Inoculantes bacterianos para una agricultura sostenible: análisis bioinformático del genoma y aplicación en experimentos piloto

Inoculantes bacterianos para una agricultura sostenible: análisis bioinformático del genoma y aplicación en experimentos piloto. Inoculantes bacterianos para una agricultura sostenible: análisis bioinformático del genoma y aplicación en experimentos piloto. Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla Sandra Arjona Pino Facultad de Farmacia, Universidad de SevillaSandra Arjona Pino TFG EXPERIMENTAL Sandra Arjona Pino Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado, carácter experimental Grado en Farmacia “Inoculantes bacterianos para una agricultura sostenible: análisis bioinformático del genoma y aplicación en experimentos piloto” Departamento de Microbiología y Parasitología Profesorado tutor: Eloísa Pajuelo Domínguez (Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia) 1 Resumen Los objetivos de este TFG han sido: 1) utilizar la bacteria Pantoea agglomerans RSO7 (una bacteria PGPR previamente aislada de marismas contaminadas por metales pesados) para inocular plantas de interés agronómico, y 2) aislar su ADN, secuenciar su genoma y hacer un análisis del mismo. P. agglomerans RSO7 mejoró el crecimiento de alfalfa in vitro. Los efectos beneficiosos se observaron principalmente en situación de limitación de nutrientes y afectaron sobre todo a la raíz (mayor masa, longitud y ramificación), aunque también incrementó la longitud del tallo, si bien las diferencias no fueron significativas. Además, mejoró la supervivencia de las plantas y disminuyó la contaminación por hongos. El análisis global del genoma revela que esta bacteria es capaz de adaptarse a una gran cantidad de situaciones ambientales y tolerar muchos tipos de estrés (calor, frío, radiación UV, estrés oxidativo, etc.). Además de una amplia versatilidad metabólica, se han detectado genes de resistencia a metales pesados (As, Cu, Ni, Co, Zn, Te), a sal (producción de osmoprotectores como glicina betaína, prolina, trehalosa, etc.) y a diversos compuestos tóxicos xenobióticos. Respecto a las propiedades PGPR, se han detectado genes de solubilización de fosfatos (fosfatasas extracelulares, acil-fosfatasas, mio-inositol fosfatasas) y de producción y/o captación de variedad de sideróforos (ferritinas, enterobactina, acromobactina, hemina, etc.). Además, se han identificado genes que participan en importantes procesos rizosféricos (movilidad, quimiotaxis, diálogo planta-bacteria, quorum sensing y competencia en la rizosfera). Finalmente, y dado que la bacteria pertenece al grupo de bioseguridad 2, se han buscado posibles genes implicados en patogenicidad, encontrándose genes de resistencia a múltiples antibióticos y varios sistemas toxina/antitoxina. Los resultados sugieren el gran potencial de esta bacteria en agricultura. Sin embargo, las restricciones al uso de microorganismos de grupo 2 como bioinoculantes podrían limitar su utilización, por lo que también se han revisado posibles alternativas bioseguras. Palabras clave: Bioinoculantes, Pantoea agglomerans RSO7, PGPR, genoma 2 ÍNDICE 1. Introducción .........................................................................................3 2. Objetivos .............................................................................................6 3. Metodología .........................................................................................6 3.1. Desinfección superficial de las semillas ...................................................................6 3.2. Preparación de la placa y cultivo de alfalfa ..............................................................6 3.3. Determinación del crecimiento de la raíz principal ....................................................7 3.4. Determinación del índice de ramificación de la raíz ..................................................7 3.5. Determinación del índice de supervivencia ..............................................................8 3.6. Determinación del crecimiento del tallo y número de trifolios ....................................8 3.7. Análisis estadístico ................................................................................................8 3.8. Extracción del ADN genómico de Pantoea agglomerans RSO7 ................................8 3.9. Secuenciación del genoma .....................................................................................9 4. Resultados y discusión............................................................................9 4.1. Efecto de la inoculación sobre la supervivencia de la planta .....................................9 4.2. Efecto de la inoculación sobre el crecimiento de la raíz principal............................. 11 4.3. Efecto de la inoculación sobre el índice de ramificación ......................................... 12 4.4. Efecto de la inoculación sobre parámetros del tallo ................................................ 14 4.5. Secuenciación del genoma ................................................................................... 16 4.6. Estudio detallado del genoma ............................................................................... 17 4.6.1. Genes relacionados con la resistencia a metales pesados .............................. 18 4.6.2. Genes relacionados con la resistencia a la sal (alta osmolaridad) ................... 20 4.6.3. Genes relacionados con las propiedades PGPR ............................................. 23 4.6.3.1. Genes relacionados con el trasporte y metabolismo de hierro ......................... 23 4.6.3.2. Genes relacionados con el fosfato y con la solubilización de fosfato. .............. 27 4.6.4. Genes relacionados con procesos rizosféricos importantes para la colonización y la interacción planta microorganismo .............................................................................. 29 4.7. Bioseguridad ....................................................................................................... 32 5. Conclusiones ...................................................................................... 32 6. Bibliografía......................................................................................... 33 3 1. Introducción El interés por el medio ambiente está cada vez más presente en la vida de las personas, de modo que los riesgos climáticos se encuentran a la cabeza de las preocupaciones del planeta actualmente en términos de probabilidad de ocurrencia, reconociéndosele su enorme impacto potencial (World Economic Forum, 2020). Por ello, y puesto que viene siendo una preocupación recurrente en los últimos años que se agrava cada vez más, se han tomado numerosas medidas para intentar frenar su deterioro. Entre estos intentos de mejora, se encuentra la búsqueda de métodos de fertilización menos contaminantes que los productos de síntesis química que se utilizan habitualmente. Es aquí donde destacamos la existencia de los bioestimulantes de plantas, los cuales quedaron definidos por du Jardin (2015) de la siguiente forma: “un bioestimulante de plantas es cualquier sustancia o microorganismo aplicado a las plantas con el objetivo de mejorar la eficiencia nutricional, la tolerancia al estrés abiótico y/o los rasgos de calidad del cultivo, independientemente de su contenido de nutrientes”. Dichos bioestimulantes quedan recogidos en el nuevo reglamento de la Unión Europea sobre fertilizantes (2019/1009) como una alternativa a considerar y promover frente a los métodos agroquímicos, que son los mayoritariamente usados en la actualidad, lo cual justificaría el interés en la búsqueda de nuevos microorganismos que puedan presentar dichas características. A las bacterias que se encuentran en el suelo, que son capaces de asociarse con las plantas de forma natural y proporcionarles a estas un beneficio, se les clasifica como PGPR (siglas de Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), que pueden colonizar la rizosfera (suelo donde se encuentran las raíces), el rizoplano (superficie de la raíz) o la raíz en sí (tejidos radiculares) (Gray and Smith, 2005). Algunos de los géneros bacterianos más frecuentemente utilizados como PGPR son Pseudomonas, Bacillus, Azospirillum, Azotobacter, Rhizobium, Enterobacter , etc. (Ferreira et al., 2019). Existen diversos mecanismos por los cuales las PGPRs pueden promover el crecimiento vegetal, se clasifican en mecanismos directos e indirectos. Los mecanismos directos son aquellos que proporcionan nutrientes o regulan el crecimiento. Los mecanismos indirectos son aquellos que protegen a las plantas de adquirir infecciones (estrés biótico) o ayudan a la planta a crecer sana durante un periodo de estrés ambiental (estrés abiótico) (Goswami et al., 2016). 4 Tabla 1. Clasificación de algunos de los mecanismos de acción de las bacterias PGPR (Dweipayan Goswami et al., 2016). Directos Indirectos Fijación biológica del nitrógeno Producción de sideróforos Solubilización de fosfatos Producción de quinasas y glucoquinasas Producción de auxinas Inducción de resistencia sistémica Producción de citoquinas Producción de ácido 1-aminociclopropano-1- carboxílico desaminasa (ACC desaminasa) Producción de giberelinas Resistencia ante el estrés abiótico Mecanismos directos El N es un factor limitante del crecimiento vegetal, ya que no pueden usarlo en su forma inerte y mayoritaria (nitrógeno atmosférico N2). La asociación de la planta y ciertos microorganismos permiten el aprovechamiento de esta forma del nitrógeno (Iqbal, 2016). El P es el segundo de los factores limitantes para el crecimiento vegetal, por detrás del N. Algunos microorganismos con propiedades PGPR son capaces de solubilizar y mineralizar el fósforo insoluble del suelo para fomentar el crecimiento de la planta. Para ello, o bien secretan ácidos o liberan el fósforo de compuestos orgánicos mediante enzimas como fosfatasas y fitasas (Alori et al., 2017). Las auxinas son unas fitohormonas que regulan la mayoría de los procesos llevados a cabo por la planta, siendo consideradas como las responsables de la mayoría de los fenómenos de desarrollo en esta. Algunas bacterias PGPR son capaces de sintetizar auxinas, que favorecen el desarrollo de la raíz, la ramificación de raíces secundarias y la formación de más pelos radiculares por los que se absorben los nutrientes (Ahmed y Hasnain, 2014). Las citoquinas son otros reguladores del crecimiento de plantas, que pueden ser también producidas por algunas bacterias PGPR ayudando a su desarrollo (Liu et al., 2013). Finalmente, también son capaces, en ocasiones, de sintetizar giberelinas que son fitohormonas importantes para el desarrollo de la planta (Kang et al., 2013). Mecanismos indirectos El Fe, esencial para la planta, puede ser asimilado en forma de sideróforos producidos por las bacterias a las que se asocian. Además de proporcionar Fe a las bacterias y liberarlo para las plantas, el secuestro de Fe es un mecanismo de biocontrol que impide el desarrollo de otros microorganismos fitopatógenos (Aznar y Dellagi, 2015). 5 La producción de quinasas y gluconasas por algunas bacterias PGPR permite controlar los patógenos del suelo mediante la degradación de su pared celular (Chet et al., 1990; Kobayashi et al., 2002; Goswami et al., 2016). Las bacterias PGPR protegen a la planta de enfermedades a través de la resistencia sistemática inducida (ISR) (Goswami et al., 2016). Hay algunas bacterias PGPR que son capaces de producir ACC desaminasa, enzima que convierte ACC (un precursor inmediato de la biosíntesis de etileno en la ruta de la metionina en plantas superiores) en amoníaco y α-cetobutirato en lugar de etileno. La regularización del nivel de etileno en las plantas reduce los efectos generados por el estrés abiótico o biótico (Mayak et al., 2004; Barnawal et al., 2012; Singh y Jha, 2017). En el caso que nos ocupa, hemos seleccionado una bacteria denominada Pantoea agglomerans RSO7, una bacteria Gram negativa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Este microorganismo ya había demostrado previamente tener muy buenas propiedades PGPR en la planta a la que hospeda de forma natural (Paredes- Páliz et al., 2016) (tabla 2): Tabla 2. Propiedades estudiadas de Pantoea agglomerans RSO7 y posible interés para la planta (Paredes-Páliz et al., 2016). Propiedades PGPR Pantoea agglomerans RSO7 Fijación de nitrógeno + Solubilización de fosfatos + Producción de sideróforos + (halo de 15 ± 2 mm) Producción de auxinas + (14,07 ± 1,67 mg/L) ACC desaminasa - Resistencia a Cu 8mM Resistencia a Zn 6mM Resistencia a Pb >10mM Biocontrol + (este trabajo) La planta a la que hospeda en la naturaleza se llama Spartina maritima , una especie presente en las marismas del suroeste de España (Castillo et al., 2010) que, aunque tiene un gran interés medioambiental, no es una planta de cultivo. Para este estudio se ha seleccionado la alfalfa, planta perteneciente a la familia Fabaceae , por tres razones: 1) tras los cereales, las leguminosas son los cultivos de mayor importancia, fuente de proteínas de alta calidad, fibra, grasas insaturadas, minerales y vitaminas (Maphosa y Jideani, 2017); 2) se adaptan a suelos estresados (salinos o ácidos); y 3) se asocian a bacterias conocidas como rizobios y forman nódulos simbióticos en los que se produce la fijación biológica de N2, con lo que no necesitan fertilizante nitrogenado y son cultivos ecológicos (Ngatia et al., 2019). 6 Centrándonos no solo en la familia, sino en la especie concreta, la alfalfa, Medicago sativa , es una planta tetraploide perteneciente al género Medicago , de amplio uso en alimentación animal y, en menor medida, humana. Por otra parte, existe otra planta del mismo género, Medicago truncatula , que es un modelo de leguminosa diploide con la particularidad de tener su genoma completamente secuenciado (Benedito et al., 2008). Esto quiere decir que, en el caso de querer investigar en un futuro los mecanismos moleculares de la interacción entre la alfalfa y nuestra bacteria P. agglomerans RSO7, se dispondrá de información genética de una especie con gran homología. 2. Objetivos Con estos antecedentes, nuestros objetivos son: • Comprobar que efectivamente promueve el crecimiento de la planta escogida, en este caso, la alfalfa, mediante un test de placas. • Secuenciar el ADN completo de Pantoea agglomerans RSO7 y realizar un estudio bioinformático del mismo. • Localizar los genes implicados en las propiedades PGPR y de la resistencia a metales pesados y salinidad de la bacteria. 3. Metodología 3.1. Desinfección superficial de las semillas Las semillas se desinfectaron superficialmente sumergiéndolas durante 5 minutos en alcohol al 90%, tras lo cual se lavaron abundantemente con agua destilada estéril. Posteriormente, se trataron con una disolución de hipoclorito sódico (lejía comercial diluida 1:5) durante 5 minutos. Finalmente, se lavaron de nuevo abundantemente con agua destilada estéril para eliminar restos de lejía que pudieran inhibir la germinación. 3.2. Preparación de la placa y cultivo de alfalfa Para llevar a cabo la prueba fueron utilizadas 8 placas cuadradas estériles de 20cm x 20cm. Como medio de cultivo para las plantas se utilizó el medio BNM (Buffered Nodulation Medium) que es específico para leguminosas. Este medio carece de fuente de nitrógeno ya que se utiliza para estudios de nodulación leguminosa-rizobio (Ehrhardt et al., 1992). Puesto que, en este caso, las plantas de alfalfa no están inoculadas con rizobio, el medio se suplementó con nitrato amónico 2.5 mM. El medio se ha utilizado a concentración normal (a la que se le denominará BNM x1) y a una concentración con la mitad de los nutrientes (a la que se le denominará BNM x1/2). 7 Se prepararon cuatro placas con medio BNM x1 y otras cuatro con medio BNM x1/2. Una vez que el medio solidificó en las placas, se procedió a la colocación de las semillas. Se colocaron en el borde superior del medio, mediante el uso de unas pinzas esterilizadas. En cada placa se colocó una media de 11-14 semillas, a una distancia equidistante entre ellas. Tras esto, se inocularon las placas dentro de una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad. A las placas que denominaremos “inoculadas” se les puso 100 μL del cultivo de P. agglomerans RSO7 con medio TSB sobre cada una de las semillas, mientras que a las que denominamos “sin inocular” solo se les añadió medio TSB. Las placas se sellaron por el borde con parafilm y la parte inferior de las mismas se cubrió con cartulina negra para evitar que la luz incidiera sobre las raíces, mientras que la parte superior se dejó al descubierto. Las placas se incubaron durante 16 días en una cámara de cultivo de plantas con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, con un régimen de temperatura día:noche de 22:18ºC. El día 8 se volvió a inocular las placas con el cultivo en medio TSB a aquellas que contenían la bacteria inicialmente (5 μL a cada semilla) y solo con TSB a las que no estaban inoculadas en un principio. 3.3. Determinación del crecimiento de la raíz principal Para saber cómo afecta la presencia o no de la bacteria P. agglomerans RSO7 al desarrollo de la raíz, se midió a partir del segundo día de crecimiento el tamaño de la raíz de cada una de estas día a día. A partir del día 8 de medida, se midió el tamaño de la raíz cada cuatro días hasta llegar al día 16. Una vez se obtuvieron todos los datos, se calculó la media diaria del tamaño de las raíces por placa, descartando todas aquellas semillas no viables o desprendidas del agar. Usando estas medias diarias se estableció la cinética del crecimiento de la raíz y se representó gráficamente. 3.4. Determinación del índice de ramificación de la raíz Otro de los parámetros que se compararon entre las placas inoculadas y no inoculadas fue el número de raíces secundarias que crecía en cada semilla. Para ello, se mantuvo el recuento de estas durante siete días, y una vez obtenidos los datos, se realizó la media del número de raíces secundarias por semilla al día en cada placa y con estas tablas se representó una gráfica para establecer una comparativa visual entre las plantas inoculadas y no inoculadas, tanto en medio BMN x1 como BNM x1/2. 14 Se realizó la prueba T-Student para ambas condiciones, de donde se obtuvieron los siguientes resultados: • Para medio de cultivo BNM x1, p=2,613-5, existe diferencia significativa. • Para medio de cultivo BNM x1/2 p=0,002, existe diferencia significativa. En este caso sí existen diferencias significativas para ambos casos, en un principio, porque puede que la bacteria ejerza un efecto positivo para el crecimiento de las raíces secundarias en ambos medios, destacando especialmente en el caso de BNM x1, lo cual puede deberse a que, en un medio BNM x1/2, al tener falta de nutrientes, incluso las plantas no inoculadas tienen tendencia a desarrollar raíces secundarias para así intentar captar un mayor número de nutrientes del medio. Estos efectos están relacionados con la capacidad de la bacteria de sintetizar auxinas (Paredes-Páliz et al., 2016a), ya que estas fitohormonas regulan, entre otros procesos, el crecimiento y ramificación de la raíz y el desarrollo de un mayor número de pelos absorbentes (Weijers et al., 2018). 4.4. Efecto de la inoculación sobre parámetros del tallo El último día de medida, día 16, se midieron los tallos de todas las plantas para establecer o no la presencia de diferencias que podrían haberse producido al estar sometidas a distintas condiciones. Los resultados se muestran en la tabla 6. Los datos presentan un aumento en el tamaño medio del tallo de las plantas de las plantas inoculadas frente a aquellas que estaban sin inocular, tanto en medio con la totalidad de nutrientes, BNM x1 como en el medio deficitario en estos, BNM x1/2, siendo mayor la diferencia en este último caso. El incremento del tallo en BNM x1 fue del 20%, mientras que el incremento de la longitud del tallo en medio BNM x1/2 fue del 53%. Estos resultados sugieren que hay un mayor efecto promotor del crecimiento en condiciones de limitación de nutrientes. Tabla 6. Media del tamaño del tallo y el número de trifolios de las plantas inoculadas y no inoculadas en medio BNM x1 (normal) y BNM x1/2 (mitad de nutrientes). Medio de cultivo Condiciones de inoculación Media del tamaño del tallo (cm) Media del número de trifolios BNM x1 Sin inocular 5,79 ± 0,49 (n= 16) 2,19 ± 0,85 (n= 16) Inoculado 6,88 ± 0,63 (n=17) 3,41 ± 0,33 (n= 17) BNM x1/2 Sin inocular 5,42 ± 0,66 (n=14) 2,28 ± 0,26 (n= 14) Inoculado 8,31 ± 0,55 (n=19) 3,42 ± 0,24 (n= 19) Se realizó la prueba T-Student para ambas condiciones, de donde se obtuvieron los siguientes resultados para la media del tamaño del tallo: • Para medio de cultivo BNM x1, p= 0,185, no existe diferencia significativa. 15 • Para medio de cultivo BNM x1/2 p= 0,001, existe diferencia significativa. En este caso, vuelve a no existir una diferencia significativa en los medios BNM x1, esto puede deberse a que las plantas en ambas condiciones crecen muy bien al tener una cantidad óptima de nutrientes, y las placas no están preparadas para tener un tallo de gran tamaño, puesto que son llenadas de más de la mitad de medio, quedando apenas unos 11-14 cm de máximo para que el tallo crezca. La limitación de espacio puede frenar su crecimiento, siendo éste el motivo más probable por el que puede no existir una diferencia significativa en el supuesto considerado. También se realizó un recuento del número de trifolios de todas las plantas y se hizo la media entre aquellas sometidas a las mismas condiciones. Los resultados se muestran en tabla 6. Se realizó la prueba T-Student para ambas condiciones, de donde se obtuvieron los siguientes resultados: • Para medio de cultivo BNM x1, p=0,003, existe diferencia significativa. • Para medio de cultivo BNM x1/2 p=0,011, existe diferencia significativa. Existen diferencias significativas en el número de trifolios tanto en el caso de BNM x1 como en el de BNM x1/2, siendo el número de estos ligeramente superior en el último caso probablemente porque, al tener menos nutrientes en el medio, la fotosíntesis, realizada por medio de estos trifolios, puede cobrar una mayor relevancia. Por último, también se realizaron unas fotografías para establecer una comparativa visual entre las placas inoculadas y las placas sin inocular. En el caso de las placas con medio completo BNM x1 mostraba alguna diferencia en su apariencia, pero lo más llamativo sucedió en el caso de las placas BNM x1/2 donde se podía ve claramente el efecto beneficioso de la bacteria sobre la planta, como se muestra en la figura 7: Figura 7. Aspecto de plantas de alfalfa cultivadas en medio BNM x1/2 inoculadas (A) y no inoculadas (B) (día 16). A B 16 4.5. Secuenciación del genoma En primer lugar, se hizo una evaluación de la calidad de la secuenciación. Para ello, se evaluaron dos parámetros estadísticos: Calidad de la secuenciación por base: Se evaluó mediante un parámetro logarítmico Q conocido como nivel de calidad Phred. Este parámetro da la probabilidad de que una base determinada sea correcta en la secuencia (Ewing et al., 1988; Ewing y Green, 1988). Así, por ejemplo, un valor de 20 indica que hay 1 en 100 (102) probabilidades de que la base sea incorrecta. La figura 8 muestra los valores de Q para las bases según su posición en la lectura. Los valores de Q van desde 30 a 40 aproximadamente, lo que indica que la probabilidad de que la lectura de estas bases sea correcta está comprendida entre 99,99 y 99,999%. Figura 8. Análisis de la calidad de la secuencia mediante el parámetro Q (nivel de calidad Phred) según la posición de las bases en la lectura. La línea azul representa la media de los valores de Q y la línea roja representa la mediana. Calidad de la secuenciación global. La figura 9 representa el número de bases que tienen un determinado índice Q. De casi 4,6 millones de bases que contuvo la secuencia total, menos de 2000 presentaban un índice Phred inferior a 30, es decir, que la probabilidad de que sean incorrectas es 10-3, o sea, que son correctas en un 99,9%. El resto tienen valores de Q más altos, por lo que la probabilidad de que sean correctas es mayor (hasta 99,99%), lo que correspondería a un valor de Q de 40. Utilizando estos criterios, las secuencias que presentaron una lectura de mala calidad se eliminaron. El ensamblaje del genoma produjo 717 contigs. Este número puede parecer bastante alto, sin embargo, hay que destacar que los 100 primeros contigs más largos aglutinaban un 96% del genoma, ya que se encontraron 86 contigs con un tamaño 17 superior a 1 Kb. El contig con el tamaño superior contenía 187.661 pb. En el otro extremo, la mayoría del resto de los contigs tenían menos de 300 pb, con lo cual es poco probable que codifiquen un gen. De todas formas, se han conservado en el análisis. El valor de N50 (un parámetro estadístico que evalúa la longitud media de un set de secuencias; es decir, que al menos el 50% del genoma está contenido en un número de contigs igual o superior a ese número) fue de 73.054. 4.6. Estudio detallado del genoma Un análisis global del genoma revela que P. agglomerans RSO7 es una bacteria muy versátil y es capaz de adaptarse a una gran cantidad de situaciones ambientales. Por ejemplo, se han encontrado operones para la utilización de un gran número de fuentes de C (sorbitol, tartrato, citrato, xilulosa, galactofuranosa, ramnosa, arabinosa, galactosa, maltosa, manosa, etc.). También puede utilizar diversas fuentes de N (nitrato, amonio, aminoácidos, incluso se han detectado genes de fijación de N2) y S (sulfato, aminoácidos como cisteína y metionina junto a taurina). Junto a su versatilidad metabólica, esta bacteria muestra resistencia a muchos tipos de estrés, no solo a metales pesados y salinidad, sino también a calor, frío, radiación UV, ácidos, estrés oxidativo (se han encontrado catalasas y diversas peroxidasas, así como superóxido dismutasa y glioxilasa) y diversos xenobióticos como compuestos azoicos (se ha encontrado una FMN-azorreductasa), curcumina (se ha encontrado una curcumina reductasa), a compuestos con grupos formilo (posee formilasa y formil-transferasa), compuestos halogenados (gracias a una dehalogenasa), compuestos con grupos nitro (se ha encontrado una nitrorreductasa), etc. Por otra parte, se han encontrado varios genes ( Syx, crp ) que indican que es competente natural, siendo capaz de incorporar ADN y por lo tanto de adquirir nuevas capacidades. También puede adquirir ADN plasmídico mediante conjugación, habiéndose detectado genes del precursor de pilina, una ATPasa implicada en la retracción del pilus y los genes ppdAB implicados en Índice Q (nivel de calidad) Phred) Número de bases Figura 9. Análisis global de la calidad de la secuencia mediante el parámetro Q (nivel de calidad Phred). 18 conjugación. La presencia de integrasas y genes de fagos (lisogenia) hace sospechar que también pueda adquirir información genética mediante transducción. Todo esto indica que está muy bien equipada para adaptarse a muchas variaciones medioambientales y es muy competitiva en la rizosfera. En particular, de todos los genes nos vamos a centrar en cuatro aspectos que son fundamentales para su aplicación como bacteria promotora del crecimiento vegetal: • Resistencia a metales pesados. • Resistencia a sal (alta osmolaridad). • Propiedades PGPR: genes relacionados con el metabolismo y trasporte del hierro y con el fosfato o la solubilización de este. • Procesos rizosféricos importantes para la colonización e interacción plantamicroorganismo. 4.6.1. Genes relacionados con la resistencia a metales pesados El análisis manual reveló que el genoma lleva operones en racimo que codifican proteínas relacionadas con la resistencia al arsénico (As) y cobre (Cu), así como genes para la tolerancia al Zn, Co y Ni y al Te. Tabla 7. Genes de resistencia a metales pesados encontrados en el genoma de Pantoea agglomerans RSO7. Metal/ Metaloide Gen Producto génico/función Máxima identidad Número de acceso Cobre CopA ATPasa tipo P exportadora de cobre. Participa en la salida de cobre. COPA_STAAB ( Staphylococcus aureus) Q2YWA3 CueR Regulador transcripcional tipo HTH CueR. Detecta el estrés citoplásmico de cobre y activa la transcripción en respuesta a este. CUER_SALTY (Salmonella typhimurium) Q93CH6 CueO Cobre-oxidasa periplásmica. Implicada en la detoxificación al oxidar Cu+ a Cu2+ impidiendo su captación al citoplasma. CUEO_YERPE ( Yersinia pseudotuberculosi s ) Q8ZBK0 ComR Represor transcripcional de tipo HTH ComR. Reprime la transcripción cuando bajan los niveles de cobre. COMR_ECOLI ( Escherichia coli ) P75952 YebZ Proteína de membrana interna YebZ. Media en la salida de iones de cobre. YEBZ_ECOLI (Escherichia coli) P39172 CutC Proteína de homeostasis de cobre CutC. Participa en el control de la homeostasis del cobre. CUTC_ERWT9 ( Erwinia tasmaniensis) B2VJB9 CusS A4752 sensor de Cu. CUSS_ECOL6 (Escherichia coli) Q8FK37 19 Zinc ZitB Transportador de zinc ZitB. Reduce la acumulación de Zn en el citoplasma haciendola más resistente al zinc. ZITB_SALTY ( Salmonella typhimurium) Q8ZQT3 ZntB Proteína de transporte de zinc ZntB. Transportador transmembrana que media la salida de iones de zinc. ZNTB_CITK8 (Citrobacter koseri) A8AGD8 Arsénico ArrH FMN-reductasa dependiente de NADPH. Inducible por As. ARREH_ACIF2 ( Acidithiobacillus ferrooxidans) B7J950 ArsB Bomba de expulsión de As (III) utilizando como energía gradiente de H+. ARSB1_ECOLX ( Escherichia coli) P08691 ArsC Arseniato reductasa. ARSC_ECOLI ( Escherichia coli) POAB96 YffB Proteina YffB. Pertenece a la familia ArsC. YFFB_ECOLI ( Escherichia coli) P24178 Níquel y cobalto RcnA Sistema de eflujo de níquel / cobalto putativo HI_1248. Sistema de eflujo de níquel y cobalto. Y1248_HAEIN ( Haemophilus influenzae) P44136 Magnesio y cobalto CorC Proteína implicada en la expulsión de magnesio y cobalto CorC. CORC_SALTI ( Salmonella typhimurium ) P0A2L4 CorA Proteína de expulsión de magnesio y cobalto CorA. Homeostasis del Mg. CORA_THEMA ( Thermotoga marítima ) Q9WZ31 Hierro FetA Proteína de unión a ATP FetA. Parte del transportador de tipo ABC FetAB, implicada en la exportación de Fe y en la resistencia al estrés oxidativo mediada por H2O2. Aporta la energía para el sistema de transporte. FETA_ECOLI ( Escherichia coli) P77279 FetB Permeasa FetB. Parte del transportador de tipo ABC FetAB, implicada en la exportación de Fe y en la resistencia al estrés oxidativo. FETB_ECOLI ( Escherichia coli) P77307 Teluro TehB Telurito metiltransferasa. Es responsable de la resistencia al teluro. TEHB_ECOLI ( Escherichia coli) P25397 Reguladores Gen Producto génico/función Máxima identidad Número de acceso Zinc y plomo HydH G Regulador transcripcional ZraR. Miembro del Sistema regulador de dos componentes ZraS/ZraR. Además de autorregular la expresión del operón ZarSR, regula la de ZarP. ZRAR_ECOLI ( Escherichia coli) P14375 Multimetal : Co, Cd y Zn. CzcR Regulador transcripcional CzcR. Forma parte del sistema de dos componentes CzcSR que controla la expresión de diferentes sistemas de resistencia a metales pesados. CZCR_CUPMC (Cupriavidus metallidurans) Q44006 Uno de los mecanismos más frecuentes de resistencia de los procariotas frente a los metales pesados consiste en el bombeo del metal fuera de la célula bacteriana (Nies, 2003). A pesar de ser también un micronutriente esencial, el cobre es uno de los elementos más tóxicos ya que es muy oxidante. Las bacterias han desarrollado múltiples sistemas de resistencia a este elemento (Moraleda-Muñoz et al., 2010). En 20 RSO7 se han encontrado un regulador transcripcional positivo (CueR) y un represor (ComR) que se activan alternativamente según la concentración periplásmica de Cu (Stoyanov et al., 2001; Mermod et al., 2012). También una proteína periplásmica de unión a Cu (CutC) y una cobre-oxidasa periplásmica (CueO) que oxida Cu2+ a Cu+ impidiendo su entrada al citoplasma (Grass y Rensing, 2001), así como dos bombas de expulsión de Cu fuera del citoplasma (CopA y YebZ) (Rensing et al., 2000). Del mismo modo, el Zn también es tóxico a altas concentraciones, habiéndose encontrado una bomba de expulsión de Zn (ZntB) (Worlock y Smith, 2002) junto a otra bomba de tipo ZitB (Grass et al., 2001). Por otra parte, Co y Ni son expulsados fuera de la célula a través de un mismo transportador, en este caso el RcnA (Rodrigue et al., 2005). Genes adicionales para la expulsión de Co y Mg son CorC y CorA , participando en la homeostasis de este último elemento (Nordin et al., 2013). Con respecto al As, se ha identificado el operón de resistencia formado por arrH, arsB y arsC (Ben Fekih et al., 2018), junto a una proteína adicional de tipo Yffb con actividad arseniato reductasa (Suhadolnik et al., 2017). Por su parte, el Fe, aunque es muy necesario como cofactor en muchas enzimas, también es perjudicial en exceso, de modo que se ha encontrado un sistema de expulsión de Fe (FetAB) formado por una permeasa y una ATPasa que suministra la energía para el transporte (Nicolaou et al., 2013). A diferencia de estos mecanismos de resistencia basados en la expulsión del elemento tóxico fuera de la célula, la resistencia frente a Se y Te (ambos del grupo VIB de la tabla periódica) consiste en la metilación y la volatilización a través de la membrana plasmática de especies volátiles como el dimetilselenio y el dimetilteluro (Chasteen y Bentley, 2003). Se ha encontrado el gen TehB que codifica una enzima con actividad telurito metiltransferasa. En cuanto a los genes reguladores, se han encontrado los genes reguladores HydHG , que codifica el regulador transcripcional ZraR, el cual regula la expresión de ZraP (Leonhartsberger et al., 2001). Adicionalmente se ha encontrado el regulador CzcR, que forma parte del sistema de dos componentes CzcSR, el cual controla la expresión de diferentes sistemas de resistencia a metales pesados como Zn, Cd y Co (Baeyens et al., 1997). 4.6.2. Genes relacionados con la resistencia a la sal (alta osmolaridad) El análisis manual del genoma reveló la presencia de genes involucrados en la resistencia a alta osmolaridad, tales como osmoprotectores o reguladores transcripcionales para evitar un posible daño producido por la sal. 21 Tabla 8. Genes relacionados con la resistencia a la sal (alta osmolaridad) encontrados en el genoma de Pantoea agglomerans RSO7. Osmoprotector Gen Producto génico/función Máxima identidad Número de acceso Glicina betaína BetA (dos copias) Colina deshidrogenasa que participa en la biosíntesis de glicina betaína. BETA_KLEP7 (Klebsiella pneumoniae) A6T613 BetB Betaína aldehído deshidrogenasa. Biosíntesis de glicina betaína. BETB_ECOLU (Escherichia coli) B7N8L4 BetT Proteína de transporte de colina de alta afinidad. Participa en la ruta de biosíntesis de betaína a partir de colina. BETT_ECO57 (Escherichia coli) P0ABD 0 YehX Proteína de unión a ATP YehX. Sistema de absorción de glicina betaína de baja afinidad. YEHX_ECOLI (Escherichia coli) P33360 YehY Permeasa YehY. Sistema de absorción de glicina-betaína de baja afinidad. YEHY_ECOLI (Escherichia coli) P33361 YehZ Proteína de unión a glicinabetaína YehZ. Parte de un complejo transportador de glicina betaína de baja afinidad. YEHZ_ECOLI (Escherichia coli) P33362 Prolina/ glicina betaína/ prolina betaína ProP Transportador de prolina / glicina betaína. PROP_STAAR (Staphylococc us aureus) Q6GJ96 ProV Proteína de unión a ATP. Parte del complejo ProU involucrado en la absorción de glicina betaína y prolina betaína. PROV_ECOLI (Escherichia coli) P14175 ProW Permeasa que forma parte del complejo ProU implicado en la captación de glicina betaína y prolina betaína. PROW_SALT Y (Salmonella typhimurium) P17327 ProX Proteína periplásmica de unión a glicina betaína/prolina betaína de alta afinidad. PROX_ECO57 (Escherichia coli) P0AFM 3 ProY Permeasa específica de prolina ProxY. PROY_SALTY ( Salmonella typhimurium) P37460 Colina-O-sulfato y glicina betaína OsmV Proteína de unión de importación de osmoprotectores dependiente de ATP. OSMV_SALTY (Salmonella typhimurium) Q8ZPK 4 OsmW Permeasa para colina-O-sulfato y glicina betaína. OSMW_SALT Y (Salmonella typhimurium) Q8ZPK 3 OsmX Parte del complejo transportador OsmU para colina-O-sulfato y glicina betaína. OSMX_SALTY (Salmonella typhimurium) Q8ZPK 2 OsmY (dos copias) Proteína periplásmica importadora de coina-O-sulfato y glicina betaína. OSMY_ECOL6 (Escherichia coli) P0AFH 8 Trehalosa OtsA Trehalosa-6-fosfato sintasa. Biosíntesis de trehalosa. OTSA_SALAR (Salmonella arizonae) A9MMQ 2 22 OtsB Trehalosa-fosfato fosfatasa. Elimina el fosfato de la trehalosa 6-fosfato para producir trehalosa libre. OTSB_SALTY (Salmonella typhimurium) P0CL50 TreA Trehalasa periplásmica. Descompone trehalosa en glucosa al volver las células a osmolaridad normal. TREA_ECOK1 (Escherichia coli) A1AAC 5 TreF Trehalasa citoplasmática. Hidroliza la trehalosa a glucosa cuando regresan las células a condiciones de baja osmolaridad. TREF_ECOS M (Escherichia coli) B1LJ63 TreH Trehalasa TreH. TREH_MYCS2 ( Mycolicibacter ium smegmatis ) A0R0W 9 TreY Maltooligosil trehalosa sintasa. TREY_ARTSQ ( Arthrobacter sp.) Q44315 TreZ Maltooligosil trehalosa trehalohidrolasa. TREZ_SACSO (Sulfolobus solfataricus) Q55088 Múltiples osmoprotecto- Res OusA Transportador de glicina betaína/ prolina/ ectoína/ ácido pipecólico OusA, pertenece a la superfamilia MSF. Implicado en transporte y acumulación de varios osmoprotectores. Se induce por estrés osmótico. OUSA_DICD3 ( Dickeya dadantii) Q47421 Reguladores transcripcionales Gen Producto génico/función Máxima identidad Número de acceso Reguladores transcripcionales OmpR- EnvZ Sistema de dos componentes EnvZ/OmpR implicado en osmoregulación. Regula la transcripción de las porinas OmpF y OmpC. Respuestas al estrés ácido y osmótico. OMPR_ECO57 (Escherichia coli) ENVZ_SALTY ( Salmonella typhimurium ) P0AA18 P08982 DoeX Proteína reguladora transcripcional DoeX. Su función es la degradación/síntesis de ectoína en respuesta a sal. DOEX_HALED (Halomonas elongata) E1V7V9 BetI Represor transcripcional tipo HTH implicado en la biosíntesis de glicina betaína. BETI_CROS8 (Enterobacter sakazakii) A7MFA 6 OsmB Lipoproteína osmóticamente inducible B. Resistencia al estrés osmótico. Importante para la supervivencia en fase estacionaria. OSMB_ECOLI (Escherichia coli) P0ADA 7 OsmE Lipoproteína inducible osmóticamente OsmE. Posible regulación osmótica del nitrógeno. OSME_ECO57 (Escherichia coli) P0ADB 2 La cepa RSO7 está equipada con una batería de genes que regulan la resistencia a la sal (estrés osmótico). La regulación se lleva a cabo mediante la actividad un sistema de dos componentes OmpR/EnvZ (Forst Set al., 1989) y otros más específicos como el regulador de la síntesis de ectoína DoeX (Schwibbert et al., 2011) o el represor de la 23 síntesis de glicina betaína BetI (Scholz et al., 2016). Estos activadores transcripcionales regulan la expresión de genes de la síntesis de betaína (del que se ha encontrado un operón de tipo BetIABT ) (Cánovas et al., 2000) y de la síntesis de trehalosa ( OtsAB ) (Kaasen et al., 1994) y TreYZ (Maruta et al., 1996). También regulan la captación desde el periplasma de prolina y la síntesis a partir de colina de glicina betaína y prolina betaína mediante tres sistemas: ProPVWXY (Stirling et al., 1989), OsmVWXY (Frossard et al., 2012) y YehXYZ (Checroun y Gutierrez, 2004), este último de baja afinidad. También se ha detectado el gen OusA , que codifica un transportador de la familia MFS (Major Facilitator Superfamily) implicado en el transporte y la acumulación de varios osmoprotectores tales como glicina betaína, prolina, ectoína y ácido pipecólico (Gouesbet et al., 1996). Tras la desaparición de las condiciones de estrés osmótico los metabolitos osmóticos son “reciclados” como fuente de carbono. Por ejemplo, se han encontrado tres trehalasas, una citosólica y otra periplásmica (TreA y TreF) (Horlacher et al., 1996) y una TreH recientemente descubierta (Carrol et al., 2007), que degradan trehalosa a glucosa cuando las células regresan a condiciones de baja osmolaridad. Finalmente, se han encontrado otras proteínas reguladas por estrés osmótico que a su vez están implicadas en diferentes procesos celulares como el metabolismo del nitrógeno (OsmE) o la supervivencia en la fase estacionaria del cultivo (OsmB). Todos estos genes ponen de manifiesto la resiliencia frente a situaciones de estrés osmótico y la fina y compleja regulación de esta respuesta. 4.6.3. Genes relacionados con las propiedades PGPR Los genes potencialmente involucrados en la promoción del crecimiento de las plantas también se extrajeron cuidadosamente, destacando aquellos implicados en el trasporte y metabolismo del hierro, así como aquellos relacionados con el fosfato o la solubilización de este. 4.6.3.1.Genes relacionados con el trasporte y metabolismo de hierro El hierro es un elemento fundamental para las bacterias, formando parte de muchos cofactores de enzimas redox, transportadores de electrones, etc. Por ello, las bacterias se aseguran de conseguirlo e incluso de competir por este elemento. Tabla 9. Genes relacionados con el transporte y metabolismo del Fe encontrados en el genoma de Pantoea agglomerans RSO7. Proceso Gen Producto génico/función Máxima identidad Número de acceso Transporte de iones Fe2+ EfeO Componente del sistema de absorción de hierro Fe2+ EfeO. Componente de unión de hierro y / o transferencia de electrones. EFEO_ECOL6 (Escherichia coli) Q8FJ35 30 CheAWYZ Proteínas de quimiotaxis CheAWYZ. Participan en la transmisión de señales sensoriales de los quimiorreceptores a los motores flagelares. Formación de biofilms AriR, BssS Proteínas reguladoras de la formación de biofilms AriR y BssS. Regulan la formación de biofilms en diversos medios y no en otros, dependiendo de la composición y en respuesta a estrés. BdlA Proteína de dispersión de biofilm BdlA. Esencial para la dispersión de biopelículas mediante la detección de señales ambientales. Modulación de la motilidad de natación y la adhesividad de la superficie celular bacteriana. Comunicación bacteriana ( quorum sensing ) QseE Sensor histidina quinasa QseE. Miembro del sistema regulador de dos componentes QseF / QseE requerido para la formación de microcolonias sobre las células del hospedador. QseG Proteína reguladora de quorum sensing G. Translocación de moléculas efectoras en células del huésped. LuxS, RhiI S-ribosilhomocisteína liasa y acil-homoserina- lactona sintasa. Participan en la síntesis de moléculas autoinductoras (AI-2, BHL y HHL). Se trata de moléculas de quorum sensing secretadas por bacterias para testar la densidad celular y el potencial metabólico del medio ambiente. Interacción plantabacteria Comunicación planta-bacteria MocR Proteína MocR. Regulador transcripcional de los genes moc para el catabolismo de rizopina. OccM, OccQ, NocT Permeasas del sistema de transporte de octopina OccMQ. Proteína periplásmica de unión a nopalina NocT. Componentes del sistema de transporte activo de octopina y nopalina OccQMPT. Exopolisacáridos implicados en virulencia y formación de biofilms AmsBCDFJKL Proteínas AmsBCDFJKL. Participan en la biosíntesis de amilovorano, polisacárido extracelular que funciona como un factor de virulencia y de formación de bioflims. Degradación pared de las células vegetales (endófitos) YesR, KdgF Proteína de degradación de pectina ramnogalacturonil hidrolasas YesR y KdgF. Supervivencia dentro del hospedador MsgA, PagC Proteínas de virulencia MsgA y PagC. Esenciales para la plena virulencia y supervivencia dentro de los macrófagos. Regulación de la virulencia y resistencia a péptidos antibacterianos del hospedador PhoPQ Proteínas reguladoras transcripcionales de virulencia PhoPQ. Miembro del sistema regulador de dos componentes PhoQ / PhoP que regula la expresión de genes implicados en la virulencia y la resistencia a los péptidos antimicrobianos de defensa del huésped. Competencia en la rizosfera Síntesis de toxinas (Sistemas toxina/antitoxina) CdiA, RelE3, HipAB Sistema de toxina-antitoxina (TA). Sistemas de dos componentes en el que uno es una toxina y el otro una proteína de inmunidad a la toxina. CdiA: toxina que permite que las bacterias se comuniquen e inhiben el crecimiento de bacterias vecinas estrechamente relacionadas de una manera dependiente del contacto. Toxina RelE3: Tiene actividad RNAasa. 31 Inhibición de la comunicación entre otras bacterias YvrE Proteína YvrE con actividad lactonasa (hidroliza las moléculas de quorum sensing de otras bacterias). Une como cofactor un catión divalente por subunidad. Antibiosis CvpA Proteína productora de colicina V. SlyA Regulador transcripcional SlyA del operón cpmABCDEFGH involucrado en la producción de antibióticos tipo carbapenem. La movilidad de la bacteria está determinada por la presencia de flagelos, para cuya síntesis, rotación y regulación se han encontrado los genes Flh y Fli (Nakamura y Minamino, 2019). La movilidad de la bacteria en la rizosfera está determinada por la quimiotaxis hacia la raíz, la cual secreta compuestos atrayentes para las bacterias (exudados radiculares). Se han encontrado genes Che implicados en quimiotaxis, así como Tsr/Tar (que codifican las proteínas de quimiotaxis que se regulan por metilo MCP I y II, quimiorreceptores de aminoácidos y ácidos orgánicos respectivamente (Feng et al., 2018). Los exudados radiculares también determinan la formación de biofilms, proceso altamente regulado del que se han encontrado genes como AriR y BssS ( Zhang et al., 2015). Además, el gen BdlA codifica una proteína de dispersión de biofilm, que está implicada en la modulación de la movilidad/formación de biofilm en respuesta a señales ambientales (Morgan et al., 2006). Para que ocurran todos estos procesos rizosféricos es necesario que haya una mínima densidad celular, detectada mediante los sistemas de quorum sensing , de los que hemos encontrado los genes Qse, Lux y Rhi (Altaf et al., 2017). Otro grupo de genes presentes en RSO7 tienen que ver con la interacción plantabacteria. De hecho, tras la inoculación de plantas con PGPR se observa en pocos días una respuesta negativa de la planta (defensa) y luego ya cambia a una respuesta simbiótica y de mejora del crecimiento (Bordiec et al., 2011). El operón AmsBCDFJKL participa en la biosíntesis de amilovorano, polisacárido extracelular que funciona como un factor de virulencia y de formación de bioflims (Koczan et al., 2009). Una vez que la bacteria se adhiere y multiplica sobre la raíz, tiene pectinasas (YesR y KdgF) que degradan la pared vegetal (Bhadrecha et al., 2020) y permiten sobrevivir en el hospedador (incluso como endófito) y se defiende de los péptidos antibacterianos producidos por el hospedador como respuesta defensiva, habiéndose encontrado los genes MsgA, PagC (Pulkkinen y Miller, 1991) y el módulo de virulencia PhoPQ (Tu et al., 2016). Finalmente, se encontaron genes que aseguran la competencia de la bacteria en la rizosfera, por ejemplo, es capaz de inhibir las señales de comunicación celular quorum sensing de otras bacterias mediante la posesión de lactonasa (Zhang et al., 2007). También produce toxinas (de las que se protege mediante el sistema toxina-antitoxina 32 (Shidore y Triplett, 2017) y es capaz de producir antibióticos como la colicina V y carbepenem (Kenawy et al., 2019). 4.7. Bioseguridad Desde el punto de vista de la bioseguridad Pantoea agglomerans se engloba en el grupo 2. Solo los microorganismos de grupo 1 están autorizados por la legislación europea para ser utilizados como inoculantes (microorganismos GRAS, siglas de Generally Recognized as Safe). La especie Pantoea agglomerans ha sido causa de infecciones oportunistas sobre todo en pacientes nosocomiales con patologías previas como fibrosis quística, cáncer, etc. (Cruz et al., 2007). Algunas cepas PGPR endófitos de plantas también han causado infecciones en trabajadores como jardineros al pincharse con plantas (Jain et al., 2012). Por esta razón se han buscado específicamente en el genoma genes que puedan estar relacionados con patogenicidad. La cepa RSO7 presenta varios determinantes de resistencia a múltiples antibióticos entre los que se encuentran: polimixina B, fosfinotricina, cloranfenicol, fumonisina, novobiocina, biciclomicina, nitroimidazol y bacitracina. Junto a estas actividades posee varias beta-lactamasas que rompen el anillo betalactámico. Por otra parte, la presencia de una gran cantidad de bombas de expulsión de sustancias tóxicas también incrementa su resistencia a antibióticos, así como una bomba de eflujo de varios antibióticos hidrófobos que puede expulsar fuera de la célula eritomicina, tetraciclina, ampicilina y norfloxacino. Además, es capaz de sintetizar toxinas (hemolisinas, RNAasa). Posee el operón YejABEF de resistencia a péptidos antibacterianos de defensa del hospedador. Finalmente, recordemos que la competencia por el Fe, la producción de sideróforos y la captación (robo) de sideróforos heterólogos son también mecanismos que aseguran la competitividad de esta bacteria. Todos estos factores son considerados factores de virulencia. Por estas razones no puede ser utilizada como inoculante. Se han diseñado estrategias para aprovechar las características PGPR en extractos libres de células. De este modo, se cultiva la bacteria y se utiliza solo el sobrenadante del cultivo para inocular las plantas. En este sobrenadante van las moléculas y proteínas secretadas por la bacteria las cuales ejercen su efecto sobre la planta sin el riesgo de utilizar un microorganismo de grupo 2 (Luziatelli et al., 2020). 5. Conclusiones 1. Pantoea agglomerans RSO7 mejora el crecimiento de plantas de alfalfa. Los efectos beneficiosos se observaron más en situación de limitación de nutrientes y afectaron sobre todo a la raíz (mayor masa, longitud y ramificación), aunque también se observaron efectos positivos en la longitud del tallo, aunque las diferencias no 33 fueron significativas, aunque sí en el número de trifolios. Además, mejoraron la supervivencia de las plantas y disminuyeron la contaminación por hongos. 2. El genoma de P. agglomerans RSO7, con 4,56 Mb, es similar en tamaño y en contenido de G+C a otras cepas de la misma especie. Un análisis global revela que es una bacteria muy versátil, capaz de adaptarse a una gran cantidad de situaciones ambientales y tolerar un gran número de situaciones de estrés (calor, frío, radiación UV, estrés oxidativo, etc.), además de mostrar una amplia versatilidad metabólica. 3. Respecto a la resistencia a metales pesados, se han detectado genes/operones de resistencia a As, Cu, Ni, Co, Zn y Te. La resistencia a sal se ha relacionado con la presencia de genes de producción de osmoprotectores como glicina betaína, prolina, trehalosa, etc. También se han hallado genes de detoxificación de diversos compuestos xenobióticos. 4. Respecto a las propiedades PGPR se han detectado genes de captación y solubilización de fosfatos (fosfatasas extracelulares, acil fosfatasas, mio-inositol fosfatasas) y de producción y/o captación de una gran variedad de sideróforos (varias ferritinas, enterobactina, acromobactina, hemina, etc.). Además, se han encontrado genes que participan en importantes procesos rizosféricos como movilidad, quimiotaxis, diálogo planta-bacteria, quorum sensing y competencia en la rizosfera. 5. Finalmente, y dado que la bacteria es del grupo de bioseguridad 2, se han encontrado genes de resistencia a múltiples antibióticos y producción de varias toxinas (sistemas toxina/antitoxina). 6. Con los resultados anteriores se puede concluir el gran potencial de esta bacteria como promotora del crecimiento vegetal. Sin embargo, las restricciones al uso de microorganismos de grupo 2 de bioseguridad como bioinoculantes podrían limitar su utilización, por lo que también se han revisado posibles alternativas bioseguras. 7. Bibliografía 1. Ahmed A, Hasnain S. Auxins as one of the factors of plant growth improvement by plant growth promoting rhizobacteria. Pol J Microbiol. 2014; 63(3): 261-266. 2. Akiyama M, Crooke E, Kornberg A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli . 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