Regulación redox de la síntesis de almidón en cereales

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis Departamento de Bioquímica Vegetal Y Biología Molecular Universidad de Sevilla – CSIC REGULACIÓN REDOX DE LA SÍNTESIS DE ALMIDÓN EN CEREALES Trabajo realizado para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla por la licenciada Beatriz Cano Ruiz Director de la Tesis Dr. Francisco Javier Cejudo Fernández Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular AGRADECIMIENTOS La realización de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a una beca predoctoral adjunta a un proyecto de excelencia (P06-CVI-01450) concedida por la Junta de Andalucía durante el periodo comprendido entre Agosto del 2007 y Julio del 2011. En primer lugar, quisiera a agradecer a mi director de tesis, el Dr. Francisco Javier Cejudo, y al Dr. José María Romero por confiar en mí y concederme la oportunidad de llevar a cabo este trabajo en el que tanto he aprendido. Gracias también a mi director de tesis por haber cogido las riendas de este barco a la deriva, su atención, consejos y apoyo han permitido que llegue a buen puerto. Y cómo no, agradecer al ahora Dr. Antonio Javier Moreno aquella llamada el verano de 2007 que me llevó a embarcarme en esta etapa tan importante en mi vida. También quisiera agradecer su colaboración a todos aquellos que han participado directamente en la obtención de los resultados presentados en este trabajo: a la Dra Pilar Carbonero, de la Universidad Politécnica de Madrid, por proporcionar el anticuerpo anti-SUS utilizado en este trabajo y al Dr. Manuel Aguilar, del CIFA Las Torres-Tomejíl, por el cultivo en sus instalaciones del arroz utilizado en este trabajo. Por supuesto, agradecer su colaboración al personal técnico del IBVF: a Pablo por hacerle siempre un hueco y cuidar de mis trigos y arroces, a Rocío Rodríguez y Carlos Parejo por el análisis de las numerosas muestras en los servicios de análisis de proteínas y cromatografía, respectivamente. Agradecer enormemente a mis compañeros de laboratorio, pasados y presentes, todo el tiempo que me habéis dedicado, por enseñarme a desenvolverme en el laboratorio y en este mundillo científico tan especial, por las numerosas técnicas que he aprendido, por vuestros consejos, por animarme en los momentos de flaqueza y por los buenos momentos que hemos pasado tanto dentro como fuera del laboratorio. Gracias por el buen ambiente que ha habido siempre en el L12, de trabajo, dedicación e ilusión por conseguir ese resultado que a veces se resiste. Así, empezando por los que ya marcharon agradecer al incombustible Pablo su acogida en el laboratorio y dedicarme su tiempo en mis primeros días, a Kerstin por su amistad, por los buenos momentos que hemos pasado y por todo lo que me ha enseñado tanto laboral como personalmente (ya lo sabes: de mayor quiero ser como tú!!), a Belén por enseñarme tanto y tanto y demostrarme que todo esfuerzo tiene su recompensa, eres una campeona!! y a Manolo por ser el que me ha aguantado todo el tiempo, con mis bromas y mis mosqueos, y por abrir todos los días las calles). Y siguiendo con los presentes, a Maricruz por su ayuda, aún con mil cosas en la cabeza siempre me hacías un huequito y siempre con el protocolo adecuado, a Anna por su ayuda y por preocuparse siempre por cómo iban las cosas, a Julia porque ha sido un placer compartir esta etapa con una compañera con tan buena energía, las largas jornadas se hacen más llevaderas con una sonrisa, a Leo y Belén N. por vuestro apoyo en la recta final, a Vicky por heredar este rompecabezas, mucha suerte!! y a Juan, que aunque no hemos coincidido mucho tiempo, tu Tesis sí que ha estado siempre con nosotros. Como componente del L12 y sobretodo como amigo, a Nando por los buenos momentos que hemos pasado, llenos de confidencias y de bromas, y por los que vendrán, que aunque te quedes en Finlandia seguirás siendo `MY FRIEND’. A los componentes de mi otro laboratorio, el L13: Isa, Fatiza, Eva, Tamara, Ana (ahora L14), Marina, Raquel, Tomás, Fran, Tere, Fede y José María. Por vuestro apoyo y porque me he sentido muy querida por vosotros, gracias. A Isa por ofrecerte siempre a echar una mano, por preocuparte por mí, por tus consejos y por muchas cosas más, GRACIAS, cuenta conmigo siempre. A Fatiza por tener un corazón tan grande, eres un Sol. A Marina por as conversas em português, por entenderme y por no olvidarte de mí aun en la distancia. Agradecer a mis compis de tupper en el parque Emilio, Paula, Tania, Sandy, Yoli, Julia y Belén que hayáis convertido cada día de trabajo en un día entre amigos, además de los conocimientos en culinaria adquiridos, que no todo iba a ser ciencia. Os echo de menos!! A Emilio y Paula, por haber estado siempre ahí, dentro y fuera del trabajo, y por haber sido superimportantes para mí en esta etapa, muchísimas gracias por todo. A Tania, mi otro yo, porque desde que te fuiste me falta un cachito. Y a todos los compañeros del IBVF que de una u otra forma me han ayudado a lograr este objetivo y han compartido esos pequeños momentos de pasillo que sacan sonrisas y animan el día: Inma, Irene, Isa, Rosana, Gloria, Rafa, Bárbara, Victoria, Mireia, Fran, Mauro, Fernando, Baldo, Luci, Rafa, Nuria,… Y esta larga etapa no hubiese sido lo mismo sin unos buenos amigos con los que desconectar. Por eso, enormemente agradecida a todos los Super-riquis: Juanan, Juanma, Zaida, Andrea, Patri, Cecilia, Jorge, Víctor, Josef, Rocío y Maribel, además de los ya mencionados. Gracias por tantos buenos momentos, fiestas, excursiones, viajes, cervecitas…lo he pasado en grande con vosotros. Agradecer a mi querida Chichí su apoyo, su amistad y todos esos momentos tan divertidos que hemos compartido (no puedo dejar de sonreír recordándolos). Gracias también a mi familia de aquí por su apoyo y cuidar de mi todo este tiempo que estuve fuera de casa, y muy especialmente a mi tía Duvi que fue una segunda madre para mí y a mi prima Conchi, inseparables últimamente, por “sufrir” mis altibajos de tesis día a día, por tener siempre una sonrisa y por ayudarme en todo lo que puede y más. A Antonio, el primero en creer que lo conseguiría y me apoyó siempre, no puedo decir otra cosa que gracias por TODO. A mis amigas Cande y MariCarmen porque sé que me apoyan siempre. Agradecer por supuesto a mis padres todo su cariño y, aunque a veces no me entiendan mucho, su ayuda y su apoyo. Gracias también por la educación que me habéis dado, la constancia y el esfuerzo lo aprendí de vosotros. A mi hermano porque sé, aunque no me lo diga, que me apoya y me quiere. A mi abueli por su cariño y su apoyo siempre. Y gracias a Huascar porque tu cariño, tu paciencia, tu apoyo, tu comprensión, tus ánimos y tus canciones han hecho mucho más llevadera esta última etapa. Contigo todos los días son especiales. 1 ÍNDICE ÍNDICE.................................................................................................................................................... 1 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ................................................................................................................ 4 ABREVIATURAS ...................................................................................................................................... 7 I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 11 I.1. LOS CEREALES ................................................................................................................................ 13 I.1.1. Estructura y composición química de las semillas de cereales ..................................................... 14 I.1.2. Ciclo de vida .................................................................................................................................. 18 I.1.2.1. Desarrollo .............................................................................................................................. 18 I.1.2.2. Germinación .......................................................................................................................... 20 I.1.3. Estrés oxidativo durante el desarrollo y germinación de las semillas de cereales ....................... 21 I.1.4. Regulación redox en semillas de cereales ..................................................................................... 23 I.1.5. Sistema NTR/Tiorredoxina en semillas de cereales ...................................................................... 24 I.1.5.1. NTRC ...................................................................................................................................... 26 I.1.6. Metabolismo del almidón ............................................................................................................. 29 I.1.6.1. Síntesis de almidón en semillas de cereales .......................................................................... 30 I.1.6.2. Degradación del almidón de reserva ..................................................................................... 34 I.1.6.3. Sacarosa sintasa ..................................................................................................................... 35 I.1.6.3.1. Familia génica y patrón de expresión de los genes Sus .................................................. 37 I.1.6.3.2. Localización subcelular de la SUS ................................................................................... 39 I.1.6.3.3. Características físico-químicas y bioquímicas de la actividad enzimática ...................... 41 I.1.6.3.4. Regulación de la actividad SUS ....................................................................................... 42 I.2. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 43 II.MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 45 II.1. MATERIAL VEGETAL ...................................................................................................................... 47 II.1.1. Esterilización de las semillas ........................................................................................................ 47 II.1.2. Germinación de las semillas y condiciones de cultivo ................................................................. 47 II.1.3. Nicothiana benthamiana ............................................................................................................. 48 II.2. BACTERIAS .................................................................................................................................... 49 II.2.1. Estirpes utilizadas ......................................................................................................................... 49 II.2.2. Cultivo en medio líquido y sólido ................................................................................................. 49 II.2.3. Obtención de células competentes .............................................................................................. 49 II.3. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE DNA....................................................................... 50 II.3.1. Clonación de cDNAs ..................................................................................................................... 50 II.3.2. Métodos de transformación genética .......................................................................................... 51 II.3.3. Aislamiento de plásmidos de E.coli .............................................................................................. 51 II.3.4. Aislamiento de DNA total de tejidos vegetales ............................................................................ 51 II.3.5. Electroforesis de DNA en geles de agarosa .................................................................................. 52 II.3.6. Purificación de fragmentos de DNA de geles de agarosa ............................................................ 52 2 II. 3.7. Restricción del DNA ..................................................................................................................... 52 II.3.8. Ligación de fragmentos de DNA ................................................................................................... 53 II.3.9. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR ............................................................................ 53 II.3.10. Secuenciación automática de DNA ............................................................................................ 53 II.4. MÉTODOS DE PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE RNA Y cDNA ............................................................. 53 II.4.1. Tratamiento del material ............................................................................................................. 53 II.4.2. Aislamiento de RNA de plantas .................................................................................................... 54 II.4.2.1. Aislamiento de RNA de hojas ................................................................................................ 54 II.4.2.2. Aislamiento de RNA de endospermo .................................................................................... 54 II.4.3. Aislamiento de RNA Poli(A) + ......................................................................................................... 55 II.4.4. Cuantificación del RNA ................................................................................................................. 55 II.4.5. Electroforesis de RNA ................................................................................................................... 55 II.4.6. Hibridación de RNA mensajero con sondas radiactivas ............................................................... 56 II.4.7. Preparación de cDNA por RT-PCR ................................................................................................ 57 II.4.8. RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) .................................................................................. 57 II.4.9. Amplificación de los extremos del cDNA (RACE) .......................................................................... 59 II.5. MÉTODOS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ........................................................... 60 II.5.1. Expresión de proteínas en E. coli ................................................................................................. 60 II.5.2. Obtención de extractos de E. coli ................................................................................................. 61 II.5.3. Expresión transitoria de proteínas en hojas de Nicotiana benthamiana ..................................... 62 II.5.4. Purificación de proteínas recombinantes .................................................................................... 63 II.6. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ..................................................................................... 63 II.6.1. Extractos totales de proteína ....................................................................................................... 63 II.6.2. Cuantificación de extractos proteicos .......................................................................................... 64 II.6.3. Precipitación de proteínas ........................................................................................................... 64 II.6.4. Cromatografía en columnas ......................................................................................................... 64 II.6.4.1. Filtración en gel .................................................................................................................... 64 II.6.4.2. Cromatografía de afinidad .................................................................................................... 65 II.6.5. Electroforesis de proteínas .......................................................................................................... 66 II.6.5.1. SDS-PAGE .............................................................................................................................. 66 II.6.5.2. Electroforesis bidimensional ................................................................................................. 66 II.6.5.3. Marcadores de masa molecular para las electroforesis de proteínas .................................. 67 II.6.6. Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida .......................................................................... 67 II.6.7. Espectrofotometría de masas e identificación de proteínas ....................................................... 67 II.7. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS ........................................................................................................ 68 II.7.1. Análisis mediante Western blot ................................................................................................... 68 II.7.2. Inmunolocalización ...................................................................................................................... 69 II.7.3. Purificación de anticuerpos .......................................................................................................... 70 II.7.3.1. Purificación de anticuerpos en Proteína A............................................................................ 70 II.7.3.2. Purificación del anticuerpo anti-NTRC en columnas NHS ..................................................... 70 II.7.4. Inmunoprecipitación .................................................................................................................... 71 II.8. ENSAYOS ENZIMÁTICOS ................................................................................................................ 71 II.8.1. Determinación de la actividad Sacarosa Sintasa .......................................................................... 71 II.9. HERRAMIENTAS DE BIOINFORMÁTICA .......................................................................................... 73 3 III. RESULTADOS .................................................................................................................. 75 III.1. ESTUDIO DE NTRC EN ENDOSPERMO DE SEMILLAS DE CEREALES................................................. 77 III.1.1. Patrón de expresión de NTRC en endospermo ........................................................................... 77 III.1.1.1. Patrón de expresión de NTRC en arroz (Oryza sativa) ......................................................... 79 III.1.1.2. Expresión de NTRC en trigo (Triticum aestivum) ................................................................. 82 III.1.2. Estudios para la identificación de NTRC en endospermo de semillas de cereales ..................... 88 III.1.3. Localización de NTRC en endospermo de semillas de cereales .................................................. 96 III.2. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN CON NTRC EN ENDOSPERMO DE SEMILLAS DE CEREALES ........................................................................................................................................ 99 III.2.1. Identificación de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de arroz (Oriza sativa) ............................................................................................................................................................. 100 III.2.1.1. Dianas identificadas por cromatografía de afinidad .......................................................... 100 III.2.1.2. Dianas de NTRC identificadas mediante inmunoprecipitación .......................................... 106 III.2.1.3. Comparación de resultados de ambos métodos ............................................................... 110 III.2.2. Identificación de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de trigo (Triticum aestivum).............................................................................................................................................. 113 III.2.3. Comparación de los resultados de arroz y trigo ....................................................................... 118 III.3. CARACTERIZACIÓN DE TRES ISOFORMAS DE SACAROSA SINTASA DE ARROZ ............................. 120 III.3.1. Análisis del patrón de expresión de los genes Sus1, Sus2 y Sus3 durante el desarrollo de las semillas de arroz .................................................................................................................................. 120 III.3.1.1. Expresión de los genes Sus de arroz en condiciones de estrés abiótico ............................ 124 III.3.2. Clonación de los cDNAs de SUS de arroz para su expresión en E. coli ...................................... 126 III.3.3. Pruebas de expresión de las SUS de arroz en E. coli ................................................................. 127 III.3.4. Clonación de los cDNAs de SUS de arroz para la expresión en N. benthamiana ...................... 128 III.3.5. Expresión de las SUS de arroz en N. benthamiana ................................................................... 130 III.3.6. Purificación de las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 ......................................................... 131 III.3.7. Caracterización bioquímica de OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 ...................................................... 133 III.3.6.1. Estudio de la regulación redox de la actividad SUS ................................................................ 139 III.3.8. Actividad sacarosa sintasa en endospermo de arroz. Regulación redox .................................. 142 IV. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 144 IV.1. El gen NtrC se expresa en endospermo de semillas de cereales dando lugar a una enzima con características peculiares ................................................................................................................... 146 IV.2. La identificación de dianas de NTRC en endospermo de semillas de cereales sugiere diferentes funciones de la enzima ...................................................................................................................... 149 IV.3. Sacarosa sintasa: posible diana de NTRC en endospermo de semillas de cereales ..................... 159 IV.3.1. El patrón de expresión de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 durante el desarrollo de la semilla no se altera en condiciones de estrés salino. .......................................................................... 160 IV.3.2. Nuevo método para la producción de sacarosa sintasa recombinante .................................... 162 IV.3.3. Las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 difieren en sus propiedades bioquímicas ............... 164 IV.3.4. La actividad SUS está modulada por el estado redox ............................................................... 166 V. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 169 VI. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 173 10 I. INTRODUCCIÓN I.INTRDUCCIÓN 12 I.INTRDUCCIÓN 13 I.1. LOS CEREALES Los cereales representan el grupo más importante de plantas cultivadas y entre ellos se encuentran el trigo y el arroz, que suponen la base de alimentación de la mayor parte de la humanidad. Históricamente se han asociado con el origen de la civilización y la cultura de los pueblos, ya que el hombre pudo pasar de nómada a sedentario cuando se hizo agricultor. Desde entonces el cultivo de los cereales ha supuesto una parte importante de su sustento, siendo la naturaleza y el valor nutritivo de sus semillas el motivo de su cultivo. Del conjunto de cereales cultivados actualmente son el trigo y el arroz, junto con el maíz, los que presentan una mayor importancia económica siendo, con diferencia, los cereales más extendidos mundialmente en términos de superficie cultivada y con mayor producción a nivel mundial, cuya suma supuso el 89% de la producción total de cereales en 2010 (FAO: http://faostat.fao.org) (Tabla I.1). Tabla I.1. Producción mundial de cereales Superficie cultivada (10 6 Ha) Rendimiento (Kg/Ha) Producción (10 6 t) Maíz 161,7 5194,6 840,3 Arroz 159,4 4368,1 696,3 Trigo 217,2 3009,2 653,6 Cebada 47,6 2595,8 123,5 Sorgo 40,9 1361,2 55,7 Mijo 34,8 907,8 31,6 Avena 9,1 2161,9 19,6 Triticale 3,9 3385,6 13,3 Centeno 5,3 2319,4 12,4 Conjunto de cereales 688,1 3571,4 2457,7 Datos obtenidos de la división de estadística de la FAO, FAOSTAT (2010). La base de la importancia económica que representan los cereales reside en el alto contenido de almidón que acumulan en sus semillas, donde puede llegar a suponer un 70% de su peso seco (Hannah and James, 2008). El almidón acumulado sirve a la planta para asegurar la progenie al constituir una reserva energética para la germinación de la semilla. El almidón procedente de las semillas de cereales suministra la principal fuente de hidratos de carbono para la alimentación humana y ganadera, además de tener importantes aplicaciones industriales, como la fabricación de colas y pegamentos, emulsionantes o papel, siendo incluso utilizado en las industrias farmacéutica y textil (James et al., 2003). En la actualidad, el uso de I.INTRDUCCIÓN 14 almidón como materia prima para la producción de biopolímeros y bioalcoholes despierta un enorme interés frente a la creciente preocupación ante la dependencia de nuestra sociedad de las fuentes de energía no renovables, ofreciendo con ello una posible alternativa energética (Gray et al., 2006). Los cereales son además una importante fuente de nitrógeno, que se acumula en forma de proteínas de almacenamiento de semillas, incrementando con ello su valor económico y nutricional. Gran parte de la importancia del trigo, por ejemplo, se debe de hecho a su composición proteica rica en gluten que le aporta a la semilla las propiedades necesarias para la fabricación del pan (Shewry and Halford, 2002). I.1.1. Estructura y composición química de las semillas de cereales Los cereales son un grupo de plantas pertenecientes en su mayoría a la familia de las Gramíneas. Son plantas herbáceas anuales cuyo fruto, comúnmente denominado grano y en términos botánicos cariópside, consta principalmente de un embrión situado en un extremo y un endospermo que contiene la reserva energética para la germinación. Éste se encuentra rodeado por una envoltura externa denominada pericarpo que se desarrolla a partir de la pared del ovario. Bajo el pericarpo se encuentra la testa y el tejido nucelar, que derivan también de la pared interna del ovario. La testa es permeable al agua pero no a las sales disueltas, siendo de gran importancia para la germinación. La cuarta capa, denominada aleurona, se origina a partir de la diferenciación de células del endospermo y juega un papel muy importante en la germinación de la semilla. Pericarpo, testa, tejido nucelar y aleurona constituyen el salvado de las semillas de cereales, que comprende alrededor del 15% del peso del grano y posee importantes propiedades nutricionales y farmacéuticas (Hosahalli and Esmaeil, 2003). La composición química del grano de los cereales es bastante uniforme, salvo excepciones como, por ejemplo, el elevado contenido en lípidos y el bajo contenido en almidón de la avena. Por lo general los cereales contienen entre un 58% y 72 % de hidratos de carbono, entre el 8% y el 13% de proteínas, una pequeña proporción de lípidos que varía entre el 2% y el 5%, alrededor de 2% de sales minerales y entre un 2% y 11% de fibras (Belitz and Grosch, 1982). A nivel de grano, la composición química no es uniforme y varía enormemente dependiendo del tejido y de la función que lleva a cabo dentro de la semilla (Fincher, 1989). I.INTRDUCCIÓN 15 Figura I.1. Composición histológica de un grano de trigo. Adaptado de (Surget and Barron, 2005) A continuación se detallan las diferentes partes de la semilla (Figura I.1) así como su composición química específica: Pericarpo, es la capa más externa del grano y tiene función de protección de embrión y endospermo. Se trata de un tejido desarrollado a partir de las paredes del ovario, fotosintéticamente activo en las etapas iniciales del desarrollo del grano y constituido por células de paredes celulares robustas cuyo contenido celular va desapareciendo con la maduración del grano. Esta capa se divide a su vez en dos: una externa denominada epicarpio, exocarpo o pericarpo externo, y otra interior o pericarpo interno formada a su vez por el mesocarpio, constituido por células transversales, y el endocarpio, constituido por células tubulares (Figura I.2). El pericarpo es un tejido rico en fibras insolubles. En el grano de trigo maduro, por ejemplo, se compone principalmente de fibras de celulosa y xilanos, además de cantidades importantes de lignina, ácido ferúlico y compuestos bioactivos (betaina y colina) (Javed et al., 2012). Testa, es un tejido de origen materno derivado de la pared interna del ovario, constituido por células cuyo contenido va desapareciendo con la maduración del grano. En el grano maduro supone una fina capa constituida por paredes celulares ricas en lignina y xilanos (Hemery et al., 2007)(Figura I.2). En algunos cereales como el trigo, la cebada y el centeno esta capa presenta un alto contenido de alquilresorcinoles (Landberg et al., 2008). Tejido nucelar, es un tejido de origen materno constituido por células parenquimáticas y epidérmicas que degeneran en etapas tempranas del desarrollo de la semilla (Domínguez and Cejudo, 1998) (Figura I.2). Este tejido participa en la nutrición del endospermo en sus etapas iniciales de crecimiento, adquiriendo de este modo un papel importante en su desarrollo y crecimiento (Thorne, 1985). I.INTRDUCCIÓN 16 Capa de aleurona, es una capa de células altamente especializadas que rodea al endospermo, a partir del cual se origina mediante diferenciación de sus células más periféricas. Sin embargo, las propiedades morfológicas y bioquímicas de las células de la capa de aleurona son diferentes de las del endospermo. En la mayoría de cereales se compone de una única capa de células aunque en algunos, como la cebada, consta de tres capas o de un número variable de capas en el caso del arroz. Las células de aleurona, que permanecen vivas durante todo el desarrollo de la semilla, poseen gruesas paredes de doble capa que definen una forma cuboide regular y encierran un contenido celular rico en proteínas y lípidos (Figura I.2). Estas células no poseen almidón. El citoplasma presenta un aspecto granular debido a la acumulación de cuerpos de inclusión vacuolares denominados gránulos de aleurona donde se acumulan altos niveles de proteínas (46%) y ácido fítico (40%), que constituye el principal componente de reserva de fósforo en el grano y su acción quelante de minerales provoca una acumulación importante de estos en los gránulos en forma de sales insolubles (Becraft and Yi, 2011; Regvar et al., 2011). Además poseen un alto contenido en vitaminas, en el trigo la mayoría de las vitaminas B están presentes en esta capa. La capa de aleurona juega un papel muy importante en las semillas de cereales sintetizando y secretando enzimas hidrolíticas hacia el endospermo para facilitar la movilización de las sustancias de reserva durante la germinación. Constituye además el punto de producción de metabolitos anti-microbianos que protege al grano contra patógenos capaces de penetrar el pericarpo. Figura I.2. Micrografía electrónica de barrido de una sección transversal del salvado de un grano de trigo que muestra las capas de tejido que lo componen Pericarpo externo (P), Células transversales (Cc), Células tubulares (Tc), Testa (T), Tejido nucelar (Nu), Aleurona (Al), Endospermo (E). (Jerkovic et al., 2010). Endospermo de reserva, constituye la mayor parte del volumen del grano y está formado por células muertas en el grano maduro. En el endospermo se almacenan los nutrientes que son movilizados durante la germinación para mantener el crecimiento de la nueva plántula hasta que ésta sea autótrofa. El principal compuesto de reserva es el almidón, I.INTRDUCCIÓN 17 formado por polímeros de amilosa y amilopectina organizados en estructuras altamente ordenadas denominadas gránulos (James et al., 2003). En las células del endospermo, los gránulos de almidón están embebidos en una matriz de proteínas de reserva (Figura I.3). Las principales proteínas de reserva en cereales son prolaminas (altamente hidrofóbicas y solubles en soluciones alcohólicas) y globulinas (solubles en soluciones salinas), aunque también acumulan otras proteínas minoritarias. Ambas, prolaminas y globulinas, forman cuerpos proteicos en el lumen del retículo endoplasmático rugoso. En trigo y otros cereales relacionados, estos cuerpos son dirigidos hacia grandes vacuolas de almacenamiento de proteínas. En maíz y otros cereales como el arroz, estos cuerpos proteicos quedan retenidos dentro del retículo endoplasmático rugoso (Sabelli and Larkins, 2009). Figura I.3. Micrografía electrónica de barrido de endospermo de maíz en desarrollo que muestra las paredes celulares (PC), los gránulos de almidón (GA) y los cuerpos proteicos (CP). Adaptado de (Sabelli and Larkins, 2009) Embrión, se localiza en un extremo del grano e incluye a su cotiledón laminar, altamente modificado, denominado escutelo. El embrión consta de un eje embrionario, donde se inserta el cotiledón que está cubierto por el coleoptilo y una radícula envuelta por la coleorriza. Escutelo, este tejido altamente especializado se localiza entre el endospermo de reserva y el embrión. Dentro de este tejido se distingue un epitelio secretor que participa tanto en la secreción de enzimas hidrolíticas como en la absorción de productos de degradación procedentes del endospermo y su transporte hasta el embrión. Las características estructurales de las células de este epitelio se asemejan a las de las células de aleurona, conteniendo cuerpos proteicos especializados rodeados por cuerpos lipídicos que contienen fitina. Además poseen un contenido elevado de azúcares solubles y vitaminas. De este modo las células del epitelio del escutelo pueden iniciar rápidamente, al igual que las células de la capa de aleurona, la biosíntesis de proteínas al inicio de la germinación. I.INTRDUCCIÓN 18 I.1.2. Ciclo de vida El ciclo de vida de la semilla comprende dos fases bien definidas: desarrollo y germinación, separadas por un periodo de dormición (Rock and Quatrano, 1995). El desarrollo de la semilla se inicia con la fertilización, a la que le sucede un periodo de crecimiento donde la semilla alcanza su máximo tamaño. Culmina en la etapa de maduración, un proceso de pérdida masiva de agua que da lugar a la semilla madura, que entra en un periodo de dormición (Bewley, 1997). La fase de germinación se inicia tras la rehidratación de la semilla bajo condiciones ambientales apropiadas. I.1.2.1. Desarrollo El desarrollo del grano se inicia tras la fertilización, que en cereales comprende un doble evento. Un primer proceso de fertilización de dos núcleos polares del saco embrionario por una célula espermática produce un cigoto triploide que dará lugar al endospermo, mientras que la fertilización del óvulo por una segunda célula espermática produce un cigoto diploide, que mediante la embriogénesis dará lugar al embrión (Sabelli and Larkins, 2009). La importancia nutricional y económica de los cereales reside principalmente en las sustancias de reserva almacenadas en el endospermo. Es por ello que el desarrollo de este tejido haya sido objeto de numerosos estudios. En el desarrollo del endospermo en cereales se pueden distinguir cuatro etapas (Bosnes et al., 1992) (Figura I.4): Figura I.4. Fases del desarrollo del endospermo de cereales Tipos celulares del endospermo de maíz (A) y de cebada (B): endospermo de reserva (end), aleurona (al), células de transferencia (Ct) y células que rodean el embrión (e). De (C) a (E), esquematización de las fases de formación del sincitio (C), celularización (D) y diferenciación (E) del desarrollo del endospermo de cereales. El código de colores es el mismo que en (A) y (B). Vacuola centra (Vc). Adaptado de (Olsen, 2004). A B C D E I.INTRDUCCIÓN 19 • Formación del sincitio. Varias horas después de la fertilización el núcleo triploide inicial sufre ciclos sincronizados de división celular sin citocinesis ni formación de pared celular que resulta en la formación de un sincitio multinucleado. Una vez alcanzado el número de núcleos adecuado, que varía según la especie, éstos migran alrededor de una gran vacuola central siguiendo un patrón de polaridad antero-posterior. Este desarrollo sincitial se considera una estrategia evolutiva que permite una rápida proliferación celular facilitando el crecimiento de este tejido, cuya función es nutrir el crecimiento del embrión, especialmente durante el periodo en el que las células específicas dedicadas a la absorción de nutrientes por el endospermo aún no se han diferenciado. • Celularización. El sincitio sufre un proceso de celularización mediante la formación de un sistema radial internuclear de microtúbulos y un proceso de formación de alveolos abiertos, esto es, estructuras tubulares abiertas por la pérdida de una pared celular periclinal interna que rodea cada núcleo. La celularización del endospermo ocurre centrípetamente desde la periferia hasta que la cavidad central está totalmente ocupada por células. • Diferenciación. Incluye la formación de los principales tipos celulares (células de transferencia, aleurona, endospermo de reserva y células que rodean al embrión), el periodo de mitosis y endoreduplicación, y la acumulación de compuestos de reserva. • Maduración. Es el proceso final del desarrollo del endospermo que consiste en una pérdida masiva de agua. Esta etapa comienza una vez que el grano ha alcanzado su máximo volumen y todos los tejidos están diferenciados y culmina con la generación de la semilla madura, que posee un contenido hídrico inferior al 10%. De este modo se incrementa la longevidad de las semillas así como su capacidad de resistencia ante condiciones ambientales adversas. La desecación de las semillas es un proceso mediado por la hormona ABA, que participa tanto en la regulación de genes codificantes de proteínas que intervienen en la protección frente a la desecación como en el establecimiento y mantenimiento de la semilla en el periodo de dormición (Bewley, 1997). Aunque el desarrollo de la semilla requiere una alta tasa de división celular que permita el crecimiento y formación de nuevos tejidos, la muerte celular también es un proceso de gran importancia durante esta fase. Diferentes tejidos como son los de origen materno (pericarpo, testa y tejido nucelar) o el endospermo sufren procesos de muerte celular programada. La semilla madura se compone por tanto de diferentes tejidos que han sufrido muerte celular y por tejidos que permanecen vivos (embrión, escutelo y células de aleurona), en un estado latente, preparados para reactivarse metabólicamente durante la germinación (Pulido et al., 2009). I.INTRDUCCIÓN 26 • Sistema de señaliación redox. Estudios de localización realizados en semillas de trigo en desarrollo revelaron la presencia de Trx h en tejidos vasculares y células de transferencia (Serrato and Cejudo, 2003). La localización en estos tejidos, implicados en la conexión de la semilla con las diferentes partes de la planta, sugieren la participación del sistema NTR/Trx h en la transmisión de señales redox. Por otro lado, estudios realizados con semillas transgénicas de cebada sobreexpresoras de Trx h, mostraron una aceleración de la germinación del embrión y un incremento en la liberación de α-amilasas por las células de aleurona, evidencias de la implicación de la Trx h en la comunicación entre ambos tejidos (Wong et al., 2002). • Protección frente al daño oxidativo en células de aleurona y escutelo durante el desarrollo y germinación de la semilla. Las células de aleurona y escutelo necesitan sobrevivir al estrés oxidativo causado durante la desecación de la semilla. La identificiación, mediante el análisis inmunocitoquímico en semillas de trigo, de la acumulación de NTR y Trx h en el núcleo de estas células junto con el descubrimiento de la capacidad de NTR para llevar a cabo la reducción del peróxido de hidrógeno a través de la 1-Cys-Prx (también con localización nuclear en estos tejidos), puso de manifiesto la participación de este sistema redox en la protección de las estructuras nucleares frente al daño oxidativo (Pulido et al., 2009). • Posible control de la expresión génica. La participación del sistema NTR/Trx h en el control de los niveles de peróxido de hidrógeno en el núcleo de células de aleurona y escutelo, junto con la capacidad del peróxido de hidrógeno de ejercer una regulación redox sobre factores de transcripción (Delaunay et al., 2002), abre la posibilidad de que el control redox de la expresión génica sea una función adicional del sistema NTR/Trx h en semillas de cereales. I.1.5.1. NTRC NTRC es una NTR atípica compuesta por un módulo NTR y un módulo Trx en el mismo polipéptido, y que es capaz de conjugar ambas actividades para reducir directamente los puentes disulfuro de sus proteínas diana utilizando NADPH como donador de electrones (Serrato et al., 2004; Moon et al., 2006; Perez-Ruiz et al., 2006). Para llevar a cabo este proceso, NTRC actúa como homodímero, de tal forma que la transferencia del poder reductor se produce preferentemente entre el módulo NTR de una subunidad y el módulo Trx de la otra (Perez-Ruiz and Cejudo, 2009) (Figura I.9). I.INTRDUCCIÓN 27 Figura I.9. Transferencia del poder reductor a través de NTRC NTRC es activa en forma de homodímero. El NADPH dona los electrones al cofactor FAD del módulo NTR de cada subunidad y posteriormente los electrones son transferidos a los residuos de cisteína del sitio activo del dominio Trx de la otra subunidad. NTRC convierte el poder reductor (NADPH) en señal redox (tioles). (Cejudo et al., 2012) NTRC está codificada por un gen de copia única exclusivo de organismos fotosintéticos encontrándose en plantas, algas y algunas, no todas, cianobacterias (Pascual et al., 2010). Inicialmente se describió como enzima cloroplastídica, sin embargo, estudios recientes sobre el patrón de expresión del gen NTRC en Arabidopsis revelaron que se expresa tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y que la proteína se localiza en todo tipo de plastos (Kirchsteiger et al., 2012). NTRC utiliza el NADPH como fuente de poder reductor, mostrando una alta afinidad por este donador de electrones (Serrato et al., 2004). En el cloroplasto, el NADPH se produce durante el día como producto final de la cadena transportadora de electrones fotosintética en una reacción catalizada por una Ferredoxina-NADP + oxidorreductasa (FNR) (Ceccarelli et al., 2004; Lintala et al., 2007) y durante la noche por la oxidación de azúcares en las reacciones iniciales de la ruta oxidativa de las pentosas fosfato (Neuhaus and Emes, 2000). De este modo, NTRC en el cloroplasto actuaría como sistema redox complementario al sistema FTR/Trx durante el día, donde los niveles de Fd reducida son elevados; y como principal vía de regulación redox durante la noche, donde no existe producción fotosintética de Fd reducida (Perez-Ruiz et al., 2006). En los plastos de tejidos no fotosintéticos la única fuente de poder reductor es el NADPH generado en la ruta oxidativa de las pentosas fosfato de la sacarosa importada desde los tejidos fotosintéticos. En estos plastos, NTRC podría estar ejerciendo un importante papel en la regulación redox. En el cloroplasto NTRC participa en la destoxificación de peróxidos actuando como principal reductor fisiológico de 2-Cys Prxs, y su función es especialmente importante durante la noche, cuando no existe ferredoxina reducida. De hecho, estudios in vitro demostraron que I.INTRDUCCIÓN 28 NTRC es capaz de reducir con más eficiencia a la 2-Cys Prx que otras Trxs cloroplastídicas que eran consideradas hasta entonces como los reductores fisiológicos de esta peroxirredoxina (Moon et al., 2006; Perez-Ruiz et al., 2006; Alkhalfioui et al., 2007). Además, el sistema NTRC/2-Cys Prx, como sistema antioxidante, estimula la actividad ciclasa durante la síntesis de clorofila, que es sensible a ROS (Aarti et al., 2006; Stenbaek et al., 2008). El mutante ntrc de Arabidopsis, knock out para la enzima, presenta una mayor sensibilidad a diferentes estreses abióticos y muestra rasgos fenotípicos característicos, como retraso en el crecimiento, hojas más pálidas debido a un menor contenido de clorofilas a y b, estructura anómala del mesófilo de la hoja, alteración en la estructura cloroplastídica y una menor tasa de fijación de CO 2 , entre otras. Además, el fenotipo de este mutante es mucho más severo en condiciones de día corto (Perez-Ruiz et al., 2006; Lepisto et al., 2009). Sorprendentemente, las alteraciones fenotípicas observadas en este mutante son mayores que las presentadas por un mutante con niveles reducidos de 2-Cys Prx cloroplastídica (Pulido et al., 2010). Este hecho, junto con la existencia de diversos sistemas antioxidantes en el cloroplasto capaces de suplir su función (Foyer and Noctor, 2009), sugerían que NTRC debe ejercer otras funciones en el cloroplasto diferentes a la regulación redox de la 2-Cys Prx. Así mismo, el descubrimiento del patrón de localización de NTRC también en plastos no fotosintéticos (Kirchsteiger et al., 2012), reveló la posibilidad de la participación de la enzima en la regulación redox de procesos diferentes a la destoxificación de ROS característica de los plastos fotosíntéticos. Para llegar a conocer las diferentes funciones que NTRC lleva a cabo tanto en plastos fotosintéticos como no fotosintéticos se requiere la identificación de sus proteínas dianas. En los últimos tiempos se han realizado avances en el conocimiento de las nuevas funciones de NTRC (Figura I.10), demostrándose su participación en diferentes procesos como la síntesis de almidón mediante la regulación redox de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa), enzima clave de la ruta y altamente regulada, y cuyo efecto regulador ha sido descrito tanto en hoja como en raíz (Michalska et al., 2009). Otros procesos para los que se ha propuesto una regulación redox mediada por NTRC son la síntesis de aminoácidos aromáticos (Lepisto et al., 2009) o la biosíntesis de clorofila a través de la regulación redox de la Mg-quelatasa, enzima implicada en la inserción de Mg 2+ en la protoporfirina IX (Stenbaek and Jensen, 2010). Sin embargo las características del efecto regulador de NTRC en estos procesos aún se desconocen. I.INTRDUCCIÓN 29 Figura I.10. Resumen de las funciones de NTRC en la regulación redox del cloroplasto El poder reductor (NADPH) en el cloroplasto procede de la ferredoxina (Fd), reducida por la cadena transportadora de electrones, en una reacción catalizada por la Fd-NADP-oxidorreductasa (FNR); o de la glucosa 6-P (G6P) a través de la ruta oxidativa de las pentosas fosfato. NTRC participa en la regulación redox de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos como el triptófano (Trp), que es un precursor de la síntesis de auxinas. NTRC es el principal reductor de 2-Cys Prx (2CP) cuya actividad reduce el peróxido de hidrógeno y, por tanto, protege la ciclasa Mg-protoporfirin monometil ester (CYC) proporcionando un efecto positivo en la biosíntesis de clorofila. Finalmente, NTRC participa en la regulación redox de la Mg-quelatasa (Mg-CHL) y de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) participando así en la regulación de la biosíntesis de clorofilas y almidón, respectivamente. Es probable la posible participación de NTRC en la regulación de otras funciones a través de la regulación redox de nuevas proteínas diana en plastos. Adaptado de (Cejudo et al., 2012). I.1.6. Metabolismo del almidón Las semillas de cereales acumulan grandes cantidades de almidón, que constituye una reserva energética primordial para la germinación. Dada la enorme importancia agroeconómica del almidón procedente de cereales, anteriormente mencionada, el metabolismo del almidón y las enzimas participantes en el mismo han sido objeto de numerosos estudios por lo que su ruta biosintética y degradativa ha sido descrita en detalle. El almidón es un polímero constituido por residuos de D-glucosa unidos mediante enlaces glucosídicos (α-1,4 y α-1,6). En las semillas de cereales se almacena almidón de reserva, que se sintetiza y acumula en los amiloplastos de las células del endospermo en forma de gránulos insolubles. El número, tamaño y forma de estos varían según la especie. La característica principal del almidón de reserva, que lo diferencia del almidón transitorio sintetizado en los cloroplastos de células fotosintéticas, es la existencia de una separación temporal entre los procesos de síntesis y de degradación, ocurriendo en fases distintas de su ciclo de vida como son el desarrollo y la germinación de la semilla, respectivamente. En el almidón transitorio en cambio, la síntesis y degradación ocurren de forma alterna y dinámica durante el ciclo día/noche. I.INTRDUCCIÓN 30 En tejidos no fotosintéticos, como es el endospermo de semillas de cereales, la fuente de carbono para la síntesis del almidón procede de la sacarosa sintetizada en el tejido fotosintético e importada a los órganos sumidero a través del sistema vascular de la planta. El transporte desde las células fuente a las células sumidero se realiza mediante transportadores de sacarosa localizados en la membrana plasmática de estas células así como de las células transportadoras del floema (Lemoine, 2000). De este modo, la sacarosa se importa al citosol de las células del endospermo donde se transforma por la acción secuencial de las enzimas sacarosa sintasa (SUS, también denominada SuSy), UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa) y fosfoglucomutasa citosólica (cPGM) en glucosa-6 fosfato (Glc-6-P). La Glc-6-P se importa al amiloplasto mediante un translocador de hexosas específico (Fischer and Weber, 2002) donde se convierte en glucosa-1 fosfato (Glc-1-P) que sirve como precursor de la síntesis de almidón (Neuhaus and Emes, 2000). I.1.6.1. Síntesis de almidón en semillas de cereales La síntesis de almidón en plantas vasculares es el resultado de una compleja ruta metabólica en la que se pueden distinguir cuatro pasos enzimáticos básicos: activación del sustrato, elongación, ramificación y desramificación del polímero (Ballicora et al., 2004). En semillas de cereales esta ruta posee además características específicas diferentes a la existente en tejidos fotosintéticos y en otros tejidos no fotosintéticos (Figura I.11). • Activación del sustrato En plantas, la forma activada de glucosa para la donación de grupos glucosilo al polímero en crecimiento es la ADP-glucosa (ADPG), sintetizada a partir de ATP y Glc-1-P en una reacción catalizada por la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa, reacción 1). ATP + Glc-1-P ADP-glucosa + PPi [1] Esta reacción es considerada como el paso limitante para la biosíntesis del almidón en plantas (Green and Hannah, 1998). La reacción sólo es reversible in vitro dado que la hidrólisis del pirofosfato (PPi) mediada por pirofosfatasas, garantiza la casi total irreversibilidad del proceso in vivo. Al catalizar el primer paso de la ruta metabólica, la AGPasa es un punto clave de regulación de la biosíntesis de almidón y como tal está sujeta a un complejo mecanismo de regulación que actúa en diferentes niveles jerárquicos. Los principales mecanismos que controlan la actividad de la enzima son la regulación alostérica por intermediarios metabólicos de las vías principales de asimilación de carbono, activándose en presencia de 3-fosfoglicerato I.INTRDUCCIÓN 31 (3-PGA) e inhibiéndose por fosfato inorgánico (Pi) (Preiss, 1988); el control redox postraduccional en respuesta a luz y azúcares mediado por Trxs (Ballicora et al., 2000; Hendriks et al., 2003) y en el que, como se mencionó anteriormente, está implicada NTRC (Michalska et al., 2009); y la regulación de la expresión de los genes que codifican AGPasa . Una característica exclusiva del endospermo de cereales es la existencia de dos formas distintas de AGPasa, plastídica y citosólica (Figura I.11B). En este tejido la síntesis de ADPG ocurre mayoritariamente en el citosol (Denyer et al., 1996; Beckles et al., 2001) y se importa al amiloplasto a través de un translocador específico, cuya actividad es crucial para la síntesis de almidón en cereales (Shannon et al., 1998). Esta isoforma citosólica exclusiva de cereales presenta características propias como son la baja sensibilidad a la activación alostérica por 3- PGA y mayor dependencia de la disponibilidad de sustrato o la ausencia en la proteína del residuo de cisteína conservado implicado en la regulación redox de la enzima. De esta forma, los cereales aseguran una alta tasa de síntesis de almidón en el endospermo de las semillas al canalizar todo el metabolismo del carbono hacia la síntesis de almidón y disponer de un suministro de ADPG garantizado (Sikka et al., 2001; Hendriks et al., 2003). • Elongación del polímero Tras la síntesis de la ADPG, tiene lugar la transferencia del grupo glucosilo al extremo no reductor del polímero en crecimiento, mediante la formación de nuevos enlaces α-(1,4). Este paso está catalizado por las almidón sintasas (SS, reacción 2). ADP-glucosa + (α-1,4-glucano) n (α-1,4-glucano) n+1 + ADP [2] En plantas, las almidón sintasas pueden clasificarse en dos grandes grupos, solubles (SSS) y unidas a gránulo (GBSS). Las SSS están implicadas exclusivamente en la síntesis de amilopectina y se pueden diferenciar, mediante comparación de sus secuencias primarias, cuatro isoformas denominadas SSSI, SSSII, SSSIII y SSSIV (Ball and Morell, 2003; Hirose and Terao, 2004; Tetlow et al., 2004). La GBSS, implicadas en la síntesis de amilosa, presentan una única isoforma en plantas (GBSSI), excepto algunos cereales como el arroz, que poseen dos (GBSSI y GBSSII) (Tetlow et al., 2004). I.INTRDUCCIÓN 32 Figura I.11. Rutas de síntesis de almidón en células fotosintéticas (A) y en células heterotróficas (B) PGI, fosfoglucosa isomerasa; PGM, fosfoglucomutasa; AGPasa, ADP-glucosa pirofosforilasa; SUS, sacarosa sintasa; UGPasa, UDP-glucosa pirofosforilasa; BT1, trasportador de ADPG Brittle1; SSs, SBEs y DBEs, almidón sintasas, enzimas ramificantes y enzimas desramificantes, respectivamente; FK, fructoquinasa. Las reacciones dentro del recuadro azul son exclusivas del endospermo de cereales. Las flechas punteadas indican una posible reacción catalizada por la SUS en células heterotróficas. A B I.INTRDUCCIÓN 33 • Ramificación del polímero Las enzimas ramificantes del almidón (SBE, reacción 3), al igual que las SS, participan en la síntesis de amilopectina. En concreto, son las responsables de catalizar la separación de un fragmento del extremo no reductor de la molécula de amilopectina, por rotura de una unión α-(1,4). El fragmento liberado es posteriormente unido, por la misma enzima, al C 6 de una molécula de glucosa mediante la formación de un nuevo enlace glucosídico α-(1,6), dando lugar a un punto de ramificación en la amilopectina. Cadena α-1,4-glucano α-1,4-α-1,6-glucano ramificado [3] En plantas se han descrito dos isoformas en base a las diferencias en su secuencia de aminoácidos, denominadas SBEI y SBEII (Ball and Morell, 2003; Tetlow et al., 2004). • Desramificación del polímero Aunque inicialmente se pensaba que las actividades SSs y SBEs eran las únicas requeridas para la síntesis de la amilopectina y la formación del gránulo, actualmente se sabe que algunas de las enzimas desramificantes (DBEs) son también necesarias para la correcta formación de éste (Zeeman et al., 1998; Tetlow et al., 2004). Las DBEs catalizan la hidrólisis de los enlaces α- (1,6) y según sus características enzimáticas y estructurales se clasifican en dos tipos, las denominadas DBE tipo isoamilasa y las DBE tipo pululanasa (Beatty et al., 1999). El proceso de biosíntesis de almidón anteriormente descrito es el más aceptado por la comunidad científica, ya que lo soportan numerosos resultados experimentales (Smith et al., 1997; Sivak and Preiss, 1998; Ball and Morell, 2003; Tetlow et al., 2004). Sin embargo, no es el único modelo propuesto. Un modelo alternativo para la síntesis del almidón propone que la SUS catalizaría, en el citosol de las células vegetales, la síntesis de novo de la ADPG, que sería transportada al interior del plasto por medio de un translocador específico (Pozueta-Romero et al., 1991; Baroja-Fernandez et al., 2003). Una vez en el plasto, sería sustrato del conjunto de enzimas encargadas de la elongación del polímero de almidón, de acuerdo con las reacciones enzimáticas descritas anteriormente. Sin embargo, aunque la SUS es capaz de producir ADPG y fructosa, a partir de sacarosa y ADP in vitro (Delmer, 1972), se considera que su función normal in vivo es la producción de UDP-Glucosa (UDPG) y fructosa (Streb et al., 2009). A pesar de todas las evidencias experimentales recogidas en la bibliografía, no se puede descartar por completo un eventual papel de la enzima SUS en las síntesis de la ADPG en el citosol. I.INTRDUCCIÓN 34 I.1.6.2. Degradación del almidón de reserva El almidón de reserva acumulado en el endospermo de las semillas de cereales es degradado durante la germinación para nutrir el crecimiento de la nueva plántula. En el momento de la germinación, el endospermo está constituido por células muertas, que perdieron la integridad celular tras la fase de secado de la semilla. La degradación del almidón en este tejido depende de las enzimas hidrolíticas del almidón liberadas al endospermo desde el escutelo y la aleurona, y de las β-amilasas, que son depositadas en el endospermo durante el desarrollo de la semilla y activadas durante la germinación por acción de las proteasas liberadas desde la capa de aleurona. El producto liberado de la degradación del almidón es principalmente la glucosa, que es captada por el escutelo y transferida al embrión (Zeeman et al., 2010). Figura I.12. Modelo de las rutas de degradación de almidón en células fotosintéticas AMY, α-amilasa; ISA, isoamilasa; BAM, β-amilasa; LDA, pululanasa; PHS, fosforilasa; DPE, enzima desproporcionante. Adaptado de (Zeeman et al., 2007). Los estudios bioquímicos revelan la presencia en el endospermo de cuatro enzimas relacionadas con la degradación del almidón: α-amilasa, β-amilasa, DBE y α-glucosidasa (maltasa) (Figura I.12). Las α-amilasas poseen un papel principal en la degradación del almidón en el endospermo. Estas enzimas inician la degradación del gránulo de almidón, probablemente en sitios específicos (poros) de la superficie del gránulo y gracias a su acción endoamilolítica se liberan una mezcla de oligosacáridos lineales y ramificados solubles. Estos son degradados por la acción de α-amilasas, DBEs y β-amilasas hasta maltosa y pequeños malto-oligosacáridos que a su vez son degradados a glucosa por las α-glucosidasas (maltasas) I.INTRDUCCIÓN 35 (Zeeman et al., 2010). Existen evidencias de que las α-glucosidasas pueden participar también junto con las α-amilasas para liberar directamente glucosa desde la superficie del gránulo (Sun and Henson, 1991). I.1.6.3. Sacarosa sintasa La enzima sacarosa sintasa (SUS) juega un papel esencial en la síntesis de almidón en los tejidos heterotróficos, donde cataliza el primer paso de la conversión de sacarosa en almidón. En estos tejidos, la SUS cataliza la degradación de sacarosa hasta UDPG y fructosa, que pueden ser metabolizados para la producción energética o ser incorporados en las rutas biosintéticas de polisacáridos (almidón, celulosa o fructanos) (Koch, 2004). Siendo la sacarosa la forma mayoritaria de carbono transportada en plantas, la SUS ha sido una enzima ampliamente estudiada desde su descubrimiento en 1955 (Cardini et al., 1955) debido a la importancia de su actividad enzimática en la distribución de los fotoasimilados en la planta. Las semillas de cereales constituyen grandes reservorios de carbohidratos y como tales, durante su desarrollo, se convierten en importantes sumideros de fotoasimilados. La “fuerza sumidero” (sink strength) de un órgano se define como su capacidad de captación de fotoasimilados (Ho, 1988). Dado que la sacarosa es el fotoasimilado mayoritario en plantas, este concepto está fuertemente relacionado con la actividad SUS en las semillas de cereales, donde es la principal enzima encargada de la rotura de la sacarosa. En plantas, además de la reacción catalizada por la SUS, existe otra vía para la degradación de la sacarosa catalizada por invertasas. Estas pueden clasificarse en base a su pH óptimo de actividad (ácida, neutra y básica), solubilidad de la enzima (soluble o insoluble) o localización celular (citosólica, vacuolar y de pared celular). Las invertasas catalizan la hidrólisis irreversible de la sacarosa en glucosa y fructosa: Sacarosa + H 2 O Glucosa + Fructosa Por el contrario, la SUS cataliza la rotura reversible de la sacarosa produciendo UDPG en vez de glucosa: Sacarosa + UDP UDP-Glucosa + Fructosa Ambas enzimas se encargan de la degradación de la sacarosa in vivo, pero los productos de sus reacciones difieren, así como el destino y función de los mismos. Las invertasas producen el doble de hexosas que la SUS, lo que les dota de la capacidad de estimular sensores de azúcares específicos cuya señal provoca una alteración en la expresión I.INTRDUCCIÓN 42 (Doehlert, 1987). Los iones divalentes Ca 2+ y Mg 2+ normalmente producen inhibición en el sentido de rotura de la sacarosa, si bien, el grado de inhibición varía según la especie. Sin embargo, en la dirección de síntesis de sacarosa, los iones Ca 2+ y Mg 2+ tienen un efecto estimulador (Huang and Wang, 1998; Tanase and Yamaki, 2000). Además, como otras muchas enzimas, la SUS está fuertemente inhibida por Cu 2+ , Zn 2+ y Hg + (Elling, 1995). I.1.6.3.4. Regulación de la actividad SUS La SUS está sujeta a modificaciones postraduccionales como fosforilación y regulación redox, capaces de modular su actividad y estabilidad. Las primeras observaciones de que la SUS podía ser objeto de fosforilación reversible las realizaron Shaw y colaboradores en 1994 (Shaw et al., 1994). La fosforilación ocurre en un residuo de serina del extremo N-terminal de la proteína (Huber et al., 1996; Zhang and Chollet, 1997). El sitio de fosforilación está conservado en casi todas las isoformas de dicotiledóneas y monocotiledóneas: -L-[STA]-R-[LV]- H-S*-[VLQ]-R (Winter and Huber, 2000). Diferentes estudios demostraron que la fosforilación de la SUS provoca un ligero incremento de su actividad enzimática en el sentido de rotura de la sacarosa, no teniendo ningún efecto sobre la actividad sintética (Huber et al., 1996; Winter et al., 1997; Nakai et al., 1998). Por el contrario, un estudio realizado con SUS recombinante de soja concluyó que la fosforilación no afectaba ni a su actividad ni a sus propiedades cinéticas y que tan solo provoca un cambio en la hidrofobicidad que altera su capacidad de unión a la membrana (Zhang et al., 1999). La fosforilación de esta serina predispone a la SUS a una segunda fosforilación (en la Ser170 o equivalente) que promueve la degradación de la proteína mediada por el proteasoma (Hardin et al., 2003). La actividad SUS también está sujeta a regulación redox mediante la formación reversible de puentes disulfuro (Pontis et al., 1981; Rohrig et al., 2004; Marino et al., 2008). En un estudio llevado a cabo en trigo se demostró que la actividad SUS se modifica por la acción de agentes redox, incrementando su actividad en sentido de rotura en presencia de agentes reductores (GSH y DTT) y disminuyéndola con la adición de agentes oxidantes (GSSG y Trxs oxidadas). La actividad SUS en sentido de síntesis de sacarosa, en cambio, no varía en función del estado redox. Se propuso que debían existir grupos tiólicos implicados en el mantenimiento de una conformación del sitio activo, cuya oxidación o reducción modifica la actividad de rotura de la SUS (Pontis et al., 1981). Similares resultados se obtuvieron en nódulos fijadores de nitrógeno de leguminosas, donde la inducción artificial de producción de ROS, y por tanto de un estrés oxidativo, provocaba una disminución de la actividad de rotura de la SUS (Marino et al., 2008). Ensayos in vitro con SUS de nódulos fijadores de nitrógeno de I.INTRDUCCIÓN 43 leguminosas demostraron que la oxidación de la enzima lleva a una disminución de su actividad en sentido de rotura de sacarosa, y que la reversión de la oxidación con agentes reductores provoca una recuperación de su actividad normal (Marino et al., 2008). Según estos resultados, la actividad SUS in vivo estaría regulada por la formación reversible de puentes disulfuro, sin embargo, el mecanismo implicado en esta regulación redox aún se desconoce. I.2. OBJETIVOS El objetivo central de este trabajo ha sido identificar procesos sometidos a regulación redox mediada por NTRC en tejidos no fotosintéticos de plantas de interés agronómico, en concreto, en el endospermo de semillas de cereales. Para llevar a cabo este estudio se han planteado las siguientes líneas de trabajo: • Estudio del patrón de expresión de Ntrc en los cereales modelo Oryza sativa y Triticum aestivum. • Caracterización de NTRC de endospermo de semillas de cereales y localización subcelular en este tejido. • Identificación de las proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de cereales. o Clonación y caracterización de tres proteínas diana de NTRC identificadas, las isoformas 1, 2 y 3 de la sacarosa sintasa de arroz. o Estudio de la participación de NTRC en la regulación redox de la sacarosa sintasa. I.INTRDUCCIÓN 44 Parte de los resultados que se exponen en este trabajo han sido publicados en los siguientes artículos y aportaciones a congresos: • Francisco Javier Cejudo, Julia Ferrández, Beatriz Cano, Leonor Puerto-Galán, Manuel Guinea (2012) The function of the NADPH thioredoxin reductase C-2-Cys peroxiredoxin system in plastid redox regulation and signalling. FEBS Lett. 586 (18): 2974-2980. • Beatriz Cano, José María Romero, Francisco Javier Cejudo. Redox control of the carbon flux in cereal endosperm. 22 th IUBMB & 37 th FEBS Congress, Sevilla, 2012. • Beatriz Cano, Julia Ferrández, Maria de la Cruz González, José María Romero, Francisco Javier Cejudo. Regulación redox de la síntesis de almidón en endospermo de arroz. (poster). X RBMP (Reunión de Biología Molecular de Plantas), Valencia, 2010. • Kerstin Kirchsteiger, Manuel Guinea, Julia Ferrández, Beatriz Cano, Belén Pascual, Maria de la Cruz González, Francisco Javier Cejudo. NTRC is a redox switch for oxidative stress response, starch metabolism and hormone signalling in Arabidopsis thaliana. “2 nd EMBO Conference on Plant Molecular Biology”, Cádiz, 2009. • Beatriz Cano, María Teresa Ruiz, José María Romero, Francisco Javier Cejudo. La ADP- Glucosa-pirofosforilasa y la NTRC muestran el mismo patrón de localización en semillas de cereales. IX RBMP (Reunión de Biología Molecular de Plantas), Santiago de Compostela, 2008. II.MATERIALES Y MÉTODOS II. MATERIALES Y MÉTODOS 46 II. MATERIALES Y MÉTODOS 47 End1 End2 End3 End4 II.1. MATERIAL VEGETAL En el desarrollo de este trabajo se han utilizado las especies de cereales Oryza sativa, Subsp. Japónica y Triticum aestivum, var. Chinese Spring. Además, se ha utilizado la planta modelo Nicotiana benthamiana como sistema para la agro-expresión de proteínas recombinantes en plantas. II.1.1. Esterilización de las semillas Las semillas de arroz o de trigo se esterilizaron incubándolas en NaOCl al 3% (v/v) durante 20-30 min. Posteriormente se sometieron a dos lavados sucesivos con agua destilada estéril, un lavado con HCl 0,01 M estéril y finalmente cinco lavados con agua destilada estéril (Abdul-Baki 1974). II.1.2. Germinación de las semillas y condiciones de cultivo En los experimentos de germinación, las semillas de arroz o de trigo, previamente esterilizadas, se incubaron en placas Petri provistas de papel de filtro humedecido con agua destilada estéril, a temperatura ambiente (22 a 25˚C) y durante los tiempos indicados en cada experimento. ESTADÍO ENDOSPERMO End1 acuoso-lechoso End2 lechoso End3 pastoso End4 duro Figura II.1. Desarrollo y clasificación de las semillas de arroz (A) Representación esquemática del orden de floración de las espigas de una panícula (la floración se completa en unos 8 días) donde las flores con x no abren (Aguilar, 2001). (B) y (C) Clasificación de las semillas de arroz realizada en este trabajo según el grado de desarrollo del endospermo. El cultivo de las plantas de arroz se realizó en las instalaciones de cultivos piloto CIFA Las Torres (Consejerías de Agricultura, Junta de Andalucía), Sevilla. Las semillas se sembraron por duplicado en balsetas (4 x 4 m) al aire libre y en condiciones de cultivo de campo. Una de B C A II. MATERIALES Y MÉTODOS 48 las balsetas, utilizada como control, se regó con agua, mientras que la otra se regó con agua suplementada con 2,5 g/L de NaCl durante todo el desarrollo de la planta. La recogida de las semillas se realizó durante la fase de llenado y maduración del grano, se congelaron inmediatamente en N 2 líquido y se almacenaron a -80°C hasta el momento de su uso. Las panículas recogidas en esta fase de desarrollo contienen granos en diferentes grados de madurez, madurando antes los granos de la parte alta de la panícula, y de fuera hacia adentro. Las semillas recolectadas se clasificaron en 4 estadíos de desarrollo (Figura II.1). Para la obtención de semillas de trigo en distintas fases de desarrollo, se dejaron germinar las semillas en placas provistas de papel de filtro humedecido con agua destilada estéril durante 2 días a 25°C en la cámara de cultivo. Posteriormente se mantuvieron en oscuridad a 4°C durante 3 días. Finalmente las semillas germinadas se trasplantaron a macetas conteniendo turba vegetal y se cultivaron en invernadero con una temperatura entre 22 y 25°C, una humedad relativa del 60% y un fotoperiodo de 16 h luz/ 8 h oscuridad. Bajo estas condiciones la espiga se forma aproximadamente a las 10 semanas de cultivo. Tras la aparición de los estambres (antesis) se recogieron semillas en distinto grado de desarrollo, hasta los 30- 35 días post-antesis (dpa), momento en el que se completa el desarrollo de la semilla (Figura II.2). Figura II.2. Semillas de trigo en desarrollo hasta los 30 días post-antesis (dpa) II.1.3. Nicothiana benthamiana El cultivo de Nicothiana benthamiana se realizó en invernadero germinando las semillas en alveolos conteniendo turba vegetal. Una vez germinadas se trasplantaron a macetas donde completaron su desarrollo. Las plantas crecieron en fotoperiodo de día largo (con 16 h de luz), a una humedad relativa del 60% y a una temperatura entre 22 y 25 °C. II. MATERIALES Y MÉTODOS 49 II.2. BACTERIAS II.2.1. Estirpes utilizadas Las estirpes de Escherichia coli empleadas en este trabajo, junto con sus características genotípicas más relevantes, se relacionan en la Tabla II.1. La estirpe DH5α se utilizó rutinariamente para la clonación de plásmidos. Las estirpes XL1-Blue y BL21 se utilizaron para la producción de proteínas recombinantes por inducción con IPTG. Para la expresión transitoria de proteínas recombinantes en Nicotiana benthamiana se utilizó la estirpe de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pGV2260. El almacenamiento de las construcciones en las bacterias se realizó al 20% de glicerol a -80°C. Tabla II.1. Estirpes de E. coli utilizadas en este trabajo Estirpes . Genotipo Referencias DH5α supE44 ∆lacU169 ( φ 80lacZ ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 (Hanahan, 1983) BL21(DE3) hsdS gal [lcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1] (Studier and Moffatt, 1986) XL1-Blue supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi-1 relA1 lac - F´ [proAB + lacI q lacZ M15 Tn10 (tet r )] (Bullock et al., 1987) II.2.2. Cultivo en medio líquido y sólido Las bacterias se cultivaron a 37°C (E. coli) o 30°C (Agrobacterium) en incubadores con agitación a 200 rpm. En ambos casos se utilizó el medio de cultivo Luria-Bertani (LB) (Sambrook, 1989) cuya composición es NaCl 10 g/L, bactotriptona 10 g/L y extracto de levadura 5 g/L. Para el cultivo en medio sólido el medio LB se solidificó con Bacto-agar al 1,5% (p/v). Para el cultivo y selección de cepas portadoras de plásmidos, el medio LB se suplementaba con 100 µg/mL de ampicilina (Ap) o 50 µg/mL de kanamicina (Km) en el caso de E. coli; y con 50 µg/mL de kanamicina (Km) o 25 µg/mL de rifampicina (Rif) en el caso de Agrobacterium. Estos antibióticos fueron se esterilizaron por filtración con filtros MILLEX®GP (MILLIPORE) de 0,2 µm de diámetro de poro. II.2.3. Obtención de células competentes La preparación de células competentes, realizadas en nuestro laboratorio o suministradas por el servicio de cultivos del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, se llevó a cabo por dos métodos diferentes. II. MATERIALES Y MÉTODOS 50 Para la obtención de células competentes electroporables de la cepa BL21(DE3) de E. coli y de Agrobacterium se siguió el protocolo descrito a continuación. Se prepararon cultivos de 500 mL de medio LB suplementado con el antibiótico adecuado, en el caso de las cepas de E. coli, o de medio YENB [bacto yeast extract 0,75% (p/v), bacto nutrient broth 0,8% (p/v)] suplementado con rifampicina (50 µg/mL) para Agrobacterium, dejándolos alcanzar una DO 600 de 0,5-0,9. Posteriormente se recogieron las células por centrifugación a 3500 xg durante 10 min a 4°C, se lavaron dos veces con 100 mL de agua fría y una vez con 20 mL de glicerol 10% (v/v). Finalmente se resuspendieron en 2-3 mL de glicerol 10% (v/v) frío y se distribuyeron en volúmenes de 40 µL. La obtención de células competentes de la cepa DH5α de E.coli para la transformación por choque térmico (Sambrook, 1989) consistió en cultivar las células en 5 mL de medio LB durante 12 h, con agitación, a 37°C. De este cultivo se utilizaron 0,5 mL para inocular 50 mL de medio LB que se cultivaron a 37°C con agitación durante 90 min. Las células se recogieron por centrifugación a 2000 xg durante 10 min a 4°C y se resuspendieron en 15 mL de CaCl 2 100 mM frío. Tras enfriar en hielo 40 min, se centrifugaron de nuevo (2000 xg, 5 min, 4°C), resuspendiendo las células en 5 mL de CaCl 2 100 mM. Tras enfriar en hielo durante 1-3 h, se añadió 1 mL de glicerol frío. La mezcla se repartió en alícuotas de 200 mL que se almacenaron a -80°C hasta su uso. II.3. MÉTODOS DE MANIPULACIÓN Y ANÁLISIS DE DNA II.3.1. Clonación de cDNAs Los cDNAs utilizados en este trabajo se amplificaron por PCR utilizando Taq Polimerasa de alta fidelidad (iProof, BioRad) con el protocolo indicado por el fabricante. Para la clonación mediante el sistema Gateway® (Invitrogen) (método de clonación por recombinación de secuencias homólogas) se introdujeron las secuencias de recombinación attB1/attB2 en el cDNA por PCR utilizando Taq Polimerasa de alta fidelidad (iProof, BioRad). A continuación se clonaron en el vector pDONR207 (Invitrogen) mediante una reacción de recombinación con la enzima BP clonasa II (Invitrogen) según el protocolo indicado por el fabricante. Generados los plásmidos, se introdujeron en la cepa de E. coli DH5α, como se describe en el apartado II.3.2. Tras comprobar las colonias positivas por PCR (apartado II.3.9) y confirmar la secuencia del inserto (apartado II.3.10) se procedía a subclonar el inserto clonado en los vectores binarios pGWB8 (--promotor 35S-R1-CmR-ccdB-R2-6xHis--) y pGWB9 (--promotor 35S-6xHis-R1-CmR-ccdB-R2--) mediante recombinación con la enzima LR clonasa II (Invitrogen). Con estos vectores binarios se transformaba la estirpe C58C1 de A. tumefaciens II. MATERIALES Y MÉTODOS 51 (apartado II.3.2), que se utilizó para la expresión transitoria de proteínas en Nicothiana benthamiana. En otros casos, el cDNA amplificado se clonó en el vector de selección pGEMt (Promega) siguiendo el protocolo indicado por el fabricante. Posteriormente se subclonaron en el vector de expresión pQE30 (Qiagen) para proceder a la inducción de la expresión de la proteína correspondiente en bacterias. II.3.2. Métodos de transformación genética La transformación por choque térmico se realizó mezclando 200 µL de células competentes, previamente descongeladas, con el DNA (<100 ng en un volumen inferior a 10 µL). La mezcla se incubó en hielo durante 15-20 min y se sometió a un choque térmico de 42°C durante 90 s. Finalmente, tras añadirle 800 µL de medio LB, se incubó durante 1 h a 37°C con agitación, sembrándose después en medio LB sólido suplementado con el antibiótico adecuado para selección de colonias positivas. En los casos en los que se pretendía seleccionar transformantes del vector pGEMt por color (Sambrook, 1989), el medio sólido se suplementaba con IPTG 0,8 mM (Sigma) y X-gal 0,1 mM (Sigma). Mediante este método podemos identificar clones portadores de moléculas recombinantes gracias a la inactivación por inserción del gen lacZ. Las colonias con plásmidos recombinantes mostraron color blanco, frente al color azul de las que no lo portaban. La transformación por electroporación se llevó a cabo en cubetas de 2 mm (cell projects) con el programa asistido del equipo Easyject óptimo (EQUIBIO) con un pulso de 2.500 V durante 19,1 ms. De inmediato se añadió LB a las bacterias y se crecieron durante 1 h a 37°C antes de sembrarlas en varias diluciones en placas de medio LB suplementado con el antibiótico adecuado. II.3.3. Aislamiento de plásmidos de E.coli Para la obtención de DNA plasmídico a pequeña escala se utilizó el kit de minipreparación de iNtRON y se siguieron las instrucciones del fabricante. La cantidad y calidad del DNA obtenido mediante este método es óptimo para su posterior uso. II.3.4. Aislamiento de DNA total de tejidos vegetales Para el aislamiento de DNA total, el material vegetal previamente triturado y congelado con ayuda de nitrógeno líquido se mezcló con 500 µL de tampón de extracción [Tris- II. MATERIALES Y MÉTODOS 58 Tabla II.3. Secuencias de oligonucleótidos usados en experimentos de qPCR Se señala el nombre de cada oligonucleótido, indicando el gen que amplifica cada pareja, así como el número de la sonda utilizada. Gen Cebador Secuencia Sonda OsNtrC OsNTRC-QPCR Fw 5´-AGTTGCCAACGACCTTCTTG-3´ #133 OsNTRC-QPCR Rv 5´-CAAGCCCCATCTCGACCATCT-3´ Sus1 OsSUS1 Fw 5´-CGATGAACCACGCTGACTT-3´ #9 OsSUS1 Rv 5´CATACTGACCAACAGTGTCCTTGT-3´ Sus2 OsSUS2 Fw 5´-TCCAAGAAATTGCTGGAAGC-3´ #43 OsSUS2 Rv 5´-AAGGGTGAATGCAATGTGTG-3´ Sus3 OsSUS3 Fw 5´-GACCCGTCTCCACAGCAT-3´ #5 OsSUS3 Rv 5´-CATTCCCTTTCCTTGGTTCA-3´ OsUbi SA941 5´-GGGTTCACAAGTCTGCCTATTT-3´ #93 RUBQIRv 5´-GCAAAACGTTTCAGACACCA-3´ TaNtrC TaNTRC-QPCR Fw 5’-CGAAGGCACAGCAAAAACTT-3’ #9 TaNTRC-QPCR Rv 5’-CTTGCCTCCATTCATGATCC-3’ RNA26S Ta26S-QPCR Fw 5’-TTCACGTGTGAACCGAAGTC-3’ #12 Ta26S-QPCR Rv 5’-AGGCGAGGACTGAAATGAGA-3’ La reacción de qPCR se llevaba a a cabo en un volumen final de 25 µL y contenía 5 µL de cDNA, 0,5 µL de cada cebador (de una solución stock 10 µM), 0,125 µL de sonda “Universal Probe Library”, 12,5 µL de mezcla de reacción (SensiMix™, Bioline) y 1,5 µL de una solución de MgCl 2 50 mM. Las reacciones se realizaron en un termociclador iQ5 de Bio-Rad siguiendo el siguiente programa: CICLOS TEMPERATURA TIEMPO CICLO 1: Paso 1 94 ° C 3 min CICLO 2: (40X) Paso 1 94 ° C 10 s Paso 2 60 ° C 1 min CICLO 3: Paso 1 72 ° C 5 min Las muestras se analizaban por triplicado y la determinación de los niveles de mRNA de cada gen corresponde a la media de tres ensayos de qPCR de tres muestras de cDNA. Para la cuantificación absoluta de los transcritos se utilizó una recta patrón que consistía en diluciones seriadas de cantidades conocidas de DNA molde que contuviera el producto a amplificar. Los valores de Ct obtenidos se relacionaban con los obtenidos en la recta patrón, calculándose de esa forma el número de copias de cada transcrito. La cantidad de transcrito entre distintas II. MATERIALES Y MÉTODOS 59 preparaciones de cDNA se relativizaba frente al número de copias del gen de expresión constitutiva poliubiquitina (OsUbi) en el caso del arroz o del RNA 26S en el caso del trigo. Los resultados se expresan como la razón del número de copias de mRNA del gen en estudio respecto al número de copias de mRNA de OsUbi y respecto al número de copias del RNA 26S en arroz y trigo, respectivamente. II.4.9. Amplificación de los extremos del cDNA (RACE) Para la clonación del cDNA completo de NTRC de endospermo de arroz se utilizó el sistema RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Esta técnica está basada en la amplificación, mediante PCR, de los extremos del mRNA a partir de una secuencia de cDNA conocida. Esta metodología permite amplificar tanto el extremo 5’ como 3’ del cDNA. En particular, en este trabajo se realizó la técnica RLM-RACE (RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends) diseñada para amplificar cDNA exclusivamente de mRNA intactos que conservan la caperuza 5´ (Figura II.3). Figura II.3. Descripción general de la técnica RLM-RACE Adaptado del manual Kit FirstChoice®RLM-RACE (Ambion). En este trabajo la amplificación del cDNA completo de NTRC en endospermo se realizó utilizando el Kit FirstChoice®RLM-RACE (Ambion) siguiendo las instrucciones especificadas por el fabricante. Para tal fin se utilizó al menos 250 ng de RNA Poli(A) + de partida y los cebadores II. MATERIALES Y MÉTODOS 60 especificados en la Tabla II.4. Como control de las reacciones se utilizaba mRNA de tejido fotosintético, donde el cDNA completo de NTRC es conocido. Una vez realizadas las reacciones de amplificación, se realizaba una electroforesis en gel de agarosa para la visualización del amplificado. Posteriormente se purificaba el fragmento de DNA del gel y se clonaba en pGEMt para su posterior secuenciación. Tabla II.4. Secuencias de oligonucleótidos usados en experimentos de RACE Cebador Secuencia 5' RACE Outer Primer* 5' RACE Inner Primer* 5' RACE Rv 5' RACE Rv (2) OsNTRC 5’ Fw 3' RACE Outer Primer* 3' RACE Inner Primer* 5'-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3' 5'-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3' 5'- AAGTTCTCCACTCCCTTGCCA-3' 5'-AACGGTCTGCTCTTCACATT -3' 5'-CATCCTCTCCCTCTCCTCTA -3' 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3' 5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3' 3' RACE Fw 5'-AATGCTCAGGACTGTCTCTGGT -3' *Oligonucleótidos suministrados por el Kit Kit FirstChoice®RLM-RACE (Ambion) II.5. MÉTODOS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS II.5.1. Expresión de proteínas en E. coli Este sistema de sobreexpresión de proteínas en E. coli se utilizó para expresar proteínas recombinantes a partir de construcciones que se habían obtenido con anterioridad en nuestro laboratorio, así como las construcciones realizadas para la expresión de las isoformas 1, 2 y 3 de sacarosa sintasas de arroz (Tabla II.5). Tabla II.5. Construcciones realizadas para la expresión de proteínas en E. coli Se especifica el gen clonado y los oligonucleótidos utilizados. Subrayados se indican los sitios de restricción BamHI (GGATCC) y HindIII (AAGCTT). Gen Cebadores Secuencia Vector/es resultante/s OsSUS1 SUS1 BamHI Fw SUS1 HindIII Rv 5’-GAGGATCCATGGGGGAAGCTGC-3’ 5’-GAAAGCTTTCACTTGTTCGACG-3’ pQE30-Sus1 OsSUS2 SUS2 BamHI Fw SUS2-pt BamHI Fw SUS2 HindIII Rv 5’-GAGGATCCATGGCTGCCAAGCT-3’ 5’-GAGGATCCCTCTTCTCTAGGTA-3’ 5’-CTAAGCTTTTACTTGGATGTGC-3’ pQE30-Sus2, pQE30-Sus2pt OsSUS3 SUS3 BamHI Fw SUS3 HindIII Rv 5’-GAGGATCCATGGGGGAAACTAC-3’ 5’-GAAAGCTTTCATTTGGTGGAGG-3’ pQE30-Sus3 II. MATERIALES Y MÉTODOS 61 Dichas construcciones se realizaron utilizando el vector de expresión pQE30 (Qiagen), que facilita la purificación de las proteínas recombinantes mediante la adición, en el extremo N-terminal, de una cola de seis His codificadas por la secuencia del vector. Mediante este sistema se expresaron las proteínas recombinantes OsNTRC, OsNTRC C380S, OsNTRB y TaTrxhA y se trataron de expresar las proteínas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3. Con los plásmidos se transformaron las estirpes de E. coli XL1-Blue o BL21(DE3), según el caso. Para inducir la síntesis de las proteínas de fusión se cultivaba un preinóculo de E. coli transformado con la construcción correspondiente a 37˚C, con agitación durante toda la noche, en medio LB suplementado con ampicilina y glucosa al 2% (p/v). Con el preinóculo de E. coli XL1-Blue y BL21(DE3) se inoculaba medio LB suplementado con ampicilina con el volumen requerido de dicho preinóculo y se cultivaba a 37˚C con agitación hasta alcanzar una DO 600 ≈0,5. A continuación se le añadía IPTG a una concentración final de 1 mM dejando el cultivo incubando generalmente otras 3 h a 37˚C con agitación (el tiempo y la temperatura variaba según la proteína que se pretendía expresar). Tras este periodo las células se precipitaban por centrifugación (2.000 xg, 10 min, 4˚C) y se almacenaban a -20˚C hasta su utilización. II.5.2. Obtención de extractos de E. coli La obtención de extractos crudos de E. coli se llevó a cabo mediante dos métodos. En el primero de ellos, para pequeños volúmenes (6 mL del cultivo), se rompían las células con perlas de vidrio (425-600 μm de diámetro) en 200 µL de un tampón de extracción que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,9, EDTA 1 mM y PMSF 1 mM, agitando en un vórtex (4 ciclos de 30 s, y dejando 30 s en hielo entre cada pulso). A continuación, se centrifugaba el extracto crudo (15.000 xg, 20 min, 4˚C) para separar el sobrenadante del precipitado de membranas y poder analizarlos de manera independiente. Los extractos se guardaron a -20˚C. Este método se utilizó para las pruebas de expresión de las proteínas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3. La rotura de volúmenes mayores (500-1000 mL de cultivo) se realizó por presión utilizando la prensa de French. Este método se llevó a cabo para la purificación de las proteínas OsNTRC, OsNTRC C380S, OsNTRB y TaTrxhA siguiendo el siguiente protocolo. Las células se resuspendían en tampón de extracción (5 mL/g de peso fresco) que contenía tampón fosfato 20 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, glicerol al 10% (v/v) y PMSF 1 mM. A continuación las células se pasaron 3 veces por la prensa de French sometiéndolas a 6.000 psi. Posteriormente, las células se centrifugaron (15.000 xg, 20 min, 4°C) para separar la fracción soluble de la membranosa, guardándose a -20°C hasta el momento de la purificación. II. MATERIALES Y MÉTODOS 62 II.5.3. Expresión transitoria de proteínas en hojas de Nicotiana benthamiana El sistema de sobreexpresión de proteínas en N. benthamiana se utilizó para expresar proteínas recombinantes a partir de construcciones realizadas para la expresión de las isoformas 1, 2 y 3 de sacarosa sintasa de arroz (Tabla II.6). Tabla II.6. Construcciones realizadas para la expresión de proteínas en N. benthamiana Se especifica el gen clonado y los oligonucleótidos utilizados. Gen Cebadores Secuencia Vector/es resultante/s OsSUS1 attB1 SUS1 attB2 SUS1 5’-attB1-CAATGGGGGAAGCTGCCGGCGAC-3’ 5’-attB2-ACTTGT CGACGGCTCGCCCTCG-3’ pGWB8-Sus1 pGWB9-Sus1 OsSUS2 attB1 SUS2 attB1 SUS2-pt attB2 SUS2 5’-attB1-CAATGGCTGCCAAGCTAGCTCGC-3’ 5’-attB1-CAATGCTCTTCTCTAGGTATGTT-3’ 5’-attB2-ACTTGGATGTGCTCTCTCCATC-3’ pGWB8-Sus2 pGWB9-Sus2 pGWB8-Sus2pt pGWB9-Sus2pt pOsSUS3 attB1 SUS3 attB2 SUS3 5’-attB1-CAATGGGGGAAACTACTGGAGAA-3’ 5’-attB2-ATTTGGTGGAGGCCTCTCCCTCA-3’ pGWB8-Sus3 pGWB9-Sus3 El procedimiento para la expresión transitoria de proteínas en hojas de N. benthamiana se realizó de acuerdo a la metodología ya descrita por He y colaboradores (He et al., 2004). El cultivo de Agrobacterium con el correspondiente gen de interés se cultivó en medio LB suplementado con kanamicina y rifampicina durante toda la noche a 30°C. Al día siguiente las células se recolectaron por centrifugación (5 min, 2.500 xg) y se lavaron dos veces con medio de inducción [MES 50 mM pH 5,6, glucosa 27 mM, NaH 2 PO 4 2mM, acetosiringona 0,2 mM y AB salts (NaH 4 Cl 16 mM, MgSO 4 7H 2 O 1,25 mM, KCl 2 mM, CaCl 2 0,05 mM, FeSO 4 7H 2 O 7,5 nM) al 5% (v/v)]. Tras la incubación durante 2 h a temperatura ambiente los cultivos se centrifugaron (5 min, 2.500 xg) y se resuspendieron en tampón MES 10 mM suplementado con 0,2 mM de acetosiringona dejándolos a una DO 600 ≈0,2. La infiltración en hojas de N. benthamiana se realizó mediante la realización de una pequeña incisión a través de la cual fueron inyectadas simultáneamente la cepa de Agrobacterium, que portaba la construcción para la expresión de la proteína de arroz, junto con la cepa de Agrobacterium que contenía el vector P19, que impide el silenciamiento de la expresión de la proteína recombinante por parte de la planta. Las hojas se recolectaron entre 3 y 6 días después de la infección dependiendo de la proteína expresada, se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta el momento de su utilización. II. MATERIALES Y MÉTODOS 63 La extracción de proteínas de este material, triturado en mortero en nitrógeno líquido, se realizó con un tampón de extracción compuesto por HEPES/KOH 50 mM pH 7,0, sacarosa 150 mM, KCl 150 mM, DTT 5 mM, glicerol al 10% (v/v), PMSF 1 mM y una mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma) al 5% (v/v). Tras mezclar bien con ayuda de un vórtex, el extracto se filtró a través de 3 capas de Miracloth (Calbiochem) previamente humedecido en tampón de extracción y se centrifugó a 16.000 xg durante 15 min a 4°C. El sobrenadante se mantenía en frío hasta el momento de su purificación. II.5.4. Purificación de proteínas recombinantes El método de purificación consistió en una cromatografía de afinidad por níquel. Se utilizaron dos metodologías diferentes según el caso: • Purificación con columnas HiTrap (Pharmacia Biosciences) cargadas con Ni 2+ en el sistema ÄKTAprime (Amersham) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. En este caso el tampón utilizado fue fosfato sódico 20 mM pH 7,4 suplementado con NaCl 0,5 M, imidazol 40 mM y glicerol al 10% (v/v). La elución de la proteína se realizaba mediante un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón fosfato. • Purificación en batch/gravidity-flow usando la resina Ni-NTA Agarose (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En este caso se utilizó un tampón compuesto por HEPES/KOH 50 mM pH 7,0, sacarosa 150 mM, KCl 150 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (v/v) y tritón X-100 al 0,1% (v/v). La elución de las proteínas se realizaba con el tampón de purificación suplementado con 200 mM de Imidazol. II.6. PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS II.6.1. Extractos totales de proteína Para la obtención de los distintos extractos crudos, aproximadamente 0,5 g del material vegetal, previamente triturado y congelado, se homogeneizaba a 4˚C con tampón de extracción [Tris-HCl 50 mM pH 7,9, MgCl 2 10 mM, EDTA 1 mM, glicerol 10% (v/v), una mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma) al 5% (v/v)]. Para condiciones reductoras el tampón se suplementaba con 2-Mercaptoetanol 14 mM y DTT 10 mM. Tras centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4˚C, se recuperaba el sobrenadante, que contenía la fracción de proteínas solubles. La extracción de proteínas del material vegetal para la realización de ensayos de actividad SUS se realizó según el protocolo descrito en Marino et al., 2008 con alguna modificación. El tejido triturado y congelado se homogeneizaba a 4°C con ácido 3-(n-morfolín) II. MATERIALES Y MÉTODOS 64 propanosulfónico (MOPS) 50 mM pH 7,0, polivinil pirrolidona (PVP) al 3% (p/v), DTT 10 mM, β- Mercaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, KCl 20 mM y MgCl 2 5 mM, y se centrifugaba a 20.000 xg durante 30 min a 4°C. II.6.2. Cuantificación de extractos proteicos Los extractos de proteínas se cuantificaron por el método de Bradford con el reactivo comercial (BioRad) según las indicaciones del fabricante. II.6.3. Precipitación de proteínas La precipitación de proteínas se realizaba cuando se requería una preparación de mayor concentración. Este tipo de precipitación se realizaba con ácido tricloroacético (TCA) según el siguiente protocolo: se añadía a la muestra TCA a una concentración final de 5% (v/v) y se dejaba 30 min en hielo. Tras centrifugar durante 20 min a 16.000 xg a 4°C, se lavaba el pellet dos veces con 200 µL de acetona fría al 100% centrifugando cada vez 20 min a 16.000 xg a 4°C. El pellet resultante se dejaba secar y se resuspendía en el tampón adecuado para su uso posterior. Si se requería una precipitación fraccionada de las proteínas, por ejemplo en el caso de las inmunoglobulinas, o el enriquecimiento de una proteína en la preparación, se realizaba una precipitación con sulfato de amonio. Este método se llevaba a cabo mediante la adición a la muestra de la cantidad de sulfato de amonio sólido necesaria para conseguir la concentración final deseada. Una vez disuelto el sulfato de amonio por agitación, se centrifugaba durante 15 min a 20.000 xg a 4°C. El pellet resultante se resuspendía en PBS y se guardaba a -20°C hasta su uso. II.6.4. Cromatografía en columnas II.6.4.1. Filtración en gel Este tipo de cromatografía se utilizó para la diálisis de proteínas y el intercambio de tampones. Se utilizaron dos tipos de columnas según se requería: A. Columnas HiTrap™ Desalting (Amersham). Este método requería la utilización del sistema ÄKTAprime (Amersham) y se realizaba siguiendo el programa predefinido por el fabricante. B. Columnas Zeba Desalting (Thermo scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. II. MATERIALES Y MÉTODOS 65 II.6.4.2. Cromatografía de afinidad En este trabajo se utilizó la cromatografía de afinidad como herramienta para la detección de proteínas dianas de NTRC en endospermo. Este método se llevó a cabo en el sistema ÄKTAprime (Amersham) utilizando columnas HiTrap™ Chelating (Amersham) a las cuales se les unía, hasta la saturación, la proteína recombinante con 6 histidinas OsNTRC mutada en la cisteína 380 del sitio activo del módulo Trx (generada anteriormente en nuestro laboratorio (Perez-Ruiz et al., 2006)). Esta mutación en la proteína permite el establecimiento de un puente disulfuro con una cisteína oxidada de la proteína diana, pero es incapaz de resolver esta unión para regresar a su forma oxidada. De este modo, las proteínas diana de NTRC quedan covalentemente unidas a ella. La metodología seguida se detalla a continuación. El primer paso consistía en cargar la columna con Ni 2+ a partir de una solución de sulfato de níquel 100 mM con ayuda de una jeringa. Tras lavar la columna, se procedía a su saturación con una preparación de unos 8 mg de la proteína OsNTRC(C380S) previamente purificada (según apartado II.5.4) y dializada (según apartado II.6.4.1.A). Este paso se realizaba recirculando la proteína durante 2 h por la columna con ayuda de una bomba peristáltica a 4°C. A continuación, tras lavar la columna, se dejaba recircular durante toda la noche a 4°C un extracto de 6-8 mg de proteínas de endospermo (según apartado II.6.1 sin la presencia de agentes reductores en el tampón de extracción), de arroz o de trigo según el caso, previamente dializado (según apartado II.6.4.1.B) y eluido en tampón A. Finalizado este paso se procedía al montaje de la columna en el sistema ÄKTAprime y se seleccionaba un programa específicamente diseñado para este experimento. El programa comenzaba con un lavado y equilibrado de la columna con tampón fosfato sódico 20 mM, seguido de tres pasos sucesivos de elución de proteínas, cada uno de ellos realizado con un tampón de elución con diferentes propiedades: 1. Elución por intercambio iónico mediante un gradiente de 0 a 1 M de NaCl. 2. Elución por reducción con 150 mM β-Mercaptoetanol o con 10 mM TCEP. 3. Elución con imidazol mediante un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol. II. MATERIALES Y MÉTODOS 66 II.6.5. Electroforesis de proteínas II.6.5.1. SDS-PAGE La separación analítica de las proteínas se realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), según el sistema discontinuo (Laemmli, 1970). El gel de separación se preparó en diferentes porcentajes de acrilamida (acrilamida:bis-acrilamida 29:1) con SDS al 0,1% (p/v) en tampón Tris-HCl 0,375 M pH 8,8. El gel de empaquetamiento, al 4% de acrilamida, contenía los mismos componentes excepto el tampón que era Tris-HCl 0,125 M pH 6,8. Los geles se polimerizaron con APS al 0,5 % (p/v) usando TEMED 6,6 mM como agente catalizador. Antes de cargar, las muestras se suplementaron con tampón de carga (4x, 1/4 del volumen total de la muestra) compuesto por Tris-HCl 62 mM pH 6,8, glicerol 10% (v/v), SDS 2% (p/v), azul de bromofenol 0,05% (p/v) en presencia o no de β-Mercaptoetanol 5% (v/v). En general, las muestras se trataron a 95˚C durante 5 min. Se utilizaron geles de dos tamaños diferentes. Los geles de 8x6 cm y 1,0 mm o 1,5 mm de grosor (geles pequeños) se dispusieron para la electroforesis en una cubeta Mini-Protean R II-2D Cell (Bio-Rad), a voltaje constante (90-150 V, 1,5-3 h) a temperatura ambiente. Con geles de 16x18 cm (geles medianos) se utilizaron separadores de 1,0 mm o de 1,5 mm de grosor según el caso, disponiéndose en una cubeta SE 600 Ruby (GE Healthcare), con voltaje constante (70 V durante la noche ó 200 V, 5-6 h). Como tampón de electroforesis se utilizó, en ambos casos, una disolución que contenía Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 0,19 M y SDS 0,1% (p/v). II.6.5.2. Electroforesis bidimensional Para realizar el isoelectroenfoque, las muestras se dispusieron en tampón de rehidratación (Bio-Rad). Si las muestras consistían en extractos totales de proteína, se procedió a precipitar con ácido tricloroacético (TCA) según apartado II.6.3. Se emplearon, en función del pI de cada proteína, tiras de Bio-Rad de 11 cm IPG del rango de pH adecuado para cada caso. Las tiras se rehidrataron de forma pasiva con 200 µL de tampón de rehidratación durante 12 h a 20°C. El isoelectroenfoque se realizó en el equipo Protean IEF Cell (Bio-Rad), según las indicaciones del fabricante. Para la segunda dimensión, las tiras se dispusieron en tampón de equilibrado [Tris-HCl 375 mM pH 8,8, Urea 6 M, SDS 2% (p/v)] suplementado con DTT 2% (p/v) durante 10 min. Posteriormente se eliminó el DTT en exceso lavando con tampón de equilibrado suplementado II. MATERIALES Y MÉTODOS 67 con iodoacetamida 135 mM durante 10 min. La segunda dimensión se realizó en gel de glicina de 16x18 cm como se describe en el apartado II.6.5.1, cubriendo la tira con agarosa 0,7%. II.6.5.3. Marcadores de masa molecular para las electroforesis de proteínas Los marcadores de masa molecular lo constituían diferentes proteínas preteñidas según los suministradores: • Broad range prestained standard (Bio-Rad): miosina (210 kDa), β-galactosidasa (117 kDa), seroalbúmina bovina (98 kDa), ovoalbúmina (55 kDa), anhidrasa carbónica (37,5 kDa), inhibidor de tripsina (29 kDa), lisozima (20 kDa) y aprotinina (7 kDa). • AccuRuler RGB PLUS Prestained Protein Ladder (Maestrogen). II.6.6. Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida Las proteínas se visualizaron rutinariamente mediante tinción con azul de Coomassie. Los geles se incubaron 30 min en agitación con solución de tinción de Coomassie [etanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v) y azul Coomassie R-250 0,01% (p/v)]. Posteriormente se desteñían [etanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v)] en agitación. En determinados casos, en los cuales se requería mayor sensibilidad o resolución se emplearon otros protocolos de tinción: • Biosafe™ Coomassie (BioRad) según las indicaciones del fabricante. • Tinción con Coomassie Coloidal (G-250). Esta tinción presenta algunas diferencias respecto a la tinción rutinaria con Coomassie R-250. Las proteínas en los geles se fijaban durante toda la noche con una solución compuesta por metanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v). Posteriormente se incubaban los geles durante 24 h, en agitación con una solución resultante de la mezcla de una solución A [ácido ortofosfórico 2% (p/v), sulfato de amonio 10% (p/v)] y de una solución B [azul de Coomassie G-250 5% (p/v)], a la que se añadía previamente ¼ de volumen de metanol. El desteñido se realizaba mediante lavados sucesivos con agua Mili-Q, hasta que las proteínas eran visibles. II.6.7. Espectrofotometría de masas e identificación de proteínas Una vez teñidas las proteínas, se procedía a la captación y extracción automática de las bandas de interés, con la ayuda del picador automático EXQuest Spot cutter (BioRad). Posteriormente, y de forma automatizada, las proteínas se sometían a un proceso de digestión tríptica en una estación robotizada de Bruker para la digestión de proteínas en gel y el II. MATERIALES Y MÉTODOS 74 III. RESULTADOS III. RESULTADOS 76 III. RESULTADOS 77 III.1. ESTUDIO DE NTRC EN ENDOSPERMO DE SEMILLAS DE CEREALES Aunque inicialmente se consideró que NTRC era exclusiva de cloroplastos, trabajos realizados por nuestro grupo han puesto de manifiesto su expresión tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y la localización de la proteína en cualquier tipo de plástido en Arabidopsis (Kirchsteiger et al., 2012). Estos resultados abren la posibilidad de que NTRC pudiese estar presente en plastos de tejidos de almacenamiento de almidón como son los amiloplastos de endospermo de semillas de cereales donde pudiera llevar a cabo funciones relacionadas con la regulación redox del metabolismo del carbono y en particular de la biosíntesis de almidón. En este trabajo hemos estudiado la presencia de NTRC en endospermo de semillas de cereales, así como su patrón de expresión, su posible localización y el papel que estaría desempeñando en este importante tejido de reserva. III.1.1. Patrón de expresión de NTRC en endospermo Las secuencias genómicas de organismos fotosintéticos que se han hecho públicas desde la identificación de NTRC en 2004 (Serrato et al., 2004) confirman la presencia de esta enzima en plantas, algas y algunas cianobacterias. A pesar de que NTRC fue inicialmente descubierta como consecuencia del análisis de la familia génica de los genes NTR de arroz, la mayor parte de los trabajos de expresión y caracterización de NTRC se han llevado a cabo en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Uno de los objetivos de este trabajo ha sido el de completar nuestro conocimiento de la expresión y la posible función de NTRC en otro tipo de plantas y, más concretamente, en tejidos como el endospermo de semillas de cereales, de gran importancia agronómica. Como paso previo hemos realizado un estudio filogenético de las secuencias de NTRC disponibles. La comparación de secuencias de NTRC de diferentes organismos muestra entre ellas una identidad entre el 70% y el 90%, compartiendo una similitud superior al 60% con algas y cianobacterias como Chlamydomonas reinhardtii y Anabaena variabilis (Figura III.1.1). El análisis filogenético muestra que las NTRCs de plantas conforman un grupo bien diferenciado con respecto a las de otros organismos fotosintéticos. Dentro de este grupo se observa que los cereales, como plantas monocotiledóneas, conforman a su vez un subgrupo diferenciado del de dicotiledóneas (Figura III.1.2). III. RESULTADOS 78 III. RESULTADOS 79 Figura III.1.1. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de NTRC de diferentes organismos El alineamiento de las secuencias aminoacídicas se realizó mediante CLUSTALW utilizando el programa BioEdit. Los números de acceso son los siguientes: Brachypodium distachyon, XP_003562531.1; Hordeum vulgare, BAJ89765.1; Oryza sativa, Q70G58.2; Zea mays, NP_001136660.1; Vitis vinífera, XP_002278551.1; Ricinus communis, XP_002529513.1; Medicago truncatula, ABH10139.1; Arabidopsis thaliana, NP_565954.1; Anabaena variabilis, YP_325129.1; Chlamydomonas reinhardtii, XP_001689807.1. Las cisteínas conservadas se han resaltado en amarillo y se señalan con un triángulo azul las pertenecientes a los sitios activos, a su vez marcados con un recuadro azul. Figura III.1.2. Árbol filogenético de NTRC de diferentes organismos El árbol filogenético se construyó a partir de secuencias de aminoácidos completas mediante CLUSTALW utilizando el programa TreeView. Los números de acceso son los siguientes: Brachypodium distachyon, XP_003562531.1; Hordeum vulgare, BAJ89765.1; Oryza sativa, Q70G58.2; Zea mays, NP_001136660.1; Vitis vinífera, XP_002278551.1; Ricinus communis, XP_002529513.1; Medicago truncatula, ABH10139.1; Arabidopsis thaliana, NP_565954.1; Anabaena variabilis, YP_325129.1; Chlamydomonas reinhardtii, XP_001689807.1. En rojo se resalta la rama que agrupa las NTRC de cereales. III.1.1.1. Patrón de expresión de NTRC en arroz (Oryza sativa) La disponibilidad de la secuencia genómica completa del arroz permitió establecer que NTRC está codificada en esta planta por un gen de copia única (Os07g0657900) y facilitó el diseño de oligonucleótidos para el análisis de su expresión en semillas. A partir de la secuencia completa del cDNA que codifica NTRC descrita en tejidos fotosintéticos y utilizando el programa “Probe Finder Software” se eligieron los cebadores y la sonda específicos para la cuantificación de la expresión del mRNA mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) (Figura III.1.3). Del mismo modo, se escogieron los cebadores y la sonda específica para el gen codificante de la poliubiquitina de arroz (OsUbi) de expresión constitutiva, que se utilizó como control endógeno de la expresión. III. RESULTADOS 80 Figura III.1.3. Secuencia de cDNA del gen NtrC de arroz y su traducción a proteína Secuencia completa del cDNA de NTRC de arroz (número de acceso GenBank AJ582621.1) y su traducción a proteína, resaltando en verde los residuos correspondientes al posible péptido de tránsito al cloroplasto, en rojo los residuos pertenecientes al módulo NTR de la proteína y en amarillo los correspondientes al módulo Trx. Las cisteínas de los sitios activos de cada módulo aparecen marcadas con un asterisco azul. Los oligonucleótidos OsNTRC-QPCR Fw y OsNTRC-QPCR Rv se utilizaron para la cuantificación de transcritos del gen mediante qPCR. El sitio de unión de la sonda aparece subrayado en gris. El triángulo negro indica la localización de una secuencia intrónica en el DNA genómico. III. RESULTADOS 81 El estudio de la expresión del gen NtrC en semillas de arroz se realizó a partir de muestras de RNA total procedentes de semillas en las diferentes fases del desarrollo definidas previamente (Materiales y métodos). En la Figura III.1.4 se representan los niveles de mRNA del gen NtrC normalizados respecto a los niveles de transcrito del gen de la poliubiquitina. Además se analizó el contenido de la proteína NTRC mediante Western blot (Figura III.1.4 B). Los resultados obtenidos muestran la expresión del gen OsNtrC en endospermo en niveles similares, siempre inferiores a los obtenidos en hoja, durante todo el desarrollo de la semilla. Figura III.1.4. Expresión de OsNTRC durante el desarrollo de semillas de arroz (A) Se determinaron mediante qPCR los niveles de mRNA del gen OsNtrC en semillas de arroz en cada uno de los estadíos de desarrollo establecidos (End1 a End4) y de hojas de planta adulta. En cada caso se utilizaron 50 ng del cDNA sintetizado a partir del RNA total aislado en las diferentes muestras. Los resultados se muetran en relación a los niveles de mRNA de la poliubiquitina (OsUbi) en cada muestra. (B) Análisis de la presencia de NTRC en las diferentes muestras mediante Western blot con un anticuerpo anti-NTRC. Se utilizaron extractos totales de proteínas de endospermo de semillas de arroz en cada estadío de desarrollo (50 μg de proteína) y de hoja (30 μg de proteína) en condiciones reductoras (tampones de extracción y de carga suplementados con βME 14 mM y DTT 10 mM). Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. A B III. RESULTADOS 82 El análisis Western blot mostró la presencia de NTRC en este tejido, si bien la proteína reconocida tenía una movilidad electroforética notablemente inferior a la de hoja. Frente a los 52 kDa que presenta NTRC en tejidos fotosintéticos, de acuerdo con el tamaño de la proteína resultante del cDNA identificado en arroz para NTRC, la proteína identificada en endospermo tenía un tamaño aproximado de 90 kDa. Dado que NTRC está codificada en arroz por un gen de copia única, una posibilidad para explicar el mayor tamaño de la proteína identificada en endospermo es que se produzca por un fenómeno de splicing alternativo no descrito hasta el momento. III.1.1.2. Expresión de NTRC en trigo (Triticum aestivum) Como un paso previo al estudio de la expresión de NTRC en semillas de trigo, fue necesario establecer la secuencia del gen ya que no se encontraba disponible en la base de datos cuandose llevó a cabo este análisis. Para ello se realizó una búsqueda de secuencias expresadas o ESTs (acrónimo del inglés expressed sequence tags) de trigo disponibles en la base de datos GenBank utilizando para la búsqueda el cDNA de NTRC de arroz. De las diferentes ESTs encontradas se utilizaron tres secuencias solapantes para la obtención de la secuencia de cDNA para NTRC cuyos número de acceso en GenBank son CA655448.1, CJ708772.1 y CJ560167.1. La secuencia resultante estaba incompleta, careciendo de la región 5’ UTR y del codón de inicio de la traducción (ATG). La comparación con otras secuencias disponibles en las bases de datos mostró que la NTRC de trigo comparte una alta identidad (95%) con la de cebada (Figura III.1.5). La búsqueda de secuencias de la región 5’ del cDNA utilizando las de cebada resultó en la identificación de una EST (número de acceso GenBank DR738974.1) peculiar, que comparte una alta identidad en la región 5’ con el cDNA de cebada pero difiere en la región central (Figura III.1.6). Estos hechos indican la existencia de diferentes transcritos a partir de una misma secuencia génica como producto bien de orígenes de la transcripción diferentes o de maduraciones alternativas del mRNA. Figura III.1.5. Secuencia parcial del cDNA que codifica NTRC de trigo Alineamiento de la posible secuencia de cDNA de NTRC de trigo (TaNTRC) con la secuencia completa del cDNA de NTRC de cebada (HvNTRC) (número de acceso GenBank AK358552.1). La secuencia parcial TaNtrC se construyó a partir del alineamiento de las ESTs disponibles en la base de datos GenBank con los números de acceso: CA655448.1 (azul), CJ708772.1 (rojo) y CJ560167.1 (verde). El alineamiento de las secuencias se realizó mediante CLUSTALW utilizando el programa BioEdit. En amarillo se señala el codón de inicio de la traducción. III. RESULTADOS 83 III. RESULTADOS 90 Mediante análisis Western blot de extractos crudos de semillas de arroz en germinación se pudo comprobar que la presencia de la proteína inmunoreactiva de mayor tamaño no es exclusiva de endospermo en desarrollo (Figura III.1.11). El estudio de los diferentes tejidos diseccionados de semillas germinadas permitió detectar a la proteína de mayor peso molecular en cotiledón y raíz, si bien en estos tejidos también se detectó la NTRC de 52 kDa. Figura III.1.11. Expresión de NTRC en semillas germinadas de arroz Se comprobó la presencia de NTRC en semillas de arroz en desarrollo mediante análisis Western blot utilizando un anticuerpo anti-NTRC de tejidos diseccionados de semillas de arroz germinadas. Se cargaron muestras de 40 µg de proteínas de extractos proteicos totales en condiciones reductoras (tampones de extracción y de carga suplementados con βME 14 mM y DTT 10 mM) de cotiledón, raíz y endospermo de semillas de arroz germinadas durante 5 días. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. Otra evidencia a favor de que la proteína de mayor peso molecular reconocida en endospermo de semillas de arroz era realmente una NTRC se obtuvo a partir de la identificación mediante MALDI-TOF de una muestra resultante de un experimento de cromatografía de afinidad (método descrito en Materiales y Métodos). Como NTRC es una proteína capaz de interaccionar consigo misma para la formación de un dímero catalíticamente activo (Perez-Ruiz and Cejudo, 2009), mediante cromatografía de afinidad con un mutante monocisteínico de la enzima se espera encontrar a la propia NTRC entre las proteínas capaces de interaccionar consigo misma. De este modo, utilizando un extracto de endospermo de arroz para la realización de la cromatografía de afinidad se podría encontrar la posible NTRC de endospermo entre las proteínas interactoras. Una de las fracciones resultantes de la elución con un agente reductor se separó mediante SDS-PAGE bidimensional. Las diferentes proteínas del tamaño esperado para la NTRC de endospermo separadas en el gel fueron analizadas mediante MALDI-TOF, identificando dos de ellas como NTRC (Figura III.1.12). III. RESULTADOS 91 Figura III.1.12. SDS-PAGE bidimensional de la cromatografía de afinidad para la identificación de NTRC de endospermo de semillas de arroz Una alícuota de 150 μL de las proteínas eluidas con reductores en la cromatografía de afinidad para la identificación de NTRC de endospermo de semillas de arroz se precipitó y se separó mediante SDS-PAGE bidimensional utilizando una tira de rango de pH de 5 a 8 no lineal (pH 5-8 NL) y gel de acrilamida al 10%. El resultado se visualizó mediante tinción del gel con azul de Coomassie. En rojo se señalan las proteínas identificadas como NTRC mediante MALDITOF. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. Paralelamente a los estudios proteómicos realizados se llevaron a cabo estudios a nivel de mensajeros con el objetivo de identificar y secuenciar el mRNA codificante para esta NTRC peculiar. En primer lugar se comprobó, mediante secuenciación del cDNA amplificado a partir de muestras de RNA total de endospermo de semillas de arroz, si el mRNA que codifica para la proteína en endospermo y hoja era el mismo o presentaba modificaciones en su secuencia. Para ello se utilizaron parejas de cebadores localizados en los extremos y región central de la secuencia conocida del cDNA de NTRC de arroz (Figura III.1.13). En endospermo solo se obtuvo amplificado utilizando la pareja de cebadores de la región central de cDNA. Se pudo comprobar que la secuencia del cDNA de NTRC de endospermo en la región amplificada es idéntica a la identificada en tejidos fotosintéticos (Figura III.1.13). Este resultado indicaba que las NTRC de endospermo y cloroplasto estarían codificadas por el mismo gen, sin embargo la ausencia de resultados en el extremo 5’ sugieren la presencia de dos poblaciones diferentes de mRNA con diferente origen de la transcripción o con una maduración diferencial. III. RESULTADOS 92 Figura III.1.13. Secuencia del fragmento del cDNA de NTRC amplificado en endospermo de semillas de arroz Alineamiento de la secuencia del fragmento de cDNA de NTRC amplificado a partir de RNA de endospermo de semillas de arroz (cDNA endosp) con la secuencia completa del cDNA (número de acceso GenBank AJ582621.1). El alineamiento de las secuencias se realizó mediante CLUSTALW utilizando el programa BioEdit. Los oligonucleótidos OsNTRC 5’ Fw y OsNTRC-sp Fw se utilizaron junto con OsNTRC 3’ Rv. III. RESULTADOS 93 La posibilidad de la existencia de dos transcritos diferentes en hoja y en endospermo para NTRC se estudió mediante análisis Northern blot. Para la identificación de los mRNAs se diseñaron, a partir de la secuencia conocida del cDNA de NTRC de hoja, dos sondas específicas: una en la región codificante del módulo NTR y otra en el módulo Trx. Se realizaron ensayos Northern blot a partir de extractos totales de RNA de endospermo de semillas de arroz y de hoja adulta. Se pudo observar que el marcaje en hoja y en endospermo muestra una movilidad electroforética distinta (Figura III.1.14) confirmando la existencia de dos poblaciones de mRNA para NTRC según el tejido. Los resultados obtenidos concuerdan además con la información procedente de los estudios de la proteína, ya que el transcrito de mayor tamaño se detectó en muestras de endospermo lo que justificaría el mayor tamaño de la proteína en este tejido. Se obtuvo el mismo resultado con ambas sondas diseñadas, confirmando la existencia de los módulos NTR y Trx en la NTRC de endospermo. Figura III.1.14. Comparación de los transcritos de NTRC en endospermo y hoja de arroz Análisis Northern blot de los mRNAs de NTRC en endospermo y hoja de arroz, utilizando sondas específicas para la región codificante del módulo NTR (MNTR) (A) y del módulo Trx (MTRX) (B) del cDNA que codifica NTRC de arroz (número de acceso GenBank AJ582621.1). Se cargó en cada caso 10 µg de RNA total. Con flechas en rojo se resalta la diferente movilidad electroforética de los transcritos marcados. Los resultados de secuenciación y Northern blot sugerían una posible maduración diferencial en endospermo generando un transcrito mayor que el presente en hojas. Con estas premisas, se iniciaron estudios de clonación de los extremos del cDNA codificante de NTRC en endospermo mediante RLM-RACE (RNA Ligase Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends) con el objetivo de conocer su secuencia completa. Para ello se diseñaron cebadores específicos en los extremos 5’ y 3’ de la secuencia conocida del cDNA de NTRC (Figura III.1.15) que, junto con los cebadores específicos de los adaptadores unidos al transcrito (Materiales y Métodos), permitirían la amplificación por PCR de los extremos del cDNA y su posterior secuenciación. Los experimentos de RLM-RACE se llevaron a cabo a partir de muestras de mRNA purificado de endospermo de semillas de arroz y, como control del experimento, de hoja de planta adulta. A B III. RESULTADOS 94 Figura III.1.15. Localización de los cebadores para la clonación de los extremos del cDNA mediante RACE A partir de la secuencia completa del cDNA que codifica NTRC (número de acceso GenBank AJ582621.1) se diseñaron en los extremos 5’ (A) y 3’ (B) del mismo, oligonucleótidos para la clonación de los extremos del cDNA mediante RLM-RACE. En amarillo y en rojo se resaltan los codones de inicio y final de la transcripción, respectivamente. En los ensayos de RLM-RACE del extremo 5’ en hoja y endospermo, se incluyeron además controles del proceso consistentes en la utilización de un cDNA sintetizado a partir de una muestra de mRNA sin el tratamiento con TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase), donde no se produciría amplificado al no poder unirse el adaptador. En los diferentes ensayos de PCR realizados para la clonación del extremo 5’ del cDNA que codifica NTRC (Figura III.1.16 A y B) no se consiguió un amplificado concreto para su aislamiento, obteniendo el mismo resultado tanto en las muestras tratadas como sin tratar con TAP. En el extremo 3’ por el contrario sí se consiguieron tanto en hoja como en endospermo amplificados definidos cuya movilidad electroforética era similar en ambas muestras (Figura III.1.16 C), lo que sugería un mismo procesamiento del mRNA en este extremo. Para conocer la secuencia nucleotídica del extremo 3’ clonado se aislaron ambos amplificados y se secuenciaron. A B III. RESULTADOS 95 Figura III.1.16. Amplificación de los extremos 5’ y 3’ del cDNA para NTRC mediante RLM-RACE A partir de muestras de mRNA aisladas de hoja y endospermo (250 ng de RNA Poli(A) + en cada caso) se sintetizó mediante RT-PCR el cDNA que se utlizó como molde para los experimentos de RLM-RACE de los extremos 5’ (A y B) y 3’ (C) de hoja y endospermo de arroz. Los experimentos de RLM-RACE del extremo 5’ en hoja (A) y en endospermo (B) se realizaron sobre muestras de cDNAs sintetizados a partir de mRNA con (TAP) o sin (-TAP) tratamiento previo con TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase). La secuenciación de los cDNAs clonados de hoja y endospermo de arroz (Figura III.1.17) mostró que en ambos casos el extremo 3’ del cDNA codificante de NTRC posee una composición nucleotídica idéntica, exceptuando cuatro nucleótidos localizados justo antes de la cola poliA terminal del mRNA que están ausentes en el cDNA de hoja. Estas secuencias son idénticas además a la secuencia conocida del mRNA de NTRC con número de acceso GenBank AJ582621.1, cuyo codón de parada de la traducción se mantiene conservado en ambos cDNAs clonados. Figura III.1.17. Extremo 3’ de los cDNAs de NTRC sintetizados a partir de mensajeros de endospermo y hoja de arroz Alineamiento de las secuencias del extremo 3’ de cDNA de NTRC obtenidas mediante RLM-RACE de muestras de endospermo (RACE-3.End) y hoja (RACE-3.Hoja) de arroz con la secuencia completa del cDNA (número de acceso AJ582621.1). La amplificación del extremo 3’ del cDNA se realizó con los cebadores 3’RACE Fw y 3’RACE Outer prime (suministrado en el RLM-RACE kit). En rojo se resalta el codón de finalización de la traducción y en naranja la secuencia del adaptador del extremo 3’ (suministrado en el RLM-RACE kit). A B C III. RESULTADOS 96 En conjunto estos estudios ponen de manifiesto la presencia de una proteína inmunoreactiva con anticuerpos que detectan a NTRC en endospermo de semillas de arroz y que se identifica como NTRC mediante MALDI-TOF. Sin ambargo, la movilidad electroforética de esta proteína tiene un peso molecular superior al esperado para NTRC, que es el de la enzima detectada en tejidos fotosintéticos. Los diferentes intentos de aislar secuencias del mensajero de esta posible nueva forma de NTRC, tanto en la región central como en la región 3’ del gen, confirman que los mensajeros de hoja y endospermo son idéticos en estas regiones. Los análisis de RT-PCR indican que la región 5’ difiere, sin ambargo, no hemos podido aislar esta región 5’ del cDNA que codificaría la proteína de mayor tamaño. III.1.3. Localización de NTRC en endospermo de semillas de cereales Para obtener más información sobre la localización de NTRC en semillas de cereales realizamos análisis inmunocitoquímicos sobre cortes histológicos de semillas de trigo en desarrollo. La elección de este cereal para la realización de los ensayos de inmunolocalización se debió a la consistencia del endospermo de su semilla de trigo durante todo el desarrollo, que lo diferencia del endospermo de semillas de arroz que en sus etapas iniciales e intermedias tiene una consistencia lechosa-pastosa. Se utilizaron semillas de trigo en tres estadíos de desarrollo: inicial (5 dpa), intermedio (13 dpa) y tardío (25 dpa). En la fase inicial se detectaba NTRC mayoritariamente en el pericarpo, que en esta etapa del desarrollo es un tejido verde fotosintético y, en menor proporción, en endospermo (Figura III.1.18 A-B). En la fase intermedia la proteína se localizó principalmente en la capa de aleurona donde la señal detectada fue muy intensa, estando también presente en menor medida en endospermo y en pericarpo, que comienza su degradación (Figura III.1.18 C-D). En la fase tardía NTRC se localizó en endospermo y aleurona con un contenido de la proteína similar (Figura III.1.18 E-F). A pesar de ser NTRC una proteína cloroplastídica en tejidos fotosintéticos (Serrato et al., 2004) y de localización plastidial en tejidos no fotosintéticos (Kirchsteiger et al., 2012), los ensayos de inmunolocalización realizados sugieren una localización citosólica en las células del endospermo y de la capa de aleurona. Si consideramos la hipótesis generada en los experimentos de identificación de la NTRC de endospermo en arroz, donde la proteína difiere de la cloroplastídica en su extremo amino, la localización citosólica podría deberse a la pérdida del péptido de tránsito que sí tiene la proteína cloroplastídica. III. RESULTADOS 97 Figura III.1.18. Inmunolocalización de NTRC en semillas de trigo Las secciones longitudinales (10 μm) de las semillas de trigo a 5 dpa (A yB), 13 dpa (C y D), 25 dpa (E y F) se incubaron con anticuerpo anti-NTRC. End, endospermo; Al, capa de aleurona; Per, pericarpo. La barra indica la escala en micrómetros (μm). D A B C E F III. RESULTADOS 98 Se quiso comparar el patrón de localización de NTRC en semillas con el de una proteína identificada previamente como diana suya tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos, la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) (Michalska et al., 2009). Esta proteína tiene una localización exclusivamente plastidial excepto en endospermo de semillas de cereales, donde presenta también una isoforma de localización citosólica que incrementa su abundancia a medida que avanza el desarrollo de la semilla (Lee et al., 2007). De este modo, el análisis inmunocitoquímico de semillas de trigo con un anticuerpo anti-AGPasa estaría detectando tanto la forma plastidial como la citosólica, siendo más abundante la citosólica en las etapas intermedia y tardía del desarrollo. Los resultados de la inmunolocalización de la AGPasa en semillas de trigo en las etapas intermedia y tardía (13 y 25 dpa, respectivamente) mostraron un patrón de localización muy similar al mostrado por NTRC en dichas etapas (Figura III.1.19), lo que apoya la idea de una posible regulación redox de esta enzima dependiente de NTRC en este tejido. Figura III.1.19. Inmunolocalización de AGPasa en semillas de trigo Las secciones longitudinales (10 μm) de las semillas de trigo a 13 dpa (A) y 25 dpa (B) se incubaron con anticuerpo anti-AGPasa. End, endospermo; Al, capa de aleurona; Per, pericarpo. La barra indica la escala en micrómetros (μm). A B III. RESULTADOS 99 III.2. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN CON NTRC EN ENDOSPERMO DE SEMILLAS DE CEREALES En este trabajo se ha descrito la presencia de NTRC en un nuevo tejido heterotrófico, el endospermo de semillas de cereales. Esta nueva localización, en un tejido altamente especializado hacia la síntesis de almidón de reserva, sugiere la participación de esta enzima en nuevas funciones diferentes de las ya descritas para tejidos fotosintéticos. En endospermo, al igual que en otros tejidos heterotróficos, NTRC estaría participando en la regulación redox de enzimas utilizando como poder reductor el NADPH generado en la ruta oxidativa de las pentosas fosfato. Partiendo de estas premisas, este trabajo se centró en la búsqueda e identificación de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de cereales con los objetivos de determinar los procesos biológicos en los que participa como modulador redox y de describir las nuevas funciones que estaría desarrollando en este tejido. Desde la primera evidencia de regulación redox de proteínas con el descubrimiento del sistema ferredoxina/tiorredoxina en cloroplastos, hace ya más de 40 años (Buchanan et al., 1967), han sido numerosos los trabajos centrados en la búsqueda de proteínas diana de tiorredoxinas. Las tiorredoxinas, tanto del sistema ferredoxina/tiorredoxina del cloroplasto como del sistema NADP/tiorredoxina del citosol y mitocondria, participan en la regulación redox de sus proteínas diana mediante la formación reversible de puentes disulfuro. Los primeros trabajos de búsqueda de proteínas diana de tiorredoxinas se basaban en métodos bioquímicos (Buchanan et al., 2002). Con los avances en proteómica de los últimos años, se han desarrollado metodologías más eficientes para la detección e identificación de posibles proteínas dianas de tiorredoxinas como son el etiquetado de proteínas con sondas capaces de unirse específicamente a grupos tiol o la cromatografía de afinidad utilizando tiorredoxinas mutadas en la cisteína resolutora del sitio activo. A estas técnicas le suceden una separación electroforética en gel (SDS-PAGE) en una o dos dimensiones y la identificación de las posibles proteínas diana mediante espectrofotometría de masas. Como resultado de estos trabajos, actualmente se han identificado aproximadamente 500 proteínas diana de tiorredoxinas (Montrichard et al., 2009). Siendo NTRC una proteína que contiene un módulo NTR y un módulo Trx, capaz de funcionar por sí misma como un sistema NADP/tiorredoxina, y basándonos en los conocimientos generados en la búsqueda de proteínas diana de tiorredoxinas, se diseñaron experimentos de búsqueda de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de cereales mediante cromatografía de afinidad utilizando un mutante monocisteínico del sitio III. RESULTADOS 106 III.2.1.2. Dianas de NTRC identificadas mediante inmunoprecipitación La inmunoprecipitación de NTRC de extractos de endospermo de semillas de arroz se realizó utilizando un anticuerpo específico anti-NTRC diseñado contra en módulo tiorredoxina de la proteína. El uso de este anticuerpo conjugado con perlas de proteína A Sepharosa, tal y como se describe en Materiales y Métodos, permite la separación específica de NTRC presente en la muestra así como de las proteínas o complejos proteicos que estén interaccionando con ella. De este modo, esperamos la identificación de posibles proteínas diana de NTRC interaccionando con ella mediante puente disulfuro o mediante otro tipo de interacción, o bien porque forma parte de un complejo proteico donde alguna de las proteínas sea diana de NTRC. La inmunoprecipitación se llevó a cabo sobre extractos proteicos totales obtenidos de endospermo de semillas de arroz desprovistas del pericarpo. Las diferentes fracciones obtenidas en el proceso se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie (Figura III.2.4 A). Paralelamente, como control negativo, se realizó el mismo procedimiento utilizando suero preinmune en cuyas fracciones no se detectaron proteínas con esta tinción (Figura III.2.4 B). Figura III.2.4. Separación electroforética de las proteínas de las fracciones obtenidas en la inmunoprecipitación de NTRC de endospermo de semillas de arroz Alícuotas (25 µL) de las diferentes fracciones proteicas obtenidas en el proceso de inmunoprecipitación de NTRC de endospermo de semillas de arroz según el protocolo descrito en Materiales y Métodos, se separaron mediante SDSPAGE al 12% en condiciones reductoras. La inmunoprecipitación se realizó con anticuerpo anti-NTRC (A) o con suero preinmune (B). El resultado se comprobó mediante tinción de los geles con azul de Coomassie. FNU, fracción proteica no unida; L1, L2 y L3, lavados; E1 y E2, eluciones; M, marcadores de peso molecular, especificados en kDa a la derecha. A B III. RESULTADOS 107 Se tomaron muestras de todas las bandas visibles para su posterior análisis e identificación mediante MALDI-TOF, que resultó en la identificación predominantemente de las inmunoglobulinas, que seguían estando presentes en las fracciones correspondientes a las eluciones. Para comprobar si el experimento estaba funcionando correctamente analizamos mediante Western blot la presencia de NTRC. Sin embargo, debido a la similitud de movilidad electroforética de inmunoglobulinas y NTRC no fue posible la identificación de esta mediante Western-blot. Como NTRC tiene un punto isoeléctrico cercano a 5 y el de las inmunoglobulinas es muy básico, abordamos la separación mediante SDS-PAGE bidimensional utilizando tiras de pH de bajo rango. De este modo se pudo identificar mediante Western blot a NTRC en las eluciones de la inmunoprecipitación (Figura III.2.5) aunque en este caso la proteína reconocida por el anticuerpo se corresponde con la NTRC de menor tamaño característica de tejidos fotosintéticos. De este modo se demostraba la presencia de esta NTRC también en endospermo de semillas de cereales. Figura III.2.5. Identificación de NTRC en las proteínas inmunoprecipitadas de endospermo de semillas de arroz Extracto de proteínas de endospermo de semillas de arroz se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-NTRC según el protocolo descrito en Materiales y Métodos. Una alícuota de 25 µL de la primera elución del proceso se separó mediante SDS-PAGE bidimensional utilizando en la primera dimensión tiras de isoelectroenfoque de rango de pH de 3 a 5 no lineal (NL) y en la segunda geles de acrilamida al 10%. El resultado se analizó mediante Western blot con anticuerpo anti-NTRC. En rojo se resalta los spots correspondientes a NTRC. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. L os sucesivos experimentos se comprobaron mediante SDS-PAGE monodimensional, mientras que las fracciones correspondientes a la elución de las proteínas interactoras de NTRC se separaron mediante SDS-PAGE bidimensional para facilitar su separación e identificación (Figura III.2.6). En este caso, se utilizaron tiras de isoelectroenfoque de amplio rango de pH que, aunque no excluyen a las inmunoglobulinas en la electroforesis, permiten la identificación de otras proteínas de punto isoeléctrico extremo (ácido o básico). III. RESULTADOS 108 Figura III.2.6. Análisis mediante electroforesis bidimensional de las posibles proteínas diana de NTRC inmunoprecipitadas de endospermo de semillas de arroz Extracto de proteínas de endospermo de semillas de arroz se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-NTRC según el protocolo descrito en Materiales y Métodos. 30 µg de proteínas del extracto y alícuotas de 25 µL de las diferentes fracciones obtenidas en el proceso se separaron mediante SDS-PAGE al 12% (A). La primera elución (E1) se precipitó y se analizó mediante electroforesis bidimensional (B) utilizando en la primera dimensión tiras de isoelectroenfoque de rango de pH de 3 a 10 no lineal (NL) y en la segunda geles de acrilamida al 12%. El resultado se visualizó mediante tinción de los geles con azul de Coomassie. Ec, extracto crudo; FNU, fracción proteica no unida; L1, L2 y L3, lavados; E1 y E2, eluciones; M, marcadores de peso molecular, especificados en kDa a la izquierda. Se analizaron mediante MALDI-TOF un total de 180 muestras de los diferentes experimentos realizados y se identificaron un total de 35 proteínas (Tabla III.2.2), la mayoría de forma consistente en las diferentes réplicas del experimento realizadas. Al igual que para las proteínas identificadas mediante cromatografía de afinidad, se especifica para cada candidata el número de cisteínas conservadas, si habían sido identificadas previamente como proteínas dianas de tiorredoxinas y su posible localización subcelular. Todas las proteínas identificadas poseen cisteínas conservadas. Un caso excepcional lo constituye la Phosphoglycerate kinase, que tiene dos cisteínas en su secuencia una de las cuales se encuentra conservada exclusivamente en cereales. Otro caso es le de Ricin B-related lectin domain containing protein (R40g2 protein) cuya secuencia es muy similar a R40c1 protein identificada previamente mediante cromatografía de afinidad en este trabajo. De las 35 posibles proteínas diana de NTRC identificadas mediante inmunoprecipitación, 24 habían sido previamente identificadas como posibles dianas de tiorredoxinas. A B III. RESULTADOS 109 Tabla III.2.2. Posibles dianas de NTRC en endospermo de semillas de arroz identificadas mediante inmunoprecipitación Para cada proteína identificada se especifica el número de identificación según la base de datos UniprotKB, el número de cisteínas conservadas en los ortólogos de plantas (Cis), si ha sido previamente identificada como diana de tiorredoxinas (Trx) y su posible localización subcelular (C, citosol; CP, cloroplasto; AP, amiloplasto; P, plastidial; M, mitocondria; RE, retículo endoplasmático; MP, membrana plasmática; PX, peroxisoma). Proteína UniprotKB ID Cis Trx Posible localización 2 - isopropylmalate synthase B, putative, expressed Q2QXY9 7 CP 60S Ribosomal protein L4/L1 family protein Q0D868 1 ● C Actin - 1 Q10DV7 4 ● C Actin - 3 Q10AZ4 4 ● C Actin - 7, putative, expressed Q67G20 4 ● C ADP - glucose pyrophosphorylase large subunit Q7G065 7 ● CP/ AP/ C ADP - glucose pyrophosphorylase small subunit P15280 4 ● CP/ AP/ C ATP synthase subunit beta, mitochondrial Q01859 2 ● M Chaperonin - 60 (mitocondrial) Q8H903 5 ● M Cytochrome P450 72A1 family protein Q0JL27 1 RE Cytochrome P450 family protein Q0DUT2 2 RE Elongation factor EF - 2 Q6H4L2 15 ● C Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase Q7FAH2 2 ● C Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase, cytosolic Q0J8A4 2 ● C Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase, cytosolic 3 Q6K5G8 2 ● C Guanine nucleotide - binding protein subunit beta - like protein P49027 7 ● C Heat shock protein 70 (HSP70) Q40693 7 ● C HSP70, Dnak - type molecular chaperone Bip Q6Z7B0 3 ● RE Phosphoglycerate kinase Q6H6C7 0 ● C Protein Brittle - 1,chloroplastic/amyloplastic Q6Z782 4 ● P Protein TOC75, chloroplastic Q84Q83 7 CP/P Pullulanasa P93416 2 CP/ AP Putative chaperonin 60 beta Q9LWT6 4 ● CP Putative hydroxypyruvate reductase Q6YU90 3 CP/ PX Pyruvate, phosphate dikinase 1, chloroplastic Q6AVA8 8 ● CP Receptor kinase - like protein Q0J8X0 2 MP Ricin B - related lectin domain containing protein (R40g2 protein) Q6Z4N6 0 C Starch branching enzyme 1 Q01401 3 CP/ AP Starch branching enzyme 3 Q6H6P8 4 ● CP/ AP Stromal 70 kDa heat shock - related protein Q2QV45 2 ● CP Sucrose synthase 1 P31924 5 ● C Sucrose synthase 3 Q43009 3 C Tubulin beta - 1 chain Q43594 11 ● C Tubulin beta - 5 chain P46265 10 ● C Tubulin beta - 7 chain P37832 10 ● C III. RESULTADOS 110 III.2.1.3. Comparación de resultados de ambos métodos Mediante dos técnicas complementarias como son la cromatografía de afinidad y la inmunoprecipitación, se han identificado un total de 79 posibles proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de arroz. Las proteínas aquí identificadas estarían participando en diferentes procesos celulares que tienen lugar en el endospermo de semillas de cereales como son el metabolismo, la síntesis y degradación de proteínas, formando parte de la estructura celular, funcionando como proteínas de almacenamiento, de defensa o de respuesta a estrés, en la transducción de señales, el procesamiento del DNA y RNA, la homeostasis celular o el transporte de proteínas (Tabla III.2.3). De acuerdo a esta clasificación, el metabolismo y más concretamente, el metabolismo del carbono, es el proceso celular que alberga un mayor número de candidatas; siendo coherente con la principal función del endospermo de cereales, la síntesis y almacenamiento de almidón. Entre las proteínas identificadas en este trabajo como posibles dianas de NTRC en endospermo se encuentran un total de 42 proteínas identificadas previamente como posibles dianas de tiorredoxinas. Tabla III.2.3. Clasificación de las posibles proteínas diana de NTRC identificadas en endospermo de arroz según su función Las proteínas que han sido previamente identificadas como dianas de tiorredoxinas se indican con * METABOLISMO Metabolismo de carbohidratos ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit* ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit* Aldolase C-1 Alpha 1,4-glucan phosphorylase L isozyme (starch phosphorylase)* Alpha-amylase/subtilisin inhibitor* Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase* Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic* Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic 3* Isoamylase (debranching enzyme) NADP-specific isocitrate dehydrogenase* Phosphoglycerate kinase* Probable alpha-glucosidase // Maltase Protein Brittle-1, chloroplastic/amyloplastic (BT1)* Pullulanase Putative dihydrolipoamide acetyltransferase* Putative sorbitol dehydrogenase* Pyruvate, phosphate dikinase 1, chloroplastic* Starch branching enzyme 1 Starch branching enzyme 3 * Sucrose synthase 1* Sucrose synthase 2 Sucrose synthase 3 Trypsin/alpha-amilase inhibitor family protein* III. RESULTADOS 111 Síntesis de ácidos grasos Acetyl-CoA carboxylase* Síntesis y degradación de aminoácidos 2-isopropylmalate synthase B, putative, expressed Acetolactate synthase 1, chloroplastic Phenylalanine ammonia-lyase* Probable N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase Probable sarcosine oxidase Putative fumarylacetoacetate hydrolase Putative hydroxypyruvate reductase (glycerate dehydrogenase) S-adenosylmethionine synthetase 2* ATP síntesis/transformación Adenylate kinase A* ATP synthase subunit beta, mitochondrial* Nucleoside diphosphate kinase 1* SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS Traducción 60S Ribosomal protein L4/L1 family protein* 60S ribosomal protein L5-1 (RPL5A) Elongation factor EF-1* Elongation factor EF-2* Plegamiento Heat shock protein 70 (HSP70)* Chaperonin-60 (mitocondrial)* HSP70, Dnak-type molecular chaperone Bip* Putative chaperonin 60 beta* Stromal 70 kDa heat shock-related protein Proteolisis Eukaryotic aspartyl protease family protein, expressed Putative DNA-binding protein GBP16 Ubiquitin-specific protease 12, putative, expressed PROTEÍNAS DE ALMACENAMIENTO EN SEMILLAS Allergen RA16 Cupin family protein Ricin B-related lectin domain containing protein (R40c1 protein) Ricin B-related lectin domain containing protein (R40g2 protein) Seed allergenic protein RAG2 ESTRUCTURA CELULAR Actin-1* Actin-1, putative, expressed* Actin-3* Actin-7, putative, expressed* Formin-like protein 3 //OsFH3 III. RESULTADOS 112 Tubulin alpha-1 chain,* Tubulin beta-1 chain* Tubulin beta-5 chain* Tubulin beta-7 chain* DEFENSA DE LA PLANTA Dirigent-like protein Xylanase inhibitor protein 2 RESPUESTA A ESTRÉS Annexin P33 Putative annexin P35 Universal stress protein (Usp) family protein (Q60EJ0)* Universal stress protein (Usp) family protein (Q5ZAV7)* TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein * Putative Calcineurin B subunit Putative GTP-binding protein* Receptor kinase-like protein RNA binding protein Rp120* PROCESAMIENTO DEL DNA Y RNA Pentatricopeptide, putative, expressed Topoisomerase-like protein HOMEOSTASIS REDOX CELULAR Thioredoxin reductase NTRC TRANSPORTE DE PROTEÍNAS Protein TOC75, chloroplastic OTROS Cytochrome P450 72A1 family protein Cytochrome P450 family protein Putative ent-kaurene oxidase De las 79 posibles proteínas diana de NTRC identificadas en endospermo de semillas de arroz, 44 fueron identificadas mediante cromatografía de afinidad (36 si descartamos las identificadas de la elución con NaCl), 20 mediante inmunoprecipitación y las 15 restantes fueron identificadas mediante ambos métodos. Estas 15 proteínas, especificadas en la Tabla III.2.4., se convierten en firmes candidatas a ser proteínas diana de NTRC en endospermo al haber sido identificadas mediante dos aproximaciones diferentes. III. RESULTADOS 113 Tabla III.2.4. Posibles dianas de NTRC en endospermo de semillas de arroz identificadas mediante cromatografía de afinidad e inmunoprecipitación Para cada proteína identificada se especifica el número de identificación según la base de datos UniprotKB, el número de cisteínas conservadas en plantas (Cis), si ha sido previamente identificada como diana de tiorredoxinas (Trx) y su posible localización subcelular (C, citosol; CP, cloroplasto; AP, amiloplasto; P, plastidial; RE, retículo endoplasmático). Proteína UniprotKB ID Cis Trx Posible localización 2 - isopropylmalate synthase B, putative, expressed Q2QXY9 7 CP Actin - 7, putative, expressed Q67G20 4 ● C ADP - glucose pyrophosphorylase large subunit Q7G065 7 ● CP/ AP/ C ADP - glucose pyrophosphorylase small subunit P15280 4 ● CP/ AP/ C Cytochrome P450 family protein Q0DUT2 0 RE Elongation factor EF - 2 Q6H4L2 15 ● C Glyceraldehyde - 3 - phosphate dehydrogenase, cytosolic 3 Q6K5G8 2 ● C Guanine nucleotide - binding protein subunit beta - like protein P49027 7 ● C HSP70, Dnak - type molecular chaperone Bip Q6Z7B0 3 ● RE Protein Brittle - 1,chloroplastic/amyloplastic Q6Z782 4 ● P Pullulanase P93416 2 CP/ AP Pyruvate, phosphate dikinase 1, chloroplastic Q6AVA8 8 ● CP Starch branching enzyme 1 Q01401 3 CP/ AP Starch branching enzyme 3 Q6H6P8 4 ● CP/ AP Sucrose synthase 3 Q43009 3 C III.2.2. Identificación de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de trigo (Triticum aestivum) La búsqueda de proteínas diana de NTRC en endospermo de semillas de cereales se completó con la realización de experimentos de identificación de sus posibles dianas en endospermo de semillas de trigo. En este caso, la búsqueda de posibles dianas de NTRC se realizó exclusivamente mediante experimentos de cromatografía de afinidad dado que, de los resultados obtenidos previamente en arroz, esta aproximación aportó el 75% de las proteínas identificadas. La metodología seguida en la cromatografía de afinidad fue similar a la utilizada en el caso de arroz eluyendo las proteínas unidas a NTRC en la columna en tres pasos sucesivos y utilizando esta vez el TCEP como único agente reductor para la elución de las posibles dianas. Los experimentos se realizaron a partir de endospermo de semillas de trigo en una fase de desarrollo comprendida entre los 9 y 11 días post-antesis (dpa) descascarilladas y desprovistas del pericarpo. III. RESULTADOS 114 Figura III.2.7. Perfil de elución de la cromatografía de afinidad realizada con extractos de endospermo aislado de semillas de trigo en desarrollo Perfil cromatográfico de las proteínas eluidas de la cromatografía de afinidad para la identificación de proteínas diana de NTRC de endospermo de semillas de trigo en desarrollo. La primera elución corresponde con la fracción proteica no unida a la columna (FNU). A continuación se realizó una elución con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M (NaCl), seguido de una elución por reducción con 10 mM de TCEP (TCEP) y una elución con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM (Imidazol). Entre las eluciones con NaCl, TCEP e imidazol se realizaron lavados con tampón fosfato (L1 y L2). En azul se representa la absorbancia (mAu) de las proteínas eluidas y en rojo las fracciones recogidas. El perfil cromatográfico obtenido (Figura III.2.7) es muy similar al obtenido previamente con extractos de endospermo de arroz utilizando el agente reductor TCEP, observándose un pico de elución tras la aplicación del reductor y, posteriormente, con la aplicación de imidazol una mayor elución de proteínas debida principalmente al mutante de NTRC. Las diferentes fracciones obtenidas en cada paso de la cromatografía se separaron mediante electroforesis (Figura III.2.8) para su posterior identificación mediante MALDI-TOF. Debido a la escasa cantidad de proteínas eluidas con NaCl tres fracciones consecutivas se analizaron conjuntamente. III. RESULTADOS 115 Figura III.2.8. Separación electroforética de de las proteínas eluídas mediante cromatografía de afinidad de endospermo de semillas de trigo Las diferentes fracciones obtenidas de la cromatografía de afinidad para la identificación de proteínas diana de NTRC de endospermo de semillas de trigo se separaron mediante SDS-PAGE al 12%. El resultado se visualizó mediante tinción con azul de Coomassie. En cada carril se cargaron alícuotas de 100 µL de las fracciones de proteína no unida (FNU) y lavados (L1 y L2), de 150 µL de las fracciones de las eluciones con NaCl y TCEP precipitadas con TCA, y 70 µL de las fracciones de las eluciones con imidazol. * indica tres fracciones consecutivas juntas. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. En este caso sólo se tomaron muestras para su identificación de la elución con el agente reductor. Se analizaron un total de 110 muestras en las diferentes repeticiones del experimento, cuyo resultado fue la identificación de 35 proteínas diferentes, detalladas en la Tabla III.2.5, como posibles dianas de NTRC en endospermo de trigo. Dado que el trigo es un cereal cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado, existen proteínas cuya secuencia completa no se encuentra disponible en la base de datos UniprotKB. A dichas proteínas se les asignó mediante comparación de secuencias el número de identificación de la proteína ortóloga más cercana. Para cada proteína se determinó el número de cisteínas conservadas, resultando que las 35 candidatas poseen al menos una cisteína conservada en su secuencia con la excepción de Protein phosphatase 2C 10-like, si bien posee hasta 4 cisteínas aunque no conservadas. Todas las proteínas aquí identificadas presentan por tanto residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro, requisito necesario para poder ser considerada como posible proteína diana de NTRC. Así mismo, se comprobó si habían sido identificadas previamente como dianas de tiorredoxinas, algo que ocurre con más de la mitad de las candidatas. Por último se indica también la posible localización subcelular de cada proteína. III. RESULTADOS 122 Figura III.3.2. Árbol filogenético de las secuencias aminoacídicas derivadas de los genes Sus de cereales Los datos de las SUS de Arabidopsis se incluyeron para la comparación con una especie dicotiledónea. Los números de acceso de las CDS son: (1) Hordeum vulgare, HvSS1, X65871; HvSS2, X69931; HvSS3, AK249450; HvSS4, AK251329; (2) Zea mays, ZmSh1, X02400; ZmSUS1, L22296; ZmSUS3, AY124703; (3) Oryza sativa, OsSUS1, AK100334; OsSUS2, AK072074; OsSUS3, AK100306; OsSUS4, AK102158; OsSUS5, AK063304; OsSUS6, AK065549; (4) Brachypodium distachyon, Bradi1g46670.1, BdSUS1; Bradi1g60320.1, BdSUS2; Bradi1g20890, BdSUS3; Bradi1g62960.1, BdSUS4; Bradi1g29570, BdSUS5; Bradi3g60690, BdSUS6; (5) Arabidopsis thaliana, AtSUS1, X70990; AtSUS2, Q00917; AtSUS3, AL161494; AtSUS4, AL353871, AtSUS5, BAB11375; AtSUS6, AAG30975. Los valores de Bootstrap se representan como porcentajes. Figura adaptada de (Barrero-Sicilia et al., 2011). Nos hemos centrado en este estudio en los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 que codifican las isoformas SUS1, SUS2 y SUS3 identificadas como posibles dianas de NTRC. El estudio del patrón de expresión de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 en endospermo de semillas de arroz se llevó a cabo mediante PCR a tiempo real (qPCR), utilizando muestras de RNA total procedentes de semillas en diferentes fases del desarrollo (según se describe en el apartado II.1.2 de Materiales y métodos). Con el fin de comparar los niveles de transcrito en este tejido con los existentes en tejido fotosintético, también se analizó la expresión de los diferentes genes en muestras de hojas de plantas adultas. Se utilizaron parejas de oligonucleótidos capaces de discernir los tres genes Sus de arroz estudiados, así como el gen de la poliubiquitina de arroz (OsUbi) de expresión constitutiva, utilizado como referencia (ver Tabla II.3. de Materiales y métodos). En la Figura III.3.3 se representan los III. RESULTADOS 123 niveles de mRNA de los tres genes OsSus normalizados respecto a los niveles de transcrito del gen de la poliubiquitina. Figura III.3.3. Expresión de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 en semillas de arroz en desarrollo (A) Se determinaron mediante qPCR los niveles de mRNA de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 en semillas de arroz en cada uno de los estadíos de desarrollo establecidos (End1 a End4) y en hojas de planta adulta. En cada caso se utilizaron 50 ng del cDNA sintetizado a partir del RNA total aislado en las diferentes muestras. Los resultados se muetran en relación a los niveles de mRNA de la poliubiquitina (OsUbi) en cada muestra. (B) Análisis de la presencia de las proteínas SUS en las diferentes muestras mediante Western blot con un anticuerpo anti-SUS. Se utilizaron extractos totales de proteínas de endospermo de semillas de arroz en cada estadío de desarrollo y de hoja (40 µg de proteína) en condiciones reductoras (tampones de extracción y de carga suplementados con βME 14 mM y DTT 10 mM). Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. Los tres genes OsSus analizados presentaron elevados niveles de expresión en endospermo durante todo el desarrollo de la semilla, siendo constantes y mayores en el caso de OsSus2 y decrecientes tanto para OsSus1 como OsSus3, cuyos niveles de transcritos disminuían hasta un orden de magnitud al final del desarrollo. Los niveles de expresión de OsSus1 fueron los más bajos durante todo el desarrollo la semilla en comparación con la expresión de OsSus2 y OsSus3, si bien este gen ha sido descrito junto con OsSus3 como gen de expresión predominante en semillas en desarrollo (Huang et al., 1996; Wang et al., 1999). En hoja los niveles de transcritos de los genes OsSus fueron menores que en endospermo, siendo prácticamente inexistente la expresión de OsSus3 en este tejido. 1,00E-05 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 End 1 End 2 End 3 End 4 Hoja Niveles de transcrito (nº copias gen/ nº copias OsUbi) OsSus1 OsSus2 OsSus3 A B III. RESULTADOS 124 El análisis Western blot mostró la presencia de la proteína, probablemente una mezcla de isoformas SUS igualmente detectadas por el anticuerpo, a lo largo del desarrollo de la semilla, siendo más abundante en los estadíos iniciales (Figura III.3.3). El contenido de proteína SUS se corresponde por tanto con los niveles totales de expresión de los genes Sus durante el desarrollo de la semilla de arroz. III.3.1.1. Expresión de los genes Sus de arroz en condiciones de estrés abiótico Los cereales en general soportan elevadas temperaturas durante el periodo de espigado y formación de la semilla. En el caso particular del arroz analizado en este trabajo, ha sido cultivado en la marisma del Guadalquivir, por tanto, con cierto grado de salinidad. El estrés salino supone un problema aún más acuciante en periodo de sequía, que deriva en un estrés oxidativo que se suma los anteriores. Dado el importante papel que juega la SUS en el control de la sacarosa importada en tejidos no fotosintéticos, como las semillas de cereales, esta enzima se encuentra altamente regulada. Entre los factores descritos como moduladores de la expresión de los genes Sus se encuentran los estreses provocados por frío y sequía, que derivan en un estrés osmótico generado por el incremento de los niveles endógenos de azúcares (Dejardin et al., 1999). En este trabajo se planteó la posibilidad de que la expresión de los genes Sus estuviera alterada durante el desarrollo de las semillas de arroz como consecuencia del estrés salino. Para ello se llevó a cabo un estudio de la expresión de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 mediante PCR a tiempo real (qPCR) durante el desarrollo de semillas de plantas de arroz cultivadas en condiciones de alta salinidad (Apartado II.1.2 de Materiales y métodos) y se compararon con los datos obtenidos en condiciones de baja salinidad. La Figura III.3.4 muestra que las condiciones de alta salinidad no influyen en los niveles de expresión de los genes OsSus estudiados. Realizando un análisis estadístico T-student de las parejas de datos, encontramos que tan solo existe un caso donde la variación del nivel de expresión entre las muestras con y sin tratamiento de salinidad es significativa para α=0,05. Se trata de la expresión del gen OsSus3 en el primer estadío de desarrollo de la semilla donde los niveles de transcrito disminuyen hasta un 64%. III. RESULTADOS 125 Figura III.3.4. Efecto de la salinidad sobre la expresión de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 de semillas de arroz Se determinaron los niveles de mRNA de los genes OsSus1 (A), OsSus2 (B) y OsSus3 (C) mediante qPCR en semillas de arroz en cada uno de los estadíos de desarrollo establecidos (End1 a End4) y hojas de plantas cultivadas en condiciones de baja salinidad (No Sal) y en condiciones de alta salinidad (suplemento de 2,5 g/L de NaCl en el agua de riego) (Sal). En cada caso se utilizaron 50 ng del cDNA sintetizado a partir del RNA total aislado en las diferentes muestras. Los resultados se muetran en relación a los niveles de mRNA de la poliubiquitina (OsUbi) en cada muestra. 1,00E-05 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 End 1 End 2 End 3 End 4 Hoja Niveles de transcrito (n° copias Sus1/ n° copias OsUbi) No Sal Sal 1,00E-05 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 End 1 End 2 End 3 End 4 Hoja Niveles de transcrito (n° copias Sus2/ n° copias OsUbi) No Sal Sal 1,00E-05 1,00E-04 1,00E-03 1,00E-02 1,00E-01 1,00E+00 End 1 End 2 End 3 End 4 Hoja Niveles de transcrito (n° copias Sus3/ n° copias OsUbi) No Sal Sal A B C III. RESULTADOS 126 III.3.2. Clonación de los cDNAs de SUS de arroz para su expresión en E. coli La disponibilidad de la secuencia completa del genoma del arroz posibilitó la clonación de los cDNAs correspondientes a los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3 codificantes de las proteínas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3, respectivamente, que fueron previamente identificadas como posibles dianas de NTRC en endospermo de arroz. Para la clonación de los cDNAs de las tres isoformas de SUS de arroz se diseñaron oligonucleótidos (Tabla III.3.1) a partir de las secuencias de cDNAs disponibles en la base de datos Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia (KOME). Según esta base de datos y programas de predicción de localización subcelular como Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html), la isoforma OsSUS2 podría tener localización mitocondrial, aunque otros programas de predicción como SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) le asignan una localización citosólica. Por este motivo, se diseñó además una pareja de oligonucleótidos (Tabla III.3.1) que permite la clonación del cDNA para la expresión de la proteína madura correspondiente a OsSUS2 sin el posible péptido tránsito a la mitocondria, que constaría según los programas de predicción de 28 aminoácidos del extremo N-terminal. Todos los oligonucleótidos se diseñaron además con las secuencias de corte de enzimas de restricción (BamHI para los cebadores del extremo 5’ y HindIII para los cebadores del extremo 3’) que permitían su posterior clonación en el vector de expresión pQE30. Tabla III.3.1. Detalles de oligonucleótidos utilizados y tamaño de los cDNAs clonados; y número de residuos, peso molecular y punto isoeléctrico de las proteínas resultantes de la clonación en el vector pQE30. Oligonucleótidos cDNA (pb) Proteína (aa) MW (kDa) PI OsSUS1 SUS1 BamHI Fw/ SUS1 HindIII Rv 2467 828 94,3 6,1 OsSUS2 SUS2 BamHI Fw/ SUS2 HindIII Rv 2443 820 93,5 6.1 OsSUS2-pt SUS2-pt BamHI Fw/ SUS2 HindIII Rv 2359 792 90,5 6.0 OsSUS3 SUS3 BamHI Fw/ SUS3 HindIII Rv 2467 828 94,5 6.3 La base de datos KOME describe que los genes de las diferentes isoformas de SUS presentan un patrón diferencial de expresión dependiendo del tejido y del estado de desarrollo de la planta. Por este motivo, la amplificación de los cDNAs se llevó a cabo por RTPCR a partir de diferentes preparaciones de RNA de arroz (var. Nipponbare) según la isoforma de SUS que se pretendía clonar. De este modo, se utilizó una preparación de RNA total aislado III. RESULTADOS 127 de raíz de plántulas de arroz germinadas en placa para la clonación de OsSUS1, de hojas de plantas adultas de arroz para la clonación de OsSUS2 y de endospermo de semillas de arroz en un estadío intermedio de su desarrollo para la clonación de OsSUS3. Los cDNAs obtenidos a partir de los oligonucleótidos diseñados fueron clonados en el vector pGEMt easy. Las secuencias se comprobaron mediante secuenciación utilizando los oligonucleótidos correspondientes a los sitios T7 y M13 presentes en el vector pGEMt easy y una pareja de oligonucleótidos internos comunes para las tres isoformas que se diseñaron en regiones conservadas de los tres genes (SUS Int Fw -5’TGGAGAAGGGTTGGGGTG3’- y SUS Int Rw -5’CATCTTCTTGAACTCAGCCTG3’-). Una vez confirmadas las secuencias, los cDNAs se clonaron en el vector de expresión pQE30. Dicho vector añade a las proteínas una cola de 6 residuos de histidina en su extremo N-terminal, que permitirán la posterior purificación mediante cromatografía de afinidad por Níquel. El tamaño final, peso molecular y punto isoeléctrico de las proteínas resultantes esperables de estas clonaciones se detalla en la Tabla III.3.1. III.3.3. Pruebas de expresión de las SUS de arroz en E. coli Para comprobar la expresión de las proteínas en E.coli se transformaron las estirpes BL21 y XL1-Blue con los plásmidos generados: pQE30-OsSUS1, pQE30-OsSUS2, pQE30-OsSUS2- pt y pQE30-OsSUS3. La inducción de la expresión de las diferentes proteínas se realizó mediante la adición de 1 mM de IPTG a cultivos de estas cepas a 37°C y se recogieron alícuotas a diferentes tiempos para la determinación del tiempo óptimo de inducción de las proteínas. Las alícuotas recogidas se lisaron separando posteriormente la fracción soluble de la membranosa y se analizaron mediante SDS-PAGE. Mediante tinción de los geles de acrilamida con Azul de Coomassie no se apreció la inducción en ningún caso. Se repitieron las pruebas de expresión con dos temperaturas diferentes, 30°C y 20°C. La tinción con azul de Coomassie de los geles de acrilamida tampoco reveló inducción de las proteínas recombinantes (Figura III.3.5). Para confirmar la falta de expresión se analizaron las muestras mediante Western blot con un anticuerpo anti-poliHis que reconocería el fragmento de 6 histidinas añadido a las proteínas clonadas en el vector pQE30. Este análisis corroboró la ausencia de las proteínas recombinantes en las diferentes condiciones de inducción ensayadas, si bien el anticuerpo reconocía una proteína de unos 37 kDa en todos los casos (Figura III.3.5). III. RESULTADOS 128 Figura III.3.5. Prueba de expresión de OsSUS3 en las estirpes de E. coli XL1-Blue y BL21 a 20°C Las cepas de E. coli XL1-Blue (A) y BL21 (B) transformadas con la construcción pQE30-OsSUS3 se cultivaron en medio líquido LB hasta alcanzar una DO 600 ≈0,5, se indujeron con 1 mM de IPTG y se incubaron a 20 °C toda la noche. Se tomaron muestras de 1 mL antes de la inducción con IPTG (0h), a las 3 horas (3h), a las 6 horas (6h) y tras una noche de incubación (ON). Alícuotas de los extractos crudos recogidos (15 µg de proteína) se analizaron en geles de acrilamida al 10% en condiciones reductoras y se tiñeron con Azul de Coomassie o se analizaron mediante Western blot con un anticuerpo anti-poliHis. Se analizaron las fraciones soluble y membranosa, según se indica. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. III.3.4. Clonación de los cDNAs de SUS de arroz para la expresión en N. benthamiana Ante la imposibilidad de la expresión de las isoformas de SUS de arroz en bacterias, se planteó un abordaje diferente para tratar de producirlas. Se trata de la expresión transitoria de proteínas heterólogas en hojas de la planta modelo Nicotiana benthamiana, de acuerdo con la metodología ya descrita por He y colaboradores (He et al., 2004). Este nuevo abordaje requería la utilización de un sistema binario de expresión y por tanto una nueva estrategia de clonación basada en la metodología Gateway® para la clonación de los cDNAs en los vectores binarios de expresión pGWB. Del mismo modo que para la clonación de los cDNAs de SUS de arroz para la expresión en E. coli, se diseñaron oligonucleótidos específicos (Tabla III.3.2) que permitieron la clonación A B III. RESULTADOS 129 de las secuencias codificantes de los genes OsSus1, OsSus2 y OsSus3. Aunque en este caso, la utilización del sistema de clonación Gateway® requería que los oligonucleótidos diseñados, a parte de la secuencia específica del gen, poseyeran los sitios de recombinación AttB1 y AttB2 en los cebadores 5’ y 3’, respectivamente. De igual forma, se diseñó una pareja de oligonucleótidos que permitía la amplificación de la isoforma OsSUS2 sin el posible péptido tránsito a la mitocondria. El procedimiento para la amplificación de los cDNAs fue similar al realizado para la expresión en E. coli, mediante RT-PCR utilizando diferentes extracciones de RNA según la isoforma a clonar (Véase apartado III.3.2). Los cDNAs amplificados con los cebadores diseñados se clonaron en el vector pDONR 207 y se comprobaron mediante secuenciación utilizando oligonucleótidos diseñados específicamente para el vector pDONR 207 y una pareja de oligonucleótidos internos comunes para las tres isoformas diseñada en regiones conservadas de los tres genes (SUS Int Fw -5’TGGAGAAGGGTTGGGGTG3’- y SUS Int Rw - 5’CATCTTCTTGAACTCAGCCTG3’-). Una vez comprobadas las secuencias, los cDNAs se clonaron en los vectores binarios de expresión pGWB8 y pGWB9 que añaden a las proteínas maduras una cola de 6 residuos de histidina, en los extremos C-terminal y N-terminal, respectivamente. El tamaño final, peso molecular y punto isoeléctrico de las proteínas resultantes de estas clonaciones se detalla en la Tabla III.3.2. Tabla III.3.2. Detalles de oligonucleótidos utilizados y tamaño de los cDNAs clonados; y número de residuos, peso molecular y punto isoeléctrico de las proteínas resultantes de la clonación en los vectores pGWB8 y pGWB9. Oligonucleódidos cDNA (pb) Proteína (aa) MW (kDa) PI pGWB8-OsSU1 AttB1 SUS1/ AttB2 SUS1 2502 825 95,2 6,07 pGWB9-OsSU1 847 96,5 6,20 pGWB8-OsSU2 AttB1 SUS2/ AttB2 SUS2 2478 827 94,4 6,09 pGWB9-OsSU2 839 95,7 6,24 pGWB8-OsSU2-pt AttB1 SUS2-pt/ AttB2 SU2 2397 800 91,5 5,96 pGWB9-OsSU2-pt 812 92,7 6,10 pGWB8-OsSU3 AttB1 SUS3/ AttB2 SUS3 2502 835 95,4 6,25 pGWB9-OsSU3 847 96,7 6,39 III. RESULTADOS 130 III.3.5. Expresión de las SUS de arroz en N. benthamiana Para llevar a cabo la expresión en Nicotiana benthamiana, se transformó previamente la cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens con las construcciones OsSUS1, OsSUS2, OsSUS2- pt y OsSUS3 clonadas en los vectores pGWB8 y pGWB9. En primer lugar se comprobó la producción de las proteínas a partir de las diferentes construcciones generadas con ambos vectores. Para ello se infiltraron plantas de N. benthamiana adultas con las cepas de Agrobacterium conteniendo las diferentes construcciones. Los extractos de hojas recogidas a los dos días tras la agroinfiltración se compararon mediante Western blot con un anticuerpo anti-poliHis. Este análisis indicó que sólo se producían las proteínas recombinantes a partir del vector pGWB9 (Figura III.3.6), que añade la cola de 6 histidinas en el extremo N-terminal. Los sucesivos experimentos se realizaron por tanto exclusivamente con las construcciones realizadas en este vector. El análisis Western blot reveló además que las diferentes isoformas de SUS mostraban una movilidad electroforética ligeramente inferior a la esperada. Figura III.3.6. Expresión en N. benthamiana de las isoformas OsSUS clonadas en los vectores pGWB8 y pGWB9 Se infiltraron hojas de N. benthamiana con cultivos de Agrobacterium transformadas con las construcciones OsSUS1, OsSUS2, OsSUS2-pt y OsSUS3 clonadas en los vectores pGWB8 y pGWB9. Alícuotas (50 µg de proteína) de los extractos crudos de hojas recogidas tras dos días de la agroinfiltración se analizaron en geles de acrilamida al 10% en condiciones reductoras. El resultado se analizó mediante Western blot con un anticuerpo anti-poliHis. Los marcadores de peso molecular, en kDa, se indican a la izquierda. El siguiente parámetro que se determinó fue el tiempo necesario tras la agroinfiltración para conseguir la máxima expresión de cada una de las isoformas. Se observó que eran necesarios al menos dos días tras la infiltración con las cepas de Agrobacterium para que la planta comience a producir las proteínas recombinantes en cantidades apreciables. A continuación, se recogieron para cada isoforma muestras a los 2, 3 y 6 días posteriores a la agroinfiltración. El análisis mediante Western blot de los extractos crudos obtenidos de las diferentes muestras recolectadas (Figura III.3.7) mostró una diferente cinética de expresión para cada isoforma. Las isoformas 1 y 2 (con y sin péptido de tránsito) alcanzaron la máxima producción a los 6 días tras la infiltración, si bien, la cantidad de OsSUS1 era notablemente mayor que la de OsSUS2(-pt) en los diferentes días analizados. La isoforma OsSUS3 en cambio III. RESULTADOS 131 alcanzó la máxima producción a los 2 días tras la infiltración, disminuyendo en los días sucesivos los niveles de proteína. Por tanto, la recolección del material vegetal para la preparación de los extractos crudos se estableció en 6 días tras la agroinfiltración en el caso de las isoformas OsSUS1 y OsSUS2(-pt) y en 2 días tras la agroinfiltración en el caso de OsSUS3. Figura III.3.7. Patrón de expresión de las isoformas OsSUS en N. benthamiana tras la agroinfiltración Plantas de N. benthamiana fueron infiltradas con cultivos de Agrobacterium transformados con las construcciones OsSUS1, OsSUS2, OsSUS2-pt y OsSUS3 clonadas en el vector pGWB9. Alícuotas (50 µg de proteína) de los extractos crudos de las hojas de N. benthamiana recogidas a los dos, tres y seis días tras la agroinfiltración se analizaron en geles de acrilamida al 8% en condiciones reductoras. El resultado se analizó mediante Western blot con un anticuerpo anti-poliHis . III.3.6. Purificación de las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 La purificación de las diferentes isoformas de SUS recombinantes de arroz expresadas en N. benthamiana se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad por Níquel (ver Materiales y métodos) a partir de la fracción soluble obtenida de extractos crudos de las hojas agroinfiltradas. El tampón de extracción utilizado para la preparación de los extractos crudos se elaboró siguiendo las siguientes pautas: una solución tampón a pH neutro que sería la misma para los posteriores ensayos de actividad (50 mM HEPES/KOH pH 7,0), fuerza iónica que evite interacciones electrostáticas inespecíficas con la fase estacionaria durante la cromatografía (150 mM KCl), sacarosa que favorece una conformación de la misma más estable para su purificación (150 mM sacarosa), inhibidores de proteasas de plantas (1 mM PMSF y una mezcla de inhibidores de proteasas) y una pequeña cantidad de glicerol para aportar más estabilidad a las proteínas purificadas en solución (10% (v/v) glicerol). La necesidad de la presencia de agentes reductores en el tampón de extracción fue una cuestión III. RESULTADOS 138 Los resultados obtenidos muestran que las diferentes isoformas presentaron distintas afinidades por los sustratos UDP y UDPG siendo OsSUS3 la isoforma de mayor afinidad tanto para UDP como para UDPG y la isoforma OsSUS1 la que presentó menor afinidad para ambos sustratos. Las isoformas OsSUS2 y OsSUS3 presentaron afinidad similar por sacarosa mientras la isoforma OsSUS1 presentó mayor afinidad por este sustrato. En el caso de la fructosa, las tres isoformas mostraron afinidades parecidas y un patrón similar de inhibición de la actividad SUS por sustrato (Figura III.3.14), alcanzando una actividad máxima con una concentración de 25-50 mM de fructosa. Los patrones de inhibición por fructosa obtenidos son además similares a los obtenidos por otros autores para las isoformas SUS1, SUS2, SUS4 y SUS6 de Arabidopsis (Bieniawska et al 2007) o SUS1, SUS2 y SUS3 del guisante (Barrat et al 2001). Figura III.3.14. Inhibición por sustrato (fructosa) de la actividad de las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 Se llevaron a cabo ensayos de actividad con 1 μM de OsSUS1 (Azul), OsSUS2 (Rojo) y OsSUS3 (Verde) en sentido de síntesis de sacarosa en una mezcla de reacción que contenía HEPES/KOH 50 mM (pH 8,0) , EDTA 2 mM, UDPG 2 mM y una concentración de fructosa que variaba entre 1 y 200 mM. El resultado se muestra en porcentaje de actividad respecto al máximo valor de actividad obtenido en cada caso. Aunque se considera generalmente al UDP como el principal nucleósido difosfato utilizado por la SUS, numerosos estudios muestran que la enzima puede utilizar eficientemente ADP como sustrato para la generación de ADPG (Delmer, 1972; Silvius and Snyder, 1979; Pozueta-Romero et al., 1991). En este trabajo se estudió también la capacidad de las diferentes isoformas de utilizar UDP frente a ADP en sentido de degradación de sacarosa y de UDPG frente a ADPG en sentido de síntesis de sacarosa. Para ello se realizaron ensayos de actividad SUS utilizando UDP o ADP y UDPG o ADPG como sustrato en sentido de degradación y síntesis, respectivamente (Figura III.3.15). Las tres isoformas presentaron una notable preferencia por el uso de UDP y UDPG en ambas direcciones. 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 0 50 100 150 200 Actividad SUS (% Máximo) Fructosa (mM) OsSUS1 OsSUS2 OsSUS3 III. RESULTADOS 139 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 OsSUS1 OsSUS2 OsSUS3 Actividad SUS (U/mg prot) UDPG ADPG Figura III.3.15. Utilización de ADP, UDP, ADPG y UDPG como sustrato por las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 Se compararon las actividades de las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 utilizando UDP o ADP como sustrato en la reacción de degradación de sacarosa (A) y UDPG o ADPG en la reacción de síntesis de sacarosa (B). Para ello se llevaron a cabo ensayos de actividad con 1 µM de enzima en una mezcla de ensayo que contenía MES/KOH 50 mM pH 6,5 (para OsSUS1) o HEPES/KOH 50 mM pH 7,0 (para OsSUS2 y OsSUS3), EDTA 2 mM, sacarosa 200 mM y UDP o ADP 2 mM para la reacción en sentido de degradación de sacarosa; y HEPES/KOH 50 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, fructosa 10 mM y UDPG o ADPG 2 mM para la reacción en sentido de síntesis de sacarosa. III.3.6.1. Estudio de la regulación redox de la actividad SUS Estudios anteriores habían puesto de manifiesto que la actividad SUS puede ser regulada por agentes redox y que dicha modificación de la actividad implica la formación de puentes disulfuros (Pontis et al., 1981; Rohrig et al., 2004; Marino et al., 2008). Los estudios realizados por Röhrig y colaboradores (2004) en soja, identificaron el residuo de cisteína C264 como uno de las 9 cisteínas presentes en la SUS implicado en el control redox de su actividad. La cisteína 264 está conservada en la secuencia de la enzima de muchas especies vegetales como alfalfa, judía, uva, melón, naranja, guisante, patata y tomate, mientras que no está presente en las de cebada, zanahoria y tabaco (Rohrig et al., 2004). En estas especies y otros cereales como son el arroz, trigo, maíz o el sorgo, la ausencia de este residuo C264 (Figura III.3.16) indica la existencia de mecanismos alternativos de regulación de la actividad SUS. 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 OsSUS1 OsSUS2 OsSUS3 Actividad SUS (U/mg prot) UDP ADP A B III. RESULTADOS 140 Figura III.3.16. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SUS de plantas El alineamiento de las secuencias de aminoácidos se realizó mediante CLUSTALW utilizando el programa BioEdit. Las secuencias de SUS de Soja, Arabidopsis, Patata, Maíz, Arroz y Cebada se obtuvieron de la base de datos GenBank con los números de acceso NP_001237525.1, NP_197583.1, CAD61188.1, AAA68209.1, AAK52129.1 y CAA75793.1 respectivamente. En rojo se señalan las cisteínas conservadas, en verde las semi-conservadas, en amarillo las conservadas en cereales y en azul las conservadas solo en especies no cereales. Soja --MATDR--LTRVHSLRERLDETLTANRNEILALLSRIEAKGKGILQHHQVIAEF-EEIPEENRQKLTDGAFGEVLRSTQEAIVLPPWVA 85 Arabidopsis --MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQIIAEF-EALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVA 87 Patata ----MAERVLTRVHSLRERVDATLAAHRNEILLFLSRIESHGKGILKPHELLAEF-DAIRQDDKNKLNEHAFEELLKSTQEAIVLPPWVA 85 Maiz MGEGAGDRVLSRLHSVRERIGDSLSAHPNELVAVFTRLKNLGKGMLQPHQIIAEYNNAIPEAEREKLKDGAFEDVLRAAQEAIVIPPWVA 90 Arroz MGEAAGDRVLSRLHSVRERIGDSLSAHPNELVAVFTRLVNLGKGMLQAHQIIAEYNNAISEADREKLKDGAFEDVLRSAQEGIVISPWVA 90 Cebada MGETAGERALSRVHSVRERIGHSLSAHTNELVAVFSRLVNQGKGMLQPHQITAEYNAAIPEAEREKLKNTPFEDLLRGAQEAIVIPPWVA 90 Consensus ::*:** ***:. :* :. **:: .::*: ***:*: ::: **: : : ::** .* ::*:.:**.**:.**** Soja LAVRPRPGVWEYLRVNVHALVVEELQPAEYLHFKEELVDGSSNGNFVLELDFEPFNAAFPRPTLNKSIGNGVQFLNRHLSAKLFHDKESL 175 Arabidopsis LAVRPRPGVWEYLRVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPTLHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESL 177 Patata LAIRLRPGVWEYIRVNVNALVVEELSVPEYLQFKEELVDGASNGNFVLELDFEPFTASFPKPTLTKSIGNGVEFLNRHLSAKMFHDKESM 175 Maiz LAIRPRPGVWEYVRVNVSELAVEELRVPEYLQFKEQLVEEGPNNNFVLELDFEPFNASFPRPSLSKSIGNGVQFLNRHLSSKLFHDKESM 180 Arroz LAIRPRPGVWEYVRVNVSELAVELLTVPEYLQFKEQLVEEGTNNNFVLELDFEPFNASFPRPSLSKSIGNGVQFLNRHLSSKLFHDKESM 180 Cebada LAIRPRPGVWEYVRVNVSELGVEELSVLRYLQFKEQLANGRTDNNFVLELDFGPFNASFPRPSLSKSIGNGVQFLNRHLSSKLFHDKESM 180 Consensus **:* *******:***: * ** * .:*:***:*.: :.**.***** **.*::*:*:* * *****:*******:*:******: 125 Soja HPLLEFLRLHSVKGKTLMLNDRIQNPDALQHVLRKAEEYLGTVPPETPYSEFEHKFQEIGLERGWGDNAERVLESIQLLLDLLEAPDPCT 265 Arabidopsis LPLLKFLRLHSHQGKNLMLSEKIQNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVLDMIRLLLDLLEAPDPCT 267 Patata TPLLEFLRAHHYKGKTMMLNDRIQNSNTLQNVLRKAEEYLIMLSPDTPYFEFEHKFQEIGLEKGWGDTAERVLEMVCMLLDLLEAPDSCT 265 Maiz YPLLNFLRAHNYKGMTMMLNDRIRSLSALQGALRKAEEHLSTLQADTPYSEFHHRFQELGLEKGWGDCAKRAQETIHLLLDLLEAPDPST 270 Arroz YPLLNFLRAHNYKGMTMMLNDRIRSLSALQGALRKAEEHLSGLSADTPYSEFHHRFQELGLEKGWGDCAKRSQETIHLLLDLLEAPDPST 270 Cebada YPLLNFLRAHNYKGMAMMLNDRIRSLGTLQGALRKAETHLSGLPADTPYSEFHHRFQELGLEKGWGDCAQRASETIHLLLDLLEAPDPSS 270 Consensus ***:*** * :* :**.::*:. .:** .***** :* : .:* * **. :*:*:***:**** *:* : : :*********..: Soja LETFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALENEMLHRIKQQGLDIVPRILIITRLLPDAVGTTCGQRLEKVF 355 Arabidopsis LETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCGERLERVY 357 Patata LEKFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQENVLGYPDTGGQVVYILDQVPALEREMLKRIKEQGLDIIPRILIVTRLLPDAVGTTCGQRIEKVY 355 Maiz LEKFLGTIPMVFNVVILSPHGYFAQANVLGYPDTGGQVVYILDQVRAMENEMLLRIKQCGLDITPKILIVTRLLPDATGTTCGQRLEKVL 360 Arroz LEKFLGTIPMVFNVVIMSPHGYFAQANVLGYPDTGGQVVYILDQVRAMENEMLLRIKQQGLNITPRILIVTRLLPDATGTTCGQRLEKVL 360 Cebada LEKFLGTIPMVFNVVILSPHGYFAQANVLGYPDTGGQVVYILDQVRAMENEMLLRIKQQGLDITPKILIVTRMLPDAHGTTCGQRLEKVL 360 Consensus **.*** :********:******** ******************* *:* *** ***: **:* *:***:**:**** *****:*:*:* 267 Soja GTEHSHILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDVAHELAKELQGKPDLIVGNYSDGNIVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPE 445 Arabidopsis DSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVELSKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPD 447 Patata GAEHSHILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYMETFIEDVAKEISAELQAKPDLIIGNYSEGNLAASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPD 445 Maiz GTEHCHILRVPFRTENGIVRKWISRFEVWPYLETYTDDVAHEIAGELQANPDLIIGNYSDGNLVACLLAHKMGVTHCTIAHALEKTKYPN 450 Arroz GTEHTHILRVPFRTENGIVRKWISRFEVWPYLETFTDDVAHEIAGELQANPDLIIGNYSDGNLVACLLAHKMGVTHCTIAHALEKTKYPN 450 Cebada GTEHTHILRVPFKTEDGIVRKWISRFEVWPYLEAYTDDVAHEIAGELQANPDLIIGNYSDGNLVACLLAHKLGVTHGTIAHALEKTKYPN 450 Consensus .:*: .******:**.***************:*:: :*.* *:: **:.:****:****:**:.*.*****:***: ************: 345 Soja SDIYWKKLEERYHFSCQFTADLFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADQTIYFPHT 535 Arabidopsis SDIYWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYT 537 Patata SDIYWKKFDEKYHFSSQFTADLIAMNHTDFIITSTFQEIAGSKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGINVFDPKFNIVSPGADINLYFSYS 535 Maiz SDLYWKKFEDHYHFSCQFTTDLIAMNHADFIITSTFQEIAGNKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADLSIYFPYT 540 Arroz SDLYWKKFEDHYHFSCQFTTDLIAMNHADFIITSTFQEIAGNKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYS 540 Cebada SDLYWKKFEDHYHFSCQFTADLIAMNHADFIITSTFQEIAGKKDTVGQYESHMAFTMPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYT 540 Consensus **:****::::****.***:*::****:*************.*:******** ***:**********:************** .:**.:: 429 Soja ETSRRLTSFHPEIEELLYSSVENEEHICVLKDRSKPIIFTMARLDRVKNITGLVEWYGKNAKLRELVNLVVVAGDRRKESKDLEEKAEMK 625 Arabidopsis EEKRRLTKFHSEIEELLYSDVENKEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRLRELANLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMK 627 Patata ETEKRLTAFHPEIDELLYSDVENDEHLCVLKDRTKPILFTMARLDRVKNLTGLVEWYAKNPRLRGLVNLVVVGGDRRKESKDLEEQAEMK 625 Maiz ESHKRLTSLHPEIEELLYSQTENTEHKFVLNDRNKPIIFSMARLDRVKNLTGLVELYGRNKRLQELVNLVVVCGDHGNPSKDKEEQAEFK 630 Arroz ESRKRLTSLHPEIEELLYSEVDNNEHKFMLKDRNKPIIFSMARLDRVKNLTGLVELYGRNPRLQELVNLVVVCGDHGNPSKDKEEQAEFK 630 Cebada EQQKRLTSLHTEIEELLFSDVENAEHKFVLKDKKKPIIFSMARLDRVKNMTGLVEMYGRNPRLQELVNLVVVCGDHGKVSKDKEEQVEFK 630 Consensus * :*** :*.**:***:*..:* ** :*:*:.***:*:*********::**** *.:* :*: *.***** **: : *** **:.*:* 499 Soja KMYGLIETYKLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRVICDTRGAFVQPAVYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCNGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHG 715 Arabidopsis KMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMDRVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHG 717 Patata KMYELIETHNLNGQFRWISSQMNRVRNGELYRYIADTKGAFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATNHGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHG 715 Maiz KMFDLIEQYNLNGHIRWISAQMNRVRNGELYRYICDTKGAFVQPAFYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATAYGGPAEIIVHGVSGYHIDPYQG 720 Arroz KMFDLIEQYNLNGHIRWISAQMNRVRNGELYRYICDTKGAFVQPAFYEAFGLTVVESMTCGLPTFATAYGGPAEIIVNGVSGFHIDPYQG 720 Cebada KMFDLIEKYNLSGHIRWISAQMNRVRNGELYRYICDMKGAFVQAAFYEAFGLTVIEAMTCGLPTFATAYGGPAEIIVNGVSGYHIDPYQN 720 Consensus **: *** ::*.*::****:**:********* *.* :*****.*.********:*:********** ********:* **:*****:. 577 Soja DRAADLLVDFFEKCKLDPTHWDKISKAGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRRESRRYLEMFYALKYRKLAESVPLAAE 805 Arabidopsis DQAADTLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEARRYLEMFYALKYRPLAQAVPLAQD 807 Patata EQAADLLADFFEKCKKEPSHWETISTGGLKRIQEKYTWQIYSERLLTLAAVYGFWKHVSKLDRLEIRRYLEMFYALKYRKMAEAVPLAAE 805 Maiz DKASALLVDFFDKCQAEPSHWSKISQGGLQRIEEKYTWKLYSERLMTLTGVYGFWKYVSNLERRETRRYLEMLYALKYRTMASTVPVAVE 810 Arroz DKASALLVEFFEKCQEDPSHWTKISQGGLQRIEEKYTWKLYSERLMTLTGVYGFWKYVSNLERRETRRYLEMLYALKYRTMASTVPLAVE 810 Cebada DKASALLVDFFGKCQEDPSHWNKISQGGLQRIEEKYTWKLYSERLMTLSGVYGFWKYVSNLDRRETRRTLKCSMPSSTAKWLQLSHWLLR 810 Consensus ::*: *.:** **: :*:** ** .**:**:*****::**:**:**:.******:**:*:* * ** *: . . . 635 Soja ------------- 805 Arabidopsis D------------ 808 Patata ------------- 805 Maiz GEPSSK------- 816 Arroz GEPSNK------- 816 Cebada ARPRANDLSLPEK 823 Consensus III. RESULTADOS 141 Como en este trabajo se había identificado la SUS como proteína diana de NTRC en endospermo, se estudió la posibilidad de que las tres isoformas de SUS aquí analizadas estuvieran sometidas a regulación redox mediada por NTRC. Para ello se sometieron a las OsSUS purificadas a tratamientos con agentes oxidantes y reductores y se compararon sus actividades. La necesidad de utilizar agentes reductores en el proceso de purificación conllevaba la obtención de las proteínas en estado reducido, por ello se requería un tratamiento de oxidación de la proteína para comparar las actividades en ambos estados redox. Los ensayos de actividad se realizaron en sentido de degradación de sacarosa con las diferentes isoformas purificadas sin tratar y tras un tratamiento de oxidación con peróxido de hidrógeno (Figura III.3.17). Figura III.3.17. Efecto de agentes reductores u oxidantes sobre la actividad de las isoformas OsSUS1, OsSUS2 y OsSUS3 Se compararon las actividades de las isoformas OsSUS1 (A), OsSUS2 (B) y Os SUS3 (C) sin tratar (Sin Tto), tras un tratamiento con H 2 O 2 10 mM durante 30 min (H2O2) en condiciones control o tras un tratamiento con DTT 10 mM durante 10 min. La actividad se determinó en sentido de degradación en una mezcla de reacción que contenía MES/KOH 50 mM pH 6,5 (para OsSUS1) o HEPES/KOH 50 mM pH 7,0 (para OsSUS2 y OsSUS3), EDTA 2 mM, sacarosa 200 mM, UDP 2 mM y 1 µM de enzima. Los resultados se muestran como porcentaje de actividad respecto al valor obtenido para cada isoforma sin tratar en condiciones control. 0 20 40 60 80 100 120 Sin Tto 10 mM H2O2 Actividad SUS (% Control) Control DTT 0 20 40 60 80 100 120 Sin Tto 10 mM H2O2 Actividad SUS (% Control) Control DTT 0 20 40 60 80 100 120 Sin Tto 10 mM H2O2 Actividad SUS (% Control) Control DTT B A C III. RESULTADOS 142 Las actividades obtenidas bajo estas condiciones de ensayo, a las que denominamos ‘Control’, se compararon con las actividades de dichas isoformas tras un tratamiento reductor con DTT. El tratamiento con peróxido de hidrógeno provocó una disminución notable de la actividad de la isoforma OsSUS1 y, en menor medida, de OsSUS2 y OsSUS3. El tratamiento con DTT no alteró la actividad de las proteínas en ninguna de las dos condiciones ensayadas (sin tratamiento y tratadas con el agente oxidante) e incluso provocó una disminución leve de la actividad de la enzima sin tratar en las tres isoformas. III.3.8. Actividad sacarosa sintasa en endospermo de arroz. Regulación redox Comparado con el amplio conocimiento que existe sobre la regulación de la SUS a nivel transcripcional en respuesta a cambios ambientales, se conoce poco sobre la modulación de la actividad SUS en respuesta a estos cambios ambientales (Marino et al., 2008). Pontis y colaboradores en 1981 demostraron que la actividad SUS se modifica por la acción de agentes oxidorreductores y que, aunque aún no se ha descrito el mecanismo de regulación, podría estar basada en la oxidación/reducción reversible de grupos tioles (Pontis et al., 1981). En nódulos de leguminosas se demostró que el residuo de cisteína C264 de la SUS estaba implicado en el establecimiento de un puente disulfuro reversible con un péptido (MELCWLTTIHGS) derivado de un mRNA ENOD40 y que dicha interacción provocaba un incremento de su actividad enzimática en el sentido de degradación de la sacarosa (Rohrig et al., 2004). Posteriormente se demostró, también en nódulos de leguminosas, que la actividad SUS se inhibe ante la presencia de agentes oxidantes confirmando con ello la existencia de un control redox de su actividad (Marino et al., 2008). En este trabajo se ha identificado a la SUS como posible proteína diana de NTRC en endospermo de cereales, lo que sugiere que en este tejido la actividad SUS también podría estar sometida a regulación redox. Con el objetivo de estudiar la posibilidad de que la actividad SUS esté modulada por el estado redox, se realizaron ensayos del efecto de agentes oxidantes o reductores sobre la actividad SUS en extractos de endospermo de semillas de arroz en desarrollo (Figura III.3.18). En extractos de endospermo no se apreciaron cambios en la actividad SUS en respuesta a estos agentes oxidantes y/o reductores. Por el contrario, la actividad SUS de hoja se mostró sensible a la aplicación de un agente oxidante que provocó una severa disminución de la misma. Además, el tratamiento posterior con un agente reductor (DTT) no tuvo ningún efecto activador. El tratamiento de ambas muestras oxidadas con NTRC provocó en cambio una reducción de la actividad SUS, siendo especialmente drástica en el caso de la hoja. La actividad SUS de extractos sin tratar no se vio alterada en ninguno de los III. RESULTADOS 143 dos casos por el tratamiento reductor con DTT, indicando que la proteína estaría en la célula en un estado completamente reducido. Figura III.3.18. Efecto de agentes oxidantes y reductores sobre la actividad SUS de endospermo y hoja de arroz Se realizaron ensayos de actividad SUS en sentido de degradación de la sacarosa a partir de extractos proteicos (50 µL) de endospermo de semillas en desarrollo y hoja de arroz sometidos a diferentes tratamientos: Control, sin tratamiento previo; DTT, DTT 10 mM durante 10 min; H2O2, H2O2 10 mM durante 10 min; H2O2 + DTT, H2O2 10 mM durante 10 min seguido de DTT 10 mM durante 10 min; H2O2 + NTRC, H2O2 10 mM durante 10 min seguido de 10 µM NTRC y NADPH 250 µM durante 10 min. Para la reacción SUS se utilizó una mezcla de ensayo que contenía HEPES/KOH 50 mM (pH 7,0), EDTA 2 mM, UDP 2 mM y sacarosa 200 mM. Los resultados se muestran como porcentaje de actividad respecto al control en cada caso. 0 20 40 60 80 100 120 Endospermo Hoja Actividad SUS (% Control) Control DTT H2O2 H2O2 + DTT H2O2 + NTRC IV. DISCUSIÓN IV. DISCUSIÓN 145 La regulación redox, una modificación post-traduccional consistente en el intercambio disulfuro-ditiol de residuos de cisteína, es un mecanismo rápido y reversible que permite la adaptación del metabolismo a las condiciones ambientales y necesidades celulares. En este tipo de regulación las Trxs, proteínas de pequeño tamaño con dos cisteínas muy conservadas en su sitio activo, juegan un papel central ya que catalizan la reducción de puentes disulfuro de sus proteínas diana participando así en la regulación de su actividad. Como consecuencia de la catálisis, las dos cisteínas de las Trxs quedan oxidadas formando un puente disulfuro que ha de ser reducido para que se produzca un nuevo ciclo catalítico. Por tanto, la regulación redox requiere poder reductor, que es proporcionado en todos los organismos, desde bacterias a plantas y animales, por NADPH en una reacción catalizada por la enzima NTR. Las NTRs son flavoproteínas cuya familia génica está compuesta en plantas por tres genes: NtrA, NtrB y NtrC (Serrato et al., 2004). Los dos primeros codifican proteínas muy similares, NTRA y NTRB, de localización citosólica y mitocondrial, ambas muy abundantes en semillas de cereales (Jacquot et al., 1994; Laloi et al., 2001; Shahpiri et al., 2008). El tercer gen codifica NTRC, una NTR peculiar que posee un dominio Trx en el extremo C-terminal (Serrato et al., 2004; Moon et al., 2006). Inicialmente NTRC se describió como una enzima exclusiva de tejidos fotosintéticos y localización cloroplastídica; sin embargo, estudios recientes sobre el patrón de expresión del gen NtrC en Arabidopsis revelaron que se expresa tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y que la proteína se localiza en todo tipo de plastos (Kirchsteiger et al., 2012). En el cloroplasto NTRC participa en la destoxificación de peróxidos actuando como principal reductor fisiológico de 2-Cys Prxs (Moon et al., 2006; Perez-Ruiz et al., 2006; Alkhalfioui et al., 2007), sin embargo, cada vez son más las evidencias que demuestran que NTRC participa en la regulación redox de otros procesos como son la síntesis de almidón (Michalska et al., 2009), la síntesis de aminoácidos aromáticos (Lepisto et al., 2009) o la síntesis de clorofilas (Stenbaek and Jensen, 2010). El objetivo principal de este trabajo ha sido la identificación de procesos sometidos a regulación redox mediada por NTRC en tejidos heterotróficos de plantas de interés agronómico. Para ello nos hemos centrado en el estudio del patrón de expresión y la identificación de las funciones que lleva a cabo NTRC en el endospermo de semillas de cereales. IV. DISCUSIÓN 146 IV.1. El gen NtrC se expresa en endospermo de semillas de cereales dando lugar a una enzima con características peculiares NTRC está codificada por un gen de copia única que se encuentra exclusivamente en organismos fotosintéticos: plantas, algas y algunas cianobacterias (Pascual et al., 2010). En todos ellos, tanto la secuencia aminoacídica como la estructura bimodular de la proteína se encuentran altamente conservadas (Figura III.1.1). La estrecha relación filogenética encontrada entre las NTRC de plantas, y en particular de cereales, (Figura III.1.2) sugiere un comportamiento y regulación de la enzima similar en las diferentes especies. El primer objetivo que nos hemos planteado en este trabajo ha sido determinar el patrón de expresión del gen NtrC en semillas de cereales, en concreto arroz y trigo. Los experimentos de qPCR realizados con semillas en desarrollo de arroz y de trigo demostraron la expresión de NtrC en semillas de cereales, aunque, los niveles de transcrito durante todo el desarrollo de las semillas en ambos casos era notablemente inferior a los detectados en hoja (Figuras III.1.4.A y III.1.8.A, respectivamente). Estos datos de expresión concuerdan con los obtenidos en órganos heterotróficos en Arabidopsis, donde la expresión de NtrC es siempre inferior a la de órganos fotosintéticos (Kirchsteiger et al., 2012). Los análisis inmunológicos realizados revelaron la presencia de la proteína en semillas en desarrollo de arroz y de trigo (Figuras III.1.4.B y III.1.8.B, respectivamente), confirmando con ello la presencia de NTRC en un órgano heterotrófico diferente a los identificados hasta el momento (Kirchsteiger et al., 2012), las semillas de cereales. Estudios previos realizados tanto en arroz como en Arabidopsis han establecido que la NTRC del cloroplasto es una enzima bimodular compuesta por dos dominios, NTR y Trx (Serrato et al., 2004). De acuerdo con las secuencias de cDNA de NTRC de diferentes plantas, la proteína madura posee un peso molecular de 50-53 kDa. En concreto, en el caso del arroz la proteína identificada en tejidos fotosintéticos tiene un peso molecular de 51,5 kDa (Serrato et al., 2004), que ha sido confirmado por los análisis Western blot realizados en este trabajo (Figura III.1.4.B). Sin embargo, los análisis realizados con endospermo de semillas de arroz con el anticuerpo anti-NTRC identificaron una proteína con un tamaño de unos 90 kDa y la ausencia de la banda esperada, de 51,5 kDa, correspondiente a la enzima detectada en tejidos fotosintéticos. En este trabajo hemos llevado a cabo diversas aproximaciones para confirmar si esta proteína de mayor peso molecular era efectivamente una forma peculiar de NTRC. Estudios inmunológicos mostraron que esta proteína mantiene la estructura bimodular presentando un módulo NTR, reconocido por el anticuerpo anti-NTRB (Figura III.1.9), y un IV. DISCUSIÓN 147 módulo Trx, reconocido por el anticuerpo anti-NTRC que detecta específicamente este módulo de la proteína (Figura III.1.4.B). Los análisis realizados en presencia de agentes desnaturalizantes, como la urea, y condiciones reductoras permitieron descartar que esta banda se debiera a la formación de un complejo con otra proteína (Figura III.1.10). Además, análisis proteómicos de esta proteína mediante MALDI-TOF confirmaron que se trataba realmente de NTRC (Figura III.1.12). En conjunto estos resultados indican la existencia de una forma peculiar de NTRC exclusiva del endospermo de semillas de arroz, ausente en tejidos fotosintéticos donde los análisis inmunológicos sólo detectaron a NTRC con el tamaño convencional de 51,5 kDa. Esta forma peculiar de NTRC se detectó tanto en el desarrollo como en la germinación de las semillas (Figuras III.1.4.B y III.1.11). De hecho, si las muestras de endospermo de semillas conservan el pericarpo, que en las fases iniciales e intermedias del desarrollo es un tejido fotosintético, los análisis Western blot permitieron identificar ambas formas de NTRC, siendo la forma de 90 kDa la predominante (Figuras III.1.9 y III.1.10). Similares resultados se obtuvieron en semillas de trigo en las que se detectó una forma de NTRC en endospermo de mayor tamaño que la de hoja, si bien, en este cereal no se pudo definir con exactitud el tamaño de esta proteína por la aparición de más de una banda en los análisis Western blot. Habiéndose identificado formas peculiares de NTRC de mayor tamaño en dos especies diferentes de cereales podría considerarse, por tanto, como una NTRC característica del endospermo de semillas de cereales. Los estudios realizados en este trabajo sobre la nueva forma de NTRC de endospermo aportaron información relacionada con la estructura bimodular de la proteína, sin embargo no permitieron la identificación de la composición peptídica de la extensión de la proteína que da lugar a una forma de NTRC con un tamaño de unos 40 kDa mayor que la descrita hasta el momento. Dado que el genoma del arroz está completamente secuenciado y a pesar de que se ha descrito que el gen que codifica NTRC en arroz es de copia única (Serrato et al., 2004), se realizó una búsqueda exhaustiva, mediante comparación de secuencias, de un gen que codificase esta nueva forma de NTRC de mayor tamaño. Sin embargo de esta búsqueda no se obtuvieron resultados. Descartada la presencia de otro gen que codifique esta forma peculair de NTRC, se analizó la posibilidad de que esta proteína se generara por un mecanismo de procesamiento alternativo del mensajero en este tejido, que daría lugar a un transcrito de mayor tamaño. A favor de esta idea los análisis Northern blot identificaron una banda de mayor tamaño en endospermo, que estaba ausente en hoja (Figura III.1.14). Las distintas estrategias para identificar este mensajero específico de endospermo mostraron que el mensajero que se expresa en este tejido es idéntico al que se encuentra en hoja en sus