Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón

ES 2 437 240 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 437 240 Número de solicitud: 201230874 51 Int. CI.: G01N 33/68 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón 73 Titular/es: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD (33.3%) Avda. de la Constitución, 18 41071 Sevilla (Sevilla) ES; CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) (33.3%) y UNIVERSIDAD DE SEVILLA (33.3%) 72 Inventor/es: PAZ-ARES GONZAGA, Luis Gonzalo; PASTOR HERRERA, María Dolores; MOLINA PINELO, Sonia; CARNERO MOYA, Amancio; SALINAS, Ana y BARBOSA DE SOUZA NOGAL, Ana 74 Agente/Representante: ILLESCAS TABOADA, Manuel 22 Fecha de presentación: 05.06.2012 43 Fecha de publicación de la solicitud: 09.01.2014 Fecha de la concesión: 09.10.2014 45 Fecha de publicación de la concesión: 16.10.2014 57 Resumen: Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón en a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o e) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. La presente invención describe además un kit de diagnóstico, así como un dispositivo y sus usos para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón según se ha indicado anteriormente. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP. Aviso: 2 Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón. La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la medicina, y se refiere a un 5 método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos en: - individuos que no presentan ni EPOC ni cáncer de pulmón - individuos con EPOC - individuos con adenocarcinoma - individuos con carcinoma escamoso10 - individuos con EPOC y adenocarcinoma. - individuos con EPOC y carcinoma escamoso. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR 15 El cáncer de pulmón (CP) es la causa más comúnmente asociada a las muertes relacionadas con cáncer en todo el mundo, se le atribuyen más de 1,3 millones de muertes cada año, representa el 12,7% de los casos de cáncer nuevos. Esta neoplasia se divide en dos grandes grupos de acuerdo a sus características clínicopatológicas: el cáncer de pulmón de células pequeñas o microcítico (small-cell lung carcinoma SCCP) y el cáncer de pulmón no microcítico (non-small-cell lung carcinoma NSCCP ó CPNM). Aproximadamente entre el 75-85% 20 de los casos de CP pertenecen al grupo de los no microciticos. Histológicamente, el cáncer de pulmón no microcitico está subdividido en dos categorías principales. El carcinoma de células escamosas (squamous cell lung carcinoma SCC), también conocido como carcinoma epidermoide, que generalmente surge en el epitelio bronquial. El adenocarcinoma que por lo general aparece en las vías aéreas periféricas y en los alvéolos. Las opciones terapéuticas disponibles hasta el momento para el tratamiento del cáncer de pulmón (CP), incluyen la 25 cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, las cuales pueden utilizarse por separado o en diferentes combinaciones. Sin embargo, a pesar de todos los avances que se han realizado, la tasa de supervivencia a 5 años para este tipo de tumor no supera el 15%. El principal factor de riesgo para el desarrollo del CP es el habito tabáquico. Aproximadamente entre el 85-90% 30 de los casos de CP son causados por este hábito. Por otro lado, el consumo de tabaco también es responsable del desarrollo de otras enfermedades tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que 3 millones de personas mueren de EPOC al año. Al igual que sucede con el CP, no todos los fumadores desarrollan EPOC. Sin embargo, alrededor del 50% de los fumadores terminan desarrollando EPOC. Además la EPOC incrementa el riesgo relativo de cáncer de pulmón 35 entre dos y seis veces. Diversos estudios sugieren que la inflamación podría ser uno de los principales procesos implicados en la patogénesis de ambas enfermedades. Mediando este proceso podrían estar participando en gran medida la amplia familia de las citoquinas. Las citoquinas son un diverso grupo de proteínas que incluyen citoquinas pro-inflamatorias, citoquinas derivadas 40 de las células T, citoquinas quimiotácticas (quimiocinas) de eosinófilos, neutrófilos, monocitos/macrófagos y células T, citoquinas anti-inflamatorias y diversos factores de crecimiento. Varios estudios realizados en pacientes diagnosticados de EPOC, revelan que existe un aumento de los niveles de citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8, IL-13, IP-10, INF-γ, MCP-1 y TNF-α) en muestras obtenidas mediante inducción de esputo en comparación con los controles sanos. Siguiendo esta línea, el factor de necrosis tumoral 45 α-(TNF-α) y los receptores solubles del TNF, se incrementan en el esputo de los pacientes con EPOC en comparación con los fumadores sanos. Por otro lado, los estudios en cáncer de pulmón ponen de manifiesto el papel de las citoquinas en esta patología correlacionándose con los estudios en EPOC. Por ejemplo, los estudios de polimorfismos revelan que existen 50 polimorfismos específicos en los genes IL-1A y 1B que aumentan el riesgo de CP, especialmente entre los sujetos de mayor edad y con un historial de tabaquismo importante. A pesar de los trabajos realizados en este campo, los resultados obtenidos, son insuficientes para explicar el papel que la inflamación juega en ambas patologías, así como cuales son los posibles mecanismos que 55 comparten y cuales son independientes de cada una, en este sentido se han analizado diversos marcadores inflamatorios tanto en CP como en EPOC de manera independiente Sin embargo aún es necesario encontrar un método alternativo de predicción, diagnóstico, y/o pronóstico, que permita la subclasificación de los individuos afectados por cáncer de pulmón y/o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. 60 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han analizado los miembros de la familia de las citoquinas y de los factores de crecimiento en el lavado broncoalveolar (LAB) de los pacientes con EPOC, con adenocarcinoma, con 65 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 DESCRIPCIÓN 3 carcinoma escamoso, con EPOC y adenocarcinoma simultáneamente, y pacientes con EPOC y cáncer de células escamosas. La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos con dichas enfermedades.5 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de las citoquinas y de los factores de crecimiento que se seleccionan de entre IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF o cualquiera de sus combinaciones, para la predicción, diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos en:10 a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso, d) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o15 e) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. Otro aspecto de la invención se refiere al uso simultáneo de las citoquinas y de los factores de crecimiento que se seleccionan de la lista que consiste en IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, y VEGF, para la predicción, diagnóstico, pronóstico y 20 clasificación de los individuos en: a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso,25 d) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o e) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. Una realización preferida se refiere al uso de IGFBP1, MIP1β, CCL-1, MIG, PDGFAA, GDF-15, VEGF y EGF para la predicción, diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos en:30 a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso, e) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o35 f) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante primer método de la invención, para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los pacientes en a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con EPOC y cáncer de pulmón, c)Individuos 40 con adenocarcinoma, d)individuos con carcinoma escamosos e) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o f) individuos con EPOC y carcinoma escamoso, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y ii) cuantificar el producto de expresión de las citoquinas y de los factores de crecimiento que se seleccionan de la lista que consiste en: IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, 45 MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, y VEGF o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la expresión de las citoquinas y de los factores de crecimiento IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, y VEGF se cuantifica de manera simultánea.50 En otra realización preferida, el método de la invención además comprende: iii) comparar las cantidades obtenidas en el paso (ii) con una cantidad de referencia. La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión constitutiva del/los genes para las 55 citoquinas o los factores de crecimiento, en un grupo de pacientes sanos o, preferentemente, que no presentan EPOC ni cáncer de pulmón. Más preferiblemente, el primer método de la invención comprende cuantificar simultáneamente los productos de expresión de IGFBP1, MIP1β, CCL-1, MIG, PDGFAA, GDF-15, VEGF y EGF. 60 Los pasos (ii) y/o (iii) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (ii) o la comparación computerizada en el paso (iii). 65 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 4 Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (i) es el lavado o el fluido o lavado broncoalveolar (LAB). El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y 5 más preferiblemente, humanos. El término “individuo” no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física. La detección la cantidad de IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la 10 técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de anticuerpos frente a estas citoquinas y factores de crecimiento de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre los diferentes tipos histológicos del cáncer de pulmón. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por las enfermedades mencionadas, que permite subclasificarlos.15 La medida de la cantidad o la concentración de estas citoquinas y factores de crecimiento, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas, y que está 20 correlacionada directamente con el número de moléculas de RNA o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal – a la que también podemos referirnos como señal de intensidad – puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).25 El término “cantidad”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o 30 químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento. El término “comparación”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de 35 la cantidad de los productos de expresión de los genes o de la cantidad de anticuerpos frente a IL-6sR, IL-1a, IL- 11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes o con una cantidad de anticuerpos frente a IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF de una o 40 varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (iii) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador. El término “producto de expresión”, también denominado “producto génico” se refiere al material bioquímico, ya 45 sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. El término “cantidad de referencia”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la cantidad absoluta o relativa (al gen de referencia) de productos de expresión de los genes o de anticuerpos frente a IL-6sR, IL-1a, IL-50 11, CCL-1, EOTAXIN-2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF que permite discriminar entre a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC. c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso, d) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o e) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. 55 Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras de individuos que no padecen ninguna de estas enfermedades. 60 La forma soluble del receptor de la interleuquina 6 (IL-6sR), con un peso molecular de aproximadamente 50k Da se ha encontrado en la orina de humanos adultos (Novick, D. et al. (1989) J. Exp. Med. 170:1409), en medios de cultivo condicionados por el crecimiento de la línea celular del mieloma humano (Nakajima, T. et al. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:373), en los sobrenadantes de cultivo de PBMC humanos PHA-estimulados y de líneas 65 celulares T HTLV-1-positivas (Honda, M. et al. (1992) J. Immunol. 148:2175), y en el suero de donantes de P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 5 sangre HIV-seropositivos (Honda, M. et al. (1992) J. Immunol. 148:2175). Esta forma soluble del receptor aparentemente surge de la ruptura proteolítica del enlace de membrana de IL-6 R. Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) NP_000556.1y /o la SEQ ID NO: 2. En el contexto de la presente invención, IL-6sR se define también por una secuencia de nucleótidos o 5 polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), 10 c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IL-6sR. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank 15 (NCBI) NM_000565.3o SEQ ID NO: 1. El gen IL-1a ó interleuquina 1, alpha (L-1A, IL1, IL1-ALPHA, IL1F1, IL-1 alpha; hematopoietin-1; interleukin-1 alpha; preinterleukin 1 alpha; pro-interleukin-1-alpha), se encuentra en el cromosoma 2 (2q14). codifica para una proteína que es miembro de la familia de citoquinas interleucina 1. Es una citoquina pleiotrópica involucrada en 20 varias respuestas inmunológicas, procesos inflamatorios, y hematopoyesis. Esta citoquina es producida por monocitos y macrófagos a proproteína, que es proteolíticamente procesada y liberada en respuesta del daño celular, e induce apoptosis. Este gen y otros 8 genes de la familia interleuquina 1 forman un cluster genético en el cromosoma 2. Se ha sugerido que el polimorfismo de estos genes está asociado con la artritis reumatoide y la enfermedad de Alzheimer.25 En el contexto de la presente invención, IL-1a se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 4, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la 30 SEQ ID NO: 4, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4, y en las que el 35 polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IL-6sR. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM 000575.3 o SEQ ID NO: 3. El gen IL-11 ó interleukin 11 (AGIF; IL-11), se encuentra en el cromosoma 19 (19q13.3-q13.4) codifica para una 40 proteína que es miembro de la familia de citoquinas gp130. Estas citoquinas dirigen el ensamblamiento de complejos receptores con multisubnidades. En el contexto de la presente invención, IL-11 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 6, y que comprendería diversas variantes procedentes de: 45 a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una 50 identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IL-11. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_000641.2 o SEQ ID NO: 5. 55 El gen CCL-1 ó chemokine (C-C motif) ligand 1 (-309, P500, SCYA1, SISe, TCA3, C-C motif chemokine 1; T lymphocyte-secreted protein I-309; inflammatory cytokine I-309; small inducible cytokine A1 (I-309, homologous to mouse Tca-3); small-inducible cytokine A1), se encuentra en el cromosoma 17 (17q12). codifica para una proteína que es miembro de la familia de citokinas relacionadas con la subfamilia de citoquinas CXC, caracterizada por dos cisteínas separadas por un único aminoácido. Esta citoquina es secretada por las células T 60 activadas y muestra actividad quimiotáctica para los monocitos pero no para los neutrófilos. Se une al receptor de quimioquinas CCR8. En el contexto de la presente invención, CCL-1, se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 8, y que 65 comprendería diversas variantes procedentes de: P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 6 a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 8, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una 5 identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CCL-1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_002981.1 o SEQ ID NO: 7. 10 El gen EOTAXIN-2 ó chemokine (C-C motif) ligand 24 (CCL24, Ckb-6, MPIF-2, MPIF2, SCYA24, C-C motif chemokine 24; CK-beta-6; eosinophil chemotactic protein 2; myeloid progenitor inhibitory factor 2; small inducible cytokine subfamily A (Cys-Cys), member 24; small-inducible cytokine A24), se encuentra en el cromosoma 17 (17q11.23). codifica para una proteína que es miembro de la familia de citokinas pequeñas CC. Las citoquinas CC están caracterizadas por dos cisteínas adjacentes. La citoquina codificada por este gen muestra actividad 15 quimiotáctica frente a los linfocitos T, una actividad mínima en neiutrófilos, y no muestra actividad para linfocitos T activados. La proteína es además un fuerte supresor de la formación de colonias por líneas celulares de progenitores hematopoyéticos multipotenciales. En el contexto de la presente invención, EOTAXIN-2 se define también por una secuencia de nucleótidos o 20 polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 10, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 10, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), 25 c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 10, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CCL-1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank 30 (NCBI) NM_002991.2 o SEQ ID NO: 9. El gen PDGFAA ó platelet-derived growth factor alpha polypeptide (PDGF-A, PDGF1, DGF A-chain; PDGF subunit A; PDGF-1; platelet-derived growth factor A chain; platelet-derived growth factor alpha chain; plateletderived growth factor alpha isoform 2 preproprotein; platelet-derived growth factor subunit A), se encuentra en el 35 cromosoma 7 (7p22). codifica para una proteína que es miembro de la familia de los factores de crecimiento derivados de plaquetas. Los cuatro miembros de esta familia son factores mitogénicos para células de origen mesenquimal y se caracterizan por un motivo de ocho cisteínas. El producto del gen puede existir tanto como homodímero o como heterodímero con el polipéptido beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, donde los dímeros están conectados por puentes disulfuro. Se han identificado dos variantes de splicing para este gen.40 En el contexto de la presente invención, PDGFA se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 12, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la 45 SEQ ID NO: 12, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 12, y en las que el 50 polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PDGFA. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_002607.5 o SEQ ID NO: 11. El gen TNFRI ó tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A (TNFRSF1A, CD120a, FPF, MGC19588, 55 TBP1, TNF-R, TNF-R-I, TNF-R55, TNFAR, TNFR1, TNFR55, TNFR60, p55, p55-R, p60, TNF-R1; TNF-RI; TNFR-I; tumor necrosis factor binding protein 1; tumor necrosis factor receptor 1A isoform beta; tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A; tumor necrosis factor receptor type 1; tumor necrosis factor-alpha receptor), se encuentra en el cromosoma 12 (12p13.2). codifica para una proteína que es miembro de la superfamilia de los factores de crecimiento derivados de plaquetas. Los cuatro miembros del receptor TNF, Es 60 uno de los principales receptores para el factor de necrosis tumoral alfa. Este receptor puede activar NF-kappaB, mediar apoptosis, y funcionar como un regulador de la inflamación. La proteína antiapoptótica BAG4/SODD y las proteínas TRADD y TRAF2 se han visto que interactúan con este receptor, y por tanto juegan un papel en la transducción de la señal mediada por receptor. 65 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 7 En el contexto de la presente invención, TNFRI se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 14, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 14, 5 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 14, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la 10 proteína TNFRI. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_001065.3 o SEQ ID NO: 13. El gen TNFRII ó tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1B (TNFRSF1B, CD120b, TBPII, TNF-R-II, TNF-R75, TNFBR, TNFR1B, TNFR2, TNFR80, p75, p75TNFR, TNF-R2; TNF-RII; p75 TNF receptor; p80 TNF-15 alpha receptor; soluble TNFR1B variant 1; tumor necrosis factor beta receptor; tumor necrosis factor binding protein 2; tumor necrosis factor receptor 2; tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B; tumor necrosis factor receptor type II), se encuentra en el cromosoma 1 (1p36.22) codifica para una proteína que es miembro de la superfamilia de los receptores TNF. Esta proteína y el TNF-receptor 1 forman un heterocomplejo que media el reclutamiento de dos proteínas apoptóticas, c-IAP1 y c-IAP2, que poseen actividad E3 ubiquitin ligasa. 20 En el contexto de la presente invención, TNFRII se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 16, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la 25 SEQ ID NO: 16, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 16, y en las que el 30 polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína TNFRII. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_001066.2 o SEQ ID NO: 15. El gen EGF ó epidermal growth factor (HOMG4, URG, beta-urogastrone; pro-epidermal growth factor), se 35 encuentra en el cromosoma 4 (4q25) codifica para una proteína que es miembro de la superfamilia de los factores de crecimiento epidérmicos. En el contexto de la presente invención, EGF se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 18, y que 40 comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 18, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, 45 d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 18, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína EGF. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 17. 50 El gen MIP-1B ó chemokine (C-C motif) ligand 4 (CCL4, CT2, AT744.1, G-26, HC21, LAG-1, LAG1, MGC104418, MGC126025, MGC126026, MIP-1-beta, MIP1B, MIP1B1, SCYA2, SCYA4, C-C motif chemokine 4; CC chemokine ligand 4; G-26 T-lymphocyte-secreted protein; MIP-1-beta(1-69); PAT 744; SIS-gamma; T-cell activation protein 2; lymphocyte activation gene 1 protein; lymphocyte-activation gene 1; macrophage 55 inflammatory protein 1-beta; secreted protein G-26; small inducible cytokine A4 (homologous to mouse Mip-1b); small-inducible cytokine A4), se encuentra en el cromosoma 17 (17q12). En el contexto de la presente invención, MIP-1B se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 20, y que 60 comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 20, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, 65 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 8 d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 20, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína MIP-1B. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_002984.2 o SEQ ID NO: 19. 5 El gen MIG ó chemokine (C-X-C motif) ligand 9 (CXCL9, CMK, Humig, MIG, SCYB9, crg-10, C-X-C motif chemokine 9; gamma-interferon-induced monokine; monokine induced by gamma interferon; monokine induced by interferon-gamma; small-inducible cytokine B9), se encuentra en el cromosoma 4 (4q21). 10 En el contexto de la presente invención, MIG se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 22, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 22, 15 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 22, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la 20 proteína MIG. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_002416.1 o SEQ ID NO: 21. El gen MCP-1 ó chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2, GDCF-2, HC11, HSMCR30, MCAF, MCP-1, MCP1, MGC9434, SCYA2, SMC-CF, C-C motif chemokine 2; monocyte chemoattractant protein 1; monocyte 25 chemoattractant protein-1; monocyte chemotactic and activating factor; monocyte chemotactic protein 1; monocyte secretory protein JE; small inducible cytokine A2 (monocyte chemotactic protein 1, homologous to mouse Sig-je); small inducible cytokine subfamily A (Cys-Cys), member 2; small-inducible cytokine A2), se encuentra en el cromosoma 17 (17q11.2-q12). 30 En el contexto de la presente invención, MCP-1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 24, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 24, 35 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 24, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la 40 proteína MCP-1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_002982.3 o SEQ ID NO: 23. El gen IGFBP2 ó nsulin-like growth factor binding protein 2 (IBP2, IGF-BP53, IBP-2; IGF-binding protein 2; IGFBP-2; insulin-like growth factor-binding protein 2), se encuentra en el cromosoma 2 (2q33-q34).45 En el contexto de la presente invención, IGFBP2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 26, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la 50 SEQ ID NO: 26, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 26, y en las que el 55 polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IGFBP2. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_000597.2 o SEQ ID NO: 25. El gen IGFBP1 ó insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1, AFBP, IBP1, IGF-BP25, PP12, hIGFBP-1, 60 BP-1; IGF-binding protein 1; IGFBP-1; alpha-pregnancy-associated endometrial globulin; amniotic fluid binding protein; binding protein-25; binding protein-26; binding protein-28; growth hormone independent-binding protein; insulin-like growth factor-binding protein 1; placental protein 12), se encuentra en el cromosoma 7 (7p13-p12). P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 9 En el contexto de la presente invención, IGFBP1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 28, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 28, 5 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 28, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la 10 proteína IGFBP1. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_000596.2 o SEQ ID NO: 27. El gen GDF-15 ó growth differentiation factor 15 (GDF-15, MIC-1, MIC1, NAG-1, PDF, PLAB, PTGFB, NRG-1; NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drug)-activated protein 1; NSAID-activated gene 1 protein; NSAID-15 regulated gene 1 protein; PTGF-beta; growth/differentiation factor 15; macrophage inhibitory cytokine 1; placental TGF-beta; placental bone morphogenetic protein; prostate differentiation factor), se encuentra en el cromosoma 19 (19p13.11). En el contexto de la presente invención, GDF-15 se define también por una secuencia de nucleótidos o 20 polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 30, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 30, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), 25 c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 30, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína GDF-15. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del 30 GenBank (NCBI) NM_004864.2 o SEQ ID NO: 29. El gen VEGFA ó vascular endothelial growth factor A (RP1-261G23.1, MGC70609, MVCD1, VEGF, VPF, vascular permeability factor), se encuentra en el cromosoma 6 (6p12). 35 En el contexto de la presente invención, VEGF se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 34, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 34, 40 b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 34, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la 45 proteína VEGF. Entre dichas moléculas de ácido nucléico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) NM_001025366.2 o SEQ ID NO: 33. En otra realización preferida, la detección de la cantidad de cualquiera de IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN- 2, PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF se realiza mediante 50 un inmunoensayo. El término “inmunoensayo”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.55 En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes 60 tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. El término “compuesto marcador”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a IL-6sR, IL-1a, IL-11, CCL-1, EOTAXIN-2, 65 PDGFAA, TNFRI, TNFRII, EGF, MIP-1B, MIG, MCP-1, IGFBP2, IGFBP1, GDF-15, VEGF. El compuesto P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 16 través de un escáner láser GenePix 4100 A (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Las intensidades de cada proteína, se midieron por cuadriplicado en cada ejemplar. Western blot. 5 50ug de proteínas procedentes del LAB fueron separadas en geles entre el 7 y 12%, dependiendo del tamaño de la proteína, mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y posteriormente transferidas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), bloqueadas con una solución de BSA al 5%, e incubadas durante toda la noche a 4 º C con anticuerpos primarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante: anti-EGF (1:500, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti VEGF, anti-10 IGFPB1, anti-IGFBP2, anti-eotaxin2 (CCL24), anti-MIP-1β (CCl4), anti-MIG, anti-GDF15 (CXCL9), anti-PDGFAA, anti-IL6R, anti-IL1R1, anti-IL11 y anti-I309 (1:200 Abcam, Cambridge , MA, EE.UU.), anti-TNFRI, anti TNFRII y anti-MCP-1 (1:1000 Cell signaling, Beverly, MA, EE.UU.). Consecutivamente, se incubaron con anticuerpos secundarios, conjugados con peroxidasa anti-ratón (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y anti-conejo (Señalización Celular, Beverly, MA, EE.UU.), se aplicaron a las membranas individuales (1:2000) durante 1 hora a temperatura 15 ambiente. Las bandas correspondientes a las proteínas de interés se revelaron mediante quimioluminiscencia usando ECL (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y se visualizaron en un analizador de imágenes (Mini LAS-3000, Fujifilm, Tokio, Japón). Los niveles de proteína relativa se calcularon en comparación con la cantidad de proteína β-actina (1:1000 Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.20 ELISA Los ensayos de ELISA se realizaron mediante el uso de anticuerpos específicos en muestras de BALF de la segunda cohorte de pacientes (cohorte de validación), se utilizaron ensayos de ELISA sándwich para CCL4/MIP-25 1β, CXCL9/MIG, IGFBP-2, IGFBP-1, EGF, RI/TNFRSF1A sTNF, RI/TNFRSF1A sTNF, IL-1 RI, IL-6 Rα, CCL2/MCP-1, VEGF, GDF-15, CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2, CCL1/I-309, IL-11, PDGF-AA (DuoSet, R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). Todas las muestras se analizaron por duplicado. Los límites de detección para estos ensayos se establecieron entre los 25 y 200µg de proteínas (Anexo II). 30 El protocolo para la realización del ELISA fue el siguiente. Primeramente se diluyo el anticuerpo de captura en PBS, y se adiciono 100ul del mismo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, la cual se incubo toda la noche a 4°C. Posteriormente se lava cuatro veces en TBS con 0,05% de Tween-20 (0,05% TBST). Seguidamente, se bloqueó con albúmina sérica bovina al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, nuevamente se lava cuatro veces con 0,05% de TBST. Consecutivamente se añadieron las muestras y los estándares de proteína, y se 35 incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras estos pasos se añade el anticuerpo de detección diluido en PBS, durante 2 horas a temperatura ambiente. Para finalizar se añade estreptavidina (DuoSet, R & D Systems) y se incubó la placa durante 30 minutos. Por último, se añadió el reactivo de coloración o-fenilendiamina la reacción se hace en oscuridad durante 20 minutos. Tras este tiempo se adiciona H2SO4 2N a cada pocillo para parar la reacción y se lee la absorbancia en un lector de placas a 450 nm (Emax, Molecular Devices, 40 Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). Las medidas de absorbancia se extrapolan a una recta patrón obtenida con los estándares de proteína para saber la concentración de proteína de la muestra medida. Resultados obtenidos. 45 El primer paso para llevar a cabo el estudio fue la realización de los arrays de anticuerpos (80 citoquinas y factores de crecimiento implicados en la respuesta inflamatoria), en los 60 pacientes recogidos en la tabla 1. Los datos obtenidos de la lectura de los arrays, se analizaron mediante la construcción de un cluster jerárquico supervisado usando la distancia euclidea como método de asociación de componentes, y mediante la utilización del software de análisis estadístico babelomics versión 4.2 (Mínguez P y J Dopazo) (fig 1). El nivel de expresión 50 de cada proteína, en relación con su nivel de expresión medio en todas las condiciones, se representó en valores del 0-100%. De este análisis nosotros destacamos 16 proteínas de interés (CCL4/MIP-1β, CXCL9/MIG, IGFBP-2, IGFBP-1, EGF, RI/TNFRSF1A sTNF, RI/TNFRSF1A sTNF, IL-1 RI, IL-6 Rα, CCL2/MCP-1, VEGF, GDF-15, CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2, PDGF-AA CCL1/I-309, IL-11), las cuales presentan diferencias de expresión en los distintos grupos de patologías estudiados respecto al grupo control (no EPOC, no CP). Como por ejemplo las 55 proteínas CCL1 e IL-11 únicamente se expresan en adenocarcinoma o adenocarcinoma con EPOC. Paralelamente, se analizaron la media y la desviación estándar de cada una de las proteínas de interés para cada uno de las patologías estudiadas así como para el grupo control. Siendo p<0,05 *, p<0,01**, p<0,001*** (fig 2). Observando diferencias significativas similares a las existentes entre los distintos grupos patológicos respecto 60 al grupo control en el análisis de clúster. Hecho que nos sugiere que esta selección de proteínas podría ayudarnos a discriminar entre unos tipos de patologías y otros, ya que cada una de estas proteínas tiene una expresión distinta respecto al grupo control dependiendo del tipo de patología. Seguidamente, se pretendió seguir ahondando en la relación de las proteínas seleccionadas y su posible 65 participación en las patologías estudiadas. Se propuso validar los hallazgos encontrados mediante la utilización P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 17 de otra metodología diferente a la anterior, para ello utilizamos la metodología western blot. Mediante esta técnica se midió la expresión de cada una de las proteínas seleccionadas en las muestras de LBA procedentes de los pacientes seleccionados en la tabla 1 (fig. 3). Se obtuvieron unos resultados que concuerdan con los anteriormente obtenidos, de forma que cada vez parece más evidente que las proteínas seleccionadas están involucradas en mayor o menor medida en las patologías estudiadas en este trabajo.5 El siguiente paso, fue la obtención de un perfil lo suficientemente robusto, susceptible de ser utilizado en la práctica clínica diaria. Para llevar a cabo este objetivo, se empleó una nueva cohorte de pacientes, con similares características a la cohorte anterior, con la única modificación de un aumento en el número de pacientes del grupo de CP y CP/EPOC. Este aumento se debe a la necesidad de esclarecer las diferencias previamente 10 observadas en los experimentos anteriores, entre los dos tipos de CP (ADE y SCC). Para la medida de proteínas se empleó la metodología de ELISA, ya que su uso está ampliamente extendido en la práctica clínica diaria (fig. 4). Gracias a este análisis se comprobó por un lado que no todas las proteínas participan en todos los grupos patológicos tal y como veníamos observando en los análisis anteriores, y que existe un grupo de 4 proteínas (GDF15, VEGF, EGF, TNFR I), que presentan diferencias de expresión significativas respecto al grupo control, 15 otras 4 proteínas (MIG, MIP-1B, MCP1,PDGFAA) que prácticamente no se expresan en situación control sin embargo presentan diferencias importantes en los diversos grupos patológicos, y dos proteínas (IGFBP1, CCL1) que solo se expresan en determinados grupos patológicos. y por otro lado este análisis ayudo a establecer un perfil de proteínas más robusto si cabe que el anterior, susceptible de poder extrapolarse en forma de kit a la práctica clínica (fig .4). 20 Posteriormente, se analizó el potencial de cada una de las proteínas como posibles biomarcadores en cada una de las patologías estudiadas. Para ello se estudió la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo, a partir de los resultados obtenidos en el apartado anterior (fig 5). Este análisis pone de manifiesto que la proteína MIG podría usarse como biomarcador, MIG presenta una sensibilidad y especificidad 25 en torno al 90% en las muestras de LBA de pacientes con EPOC, a la vez que las proteínas CCL1 e IGFBP1 presentan una sensibilidad 0% y una especificidad del 100%, lo que indicaría que estas tres proteínas podrían diagnosticar esta patología mediante un ELISA convencional. Del mismo modo, la proteína CCL1 presenta una especificidad del 100% y una sensibilidad del 40% por lo que podría ser un biomarcador discriminante para las muestras provenientes de Adenocarcinoma. Este análisis consolida el perfil de proteínas que hemos ido 30 obteniendo a través de los diferentes análisis, ayudándonos a establecer un posible kit capaz de discriminar los pacientes en los distintos grupos del estudio. Por último se empleó un modelo de regresión logística mediante el cálculo de la odds ratio, para definir el posible kit diagnostico. Esto permitió asociar si la presencia o ausencia de determinadas proteínas tenía relación con la 35 probabilidad de tener una determinada patología (Tabla 4). Tabla 1. Características de la primera cohorte de pacientes 40 Control n=16 EPOC n=15 CP n=17 EPOC con CP n=12 Género Masculino 100,0% (16) 100,0% (15) 100,0% (17) 100,0% (12) Femenino 0,0% (0) 0,0% (0) 0,0% (0) 0,0% (0) Media de edad [rango] 61,3 [41-80] 61,5 [45-78] 60,7 [46-69] 60,7 [49-68] Status Fumador 68,8% (11) 53,3% (8) 52,9% (9) 83,3% (10) Ex-fumador 31,2% (5) 46,7% (7) 47,1% (8) 16,7% (2) Packs-year 21,82 32,2 35,21 30,78 EPOC 1 - 20,0% (3) -58,3% (7) 2 - 33,3% (5) -25,0% (3) 3 - 26,7% (4) -0,0% (0) 4 - 20,0% (3) -16,7% (2) Cáncer de Pulmón ADC - - 70,6% (12) 33,3% (14) SCC - - 29,4% (5) 66,7% (8) P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 18 Tabla 2. Características de la segunda cohorte de pacientes. Control n=10 EPOC n=13 CP n=24 EPOC con CP n=34 Género Masculino 60,0% (6) 84,6% (11) 83,3% (20) 95,5% (32) Femenino 40,0% (4) 15,4% (2) 16,7% (4) 4,5% (2) Media de Edad [rango] 52,3 [42-58] 65,2 [51-75] 61,2 [48-75] 64,3 [48-75] Estatus Fumador 100,0% (10) 53,8% (7) 50,0% (12) 53,0% (18) Ex-fumador 0,0% (0) 46,2% (6) 50,0% (12) 47,0% (16) Años 21,82 34,2 33,21 39,78 EPOC 1 - 30,8% (4) -26,5% (9) 2 - 53,8% (7) -50,0% (27) 3 - 15,4% (2) -23,5% (8) 4 - 0,0% (0) -0,0% (0) Cáncer de Pulmón ADC - - 37,5% (9) 47,0% (16) SCC - - 62,5% (15) 53,0% (18) 5 Tabla 3. Cantidad de proteínas empleadas en el ELISA PROTEÍNA µg GDF-15 TNFRI VEGF EGF 25 MIG MCP-1 IGFBP-1 50 PDGFAA 75 MIP1β 125 CL-1 200 10 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 19 Tabla 4. Análisis de regresión logística mediante el cálculo de la odd ratio. Asociación de la posible condición a la permanencia o no del grupo patológico donde se ha definido. Grupo CONDICIÓN P-valor OR(95%CI) Control (sin EPOC ni CP) IGFP1 negativo MIP1B negativo CCL1 negativo MIG negativo PDGFAA negativo P<0,001 50(5,64-500) EPOC IGFP1 negativo CCL1 negativo MIG positivo 0,002 12,071(2,485-58,629) Adenocarcinoma CCL1 positivo MIP1B negativo 0,002 20,83(7,69-76,92) Carcinoma escamoso CCL1 negativo EGF negativo PDGFAA o MIP1B positivo 0,009 5,88(1,52-22,2) Adenocarcinoma y EPOC CCL1 positivo VEGF negativo 0,001 5,31(1,96-14,49) Carcinoma escamoso y EPOC GDF 15 positivo VEGF positivo CCL-1 negativo EGF negativo 0,002 9,34(2,19-40) 5 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 20 REIVINDICACIONES 1.- El uso simultáneo de las citoquinas y de los factores de crecimiento que se seleccionan de la lista que consiste en IGFBP1, MIP1β, CCL-1, MIG, PDGFAA, GDF-15, VEGF y EGF, para la predicción, diagnóstico, 5 pronóstico y clasificación de los individuos en: a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con carcinoma escamoso,10 e) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o f) individuos con EPOC y carcinoma escamoso. 2.- El uso según la reivindicación anterior, que además comprende las citoquinas y los factores de crecimiento IL-6sR, IL-1a, IL-11, EOTAXIN-2, TNFRI, TNFRII, IGFBP2, MCP1 e GDF-15.15 3.- Un método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de los individuos en a) individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) individuos con EPOC, c) individuos con adenocarcinoma, d) individuos con EPOC y adenocarcinoma, o e) individuos con EPOC y carcinoma escamoso, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y20 ii) cuantificar el producto de expresión de las citoquinas y de los factores de crecimiento que se seleccionan de la lista que consiste en: IGFBP1, MIP1β, CCL-1, MIG, PDGFAA, GDF-15, VEGF yEGF. 4.- El método según la reivindicación anterior, que además comprende: iii) comparar las cantidades obtenidas en el paso (ii) con una cantidad de referencia. 25 5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, que además comprende cuantificar el producto de expresión de las citoquinas y de los factores de crecimiento IL-6sR, IL-1a, IL-11, EOTAXIN-2, TNFRI, TNFRII, IGFBP2, y MCP-1. 30 6.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde los pasos (ii) y/o (iii) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados. 7.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, donde la muestra biológica es fluido brocoalveolar. 35 8.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, donde la cuantificación se hace mediante un inmunoensayo. 9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, donde el inmunoensayo es un ELISA. 40 10.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos sin EPOC ni cáncer de pulmón, cuando no presenta expresión de los genes IGFBP1, MIP1β, CCL-1, MIG y PDGFAA. 45 11.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos con EPOC cuando se detecta la expresión de MIG, y no se detecta la expresión de CCL-1 e IGFBP1. 12.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según 50 cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos con adenocarcinoma cuando se detecta la expresión de CCL-1, y la cantidad de expresión de MIP1β es menor a 20 pg/ml. 13.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según 55 cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos con carcinoma escamoso cuando se detecta la expresión de PDGFAA oMIP1β a cualquier nivel, y no se detecta la expresión de CCL-1. 14.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según 60 cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos con EPOC y adenocarcinoma cuando se detecta la expresión de CCL-1 a cualquier nivel, y la expresión de VEGF es menor de 200 pg/ml. P201230874 03-10-2012  ES 2 437 240 B1 21 15.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (i)-(iii) según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, y que además comprende asignar al individuo del paso (i) al grupo de individuos con EPOC y carcinoma escamoso cuando se detecta la expresión de GDF-15 y de VEGF superior a 50 pg/ml y 200pg/ml respectivamente, y no se detecta la expresión de CCL-1 ni EGF. 5 16.- Un kit o dispositivo, que comprende los anticuerpos anti-IGFBP1, anti-MIP-1B, anti-CCL-1, anti-MIG, anti- PDGFAA, anti-GDF-15, anti-VEGF o anti-EGF. 17.- El kit o dispositivo según la reivindicación 16, que además comprende los anticuerpos anti-IL-6sR, anti-IL-1a, anti-IL-11, anti-EOTAXIN-2, anti-TNFRI, anti-TNFRII, anti-IGFBP2, y anti-MCP1.10 18.- El uso de un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 16 -17, para llevar a cabo un método según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 a15. P201230874 03-10-2012  ES 2 437 240 B1 23 FIGURA 1 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 24 FIGURA 2 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 25 FIGURA 2 (continuación) P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 26 FIGURA 3 P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 33 FIGURA 5 (continuación) P201230874 05-06-2012  ES 2 437 240 B1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: 201230874 22 Fecha de presentación de la solicitud: 05.06.2012 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : G01N33/68 (2006.01) DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas A A A A A JIANG F. et al. A Panel of Sputum-Based Genomic Marker for Early Detection of Lung Cancer. Cancer Prevention Research. 2010. Vol. 3(12), páginas: 1571-1578, todo el documento. PINTO-PLATA VM. et al. Systemic Cytokines, Clinical and Physiological Changes in Patients Hospitalized for Exacerbation of COPD. CHEST. 2007. Vol. 131(1), páginas: 37-43, todo el documento. MOERMANS C. et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 2011. Vol. 56, páginas: 298-304, todo el documento. TAKIZAWA H. et al. Increased Expression of Transforming Growth Factor-b1 in Small Airway Epithelium from Tobacco Smokers and Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2001. Vol. 163, páginas: 1476-1483, todo el documento. ES 2263228 T3 (TEIJIN LIMITED) 01.12.2006, página 2, línea 15; página 3, línea 39; reivindicaciones 1,2,4,5. 1-18 1-18 1-18 1-18 1-18 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado  para todas las reivindicaciones  para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe 21.10.2013 Examinador M. D. García Grávalos Página 1/4 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 201230874 Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, NPL, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, PUBMED, GOOGLE PATENTS, GOOGLE SCHOLAR. Informe del Estado de la Técnica Página 2/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201230874 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 21.10.2013 Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-18 SI Reivindicaciones NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-18 SI Reivindicaciones NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Informe del Estado de la Técnica Página 3/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201230874 1. Documentos considerados.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 JIANG F. et al. Cancer Prevention Research. 2010. Vol. 3(12), páginas: 1571-1578. 2010 D02 PINTO-PLATA VM. et al. CHEST. 2007. Vol. 131(1), páginas: 37-43. 2007 D03 MOERMANS C. et al. Cytokine. 2011. Vol. 56, páginas: 298-304. 2011 D04 TAKIZAWA H. et al. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2001. Vol. 163, páginas: 1476-1483. 2001 D05 ES 2263228 T3 01.12.2006 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud divulga un método de obtención de datos útiles para diagnóstico, pronóstico y clasificación de sujetos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón, mediante la cuantificación del producto de expresión de una serie de citoquinas y factores de crecimiento. Se refiere también a un kit o dispositivo para diagnóstico, pronóstico y siguiente clasificación de: a) sujetos sin EPOC ni cáncer de pulmón, b) sujetos con EPOC, c) sujetos con adenocarcinoma, o e) sujetos con EPOC y carcinoma escamoso (reivindicaciones 1-18). El documento D01 divulga una búsqueda de marcadores genéticos de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), mediante un estudio realizado con ADN aislado de muestras de esputos de 49 pacientes con cáncer de pulmón (NSCLC), de 49 pacientes que padecen enfermedad obstructiva respiratoria (EPOC) y de 49 individuos fumadores sanos. El resultado mostró en primer lugar un panel de quince genes que presentaban diferencias entre los individuos de una u otra enfermedad y los sanos. Con seis de estos genes se consigue una mayor predicción y especificidad para casos de individuos con cáncer de pulmón en diferentes estadios y en la identificación de casos de individuos con adenocarcinoma escamoso de pulmón (ver todo el documento). El documento D02 divulga la alteración del entorno de citoquinas sistémicas en pacientes hospitalizados por exacerbación de EPOC (ver todo el documento). El documento D03 divulga un estudio sobre la inflación sistémica de las vías aéreas y liberación de citoquinas en pacientes con EPOC (ver todo el documento). El documento D04 divulga un estudio sobre el incremento de la expresión del factor de crecimiento transformante (TGF- beta1) en células epiteliales las vías aéreas en individuos fumadores y en pacientes con EPOC (ver todo el documento). El documento D05 divulga un método para predecir la susceptibilidad de padecer una enfermedad pulmonar obstructiva en un humano basado en el polimorfismo del gen de la tripsina proteasa humana del tracto respiratorio (ver página 2, línea 15; página 3, línea 39; reivindicaciones 1, 2, 4 y 5). 1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y 8.1 LP 11/1986) El objeto técnico de la presente solicitud es un método de obtención de datos útiles para diagnóstico, pronóstico y clasificación de sujetos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón, mediante la cuantificación del producto de expresión de una serie de citoquinas y factores de crecimiento. 1.1. REIVINDICACIONES 1-18 En el estado de la técnica se encuentran métodos para diagnóstico, pronóstico de sujetos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y/o cáncer de pulmón. Por otra parte, también se encuentran documentos que relacionan la expresión de citoquinas o factores de crecimiento con estas enfermedades. Sin embargo, las características técnicas que presentan no coinciden con las reivindicadas en la presente solicitud. La presente invención reivindica un método basado en la cuantificación del producto de expresión de una serie de citoquinas y factores de crecimiento seleccionados que no ha sido encontrado en el estado de la técnica. En consecuencia, las reivindicaciones 1-18 cumplen el requisito de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y 8.1 LP 11/1986) Los documentos D01-D05 se refieren al estado de la técnica y no se consideran relevantes a efectos de la valoración de la novedad y actividad inventiva de la presente solicitud de patente. Informe del Estado de la Técnica Página 4/4