Un subgrupo de isoformas de los receptores de lipoforinas de Drosophila melanogaster interacciona con distintas afinidades con las lipoproteinas lipoforina y LTP en la membrana plasmática, mediando así la adquisición celular de lípidos neutros.

“Un subgrupo de isoformas de los receptores de lipoforinas de Drosophila melanogaster interacciona con distintas afinidades con las lipoproteínas lipoforina y LTP en la membrana plasmática, mediando así la adquisición celular de lípidos neutros” TESIS DOCTORAL Miriam Rodríguez Vázquez Sevilla, 2018 “Un subgrupo de isoformas de los receptores de lipoforinas de Drosophila melanogaster interacciona con distintas afinidades con las lipoproteínas lipoforina y LTP en la membrana plasmática, mediando así la adquisición celular de lípidos neutros” UNIVERSIDAD DE SEVILLA DOCTORADO EN BIOLOGÍA INTEGRADA: Biología Molecular y Celular, Microbiología: Fisiología, Biotecnología y Biodiversidad TESIS DOCTORAL Director de Tesis: Joaquim Culi Espigul Miriam Rodríguez Vázquez Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD) Sevilla, 2018 5 Pensaba que esta parte sería la más fácil de escribir, sin embargo, muchos sentimientos se acumulan al recordar todo el camino recorrido para llegar a este momento. En primer lugar, quiero agradecer enormemente a Joaquim Culi, por darme la oportunidad de trabajar a su lado e impregnarme de parte de su enorme sabiduría. Agradezco la confianza que has depositado en mí desde el primer momento y la infinita paciencia que has tenido conmigo en este largo camino. No podría haber tenido mejor maestro de orquesta, y aunque desafinara algunas veces, siempre me has guiado para que me superase día a día. No sólo me has enseñado protocolos de laboratorio (sin olvidar los controles), me has enseñado algo mucho más importante que es pensar y desarrollar las ideas como un científico. No puedo hablar de Quim sin nombrar al laboratorio 142, aquel en el que entré años atrás y donde me acogieron como una más de la familia. Esmeralda, me enseñó la rigurosidad y su siempre disponibilidad para debatir cualquier asunto científico. David, gran amigo y apoyo en estos años. Gracias “chico” por ayudarme en todo momento y sacarme siempre una sonrisa. Y John, ¿Qué hubiera sido de mí sin ti? Mucho de lo que sé te lo debo a ti. Me acogiste en tu poyata en mis primeros pasos en el mundo de la Biología molecular y tuviste una paciencia de oro. El pequeñín del lugar me ha enseñado grandes cosas, destacando el significado de “GP: Guinea Pig”. A todos vosotros muchas gracias por hacer que mi día a día fuera más ameno, y no sólo compartir pipetas sino risas y buenos momentos que jamás olvidaré. Pasamos al laboratorio 143 o comúnmente denominado “el laboratorio de los vecinos”. Primero quiero agradecer a James Castelli y Sol Sotillos por sus consejos y su ayuda en todo momento. Muchas personas han pasado a lo largo de estos años y todas han aportado algo positivo. Gracias a cada una de ellas: Marisa, Patri, Silvia, Mari Carmen, Pako, Pedro, Carlos, José y Sara. Tengo que destacar a Mario y Calero. No me puedo imaginar mi tesis sin vosotros como coprotagonistas. El final del día visitando a “los vecinos” para contar lo que ha acontecido durante el día. Carcajadas infinitas y confesiones desastrosas. Mario, has sido un ejemplo de superación y tus consejos me han servido para avanzar y ser más exigente conmigo misma. Además de un compañero, me llevé un gran amigo. Calero, mi Lero, ¿Qué te puedo decir que no sepas? Has sido para mi un pilar fundamental en todo este tiempo. No existen palabras de agradecimiento para expresar lo mucho que me has ayudado y apoyado en los momentos más difíciles. Gracias también por tu amistad, los numerosos viajes y momentos del que me has hecho partícipe. Quedarán por siempre en mi retina. Un poco más hacia delante se encuentra el laboratorio de Casares (sin número). Gracias a Mari Ángeles, Antonella, Marta Magri, Jorge y mis niñas Diana y Martinha. No puedo salir de este laboratorio sin antes dedicar unas líneas a Marta, mi portuguesinha. Mi gratitud hacia ti es infinita. Siempre has estado ahí cuando te he necesitado, echándome una mano en cualquier ámbito: Escuchando mi inglés en los ensayos de los seminarios más importantes o en el coche intentando entonar las canciones más dispares. Muito obrigada minha amiga. Entre los moscólogos, agradecer a Lola y Acaimo, por su generosidad y sus aportaciones en los seminarios, ampliando mis perspectivas en el ámbito de Drosophila. También a: Mari Carmen, Alicia, Clara, Juanjo, Beatriz, María, Andrea, Alfonsa y Besaid; por sus risas y sus charlas tan amenas. AGRADECIMIENTOS Gracias a la gente de gusanos: Blanca, Celia, Gina, Artur y Carlos Viso. De peces: María Nicolás, Ana Ariza, Inés, Nacho y Carlos. A los “Damianes”: Franz, Juan Carlos, David, Ibai, Ricardo y Timothée. Proteómica: Laura Tomás. Y en general, dar las gracias a toda la gente del CABD. Todos ellos han formado parte de mi vida diaria y siempre me han sacado una sonrisa. Tengo que agradecer especialmente a mi gente del “Coffee-time”, Mariam, Sofi, Helenita, Elena, Ana, David, Kathy, José, Juan, Calero y Mario. Jamás olvidaré aquellas charlas que nos evadían por unos momentos del laboratorio, las risas y los buenos ratos concentrados en unos sofás donde cada uno tenía su sitio bien establecido. Lo importante ha sido que después hemos podido pasar más e incluso mejores momentos fuera, con recuerdos que permanecerán guardados siempre en la memoria: Mi primera feria, la ruta de la Alfalfa, esos serranitos de pollo del Trini, Donaldzon, y demás. Es bonito saber que además de una tesis, te llevas a amigos de verdad. Gracias a mis amigos de la facultad: Carmen Mari, Rosa, Amalia, Alejandra, Patri, Ana Mari, Laura, Antonio, David, Ana y Juanma, por hacer que la tesis sea más llevadera. Mis compis Susana y Lolet, porque ¡no sé qué haría sin vosotras chicas! Y mis amigos: Isa, Carmencita, María José, Eres, Virginia, Angy, mis Cartayeras, Raúl, Asier y Azu, compartir el tiempo y la vida con vosotros ha sido el mejor regalo. No puedo dar por terminado los agradecimientos sin agradecer a mi familia. Gracias a mis abuelos, tíos y primos, por animarme y ser feliz. Me siento agradecida por tener una familia tan unida. Gracias a mis padres por todo lo que han hecho por mí. Por su confianza, por creer en mí antes de que yo lo hiciera. Por empujarme hacia la persona que soy hoy día. Por enseñarme los verdaderos valores de la vida, de querer siempre mejorar y alcanzar mis metas. De que la palabra imposible no existe. Gracias por hacerme una persona independiente, que cometiera mis propios errores y que aprendiera de ellos. No puedo pedir mejores guías de la vida, con ellos sé que jamás viajaré sola. Por todo esto y por vuestro respaldo incondicional, os quiero. Antes de acabar, me gustaría compartir el resumen que realiza mi abuela Carmen de lo que ha supuesto mi tesis: “Mi nieta 1San-Miriam, es Bionosequé (pausa mientras piensa qué es nosequé). Vamos, que se dedica a matar moscas en el laboratorio” 1San., no procede del apócope de Santa, sino del nombre de mi prima Sandra. 6 ÍNDICE RESUMEN/SUMMARY.................................................................................................13 ABREVIATURAS.............................................................................................................19 INTRODUCCIÓN...........................................................................................................25 1. Síndrome metabólico y su relevancia .............................................................................27 2. Drosophila como organismo modelo para el estudio del metabolismo lipídico........27 3. Familia de los receptores LDLR.........................................................................................30 4. Caracterización de los dominios de interacción entre miembros de la familia LDLR y sus ligandos..................................................................................................33 5. Comparación del transporte de lípidos en mamíferos e insectos................................36 5.1. Metabolismo lipídico: Las lipoproteínas..................................................................................36 5.2. Metabolismo de los TAG en mamíferos (quilomicrones, remanentes de quilomicrones y VLDL)....................................................................................................................37 Metabolismo de las lipoproteínas ricas en TAG...............................................................38 5.3. Metabolismo del colesterol en mamíferos y proteínas de transferencia de lípidos (CETP) y fosfolípidos (PLTP) ............................................................................................40 5.4. Metabolismo lipídico en insectos ............................................................................................42 Lipoforina..............................................................................................................................42 LTP (Lipid Transfer Particle)................................................................................................45 Receptores de lipoforinas.....................................................................................................51 6. Estructura de los péptidos señal y sus funciones...........................................................55 OBJETIVOS........................................................................................................................59 MATERIALES Y MÉTODOS......................................................................................63 1. GENÉTICA.........................................................................................................................65 1.1. Sistema UAS/Gal4/Gal80ts ..........................................................................................65 SUMMARY 17 Sedentary lifestyle and new dietary habits are causing a worldwide increase in diseases and conditions related to an unbalanced lipid metabolism, such as atherosclerosis. The core elements of mammalian lipid metabolism and cellular lipid uptake are well understood. One of the key components is the Low Density Lipoprotein Receptors (LDLR), which regulate cholesterol homeostasis. Because of its genetics, Drosophila is becoming a widely used model organism to study disorders associated to metabolic syndrome, such as obesity. However, there are still basic aspects of Drosophila lipid metabolism that we do not understand, hindering its value as a valid model. In this thesis, we uncovered the molecular mechanism that mediates the transfer of lipids from circulating lipoproteins to peripheral tissues like imaginal discs and ovaries in Drosophila. Lipophorin is the major lipid carrier in hemolymph. It interacts with tissues through the lipophorin receptors, homologous to the human LDLR. However, we have demonstrated that this interaction is mostly indirect and transient. In addition to lipophorin, hemolymph also contains the lipoprotein Lipid Transfer Particle (LTP), with the catalytic activity of transferring lipids between lipoproteins and membranes. Here, we show that the lipophorin receptors recruit LTP to the plasma membrane and that this is the key event that triggers the uptake of neutral lipids into cells. This high affinity binding between LTP and the lipophorin receptors requires the LA1 domain, found in a subset of lipophorin receptor isoforms, and is strengthened by a contiguous region of 16 conserved amino acids. This interaction also promotes the extracelullar stabilization of lipophorin in the plasma membranes. These three elements: Lipophorin receptors, LTP and lipophorin, represent a functional intermediate during lipid transfer from lipophorin to cells, a process that does not require the endocytosis of the complex. We also show that the lipophorin receptor isoforms that mediated lipid uptake contain an atypically long signal peptide that induces low levels of translation. We do not know the functional implications of this. Together, our data improves our understanding of a central aspect of lipid metabolism in Drosophila. Interestingly, even though the lipophorin receptors and the human LDLR have related functions and structure, the specific molecular mechanisms involved are diverse. This is a clear example of LDLR family versatility throughout evolution and in different species. ABREVIATURAS ABREVIATURAS 21 ABCA1 ATP-Binding Cassette Transporter 1 ACAT Acil-CoA Colesterol aciltransferasa ADN Ácido Desoxirribonucleico ADNc ADN complementario AKH Adipokinetic Hormone (Hormona adipocinética) AM Anterior midgut (Intestino medio anterior) ap apterous ApoER2 Apolipoprotein E Receptor 2 ARN Ácido Ribonucleico ARNi ARN de interferencia ARNm ARN mensajero ATGL Adipose Triglyceride Lipase BDGP Berkeley Drosophila Genome Project CETP Cholesteryl Ester Transfer Protein (Proteína transportadora de ésteres de colesterol) CM Chylomicron (Quilomicrón) CMR Chylomicron Remnant (Remanentes de quilomicrones) Co-IP Co-InmunoPrecipitación Crb Crumbs CSPG Crondroitín Sulfato ProteoGlicanos DAG Diacilglicerol DAPI 4’,6-diamidino-2-fenilindol diclorhidratado Df Deficiencia DGAT Diacilglicerol aciltransferasa DGRC Drosophila Genomics Resource Center DIAP Death-associated Inhibitor of Apoptosis DSHB Developmental Studies Hybridoma Bank DTT 1,4-Dithiothreitol ED Extension Domain EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGF Epidermal Growth Factor en engrailed EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein FB Fat Body (cuerpo graso) FFA Free Fatty Acids (Ácidos grasos libres) ABREVIATURAS 22 FH Familial hypercholesterolemia (Hipercolesterolemia familiar) Flp Flipasa recombinasa FRT Flippase Recognition Target GC Gastric caeca (divertículos gástricos) GFP Green Fluorescent Protein (Proteína fluorescente verde) h hora HDL High Density Lipoprotein (Lipoproteína de alta densidad) HDLp High Density Lipophorin (Lipoforina de alta densidad) hh hedgehog HL Hepatic Lipase (Lipasa hepática) hs heat shock (choque térmico) HSPG Heparán sulfato proteoglicanos IDL Intermediate-Density Lipoprotein (Lipoproteína de densidad intermedia) Ig Inmunoglobulina ILP Insuline-like peptides (Péptidos parecidos a la insulina) IPC Insuline Producer cells (Células productoras de insulina) kDa kiloDalton LAMP Lysosomal-Associated Membrane Protein LB Laemmli Buffer LCAT Lecitina colesterol aciltransferasa LD Lipid Droplets (Inclusiones lipídicas) LDL Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de baja densidad) LDLp Low Density Lipophorin (Lipoforina de baja densidad) LDLR Low Density Lipoprotein Receptor (Receptor de Lipoproteína de baja densidad) LLT Large Lipid Transfer Lp Lipoforina LPL Lipoprotein Lipase (Lipoproteína lipasa) lpr1 lipophorin receptor 1 (receptor de lipoforina 1) lpr2 lipophorin receptor 2 (receptor de lipoforina 2) LRP1-8 LDLR-Related Protein 1-8 LTP Lipid Transfer Particle LTTP Large Lipid Transfer Particle MAG Monoacilglicerol MEGF7 Multiple Epidermal Growth Factor repeat-containing protein 7 mg miligramo ABREVIATURAS 23 MHC-I Major Histocompatibility Complex-I (Complejo mayor de histocompatibilidad) min minuto ml mililitro mM miliMolar MMTV Mouse Mammary Tumor Virus (Virus del tumor mamario de ratones) MTP Microsomal triglyceride Transfer Protein MVB MultiVesicular Body (Cuerpo multivesicular) NCN Non-Conserved N-terminal domain (Dominio N terminal no conservado) nm nanometro NR Nile Red nub nubbin ONPG O-nitrophenyl-b-D-galactoside OR Oregon R PAF Parafolmaldehído PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida pb Pares de bases PBS Phosphate Buffer Saline PBT Phosphate Buffer Saline + Triton X-100 PC Phosphatidylcholine (Fosfatidilcolina) PCR Polimerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-like 9 PD Promotor Distal PE Phosphatidylethanolamine (Fosfatidiletanolamina) PFA Paraformaldehído PLTP Phospholipid Transfer Protein (Proteína transportadora de fosfolípidos) PM Posterior Midgut (intestino medio posterior) PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PP Promotor Proximal ptc patched RAP Receptor-Associated Protein (Proteína Asociada a Receptor) RE Retículo Endoplasmático rpm revoluciones por minuto RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Dodecilsulfato sódico shi Shibire ABREVIATURAS 24 SP Signal Peptide (Péptido señal) SPase Signal Peptidase SPPase Signal Peptide Peptidase Sqh Spaguetti squash SR-B1 Scavenger Receptor- B1 SRP Signal Recognition Particle (Partícula de reconocimiento señal) t.a. Temperatura ambiente TAG Triacilglicerol TAP Tandem Affinity Purification (Purificación por Afinidad en Tándem) TGN Trans-Golgi Network (Red del trans-Golgi) Tris Tris-hidroximetil-aminometano U Unidades UAS Upstream activation sequence VDRC Vienna Drosophila Research Center VHDLp Very High Density Lipophorin (Lipoforina de muy alta densidad) VLDL Very Low Density Lipoprotein (Lipoproteína de muy baja densidad) VLDLR Very Low Density Lipoprotein Receptor (Receptor de Lipoproteína de muy baja densidad) w white Wg Wingless wt wild type (silvestre) y yellow YFP Yellow Fluorescent Protein (Proteína fluorescente amarilla) μg microgramo μl microlitro μm micrómetro INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 32 plegamiento y el mantenimiento de la integridad del dominio (Blacklow and Kim, 1996; Atkins et al., 1998). Cada dominio LA está conectado con el siguiente por cortas regiones flexibles (linker) (Beglova et al., 2001). Tradicionalmente, se ha propuesto que la interacción de los ligandos con estos receptores tenía lugar en estos dominios. Por ejemplo, las partículas LDL se unen al receptor LDLR en la región LA3-LA7 (Esser et al., 1988 y Russell et al., 1989). Su vital importancia se ve reflejada en que un gran número de mutaciones identificadas en los residuos que coordinan el calcio o que forman parte de los puentes disulfuro de los dominios LA del LDLR humano provocan hipercolesterolemia familiar (FH, del inglés Familial Hypercholesterolemia), una enfermedad genética originada por la falta de función del LDLR y que consiste en una elevada concentración de colesterol en plasma (Fass et al., 1997). - Dominio EGF (del inglés, Epidermal Growth Factor): Este dominio contiene entorno a 40-50 aminoácidos formando dos pares de cortas láminas β antiparalelas (Figura 2C). Se pueden encontrar solos o en grupo de dos. Al igual que el dominio LA, también presenta 6 cisteínas conservadas. Sin embargo, éstas forman un patrón de puentes disulfuro distinto (C1-C3, C2- C4, C5-C6). Mutaciones en estos dominios no afectan la unión del receptor con los ligandos, pero sí pueden interferir con la disociación de los ligandos en los endosomas, afectando así al reciclaje del receptor, como ocurre con el receptor LDLR y la partícula LDL (Hobbs et al., 1992). - Dominio YWTD o β-propeller: Está compuesto por 6 grupos de 4 láminas β antiparalelas generando cada uno una estructura circular en hélice (propeller). Repeticiones YWTD están presentes en cada lámina β y dan lugar al nombre del dominio. Suele ir flanqueado por un dominio EGF que le confiere estabilidad y permite su correcto plegamiento con la ayuda de la chaperona Mesd/Boca (Figura 2D) (Culi et al, 2004). Se ha demostrado que los dominios β-propeller se unen a otros dominios de la misma proteína, provocando un cambio conformacional necesario para su actividad. Por ejemplo, el pH ácido de los lisosomas induce que los dominios LA4 y LA5 del receptor LDLR se plieguen e interaccionen con el β-propeller, permitiendo la disociación del ligando LDL del receptor y su reciclaje (Rudenko et al., 2002). - Dominio de O-Glicosilación: Está presente en algunos, pero no todos los miembros de la familia LDLR, por ejemplo, está ausente en Megalin (LRP2). Es un dominio de longitud variable que contiene una gran cantidad de residuos de serina y treonina susceptibles de sufrir un proceso de O-glicosilación (Willnow, 1999; Herz and Bock, 2002). Todavía no está clara su función. Inicialmente se pensaba que tenía un papel estructural creando un espacio entre el ectodominio y la región transmembrana y aportando de esta manera estabilidad al receptor (Kingsley et al., 1986; Magrané et al., 1999). Sin embargo, su función debe ser más sutil ya que se ha observado que tanto en los receptores humanos VLDLR y ApoER2 como en los receptores de lipoforinas de la mayoría de los insectos hay distintas isoformas que se diferencian en este dominio, sugiriendo que no es esencial para la estabilidad de estas proteínas (Martensen et al., 1997; Iijima et al., 1998; Nakamura et al., 1998; Clatworthy et al., 1999; Magrané et al., 1999; Sun and Soutar, 1999; Korschineck et al., 2001). - Dominio transmembrana: De pequeño tamaño (entorno a 24 aminoácidos). Forma una alfa hélice y es de un solo paso. Es imprescindible para la función del receptor. - Dominio intracelular o citoplásmico: Desempeña un papel indispensable en la endocitosis mediada por clatrina gracias a la presencia de la secuencia [F/Y]xNPxY, que media la interacción con la maquinaria endocítica. Todos los miembros de esta familia poseen al menos una copia de esta secuencia. Asimismo, se ha demostrado una función directa en INTRODUCCIÓN 33 transducción de señales por la unión de proteínas adaptadoras citoplásmicas, por ejemplo, Dab1 (Lakomá et al., 2011). Además, el dominio intracelular puede poseer secuencias requeridas para la correcta localización subcelular del receptor. Por ejemplo, para dirigir el LDLR hacia membranas basolaterales (Yokode et al., 1992; Koivisto et al., 2001), o hacia el dominio apical para la proteína Megalin (Takeda et al., 2003). 4. Caracterización de los dominios de interacción entre miembros de la familia LDLR y sus ligandos Una de las razones por la cual los receptores de la familia LDLR desempeñan funciones tan diversas se debe a que tienen la capacidad de unir una amplia variedad de ligandos. El receptor clásico que representa a esta familia es el LDLR. Su mecanismo de acción ha sido uno de los ejemplos más empleados a la hora de estudiar la endocitosis mediada por receptor. El LDLR se encuentra ampliamente distribuido en el organismo, pero se expresa a altos niveles en el hígado. Su función principal consiste en mediar la endocitosis y eliminación de las lipoproteínas LDL (del inglés, Low Density Lipoprotein) y así mantener la homeostasis del colesterol. Mutaciones en este receptor llevan a un fuerte incremento de los niveles de colesterol en sangre y al desarrollo de enfermedades de las arterias coronarias y ateroesclerosis, principales causas de mortalidad en las sociedades occidentales, de ahí la importancia de estudiar su mecanismo de acción. A lo largo de los años se han ido caracterizando distintos ligandos y sus sitios de unión con el receptor. A continuación, describiremos los ejemplos más significativos, aunque nos centraremos principalmente en la interacción con la lipoproteína de baja densidad o LDL a través de la Apolipoproteína B (ApoB): - ApoB. La lipoproteína de baja densidad o LDL es el transportador de colesterol más abundante en el torrente sanguíneo y por esta razón, la interacción entre el LDLR y las LDL ha sido analizada en detalle. Cada partícula de LDL contiene una única molécula de la Apolipoproteína B. Existen dos tipos de ApoB: ApoB-100 y ApoB-48 producidas en el hígado y en el intestino respectivamente, que derivan del mismo gen a través de un proceso de edición del ARNm. La primera de ellas, ApoB-100, está compuesta por 4536 aminoácidos, siendo una de las mayores proteínas existentes. Debido a la dificultad para trabajar con ella como proteína aislada, los estudios estructurales han sido limitados. La partícula LDL cargada de colesterol se une al receptor en los dominios de unión a ligando o LA. Gracias a estudios bioquímicos se conoce que la región esencial para esta interacción abarca LA3-7 más el dominio EGF-A (Esser et al., 1988; Russell et al., 1989). Asimismo, existen análisis que evidencian que los dominios LA son los más importantes, ya que usando minirreceptores recombinantes se observó que aquel que contenía sólo los dominios LA tenían la capacidad de unir LDL in vitro (Simmons et al., 1997). La región de unión en ApoB se localiza principalmente en la zona C-terminal de la proteína, concretamente en el denominado sitio B (residuos 3359-3369 ricos en alanina y arginina) (Borén et al., 1998). Se piensa que la unión LDLR-LDL es electroestática, ya que la superficie de ApoB presenta una carga neta positiva gracias a los residuos de Ala y Arg del sitio B mientras que los dominios LA del LDLR poseen carga negativa. Por otro lado, se ha demostrado que la afinidad del LDL con el receptor depende también del tamaño de la partícula. Partículas pequeñas tienen menos afinidad que partículas grandes (Clavey et al., 1995) INTRODUCCIÓN 34 Figura 3. Interacción de ApoB-100 de las partículas LDL con los receptores LDLR y endocitosis. (A) Esquema general del proceso. Cuando las células presentan niveles bajos de colesterol, el factor de transcripción SREBP se procesa activando la transcripción de los receptores LDLR. (1) La partícula LDL circulante se une al receptor LDLR. (2) El complejo LDL-LDLR se endocita al interior celular mediante vesículas rodeadas de clatrina. (3) Una vez en el endosoma el complejo LDL-LDLR se disocia debido al bajo pH lisosomal. Como consecuencia de ello, la partícula LDL se libera y el receptor puede reciclarse hacia la superficie celular, (4) para que se repita el ciclo. Modificado de Reiner, 2015. (B) Representación esquemática del proceso de liberación de la partícula LDL. A pH neutro, la Apolipoproteína B100 se une al dominio extracelular del receptor, concretamente en los dominios de unión LA3-7, a través de su sitio B. La liberación del ligando se produce a pH lisosomal, debido a un cambio conformacional del receptor producido por la interacción de los dominios LA4 y LA5 con el dominio β-propeller. Tomada y modificada de Borén et al., 1988a y Jeon and Blacklow, 2005. Una vez unidas, se produce la internalización del complejo ligando-receptor vía endocitosis mediada por clatrina. En el interior de la célula, el complejo se deshace a pH lisosomal (Figura 3A). Ello se debe a que en estas condiciones, el dominio extracelular del receptor sufre un cambio conformacional plegándose sobre sí mismo debido a la unión de los dominios LA4-5 con el β-propeller, cambiando a una disposición cerrada en contraste con su disposición elongada que adopta a pH fisiológico (Rudenko et al., 2002; Innerarity, 2002) (Figura 3B). Se comprobó que el dominio LA7 junto con EGF-A también participan en el proceso de liberación del ligando en los lisosomas, creando una región rígida donde tres residuos de histidina son de vital importancia para la disociación de la partícula (Jeon and Blacklow, 2003). De esta manera, la partícula LDL se degrada liberando su contenido a la célula, mientras que el receptor es reciclado a la superficie celular. - ApoE. Junto con ApoB, es una de las apolipoproteínas mayoritarias de mamíferos. Es bastante más que pequeña que la anterior, teniendo tan sólo 299 aminoácidos. Se encuentra principalmente formando parte de los quilomicrones, remanentes de quilomicrones y VLDL, y a diferencia de la ApoB, existen varias copias de ApoE en cada partícula. Su deficiencia INTRODUCCIÓN 35 deriva en una enfermedad denominada disbetalipoproteinemia, dando lugar a niveles altos de colesterol y triglicéridos en sangre (Schneider et al., 1981). Estudios bioquímicos con proteínas recombinantes desvelaron que los dominios LA4-5 del LDLR eran suficientes para unir ApoE al receptor. No obstante, los dominios LA4 y LA5 por sí solos no tendrían esta capacidad (Fisher et al., 2004). Por otra parte, la región N-terminal de la ApoE (residuos 130-160 y R172) rica en Arginina y Lisina, le confiere una carga neta positiva en su superficie, promoviendo de esta manera su interacción con el receptor (Fisher et al., 2004; Innerarity et al., 1983; Weisgraber et al., 1982; Lalazar et al., 1988; Zaiou et al., 2000 y Morrow et al., 2000). - Proteína RAP (del inglés, Receptor-Associated Protein), es una chaperona residente en el retículo endoplasmático necesaria para la maduración de muchos miembros de la familia de los LDLR. Además, previene la asociación prematura del receptor con sus ligandos a lo largo de la ruta secretora, facilitando así el tránsito del receptor hacia la superficie celular (Bu et al., 1995; Willnow et al., 1995, 1996). Se comprobó como la proteína RAP se une al receptor en los dominios de unión a ligando (LA) previamente descritos, concretamente la región de interacción comprende LA2-5 (Fisher et al., 2006; Guttman and Komives, 2011 y Kurasawa et al., 2013). - Factor VIII de coagulación de la sangre (FVIII). Este ligando es un claro ejemplo de la versatilidad del LDLR, ya que su función no está relacionada con el metabolismo lipídico. El Factor VIII es un cofactor que activa al Factor IX de la vía intrínseca de la coagulación de la sangre. La deficiencia del FVIII provoca hemofilia A (Fay, 2006). El receptor LDLR actúa junto con el receptor LRP1 para captarlo del plasma disminuyendo de esta manera su vida media (Bovenschen et al., 2005). La región del receptor destinada a la unión con el FVIII coincide con la región que interacciona con la proteína RAP, abarcando LA2-5 (Kurasawa et al., 2013). La comparación de los sitios de unión del LDLR con sus ligandos muestran que los dominios LA4-5 están implicados en la mayoría de esas interacciones. Notablemente, este doblete posee una zona de unión entre dominios (linker) inusualmente larga comparada con el resto, proporcionándoles más flexibilidad para adaptarse a los diferentes ligandos. Además, el dominio LA5 presenta una afinidad significativamente mayor para el calcio (Ca2+) que cualquier otro dominio LA (Guttman and Komives, 2011). Por otra parte, LA5 por sí solo no es suficiente para la unión del receptor con los ligandos sino que el contexto en el que reside también es crítico para maximizar el reconocimiento y la unión (Yamamoto and Ryan, 2009). Hay que destacar que no sólo se han descrito interacciones a través de los dominios LA para el receptor LDLR, sino también para otros miembros de esta familia como por ejemplo, los receptores VLDLR y ApoER2, que interaccionan con la proteína Reelin (Hiesberger et al., 1999) y las proteínas de la matriz extracelular tales como Trombospondina y F-espondina (Blake et al., 2008 y Hoe et al., 2005), todas ellas asociadas con la migración neuronal. Por otro lado, se han identificado interacciones en prácticamente todas las regiones de las proteínas previamente mencionadas. Tal es el caso del dominio EGF-A del receptor LDLR al cual se une la glicoproteína PCSK9 (del inglés, Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-like 9). Esta proteína controla los niveles de colesterol en plasma promoviendo la degradación del receptor (Gu et al., 2013). Otro claro ejemplo son los receptores LRP5/6 ( y arrow, su ortólogo en Drosophila), que actúan como co-receptores junto con Frizzled de las proteínas Wnt (wingless en Drosophila) para la transducción de señales de esta importante vía implicada en el desarrollo. Esta interacción se ha visto que tiene lugar en uno de los dominios β-propeller (YWTD) (Kikuchi et al., 2007). INTRODUCCIÓN 36 5. Comparación del transporte de lípidos en mamíferos e insectos 5.1. Metabolismo lipídico: Las lipoproteínas Los lípidos son biomoléculas orgánicas esenciales para el desarrollo de la vida cuyas funciones principales son: a) reserva energética del organismo, en forma de triacilglicéridos (TAG), b) función estructural, formando parte fundamental de las membranas celulares (fosfolípidos) y c) como precursores de vitaminas, hormonas esteroideas, prostaglandinas (colesterol) y mensajeros secundarios. Para poder ejercer su correcta función y llegar a los órganos diana, los lípidos están continuamente circulando en el organismo a través de medios acuosos extracelulares como, el sistema circulatorio en mamíferos o la hemolinfa en insectos. Sin embargo, una característica básica de estas moléculas es su hidrofobicidad, es decir, son insolubles en agua. Esta particularidad hace que requieran de mecanismos especiales para su transporte. Concretamente, son transportadas en unas partículas denominadas lipoproteínas, presentes tanto en invertebrados como en vertebrados. Figura 4. Clasificación general de las lipoproteínas de mamíferos. Se muestran las diferentes clases de lipoproteínas (HDL, LDL, VLDL y quilomicrones) clasificadas según su densidad. El tamaño puede oscilar entre los 5 nm de las HDL hasta los 1200 nm de los quilomicrones (las lipoproteínas no están representadas a escala). Cada lipoproteína está formada por una capa externa compuesta por una monocapa de fosfolípidos (PL), colesterol libre (CH), y una o varias clases de apolipoproteínas. En su interior se localizan principalmente los triacilglicéridos (TG) y los ésteres de colesterol (CE). El contenido lipídico varía según el tipo de lipoproteína, por ejemplo, las LDL están formadas principalmente de ésteres de colesterol, sin embargo, los quilomicrones de triacilglicéridos. Tomada y modificada de Thaxton et al., 2016. Las lipoproteínas son complejos macromoleculares generalmente globulares compuestos por lípidos y proteínas. Los LÍPIDOS están empaquetados en un núcleo hidrofóbico que contiene INTRODUCCIÓN 37 lípidos neutros (triacilglicerol, ésteres de colesterol y pequeñas cantidades de colesterol libre y otros lípidos, como pueden ser vitaminas liposolubles) y que están rodeados por una monocapa anfipática compuesta de fosfolípidos y colesterol libre. Las PROTEÍNAS que forman parte de las lipoproteínas se denominan apolipoproteínas y son esenciales para estabilizar y regular estas partículas. Estas proteínas se clasifican en dos grandes grupos: intercambiables y no intercambiables. Las no intercambiables son un componente integral de la partícula y no se pueden extraer sin destruir el complejo. Las principales son ApoB-100 y ApoB-48, presentes en la mayoría de lipoproteínas, de gran tamaño e insolubles en agua. Por otra parte, las apolipoproteínas intercambiables ApoA-I, ApoA-II, ApoC o ApoE son de menor tamaño y poseen cierta solubilidad en agua. Se incorporan o extraen de las lipoproteínas de forma dinámica durante la vida de las mismas. En mamíferos las lipoproteínas se sintetizan en el retículo endoplasmático de enterocitos y hepatocitos a la vez que ocurre su lipidación con la ayuda de un cofactor denominado MTP (del inglés, Microsomal Triglyceride transfer Protein) (Olofsson et al., 1999). Existen una amplia variedad de lipoproteínas según su densidad (Figura 4). Dependiendo del contenido relativo de lípidos y proteínas se clasifican en: Quilomicrones (CM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). En insectos la lipoproteína más abundante es la lipoforina (Lp), la cual describiremos extensamente más adelante. 5.2. Metabolismo de los TAG en mamíferos (quilomicrones, remanentes de quilomicrones y VLDL) Los triacilglicéridos (TAG) son la mayor reserva energética del organismo. Este lípido está compuesto por una molécula de glicerol esterificada por sus grupos hidroxilos a tres ácidos grasos, los cuales pueden ser saturados o insaturados y de longitud variable (Figura 5A). Esta molécula altamente energética es totalmente hidrofóbica, por tanto, no forma ni micelas ni bicapas como otros lípidos. Esto le permite ser almacenadas en grandes cantidades sin alterar el funcionamiento normal de la célula (Farese and Walther, 2009). Figura 5. Estructura y composición de las inclusiones lipídicas (LD). (A) Representación estructural de un triacilglicérido (TAG), compuesto por una molécula de glicerol (rojo) esterificado a tres ácidos grasos (gris). (B) Características estructurales de una inclusión lipídica. El núcleo lo componen TAG y ésteres de colesterol (CE). Este núcleo se encuentra rodeado por una monocapa de fosfolípidos que contiene además de colesterol, varias proteínas en su superficie. Tomada y modificada de Krahmer et al., 2009 (snapshot). INTRODUCCIÓN 38 Los TAG se almacenan intracelularmente en inclusiones lipídicas, denominadas en inglés Lipid Droplets (LD) (Figura 5B). Estos compartimentos intracelulares tienen similitudes con las lipoproteínas, ya que están compuestos por un núcleo de lípidos neutros rodeados por una monocapa de lípidos anfipáticos (fosfolípidos y colesterol). No obstante, difieren en su mayor tamaño (entre 1-100 mm), localización (citosol) y las proteínas de su superficie, ya que en lugar de apolipoproteínas contienen otras proteínas específicas para la regulación de sus funciones. Metabolismo de las lipoproteínas ricas en TAG: En las sociedades occidentales existe una relación directa entre niveles altos de lípidos en sangre y el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares (Nordestgaard et al., 2007). Por esta razón, se ha experimentado un renacimiento en el estudio de las lipoproteínas y su regulación. El metabolismo de las lipoproteínas ricas en TAG sigue principalmente dos rutas: exógena y endógena. En la primera de ellas, los lípidos procedentes de la ingesta se encapsulan en lipoproteínas muy ricas en TAG en el intestino (quilomicrones, CM) para su distribución por el cuerpo a través del torrente linfático y sanguíneo. En la ruta endógena, se producen las partículas VLDL en el hígado durante condiciones de ayuno. Posteriormente, estas lipoproteínas se transportan por el torrente sanguíneo a los tejidos periféricos como fuente de energía entrando en el ciclo de la β oxidación o almacenándose en el tejido adiposo (Fielding and Fielding, 2008). En la RUTA EXÓGENA (Figura 6, panel izquierdo), la hidrólisis de los lípidos provenientes de la dieta se inicia en el estómago mediante las lipasas gástricas después de su emulsificación por las sales biliares, produciéndose ácidos grasos libres y 2-monoacilglicerol. Estos compuestos pasan al interior de las células del intestino (enterocitos) a través de transportadores de ácidos grasos localizados en su membrana. En estas células, los ácidos grasos y el colesterol son re-esterificados a TAG y a ésteres de colesterol en el RE por la acción de las enzimas Acil coenzima A diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) y Acil CoA: colesterol aciltransferasa (ACAT) respectivamente. Ambos productos son empaquetados en quilomicrones (CM) junto con la Apolipoproteína B-48. Posteriormente, se adicionan las apolipoproteínas intercambiables ApoE, ApoC-II y ApoC-III. La síntesis de los quilomicrones es un proceso complejo que requiere la actividad de cofactores específicos como el MTP (del inglés, Microsomal Trigliceride Transfer Protein), proteína de la familia de la ApoB. Una vez sintetizados, los CM pasan al sistema linfático y de ahí al sistema circulatorio donde son transportados a los tejidos diana (músculo esquelético o tejido adiposo). En ellos, los CM interaccionan con la pared endotelial de los microcapilares, rica en la enzima lipasa de lipoproteínas (LPL, del inglés, Lipoprotein Lipase). Esta enzima es activada por la ApoC-II presente en los CMs, promoviendo de esta manera la hidrólisis de los TAG y la liberación de los ácidos grasos que son transportados a través del endotelio para posteriormente ser metabolizados en las células de los tejidos periféricos (Hagberg et al., 2010). El contenido en TAG de esas partículas se va reduciendo progresivamente, disminuyendo de tamaño y aumentando su densidad, y generándose de esta manera los denominados remanentes de quilomicrones (CMR, del inglés, Chylomicron Remnant). Los CMR son transportados por el torrente circulatorio hacia el hígado para ser eliminados mediante receptores específicos presentes en la superficie de los hepatocitos: el receptor LDLR y de forma redundante, el receptor LRP1 (Fielding, 2008). Los CMR interaccionan con el receptor mediante la ApoE que contienen y son internalizados por endocitosis y catabolizados en los lisosomas por la lipasa ácida. Estos CMR son ricos en ésteres de colesterol que son liberados en los hepatocitos y reutilizados para la formación de sales biliares y excretados en la bilis o incorporados a las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) generadas en el hígado. INTRODUCCIÓN 39 Figura 6. Esquema general de las vías endógenas y exógenas del metabolismo de los triacilglicéridos (TAG) en mamíferos. El TAG presente en circulación puede originarse a partir de dos vías diferentes, la vía endógena y la exógena. La exógena se inicia en el intestino, donde se generan quilomicrones ricos en TAG a partir de los lípidos dietarios. La vía endógena se inicia en el hígado, donde se generan las lipoproteínas VLDL. LPL (Lipoproteína Lipasa), FFA (ácidos grasos libres). Tomada de Fauci et al., 2008. En la RUTA ENDÓGENA (Figura 6, panel derecho) se transportan TAG y colesterol a los tejidos periféricos en condiciones de ayuno. En el hígado se sintetizan TAG y ésteres de colesterol utilizando como sustrato ácidos grasos y carbohidratos. A continuación, éstos se empaquetan en lipoproteínas de muy baja densidad o VLDL. Su síntesis y secreción ocurre de manera similar a los quilomicrones y también requiere de la acción de MTP en el RE. Sin embargo, la isoforma de la ApoB que los constituye es ApoB-100. Las lipoproteínas VLDL son liberadas al torrente circulatorio, donde son procesadas en los microcapilares por las lipasas de lipoproteínas (LPL) de forma semejante a los quilomicrones, liberando ácidos grasos libres y glicerol a los tejidos periféricos. Una vez procesadas, pasan a ser remanentes de VLDL, o también denominadas IDL (lipoproteínas de densidad intermedia), siendo de menor tamaño y más densas, las cuales son eliminadas de la circulación en el hígado gracias a los receptores LDLR que se localizan en la superficie de los hepatocitos. Las IDL pueden también ser procesadas en mayor grado INTRODUCCIÓN 40 por lipasas hepáticas (HL, del inglés Hepatic Lipase), una enzima extracelular localizada en el endotelio de los sinusoides hepáticos y en la superficie de los hepatocitos, formando partículas muy ricas en colesterol denominadas lipoproteínas de baja densidad o LDL, siendo aún más densas y de menor tamaño que las anteriores. Como hemos comentado en el apartado anterior la mayor parte de las partículas LDL son eliminadas por el hígado gracias a la interacción con los receptores LDLR. El resto de LDL libre en el organismo es retirado por células extra-hepáticas por una vía de receptores escavenger. 5.3. Metabolismo del colesterol en mamíferos y proteínas de transferencia de lípidos (CETP) y fosfolípidos (PLTP) Las principales lipoproteínas encargadas de transportar el colesterol son las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL). Estas últimas son las más pequeñas y las más densas de todas. Se sintetizan tanto en el intestino como en el hígado y tienen una morfología completamente diferente al resto de lipoproteínas, siendo achatadas en lugar de esféricas (Figura 4, preβ-HDL). Principalmente contiene Apolipoproteína A-I (ApoA-I) en su superficie (entre 1-4 moléculas), además de ApoA-II, ApoA-IV, ApoC y ApoE. La lipoproteína HDL se encarga de recoger el colesterol libre de los tejidos periféricos y llevarlos de vuelta al hígado, donde será procesado para excretarlo en la bilis. A este proceso se le conoce como transporte reverso del colesterol (Fielding and Fielding, 1995). El colesterol no esterificado acumulado en los tejidos periféricos se libera al exterior celular a través de transportadores específicos presentes en la membrana, principalmente ABCA1 (del inglés, ATP-bindind Cassette transporter) (Figura 7). Este transportador media la unión de partículas ricas en ApoA circulantes a la superficie celular y su lipidación mediante la transferencia de colesterol. En las HDL (denominadas en este caso preβ-HDL) se esterifica dicho colesterol libre por la acción de una enzima asociada a ella denominada Lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT) que es activada por la ApoA-I. Esta enzima cataliza la transferencia de un ácido graso procedente de la fosfatidilcolina (PC) al colesterol para crear un éster de colesterol, los cuales ocuparán el núcleo de la partícula. Esta reacción necesita un aporte continuo de fosfolípidos (principalmente PC), que se obtienen desde otras lipoproteínas circulantes mediante la acción de la proteína de transferencia de fosfolípidos o PLTP. Concretamente, media la transferencia de fosfolípidos desde las lipoproteínas que transportan TAG (CM, CMR y VLDL) hacia las HDL durante la lipolisis de estos triglicéridos (Huuskonen et al., 2001). Además de transferir fosfolípidos, es capaz de ceder otros componentes anfipáticos como colesterol libre, lipopolisacáridos (LPS) y vitamina E (Hailman et al., 1996 y Jiang et al., 2002). Tanto mutaciones en ABCA1 como en PLTP producen dislipidemias. La pérdida de función en ambos alelos del gen de ABCA1 en humanos y ratones produce una deficiencia en HDL y la acumulación de colesterol en macrófagos de tejidos periféricos, la denominada enfermedad de Tangier (Ceccani et al., 2016). La ausencia de PLTP en ratones provoca una reducción del 60% de lípidos y de ApoA-I en HDL (Jiang et al., 1999). No obstante, no se han encontrado deficiencias genéticas en humanos del gen de PLTP. Una vez que la HDL se ha cargado de ésteres de colesterol y tras sucesivos ciclos, la partícula va agrandándose y adoptando una forma esférica transformándose en HDL3. La cual, circula en plasma para seguir recibiendo colesterol y fosfolípidos de otras lipoproteínas. INTRODUCCIÓN 41 Figura 7. Metabolismo de las HDL y transporte reverso del colesterol. La ApoA-I se sintetiza tanto en el hígado como en el intestino y posteriormente es liberada al torrente sanguíneo. Allí se genera preβ-HDL que circula hasta que se une al receptor ABCA1 de macrófagos o de cualquier tejido periférico. La unión promueve la activación de la enzima colesterol éster hidrolasa (CEH) liberando y transfiriendo colesterol a la superficie de la partícula HDL. El colesterol libre es re-esterificado por la lecitina colesterol aciltransferasa (LCAT) y acumulado en el interior de la partícula HDL. Durante este proceso la lipoproteína pobre en lípidos HDL3 pasa a HDL2. Este proceso (HDL2 a HDL3) puede ser invertido por la acción de las lipasas hepáticas (HL) y la transferencia de fosfolípidos mediante el transportador PLTP. En el torrente sanguíneo, la proteína de transferencia de ésteres de colesterol o CETP permite el intercambio de parte de los ésteres de colesterol a otras lipoproteínas VLDL, IDL y/o LDL y a su vez la transferencia de triacilglicéridos a los HDL. También tiene lugar la transferencia de fosfolípidos a través del transportador específico PLTP desde las lipoproteínas anteriores hacia las HDL. Las lipoproteínas VLDL, IDL y LDL pueden ser endocitadas en el hígado a través de los receptores LDLR donde serán procesadas. Las partículas HDL2 cargadas de ésteres de colesterol, se unen a los receptores SRB1 presentes en el hígado para su procesamiento por lipasas hepáticas y su posterior eliminación. Una vez que descargan su contenido lipídico, las preβ-HDL o HDL3 se liberan y vuelven a la circulación para repetir el ciclo. LPL: lipoproteína lipasa. Modificada de Varici, 2016. Los ésteres de colesterol generados por LCAT en HDL3 pueden ser transferidos por un transportador específico CETP (del inglés, cholesteryl ester transfer protein) a otras lipoproteínas: VLDL, IDL, ó LDL y viceversa (Hesler et al., 1987). De esta manera, las lipoproteínas VLDL, IDL y LDL se enriquecen en ésteres de colesterol, mientras que las HDL3 lo hacen en TAG, generándose la subespecie HDL2 (HDL maduro). CETP es una glicoproteína plasmática de 476 aminoácidos (76 kDa) producida en el hígado y en el tejido adiposo. Su estructura está relacionada con la proteína PLTP, con un 25% de similitud en su secuencia. Las personas que INTRODUCCIÓN 48 Otros estudios realizados en condiciones más cercanas a las fisiológicas han examinado el papel del LTP en la transferencia de lípidos entre tejidos y la lipoforina. Por ejemplo, tejidos tales como el cuerpo graso (tanto adulto como larvario) o sacos del intestino medio de Manduca sexta conteniendo lípidos marcados, se incubaron con lipoforina purificada (HDLp), y se observó una transferencia de lípidos hacia la lipoforina dependiente del LTP, ya que esta actividad se inhibía casi totalmente al tratar los tejidos con un anticuerpo específico contra ApoLTP (α-LTP). Además, esta actividad se restablecía al añadir LTP purificado de la hemolinfa (Van Heusden and Law, 1989; Canavoso et al., 2001, 2004). Hay que resaltar que se observó bidireccionalidad del proceso de transferencia de lípidos en el caso del cuerpo graso larvario y la lipoforina (Canavoso et al., 2004). Estos experimentos llevaron a algunos autores a proponer que la función fisiológica del LTP sería promover la transferencia de lípidos desde el cuerpo graso a lipoforinas circulantes de alta densidad (HDLp) formándose lipoforinas de baja densidad (LDLp) en condiciones de alto requerimiento energético, como por ejemplo durante el vuelo. Estas LDLp cederían su contenido lipídico a tejidos periféricos como el músculo del vuelo (Van Heusden and Law, 1989). Se ha propuesto que el LTP también participa en la acumulación de lípidos en el huevo que ocurre durante la vitelogénesis. Se vio que los oocitos de M. sexta contienen LTP con capacidad de promover el intercambio de lípidos. En este caso, se prepararon extractos de ovarios que habían sido tripsinizados previa a su homogenización para eliminar el LTP que pudiera estar asociado a las superficies celulares. Estos extractos de ovarios promovían la transferencia de lípidos desde HDLp al LDL humano, produciendo lipoforinas de muy alta densidad (VHDLp). En este trabajo concluían que existe una fracción de LTP que se encuentra dentro de los oocitos. La función de este LTP podría consistir en mediar la extracción de lípidos de las HDLp endocitadas por el oocito para su almacenaje en el huevo y su transformación a VHDLp, que también se acumula dentro del oocito (Liu and Ryan, 1991). Esta transferencia de DAG desde la lipoforina hacia ovariolas también fue observada en Bombyx mori (Jouni et al., 2003). El mecanismo de acción del LTP se ha comparado con la proteína de transferencia de ésteres de colesterol humana o CETP, que recordemos que permite el intercambio tanto de ésteres de colesterol como de TAG entre distintas lipoproteínas formando un complejo ternario entre ellos (Charles and Kane, 2012). En este sentido, ha habido cierta controversia a la hora de determinar si el LTP forma un complejo ternario entre el donador y el aceptor o si actúa como intermediario entre ambas partículas. Para solventar este asunto se realizaron una serie de experimentos in vitro en Manduca sexta donde las lipoproteínas donadoras y el aceptoras de lípidos estaban físicamente separadas. Cada tipo de lipoforina estaba unida covalentemente a una matriz de sefarosa en columnas distintas pero conectadas en serie, entre las cuales se hacía circular tampón con o sin LTP (como control) (Blacklock et al., 1992). En la primera columna se fijó la lipoforina con lípidos tritiados [3H-DAG]-HDLp y en la segunda el aceptor, la partícula LDL humana. Cuando circulaba entre ellas el tampón con concentraciones crecientes de LTP, se observó como esta lipoproteína era capaz de transferir los lípidos desde el donador hasta el aceptor LDL. Esta transferencia no tenía lugar con tampón sin LTP (Blacklock et al., 1992). Todos los resultados obtenidos dieron lugar a la misma conclusión, la transferencia de lípidos entre el donador y el aceptor mediante el LTP no requería la formación de un complejo ternario. Por lo tanto, el LTP actúa como intermediario entre ambas partículas. Para complementar el mecanismo de acción, se realizaron estudios específicos de inhibición con diferentes anticuerpos. En ellos se pudo concluir que tanto ApoLTP-I como ApoLTP-II son importantes para la función catalítica del LTP (Blacklock and Ryan, 1995; Van Heusden et al., 1996). INTRODUCCIÓN 49 Como esta tesis está centrada en el metabolismo lipídico de Drosophila melanogaster, vamos a exponer algunos estudios sobre el LTP en este organismo modelo con mayor profundidad. En Palm et al., 2012, se purificaron las distintas lipoproteínas presentes en la hemolinfa de larvas de Drosophila. Además de la ya conocida lipoforina, se identificó el LTP y crossveinless d (cvd) (Figura 12A). El LTP de Drosophila tiene una densidad parecida al LTP del resto de insectos (~1,23 mg/ml) y su cantidad en la hemolinfa es hasta 10 veces menor con respecto a la lipoforina (Figura 12B). Figura 12. Fenotipo de falta de función del LTP en Drosophila melanogaster. (A) Representación de las proteínas de moscas y humanos conteniendo el dominio vitelogenina (marcado en verde). En Drosophila existen dos homólogos de la ApoB: ApoLpp y ApoLTP, además de MTP y cv-d más divergentes. En humanos, sólo existe un gen apoB que da lugar a ApoB-100 y ApoB-48, y un gen para MTP. Tanto ApoLpp como ApoLTP, sufren un procesamiento por una furina que da lugar a dos polipéptidos denominados ApoLpp-I, ApoLpp-II, y ApoLTP-I, ApoLTP-II, respectivamente (marcas rojas). Los números en el interior de las cajas definen el número de aminoácidos (aa) totales predicho para ese polipéptido. Los números debajo de las cajas definen los aminoácidos correspondientes a cada dominio marcado. (B) Tinción de plata de un gel mostrando las lipoproteínas de la hemolinfa de larvas en el tercer estadio del desarrollo después de ser fraccionadas por gradiente de KBr. (C) Inmunotinción del intestino procedente de larvas silvestres en segundo estadio larvario. La lipoforina (Lp) está marcada en azul, el LTP en rojo y los lípidos en verde (Nile red). El asterisco señala un fragmento de cuerpo graso, DG: divertículos gástricos, IMA: intestino medio anterior, IMP: intestino medio posterior, TM: túbulos de Malpighi e IP: intestino posterior. Barra de escala: 200 μm. (D) Inclusiones lipídicas de la región posterior del intestino medio (IMP) bajo el silenciamiento por ARNi de apoLp, apoLTP y apoMTP. Los lípidos están marcados con Nile red en amarillo. Barra de escala: 50 μm. Imágenes tomadas y modificadas de Palm et al., 2012. Tanto la Apolipoforina como la ApoLTP son homólogas de ApoB de mamíferos. En mamíferos las lipoproteínas se sintetizan tanto en el hígado como en el intestino. Sin embargo, en INTRODUCCIÓN 50 Drosophila y Manduca sexta, se ha demostrado que el LTP se sintetiza en el cuerpo graso de manera dependiente del MTP, pero no en el intestino (Palm et al., 2012 y Van Heusden et al., 1996). No obstante, tal y como se muestra en la Figura 12C, el LTP está presente en el intestino, mayoritariamente en el intestino medio posterior (IMP) y los divertículos gástricos (DG), regiones donde tiene lugar una mayor acumulación de lípidos. En Panáková et al., 2005 se observó como el silenciamiento del gen de la apolipoforina por ARN interferente producía una acumulación de inclusiones lipídicas en el intestino. De forma similar, al bloquear la función de MTP o de apoLTP mediante ARN interferente, se producían fenotipos similares consistentes en un aumento en el tamaño y número de las inclusiones lipídicas en el intestino medio y más moderadamente en los divertículos gástricos, revelando el posible papel del LTP en el metabolismo lipídico (Figura 12D). Con respecto a su función fisiológica, en Palm et al., 2012, observaron que al igual que en Manduca sexta (Canavoso et al., 2001), el LTP de Drosophila melanogaster facilitaba la transferencia de lípidos desde el intestino a la lipoforina circulante. En estos experimentos, estudiaron el contenido lipídico de las lipoforinas tras incubar in vitro intestinos procedentes de larvas deficientes para LTP ya sea con hemolinfa obtenida de larvas silvestres o de larvas deficientes para el LTP. Como el contenido lipídico de las lipoforinas procedentes de larvas deficientes para LTP es bajo, utilizaron como control larvas silvestres mantenidas en ayunas, que igualmente muestran lipoforinas de bajo contenido lipídico. Se observó como sólo en el primer caso disminuía la densidad de las lipoforinas debido a la incorporación de lípidos desde el intestino, indicando la necesidad del LTP para este proceso. Respecto al mecanismo de acción del LTP, vieron que éste debía de ser internalizado mediante endocitosis para que la movilización de los lípidos en los enterocitos tuviera lugar. Al inhibir la endocitosis en el intestino mediante la expresión de una forma de la dinamina dominante negativa, se observó como las inclusiones lipídicas aumentaron de tamaño, al igual que ocurre al bloquear la lipoforina o el LTP de forma sistémica. Esto, junto con el hecho que el LTP se detecta en el interior de los enterocitos por inmunofluorescencia, sugiere que la endocitosis del LTP es necesaria para la transferencia de lípidos desde el intestino a la lipoforina circulante. Sorprendentemente, la lipoforina nunca se observa en el interior de los enterocitos. En resumen, estos trabajos han mostrado que tanto el LTP como la lipoforina se sintetizan en el cuerpo graso y para ello requieren de MTP, una proteína del retículo endoplasmático con funciones de chaperona. Posteriormente, lipoforina y LTP son secretados a la hemolinfa. En el intestino, se produce la endocitosis del LTP, mientras que la lipoforina se localiza en la superficie de los enterocitos. Por un mecanismo no aclarado, la lipoforina se carga de lípidos mediante un proceso dependiente de LTP. Algo parecido podría ocurrir en el cuerpo graso en condiciones que inducen la movilización de lípidos. Esta lipoforina cargada es transportada hacia otros tejidos periféricos donde puede ceder su carga lipídica en un proceso que también podría requerir del LTP. Es importante resaltar el recientemente descubierto papel del LTP en el sistema nervioso de Drosophila. En este caso el LTP actúa como un intermediario que informa al cerebro del estado nutricional del organismo, en particular, de la entrada de lípidos durante la ingesta. El LTP puede atravesar la barrera hematoencefálica gracias a los receptores LRP1 y Megalin que median su transcitosis. Posteriormente, se ha visto que se acumula en varias neuronas que establecen sinapsis con células neurosecretoras productoras de péptidos similares a la insulina (ILPs), induciendo su liberación a la hemolinfa de forma dependiente de la dieta (Brankatschk et al., 2014). INTRODUCCIÓN 51 Receptores de lipoforinas Los receptores de lipoforinas son ortólogos a los receptores LDLR de mamíferos. En estudios clásicos se observó la capacidad de estos receptores para internalizar partículas de lipoforina mediante endocitosis en el cuerpo graso de Manduca sexta y en células de mamífero en cultivo transfectadas con estos receptores (Tsuchida and Wells, 1990; Dantuma et al., 1999, respectivamente). Posteriormente, estos receptores fueron caracterizados molecularmente en otros insectos como por ejemplo, Aedes aegypti (Cheon et al., 2001; Seo et al., 2003), Galleria mellonella (Lee et al., 2003a,b), Bombyx mori (Gopalapillai et al., 2006), Blatella germanica (Ciudad et al., 2007), Apis mellifera (Guidugli et al., 2008) y Leucophaea maderae (Tufail et al., 2009). Figura 13. Patrón de expresión de los receptores de lipoforinas y su implicación en la toma de lípidos. La distribución del receptor se muestra en gris mediante el anticuerpo específico α-Lpr2 en discos imaginales de ala (A) y ovarios (B) silvestres. En los ovarios, Lpr2 se acumula en las membranas de las células nutricias (n) y del oocito (o) (recuadro amarillo, flecha) del estadio 11 y 10 respectivamente. (C-D) Acumulación de lípidos neutros en amarillo marcados con Nile red en la región que da lugar al ala adulta en discos imaginales de ala silvestre (C) y en la cámara del huevo en estadio 10 de ovarios silvestres (D). La falta de función de ambos receptores Lpr1 y Lpr2, en discos imaginales (E) y ovarios (F) muestra como el contenido lipídico disminuye drásticamente. Barras de escala: 100 μm. Tomadas y modificadas de Parra- Peralbo and Culi, 2011. En Drosophila melanogaster se identificaron dos genes con una alta homología a los receptores LDLR, el lipophorin receptor 1 (lpr1) y el lipophorin receptor 2 (lpr2). Estos receptores se expresan INTRODUCCIÓN 52 en tejidos que acumulan gran cantidad de lípidos. Entre ellos destacan los discos imaginales de ala expresándose en la zona que da lugar al ala adulta (Figura 13A), y en ovarios donde se acumula en las membranas de las células nutricias y del oocito (Figura 13B). En el ovario empiezan a detectarse en el estadio 8 coincidiendo con el comienzo de la vitelogénesis, siendo máxima su expresión en el estadio 10. Los receptores de lipoforinas son esenciales para la toma de lípidos en ovarios y discos imaginales de ala, ya que en tejidos mutantes para estos receptores (Df(3R)lpr1/lpr2) se aprecia una fuerte disminución de la acumulación de inclusiones lipídicas intracelulares (Figura 13 Comparar C-D con E-F). Si bien estas moscas doble mutantes son viables en homocigosis, las hembras adultas presentan un fenotipo de esterilidad debido a la atrofia de los ovarios (Parra-Peralbo and Culi, 2011). Figura 14. Los receptores de lipoforinas codifican múltiples isoformas generadas por el uso de dos promotores diferentes y por splicing alternativo. Estructura modular de las distintas isoformas de lpr1 y lpr2, mostrando la correspondencia entre dominios proteicos y exones (rectángulo azul arriba). Las regiones UTR están marcadas en gris. Las isoformas transcritas desde el PD y PP están resaltadas en rojo y verde respectivamente. Tomada y modificada de Parra-Peralbo and Culi, 2011. En Drosophila, lpr1 y lpr2 tienen una disposición en tándem en el tercer cromosoma. Ambos genes tienen 15 exones que están organizados de forma similar (Figura 14), de manera que los exones que ocupan posiciones equivalentes codifican para los mismos dominios proteicos. Asimismo, existen dos promotores distintos para cada gen, un promotor proximal (PP) y un promotor distal (PD), refiriéndose a su posición relativa con el centrómero del cromosoma. Estos genes generan múltiples isoformas dependiendo del promotor utilizado y de eventos de INTRODUCCIÓN 53 splicing alternativo. Las isoformas se diferencian entre ellas en tres características fundamentales: la primera de ellas es el número e identidad de los dominios LA, que definen su función; la segunda es la presencia de una mayor o menor región de O-glicosilación próxima al dominio transmembrana, que también ocurre en otras especies como por ejemplo, Aedes aegypti (Seo et al., 2003a), Bombyx mori (Gopalapillai et al., 2006) y Blatella germanica (Ciudad et al., 2007), y la tercera es la presencia de un dominio N-terminal sin homología con otras proteínas o dominios. Mediante experimentos de rescate, en los que se sobre-expresaron las distintas isoformas así como quimeras artificiales generadas a partir de estas isoformas, en una región concreta del disco imaginal de ala o en los ovarios y en fondo mutante para ambos receptores (Df(3R)lpr1/2), se estableció que sólo las isoformas de lpr1 y lpr2 transcritas desde promotor distal son capaces de mediar la toma de lípidos. Asimismo, se determinó que el dominio LA1 era crítico para que la adquisición de lípidos tuviera lugar (Figura 15). Este dato es muy relevante para el desarrollo de esta tesis doctoral. Figura 15. El dominio LA1 es esencial para la toma de lípidos. (A-C) Expresión de los receptores de lipoforinas en el compartimento posterior de discos de ala mutantes para lpr1 y lpr2. Los lípidos neutros se muestran en verde y en un canal desglosado, en gris. (A) UAS-lpr2E (B) UAS-lpr2F y (C) UAS-lpr2F+LA1. La adición del dominio LA1 a la isoforma Lpr2F es suficiente para que obtenga la capacidad de mediar la toma de lípidos. Barra de escala: 100 μm. Tomada y modificada de Parra-Peralbo and Culi, 2011. En Drosophila la toma de lípidos es un proceso independiente de la endocitosis. Así, al bloquear la endocitosis generando clones en la línea germinal de mutantes nulos de Rab5, un importante mediador de las vesículas endocíticas tempranas, las cámaras del huevo mostraron una acumulación normal de inclusiones lipídicas intracelulares tanto en el oocito como en las células nutricias (Figura 16A y B). El modelo actual para la función de los receptores de lipoforinas propone que éstos estimulan la toma de lípidos actuando a nivel extracelular (Parra-Peralbo and Culi, 2011), INTRODUCCIÓN 54 de forma semejante a como se ha descrito para la toma de lípidos neutros en el endotelio vascular de mamíferos y que hemos discutido en apartados previos (Dallinga-Thie et al., 2010). Esta hipótesis se apoya en el hecho de que, como hemos comentado, no se requiere de la endocitosis, y por otro lado, se vio que los receptores de lipoforinas tenían un efecto no autónomo celular. Es decir, al expresar los receptores en discos imaginales de ala o en la línea germinal de ovarios en fondo mutante (Df(3R)lpr1/lpr2), se observó como la acumulación de inclusiones lipídicas tuvo lugar no sólo en las células que expresaban los receptores, sino también en las células adyacentes que no lo expresaban (Figura 16C y D). Figura 16. El proceso de adquisición de lípidos en Drosophila es independiente de endocitosis. (A) Cámara del huevo en estadio 10 de fenotipo silvestre. Los lípidos están marcados en rojo mediante Nile red y los núcleos en azul con DAPI. Obsérvese la acumulación de lípidos (flecha) en las células nutricias (n) y la autoflorescencia de las proteína Yolk en el oocito (o) en azul. (B) Cámara del huevo cuya línea germinal es mutante para rab5. Los lípidos neutros (flecha) se acumulan en las células nutricias de manera similar a como ocurre con el genotipo silvestre. Por el contrario, las proteínas Yolk no están presentes en el oocito, confirmando que la endocitosis está bloqueada en fondo mutante en rab5. (C-D) Expresión ectópica de Lpr2E en el compartimento posterior del disco imaginal de ala Df(3R)lpr1/2, mediante en-Gal4. La distribución de Lpr2E fue detectada con α-HA y se muestra en verde. La distribución de las lipoforinas se muestra en magenta, marcando los contornos celulares. (C) Sección transversal del disco con la parte apical arriba y la basal abajo. Los lípidos neutros (rojo) se detectaron con Nile red. (D) Una sección basal del mismo disco. Nótese que las células que expresan Lpr2E y también dos filas de células adyacentes que no lo expresan, acumulan altos niveles de inclusiones lipídicas localizadas en un plano basal. Una línea blanca indica el límite de expresión de Lpr2E. Observándose que el proceso de adquisición de lípidos celular llevado a cabo por los receptores es por un efecto no autónomo. Barras de escala: 100 μm (A-C) 10 μm (D). Tomadas y modificadas de Parra-Peralbo and Culi, 2011. Finalmente, es importante destacar que las isoformas transcritas desde el promotor distal tienen péptidos señal atípicamente largos (68 y 88 aminoácidos para lpr1 y lpr2, respectivamente) comparados con los transcritos desde el promotor proximal de 20 (lpr1) y 24 (lpr2) aminoácidos. Como en esta tesis doctoral vamos a prestar especial atención al papel de los péptidos señal de los receptores de lipoforinas, a continuación introducimos su estructura y función. INTRODUCCIÓN 55 6. Estructura de los péptidos señal y sus funciones El péptido señal (SP) es una secuencia situada en el extremo N-terminal de algunas proteínas que las lleva a entrar en la vía secretora, principalmente proteínas transmembranas y proteínas secretadas. La mayoría están constituidos por entre 15-30 aminoácidos. Sin embargo, existen algunos péptidos señal de mayor extensión, llegando a tener incluso más de 100 aminoácidos (Hegde and Bernstein, 2006). A pesar de no haber homología de secuencia entre péptidos señal como se muestra en la Figura 17A, la mayoría presentan una estructura similar. Se distinguen tres regiones distintas, n, h y c: la región N-terminal (n) de longitud variable y caracterizada por contener aminoácidos pequeños con una carga neta positiva, es la que contribuye a la variación respecto a la longitud. A continuación, la región central, siendo una región hidrofóbica (h) con una extensión de entre 7-15 aminoácidos, es la parte esencial del péptido señal para el targeting y la inserción en la membrana del retículo endoplasmático. Y finalmente, la región C-terminal (c), de menor tamaño con 3-7 aminoácidos, entre ellos se encuentra una secuencia consenso que consiste en un aminoácido de cadena corta en la posición -1 y uno no cargado en la posición -3, que determinan el sitio de corte por la enzima Signal peptidase (SPase), en la posición 0. La función principal del péptido señal es mediar el transporte de la proteína secretada o de membrana que está iniciando su traducción a la membrana del RE. A este proceso se le denomina targeting (Walter and Johnson 1994) (Figura 17B). Puede realizarse por una vía dependiente o una independientemente de la ribonucleoproteína SRP (del inglés, Signal Recognition Particle). El SRP se une al péptido señal por su región h y lo lleva hacia la membrana del RE, donde se produce la unión del SRP con su receptor. Ello lleva a la inserción del péptido señal en el translocón, un complejo de proteínas heterotriméricas que media el paso de polipéptidos a través de la membrana del RE, quedando la región n en el lado citosólico y la región c en el lumen del retículo (topología II). A continuación, se prosigue con la traducción de la proteína por los ribosomas. El péptido señal debe escindirse de la proteína traducida. Este procesamiento lo realiza la SPase y suele ocurrir normalmente de forma co-traduccional. Se ha descrito que después de sufrir este procesamiento, el péptido señal puede seguir varias rutas: degradarse, quedarse anclado en la membrana o liberarse al citoplasma donde puede ejercer una función. Si bien la función principal del péptido señal es la de guiar a la proteína que está iniciando su traducción hacia la membrana del RE, también se ha visto que puede afectar a la interacción con el translocón o regular la eficiencia con la que se inserta en la membrana (Kim et al., 2002; Ott and Lingappa, 2004). Después de ser procesadas por la SPase, los péptidos señal quedan insertados en la membrana del RE. Algunas veces estos pueden sufrir un procesamiento adicional en la región hidrofóbica (h) por la enzima Signal Peptide Peptidase (SPPase). Esta enzima es un miembro de las proteasas aspárticas y está relacionada con la preselinina (la subunidad proteolíticamente activa del complejo de la gamma-secretasa). Al igual que la SPase, se localiza en el RE. El corte del péptido señal por la SPPase lleva a la liberación de péptidos para su posterior degradación (Kilic et al., 2010) o estos podrían ser bioactivos y tener nuevas funciones (Kapp et al., 2009). En Drosophila, existe un homólogo poco caracterizado para esta enzima cuya pérdida de función produce letalidad larvaria y defectos en el desarrollo de las tráqueas (Casso et al., 2012). Asimismo, la proteína Crumbs de Drosophila, caracterizada por tener un péptido señal largo, ha sido descrita como un sustrato para la SPPase, aunque se desconoce si los péptidos INTRODUCCIÓN 56 que se generan a partir del péptido señal de Crumbs poseen una función adicional (Kilic et al., 2010). En vertebrados, la SPPase está implicada en la regulación del sistema inmune y participa en la maduración de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis C, entre otras (Moriishi, 2017). Por tanto es considerada una diana terapéutica para enfermedades virales. Figura 17. Estructura y mecanismo de acción de los péptidos señal. (A) Representación esquemática de la estructura del péptido señal, compuesto de tres partes bien diferenciadas: (n) extremo N-terminal, (h) región hidrofóbica y (c) extremo C-terminal. Debajo se muestran algunos ejemplos. (B) Esquema general de la función del péptido señal. Al iniciarse la traducción de una proteína que contiene un péptido señal, éste interacciona con la proteína de reconocimiento de señal o SRP que la guía hacia el RE al unirse con el receptor SRP. Allí el ribosoma facilita la entrada del péptido señal hacia el interior del translocón y tiene lugar la finalización de la traducción de la proteína. Esto conlleva el procesamiento del péptido señal por una enzima específica denominada signal peptidase, SPase. Tras esto, el fragmento puede seguir diferentes rutas ejerciendo funciones adicionales o degradándose. Tomada y modificada de www.signalpeptide.de. La mayor parte de los péptidos señal que ejercen funciones adicionales al transporte de la proteína hacia el RE, suelen ser de gran longitud. No obstante, no todos los péptidos señal largos presentan una función adicional. A continuación, describiremos algunos ejemplos: - El virus del tumor mamario de ratones (MMTV, del inglés, Mouse Mammary Tumor Virus) es un retrovirus tipo B, causante de carcinomas mamarios y de linfomas de células T (Michalides et al.,1982; Racevskis and Sakar, 1982). La proteína Rem procede de una versión truncada de la proteína envelope (Env) de este virus. Ambas comparten el mismo péptido señal INTRODUCCIÓN 57 cuya extensión es de 98 aminoácidos y el cual contiene una secuencia de localización nuclear (NLS, del inglés, Nuclear Localization Signal) en la región n (1-80) (Figura 18A). El péptido señal es procesado co-traduccionalmente por la enzima SPase, quedando retenida en el retículo y posteriormente liberado al citosol por un proceso independiente a la enzima SPPase. Finalmente, el péptido señal o la proteína completa (gp32Rem + SP) van hacia el núcleo actuando como factores de exportación nuclear para transcritos con intrones (Figura 18B) (Dultz et al., 2008). Figura 18. Ejemplos de péptidos señal que poseen funciones adicionales. (A) Representación esquemática del péptido señal que comparten las proteínas Envelope y Rem del virus del tumor mamario de ratones (MMTV), el cual contiene una secuencia de localización nuclear (NLS) en la región N-terminal. (B) Mecanismo de acción mediante el cual el péptido señal es procesado co-traduccionalmente en la membrana del RE mediante la enzima SPase. El péptido señal resultante es liberado de la membrana y transportado al núcleo donde realiza su función. Tomada y modificada de Dultz et al., 2008. (C) Arriba se muestra el péptido señal de la molécula HLA-A. Las distintas regiones se diferencian según el color: Rojo (n), verde (h) y azul (c). Debajo se expone el proceso mediante el cual se cargan y se presentan los distintos fragmentos de péptidos señal de las MHC-I clásicas por las moléculas HLA–E. Tomada y modificada de Martoglio and Dobberstein, 1998. - El complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I), presenta péptidos a las denominadas células T natural killer (NK) o células T citotóxicas para informar al sistema inmune de que hay una célula infectada por un virus y que éstas puedan reconocerlas y eliminarlas. Este reconocimiento es llevado a cabo por las moléculas clásicas: HLA-A, -B, -C. Por otra parte, la molécula no clásica HLA-E se une selectivamente a fragmentos derivados de la región n del péptido señal de las anteriores: HLA-A, -B o -C. Estos péptidos señal están altamente conservados y son procesados co-traduccionalmente por la SPase y posteriormente por la SPPase en la membrana del RE. El resultado de este último procesamiento es la liberación al citosol de un fragmento de unos 14 residuos conteniendo la región N-terminal y parte de la región hidrofóbica. Este es recortado por el proteosoma. Los fragmentos resultantes son MATERIALES Y MÉTODOS 65 1. GENÉTICA 1.1. Sistema UAS/Gal4/Gal80ts Durante el desarrollo de esta tesis ha sido necesario sobre-expresar múltiples transgenes de manera dirigida y específica, para ello hemos utilizado el sistema UAS/Gal4 (Brand and Perrimon, 1993). Este sistema se basa en el factor de transcripción Gal4 de levaduras que activa la transcripción de genes que contengan las secuencias reguladoras UAS en el promotor (del inglés, Upstream Activation Sequence). Esta secuencia no une ningún factor de transcripción de Drosophila, ni hay en Drosophila secuencias reconocidas por la proteína Gal4 (Figura 19A). Existen multitud de cepas de Drosophila que expresan el factor Gal4 en tejidos con patrones específicos. Por otro lado, se pueden generar cepas con un transgen de interés bajo control de la secuencia reguladora UAS. Por lo tanto, cruzando las dos cepas, la línea activadora Gal4 y la cepa UAS, obtendremos en la descendencia animales con la expresión espacio-temporal deseada de nuestro transgen de interés (Figura 20). Figura 19. Representación del sistema UAS/Gal4/Gal80ts. (A) Esta técnica permite la activación transcripcional del transgen de interés (gen X) regulado por las secuencias UAS, en las células que expresen la proteína Gal4. (B) A 18ºC el represor Gal80ts está unido al factor de transcripción Gal4 impidiendo la transcripción del gen de interés (gen X). En cambio, a 29ºC, la proteína Gal80ts se disocia del Gal4, permitiendo que active la transcripción. Imagen modificada de Muqit and Feany, 2002. Este sistema también nos permite la expresión de ARN interferentes (ARNi) de doble cadena con homología a un gen de interés, pudiendo inducir de esta manera el silenciamiento del mismo en un patrón espacio-temporal definido (Nagel et al., 2002). El sistema UAS/Gal4 se puede utilizar combinado con la proteína Gal80 para proporcionar un mayor control temporal. La proteína Gal80 de levaduras se une al dominio activador de Gal4 e inhibe su actividad (Lue et al., 1987). Existe además un alelo termosensible de esta proteína (Gal80ts) que sólo es funcional a baja temperatura. La expresión ubicua de Gal80ts mediante el promotor del gen de la tubulina permite controlar la actividad del Gal4 simplemente variando la temperatura. Así, a 18ºC el Gal80ts se encuentra inhibiendo la actividad del Gal4, sin embargo, cuando pasamos a temperatura restrictiva (29ºC) el Gal80ts queda inactivado, permitiendo que el Gal4 active la expresión del transgen (McGuire et al, 2003) (Figura 19B). MATERIALES Y MÉTODOS 66 1.2. Cepas de Drosophila Tanto las cepas como los cruces realizados en esta tesis se mantuvieron en un medio de cultivo estándar para Drosophila y en un incubador a 25ºC, salvo excepciones especificadas en cada caso. A continuación, se muestran las cepas utilizadas durante el desarrollo de este trabajo. LÍNEAS UAS Sitio de inserción/#Chr Origen UAS-apoLp-i #2 VDRC UAS-apoLTP-i #3 Rodríguez-Vázquez et al., 2015 UAS-diap1 #3 BDSC UAS-gfp #2 BDSC UAS-hldlr-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo, no publicado UAS-hvldlr-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo, no publicado UAS-lamp1 #2 Pulipparacharuvil et al., 2005 UAS-lpr1D #3 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr1H-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr1J-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr1M-HA 51D/ #2 Esta tesis UAS-lpr2E_ecto-TAP #2 Rodríguez-Vázquez et al., 2015 UAS-lpr2E-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2E-HA-Flag 51D/ #2 Esta tesis UAS-lpr2E-HA-Myc 22A/ #2 Esta tesis UAS-lpr2F_ecto-TAP #2 Rodríguez-Vázquez et al., 2015 UAS-lpr2F-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2F-HA-Flag 51D/ #2 Esta tesis UAS-lpr2F-HA-Myc 22A/ #2 Esta tesis UAS-lpr2F+LA1-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2F+LA1+ED-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2F+LA1+NCN-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2F+NCN-HA 22A/ #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UAS-lpr2F+NCN-HA-Myc 22A/ #2 Esta tesis UAS-Lpr2FrICD-HA #2 Parra-Peralbo, no publicado UAS-perdido-HA #2 Schnörrer et al., 2007 UAS-rab5-GFP #3 Wucherpfenning et al., 2003 UAS-SP(Crb)_lpr2F-HA 22A/ #2 Esta tesis UAS-SP(E)_lpr2F-HA 22A/ #2 Esta tesis UAS-SP(E)_lpr2F-HA-Myc 22A/ #2 Esta tesis UAS-SP(F)_lpr2E-HA 22A/ #2 Esta tesis UAS-SP(F)_lpr2E-HA-Myc 22A/ #2 Esta tesis UASp-lpr2E-HA #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 UASp-lpr2F-HA #2 Parra-Peralbo and Culi, 2011 VDRC: Vienna Drosophila Resource Center. BDSC: Bloomington Drosophila Stock Center. MATERIALES Y MÉTODOS 67 LÍNEAS ACTIVADORAS: Gal4/Gal80ts Origen AB.1-Gal4 BDSC apterous-Gal4 (ap-Gal4) BDSC Cg-Gal4 Rusten et al., 2004 elav-Gal4 BDSC engrailed-Gal4 (en-Gal4) A. Martínez Arias Fat Body-Gal4 (FB-Gal4) Grönke et al., 2003 heat shock-Gal4 (hs-Gal4) Tanimoto et al., 2000 hedgehog-Gal4 (hh-Gal4) BDSC MD638-Gal4 BDSC nubbin-Gal4 (nub-Gal4) BDSC patched-Gal4 (ptc-Gal4) BDSC repo-Gal4 BDSC tub-Gal80ts McGuire et al., 2003 V32-Gal4 Daniel St. Johnson Figura 20. Patrón de expresión de algunas líneas Gal4. La región azul muestra la zona donde se expresan las líneas activadoras indicadas abajo. De izquierda a derecha se muestran el compartimento posterior, dorsal, borde antero-posterior y primordio del ala (wing pouch). LÍNEAS MUTANTES Origen Df(3R)lpr2[1.40] Parra-Peralbo and Culi, 2011 Df(3R)lpr1/2[2.41] Parra-Peralbo and Culi, 2011 shibire termosensible (shits)Grigliatti et al., 1973 OTRAS LÍNEAS Origen Oregon R (OR) (Silvestre) BDSC white (w) BDSC sqh-EYFP-ER BDSC Pxn[CPTI003897]-YFP Kyoto Stock Center MATERIALES Y MÉTODOS 68 1.3. Inhibición de la endocitosis: shits Para conseguir una mayor cantidad de proteína en la membrana, en algunos experimentos inhibimos la endocitosis haciendo uso de un alelo termosensible de la proteína Shibire (Shi), homóloga a la dinamina de humanos. Esta proteína termosensible queda inactivada de forma reversible a 33ºC, bloqueándose por tanto la endocitosis. Para la realización de estos experimentos, se cruzaron hembras homocigotas de genotipo: shits; hh-Gal4/TM6b con machos que llevaban un transgen UAS para la expresión de una de las isoformas o quimeras de los receptores de lipoforinas. Mantuvimos el cruce a 25ºC y tras la eclosión de las larvas, éstas se transfirieron a 18ºC. Una vez que las larvas estuvieron en estadio LIII, se seleccionaron machos, hemicigotos para shits y que llevaran tanto el transgen UAS como la línea activadora hh-Gal4. Éstas se incubaron a la temperatura restrictiva (33ºC) durante 3 horas en un tubo de cristal con un papel de filtro humedecido en su interior para que el cambio de temperatura fuera más homogéneo y rápido. Finalmente, se transfirieron rápidamente a hielo para evitar que la endocitosis tuviera lugar y se procedió a la disección y fijación de los discos imaginales de ala a 4ºC. Para el estudio de la estabilidad de la unión entre los ligandos LTP y lipoforina con el receptor Lpr2E in vivo mostrado en la Figura 55, se inhibió la endocitosis durante 3 horas, se diseccionaron los discos imaginales de ala de larvas LIII en medio de cultivo Sf-900 II SFM en hielo y se incubaron posteriormente en el mismo medio durante 30 o 60 minutos a 4ºC. Después de esta incubación, fueron fijados y procesados siguiendo el protocolo estándar. 1.4. Generación de clones de falta de función Para la inducción de clones mitóticos de falta de función se utilizó el sistema FLP/FRT (Xu and Rubin, 1993), que consiste en inducir la recombinación entre cromosomas homólogos que llevan una secuencia FRT (del inglés Flippase Recognition Target) en posiciones análogas, expresando artificialmente la enzima flipasa recombinasa (FLP) de levadura. Si ocurre recombinación y durante la segregación de los cromosomas en el proceso de mitosis, una de las células hijas obtienes dos copias del cromosoma mutante (clon mutante) y la otra célula hija dos copias con el marcador (clon gemelo) (Figura 21). La expresión de la flipasa está regulada por un promotor inducible de la proteína de choque térmico hsp70. Para su activación incubamos las larvas en el estadio deseado a 37ºC durante 1 hora. Los clones son visibles por la ausencia de un marcador de expresión ubiqua, por ejemplo, GFP (Davis et al., 1995) y van acompañados de un clon gemelo, conteniendo doble copia del marcador. Los genotipos utilizados fueron los siguientes: a) y, w, hs-flp; FRT82B,ubi-GFP/FRT82B,Df(3R)lpr1/2[2.41] b) shits,FRT9.2/ubi-GFP,FRT9.2;hs-flp/+ En nuestro caso, para inducir los clones en discos imaginales de alas (genotipo a), se realizó un choque térmico de 1 hora a 37ºC a las 48-72 horas tras la puesta. Una vez que las larvas llegaron al estadio adecuado (LIII), diseccionamos y fijamos los tejidos. Para la generación de los clones shits en discos imaginales de ala (genotipo b), se indujo un choque térmico a 37ºC MATERIALES Y MÉTODOS 69 durante 1h a las 48-72h. Tras ello, las larvas se mantuvieron a 18ºC hasta llegar a estadio LIII. En ese momento se pasaron a temperatura restrictiva (33ºC) durante 8 horas y se diseccionaron. Figura 21. Representación de la generación de clones de falta de función. El sistema FLP/ FRT permite que tras la replicación y segregación de los cromosomas se puedan obtener células con dos copias de la mutación obteniendo el clon mutante deseado acompañado de su clon gemelo con doble copia del marcador. Imagen modificada de Tabata, 2001. 2. INMUNOHISTOQUÍMICA 2.1. PROTOCOLO ESTÁNDAR: Inmunotinción de discos de alas, ovarios, glándulas salivales y cuerpo graso Los diferentes tejidos diseccionados se fijaron en paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS al 4% y a continuación, en PFA suplementado con Tritón X-100 al 0,1% durante 20 minutos, ambas a temperatura ambiente. A continuación, los tejidos se lavaron cuatro veces en PBS más TritónX-100 al 0,3% (PBT) durante un total de una hora. Posteriormente, se bloquearon durante otra hora con BSA al 1% disuelta en PBT. La incubación con los anticuerpos primarios disueltos en PBT-BSA se realizó durante toda la noche a 4ºC, utilizando las concentraciones indicadas en el apartado 7.1. Tras la incubación con los anticuerpos primarios, se realizaron una serie de lavados con PBT y PBT-BSA durante una hora al igual que describimos previamente, e incubamos con los anticuerpos secundarios correspondientes conjugados a fluorocromos Alexa-Fluor de Invitrogen, disueltos en PBT-BSA (1/500), durante 2 horas. En los casos en que se utilizaron colorantes tales como DAPI (núcleos) y Faloidina conjugada con rodamina (actina-F), éstos se añadieron junto con los anticuerpos secundarios a la concentración indicada en el apartado 7.1 de Métodos. Por último, los tejidos se lavaron varias veces con PBT durante un total de una hora y se montaron en Vectashield (Vector Lab). MATERIALES Y MÉTODOS 70 En el caso de los ovarios, al ser un tejido de mayor tamaño, las fijaciones se realizaron durante 30 minutos cada una y el anticuerpo secundario se incubó durante toda la noche a 4ºC. Los lípidos fueron visualizados con dos tipos distintos de colorantes: Nile Red y Oil red O. Para la utilización del Nile Red, los discos imaginales de ala u ovarios previamente fijados, fueron incubados con 0.002% de Nile Red diluido en PBT durante 1 hora y lavados durante 10 minutos en PBT. En el caso del Oil Red O, los discos imaginales fueron incubados en una solución al 0.5% de Oil Red O en propilen glicol a 60ºC durante 1 hora y después se realizaron dos lavados en propilen glicol al 85% y tres veces en PBS (Tennessen et al., 2014) 2.2. Tinción extracelular Para la detección de las proteínas extracelulares, utilizamos un protocolo modificado de Strigini and Cohen, 2000, en el cual, todo el proceso se lleva a cabo a 4ºC para inhibir la endocitosis. Los discos imaginales fueron diseccionados (y acumulados) en medio de cultivo Sf-900 II SFM de Gibco mantenido en hielo. A continuación, se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo primario de la proteína de interés disuelto en medio de cultivo, también en hielo, a una concentración 10 veces superior a la indicada para la inmunotinción estándar (mostradas en el apartado 7.1 de Métodos). Seguidamente, se realizaron cuatro lavados a 4ºC con PBS 1X durante 30 minutos en total y se fijaron con PFA al 4%, primero a 4ºC durante 10 minutos y luego a temperatura ambiente. A partir de ese punto, se continuó el protocolo estándar descrito previamente. En algunos casos (Figura 34), realizamos tinciones dobles combinando la tinción extracelular con la tinción total (protocolo estándar). Tras la fijación, los lavados en PBT y el bloqueo en PBT-BSA, se incubó con el anticuerpo primario durante toda la noche como se ha mencionado previamente en el protocolo estándar. Para estudiar la distribución extracelular de la lipoforina en discos imaginales de ala en larvas con niveles reducidos de LTP mostrado en la Figura 53, usamos los siguientes genotipos: Cg-Gal4, tub-Gal80ts/UAS-lpr2E-HA; hh-Gal4/UAS-apoLTP-i Cg-Gal4, tub-Gal80ts/UAS-lpr2E-HA; hh-Gal4/+ (Control) Los cruces se mantuvieron a 18ºC y cuando las larvas se encontraban en estadio LII o LIII temprano, fueron transferidas a 29ºC durante 2 días para activar los transgenes UAS. Finalmente, se siguió el protocolo de tinción extracelular. 2.3. Inmunotinción en células S2 de Drosophila melanogaster Sembramos entorno a 300.000 células por cámara en un portaobjetos con 8 cámaras de Lab Tek. Después de unas 2 horas, las células se adhirieron a la superficie. A continuación, se procedió con el protocolo de transfección, que varía en función del reactivo utilizado (Cellfectin® de Invitrogen o Effectene® de Qiagen). Ver en más detalle en el apartado 3.1 de Métodos. Una vez transfectadas las células, se procedió con el protocolo estándar de inmunotinción descrito previamente, pero en este caso reduciendo los periodos de incubación: 10 minutos MATERIALES Y MÉTODOS 71 para cada fijación y lavados. Al finalizar, se montó la preparación en Vectashield (Vector Lab). Durante todo el proceso, hay que tener especial cuidado para evitar que las células se desprendan de la superficie del portaobjetos ya que las células S2 se adhieren sólo parcialmente. Todas las imágenes de esta tesis están tomadas con el microscopio de confocal Leica SP2 DME ó Leica TCS SPE; y procesadas con el programa ImageJ para realizar las proyecciones y secciones en el eje Z. 3. CULTIVOS CELULARES Utilizamos la línea celular Schneider 2 (S2) de Drosophila melanogaster. Esta línea procede de un cultivo primario de embriones en estadio tardío (20-24 horas) (Schneider, 1972) y probablemente deriva de macrófagos. A diferencia del cultivo celular de células humanas, no requieren CO2 ni suero en el medio de cultivo, crecen a temperatura ambiente y son semi-adherentes. En este caso, las células S2 se mantuvieron a 25ºC en frascos de Roux de 160 ml (nuncTM), con medio de cultivo Sf-900 II SFM de Gibco suplementado con Penicilina (50 U/ml) y Estreptomicina (50 μg/ml). 3.1. Transfección de células S2 Se indujo la expresión de los diferentes transgenes en la línea celular S2 de Drosophila. Para ello, los ADNs contenidos en el vector de expresión pUASattb se co-transfectaron junto a pAC-Gal4 (expresa constitutivamente la proteína Gal4 y activa la transcripción de los transgenes UAS) y pAC-LacZ, este último nos servirá para medir la eficiencia de transfección mediante el ensayo β-galactosidasa. Sembramos entorno a 2.5x106 células en 3.5 ml de medio por pocillo en una placa de 6 pocillos de VWR (previo conteo en una cámara de Neubauer). Esperamos que las células se adhieran a la superficie durante al menos 2 horas. A continuación, se procede al protocolo de transfección, que varía en función del reactivo utilizado: Cellfectin® II Reagent de Invitrogen o Effectene® de Qiagen (Figura 22). Cellfectin® II Reagent: Se transfectaron 5 μg de ADN total por pocillo y se distribuyeron dependiendo de si el transgen requería del factor de transcripción Gal4 (UAS-transgen) o si estaba contenido en un vector con promotor ubicuo (pAC-transgen) MATERIALES Y MÉTODOS 72 Se mezclaron por un lado los 5 μg de ADN total y por otro lado 20 μl del reactivo Cellfectin® IIReagent, con medio de cultivo sin antibiótico. Mezclamos ambas soluciones e incubamos durante 20 minutos a temperatura ambiente para que se formaran los complejos lipídicos conteniendo el ADN. Añadimos medio sin antibiótico y lo agregamos a las células. Se dejó durante 3 horas para que las células incorporaran estos complejos. Tras ese periodo de tiempo, se retiró el contenido con cuidado de no arrastrar células y añadimos medio condicionado. Dejamos que se expresara el transgen durante 24-48 horas. Figura 22. Representación esquemática del proceso de transfección de células S2 de Drosophila mediante dos reactivos diferentes: Cellfectin®® II Reagent y Effectene®. (1-1’) Se siembran las células y se dejan que se adhieran a la superficie. Con Cellfectin® se añade el reactivo (2) y el ADN (3) en tubos independientes con medio de cultivo. Posteriormente, se mezclan y se deja incubar durante 20 minutos (4). Con Effectene®, se mezclan los distintos componentes del kit: EC Buffer, Enhancer y el ADN, y se incuban durante 5 minutos con medio de cultivo (2’). A continuación, se incorpora el reactivo Effectene® durante 8 minutos (3’). Las mezclas (4) y (3’), se incorporan a las células y se deja actuar durante 3 horas (5) o 24-48 horas (4’). Con Cellfectin® se realiza un paso adicional, ya que se debe retirar la mezcla y añadir medio de cultivo condicionado y tras ese proceso, dejar crecer las células durante 24-48 horas (6). Effectene®: En este caso, se transfectaron 4 μg de ADN total y se distribuyeron en las mismas proporciones que con el reactivo anterior. El protocolo seguido es una adaptación de M. Zeidler del Effectene Transfection Reagent Handbook. Mezclamos los componentes del kit: 200 μl de EC Buffer y 16 μl de Enhancer junto con el ADN, e incubamos durante 5 minutos a temperatura ambiente para que el ADN se MATERIALES Y MÉTODOS 73 condensara. Añadimos 20 μl del reactivo Effectene®, mezclamos e incubamos durante 8 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo de transfección. A continuación, añadimos medio de cultivo y se distribuyó a las células. Finalmente, dejamos que se expresara el transgen entre 24-48 horas. Ensayo β–Galactosidasa (β-Gal) El gen lacZ de Escherichia coli codifica para la enzima β-galactosidasa que es capaz de hidrolizar la lactosa en sus monómeros glucosa y galactosa. Dicha actividad se puede detectar en extractos celulares usando un sustrato cromogénico artificial denominado o-nitrophenyl- β-d-galactoside (ONPG). El ONPG es incoloro, sin embargo, tras la hidrólisis producida por la enzima, se produce un compuesto de color amarillo que absorbe la luz a 420 nm, medible en el espectrofotómetro. Para medir la actividad β-galactosidasa (Zhang y Bremer,1995), mezclamos 25 μl de los extractos junto con 450 μl del tampón Z (que debe prepararse en el momento) y 100 μl del sustrato ONPG. Incubamos a 37ºC durante al menos 1 hora, hasta que aparece el color amarillo. Posteriormente, se para la reacción con 250 μl de la solución de Stop, y se mide a 420 nm. 4. BIOQUÍMICA 4.1. Ensayo de Co-InmunoPrecipitación (Co-IP) Este método nos permite detectar la interacción física entre dos proteínas. La proteína de interés se aisla mediante un anticuerpo específico y las moléculas que interaccionan con esta proteína se identifican mediante western blot. a) Protocolo de Co-Inmunoprecipitación Todas las co-inmunoprecipitaciones siguen el mismo esquema general, salvo pequeñas variaciones que serán detalladas en cada caso. Para su realización, se usaron bolas magnéticas Dynabeads® (novex) conjugadas a proteína G, una proteína que une con alta afinidad IgGs de varias especies incluidas el ratón, la rata y el conejo. Esto permite la unión de los anticuerpos correspondientes a estas bolas. En primer lugar, las Dynabeads® se unieron a los distintos anticuerpos específicos, para ello 25 μl de dynabeads protG se incubaron con 5-10 μg de anticuerpo y PBS suplementado con 0,002% de Tween-20 a temperatura ambiente, durante 30 minutos en agitación. A continuación, se lavaron las dynabeads ayudados con un imán con PBS al 0,002% de Tween-20. Seguidamente, las dynabeads cubiertas con el anticuerpo se repartieron en alícuotas iguales para las diferentes muestras. Finalmente, se añadieron los extractos correspondientes, las cantidades varían dependiendo de la procedencia: - Ovarios: 200-300 μl - Glándulas salivales: 100 μl - Células S2: 100 μl (Ver en el apartado 7.3) MATERIALES Y MÉTODOS 80 con los cebadores Lpr2UASFL y arrFLUreverse2, siendo la región solapante los 18 pares de bases iniciales (Val23-Glu28) del primer dominio de tipo complemento (LA2) del receptor humano LDLR. A continuación, se transfirió secuencialmente al vector pSpark® I (canvax) y finalmente, al vector pUASattb. UAS-hvldlrDLA1-HA. Digerimos con Asp718-HindIII el vector pUASTattb-hVLDLR-HA para obtener el receptor humano VLDLR (Parra-Peralbo, no publicado). Posteriormente, subclonamos en el vector pAC5.1 con promotor ubicuo donde realizamos una PCR inversa para que a la vez que añadimos una diana NotI, eliminemos el dominio LA1 (Cys33-Lys69) del transgen. Para ello, se usaron la pareja de cebadores hVLDLRChimF2 y hVLDLRChimRev previamente fosforilados, obteniendo pAC5.1-hVLDLR+LA1-HA. Seguidamente digerimos con Asp718-XbaI para obtener el transgen, el cual subclonamos en el vector pUASTattb. - Otras construcciones: UAS-lpr1-HA: Partiendo de moscas machos se realizó una RT-PCR usando random primer. La librería de ADNc obtenidas se amplificó por PCR utilizando un par de oligos específicos para las isoformas transcritas desde el promotor proximal del gen lpr1. Los productos de PCR obtenidos fueron directamente clonados en pGEM®-T (Promega). De los clones obtenidos, se aisló la isoforma Lpr1M mediante PCR con un par de oligos: uno específico del promotor proximal del gen lpr1 y otro específico de la región C-terminal, siendo verificado mediante secuenciación. Al secuenciar, comprobamos que se introdujo una mutación puntual N160A- >D160G en el dominio de tipo complemento LA5. A partir del dominio anterior (LA4) hasta el final de la proteína, es común a la isoforma Lpr1D, por lo tanto, para eliminarlo substituimos la región conteniendo el error, por la misma región de la proteína Lpr1D. Para ello, se amplificó mediante PCR el fragmento perteneciente a la isoforma Lpr1M: desde el extremo amino terminal hasta el dominio LA4 (Met1-Ala117) con los oligos Lpr1FL_Asp718 y 1E8Forw2. Por otro lado, se obtuvo también por PCR el fragmento común de ambas isoformas para subsanar el error, desde Tyr109 (LA4) hasta el final de la proteína de la isoforma Lpr1D, a partir del clon RE14223 (BDGP) con los cebadores 1E8Forw_R y Lpr1UAS_LR. Debido a que los cebadores 1E8Forw2 y 1E8Forw_R son complementarios, la unión de ambos fragmentos la realizamos a través de “overlap extension PCR” con los cebadores Lpr1FL_ Asp718 y Lpr1UAS_LR. Una vez obtenido el transgen completo clonamos secuencialmente en el vector pSpark® I, pAC5.1 modificado con un epítopo 3xHA y finalmente, en pUASTattb. Al igual que la contrucción conteniendo el Flag extracelular, este transgen fue insertado en la posición 51D (2R: en el brazo derecho del segundo cromosoma) en lugar de la posición 22A. Peroxidasina-Myc: A partir del ADNc de la peroxidasina (clon GH13031 procedente de Drosophila Genomics Resource Center: DGRC) se amplificó el transgen añadiendo las dianas Asp718 y EcoRI en los extremos N y C-terminal respectivamente, usando los cebadores Pxn_Asp718_F y Pxn_EcoRI_R. Por otro lado, se amplificó la etiqueta 6xMyc a partir del vector pPMW (The Drosophila GatewayTM Vector Collection), añadiendo las enzimas EcoRI y XbaI con la pareja de cebadores EcoRI_Myc2_F y XbaI_Myc2_R. Ambos fragmentos fueron transferidos a pSpark® I. Tras secuenciarlos, el fragmento de la peroxidasina fue transferido al vector pAC5.1. A continuación, se insertó el epítopo 6xMyc vía EcoRI. MATERIALES Y MÉTODOS 81 Todos los fragmentos obtenidos por PCR fueron secuenciados para evitar la introducción de mutaciones no deseadas. Los cebadores utilizados en la realización de las construcciones se detallan en el apartado 7.2. Las enzimas de restricción están resaltadas en rojo. Las moscas transgénicas se obtuvieron mediante el sistema basado en la integrasa phiC31 (Bischof et al., 2007). Este método permite que la integración de los transgenes tenga lugar en la misma localización cromosómica, minimizando los efectos que puedan tener sobre la transcripción el lugar en que se produzca la inserción. Todos los transgenes UAS usados en este trabajo fueron insertados en el sitio 22A (2L: en el brazo izquierdo del segundo cromosoma), salvo excepciones indicadas en cada caso. Las moscas transgénicas fueron generadas en el Servicio de Microinyección de Drosophila “Consolider-Ingenio 2010 GESHAPE”. MATERIALES Y MÉTODOS 82 6. TAMPONES Actividad β-galactosidasa Co-Inmunoprecipitación Para los ensayos de Co-IP de la lipoforina, al tampón de lavado y de lisis se le añadieron 1 mM de DTT y 2,5 mM de CaCl2, ya que se ha descrito que la interacción de varios miembros de la familia LDLR con sus ligandos es dependiente de Ca2+ (Ren et al., 2010). MATERIALES Y MÉTODOS 83 7. TABLAS 7.1. Anticuerpos Anticuerpo (α-) [Inmunotinción] [Western blot ] Animal Procedencia AP50 1:50 - Ratón BD Bioscience aPKCζ C-20 - 1:5000 Conejo Santa Cruz Biotechnology ApoLp FL (Lp) 1:500 1:2500 Conejo Laboratorio ApoLP-II - 1:20000 Conejo Laboratorio ApoLTP-I 1:1000 - Conejo Palm et al., 2012 ApoLTP-II - 1:1000 Conejo Palm et al., 2012 Boca 1:500 - Cobaya Culi and Mann, 2003 Casp3 activada 1:50 - Conejo Cell Signaling Technology CBP - 1:500 Cabra Santa Cruz Biotechnology Flag 1:50 1:5000 Ratón Sigma GFP 1:300 - Conejo Sigma GFP 1:500 - Pollo Abcam GFP - 1:2000 Ratón Sigma Golgi 1:100 - Ratón Calbiochem HA 1:500 1:2500 Rata Roche HA 1:25 1:250 Ratón Santa Cruz Biotechnology Hrs 1:500 - Ratón Lloyd et al., 2002 Lpr1 1:100 - Cobaya Parra-Peralbo and Culi, 2011 Lpr2 1:100 - Cobaya Parra-Peralbo and Culi, 2011 Myc 1:100 - Conejo Sigma Myc (9E10) 1:50 1:100 Ratón Hibridoma Bank Rab11 1:100 - Ratón BD Bioscience Rab8 1:100 - Ratón BD Bioscience DAPI 1:500 - - Molecular Probes Faloidina- Rodamina 1:100 - - Sigma Anticuerpos conjugados con HRP - 1:25000 Ratón, Conejo, Rata, Cobaya y Cabra Thermo Fisher Scientific Clean Blot -1:100 Ratón, Conejo, Rata, Cabra, Oveja, Bovino y Humano Thermo Fisher Scientific En gris se muestran los colorantes y anticuerpos secundarios. MATERIALES Y MÉTODOS 84 7.2. Cebadores NOMBRE DEL CEBADOR SECUENCIA (5’ => 3’) 1E8Forw_R ACCTGTTCACCGGATGAATATGC 1E8Forw2 AGTCCTTGCTCTGGTCGCACAT arruFLUreverse2 TCTAGACTACACCATGCTAGCGTAATCT EcoRI_Myc2_F GAATTCAGAAGCTCCGCCACCATG hVLDLRChimF2 CCCGAAGACGTGTGCTGAATCTG hVLDLRChimRev CCGCTTTGGCTTTTCTCCCGGTT LDL_A1_F GTGGGCGACAGATGTGAAAGAAAC Lipophorin5 GGTACCAACATGGGACCAATATGCC LpNotGTM_F CCGCAGATCTGGGTATCCCAACTG Lpr1FL_Asp718 GGTACCGGAAAATGGGGCGCA Lpr1UAS_LR AAGCTTATACGAGGATATGCCTATGAC Lpr2E_SP_F GCGGTAAATGCCGCCCATGT Lpr2E_SP_R CAATCCGACGACTCTGGACGCCGCATTGCAGAATTTG Lpr2Eflag_F TACAAGGACGATGATGACTACAGCGGATCGGCGCTG Lpr2Eflag_R GTCATCATCGTCCTTGTAGTCCAGATTGTGCATTATCTCGCT Lpr2F_SP_F TCCAGAGTCGTCGGATTGGAATC Lpr2F_SP_R GGCGGCATTTACCGCGGCATGGTGCGG Lpr2Fflag_F TACAAGGACGATGATGACTACGAATCAACTTGCAGCCAG Lpr2Fflag_R GTCATCATCGTCCTTGTAGTCCAATCCGACGACTCTGGA Lpr2FL_R AAGCTTAACACATTCGGTGCCAGATTTGAAG Lpr2Myc_R CCGCTTCGACGCACATTAGCCCGT Lpr2UASFL GGTACCAAAGATGGCCACAACCTGC Myc_Not_F GCGGCCGCTCGATCGAAAGCTATGGAGCAA Myc_Not_R GCGGCCGCGAGAGGCCTTGAATTCAAGTC NCN_A1_R TTCACATCTGTGCCCACTGTAAACTTGCACTCCTCCAG Pxn_Asp718_F GGTACCAAAATGCGATTTATGCTGCTCAT Pxn_EcoRI_R GAATTCCTTGACCATCGGGCAGT SP(Crb)_F GGTACCAACATGGCTAAAATCGCCAATG SP(Crb)_R CAATCCGACGACTCTGGATGAGGCGACATCTGTTGC XbaI_Myc2_R TCTAGAACAAACTTGTATACCGGTGATTC Enzimas de restricción: Asp718: GGTACC XbaI: TCTAGA EcoRI: GAATTC HindIII: AAGCTT NotI: GCGGCCGC MATERIALES Y MÉTODOS 85 7.3. ADNc ADNc pUASattb-Lpr2E-HA pUASattb-Lpr2F-HA pUASattb-Lpr2E-HA-Myc pUASattb-Lpr2F-HA-Myc pUASattb-Lpr2F+LA1-HA pUASattb-Lpr2F+LA1+ED-HA pUASattb-Lpr2F+LA1+NCN-HA pUASattb-Lpr2F+NCN-HA pUASattb-hLDLR-HA pUASattb-hLDLR+LA1+NCN-HA pUASattb-hVLDLR-HA pUASattb-hVLDLRΔLA1-HA pAC5.1-Peroxidasina-Myc RESULTADOS RESULTADOS 89 1. Efecto de los distintos dominios proteicos de los receptores de lipoforinas sobre su distribución subcelular en discos imaginales Como hemos descrito en la introducción, existen múltiples isoformas de los receptores de lipoforinas generadas por splicing alternativo y también por el uso de dos promotores distintos. Sin embargo, todas ellas son muy parecidas estructuralmente. A pesar de esta similitud, observamos que cuando sobre-expresamos en el compartimento dorsal de los discos imaginales de ala con el activador apterous-Gal4 (ap-Gal4) las isoformas UAS-lpr2E-HA y UAS-lpr2F- HA, transcritas en el genoma a partir del promotor distal y proximal respectivamente, su distribución subcelular en el epitelio es muy diferente, tal como se observa en la Figura 25. Figura 25. Distribución de los receptores de lipoforinas en discos imaginales de ala. Discos de ala en los que se han sobre-expresado las isoformas Lpr2E (A y C) y Lpr2F (B y D) en el compartimento dorsal o posterior mediante las líneas activadoras ap-Gal4 y en- Gal4 respectivamente. Se muestra un corte en el eje apico-basal (A-D) y transversal (A’- D’). La posición de los planos transversales mostrados se marca con un asterisco en A. La distribución del receptor se ha detectado mediante α-HA. Lpr2E se acumula en múltiples vesículas (flechas en A-A’ y C-C’). Lpr2F se acumula en la región apical del disco (flecha en B y D). La llave muestra el Efecto borde. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. (E) Dibujo de una larva de Drosophila en el tercer estadio larvario mostrando los distintos discos imaginales. La flecha señala el disco imaginal de ala. Tomada de Flybase. (F) Esquema en el eje x-y del disco imaginal de ala donde se indican los cortes transversales en el eje x-z (G-H). El primordio del ala está marcado en gris. v: ventral, d: dorsal, a: anterior, p: posterior Tomada y modificada de Windmann and Dahmann, 2009. La isoforma Lpr2E se distribuye homogéneamente en el citoplasma de las células que lo expresan, con una ligera mayor acumulación en un dominio apical y en vesículas (Figura 25A y A’). En el caso de la isoforma Lpr2F, observamos que se acumula fundamentalmente en la región más apical y basal de las células y es casi indetectable en el citoplasma a niveles intermedios del eje apico-basal. Además, no se observa en vesículas (Figura 25B y B’). Sorprendentemente, esta distribución es distinta en las células situadas en el borde del territorio RESULTADOS 96 Por otra parte, es interesante recalcar que el péptido señal de las isoformas transcritas desde el promotor distal, como Lpr2E, es atípicamente largo, de 88 aminoácidos según las predicciones del software SignaIP 4.1 (Bendtsen et al., 2004) y PrediSi (Hiller et al., 2004), mientras que las isoformas transcritas desde el promotor proximal, como Lpr2F, poseen péptidos señal típicos de 24 aminoácidos. En el caso del gen lpr1, el péptido señal de las isoformas transcritas desde el promotor distal tales como Lpr1H y/o Lpr1J es también atípicamente largo, de 68 aminoácidos, y las transcritas desde el promotor proximal (Lpr1D) es típico de 20 aminoácidos. Para examinar cuál de estos dominios es el responsable de las diferencias en la distribución de las distintas isoformas de lipoforinas, utilizamos diferentes formas quiméricas de los receptores construidas artificialmente mediante intercambio de dominios. Concretamente, a la isoforma Lpr2F se le añadieron los distintos dominios específicos de la isoforma Lpr2E (Figura 29B). Estas quimeras se sobre-expresaron en discos imaginales de ala en el compartimento posterior o en el compartimento dorsal, utilizando la línea activadora en-Gal4 o ap-Gal4 respectivamente, y se compararon con las isoformas Lpr2E y Lpr2F. Tal y como se observa en la Figura 30, las quimeras obtenidas al añadir el dominio LA1 (Figura 30C-C’’) o LA1+ED (Figura 30D-D’’) a Lpr2F se distribuyen de forma similar a Lpr2F (Figura 30B-B’’), sugiriendo que estos dominios no afectan a la distribución subcelular de estas proteínas. Sin embargo, la quimera que contiene la región N-terminal de Lpr2E completa fusionada a Lpr2F, LA1+NCN (Figura 30E-E’’), se distribuye de forma parecida a la isoforma Lpr2E (Figura 30A-A’’), indicando que efectivamente, la región N-terminal es decisiva para definir los distintos patrones de acumulación. Para acotar más los dominios relevantes, analizamos una quimera adicional que contiene los dominios NCN y el péptido señal de Lpr2E fusionados a Lpr2F (Figura 30F-F’’). Observamos que éstos eran suficiente para cambiar el patrón de distribución ya que esta quimera se acumula en todo el citoplasma a lo largo del eje apico-basal de forma semejante a Lpr2E (Figura 30A-A’’). Para continuar acotando los dominios requeridos, nos llamó la atención que el péptido señal de Lpr2E, y otras isoformas sintetizadas a partir del promotor distal, fuera atípicamente largo. Por ello nos preguntamos si el péptido señal podía influir en la distribución diferencial de estas isoformas. En esta dirección, generamos un transgen reemplazando el péptido señal de la isoforma Lpr2F por el péptido señal atípicamente largo de la isoforma Lpr2E, obteniendo UAS-SP(E)_lpr2F- HA. Al sobre-expresar esta quimera en el compartimento dorsal del disco imaginal de ala usando la línea activadora ap-Gal4 observamos que se distribuía de forma similar a Lpr2E (Figura 31A-A’’). Por tanto, estos resultados indicaban que el péptido señal desempeñaba un papel importante en definir la localización subcelular de las isoformas de lpr2. Como se ha comentado en la introducción, algunos péptidos señal atípicos desempeñan funciones una vez procesados y pueden afectar las propiedades de la célula. Por tanto, quisimos analizar si el péptido señal atípico de Lpr2E podría ser sustituido por otro péptido señal atípicamente largo. Para ello generamos un nuevo transgen siguiendo la estrategia anterior, pero en este caso, reemplazando el péptido señal de Lpr2F por el único péptido señal largo bien caracterizado hasta ahora en Drosophila, el péptido señal de la proteína Crumbs (Kilic et al,. 2010), siendo ésta una proteína transmembrana que desempeña funciones principales en polaridad celular y morfogénesis (Pocha and Knust, 2013). Cuando expresamos de manera ectópica el transgen UAS-SP(Crb)_lpr2F-HA en discos de ala, observamos como la distribución de la proteína a lo largo del disco era similar a la de Lpr2F a pesar de la presencia del péptido señal largo (Figura 31B-B’’). Por tanto, el péptido señal largo de Lpr2E tienen propiedades que no comparten otros péptidos señal atípicos, como el de la proteína Crumbs. RESULTADOS 97 Figura 30. El dominio N-terminal define la distribución de las distintas isoformas. (A-F) Sección transversal de discos imaginales de ala con la parte apical arriba y la basal abajo en los que se han sobre-expresado diferentes quimeras en el compartimento posterior (en-Gal4) o dorsal (ap-Gal4). Los dominios proteicos relevantes de las quimeras expresadas ectópicamente están representadas a la izquierda de la figura. El asterisco muestra la zona donde se tomó la sección óptica, que se presenta en un canal desglosado en gris. Las llaves indican la zona intermedia con bajos niveles de tinción. La detección del receptor se realizó con α-HA en verde y se muestra también en un canal desglosado en gris. La distribución de lipoforinas con α-Lp en rojo, marcando los contornos celulares. Las quimeras Lpr2F+LA1-HA (C-C’’) y Lpr2F+LA1+ED-HA (D-D’’) se distribuyen de manera parecida a Lpr2F, sin embargo, las quimeras Lpr2F+LA1+NCN-HA (E-E’’) y Lpr2F+NCN-HA (F-F’’) se distribuyen de manera parecia a Lpr2E, siendo el dominio NCN junto con el péptido señal los responsables de la diferencia en distribución de la proteína. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. RESULTADOS 98 De esta manera, nuestros datos sugieren que el péptido señal atípico de Lpr2E se requiere para la distribución subcelular correcta de esta isoforma. Si ello es así, al sustituir su péptido señal largo por el péptido señal de la isoforma Lpr2F esperaríamos que su distribución cambiara y fuera más parecida a la de Lpr2F. Generamos esa nueva quimera, UAS-SP(F)_lpr2E-HA, y tal como se esperaba, la proteína se distribuye de forma parecida a Lpr2F (Figura 31C-C’’). Todos estos resultados sugieren que la distinta distribución de los receptores de lipoforinas en el disco imaginal de ala, viene determinado por el tipo de péptido señal que presente: típico o atípicamente largo. Además, en el caso del péptido señal largo procedente de las isoformas transcritas desde el promotor distal (Lpr2E), su función no se debe a la longitud sino a propiedades intrínsecas de éste. Más adelante analizaremos en más detalle la secuencia del péptido señal largo de la isoforma Lpr2E. 1.3. Fusión de un epítopo extracelular a distintas isoformas de los receptores de lipoforinas Las diferencias de distribución mostradas por las distintas isoformas podrían deberse a una distinta acumulación en la membrana plasmática, donde ejercen su función a través de la interacción con sus ligandos. Una de las mejores técnicas para analizar la distribución en membrana de un receptor consiste en detectar el ectodominio mediante un anticuerpo en Figura 31. La distribución de las isoformas de los receptores de lipoforinas viene determinada por el tipo de péptido señal que presente. (A-C) Sección transversal de discos imaginales de ala en los que se han sobre-expre- sado diferentes quimeras en el compartimento posterior. Los dominios proteicos relevantes de las quimeras expresadas ectópicamente están representados a la izquierda de la figura. El asterisco muestra la zona donde se tomó la sección óptica, que se presenta en un canal desglosado en gris. La detección del receptor se realizó con α-HA en verde y la distribución de lipoforinas con α-Lp en rojo, marcando los contornos celulares. Al intercambiar los péptidos señales en las quimeras SP(E)_Lpr2F-HA (A-A’’) y SP(F)_Lpr2E-HA (C-C’’) la distribución del receptor varía en función del péptido señal y no del resto de la proteína. En el caso de la quimera SP(Crb)_Lpr2F-HA (B-B’’) la distribución es más parecida a la que se observa con el péptido señal típico. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. RESULTADOS 99 tejidos en los que no se ha permeabilizado la membrana plasmática. Sin embargo, los transgenes que hemos utilizado hasta ahora no son útiles para ello, ya que tanto el epítopo HA con el que están marcados como el epítopo detectado por α-Lpr2, se localizan en la región intracelular de la proteína. Por ello, decidimos añadir una etiqueta en el ectodominio de las isoformas utilizadas hasta ahora, Lpr2E y Lpr2F. Para permitir detectar de forma simultánea el ectodominio y el dominio intracelular, realizamos pruebas fusionando las etiquetas Flag o Myc en el ectodominio y HA en el dominio intracelular. Epítopo Flag En una primera aproximación, añadimos una copia del epítopo Flag (Hopp et al,. 1988) inmediatamente después del péptido señal (Figura 32A), tras Leu110 y Leu30 para las isoformas Lpr2E y Lpr2F respectivamente. Elegimos este epítopo debido a su pequeño tamaño, que no debería interferir con la síntesis y plegamiento de las proteínas. Sorprendentemente, al sobreexpresar estas construcciones in vivo tanto en discos imaginales de ala (Figura 32B-B’’’), como en células S2 (Figura 32C-C’ y D-D’) se observó una expresión muy débil o nula (no mostrado) al utilizar el anticuerpo anti-Flag para su detección. No obstante, la tinción con anti-HA, epítopo también presente en las nuevas construcciones, fue la esperada (Figura 32B). Figura 32. El epítopo Flag no es un buen marcador extracelular para los receptores de lipoforinas. (A) Representación modular de las isoformas Lpr2E y Lpr2F conteniendo el epítopo HA en el dominio intracelular (triángulo rojo) y el epítopo Flag inmediatamente después del péptido señal (triángulo gris) cuya secuencia se muestra a la derecha. La línea de puntos muestra la región transmembrana (B-B’’) Planos transversales de discos imaginales de alas sobre-expresando en el compartimento posterior la isoforma Lpr2F conteniendo ambos epítopos. El asterisco muestra la zona donde se tomó la sección óptica que se muestra a la derecha (B’’’). (C-D) Expresión de las isoformas Lpr2E y Lpr2F en células S2 de Drosophila. La distribución de los receptores fue detectada con α-HA en verde y α-Flag en rojo. Barra de escala: 10 μm. A RESULTADOS 100 Examinamos la posibilidad de que la introducción del epítopo Flag en la proteína en una posición cercana al sitio de corte del péptido señal, hubiera modificado el sitio de procesamiento eliminando total o parcialmente el epítopo Flag. Analizamos el sitio de corte teórico de los péptidos señal con el software SignalP 4.1 (Bendtsen et al., 2004) y PrediSi (Hiller et al., 2004), que dieron resultados idénticos. En el caso de la isoforma Lpr2E, el sitio de corte se modificaba de Ala88 a Ser57 mientras que en la isoforma Lpr2F no se alteraba Ala24. En ambos casos, los sitios de corte teóricos no afectaban a la secuencia Flag. Epítopo Myc Como las fusiones con el epítopo Flag resultaron difíciles de detectar por inmunohistoquímica, decidimos realizar nuevas construcciones insertando una etiqueta diferente en la región extracelular: seis copias del epítopo Myc (6xMyc). Para evitar posibles interferencias con el procesamiento del péptido señal, se insertó entre el dominio EGF-C y la región de O-glicosilación de los receptores, una zona compartida entre las dos isoformas (Lpr2E y Lpr2F). Al tratarse de una posición entre dominios proteicos, es menos probable que afecte al plegamiento de la proteína (Figura 33A). El anticuerpo anti-Myc detectaba adecuadamente las proteínas Lpr2E-HA-Myc y Lpr2F- HA-Myc, con una eficiencia semejante a anti-HA, como puede observarse en la Figura 33 B-B’’’ y C-C’’’, en la que sobre-expresamos UAS-lpr2E-HA-Myc y UAS-lpr2F-HA-Myc en el compartimento dorsal de discos imaginales de ala usando la línea activadora ap-Gal4. En estas inmunotinciones nos dimos cuenta de un hecho inesperado. De un lado, al expresar UAS- lpr2E-HA-Myc en el disco imaginal y detectar la proteína simultáneamente con el epítopo HA y Myc, ambos epítopos co-localizan perfectamente, siendo la distribución de la proteína en el citoplasma celular homogénea a lo largo del eje apico-basal (Figura 33B-B’’). Sin embargo, en el caso de la isoforma Lpr2F los dos epítopos no co-localizaban completamente. Mientras que con el epítopo HA, Lpr2F se detectaba como ya hemos descrito y aparecía el Efecto borde, con el epítopo Myc la misma proteína se detectaba en el citoplasma celular a altos niveles en los dominios apical y basal pero también, a menor nivel, en un plano intermedio en el eje apicobasal del disco imaginal. Es decir, con el epítopo Myc no se observa el Efecto borde (Figura 33C-C’’). Estas diferencias pueden apreciarse claramente en una sección óptica realizada en un plano intermedio en el eje apico-basal (Figura 33C’’’, asterisco). Por tanto, con anti-HA sólo detectamos parte de la proteína sobre-expresada. A pesar de ello, con ambos epítopos se observa una fuerte acumulación de Lpr2F tanto en apical como en basal que no ocurre con Lpr2E (Figura 33C-C’’, flecha). Nuestros datos anteriores indicaban que el péptido señal juega un papel fundamental en cuanto a la distribución de las distintas isoformas. Para comprobarlo, añadimos el epítopo 6xMyc a las quimeras con los péptido señal intercambiados generando SP(E)_Lpr2F-HA-Myc y SP(F)_Lpr2E-HA-Myc. Al sobre-expresar estas proteínas en discos imaginales de ala y detectarlas con anti-Myc, la quimera SP(E)_Lpr2F-HA-Myc muestra una distribución similar a Lpr2E (Figura 33D-D’’’), mientras que la quimera SP(F)_Lpr2E-HA-Myc se distribuye de manera semejante a la isoforma Lpr2F, observándose una mayor cantidad de receptor en apical (Figura 33E-E’’) y evidenciándose el Efecto borde al comparar la tinción con anti-HA y con anti-Myc (Figura 33E’’’). Por tanto, se corrobora nuestra conclusión inicial que daba al péptido señal un papel relevante en definir la distribución de las isoformas Lpr2E y Lpr2F. Para examinar la fracción de receptor localizado en la membrana, realizamos una tinción extracelular siguiendo un protocolo modificado de Strigini and Cohen, 2000, en el que la incubación con el anticuerpo anti-Myc se realiza sin permeabilizar las células y a 4ºC para RESULTADOS 101 evitar su endocitosis. El resultado se muestra en la Figura 34A-A’. Tanto Lpr2E como Lpr2F se distribuyen principalmente en la membrana basolateral (flecha) y levemente en la membrana apical, no observándose diferencias entre ambas isoformas. Figura 33. El epítopo Myc es capaz de detectar la proteína de manera eficiente. (A) Representación modular de las isoformas Lpr2E y Lpr2F conteniendo el epítopo HA en el dominio intracelular (triángulo rojo) y el epítopo Myc entre el dominio de O-glicosilación y el dominio EGF-C (triángulo amarillo), cuya secuencia se indica a la derecha. La correspondencia entre dominios proteicos del receptor y los exones se muestra en el rectángulo azul de arriba. Planos sagitales de discos imaginales de ala sobre-expresando Lpr2E (B), Lpr2F (C), SP(E)_ Lpr2F (D) y SP(F)_Lpr2E (E) en el compartimento dorsal. La distribución de las proteínas fue detectada con α-Myc en rojo y α-HA en verde, ambos se muestran también en un canal desglosado (B’-E’ y B’’-E’’ respectivamente) en gris. El asterisco muestra la zona donde se tomó la sección óptica. La inmunotinción con la isoforma Lpr2E es muy similar con ambos epítopos (B), sin embargo, con la isoforma Lpr2F se observa como la inmunotinción con myc difiere a la de HA (C), no obstante con ambos epítopos observamos una importante acumulación de proteína en apical (flechas blancas). Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. RESULTADOS 102 Al combinar la tinción extracelular del epítopo Myc con la tinción estándar del epítopo HA intracelular, vimos que la mayor parte de la proteína que observamos en basal se localiza en la membrana. Por el contrario, en apical la localización de los receptores es mayoritariamente intracelular (Figura 34 Comparar B’ y C’ con B’’ y C’’). Figura 34. Las isoformas Lpr2E y Lpr2F se distribuyen de manera similar en la membrana. (A-C) Cortes transversales de discos imaginales de ala sobre-expresando UAS-lpr2E-HA-Myc ó UAS-lpr2F-HA-Myc en el compartimento posterior (en-Gal4). Las proteínas extracelulares fueron detectadas por un protocolo modificado sin permeabilización de las células con el anticuerpo α-Myc mostrado en rojo (B-C) y en un canal desglosado en gris (B’-C’). Además, se detectó la proteína total con la tinción estándar usando el anticuerpo α-HA en verde y en un canal desglosado en gris (B’’, C’’). A la derecha se muestran planos apicales (a, a’) y basales (b, b’) del disco de ala. Lpr2E y Lpr2F se acumulan con niveles similares en dos dominios, en las membranas celulares apicales y basolaterales. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. 1.4. Los altos niveles de expresión de Lpr2F inducen apoptosis Como hemos comentado anteriormente, la distribución de la isoforma Lpr2F después de su sobre-expresión en discos imaginales de ala es distinta según se detecte con anti-HA o con anti- Myc (Ver Figura 34). Teniendo en cuenta que el epítopo HA se localiza en la cola intracelular de Lpr2F mientras que el epítopo Myc se encuentra en el ectodominio, este resultado podría sugerir que la isoforma Lpr2F puede procesarse y perder su dominio intracelular cómo se ha descrito para otras proteínas de la familia LDLR, en particular LRP1 y Megalin (May et al,. RESULTADOS 103 2002 y Hjälm et al., 1996). Para examinar esta posibilidad, en primer lugar decidimos detectar la proteína Lpr2F-HA con un anticuerpo policlonal generado específicamente contra el dominio intracelular de Lpr2 (Parra-Peralbo and Culi, 2011) para comprobar si se reproducía la distribución detectada con anti-HA (Figura 35A). No fue el caso. Al sobre-expresar UAS- lpr2F-HA con ap-Gal4 en el disco imaginal y realizar una inmunotinción con anti-HA y anti- Lpr2, observamos que con este último se detecta claramente tinción en la zona del citoplasma intermedia mientras que con anti-HA no es así (Figura 35B-B’’). Estos datos sugieren que la diferencia en la distribución de Lpr2F-HA-Myc detectada con anti-HA y anti-Myc no se debe al procesamiento del dominio intracelular. Esta conclusión se confirmó al ver que la proteína Lpr2FrICD-HA, que consiste en la isoforma Lpr2F a la que se delecionó el dominio intracelular, no se detecta en el citoplasma celular en posiciones intermedias del eje apico-basal mediante el anticuerpo HA (Figura 35C-C’’). Por tanto, estos datos sugieren que las diferencias de distribución detectadas con anti-HA no se deben al procesamiento del dominio intracelular. Por otro lado, examinamos el posible procesamiento proteolítico del dominio intracelular mediante experimentos de western blot con extractos de células S2 y de discos imaginales de ala en los que se expresaron Lpr2E o Lpr2F (Figura 35D). Figura 35. El Efecto borde no se debe al procesamien- to del dominio intracelular. (A) Representación modular del receptor de lipoforinas mostrando la localización del epítopo HA en la región C-termi- nal (triángulo rojo) y del anticuerpo α-Lpr2 (azul) frente a la región intracelular. Expresión ectópica en el compartimento posterior del disco imaginal de ala de la isoforma Lpr2F (B) ó la isoforma Lpr2F careciendo del dominio citosólico: Lpr2FrICD (C). La distribución del receptor fue detectada con α-HA en verde y α-Lpr2 en rojo, ambos se muestran en un canal desglosado en gris. Anti-Lpr2 detecta expresión en la zona intermedia del del disco, mientras que anti-HA no. El anticuerpo frente al dominio intracelular no reconoce la quimera Lpr2FrICD(C’’). Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. (D) Western blot de células S2 (c) y discos de ala (d) expresando Lpr2E o Lpr2F. El panel superior se corresponde con la proteína completa y los paneles inferiores con los posibles productos resultantes del procesamiento de los receptores. La proteína se detectó con α-HA. Arriba se muestran las cantidades cargadas en el gel. RESULTADOS 104 Observamos en todos los casos una banda mayoritaria de alto peso molecular correspondiente a la proteína completa y un doblete minoritario de bajo peso molecular (alrededor de 18 kDa) que podría corresponder al dominio intracelular procesado (Figura 35D). Sin embargo, nuestros datos no permiten concluir que exista un procesamiento diferencial entre Lpr2E y Lpr2F. En la bibliografía se describe que el epítopo HA, presente en la región C-terminal de nuestros transgenes, puede procesarse y perder inmunorreactividad durante el proceso de muerte celular por apoptosis, ya que es reconocido por las caspasas (Schembri et al., 2007). Por esta razón, investigamos si la sobre-expresión de los receptores de lipoforinas podría estar induciendo apoptosis y ello interferir con la detección de las proteínas mediante anti-HA. Las células del disco imaginal de ala son extruidas basalmente del epitelio cuando sufren muerte celular por apoptosis, acumulándose en esa región (Figura 36B) (Li and Baker, 2007). Teniendo esto en cuenta, sobre-expresamos las isoformas Lpr2E y Lpr2F utilizando la línea activadora patched-Gal4 (ptc-Gal4) (Figura 36A-A’’, C-C’’ y D). Esta línea nos permite dirigir la expresión en una región muy limitada del disco (el borde antero-posterior). Vimos que la sobre-expresión de la isoforma Lpr2F induce la formación de agregados celulares en basal, detectados mediante microscopía Nomarski (Figura 36D), sugiriendo que hay un proceso apoptótico. Efectivamente, al teñir los núcleos celulares mediante la tinción DAPI observamos que estas células extruidas tenían núcleos picnóticos y además, co-localizan con la caspasa3 activada, un marcador de muerte celular (Figura 36C’ y C’’, respectivamente). Hemos visto anteriormente que la diferencia de la distribución entre ambos receptores se debe al tipo de péptido señal que presente. Por esta razón, decidimos analizar la correlación entre el tipo de péptido señal y la inducción de apoptosis tras su sobre-expresión. De este modo, al añadir el dominio LA1 a la isoforma Lpr2F se aprecian agregados celulares, indicando que hay muerte celular por apoptosis (Figura 36E-E’, recuadro amarillo), no obstante, las quimeras que contienen el dominio NCN (Figura 36F-F’), todo el dominio N-terminal (LA1+NCN) (Figura 36G-G’) o el péptido señal atípicamente largo de la isoforma Lpr2E (Figura 36H-H’), no se observó apoptosis. Por lo tanto, sólo se aprecian los agregados celulares característicos de la apoptosis (recuadro amarillo) con la quimera conteniendo el péptido señal típico (Figura 36E- E’). En cambio, el resto de quimeras que contienen el péptido señal largo no desencadenan el proceso apoptótico (Figura 36F-F’, G-G’ y H-H’). De este modo, los datos indican que el péptido señal además de determinar la distribución, también influye en la inducción de muerte celular por apoptosis. Todo ello sugiere que la ausencia de proteína en la región central del disco de ala, lo que hasta ahora hemos denominado “Efecto borde”, se debe al procesamiento del epítopo HA promovida por la muerte celular debido a la sobre-expresión de las isoformas y quimeras con péptido señal típico. Si es así, al bloquear la apoptosis se debería recuperar esta tinción. Co-expresamos el transgen UAS-lpr2F-HA junto con UAS-diap1, siendo DIAP1 una enzima E3-ubiquitín ligasa cuya función principal es la inhibición de la apoptosis mediante la degradación de las caspasas iniciadoras (Wang et al., 1999; Meier et al., 2000). Como puede observarse en la Figura 37A-A’’, la inmunotinción de la región central se recupera totalmente con el anticuerpo anti-HA al bloquear la apoptosis (desaparece el Efecto borde) mientras que ello no ocurre en el control en el que co-expresamos UAS-GFP (Figura 37B-B’’). RESULTADOS 105 Figura 36. La sobre-expresión de Lpr2F, pero no de lpr2E, induce apoptosis celular. (A,C,E-H) Expresión ectópica de las isoformas y quimeras indicadas de los receptores de lipoforinas en el borde antero-posterior del disco imaginal de ala. El receptor se detectó con α-HA en rojo, los núcleos en azul con DAPI y las células apoptóticas con α-casp3 activada en verde. (B) Esquema representando el epitelio del disco imaginal de ala, siendo apical arriba y basal abajo, donde se observa como las células apoptóticas caen hacia la región basal. Tomada de Bergantiños et al., 2010. (D) Imagen del disco imaginal de ala sobre-expresando la isoforma Lpr2F tomada mediante microscopia Nomarski. La sobre-expresión de Lpr2F (C, D) y de Lpr2F+LA1 (E) induce la acumulación de células apoptóticas en un dominio basal, mientras que no es así para Lpr2E (A) o para Lpr2F+NCN (F), Lpr2F+LA1+NCN (G) y SP(E)_Lpr2F (H). Barra de escala: 100 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. Por tanto, una de las principales diferencias en la distribución subcelular entre las isoformas Lpr2E y Lpr2F, la presencia del Efecto borde, se debe a un artefacto causado por el procesamiento del epítopo HA por caspasas. Sin embargo, otras diferencias en su distribución las observamos tanto en inmunotinciones con Myc como con anti-Lpr2. En particular observamos una preferente acumulación de la isoforma Lpr2F en la región apical en comparación con la isoforma Lpr2E que se distribuye homogéneamente y en vesículas. RESULTADOS 112 Figura 41. Alineamiento de secuencias de péptidos señal atípicamente largos procedentes de los receptores de lipoforinas (Lpr1 y Lpr2) de especies del género Drosophila y Ceratitis capitata. Resultado del alineamiento de múltiples secuencias por el servidor “Clustal W”. Los receptores de lipoforinas 1 están marcados en gris claro, mientras que los Lpr2 en gris oscuro. La especie Drosophila melanogaster está resaltada en negrita y las isoformas que hemos usado son Lpr2E y Lpr1H. En lila se muestran los aminoácidos hidrofóbicos (G, A, V, L, I, W, M y F), en verde con carga positiva (R, K y H) y en rojo con carga negativa (D y E). La flecha roja señala el posible sitio de corte del péptido señal predicho por PrediSi. La flecha verde indica un aminoácido atípico de carga positiva (K) presente en la región c del péptido señal de todas las especies mostradas. Los símbolos bajo las secuencias indican el tipo de alineamiento: (*) correcto, (:) residuos con propiedades estructurales y físico-químicas similares y (.) no hay coincidencia entre todas las secuencias alineadas. La barra de color bajo las secuencias muestra las distintas regiones de los péptido señal: (n) en amarillo, (h) en naranja y (c) en rojo. RESULTADOS 113 Hipotetizamos que la eficiencia del péptido señal largo podría estar regulada por los niveles de lípidos celulares, actuando como un componente de retroalimentación negativa, de forma que bajos niveles de lípidos celulares llevaran a una mayor eficiencia del péptido señal largo, mayor acumulación de Lpr2E y mayor adquisición de lípidos a partir de lipoforinas circulantes. Para analizar esta posibilidad, examinamos los niveles de la quimera UAS-lpr2F+NCN-HA por western blot en discos imaginales de ala en dos condiciones distintas: en fondo mutante para los receptores de lipoforinas (Df(3R)lpr1/2[2.41]), en el que hay un fuerte déficit de lípidos neutros celulares, y en fondo heterocigoto para esta mutación (Df(3R)lpr1/2[2.41]/TM6b), esencialmente silvestre en cuanto a los lípidos. Es importante recordar que la quimera UAS-lpr2F+NCN-HA contiene el péptido señal de Lpr2E y se expresa a niveles similares que UAS-lpr2E pero a diferencia de ésta, no induce la toma de lípidos por carecer del dominio LA1. Sobre-expresamos esta quimera en la zona que dará lugar al ala adulta con la línea activadora nub-Gal4 durante 24 horas (tiempo suficiente para que haya una cantidad detectable de proteína). Vimos que la cantidad de receptor es similar en ambas condiciones (Figura 42), sugiriendo que los niveles celulares de lípidos en el disco imaginal de ala no afecta la eficiencia del péptido señal largo. 2. Interacción de los receptores de lipoforinas con sus ligandos Estudios anteriores realizados principalmente en mamíferos han desvelado que las proteínas de la familia de los receptores LDLR tienen la capacidad de unir una amplia variedad de ligandos y como consecuencia de ello, desempeñar múltiples funciones. Esta versatilidad se debe a que sus dominios extracelulares, a pesar de estar compuestos únicamente por tres tipos básicos de dominios proteicos, éstos se encuentran repetidos y combinados de distintas formas dando lugar a ectodominios que pueden ser muy grandes y complejos. La visión más clásica establecía que los dominios LA también denominados de unión a ligando, eran los que determinaban la interacción con los ligandos extracelulares tales como las lipoproteínas, implicadas en metabolismo lipídico, o la proteína Reelin, relacionada con el desarrollo del sistema nervioso (Brown and Goldstein, 1986; Esser et al., 1988; Russell et al., 1989; Hiesberger et al., 1999). Sin embargo, más recientemente se han ido caracterizando otros dominios que también participan en la unión de ligandos. Por ejemplo, el β-propeller del LDLR humano interacciona con los dominios LA del propio receptor (Jeon and Blacklow, 2003; Andersen et al., 2013). Asimismo, el dominio EGF-A también del receptor LDL humano es el sitio de unión de la enzima PCSK9 (del inglés, Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), que al unirse induce la degradación del receptor (Zhan et al., 2007). Otro ejemplo es la proteína adaptadora Disabled 1 (Dab1), la cual interacciona con los receptores VLDLR y ApoER2 de mamíferos en Figura 42. El péptido señal largo no se ve afectado por los niveles de lípidos celulares. Western blot de discos imaginales de ala donde se ha sobre-expresado la quimera Lpr2F-NCN-HA en fondo mutante para lpr1 y lpr2 (Df(3R)lpr1/2[2.41]) y en fondo heterocigoto para la mutación (Df(3R)lpr1/2[2.41]/TM6). El receptor se detectó mediante α-HA (panel superior) y como control de carga usamos la proteína aPKC (panel inferior). RESULTADOS 114 la secuencia NPxY del dominio intracelular, iniciando de este modo la cascada de señalización de la proteína Reelin (Trommsdorff et al., 1998; Howell et al., 1999; Ranaivoson et al., 2016). Las distintas isoformas de los receptores de lipoforinas en Drosophila presentan idénticos dominios extracelulares, EGF-A, EGF-B, EGF-C y β-propeller. Sin embargo, difieren en el número e identidad de los dominios LA. Por ello, es altamente probable que estos últimos determinen su capacidad de interaccionar de forma diferencial con unos ligandos u otros. En la mayoría de insectos estudiados los receptores de lipoforinas contienen 8 dominios LA, el mismo número que el VLDLR humano, (Dantuma et al., 1999; Cheon et al., 2001; Seo et al., 2003; Lee et al., 2003a; Gopalapillai et al., 2006; Ciudad et al., 2007; Tufail et al, 2009 y Parra-Peralbo and Culi, 2011). No obstante, en el mosquito Aedes aegypti, la cucaracha alemana Blatella germanica y la mosca de la fruta Drosophila melanogaster se han encontrado variantes que contienen solamente 7, de manera similar al receptor LDLR de mamíferos (Seo et al., 2003; Ciudad et al., 2007 y Parra-Peralbo and Culi, 2011). Esto sugiere que el número de dominios LA podría ser importante para definir su capacidad de unir ligandos específicos. Por estos motivos, para estudiar las distintas capacidades de las isoformas de los receptores de lipoforinas para unir a sus ligandos hemos elegido las isoformas Lpr2E y Lpr2F que contienen distinto número e identidades de dominios LA, siendo 8 y 7 respectivamente. De este modo, decidimos abordar el estudio de la interacción de las diferentes isoformas de los receptores de lipoforinas con su ligando clásico, la lipoforina (Lp), así como otros dos interactores identificados en el laboratorio mediante experimentos de purificación por cromatografía de afinidad: Lipid Transfer Particle (LTP) y la Peroxidasina (tesis David Vaquero Escala, 2015 y Rodríguez-Vázquez et al., 2015). 2.1. Interacción de los receptores de lipoforinas con su ligando clásico: La lipoforina a) Interacción de los receptores de lipoforinas con la lipoforina Desde los años 90 hasta la actualidad, varios grupos han analizado en varias especies de insectos la unión de los receptores de lipoforinas con la lipoforina, principalmente mediante ensayos de unión a ligando tipo far western, también denominado ligand blotting assay. En la mayoría de los casos, el receptor no estaba purificado sino que se utilizaba un extracto crudo de un tejido que lo expresara y los resultados no son por tanto del todo concluyentes (Lee et al., 2003b). En Drosophila, la interacción física entre los receptores de lipoforinas y la lipoforina no ha sido demostrada. Por ello, en esta tesis abordamos este estudio mediante ensayos de co-inmunoprecipitación expresando los receptores en células S2 y en tejidos tales como las glándulas salivales y los ovarios. En un primer experimento de co-inmunoprecipitación, la lipoforina fue inmunopurificada a partir de hemolinfa extraída de larvas silvestres mediante esferas magnéticas dynabeadsproteína G conjugadas a un anticuerpo anti-lipoforina generado a partir de la proteína completa (α-ApoLp FL). Como control negativo conjugamos la matriz dynabeads-proteína G con suero de conejo (que contiene IgG inespecíficas). La matriz cargada con lipoforina y la matriz control se incubaron con extractos de células S2 que expresaban Lpr2E o Lpr2F. En el caso de que el receptor de lipoforinas interaccione con la lipoforina unida a las dynabeads, formará un complejo con ésta que podrá ser identificado mediante western blot. RESULTADOS 115 Como se observa en la Figura 43A, ni Lpr2E ni Lpr2F co-inmunoprecipitaron a pesar de que estos receptores se expresaban en las células S2 de forma adecuada y de que la lipoforina permaneció unida a las dynabeads durante todo el proceso. Este resultado fue sorprendente ya que la lipoforina había sido descrita como ligando de los receptores de lipoforinas en varios insectos (Seo et al., 2003b; Lee et al., 2003; Ravikumar et al., 2011). Por ello, nos preguntamos si se requeriría algún otro componente de la hemolinfa para que esta unión tuviera lugar. Realizamos un nuevo ensayo de co-inmunoprecipitación, esta vez pre-incubando lisados de células S2 que expresaban Lpr2E ó Lpr2F junto con una pequeña cantidad de hemolinfa extraída de larvas silvestres. Después de esta pre-incubación para permitir la posible formación de complejos lipoforina-receptor de lipoforina, inmunoprecipitamos los complejos mediante esferas magnéticas dynabeads-proteína G conjugadas a anti-lipoforina. Tampoco con estas nuevas condiciones co-inmunoprecipitó Lpr2E ó Lpr2F con la lipoforina (Figura 43B). En otra serie de experimentos expresamos los dominios extracelulares de Lpr2E y Lpr2F fusionados al módulo TAP (del inglés, Tandem Affinity Purification) en el cuerpo graso de larvas de Drosophila utilizando la línea activadora FB-Gal4, específica de cuerpo graso. Al pre-incubación de los extractos de células S2 que sobre-expresaban los receptores con una pequeña cantidad de hemolinfa. Los paneles superiores izquierdos muestran el revelado del eluído con (A) α-Myc o (B) α-HA de la Co-IP no observándose ninguna banda en ningún caso, y los derechos, los extractos iniciales. Los paneles inferiores muestran la cantidad de lipoforina inmunoprecipitada en el eluído detectado con α-ApoLp FL. El panel inferior izquierdo muestra la lipoforina detectada en el extracto inicial. (C) Co-IP de la lipoforina a partir de extracto de hemolinfa de larvas que expresaban los receptores solubles Lpr2E_ecto_ TAP y Lpr2F_ecto_TAP en el cuerpo graso, como control usamos hemolinfa de larvas white. Detectamos la lipoforina utilizando el anticuerpo específico frente a la subunidad pequeña α-ApoLp-II no observando diferencias entre el control y los receptores (flecha gris). A su vez, realizamos la detección de los receptores gracias al dominio de proteína A que poseen en la etiqueta TAP (flechas negras). Figura 43. Análisis de la interacción física entre los receptores de lipoforinas purificados de células S2 y la lipoforina. (A-B) Co-inmunoprecipitación del receptor a partir de extractos de células S2 en los que se han sobre-expresado Lpr2E-HA-Myc o Lpr2F- HA-Myc. La lipoforina fue inmunopurificada de hemolinfa de larvas silvestres utilizando un anticuerpo específico para la lipoforina y suero de conejo como control. (B) Se realizó una RESULTADOS 116 carecer de dominio transmembrana, las proteínas Lpr2E extracelular (Lpr2E_ecto_TAP) y Lpr2F extracelular (Lpr2F_ecto_TAP) se secretan y se acumulan en la hemolinfa de las larvas, donde potencialmente podrían interaccionar con la abundante lipoforina presente. En estos experimentos extrajimos la hemolinfa de las larvas que expresaban Lpr2E_ecto_ TAP o Lpr2F_ecto_TAP e inmunoprecipitamos los receptores de lipoforinas haciendo uso del dominio artificial TAP al que están fusionados mediante una matriz magnética conjugada a IgG. Las IgG interaccionan con alta afinidad con el dominio proteína A presente en el módulo artificial TAP. En la Figura 43C pudimos comprobar que efectivamente, inmunoprecipitábamos cantidades fácilmente detectables de receptores de lipoforinas (flechas negras). Sin embargo, no vimos co-inmunoprecipitación de lipoforina superior al control negativo (hemolinfa de larvas white) ni con Lpr2E_ecto_TAP ni con Lpr2F_ecto_TAP (flecha gris). En algunos experimentos no mostrados incrementamos la concentración de sales en la solución de lavado desde 150 mM hasta 200 mM para facilitar la formación de complejos multiproteicos. Sin embargo, tampoco así pudimos detectar una interacción específica. Como se ha mencionado antes, estudios realizados en varios insectos identificaron una interacción entre los receptores de lipoforinas y la lipoforina utilizando extractos crudos que contenían los receptores mediante la técnica de far western blot. En Drosophila, por su pequeño tamaño y la dificultad de extraer hemolinfa, es muy complejo purificar lipoforina a las altas concentraciones y cantidades requeridas para el uso de esta técnica. Se ha intentado en otro laboratorio, pero sin éxito (tesis de Richard Dunbar Yaffe. Universidad de Toronto, 2008). Por ello, descartamos utilizar esta técnica. La falta de interacción que observamos podría deberse a que los complejos lipoforina-receptor sólo se forman de manera eficiente en su contexto fisiológico, es decir, en la membrana plasmática y con la participación de otros posibles cofactores. Por ello decidimos cambiar la estrategia y realizar ensayos de Co-IP utilizando como material de partida tejidos larvarios en los que se sobre-expresaba Lpr2E o Lpr2F en las membranas expuestas a la hemolinfa, permitiendo de esta manera la formación de los complejos lipoforina-receptor in vivo en su contexto fisiológico. Inicialmente, utilizamos las glándulas salivales para este ensayo ya que en Callejo et al., 2008 muestran como la lipoforina co-inmunoprecipita con el receptor de membrana Patched, expresando dicho receptor en glándulas salivales, siendo por tanto, también una buena opción para nuestro estudio. En primer lugar, expresamos las isoformas UAS-lpr2E-HA y UAS-lpr2F-HA en glándulas salivales usando la línea activadora AB.1-Gal4 (Figura 44A) y realizamos el ensayo inmunoprecipitando la lipoforina con matriz magnética conjugada al anticuerpo anti-lipoforina y detectando el receptor con anti-HA, un epítopo presente tanto en UAS-lpr2E-HA como en UAS-lpr2F-HA. Sorprendentemente, en estas condiciones la lipoforina co-inmunoprecipitó con ambos receptores, siendo esta interacción muy robusta (Figura 44B). Al contrastar notablemente este resultado con los obtenidos anteriormente, decidimos incluir en el ensayo otra proteína no relacionada como un control negativo adicional para examinar si la interacción observada podría tratarse de un artefacto. Este control negativo debía de ser una proteína de membrana que además contuviera el epítopo HA en el extremo C-terminal o Myc en la región extracelular. En la bibliografía encontramos el transgen UAS-perdido-HA o KON-tiki, siendo una proteína transmembrana localizada en los miotubos cuya función principal es la adhesión de estas células con las células tendinosas para generar una unión estable entre ellas (Schnörrer et al., 2007). Estructuralmente es similar al receptor de lipoforina, presentando un gran ectodominio y una región intracelular más pequeña con la presencia del epítopo HA en el extremo C-terminal. Por consiguiente, decidimos expresar ambos receptores y Perdido en glándulas salivales y realizar la co-inmunoprecipitación en las dos direcciones posibles: inmunoprecipitando la lipoforina (Figura 44C) e inmunoprecipitando los receptores o Perdido vía el epítopo HA (Figura 44D). RESULTADOS 117 El resultado muestra que Perdido aparecía en complejos con la lipoforina independientemente de la dirección de la co-inmunoprecipitación y de forma semejante a Lpr2E o Lpr2F, aunque al inmunoprecipitar los receptores y Perdido vía el epítopo HA, la cantidad de lipoforina recuperada no era muy abundante (Figura 44D). Por tanto, los receptores de lipoforinas pueden co-inmunoprecipitar con la lipoforina en determinadas situaciones experimentales a través de una interacción inespecífica. Esto podría deberse a que las lipoforinas formaran agregados proteicos, como se ha descrito en casos anteriores (Wilson et al., 1991; Walsh and Atkinson , 1990) y estos agregados contuviera otras proteínas presentes en el momento de preparación del lisado celular. Figura 44. Análisis de la interacción física entre los receptores de lipoforinas purificados de glándulas salivales y la lipoforina. (A) Sobre-expresión de UAS-lpr2E-HA en glándulas salivales, usando la línea activadora AB.1-Gal4. La detección del receptor se realizó con α-HA en verde y la distribución de las lipoforinas con α-ApoLp FL en rojo. El receptor se localiza principalmente en las membranas de las glándulas salivales. CG: Cuerpo Graso (B-D) Coinmunoprecipitación del receptor a partir de extractos de glándulas salivales en los que se ha sobre-expresado (B) Lpr2E-HA y Lpr2F-HA y (C) Lpr2E-HA y Perdido-HA. La lipoforina fue inmunopurificada utilizando el anticuerpo específico α-ApoLp FL y suero de conejo como control. Los paneles superiores izquierdos muestran la detección con α-HA de los receptores presentes en el eluído de la Co-IP, mostrando una fuerte interacción entre la lipoforina y los receptores, y los derechos, los extractos iniciales. Los paneles inferiores muestran la cantidad de lipoforina inmunoprecipitada del eluído detectada con α-ApoLp FL. (D) Co-IP de la lipoforina a partir de extractos de glándulas salivales en los que se ha sobre-expresado Lpr2E-HA, Lpr2F- HA o Perdido-HA. En el panel superior detectamos la lipoforina co-inmunoprecipitada con el anticuerpo α-ApoLp FL, mostrando que no hay diferencias entre los receptores de lipoforinas y Perdido. En los paneles inferiores, detectamos con α-HA los receptores procedentes del eluído (izquierda) y del extracto inicial (derecha). (D). Barra de escala: 100 μm. RESULTADOS 118 Tras los problemas que experimentamos en los ensayos a partir de glándulas salivales, decidimos utilizar los ovarios como tejido alternativo, ya que de forma natural expresa los receptores de lipoforinas y éstos son esenciales para la adquisición de lípidos y el correcto desarrollo de los ovarios (Parra-Peralbo and Culi, 2011). Por otro lado, el gran tamaño de los ovarios nos permitía obtener fácilmente una gran cantidad de proteína. De este modo, llevamos a cabo el ensayo sobre-expresando los transgenes UASp-lpr2E-HA y UASp-lpr2F-HA en la línea germinal usando la línea activadora V32-Gal4 (Figura 45A). Realizamos Co-IPs en las dos direcciones posibles: inmunoprecipitando la lipoforina (Figura 45B) e inmunoprecipitando el receptor (Figura 45C). El resultado fue muy parecido al obtenido utilizando las glándulas salivares como tejido de partida, observando una fuerte co-inmunoprecipitación en el primer caso (Figura 45B) y débil en el segundo (Figura 45C). Desafortunadamente no nos fue posible encontrar una proteína que pudiera usarse de control negativo y cuya expresión pudiera dirigirse a los ovarios, es decir, que estuviera clonado en el plásmido UASp. Por tanto, es difícil concluir si la inmunoprecipitación detectada se corresponde a una interacción específica. Figura 45. Análisis de la interacción física entre los receptores de lipoforinas purificados de ovarios y la lipoforina. (A) Sobre-expresión de UASp-lpr2E-HA en la línea germinal de los ovarios usando la línea activadora V32-Gal4. La detección del receptor se realizó con α-HA en verde, la faloidina en rojo para mostrar la morfología del tejido y los núcleos teñidos con DAPI en azul. El receptor se acumula fundamentalmente en las membranas de las células nutricias (flechas) del estadio 10. n: células nutricias, o: oocito. Barra de escala: 100 μm. Co-inmunoprecipitación del receptor (B) o de la lipoforina (C) a partir de extractos de ovarios en los que se ha sobre-expresado UASp-lpr2E-HA o UASp-lpr2F- HA en la línea germinal. La lipoforina (B) y los receptores (C) fueron inmunopurificados utilizando el anticuerpo específico α-ApoLp FL y α-HA respectivamente. Como controles se usaron suero de conejo en (B) y extracto de ovarios Oregon R (OR) en (C). Los paneles superiores muestran (B) la detección con α-HA de los receptores co-inmunoprecipitados, apareciendo una banda con ambos receptores. (C) La lipoforina con α-ApoLp FL, mostrando como la señal con el control es más débil que con los receptores. En los paneles inferiores detectamos (B) con α-ApoLp FL la cantidad de lipoforina inmunoprecipitada y (C) con α-HA los receptores procedentes del eluído (izquierda) y del extracto inicial (derecha). RESULTADOS 119 El conjunto de todos estos resultados nos sugiere que la interacción del receptor de lipoforina con la lipoforina es muy débil y/o transitoria. Esto concuerda con las constantes de disociación calculadas para el LDLR humano, que son medias-altas. Una vez realizados los ensayos bioquímicos, quisimos ampliar el estudio de esta interacción mediante experimentos in vivo. En Parra-Peralbo and Culi, 2011, describen como la expresión de la isoforma Lpr2E estabiliza extracelularmente la lipoforina. Esto sugiere que al menos Lpr2E debe interaccionar de alguna forma con la lipoforina, aunque pueda ser de forma indirecta. Para comparar la capacidad de las distintas isoformas en mediar esta estabilización y conocer qué dominios proteicos son relevantes para llevarla a cabo, sobre-expresamos en el compartimento posterior de discos imaginales de ala UAS-lpr2E-HA, UAS-lpr2F-HA así como quimeras en las que dominios específicos de Lpr2E y de Lpr2F se intercambiaron, usando la línea activadora hh- Gal4. En estos experimentos inhibimos la endocitosis durante las 3 horas previas a la disección utilizando para ello el alelo termosensible de shibire (shits), homólogo de la dinamina humana. La falta de función de shi impide la escisión de las vesículas endocíticas de la membrana plasmática. En estas condiciones, al inhibirse la endocitosis, se produce una acumulación de receptores en la membrana plasmática, incluyendo los receptores sobre-expresados Lpr2E y Lpr2F, y con ello también se acumulan sus ligandos. De esta forma se sensibiliza el ensayo, permitiendo detectar interacciones receptor-ligando por inmunohistoquímica que no serían detectables de otra forma. Los resultados muestran como la expresión de la isoforma Lpr2E induce una importante acumulación de lipoforina principalmente en la membrana basolateral (Figura 46B). Por el contrario, esta acumulación es bastante menor al expresar la isoforma Lpr2F (Figura 46A). Estas diferencias no se deben a que Lpr2E y Lpr2F se expresen a distintos niveles ya que cuando examinamos la cantidad de receptor en la membrana plasmática realizando un protocolo de inmunotinción que únicamente detecta los epítopos extracelulares, observamos como ambas isoformas se acumulaban con niveles similares, localizándose principalmente en la membrana basolateral (Figura 34A-A’). Para identificar los módulos proteicos presentes en Lpr2E que le confieren esta alta capacidad para estabilizar la lipoforina, examinamos distintas proteínas quiméricas. Cuando añadimos el dominio LA1 a Lpr2F observamos un ligero aumento de la acumulación de lipoforina (Figura 46C). Sin embargo, la adición de LA1+ED o la región N-terminal completa de Lpr2E (LA1+NCN), confieren la misma capacidad de acumular lipoforinas que la isoforma Lpr2E (Figura 46D y F, respectivamente). El dominio LA1 es esencial para esta acumulación, ya que la quimera que contiene el dominio NCN y carece del LA1 (Lpr2F+NCN) induce la estabilización de lipoforina de forma parecida a Lpr2F (Figura 46E). Estos resultados sugieren que ambas isoformas inducen la acumulación o estabilización extracelular de la lipoforina in vivo, aunque esta capacidad se ve incrementada por la presencia del dominio LA1 de la isoforma Lpr2E, siendo éste fundamental para la estabilización robusta de la lipoforina. Además, el módulo ED potencia aún más la capacidad para estabilizar la lipoforina. En Parra-Peralbo and Culi, 2011 se demostró que el dominio LA1 era también primordial para que la toma de lípidos tuviera lugar. Por lo tanto, es posible que esta estabilización extracelular de lipoforina tenga una relación directa con la adquisición celular de lípidos. RESULTADOS 120 Figura 46. Los dominios LA1 y ED de los receptores de lipoforinas se requieren para una robusta estabilización de la lipoforina en discos imaginales de ala. (A-F) Discos imaginales de ala expresando en el compartimento posterior diferentes isoformas y quimeras de los receptores de lipoforinas según se indica. Todas las imágenes fueron tomadas en un plano basal. La detección del receptor y las quimeras se realizó con α-HA en rojo, la lipoforina se muestra en verde y también en gris en un canal desglosado (en el panel inferior). Todas las inmunotinciones fueron realizadas después de bloquear la endocitosis durante 2,5 horas. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo aumento. b) Efecto de la expresión de los receptores de lipoforinas sobre la endocitosis de lipoforina En mamíferos, el receptor LDLR desempeña un papel fundamental en el metabolismo lipídico, ya que capta las lipoproteínas circulantes ricas en colesterol (LDL) y las internaliza en la célula por un proceso de endocitosis mediada por clatrina (Brown and Goldstein, 1986). De manera similar, se ha descrito como los homólogos de estos receptores en insectos, los receptores de lipoforinas, son capaces de endocitar lipoforina en células transfectadas en cultivo y en el cuerpo graso (Dantuma et al., 1999; Van Hoof et al., 2003; 2005). Del mismo modo, se ha visto que Lpr1 en Drosophila endocita la serpina necrotic (Soukup et al., 2009) y ambos receptores, Lpr1 y Lpr2, cuando se sobre-expresan en discos imaginales de ala inducen la endocitosis de la lipoforina (Callejo et al., 2008 y Khaliullina et al., 2009). Sin embargo, a pesar de que los receptores son capaces de endocitar estas lipoproteínas, a diferencia del receptor LDL humano, la toma de lípidos neutros en Drosophila tiene lugar por un proceso independiente de endocitosis (Parra- Peralbo and Culi, 2011). Confirmamos estos datos bloqueando la endocitosis durante 8 horas en RESULTADOS 121 clones de shits en discos imaginales de ala. No observamos cambios en el patrón de acumulación de lípidos (Figura 47D). Por esta razón, decidimos comparar la capacidad de endocitar la lipoforina de las isoformas Lpr2E y Lpr2F. Para ello, los transgenes UAS-lpr2E-HA y UAS-lpr2F-HA se sobre-expresaron en el compartimento posterior de discos imaginales de ala junto con el marcador de endosomas tempranos UAS-rab5-GFP. En la Figura 47A-C, se observa como ambas isoformas inducen la endocitosis de lipoforinas y que además, estas vesículas, co-localizan parcialmente con el marcador de endosomas tempranos Rab5-GFP. Es importante resaltar que la mayor parte de la endocitosis de lipoforinas tiene lugar en la zona apical, tal como se observó anteriormente en Callejo et al., 2008. Esto contrasta con el hecho de que la mayor parte de la lipoforina estabilizada extracelularmente tenga lugar en la región basolateral (Figura 46A-F). Figura 47. Los receptores de lipoforinas median la endocitosis de lipoforina en discos imaginales de ala. UAS-rab5-GFP y UAS-lpr2E-HA (A y B) o UAS- lpr2F-HA (C) fueron co-sobre- expresados en el compartimento posterior de discos imaginales de ala usando la línea activadora en-Gal4. Los receptores de lipoforinas fueron detectados con α-HA en azul, Rab5-GFP en verde y la lipoforina en rojo. Todos se muestran en un canal desglosado. Sección transversal (A) y secciones apicales (B y C) de discos imaginales de ala. Se aprecian múltiples vesículas conteniendo lipoforina, Rab5 y el receptor (flechas amarillas), demostrando que tanto Lpr2E como Lpr2F inducen la endocitosis de lipoforinas. (D) Discos imaginales de ala conteniendo clones de shits homocigotos. Los clones se identificaron por la ausencia del marcador GFP (rojo) y son resaltados con unas líneas. Los lípidos neutros están teñidos con Nile Red (verde) y mostrados en un canal desglosado. No hay cambios en el patrón de acumulación de los lípidos. Barra de escala: 10 μm (A-C) y 100 μm en D. RESULTADOS 128 RESULTADOS 129 Figura 51. El dominio LA1 extendido encontrado en algunas isoformas de los receptores de lipoforinas se requiere para su fuerte unión al LTP. (A-L y N-O) Sección basal de discos imaginales de ala sobre-expresando las distintas isoformas y quimeras de los receptores de lipoforinas en el compartimento posterior (hh-Gal4) detectadas con α-HA en rojo. La distribución del LTP es mostrado en verde y también en un canal desglosado. Los paneles marcados como “endoc-“ muestran discos imaginales en los cuales la endocitosis fue bloqueada durante 3 horas previas a la disección por la inactivación del alelo termosensible de shibire (C,D,G,H,K,L,N,Ñ y O). Todas las imágenes están mostradas al mismo aumento. Barra de escala: 10 μm. (M) Co-IP del LTP de algunas isoformas y quimeras de los receptores de lipoforinas. Lpr2F, Lpr2F+LA1, Lpr2F+LA1+ED y Lpr2E fueron expresadas y purificadas en células S2 de Drosophila e incubadas con hemolinfa diluida de larvas silvestres. Los receptores de lipoforinas y las quimeras fueron inmunoprecipitadas con α-HA y los eluídos detectados mediante western blot con α-LTP (panel superior) y α-HA (panel inferior). El último carril contiene hemolinfa. detección. Concordando con los resultados descritos anteriormente, todas las quimeras que contienen los dominios LA1+ED, acumulan LTP en la región basolateral (Figura 51C, G y K), mientras que después de expresar Lpr2F o la quimera que carece de LA1 (Lpr2F+NCN) no se observa dicha acumulación (Figura 51D y L). Sorprendentemente, vimos que la quimera Lpr2F+LA1 era capaz de inducir una cierta acumulación de LTP, que era indetectable en condiciones normales (Comparar Figura 51F y H). Con lo observado en estos experimentos, podemos concluir que el dominio LA1 confiere cierta capacidad de unión al LTP, y que la adición de los 16 aminoácidos precedentes (ED) incrementa considerablemente esta interacción. Corroboramos los resultados mostrados in vivo mediante ensayos in vitro de coinmunoprecipitación entre los receptores de lipoforinas y el LTP. Los receptores de lipoforinas y sus quimeras fueron purificados de células S2 transfectadas con los respectivos plásmidos de expresión mediante una matriz magnética conjugada a proteína G y a α-HA. Esta matriz cargada ya con las distintas isoformas o sus quimeras fue incubada con hemolinfa diluida procedente de hemolinfa de larvas silvestres, que contiene LTP. Después de los lavados, la posible presencia de LTP unido a la matriz fue examinada mediante western blot. En la Figura 51M se muestra como Lpr2F no interacciona con el LTP. En cambio, al añadir el dominio LA1 se aprecia como existe cierta interacción. Asimismo, cuando extendemos esta región con los 16 aminoácidos precedentes (ED), observamos como aumenta sustancialmente la afinidad con el LTP a niveles similares a los de la isoforma Lpr2E. Por lo tanto, el ED ejerce un efecto sinérgico junto con el dominio LA1, aumentando la afinidad de los receptores de lipoforinas por el LTP. El dominio LA1 extendido también está presente en algunas isoformas de lpr1. Por tanto, nos preguntamos si éstas también tendrían afinidad por el LTP. Para ello, sobre-expresamos varias isoformas de Lpr1 en discos imaginales de ala y examinamos su capacidad de inducir la acumulación de LTP. En estos experimentos inhibimos la endocitosis para aumentar su sensibilidad. Cuando sobre-expresamos las isoformas Lpr1H o Lpr1J, que presentan el dominio LA1, pudimos observar acumulación de LTP en la región basolateral de las células (Figura 51N y Ñ). Por el contrario, esto no ocurre con Lpr1M, la cual carece de este dominio (Figura 51O). Todos estos datos demuestran que sólo las isoformas que contienen el dominio LA1 extendido (LA1+ED) son capaces de interaccionar con el LTP eficientemente. Como el dominio LA1 se ha demostrado que es fundamental para la adquisición de lípidos, nuestros datos sugieren que la unión del LTP a los receptores de lipoforinas está relacionado con este proceso. RESULTADOS 130 Figura 52. Análisis de los dominios LA entre distintas especies de dípteros y Drosophila.(A)Árbol filogenético obtenido a partir de los distintos LA1-9 de los receptores de lipoforinas de varias especies de dípteros. Obsérvese que los dominios LA se agrupan según su posición en la proteína (http://www.genome.jp/tools/ clustalw). (B) Ampliación del primer cluster de (A) mostrando los distintos dominios LA1 agrupados dependiendo del gen al que pertenecen. (C) Resultado del alineamiento de múltiples secuencias por el servidor “Clustal W” pertenecientes a los dominios LA1-9 de la isoforma Lpr2E (arriba de distintas especies de dípteros y del género de Drosophila (abajo). Los colores representan las propiedades físico-químicas de los aminoácidos: morado, verde y rojo para los residuos hidrofóbicos, positivos y negativos respectivamente. Las 6 cisteínas características de los dominios LA se indican en morado oscuro. Los símbolos bajo las secuencias indican el tipo de alineamiento: (*) correcto, (:) residuos con propiedades estructurales y físico-químicas similares y (.) no hay coincidencia entre todas las secuencias alineadas. Los residuos mostrados en la barra gris debajo del alineamiento son los aminoácidos conservados entre todas las secuencias, los indicados en rojo señalan aquellos que son específicos para el dominio LA1. Las secuencias utilizadas son: Drosophila (D. melanogaster lpr1Q9VBN0 lpr2Q7YU01, D. erecta lpr1B3P6F8 lpr2B3P6F9, D. ananassae lpr1B3LYM0 lpr2B3LYM1, D. pseudoobscura lpr1B5DYP7, D. persimilis lpr1B4GFZ1, D. virilis lpr1B4M4P2 lpr2B4M4P1, D. mojavensis lpr1B4K4V9 lpr2B4K4V0, D. willistoni lpr1B4NJC5 lpr2B4NJC7, D. yakuba lpr2B4PTH2, D. sechellia lpr2B4ICD0 y D. grimshawi lpr2B4JT37), así como de la mosca de la fruta del mediterráneo Ceratitis capitata gi499011708, Musca domestica XP_005180047 y el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti Q963T3. RESULTADOS 131 Comparación del dominio LA1 entre especies Al percatarnos de que el dominio LA1 era crítico tanto para la unión con el LTP como para la adquisición de lípidos, decidimos llevar a cabo un estudio de su secuencia con el propósito de encontrar características específicas que lo diferenciaran del resto de dominios LA y que pudieran aportarle la particularidad de interaccionar con el LTP. Para ello nos ayudamos de la comparación filogenética de las secuencias de los receptores de lipoforinas en distintas especies. En primer lugar, obtuvimos las secuencias de receptores de lipoforinas en diferentes especies. Extrajimos las secuencias de los distintos dominios LA, que identificamos por contener 6 cisteínas características que establecen tres puentes disulfuro, y medir entorno a 30 aminoácidos. Un alineamiento múltiple de todos los dominios LA (http://www.genome.jp/ tools/clustalw) produjo un árbol filogenético en el que los dominios LA1 se agrupan según su identidad independientemente de la especie de la que proceda (Figura 52A). Ello es compatible con que los dominios LA1 contengan secuencias que no están presentes en los otros tipos de dominio LA. Al centrarnos en el LA1, observamos como dentro del cluster, se agrupan a su vez dependiendo del gen al que pertenezcan lpr1 o lpr2 (Figura 52B). Para identificar aquellos residuos conservados característicos de LA1, que no están presentes en los LA2-9, comparamos el alineamiento de los LA1 con el de todos los dominios LA de Lpr2E. Varios aminoácidos están conservados en todos los LA, como ya había sido descrito en Tufail and Takeda, 2008 (CDxxxDCxDGSDE). Sin embargo, observamos varios aminoácidos conservados en los LA1 que no están presentes en LA2-9, lo que sugiere que podrían ser relevantes para la interacción con el LTP (Figura 52C, arriba). En particular nos llaman la atención los aminoácidos cargados tanto negativa (D: Aspártico, E: Glutámico) como positivamente (K: Lisina) en el extremo amino de la secuencia, y un amino ácido de carácter hidrofóbico en la región central (I: Isoleucina), marcados en rojo en la Figura 28C, abajo. Por tanto, un posible sitio de unión entre el receptor y el LTP podría situarse en la región N-terminal del dominio LA1 (D/EEK), siendo la región más cercana a los 16 aminoácidos que constituyen el dominio extendido (ED). e) La interacción de la isoforma Lpr2E con su ligando LTP se requiere para la estabilización de la lipoforina Hemos comprobado que el dominio LA1 extendido (LA1+ED) presente en algunas isoformas de los receptores de lipoforinas es esencial para la acumulación extracelular de los ligandos lipoforina y LTP en la región basolateral de las células del epitelio. La acumulación de ambos correlaciona con la toma de lípidos por las células. Por un lado, tienen lugar cuando sobreexpresamos la isoforma Lpr2E, que media la toma de lípidos y no con Lpr2F, que no la media (Parra-Peralbo and Culi, 2011) y por otro, al eliminar el LTP o la lipoforina circulante mediante su silenciamiento por ARNi, tejidos como los ovarios o discos imaginales de ala ven reducida su capacidad de adquirir lípidos (Palm et al., 2012 y Figura 50). Por esta razón nos preguntamos si la acumulación del LTP y la estabilización extracelular de la lipoforina son procesos relacionados o independientes. Para averiguarlo, disminuimos la cantidad de LTP en la hemolinfa y analizamos la estabilización de la lipoforina en discos imaginales de ala. Expresamos simultáneamente un ARN interferente contra el gen apoLTP (UAS-apoLTP-i) y el receptor Lpr2E (UAS-lpr2E) tanto en el cuerpo graso a través de la línea activadora Cg-Gal4 como en la región posterior del disco imaginal de ala mediante la línea activadora hh-Gal4. Como la expresión continuada de UAS-apoLTP-i en el cuerpo graso es letal, limitamos la expresión de ambos transgenes temporalmente usando el sistema Gal80ts. Vimos que la expresión de estos RESULTADOS 132 transgenes durante dos días en el periodo larvario disminuía la cantidad de LTP circulante hasta niveles indetectables por western blot. Por el contrario, los niveles de lipoforina no se vieron afectados como se muestra en la Figura 53C. Como el gen apoLTP no se expresa en el disco de ala, la sobre-expresión de UAS-apoLTP-i en el mismo no esperamos que tenga ningún efecto. Como se ha descrito previamente, la expresión de Lpr2E en discos de ala produce la estabilización extracelular de la lipoforina en las membranas basolaterales (Figura 53A-A’). Esta acumulación se ve drásticamente disminuida al reducir la cantidad de LTP circulante (Figura 53B-B’). Estos resultados demuestran que la estabilización extracelular de la lipoforina requiere del reclutamiento previo o simultáneo del LTP mediante los receptores de lipoforinas. Figura 53. La estabilización extracelular de lipoforina por parte de Lpr2E requiere del LTP. (A y B) Discos imaginales de ala expresando UAS-lpr2E-HA en el compartimento posterior (hh-Gal4). Lpr2E-HA se muestra en rojo, mientras que la lipoforina extracelular en verde y también en canales separados (A’ y B’). (A) Disco control (B) apoLTP fue silenciado por la expresión de UAS-apoLTP-i en el cuerpo graso (Cg-Gal4) durante 2 días previos a la disección. El uso del sistema Gal80ts fue requerido para el control temporal. Se observó una gran reducción de lipoforina extracelular. El genotipo completo de (B) es Cg-Gal4,tub-Gal80ts/ UAS-lpr2E-HA;hh-Gal4/UAS-apoLTP-i. Barra de escala: 10 μm. (C) Western blot de muestras de hemolinfa procedente de larvas silvestres (Silv., líneas 2-4) y larvas experimento (Exp., líneas 5-7) descritas en (B). El LTP y la lipoforina fueron detectadas usando los anticuerpos indicados. Tres réplicas biológicas fueron analizadas para cada genotipo. Las proteínas totales fueron teñidas con Coomassie coloidal siendo el control de carga. Los marcadores de peso molecular fueron cargados en las líneas 1 y 8. Los niveles de LTP circulante son indetectables en los animales experimentales mientras que los niveles de lipoforina son equivalentes al control. RESULTADOS 133 Un efecto parecido también se observó en el cuerpo graso. Al expresar exclusivamente el receptor Lpr2E en este tejido se apreció un incremento en la acumulación tanto del LTP como de la lipoforina en la superficie celular (Figura 54 Comparar C-C’ y D-D’ con A y B). Por el contrario, cuando expresamos Lpr2E y a su vez silenciamos la expresión de apoLTP con el uso de un ARN interferente (UAS-apoLTP-i) en el cuerpo graso, la cantidad de lipoforina en la superficie de los adipocitos disminuyó fuertemente (Figura 54 Comparar F-F’ con D-D’), y como era esperable, el LTP fue indetectable (Figura 54E-E’). Por tanto, vemos que en ambos tejidos, los discos imaginales y el cuerpo graso, el LTP es indispensable para la asociación de la lipoforina con Lpr2E. Figura 54. El LTP también es necesario para la estabilización de la lipoforina en las células del cuerpo graso. Las larvas fueron crecidas a 18ºC y transferidas a 29ºC durante los 2 días previos a la disección para activar los transgenes UAS. La distribución del LTP y la lipoforina se muestran en rojo, los núcleos (DAPI) en azul y la sobre-expresión de Lpr2E-HA en verde. (A) El LTP se acumula en las membranas celulares del cuerpo graso silvestre. Esta acumulación es fuertemente incrementada al sobre-expresar Lpr2E (C) e indetectable cuando se co-expresa con ApoLTP-i (E). (B) La lipoforina puede ser detectada tanto en las membranas celulares como en el citoplasma de las células del cuerpo graso silvestre. (D) La expresión de Lpr2E incrementa la cantidad de lipoforina acumulada en las membranas, sin embargo, (F) cuando se co-expresa con ApoLTP-i la lipoforina se reduce a niveles similares al silvestre, indicando que el incremento de la acumulación de lipoforina inducida por Lpr2E requiere LTP. Barra de escala: 100 μm. RESULTADOS 134 Los datos que acabamos de presentar sugieren que Lpr2E recluta al LTP y a la lipoforina a la membrana plasmática formando un complejo trimérico cuya estabilidad requiere al menos del LTP, ya que en ausencia de LTP la lipoforina no se une a lpr2E o lo hace con muy baja afinidad. El requerimiento de la lipoforina para la formación del complejo Lpr2E-LTP no se ha podido analizar directamente ya que la falta de lipoforina produce letalidad. Sin embargo, en la Figura 49A mostramos que el LTP permanece unido a Lpr2E en ausencia de lipoforina, indicando que al menos la lipoforina no se requiere para la estabilidad de la unión lpr2E-LTP in vitro. Teniendo esto en cuenta, quisimos analizar la estabilidad del complejo Lpr2E-LTP-lipoforina a lo largo del tiempo in vivo. Para ello expresamos el receptor Lpr2E en la región posterior de discos imaginales de ala y previo a la fijación del tejido, realizamos lavados en PBS a 4ºC durante periodos crecientes de tiempo (30 y 60 minutos). Durante el lavado, el LTP y/o la lipoforina podrían disociarse del complejo, estando la endocitosis del complejo bloqueada por la baja temperatura. De este modo, pudimos apreciar como la lipoforina inicialmente estabilizada por Lpr2E se va disociando a lo largo del tiempo (Figura 55A-C), mientras que el LTP se mantiene unido al receptor (Figura 55D-E), indicando que el complejo trimérico formado no es estable. Una posibilidad es que el complejo trimérico Lpr2E-LTP-lipoforina represente un intermediario funcional que sólo es estable durante el tránsito de los lípidos desde la lipoforina al LTP. Figura 55. La asociación de la lipoforina con las células mediada por Lpr2E es transitoria. (A-F) Secciones basales de discos imaginales de ala sobre-expresando UAS-lpr2E-HA (α-HA en rojo) en el compartimento posterior. La endocitosis fue inhibida durante 3 horas y los discos fueron fijados inmediatamente (A y D) o lavados durante 30 minutos (B y E) o 60 minutos (C y F) en medio de cultivo celular a 4ºC. La distribución de la lipoforina (A-C) y del LTP (D-F) se muestra en verde y también en canales separados. Barra de escala: 50 μm. f) Conservación de la función de los receptores LDLR Hemos descrito como el reclutamiento del LTP en las membranas basolaterales de los discos imaginales de ala por parte de la isoforma Lpr2E gracias al dominio LA1 extendido (LA1+ED) RESULTADOS 135 es probablemente el paso inicial para que la toma de lípidos tenga lugar, ya que facilita la estabilización extracelular de lipoforina y la transferencia de lípidos. Si esta premisa es correcta, reclutar LTP a la membrana plasmática podría ser suficiente para inducir la entrada de lípidos. Nos planteamos analizar esta hipótesis intentando crear un receptor artificial que tuviera la capacidad de unir al LTP. Para ello añadimos el dominio LA1 extendido al LDLR humano, que por su parecido estructural a los receptores de lipoforinas tiene mayor probabilidad de reconstituir un receptor funcional. Por simplicidad, añadimos todo el dominio N-terminal de la isoforma Lpr2E, conteniendo además del dominio LA1 extendido, el péptido señal y el dominio NCN completo (LA1+NCN). Utilizando este receptor artificial, realizamos un ensayo de coinmunoprecipitación con el objetivo de detectar la interacción de este receptor quimérico con el LTP, purificando el receptor a partir de células S2 e incubándolo con hemolinfa de larvas silvestres conteniendo el LTP. Figura 56. El receptor VLDLR humano posee cierta capacidad de unión al LTP. (A-B) Co-inmunoprecipitación del LTP de algunas isoformas y quimeras de los receptores de lipoforinas y de los receptores LDLR humanos. Todos los receptores y quimeras fueron expresados y purificados en células S2 de Drosophila e incubados con hemolinfa diluida de larvas silvestres. (A) Lpr2F, Lpr2E, Lpr2F+LA1+ED, Lpr2F+LA1+NCN, hLDLR+LA1+NCN, hLDLR y (B) hVLDLRΔLA1, hVLDLR, hLDLR y Lpr2E fueron inmunoprecipitadas con α-HA y los eluídos detectados mediante western blot con α-LTP (panel superior) y α-HA (panel inferior izquierdo). El extracto de células S2 (S2) se usó como control negativo en (A). El último carril contiene hemolinfa en (B). Los extractos iniciales fueron analizados mediante α-HA (panel inferior derecho). (C-C’’) Rescate de toma de lípidos en discos imaginales de ala doble mutantes para los receptores de lipoforinas en los que se ha sobre-expresado el receptor hVLDLR en el compartimento posterior (indicado con flecha). Los lípidos neutros son marcados con Nile red en amarillo y los núcleos con DAPI en azul. Barra de escala: 10 μm. RESULTADOS 136 Desafortunadamente, en la Figura 56A se observa como el receptor artificial no interacciona con el LTP, mientras que los controles (Lpr2E y las quimeras Lpr2F+LA1+ED y Lpr2F+LA1+NCN) si lo hacen. Por lo tanto, ni el receptor humano LDLR ni la quimera incluyendo el extremo N-terminal de Lpr2E: LDLR+LA1+NCN son capaces de interaccionar con el LTP. Durante la realización de estos experimentos, examinamos también la interacción del VLDLR humano con el LTP de Drosophila mediante co-inmunoprecipitación. El VLDR humano contiene 8 dominios LA, por lo que en este aspecto es más parecido a Lpr2E que el LDLR humano, que sólo contiene 7. Sorprendentemente, tal como se muestra en la Figura 56B, el receptor hVLDLR se une levemente al LTP. Ello nos impulsó a caracterizar un poco mejor esta interacción. Como el dominio mínimo responsable de la unión de los receptores de lipoforinas de Drosophila con el LTP es LA1, delecionamos dicho dominio en el VLDLR humano, generando UAS-hvldlrΔLA1-HA. En la Figura 56B, se puede apreciar como el LTP no interacciona con este receptor, mientras que sí interacciona de manera muy robusta con Lpr2E y levemente con el hVLDLR. Estos resultados sugieren que el VLDLR humano, al igual que Lpr2E, es capaz de interaccionar aunque débilmente con el LTP. Asimismo, de los 8 dominios LA que posee, al eliminar el primero de ellos (LA1), se pierde la afinidad por el ligando. Por el contrario, el receptor hLDLR, de tan sólo 7 dominios LA, no tiene la capacidad de unir el LTP. El hecho de que el receptor VLDLR humano fuese capaz de interaccionar levemente con el LTP, nos sugería que además, podría mediar la toma de lípidos celular. Por este motivo, decidimos examinar el rescate de lípidos en discos de ala mutantes para los receptores de lipoforinas, en los que se sobre-expresó el receptor VLDLR humano. Tal como se muestra en la Figura 56C- C’’ (flecha), el receptor VLDLR no rescata la toma de lípidos a pesar de interaccionar con el LTP. Además, puede apreciarse una morfología anómala del tejido en la región posterior debido probablemente a la sobre-expresión de la proteína. Figura 57. Análisis in vivo de la capacidad del receptor VLDLR humano de reclutar LTP en discos imaginales de ala. Secciones basales de discos imaginales de ala en los que se ha sobre-expresado Lpr2E-HA, hLDLR-HA y hVLDLR-HA en el compartimento dorsal (A-C) y en el compartimento posterior (D-F). Además, la endocitosis fue bloqueada durante 3 horas previas a la disección por la inactivación del alelo termosensible de shibire (D-F). Los receptores fueron detectados con α-HA en verde y el LTP en rojo. No se detectó acumulación de LTP con ningún receptor humano en comparación con Lpr2E (Comparar A’ y D’ con B’, C’, E’ y F’). Las flechas señalan la pérdida de la integridad del epitelio (F-F’). Todos los paneles se muestran al mismo aumento. Barra de escala: 10 μm. RESULTADOS 137 Dado que los resultados del rescate fueron negativos, decidimos contrastar los resultados bioquímicos analizando in vivo la capacidad de unión del LTP con los receptores humanos. Para ello, expresamos los transgenes UAS-lpr2E-HA, UAS-hldlr-HA y UAS-hvldlr-HA en la zona dorsal de los discos imaginales de ala usando la línea activadora ap-Gal4. Ninguno de los receptores humanos acumularon LTP en la zona de sobre-expresión a diferencia del receptor de Drosophila, Lpr2E (Figura 57 Comparar A con B y C). Al igual que en ensayos anteriores, aumentamos la sensibilidad del experimento inhibiendo la endocitosis usando el alelo termosensible de shibire (shits), y expresamos los receptores en la zona posterior del disco de ala con la línea activadora hh- Gal4. Tampoco en este caso se detectó acumulación del LTP (Figura 57 Comparar D con E y F). Nuestros datos in vitro indicaban que el VLDLR humano tenía cierta capacidad de interaccionar con el LTP, que no podemos detectar in vivo. Sin embargo, observamos que su expresión en el disco imaginal no era homogénea, sugiriendo cierta toxicidad celular (Figura 57F-F’, flechas). Ésta resultó más obvia después de su sobre-expresión en una zona mayor del disco con la línea activadora nub-Gal4 (Figura 58A-A’’, flecha). También observamos que el hVLDLR inducía una morfología irregular en células S2 transfectadas (Figura 58 Comparar E-E’ con B-D). Ello nos permite concluir que la expresión del VLDLR humano en Drosophila es tóxica y por tanto no es posible llegar a ninguna conclusión respecto a su posible actividad en la toma de lípidos. Figura 58. La sobre-expresión continuada de hVLDLR produce alteraciones morfológicas tanto en discos imaginales de ala como en células S2 de Drosophila. (A) Expresión de hVLDLR en el primordio del disco imaginal de ala durante 48 horas usando el sistema Gal80ts. La flecha señala un hueco creado en la membrana basal (B-E) Expresión de los transgenes UAS-lpr2E-HA, UAS-hldlr-HA, UAS-hldlr+LA1+NCN-HA y UAS-hvldlr-HA en células S2 transfectadas. Los receptores fueron detectados con α-HA en verde y faloidina en rojo para marcar los contornos celulares. Las flechas indican las zonas donde el receptor se localiza en la membrana. B-E se muestran al mismo aumento. Barra de escala: 100 μm. DISCUSIÓN 144 largos aquellos que pertenecen a las isoformas que median la toma de lípidos (como Lpr2E). Los péptidos señal fueron identificados mediante algoritmos bioinformáticos y no llegamos a caracterizarlos experimentalmente, aunque este tipo de predicciones es muy fiable (Hiss and Schneider, 2009). Las distintas distribuciones subcelulares observadas nos hizo pensar que estas proteínas podrían acumularse en distintos compartimentos de la vía secretora o endocítica. Sin embargo, su análisis en discos imaginales de ala y en células S2 utilizando marcadores para distintos compartimentos subcelulares no mostró diferencias significativas (Figuras 27 y 28). Nuestros experimentos mostraron que la principal propiedad del péptido señal atípico es que induce unas diez veces menos expresión que el péptido señal típico. Por tanto, la presencia de un tipo u otro de péptido señal define la eficiencia de traducción de estas proteínas (Figuras 38, 39 y 40). La baja eficiencia del péptido señal largo podría deberse a su larga región hidrofóbica (región h), ya que se ha visto que esta característica induce un cambio en su posición cuando está asociado al translocón que disminuye la probabilidad de ser procesado por la enzima Signal peptidase (SPase) co-traduccionalmente (Von Heijne, 1984). En la bibliografía podemos encontrar casos similares. Por ejemplo, la regulación negativa de la expresión de la proteína interleucina15 está asociada con el uso de un péptido señal atípicamente largo. La interleucina 15, una proteína implicada en el sistema inmunitario, posee 2 isoformas con péptidos señal de distinta longitud, uno típico de 21 aminoácidos y otro atípicamente largo de 48. El péptido señal largo permite que la tasa de secreción sea más baja. Se desconoce si es debido a una lenta liberación del translocón o por una interacción ineficiente con la enzima Signal peptidase (SPase) (Kurys et al., 2000). Otro ejemplo es la generación de las formas citosólica y secretada del inhibidor del activador de plasminógeno 2 (PAI-2), descrito en Belin et al., 1989. El péptido señal de esta proteína interacciona con la maquinaria de translocación con baja eficiencia de forma que únicamente una fracción de las cadenas nacientes sigue la ruta secretora y es secretada, el resto pasa a la fracción citoplasmática. Finalmente, en el caso de la interleucina 2, se generan dos péptidos señal diferentes por el uso de distintos codones de inicio. Estos péptidos señal contribuyen a definir si la interleucina 2 se transporta mediante la vía secretora o por el contrario se dirige al núcleo (Acland et al., 1990). Los distintos niveles de expresión mediados por los péptidos señal proximal (típico, con altos niveles de expresión) y distal (atípico, con bajos niveles) probablemente tienen un cierto efecto en la distribución subcelular de los receptores de lipoforinas. Sin embargo, en los experimentos iniciales que realizamos estas diferencias de expresión generaban, de manera artefactual, unos asombrosos cambios en la distribución subcelular de los receptores (Figura 25). El análisis detallado de este efecto reveló que los altos niveles de receptores de lipoproteínas que se podían obtener con los transgenes que llevaban el péptido señal típico inducían la activación de caspasas y la muerte celular por apoptosis (Figuras 36 y 37). En los experimentos iniciales, detectábamos los receptores de lipoforinas en experimentos inmunohistoquímicos gracias al epítopo HA que poseían los transgenes. Desafortunadamente, el epítopo HA contiene una diana de corte de las caspasas, de manera que las células que han iniciado la cascada apoptótica pierde su inmunorreactividad (Schembri et al., 2007) y esta era la principal causa de las distintas distribuciones observadas. Si bien este efecto nos confundió inicialmente, estudios adicionales comparando la distribución de los receptores expresados a bajos niveles que no inducían apoptosis y detectándolos de manera independiente al epítopo HA, mostraron que Lpr2F seguía mostrando una cierta preferencia por acumularse en la región apical. Desconocemos la base DISCUSIÓN 145 molecular de esta preferencia. Los datos obtenidos a lo largo de esta tesis, nos hace pensar que los receptores de lipoforinas al ser sintetizados se dirigen preferencialmente hacia la región apical (Figura 27). Una vez en la membrana plasmática apical, se podrían redistribuir hacia las membranas basolaterales (Figura 34). Esto concordaría con los resultados en los que hay una gran acumulación de la proteína en apical debido a la alta tasa de transcripción promovida por el péptido señal típico. ¿Porque las isoformas de los receptores de lipoforinas que median la toma de lípidos contienen un péptido señal poco eficiente? Una posibilidad sería que simplemente estas proteínas deban expresarse a bajos niveles o que altos niveles de expresión resultaran en toxicidad celular. De hecho, nuestros datos son consistentes con que la expresión artificial de UAS-Lpr2E a altos niveles induce cierta toxicidad celular (Figura 40). Sin embargo, esto sólo ocurre a niveles muy altos y alejados de las condiciones fisiológicas, por lo que probablemente no tiene relevancia funcional. Otra posibilidad más interesante es que la actividad, basalmente baja, de los péptidos señales atípicos de los receptores de lipoforinas pudiera estar regulada por los requerimientos lipídicos celulares, de manera que niveles bajos de lípidos celulares indujeran una mayor eficiencia del péptido señal, mayores niveles de receptores de lipoforinas y por tanto mayor adquisición de lípidos en la célula. Alternativamente, el péptido señal ya procesado podría ejercer funciones post-targeting relacionadas con la homeostasis lipídica. El hecho de que el péptido señal presente en las isoformas que median la toma de lípidos sea atípicamente largo concordaría con esta segunda posibilidad. De hecho, se han descrito en la literatura varios casos en los que un péptido señal atípico tiene funciones post-targeting. Por ejemplo, el péptido señal de la glicoproteína del virus linfocítico de la coriomeningitis de 58 aminoácidos, es procesado por la SPase y retenido en la membrana del retículo endoplasmático donde se une a la proteína naciente, siendo esencial para su maduración y la infectividad del virus (Schrempf et al., 2007). Otro ejemplo es el precursor de la prolactina (preProSP: 86 aminoácidos), procesado por las enzimas SPase y SSPase. Esta última produce un péptido bioactivo (el fragmento N-terminal resultante) que se libera al citosol e interacciona con la proteína calmodulina de manera dependiente de Ca2+, regulando de esta manera la secreción de la prolactina (Martoglio et al., 1997). Sin embargo, nuestros experimentos no relevaron que la disponibilidad lipídica celular afectara a la eficiencia del péptido señal atípico (Figura 42). Tal vez experimentos realizados en condiciones más controladas, por ejemplo en células S2 que expresen los receptores de lipoforinas y cultivadas en medio de cultivo delipidado o suplementado con ácido oleico, podrían ser más sensibles (Guo et al., 2008). Otra posibilidad para esclarecer si la presencia del péptido señal atípico tiene alguna relevancia en la toma de lípidos más allá de los ensayos crudos que hemos podido realizar, consistiría en modificar directamente los genes lpr1 y lpr2 mediante edición del genoma, por ejemplo mediante la técnica CRISPR/Cas9, substituyendo el péptido señal atípico por el típico de las isoformas que no median la toma de lípidos. Este tipo de análisis también permitiría examinar la relevancia de la lisina de la región C-terminal (c), con carga positiva, presente en todas las especies de Drosophila y en la mosca del mediterráneo Ceratitis capitata, para comprobar si es responsable de la baja eficiencia del péptido señal. En todo caso, hemos demostrado claramente que el péptido señal atípico no es esencial para que los receptores de lipoforinas medien la toma de lípidos. Así, hemos ensayado varias quimeras que si bien contienen el péptido señal corto, poseen el dominio LA1. Estas quimeras median la toma de lípidos de manera similar a las que tienen el péptido señal atípico. En general, la función de los péptidos señal está completamente codificada en su secuencia y en los dos aminoácidos adyacentes al sitio de corte. Sin embargo, en el caso de los péptidos DISCUSIÓN 146 señal atípicos de los receptores de lipoforinas tenemos evidencias de que los aminoácidos entre el péptido señal y/o los 16 aminoácidos que forman parte del dominio extendido (ED), son también relevantes para su función. Así, la quimera SP(E)_Lpr2F, que no contiene esos aminoácidos, se expresa a menores niveles que Lpr2E. Esto se observa tanto en inmunotinciones donde apenas hay acumulación en apical o basal (Ver Figura 33 Comparar B con D), como en western blot (ver Figura 39A). El hecho de que tanto el péptido señal como el dominio NCN proceden del mismo exón (exón 2) (Figura 14), refuerza la hipótesis de que forman parte de una misma unidad funcional. Desafortunadamente, no pudimos encontrar una función fisiológica para el péptido señal atípicamente largo característico de los receptores que median la toma de lípidos. Su conservación evolutiva dentro de los dípteros sugiere que tiene una función, al menos en estos organismos. Sin embargo, esta función no se extendería a mamíferos ya que al analizar los péptidos señales de varios miembros de la familia LDLR en mamíferos (Megalin, LRP1, LRP1b, MEGF7, LRP5, LRP6, VLDL, LDL y ApoER2), todos eran típicos (Ver anexo II). Tampoco encontramos secuencias homólogas al péptido señal al realizar un análisis mediante BLAST en ninguna otra proteína, lo que habría indicado que esa función podría haber sido transferida a otra proteína mediante evolución divergente. 2. La lipoforina se une débilmente a los receptores de lipoforinas Los receptores de lipoforinas fueron descritos en varias especies de insectos por su propiedad de interaccionar con la lipoforina. La evidencia más directa fue la observación de que la expresión heteróloga del receptor en células de mamífero en cultivo inducía la endocitosis de las lipoforinas añadidas al medio (Dantuma et al., 1997). En otros estudios, se vio mediante ensayos de far-western realizados a partir de extractos de tejido que la lipoforina purificada, a altas concentraciones, se unía a una de las proteínas transferidas a la membrana que mostraba un tamaño consistente con los receptores de lipoforinas, sugiriendo que se unía a estos (Tsuchida and Wells, 1990; Lee et al., 2003a,b). En esta tesis hemos analizado exhaustivamente y de forma más directa la interacción de los receptores de lipoforina con la lipoforina mediante ensayos de co-inmunoprecipitación. Los receptores se han purificado tanto a partir células S2 (Figura 43) como de extractos de tejidos (Figura 44 y 45). Estos experimentos no detectaron una interacción, indicando que ésta o bien no existe o está por debajo del nivel de detección de esta técnica. En particular, al utilizar receptores de lipoforinas purificados a partir de extractos de células S2, no observamos interacción con la lipoforina. Sin embargo, se detecta una interacción robusta con el LTP a pesar de que la hemolinfa contiene unas diez veces más lipoforina circulante que LTP (Figura 43 y 49A), lo que descarta un posible problema técnico. En los ensayos realizados a partir de extractos de glándulas salivales, la interacción detectada era parecida a la observada con un control negativo, la proteína Perdido (Figura 44C y D), lo que podría indicar una tendencia de la lipoforina a formar agregados inespecíficos con otras proteínas. Estos resultados, sugiriendo una interacción muy débil o nula, concuerdan con nuestros datos obtenidos mediante otras técnicas in vivo. En particular, hemos analizado los cambios en distribución de la lipoforina en discos imaginales después de sobre-expresar los receptores DISCUSIÓN 147 de lipoforinas. En discos imaginales control, la lipoforina se acumula a altos niveles en la matriz extracelular alrededor de las células. Esta distribución de lipoforina total no cambia apreciablemente después de expresar los receptores de lipoforinas. Sin embargo, si los discos son incubados antes de su fijación en tampón o en medio de cultivo, la lipoforina que no está asociada estrechamente al tejido puede difundir de manera que sólo detectamos la fracción retenida por su interacción con sus receptores. En estos experimentos, también se bloqueó la endocitosis con el fin de aumentar la cantidad de receptor en la membrana plasmática. Así, pudimos observar una muy ligera acumulación de lipoforina en la membrana basolateral al expresar Lpr2F y a una acumulación mucho mayor para Lpr2E (Figura 46 y Parra-Peralbo and Culi, 2011). Sin embargo, en el caso de Lpr2E la interacción es indirecta estando mediada por el LTP, como se discutirá más adelante (Figura 55). El conjunto de todos estos resultados nos sugiere que la interacción del receptor de lipoforina con la lipoforina es muy débil y/o transitoria. Esto concuerda con las medias-altas constantes de disociación calculadas para el LDLR humano con su ligando LDL o sugeridas para el receptor de lipoforina presente en el cuerpo graso del insecto Galleria mellonella con la lipoforina, utilizando ensayos de far-western y de unión de ligando a preparados de membrana (KD: 30-50 mM) (Lee et al., 2003b). Además, la interacción presentaba una dinámica saturable, sugiriendo que estaba mediada por un receptor (Lee et al., 2003b). Resultados parecidos se obtuvieron también en Manduca sexta (Tsuchida and Wells, 1990). A modo de comparación, la constante de disociación para la interacción fuerte antígeno-anticuerpo es del orden picoMolar (pM). Para poder detectar interacciones con contantes de disociación similares, otros laboratorios han usado la técnica de Resonancia de plasmones de superficie (SPR, del inglés, Surface Plasmon Resonance) con resultados positivos para el receptor LDLR. En Martínez-Oliván et al., 2014, describen la unión de ApoB y ApoE al dominio LA5 del receptor mediante esta técnica. Y en Kurasawa et al., 2013, lo usaron para determinar la unión de LDLR con el factor VIII de coagulación. Sería interesante utilizar esta tecnología para corroborar de manera cuantitativa la unión de la lipoforina con las distintas isoformas de los receptores de lipoforinas y ver si hay diferencias entre ellas. La dificultad para detectar la interacción entre los receptores de lipoforinas con la lipoforina nos imposibilitó, por tanto, identificar la región de unión entre ellos. No obstante, la interacción del receptor mediante el dominio LA1 extendido con la lipoproteína LTP probablemente descarta, por razones estéricas, su intervención en el proceso. En Locusta migratoria gracias a experimentos con receptores híbridos entre HDLp y el LDLR humano expresados en células CHO y utilizando ensayos de citometría de flujo in vivo, se determinó que el dominio fundamental para la unión de los receptores de lipoforinas con la lipoforina es el LA3, descartándose la participación del dominio LA1 (Roosendaal et al., 2008). Por otra parte, en mamíferos, observaron como la deleción de los dominios LA1-2 de los receptores LDLR tenían muy poco efecto sobre la unión con el LDL, siendo fundamentales los dominios LA3-7 para la interacción (Esser et al., 1988; Russell et al., 1989). Estos datos, podrían indicar que la unión de los receptores de lipoforinas de Drosophila melanogaster con la lipoforina estaría mediado por los dominios de unión a ligando, posiblemente a partir del tercer LA (LA3). Teniendo en cuenta que los dominios LA3 y LA4 sólo se encuentran en algunas isoformas, ello podría afectar sus afinidades para la lipoforina (Figura 14). DISCUSIÓN 148 3. Los receptores de lipoforinas endocitan la lipoforina independientemente de la toma de lípidos Tanto en Drosophila como en otros insectos, la adquisición de lípidos celular no requiere la endocitosis de la lipoforina (Dantuma et al., 1997; Parra-Peralbo and Culi, 2011). No obstante, se ha descrito como los receptores de lipoforinas tienen la capacidad de endocitar las lipoproteínas en células transfectadas y en tejidos como por ejemplo el cuerpo graso de larvas y de adultos jóvenes y en discos imaginales de ala (Dantuma et al., 1997; 1999; Callejo et al., 2008). En Drosophila, mostraron como la isoforma Lpr2F, la cual no media la toma de lípidos, se detectaba en endosomas tanto tempranos como tardíos junto con la lipoforina en discos imaginales de ala (Callejo et al., 2008). Sin embargo, se desconoce cuál es el papel que desempeña este proceso. A diferencia de mamíferos, el complejo lipoproteína-receptor es resistente al pH ácido endosomal y no se disocia, de manera que se ha propuesto que la lipoforina, después de su endocitosis, es reciclada junto con el receptor en lugar de degradarse (Roosendaal et al., 2008). Además, en Manduca sexta, se observó que los receptores son reciclados siguiendo la misma ruta que la transferrina (Van Hoff et al., 2002). Los detalles de cómo podría funcionar este mecanismo de reciclaje de la lipoforina mediado por sus receptores se desconoce. Para averiguar si la capacidad de endocitar lipoforina podría estar relacionada con la toma de lípidos, comparamos las isoformas Lpr2E y Lpr2F, mostrando que ambas poseían una capacidad similar de endocitar grandes cantidades de lipoforina, independientemente de si median o no la toma de lípidos (Figura 47 y 48). Además, al bloquear la endocitosis en discos imaginales de ala en clones del alelo shits no se aprecia una disminución en las inclusiones lipídicas (Figura 47), evidenciando que la endocitosis de lipoforinas no se requiere para la toma de lípidos en este tejido, al igual que en el ovario. Esta endocitosis podría ser un mecanismo para la adquisición de especies lipídicas distintas a los DAG, o podría ejercer una función no relacionada con el metabolismo lipídico, ya que la lipoforina desempeña funciones más allá del metabolismo de lípidos. El hecho de que la endocitosis se detecte principalmente en la región apical del disco, en contraste con la acumulación de LTP y la toma de lípidos, que ocurre en basolateral, apoya la hipótesis de que ambos procesos son independientes (Figura 62). Existen dos posibilidades que explicarían el incremento en la endocitosis de lipoforina después de sobre-expresar los receptores de lipoforinas. Una es que la interacción de la lipoforina con los receptores, aunque débil, sea suficiente como para mediar su endocitosis. La segunda, que creemos más probable, es que la simple expresión de los receptores de lipoforinas incremente la cantidad total de endocitosis. Al ser la lipoforina una proteína muy abundante en la matriz que rodea a las células, su endocitosis se incrementaría de forma inespecífica. Varios datos indican que los receptores de lipoforinas están regulados a múltiples niveles y que posiblemente ejerzan funciones específicas en distintos contextos. De un lado, existen una gran variedad de isoformas tanto en Drosophila melanogaster como en otros insectos, de manera que los distintos módulos proteicos que los forman pueden afectar a sus propiedades y funciones. Por otro lado, la regulación transcripcional de estos receptores depende de cambios fisiológicos y requerimientos energéticos del organismo y del tejido donde se expresan. Por ejemplo, en el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti, el patrón de expresión de los dos genes de receptores de lipoforinas (AaLpRov y AaLpRfb) es distinto DISCUSIÓN 149 entre ellos y además depende del estadio del organismo. Así, AaLpRfb se expresa en el cuerpo graso durante el periodo post-vitelogénico para la re-absorción de lípidos, mientras que AaLpRov se detecta en el ovario durante todos los estadios vitelogénicos (Seo et al., 2003). Figura 62. Disposición de los distintos elementos implicados en la toma de lípidos en discos imaginales de ala. (A) Dibujo representativo de una sección transversal del disco imaginal de ala, en el cual tiene lugar la adquisición de lípidos en la región basal. Las distintas partes se exponen a la izquierda. La membrana apical se muestra en rojo y la basal en azul. Tinciones extracelulares del receptor Lpr2E detectado con α-Myc (B), la lipoforina con α-Lp (C) y el LTP con α-LTP (D) en discos imaginales de ala sobre-expresando la isoforma Lpr2E en el compartimento posterior. (E) Expresión de UAS-Lpr2E-HA en discos mutantes para los receptores lpr1 y lpr2. El receptor se detectó con α-HA en verde, la lipoforina con α-Lp en magenta y los lípidos neutros en rojo con Nile red. Tomada de Parra-Peralbo and Culi, 2011. Las flechas señalan la región basolateral donde se acumulan preferencialmente tanto el receptor como las lipoproteínas Lipoforina y LTP, así como las inclusiones lipídicas. Barra de escala: 10 μm. Todos los paneles se muestran al mismo tamaño. DISCUSIÓN 150 4. La lipoproteína LTP es indispensable para la adquisición de lípidos en tejidos periféricos. Mecanismo de acción Los mecanismos moleculares que median la toma de lípidos en Drosophila se han empezado a esclarecer recientemente. Así, se ha visto que en tejidos periféricos como los ovarios o los discos imaginales, requiere de los receptores de lipoforina y es independiente de endocitosis (Parra-Peralbo and Culi, 2011). Sin embargo, se ignora el mecanismo molecular por el cual los lípidos se internalizan en estos tejidos. En esta tesis, hemos caracterizado como el LTP, un nuevo ligando de los receptores de lipoforinas, participa en estos procesos y desempeña un papel clave en ellos. En primer lugar, hemos visto que el LTP únicamente interacciona in vitro con aquellas isoformas de los receptores de lipoforinas capaces de mediar la adquisición de lípidos (como Lpr2E) (Figura 49). Además, la expresión de los receptores de lipoforinas en la membrana plasmática de tejidos periféricos como son los discos imaginales o los ovarios, lleva a su vez a la acumulación de LTP. En segundo lugar, la reducción de los niveles de LTP en circulación lleva a una disminución de los niveles de lípidos neutros en discos imaginales y ovarios (Figura 50). Se ha descrito que el LTP se requiere para la transferencia de los lípidos procedentes de la dieta desde el intestino hacia la lipoforina circulante (Palm et al., 2012). Por tanto, es posible que la reducción en la cantidad de lípidos en tejidos periféricos observada al silenciar el LTP se deba a una disminución en la cantidad de lípidos circulantes disponibles para los tejidos (Palm et al., 2012). Sin embargo, nuestros datos antes expuestos junto con los de otros laboratorios demuestran una implicación directa del LTP en este proceso, aunque no descartamos una combinación de ambos efectos. Una de las pruebas más concluyentes se describe en Jouni et al., 2003. En este artículo se muestra que en insectos como Bombyx mori, al incubar ovariolas en medio de cultivo conteniendo lipoforinas marcadas, se producía una transferencia de lípidos desde las lipoforinas a las ovariolas. Esta transferencia era inhibida con un anticuerpo frente al LTP (anti-LTP) y se recuperaba al suplementar de nuevo el medio con LTP purificado, demostrando así una implicación directa del LTP en la transferencia de lípidos desde la lipoforina a las ovariolas. ¿Qué papel desempeña el LTP en la transferencia de lípidos desde las lipoforinas a las células? Como ya se ha expuesto en la introducción, el LTP cataliza el intercambio de diversas especies lipídicas como el DAG, fosfolípidos y ésteres de colesterol entre lipoproteínas o entre lipoproteínas y células. En este sentido, se lo ha comparado con las proteínas transportadoras de ésteres de colesterol (CETP) o de fosfolípidos (PLTP) de mamíferos. Sin embargo, en contraste con el CETP, el LTP no actúa formando un complejo ternario entre el donador y el aceptor, sino que puede actuar de forma secuencial, cargándose primero de lípidos y cediéndolos luego en una etapa posterior (Blacklock et al., 1992). La estructura del LTP sugiere un posible mecanismo molecular para ello. Estudios con microscopía electrónica han desvelado la particular forma de esta lipoproteína, compuesta por dos partes bien diferenciadas, una cabeza globular donde podrían almacenarse los lípidos y una cola flexible que podría mediar la interacción con otras partículas o con receptores celulares (Figura 10). Teniendo en cuenta esta información y nuestros datos, proponemos que el LTP circulante es reclutado a las membranas plasmáticas basolaterales de las células gracias a su interacción con los receptores de lipoforinas, tal vez a través del dominio en forma de cola del LTP, aumentando así su concentración local. Una vez unido, interacciona secuencialmente con las lipoforinas DISCUSIÓN 151 cargadas de lípidos adsorbidas a la matriz extracelular que rodea a las células y con la membrana plasmática, transfiriendo una determinada cantidad de lípidos en cada ciclo. Los datos que apoyan este modelo son los siguientes: (1) Existe un pool de lipoforinas asociado a la matriz extracelular que rodea a las células, tal y como hemos observado mediante inmunotinciones. Este pool es probablemente muy dinámico, ya que rápidamente disminuye al incubar los tejidos en un medio libre de lipoforina (por ejemplo, Figura 55). Proponemos que esta lipoforina se encuentra débilmente asociada a la matriz extracelular mediante interacciones de baja afinidad con los HSPG (Eugster et al., 2007), con los receptores de lipoforinas o con otros receptores no identificados por el momento (Figura 63A). De forma similar, en Locusta migratoria se ha mostrado mediante experimentos inmunohistoquímicos, que la lipoforina se localiza fundamentalmente en la matriz extracelular que rodea las membranas plasmáticas del músculo del vuelo (Van Antwerpen et al., 1988). Es interesante destacar que, en Manduca sexta, se ha observado como en el cuerpo graso larvario existe un pool de lípidos extracelular asociado a la parte externa de la membrana plasmática. Es probable que estos lípidos estén contenidos en las lipoforinas adsorbidas a la matriz extracelular que nosotros hemos observado y pueden suponer un intermediario en el proceso de transferencia de lípidos a las células, donde el LTP y los receptores de lipoforinas se requieren y participan activamente (Canavoso et al., 2004). (2) En Parra-Peralbo and Culi, 2011, se estableció que en Drosophila melanogaster el dominio LA1 de las isoformas transcritas a partir del promotor distal, es indispensable para la adquisición de lípidos celular. En esta tesis hemos esclarecido que la interacción entre el receptor y la lipoproteína LTP requiere precisamente de este dominio LA1, que posiblemente se una a la región flexible del LTP, dejando así libre la región globular para facilitar el contacto con la lipoforina y la membrana plasmática (Figura 63A). Por tanto, hay una perfecta correlación entre aquellas isoformas que unen al LTP y su capacidad de mediar la toma de lípidos, sugiriendo que los dos procesos están relacionados. Esta unión LTP-dominio LA1 del receptor se ve incrementada por la presencia de 16 aminoácidos adyacentes, formando el que hemos denominado dominio extendido (LA1+ED) (Figura 51), asignando por primera vez funcionalidad al dominio NCN. Dada la relevancia funcional del dominio LA1, analizamos su secuencia en los receptores de lipoforinas de diferentes géneros de Drosophila con el fin de identificar las particularidades que lo distinguen de otros dominios LA. El resultado de este estudio desveló un grupo de residuos cargados en la región N-terminal (D/EEK) ausentes en otros dominios LA, que podrían aportar la especificidad de unión al LTP (Figura 52). Estos residuos se encuentran adyacentes a los 16 aminoácidos del ED, sugiriendo que podrían constituir un dominio estructural junto a estos. (3) Las lipoforinas extracelulares se estabilizan en la membrana plasmática de células que expresan los receptores de lipoforina de forma dependiente de LTP (Figura 63B). Ello lo hemos observado tanto en discos imaginales como en el cuerpo graso (Figuras 53 y 54). Esto sugiere que efectivamente, se produce una interacción entre LTP y lipoforina en las superficies celulares que podría representar un intermediario funcional formado durante el tránsito de los lípidos desde la lipoforina al LTP tal y como proponemos en nuestro modelo. Sin embargo, nuestros datos no apoyan que lipoforina y LTP interaccionen directamente. Por ejemplo, podemos inmunoprecipitar considerables cantidades de LTP de la hemolinfa utilizando de cebo el receptor Lpr2E. En estas condiciones, la lipoforina no co-inmunoprecipita junto al LTP sugiriendo que no interaccionan directamente en la hemolinfa (Figura 49). Proponemos que DISCUSIÓN 152 el LTP unido a los receptores de lipoforinas expresados en la membrana plasmática a través de interacciones de alta afinidad, interactúa con la lipoforina adsorbida a la matriz extracelular y de esta forma toma parte de su carga lipídica. Esta interacción estabilizaría de forma transitoria a la lipoforina en la región. Es posible que otra interacción, de baja afinidad, entre la lipoforina y los receptores de lipoforina ayude a que se forme el complejo receptor-LTP-lipoforina. Esto lo sugieren nuestros experimentos en los que expresamos lpr2F, que no interacciona con el LTP pero si induce una ligera acumulación de lipoforina (Figuras 51 y 46). Finalmente, el ciclo se completa con la transferencia de lípidos desde el LTP a la célula (Figura 63C). HSPG Lp Hemolinfa Membranabasal Lp Lpr2E LTP HSPG Lp Hemolinfa Membranabasal Lp Lpr2E LTP Estabilización extracelular de la lipoforina Figura 63. Modelo molecular para la toma de lípidos celular en tejidos periféricos de Drosophila. (A) Por un lado, la lipoforina se localiza en la matriz extracelular de los tejidos periféricos unida débilmente a los heparán sulfatos proteoglicanos (HSPG), a los receptores de lipoforinas u otros receptores desconocidos. Por otro lado, el LTP circulante se une probablemente por su región elongada al dominio LA1 extendido de los receptores (LA1- ED). (B) La interacción del LTP con el receptor promueve la estabilización de la lipoforina. A su vez, transfiere lípidos desde la lipoforina hacia el LTP, donde se acumulan problamente en la región globular. (C) Posteriormente, los lípidos neutros son transferidos hacia la célula del tejido de manera hasta ahora desconocida. La lipoforina delipidada podría liberarse a la hemolinfa para llegar a un tejido fuente (cuerpo graso o intestino), donde tendría lugar la carga de lípidos. A B C DISCUSIÓN 153 Como hemos discutido previamente, no hemos podido detectar interacción in vitro entre los receptores de lipoforinas y la lipoforina, indicando que es muy débil. Si bien este dato puede parecer contra intuitivo, esta interacción débil puede ser importante para permitir un flujo constante de nuevas partículas de lipoforina, cargadas de lípidos, hacia los complejos LTP- receptor anclados de manera estable a la superficie celular. Una interacción de alta afinidad enlentecería el recambio de las lipoforinas, que permanecerían unidas al receptor una vez ya delipidadas bloqueándose así la transferencia de lípidos. En la Figura 55 mostramos como si bien inicialmente tanto la lipoforina como el LTP se estabilizan en las membranas plasmáticas de células que expresan lpr2E, la unión del LTP es estable a lo largo del tiempo, mientras que la lipoforina se disocia al cabo de pocos minutos de incubación en tampón. Se nos ocurren dos posibilidades para explicar esta transitoriedad. De un lado, es posible que la lipoforina se una al receptor de lipoforinas y al LTP de forma cooperativa pero aun así, con baja afinidad, de forma que se disocia del complejo espontáneamente. La segunda posibilidad es que la afinidad de la lipoforina por el complejo receptor-LTP disminuya al delipidarse ésta o al lipidarse el LTP. Es decir, el complejo trimérico receptor-LTP-lipoforina sólo sería estable mientras ocurriera la transferencia de lípidos desde la lipoforina al LTP. Algunos datos pueden apoyar esta posibilidad. En Manduca sexta, la afinidad de la lipoforina por sus receptores del cuerpo graso depende del contenido lipídico de ésta, de manera que lipoforinas con bajo contenido en DAG se unen con menos afinidad que las ricas en lípidos. Esta propiedad podría facilitar el transporte direccional de lípidos entre tejidos (Tsuchida and Wells, 1990). Por otro lado, se ha demostrado que el LTP es un catalizador muy eficiente. Por ejemplo, en Ryan et al., 1990c se muestra una transferencia de DAG entre HDLp de Manduca sexta y LDL de mamíferos. Cuando se incuban LDL conteniendo DAG marcado con HDLp en presencia o ausencia de LTP se observa como sólo en presencia de LTP ocurre transferencia de lípidos, que además es dependiente de la concentración del donador, sugiriendo que el LTP es muy eficiente catalíticamente. Además, en otros insectos como por ejemplo Bombyx mori la tasa de transferencia de DAG, catalizada por LTP, es muy rápida comparada con otras moléculas como los carotenos. En estos experimentos usaron como donador HDLp marcadas con [3H]-DAG y como aceptor LDLp (pobres en carotenos), incubándose en presencia de LTP. Tras su posterior purificación por ultracentrifugación de gradiente de densidad KBr y separación en fracciones, se midió la radiactividad de las fracciones elegidas, y observaron como la tasa de transferencia de DAG in vitro es muy rápida en comparación con los carotenoides: a los 5 minutos el DAG marcado llegó al equilibrio, mientras que los carotenoides tardaron entorno a 4 horas (Tsuchida et al., 1998). Una importante incógnita todavía no resuelta es el mecanismo de entrada de lípidos desde el LTP al interior de las células. Éstos podrían transferirse a la membrana plasmática directamente o a través de otro factor hasta ahora desconocido. Según nuestra hipótesis, el reclutamiento del LTP por parte de los receptores de lipoforinas en la región extracelular es el primer paso para que la toma de lípidos tenga lugar. Intentamos llevar a cabo este reclutamiento del LTP mediante receptores quiméricos compuestos del dominio N-terminal (LA1+NCN) de Lpr2E fusionado a otra proteína de superficie. Sin embargo, los receptores quiméricos construidos a partir de los receptores de la familia de los LDLR de mamíferos no fueron capaces de unir el LTP in vivo. Esto puede deberse a la toxicidad celular producida por la sobre-expresión de estas proteínas quiméricas (Figuras 56, 57 y 58). Durante estos experimentos observamos como el receptor VLDLR humano tiene cierta capacidad de