Estudio del daño oxidativo renal en modelo de rata con preeclampsia tardía

ESTUDIO DEL DAÑO OXIDATIVO RENAL EN MODELO DE RATA CON PREECLAMPSIA TARDÍA Trabajo Fin de Grado Facultad de Biología – Grado en Bioquímica Grupo de investigación: Fisiopatología Cardiovascular Autora: Ana María Sevilla Jiménez Sevilla, junio 2023 Imagen: Jung et al. (2022). The etiology of preeclampsia. American journal of obstetrics and gynecology, 226(2S), S844–S866. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2021.11.1356 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA GRADO EN BIOQUÍMICA TRABAJO FIN DE GRADO Estudio del daño oxidativo renal en modelo de rata con preeclampsia tardía Autora: Ana María Sevilla Jiménez Tutora: Dra. Carmen María Vázquez Cueto Cotutora: Dra. Claudia Reyes Goya Departamento: Fisiología Grupo de investigación: Fisiopatología Cardiovascular, Facultad de Farmacia 5ª planta Sevilla, junio 2023 A mi madre y mi hermana, quienes me impulsan a seguir avanzando sin saber que con ellas yo ya lo tengo todo. ÍNDICE 1. Abreviaturas …………………………………………………...…………………………….… 1 2. Resumen …………………………………………………..………………..…………….....…. 3 3. Introducción ………………………………………...……………………..………….……….. 4 4. Objetivos ………………………………………...……………………..………….…………… 9 5. Materiales y métodos ………………………………………..……….……………...………… 9 5.1 Lista de reactivos ……………..…………………………..……………….……………….... 9 5.2 Preparación de reactivos y tampones …………………..…………………….…….……… 10 5.3 Animales de experimentación y tratamientos …………….………...……..….………....…. 11 5.3.1 Modelo animal de preeclampsia ………….……………….………..….…………... 11 5.4 Características generales de los animales y medida de la presión arterial…… …………….12 5.4.1 Recogida de muestras de orina y determinación de proteinuria ….…….….........… 12 5.4.2 Sacrificio de los animales ………… …………………………..……………............ 13 5.4.3 Expresión génica de sFlt-1 ………………………………………....…………..….. 13 - 5.4.3.1 Extracción de ARN ……………………..…………….………………..... 13 - 5.4.3.2 Control de calidad de la extracción de ARN ……………………………. 14 - 5.4.3.3 Retrotranscripción (RT) …………………………..………..…….……… 14 - 5.4.3.4 RT-PCR ………………………………...…………….…….….………… 15 5.5 Histología ………………………………..……………………………………..….…….... 16 5.5.1 Fijación y deshidratación de muestras ……….....……..……….…………….……. 16 5.5.2 Inclusión en parafina y formación de los bloques ……..………….….…….……… 16 5.5.3 Obtención de cortes histológicos ………………………………………….………. 16 5.5.4 Desparafinado ……………………………………………….………...……..……. 17 5.5.5 Tinción morfológica con hematoxilina – eosina .………..….….……..……....…… 17 5.5.6 Determinación de la producción de ERO in situ ……..……….……………..…….. 17 5.5.7 Obtención de imágenes en el microscopio ……………………….………………… 18 5.6 Análisis estadístico ………………………… ……………...………..……………….…… 18 6. Resultados y discusión …………………………………………...……..…………………… 18 6.1 Características de los animales de estudio ………………………..……………………….. 18 6.2 Demostración del modelo de preeclampsia tardía en ratas ………..………………………. 19 6.3 Análisis histomorfológico …………………………………...…………...……………….... 22 6.4 Análisis de la producción de ERO in situ …………..…………………….………..……….. 23 7. Conclusión ………………………………...………...………………….…………..…..…….. 25 8. Bibliografía …………………………………..……...…………………..….……..…………. 25 1 1. ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc ADN complementario Ang II Angiotensina II ARN Ácido ribonucleico Art. Artículo Ct Cycle threshold (umbral de ciclo) DG Día de gestación DHE Dihidroetidio dNTP Desoxinucleótido trifosfato DPX Dibutil-ftalato poliestireno xileno EDTA Ácido etilendiaminotetraacético ERO Especies reactivas de oxígeno FAD Flavín adenín dinucleótido FGR Fetal growth restriction, restricción del crecimiento fetal GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GKT136901 Inhibidor de NOX1 y NOX4 H2O Agua H2O2 Peróxido de hidrógeno HELLP Haemolysis, elevated liver enzymes and low platelet count H&E Hematoxilina-eosina LOPE Late-onset preeclampsia, preeclampsia de fase tardía ML171 Inhibidor específico de NOX1 NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NOX NADPH oxidasa 2 NP Normal pregnant, embarazo normal (condición control) O2.- Anión superóxido PAD Presión arterial sistólica PAS Presión arterial diastólica PBS Phosphate buffered saline, tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PE Preeclampsia PEG-SOD SOD conjugada con polietinglicol PFA Paraformaldehído PlGF Placental growth factor, factor de crecimiento placentario RAAS Sistema renina-angiotensina-aldosterona RD Real Decreto RFU Unidades relativas de fluorescencia RT Retrotranscripción RT-PCR Real-time PCR, PCR en tiempo real SEM Standard error of mean, error estándar de la media sEng Soluble endoglin, endoglina soluble sFlt-1 Soluble fms-like tyrosine kinase-1, tirosina quinasa soluble tipo 1 SOD Superóxido dismutasa TAE Tampón tris-acetato-EDTA UE Unión Europea UV Ultravioleta VAS2870 Pan-inhibidor de las isoformas NOX VEGF Vascular endotelial growth factor, factor de crecimiento del endotelio vascular 3 2. RESUMEN La preeclampsia (PE) es una enfermedad multisistémica que afecta en torno al 4 % de las embarazadas cada año, produciendo daños en órganos vitales tanto en la madre como en el feto y siendo una de las principales causas de mortalidad para ambos. Según la aparición de los primeros síntomas, la PE se clasifica en fase temprana (early-onset, antes de las 34 semanas de gestación) o fase tardía (late-onset, después de las 34 semanas de gestación). Entre los órganos dañados tiene una alta relevancia el daño renal observado en la madre, consecuencia de su alta relación con el sistema cardiovascular. Dado a que la hipoxia provocada por la enfermedad desemboca en la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), el objetivo general de este Trabajo de Fin de Grado es determinar el daño oxidativo a nivel renal, centrándonos en el papel de la enzima NADPH oxidasa (Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato oxidasa), principal productora de anión superóxido, en un modelo de preeclampsia tardía mediante la infusión del factor antiangiogénico sFlt-1 (tirosina quinasa soluble tipo 1) en ratas Wistar. Los resultados destacan la contribución de la enzima NADPH oxidasa, en su isoforma NOX1, en la producción de ERO en el glomérulo renal. Estos resultados, junto con el aumento del tamaño de los glomérulos, indican una relación entre el desarrollo de la preeclampsia tardía, daño renal y estrés oxidativo. Palabras clave: Preeclampsia tardía, riñón, estrés oxidativo, NADPH oxidasa, NOX1, ERO 4 3. INTRODUCCIÓN La preeclampsia (PE) es una complicación en el embarazo que aparece a partir de las 20 semanas de gestación y que afecta entre el 2 y el 5% de las mujeres, siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad tanto para la madre como el feto (Poon et al., 2019). Se trata de una enfermedad de origen multisistémico que comienza con la aparición de un cuadro hipertensivo, seguido de al menos uno de los siguientes síntomas: proteinuria o alguna disfunción de los órganos maternos, como por ejemplo la disfunción uteroplacentaria que puede afectar al crecimiento fetal y a la proporción de factores angiogénicos, o el daño renal el cual tiene una relación directa con la regulación del sistema cardiovascular. También se ha observado la presencia de afecciones en otros órganos, tales como en los ojos, donde pueden aparecer escotomas (presencia de manchas oscuras en la visión) y en ocasiones ceguera cortical. Otro órgano afectado es el hígado, el cual presenta una alta irrigación, lo que resulta una diana importante de daño vascular consecuencia de la disfunción uteroplacentaria presente en la PE, dando lugar a una isquemia local que deriva en inflamación y desarrollo del síndrome HELLP (Haemolysis, Elevated Liver enzymes and Low Platelet count) (Dimitriadis et al., 2023). Según el momento en el que se manifiestan los primeros signos de la enfermedad, podemos hablar de fase temprana (cuya aparición se da antes de las 34 semanas de gestación) o tardía (si ocurre pasadas las 34 semanas de gestación). Se cree que la fase temprana está más relacionada con fallos en la invasión del trofoblasto y la remodelación de las arterias espirales, mientras que la fase tardía tiene como causa la disfunción endotelial materna, así como patologías previas de la madre que puedan comprometer la integridad endotelial (Dimitriadis et al., 2023). A pesar de que la fase tardía presenta una sintomatología más leve, se trata de la forma de la enfermedad más prevalente, con hasta un 80% de casos entre todas las embarazadas con PE (Hu & Zhang, 2022). Existen múltiples factores de riesgo que fomentan la aparición de la PE. Con respecto al cuadro médico de la madre, son considerados factores de riesgo alto el padecer: enfermedad renal crónica, diabetes tipo 1 o 2, obesidad o enfermedades autoinmunes. También se consideran factores de riesgo de nivel moderado los antecedentes familiares de PE, embarazo múltiple, edad gestacional extrema (< 25 años o > 45 años) y otros factores de carácter socioeconómico y étnico (Chang et al., 2023). 5 La patogenia de esta enfermedad sigue sin tener una definición clara. No obstante, el modelo de dos fases con el comienzo de la invasión del trofoblasto es considerado el más adecuado con la información que tenemos de esta enfermedad. Recientemente, la revista International Journal of Enviromental Research and Public Health, ha descrito que el desarrollo de la PE se produce en dos fases: una primera fase subclínica, seguida de una segunda fase clínica que dura hasta el final del embarazo (Chang et al., 2023). A pesar de coincidir en el orden de sucesos de cada fase, aún no hay consenso en cuanto a la duración exacta de cada una de las fases. El comienzo de la primera fase se cree que es debido a una mala invasión del trofoblasto. Durante la invasión normal del trofoblasto, se da la remodelación de las arterias espirales que irrigan la placenta, con el fin de proporcionar un mayor riego sanguíneo y así garantizar la llegada de nutrientes al feto. Sin embargo, los factores de riesgo anteriormente mencionados pueden provocar un fallo en este paso de remodelación vascular, de modo que se produce un menor riego sanguíneo, la aparición de hipoxia y un ambiente oxidativo (Hu & Zhang, 2022). Esta situación causa un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos: aumenta la producción de los factores antiangiogénicos, como la tirosina quinasa soluble tipo 1 (sFlt-1; soluble fms-like tyrosine kinase-1) y la endoglina soluble (sEng; soluble endoglin); y disminuye la expresión de los factores angiogénicos, como el factor de crecimiento placentario (PlGF; placental growth factor) y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF; vascular endotelial growth factor), provocando disfunción endotelial acompañada de un ambiente proinflamatorio (Hernandez et al., 2021) (Figura 1). La segunda fase es considerada como la fase clínica, ya que las alteraciones producidas en la fase anterior comienzan a manifestarse como daños en diversos órganos, lo que deriva en un fallo multisistémico en la madre y problemas en el desarrollo del feto. Algunos de esos efectos presentes en la madre se dan a nivel hepático, como el síndrome HELLP, aparición de edemas pulmonares, y disfunción renal, que desemboca en proteinuria. Con respecto a las consecuencias negativas que puede sufrir el feto, se incluyen la disminución en el crecimiento durante la gestación (FGR; Fetal Growth Restriction), propensión al parto prematuro y otros efectos consecuencia de la hipoxia placentaria e incluso en ocasiones puede ocurrir la muerte perinatal (Ngene & Moodley, 2018; Raia-Barjat et al., 2022) (Figura 1). 12 la zona intraperitoneal, anestesiando previamente las ratas mediante la inhalación controlada de isofluorano al 3 %. 5.4 Características generales de los animales y medida de la presión arterial Se llevó a cabo un control durante el tratamiento de los valores correspondientes al peso de las ratas y de la presión arterial sistólica y diastólica, esto último para comprobar la eficacia del tratamiento. Por un lado, se pesaron las ratas antes de la operación (DG15) y el último día de gestación (DG19). Por otro lado, la determinación de la presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD) se realizó los días DG15 y DG19 mediante el método indirecto por oclusión de la cola a través del medidor de presión NIPREM 645 versión 1.5 (CIBERTEC S.A). Para ello, primero se inmovilizan las ratas en un cepo y se colocan las colas bajo una lámpara de infrarrojos durante 5 minutos a 37 ºC, con la finalidad de favorecer la vasodilatación de la cola del animal. A continuación, se coloca el manguito presurizador en la cola, el cual comienza a presionar para atenuar el pulso de la arteria caudal. Cuando cesa el pulso de la cola, el manguito comienza a desinflarse para poder registrar el pulso real del animal. Los datos son recogidos por un transductor de señales, acoplado a un software que representa los valores gráficamente. 5.4.1 Recogida de muestras de orina y determinación de proteinuria Para obtener muestras de orina, los animales se colocaron 24 horas antes del sacrificio en distintas jaulas metabólicas, con libre acceso de agua y comida. En primer lugar, se midió la cantidad total de orina excretada de todos los animales. Luego, se centrifugaron las muestras a 2500 g durante 7 minutos a 20 ºC y el sobrenadante obtenido se recogió y se almacenó a -80 ºC hasta el momento de su utilización. La concentración de proteínas en orina se determinó por el método colorimétrico descrito por Bradford (Bradford, 1976). En la placa, se realizó una curva patrón con diluciones seriadas de gammaglobulina. En la placa se cargaron 5 μL de las muestras, con una previa dilución de 1/40, por cada pocillo y 250 μL de reactivo Bradford, previamente diluido 1/5. La placa se mantuvo en agitación a velocidad baja-moderada durante 10 minutos y, a continuación, se leyó a 595 nm en el lector de placas (ASYS UVM 340) y el software MicroWin versión 4.36. 13 5.4.2 Sacrificio de los animales El sacrificio de los animales se realiza en DG19 mediante sobredosis de anestésico (isofluorano 5%) hasta confirmar parada cardiorrespiratoria, seguido de exanguinación y neumotórax. Se realiza una disección del abdomen y se extirpan los riñones, objeto de este estudio. Seguidamente, los órganos se colocan en una placa de Petri con suero fisiológico frío y se limpian eliminando los restos de sangre y de tejido graso. Los riñones se decapsulan, eliminando la capa fibrosa externa con la ayuda de dos pinzas quirúrgicas, se secan en papel de filtro y se pesan en la balanza analítica. Tras el pesaje, los riñones se cortan longitudinalmente con ayuda de un bisturí, dividiéndolos simétricamente. Por otra parte, se procede a determinar los pesos de los fetos, clasificados por cuerno uterino. Parte de la muestra de riñón se destina para estudios histológicos, mientras la otra parte se destina para experimentos de biología molecular. 5.4.3 Expresión génica de sFlt-1 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar regiones específicas del genoma para determinar el grado de expresión de distintos genes. La PCR en tiempo real (RT-PCR) permite cuantificar a tiempo real la cantidad de producto amplificado, mediante la adición de fluoróforos específicos que son detectados en el termociclador. Para la realización de los siguientes experimentos se preparó previamente la zona de trabajo, aplicando un inhibidor de ARNasa (RNaseZAP) y limpiando todo el material necesario con etanol al 70 %. - 5.4.3.1 Extracción de ARN El primer paso es la extracción de ARN del tejido renal, para ello, se pesaron 50 mg del tejido de 3 ratas NP y 3 ratas LOPE y se añadieron 500 μL de TRIzol Reagent. Para la homogeneización de las muestras se realizaron 3 intervalos de 10 segundos en el Polytron (Heidolph DIAX 900). Una vez homogeneizadas las muestras, se añadieron 100 μL de cloroformo a cada una y se centrifugaron a 4 ºC durante 10 minutos a velocidad 12000 g. Tras centrifugar se observaron 3 fases, siendo el sobrenadante la fracción correspondiente al ARN. La fase intermedia y el pellet son las fracciones correspondientes al ADN y resto de proteínas, respectivamente. El sobrenadante se recogió en un eppendorf libre de ARNasas, junto con 250 μL de isopropanol en cada muestra para precipitar el ARN. Tras 14 dejarlo reposar 10 minutos a temperatura ambiente, se volvió a centrifugar siguiendo las mismas condiciones anteriormente mencionadas. A continuación, se retiró el sobrenadante y se añadió 500 μL de etanol al 75 % al pellet, para purificar la muestra. Luego, se volvió a centrifugar a 4 ºC durante 5 minutos a velocidad 8000 g. El sobrenadante se desechó y las muestras se mantuvieron durante 15 minutos a temperatura ambiente para garantizar la completa evaporación del etanol. Por último, se añadieron 30 μL de H2O DEPC, se incubaron 10 minutos más a temperatura ambiente. Las muestras se mantuvieron en hielo para los pasos posteriores. - 5.4.3.2 Control de calidad de la extracción de ARN Para comprobar la integridad del ARN, se realizó una electroforesis en gel de agarosa (1,5%). En cada pocillo se cargó un volumen final de 10 μL por muestra (5 μL de H2O DEPC, 4 μL de ARN y 1 μL de Tampón mixto 10X). Las condiciones del gel fueron 20 minutos a 190 V. Transcurrido este tiempo, la integridad del ARN se observó mediante la presencia de dos bandas nítidas correspondientes a las subunidades de ARN ribosómico 18 S y 28 S bajo una lámpara UV. Otro método que se utiliza para medir la pureza de las muestras es la cuantificación de ARN mediante Nanodrop (Software ND100). Se trata de un espectrofotómetro de barrido que mide la variación de la absorbancia de 1 μL de muestra a distintas longitudes de onda. Existen dos parámetros que determinan la pureza del material genético, los ratios 260/280 y 260/230. Ambos representan la relación entre la medida de absorbancia del material genético (260 nm) y la presencia de contaminantes (280 nm y 230 nm). Valores cercanos a 2 son considerados puros (Loughrey & Matlock, 2016). Además, esta técnica también nos permite determinar la concentración de ARN de cada muestra. - 5.4.3.3 Retrotranscripción (RT) La retrotranscripción sirve para obtener muestras de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN para poder realizar una posterior RT-PCR. Con la concentración calculada en Nanodrop, se añade en un volumen final de 10 μL, 2 μg de ARN ya que es la cantidad permitida por el kit utilizado (cDNA Reverse Transcription kit). Para cada muestra de 10 μL se preparan 10 μL de Master Mix. A continuación, se puso en marcha el protocolo de RT en el termociclador (Biometra Tgradient), cuyos pasos están descritos en la Tabla 1. Las muestras de ARN se introducen 15 en el paso 3 y tras el paso 4 se sacan del termociclador y se mantienen en hielo. Mientras se ejecutan los pasos 5 y 6 se añaden los 10 μL de Master Mix previamente preparada. Una vez terminado el paso 6 se introducen de nuevo las muestras en el termociclador y se ejecutan los pasos restantes. Una vez terminado el programa se miden las muestras de ADN monocatenario en el Nanodrop (tal y como se explica en el punto 5.4.3.2) para evaluar su pureza. Las muestras se conservaron a -20 ºC hasta el siguiente paso. - 5.4.3.4 RT-PCR Por último, las muestras de ADNc se incubaron con cebadores específicos, (dilución 1/10, previa eficiencia) para nuestro gen de interés (sFlt-1) y para un gen de referencia, el de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) que sirve para normalizar los valores de expresión. Las secuencias de los cebadores correspondientes a cada gen se encuentran en la Tabla 2. Tabla 2. Lista de cebadores utilizados para la PCR. sFlt-1 (tirosina quinasa soluble de tipo 1), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). Para cada gen de interés hay que realizar una dilución “stock”: 7,8 μL H2O DEPC, 0,6 μL de cada cebador (sentido y antisentido) con dilución 1/10 y 10 μL SYBR Green Supermix. Estos volúmenes se multiplicaron por el número de muestras que se añadieron en la placa. En cada pocillo, se añadieron 1 μL de ADNc y 19 μL de “stock”. La placa se selló con una lámina adhesiva y se llevó al termociclador (MiniOpticon, BioRad) donde siguió el siguiente protocolo: un primer ciclo de activación del fluoróforo y desnaturalización inicial del ADN a 95 ºC durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos donde las muestras seguían un paso de desnaturalización (95 ºC durante 15 segundos) y otro de hibridación y elongación de las cadenas (60 ºC durante 1 minuto). Gen Cebador sentido (5'→3') Cebador antisentido (3'→5') Referencia sFlt-1 CAAGGGACTCTACACTTGTC CCGAATAGCGAGCAGATTTC AF157595.1 GAPDH GCCAAAAGGGTCATCATCTCCGC GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG NM_017008.4 Paso 1: 25 ºC 10 min Paso 5: 25 ºC 5 min Paso 9: 85 ºC 5 min Paso 2: 25 ºC Pausa Paso 6: 25 ºC Pausa Paso 10: 4 ºC 1 min Paso 3: 65 ºC 10 min Paso 7: 25 ºC 10 min Paso 11: 4 ºC Pausa Paso 4: 65 ºC Pausa Paso 8: 37 º C 2 h Tabla 1. Flujo de trabajo del programa de retrotranscripción en el termociclador. 16 Los resultados son recogidos y analizados en el programa BioRad CFX Manager 3.1. La aparición de un único pico en las curvas de disociación (melting curve) de las muestras indicó una correcta amplificación. Para confirmar que el producto de PCR obtenido es el deseado se realizó una electroforesis en gel de agarosa (1,5 %), donde se cargaron 20 μL del producto de PCR con 1 μL de Tampón mixto 10X, además de 3 μL de marcador de peso molecular (Quick-Load® Purple) en un pocillo separado para poder confirmar el tamaño de las bandas. La cuantificación de la expresión de sFlt-1 se relativizó a partir del nivel de expresión del gen GAPDH, a través de la ecuación 2-ΔΔCt, donde Ct indica el ciclo en el cual la amplificación cruza el umbral de ruido de fondo y se asume que la cantidad medida es proporcional al ADNc (Livak & Schmittgen, 2001). 5.5 Histología 5.5.1 Fijación y deshidratación de las muestras Para preservar la estructura original de los órganos, el tejido obtenido en el apartado 5.4.2 se sumerge en paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 24 horas en rotación. Para retirar todo el contenido en agua en el tejido, se sumerge el tejido en etanol. Primero se sumerge en etanol al 70 % durante 12 horas. Transcurrido el tiempo, se sumerge en concentraciones crecientes de etanol (80, 85, 90, 95 y 100 %) durante 1 hora en cada uno. 5.5.2 Inclusión en parafina y formación de los bloques Una vez completado el protocolo de deshidratación, se introducen las muestras en una solución de xilol: etanol (1:1) y luego en xilol puro, 1 hora en cada uno. A continuación, en una estufa a 60 ºC se sumerge el tejido en una solución xilol: parafina (1:1) durante 1 hora. Por último, se deja durante toda la noche el tejido sumergido en parafina dentro de la estufa a 60 ºC. Al día siguiente, el tejido está listo para formar los bloques de parafina. Para ello, se coloca en un molde metálico cuadrado el tejido en la orientación adecuada, de forma que la zona donde se realizó el corte se vea en la superficie del bloque. Tras esto se vierte parafina líquida sobre los moldes y se colocan los cassettes. Estos se guardan posteriormente en el frigorífico a 4 ºC hasta su completa solidificación. 5.5.3 Obtención de cortes histológicos Las secciones deben ser de un grosor muy fino para que se puedan ver correctamente al microscopio. Para ello, se usa un microtomo (MR-2258, Histo-lineLaboratories), ajustado para realizar cortes de 5 μm. Los cortes realizados se depositan en un baño de agua a 17 45 ºC para favorecer que la sección se estire correctamente en el porta. El porta utilizado para colocar los cortes presenta un tratamiento con polilisina (Polysine Adhesion Microscope Slides, Epredia), el cual garantiza que no haya pérdida del tejido en tratamientos posteriores. Por último, los portas con las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente durante 24 horas. 5.5.4 Desparafinado El primer paso previo a la tinción es el desparafinado de la muestra para favorecer la entrada de los distintos colorantes en el interior celular. Para ello, se introducen las muestras en xilol puro dos veces durante 6 minutos cada vez. A continuación, se sumergen en etanol: xilol (1:1) y en distintas cubetas a concentraciones decrecientes de etanol (100, 90, 80 y 70 %), seguido de una última cubeta en agua corriente, 5 minutos en cada una de las cubetas. 5.5.5 Tinción morfológica con hematoxilina - eosina La hematoxilina es un compuesto de color púrpura que se une a las zonas ácidas del tejido, como por ejemplo los núcleos celulares. Por otro lado, la eosina aporta una coloración rosada en las zonas básicas, como el citoplasma. Tras el protocolo de desparafinado, las muestras se incubaron durante 1 minuto y 30 segundos en hematoxilina (Gill Nº 3), seguido de un lavado de 15 minutos en agua corriente. A continuación, se tiñeron con eosina 1 % durante 15 minutos y transcurrido este tiempo se realizaron dos lavados de 5 minutos en etanol puro y otros dos lavados de la misma duración en xilol puro. Por último, se montaron las muestras con medio de montaje DPX. 5.5.6 Determinación de la producción de ERO in situ Con el fin de observar la producción de ERO, las muestras se trataron con dihidroetidio (DHE). Se trata de un compuesto fluorescente azul que se oxida principalmente por radicales O2.-, dando lugar a 2-hidroxietidio. Además, también puede interaccionar de forma inespecífica en el núcleo con otras especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que provoca la oxidación del DHE en etidio. Ambos productos tienen la capacidad de emitir una coloración fluorescente roja, cuyas longitudes de onda de excitación y emisión son 535 nm y 635 nm, respectivamente. Tras el protocolo de desparafinado se secan los portas y se dibuja un pocillo alrededor de cada sección con un rotulador hidrófobo. Los portas con DHE a concentración 10 μM se 18 introducen en una cámara húmeda y se incuban a 37 ºC durante 10 minutos. Tras esto, se realizan 3 lavados de 5 minutos con PBS. Para garantizar que la señal de DHE es específica de ERO, se realizó un ensayo paralelo con superóxido dismutasa a concentración 2,7 x104 U/mL (PEG-SOD). Por otro lado, para determinar la participación de cada isoforma de la enzima NADPH oxidasa en la producción de ERO, se preincubaron 30 minutos a 37 ºC con los inhibidores específicos de las NOX, como ML171 (inhibidor de NOX1, concentración final = 10 μM), GKT136901 (inhibidor de NOX1 y NOX4, concentración final = 0,1 μM) y VAS2870 (inhibidor de NOX1, NOX2 y NOX4 concentración final = 10 μM) del tratamiento con DHE. Las intensidades y áreas de las muestras se midieron en la zona del glomérulo, utilizando el programa de análisis de imagen ImageJ (versión 1.54d), siendo los valores de fluorescencia los correspondientes al comando “IntDen”. Los valores representados gráficamente fueron normalizados por el área de los glomérulos. 5.5.7 Obtención de imágenes en el microscopio Las imágenes para la determinación de ERO in situ fueron tomadas a través del microscopio de fluorescencia Axioskop 40 y utilizando el programa ZEN 3.3. Por otro lado, para las muestras teñidas con hematoxilina–eosina se utilizó el microscopio Olympus BX41 y el programa OLYMPUS cellSens 1.18. 5.6 Análisis estadístico Los datos obtenidos se representaron como media  S.E.M y se analizaron en el programa GraphPad Prism versión 8.0.2 (263). Para demostrar la significancia estadística de los datos se realizó un análisis t de Student para datos no emparejados, asumiendo una distribución Gaussiana y desviación estándar iguales. Los datos se consideraban significativamente distintos a valores inferiores de p < 0,05. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Características de los animales del estudio En la Tabla 3 se recogen los datos correspondientes a las características de los animales tras su sacrificio, el día 19 de gestación (DG19). Los pesos finales de los animales, así como de los riñones, no mostraron diferencias significativas. Estos datos coinciden con los encontrados en un estudio realizado en el mismo grupo de investigación, pero en ratas 19 con PE de fase temprana, donde tampoco se observaron diferencias significativas con respecto a las ratas NP (Santana-Garrido et al., 2022). Con respecto a las características de las crías, diversos estudios indican la reducción del crecimiento fetal como uno de los síntomas más notables (Ngene & Moodley, 2018; Raia- Barjat et al., 2022). Sin embargo, en este estudio no se observaron variaciones entre el tamaño fetal de los grupos, por lo que no explicaría la restricción en el crecimiento que suele aparecer en la PE. Esto podría deberse a las diferencias de cómo se desarrolla la enfermedad, puesto que al desarrollarse la PE después de la semana 34 de gestación (fase tardía), no se ha producido una mala placentación como sucede en el fase temprana, y, por tanto, el feto ha pasado gran parte de la gestación sin sufrir los efectos negativos de ello (Gyselaers & Thilaganathan, 2019). Si bien es cierto que la restricción en el crecimiento fetal es un síntoma claro que aparece en los embarazos con PE, la mayoría de los estudios se han realizado en embarazadas con PE temprana, como se observó en un estudio previo del grupo utilizando ratas preeclámpticas (Santana-Garrido et al., 2022). Sin embargo, en aquellos estudios que también incluían PE tardía concluían que existe una menor incidencia de este síntoma (Wójtowicz et al., 2019). No obstante, existen otros estudios clínicos que sí observan restricción del crecimiento fetal en la PE tardía (Teka et al., 2023), lo que podría respaldar la idea de la heterogeneidad en la sintomatología de esta enfermedad. Tabla 3. Características de los animales al final del experimento. Pesos de los animales, riñones, y crías en el día 19 de gestación (DG19). Los resultados representan la media  S.E.M, de al menos 6 animales por grupo. NP: normal pregnant, LOPE: late-onset preeclampsia. 6.2 Demostración del modelo de preeclampsia tardía en ratas La PE, como se ha mencionado anteriormente, se diagnostica como una enfermedad de carácter hipertensivo junto con, al menos, uno de los siguientes síntomas: proteinuria, aumento de factores antiangiogénicos, disminución de factores angiogénicos o disfunción endotelial, entre otros. Parámetro Peso del animal (g) 327,30 ± 30,48 338,40 ± 28,88 Peso de riñones (g) 0,83 ± 0,09 0,89 ± 0,05 g riñón/100 g peso animal 0,25 ± 0,01 0,26 ± 0,02 Media nº crías 10,83 ± 3,92 11,30 ± 2,63 Peso crías cuerno derecho (g) 2,15 ± 0,43 2,52 ± 0,48 Peso crías cuerno izquierdo (g) 2,15 ± 0,40 2,50 ± 0,57 NP LOPE 20 En primer lugar, al medir los valores de la presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD) al inicio del tratamiento (DG15) no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos de animales. Sin embargo, al finalizar el tratamiento (DG19), el grupo LOPE presentaba un incremento significativo de PAS y PAD, con respecto al grupo NP. Esto demuestra que el modelo de rata utilizado en este estudio presenta una condición hipertensiva, tal y como se aprecia en la Figura 3. La presencia de hipertensión en modelo de ratas con PE tardía ya se ha confirmado en otros estudios (Kasture et al., 2019). Figura 3. Medidas de presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD). Representación gráfica de la determinación de la presión arterial sistólica (A) y diastólica (B) de ambos grupos de experimentación, los días 15 (DG15) y 19 (DG19) de gestación. (C) Datos recogidos tabla tras la determinación de la presión. Los resultados representan la media  SEM, de al menos 4 animales por grupo. Significación estadística: ** p < 0,01 y *** p < 0,001 vs NP en DG19. NP: normal pregnant, LOPE: late-onset preeclampsia. En cuanto a la determinación de la proteinuria, no se observaron diferencias significativas entre los animales del estudio (Figura 4). A pesar de ser uno de los biomarcadores más utilizados en el diagnóstico de la PE, en otros estudios se ha visto que la proteinuria puede ser el último síntoma que aparece y, por tanto, la PE se puede dar sin signos de proteinuria (Irwanto et al., 2021). Estudios con el mismo modelo de inducción de la PE de fase temprana muestran claras diferencias entre el grupo enfermo y el sano. Sin embargo, en nuestro trabajo dichas diferencias no se han observado. Esto se puede deber a las diferencias en el abordaje experimental, donde el comienzo de la infusión del factor sFlt-1 en las ratas se produce a partir del día 7 de gestación (DG7), originando una PE temprana, y en nuestro caso fue a partir del día 15 de gestación (DG15). Por ello, al tener (C) (B) (A) PAS (mm Hg) 108,50 ± 2,91 106,10 ± 2,10 112,70 ± 0,70 121,60 ± 0,90 *** PAD (mm Hg) 78,01 ± 0,88 74,95 ± 2,01 79,32 ± 0,39 86,72 ± 0,60 ** DG19 NP LOPE DG15 DG19 DG15 DG15 DG19 0 50 100 150 Presión arterial sistólica (mm Hg) NP LOPE *** DG15 DG19 0 20 40 60 80 100 Presión arterial diastólica (mm Hg) NP LOPE ** 21 más días de tratamiento las ratas pudieron desarrollar síntomas de forma más notable, entre los cuales se encuentra la proteinuria (Santana-Garrido et al., 2022). El hecho de que el mismo modelo de ratas, pero con cambios en la duración del tratamiento, afecte al desarrollo de la proteinuria se explica a través del propio factor sFlt-1, pues se ha encontrado una fuerte correlación entre los niveles de sFlt-1 y el desarrollo de proteinuria (Tataru-Copos et al., 2022). Figura 4. Determinación de proteinuria. (A) Representación gráfica de cantidad de proteína en orina de 24 horas, (B) Datos recogidos tras la extracción de orina y determinación de proteinuria en ratas. Los resultados representan la media  SEM, de al menos 4 animales por grupo. NP: normal pregnant, LOPE: late-onset preeclampsia. En el diagnóstico clínico de la PE de fase tardía, la sobreexpresión del factor antiangiogénico sFlt-1 es considerado como otro biomarcador importante (Cim et al., 2017). En la Figura 5 se muestran los cambios en la expresión de este factor en tejido renal, donde observamos una expresión significativamente mayor en el grupo LOPE con respecto al grupo NP. En otro estudio con un modelo de PE temprana en ratas cuya inducción de la enfermedad se realizó bajo el mismo procedimiento, también observaron una sobreexpresión de sFlt-1 en los riñones (Santana-Garrido et al., 2022), por tanto, este análisis confirma que el método de inducción de la PE ha funcionado correctamente. Parámetro mg/mL 0,7 ± 0,21 0,81 ± 0,09 mL/24h 7,18 ± 2,07 6,83 ± 1,56 mg/24h 5,04 ± 1,88 5,12 ± 0,80 NP LOPE NP LOPE 0 2 4 6 8 Proteinuria (mg prot / 24h) (A) (B) NP LOPE 0 1 2 3 4 Niveles de expresión relativa de ARNm sFlt-1 * Figura 5. Expresión relativa de sFlt-1 en tejido renal. Los resultados se representaron en tanto por uno con respecto a la expresión génica de sFlt-1 en NP, de al menos 3 animales por cada grupo. Significación estadística: * p < 0,05 vs. NP. NP = normal pregnant, LOPE: late-onset preeclampsia. 28 resting and phagocytizing cells. Experientia, 20(1), 21–23. https://doi.org/10.1007/BF02146019/METRICS San Juan-Reyes, S., Gómez-Oliván, L. 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