Procedimiento para la selección de levaduras superproductoras de aminoácidos

k 19 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 N.◦de publicaci´on: ES 2 073 357 k 21 N´ume o de solici ud: 9301641 k 51 In . Cl.6:C12M 1/36 k 12 PATENTEDEINVENCION B1 k 22 Fecha de p esen aci´on: 21.07.93 k 73 Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa Vice ec o ado de In es igaci´on C/ San Fe nando, 4 41004 Se illa, ES k 43 Fecha de publicaci´on de la solici ud: 01.08.95 Fecha de concesi´on: 29.01.96 k 72 In en o /es: Ma ´ın Fo ce, En ique y Ben´ı ez Fe nandez, Tah´ıa k 45 Fecha de anuncio de la concesi´on: 01.03.96 k 45 Fecha de publicaci´on del olle o de pa en e: 01.03.96 k 74 Agen e: No cons a k 54 T´ı ulo: P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as supe p oduc o as de amino´acidos. k 57 Resumen: P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as su- pe p oduc o as de amino´acidos en cul i o con inuo con olado po pH, aplicable en la indus ia alimen- a ia pa a p oduci biomasa con al o con enido en amino´acidos como suplemen o nu icional animal y humano, ca ac e izado po que la en ada de medio desde el anque de alimen aci´on (1) has a el an- que de cul i o (2) es ´a egulada po una bomba pe- is ´al ica (3) conec ada al pH-me o (4) que mide la acidez del medio de cul i o. El anque de alimen- aci´on con iene al as concen aciones de un an´alogo ´oxico del amino´acido que se desea supe p oduci . La en ada de medio esco en el anque de cul i o p o- oca el en enenamien o de la poblaci´on de le adu as, excep o aqu´ellas que supe p oduzcan el amino´acido en cues i´on, que se ´an las que c ezcan. Al c ece baja ´an el pH p o ocando una nue a en ada de me- dio con mayo es concen aciones del ´oxico (y po lo an o de p oducci´on de amino´acidos), has a que se alcance la concen aci´on m´axima que las le adu as puedan ole a . A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a ◦37.3.8 LP. Ven ade asc´ıculos: O icina Espa˜nola de Pa en es y Ma cas. C/Panam´a, 1 – 28036 Mad id ES 2 073 357 B1 1ES 2 073 357 B1 2 DESCRIPCION T´ı ulo P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as supe p oduc o as de amino´acidos. Obje o de la in encion La p esen e in enci´on se e ie e a un p ocedi- mien o pa a la selecci´on de le adu as supe p o- duc o as de de e minados amino´acidos en cul i o con ´ınuo con olado po pH. El p ocedimien o se puede u iliza pa a la p oducci´on de biomasa, a pa i de cepas indus iales de le adu as, con ele- ado con enido en de e minados amino´acidos, po ejemplo, aqu´ellos en los cuales son de ici a ias las die as de alimen aci´on animal y/o humana, a modo de suplemen o nu icional. Es ado de la ´ecnica La egulaci´on de la biosin esis de amino´acidos se ha es udiado u ilizando an´alogos ´oxicos pa a la selecci´on de mu an es con al e aciones en la u a de biosin esis (A in y Gan , 1983). Uno de los usos p ´ac icos del empleo de an´alogos ´oxicos es que los mu an es esis en es suelen se supe - p oduc o es del an´alogo na u al (Alix, 1982). Se han aislado mu an es de le adu as en cul i os dis- con inuos que son esis en es al an´alogo ´oxico hid oxino alina y p oducen en e 15 y 30 e- ces m´as eonina que la cepa sil es e (Ramos e al., 1991). La mu aci´on se asoci´oalap esencia de una de las enzimas en la u a de biosin esis de eonina, la aspa a o kinasa, insensible a e- p esi´on po eonina. Cuando el gen que codi ica es a enzima se in odujo en una cepa sil es e, po ingenie ´ıa gen´e ica, los ans o man es p o- duc´ıan en e 3 y 4 eces m´as eonina que la cepa sil es e (Ma ´ın-Rendon e al. 1993). Sin emba go, debido a nume osos e ec os ines- pec´ı icos p oducidos po el an´alogo ´oxico, la mayo ´ıa de los mu an es y ans o man es e- sis en es al ´oxico aislados c ecen peo que la cepa sil es e y exp esan muchos e ec os nega- i os: baja iabilidad, sensibilidad a empe a- u a, e c. (Ramos e al., 1991; Ma ´ın-Rendon e al., 1993). La selecci´on de mu an es capaces de esis i las mayo es concen aciones de an´alogos ´oxicos, supe p oduciendo las mayo es concen a- ciones de amino´acidos posibles, acumulando nu- me osas mu aciones y al mismo iempo c eciendo a elocidades simila es e incluso mayo es que las del ipo sil es e es ex emadamen e di ´ıcil. El aislamien o de ales mu an es equie e necesa ia- men e ´ecnicas de selecci´on en cul i o con inuo y du an e pe ´ıodos muy la gos, pa a que el o ga- nismo acumule aquellas mu aciones que le pe mi- an simul ´aneamen e supe p oduci amino´acidos y c ece a la m´axima elocidad. Desc ipci´on de la in encion El nue o p ocedimien o se basa, undamen- almen e, en la u ilizaci´on de un quimios a o como u bidos a o con olado po pH pa a la se- lecci´on de cepas de le adu as supe p oduc o as de amino´acidos, y en gene al pa a selecciona cepas cuya elocidad de o maci´on de p oduc o sea m´axima, siendo los p oduc os unci´on de la elocidad de c ecimien o, y siemp e que exis a un an´alogo ´oxico que pe mi a selecciona s´olo aquella acci´on de la poblaci´onquenoseen- enena po supe p oducci´on del co espondien e 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 compues o isiol´ogico. En el quimios a o con encional exis e un an- que de alimen aci´on con medio nu i i o que, a a ´es de una bomba pe is ´al ica egulada po el in es igado , pasa ´a al co espondien e anque de cul i o. Simul ´aneamen e y de o ma con inuada, po g a edad i ´an pasando medio de cul i o y c´elulas a un e ce anque de desecho. Cuando la en ada de nu ien es es muy len a o cuando es ´ap esen ealg´un compues o ´oxico, las c´elulas del cul i o c ecen muy len amen e, bien po que ago an ´apidamen e los nu ien es, de modo que el c ecimien o es muy len o (ya que la elocidad a la que las c´elulas c ecen y se di iden es ´a limi ada po la al a de nu ien es), o bien po que una acci´on impo an e de la poblaci´on es ´a mu iendo debido a la p esencia del com- pues o ´oxico. Si la elocidad de o maci´on de un p oduc o depende de la asa de c ecimien o, dicho p oduc o, po ejemplo amino´acidos, se o ma ´a muy len amen e, ya sea po que oda la poblaci´on i a e enado su c ecimien o po el nu ien e li- mi an e,opo quelap esenciadel ´oxico hace que s´olo una acci´on peque˜na de la poblaci´on, la que esis e al ´oxico po supe p oducci´on del an´alogo isiol´ogico, es ´e p oduciendo el compues o de in- e ´es. En casos l´ımi es es a p oducci´on puede se ce o. El quimios a o adicional iene un pH-me o que egula el pH del medio con dos bombas pe- is ´al icas que a˜naden sosa o ´acido cuando el pH es ´a po debajo o po encima de cie os l´ımi es ma cados po el in es igado . La egulaci´on del pH se hace necesa ia po que las le adu as, al c e- ce , ienden a acidi ica el medio, y una acidez ex- cesi a pod ´ıa hace que el cul i o deja a de c ece a´un con eniendo nu ien es en exceso. Es a acidi icaci´on del medio, po o a pa e, puede se ap o echada pa a la selecci´on de le a- du as supe p oduc o as de amino´acidos. El an- quedealimen aci´on (1) que apo a los nu ien- es es ´a suplemen ado con dosis al ´ısimas de un an´alogo ´oxico del amino´acido que in e esa su- pe p oduci . La llegada de nu ien es desde el anque de alimen aci´on has a el medio de cul i o (2) donde se encuen an las le adu as se hace a a ´es de una bomba pe is ´al ica (3) conec ada al pH-me o (4), de mane a que no unciona au- om´a icamen e de o ma con inua sino que se co- nec a y desconec a selec i amen e, dependiendo del pH del medio donde es ´an c eciendo las le a- du as y que es medido po el pH-me o a a ´es de una sonda (5). La medida del pH-me o a su ez depende de si las c´elulas es ´anonoc eciendo. La elocidad de en ada de nu ien es, y po lo an o del ´oxico, iene egulada po la elocidad de c e- cimien o de las c´elulas. Si, po ejemplo, se egula la bomba de mane a que se conec a a pH po de- bajo de 5 y se desconec a a pH supe io a 5.2, si las c´elulas es ´an c eciendo acidi ica ´an el medio a una elocidad p opo cional a la elocidad de c e- cimien o. Supongamos que hay en ada de medio de mane a que el pH del cul i o sube po encima de 5.2: la bomba en onces se desconec a y deja de en a medio. La en ada de medio con ´oxico ma a ´aalamayo ´ıa de la poblaci´on, y la acci´on de c´elulas que sob e i an po supe p oducci´on del amino´acido isiol´ogico se ´a la que c ece ´a aunque 2 3ES 2 073 357 B1 4 a da ´an en baja el pH. Cuando el pH baje po debajo de 5, la bomba ol e ´a a conec a se y a a˜nadi medio, aumen- ando la concen aci´on del ´oxico en el anque de cul i o donde se encuen an las c´elulas. Es e inc emen o conduci ´a a un aumen o de la asa de mue e, excep o en aquellas c´elulas que su- pe p oduzcan su icien e can idad del amino´acido isiol´ogico como pa a con a es a el e ec o del ´oxico. Nue os ciclos de c ecimien o y acidi i- caci´on i ´an aumen ando p og esi amen e la con- cen aci´on del ´oxico en el anque de cul i o y se- leccionando aquellas c´elulas que m´as amino´acido p oduzcan, has a alcanza la m´axima supe p o- ducci´on posible pa a el amino´acido en cues i´on. Las en ajas de es e p ocedimien o son las si- guien es: 1. Pe mi en ob ene supe p oduc o es de un amino´acido en pa icula , en unci´on del an´alogo ´oxico que se u ilice. 2. La elocidad de en ada del ´oxico iene egulada po la p opia elocidad de c eci- mien o del cul i o, al es a egulada dicha en ada po la elocidad de acidi icaci´on. 3. Al mismo iempo, la concen aci´on del ´o- xico pe mi e la selecci´on de s´olo aquella acci´on de la poblaci´on esis en e po su- pe p oducci´on del amino´acido isiol´ogico. 4. A lo la go del iempo, el aumen o de la con- cen aci´on del ´oxico pe mi e el aislamien o de cepas cada ez m´as supe p oduc o as. 5. Al au o egula se la en ada de medio po la capacidad de c ece de las c´elulas, el p oceso pe mi e aisla las cepas capaces de m´axima supe p oducci´on, c eciendo adem´as a la m´axima elocidad. Caso p ´ac ico: ob enci´on de cepas de le adu as supe p oduc o as de me ionina y eonina Como caso p ´ac ico de u ilidad del p ocedi- mien o, que debe en ende se no iene ca ´ac e li- mi a i o de la in enci´on, se desc ibe la aplicaci´on del quimios a o con olado po pH y los an´alogos ´oxicos p esen es en el anque de alimen aci´on pa a el aislamien o de cepas supe p oduc o as de me ionina y eonina. Un cul i o con inuo con olado po pH se u iliz´o pa a selecciona aquellas le adu as que e an mas ole an es a e ionina, an´alogo ´oxico 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 de la me ionina, y a hid oxino alina, an´alogo ´oxico de la eonina. Es as le adu as ole an- es e an supe p oduc o as de los co espondien es amino´acidos me ionina y eonina. El anque de alimen aci´on se llen´oconmediom´ınimo de le a- du as (SD) y p olina como uen e de ni ´ogeno, y se suplemen ´o con e ionina has a 10 mM, o con hid oxino alina has a 5mM. El anque de cul- i o se inocul´o en ambos casos con 15 ml de un cul i o en ase es aciona ia (5·108c´elulas/ml) de una cepa indus ial de le adu a, u ilizable pa a suplemen o nu icional animal y humano. Al c e- ce , las c´elulas acidi ica on el medio, p o ocando la conexi´on de la bomba pe is ´al ica al baja el pH y dando luga al paso de medio desde el an- que de alimen aci´on al de cul i o. Cada ez que es a ope aci´on se epe ia y pasaba medio, aumen- aba la concen aci´on del ´oxico e ionina o hid o- xino alina en el anque de cul i o. La eloci- dad de en ada del medio en´ıa con olada po la elocidad de acidi icaci´on del cul i o, que a su ez depend´ıa de la capacidad de esis encia de las c´elulas al an´alogo ´oxico del medio, es deci , de la capacidad de supe p oduci el amino´acido isiol´ogico. Aquellas c´elulas poco esis en es al an´alogo ´oxico, no supe p oduc o as e incapaces de c ece , an quedando eliminadas del medio de cul i o, mien as que las m´as esis en es y supe - p oduc o as c ecen m´as ´apidamen e, y an en i- queciendo el cul i o. A lo la go de odo el p o- cedimien o, el medio de cul i o a ´ıa desde no ene an´alogo ´oxico, e ionina o hid oxino alina, has a ene la concen aci´on m´axima que las ce- pas m´as esis en es son capaces de ole a , pues o que mien as haya c´elulas capaces de c ece hab ´a acidi icaci´on y, po lo an o, en ada de medio con an´alogo ´oxico. Cuando las c´elulas m´as esis en- es ya no c ecen y consecuen emen e no acidi ican, no hay m´as en ada de medio po que la bomba no se conec a, con lo que se ha conseguido se- lecciona , de en e una g an poblaci´on de le adu- as, aquellas c´elulas m´as esis en es a los an´alogos ´oxicos, que c ecen m´as ´apidamen e y supe p o- ducen amino´acidos. Po es e p ocedimien o se han seleccionado dos cepas, una denominada S. C MBI, y o a de- nominada S.C. MB2, capaces de p oduci 160 e- ces m´as me ionina y 40 eces m´as eonina, es- pec i amen e, que la cepa de pa ida. Es as cepas han sido deposi adas en la Colecci´on Espa˜nola de Cul i os Tipo, es ando el Depa amen o de Gen´e ica de la Uni e sidad de Se illa en posesi´on de los co espondien es ce i icados de iabilidad. 3 5ES 2 073 357 B1 6 REIVINDICACIONES 1. P ocedimien o pa a la selecci´on de le a- du as supe p oduc o as de amino´acidos en cul- i o con inuo con olado po pH, aplicable pa a la p oducci´on de biomasa con al o con enido en amino´acidos como suplemen o nu icional animal y humano, ca ac e izado po que la en ada de medio desde el anque de alimen aci´on has a el anque de cul i o es ´a egulada po una bomba pe is ´al ica conec ada al pH-me o que mide la acidez del medio de cul i o. El anque de ali- men aci´on con iene al as concen aciones de un an´alogo ´oxico del amino´acido que se desea supe - p oduci , de o ma que la en ada de medio esco en el anque de cul i o p o oca el en enenamien o de la poblaci´on de c´elulas, excep o aqu´ellas que p oduzcan el amino´acido en cues i´on, que se ´an 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 las que c ezcan, lo cual p o oca ´a una acidi i- caci´on del medio, bajada de pH, pues a en un- cionamien o de la bomba pe is ´al ica y nue a en- ada de medio con ´oxico, y as´ı sucesi amen e, has a que se alcance la concen aci´on m´axima que las le adu as puedan ole a . 2. P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu- as, seg´un ei indicaci´on 1a ¯, que pe mi e ob e- ne cepas supe p oduc o as de un amino´acido en pa icula , en unci´on del an´alogo ´oxico que se u ilice. 3. P ocedimien o pa a la selecci´on de le a- du as, seg´un ei indicaciones 1a ¯y2 a ¯,enelque la elocidad de en ada del ´oxico iene egulada po la p opia elocidad de c ecimien o del cul i o, lo cual pe mi e aisla aquellas cepas que, adem´as de se capaces de la m´axima supe p oducci´on, lo hacen c eciendo a la m´axima elocidad. 4 ES 2 073 357 B1 5 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 ES 2 073 357 k 21 N.◦solici ud: 9301641 k 22 Fecha de p esen aci´on de la solici ud: 21.07.93 k 32 Fecha de p io idad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 51 In . Cl.6:C12M 1/36 DOCUMENTOS RELEVANTES Ca ego ´ıa Documen os ci ados Rei indicaciones a ec adas AEP-0065895-A (L’AIR LIQUIDE, SOCIETE ANONYME POUR L’ETUDE ET L’EXPLOITATION DES PROCEDES GEORGES CLAUDE) 01.12.82 AUS-3472765-A (WILLIAM E. BUDD e al.) 14.10.69 Ca ego ´ıa de los documen os ci ados X: Y: A: de pa icula ele ancia de pa icula ele ancia combinado con o o/s de la misma ca ego ´ıa e leja el es ado de la ´ecnica O: P: E: e e ido a di ulgaci´on no esc i a publicado en e la echa de p io idad y la de p esen aci´on de la solici ud documen o an e io , pe o publicado despu´es de la echa de p esen aci´on de la solici ud El p esen e in o me ha sido ealizado ×pa a odas las ei indicaciones pa a las ei indicaciones n◦: Fecha de ealizaci´on del in o me Examinado P´agina 23.06.95 M. Yba a Fe n´andez 1/1