Reposicionamiento de fármacos para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gramnegativos multirresistentes

TESIS DOCTORAL Reposicionamiento de fármacos para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gramnegativos multirresistentes Andrea Miró Canturri Sevilla 2020 Director 1: Jerónimo Pachón Díaz Director 2: Younes Smani Programa de Doctorado de Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Departamento de Medicina Universidad de Sevilla Departamento de Medicina El Dr. Jerónimo Pachón Díaz, Profesor Emérito de Medicina de la Universidad de Sevilla, como Director y Tutor de la Tesis Doctoral y el Dr. Younes Smani, investigador del programa Miguel Servet del Instituto de Salud Carlos III, como Director de la Tesis Doctoral, CERTIFICAN: Que la Tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla que lleva por título “Reposicionamiento de fármacos para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gramnegativos multirresistentes” ha sido realizada por la Graduada Andrea Miró Canturri bajo nuestra supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Para que conste a los efectos oportunos, expiden la presente certificación en Sevilla, 22 de mayo de 2020. Jerónimo Pachón Díaz Younes Smani Director y Tutor Director FINANCIACIÓN TESIS DOCTORAL Programa Miguel Servet del Instituto de Salud Carlos III y Ministerio de Economía y Competitividad. Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III. Proyecto de Investigación en Salud PI16/01378. “Eficacia terapéutica de la oxiclozanida como terapia combinada con colistina in vitro y en modelos experimentales murinos de infecciones graves”. PRODUCCIÓN CIENTÍFICA RELACIONADA CON LA TESIS DOCTORAL Publicaciones 1. Miró-Canturri A*, Ayerbe-Algaba R*, Smani Y. Drug repurposing for the treatment of bacterial and fungal infections. Front. Microbiol. 2019; 10: 41. * Los autores han contribuido de igual manera 2. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Rodríguez-Villodres Á, Pachón J, Smani Y. Repositioning rafoxanide drug to treat Gram-negative bacilli infections. J Antimicrob Chemother. 2020 Apr 2:pii:dkaa103. doi: 10.1093/jac/dkaa103 [ahead of print]. Comunicaciones en congresos 1. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Parra-Millán R, Pachón-Ibáñez ME, Pachón J, Smani Y. In vitro activity of rafoxanide in combination with colistin against colistin-susceptible and colistin-resistant Acinetobacter baumannii. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. Sevilla, España 2017. 2. Ayerbe-Algaba R*, Miró-Canturri A*, Pachón-Ibáñez ME, Pachón J, Smani Y. Tamoxifen as repurposing drug for Acinetobacter baumannii infections therapy: in vitro and in vivo approaches. 11th International Symposium on the Biology of Acinetobacter. Sevilla, España 2017. * Los autores han contribuido de igual manera 3. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Pachón-Ibáñez ME, Pachón J, Smani Y. In vitro and in vivo activity of rafoxanide in combination with colistin against Acinetobacter baumannii infection. 29th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Amsterdam, Holanda 2019. 4. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Vila-Domínguez A, Pachón-Ibáñez ME, Jiménez-Mejías ME, Pachón J, Smani Y. Tamoxifen metabolites as repurposing drug against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. 12th International Symposium on the Biology of Acinetobacter, Frankfurt, Alemania 2019. 5. Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Pachón-Ibáñez ME, del Toro R, Pachón J, Smani Y. Reposicionamiento del tamoxifeno para combatir infecciones causadas por bacilos gramnegativos multirresistentes. XII Congreso de la Sociedad Andaluza de Enfermedades Infecciosas. Sevilla, España 2019. Otras publicaciones relacionadas con la línea de investigación 1. Ayerbe-Algaba R, Gil-Marqués ML, Miró-Canturri A, Parra-Millán R, Pachón- Ibáñez ME, Jiménez-Mejías ME, Pachón J, Smani Y. The anthelmintic oxyclozanide restores the colistin activity in colistin-resistant Gram-negative bacilli. Int. J. Antimicrob Agents 2019; 54(4): 507-512. 2. Vila-Domínguez A*, Ayerbe-Algaba R*, Miró-Canturri A, Rodríguez-Villodres Á, Smani Y. Antibacterial activity of colloidal silver against Gram-negative and Gram-positive bacteria. Antibiotics (Basel) 2020; 9(1): 36. * Los autores han contribuido de igual manera 3. Gil-Marqués ML, Smani Y, Labrador-Herrera G, Miró-Canturri A, Pachón J, Pachón-Ibáñez ME. Role of PstS on the pathogenesis of Acinetobacter baumannii under microaerobiosis and normoxia. J. Infect. Dis. 2020 Apr 23:jiaa201. doi: 10.1093/infdis/jiaa201 [ahead of print]. ÍNDICE DE CONTENIDOS 1 ABREVIACIONES 4 LISTAS DE FIGURAS & TABLAS 8 RESUMEN 10 I. INTRODUCCIÓN 13 1. Situación actual de la resistencia antimicrobiana 14 2. Infecciones asociadas a la atención sanitaria 19 3. Bacilos gramnegativos (BGN): Epidemiología, resistencia antimicrobiana, opciones terapéuticas y virulencia 20 3.1 Acinetobacter baumannii 21 3.1.1 Epidemiología 21 3.1.2 Mecanismos de resistencia antimicrobiana 23 3.1.2.1 Enzimas β-lactamasas 24 3.1.2.2 Enzimas modificadoras de aminoglucósidos 25 3.1.2.3 Bombas de flujo 25 3.1.2.4 Defectos en la permeabilidad 26 3.1.2.5 Modificación de la diana 26 3.1.3 Tratamientos actuales 27 3.2 Pseudomonas aeruginosa 29 3.2.1 Epidemiología 29 3.2.2 Mecanismos de resistencia antimicrobiana 31 3.2.2.1 Mecanismos de resistencia intrínsecos 31 3.2.2.2 Mecanismos de resistencia adquiridos 32 3.2.2.3 Mecanismos de resistencia adaptativos 34 3.2.3 Tratamientos actuales 35 3.3 Enterobacterales: Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. 37 3.3.1 Epidemiología 37 3.3.2 Mecanismos de resistencia antimicrobiana 39 3.3.2.1 Enzimas β-lactamasas 39 3.3.2.2 Enzimas modificadoras de aminoglucósidos 40 3.3.2.3 Bombas de flujo 40 3.3.2.4 Defectos en la permeabilidad 40 3.3.2.5 Modificación de la diana 41 3.3.3 Tratamientos actuales 41 3.4 Factores de virulencia de los BGN 43 ÍNDICE DE CONTENIDOS 2 3.4.1 Componentes de la membrana externa 43 3.4.2 Fosfolipasas 45 3.4.3 Sistemas de secreción 45 3.4.4 Toxinas 46 3.4.5 Vesículas de la membrana externa 46 3.4.6 Sideróforos (quelantes de metales) 47 3.4.7 Motilidad 47 3.4.8 Formación de biofilm 48 3.4.9 Quorum sensing 49 4. Sistema inmune e infección 52 4.1 Papel de la inmunidad innata y adaptativa 52 4.2 Células de la inmunidad innata 54 4.2.1 Neutrófilos 54 4.2.2 Macrófagos 54 4.2.3 Monocitos 55 4.2.3.1 Monocitos inflamatorios Ly6Chi 55 4.2.3.2 Monocitos residentes Ly6Clow 55 4.2.3.3 Monocitos intermedios Ly6Cint 56 4.2.4 Células dendríticas 56 4.2.4.1 Células dendríticas convencionales 56 4.2.4.2 Células dendríticas plasmocitoides 57 4.2.4.3 Células dendríticas derivadas de monocitos 57 4.2.4.4 Células de Langerhans 57 4.3 Maduración y migración de las células de la inmunidad innata 59 4.3.1 Maduración en la médula ósea 59 4.3.2 Migración y quimioquinas responsables 59 4.4 Respuesta inmune durante la infección bacteriana 61 5. Nuevas terapias para tratar las infecciones por BGN 62 5.1 Antiguos antibióticos 64 5.2 Terapia de fagos 65 5.3 Inhibidores de factores de virulencia 65 5.3.1 Inhibidores de la adherencia bacteriana 66 5.3.2 Inhibidores del quorum sensing 66 5.3.3 Inhibidores de los sistemas de secreción 67 ÍNDICE DE CONTENIDOS 3 5.3.4 Inhibidores de toxinas 67 5.4 Moléculas con acción frente al sistema inmune 68 5.4.1 Moléculas moduladoras de la respuesta inmune 68 5.4.2 Péptidos antimicrobianos 68 5.5 Anticuerpos y vacunas 69 5.6 Reposicionamiento de fármacos 69 5.6.1 Artículo 1. Drug repurposing for the treatment of bacterial and fungal infections 72 II. FUNDAMENTOS 85 III. HIPÓTESIS 87 IV. OBJETIVOS 89 V. RESULTADOS 92 1. Capítulo I. Reposicionamiento del tamoxifeno como estrategia antimicrobiana 93 1.1 Artículo 2. Tamoxifen repurposing to combat infections by multidrug-resistant Gram-negative bacilli 94 2. Capítulo II. Reposicionamiento de la rafoxanida como tratamiento antimicrobiano 132 2.1 Artículo 3. Repositioning rafoxanide to treat Gram-negative bacilli infections 133 VI. DISCUSIÓN GENERAL 161 VII. CONCLUSIONES 176 VIII. BIBLIOGRAFÍA 179 ABREVIACIONES 4 5-FU: 5-fluorouracilo AAC: Acetiltransferasas modificadoras de aminoglucósidos ABC: Familia casete de unión a ATP (bombas de flujo) AFLP: Identificación de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados AHL: Lectonas acil-hemolisinas (autoinductores del quorum sensing) AIP: oligopéptidos autoinductores (quorum sensing) AMR: Resistencia antimicrobiana ANT: Nucleotidiltransferasas modificadoras de aminoglucósidos APC: Células presentadoras de antígeno APH: Fosfotransferasas modificadoras de aminoglucósidos Bap: Proteína asociada a biofilm de A. baumannii BGN: Bacilos gramnegativos BLEE: Betalactamasas de espectro extendido BL/IBL: Beta-lactámicos/Inhibidores de beta-lactamasas CAZ/AVI: Ceftazidima/Avibactam CC: Complejos clonales CCR2: Receptor de quimioquina CC2 o MCP-1 CD4: Linfocitos T cooperadores CD8: Linfocitos T citotóxicos CDC: Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos cDC: Célula dendrítica convencional CMI: Concentración mínima inhibitoria CMS: Colistimetato de sodio cMoP: Progenitor común de monocitos CNF-1: Factor citotóxico necrotizante 1 CX3CR1: Receptor de la quimioquina CX3C1 DALY: Años de vida ajustados por discapacidad DAMPs: Patrones moleculares asociados al daño DC: Célula dendrítica DDD: Dosis diarias definidas DMT: Familia de transporte de metabolitos (bombas de flujo) EARS-Net: Red Europea de Vigilancia de la Resistencia Antimicrobiana ECAD: Escherichia coli de adherencia difusa ECDC: Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades RESUMEN 11 El aumento de bacterias multirresistentes y la dificultad de encontrar un tratamiento eficaz para este tipo de infecciones, supone un problema a nivel mundial. Entre los patógenos más destacados se encuentran los bacilos gramnegativos (BGN), tales como Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, y Enterobacterales como Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, para los cuales la investigación y el desarrollo de nuevos antimicrobianos es una prioridad crítica. Debido a que el desarrollo de nuevos antibióticos supone un elevado coste económico, de tiempo empleado y poca rentabilidad a causa de la rápida aparición de resistencias, la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas se encuentra en auge. Esta Tesis Doctoral está basada en el uso de un nuevo enfoque conocido como “Drug repurposing” o reposicionamiento de fármacos, que consiste en la búsqueda de nuevas indicaciones para fármacos que se usan en la práctica clínica y en veterinaria. El objetivo principal fue el estudio de dos fármacos distintos: i) el tamoxifeno, anticancerígeno usado para el tratamiento de cáncer de mama y ii) la rafoxanida, antihelmíntico usado en veterinaria para tratar infecciones por trematodos. Por un lado, se demostró que la monoterapia con tamoxifeno presentó eficacia in vivo en un modelo de sepsis peritoneal murino por A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli usando ratones inmunocompetentes e inmunodeprimidos. Esta actividad es debida a la reducción de la liberación de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1, del inglés monocyte chemoattractant protein-1), que en última instancia produjo una disminución de la migración de células de la inmunidad innata desde la médula ósea hasta el torrente sanguíneo, reduciendo la inflamación exacerbada producida en este modelo. Además, la modificación de la respuesta inmune del huésped va unida a la actividad antimicrobiana que presentaron los metabolitos del tamoxifeno: n-desmetiltamoxifeno, endoxifeno y 4- hidroxitamoxifeno, frente a las cepas bacterianas de estudio. Por otra parte, se demostró que la rafoxanida potenció el efecto de la colistina en cepas sensibles y resistentes a colistina de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae. La sinergia observada es debida posiblemente al aumento de la permeabilidad de membrana y al aumento de cargas negativas en la superficie de la misma, potenciando la afinidad de la colistina y restaurando su actividad. Además, la rafoxanida también presentó eficacia terapéutica tanto en monoterapia como en terapia combinada con colistina en un modelo de sepsis peritoneal murino causado por cepas resistentes a colistina de los tres patógenos. En conjunto, estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el uso del anticancerígeno tamoxifeno y el antihelmíntico rafoxanida en monoterapia o en RESUMEN 12 combinación con colistina, así como sobre el mecanismo de acción de ambos fármacos. Por ello, esta Tesis Doctoral proporciona dos nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de infecciones causadas por BGN multirresistentes. 13 I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 14 1. Situación actual de la resistencia antimicrobiana La resistencia antimicrobiana se ha convertido en un desafío mundial debido a la alta morbilidad y mortalidad causada por bacterias que presentan resistencia a la gran mayoría de antimicrobianos disponibles en el mercado (1). La Organización Mundial de la Salud (OMS), y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, del inglés Centers for Diseases Control and Prevention) ya han declarado la resistencia antimicrobiana como un problema de carácter global. Tan sólo en los EE.UU., se registran más de 2,8 millones de infecciones por bacterias multirresistentes y más de 35.000 muertes al año (2). En los países pertenecientes a la región UE/AEE (para Unión Europea/Área Económica Europea) se producen más de 670.000 infecciones causadas por bacterias multirresistentes y alrededor de 33.000 muertes como consecuencia directa de este tipo de infecciones (3). A nivel mundial, el número de muertes asciende a 700.000, según datos aportados por la OMS (4). Esto es debido al número creciente de bacterias multirresistentes que producen infecciones graves y que anteriormente eran fácilmente tratables, así como la rápida expansión de las mismas a lo largo del globo (4,5). Entre las enfermedades más frecuentes, encontramos la neumonía comunitaria y nosocomial, infecciones del tracto urinario, cistitis, bacteriemias e infecciones adquiridas en el ámbito hospitalario como infecciones relacionadas con cateterismos o post-quirúrgicas (6,7). Datos del Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (ECDC; para European Center for Disease Prevention and Control) recogidos por la Red Europea de Vigilancia de Resistencia Antimicrobiana (EARS-Net para European Antimicrobial Resistance Surveillance Network) muestran un aumento de casos y muertes causadas por microorganismos multirresistentes en Europa en los últimos años (Figura 1) (3). Según EARS-Net los porcentajes de resistencia antimicrobiana varían en función del microorganismo, de la región geográfica y del antimicrobiano, hecho que refleja diferencias en la práctica del uso de los antibióticos dependiendo del país (8). En especial, la situación de los BGN es realmente preocupante. Actualmente, alrededor de la mitad (56,4%) de los aislados de Acinetobacter spp. informados a EARS-Net en 2018 por parte de los países pertenecientes a la UE/AEE, fueron resistentes a, al menos, una de las familias de antimicrobianos bajo vigilancia regular (fluoroquinolonas, aminoglucósidos y carbapenémicos). En el caso de P. aeruginosa, el porcentaje de aislados resistentes a, al menos, uno de los grupos de antimicrobianos bajo vigilancia regular (piperacilina/tazobactam, fluoroquinolonas, ceftazidima, aminoglucósidos y INTRODUCCIÓN 15 carbapenémicos) fue del 32,1%. En cuanto al orden Enterobacterales, EARS-Net 2018 informó que más de la mitad de los aislados de E. coli (58,3%) y más de un tercio de los aislados de K. pneumoniae (37,2%) fueron resistentes a, al menos, uno de los grupos bajo vigilancia regular (aminopenicilinas, fluoroquinolonas, cefalosporinas de tercera generación, aminoglucósidos y carbapenémicos) (9). Figura 1. Infecciones causadas por bacterias multirresistentes medidas en número de casos, muertes atribuidas y años de vida ajustados por discapacidad (DALY del inglés Disability adjusted life years) en UE/AEE en 2015 (3). Esta situación ha conllevado a que las opciones terapéuticas para los pacientes infectados por BGN multirresistentes se limite a antibióticos de última línea, y además, se ha unido el hecho de que en los últimos 40 años no se han diseñado nuevas familias de antimicrobianos (Figura 2). Por esta razón, en el año 2017, la OMS publicó una lista de los patógenos para los cuales la investigación y el desarrollo de nuevos antibióticos es una necesidad urgente (10). Dentro de los patógenos considerados como primera prioridad, se encuentran A. baumannii resistente a carbapenémicos, P. aeruginosa INTRODUCCIÓN 16 resistente a carbapenémicos y enterobacterias resistentes a carbapenémicos y productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). Figura 2. Cronología de desarrollo de nuevos antimicrobianos y la evolución de resistencias. Imagen extraída de www.biomerieux.com. Challenges. Lack of new antibiotics. El mal uso de los antimicrobianos durante décadas, tanto en seres humanos como en ganadería, ha sido una de las principales causas de selección y propagación de resistencias. En un estudio en el cual fueron escogidos 76 países distribuidos a lo largo del globo, el consumo de antimicrobianos aumentó de 11,3 a 15,7 dosis diarias definidas (DDD) por 1000 habitantes por día entre 2000 y 2015, hecho que supone un INTRODUCCIÓN 17 incremento del 39% (Figura 3) (11). Según datos aportados en el informe epidemiológico anual de 2018, publicado por el ECDC, el consumo de antibióticos sistémicos (incluyendo infecciones comunitarias y nosocomiales) fue de 20,1 DDD por 1000 habitantes por día, presentando un rango entre países desde un 9,7-34 DDD por 1000 habitantes por día (12) (Figura 4). Durante el periodo comprendido entre 2009 y 2018, no se encontraron diferencias significativas en el consumo de antimicrobianos teniendo en cuenta todos los países integrantes de la UE/AEE. Sin embargo, se ha visto que la tendencia al consumo ha disminuido en 11 de los países y ha incrementado en 4 de ellos (12). Figura 3. Cambios en el consumo de antimicrobianos medido en DDD por 1000 habitantes por día entre 2000-2015 en un total de 76 países (11). Figura 4. Consumo de antibióticos sistémicos expresado en DDD por 1000 habitantes por día en Europa el año 2018. * Países que sólo han proporcionado datos totales. Gráfica extraída de ESAC-Net (13). INTRODUCCIÓN 18 Las penicilinas, son los antibióticos prescritos con más frecuencia en todos los países, mientras que el consumo de otras clases de antimicrobianos como por ejemplo las cefalosporinas, macrólidos, quinolonas o glucopéptidos varió considerablemente entre países y se encuentran en niveles inferiores (12). Además, actualmente se conoce que los países con un mayor consumo de antibióticos presentan mayores tasas de resistencia a los mismos. Si esta situación no revierte, se estima que en 2020, el número de muertes causadas por organismos multirresistentes puede alcanzar los 10 millones al año superando enfermedades como el cáncer (Figura 5) (14). Figura 5. Estimación del número de muertes a causa de organismos multirresistentes en el año 2020 (14) AMR: Antimicrobial resistant. Debido a la necesidad de reducir el porcentaje de bacterias multirresistentes, la OMS ha puesto en marcha políticas de vigilancia del consumo de antimicrobianos (15). En Europa, ha sido creada una red de vigilancia del consumo de antimicrobianos (ESAC- Net) a nivel de atención primaria y en pacientes hospitalizados para la cual los países integrantes están aportando datos. A nivel nacional, una de las medidas tomadas para reducir el consumo de antimicrobianos y promover el uso adecuado de los mismos es la implementación del programa PIRASOA, un programa integral de prevención y control de infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria y uso apropiado de los antimicrobianos llevado a cabo en Andalucía (España). Transcurridos cuatro años desde su implementación, se ha podido observar una mejora en el uso de antimicrobianos prescritos para tratar infecciones por E. coli BLEE de adquisición comunitaria (16). También en Andalucía, en el año 2011 se puso en marcha el programa PRIOAM, con la INTRODUCCIÓN 19 finalidad de mejorar la prescripción antibiótica bajo un diseño participativo y de contenido educativo. En este caso, el programa realizado en el Hospital Virgen del Rocío de Sevilla (España), empezó con un 53% de prescripciones inapropiadas y estas han disminuido hasta el 26,4%. Asimismo, el consumo se redujo desde 1150 DDD por 1000 camas ocupadas hasta 852 DDD por 1000 camas ocupadas (17). Por lo tanto, los altos niveles de resistencia antimicrobiana alcanzados por los BGN en todo el mundo y su tendencia al aumento, especialmente en infecciones relacionadas con el ámbito hospitalario, implican la necesidad de crear estrategias integradas a todos los sectores que engloban la salud (7). 2. Infecciones asociadas a la atención sanitaria (IAAs) Las infecciones asociadas a la atención sanitaria o infecciones nosocomiales son aquellas que aparecen durante la hospitalización, se manifiestan a partir de las 72 h o más después del ingreso del paciente, y no estaban presentes ni en periodo de incubación antes de la admisión del mismo (18). Estas infecciones constituyen una de las causas principales de morbilidad y mortalidad en pacientes hospitalizados (19). Datos obtenidos en el año 2013, indican que se produjeron alrededor de 4,2 millones de infecciones nosocomiales en la Unión Europea dando lugar a 175.000 muertes (7). Actualmente, se estima que en Europa se producen 8,8 millones de IAAs al año, valores obtenidos teniendo en cuenta hospitales y centros de cuidado a largo plazo (20). En EE.UU., 1,7 millones de pacientes al año adquieren una IAA causando 99.000 muertes (21). Las IAAs se asocian mayormente a los dispositivos invasivos y a cirugías. Entre ellas destacan las infecciones del torrente sanguíneo o bacteriemias, infecciones del tracto urinario (ITU) asociadas a catéter, neumonías asociadas a ventilación mecánica (NAVM) e infecciones del sitio quirúrgico (22). Muchas de estas infecciones están causadas por patógenos multirresistentes incluyendo A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli, Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Enterococcus resistente a vancomicina (23). Las IAAs, constituyen un grave problema sobretodos para pacientes que se encuentran en las unidades de cuidados intensivos (UCIs). Según datos del ECDC en el año 2017, 11.787 pacientes ingresados en la UCI (8,3%) desarrollaron al menos una IAA que se encuentra bajo vigilancia (bacteriemia, neumonía o ITU). Los patógenos asociados con más frecuencia fueron estafilococos coagulasa negativos (bacteriemia), P. aeruginosa (neumonía) y E. coli (ITU) (24). Además, recientemente, INTRODUCCIÓN 20 se han publicado datos recogidos durante 2008-2012 en los cuales se estima que las IAAs en UCIs suponen 8.650 muertes atribuidas y 3,43 millones de días extras de hospitalización al año (25). Como resultado de estas infecciones, se produce un aumento del tiempo de hospitalización, de la mortalidad y en última instancia de los costes económicos en relación a la salud pública (26). Se ha calculado que los costes asociados a este tipo de infecciones oscilan entre los 5 y 10 billones de dólares anuales (27). Una estrategia para reducir las IAAs, es la implantación de protocolos de vigilancia y de respuesta adecuada (28). En los años 80, se demostró la importancia de la vigilancia mediante el Estudio para la Eficacia del Control de la Infección Nosocomial (SENIC) en EE.UU., en el cual se incluyeron 338 hospitales seleccionados al azar estratificados por geografía, capacidad de camas y estado de enseñanza. Los resultados de este estudio mostraron que los programas de control de infecciones realizados por epidemiólogos y los programas de vigilancia redujeron las infecciones nosocomiales un 32% en comparación con aquellos centros que carecían de estos programas (29). Siguiendo la misma estrategia, actualmente en Andalucía el programa PIRASOA no sólo tiene como objetivo promover el uso adecuado de antimicrobianos sino también reducir la tasa IAAs hasta alcanzar niveles de excelencia. Es importante destacar que las infecciones nosocomiales causadas por bacterias gramnegativas preocupan especialmente debido a la capacidad de estos patógenos para inducir o adquirir genes de resistencia. En EE.UU. alrededor de un 70% de las infecciones en UCIs están causadas por patógenos gramnegativos (30). Particularmente, los BGN requieren de especial atención debido a que son una causa frecuente de IAA y además las tasas de resistencia en estas bacterias está aumentando (27). 3. Bacilos gramnegativos (BGN): Epidemiología, resistencia antimicrobiana, opciones terapéuticas y virulencia El auge de las infecciones causadas por BGN multirresistentes representa un desafío a nivel global, sobre todo cuando nos referimos al tratamiento de infecciones adquiridas a nivel hospitalario. Especialmente en las UCIs, los BGN son los responsables de gran parte de las neumonías de adquisición hospitalaria e ITU, y del 25-30% de infecciones de sitio quirúrgico y del torrente sanguíneo (31). Algunos de los agentes etiológicos con más relevancia a nivel de infecciones nosocomiales, sobre todo en pacientes cuya INTRODUCCIÓN 27 respectivamente, que confieren protección ribosomal (70,71). Finalmente, también se puede producir una modificación o pérdida del LPS que afecta principalmente a la actividad de la colistina. Se ha descrito la modificación del lípido A (componente del LPS) mediante la adición de fosfoetanolamina (PEtN) debido a mutaciones en el sistema de regulación de dos componentes pmrA/pmrB (72). Además, la inactivación in vitro de los genes que sintetizan el LPS (lpxA, lpxC y lpxD) resultando en la pérdida completa del mismo, aumentan la resistencia a colistina. Sin embargo, estas modificaciones no han sido descritas en la clínica posiblemente debido al alto coste de fitness que suponen (73,74). Por último, la adquisición de plásmidos que contienen el gen mcr implicado en la resistencia a colistina también ha sido descrita en A. baumannii (75). 3.1.3 Tratamientos actuales A. baumannii presenta varias alternativas terapéuticas cuando se trata de un aislado sensible. Estas infecciones pueden ser tratadas con cefalosporinas de amplio espectro (como ceftazidima o cefepime), carbapenémicos (como imipenem, meropenem o doripenem) o la combinación de β-lactámicos/inhibidores de β-lactamasas (BL/IBL), siendo ampicilina-sulbactam una de las combinaciones más usadas (76). Sin embargo, el aumento de la resistencia a estos antibióticos ha promovido la necesidad de usar los últimos fármacos que permanecen activos como tigeciclina y sulbactam, o bien usar antiguos antibióticos que habían quedado en desuso como las polimixinas y minociclina. Polimixinas: La colistina (polimixina E) junto a la polimixina B, son antibióticos bactericidas concentración dependientes. Se diferencian solo en un aminoácido, pero su administración es distinta. La polimixina B se administra de forma directa mientras que la colistina se administra en forma de colistimetato de sodio (CMS, del inglés colistimethate sodium), pro-droga que se convertirá en colistina después de la administración (77). El uso de una u otra depende del área geográfica, en Europa se usa CMS (77). Ambos empezaron a comercializarse en los años 50 y posteriormente quedaron en desuso, por ello, el conocimiento de farmacocinética y seguridad es reducido (78). INTRODUCCIÓN 28 Tienen como diana el LPS, presentando una actividad potente frente a bacterias gramnegativas. Debido a la elevada resistencia antibiótica que presenta A. baumannii, este grupo de fármacos se ha convertido en uno de los últimos recursos (79). Sin embargo, estudios realizados en humanos, muestran que la colistina presenta un perfil farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD, del inglés pharmacokinetics /pharmacodynamics) sub-óptimo (80). Además, una de las principales desventajas es la nefrotoxicidad, hecho que reduce la ventana terapéutica del fármaco (81). El aumento del uso de la colistina ha promovido el aumento de resistencias en algunos países, sobre todo en los países asiáticos. En el año 2016, el 4% de los aislados en Europa fueron resistentes (42) y además, se han descrito fenómenos de heterorresistencia relacionados con el fracaso clínico (82). La incapacidad de las polimixinas de alcanzar valores óptimos de PK/PD y la posible selección de resistencias durante el tratamiento, ponen en duda su uso como monoterapia (83). Una posible solución es la combinación con otros antimicrobianos. Varios estudios preclínicos y clínicos indican que la colistina presenta sinergia con sulbactam, rifampicina o carbapenémicos (84-86). Tigeciclina: Primer antibiótico de una nueva familia de antimicrobianos llamados glicilciclinas. Se trata de un antibiótico bacteriostático debido a su unión con la subunidad 30S del ribosoma. A pesar de que la tigeciclina presenta una excelente actividad in vitro, no parece más efectiva que otras terapias utilizadas para A. baumannii multirresistente (87,88). La principal razón radica en que las concentraciones alcanzadas en pulmón y sangre después de una dosis estándar, son sub-óptimas (89). La utilización de dosis más altas ha presentado mejores resultados clínicos en pacientes con NAVM (90). No obstante, en este caso es necesario un mayor seguimiento debido a los problemas de toxicidad. Sulbactam: Inhibidor de β-lactamasas que suele formularse junto con ampicilina para el tratamiento de bacterias con resistencia mediada por estas enzimas. Sin embargo, el sulbactam por sí solo presenta actividad intrínseca frente A. baumannii, debido a su afinidad por las proteínas de unión a penicilina (PBP, del inglés penicillin-binding- protein) tipo 1A y tipo 2 (91). La mayoría de ensayos clínicos han sido realizados en combinación con ampicilina, presentando mejores resultados que la terapia con colistina (92,93). Lamentablemente, en la última década se ha detectado un aumento mantenido de la resistencia a sulbactam (94). INTRODUCCIÓN 29 Minociclina: Antibiótico bacteriostático perteneciente a la familia de las tetraciclinas. Igual que la tigeciclina, se une a la subunidad 30S del ribosoma impidiendo la síntesis proteica. La tasa de susceptibilidad de A. baumannii frente a este antibiótico (alrededor del 80%) así como ensayos clínicos realizados hasta la fecha, convierten a este fármaco en un buen candidato (95,96). Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar el papel de la minociclina en el tratamiento de infecciones por A. baumannii multirresistente. 3.2 Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa es un patógeno gramnegativo, no fermentador, oportunista y muy ubicuo en el medio ambiente. Causa principalmente infecciones nosocomiales como NAVM, bacteriemias e ITU en pacientes inmunodeprimidos con neutropenia, quemaduras y fibrosis quística. Estas infecciones se caracterizan por requerir altos periodos de hospitalización además de altos costes sanitarios (97). 3.2.1 Epidemiología P. aeruginosa es un patógeno con una alta resistencia intrínseca a los antibióticos debido a la capacidad de su membrana externa de evitar la entrada de estas moléculas así como su expulsión. Datos proporcionados por la ECDC en 2019, informan que en el año 2017 P. aeruginosa fue uno de los microorganismos aislados con más frecuencia en la UCI, siendo el primer causante de neumonía y frecuentemente aislado en bacteriemias y UTIs. En España es el primer agente etiológico aislado en neumonías adquiridas en esta unidad (24%) (24). En otros países del mundo como India, China o Etiopía los aislados de P. aeruginosa obtenidos en cohortes realizadas con pacientes de UCI fueron el 10,2%, 15,5% y 7,1%, respectivamente (41). En Kuwait los aislados obtenidos de pacientes con quemaduras fueron el 14,6% (98). En relación a la resistencia antimicrobiana, el porcentaje de resistencia en la UE/AEE en 2018 a piperacilina/tazobactam, fluoroquinolonas, carbapenémicos, ceftazidima y aminoglucósidos fue del 18,3%, 19,7%, 17,2%, 14,1% y 11,8%, respectivamente. Un 32,1% de los aislados fueron resistentes a al menos uno de los antibióticos anteriores y el 4,1% presentaron resistencia a todos ellos. Afortunadamente, la resistencia a tres grupos o más de estos antimicrobianos ha disminuido entre 2015 y 2018 (9). Además, la INTRODUCCIÓN 30 resistencia a colistina en Europa presenta niveles bajos siendo inferior al 1% (42). En EE.UU., el CDC informó en 2019 que se produjeron 32.600 casos de P. aeruginosa MDR en pacientes hospitalizados en el año 2017, y un total de 2.700 muertes (2). Por último, en los países asiáticos como India y China, el porcentaje de aislados de P. aeruginosa MDR en los estudios comentados anteriormente fue de 66,7% y 16,7%, respectivamente. En cuanto a su distribución, P. aeruginosa presenta una estructura epidemiológica noclonal, clasificada en ST específicos obtenidas mediante MLST. Se ha consensuado que no hay asociación entre un clon y un hábitat en concreto (99), sin embargo, la transmisión en los hospitales ha aumentado la prevalencia de clones específicos (100). Existen tres clones vinculados a cepas MDR y XDR (XDR, del inglés extensively drugresistant) llamados clones de alto riesgo. Estos clones pertenecen al ST111, ST175 y ST235 y están distribuidos en todo el mundo. El clon más diseminado es el ST235, seguido por el ST111 que ha sido aislado en todos los continentes menos en Oceanía. Por último el ST175 que se encuentra distribuido por varios países europeos (Figura 6) (101). Figura 6. Distribución mundial (A) y europea (B) de los clones más frecuentes de Pseudomonas aeruginosa MDR/XDR (101). MDR: multidrug-resitant, XDR: extensively drug-resistant. INTRODUCCIÓN 31 3.2.2 Mecanismos de resistencia antimicrobiana Los mecanismos de resistencia de P. aeruginosa se pueden clasificar en intrínsecos, adquiridos o adaptativos (Figura 7). 3.2.2.1. Mecanismos de resistencia intrínsecos La resistencia intrínseca es aquella que se encuentra codificada en el cromosoma. En el caso de P. aeruginosa, consiste principalmente en la baja permeabilidad de la membrana externa, la expresión constitutiva de bombas de flujo y la expresión cromosómica inducible de β-lactamasas. - Defectos en la permeabilidad: Las porinas son la principal causa de la disminución en la permeabilidad. OprF (homóloga de OmpA en A. baumannii y E. coli) es la porina mayoritaria de P. aeruginosa y es la responsable de la entrada inespecífica de iones y sacáridos (102). A diferencia de lo que ocurre en otras bacterias, alrededor del 95% de OprF se encuentra en conformación cerrada, siendo el motivo principal por el cual P. aeruginosa presenta una permeabilidad mucho menor que el resto de patógenos (103). La segunda porina más abundante en P. aeruginosa es OprD y una de las más estudiadas debido a su implicación en la resistencia a carbapenémicos, sobretodo imipenem y meropenem (104). OprD está altamente regulada a nivel transcripcional y post-transcripcional por reguladores de bombas de flujo, metales, pequeñas moléculas etc.; por ello, se cree que es el mecanismo de resistencia a carbapenémicos más prevalente (105). Se pueden dar mutaciones que resultan en una disminución de la expresión de OprD, conllevando a la resistencia a imipenem, pero también se han descrito mutaciones que consisten en la substitución de aminoácidos específicos sin afectar la transcripción (106). Varios estudios funcionales revelan que el truncamiento de la proteína, sobretodo de los loops 2 y 3 (loops que permiten la entrada de imipenem), están implicados en la resistencia a este antibiótico (107). Un estudio reciente realizado en pacientes con bacteriemia, revela que las infecciones causadas por aislados de P. aeruginosa con OprD truncada presentaron mayor tasa de mortalidad que aquellos infectados con P. aeruginosa con OprD intacta (108). Finalmente, OprH está asociada con la resistencia a polimixina B y gentamicina (109,110). INTRODUCCIÓN 32 - Bombas de flujo: Las bombas de flujo también juegan un papel importante a la hora de expulsar componentes tóxicos, incluyendo antibióticos, fuera de la célula bacteriana. Igual que en el caso de A. baumannii, las bombas de flujo de P aeruginosa se clasifican en seis familias: RND, MFS, MATE, SMR, ATP y DMT aunque no todas intervienen en la resistencia antimicrobiana. Clínicamente, las bombas de flujo más relevantes de P. aeruginosa son MexAB-OprM, MexXY/OprM, MexCD-OprJ y MexEF-OprN, todas ellas pertenecientes a la superfamilia RND. MexAB-OprM y MexXY/OprM presentan una alta prevalencia en cepas clínicas y confieren resistencia a un amplio rango de antibióticos (111). MexCD-OprJ y MexEF-OprN expulsan β-lactámicos y quinolonas, respectivamente (112,113). - Enzimas inactivadoras de antibióticos: La enzima más relevante es AmpC, una βlactamasa de expresión cromosómica que confiere bajo nivel de resistencia a aminopenicilinas y cefalosporinas. Sin embargo, AmpC puede hiperproducirse a través de mecanismos de resistencia adaptativos o adquiridos y conferir resistencia a un gran número de antibióticos (114). Además, en el cromosoma de P. aeruginosa también se pueden encontrar encimas modificadoras de aminoglucósidos como la APH(3′)-IIb (115). 3.2.2.2. Mecanismos de resistencia adquiridos P. aeruginosa puede adquirir resistencia a antibióticos a través de la mutación de genes intrínsecos o bien por transferencia horizontal mediante plásmidos, transposones e integrones de otras bacterias (116). A diferencia de la resistencia intrínseca, la resistencia adquirida está relacionada con la presión antibiótica dando lugar a la selección de poblaciones resistentes (117). Los genes de resistencia intrínsecos están regulados positivamente o negativamente por mecanismos regulatorios. La mutación de una de estas vías reguladoras puede aumentar la actividad del promotor dando lugar a un aumento de la expresión de estos genes y consecuentemente, una hiperproducción de enzimas y bombas de flujo. - Defectos en la permeabilidad: Se han descrito mutaciones en proteínas de la membrana externa que confieren resistencia a antimicrobianos. La pérdida o reducción de OprD, porina específica de carbapenémicos, reduce la permeabilidad de membrana INTRODUCCIÓN 33 confiriendo resistencia a los mismos (118). Además, como se ha comentado anteriormente, mutaciones en aminoácidos de OprD que no afectan a su expresión también pueden producir resistencia a carbapenémicos (106). - Bombas de flujo: Se han descrito variedad de mutaciones en bombas de flujo responsables de la resistencia antimicrobiana de P. aeruginosa. Entre ellas, se encuentran las mutaciones en MexAB/OprM y MexXY/OprM, que confieren resistencia a β-lactámicos (119,120). - Enzimas inactivadoras de antibióticos: Como se ha comentado en el apartado de la resistencia intrínseca, un ejemplo sería la inactivación por mutación de ampD (represor de ampC) que conduce a una sobreexpresión de la β-lactamasa y al aumento de la resistencia (121). Otra forma de resistencia adquirida consiste en la transferencia horizontal de genes de resistencia. P. aeruginosa ha adquirido β-lactamasas tipo BLEE como TEM (nombre procedente del primer paciente Temoneira) o VEB (Vietnam extended-spectrum-β-lactamase) y metalobetalactamasas (MBL), siendo las más frecuentes VIM (Verona-integron-encoded-metallo-β-lactamase) e IMP (Active on imipenem β-lactamase). Por último, aunque menos común, también se ha descrito la adquisición de carbapenemasas tipo KPC (K. pneumoniae carbapenemase) y GES (Guiana extended spectrum β-lactamase (122). En cuanto a enzimas modificadoras de aminoglucósidos, se ha descrito la presencia en plásmidos o integrones de todos los grupos de enzimas predominando las acetiltransferasas (115). - Modificación de la diana: Otra estrategia bacteriana consiste en la modificación o protección de la diana antimicrobiana. Mutaciones en genes de P. aeruginosa que codifican para la ADN girasa (gyrA y gyrB) o la topoisomerasa IV (parC y parE) reducen la afinidad con la que se unen las quinolonas conduciendo a una mayor susceptibilidad (122). También se han descrito modificaciones en las PBPs aumentando la resistencia a β-lactámicos (123) y mutaciones en los sistemas de regulación PhoPQ y PmrAB, que modifican el lípido A confiriendo una mayor resistencia a polimixinas (124). INTRODUCCIÓN 34 3.2.2.3. Mecanismos de resistencia adaptativos La resistencia adaptativa se trata de un mecanismo inestable y transitorio en respuesta a un estímulo como la presencia de un antibiótico u otro tipo de estrés ambiental, y que revierte con la desaparición del mismo (125). Varios estudios ponen de manifiesto la capacidad de P. aeruginosa para adquirir resistencia de manera adaptativa a las polimixinas (126,127). Además, también se podrían considerar mecanismos de resistencia adaptativos la formación de biofilm y las células persistentes. En el caso de P. aeruginosa, es común la formación de ambas formas en el pulmón de los pacientes con fibrosis quística, hecho que complica el tratamiento antimicrobiano (128). Figura 7. Mecanismos de resistencia intrínsecos, adquiridos y adaptativos de Pseudomonas aeruginosa. Car: Carbapenémicos, Ceph: Cefalosporinas, Pen: Penicilinas, Ami: Aminoglucósidos, Flu: Fluoroquinolonas, Mac: Macrólidos, Pol: Polimixinas, CM: Membrana citoplasmática, OM: Membrana externa (129). INTRODUCCIÓN 35 3.2.3 Tratamientos actuales Desde el punto de vista clínico, las infecciones causadas por P. aeruginosa se pueden clasificar en agudas-superficiales no invasivas, agudas invasivas o crónicas. Este apartado se centra principalmente en el segundo grupo, que comprende infecciones severas incluyendo bacteriemias, neumonía, endocarditis, infección por quemaduras e infección urinaria, entre otras. El tratamiento empírico frente a una infección por P. aeruginosa se basa en la severidad de la infección. Se tiene en cuenta la presencia de sepsis severa o shock séptico, inmunodepresión severa, infecciones con alto contenido bacteriano no controlable por cirugía y el riesgo de que la infección esté causada por una bacteria multirresistente. En el caso de que se cumplan las condiciones mencionadas, el tratamiento de elección constaría de un β-lactámico o un BL/IBL (meropenem, ceftazidima, piperacilina/tazobactam, ceftolozano/tazobactam o ceftazidima/avibactam) en combinación con amikacina o colistina. Por el contrario, si estas condiciones no se cumplen se tratará con meropenem/piperazilina-tazobactam/ceftazidima combinado con amikacina o ciprofluoxacino (130). En el caso de infecciones crónicas por P. aeruginosa, como es el caso de pacientes con fibrosis quística, el tratamiento de elección es tobramicina, colistina o aztreonam, aunque la cepa sea sensible a los βlactámicos (131). Actualmente, el número creciente de aislados P. aeruginosa MDR y XDR ha reducido la cantidad de antimicrobianos disponibles. Por ello se ha vuelto al uso de antiguos antibióticos como las polimixinas y fosfomicina o bien a la utilización de nuevos antibióticos, normalmente combinación de BL/IBL como ceftolozano-tazobactam, ceftazidima-avibactam e imipenem/relebactam. Polimixinas: Mayoritariamente se usa la colistina (polimixina E) y la polimixina B. Alrededor del 99% de las cepas de P. aeruginosa son sensibles a colistina, y la sensibilidad en otros BGN continúa siendo alta (42). Por esta razón, actualmente su uso se ha extendido y en los últimos años se han realizado una cantidad considerable de estudios pre-clínicos y clínicos para ampliar la información sobre este fármaco (132- 134). A pesar de ello, todavía hay controversia sobre la dosis intravenosa a usar (101). En el caso de P. aeruginosa MDR, los estudios realizados son variables debido a que se trata de series retrospectivas realizadas en un solo centro y bajo número de pacientes INTRODUCCIÓN 36 (101). También se está estudiando el uso de colistina en terapia combinada. Dos trabajos indican que la combinación de colistina con otro antimicrobiano se correlaciona con mejores resultados clínicos (135,136). Además, las guías para el uso óptimo de las polimixinas recomiendan usarlas en combinación, aunque las cepas P. aeruginosa MDR/XDR sean sensibles a este grupo de antimicrobianos (137). Fosfomicina: Se trata de un antiguo fármaco descubierto hace cuatro décadas, de amplio espectro y que tiene como mecanismo de acción la inhibición de la síntesis del peptidoglicano. Debido a su actividad bactericida in vitro frente a cepas de P. aeruginosa MDR, su uso intravenoso en combinación con otros antimicrobianos como β-lactámicos, aminoglucósidos o ciprofluoxacino ha resurgido como tratamiento para este tipo de infecciones (138). Ceftolozano/tazobactam: Es una cefalosporina de quinta generación combinada con un IBL que presenta fuerte actividad anti-pseudomónica. El ceftolozano inhibe PBPs y βlactamasas como TEM, SHV, AmpC y oxacilinasas pero no tiene actividad frente a carbapenemasas, mientras que el tazobactam inhibe BLEE (139). La susceptibilidad a ceftolozano/tazobactam en distintas cepas de P. aeruginosa MDR varía entre países con valores entre el 55-96,6% (101). Ceftazidima/avibactam (CAZ/AVI): Es otra cefalosporina de tercera generación combinada con un IBL. Avibactam presenta actividad frente a β-lactamasas de clase A y C, incluyendo BLEE, AmpC y KPC pero no presenta actividad frente a MBL (140,141). La adición de avibactam a esta cefalosporina la protege de enzimas como AmpC y otras BLEE como GES (142). Diferentes estudios han mostrado que CAZ/AVI inhibe entre el 61,1-86,5% de cepas P. aeruginosa MDR/XDR (101). Imipenem/relebactam: Forma parte de los antibióticos BL/IBL. El relebactam es un inhibidor de β-lactamasas de clase A y C restituyendo la susceptibilidad a imipenem (143). Estudios in vitro con cepas de todo el mundo muestran que entre el 90-92% de los aislados de P. aeruginosa fueron sensibles a la combinación y en el caso de las cepas MDR, los aislados sensibles fueron el 71-80% (144-146). INTRODUCCIÓN 43 Fosfomicina: Se está reutilizando de nuevo debido a su actividad frente a bacterias MDR y XDR, sobretodo en Enterobacterales. Fosfomicina presenta una excelente actividad in vitro frente a cepas BLEE de E. coli y K. pneumoniae presentando una tasa de susceptibilidad del 97% y el 81%, respectivamente (190). En clínica se usa principalmente para el tratamiento de ITUs complicadas causadas por E. coli. Varios estudios muestran que su eficacia es comparable a la de otros antibióticos como amoxicilina/ácido clavulánico o cefalosporinas (191). Su uso en combinación con otros antimicrobianos como meropenem se está estudiando (192). 3.4 Factores de virulencia de los BGN Los BGN han desarrollado una gran variedad de factores de virulencia para promover la colonización y la posterior infección del huésped, causando en última instancia la enfermedad (193). Debido a las altas tasas de resistencia y la escasez de arsenal terapéutico para combatir infecciones causadas por BGN, es importante la caracterización en profundidad de la patogénesis bacteriana y la determinación de nuevas dianas terapéuticas. Dentro de los factores de virulencia más relevantes, encontramos componentes de la membrana externa, proteínas que facilitan la adherencia bacteriana, estructuras que permiten la motilidad bacteriana, sistemas de secreción, toxinas, vesículas de la membrana externa, presencia de sideróforos y finalmente comportamientos colectivos como la formación de biofilm y el quorum sensing. Aunque estos factores, en su gran mayoría, son compartidos entre BGN, cada patógeno está dotado de proteínas y mecanismos específicos (Tablas 4, 5 y 6). 3.4.1 Componentes de membrana externa Los BGN presentan una envuelta celular formada por la membrana externa, peptidoglicano y membrana citoplasmática (Figura 8). La membrana externa es la primera línea de contacto entre la bacteria y el entorno, permitiendo la entrada de nutrientes necesarios para la supervivencia bacteriana pero a su vez, confiriendo protección e impidiendo la entrada de moléculas tóxicas como los antibióticos. La membrana externa está compuesta principalmente por proteínas de membrana externa (OMPs), en su mayoría porinas, fosfolípidos y LPS. INTRODUCCIÓN 44 Figura 8. Estructura de las bacterias gramnegativas. La envuelta celular consiste en la membrana externa y la membrana citoplasmática. La membrana externa está formada por el lipopolisacárido (LPS) y diversas proteínas que actúan como porinas (OmpC/OmpF y OmpA) mientras que la membrana citoplasmática está formada por una bicapa de fosfolípidos. En el espacio periplásmico se encuentra el peptidoglicano (PG) y proteínas periplásmicas. Además, existen proteínas que confieren estabilidad a la estructura como la lipoproteína de Braun (Lpp) que une el PG con la membrana externa o las proteínas Tol y Pal que permiten la unión con la membrana citoplasmática (194). Los componentes de la membrana externa sirven como factores de virulencia y están implicados en una gran variedad de procesos que permiten una mejor adherencia e invasión al huésped así como la evasión del sistema inmune (Tablas 4, 5 y 6). Cabe destacar la importancia de OmpA, proteína que se encuentra altamente conservada entre especies, a la cual se le atribuyen multitud de funciones (195). En A. baumannii, desempeña un papel importante en la adherencia, invasión, citotoxicidad y formación de biofilm (196). Además, OmpA puede movilizarse a través de vesículas de membrana externa (OMV) y como se ha dicho anteriormente, contribuye a la disminución de la sensibilidad a algunos antibióticos (197). A. baumannii presenta otras OMPs importantes para su fitness y virulencia, como Omp33-36 y CarO (198,199). En P. aeruginosa, OprF, homóloga de OmpA, es necesaria para la virulencia de este patógeno debido a su implicación en la adhesión y su relación con determinantes del quorum sensing (200). En especies de Enterobacterales, como en E. coli, se ha evidenciado que OmpA está implicada en la adhesión celular a distintos tipos celulares, como células INTRODUCCIÓN 45 epiteliales, endoteliales y macrófagos (201,202). En K. pneumoniae OmpK36 disminuye la fagocitosis por parte de los neutrófilos y aumenta la resistencia en suero (203). La lipoproteína asociada a peptidoglicano (Pal) y la lipoproteína mureina (LppA) también confieren resistencia al suero así como protección frente a la fagocitosis (204). 3.4.2 Fosfolipasas Las fosfolipasas (PL, del inglés phospholipase) son un grupo heterogéneo de enzimas encargadas de romper los enlaces éster de los fosfolípidos. Están asociadas a membranas celulares o a vesículas de membrana y se encargan de la desestabilización de las mismas así como de procesos de señalización celular. Estas funciones son debidas a que su producto de hidrólisis, los fosfolípidos, son importantes en procesos de penetración en el huésped y en la lisis celular (205). Las fosfolipasas se clasifican en cuatro grupos según su sitio de acción en los fosfolípidos: fosfolipasa A (PLA), fosfolipasa B (PLB), fosfolipasa C (PLC) y fosfolipasa D (PLD) (205). A. baumannii presenta dos PLC implicadas en la virulencia mediante la hemolisis de eritrocitos y aumento de la citotoxicidad (206). En P. aeruginosa, la PLC hemolítica reduce la actividad de los neutrófilos en las vías respiratorias (207). Mientras, en K. pneumoniae, PLD1 es importante para la virulencia en modelos murinos de neumonía (208). 3.4.3 Sistemas de secreción Los BGN presentan seis sistemas de secreción (I-VI): sistema de secreción tipo I (T1SS), sistema de secreción tipo II (T2SS), sistema de secreción tipo III (T3SS), sistema de secreción tipo IV (T4SS), sistema de secreción tipo V (T5SS) y sistema de secreción tipo VI (T6SS), algunos más estrechamente relacionados con la virulencia bacteriana. En las tablas 4, 5 y 6 se recogen algunos ejemplos concretos. Todos ellos son sistemas transmembrana menos el T5SS que sólo se encuentra en la membrana externa (209). T1SS en su gran mayoría secreta productos que permiten la adquisición de metales o están implicados en la virulencia, como la hemolisina A, formadora de poros (210). Se encuentra ampliamente distribuido en bacterias como P. aeruginosa y E. coli y en A. baumannii está asociado a la formación de biofilm (211,212). T2SS se encarga de secretar proteínas plegadas desde el periplasma al medio extracelular. Principalmente secreta enzimas hidrolíticos como la pseudolisina en P. aeruginosa, la INTRODUCCIÓN 46 pululanasa en K. pneumoniae y la invasina DraD en ECUP, todas ellas importantes para la supervivencia bacteriana en el huésped (213). El T3SS, también conocido como inyectoma, se encarga de la transferencia de proteínas de virulencia, llamadas proteínas efectoras, desde el citoplasma bacteriano a la célula eucariota. Es muy relevante en la virulencia de P. aeruginosa y también se encuentra en ECEP y ECEH, relacionándose con la colonización del huésped y la severidad de la infección (214,215). El T4SS se diferencia de los otros sistemas de secreción en su capacidad de transferir ADN además de proteínas (216). T5SS en general transporta proteínas a lo largo de la membrana externa y no está implicado en la virulencia bacteriana (217). Por último, T6SS transloca proteínas efectoras a la célula eucariota y tiene un papel fundamental en la patogénesis bacteriana y la competición (218). 3.4.4 Toxinas Las toxinas son determinantes importantes de la virulencia bacteriana. Además de las toxinas secretables, también se incluye la endotoxina o LPS, presente en todos los gramnegativos. En el caso de P. aeruginosa, una de las toxinas más importantes es la exotoxina A, secretada a través del T3SS (219). Algunos ejemplos en E. coli son la alfahemolisina (HlyA), toxina que afecta a muchos tipos celulares incluyendo células epiteliales y eritrocitos (220,221) y el factor citotóxico necrotizante 1 (CNF1), implicado principalmente en la internalización bacteriana (222). 3.4.5 Vesículas de la membrana externa (OMVs) Las OMVs son vesículas esféricas con un diámetro de entre 20-200 nm producidas comúnmente por BGN y que son derivadas y secretadas a partir de su membrana externa (223). Están compuestas de ADN, ARN, LPS, lípidos y OMPs (194). Debido a su papel en la interacción bacteria-bacteria y bacteria-huésped las OMV suelen contener factores de virulencia como toxinas, en el caso de E. coli, o enzimas como proteasas y fosfolipasas como sucede en P. aeruginosa y A. baumannii (224). Además, también se está estudiando su papel como adyuvantes y para el desarrollo de vacunas (225). INTRODUCCIÓN 47 3.4.6 Sideróforos (quelantes de metales) Los quelantes de metales son necesarios para la supervivencia bacteriana. Una de las moléculas quelantes más importantes son los sideróforos, encargados de la captación de hierro. Debido a que el hierro es un componente esencial para el crecimiento bacteriano, las bacterias han desarrollado sistemas eficientes para la adquisición del mismo promoviendo su supervivencia y crecimiento en el huésped (226). En A. baumannii se ha identificado la acinetobactina o la fimsbactina, la pioverdina y pioquelina en P. aeruginosa y por último, la aerobactina y la enterobactina han sido descritas en E. coli y K. pneumoniae (227). 3.4.7 Motilidad Con la finalidad de desplazarse sobre distintas superficies, las bacterias emplean varios comportamientos según las estructuras que desarrollen (Figura 9). A. baumannii no presenta flagelo por lo tanto su movilidad es debida a la extensión de pilis tipo IV o “twitching” (228). P. aeruginosa presenta un flagelo polar y múltiples pilis de tipo IV (229). E. coli se mueve gracias a múltiples flagelos orientados axialmente a lo largo de la célula bacteriana y finalmente K. pneumoniae se considera un patógeno no motil, aunque algún estudio apunta a que podría presentar motilidad gracias a un flagelo polar (230,231). Figura 9. Motilidad bacteriana. El “swarming” consiste en un movimiento de propulsión causado por la rotación de flagelos, el “swimming” es un movimiento de bacterias individuales debido a flagelos giratorios, el “twitching” se produce por la extensión de pilis tipo IV, el “gliding” no requiere flagelos ni pilis y consiste en complejos de adhesión local y el “sliding” consiste en la translocación pasiva a una superficie promovida por el crecimiento y facilitada por un agente sulfactante (232). INTRODUCCIÓN 48 3.5.8 Formación de biofilm La formación de biofilm consiste en la auto-organización de una comunidad bacteriana multicelular, embebida en una matriz de exopolisacáridos, proteínas y DNA extracelular (233). Se trata de una estructura dinámica y compleja que confiere protección a la comunidad bacteriana para sobrevivir en ambientes adversos y durante los procesos de infección (234) (Figura 10). Es un factor de virulencia importante a nivel clínico debido a que otorga a la bacteria la capacidad de colonizar tanto superficies bióticas como abióticas, protección frente a la acción del sistema inmune y fracaso terapéutico debido a la poca penetración del antibiótico en interior del biofilm (235,236). Figura 10. Formación de biofilm. La formación de biofilm es un proceso que requiere de varias etapas. Bacterias libres se acercan a una superficie y se adhieren, donde posteriormente se dividirán y se agregaran formando microcolonias dando lugar al biofilm maduro. Finalmente, parte de este biofilm se dispersará liberando bacterias que colonizarán otras superficies (240). A. baumannii presenta genes de virulencia y proteínas que son cruciales para la formación y el mantenimiento de biofilm como la proteína asociada a biofilm (Bap) o el pili Csu, presente en la mayoría de cepas clínicas y regulado por el sistema de dos componentes BfmRS (212). La formación de biofilm por parte de P. aeruginosa es de vital importancia en pacientes con fibrosis quística. En las cepas aisladas de estos INTRODUCCIÓN 49 pacientes, se han detectado mutaciones en el gen mucA, que junto a otros genes, contribuye a la formación de biofilm (238). Por otro lado, el grupo de genes cup, son necesarios para la formación de biofilm en superficies abióticas (239). En E. coli, la formación de biofilm es un fenómeno que no se ha estudiado en profundidad, pero se ha descrito una morfología de biofilm característica, denominada rdar, en cepas comensales y uropatogénicas (240). 3.5.9 Quorum sensing El quorum sensing es un mecanismo de comunicación célula-célula mediante la excreción de compuestos químicos. Una vez alcanzado un umbral de población, las bacterias se coordinan para expresar varios rasgos colectivos como la producción de factores de virulencia o la formación de biofilm (241). El quorum sensing depende de la producción, secreción y detección de pequeños autoinductores difusibles, como lactonas acil-hemoserinas (AHL, del inglés acyl homoserine lactones), propias de A. baumannii y P. aeruginosa o oligopéptidos autoinductores (AIP, del inglés autoinducing peptide), más propios de E. coli y K. pneumoniae (242). La maquinaria de quorum sensing en A. baumannii está mediada por el sistema AbaI/AbaR, homólogo al sistema LuxI/LuxR encontrado en otras bacterias gramnegativas. AbaI es una proteína sensora, que funciona como auto-inductor y produce la síntesis de la molécula señal AHL, que en última instancia se unirá a su receptor (AbaR) induciendo una cascada de reacciones. El papel más importante de AbaI/AbaR es el desarrollo de biofilm (243). P. aeruginosa presenta uno de los sistemas quorum sensing más complejos. Consta de tres circuitos: LasI/LasR, que produce el inductor 3O-C12-AHL; Rh1I/Rh1R, que produce el inductor C4-AHL, ambos sistemas con inductores de tipo AHL y homólogos de LuxI/LuxR; y el sistema señal de quinolonas (PQS). Estos circuitos controlan la activación de más de 300 genes y gran variedad de procesos (244). E. coli también presenta un homólogo de LuxR, denominado SdiA, pero no presenta LuxI y por lo tanto, no es capaz de producir la molécula señal AHL (245). Sin embargo, el sistema de quorum sensing más relevante en E. coli es luxS/AI-2, que produce autoinductores AIP. Está implicado en la comunicación intra-especie, con la finalidad de adaptarse a un ambiente tan poblado como el intestino, y además está implicado en la INTRODUCCIÓN 50 adhesión, motilidad y formación de biofilm (245,246). Finalmente, aunque menos estudiado, el sistema AI-2 también se encuentra en K. pneumoniae (247). Tabla 4. Principales factores de virulencia de Acinetobacter baumannii y su implicación en la patogénesis. Factor de virulencia Implicación en la patogénesis Ejemplos Referencia Porinas Apoptosis, adherencia e invasión, capacidad de escapar del sistema complemento, citotoxicidad, virulencia en modelos animales murinos OmpA, Omp33-36, Caro 198, 199, 248 Fosfolipasas Invasión, resistencia a suero, virulencia en modelos animales murinos PLC (gen A1S_0043) PLD (gen A1S_2055) 206,249 LPS Capacidad de escapar del sistema complemento, formación de biofilm, adherencia, resistencia a suero, virulencia en modelos animales murinos BfmS, pglC, LpxC 250-252 OMVs Contienen proteasas, liberación de factores de virulencia, transferencia horizontal de genes de resistencia a antibióticos OMV que contienen proteasas (gen A1S_2525), OMVs que contienen OmpA 253,254 Sistemas de secreción Formación de biofilm, adherencia, muerte de las células del huésped, resistencia a suero y virulencia en modelos animales murinos T1SS, T2SS, T5SS 196 Quorum sensing Formación de biofilm AbaI/AbaR 243 Sideróforos y otros quelantes Persistencia y virulencia en modelos animales murinos Acinetobactina, fimsbactina, ZnuABC, MumC/MumT 255-257 Tabla 5. Principales factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa y su implicación en la patogénesis. Factor de virulencia Implicación en la patogénesis Ejemplos Referencia Porinas Formación de biofilm, adhesión con el huésped, formación de OMVs OprF 200,258 Fosfolipasas Hemolítica, disminución de la actividad de los neutrófilos en las vías respiratorias, citotoxicidad en células endoteliales y monocitos PlcHR (PLC hemolítica) 207,259 LPS Diseminación, resistencia a suero, resistencia a la opsionización, activación cascada inflamatoria Lípido A y antígeno O del LPS 260 OMVs Resistencia a antibióticos, activación del quorum sensing, toxicidad células epiteliales de las vías respiratorias OMV que contienen βlactamasas, hemolisinas, moléculas del quorum sensing, toxina Cif 261 INTRODUCCIÓN 51 Sistemas de secreción Secreción de exotoxinas que contribuyen al daño de la barrera epitelial y favorecen la colonización y secreción de otras proteínas como proteasas T1SS (secreción de la proteasa AprA) T3SS ( Secreción de exotoxinas ExoY, ExoS, ExoT y ExoU) 262 Quorum sensing Supervivencia bacteriana, toxicidad celular, formación de biofilm, tolerancia frente a antimicrobianos, interacciones huésped-patógeno LasI/LasR, RhII/RhIR y PQS 244 Toxinas Inhibición de la síntesis proteica en las células del huésped Exotoxina A 219 Sideróforos y otros quelantes Colonización y supervivencia durante la infección Pioverdina, pioquelina, HasA/HasR, ZnuABC, MgtA/MgtB 263 Tabla 6. Principales factores de virulencia de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae y su implicación en la patogénesis. Factor de virulencia Implicación en la patogénesis Ejemplos Referencia OMPs/Porinas Evasión del sistema complemento, adhesión, invasión y colonización, virulencia en modelos animales murinos OmpA, Pal, LppA, OmpK35, OmpK36, OmpW, OmpX 156,202,264, 265 Fosfolipasas Virulencia en modelos animales murinos PLD1 208 LPS y cápsula Resistencia a suero, inhibir y evadir la fagocitosis, evasión del complemento, neutralización de la actividad antibacteriana del huésped Antígeno O del LPS Serotipos capsulares de K. pneumoniae como K1 y K2 266 OMVs Daño celular, activación del sistema inmune innato, virulencia en modelos animales murinos OMV que contienen toxinas (Stx2a, CdtV) y hemolisinas, OMV con diverso contenido proteico 267,268 Sistemas de secreción Adherencia, invasión y colonización, supervivencia durante la infección T6SS 269,270 Quorum sensing Comunicación entre especies y adaptación en el intestino. Formación de biofilm SdiA, luxS-AI2 245,271 Fimbrias Invasión celular, colonización, formación de biofilm, activación de células del sistema inmune, formación intracelular de comunidades bacterianas Fímbrias de tipo I (FimA/FimH) y tipo III (MrkD/MrkA) 170,272 Toxinas Activación del sistema inmune, citotoxicidad, invasión celular α-hemolisina (HlyA), toxina Shiga(Stx), factor citotóxico necrotizante 1 (CNF1) 273 Sideróforos Supervivencia y propagación durante la infección Enterobactina, aerobactina, yersiniabactina, salmoquelina 156,274 INTRODUCCIÓN 52 Además, de las características que atañen a la bacteria, como mecanismos de resistencia y factores de virulencia, el sistema inmune del huésped también juega un papel importante en la resolución de la infección. 4. Sistema inmune e infección 4.1 Papel de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa La respuesta a patógenos está mediada por la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa frente a microorganismos y consta de mecanismos celulares y bioquímicos presentes antes de la infección y con capacidad de responder rápidamente a la misma. Los componentes principales de la inmunidad innata consisten en: barreras físico-químicas como la piel, el epitelio de las mucosas y las sustancias antimicrobianas secretadas, células fagocíticas (macrófagos y neutrófilos), células dendríticas, linfocitos natural-killer y el sistema complemento (275). Por otro lado, la inmunidad adaptativa consiste en una respuesta específica frente a una gran variedad de antígenos además de la capacidad de presentar memoria, hecho que permitirá una respuesta más rápida e intensa a exposiciones posteriores (276). La inmunidad adaptativa se divide en inmunidad humoral e inmunidad celular. Las principales células de la inmunidad humoral son los linfocitos B, capaces de secretar anticuerpos que reconocen antígenos microbianos, neutralizan y marcan a los patógenos para que éstos sean reconocidos por otros tipos celulares como los fagocitos. La inmunidad celular está mediada por los linfocitos T cooperadores (CD4+) y los linfocitos T citotóxicos (CD8+), encargados de la activación y el mantenimiento de la respuesta inmune, así como de la eliminación de patógenos intracelulares en células infectadas (275) (Figura 11). La respuesta inmunitaria adaptativa consta de distintas fases (Figura 12). En la primera fase tiene lugar el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos vírgenes gracias a las células presentadoras de antígeno o célula dendrítica (DC, del inglés dendritic cell). Posteriormente, se produce la expansión clonal de aquellos clones seleccionados y finalmente se produce la activación y diferenciación de los mismos. Este proceso dura alrededor de 7 días y seguidamente, se produce la fase efectora en la INTRODUCCIÓN 59 4.3 Maduración y migración de las células de la inmunidad innata 4.3.1 Maduración en la médula ósea Los monocitos se generan continuamente en la medula ósea. Las células madre hematopoyéticas (HSC del inglés, Hemotopoietic Stem Cells), se diferencian a precursores de macrófagos y células dendríticas (MDP del inglés, Macrophage Dendritic cell Progenitors), posteriormente al progenitor común de monocitos (cMoP) y finalmente se diferenciarán a monocitos Ly6Chi o Ly6Clow. Los monocitos Ly6Chi serán reclutados rápidamente a los sitios de infección bacteriana donde se diferenciarán en macrófagos y DC mientras que los Ly6Clow se diferenciarán en macrófagos que tendrán como función patrullar y reparar el tejido endotelial (285). Los neutrófilos son generados en la médula ósea a partir de precursores bajo la regulación del factor estimulante de granulocitos (G-CSF del inglés, Granulocyte Colony Stimulating Factor). Su producción se regula en función de la apoptosis producida en los tejidos. Cuando los macrófagos y las DC fagocitan neutrófilos apoptóticos, ambas células reducen la producción de IL-23. IL-23 estimula la producción de IL-17A, que actúa como estímulo importante de G-CSF. Por lo tanto, la producción de G-CSF se ve reducida cuando el número de neutrófilos en los tejidos aumenta (303). 4.3.2 Migración y quimioquinas responsables Los monocitos son reclutados a los sitios de infección con la finalidad de mediar una respuesta antimicrobiana (290). Aunque los monocitos Ly6Clow pueden ser reclutados, el reclutamiento de Ly6Chi es mucho más prominente (304). Como se ha comentado anteriormente, los monocitos presentan un receptor llamado CCR2 que se une a dos ligandos: CCL2 (también conocido como MCP-1) y CCL7 (también conocido como MCP-3) (288). Esta unión quimioquina-receptor es responsable de la migración de estas células desde la médula ósea hasta la sangre. La expresión de CCR2 está restringida a pocos tipos celulares, sin embargo, MCP-1 puede ser secretada prácticamente por todas las células nucleadas en respuesta a citoquinas y moléculas microbianas (305) (Figura 14). INTRODUCCIÓN 60 En el caso de las infecciones bacterianas, este proceso ha sido estudiado principalmente en Listeria monocytogenes (305), pero no en BGN. Cuando se produce la infección bacteriana, ésta es detectada y aumenta la liberación de MCP-1 en sangre y en tejidos (306), así como por parte de las células de la médula ósea (307). La unión de MCP-1 con su receptor promueve la migración de los monocitos desde la médula ósea hasta el torrente sanguíneo (308). Posteriormente, se produce la migración de los monocitos a los tejidos, donde podrán diferenciarse en TipDC, población que se caracteriza por la producción de TNF-α e iNOS, (299) y en macrófagos (309) (Figura 14). Sin embargo, el tráfico de monocitos a los sitios de infección, como el bazo y el hígado, es independiente de CCR2 (308,310). Figura 14. Tráfico de monocitos. Las células precursoras de macrófagos y células dendríticas (MDP) dan lugar a los monocitos Ly6Chi que: a) en ausencia de infección pueden retornar a la INTRODUCCIÓN 61 médula ósea y diferenciarse en Ly6Clow o b) en respuesta a la infección migran a la sangre de manera CCR2 dependiente y posteriormente a los tejidos inflamados donde darán lugar a macrófagos, DC inflamatorias y TipDC. Los monocitos Ly6Clow también pueden ser reclutados a los sitios de inflamación y diferenciarse a macrófagos alternativos, posiblemente contribuyendo a la reparación del tejido. Además, experimentalmente se ha visto que los monocitos Ly6Chi pueden dar lugar células de Langerhans, microglía y macrófagos intestinales. Por otro lado, después de un infarto de miocardio, los monocitos Ly6Chi de los reservorios esplénicos, son selectivamente reclutados al tejido cardiaco dañado (285). Por otro lado, la migración de los neutrófilos está controlada por los receptores CXCR4 y CXCR2, presentes en células de la médula ósea (303). CXCR4 se encarga de retener los neutrófilos en la médula ósea para su posterior liberación (311), mientras que la liberación estará mediada por la unión del receptor CXCR2 con sus ligandos CXCL1 y CXCL2 (también llamados KC y MIP-2, respectivamente) (312). Por lo tanto, la retención o la liberación de neutrófilos estará determinada por el balance entre CXCR4 (favorece la retención) y CXCR2 (favorece la liberación). Los neutrófilos migran a los tejidos mediante un proceso multipaso. Primero se produce el anclaje (tethering en inglés) y el rodamiento (rolling en inglés), dependiente de selectinas. A continuación se produce la adhesión al endotelio vascular, el crawling que consiste en el desplazamiento sobre el endotelio y finalmente la transmigración al tejido infectado (313). 4.4 Respuesta inmune durante la infección bacteriana La sepsis es una de las infecciones bacterianas en las que se genera una desregulación de la respuesta inmune. En la sepsis, la respuesta inmune generada frente a un patógeno por parte del huésped no puede regresar a la homeostasis, hecho que culmina en una inflamación generalizada excesiva y sostenida unida a una supresión inmune (314). La excesiva inflamación en la sepsis está asociada con una potente activación del sistema inmune innato, mediado por la activación de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR, del inglés Pattern Recognition Receptors) por parte de los PAMPs y los patrones moleculares asociados al daño (DAMPs, del inglés Damage-Associated Molecular Patterns). La activación por parte de DAMPs, además, provoca un círculo de retroalimentación que implica la continua activación del sistema inmune y disfunción orgánica (315). La respuesta inflamatoria durante la sepsis se caracteriza por una INTRODUCCIÓN 62 excesiva activación del sistema complemento, mayor coagulación y mayor liberación de citoquinas pro-inflamatorias por parte de las células endoteliales y leucocitos. El sistema complemento es esencial para la protección frente a patógenos, pero su activación descontrolada puede causar daño tisular (316). C5a, producto de la cascada del complemento, es un potente quimioatrayente implicado en el reclutamiento de neutrófilos, eosinófilos, monocitos y células T y además, promueve la activación de células fagocíticas. Cuando ambas funciones se encuentran descontroladas, pueden ocasionar daño tisular y disfunción orgánica (317). El bloqueo de C5a mejora la supervivencia frente a distintos modelos animales (318,319). La inhibición del factor tisular, una de las proteínas principales implicadas en la coagulación, previene la disfunción orgánica y la mortalidad en un modelo de sepsis (320). Finalmente, el bloqueo de citoquinas implicadas en la patogénesis de la sepsis como TNF-α, IL-12, IL- 18 o IL-1β también previene la mortalidad en un modelo de sepsis (321). Por otro lado, también tiene lugar la supresión del sistema inmune. Se produce una depleción de las células B y de las células T CD4+ y CD8+ debido al aumento de la apoptosis (322). Además, también se produce el agotamiento de las células T, es decir, la pérdida progresiva de la función efectora debido a una estimulación de antígeno prolongada (323). En cuanto a los neutrófilos, se produce un retraso en la apoptosis, así como un aumento en la liberación de neutrófilos inmaduros a la circulación. Por ello, los pacientes con sepsis presentan mayor número de neutrófilos circulantes con distintos grados de maduración (324). Además, se ha observado una pérdida de función de los mismos, hecho que incluye una menor eliminación de la bacteria y menos producción de ROS (325). Las DC también se ven reducidas por un aumento en la apoptosis y disminuye su capacidad de presentación de antígeno (326,327). Por último, también se ha observado que monocitos-macrófagos se vuelven tolerantes al antígeno y no son capaces de responder correctamente a estímulos bacterianos (328). 5. Nuevas estrategias para tratar las infecciones por BGN El incremento de la resistencia antimicrobiana junto con la falta de desarrollo de nuevos antimicrobianos supone un problema clínico de enorme magnitud. La ausencia de nuevos antibióticos es debida a la dificultad y al tiempo que comporta el desarrollo de los mismos. De todos los compuestos desarrollados en la fase preclínica, solo el 2% es aprobado, en un proceso que puede conllevar más de 10 años (Figura 15) (329). INTRODUCCIÓN 63 Figura 15. Fases de descubrimiento de un fármaco. Un número razonable de compuestos se encuentran en la frase preclínica, sin embargo, este número va decreciendo a medida que se avanza en las fases de ensayo clínico hasta que llega al mercado (329). Para aumentar el arsenal terapéutico y combatir la resistencia antimicrobiana, es necesaria la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas como el uso de antiguos antimicrobianos, el desarrollo o la búsqueda de moléculas no antimicrobianas que actúen frente a la bacteria sin presentar efecto bactericida o bacteriostático, moléculas que actúen a nivel del huésped o el reposicionamiento de fármacos, entre otras (Figura 16). A nivel general, los estudios preclínicos de moléculas antibacterianas son llevados a cabo por pequeñas-medianas empresas. Alrededor del 50% de los proyectos focalizados en la búsqueda de nuevos compuestos, está destinado a aquellos que presentan una acción directa frente a la bacteria (antibióticos tradicionales) mientras que la otra mitad se reparte en otras alternativas terapéuticas como la terapia de fagos, el diseño de vacunas o el reposicionamiento de fármacos (330). INTRODUCCIÓN 64 Figura 16. Estudios preclínicos destinados al desarrollo de fármacos. Número de estudios destinados al descubrimiento de nuevas terapias antimicrobianas enfocando distintas estrategias (330). 5.1 Antiguos antibióticos Debido a la problemática de la resistencia antimicrobiana, antibióticos que habían quedado en desuso vuelven a tener cabida frente a infecciones causadas por BGN multirresistentes para los cuales las opciones terapéuticas son muy limitadas. Entre ellos se encuentra la colistina, para la cual se ha obtenido una mejor caracterización de la farmacocinética (331) y se está estableciendo la dosis óptima (132). La fosfomicina fue descubierta en los años 60 y fue rápidamente abandonada debido a la disponibilidad de otras moléculas. Actualmente, vuelve a usarse en la práctica clínica, generalmente frente a K. pneumoniae resistente a carbapenémicos (332). Finalmente, este año se ha iniciado un ensayo clínico en el cual se compara la actividad de temocelina, un antiguo β- INTRODUCCIÓN 65 lactámico, y meropenem para el tratamiento de bacteriemia por Enterobacterales resistentes a cefalosporinas de tercera generación (333). 5.2 Terapia de fagos Consiste en el uso de bacteriófagos, virus capaces de lisar bacterias de manera específica. Fueron descubiertos hace un siglo pero su uso quedó restringido a los países pertenecientes a la Unión Soviética. Actualmente, debido al problema de la resistencia antimicrobiana, su uso vuelve a ser de interés (334). Los fagos líticos se unen a receptores de la superficie bacteriana, vierten su contenido genético, se replican, forman nuevas partículas víricas y escapan del citoplasma produciendo la lisis bacteriana, actividad que podría ser comparable a la actividad bactericida de un antibiótico, y que además, puede auto-amplificarse debido a que las nuevas partículas víricas infectarán nuevas células (335). Una de las ventajas es que están ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden ser específicos de cada patógeno, incluso de cada cepa, y por lo tanto no dañan la microbiota (336). Los fagos se pueden administrar de diversas maneras. La terapia convencional consiste en usar un único fago o un cocktail de fagos, que pude tener como diana una única especie bacteriana o bien ser de amplio espectro (337). Actualmente, en Rusia y Georgia, se comercializa un cocktail de fagos llamado Pyophage (PYO), que contiene fagos dirigidos a S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Proteus vulgaris, P. mirabilis y Streptococcus pyogenes (338). La combinación de fagos y antibióticos también ha sido estudiada presentando eficacia tanto in vitro como in vivo frente a los patógenos ESKAPE (339). Por último, también se ha estudiado la utilización de proteínas derivadas de fagos así como fagos diseñados mediante bioingeniería (337). Actualmente, existe una gran variedad de estudios preclínicos en modelos murinos y ensayos clínicos que evalúan la actividad de los fagos frente A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli y K. pneumoniae (334,335). 5.3 Inhibidores de factores de virulencia El mayor conocimiento de la patogénesis bacteriana y la comunicación celular ha revelado la existencia de muchas dianas terapéuticas potenciales que podrían ser útiles para tratar enfermedades causadas por bacterias (340). La inhibición de la virulencia está resultando una estrategia bastante convincente debido a que es posible que se ejerza INTRODUCCIÓN 66 una menor presión selectiva para el desarrollo de resistencias que con las terapias tradicionales (341). Las terapias anti-virulencia se están centrando en actuar contra factores o mecanismos del patógeno que sean cruciales para el inicio de la infección y para causar enfermedad. Esto conlleva a interferir en la adherencia e invasión celular, en la replicación en el interior del huésped, en mecanismos para escapar de la respuesta inmune, en la capacidad de formación de biofilm y finalmente en la comunicación celular y la capacidad de adaptación al ambiente del huésped (342). Además, estas moléculas antivirulencia podrían usarse en combinación con antibióticos consiguiendo una mayor eficacia terapéutica (66,343). 5.3.1 Inhibidores de la adherencia bacteriana Las bacterias usan pilis, fimbrias y adhesinas para entrar en contacto con la célula del huésped. Muchos pilis se ensamblan en la célula bacteriana gracias a una vía dependiente de chaperonas (chaperone usher pathway) (344). Se ha encontrado que pequeñas moléculas inhibidoras de esta vía impiden la formación de pilis de ECUP (345,346). En otro estudio en el cual se utilizan antagonistas de las lectinas FimH, presentes en el pili, también se observa una menor colonización e invasión del epitelio por parte de ECUP, traduciéndose en una disminución de la carga bacteriana en vejiga y orina en un modelo murino de ITU (347). Un gran número de patógenos usa proteínas de la membrana externa para entrar en contacto con el huésped, invadir tejidos y escapar de la respuesta inmune. En este contexto, se han desarrollado inhibidores de las OMPs. El péptido AOA-2 se une a OmpA produciendo una inhibición de la adherencia de A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli a las células del huésped in vitro además de disminuir la mortalidad y reducir la carga bacteriana en modelos murinos de sepsis peritoneal (348). Dándole un valor añadido, se ha visto que AOA-2 también presenta sinergia in vivo con colistina (66). 5.3.2 Inhibidores del quorum sensing Las bacterias pueden emplear la comunicación intracelular para cambiar sus perfiles de transcripción e inducir la expresión de factores de virulencia (349). Esta comunicación, INTRODUCCIÓN 67 a su vez, está estrechamente relacionada con el control de la formación de biofilm, responsable de una amplia variedad de infecciones nosocomiales (350). Debido a que P. aeruginosa presenta uno de los sistemas de quorum sensing más complejos, se han realizado una gran variedad de estudios con este patógeno. Existen compuestos naturales como los flavonoides que inhiben el quorum sensing de P. aeruginosa mediante la inhibición de LasR y RhlR (351). Las furanonas son capaces de reducir la colonización y la mortalidad en modelos murinos de neumonía (352) y enzimas que degradan la molécula señal lactona acil-hemoserina o inhibidores del receptor PqsR presentan eficacia frente a modelos de infección por quemaduras (353,354). Sin embargo, la eficacia de los inhibidores de quorum sensing y su relevancia a nivel clínico no ha sido ampliamente testada debido a que solo se han realizado ensayos con aquellos compuestos que ya estaban previamente aprobados como la azitromicina o el anticancerígeno 5-fluorouracilo (5-FU) (355). 5.3.3 Inhibidores de los sistemas de secreción Los inhibidores de los sistemas de secreción pueden actuar a distintos niveles: evitando el ensamblaje del propio sistema, inhibiendo su interacción con el huésped o bien impidiendo la secreción de los efectores del sistema (340). Existen seis tipos de sistemas de secreción mencionados anteriormente, y en alguno de los casos su función consiste en la translocación de efectores bacterianos, comúnmente toxinas, al citoplasma de la célula huésped (356). Uno de los más relevantes en el caso de los BGN es el sistema de secreción tipo III. El primer inhibidor de este sistema fue descubierto por Linington et al. frente a ECEP (357). Posteriormente, se han identificado otros inhibidores como TS027 y TS103, que inhiben la transcripción de ExoS, componente del sistema de secreción de tipo III de P. aeruginosa (358). 5.3.4 Inhibidores de toxinas La neutralización de las toxinas bacterianas también es una buena estrategia antivirulencia. Actualmente se encuentra en el mercado un compuesto llamado Synorb-Pk, un inhibidor de la unión de la toxina Shiga de ECEH con su receptor Gb3, presente en el riñón (359). Además, se está desarrollando un ensayo clínico de fase II con un INTRODUCCIÓN 68 anticuerpo denominado Shigamab dirigido frente a los toxinas Stx2 de E. coli en pacientes con síndrome urémico hemolítico (360). 5.4 Moléculas con acción sobre el sistema inmune Moléculas que tienen como diana la modulación o activación del sistema inmune del huésped pueden ser eficaces a la hora de resolver la infección bacteriana. Sin embargo, es conveniente usarlas como adyuvantes al tratamiento antimicrobiano (361). 5.4.1 Moléculas moduladoras de la respuesta inmune La lisofosfatidilcolina (LPC) es un componente de los fosfolípidos de las células eucariotas que tiene como función el reclutamiento y la activación de monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos T (362). Se ha demostrado que la LPC en monoterapia aumenta la supervivencia en modelos murinos de ligación cecal y punción por E. coli y en modelos de sepsis peritoneal por A. baumannii (363,364). Además, presenta eficacia in vivo en combinación con antimicrobianos como colistina, tigeciclina o imipenem para A. baumannii multirresistente o con ceftazidima e imipenem para P. aeruginosa multirresistente (365,366). La terapia con el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), también ha mostrado buenos resultados en pacientes con sepsis causada por bacterias grampositivas y gramnegativas (367). Finalmente, la administración de anticuerpos bloqueando el eje PD-1/PD-L1 (receptorligando), conocido por su elevada expresión en los linfocitos T de pacientes con sepsis, mejora la supervivencia en modelos animales de sepsis por punción y ligación cecal (368). 5.4.2 Péptidos antimicrobianos Los péptidos antimicrobianos pueden tener una acción directa sobre la bacteria pero además, promover la activación del sistema inmune para ayudar al huésped a controlar la infección. Existen varios péptidos como el IMX942 o el hLF-1-11 en fase preclínica y clínica (369). Las defensinas hBD-2 y hBD-3, péptidos pertenecientes al sistema inmune innato de los humanos, presentan actividad bactericida frente a cepas de A. baumannii y P. aeruginosa. (370,371). El péptido antimicrobiano humano LL-37, INTRODUCCIÓN 75 INTRODUCCIÓN 76 INTRODUCCIÓN 77 INTRODUCCIÓN 78 INTRODUCCIÓN 79 INTRODUCCIÓN 80 INTRODUCCIÓN 81 INTRODUCCIÓN 82 INTRODUCCIÓN 83 INTRODUCCIÓN 84 OBJETIVOS 91 3. Determinar el mecanismo de acción de rafoxanida sobre cepas de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae sensibles y resistentes a colistina. 4. Evaluar la eficacia terapéutica de la rafoxanida en monoterapia y en terapia combinada con colistina frente a aislados clínicos de A. baumannii, P. aeruginosa y K. pneumoniae resistentes a colistina, en el modelo de sepsis peritoneal murina. 92 V. RESULTADOS 93 CAPÍTULO I Reposicionamiento del tamoxifeno como estrategia antimicrobiana CAPÍTULO I. Artículo 2 94 1.1 Artículo 2. Tamoxifen repurposing to combat infections by multidrug-resistant Gram-negative bacilli. El aumento de la resistencia antimicrobiana se trata de un problema a nivel global y existe una necesidad urgente de aportar soluciones inmediatas. La OMS ha publicado una lista de patógenos para los cuales es imprescindible la investigación y el desarrollo de nuevos antimicrobianos, entre ellos se incluyen los bacilos gramnegativos A. baumannii, P. aeruginosa y Enterobacterales resistentes a carbapenémicos. Debido a que los costes y el tiempo necesario para desarrollar un nuevo antimicrobiano son altos, la estrategia del reposicionamiento de fármacos se encuentra en auge. Siguiendo esta nueva tendencia, el objetivo principal de este capítulo fue estudiar la actividad antimicrobiana del tamoxifeno, un fármaco anticancerígeno usado para el tratamiento de cáncer de mama. El mecanismo de acción del tamoxifeno consiste en antagonizar el receptor de estrógenos, pero además, se ha descrito que puede estar implicado en otras vías de señalización celular como la vía de las MAPK o la regulación de células del sistema inmune. Esta premisa nos lleva a la hipótesis de que el tamoxifeno puede modular/regular el sistema inmune del huésped para una mejor resolución de la infección. En estudios publicados anteriormente, se ha demostrado que el tamoxifeno reduce la transcripción de MCP-1, quimioquina importante para la migración de monocitos desde la médula ósea hasta el torrente sanguíneo, y que además, ésta quimioquina se encuentra sobreexpresada en pacientes con sepsis y shock séptico. A su vez, MCP-1 está regulada por la vía de ERK y la expresión de IL-18. Mediante ELISA y Western Blot se estudiaron los niveles de MCP-1, ERK e IL-18 en ratones y en una línea celular murina de macrófagos, infectados con A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli pre-tratados con tamoxifeno o sin tratamiento. La migración de las células de la inmunidad innata en respuesta a los mismos patógenos, incluyendo células de origen mieloide, monocitos y neutrófilos, se estudió mediante citometría de flujo en ratones wild type (WT), en ratones deficientes en el gen mcp-1 (mcp-/-) infectados y pretratados con tamoxifeno o sin tratamiento. Se evaluó la actividad in vivo del tamoxifeno usando modelos de sepsis peritoneal murinos (inmunodeprimidos e inmunocompetentes) de A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli. Se estudió la función de los principales fagocitos, los macrófagos y neutrófilos, en respuesta a la infección y después del tratamiento con tamoxifeno. Finalmente, se determinó la actividad antibacteriana in vitro de los metabolitos del tamoxifeno: n-desmetiltamoxifeno, CAPÍTULO I. Artículo 2 95 endoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno, mediante ensayos de microdilución y curvas tiempomuerte frente a cepas de referencia y aislados clínicos de A. baumannii y E. coli. Los resultados de este estudio muestran que el tamoxifeno reduce la expresión de MCP- 1 (a través de su vía de señalización) en respuesta a la infección por A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli, reduciendo la migración de células de origen mieloide, monocitos y neutrófilos desde la médula ósea hasta la sangre, modulando en última instancia la respuesta inflamatoria mediada por estas células. En relación a la función de macrófagos y neutrófilos, el tratamiento con tamoxifeno aumenta la capacidad de estas células de eliminar A. baumannii y E. coli, hecho que también podría contribuir a la resolución de la infección. Además, en modelos de sepsis peritoneal murinos por los tres patógenos en ratones inmunocompetentes, el tratamiento con tamoxifeno aumentó la supervivencia animal hasta el 60-100% y redujo la carga bacteriana en bazo, pulmón y sangre entre 3 y 5 log10 UFC/mL. En el caso de los ratones inmunodeprimidos, la supervivencia animal aumentó hasta el 20-60% y la carga bacteriana en sangre y tejidos se redujo en menor medida. Por último, aunque el tamoxifeno no presente actividad antibacteriana in vitro, este estudio muestra que la mezcla de sus tres metabolitos presenta actividad antibacteriana frente a una colección de aislados clínicos de A. baumannii y E. coli in vitro, sugiriendo que el metabolismo del tamoxifeno está relacionado con su eficacia terapéutica in vivo. Por lo tanto, el tamoxifeno presenta eficacia frente a cepas susceptibles y MDR de A. baumannii, P. aeruginosa y E. coli siendo un potencial candidato a ser reposicionado. El manuscrito resultante de este trabajo se encuentra bajo revisión. CAPÍTULO I. Artículo 2 96 Title: Tamoxifen repurposing to combat infections by multidrugresistant Gram-negative bacilli Authors: Andrea. Miró-Canturri1,2†, Rafael. Ayerbe-Algaba1,2†, Raquel. del Toro2,3,5, Jerónimo. Pachón2,4, Younes. Smani1,2*. Affiliations 1Clinical Unit of Infectious Diseases, Microbiology and Preventive Medicine, University Hospital Virgen del Rocío, Seville, Spain. 2Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío/CSIC/University of Seville, Seville, Spain. 3Department of Medical Physiology and Biophysics, Institute of Biomedicine of Seville, University of Seville, Sevilla, Spain. 4Department of Medicine, University of Seville, Seville, Spain. 5CIBER de enfermedades cardiovasculares (CIBER-CV), Spain. Each affiliation should be a separate paragraph. *To whom correspondence should be addressed: Younes Smani, Clinic Unit of Infectious Diseases, Microbiology and Preventive Medicine, Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, Av. Manuel Siurot s/n, 41013, Seville, Spain. Tel: +34-955923100, E-mail: [email protected]. †Both authors have contributed equally to this work. CAPÍTULO I. Artículo 2 97 ABSTRACT The development of new strategic therapies for multidrug-resistant bacteria, like the use of non-antimicrobial approaches and/or drugs repurposing to be used as monotherapies or in combination with clinically relevant antibiotics, has become an urgent need. A therapeutic alternative for infections by multidrug-resistant Gram-negative bacilli (MDR-GNB) is immune system modulation to improve the infection clearance. We showed that immunocompetent mice infected by Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa or Escherichia coli in peritoneal sepsis models and treated with tamoxifen at 80 mg/kg/d for three days reduced the release of MCP-1 and its signalling pathway IL-18 and phosphorylated ERK1/2. This reduction of MCP-1 induced the reduction of migration of inflammatory monocytes and neutrophils from bone marrow to blood. Indeed, the treatment with tamoxifen in murine peritoneal sepsis models reduced the bacterial load in tissues and blood; and increased the mice survival from 0% to 60-100%. Tamoxifen treatment of neutropenic mice infected by these pathogens increased mice survival up to 20-60%. Furthermore, susceptibility and timekill assays showed that the metabolites of tamoxifen, N-desmethyltamoxifen, hydroxytamoxifen and endoxifen, the three together exhibited MIC90 values of 16 mg/L and were bactericidal against clinical isolates of A. baumannii and E. coli. This antimicrobial activity of tamoxifen metabolites parallels’ an increased membrane permeability of A. baumannii and E. coli without affecting their outer membrane proteins profiles. Together, these data showed that tamoxifen present a therapeutic efficacy against MDR A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli in experimental models of infections and can be repurposed as new treatment for GNB infections. INTRODUCTION Infections caused by Gram-negative bacilli (GNB) such as Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli represent an increasing worldwide problem. In 2017, the World Health Organization has listed these pathogens as the first antibiotic-resistant “priority pathogens” that pose the greatest threat to human health. There is, therefore, an urgent need to find new antimicrobial agents against extensive- and pan-drug-resistant GNB. Two key approaches can help alleviate the problem of antibiotic resistance, firstly targeting of bacterial virulence factors without inhibiting bacterial growth, which can slow the development of drug resistance by reducing the selective pressure on the bacteria (1, 2) and, secondly, by the modulation/regulation of CAPÍTULO I. Artículo 2 98 the immune system response to improve the infection development (3, 4). In this way, some studies were focused on the stimulation of the immune system to treat bacterial infections using molecules, including lysophosphatidylcoline as monotherapy and as adjuvant for the antimicrobial treatment (3, 5, 6) or 3’-5’-cyclic diguanylic acid (c-di- GMP) which increase neutrophils protecting against A. baumannii infection (7). Inflammatory monocytes and neutrophils derived from bone marrow are important cellular mediators of innate immune response against bacterial infections. During early stages of bacterial infection, both cell populations migrate from the bone marrow to the bloodstream and subsequently to the sites of infection (8, 9). This migration is regulated partially by the monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), which expression is increased by bone marrow mesenchymal cells in response to circulating Toll-like receptor ligands and produces the mobilization of inflammatory monocytes (10). It is well established that MCP-1 release is controlled by IL-18 and ERK1/2 (11), and the levels of MCP-1 are higher in patients with sepsis and septic shock, and pneumonia (12, 13). It is well documented that anti-cancer drugs like tamoxifen can modify the immune response by regulating cytokine release (14). Mechanistically, tamoxifen has been reported to reduce MCP-1 transcription and expression in human coronary artery endothelial cells and endometrial cancer cells, respectively (15, 16). As MCP-1 is involved in the immune cells migration, it may be hypothesized that an undiscovered connection between MCP-1 release and immune cells migration after bacterial infection and treatment with tamoxifen is present. In prokaryotic cells, tamoxifen is known to present antifungal and antibacterial activities against Mycobacterium tuberculosis and some Gram-positive bacteria in vitro and in vivo (17, 18), but not against Gram-negative bacteria. As with other antimicrobial agent such as colistimethate sodium (19), tamoxifen is a prodrug and converted after liver passage to three major active metabolites, 4-hydroxytamoxifen, endoxifen and N- desmethyltamoxifen (20). However, their antibacterial activities remain unknown. In this study, we report that tamoxifen downregulates the expression of MCP-1, impairing the migration of bone marrow derived cells to the bloodstream induced by A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli and, consequently, modulating the inflammatory response. In murine peritoneal sepsis model, we observe that tamoxifen decreases the development of infection by these pathogens, lowering their concentrations in tissues and blood and increasing the mice survival. Although tamoxifen did not present CAPÍTULO I. Artículo 2 99 bactericidal nor bacteriostatic effects against A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli in vitro, we show that tamoxifen metabolites exhibit high antibacterial activity against A. baumannii and E. coli, suggesting that tamoxifen metabolism is actively involved in the therapeutic efficacy of tamoxifen in vivo. RESULTS Bone marrow immune cells migrates in response to MCP-1 and IL-18 during bacterial infection To determine whether bacterial infection influences circulating immune cells from the bone marrow in response to MCP-1 and IL-18, a MCP-1 controller (11), we administered intraperitoneally A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli to mice and measured the proportions of myeloid cells CD11b+, inflammatory monocytes CD11b+Ly6Chi and neutrophils CD11b+Ly6G+. A. baumannii administration decreased, 24 h after, the myeloid cells, inflammatory monocytes and neutrophils in bone marrow, and increased them in blood (Figures 1A, 1B and 1C). Same results were observed when mice were infected with P. aeruginosa and E. coli (Figures 1A, 1B and 1C). The rates of these immune cells in the spleen remained unchanged after infection with A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli for 24 h (Figure S1) indicating that the increase of circulating monocytes and neutrophils did not proceed from the splenic reservoir (21, 22). A paradigm widely accepted is the formation of chemokine gradients to guide inflammatory cells to the sites of infection (23). Among them, MCP-1 has been shown to be involved in the migration of immune cells from the bone marrow to the bloodstream after binding to CCR2 receptor (24). As it is shown in the figure 1D, mice infected with A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli for 6 and 24 h increased significantly and progressively the release of MCP-1 in mice serum (between ≈1000 and 4000 µg/mL). It is well known that MCP-1 release is controlled by IL-18 and ERK1/2 (11). Consequently, the levels of IL-18 in mice serum gradually increased 6 and 24 h after infection by A. baumannii, P. aeruginosa and E.coli. The IL-18 levels at 24 h were 2144 ± 408.1 µg/mL, 7286 ± 1056 µg/mL and 3124 ± 671.3 µg/mL, respectively (Figure 1E). Moreover, ERK1/2 was phosphorylated 2 h after infection of RAW 264.7 macrophages cell line in vitro by A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli, defining the activation of kinase response to these pathogens (Figure 1F). CAPÍTULO I. Artículo 2 100 To determine whether MCP-1 is involved in the migration of inflammatory monocytes and neutrophils from bone marrow to blood, wild-type (WT) and mice lacking MCP-1 protein (MCP-1 KO mice) were infected by A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli. First, we detected MCP-1 release only in WT mice (Figure 2A). Importantly, the infection of MCP-1 KO mice by these pathogens showed that the migration of inflammatory monocytes and neutrophils from bone marrow to blood (Figures 2B and 2C) exhibits a reduction of 2.17 ± 1.14% and 4.13 ± 0.99%, respectively, for A. baumannii infection. Similar results were observed when MCP-1 KO mice were infected with P. aeruginosa and E. coli strains (Figures 2B and 2C). Non-infected WT and MCP-1 KO mice presented similar inflammatory monocytes and neutrophil proportions in bone marrow and blood indicating that the lack of MCP-1 did not affect the migration of these cells from bone marrow in basal conditions (Figures 2B and 2C). These data suggest that MCP-1 is involved in the traffic of immune cells from the bone marrow to blood after infection by A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli. Tamoxifen impairs the migration of immune cells from bone marrow to blood through MCP-1 regulation In order to study whether tamoxifen can modulate inflammation generated by bacterial infections, we treated RAW 264.7 macrophage cell line with tamoxifen during 24 h and infected them with A. baumannii, P. aeruginosa or E. coli for 2 h. After this incubation we determined the secretion of MCP-1 in the macrophage cells supernatant (ELISA assay) and the phosphorylation of ERK in the macrophage cells by Western blot. The treatment with tamoxifen decreased the release of MCP-1 and the phosphorylation of ERK1/2 in macrophages infected by these pathogens, compared to macrophages without tamoxifen treatment (Figures 3A and 3B). To confirm these data in vivo, mice were treated ip. with 3 doses of 80 mg/kg/d of tamoxifen before the bacterial infection. Serum was collected 6 and 24 h post-bacterial infection. Figure 3C revealed that treatment with tamoxifen reduced MCP-1 levels when compared with A. baumannii, P. aeruginosa or E. coli infected and not treated groups. It is noteworthy to highlight that IL-18 levels were also reduced after tamoxifen treatment of infected mice by A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli (Figure 3D). These results suggest that the reduction of IL-18 secretion due to tamoxifen injection may drive a reduction of MCP-1 release through a reduction of ERK phosphorylation. This MCP-1 reduction after CAPÍTULO I. Artículo 2 107 coli clinical strains from REIPI-GEIH 2010 collection and Bact-OmpA collection (51, 52). Animals Immunocompetent C57BL/6 female mice (16-18 g) were obtained from the University of Seville facility. MCP-1 KO mice were generated with C57BL/6 background and obtained from Jackson Laboratory, USA. All mice had the sanitary status of murine pathogen free and were assessed for genetic authenticity and housed in regulation cages with food and water ad libitum. This study was carried out in strict accordance with the protocol approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the University Hospital of Virgen del Rocío, Seville (0704-N-18). All surgery was performed under sodium thiopental anaesthesia and all efforts were made to minimize suffering. Immunosuppressed mice Blood frequencies of monocytes and neutrophils were reduced with cyclophosphamide treatment following the protocol of Zuluaga et al. (29). Immunocompetent C57BL/6 female mice were treated with cyclophosphamide at 100 and 150 mg/kg at day 4 and 1, respectively, before the bacterial infection. A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli peritoneal sepsis models Murine peritoneal sepsis models with A. baumannii, P. aeruginosa or E. coli strains were established by ip. inoculation of the bacteria in immunocompetent and neutropenic mice (2). Briefly, 6 mice for each group were inoculated with the minimal bacterial lethal dose 100 (MLD100) of the bacterial suspensions mixed in a 1:1 ratio with a saline solution containing 10% (w/v) porcine mucin. The MLD100 of ATCC 17978, Ab9, Ab186, PAO1, Pa39, Pa238, ATCC 25922, C1-7-LE and EcMCR-1+ were 3.2, 5.9, 5.0, 4.9, 3.85, 6.7, 4.7, 2.91 and 6 log CFU/mL, respectively. Mortality was recorded over 3 or 7 days. After the death or sacrifice of the mice at the end of the experimental period, aseptic thoracotomies were performed, and blood samples were obtained by cardiac puncture. The spleen and lungs were aseptically removed and homogenized (Stomacher 80; Tekmar Co., USA) in 2 mL of sterile NaCl 0.9% solution. Ten-fold dilutions of the homogenized spleen, lungs and blood were plated onto Sheep blood agar (Becton CAPÍTULO I. Artículo 2 108 Dickinson Microbiology Systems, USA) for quantitative cultures. If no growth was observed after plating the whole residue of the homogenized tissue and blood, a logarithm value corresponding to the limit of detection of the method (1 CFU) is assigned. Therapeutic effect of tamoxifen in immunocompetent murine models of peritoneal sepsis The immunocompetent murine peritoneal sepsis models by A. baumannii (ATCC 17978, Ab9 and Ab186), P. aeruginosa (PAO1, Pa39 and Pa238), or E. coli (ATCC 25922, C1-7-LE and EcMCR-1+) strains were established by ip. inoculation of the bacteria in immunocompetent mice. Briefly, 6 animals of each group were infected ip. with 0.5 mL of the MLD100 of each strain mixed 1:1 with 10% porcine mucin. Tamoxifen therapy was administered for 3 days at one safe dose of 80 mg/kg/d before bacterial inoculation. Mice were randomly ascribed to the following groups: 1). controls (without treatment), and 2). Tamoxifen administered at 80 mg/kg/d ip. for 3 days before bacterial inoculation with each strain. Mortality and bacterial loads in tissues and blood were determined as in “A. baumannii, P. aeruginosa and E. coli peritoneal sepsis models” section. Therapeutic effect of tamoxifen in immunosuppressed murine models of peritoneal sepsis The neutropenic murine peritoneal sepsis models by A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC 25922 strains were established by ip. inoculation of the bacteria in neutropenic mice. Briefly, animals (6 mice for each group) were infected ip. with 0.5 mL of the MLD100 of each strain mixed 1:1 with 10% porcine mucin. Tamoxifen therapy, mortality and bacterial loads in tissues and blood were determined as in “Therapeutic effect of tamoxifen in immunocompetent murine models of peritoneal sepsis” section. Flow cytometry Blood and bone marrow cells, and spleen samples were prepared from control and infected mice with DML100 of ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922 and pretreated or not with tamoxifen as described before (3, 53). Briefly, blood samples were harvested from mouse periorbital plexuses and resuspended in EDTA. Bone marrow CAPÍTULO I. Artículo 2 109 cells were collected by flushing mouse femurs with ice-cold PBS, and red blood cells were depleted by lysis in a lysis buffer containing 0.15 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3 and 0.01 M of disodium-EDTA. Spleen samples were harvested, homogenized and filtered through a 20 µm mesh prior to red blood cells depletion by lysis buffer. Bone marrow and spleen samples were lysed by lysis buffer for 10 min at 4 °C, whereas blood samples were lysed for 10 min at room temperature. Cells (1-2 x 106 cells per sample) were resuspended in PBS with 2% FBS and then incubated with the appropriate dilution of antibody conjugates. Samples were analyzed with LSRFortessa Flow Cytometer (BD Biosciences, USA) and data obtained were analyzed with DIVA software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). The staining protocols included combination of the following antibodies: anti-CD11b (clone M1/70, APC), anti-Ly6C (clone, AL-21, FITC) and anti-Ly6G (clone 1A8, PE) (BD Bioscience, Spain) diluted at 1:300 in PBS with 2% fetal bovine serum. Cytokine assays Blood samples were collected from periorbital plexuses of mice infected with DML100 of ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922 and pretreated or not with tamoxifen as previously described (11). Serum levels of murine MCP-1, IL-6, IL-18 and TNF-α were collected 6 and 24 h post-bacterial infection without or with tamoxifen treatment. MCP- 1, IL-6, IL-18 and TNF-α levels were determined by ELISA kit (ThermoFisher, for MCP-1) and (Affymetrix eBioscience, for IL-6, IL-18 and TNF-α) in accordance with the manufacturer’s instructions. Furthermore, extracellular medium of RAW 264.7 macrophages cells infected with 8 log CFU/mL of ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922, and pre-incubated or not with 2.5 mg/L tamoxifen for 24 h previous was collected to determine the MCP-1 levels. Cell culture and infection Macrophages cell line RAW 264.7 were obtained from American Type Culture Collection (LGC, UK) and were grown in DMEM medium (Invitrogen, Spain) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, vancomycin (50 mg/L), gentamicin (20 mg/L), amphotericin B (0.25 mg/L) (Invitrogen, Spain) and 1% HEPES (Invitrogen, Spain) in a humidified incubator, 5% CO2 at 37 °C, as described previously (54). RAW 264.7 cells were routinely passaged every 3-4 days. The cells were seeded 24 h in 24 well plates before bacterial infection for western blot and adhesion assay. CAPÍTULO I. Artículo 2 110 Human promyelocytic leukemia HL-60 cells (ATCC CCL-240) were grown in RPMI 1640 medium (GE Healthcare Life Sciences, Spain) supplemented with 10% heatinactivated fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine (Sigma, Spain), 25 mM HEPES, and penicillin/streptomycin solution in a humidified incubator, 5% CO2 at 37 °C. HL-60 cells culture and differentiation were performed as previously describer with minor changes (55). HL-60 cells were incubated with 1.3% DMSO (Sigma, Spain) for 7 days and their differentiation into neutrophils (referred to as HL-60 neutrophils) was monitored by flow cytometry analysis using anti-CD11b (clone ICRF44, APC) (Biolegend) and DAPI as viability marker. Western blot immunoblotting Proteins of infected RAW 264.7 macrophages cells with 8 log CFU/mL of ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922, and pre-incubated or not with 2.5 mg/L tamoxifen were collected, homogenized in RIPA buffer supplemented with 1 mM PMSF and 10% cocktail of protease inhibitors and centrifuged at 13,000 g for 20 min at 4°C. The supernatant was removed and the amount of proteins was determined using the BCA assay (Promega, Spain). The samples were stored at -80ºC until later use. Six μg of proteins of each sample were mixed with an equal volume of 2x Laemmli buffer, denaturated by heating the mixture for 5 min at 95°C, and then resolved by by 4-15% SDS-PAGE. The separated proteins were transferred using polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes (Amersham Bioscience, Spain), and the membranes were blocked for 2 h with PBS and 0.1% (v/v) Tween 20 (PBST buffer) containing 5% (w/v) milk. The PVDF membranes were then incubated overnight at 4ºC with primary antibody: rabbit anti-mouse p44/42 MAPK (Erk1/2) (1:1000 dilution), Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (1:1000 dilution) and β-actin (1:1000 dilution) (Cell Signaling Technology, Spain) diluted in PBST buffer containing 5% milk. After washing with PBST buffer, the membranes were incubated for 1 h at room temperature with a horseradish peroxidaseconjugated donkey anti-rabbit IgG as secondary antibody (GE Healthcare, Spain) (dilution 1:2000) diluted in PBST buffer containing 5% milk. Subsequently, immunoreactive proteins were visualized using the enhanced chemiluminescence protocol (Super ECL, Thermo Scientific, USA). CAPÍTULO I. Artículo 2 111 Macrophages adhesion assay RAW 264.7 cells were pretreated with 2.5 mg/L tamoxifen for 2, 6 and 24 h; and infected with ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922 strains (MOI 1:100) for 2 h with 5% CO2 at 37°C. Subsequently, infected RAW 264.7 macrophages cells were washed five times with prewarmed PBS and lysed with 0.5 % Triton X-100. Diluted lysates were plated onto Sheep blood agar and incubated at 37 ºC for 24 h for enumeration of developed colonies and then the determination of the number of bacteria that attached and invaded RAW 264.7 cells. Alternatively, we determined the concentration of the extracellular medium bacteria by plating diluted extracellular medium onto Sheep blood agar. HL-60 neutrophils were pretreated with 2.5 mg/L for 2 and 6 h; and infected with ATCC 17978, PAO1 and ATCC 25922 strains (MOI 1:100) for 2 h with 5% CO2 at 37°C. Subsequently, HL-60 neutrophils were washed five times with prewarmed PBS by centrifugation and lysed with 0.5 % Triton X-100. Diluted lysates were plated onto Sheep blood agar and incubated at 37 ºC for 24 h for enumeration of developed colonies and then the determination of the number of bacteria. The neutrophil killing index was calculated according to the formula: [(CFU in the absence of neutrophils − CFU in the presence of neutrophils)/ CFU in the absence of neutrophils] × 100 (56). In vitro susceptibility testing and time-kill experiments The MICs of N-desmetyltamoxifen, endoxifen and 4-hydroxytamoxifen and the mixture of the 3 tamoxifen metabolites against A. baumannii and E. coli clinical strains were determined by microdilution assay in two independent experiments, in accordance with CLSI guideline (57). Time-kill kinetic assays of the Ab9 and EcMCR+ strains were conducted in Moeller Hinton Broth in the presence of the mixture of the 3 tamoxifen metabolites at 4xMIC, and were performed in duplicate as previously described (57). Drug-free broth was evaluated in parallel as a control and cultures were incubated at 37°C. Viable counts were determined by serial dilution at 0, 2, 4 and 8 h after adding the 3 tamoxifen metabolites, and plating 100 μL of control, test cultures or dilutions at the indicated times onto sheep blood agar plates. Plates were incubated for 24 h and, after colony counts, the log10 of viable cells (CFU/mL) was determined. CAPÍTULO I. Artículo 2 112 Analysis of outer membrane proteins (OMPs) by SDS-PAGE Bacterial cells of MDR A. baumannii and MDR E. coli were grown in LB broth to the logarithmic phase, incubated with 2 and 16 mg/L of tamoxifen metabolites mixture, respectively, for 4 or 24 h and lysed by sonication. OMPs were extracted with sodium lauroylsarcosinate (Sigma, Spain) and recovered by ultracentrifugation as described previously (43). The OMP profiles were determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using 10% SDS gels and 6 μg protein of OMPs, followed by Simply Blue SafeStain gel (Invitrogen, Spain). Membrane permeability assays Bacterial suspensions (adjusted to O.D600 = 0.2) of MDR A. baumannii and MDR E. coli were placed into a 96-well plate, incubated with 2 and 16 mg/L of tamoxifen metabolites mixture, respectively, and mixed in a solution of PBS containing Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) (1:500) (Invitrogen, USA). After 10 min of incubation, fluorescence was monitored during 160 min using Thyphoon FLA 9000 laser scanner (GE Healthcare Life Sciences, USA) and quantified by ImageQuant TL software (GE Healthcare Life Sciences, USA). Bacterial counts were obtained at the beginning and at the end of the experiment to ensure that metabolites mixture was not presenting bactericidal activity against A. baumannii and E. coli strains. Statistical analysis Group data are presented as means ± standard errors of the means (SEM). For in vitro studies, the Student t test was used to determine differences between means. Differences in bacterial spleen, lung and blood concentrations (mean ± SEM log10 CFU per g or mL) were assessed by analysis of variance (ANOVA) and post-hoc Dunnett’s and Tukey’s tests. Differences in mortality (%) between groups were compared by use of the χ2 test. P values of <0.05 were considered significant. The SPSS (version 21.0; SPSS Inc.) statistical package was used. Acknowledgments: We thank Dr. José Manuel Rodríguez Martinez for the kind gift of the EcMCR+ strain. Funding: This study was supported by the Instituto de Salud Carlos III, Proyectos de Investigación en Salud (grants CP15/00132, PI16/01378 and PI19/01453) and by Plan Nacional de I+D+i 2013‐ 2016 and Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General CAPÍTULO I. Artículo 2 113 de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD16/0016/0009) ‐ cofinanced by European Development Regional Fund “A way to achieve Europe”, Operative program Intelligent Growth 2014‐ 2020. Younes Smani is supported by the Subprograma Miguel 301 Servet Tipo I from the Ministerio de Economía y Competitividad of Spain (CP15/00132). Author contributions: R.T., J.P., Y.S. conceived the study and designed the experiments. A.M.C., R.A.A, R.T, performed experiments and interpreted data. J.P. and Y.S. wrote the manuscript with the input of all the other authors. Competing interests: No conflicts of interest to declare. REFERENCES 1. Rasko DV, Sperandio V. 2010. Anti-virulence strategies to combat bacteriamediated disease. Nat Rev Drug Discov 9:117-128. 2. 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Differentiation and function of mouse monocytederived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunol Rev 234:90-104. CAPÍTULO I. Artículo 2 123 Figure 4. Tamoxifen impairs, after bacterial infection, the migration of immune cells from bone marrow to blood through MCP-1 regulation. Mice received tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days) and infected with minimal lethal dose 100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains. Twentyfour hours post-infection, (A) myeloid cells, (B) inflammatory monocytes and (C) neutrophils were identified as CD11b+, CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6G+ by flow cytometry, respectively, in bone marrow and blood of mice. Data are representative of 6 mice per group and are expressed as mean ± SEM. *P<0.05: treated vs. CTL. CTL: noninfected mice, TAM: tamoxifen. CTL T A M A. bau m a n nii A . bau amann ii+ TA M P . aeru gin osa P . aeru ginosa+ TA M E. coli E. coli+ TA M 0 15 30 45 60 75 C D 11b + viab le c ells (% ) B on e m arro w C TL TA M A . baum an nii A. bauam an n ii+ T A M P . aerug ino sa P . aeruginos a+T A M E. co li E. coli+ TA M 0 15 30 45 60 75 C D 11b + viab le cells (% ) B lo od C TL TA M A . baum an nii A. bauam an n ii+ T A M P . aerugino sa P . aeruginos a+TA M E. co li E. coli+T A M 0 4 8 12 16 20 Ly6C hi viable cells (% ) B on e m arro w C TL TA M A . baum an n ii A. bauam an n ii+T A M P . aerugino s a P . aeruginosa+ TA M E. co li E. coli+T A M 0 4 8 12 16 20 Ly6C hi viable cells (% ) B lo od C TL TA M A . baum an nii A. bauam an n ii+ T A M P . aerugino sa P . aeruginos a+TA M E. co li E. coli+T A M 0 10 20 30 40 50 Ly6G + viab le cells (% ) B on e m arro w C TL TA M A . baum an nii A. bauam an n ii+ T A M P . aerugino sa P . aeruginos a+TA M E. co li E. coli+T A M 0 10 20 30 40 50 Ly6G + viab le cells (% ) B lo od A B C * * * * * * * * * * * * * * * * * CAPÍTULO I. Artículo 2 124 Figure 5. Tamoxifen impairs, after bacterial infection in mice MCP-1-deficient, the migration of immune cells from bone marrow to blood through MCP-1 regulation. (A) WT and MCP-1 KO mice received tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days) and infected with minimal lethal dose 100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains. Twenty-four hours post-infection, (A) inflammatory monocytes and (B) neutrophils were identified as CD11b+, CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6G+ by flow cytometry, respectively, in bone marrow and blood of mice. Data are representative of 6 mice per group and are expressed as mean ± SEM. CTL: non-infected mice. *P<0.05: infected WT vs. infected MCP-1 KO, **P<0.05: infected MCP-1 KO vs. infected MCP-1 KO + TAM, ***P<0.05: infected WT + TAM vs. infected MCP-1 KO + TAM. CTL: non-infected mice, TAM: tamoxifen. A B * * *** * * * * ** CAPÍTULO I. Artículo 2 125 Figure 6. Tamoxifen shows therapeutic efficacy in murine sepsis models by GNB. (A) Mice survival was monitored during 3 days for mice infected with minimal lethal dose 100 (MLD100) of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains treated or not with 3 i.p. doses of tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days). (B) Bacterial burden in spleen, lung and blood of mice treated or not with 3 ip. doses of tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days), and infected with MLD100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains. (C) Mice survival was monitored during 7 days for 6 mice infected with MLD100 of non-MDR and MDR A. baumannii (Ab9 and Ab186), P. aeruginosa (Pa39 and Pa238) or E. coli (C1-7-LE and EcMCR+) strains treated or not with 3 i.p. doses of tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days). *P<0.05: treated vs. untreated, **P<0.05: treated vs. untreated, ***P<0.05: treated vs. untreated. TAM: tamoxifen, MDR: multidrug-resistant. A * ** *** * ** *** * ** *** B C * ** * ** * ** * ** Spleen Lung Blood CAPÍTULO I. Artículo 2 126 Figure 7. Immunosuppressed mice respond to TAM treatment. (A) Mice survival was monitored during 3 days for immunocompetent and neutropenic mice, induced by cyclophosphamide, infected with MLD100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains treated or not with 3 ip. doses of tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days). (B) Bacterial burden in tissues and blood of immunocompetent and neutropenic mice treated or not with 3 i.p. doses of tamoxifen (80 mg/kg/d, for 3 days), and infected with MLD100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains. *P<0.05: bacteria vs. bacteria + CPM, **P<0.05: bacteria + TAM vs. bacteria + CPM + TAM, ***P<0.05: bacteria + CPM vs. bacteria + CPM + TAM. CPM: cyclophosphamide, TAM: tamoxifen. ns: nonsignificant. CAPÍTULO I. Artículo 2 127 Figure 8. Tamoxifen metabolites present antibacterial activity targeting the bacterial membrane. (A) Histogram distribution of MIC for the three tamoxifen metabolites mixture against a collection of A. baumannii and E. coli. (B) Time–kill curves of the MDR A. baumannii Ab186 and E. coli EcMCR+ strains alone and in the presence of metabolites mixture (4xMIC) for 8 h. (C) Tamoxifen metabolites effect on the bacterial permeability. The membrane permeabilization of MDR A. baumannii Ab186 and E. coli EcMCR+ strains in absence and presence of tamoxifen metabolites (2 and 16 mg/L, respectively) incubated for 24 h, was quantified by Typhon Scanner. (D) SDS–PAGE of the outer membrane proteins of MDR A. baumannii Ab186 and E. coli EcMCR+ strains with or without tamoxifen metabolites (2 and 16 mg/L, respectively). MET: The three tamoxifen metabolites together. CTL: control. A 45 33 51 43 MIC50: 16 MIC90: 16 5 19 17 42 MIC50: 8 MIC90: 16 B C D CTL MDR A. baumannii MET 4h MET 24h CTL MET 4h MET 24h MDR E. coli 11 20 35 48 63 75 100 135 kDa CAPÍTULO I. Artículo 2 128 SUPPLEMENTARY MATERIALS Figure S1. Bone marrow immune cells migration to spleen during bacterial infection. Myeloid cells, inflammatory monocytes and neutrophils were identified as CD11b+, CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6G+ by flow cytometry, respectively, in spleen of mice infected with MLD100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains for 24h. Data are representative of 6 mice per group and are expressed as mean ± SEM. CTL: non-infected mice. CAPÍTULO I. Artículo 2 129 Figure S2. Role of MCP-1 in the bone marrow immune cells migration to blood during bacterial infection. Inflammatory monocytes and neutrophils were identified as CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6G+ by flow cytometry, respectively, in bone marrow of WT and MCP-1 KO mice infected with MLD100 of A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli ATCC25922 strains for 24 h. Data are representative of six mice per group, and expressed as mean ± SEM. *P<0.05: MCP-1 KO+TAM vs. MCP-1 KO. WT: wild-type, MCP-1 KO: mice lacking MCP-1. CTL: non-infected mice. * * * * * CAPÍTULO I. Artículo 2 130 Figure S3. Tamoxifen induces phagocytic activity of macrophages and neutrophils. RAW 264.7 cells and HL-60 neurophils were incubated with tamoxifen for 2 and 6h and infected for 2 h with A. baumannii ATCC17978, P. aeruginosa PAO1 or E. coli * * RAW 264.7 HL-60 neutrophils A B CAPÍTULO I. Artículo 2 131 ATCC25922 strains (MOI:100) (A) The adherence and invasion of these strains are expressed as the percentage of total control strain adhered or internalized to RAW 264.7 and the killing index of HL-60 neutrophil cells is expressed as the percentage. (B) The extracellular strains in the culture medium are determined as Log CFU/ml. Data are representative of three independent experiments, and expressed as mean ± SEM. *P<0.05: treated vs. CTL. CTL: infected mice without tamoxifen treatment. TAM: tamoxifen. Figure S4. Immune cells percentages in immunosuppressed mice. Inflammatory monocytes and neutrophils were identified as CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6G+ by flow cytometry, respectively, in blood of neutropenic mice. C TL Cyclo D 5 C yclo D 7 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Ly6C hi + (m onocytes) B lood C TL Cyclo D 5 Cyclo D 7 0 1 2 3 4 5 Ly6G (N eutrophils) B lood 132 CAPÍTULO II Reposicionamiento de la rafoxanida como tratamiento antimicrobiano CAPÍTULO II. Artículo 3 139 CAPÍTULO II. Artículo 3 140 CAPÍTULO II. Artículo 3 141 CAPÍTULO II. Artículo 3 142 CAPÍTULO II. Artículo 3 143 CAPÍTULO II. Artículo 3 144 CAPÍTULO II. Artículo 3 145 CAPÍTULO II. Artículo 3 146 SUPPLEMENTARY MATERIAL MATERIAL AND METHODS Bacterial strains Reference Col-S A. baumannii ATCC 17978 strain,1 P. aeruginosa PAO12 and K. pneumoniae CECT 9973 strains were used in this study. We also used thirteen Col-R A. baumannii clinical isolates from an hospital outbreak in 2000 and from a meningitis patient in 2009,4,5 three P. aeruginosa Col-R clinical isolates from patients with cystic fibrosis,6 and one Col-S and three Col-R clinical isolates of K. pneumoniae from Spanish surveillance study in 20097 (Table S1). MIC susceptibility breakpoint was determined according to the standard recommendations of the EUCAST being susceptible < 2 mg/L and resistant >2 mg/L.8 Antimicrobial agents and reagents For the in vitro assays, standard laboratory powders of colistin sulfate salt (Sigma, Spain) and rafoxanide (Sigma, Spain), imipenem (Sigma, Spain), ciprofloxacin (Sigma, Spain), piperacillin (Sigma, Spain), tazobactam (Sigma, Spain) and vancomycin (Fluka, Spain) were used. For the in vivo experiments, clinical formulation of colistimethate sodium (CMS) (Promixin, Spain) was used. Rafoxanide was prepared by resuspension in DMSO (3.3%) and diluted to obtain a dose of 10 mg/kg. Euthanization of the mice was performed using sodium thiopental (Zambon S.p.A., Italy). In vitro susceptibility testing MICs of colistin (Sigma, Spain), rafoxanide (Sigma, Spain), and colistin in presence of 1 mg/L of rafoxanide against Col-S and Col-R reference and clinical isolates of A. buamannii, P. aeruginosa and K. pneumoniae were determined in two independent experiments by broth microdilution method according to the standard recommendations of EUCAST for A. baumannii, P. aeruginosa and K. pneumoniae.8 One milligram per liter rafoxanide has been used in this experiment because checkerboard assays showed higher synergy with colistin. Initial inoculums of 5.5x105 CFU/mL for each strain cultured in cation-adjusted Moeller Hinton Broth (Ca-MHB) were used in microtiter plates with U bottom (Deltlab, Spain) in presence of colistin, rafoxanide or colistin plus rafoxanide, and incubated for 16-18h at 37ºC. Escherichia coli ATCC 25922 was used as control strain. CAPÍTULO II. Artículo 3 147 Checkerboard assay The assay was performed on a 96-well plate as previously described.9 Colistin was 2- fold serially diluted along the x axis, whereas rafoxanide was 2-fold serially diluted along the y axis to create a matrix, where each well consists of a combination of both agents at different concentrations. Bacterial cultures grown overnight were then diluted in saline to 0.5 McFarland turbidity, followed by 1:50 further dilution Ca-MHB and inoculation on each well to achieve a final concentration of approximately 5.5x105 CFU/mL. The 96-well plates were then incubated at 37°C for 18 h and examined for visible turbidity. The fractional inhibitory concentration (FIC) of the colistin was calculated by dividing the MIC of colistin in the presence of rafoxanide by the MIC of colistin alone. Similarly, the FIC of rafoxanide was calculated by dividing the MIC of rafoxanide in the presence of colistin by the MIC of rafoxanide alone. The FIC index was the summation of both FIC values. FIC index values of ≤0.5 were interpreted as synergistic. The same experiment was performed with imipenem, ciprofloxacin, piperacillin/tazobactam and vancomycin. Time-kill kinetic assays Time kill curves of Col-S A. baumannii ATCC 17978, P. aeruginosa PAO1 and K. pneumoniae CECT 997 strains, and Col-R A. baumannii CR17, P. aeruginosa M5, and K. pneumoniae Kp21 strains were performed in duplicate as previously described.10 Initial inoculums of 1x106 UFC/mL were conducted on Ca-MHB in presence of 1 mg/L rafoxanide and 0.5xMIC colistin alone or in combination. Drug free broth was evaluated in parallel as a control. Tubes of each condition were incubated at 37ºC with shaking and viable counts were determined by serial dilution at 0, 2, 4, 8 and 24 h. Viable counts were determined by plating 100 μL of control, test cultures, or the respective dilutions at the indicated times onto sheep blood agar plates (Beckton Dickinson, USA). Plates were incubated for 24 h at 37 ºC, and after colony counts, the log10 of viable cells (CFU/mL) was determined. Synergy was defined as the reduction of ≥ 2 log10 CFU/mL with the combination respect to the more active drug.11 Therefore, rafoxanide was considered synergistic when in combination with colistin reduced the bacterial concentration ≥ 2 log10 CFU/mL respect to colistin alone. Time-kill curves of Col-R strains, CR17, M5 and Kp21 in presence of 128 mg/L and 256 mg/L of rafoxanide were also performed on Ca-MHB and following the same procedure described above. CAPÍTULO II. Artículo 3 148 Analysis of outer membrane proteins (OMPs) profile Bacterial cells were grown in LB Broth to the logarithmic phase, incubated with 1 mg/L rafoxanide for 4 or 24 h, and lysed by sonication. OMPs were extracted with sodium lauroylsarcosinate (Sigma, Spain) and recovered by ultracentrifugation as previously described.12 The OMP profiles were determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using 10% SDS gels and 6 µg protein of OMPs, followed by Simply Blue SafeStain gel (Invitrogen, Spain). Membrane permeability assays Bacterial cells were grown in LB Broth and incubated in absence or presence of 1 mg/L rafoxanide for 24 h. Pellet was harvested by ultracentrifugation at 4600g for 15 min. Bacterial cells were washed with PBS 1X and after centrifugation in the same condition described before, (i) pellet was resuspended in 100 µL of PBS 1X containing 10 μL of Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) (Invitrogen, USA). After 10 min of incubation, (i) 10 μL of pellet was placed into a slide to visualize by Leica fluorescence microscope (DM- 6000; Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Germany), and (ii) 100 μL was placed into a 96-well plate to measure fluorescence at 0, 10, 15, 20, 30, 40, 70, 100 and 130 min using Typhoon FLA 9000 laser scanner (GE Healthcare Life Sciences, USA) and quantified by ImageQuant TL software (GE Healthcare Life Sciences, USA). Transmission electron microscopy visualization Bacterial cells were grown in LB Broth, incubated in absence or presence of 1 mg/L rafoxanide for 24 h. Pellet was harvested by ultracentrifugation at 4600g for 15 min and resuspended in 2.5 % glutaraldehyde containing 0.1M cacodylate buffer in order to fix the samples. After three rounds of centrifugation in the same condition described above and washed with 0.1M cacodylate buffer, pellet was included in agarose resin by automatic processor and ultrathin sections were obtained by ultramicrotome. These sections were placed into a grid to visualize by Zeiss Libra 120 transmission electron microscope. Zeta potential measurements Zeta potential measurements were performed as we previously described.13 Briefly, the bacterial surface was cleansed by washing twice with Milli-Q water, resuspended in Milli-Q water at 1x108 CFU/mL, and diluted 10-fold in the same medium immediately