Aplicación de tecnología de microondas de frecuencia variable para recalentamiento de tejido cardíaco criopreservado

Equation Chapter 1 Section 1 Proyecto Fin de Carrera Grado en Ingeniería Electrónica, Robótica y Mecatrónica Aplicación Tecnología Microondas de Frecuencia Variable para Recalentamiento de Tejido Cardíaco Criopreservado Autor: Ana Zarco López Tutor: Ramón Jesús Risco Delgado Dpto. Física Aplicada III Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 ii iii Proyecto Fin de Carrera Ingeniería Electrónica, Robótica y Mecatrónica Aplicación Tecnología Microondas de Frecuencia Variable para Recalentamiento de Tejido Cardíaco Criopreservado Autor: Ana Zarco López Tutor: Ramón Risco Delgado Profesor titular Dpto. de Física Aplicada III Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 iv v Proyecto Fin de Carrera: Aplicación Tecnología Microondas de Frecuencia Variable para Recalentamiento de Tejido Cardíaco Criopreservado Autor: Ana Zarco López Tutor: Ramón Risco Delgado El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Fecha: El Secretario del Tribunal: vi vii Agradecimientos Este apartado es el directo responsable de estos minutos de pausa que me he tomado a hacer memoria para recordar todo lo vivido en esta etapa. Estos momentos están repletos de personas que han estado presente y junto con las que he pasado la misma. A las que les quiero dedicar estos párrafos de agradecimiento. En primer lugar, quisiera agradecer a Ramón y mis compañeros. No podría haber tenido mejor tutor, al que agradezco mucho su ayuda y la confianza que puso en mí. Ha sido un placer trabajar en este interesante proyecto junto con este equipazo. A todos los profesores y profesoras que durante mis etapas académicas no solo me han enseñado conocimientos sino otros valores y que me han inspirado como persona. A mis compañeros y compañeras, aunque desgraciadamente no volveré a verles cada mañana compartiendo tantas vivencias juntos y terminemos distanciándonos al tomar cada uno su propio camino, han sido un pilar fundamental durante la etapa universitaria. Sea como sea, seguro que no les olvidaré. A mis amigas y amigos, a pesar del reducido tiempo que hemos podido pasar juntos por las circunstancias, me han hecho sentirme querida y valorada en todo momento. Hemos forjado una relación que, independientemente del contacto que mantengamos, sé que siempre están ahí, igual que yo estoy para ellos como confió que siga siendo durante muchos más años. También a mis amigos virtuales o simplemente amigos, seguramente los que más me han escuchado diariamente en esta etapa y que han sido los que me han alegrado muchos de ellos. A mi familia, mis padres y hermanos, por todo lo que han hecho por mí, por su amor, gracias. Y si esto se permite quisiera agradecérmelo a mi misma. Ana Zarco López Grado en Ingeniería Electrónica, Robótica y Mecatrónica Sevilla, 2021 viii ix Resumen Una de las proyecciones futuras de la criopreservación es lograr completar dicho desarrollo manteniendo la viabilidad y funcionalidad de tejidos biológicos. Esto permitiría formar bancos de órganos criopreservados entre otras aplicaciones que abriría paso esta técnica. No obstante, se encuentran complicaciones que no lo hacen factible y aún permanecen en investigación soluciones y técnicas potenciales. Entre estos problemas, una de las principales dificultades reside en el proceso de recalentamiento, en el cual el tejido sufre daños biológicos internos que destruyen estos tejidos de mayor tamaño. Este estudio se realiza con objetivo de analizar una posible solución a esta cuestión, el recalentamiento de órganos mediante tecnología VFM, basada en la introducción de tasas de cambio de frecuencia de microondas. Con el fin de recabar toda la información posible para caracterizar el estudio de forma completa y afín a datos reales, se parte comenzando con una revisión bibliográfica del estado actual y las investigaciones que se han llevado a cabo en el campo de la criopreservación y VFM, además de documentar las características y propiedades dieléctricas de las muestras biológicas tratadas. En este proyecto se han desarrollado una serie de modelos que emulan cómo se comportaría el sistema de calentamiento de un corazón humano criopreservado mediante simulaciones realizadas en programas de elementos finitos, QuickWave y Comsol Multiphysics. Para el análisis se realizaron dos tipos de experimentos controlados, modelando un sistema microondas con frecuencia fija y otro con frecuencia variable. Finalmente, se presentan los resultados obtenidos. Estos demostraron que la uniformidad y la eficiencia del calentamiento están muy influenciadas por la frecuencia. Esta prometedora tecnología VFM optimizaba el proceso de recalentamiento y su rendimiento de forma notoria. Obteniendo perfiles de transferencia de calor más rápidos y un mapa de distribución de temperaturas más uniformes u homogéneos. xvi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2.1 Diagrama P-T del agua. Representación de principio descenso crioscópico. 4 Figura 2.2 Distintos escenarios consecuencia de la osmosis en células de glóbulos rojos. 5 Figura 2.3 Distintos escenarios consecuencia de la velocidad de enfriamiento. 8 Figura 2.4 Naturaleza de los daños crioinducidos según la velocidad de congelación. 8 Figura 2.5 Probabilidad de fenómenos de nucleación y crecimiento en función de la temperatura y concentración de crioprotector genérico. 10 Figura 2.6 Espectro electromagnético 15 Figura 2.7 Bandas de radiofrecuencia. 16 Figura 2.8 Efectos en las moléculas causados por microondas. (a) por distribución de la carga, (b) redistribución polar. 16 Figura 2.9 Onda estacionaria en el interior de microondas tradicional de frecuencia fija. 18 Figura 2.10 Microondas de tecnología VFM: modelo microcure 2100. 18 Figura 4.1 Esquema simplificado fisiología órgano cardiaco. 26 Figura 4.2 Modelado y modificación corazón en software autodesk Fusion 360 27 Figura 4.3 Modelo geométrico corazón en QuickWave. Vista en alzado planta y perfil. 27 Figura 4.4 Modelo geométrico simplificado esfera corazón en COMSOL. 28 Figura 4.5 Parámetros dieléctricos del material y sus unidades en QuickWave 29 Figura 4.6 Contenido de agua en porcentaje en distintos tejidos y órganos humanos. 29 Figura 4.7 Permitividad y conductividad de tejido animal en función del contenido de agua a 3GHz. 30 Figura 4.8 Esquema distintas regiones de las propiedades dieléctricas, ɛ y σ, de tejidos en función de la frecuencia. 32 Figura 4.9 Grafica especifica de corazón humano. Datos de permeabilidad relativa y conductividad eléctrica en un alto rango de frecuencia 32 Figura 4.10 Grafica de la permitividad real, conductividad en un rango de 100MHz a 25Ghz de mezclas con distintas concentraciones de glicerina. 34 Figura 4.11 Interfaz software COMSOL. Datos dieléctricos del material de estudio 34 Figura 4.12 Datos dieléctricos del material de estudio en software QuickWave 35 Figura 4.13 Interfaz Software de simulación (a) Comsol (b) QuickWave 35 Figura 4.14 Modelo geométrico completo. Esquema 3d y árbol bloques que lo forman. 36 Figura 4.15 Barra de herramientas para modelado geométrico de COMSOL (a) y de QuickWave (b) 36 Figura 4.16 Modelo geométrico detalle: cavidad del horno y puertos 37 Figura 4.17 Modelo geométrico detalle: plato central 37 Figura 4.18 Modelo geométrico detalle: órgano de estudio 38 Figura 4.19 Árbol de definiciones en el que se ven declarados las partes que componen la geometría espacial. 38 Figura 4.20 Modelo 3d: plano simetría. 40 Figura 4.21 Geometría del microondas a tamaño completo (izquierda) y reducido a la mitad (derecha) 40 Figura 4.22 Árbol con materiales usados en el modelo. 40 Figura 4.23 Librería de materiales definidos en el software simulación. 41 Figura 4.24 Mallado del interior cavidad horno 44 Figura 4.25 Mallado del modelo de órgano 44 Figura 4.26 Árbol de físicas en software de simulación. 45 Figura 4.27 Representación onda electromagnética simulada QWED. 45 Figura 4.28 Puertos de campo electromagnético 46 xvii Figura 4.29 Configuración del puerto electromagnético (a) en COMSOL y (b) en QuickWave. 47 Figura 4.30 Configuración estudio transferencia de calor en solidos de COMSOL . 47 Figura 4.31 Acoplamiento físico en el software de simulaciones 48 Figura 4.32 Configuración de la simulación en QWED. 49 Figura 4.33 Tabla QWED de asignación de frecuencias variables en cada paso 50 Figura 4.34 Código Matlab para generación tabla de frecuencias variables en QuickWave 50 Figura 4.35 Configuración estudio del dominio temporal de Comsol. 51 Figura 4.36 Estrategia de simulación modelo variable de Comsol con Matlab 52 Figura 4.37 Mensajes salida en consola livelink comsol 5.6 with matlab 52 Figura 4.38 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 1 53 Figura 4.39 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 2 53 Figura 4.40 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 3 54 Figura 5.1 Mapa distribución espacial patrón de campo magnético E [V/mm] para distintas frecuencias desde 2.45GHZ(a), 3.5GHz(b), 5 Ghz(c) hasta 7 GHz(d) 57 Figura 5.2. Tabla de energía y potencia disipada a frecuencia 2.46GHz(a) y 4 GHz(b). 58 Figura 5.3. Mapa distribución temperatura en esfera tras calentamiento 30s a frec.fija (a) y frec.variable (b) 59 Figura 5.4. Mapa distribución temperatura en órgano QWED tras calentamiento 30s a frec.fija (a) y frec.variable (b) 61 Figura 5.5 Tabla datos temperatura de calentamiento en QuickWave. 60 Figura 5.6 Grafica comparativa de temperatura media con frec.fija vs variable en experimento QuickWave. 61 Figura 5.7 Línea de corte 3D para representación de datos. 61 Figura 5.8 Perfil térmico para una línea de referencia en el eje coordenado x del modelo de frecuencia fija y 1KW de potencia 62 Figura 5.9 Valor absoluto del campo eléctrico formado por ondas de frecuencia 2.45 GHz a lo largo de la línea de referencia. 62 Figura 5.10 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia fija a 250W con distintos pasos de simulación hasta 60s. 63 Figura 5.11 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia fija a 600W al finalizar simulación 60s 63 Figura 5.12 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia variable a 600W al finalizar simulación de 30s. 64 xviii 1 1 INTRODUCCIÓN A mediados del siglo pasado nace una herramienta que supuso una revolución en el campo de las disciplinas de ciencias biológicas, la criopreservación. El interés de conservar material biológico a estas bajas temperaturas reside en la capacidad de suspender el tiempo biológico, deteniendo la actividad enzimática o química que pueda degradar el mismo. Sustenta numerosos empleos, desde su uso para investigación de microorganismos, como también para el desarrollo de la sostenibilidad de recursos biológicos y la conservación de especies hasta para la medicina regenerativa a partir de células madre congeladas. Una de las utilidades más importantes que se plantean en medicina son bancos de órganos. Debido a la escasez de órganos disponibles de donaciones y las largas listas de espera de pacientes para recibir estos trasplantes, se ha convertido en un punto crítico mantener la viabilidad de los órganos desde su extracción hasta comprobar el triunfo del injerto. Esta línea de investigación es relativamente novedosa y a pesar de los grandes avances conquistados en las distintas fases de la criopreservación, aun hoy en día se encuentra vigente la búsqueda de soluciones y mejoras a las dificultadas y problemas de lesiones irreversibles que se presentan en este proceso de enfriamiento y su posterior reversión mediante calentamiento. Por otro lado, se ha desarrollado una tecnología que solventa los problemas inherentes en el proceso de calentamiento convencional por microondas a frecuencia fija. Mediante un barrido en el rango de frecuencias se consigue un patrón de temperaturas de calentamiento selectivo y más uniforme junto con una mayor eficiencia. Esta técnica VFM es usada de forma asidua en la industria para la unión y secado a alta velocidad de distintos polímeros termoplásticos, sin embargo, aún no ha sido extendida su aplicación a otros campos como el biotecnológico. El siguiente estudio tiene, por tanto, como objetivo analizar estos posibles beneficios que puede ofrecer la incorporación de dicha tecnología en el proceso de criopreservación. En concreto, se enfoca en determinar los efectos del recalentamiento con VFM sobre el tejido cardiaco de un corazón humano. A lo largo del siguiente documento se encuentran los distintos apartados que trataremos. Se comienza con el contexto actual de la criopreservación, pasando a detallar la metodología seguida y finalmente mostrando los resultados obtenidos junto con las conclusiones y líneas futuras para la investigación. 2 3 2 ESTADO DEL ARTE 2.1. Criopreservación. 2.1.1 Introducción, origen y definición de conceptos La criopreservación se define como el proceso en el cual una célula o tejidos biológicos son congelados a temperaturas criogénicas con el objetivo de mantener la viabilidad y funcionalidad de los mismos en el tiempo. Esta herramienta viene respaldada científicamente por la demostración de la relación directa que existe entre la temperatura de almacenamiento y el tiempo de viabilidad de la muestra criopreservada. Esto sucede ya que el tiempo biológico viene determinado por reacciones bioquímicas que van degradando el tejido biológico. El frio prolonga este tiempo pues a bajas temperaturas, inferiores a -140 ºC , cualquier actividad biológica o metabólica queda detenida evitando la destrucción de la célula y manteniendo sus condiciones suspendidas. El fundamento de esta práctica se conoce desde hace miles de años. En el periodo Neolítico, nuestros antepasados utilizaban fosas y cuevas donde había menor temperatura para la conservación de los alimentos. Así como en la propia naturaleza encontramos especies que, por las condiciones extremas de temperaturas, han desarrollado mecanismos propios que les permiten sobrevivir tras ser congelados. Por ejemplo, la especie de rana selvática pasa por un proceso similar al que trataremos, generando un anticongelante natural a partir de unas proteínas especializadas y glucosa. [1] Más no fue hasta 1949 cuando se aplicó satisfactoriamente el concepto de criopreservación como lo conocemos hoy en día. Un equipo de científicos a cargo de Christopher Polge consiguieron criopreservar por primera vez eficazmente gametos de toro. Este logro fue posible gracias al nacimiento predecesor del área de investigación de la criobiología con la publicación de la obra de Luyent “Vida y muerte a bajas temperaturas” en el año 1940 y los posteriores avances que impulsaron. Desde entonces se han conseguido numerosos hitos y conocimientos en este ámbito, sin embargo, es una ciencia moderna de la que hoy en día aún sigue vigente su investigación como se reflejará en los siguientes apartados. La criobiología es la ciencia que estudia cómo afecta las bajas temperaturas a los tejidos biológicos, es decir, estudia la base de conocimientos necesarios para su aplicación en la criopreservación. Es imprescindible conocer ciertas características de las células y tejidos, junto con sus propiedades fisicoquímicas, entre ellas la estructura y composición de las membranas plasmáticas, pues determinan los principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de criopreservación y de los cuales depende la viabilidad y supervivencia de las muestras. Por consiguiente, de forma previa a abordar este proyecto es esencial entender ciertos conceptos implicados. Una célula eucariota está formada por un núcleo junto con distintos orgánulos encargados de realizar las funciones celulares sumergidos en citoplasma, una disolución de agua y sales, y delimitada por una membrana plasmática semipermeable. Las células de tejido miocárdico están compuestas aprox. por un 70% de agua del total de su volumen, lo cual significa que su comportamiento está bastante relacionado con las características del agua. 4 Las moléculas de agua tienen un comportamiento muy particular comparado con el resto de compuestos que encontramos en la naturaleza. Esto se debe a su formación. Cada molécula de H2O está compuesta, como indica su formulación, por dos átomos de hidrogeno y uno de oxígeno que se encuentran unidos por enlaces covalentes, quedando una disposición en la cual estos distintos átomos quedan cargados positiva y negativamente respectivamente. Esto provoca que las distintas moléculas de agua se unan entre si mediante enlaces intermoleculares débiles conocidos como puentes de hidrogeno. Estos enlaces provocan que el agua se compacte en su estado sólido. Esté fenómeno estará presente en el proceso de criopreservación donde descendemos a umbrales de temperaturas bajo cero, atravesando el punto de congelación del agua pura en condiciones de presión atmosférica normalizadas. Como se detallará más adelante, esta congelación es crítica para la viabilidad de la célula por lo que se debe evitar. Para ello una de las técnicas usadas se basa en usar a favor el principio físico del descenso crioscópico. El descenso crioscópico consiste en disminuir la temperatura del punto de fusión del agua pura mediante la adición de sales. Es una propiedad coligativa, es decir, la relación de este descenso es directamente proporcional a la concentración de soluto existente en la disolución acuosa, dependiendo únicamente de ello y no de la naturaleza del mismo. Por tanto, permitiría descender la temperatura de la célula por debajo de 0ºC sin que las moléculas de agua que esta contiene pasen a su estado sólido. En la figura siguiente se ilustra gráficamente el efecto del descenso crioscópico. Se observa como la curva verde, que representa la disolución acuosa, encuentra desplazado su punto de fusión a menor temperatura respecto al disolvente puro en un ∆T. Así como también se aprecia la consecuencia directa de la disminución de la presión de vapor, ∆P, bajo las mismas condiciones de temperatura. Figura 2.1 Diagrama P-T del agua. Representación de principio descenso crioscópico. De la mano de esta herramienta de adicción de soluto para la criopreservación se hace necesario el transporte de estas sustancias a través de la membrana que recubre la célula. Existen dos formas de transporte celular basando como criterio de clasificación el consumo de energía metabólica que implica el proceso. Así el transporte que no utiliza energía se define como transporte pasivo mientras que el que por el contrario si consume energía constituye el transporte activo. En el primer caso, el soluto se mueve siempre a favor de gradiente, que se convierte en la fuerza de conducción para el movimiento. Mientras que, por el contrario, el transporte activo ocurre de manera inversa, el movimiento se realiza en contra de gradiente de potencial químico o electroquímico. Para que esto sea posible se necesita un consumo de energía. [2] La principal energía celular es denominada a ATP. El ATP bombea iones de sodio/potasio que poseen cargas positivas, Na+/K+, presentes en la propia membrana de la célula, hacia el exterior de la célula (exoplasma). Dando como resultado una pérdida de la electropositividad interna de la célula que mantiene un gradiente de 5 concentraciones. [3] Por otro lado, se encuentra el trasporte pasivo principalmente constituido por el proceso de osmosis. Se basa en el principio de difusión a través de una membrana, en la cual, las moléculas de una sustancia se dirigen desde la solución más concentrada a la menos concentrada buscando el equilibrio hasta alcanzar una distribución homogénea en todo el espacio que les es accesible. La membrana biológica tiene comportamiento de membrana semipermeable. Esto quiere decir que es permeable al agua dejando pasar esta pero impide el paso de solutos. La osmosis es una clase de difusión a través de esta membrana semipermeable celular, en la que, por sus características, se enfoca en el movimiento del disolvente. El agua se mueve desde soluciones con baja concentración de soluto hacia soluciones con mayor concentración de soluto. Esta separación de dos sistemas, el intracelular y el intercelular, con diferentes concentraciones de soluto genera una presión en la membrana semipermeable que los separa, esto se denota como la presión osmótica. Esta tendencia de difusión a través de la membrana de una zona a otra está definida por la ley de difusión de Fick, que relaciona el gradiente entre ambos medios (gradiente químico o de concentración) con las propiedades de la membrana (área, grosor y permeabilidad). Calcula la velocidad a la que se produce el intercambio mediante una constante de difusión cuyo valor es directamente proporcional a la superficie de la membrana y a la diferencia de concentración de soluto, mientras que el grosor de la membrana colaboraría de forma inversa. [4] Al introducir la célula en una disolución de sales con una concentración de sales superior a la del interior de la célula, denominado medio hipertónico, el agua saldrá de la célula, por lo que consecuentemente esté verá su volumen reducido. En el caso inverso, si la solución que rodea a la célula es hipertónica, la célula aumentará el volumen de agua que contiene. Mientras que si no existe gradiente, como ocurre en un medio isotónico, no se activaría el proceso de osmosis al encontrarse en equilibrio. Figura 2.2 Distintos escenarios consecuencia de la osmosis en células de glóbulos rojos. Fuente: [osmosis and redbood cells -www.NDP teacher.org] El transporte a través de las membranas de sustancias durante la congelación y descongelación no es simple. Las bajas temperaturas (relacionadas con el aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez a la que se producen los cambios osmóticos en los procesos de congelación y post-descongelación dificultan el movimiento de moléculas a través de la membrana celular mediante procesos de transporte activo. Este transporte es dependiente de la acción de las bombas de ATP. Descender temperatura desde 25ºC a 10ºC reduce en la actividad de estas en un 60%. Por tanto, en el rango de temperaturas que se trabajan en la criopreservación uno de estos dos tipos de transporte se elimina, y el transporte pasa a ser predominado por los procesos de difusión y ósmosis en los momentos de estrés osmótico. 6 2.1.2 Proceso y dificultades 2.1.2.1 Introducción daños Tras comprender los distintos conceptos químicos y biológico se tratará como afectan estos concretamente durante el proceso de criopreservación. Como se ha visto anteriormente, la criopreservación es una herramienta que permite preservar el tejido biológico. Para esta congelación se hace uso de un elemento criogénico, normalmente nitrógeno líquido a -196ºC, hasta alcanzar el objetivo de una temperatura óptima para el almacenamiento de la muestra. La temperatura que se asigna como optima se encuentra entre unos -140 ºC y -150 ºC pues en este rango de temperaturas ya no existen fenómenos de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo las reacciones químicas. Temperaturas superiores a la óptima no asegura esta paralización del tiempo biológico y por tanto la correcta criopreservación y por otro lado el almacenamiento a temperaturas inferiores tampoco es recomendable, ya que se produce estrés mecánico que da lugar al crecimiento de las fracturas, sin presentar ninguna ventaja adicional. A pesar de esto, la criopreservación no es un proceso libre de complicaciones, ya que puede inducir variaciones extremas irreparables en las propiedades químicas, térmicas y eléctricas de las membranas celulares y las interacciones entre células del tejido. (Ávila-portillo, Madero y López, 2006). [5] Estas dificultades de la congelación no derivan de la permanencia a temperaturas bajas, como ya se ha indicado, sino de la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiológicas en la descongelación, que suponen los periodos críticos para la supervivencia celular durante la criopreservación. Los daños y lesiones celulares crioinducidos durante el proceso de criopreservación se pueden reducir a seis tipos, como clasifica el profesor m.Kasai: [Kasai et al., 1996]: formación de Hielo tanto intracelular como extracelular, daños de fractura en estructura celular, altos índices de toxicidad en las sustancias crioprotectoras y variaciones extremas de la presión osmótica excediendo rango tolerable tanto por aumento como por descenso. [6] 2.1.2.2 Proceso y formación de cristales Se detalla el proceso que sufren las células en esta fase donde tendrá lugar la cadena de eventos que vienen explicados en el apartado anterior y en los que se observan estas complicaciones mencionadas. Para conservar en frio un conjunto de células deben ser sumergidas en una solución salina. En primera instancia este medio isotónico tendrá una concentración de soluto similar a la que esperamos en el interior de la célula, por tanto, se encuentra en un equilibrio en ausencia de intercambio. Cuando se comienza a disminuir a temperatura de este conjunto, por las propiedades de transferencia de calor, la solución añadida exterior alcanza previamente bajas temperaturas en comparación con el interior de la célula. Por lo que consecuentemente las moléculas de agua de esta disolución comienzan a cambiar de estado y formar hielo. Como consecuencia directa el agua líquida de la disolución extracelular va mermando y lo que previamente era un medio isotónico se convierte en uno hipertónico. Actúa en ese momento el principio de ósmosis antes enunciado, la célula empezará a expulsar agua del interior para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares. Al salir agua de la célula, puesto que solo se intercambia el agua, aumentará la concentración de sal perteneciente a la disolución interna. Es aquí cuando interviene el otro principio repasado: de descenso crioscópico, que se utiliza a favor para descender el punto de congelación. La concentración salina intracelular es mayor, la temperatura a la que se formará hielo desciende. Esto beneficia al proceso pues dificulta que el agua del interior de la célula se congele y dañe su estructura. 2.1.2.3 Daño estructural: deshidratación y cambios en la membrana Además de esta formación de hielo intercelular aparecen otros dos factores que pueden perjudicar la viabilidad de la célula. Al evacuar tanta agua de la célula ocurren dos cosas, primero esta disminuye su volumen drásticamente, lo que provoca deformaciones estructurales irreversibles. Por otro lado, alcanzar concentraciones muy elevadas de sales puede resultar altamente toxica para la célula. Conforme la célula pierde volumen por la salida de agua, el líquido citoplasmático del interior genera una 7 compresión que hace que aumente la resistencia a continuar esta difusión. Cuando excede cierto nivel marcado por la resistencia física propia de la membrana estos cambios en la permeabilidad son irreversibles, perdiendo la capacidad de posteriormente rehidratarse y volver a las condiciones iniciales. La membrana son las estructuras que más se resignan en este proceso. No solo sufre por la presión osmótica que produce la deshidratación sino también por el propio frio al que se expone. Este fenómeno se entiende poniendo el foco en la composición de la membrana. Aunque esta varíe sus porcentajes dependiendo del tipo y especie de célula que se trate, normalmente se componen en gran medida de lípidos anfipáticos y en menores cantidades de proteínas y carbohidratos. Estos lípidos anfipáticos precisamente son los que se relacionan con el intercambio de agua que hemos tratado hasta ahora. Están caracterizadas por ser moléculas que tienen una zona polar, que interacciona fácilmente con el agua, y una zona hidrofóbica, que por el contrario excluye tanto al agua como a otros compuestos polares. Estos lípidos líquidos cambian su estado a solido alrededor de temperaturas de entre 10°C - 16°C, perdiendo la fluidez y aumentado considerablemente el grado de fragilidad del contorno celular. Se altera también las funciones de la membrana plasmática. Como se ha tratado, en el proceso de deshidratación también se puede presentar la perdida de estos lípidos, colaborando a mermar la capacidad de expansión posterior al volver a condiciones isotónica. 2.1.2.4 Influencia del tiempo en el proceso. Formación de hielo-deshidratación. Una vez conocidas estas dificultades se retoma los acontecimientos que tienen lugar en el proceso de congelación. Durante este proceso pueden ocurrir distintas cosas, en la cual predominará un tipo de daño u otro dependiendo de la velocidad con la que se lleva a cabo el enfriamiento. Lo primero que ocurre al alcanzar temperaturas cercanas a bajo cero es la formación de hielo, comenzando en el exterior celular. Tras este hecho, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se producirán distintas consecuencias. La primera situación corresponde a un enfriamiento lento. En esta el proceso de osmosis cuenta con el tiempo suficiente para desalojar agua y el descenso criogénico permite evitar la formación de hielo intercelular. Sin embargo, supondría una excesiva pérdida de agua y reducción de su volumen, que puede resultar letal e irreversible. Aumentaría también el hielo extracelular. Si por el contrario se realiza una congelación más rápida se puede evitar la salida de agua pero a costa de aumentar la probabilidad de formación de hielo en ambos medios, tanto el intracelular como el extracelular, que pueden contribuir a la destrucción celular mecánica. Pues la célula no alcanzaría la deshidratación suficiente para conseguir el descenso del punto de congelación optimo que evite la formación de hielo. [7] 14 Una de las aplicaciones de investigación que ya se realizan es la preservación de microorganismos, pues debido a su reducido tamaño se ha conseguido altos resultado de éxito. Esto permite la investigación de la microbiología. El mundo microscópico es bastante más importante de lo que solemos pensar pues, aunque no lo veamos, están presentes en mayoritariamente todos los hábitats de la Tierra y su papel es indispensable para la vida en ella, el mantenimiento y funcionamiento de los ecosistemas globales [9]. Este grupo incluye hongos, todos los tipos de bacterias, virus… y se estima que solo se ha estudiado un 1% de este. La criopreservación permitiría almacenar más muestras de estos, contribuyendo a su estudio pues un gran número de estos son destruidos en las pruebas que se realizan en los laboratorios. El frio no solo permite este almacenamiento, sino que también reduce el riesgo de contaminación, muy importante en estos ambientes. [10] En la directa preservación del medio ambiente y la biodiversidad también supone una gran herramienta. Debido a ciertos factores entre los que se encuentra el cambio climático y la contaminación de la naturaleza muchas especies están siendo afectadas y cada vez mas de ellas se agregan a la lista de especies en peligro de extinción. En la actualidad se estima que alrededor de 100.000 especies vegetales están en peligro de extinción, lo cual representa casi 1/3 de las especies de plantas en el mundo (Panis&Lambardi, 2005). La criopreservación permite congelar material genético y preservar la variabilidad original de las poblaciones con la menor pérdida de información genética posible (Riveraet.al. 2008). En uno de estos bancos zoológicos mayores se encuentran criopreservada 600 especies, y han logrado el éxito de recuperar especies que en caso contrario estarían ya extintas como el cóndor de California donde ya se dispone de 300 ejemplares. [11] Una de las grandes proyecciones que tiene la criopreservación es la creación de bancos de órganos. Esta incorporación en el proceso de trasplante seria revolucionario para el protocolo actual. Pues el tiempo desde que el órgano es extirpado hasta que es trasplantado al paciente receptor es un parámetro primordial para garantizar el triunfo del injerto. Ciertos órganos son críticos, como el corazón, para el que se disponen sólo 4 horas desde la extracción. Mantener estos órganos en frio permitirían parar el tiempo biológico de su degradación. Las listas de espera de pacientes que necesitan trasplantes son largas y según la Organización Mundial de la Salud (OMS) la disponibilidad de estos tejidos en condiciones para trasplantes no satisface la demanda existente, solo se cubren el 10% de la demanda de pacientes. [12] Por esto, la introducción de conservar bancos de órganos indefinidamente ayudaría notoriamente en este serio problema de los trasplantes. Sin embargo, realizar el proceso de criopreservación en tejidos de este tamaño aún no ha sido conseguido. Hasta el momento el mayor hito datado es un estudio dirigido por Gregory M. Fahy, donde se logró con éxito el trasplante de riñones recalentados de conejo. Dicha investigación está se describe en el artículo -Physical and biological aspects of renal vitrificationpublicado en la revista Cryobiology. Los avances en medicina determinaron unos grandes resultados en el uso de células madre en la cura de determinadas enfermedades. La ingeniería de células madre combinada con la ciencia que tenemos entre manos supone una herramienta muy potente que permitiría almacenar el cordón umbilical cuya sangre es rica en estas células. Esto da lugar a la organogénesis, que consiste en una impresión biológica en 3D de órganos de forma personalizada a partir de estas células madre. Esta tecnología no solo supondría un enorme alivio a las listas de espera, sino que también asegura menores tasas de rechazo al usar células propias y por tanto el éxito del trasplante. [13] Además de todas estas aplicaciones directas medicas también es útil para la investigación biomédica. Al igual que en la investigación microbiológica la preservación de tejidos impulsaría la investigación en este campo, facilitando la disponibilidad de muestras de material y mejorando la eficiencia de los experimentos. Pudiendo experimentar incluso directamente en el ADN humano en vez de usar animales de laboratorio de farmacología por ejemplo (Pichugin, Fahy y Morin, 2006). 15 2.2. Microondas y tecnología vfm El uso de microondas para producir calentamiento es una de las técnicas que ha tenido mayor impacto en la industria. Actualmente es una tecnología cotidiana que se encuentra como electrodoméstico en muchos hogares. Se basa en la teoría electromagnética de Jamer Clerk Maxwell formulada en 1873. Recoge los resultados de las investigaciones anteriores de Laplace, Poisson, Faraday, Gauss y otros, planteando la hipótesis de que la luz era una forma de energía electromagnética y a partir de ecuaciones matemáticas describió la propagación de estas ondas a través del espacio. No se reconoció hasta 15 años después cuando Heinrich Hertz realizó experimentos que lo verificaron y Guillermo Marconi lo aplico en el año 1900 transmitiendo señales inalámbricas que recorrieron el Océano Atlántico. Desde entonces numerosos científicos e ingenieros del siglo XIX han aportado descubrimientos y avances en esta línea que han conseguido que hoy en día contemos con esta tecnología de radiofrecuencia indispensable en la sociedad moderna. [14] Por radiofrecuencia se entiende a una parte del espectro electromagnético, localizado en las ondas electromagnéticas que se caracterizan por la radiación menos energética que tiene una frecuencia entre 3KHz y 300GHz. (fig. 2.6) Figura 2.6 Espectro electromagnético Una onda electromagnética propaga un campo eléctrico y a su vez también se crea un campo magnético generado por esta carga eléctrica en movimiento. Dentro de este grupo de ondas se realiza otra subclasificación (fig. 2.7) dependiendo de su frecuencia pues no todas las ondas electromagnéticas se comportan de igual forma en su propagación o interacción con el medio. Por convenio cada rango de radiofrecuencia se asigna para distintas aplicaciones por la Unión Internacional de Telecomunicaciones (UIT). 16 Figura 2.7 Bandas de radiofrecuencia. Fuente: [14] En este estudio nos centramos en las ondas electromagnéticas del rango de frecuencias con aplicación de microondas y hornos para recalentamiento. Este recalentamiento tiene origen por la interacción del campo eléctrico cambiante en dirección con la materia polar, mediante dos fenómenos (fig. 2.8): el de inducción que desplaza las moléculas y el de polarización que hace que giren sobre si mismas en su posición inicial de equilibrio. Estos dos fenómenos inducen a movimientos energéticos que producen calor dentro del material. Figura 2.8 Efectos en las moléculas causados por microondas. (a) por distribución de la carga, (b) redistribución polar. Fuente: [15] Gracias a estos fenómenos el tipo de recalentamiento producida por los microondas presenta mejores características que el resto de formas de recalentamiento convencionales. En un horno convencional la muestra se calienta por conducción del calor que pasa desde la superficie hasta el interior, siendo un fenómeno lento y con un claro gradiente de temperaturas. Pero por el contrario en el calentamiento que trabajamos, el calor se genera en el interior del producto siendo más rápido y eficiente al centrar toda la energía directamente en el cuerpo. La energía que produce este calor puede ser expresada mediante la ecuación (1). En función de la frecuencia, el campo eléctrico y las perdidas (ε ' ') en cada punto del material expuesto a la irradiación del microondas. La distribución de este campo eléctrico en toda la muestra también depende de la geometría de la cavidad del horno y las propiedades dieléctricas del material. Por ello es imprescindible caracterizar adecuadamente el material con el que se trabaja. Además, en general, estas constantes dieléctricas pueden cambiar con el tiempo y la zona. [15] Q=2π f ε0 ε’’ ( E 󰇍 󰇍 rms (x,y,z,t))2 ( 1) 17 Para el funcionamiento de esta tecnología se necesita un generador de ondas electromagnéticas con su aplicador, una cavidad resonante que corresponde al interior del sistema donde residirá la muestra a calentar y una guía de ondas que introducirá estas desde el generador al interior del sistema. La cavidad interna del horno se presenta en distintas geometrías adaptadas a la función destinada y sus paredes están hechos de material metálico conductor para contener las ondas del interior. Por simplicidad sus formas suelen ser sencillas para abaratar su fabricación, es muy común encontrarlas con una forma de cubo rectangular. Las guías de ondas están formadas por conductores que se extienden en una dirección del espacio de sección recta y constante de modo que propagan las ondas por su interior. Estas pueden tener distintas formas y componentes, pero detallaremos las rectangulares con un solo conductor. Es importante determinar estas características de las guías pues de ellas depende el modo en el que se propagan las ondas del campo electromagnético y por ende su comportamiento. Encontramos así distintos modos: 1. Modo TEM. Se caracterizan por tener tanto componentes eléctricas como magnéticas en la dirección de propagación nulas. Ez=0 y Hz=0. Este modo solo se da en guías no rectangulares formadas por más de un conductor. 2. Modo TE. El campo eléctrico no tiene componente longitudinal, componiéndose exclusivamente de ondas eléctricas trasversales. Además, el campo magnético si tiene valores no nulos en su dirección z. Ez=0 y Hz=/0. 3. Modo TM. A diferencia del anterior, en este modo es el campo magnético el que solo tiene componentes trasversales y en cambio el campo eléctrico si puede propagarse de forma longitudinal. Ez=/0 y Hz=0. En este proyecto se usa guías rectangulares de un conductor con el modo TE. En un comienzo los generadores habituales se construían a partir de un magnetrón encargado de transformar la energía eléctrica en suso dichas ondas. Pero gracias al avance de la investigación electrónica se encuentran distintos diseños que incluyen amplificadores, y otros componentes MEMS que permitieron, entre otras cosas, el desarrollo de esta tecnología VFM con frecuencia cambiante. Esta tecnología nace para solventar los problemas que se dan en la tecnología tradicional de microondas. La frecuencia a la que funciona los microondas tradicionales es conocida y fija, asignada en Europa a 2.45 GHz. Este valor es seleccionado por convenio para evitar interferencias con otras tecnologías, sin embargo, si se puede modificar y usar otras frecuencias en el rango del espectro de la radiofrecuencia incluso más energéticas para el calentamiento como usa esta nueva tecnología VFM. El principal problema que presenta esta tradicional forma de calentamiento con frecuencia fija es la poca homogeneidad de su calentamiento. La distribución de temperatura se ve significativamente afectada por la geometría de la cavidad y la frecuencia. Además, la posible diferencia en los valores de los parámetros dieléctricos a lo largo de todo el material puede contribuir también a que unos puntos se calienten de forma más rápida que otros. En los tejidos biológicos, por ejemplo, las zonas compuestas por grasa alcanzan temperaturas elevadas de forma más rápida al contar con una absorción de la radiación mayor que el resto de zonas del tejidos. En la cavidad la onda viajera rebota en las parades del mismo y se forma una onda estacionaria en la que se encuentran nodos calientes donde la amplitud de la onda es máxima y nodos fríos donde esta onda tiene valores nulos y no se produce su efecto. Este fenómeno se puede observar en la figura 2.9. Esto puede causar puntos calientes y perdidas de energía en el material comprometiendo la calidad y eficiencia del recalentamiento. Este efecto es empeorado por el hecho de que las propiedades dieléctricas de las que hablamos no son distintas solo desde el comienzo, sino que también se modifican con la temperatura haciendo que absorba aún más radiación y los puntos calientes tiendan a calentarse más (thermal runaway), generando una diferencia de temperaturas irreversible en relación con las áreas frías. 18 Figura 2.9 Onda estacionaria en el interior de microondas tradicional de frecuencia fija. Se investigaron numerosos métodos para solucionar estos problemas presentados. Se encontró así un método de recalentamiento por microondas, la tecnología VFM de la que hablábamos, que consiste en barrer valores de frecuencia de un ancho de banda seleccionado de forma rápida. Ofreciendo un calentamiento no solo más rápido con un acoplamiento altamente energético, sino uniforme al generar múltiples focos calientes cambiantes en la cavidad y permitiendo mayor control selectivo sobre el campo electromagnético diseñando el recalentamiento en diferentes partes de un objeto que pudiera tener propiedades dieléctricas dispares. [16] En la industria existen varios tipos de dispositivos que ya usan esta tecnología VFM. Conoceremos algunos de sus valores con el fin de caracterizar nuestro modelo de forma similar a estos dispositivos ya funcionales. Hay dispositivos de distintos tamaños y características. Uno de los más potentes se encuentra en el Instituto de Investigaciones Industriales Swinburne (IRIS), Universidad Tecnológica de Swinburne, Melbourne, Australia- Es el modelo VW1500 y cuenta con una potencia de 125 W, consigue cambiar la frecuencia más de 100 veces por segundo en un rango de 6-18GHz. Otro modelo comerciado es Microcure 2100, su potencia es de 250W, las dimensiones de su cavidad son 300 mm×275 mm×375 mm y el rango de frecuencias que opera es de 2-7 GHz [17]. Las características que simularemos serán similares a estos parámetros. Figura 2.10 Microondas de tecnología VFM: modelo microcure 2100. Esta investigación ha sido impulsada por la necesidad en otras industrias de solventar los problemas del calentamiento del microondas y obtener estas mejores características. Desde entonces lleva siendo utilizada para estas distintas tareas generando resultados óptimos. En el campo aeronáutico y naval es usado para la unión y curado de piezas importantes expuestas a unas condiciones que debe asegurar que no tenga ningún desperfecto que las separe. También es muy importante en ingeniería química para el procesado de compuestos, síntesis 19 química y polimerización. Así como en la electrónica se usa para el curado de chips y tarjetas inteligentes. Incluso es usado para el secado de termoplásticos que encontramos en objetos cotidianos. [17] Sin embargo, esta tecnología no ha sido aun aplicada al campo de la criopreservación, por esto, entre otras razones que se comentan a continuación se comienza a realizar este estudio. 21 3 OBJETIVOS En el apartado predecesor se ha investigado sobre la situación en la que se encuentra actualmente el estudio de la criopreservación. Junto a ella se entiende de forma más precisa y concreta las limitaciones que sigue presentando, en las cuales numerosos científicos trabajaban para paliar y solucionar. Se han alcanzado grandes avances en el proceso de congelación, sin embargo, uno de los procesos que aún resulta con más dificultades es el recalentamiento, que constituye la última fase de la criopreservación. Por otro lado, en la industria se ha incorporado un sistema de calentamiento avanzado mediante microondas de frecuencia variable que presenta mejores características que otros tipos de calentamiento. Sin embargo, el uso de este no ha sido extrapolado aún al campo médico. De esta forma el objetivo que pretende abarcar el siguiente proyecto consiste en determinar la viabilidad del uso de dicha tecnología en el calentamiento de tejido biológico. Pues hasta el momento no se encuentran datados estudios de este ámbito. Este estudio comprendería el análisis del comportamiento en el calentamiento de un corazón humano mediante simulación por computador con softwares de elementos finitos englobando distintos puntos: Diseño y caracterización de los parámetros del modelo y experimentos con propósito de obtener resultados lo más óptimos posibles a la vez de modelar condiciones realistas que otorgue validez a dicho estudio. Incluyendo la recapitulación de información sobre los parámetros dieléctricos del material biológico en estas condiciones a las que se expone en el experimento. Determinar la eficiencia y eficacia de esta tecnología de frecuencia variable en comparación con microondas de frecuencia fija convencional. Incluyendo la homogeneidad que se consigue en el calentamiento, observando la distribución de temperaturas en el cuerpo. Verificar si la velocidad de calentamiento media del órgano es suficientemente aceptable para la idoneidad de su uso. Esta debe cumplir la tasa de 100ºC por minuto como establece las investigaciones mencionadas. Con esta información estatuir el grado de viabilidad en función del porcentaje estimado de supervivencia de las muestras. Analizar las ventajas y avances que supondría la inclusión de esta tecnología en este camino de investigación. Así como también señalar los puntos débiles y los siguientes pasos al estudio. La realización de este proyecto pretende ser un paso, con sus limitaciones, que arroje ciertos resultados que sirvan de forma positiva en su campo de investigación perteneciente. La mayor motivación de este proyecto es que el progreso en esta línea de investigación podría suponer una gran apertura en las numerosas y útiles aplicaciones que ofrece la herramienta de la criopreservación. Como se ha mencionado en el punto 2.1.4 entre ellos la posibilidad de poder preservar en temperaturas criogénicas corazones humanos permitiendo la existencia de bancos de órganos disponibles ante la necesidad de trasplantes. 22 23 4 METODOLOGÍA 4.1 Fundamentos físicos y modelo matemático En el estudio que se abarca ocurren varios fenómenos físicos relacionados con el campo electromagnético y la transferencia de calor en sólidos. Estos fenómenos se describen mediante leyes y modelos matemáticos cuya resolución es necesaria para describir y determinar los experimentos y los resultados buscados. El acoplamiento de estos dos fenómenos da a ecuaciones altamente no lineales y complejas por lo que serán resueltos de forma computacional mediante simulaciones. El análisis electromagnético es determinado por las leyes de Maxwell. La energía electromagnética de las ondas estacionarias del interior del horno se rige por sus ecuaciones. [18] ∇ × µ𝑟 −1(∇ × E 󰇍 󰇍 )−𝑘2(ɛ′−𝐽ɛ′′)=0 ( 2) Donde µ𝑟 representa la permeabilidad relativa del material, ε' es la parte real de la constante dieléctrica del material mientras que ε'’ la parte imaginaria. E 󰇍 󰇍 es el campo eléctrico (V/m) cuyo valor es: E 󰇍 󰇍 = ∑ 𝐴𝑙.𝑚,𝑛 sin(𝑘𝑛𝑥)sin(𝑘𝑚𝑦)sin (𝑘𝑙𝑧) 𝑙.𝑚,𝑛 ( 3) Las constantes tienen los siguientes valores : kn=l π /a ; Km=m π /b ; kl=n π /d. n, m y l son el número de variaciones semisinusoidales que se dan en la onda estacionaria. 𝑘2= 𝑘𝑙2+𝑘𝑚2+𝑘𝑛2=(2π c)2𝑓2 ( 4) Sustituyendo la ecuación (4) y (3) en la ecuación inicial de maxwell (2) se puede deducir que la intensidad del campo eléctrico depende de la frecuencia, f , por tanto para distintos valores no producirá la misma distribución del campo en el interior de la cavidad. En los sistemas reales esta onda electromagnética tiene perdidas de energía al pasar por un medio dieléctrico con pérdidas, Pdis (potencia disipada por unidad de volumen [W/m3] ). Dicha potencia de perdidas es la fuente de calor que se produce en un calentamiento por microondas debido a la agitación térmica de las partículas dentro del material introducido convirtiendo la energía eléctrica en calorífica. Pdis=2π f ε0 ε’’ ( E 󰇍 󰇍 )2 ( 1) Esta energía como vemos es proporcional a los parámetros de perdidas dieléctricas y a la intensidad del campo eléctrico cuyo valor ya está determinado con la ecuación (3) La termodinámica entiende que la transferencia de calor tiene lugar principalmente mediante tres tipos de mecanismos: Conducción, la transmisión de calor se produce por contacto sin transferencia de materia; 30 Datos de estudios realizados por Altman and fiettmer (1964), Best and Taylor (1950), Spells (1960), Mitchell et al (1945) y Pethig (1984). Fuente: [23] Conocer este dato es preciso pues el contenido de agua influye en gran medida en los parámetros dieléctricos como recoge distintos estudios realizados. [23] Figura 4.7 Permitividad y conductividad de tejido animal en función del contenido de agua a 3GHz. En estos ensayos estadísticos se puede observar la relación que existe entre el porcentaje de agua en peso y el aumento del valor de las propiedades de conductividad y permitibilidad medidas en muestras de tejido animal de características similares al tejido humano y expuesto a una frecuencia de 3GHz rango comprendido en las simulaciones que buscamos. En cambio, en la muestra estudiada no se encuentran estas cantidades de agua pues esta es sustituida por una disolución con crioprotector en el proceso de congelación en búsqueda de mejora en las propiedades. Otro estudio realizado en el laboratorio expone que las concentraciones de crioprotector para la que se observaba un comportamiento más optimo y menor formación de hielo rondaban alrededor del 60% de soluto. Las sustancias anticongelantes que se mencionan en la sección 2.1.4 de criopreservación son las más usadas y 31 mejores resultados ofrecen, en este caso el estudio utiliza glicerol. En definitiva, el corazón humano de trabajo se compone de un 30% tejido muscular, otro porcentaje igual de H2O y un 40% de C3H8O3 aproximadamente. Así teniendo los datos conocidos y documentados de otros estudios añadidos a la bibliografía se obtiene las propiedades totales intrínsecas del material y de trasmisión de calor. [24] [25] [26] [27] [28] Tabla 4.1 Datos de densidad, calor especifico y conductividad térmica órgano. Material Densidad (p) [g/cm^3] Calor especifico. [J/gºC] Conductividad térmica [W/mK] Agua 0.92 4.19 0.6 Glicerol 1.26 2.42 0.29 Tejido cardiaco [1.075, 1.127] 3.75 0.25 Total (0.4*valor glicerol+ 0.3*valor agua+ 0.3*valor tejido) 1.110 3.35 0.35 Se determinan a continuación los parámetros relacionados con someter la materia a un campo electromagnético. Como ya se ha explicado estos valores son dependientes de la frecuencia. Mediante la siguiente grafica (fig.4.8) se aclara como afecta el valor de este parámetro de las ondas en el comportamiento del tejido biológico y la dominancia de ciertas propiedades frente a otras. 32 Figura 4.8 Esquema distintas regiones de las propiedades dieléctricas, ɛ y σ, de tejidos en función de la frecuencia. (Bourne et al.,1996) Figura 4.9 Grafica especifica de corazón humano. Datos de permeabilidad relativa y conductividad eléctrica en un alto rango de frecuencia. (S.Gabriel, 1996) Fuente: [29] En la Figura 4.9 se puede observar en los resultados este comportamiento relativo de la permitividad relativa y la conductividad eléctrica frente a la frecuencia. Para el primer parámetro se tiene que conforme aumenta la 33 frecuencia su valor va disminuyendo, mientras que para el segundo parámetro es de forma inversa, va aumentando cuando la frecuencia aumenta. Se aprecian de este modo 3 regiones del tejido biológico en la que se identifican también 3 factores de relajación o dispersión relacionados con la respuesta del mismo a la corriente y la frecuencia. Las propiedades dieléctricas de diversos tejidos biológicos fueron estudiadas y expuestas en los estudios realizados por Foster y Schwan en el año 1989. En dicho estudio se presenta la distribución de tres regiones principales de dispersión y una última relacionada con la respuesta de estos tejidos bilógicos a la corriente y frecuencia que se sometían (representados en la figura 4.8). Estas tres regiones principales se distinguen como α, β, γ para bajas, medias y altas frecuencias, respectivamente. El último tramo, a muy altas frecuencias, se distingue por una dispersión más pequeña denominada δ. Cada una de estas regiones están centradas en un rango de frecuencias y se caracterizan por mecanismos de polarización diferentes al ser atravesadas por un campo. [22] [30] 1. Región de dispersión α. Para bajas frecuencias por debajo de los KHz. El efecto dominante en la conductividad de los tejidos es la conducción de electrolitos en el espacio extracelular produciéndose la difusión iónica a través la membrana celular. Procesos físicos que incluye la polarización a lo largo de la estructura de frontera de la membrana. En frecuencias por debajo de la que se produce este tipo de dispersión, la permitividad relativa crece exponencialmente. 2. Región de dispersión β. Dada en rango inferior de radiofrecuencias, entre 0.1 MHz y 10 MHz. En esta región se inducen los efectos de polarización de las membranas celulares. Pues en esta, la membrana celular tiene impedancia despreciable y la corriente logra pasar a través de ella desde el medio intracelular al extracelular poniéndose de manifiesto en la permitividad y conductividad. 3. Región de dispersión γ. Se sitúa en la región de los gigahercios, GHz. Su aparición se debe a la polarización de los dipolos de agua existentes en el tejido. Se han realizado distintos ensayos sobre corazones humanos para medir estos valores. Una de las formas más simple de medición de las propiedades dieléctricas de permitividad y conductividad de una muestra a priori sin caracterizar es a partir de la medición de una impedancia de prueba ajustándola en relación con muestra que si es conocida. La metodología o técnica más usada para el registro de estas propiedades eléctricas de los tejidos biológicos utiliza electrodos de contacto que introducen una corriente eléctrica y otro número variante de electrodos que miden de la caída de potencial (Salazar, 2004; Bragos et al., 1999; Rafiei et al., 2007; Beckmann et al., 2007). Otro método es obtener esta medida a través de inducción magnética (Hagmann, 1993; Gandhi  Chen, 1990), aplicando un campo magnético primario al sitio de estudio y obteniendo la información recibida de otro campo magnético secundario que se genera. De la diferencia entre ambos campos se obtiene las características buscadas. [30] Así lo realizó Gabriel en sus experimentos para tejido muscular. Gabriel parametrizó los datos obtenidos para posteriormente formular la ecuación de Cole-Cole con la que se podría obtener rápidamente los valores para cualquiera de las frecuencias. Nos centramos en el primer grupo de valores de la tabla 4.2 que son obtenidos en la frecuencia de trabajo y cuyo error reportado fue de alrededor del ± 5%. Tabla 4.2 Parámetros de tejido muscular de la ecuación Cole-Cole obtenidos por S.Gabriel. Por otro lado, la permitividad relativa y conductividad eléctrica viene determinada en gran parte por su contenido de la mezcla de agua y glicerina en un 60% cuyos valores están datados y graficados, como se observa en la siguiente figura. 34 Figura 4.10 Grafica de la permitividad real, conductividad en un rango de 100MHz a 25Ghz de mezclas con distintas concentraciones de glicerina. Fuente: [31] Valorando estos conocimientos se asienta el valor de la permitividad relativa aproximadamente en 50 y la conductividad eléctrica en 5. Por último, la permeabilidad relativa, mu µ, se considera cercana al valor del agua por lo que se asigna a la unidad. Todos estos datos expresados en las correspondientes unidades se introducen en ambos programas en la tabla de propiedades del material destinado a ello. Figura 4.11 Interfaz software COMSOL. Datos dieléctricos del material de estudio. 35 Figura 4.12 Datos dieléctricos del material de estudio en software QuickWave Una vez constituido el modelo del objeto completo se diseña y configura el resto del modelo para realizar las simulaciones del estudio. 4.4 Descripción del modelo completo A continuación, se precisa el modelo completo a simular. Se siguen los distintos pasos a configurar en orden: geometría, materiales, malla, física, estudio y resultados. Figura 4.13 Interfaz Software de simulación (a) Comsol (b) QuickWave Estos vienen marcados de forma intuitiva en la interfaz propia de los softwares mediante pestañas separadas, al entrar en cada módulo se despliega las correspondientes herramientas y opciones disponibles. 36 En primer lugar se creara un modelo ‘.mph’ vacío en el que se añadirá la geometría. Este modelo se diseña en base a los dispositivos microondas de última tecnología ya existentes en la industria, aprovechando así las numerosas investigaciones ya realizadas para la maximización de rendimiento y funcionalidad óptima del sistema. El modelo geométrico completo (figura 4.14) incluye la cavidad del horno, un plato circular como bandeja, el puerto coaxial junto con la guía de ondas y finalmente el objeto introducido para calentar al que está dedicado el punto anterior. Figura 4.14 Modelo geométrico completo. Esquema 3d y árbol bloques que lo forman. En comsol(a) y Quickwave (b) Al tratarse de una geometría compuesta por figuras simples se aborda directamente en el software con las herramientas de diseño gráfico existentes que permiten generar formas 3D básicas. Figura 4.15 Barra de herramientas para modelado geométrico de COMSOL (a) y de QuickWave (b) 37 Primero se crea la cavidad que delimita el horno y en el cual se producirá el calentamiento en su interior. Existen muchos modelos con distintos tamaños, para este estudio se escoge uno de dimensiones adaptadas al órgano a recalentar. Se genera un cubo de base aproximadamente cuadrada de 26cm en el planoxy y una altura de 20cm comenzando el primer vértice en el origen (0,0,0) y extendiéndose su superficie hacia las coordenadas crecientes con valores positivos. Se añade un puerto rectangular (posicionado de forma vertical en QWED y horizontal en Comsol ) centrado en la base superior de la pared. Sus dimensiones son de 0.05x0.78x0.018 m de ancho, largo y alto respectivamente. Figura 4.16 Modelo geométrico detalle: cavidad del horno y puertos En el centro de la base de la cavidad se añade un cilindro que representa el plato soporte. El cilindro tendrá un radio de 11.35 cm ocupando gran parte de la superficie del microondas y un grosor de 1.5 cm. Figura 4.17 Modelo geométrico detalle: plato central Se importa el cuerpo que representa el órgano como ya fue mencionado y se traslada mediante las herramientas 38 a la posición central deseada en el plano xy asignándole como coordenada la mitad de los valores del ancho y largo de la cavidad. Luego, se sitúa sobre el plato elevando su coordenada z, tanto los cm de radio propios del cuerpo como el espesor de la geometría del plato de cristal, para evitar que ciertos puntos de ambos dominios compartan espacio físico a la vez. Figura 4.18 Modelo geométrico detalle: órgano de estudio esférico Adicionalmente se definen y nombran explícitamente las distintas partes geométricas, a priori denominadas automáticamente con números por el propio programa, con el fin de distinguir de forma más sencilla los dominios para continuar la configuración en los siguientes pasos. Figura 4.19 Árbol de definiciones en el que se ven declarados las partes que componen la geometría espacial. También se fijan los valores de otros parámetros globales útiles para ser utilizado en varios campos o ser modificados rápidamente a lo largo de los distintos experimentos. Tabla 4.3 Definicion parámetros globales COMSOL. Nombre Expresión Valor Descripción wo 267[mm] 0.267 m Oven width do 270[mm] 0.27 m Oven depth ho 188[mm] 0.188 m Oven height 39 Nombre Expresión Valor Descripción wg 50[mm] 0.05 m Waveguide width dg 78[mm] 0.078 m Waveguide depth hg 18[mm] 0.018 m Waveguide height rp 113.5[mm] 0.1135 m Glass plate radius hp 6[mm] 0.006 m Glass plate height bp 15[mm] 0.015 m Glass plate base rpot 40[mm] 0.040 m Sfere radius T0 203[K] 203 K Initial organ temperature full_geometry 1 1 Symmetry flag frec 2.45[GHz] 2.45E9 Hz frequency tiempot 60[s] 60 s Time of simulation En la tabla se encuentran declarado los parámetros que se usan con un nombre que se identifica para su uso, junto con una expresión, en este caso se asignan valores reales fijos pero ofrece la posibilidad de ajustar una función que calcule su valor. Se debe añadir entre corchetes las unidades correspondientes al dato, estas no tienen por qué estar dadas en el sistema internacional, el programa se encarga de conversionar dicho dato a las unidades designadas para los cálculos, indicándolo automáticamente en la columna contigua. Adicionalmente cuenta con una cuarta casilla que, de forma opcional, puede ser usada para describir brevemente la entrada del parámetro y evitar confusiones. En el software COMSOL es importante remarcar que se añade un plano de simetría que corta la geometría aprovechando esta característica particular del sistema para disminuir considerablemente el coste de cálculo, siendo necesario solo resolver las ecuaciones en la mitad del espacio. Se utiliza un planoY desplazado la mitad del largo del horno pasando por el centro del órgano y la mitad del puerto de ondas con un vector normal (0,1,0). 46 La guía por la que se transmiten es rectangular y el modo de propagación que se asigna es TE10, esta asignación es importante para el comportamiento pues lo describen ecuaciones distintas como fue explicado en detalle en el apartado 2.2 de tecnología microondas. La potencia del microondas se ajusta hasta dar con el valor más optimo adecuado, se comienza con una potencia de 1KW. Figura 4.29 Configuración del puerto electromagnético (a) en COMSOL y (b) en QuickWave. El campo eléctrico, E, es nulo en un comienzo, por ello como condiciones iniciales se asigna un valor de 0 V/m a sus componentes Ex, Ey y Ex. La frecuencia a la que se inicia el puerto es la tipificada de 2,45 GHz. 47 Figura 4.30 Configuración estudio transferencia de calor en solidos de COMSOL. Para el módulo de calentamiento solo se tendrá que añadir el dominio sobre el que se aplica este calentamiento. En cuanto a la temperatura inicial se introducen dos condiciones iniciales distinta. Los tejidos criopreservados se almacenan a unas temperaturas bajo cero alrededor de -150ºC (temperatura recomendada por estudios de Cryobiotech). Por tanto, el dominio correspondiente al órgano se asigna esta temperatura inicial en el software QWED. Sin embargo, en el software COMSOL donde el modelo es más pesado de simular se reduce esta temperatura inicial como -70ºC a fin de reducir este coste de tiempo. El rango de temperatura que interesa estudiar su evolución es el que se comprende entre -70ºC hasta -20ºC pues supone el periodo crítico de formación de hielo donde se desgasta la viabilidad de la muestra. El dominio que lo rodea correspondiente al aire existente dentro de la cavidad se considera que se encuentra en condiciones normales a una temperatura media de 25 ºC. También se considera normalizada la presión atmosférica de trabajo asignado a 1atm. El horno se encuentra aislado térmicamente con el exterior de forma que las características ambientales en el que sea colocado no interfieran en los resultados obtenidos. Se importan las propiedades de la termodinámica, densidad, etc. que serán tomada desde el material considerado con un comportamiento ideal. Ya solo restaría acoplar ambos fenómenos físicos asegurando que estos no se resuelven independientemente, sino que los distintos cálculos se relacionen entre si afectándose mutuamente y produciendo un calentamiento con origen electromagnético. Figura 4.31 Acoplamiento físico en el software de simulaciones. 48 En este paso el modelo se encuentra completamente definido para el estudio, preparado para realizar las simulaciones que serán explicadas a continuación. 4.5 Experimentos y Simulaciones En este punto solo resta por indicar al simulador la forma de estudio que se quiere realizar para comenzar con el mismo. En busca del objetivo de analizar la eficacia de la tecnología VFM para su uso en la criopreservación se realizan distintos experimentos. Para determinar esto se realiza una comparación de la tecnología tradicional de microondas con esta otra nueva tecnología. Se requiere así diversas configuraciones para llevar a cabo estas simulaciones bajo distintas condiciones. Hasta ahora se han construido modelos similares en ambos softwares de simulación, sin embargo, en este paso final se crea una diferenciación que hace que se deba detallar las operaciones realizadas en cada uno de forma individual. Además, como se ha especificado se requiere dos modelos en cada programa para comparar sus condiciones con frecuencia fija y variable. Se trabaja así finalmente con 4 modelos. Comenzamos con el conjunto de software QWED, el modelo ha sido abierto hasta este momento en el programa Modeller v2019, pero al simular se lanza de forma automática el programa QW-GPU Simulator v2019x64 para completar los cálculos y presentar una interfaz más adecuada en este paso. En el modelo de frecuencia fija la configuración del puerto se mantiene como la inicial comentada en el apartado anterior (fig. 4.29). En opciones BHM se asigna un estudio del calentamiento del objeto durante 60s con pasos fijos de 1s dividiendo así el estudio en tiempo en un número suficiente de 60 pasos cuyos resultados intermedios pueden ser consultados así. Figura 4.32 Configuración de la simulación en QWED. Para el modelo de frecuencia variable, el entorno software contempla la posibilidad de modificar el puerto durante el tiempo de la simulación. Para ello se contemplan dos formas: marcando la casilla de parar el tiempo 49 en cada paso del calentamiento BHM y modificando de forma manual el valor de la frecuencia antes de continuar la simulación o de forma automática mediante una tabla que asigna las frecuencias a cada paso de forma automática. Como se trata de una simulación pesada y larga la forma más eficiente de realizar este modelo sin tener que parar la simulación a cada paso ni necesitar supervisión humana extra es con esta segunda opción. Solo hace falta marcar la opción de parámetros de excitación de puerto y modificar la tabla de forma previa con los valores deseados del puerto. (fig. 4.33) Figura 4.33 Tabla QWED de asignación de frecuencias variables en cada paso Sin embargo, esta opción sigue requiriendo un trabajo repetitivo y expuestos a fallos humanos al necesitar una introducción manual de estos valores y que crece linealmente con el número de pasos deseados. Por la naturaleza del mismo, se incita a realizar un código en Matlab que genere la tabla deseada de forma rápida, pudiendo modificar la misma de forma sencilla cuando se requiera. Solo se debe observar el formato necesario de la tabla para cargar en el programa y replicarlo. 50 Figura 4.34 Código Matlab para generación tabla de frecuencias variables en QuickWave En primer lugar, se declaran y asignan valores a las variables que se usan: las frecuencias que recorrerá, los segundos de simulación y el número de pasos. Estos valores iniciales son así detectables fácilmente para poder modificarlos en caso de realizar distintos experimentos. En este caso se especifican más adelante sus valores. Se abre un documento de texto plano tipo ‘.txt’, se da nombre y ubica en el directorio donde se encuentra el propio código de Matlab ‘.m’. A continuación, solo se necesita un bucle hasta completar el número de pasos totales en el cual se escribe el texto con el formato necesario a la vez que se usa otro índice para recorrer el vector de frecuencias de forma correcta ascendente y saturando para comenzar de nuevo de forma descendente. Una vez terminado el bucle se cierra el documento y ya está listo para su introducción en el software. Para este experimento al igual que la frecuencia fija con la que comparamos se simula durante 1 min (posteriormente también se probó otros tiempos como 30s y 5 min) y se realizaran pasos cada 0.1s es decir se generarían un total de 6000 pasos. En cada uno de estos pasos, de forma equivalente, en cada décima de segundo se modifica la frecuencia del puerto. Esta es la razón de tener un mallado más preciso en este modelo, para modificar la frecuencia de forma rápida acercándose al funcionamiento real de este tipo de tecnologías VFM. El rango de frecuencia entre el que se mueve el puerto se elige entre [2,7] GHz. Aunque en la realidad los cambios se producen de forma aproximadamente continua, realizamos una aproximación discreta evitando grandes saltos en la frecuencia. Se barre así el intervalo de forma creciente incrementando 0.5 GHz en cada paso de décima de segundo y cuando llegue a la frecuencia máxima de 7Ghz de decrementará de igual modo. Realiza esta operación durante toda la simulación, modificando la frecuencia diez veces en total cada segundo. Se pasa a generar de igual forma ambos modelos en el software COMSOL. El modelo de frecuencia fija se genera de forma análoga, aunque se encuentren diferencias en el formato. En la configuración del dominio temporal se fija el tiempo de simulación total igual de 60s, es decir una unidad de minuto, facilitando posteriormente la extrapolación y otros cálculos. En el campo de tiempos de salida se indica por tanto un vector que comprenda desde el inicio a 0 s hasta 60 s realizando saltos de 60/10s. 51 Figura 4.35 Configuración estudio del dominio temporal de Comsol. Listo el modelo de frecuencia fija se aborda el siguiente de frecuencia variable. COMSOL Multiphysics no ofrece la capacidad de implementar un modelo de calentamiento por microondas electromagnéticas dependiente del tiempo cuya frecuencia pueda ser modificada en los distintos momentos de simulación, si no que la configuración del puerto permanece fija y estable durante toda ella. Para solucionar esto se investigan distintas formas que permitieran llegar al objetivo. Se desarrolla un método que combina la capacidad de resolver multifisicas de COMSOL y la gran herramienta para procesar datos y cálculos de MATLAB. Se utiliza el software MATLAB versión 2020a que junto con el programa liverlink perteneciente a COMSOL 5.6 permite crear un enlace virtual con una consola que ejerce de cliente y servidor para, no solo poder procesar los datos de las simulaciones de COMSOL sino también, poder modificar el propio modelo de forma externa mediante MATLAB. Recoge una serie de funciones para ello y que se pueden consultar su funcionamiento y uso en la propia web de la empresa del producto. [35] El algoritmo de funcionamiento se representa en la fig. 4.35. Se trata de un bucle en el cual se va modificando la frecuencia de f0 a f0+Af y con este cambio se simula durante un periodo de calentamiento t0+At. Al final de cada paso de tiempo se almacena la temperatura junto con su coordenada local. Esta distribución de temperatura es utilizada en la iniciación de la siguiente iteración y se repite el proceso hasta que se completa el proceso de calentamiento completo. 52 Figura 4.36 Estrategia de simulación modelo variable de Comsol con Matlab Fuente: [18] En primer lugar se debe de establecer la conexión entre servidor y cliente por el puerto de comunicaciones asignados y abrir el modelo desde MATLAB, una vez cargado y conectado aparece un mensaje por la consola que lo indica (fig. 4.37). Figura 4.37 Mensajes salida en consola livelink comsol 5.6 with matlab Se limpia las posibles variables internas residuales para evitar interferencia y que puedan corromper los resultados. Se declaran e inicializan las nuevas variables que se usan: un subíndice para recorrer el bucle, la frecuencia y temperaturas iniciales, la frec. máxima y mínima del rango que trabajamos y el número de pasos de la simulación. 53 Figura 4.38 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 1 Se configura el modelo con las condiciones iniciales con las funciones ‘model.param.set’ y ‘model.componets’. Luego se calcula el estudio con las líneas de código ‘model.study’ y se guardan los resultados en un archivo con ‘model.results.export’. Este texto servirá como condiciones iniciales de la siguiente simulación. Figura 4.39 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 2 Una vez simulado el primer paso se realiza un bucle que realice el algoritmo explicado. Este bucle ‘for’ se define con un subíndice ‘i’ desde el segundo paso hasta el número total de pasos que se haya dividido la simulación. Dentro de este bucle se sigue unos puntos ordenados. Primero se asigna la nueva frecuencia modificada al puerto. En segundo lugar, se crea una función de interpolación que se nombra como ‘int_i’ donde ‘i’ es el número de 54 paso correspondiente. Esta función es determinada así por los datos importados contenientes en el archivo de texto generado como resultados del paso predecesor indicando que se obtiene la temperatura expresada en K en función de sus coordenadas x,y,z escritas en metros. Con estas nuevas condiciones asignadas se vuelve a calcular el estudio de igual forma. Una vez terminado el cálculo se vuelve a generar el conjunto de datos de temperatura de todos los puntos pertenecientes al interior de la cavidad preparados para introducir en la siguiente iteración. Finalmente se guarda el modelo generado y aparece un mensaje por la consola de MATLAB que indica que el tiempo de simulación ha sido completado satisfactoriamente. Figura 4.40 Código Matlab para modelado frecuencia variable con Comsol. Parte 3 Dichos códigos se encuentran adjunto en formato original (anexo B) En cuanto a la caracterización numérica de este experimento se simula como se ha hecho en el resto 60s. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso, este modelo supone mucha carga computacional y como se indicó anteriormente se realiza una simulación parcial en el rango de calentamiento crítico. En vez de comenzar con la temperatura inicial de -140ºC se asignó -70ºC en los modelos COMSOL. Esta simulación de frecuencia variable se para cuándo se complete esta fase y alcance la temperatura segura de -20ºC en vez de completar el tiempo de simulación asignado de 1 min. A diferencia del modelo de frecuencia variable de QWED, por este problema mencionado no es posible llevar a cabo una simulación tan precisa y se deberá reducir el número de paso intermedios (120 pasos en este experimento, variando la frecuencia cada 0.5s) hasta ser viable computacionalmente. Se prueban varias formas de asignar la frecuencia de los puertos, desde recorrer un vector de frecuencias como 55 en el programa anterior hasta asignarle frecuencias aleatorias dentro del rango. Finalmente se escogió la que dio mejores resultados. La frecuencia del puerto se modifica más lentamente recorriendo de forma ascendente las frecuencias comprendidas entre 2 y 7 GHz una vez repartido entre el número de pasos. Una vez definidos el tipo de simulación y configurado la forma de realizar los cálculos se comienza a simular. Para resolver las distintas ecuaciones se calculan con un resolvedor lineal iterativo que utiliza Lagrange Cuadrático para calcular la geometría. El programa COMSOL indica que el número de grados de libertan resueltos es de 138601 (mas 140379 grados de libertad internos) alcanzado errores lineales de alrededor de 1.1e-15. La simulación tiene una duración que depende del equipo y la complejidad del modelo que se realice. En este caso necesita aprox. media hora en QWED y otras 22h en COMSOL para obtener resultados en el modelo simple de frec. fija y más de 50h para la simulación del modelo de frecuencia variable. Utilizando una memoria tanto virtual como física de 6GB. Finalmente se generan los resultados y se pasa a su análisis en el siguiente apartado. 62 Figura 5.8 Perfil térmico para una línea de referencia en el eje coordenado x del modelo de frecuencia fija y 1KW de potencia. La figura 5.8 representa la evolución de la temperatura en el órgano del modelo de frecuencia fija en distintos tiempos. La primera curva azul marino corresponde con el instante inicial en el cual el órgano se encuentra a - 70ºC o 203K y el ambiente que lo rodea a 25ºC o 298K. Las sucesivas curvas representan el perfil térmico en los distintos pasos de la simulación hasta terminar el estudio de 60s. Se observa como el centro del órgano se calienta de forma más rápida mientras que los puntos periféricos se encuentran a menor temperatura. Figura 5.9 Valor absoluto del campo eléctrico formado por ondas de frecuencia 2.45 GHz a lo largo de la línea de referencia Se observa como las zonas que alcanzan más temperatura se corresponden en parte con los nodos donde mayor valor toma el campo eléctrico. 63 Se obtienen otros perfiles de temperatura en ambos modelos de los experimentos realizados con distintas condiciones. Figura 5.10 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia fija a 250W con distintos pasos de simulación hasta 60s. Figura 5.11 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia fija a 600W al finalizar simulación 60s El patrón de calentamiento no cambia con la potencia, depende de la frecuencia, por esto es distinto en el 64 modelo en el que la frecuencia varia. Figura 5.12 Perfil térmico en puntos de línea de referencia en modelo de frecuencia variable a 600W al finalizar simulación de 30s. Estas graficas recogen la información solo de ciertos puntos del cuerpo, para analizar mejor estos datos se calcula la media de temperaturas entre todos los puntos que lo componen. Tabla 5.1 Tabla de temperatura media alcanzada con frecuencia fija (a) y variable (b) en los modelos de Comsol 65 En la tabla se representa la temperatura media en el volumen del organo completo de ambos modelos durante los distintos pasos de simulacion. Comienzan con una temperatura de aproximadamente -70ºC para estudiar el comportamiento en el rango critico del descongelameinto. En los datos del modelo de frecuencia fija se presentan los 10 pasos realizados cada 6s. Al final de la simulacion de la frecuencia fija, trascurrido 60s, se alcanza una temperatura de -30ºC. El recalentamiento no alcanza la temperatura de -20ºC a la que se considera que se ha escapado del rango critico de formacion de cristales pero observando su comportamiento lineal se estima llegar a alcanzarlo en sus 2-3 proximos pasos, es decir, alrededor de 1min y 15s. La tabla correspondiente al modelo de frecuencia variable se agrupan los datos de los pasos principales, en este caso se elige cada 5 segundos. Se comprueba que el calentamiento ocurre de forma mas rapida y alcanza la temperatura final del modelo de frecuencia fija a los 35s. A los 40s la temperatura que alcanza el objeto ya es aproximadamente -20ºC saliendo del rango que se pretendia estudiar y acabando la simulación. Esto supone una velocidad de calentamiento de 71.3 ºC/min mientras que la velocidad del modelo de frecuencia fija llegaba a 36.3ºC/min obteniendo asi una mejora relativa de 196%, lo que supone casi el doble de tasa de velocidad. La tasa de velocidad lograda con la tecnologia VFM, aunque no llega a los 100ºC/min recomendados se acerca a ella. A pesar de implementarse con bajas especificaciones de cambios en la frecuencia debido a las limitaciones encontradas con el software, se presentan buenos resultados que se preveen aún más adecuados con el uso de equipos existentes de alta potencia. Comsol tambien almacena la informacion de los puntos individualmente. Asi nos muestra el valor de temperatura del punto donde se ha concentrada la mayor potencia de calentamiento y el que apenas ha cambiado su temperatura inicial como indica la siguiente tabla. Tabla 5.2 Datos de densidad, calor especifico y conductividad térmica órgano. De igual forma que con el anterior software aparecen puntos aislados con temperaturas extremas, pero si son indicadores de una mejora en la homogeneidad con el modelo de frecuencia variable consiguiendo hasta una diferencia de temperaturas el doble menos respecto al modelo de frecuencia fija. Se termina el análisis de los datos con las conclusiones extraídas. Datos (K) \ Tecnología microondas Frecuencia fija Frecuencia variable Temperatura máx. 609.63 316.82 Temperatura min. 203.78 204.59 66 67 6 CONCLUSIONES Y LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN FUTURAS Al finalizar el estudio descrito en este documento se puede considerar que se obtuvieron unos resultados favorables cumpliendo la premisa conforme la que se abordó la investigación y sus objetivos. Los resultados extraídos en el desarrollo de las simulaciones son esperanzadores. Demostrando una notable mejora en el proceso de recalentamiento de un órgano cardiaco humano criopreservado. Probando que el uso de esta tecnología VFM podría ser un método viable para conseguir el completo almacenamiento de estos tejidos sin sufrir daños biológicos y degradación. Estos resultados prueban alcanzar unas velocidades de calentamiento mayores que los métodos de recalentamiento habituales. Además de solucionar el problema existente de nodos calientes y fríos que producían fenómenos indeseables y grandes gradientes térmicos, alcanzando una homogeneidad optima en el conjunto de la muestra. Sin embargo, estas tasas no son suficientes para el criterio que garantiza de forma presumible la viabilidad y el éxito del proceso. De manera que, aunque este sistema sea un primer desarrollo y acercamiento, aun se debe de afrontar un diseño o método más robusto. Por ello este campo de investigación sigue abierto. Entre ellos se indica algunas líneas de desarrollo que, aunque no entran en el alcance de este proyecto, si pudiese suponer los siguientes pasos para otros proyectos futuros: En primer lugar, el siguiente procedimiento natural a seguir sería partir de las bases de este estudio con simulaciones por computador y realizarlo bajo las mismas condiciones para verificar la validez de los resultados con otros programas de simulación de multifisicas existentes. No solo quedarse en este paso sino ir más allá y, basado en el modelo inicial abordado, realizar mejores simulaciones más adaptadas. Pues como se ha indicado, los experimentos realizados no están modelados con el diseño más optimo y realista posible a causa de las limitaciones encontradas. Se pueden abordar por un nuevo software y equipo más potente especializado en simulaciones con ondas electromagnéticas y que permita una gran configuración en la variación de los parámetros de la microonda. Sin depender de softwares externos y coste computacional de los modelos más ligeros. Además de usar otros softwares, para enriquecer la información presentada en este proyecto, también es oportuno realizar experimentos bajos distintas condiciones observando cómo afectan los distintos cambios. Se podría barajar un rediseño modelando otras cavidades con distintas características, hornos microondas combinados, distintas potencias… Otra de las posibles mejoras es contrastar las propiedades dieléctricas del corazón y otros órganos humanos documentados durante la investigación con la bibliografía indicada. Estas propiedades han sido calculadas y aproximadas con hipótesis, al no ser medidas en las mismas condiciones a las que se exponen en estos experimentos. Es ciertamente interesante estudiar de forma experimental estas características a temperaturas de criogenización y expuestos al campo electromagnético tratado. Dicha evaluación posibilita una aproximación más realista de los modelos simulados. En este estudio se aborda la mejora de la fase calentamiento desde el punto de la tecnología de recalentamiento pero, en esta dirección focalizando la investigación sobre el material, también resulta interesante inferir sobre los efectos de las propiedades dieléctricas del material biológico y descubrir nuevas formas de usar estas a nuestro favor como supuso la adicción de crioprotectores u otras técnicas mencionadas. Finalmente, una vez completado toda la caracterización de los experimentos de la forma más realista posible es necesario completar el estudio realizando estos experimentos de forma práctica. Las simulaciones deben ser contrastadas con datos experimentales para ser considerado resultados totalmente fiables pues hay varios matices que la computación discretizada no es capaz de contemplar y no siempre realiza el estudio de la manera que ocurriría en una simulación real. Se hace patente afrontar la recreación de estos experimentos con muestras biológicas criopreservada reales en 68 un laboratorio con los dispositivos tecnológicos existentes, planteando el estudio bajo las condiciones que se predijeron con mejor resultado en los pasos anteriores. 69 70 REFERENCIAS [1] Wikipedia, «Criobiología» [En línea]. Available: https://es.wikipedia.org/wiki/Criobiolog%C3%ADa. [Último acceso: Mayo 2021]. [2] J. Merino Pérez y M. J. Noriega Borge, «Fisiología General. Transporte a través de la membrana» [En línea]. Available: https://ocw.unican.es/pluginfile.php/879/course/section/967/Tema%25204- Bloque%2520II-Transporte%2520a%2520traves%2520de%2520Membrana.pdf. [Último acceso: Mayo 2021]. [3] Wikipedia, «Transporte celular» [En línea]. Available: https://es.wikipedia.org/wiki/Transporte_celular#Transporte_activo. [Último acceso: Mayo 2021]. [4] L. M. Ávila-Portillo, «Fundamentos de criopreservacion.» Revista colombiana de Obstetricia y Ginecología, vol. 57, nº 4, pp. 291-300, Diciembre 2006. [5] B. Tortosa Albiol, «Diseño y aplicación de técnicas de vitrificación en equilibrio para la criopreservación de corazón y encéfalo de Mus musculus» Universidad de Cataluña UVIC, 2019. [6] R. Risco, «Generalidades de la criopreservación» de Modelado matemático e implementacion practicas de sistemas de vitrificacion ultrarapida mediante radiación laser, Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla, Departamento Física Aplicada III, p. Capitulo 1. [7] A. Sanchez Salinas, Estudio de la eficacia y seguridad del lavado de progenitores hematopoyéticos de sangre periférica criopreservados mediante un sistema cerrado y automatizado para trasplantes autólogos, Universidad de Murcia: Dtp. Medicina, 2013. [8] J. C. Pérez, Recalentamiento de material criopreservado mediante ultrasonidos focalizados de alta intensidad, Universidad de Sevilla, 2019. [9] P. Yocelyn Ocares y F. Jean Franco Castro, «Preservación de microorganismos por congelación» de Boletín INIA nº 428, Instituto de Investigaciones Agropecuarias INIA / MINISTERIO DE AGRICULTURA, pp. 119-134, Cap. 7. [10] Wikipedia, «Microbiologia» [En línea]. Available: https://es.wikipedia.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa. [Último acceso: Julio 2021]. [11] A. F. Muerza, «Criopreservacion de especies amenazadas» consumer, 2 septiembre 2010. [En línea]. Available: https://www.consumer.es/medio-ambiente/criopreservacion-de-especies-amenazadas.html. [Último acceso: Agosto 2021]. [12] J. cabo, «Congreso mundial criobiologia udima» 2018. [En línea]. Available: https://www.udima.es/es/javier-cabo-congreso-mundial-criobiologia-udima-2018.html. [Último acceso: Agosto 2021]. [13] S. D. León Dueñas, «Científicos del grupo Ciclotrón del CNA llevan a cabo estudios de criopreservación de órganos» CNA (Universidad de Sevilla-Junta de Andalucía-CSIC), Sevilla, 2012. 71 [14] E. G. San Román Castillo, P. R. Castillo Araníbar, M. G. Sotomayor Polar, L. V. Gonzales Fuentes y E. Zenteno Bolaños, Aplicaciones y teoría de ingeniería de microondas, Unión Europea. Programa ALFA III EuropeAid: 1a ed. Iniciativa Latinoamericana de Libros de Texto Abiertos (LATIn),p. 108, Marzo 2014. [15] A. Díaz Morcillo, J. Monzó Cabrera, E. Domínguez Tortajada y M. E. Requena Pérez, «Principios fundamentales y aplicaciones del calentamiento por microondas» ResearchGate, Universidad Politécnica de Cartagena Campus Muralla de Mar. Edificio Antiguo Hospital de Marina, Enero 2004. [16] H.S. Ku , F. Siu , E. Siores , J.A.R. Ball, «Variable frequency microwave (VFM) processing facilities and application in processing thermoplastic matrix composites» elservier. Journal of Materials Processing Technology , a University of Southern Queensland, Toowoomba, Australia, 2003. [17] C. Antonio, R. Deam & A. Taube. A review of the variable frequency microwave technology in material processing journal of microwave power and electromagnetic energy, 38:1, 75-87, DOI: 10.1080/08327823.2003.11688488,, 2003. [18] Z. Du, «Multi-physics modeling and process simulation for a frequency-shifted solid-state source microwave oven» IEEE Access, nº Digital Object Identifier 10.1109/ACCESS.2019.2960317, p. 8, Diciembre 2019. [19] G. Barbosa Roas, Evaluación computacional sobre la homogeneidad de calentamiento para un horno microondas basada en la norma UNE-EN 60705:2015, Universidad politécnica de Cartagena, octubre 2018. [20] J. Arballo, L. Campañone y R. Mascheroni, Análisis de perfiles de temperatura durante el proceso de calentamiento de frutas por microondas, Mendoza, Argentina: Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de la Plata., Noviembre 2013. [21] «Structure and function of the heart,» News medical, [En línea]. Available: https://www.newsmedical.net/health/Structure-and-Function-of-the-Heart-(Spanish).aspx]. [Último acceso: Mayo 2021]. [22] M. E. Moncada, M. d. P. Saldarriaga, A. Fernandez Bravo y C. R. Pinedo, «Medición de impedancia eléctrica en tejido biologico,» Revisión Tecno Lógicas, Vols. %1 de %2ISSN 0123-7799, nº 25, pp. 51- 76, Diciembre 2010. [23] A. Campbell Margaret, Measurements and analysis of the microwave dielectric properties of tissues., University of Glasgow: core.ac.uk, October 1990. [24] Sears, Z & Y. Física Universitaria, «Tabla densidades,» Serway. Physics for scientish and engineers, [En línea]. Available: https://didactica.fisica.uson.mx/tablas/densidad.htm. [Último acceso: 2021]. [25] «Calor especifico corazón humano», Miranda fisioterapia, [En línea]. Available: https://wwwmirandafisioterapia-com.cdn.ampproject.org/v/s/www.mirandafisioterapia.com/amp/calorespecifico?amp_js_v=a6&_gsa=1&usqp=mq331AQKKAFQArABIIACAw%3D%3D#aoh=1628 2856714984&referrer=https%3A%2F%2Fwww.google.com&_tf=De%20%251%24s&share =http. [26] L. d. Pierre y A. Mérèse petit, «Calor especifico. Recursos formula quimica», Thales.cica, [En línea]. Available: https://thales.cica.es/rd/Recursos/rd99/ed99-0265-04/calorespec%EDfico.htm. [Último acceso: 2021]. 78 % model.func('int1').set('filename',sprintf('T_frecuenciavariable_%d.txt',i- 1)); % model.func('int1').importData; model.func.remove(sprintf('int_%d',i-1)); model.func.create(sprintf('int_%d',i), 'Interpolation'); %crea una funcion interpolación por cada iteracion model.func(sprintf('int_%d',i)).set('source','file'); model.func(sprintf('int_%d',i)).set('filename',sprintf('T_frecuenciavariable_ %d.txt',i-1)) model.func(sprintf('int_%d',i)).importData; %Le mete de temperatura inicial el campo de temperaturas y le dice que lea %los ejes x, y, z en metros % con función int1 ya estaría introducido en condiciones iniciales % con la función variante con cada interacción si habrá que volver a % configurar lo de las condiciones iniciales de temp. Además ha añadido % para el aire? no entiendo diferencia si mete mismos datos model.component('comp1').physics('ht').feature('init1').set('Tinit', sprintf('int_%d(x/1[m],y/1[m],z/1[m])',i)); model.component('comp1').physics('ht').feature('init2').set('Tinit', sprintf('int_%d(x/1[m],y/1[m],z/1[m])',i)); %paso 3 model.study('std1').run %comando que run estudio , std1 corresponde al nombre que tiene entre paréntesis el estudio a calcular en el árbol de nuestro modelo %paso4. model.sol('sol1').run; %paso5 % model.result.export.create('data1', 'Data'); % model.result.export('data1').set('unit', {'K'}); % model.result.export('data1').set('descr', {'Temperature'}); % model.result.export('data1').set('expr', {'T'}); % model.result.export('data1').setIndex('looplevelinput', 'last', 0); % model.result.export('data1').set('filename', sprintf('T_frecuenciavariable_%d.txt',i)); % model.result.export('data1').run; %Exporta los datos model.result.export.create(sprintf('data%d',i2), 'Data'); model.result.export(sprintf('data%d',i)).set('unit', {'K'}); model.result.export(sprintf('data%d',i)).set('descr', {'Temperature'}); model.result.export(sprintf('data%d',i)).set('expr', {'T'}); model.result.export(sprintf('data%d',i)).setIndex('looplevelinput', 'last', 0); model.result.export(sprintf('data%d',i)).set('filename', sprintf('T_frecuenciavariable_%d.txt',i)); model.result.export(sprintf('data%d',i)).run; 79 %guardamos nuevo modelo mphsave(model,aprintf('modelo_frecvar_paso_%d.mph',i)); %imprime por pantalla matlab para tener realimentación por donde va %ejecutando Código sprintf('datos de interacion numero %d almacenados',i ) end sprintf('TERMINADO!')