lo que todos los animales disponibles fueron aptos para la caracterización conductual realizada. 2.4.3 Evaluación de síntomas positivos 2.4.3.1 Test del campo abierto En esta prueba, el ratón se introdujo en una caja de metacrilato opaco gris de 50 cm de lado durante 15 minutos. Este test permitió evaluar la locomoción y ansiedad del modelo transgénico, mediante la cuantificación de la distancia recorrida total y por zonas, la velocidad media, el tiempo de estancia en cada área y el número de entradas al centro (protocolo descrito en el apartado 4.3.1 de Materiales y 110 V RESULTADOS 2.4.4 Evaluación de síntomas negativos 2.4.4.1 Test de las tres salas Para evaluar los posibles defectos sociales, se realizó el test de las tres salas (protocolo descrito en el apartado 4.4.1 de Materiales y Métodos). En la fase de preferencia social (Figura 52A), los machos ADAMTS2-Cre mostraron un índice social significativamente menor (wt-Cre: 0.51 ± 0.04; ADAMTS2-Cre: 0.22 ± 0.07) (Figura 52B), lo cual se corroboró al analizar el tiempo de interacción con el señuelo y el objeto (Figura 52C). Estos resultados indican que los ratones machos transgénicos presentan defectos en preferencia social. No se observaron diferencias entre genotipos en hembras en ningún parámetro analizado. No se hallaron diferencias en el tiempo total de interacción en ningún sexo (Figura 78 de Anexo 2). Figura 52. Fase de preferencia social del test de las tres salas en el ratón transgénico. A, Vista cenital del test (fase de preferencia social). B, Índice social. C, Cuantificación del tiempo de interacción con 111 V RESULTADOS el ratón señuelo y el objeto. N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey o t-test. p-value: **p<0.01; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. En cuanto a la fase de novedad social (Figura 53A), se obtuvieron resultados similares. Los ratones machos transgénicos mostraron un índice de memoria significativamente menor con respecto a los controles (wt-Cre: 0.42 ± 0.05; ADAMTS2-Cre: 0.17 ± 0.05) (Figura 53B), así como unos tiempos de interacción similares entre ambos señuelos, nuevo y familiar (Figura 53C). Esto indica defectos en la capacidad de distinción entre un ratón conocido y un ratón nuevo. Las hembras no mostraron diferencias significativas entre genotipos. Al igual que en la fase anterior, no se obtuvieron diferencias en el tiempo de interacción total (Figura 78 de Anexo 2). Figura 53. Fase de novedad social del test de las tres salas en el ratón transgénico. A, Vista cenital del test (fase de novedad social). B, Índice de memoria. C, Cuantificación del tiempo de interacción 112 V RESULTADOS con los ratones señuelo y nuevo. N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey o t-test. p-value: **p<0.01; ****p<0.0001. Todas las barras de error son SEM. En resumen, los machos ADAMTS2-Cre presentan defectos tanto en preferencia social como en novedad social, mientras las hembras transgénicas no muestran ninguna alteración en estos parámetros. 2.4.4.2 Test del tubo Para analizar la dominancia social en el modelo ADAMTS2-Cre, se realizó el test del tubo (protocolo descrito en el apartado 4.4.2 de Materiales y Métodos) (Figura 54A). Se observó una dominancia social significativa en el genotipo ADAMTS2-Cre con respecto a los controles, tanto en machos (wt-Cre: 37.18 ± 12.82; ADAMTS2- Cre: 75.00 ± 10.15. Unidades: porcentaje de victorias) como en hembras (wt-Cre: 33.25 ± 11.41; ADAMTS2-Cre: 65.67 ± 8.27. Unidades: porcentaje de victorias) (Figura 54B). Por tanto, la sobreexpresión de ADAMTS2 en el modelo causa un aumento de la dominancia social en ambos sexos. Figura 54. Test del test del tubo en el ratón transgénico. A, Vista lateral del test. B, Cuantificación del porcentaje de victorias. N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. 113 V RESULTADOS 2.4.4.3 Suspensión por la cola El test de suspensión por la cola se realizó en el modelo transgénico para evaluar el comportamiento depresivo (protocolo descrito en el apartado 4.4.3 de Materiales y Métodos) (Figura 55A). No se observaron diferencias entre genotipos en machos. Sin embargo, las hembras ADAMTS2-Cre mostraron un tiempo de actividad significativamente menor que sus controles (wt-Cre: 234.09 ± 16.60; ADAMTS2-Cre: 172.23 ± 18.50. Unidades: s) (Figura 55B). Esto podría indicar un comportamiento de apatía frente a una situación de estrés (Cryan et al., 2005; Can et al., 2011). Figura 55. Test del test del tubo en el ratón transgénico. A, Vista frontal del test. B, Cuantificación del tiempo de actividad. N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. 2.4.5 Evaluación de síntomas cognitivos 2.4.5.1 Reconocimiento de objeto nuevo La memoria de reconocimiento de objeto nuevo se realizó a las 3 horas tras la habituación al objeto familiar (protocolo descrito en el apartado 4.5.1 de Materiales y Métodos) (Figura 56A). Los ratones machos ADAMTS2-Cre no mostraron diferencias en índice de memoria (Figura 56B) ni el tiempo de interacción con ambos objetos (Figura 56C). En hembras ADAMTS2-Cre, se observó un menor índice de memoria en comparación con sus controles (wt-Cre: 0.34 ± 0.04; ADAMTS2-Cre: 114 V RESULTADOS 0.19 ± 0.08) (Figura 56B), así como tiempos de interacción similares entre ambos objetos (Figura 56C), siendo no significativas estas diferencias. No hubo alteraciones entre grupos en el tiempo de interacción total (Figura 79 de Anexo 2). En conjunto, no se observan defectos cognitivos significativos en este test en el ratón transgénico. Figura 56. Test de reconocimiento de objeto nuevo en el ratón transgénico. A, Vista cenital del test (fase de retención y fase de memoria). B, Índice de memoria. C, Cuantificación del tiempo de interacción con los objetos familiar y nuevo. N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey y t-test. Todas las barras de error son SEM. 2.4.5.2 Laberinto en Y Se evaluó la memoria de alternancia en el modelo transgénico mediante el laberinto en Y (protocolo descrito en el apartado 4.5.2 de Materiales y Métodos) (Figura 57A). No se encontraron diferencias entre genotipos en el porcentaje de 115 V RESULTADOS alternancia (Figura 57B). Sin embargo, al analizar la distancia total recorrida, se observó un aumento significativo en el genotipo ADAMTS2-Cre en machos (wt-Cre: 1777.93±107.69; ADAMTS2-Cre: 2133.05±106.43. Unidades: cm) (Figura 57C). Por lo tanto, los machos transgénicos presentan una mayor locomoción en espacios limitados como el laberinto en Y, pero no en espacios abiertos como en el campo abierto (apartado 2.4.3.1 de Resultados). Figura 57. Test del laberinto en Y en el ratón transgénico. A, Vista cenital del test. B, Distancia total recorrida. C, Distancia recorrida en cada brazo (A, B y C). N=12-16/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: one-way ANOVA post-hoc Tukey y t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. 2.4.6 Resumen del comportamiento del modelo transgénico ADAMTS2-Cre A continuación, se resumen en la siguiente tabla los tests de comportamiento realizados en el modelo en los cuales ha habido defectos en el transgénico en comparación con los controles (Tabla 10). 116 V RESULTADOS ADAMTS2-Cre Test Machos Hembras Campo abierto Acicalamiento Respuesta de sobresalto Enterramiento de canicas Placa caliente Tres salas Tubo Suspensión por cola Reconocimiento de objeto nuevo Laberinto en Y Tabla 10. Tabla resumen de los efectos en comportamiento hallados en la línea ADAMTS2-Cre con respecto a sus controles. El color gris indica el sexo en el que se han observado diferencias significativas en cada test. 2.5 Análisis de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la enfermedad de esquizofrenia 2.5.1 Alteraciones en la microglía y astrocitos del ratón ADAMTS2-Cre Se han descrito alteraciones moleculares y funcionales en las células gliales, incluidos los astrocitos y la microglía, en pacientes de la enfermedad de esquizofrenia (Zhang et al., 2020; Notter, 2021; Bloomfield et al., 2016; Zhuo et al., 2023), aunque los resultados entre estudios han sido contradictorios y heterogéneos, especialmente en relación a los astrocitos (Zhang et al., 2020; Notter, 2021). En cuanto a la microglía, se ha relacionado un exceso de activación de la misma con los déficits cognitivos de la esquizofrenia (Bloomfield et al., 2016; Zhuo et al., 2023). Para realizar una caracterización inicial de la expresión de ambos tipos celulares en el modelo transgénico, se llevaron a cabo experimentos de Western blot para determinar la expresión de Iba1 (molécula adaptadora de enlace al calcio ionizado 1) y GFAP (proteína acídica fibrilar glial), marcadores de microglía y astrocitos, respectivamente. 117 V RESULTADOS Estos análisis se hicieron tanto en muestras de corteza prefrontal (Figura 58A) como de hipocampo (Figura 59A) del modelo transgénico. En cuanto a la expresión de Iba1, se observó una menor expresión no significativa en lisados de corteza prefrontal en los ratones ADAMTS2-Cre en comparación con sus controles (wt-Cre: 1.00 ± 0.25; ADAMTS2-Cre: 0.71 ± 0.11) (Figura 58B). En hipocampo, en cambio, no se observaron diferencias de expresión entre genotipos (Figura 59B). Figura 58. Expresión de las proteínas ADAMTS2, GFP, Iba1 y GFAP en corteza prefrontal en el ratón transgénico mediante Western blot. A, Expresión de ADAMTS2, GFP, Iba1 y GFAP en corteza prefrontal (CPF) en ratones wt-Cre y ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad. Como control de carga se utilizó β-actina. B, Cuantificación de los niveles de expresión de Iba1 y GFAP normalizados al wt-Cre y al control de carga. N=4/genotipo. Análisis estadístico utilizado: t-test. p-value: *p<0.05. Todas las barras de error son SEM. En cuanto a la expresión de GFAP, se observó una expresión significativamente menor en corteza prefrontal de ratones ADAMTS2-Cre en relación a sus controles (wt-Cre: 1.00 ± 0.03; ADAMTS2-Cre: 0.62 ± 0.09) (Figura 58B). Sin embargo, en 118 V RESULTADOS muestras de hipocampo de estos mismos ratones, se encontró una expresión significativamente mayor en comparación con los ratones control (wt-Cre: 1.00 ± 0.11; ADAMTS2-Cre: 1.90 ± 0.12) (Figura 59B). Figura 59. Expresión de las proteínas ADAMTS2, GFP, Iba1 y GFAP en hipocampo en el ratón transgénico mediante Western blot. A, Expresión de ADAMTS2, GFP, Iba1 y GFAP en hipocampo (HP) en ratones wt-Cre y ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad. Como control de carga se utilizó β-actina. B, Cuantificación de los niveles de expresión de Iba1 y GFAP normalizados al wt-Cre y al control de carga. N=4/genotipo. Análisis estadístico utilizado: t-test. p-value: **p<0.01. Todas las barras de error son SEM. 2.5.2 Reelina y marcadores relacionados con la sinapsis Debido a que ADAMTS2 interviene en el procesamiento de Reelina (Yamakage et al., 2019), y esta proteína está alterada en diversos modelos animales relacionados con la enfermedad de esquizofrenia (Ratnayake et al., 2012; Negrón-Oyarzo et al., 2016; Sánchez-Hidalgo et al., 2022), se estudió la posible alteración de Reelina en el modelo de sobreexpresión de ADAMTS2. 119 V RESULTADOS Figura 60. Expresión de las proteínas ADAMTS2, GFP, Reelina, Dab1, PSD95, NL1 y NL2 en corteza prefrontal en el ratón transgénico mediante Western blot. A, Expresión de ADAMTS2, GFP, Reelina (proteína completa y fragmento N-2R), Dab1, PSD95, NL1 y NL2 en corteza prefrontal (CPF) en ratones wt-Cre y ratones ADAMTS2-Cre de 2-3 meses de edad. Como control de carga se utilizó β-actina. B, 126 V RESULTADOS Figura 66. Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas en CA1 (hipocampo) en el ratón transgénico. A, Imagen representativa de una dendrita analizada de ratones transgénicos y control de ambos sexos. Escala: 10μm. B, Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas. N=4- 6/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: t-test. Todas las barras de error son SEM. 127 V RESULTADOS Figura 67. Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas en corteza prefrontal en el ratón transgénico. A, Imagen representativa de una dendrita analizada de ratones transgénicos y control de ambos sexos. Escala: 10μm. B, Cuantificación de la densidad de espinas dendríticas. N=4- 6/genotipo/sexo. Análisis estadístico utilizado: t-test. Todas las barras de error son SEM. VI. DISCUSIÓN 131 VI DISCUSIÓN En esta Tesis Doctoral, nos planteamos si Reelina, uno de los principales componentes de la MEC, podría ser considerado un biomarcador de modelos de la enfermedad, y evaluamos su alteración en un modelo de esquizofrenia de “doble impacto”, consistente en una inyección prenatal con Poly(I:C) y una exposición postnatal a THC. Nuestro modelo muestra una reducción de los niveles de Reelina en la corteza prefrontal de los ratones tratados con THC, además de una reducción del número de células positivas para la misma. En relación a su caracterización conductual, nuestro modelo presenta fenotipos relacionados con los síntomas positivos de la enfermedad en machos, así como fenotipos asociados a los síntomas negativos en ambos sexos. Por último, observamos una reducción del grosor de la corteza en los grupos tratados con THC y una disminución de la densidad de espinas dendríticas en la corteza prefrontal y el hipocampo del grupo de “doble impacto”. Asimismo, debido a los recientes avances en el estudio del papel de ADAMTS2 como metaloproteasa de Reelina, quisimos estudiar la implicación de este marcador en la esquizofrenia mediante un modelo de ratón transgénico. Nuestro modelo generado presenta una reducción de los niveles de expresión de Reelina en la corteza prefrontal, así como una acumulación de su fragmento N-R2. El modelo no presenta mortalidad, ni diferencias en las frecuencias genotípicas ni de peso. En cuanto a su evaluación comportamental, nuestro modelo transgénico muestra fenotipos asociados a síntomas positivos y sociales (negativos) en machos y un fenotipo de estrés en hembras. 1. Generación de modelos de ratón relacionados con la enfermedad de esquizofrenia Los modelos animales de la esquizofrenia permiten el estudio preciso y controlado de las alteraciones moleculares, estructurales y comportamentales que se han descrito en los pacientes de la enfermedad, además de permitir testar nuevos tratamientos (Sánchez- Hidalgo et al., 2022; Shangase et al., 2023). Para llevar a cabo los objetivos descritos en esta Tesis Doctoral, se han utilizado dos modelos de ratón relacionados con la enfermedad de la esquizofrenia. 132 VI DISCUSIÓN 1.1. Establecimiento de un modelo de ratón de “doble impacto” mediante una infección prenatal con Poly(I:C) y una exposición postnatal a THC Los modelos animales de “doble impacto”, consistentes en un primer insulto ambiental en etapas prenatales y una exposición a cannabis en etapas postnatales, se estudiaron en una revisión sistemática de la literatura con el fin de profundizar en la hipótesis del “doble impacto” de esquizofrenia. Los resultados concluyeron que los insultos prenatales y postnatales pueden tener efectos de forma individual o en combinación, principalmente en el peso y el comportamiento de los modelos, en alteraciones genómicas y electrofisiológicas, así como en la estructura y funciones cerebrales. Además, destaca el modelo de AIM y exposición postnatal a cannabis como un paradigma de “doble impacto” por sus efectos específicos y significativos (Martín- Cuevas et al., 2023). Con el fin de estudiar los mecanismos alterados en la hipótesis del “doble impacto” de la enfermedad de esquizofrenia, así como de evaluar la posible alteración de Reelina, se estableció un modelo de ratón de “doble impacto”, el cual se basó en una infección prenatal mediante Poly(I:C) en G9 y a una exposición postnatal a THC (P55- 60). La elección del día de gestación para la inyección prenatal con Poly(I:C) es altamente importante en este modelo, debido a que una AIM en etapas tempranas de la gestación en comparación con una AIM en etapas tardías provocan respuestas diferentes en los embriones y fenotipos conductuales diferentes (Haddad et al., 2020). Para este modelo, se escogió el día G9 para llevar a cabo la inyección con Poly(I:C), debido a que corresponde al periodo del neurodesarrollo crítico del ratón a nivel cortical y equivale aproximadamente al primer o segundo trimestre del embarazo en humanos (Fatemi et al., 2002; Reisinger et al., 2015; Guma et al., 2023). La dosis utilizada de 5 mg/kg se seleccionó en base a la literatura, ya que las dosis más comunes en el momento de infección de G9 varían en un rango de entre 4 y 5 mg/kg (Meyer et al., 2006; Guma et al., 2023; Haddad et al., 2020). Nuestros resultados confirman que el modelo no presenta alteración en la viabilidad de las crías y tampoco tiene un fenotipo de letalidad. Cabe destacar que, al tratarse de un modelo de infección mediante Poly(I:C), es necesario realizar un estudio de calidad de la infección provocada para confirmar que 133 VI DISCUSIÓN la AIM está teniendo lugar (Chow et al., 2016), de modo que utilizamos este estudio de calidad como criterio de inclusión para todos los análisis posteriores. Para ello, se registró el peso y la temperatura de las hembras gestantes en el momento previo a la infección como dato basal, y a las 3, 6, 24 y 48 horas tras la inyección. Todas las hembras gestantes inyectadas con Poly(I:C) presentaron un menor peso corporal de forma significativa con respecto a los controles a las 24 y 48 horas, lo cual concuerda con la literatura (Chow et al., 2016; Lecca et al., 2019). Con respecto a la temperatura, estas hembras mostraron una disminución de la misma a las 3 horas y un aumento a las 24, siendo estas diferencias significativas con respecto a las hembras control en ambos tiempos, resultados que de nuevo coinciden con la literatura (Chow et al., 2016; Mueller et al., 2019). Las hembras control (inyectadas con salino) mantuvieron un peso y temperatura constantes en todos los tiempos registrados. Como todas las hembras inyectadas con Poly(I:C) siguieron el patrón de peso y temperatura descritos en la literatura, todas sus crías fueron incluidas en los estudios que se recogen en esta Tesis Doctoral en el modelo de “doble impacto”. Además de ambos controles de calidad, nuestros resultados evidencian que se produjo la respuesta inflamatoria pretendida en las hembras gestantes. El estudio de la respuesta inflamatoria aguda, tanto en bazo materno como en los embriones a las 3 horas tras la inyección, mostró niveles significativamente elevados de las citoquinas analizadas (IL-6 y TNFα) con respecto a los controles, confirmando así la AIM (Chow et al., 2016; Hameete et al., 2021). Estos resultados corroboran lo descrito en la literatura, ya que otros estudios han mostrado que el Poly(I:C) provoca un aumento de citoquinas proinflamatorias como IL-6 en este punto temporal (Meyer et al., 2006; Harvey y Boksa, 2012; Chow et al., 2016). Es importante tener en cuenta que está descrito que las alteraciones provocadas por una inyección con Poly(I:C) prenatal pueden verse afectadas por la cepa de ratón, el sexo, y el lote del producto, además de la dosis utilizada y el día de inyección (Mueller et al., 2019; Haddad et al., 2020). Para disminuir la variabilidad de resultados, hemos utilizado la cepa de ratón C57BL/6J para todos los análisis debido a que es una cepa altamente utilizada tanto en modelos de AIM con Poly(I:C) como en estudios comportamentales y se incluyeron tanto machos como hembras para evaluar el 134 VI DISCUSIÓN posible dimorfismo sexual. Además, se utilizó siempre el mismo lote de Poly(I:C) en todos los estudios del modelo de “doble impacto” descritos en esta Tesis Doctoral. De esta manera, evitamos las posibles variaciones en la potencia de los diferentes lotes del producto (Mueller et al., 2019). En cuanto al tratamiento con THC, enfatizamos que el momento de exposición al cannabis es un factor crítico en el estudio de la hipótesis del “doble impacto” de la esquizofrenia. Es destacable que 4 de los 6 artículos que no reportaron alteraciones específicas del grupo de “doble impacto” en nuestra revisión sistemática utilizaron un paradigma de exposición a cannabinoides en estadíos adultos, en contraste con un tratamiento en adolescentes o juveniles (Martín-Cuevas et al., 2023). En este momento del desarrollo, el cerebro presenta una mayor plasticidad que en adultos, y es más susceptible a cambios inducidos por cannabinoides (Chesworth y Karl, 2017). Varios estudios epidemiológicos han observado que el consumo de cannabis en edades tempranas y con altas dosis provoca una aparición más rápida de los síntomas psicóticos (Singh y Balhara, 2017; Patel et al., 2020). En conjunto, estos hechos nos sugieren que puede existir una mayor interacción entre el insulto prenatal y el postnatal cuando la exposición a cannabinoides ocurre durante una etapa adolescente o juvenil, lo cual puede resultar en efectos más pronunciados y significativos entre grupos de tratamiento. Por lo tanto, decidimos realizar la exposición a THC en nuestro modelo de “doble impacto” en etapas juveniles (P55-P60). El número de días consecutivos de tratamiento (6) y la dosis utilizada (10 mg/kg) se seleccionaron en base a la literatura para simular un consumo subcrónico (Chesworth y Karl, 2017), evitando así efectos agudos asociados a un consumo puntual. Las personas con esquizofrenia pueden presentar alteraciones del metabolismo o problemas de obesidad (Annamalai et al., 2017; Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Varios estudios han hallado alteraciones del peso corporal en modelos de AIM con exposición a lipopolisacárido (LPS) (Harvey y Boksa, 2012; Nouel et al., 2012) o Poly(I:C) (Harvey y Boksa, 2012). Además, el consumo de cannabis está estrechamente relacionado con el apetito y el peso corporal (Williams y Kirkham, 2002; Farrimond et al., 2012; Fearby et al., 2022). Sin embargo, los modelos de “doble impacto” incluidos en nuestra revisión sistemática (Martín-Cuevas et al., 2023) no reportaron ninguna alteración del 135 VI DISCUSIÓN peso de los animales. Al evaluar el peso corporal y cerebral en nuestro modelo de “doble impacto”, no se vieron diferencias entre grupos antes (P55) e inmediatamente después (P60) del tratamiento con THC. Por el contrario, en el momento previo al sacrificio (P75), se observó una reducción del peso corporal en los ratones machos tratados con THC, siendo significativas las diferencias en la ratio del peso cerebro/ratón entre el grupo de “doble impacto” con los controles y con los ratones tratados con Poly(I:C) únicamente. No se observaron diferencias significativas en hembras. Por lo tanto, los ratones machos presentaron una mayor sensibilidad en cuanto al peso frente al tratamiento con THC. Los mecanismos biológicos cerebrales subyacentes a la interacción entre una infección en etapas prenatales y una exposición posnatal a THC es de máximo interés en el estudio de los sistemas biológicos alterados de la enfermedad y no se han descrito en su totalidad. Algunos autores han sugerido varias vías de señalización en las que los mecanismos de la AIM y el THC convergen, basándose en la comunicación entre neuronas, microglía y astrocitos en respuesta a esta combinación de dos impactos (Murlanova y Pletnikov, 2023). Siguiendo esta hipótesis, queremos enfatizar el potencial papel de la matriz extracelular como un factor convergente adicional a la comunicación entre neuronas y glía, destacando especialmente el papel de Reelina en el contexto de la hipótesis del “doble impacto” (Martín-Cuevas et al., 2023). 1.2. Generación de un modelo de ratón transgénico de sobreexpresión de ADAMTS2 en regiones cerebrales En los últimos años, nuestro grupo ha descrito que los niveles del gen ADAMTS2 estaban sobreexpresados en muestras de sangre periférica de pacientes de primeros episodios de psicosis, y estos niveles se normalizaban tras el tratamiento con AP (Sainz et al., 2013; Crespo-Facorro et al., 2015; Ruso-Julve et al., 2019). Además, se confirmó la alteración de Adamts2 en un modelo de ratón establecido de la enfermedad de esquizofrenia (exposición a influenza) (López-Giménez et al., 2017) y se demostró que la expresión de ADAMTS2 depende de la señalización dopaminérgica, específicamente Neuroscience and Biobehavioral Reviews 154 (2023) 105409 15 to schizophrenia. Can. J. Psychiatry 64 (1), 5–17. https://doi.org/10.1177/ 0706743718773728. Woods, R.M., Lorusso, J.M., Potter, H.G., Neill, J.C., Glazier, J.D., Hager, R., 2021. Maternal immune activation in rodent models: A systematic review of neurodevelopmental changes in gene expression and epigenetic modulation in the offspring brain. Neurosci. Biobehav. Rev. 129, 389–421. https://doi.org/10.1016/j. neubiorev.2021.07.015. Zamberletti, E., Beggiato, S., Steardo, L., Prini, P., Antonelli, T., Ferraro, L., Rubino, T., Parolaro, D., 2014. Alterations of prefrontal cortex GABAergic transmission in the complex psychotic-like phenotype induced by adolescent delta-9- tetrahydrocannabinol exposure in rats. Neurobiol. Dis. 63, 35–47. https://doi.org/ 10.1016/j.nbd.2013.10.028. Zamberletti, E., Gabaglio, M., Prini, P., Rubino, T., Parolaro, D., 2015. Cortical neuroinflammation contributes to long-term cognitive dysfunctions following adolescent delta-9-tetrahydrocannabinol treatment in female rats. Eur. Neuropsychopharmacol. 25 (12), 2404–2415. https://doi.org/10.1016/j. euroneuro.2015.09.021. C. Martín-Cuevas et al. 239 X ANEXOS 5. Listado de abreviaturas A continuación, se detallan las abreviaturas utilizadas en esta Tesis Doctoral: ADAMTS: Desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina ADAMTS2: Desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina de tipo 2 AIM: Activación inmune materna AP: Fármacos antipsicóticos ApoER2: Receptor 2 de apolipoproteína CaMKIIα: Proteína quinasa tipo II alfa dependiente de calcio/calmodulina cAMP/CREB: adenosin monofosfato cíclico/elemento de unión de respuesta a cAMP CB1R: Receptor cannabinoide tipo 1 CB2R: Receptor cannabinoide tipo 2 CPF: Corteza prefrontal CTX: Corteza D1 y D2: Receptores de dopamina tipo 1 y 2 Dab1: Disabled homolog-1 EGF: Factor de crecimiento epidérmico GABA: Ácido gamma-aminobutírico G: Día de gestación GFAP: Proteína ácida fibrilar glial GFP: Proteína fluorescente verde HP: Hipocampo Iba1: Molécula adaptadora de enlace al calcio ionizado 1 IL- : Interleuquina IL-6: Interleuquina 6 IPA: Ingenuity pathway analysis IRF3: Factor de regulación del interferón 3 LPS: Lipopolisacárido MEC: Matriz extracelular MMP: Metaloproteasas de matriz NL: Neuroliguina 240 X ANEXOS NF-kB: Factor nuclear kappa B NMDA: N-metil-D-aspartato P: Día postnatal P+T: Poly(I:C) prenatal + THC postnatal P+V: Poly(I:C) prenatal + vehículo postnatal pb: Pares de bases PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PLAC: Protease and lacunin Poly(I:C): Ácido Poliinosínico-policitidílico PSD95: Proteína de densidad postsináptica 95 qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa S+T: Salino prenatal + THC postnatal S+V: Salino prenatal + vehículo postnatal SEM: Error estándar de la media SHIRPA: Batería de test que evalúan la salud y fenotipo general de los animales de experimentación, diseñado por SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College and Royal London Hospital Src: Stored response chain STR: Estriado THC: Δ9-Tetrahidrocannabinol TNFα: Factor de necrosis tumoral alfa TSR: Motivos de trombospondina TLR3: Toll-like-receptor 3 VLDLR: Receptor de lipoproteínas de muy baja densidad wt: wild type, ratón silvestre NOTAS NOTAS NOTAS