Regulación de la homeostasis iónica en plantas por el antiportador NA+/H+SOS1

   7(6,6'2&725$/         5HJXODFLyQGHODKRPHRVWDVLVLyQLFDHQ SODQWDVSRUHODQWLSRUWDGRU1D+626                      Presentada por: D. Carlos Tello Lacal. Dirigida por: Prof D. José Manuel Pardo Prieto. Dr. D. Francisco Javier Quintero Toscano. 0. Índice  ,  0. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………1 I.1. El problema de la salinidad en la producción agrícola………….…………………………..1 I.2. Efectos fisiológicos producidos por el estrés salino sobre las plantas…….………………2 I.3. Respuestas adaptativas de las plantas frente al estrés salino……….…………………….4 I.3.1. Adaptaciones a nivel celular a altas concentraciones de Na + ……….……….…...4 I.3.1. Adaptaciones a nivel de planta completa a altas concentraciones de Na + ….......7 I.4. Transducción de señales en respuesta a estrés salino………………………….………...11 I.5. El transporte iónico en el mantenimiento de la homeostasis y la tolerancia a estrés.….19 I.6. Transporte de K + en la planta……………………………………....………………….……..22 I.6.1. Absorción de K + de alta y baja afinidad………………………………….…………22 I.6.2. Carga de K + en el xilema…………………………………………….….……………24 I.6.3. Recirculación floemática de K + …………………………………………….……......25 I.6.4. Regulación de la transpiración mediante apertura y cierre estomático…….…...26 I.7. Transporte de Na + en la planta…………………………………….……….…………………28 I.7.1. Absorción de Na + ………………………………………………………….…………..28 I.7.1.1. Mecanismos sensibles a Ca 2+ ………………………………………….…..28 I.7.1.2. Mecanismos insensibles a Ca 2+ …………………………………….……...29 I.7.1.3. Vía apoplástica……………………………………….………………………31 I.7.2. Compartimentación de Na + en la vacuola…………………….……………….……32 I.7.3. Expulsión y transporte a larga distancia de Na + …………………….…….……….35 I.7.3.1. SOS1: filogenia y características…………………………………….…….38 I.7.3.2. Regulación del sistema SOS………………………………………….……38 I.7.3.3. Interacción de la ruta SOS con la nutrición de K + ………………….…….42 I.7.3.4. Sobreexpresión de SOS1 y mejora de la tolerancia a salinidad….…….44 I.7.3.5. Ruta SOS y estrés oxidativo……………………………………….………..45 II. OBJETIVOS…………………………………………………………………….………………….…..47 III. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………………...49 M.1. Material biológico…………………………………………………….…………………………49 M.1.1. Bacterias……………………………………………………………………………….49 M.1.1.1. Cepas de bacterias utilizadas…….………………………………………..49 M.1.1.2. Medios y condiciones de crecimiento……………………………………..50 M.1.2. Levaduras……………………………………………………………………………...52 M.1.2.1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas…………………………52 M.1.2.2. Medios y condiciones de crecimiento de levaduras……………………..53 M.1.3. Arabidopsis thaliana………………………………………………………………….53 M.1.3.1. Líneas utilizadas………………………….…………...…………………….53 M.1.3.2. Cultivo de plantas en suelo……………………………………….………..53 M.1.3.3. Cultivo de plantas in vitro…………………………………………………..55 0. Índice  ,,  M.1.3.4. Cultivo de plantas en medio líquido…………………………………….…56 M.1.3.5. Cultivo de plantas en hidropónico…………………………………………56 M.2. Purificación y análisis de DNA………………………………………………………………..57 M.2.1. Purificación de DNA…………………………………………………………………..57 M.2.1.1. Minipreparación de DNA plasmídico bacteriano…………………………57 M.2.1.1.1. Minipreparación de DNA plasmídico de E. coli…………………57 M.2.1.1.2. Minipreparación de DNA plasmídico de A. tumefaciens………57 M.2.1.2. Extracción de DNA de plantas……………………………………………..58 M.2.2. Cuantificación del DNA……………………………………………………………....58 M.2.3. Precipitación del DNA………………………………………………………………..58 M.2.4. Electroferesis de DNA en geles de agarosa…….…………………………………59 M.2.5. Extracción de bandas de DNA en geles de agarosa………………….…...……..59 M.2.6. Manipulación enzimática del DNA…………………………………………….…….59 M.2.6.1. Digestión del DNA con enzimas de restricción…………………………..59 M.2.6.2. Desfosforilación de los extremos 5’ del DNA…………………………….59 M.2.6.3. Generación de extremos romos del DNA………………………………...60 M.2.6.4. Ligación de fragmentos de DNA…………………………………………..60 M.2.6.5. Amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR con Taq polimerasa……………………………………………………………………………...60 M.2.6.6. PCR con DNA polimerasa de alta fidelidad………………………………61 M.2.6.7. Mutagénesis dirigida mediante PCR……………………………………...61 M.2.7. Mutagénesis aleatoria de plásmidos in vivo……………………………………….61 M.3. Purificación y análisis de RNA………………………………………………………………..62 M.3.1. Extracción de RNA total de plantas………………………………………………...62 M.3.2. Electroforesis de RNA………………………………………………………………..62 M.3.3. Cuantificación de RNA……………………………………………………………….63 M.3.4. RT-PCR………………………………………………………………………………..63 M.4. Transformación de los distintos organismos utilizados…………………………………….63 M.4.1. Transformación de E. coli…………………………………………………………....63 M.4.1.1. Preparación de células competentes de E. coli………………………….63 M.4.1.2. Transformación de células de E. coli competentes por choque térmico………………………………………………………………………………….64 M.4.1.3. Preparación de células electrocompetentes de E. coli…………………64 M.4.1.4. Transformación de células de E. coli competentes por electroporación………………………………………………………………………..64 M.4.2. Transformación de A. tumefaciens………………………………………………...65 M.4.2.1. Preparación de células competentes de A. tumefaciens………………65 M.4.2.2. Transformación de células de A. tumefaciens competentes por choque térmico…………………………………………………………………………………65 M.4.2.3. Preparación de células electrocompetentes de A. tumefaciens………66 0. Índice  ,,,  M.4.2.4. Transformación de células competentes de A. tumefaciens por electroporación…………………………………………………………………………66 M.4.3. Transformación de levaduras…………………………………….………………….66 M.4.4. Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis………………………………67 M.4.4.1. Preparación de las células de A. tumefaciens…………………………...67 M.4.4.2. Transformación de plantas de A. thaliana………………………………..67 M.4.4.3. Selección de transformantes y propagación……………………………..68 M.4.4.4. Presencia, expresión y número de copias del transgén………………...68 M.4.4.4.1. Presencia…………………………………………………………68 M.4.4.4.2. Expresión…………………………………………………………68 M.4.4.4.3. Número de copias………………………………….………...….69 M.4.4.5. Fijación de líneas transgénicas homocigotos…………………….………69 M.5. Obtención de líneas de dobles mutantes mediante cruzamiento clásico…….………….69 M.6. Caracterización de transformantes de levadura………………………………….………...69 M.7. Caracterización fisiológica de plantas de Arabidopsis thaliana……………..………….…70 M.7.1. Ensayos de crecimiento en medio sólido……………………………..……………70 M.7.2. Ensayos de crecimiento en medio salino líquido……………………..…………...70 M.7.3. Determinación del contenido en clorofila…………………………….…………….70 M.7.4. Ensayos en cultivo hidropónico……………………………………………………..70 M.7.5. Medida de contenidos iónicos…………………………………………….…………71 M.8. Secuenciación………………………………………………………………………….……….71 M.9. Herramientas informáticas…………………………………………………………….………71 M.9.1. Programas informáticos……………………………………………………….……..71 M.9.2. Herramientas de Internet…………………………………………………………….72 IV RESULTADOS……………………………………………………………………..………………….73 R.1. La actividad del antiportador SOS1 controla otras funciones en la planta, además del transporte de Na + ……………………………………………………………….……………………73 R.1.1. Función del antiportador SOS1 en la homeostasis de K + . Interacción funcional entre SOS1 y AKT1…………………………………………………………………………..73 R.1.1.1. Crecimiento del mutante sos1-1 en ausencia total de Na + ……………..73 R.1.1.2. Obtención y genotipado del doble mutante akt1 sos1…………………..74 R.1.1.3. Caracterización fisiológica del mutante akt1 y del doble mutante akt1 sos1 en cultivo hidropónico…………………………………………………………..76 R.1.1.4. Determinación de los contenidos iónicos…………………………………78 R.1.2. Expresión en planta y levadura de un alelo de SOS1 mutado en el residuo conservado de ácido aspártico en posición 201 que inhabilita el transporte de Na + ……………………………………………………………………………………..……….82 R.1.2.1. Caracterización funcional del alelo mutado SOS1_D201N en levadura…………………………………………………………………………………82 0. Índice  ,9  R.1.2.2. Transformación de la línea sos1-1 de Arabidopsis con el alelo SOS1_D201N………………………………………………………………………….84 R.1.2.3. Caracterización funcional del alelo SOS1_D201N frente a salinidad en la línea mutante sos1-1 de Arabidopsis………………………………………………..85 R.1.2.4. Caracterización funcional del alelo SOS1_D201N frente a estrés oxidativo en la línea mutante sos1-1 de Arabidopsis……………………………..............................................87 R.2. Búsqueda y expresión de alelos hiperactivos de SOS1 en Arabidopsis…………………89 R.2.1. Complementación de la mutación sos1-1 con los alelos mutados………………90 R.2.2. Expresión in vitro de candidatos a alelos hiperactivos en plantas silvestres de Arabidopsis…………………………………………………………………………………….95 R.2.3. Análisis del nivel de expresión del transgén por RT-PCR semicuantitativa…..105 R.2.4. Ensayos en cultivo hidropónico…………………………………………………….106 R.2.6. Determinación de los contenidos iónicos…………………………………………108 R.2.7. Rastreo de alelos hiperactivos de SOS1 en Arabidopsis……………………….111 R.2.8. Secuenciación del transgén en los candidatos seleccionados…………………113 V. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………..117 D.1. Intervención del antiportador Na + /H + SOS1 en la homeostasis de K + ………..…………117 D.2. Caracterización de un alelo de SOS1 mutado en un aminoácido muy conservado…..120 D.3. Búsqueda de alelos hiperactivos de SOS1………………………………………………...121 VI. CONCLUSIONES……………………………………...……………………………………………129 VII. BIBLIOGRAFÍA.…..………………………………………………………………………………..131 VIII. ANEXOS……………………………………………………………………………………………159 Anexo 1. Abreviaturas……………………………………………………………………………...159 Anexo 2. Oligonucleótidos utilizados……………………………………………………………..160  1 I INTRODUCCIÓN. I.1 El problema de la salinidad en la producción agrícola. La salinidad de los suelos es un factor abiótico que conlleva graves consecuencias para la agricultura, ya que limita la producción de los cultivos e impide el potencial uso agrícola de suelos no cultivados previamente (Munns, 2002; Flowers, 2004). Un suelo se define como salino cuando la conductividad eléctrica del extracto de saturación es de al menos 4 dS/m, lo que equivale a una concentración de NaCl (la sal más común en los suelos) de 40 mM y que genera una presión osmótica de 0.2 MPa (Munns y Tester, 2008). La salinidad afecta a ~10 9 ha de la superficie terrestre total (Szabolcs, 1994; Tester y Davenport, 2003), habiéndose estimado que un 20% de la superficie agrícola y un 50% de la superficie de regadío se encuentran salinizadas (Flowers y Yeo, 1995; Yokoi et al., 2002a). La salinización de los suelos se produce de forma natural por la meteorización de rocas o por la deposición de sales oceánicas arrastradas con el viento y el agua (Munns y Tester, 2008). En regiones áridas y semiáridas, la alta insolación y la baja pluviometría contribuyen a concentrar las sales en el suelo y sólo mediante el cultivo en regadío se puede mejorar la productividad agrícola. Desgraciadamente, la irrigación suele agravar el problema de la salinización del suelo, especialmente cuando se usa agua de poca calidad y el drenaje es insuficiente (Bressler y Hoffman, 1986; Ghassemi et al., 1995; Serrano et al., 1996). Unas prácticas agrícolas adecuadas pueden corregir el proceso (riego con aguas de alta calidad, instalación de sistemas de drenaje, rectificación de la sodicidad del suelo mediante la adición de óxido o sulfato cálcico…), si bien el coste de estas medidas resulta inviable en la mayoría de terrenos (Tester y Davenport, 2003). Otra posible solución al problema de la baja productividad de los cultivos en suelos salinos es el uso de cultivares halotolerantes. En la naturaleza existen especies halofitas, que resisten concentraciones salinas de hasta 500 mM, y glicofitas, que son sensibles a alta salinidad e incluyen a la mayoría de especies cultivadas (Hasegawa et al., 2000; Tester y Davenport, 2003). En general, ambos tipos de especies comparten mecanismos de resistencia al estrés salino y sólo se diferencian en el perfil de expresión de los genes implicados (Hasegawa et al., 2000; Cushman y Bonhert, 2000). Como ejemplo ilustrativo, la especie halofita Thelungiella salsuginea, cuyo genoma muestra una homología del 90-95% con el de Arabidopsis thaliana, induce constitutivamente más de 40 genes que en Arabidopsis sólo se expresan en condiciones de estrés (Taji et al., 2004). La investigación en mejora de la halotolerancia se dirige a la mejor comprensión de los efectos causados por el estrés salino, tanto a nivel celular como de organismo completo, así como de las respuestas adaptativas de las plantas frente a dicho estrés. Para ello es necesario identificar tanto los componentes que determinan la tolerancia a sal como los elementos reguladores de éstos. (Hasegawa et al., 2000; Zhu, 2001b).  2 I.2. Efectos fisiológicos producidos por el estrés salino sobre las plantas. A diferencia de otros organismos pluricelulares, las plantas son organismos sésiles. La imposibilidad de escapar cuando las condiciones del medio no son las adecuadas las obliga a desarrollar mecanismos de respuesta frente a todo tipo de estrés abiótico: térmico, hídrico y salino. Los efectos fisiológicos producidos por el estrés salino en plantas derivan de sus dos componentes principales: el desajuste osmótico y la toxicidad iónica. De estos efectos primarios derivan un conjunto de efectos secundarios como son el estrés oxidativo, deficiencias en la absorción de otros iones (principalmente K + ), disminución del crecimiento celular, reducción de la evapotranspiración y disminución de la eficiencia fotosintética (Niu et al., 1995; Zhu, 2001a; Zhu, 2002; Tester y Davenport, 2003; Munns y Tester, 2008). Estrés osmótico. El exceso de sales provoca una drástica reducción en el potencial osmótico del suelo, dificultando la absorción de agua por las plantas. En unas pocas horas, el menor contenido hídrico causa una reducción transitoria en el crecimiento de hojas y raíces. Se produce una alteración en las relaciones hídricas de las células, ya que éstas responden a la falta de agua en el citosol (necesaria para las reacciones metabólicas) aportándola desde la vacuola. De este modo, las células pierden turgencia y reducen su expansión. Además, las plantas minimizan la deshidratación cerrando los estomas para evitar la pérdida de agua por evapotranspiración. El cierre estomático disminuye la toma de CO 2 , lo que disminuye la fijación de esta molécula por fotosíntesis (Hasegawa et al., 2000; Zhu, 2001b, 2002; Munns et al., 2002). Toxicidad iónica y desequilibrio electroquímico. La homeostasis es la tendencia de un organismo a mantener su estado interno a pesar de los cambios en su entorno. En condiciones fisiológicas, las concentraciones homeostáticas de iones en el citoplasma son de 100-200 mM K + , 1-10 mM Na + y Cl - , y 100-200 nM Ca 2+ (Niu et al., 1995). El exceso de NaCl en el medio durante episodios de estrés salino causa fuertes desequilibrios en la homeostasis iónica, que la célula debe reestablecer para su crecimiento y funcionamiento metabólico (Binzel et al., 1988). Dada la similitud en las propiedades fisicoquímicas entre el Na + y el K + , el primero actúa como inhibidor competitivo en los sitios específicos de enzimas que requieren la unión de K + como cofactor. La célula necesita mantener siempre un alto cociente K + :Na + , ya que concentraciones de Na + superiores a 100 mM en el citoplasma inhiben procesos bioquímicos y fisiológicos (Bhandal y Malik, 1988; Marschner, 1995; Serrano et al., 1996). Procesos celulares esenciales como la síntesis de proteínas, el procesado del RNA o el metabolismo de azúcares se ven fuertemente inhibidos en presencia de altas concentraciones de Na + (Marschner, 1995; Blaha et al., 2000; Forment et al., 2002). Además, concentraciones salinas superiores a 400 mM rompen el equilibrio electrostático necesario para el mantenimiento de las estructuras terciarias y cuaternarias de  3 las proteínas, produciendo la inhibición de la mayor parte de la actividad enzimática por desnaturalización (Wyn-Jones y Pollard, 1983). Estrés oxidativo. El estrés salino produce daños oxidativos por la sobreacumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés Reactive Oxygen Species) como los radicales superóxido (·O 2- ), peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) o los radicales hidroxilo (·OH - ), producidos de forma natural en procesos aeróbicos como el transporte de electrones en cloroplastos y mitocondrias o la oxidación de metabolitos (Smirnoff et al., 1993; Moran et al., 1994; Borsani et al., 2001; Hernández et al., 2001). El exceso de ROS causa daños oxidativos en lípidos de membrana plasmática, proteínas y ácidos nucleicos (Smirnoff et al., 1993; Hernández et al., 2001). Las plantas degradan las ROS mediante antioxidantes no enzimáticos, como el ascorbato, glutatión, flavonoides, alcaloides y carotenoides, o enzimas detoxificadoras como la superóxido dismutasa, catalasa o pertenecientes al ciclo del ascorbato-glutatión (Chinnusamy et al., 2004; Apel y Hirt, 2004). Deficiencia en la toma de K + . El K + es un elemento esencial para la célula, ya que interviene en el ajuste osmótico, regula los movimientos estomáticos y actúa como cofactor en diversas enzimas (Hasegawa et al., 2000). El Na + compite con el K + por los sitios de unión a los sistemas de transporte de alta y baja afinidad, contribuyendo a disminuir el cociente K + :Na + de la célula (Rains y Epstein, 1967; Maathuis et al., 1996). Los canales activados por nucleótidos cíclicos (CNGC) se han postulado como una posible fuente de entrada de iones Na + en la raíz (Amtmann y Sanders, 1999; Tyerman y Skerret, 1999; Zhu et al., 2003; Rus et al., 2004). Además, la acumulación de Na + en la célula produce depolarización de la membrana plasmática, impidiéndose la entrada pasiva de K + a través de canales rectificadores de entrada a la vez que se favorece su salida por canales rectificadores de salida. Finalmente, la síntesis de solutos compatibles usados en la osmoprotección celular consume mucho ATP, que ya no puede ser utilizado para el transporte activo de K + de alta afinidad (Shabala et al., 2003; Shabala y Cuin, 2007). Otros efectos secundarios del estrés salino. Incluyen la desregulación de la fotosíntesis, el cierre estomático, la detención del crecimiento celular y la activación de muerte celular programada. (Serrano et al., 1999; Hasegawa et al., 2000; Zhu, 2003). Además, parece existir una relación entre estrés salino y genotoxicidad, como se desprende del hallazgo del mutante de Arabidopsis uvs66, que es sensible tanto a agentes genotóxicos como al estrés salino (Albinsky et al., 1999).  4 I.3. Respuestas adaptativas de las plantas frente al estrés salino. Tanto las enzimas de plantas halofitas como las de glicofitas son sensibles a altas concentraciones de Na + en el citoplasma, por lo que ambos tipos de especies han desarrollado una serie de procesos de adaptación que se desencadenan en presencia de este tipo de estrés (Hasegawa et al., 2000; Zhu, 2003). Las respuestas adaptativas a alta salinidad se pueden dividir en dos grupos: adaptaciones a nivel celular y adaptaciones a nivel de planta completa. I.3.1. Adaptaciones a nivel celular a altas concentraciones de Na+. Regulación de la homeostasis. La entrada de Na + en la célula produce la disrupción de su homeostasis iónica y osmótica. Cuando la concentración de Na + en el medio extracelular aumenta, se crea un gradiente de concentraciones de este catión a ambos lados de la membrana plasmática que unido a la diferencia de potencial favorece su entrada pasiva en la célula, pudiendo producirse la apoptosis si se acumula en exceso (Niu et al., 1995; Serrano et al., 1999). En las plantas superiores, la homeostasis iónica se reestablece principalmente con la ayuda de los antiportadores Na + /H + , que expulsan el Na + de la célula o lo compartimentan en la vacuola (Xiong y Zhu, 2002). La energía para el transporte de cationes proviene del gradiente de protones generado por la H + -ATPasa de tipo P en la membrana plasmática o la H + -ATPasa de tipo V y la H + -pirofosfatasa en la vacuola (Blumwald et al., 2000). El primer antiportador identificado en plantas fue AtNHX1, una proteína vacuolar que muestra la misma afinidad por el transporte de Na + /H + y K + /H + . Tanto por homología en su secuencia como por presentar la misma afinidad por ambos cationes, es muy similar a ScNHX1 de levadura (Nass et al., 1997; Venema et al., 2002; Barragán et al., 2012). La sobreexpresión de esta proteína o de la H + - pirofosfatasa AVP1 demostraron mejorar la tolerancia de Arabidopsis (Apse et al., 1999; Gaxiola et al., 2001) y tomate (Zhang et al., 2001) frente a estrés salino. La expulsión de Na + de la célula se lleva a cabo a través del antiportador Na + /H + de membrana plasmática SOS1 (Shi et al., 2000; Qiu et al., 2002), cuya sobreexpresión también mejora la tolerancia a salinidad en Arabidopsis (Shi et al., 2003; Yang et al., 2009). La acumulación de iones en el lumen vacuolar disminuye su potencial osmótico hacia valores más negativos. Para mantener el mismo potencial osmótico a ambos lados del tonoplasto, las plantas sintetizan osmolitos compatibles y los acumulan en el citoplasma (Tester y Davenport, 2003). Los osmolitos compatibles se pueden acumular en la célula sin alterar la bioquímica intracelular e incluyen elementos esenciales como el K + , azúcares simples (glucosa, fructosa…), alcoholes de azúcares (glicerol e inositoles metilados), azúcares complejos (trehalosa, rafinosa y fructanos), derivados cuaternarios de aminoácidos (prolina, glicinabetaína, β-alanina-betaína, prolina-betaína…), aminas terciarias (ectoína) y compuestos de sulfonio (sulfato de colina, propionato de dimetilsulfonio…) (Bohnert y Jensen, 1996; Nuccio et al., 1999). Finalmente, las acuaporinas son canales de agua localizados en la membrana  11 I.4. Transducción de señales en respuesta a estrés salino. El reconocimiento del estrés salino por sensores, mayoritariamente no identificados, genera mensajeros secundarios que, mediante la activación de cascadas de fosforilación de proteínas, activan finalmente a proteínas implicadas directamente en la protección celular o factores de transcripción que controlan la transcripción de genes regulados por estrés (Hasegawa et al., 2000; Zhu, 2002; Xiong et al., 2002). Las rutas de señalización son muy complejas y a menudo comparten entre sí elementos comunes, siendo necesaria la adecuada coordinación de los distintos elementos para la producción de respuestas específicas inducibles para cada tipo de estrés (Knight y Knight, 2001; Zhu, 2002). Sensores del estrés salino. En Escherichia coli, los cambios en la turgencia celular debidos a estrés hipo e hiperosmótico causan estimulación mecánica que activan o reprimen respectivamente a canales mecanosensibles para la liberación de agua y solutos (Booth y Louis, 2000; Blount y Moe, 1999). En levadura, la detección del estrés osmótico mediante los sensores transmembrana SLN1 y SHO1 activa sendas cascadas de señalización que convergen en la fosforilación de la MAPKK Pbs2, que a su vez fosforila y activa a la MAPK HOG1. HOG1 inhibe por fosforilación a SKO1, represor transcripcional de la Na + -ATPasa ENA1, favoreciendo así el bombeo activo de Na + al medio extracelular (Maeda et al., 1995; Proft y Serrano, 1999; revisado por Saito y Tatebayashi, 2004). La histidín-kinasa de Arabidopsis ATHK1 (Urao et al., 1999) es un candidato a osmosensor en plantas. ATHK1 se induce por estrés salino y baja temperatura y es capaz de activar la cascada de HOG1 en el mutante de levadura con sus dos osmosensores, SLN1 y SHO1, mutados. Estudios transcripcionales en tabaco han identificado un posible receptor de estrés osmótico, NtC7, también inducido por heridas (Tamura et al., 2003). En cambio, poco se sabe de la detección específica del estrés iónico. El Na + podría ser detectado por receptores en la membrana plasmática o en el citosol. Dada la presencia de una larga cola citosólica en el extremo carboxiterminal de SOS1, se postuló su función como sensor de Na + (Shi et al., 2000; Zhu, 2002), si bien esta hipótesis continúa de momento sin confirmarse. Mensajeros secundarios. La detección de todo tipo de estreses por los sensores induce oscilaciones transitorias en los niveles de Ca 2+ citosólicos (Sanders et al., 1999). El tipo de señal de Ca 2+ varía en función del tipo de estrés, el grado de desarrollo del mismo, el tipo de tejido y la exposición previa a dicho estrés (Knight et al., 1997; Plieth et al., 1999; Kiegle et al., 2000). El incremento primario en la concentración de Ca 2+ citosólico facilita la generación de moléculas señalizadoras secundarias que pueden estimular nuevos incrementos transitorios de Ca 2+ para  12 la regulación de pasos previos o la señalización primaria de nuevas rutas (Xiong et al., 2002).La concentración de Ca 2+ libre en las células se mantiene en ~200 nM en condiciones fisiológicas, si bien en el citosol existe una cantidad de este catión mucho mayor que se encuentra unida a distintas proteínas (Bush, 1995). Los niveles citosólicos de Ca 2+ pueden aumentar, en respuesta a cualquier estímulo, debido a su entrada pasiva por canales de la membrana plasmática o por su liberación de orgánulos con capacidad de secuestrar este catión como el retículo endoplasmático, las mitocondrias, los cloroplastos y sobre todo la vacuola (Sanders et al., 1999). En la membrana plasmática existen dos tipos de canales para permitir la entrada pasiva de Ca 2+ : los canales no selectivos “maxi-catión” y los canales selectivos dependientes de voltaje (Piñeros y Tester, 1997; White, 2000), muchos de los cuales se activan por despolarización de la membrana plasmática (Ward et al., 1995). En el retículo endoplasmático, a su vez, existen canales que liberan Ca 2+ al citosol durante la señalización y son activados por inositol trifosfato, ADP-ribosa cíclica o cambios en el potencial de membrana (Schumaker y Sze, 1987; Johannes et al., 1992; Gelli y Blumwald, 1993; Allen y Sanders, 1994; Allen et al., 1996) Estos incrementos en los niveles de Ca 2+ son transitorios y rápidamente se ponen en funcionamiento los mecanismos para reestablecer su homeostasis en el citosol: bombas y transportadores. Las bombas de Ca 2+ son ATPasas de tipo P que utilizan la hidrólisis del ATP para bombear Ca 2+ en contra de gradiente. Existen dos familias distintas de estas proteínas (Axelsen y Palmgren, 1998): la familia IIA incluye ATPasas similares a las bombas del retículo endoplasmático de animales, como LCA1 de tomate, OCA1 de arroz o ECA1/ACA3 de Arabidopsis (Wimmers et al., 1992; Liang et al., 1997). La familia IIB incluye ATPasas similares a las bombas de membrana plasmática animales estimuladas por calmodulina, como ACA1 y ACA2 de Arabidopsis o BCA1 de Brassica oleracea (Huang et al., 1993; Malmstrom et al., 1997; Harper et al., 1998). Los transportadores CAX son antiportadores Ca 2+ /H + vacuolares que utilizan la fuerza protón-motriz generada por la H + -ATPasa para transportar Ca 2+ en contra de gradiente (Sanders et al., 1999). En el genoma de Arabidopsis existen 12 posibles transportadores CAX (CAX1-11 y MHX), habiéndose aislado algunos de ellos por su capacidad para suprimir el fenotipo de hipersensibilidad a Ca 2+ de un mutante de levadura pmc1 vcx1 cnb1, carente de los sistemas endógenos de transporte de Ca 2+ e incapaz de compartimentar este catión en la vacuola (Hirschi et al., 1996; Mässer et al., 2001). La kinasa SOS2 es capaz de activar a CAX1 en esta cepa, suprimiendo su fenotipo de hipersensibilidad a Ca 2+ . Plantas transgénicas del mutante cax1 de Arabidopsis sobreexpresando CAX1 mostraron cierta halosensibilidad, sugiriendo un incremento descontrolado de la compartimentación del Ca 2+ citosólico en la vacuola debida a la desregulación de CAX1. De este modo la señalización por Ca 2+ inducida por estrés disminuiría, impidiendo desencadenar respuestas de adaptación como la ruta SOS de halotolerancia, descrita en el apartado I.7.3.2 de la presente Tesis, por la que se activa el antiportador Na + /H + SOS1 (Cheng et al., 2003). Los fosfolípidos de la membrana plasmática constituyen un sistema dinámico que genera multitud de moléculas señalizadoras mediante su hidrólisis con las fosfolipasas A2, C y  13 D (Zhu, 2002; Xiong et al., 2002). La fosfolipasa C activada (PI-PLC) hidroliza el 4,5-difosfato de fosfatidilinositol (PIP 2 ) (Martin, 1998). La producción de PIP 2 se induce en plantas ante estrés osmótico y ABA a través de la inducción de la kinasa PIK5, mientras que la sequía y el estrés salino aumentan la expresión de PI-PLC (Hirayama et al., 1995; Mikami et al., 1998). La hidrólisis de PIP 2 por PI-PLC produce dos moléculas de gran importancia en señalización celular: diacilglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato de inositol (IP 3 ). A diferencia de lo observado en animales, en plantas no es el IP 3 sino el IP 6 el que libera Ca 2+ de orgánulos de almacenamiento interno, provocando el cierre estomático y la activación de genes de respuesta a estrés. Por otra parte, se desconoce la existencia de análogos de la proteín-kinasa C animal en plantas y el principal mensajero secundario es el ácido fosfatídico (PA) producido por la fosforilación de DAG mediante diacilglicerol kinasas (DGKs) (revisado en Munnik y Vermeer, 2010). El PA se induce rápidamente en presencia de estrés salino en todo tipo de especies vegetales (Bargmann et al., 2009). La inducción de PA también se da por estrés osmótico, si bien de una forma más lenta y menos severa. Se cree que dos proteínas pertenecientes a la familia SnRK2 (del inglés, SNIF-Related Kinases 2) son activadas por este fosfolípido en respuesta a estrés osmótico, ya que se inducen por este tipo de estrés y muestran capacidad de unión a PA (Testerink et al., 2004). La aplicación de un choque frío a 0ºC produjo en Arabidopsis, una inducción temprana de AtDGK1 y una más tardía de AtDGK2. Al parecer ambos se inducen por el factor de transcripción ICE1, regulador positivo de muchos genes inducibles por frío. (Chinnusamy et al., 2003; Lee et al., 2005; ). Se han identificado varias proteínas capaces de unirse a PA en plantas (revisado en Arisz et al., 2009), destacando las kinasas CTR1 y PDK1, y la fosfatasa ABI1. El PA inhibe a CTR1 y ABI1, reguladores negativos de la señalización por etileno y ABA respectivamente, mientras activa a PDK1, que a su vez activa a la kinasa OXI1 para regular positivamente la respuesta a ROS (Anthony et al., 2004; Rentel et al., 2004; Zhang et al., 2004)La inhibición de la PI-PLC impide la acumulación de PA en presencia de estrés salino y con ello la inducción de genes de respuesta a estrés como RD29A y COR47 (Takahashi et al., 2001; DeWald et al., 2001). Dada la importancia de estos compuestos en procesos de señalización, su producción y degradación deben estar perfectamente reguladas. El inositol se degrada por rutas de inositol polifosfato 3-kinasa o inositol polifosfato 5-fosfatasa, produciéndose respectivamente 1,3,4,5-tetrafosfato o 1,4-difosfato de inositol, ambos incapaces de activar cascadas de respuesta (Majerus, 1992). En Arabidopsis se ha identificado la proteína FRY1/SAL1, capaz de contribuir al reciclaje de fosfatos de inositol mediante la hidrólisis de 1,4-difosfato y 1,3,4-trifosfato de inositol (Quintero et al., 1996). Las plantas producen ROS continuamente a través de procesos como la fotosíntesis en los cloroplastos, la respiración celular en las mitocondrias o la detoxificación en los peroxisomas, pero las degradan con enzimas y antioxidantes para mantenerlos a bajos niveles (revisado en Jaspers y Kangasjärvi, 2011). El estrés salino, al igual que el frío y el estrés hídrico, induce la acumulación de ROS por incremento de su producción e inhibición de su degradación (Hasegawa et al., 2000). Aunque el exceso de ROS produce daño oxidativo en distintas estructuras celulares, su papel en señalización controla procesos como la respuesta a  14 patógenos, respuesta a estrés abiótico y muerte celular programada (Knight y Knight, 2001). El H 2 O 2 inducido por ABA activa los canales de Ca 2+ en las células guarda para producir el cierre estomático (Pei et al., 2000), induce la expresión de la catalasa CAT1 (Guan et al., 2000) o de genes de respuesta a estrés térmico (Gong et al., 1998) e incluso favorece la biosíntesis de ABA (Zhao et al., 2001). En Arabidopsis, las ROS activan a la MAPKKK ANP1, lo que induce la expresión de genes de respuesta como GST6, HSP18.2 y GH3 (Kovtun et al., 2000). El ácido salicílico potencia la generación de ROS en la respuesta hipersensible a patógenos y, presumiblemente, también ante estrés osmótico y salino, como sugiere la mayor tolerancia a este tipo de estrés de plantas de Arabidopsis expresando una salicilato hidroxilasa que estaría evitando la acumulación de ROS debida a ácido salicílico (Borsani et al., 2001). Genes de respuesta a estrés osmótico como el factor de transcripción DREB2A, varios factores pertenecientes a las familias AP2/ERF, NAM/NAC y WRKY y las MAP kinasas AtMEKK1, AtMPK4 y AtMPK6 también se inducen por la presencia de ROS (Desikan et al., 2001; Yuasa et al., 2001; Teige et al., 2004; Gadjev et al., 2006). El ácido abscísico (ABA) se acumula en las plantas ante estrés osmótico debido a la activación mediante factores de transcripción de genes de su ruta de biosíntesis (ABA1, NCED, y ABA3/LOS5) y, probablemente, a la inhibición de los que controlan su degradación a ácido faseico (Koornneef et al., 1989; Liotenberg et al., 1999; Seo et al., 2000; Zhu, 2002). El gen NCED constituye un paso limitante en la biosíntesis de ABA, ya que es el único que no se induce por esta hormona (Iuchi et al., 2001). Las SnRK2 actúan como reguladores positivos en la ruta de señalización por esta hormona, como demuestran los fenotipos de insensibilidad a ABA en inhibición de la germinación y elongación de la raíz mostrados por el doble mutante snrk2.2 snrk2.3. (Fujii et al., 2007). El genoma de Arabidopsis codifica 10 SnRK2s, de las cuales 3 (OST1, SnRK2.2 y SnRK2.3) participan en la señalización por ABA (Fujii y Zhu, 2009; Fujita et al., 2009; Nakashima et al., 2009). Las SnRK2 activadas por fosforilación muestran actividad kinasa y son capaces de fosforilar a numerosas proteínas implicadas en la respuesta a ABA (Choi et al., 2000; Uno et al., 2000; Belin et al., 2006), mientras las fosfatasas PP2C de tipo A como ABI1 y 2 o HAB1, al inhibir a las anteriores en ausencia de ABA por desfosforilación, funcionan como reguladores negativos de la respuesta a esta hormona (Schweighofer et al., 2004; Umezawa et al., 2009). La familia PYR/PYL/RCAR se ha identificado por su papel como receptores de ABA (Park et al., 2009; Ma et al., 2009; Santiago et al., 2009; Nishimura et al., 2009). Estas pequeñas proteínas solubles, tras unirse a ABA, cambian su conformación para facilitar la unión a fosfatasas de tipo PP2C, compitiendo con ellas por la unión a las SnRK2 (Melcher et al., 2009; Yin et al., 2009; Miyazono et al., 2009). En el cuádruple mutante pyr1/pyl1/pyl2/pyl4, el ABA fue incapaz de activar a las kinasas SnRK2 (Park et al., 2009). Tras numerosos estudios de inducción de genes de respuesta a estrés en mutantes de Arabidopsis deficientes (aba1-1) o insensibles a ABA (abi1-1 y abi2-1), se observó que la activación de genes de respuesta a estrés osmótico se puede llevar a cabo por rutas dependientes o independientes de ABA (Thomashow, 1998; Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki,  15 2000). Dos de los principales loci identificados por su baja respuesta a estrés abiótico, LOS5 y LOS6, mostraron ser deficientes en la inducción de ABA por sequía y osmolaridad respectivamente (Xiong et al., 2001). El mutante los5, alelo de ABA3, mostró baja expresión de los genes RD29A, COR15, COR47, RD22 y P5CS, mientras en el mutante los6, alelo de ABA1, se vio una menor inducción de RD29A, COR15A, KIN1, COR47, RD19 y ADH, revirtiéndose en ambos casos el fenotipo mediante la aplicación exógena de ABA. En los promotores de los genes que se inducen en respuesta a estrés hídrico y osmótico ante ABA se han identificado secuencias llamadas ABRE (del inglés, Abscicic Acid Responsive Elements), a las que se unen varios factores de transcripción del tipo cremallera de leucina básica (bZIP) llamados ABF/AREB (Stockinger et al., 1997; Choi et al., 2000; Uno et al., 2000). El genoma de Arabidopsis codifica 9 factores de transcripción de este tipo. Los genes AREB1, AREB2 y AREB3, funcionalmente redundantes, se inducen en tejidos vegetativos por ABA, salinidad y sequía. Para su activación durante la señalización por ABA, estos factores de transcripción necesitan ser fosforilados por kinasas SnRK2 (Fujita et al., 2005, 2009; Yoshida et al., 2010). Por su parte, los promotores de los genes no inducibles por ABA contienen secuencias DRE/CRT (del inglés, Dehydration Responsive Elements), que son reconocidas por factores de transcripción como los de tipo CBF/DREB1, o CBF/DREB2 (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994; Stockinger et al., 1997; Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998; Medina et al., 1999). Los factores de tipo CBF/DREB1 constituyen un destacado regulón que activa más de 40 genes de respuesta a frío. Se activa por el factor de transcripción inducible por frío ICE1 y se reprime por MYB15, que se unen al promotor CBF3 para regular la respuesta de las plantas a este tipo de estrés. A través del promotor CBF2, también es posible activar su transcripción mediante activadores de unión a calmodulina (Chinnusamy et al., 2003; Agarwal et al., 2006; Doherty et al., 2009; revisado por Qin et al., 2011). Además, algunos de estos factores de transcripción se activan también por estrés osmótico (Haake et al., 2002; Magome et al., 2004). Dos factores pertenecientes a este grupo, RAP2.4 RAP2.4B, se identificaron recientemente como reguladores de genes de acuaporinas, indicando su papel en el mantenimiento de la homeostasis hídrica en condiciones de estrés (Rae et al., 2011). Los de tipo CBF/DREB2 no se inducen por frío sino por salinidad y estrés hídrico, incrementando la expresión de genes de respuesta a ambos tipos de estrés, así como de factores de transcripción inucibles por estrés térmico (Sakuma et al., 2002, 2006a, 2006b). Las plantas con sobreexpresión de factores DREB1 muestran un perfil transcriptómico y metabólico similar al de plantas sometidas a estrés por congelación, mientras que la sobreexpresión de factores de tipo DREB2 favorece la acumulación de metabolitos propios de plantas deshidratadas (Maruyama et al., 2009). Los nucleótidos cíclicos cAMP y cGMP son mensajeros secundarios que regulan la apertura estomática, flujo de cationes mono y divalentes, desarrollo de cloroplastos, señalización por giberelinas para la hidrólisis de almidón en las láminas de aleurona, respuesta a patógenos y transcripción de muchos genes, entre los que se encuentran transportadores (Bowler et al., 1994; Penson et al., 1996; Volotovski et al., 1998; Maathuis y Sanders, 2001; Newton et al., 2004; Maathuis, 2006; Martínez-Atienza et al., 2007b). En plantas, los  16 nucleótidos cíclicos tienen como principal diana a los canales dependientes de nucleótidos cíclicos, a los que activan (CNGC, del inglés Cyclic Nucleotide Gated Channels). Se cree que estos canales pueden convertir la señal de nucleótidos cíclicos en una señal de Ca 2+ , sin necesidad de kinasas dependientes de nucleótidos cíclicos, que sí son necesarias en células animales (Bailey et al., 2005). Rutas de señalización mediante cascadas de fosfoproteínas. En plantas la señalización del estrés abiótico desencadena rutas dependientes de Ca 2+ (a través de CDPKs y CBLs) y cascadas de MAP kinasas, que no están reguladas por este catión (Xiong et al., 2002). Las CDPKs (del inglés Calcium-Dependent Protein Kinases) son serina/treonina kinasas con un dominio carboxiterminal similar a la calmodulina que contiene 4 motivos “EF- hand” para la unión de Ca 2+ . Algunas contienen la secuencia de miristoilación en su extremo aminoterminal, sugiriendo una posible asociación a membranas plasmáticas (Xiong et al., 2002). Las primeras demostraciones de la implicación de las CDPKs en la transducción de señales por estrés se obtuvieron en protoplastos de maíz, utilizando el gen de la luciferasa. Cuando se expresó bajo el control del promotor del gen HVA1 de respuesta a ABA de cebada o del gen RAB16 de respuesta a ABA y estrés osmótico en arroz, fue inducido por la kinasa de Arabidopsis AtCDPK1, que está implicada en señalización por estrés salino e hídrico (Sheen, 1996; Saijo et al., 2000). En arroz, OsCDPK7 se induce por frío y estrés salino, y promueve la expresión de genes diana por salinidad y sequía, aunque no por frío (Saijo et al., 2000). En Mesembryanthemum crystallinum, McCDPK1 es una CDPK inducida por salinidad y sequía que fosforila al regulador de pseudo-respuesta CSP1 en presencia de señales de Ca 2+ . El estrés salino favorece la colocalización de ambas proteínas en el núcleo para facilitar su interacción (Patharkar y Cushman, 2000). El genoma de Arabidopsis codifica 34 CDPKs distintas (Harmon et al., 2000), que han ido caracterizándose en los últimos años. CPK32 activa por fosforilación al factor de transcripción ABF4 y su sobreexpresión produjo plantas de Arabidopsis hipersensibles a ABA y salinidad, indicando su papel en la señalización por esta hormona (Choi et al., 2005). Los fenotipos obtenidos mediante la sobreexpresión y pérdida de función de CPK23 en Arabidopsis también demostraron su papel en la señalización por ABA. Junto con CPK21, activa por fosforilación al canal de salida de aniones SLAC1 en presencia de esta hormona. De este modo, la despolarización de la membrana plasmática produce la activación del canal de salida de K + GORK, ocasionando el cierre estomático en episodios de estrés hídrico (Ma y Wu, 2007; Geiger et al., 2010). CPK3 y CPK6 también favorecen el cierre estomático por ABA, aunque se desconoce su mecanismo de acción (Mori et al., 2006). También CPK4 y CPK11 son reguladores positivos de la respuesta a ABA, al parecer mediante la activación de los factores ABF1 y ABF4, mientras que CPK12 equilibra la respuesta a esta hormona mediante la activación por fosforilación tanto de estos dos factores de transcripción como del regulador negativo ABI2 (Zhu et al., 2007; Zhao et al., 2011). Finalmente, CPK10  17 regula positivamente la respuesta de las plantas a sequía mediante la activación de la proteína HSP1 (Zou et al., 2010). Las CBLs (del inglés Calcineurin B-Like protein) muestran similitud con la subunidad reguladora B de la calcineurina y con los sensores neuronales de Ca 2+ (Liu y Zhu, 1998; Kudla et al., 1999). Estas proteínas se caracterizan por la presencia de 4 módulos formados por un dominio hélice-bucle-hélice de unión a Ca 2+ llamado “EF-hand” (Guo et al., 2001; Luan et al., 2002). En el genoma de Arabidopsis existen 10 proteínas CBL distintas, que actúan como sensores de Ca 2+ para la activación de 25 kinasas con las que interactúan (llamadas CIPKs, del inglés CBL-Interacting Protein Kinases) (Guo et al., 2001; Sanders et al., 2002; Hrabak et al., 2003). En condiciones normales, las CIPKs se encuentran autoinhibidas mediante la interacción del dominio aminoterminal catalítico con el carboxiterminal regulador. Las CBLs activadas por Ca 2+ se unen al dominio FISL de las CIPKs, situado entre los dominios catalítico y regulador, liberando a la kinasa de su autoinhibición y permitiéndole activar a proteínas diana por fosforilación (Albrecht et al., 2001; Guo et al., 2001). La expresión constitutiva de CIPK20, así como el silenciamiento de CBL1 o CIPK15, que codifica a la kinasa con la que interactúa, produjeron plantas transgénicas hipersensibles a ABA en las que se indujo la expresión de numerosos genes de respuesta a esta hormona (Leung y Giraudat, 1998, Gong et al., 2002; Guo et al., 2002). Estos resultados indican que el complejo CBL1/CIPK15 actúa como regulador negativo de la respuesta global a ABA, mientras CIPK20 sería un regulador positivo. También CIPK3 regula la señalización por ABA, ya que mutantes por inserción de T-DNA en este gen mostraron hipersensibilidad durante germinación y desarrollo de plántulas (Kim et al., 2003). CBL2, en interacción con CIPK11, controla el pH citosólico inhibiendo la H + -ATPasa mediante la prevención de su activación por la proteína 14-3-3 (Fuglsang et al., 2007). En respuesta a bajas concentraciones de K + en el medio, tanto CBL1 como CBL9 reconocen las señales de Ca 2+ generadas y activan a CIPK23, que fosforila a AKT1 para permitir la toma de K + de alta afinidad (Li et al., 2006). Adicionalmente, ambas CBLs regulan, a través de CIPK23, el movimiento estomático, mostrando el doble mutante cbl1 cbl9 (pero no ninguno de los dos mutantes simples) hipersensibilidad a ABA en el cierre de los estomas (Cheong et al., 2007). También se unen a CIPK1 para activar respuestas desencadenadas por estrés osmótico (en el caso de CBL1) o por ABA (en el caso de CBL9), habiéndose detectado simultáneamente la formación de ambos complejos en la membrana plasmática (D’Angelo et al., 2006; Waadt et al., 2008). La interacción entre CBL1 y CIPK1 se da en el citoplasma, donde CBL1 es miristoilada en su extremo aminoterminal para dirigir el complejo al retículo endoplasmático. Allí es modificada por una palmitoíl-transferasa, que produce su S-palmitoilación para permitir el transporte del complejo a la membrana plasmática (Batistic et al., 2008). Finalmente, en la ruta SOS, la CBL SOS3 (CBL4) responde a la señal de Ca 2+ producida por el estrés salino liberando a la CIPK SOS2 (CIPK24) de su autoinhibición para permitir la activación por fosforilación del antiportador Na + /H + SOS1 (Shi et al., 2000; Qiu et al., 2002; Quintero et al., 2011)(ver apartado I.7.3.2).  18 El estrés salino puede desencadenar respuestas independientes de Ca 2+ a través de cascadas de MAP kinasas (del inglés, Mitogen Activated Protein-Kinases). Las señales percibidas por las ~60 MAPKKKs codificadas en el genoma de Arabidopsis son transducidas por las ~10 MAPKKs a las ~20 MAPKs, que están implicadas en señalización por estreses biótico y abiótico, así como por hormonas y cambios durante el desarrollo (Ligterink y Hirt, 2001). La primera cascada de MAP kinasas identificada en Arabidopsis fue la formada por AtMEKK1, AtMEK1/AtMKK2 y AtMPK4/AtMPK6 (Ichimura et al., 2000). El estrés salino induce la expresión y actividad de AtMEKK1. En el mutante de Arabidopsis mpk4, se observó insensibilidad a ácido jasmónico, hiperacumulación de ácido salicílico y respuesta sistémica adquirida (SAR) constitutiva. La fosfatasa MKP1 puede interactuar con AtMPK4 y AtMPK6 (Ulm et al., 2002), regulando negativamente la transcripición del antiportador catión/H + CHX17. Las ROS activan la cascada de MAP kinasas formada por ANP1, AtMPK3 y AtMPK6 (Kovtun et al., 2000; Moon et al., 2003). La sobreexpresión de la MAPKKK ANP1 produjo plantas transgénicas de Arabidopsis con mayor inducción de genes de respuesta a estrés oxidativo y mayor tolerancia a congelación, salinidad y estrés térmico. La cascada formada por AtMKK1 y AtMPK6 regula el metabolismo de H 2 O 2 a través de CAT1, mientras AtMEKK1 y AtMPK4 lo regulan a través de CAT2 (Xing et al., 2008; Pitzschke y Hirt, 2009). Los genes AtMPK6 y AtMPK3 se inducen por ozono, mostrando hipersensibilidad a esta ROS las líneas de Arabidopsis con pérdidas de función para estas proteínas (Ahlfors et al., 2004; Miles et al., 2005). La expresión de AtMEKK1 y AtMPK3 se induce también por sequía y elevada temperatura (Mizoguchi et al., 1996), mientras que la de AtMKK2, así como AtMPK4 y AtMPK6 que funcionan como sustratos suyos, lo hacen por frío (Ichimura et al., 2000; Mizoguchi et al., 2000; Teige et al., 2004) .En tabaco, la sobreexpresión de la MAPKKK NtNPK1 produjo plantas transgénicas tolerantes a distintos estreses abióticos en las que la expresión constitutiva de la MAPKKK mimetizaba la señal generada por el H 2 O 2 , iniciando una cascada de fosforilación de MAP kinasas cuyo resultado era la activación de distintos genes de respuesta a estrés (Kovtun et al., 2000). En maíz se han identificado más recientemente las MAP kinasas inducidas por salinidad ZmMPK3, ZmMAPK5 y ZmSIMK1. ZmMPK3 juega además un papel importante en respuesta a otros tipos de estrés abiótico como el estrés hídrico, mientras que ZmMAPK5 se induce por frío (Ding et al., 2009; Gu et al., 2010; Wang et al., 2010).  19 Tipos de señalización I II III Frío y estrés osmótico Estrés iónico MAPKKK H 2 O 2 MAPKK MAPK Antioxidantes Osmolitos IP3 ABA Ca 2+ Ca 2+ CDPK Fosfoproteínas Mensajeros secundarios Cascada de fosfoproteínas Productos Factores de transcripción Proteínas LEA SOS3 SOS2 Transportadores iónicos Homeostasis iónica ABA Tipos de señalización I II III Frío y estrés osmótico Estrés iónico MAPKKK H 2 O 2 MAPKK MAPK Antioxidantes Osmolitos IP3 ABA Ca 2+ Ca 2+ CDPK Fosfoproteínas Mensajeros secundarios Cascada de fosfoproteínas Productos Factores de transcripción Proteínas LEA SOS3 SOS2 Transportadores iónicos Homeostasis iónica ABA Figura I.3. Principales tipos de señalización en las plantas durante estrés frío, hídrico y salino. Se representan las moléculas señalizadoras, cascadas y productos de los tres tipos principales de rutas de señalización en plantas. El tipo I corresponde a las cascadas de MAP kinasas implicadas en la degradación de ROS y producción de osmolitos. El tipo II tiene como resultado la producción de proteínas de respuesta a estrés mediante rutas dependientes de Ca 2+ . El tipo III corresponde a la ruta SOS, específica de estrés iónico (Adaptado de Xiong et al., 2002). I.5 El transporte iónico en el mantenimiento de la homeostasis y la tolerancia a estrés. Los transportadores iónicos son indispensables para la planta, ya que permiten la toma y distribución intra e intercelular de elementos nutritivos, así como la expulsión de los que son perjudiciales. El genoma de Arabidopsis codifica ~800 proteínas de membrana, el 65% de las cuales funcionan como transportadores de iones y compuestos orgánicos (Saier, 2000). Las proteínas encargadas del transporte iónico se pueden clasificar en bombas, canales y transportadores (Sussman y Harper, 1989). Las bombas aprovechan directamente la energía obtenida mediante la hidrólisis de ATP o pirofosfato para el transporte de iones en contra de su gradiente electroquímico. A diferencia de las levaduras, las plantas vasculares no pueden expulsar Na + directamente a través de bombas ATPasa (Serrano y Rodríguez-Navarro, 2001). Sus bombas, H + -ATPasa de tipo P en membrana plasmática y H + -ATPasa de tipo V y H + - PPasa en tonoplasto, transportan H + en contra de gradiente para generar un potencial de  20 membrana que permita a los antiportadores catión/H + el transporte activo de cationes (Blumwald et al., 2000). Los canales realizan un transporte rápido y pasivo a través de membrana a una velocidad de 10 7 moléculas por segundo. Los transportadores pueden ser uniportadores, que transportan una molécula a favor de gradiente, o antiportadores y simportadores, que mueven simultáneamente dos moléculas, una a favor y otra en contra de gradiente, en dirección opuesta o en la misma dirección respectivamente. El transporte es más lento que en los canales, del orden de 10 4 moléculas por segundo (Niu et al., 1995; Chrispeels et al., 1999). El análisis del genoma de Arabidopsis identificó cuatro subfamilias de transportadores catión/H + con afinidad por Ca 2+ , Na + , K + y Mg 2+ (CaCA, NhaD, CPA1 y CPA2)(Mäser et al., 2001). La subfamilia CaCA está formada por 11 transportadores Ca 2+ /H + llamados CAX1-11, en los que algunos miembros pueden transportar también Mn 2+ y Cd 2+ (Cheng et al., 2002). AtMHX, relacionada filogenéticamente con la familia de los CAX, interviene en la compartimentación de Mg 2+ y Zn 2+ en la vacuola (Shaul et al., 1999). Los dos miembros de la subfamilia NhaD (NHD1 y NHD2) muestran cierta similitud con antiportadores Na + /H + bacterianos, habiéndose caracterizado solamente NHD1 como antiportador Na + /H + cloroplástico implicado en la toma de piruvato dependiente de Na + llevada a cabo por el transportador BASS2 (Pardo et al., 2006; Furumoto et al., 2011). La familia CPA1 consta de 8 miembros: NHX1-6, SOS1 y NHX8. Son antiportadores catión/H + vacuolares, un antiportador Na + /H + de membrana plasmática y un antiportador Li + /H + de membrana plasmática respectivamente (Blumwald, 2000; Qiu et al., 2002, An et al., 2007; Bassil et al., 2011; Barragán et al., 2012). Por último, la subfamilia CPA2 incluye 28 intercambiadores catión/H + CHX y 5 antiportadores KEA (Pardo et al., 2006). Se ha demostrado la implicación de los transportadores HKT en el simporte de K + y Na + de alta afinidad o la toma de Na + de baja afinidad en raíz, habiéndose propuesto también su papel en la toma de Na + y su recirculación en plantas sometidas a estrés salino (Rubio et al., 1995; Rus et al., 2001; Laurie et al., 2002; Apse y Blumwald, 2007). Los distintos transportadores HKT muestran selectividad iónica mezclada cuando se expresan en sistemas heterólogos. El análisis filogenético realizado mediante la comparación de secuencias de aminoácidos en distintos transportadores HKT de mono y dicotiledóneas llevó al establecimiento de 2 subfamilias (Platten et al., 2006). Los miembros de la subfamilia 1 (HKT1;n) se encuentran representados tanto en mono como en dicotiledóneas y muestran especificidad por Na + , posiblemente debido a la presencia de una serina en el primer bucle del poro. Los transportadores de la subfamilia 2 (HKT2;n) pertenecen exclusivamente a monocotiledóneas, transportan Na + y K + , y la serina típica de la subfamilia 1 se encuentra sustituida por una glicina (excepto en OsHKT2;1, que funciona como uniportador de Na + ). Se ha sugerido que la principal función del único miembro de esta familia en Arabidopsis, AtHKT1;1, es el transporte a larga distancia de Na + . En presencia de estrés salino, AtHKT1;1 descargaría Na + del xilema y favorecería la acumulación preferente de este catión en raíz, protegiendo así al tejido foliar de los daños causados por su excesiva acumulación en la parte  27 CO 2 también produce despolarización y alcalinización de este tipo de células. Mientras el Ca 2+ activa a los canales de entrada de aniones, los canales de entrada/salida de K + se activan por la acidificación/alcalinización del pH e hiperpolarización/despolarización de la membrana. El control de la apertura y cierre estomáticos es muy importante para controlar las relaciones hídricas de la planta, así como la fijación de CO 2 (MacRobbie, 1998; Hedrich et al., 2001). Ensayos de RT-PCR cuantitativa para los distintos canales de tipo “Shaker” en protoplastos de células guarda mostraron un nivel de expresión alto para KAT1, moderado para GORK, KAT2 y AKT1, bajo para AKT2 y AtKC1 y nulo para SKOR, AKT5 y AKT6 (Szyroki et al., 2001). KAT1 es un canal rectificador de entrada de K + que se expresa en células guarda e interviene en la apertura estomática (Schachtman et al., 1991; Nakamura et al., 1995a; Ichida et al., 1997). La expresión de canales KAT1 con mutaciones dominantes negativas en Arabidopsis produjo plantas en las que la disminución en las corrientes de entrada de K + en las células guarda redujo la apertura estomática (Kwak et al., 2001). Se ha demostrado que su homólogo KAT2, con quien puede formar heteromultímeros, muestra unas características más propias de canales de entrada de K + en células guarda como la mayor sensibilidad a la acidificación del pH extracelular o la abundancia de regiones en su secuencia que permiten su regulación pre y post-traduccional, por lo que se ha especulado que su importancia en la apertura estomática podría ser mayor que la de KAT1 (Pilot et al., 2001). La caracterización del mutante kat1 de Arabidopsis no reveló diferencias con la línea silvestre en cuanto a morfología, tamaño o número de cloroplastos en las células guarda. Tampoco se vio alterado el comportamiento de los estomas frente a CO 2 , luz, ABA o niveles bajos de K + en el apoplasto, si bien la permeabilidad a K + se mostró más sensible a la adición de Ca 2+ . De los canales expresados en células guarda, sólo AKT2 es sensible al bloqueo por Ca 2+ , lo que sugiere la interacción de esta subunidad con complejos del tipo proteín-kinasa/proteín-fosfatasa dependientes de Ca 2+ para su regulación (Ivashikina et al., 2005). A raíz de los resultados anteriormente expuestos, se puede concluir que la apertura de los estomas por la entrada de K + en las células guarda no se debe exclusivamente a KAT1, sino que también intervienen canales insensibles (posiblemente AKT1 y KAT2) y sensibles a Ca 2+ (AKT2) (Szyroki et al., 2001). La proteína GORK es un canal rectificador de salida de K + que se activa por despolarización celular y no se inhibe por pH ácido como los canales de entrada. Su activación es más rápida cuando la concentración de K + extracelular es baja, por lo que también actúa como sensor. Se expresa en células guarda y pelos radicales, permitiendo el cierre estomático y la detección de la concentración de K + en la solución del suelo (Ache et al., 2000; Ivashikina et al., 2001). La disrupción del gen GORK por inserción de T-DNA produjo plantas mutantes de Arabidopsis con excesivas pérdidas de agua por evapotranspiración debido a su incapacidad para cerrar los estomas. (Hosy et al., 2003). En presencia de ABA inducido ante estrés hídrico, las kinasas CPK21 y CPK23, activan al canal de salida de aniones SLAC1, lo que produce la liberación de K + a través de GORK como consecuencia de la despolarización celular (Becker et al., 2003; Ma et al., 2007; Geiger et al., 2010).  28 I.7 Transporte de Na + en plantas. I.7.1. Absorción de Na + . Bajo condiciones fisiológicas normales, las plantas tienden a mantener un alto cociente K + :Na + en el citosol, con concentraciones de K + de 100-200 mM y 1-10 mM de Na + . El aumento en la concentración extracelular de Na + establece un alto gradiente de concentraciones que, unido al potencial de membrana negativo (-140 mV), favorece la entrada pasiva de este catión al citosol (Higinbotham, 1974; Niu et al., 1995). Al igual que el K + , el Na + es transportado en un flujo radial por el córtex de la raíz, a través de las vías apoplástica y simplástica, hasta llegar a la endodermis, donde la presencia de la barrera impermeable formada por la banda de Caspari obliga a que el flujo hacia la estela pase por la vía simplástica. Una parte del transporte puede continuar por la vía apoplástica en las discontinuidades que presenta la endodermis en los ápices radiculares o en las zonas de emergencia de las raíces secundarias (Tester y Leigh, 2001). Tester y Davenport (2003) clasificaron las vías de entrada de Na + en las raíces en tres grupos: simplásticas sensibles a Ca 2+ , simplásticas independientes de Ca 2+ y apoplástica. La importancia de cada vía depende de la especie y condiciones de cultivo. I.7.1.1. Mecanismos sensibles a Ca 2+ . La supresión parcial de la toxicidad sódica en plantas mediante la adición de hasta 10 mM de Ca 2+ a la solución externa es un fenómeno conocido desde hace mucho (Cramer et al., 1985). Este efecto, además de estar causado por la activación de la ruta SOS de señalización (Liu y Zhu, 1998) se debe a la inhibición del flujo de entrada de Na + (Davenport y Tester, 2000), siendo los canales no selectivos de cationes (NSCC) la vía más probable de entrada de Na + sensible a Ca 2+ (Amtmann y Sanders, 1999; Tyerman y Skerret, 1999; Zhu, 2003; Rus et al., 2004). Dentro de la familia de los NSCC, las principales subfamilias de canales candidatos son los canales activados por nucleótidos cíclicos (CNGC) y los canales activados por glutamato (GLR) (Lacombe et al., 2001; Leng et al., 2002). Los CNGC se expresan en raíz y están implicados en la toma de cationes (Sunkar et al., 2000; White et al., 2002). Aunque la inhibición de la toma de Na + in planta mediante la adición de nucleótidos cíclicos parece demostrar la implicación de los CNGCs en esta mejora de la halotolerancia (Maathuis y Sanders, 2001), la expresión de estas proteínas de plantas en oocitos de Xenopus mostró que la adición de cAMP no inhibía sino que activaba corrientes de entrada de Na + a través de AtCNGC1, AtCNGC2 y AtCNGC4 de Arabidopsis y NtCBP4 de tabaco (Leng et al., 2002; Balagué et al., 2003). También la expresión heteróloga en levadura parece contradecir los resultados in planta, ya que la supresión del fenotipo de sensibilidad a bajo K + de un mutante trk1,trk2 de levadura por AtCNGC2 se activó por cAMP (Leng et al., 2002). El canal AtCNGC3 parece estar implicado en la toma de Na + , ya que el mutante cngc3  29 de Arabidopsis mostró mayor tolerancia que la línea silvestre a concentraciones altas de Na + o K + en el medio y la expresión heteróloga de este gen en mutantes de levadura deficientes en las bombas Na + -ATPasa ENA1-4 aumentó la acumulación de Na + (Gobert et al., 2006). A la vista de los datos anteriores, parece lógico postular que la mejora de la halotolerancia producida por los nucleótidos cíclicos se debe a la activación de alguna proteína distinta de los CNGCs. El antiportador Na + /H + SOS1 podría ser un candidato, ya que contiene un dominio putativo de unión a nucleótidos cíclicos comprendido entre los aminoácidos 745 y 997 (Quintero et al., 2011). Aunque se desconocen las implicaciones fisiológicas de los resultados, análisis transcriptómicos en Arabidopsis revelaron que el estrés salino induce la expresión de AtCNGC1, AtCNGC19 y AtCNGC20 en raíz y de AtCNGC3, AtCNGC8 y AtCNGC19 en parte aérea (Maathuis, 2006). También se ha postulado la implicación de los GLRs en la adquisición de Na + , a raíz de la mayor toma de este catión en plantas tras la adición de glutamato y la similitud de estas proteínas con los receptores ionotrópicos de glutamato en neuronas de vertebrados (iGLRs), que controlan la transmisión del impulso nervioso mediante el transporte de Na + , K + y Ca 2+ (Lam et al., 1998). Sin embargo, los GLRs caracterizados hasta la fecha muestran actividad nula, como AtGLR2.8, actividad independiente de glutamato, como AtGLR3.4, o implicación en la entrada de Ca 2+ a través de la membrana plasmática, como AtGLR3.3. Estos resultados, junto con el incremento transitorio en Arabidopsis de los niveles citosólicos de Ca 2+ en presencia de glutamato, sugieren la participación de estas proteínas en la entrada de Ca 2+ y no Na + en la célula (Demidchik et al., 2004; Qi et al., 2006). Finalmente, la proteína LCT1 (Low Affinity Cation Transporter 1) de trigo, con una estructura distinta a la del resto de transportadores iónicos de plantas superiores, permite la toma de baja afinidad de Cd 2+ , Ca 2+ , Rb + y Na + y causa sensibilidad a Na + al ser expresada en levadura. La entrada de Na + se redujo mediante la adición de Ca 2+ , aunque la similitud entre su selectividad iónica y la de los sistemas de transporte de cationes propios de levadura podría indicar que esta proteína actúa mediante la estimulación de transportadores iónicos endógenos (Schachtman et al., 1997; Clemens et al., 1998; Amtmann et al., 2001). I.7.1.2. Mecanismos insensibles a Ca 2+ . Además de ser causada por el componente insensible a Ca 2+ de los NSCC (Tester y Davenport, 2003), la toma de Na + insensible a Ca 2+ podría deberse a los transportadores de tipo HKT, emparentados con los transportadores de K + TRK de levadura y KtrB, KdpA y TrkH de bacteria (Durell y Guy, 1999). El transportador TaHKT2;1 de trigo fue el primero en identificarse. Cuando se expresa en oocitos de Xenopus o levadura cataliza un simporte de alta afinidad de Na + y K + a concentraciones micromolares de Na + o un uniporte de Na + de baja afinidad a concentraciones milimolares de este catión, siendo el flujo insensible a Ca 2+ (Rubio et al., 1995; Tyerman y Skerrett, 1999). Los genes Kna1 de trigo blando y Nax2 de la línea 149 de trigo duro obtenida por cruzamiento entre T. monococcum y T. durum, implicados en  30 tolerancia a salinidad, se ubicaron por mapeo cromosómico en las regiones distales 4DL y 5Al respectivamente. Ambas regiones son homeólogas y codifican un transportador similar a OsHKT1;5, que podría ser el responsable del papel de estos loci de trigo en el mantenimiento de un bajo contenido de Na + y un alto cociente K + /Na + en las hojas (Gorham et al., 1990; James et al., 2006; Byrt et al., 2007). En arroz se han identificado transportadores que, al igual que TaHKT2;1, pueden funcionar como uni o simportadores (OsHKT2;2), uniportadores específicos de Na + como OsHKT2;1, OsHKT1;3 y OsHKT1;1 o uniportadores de K + como OsHKT2;4. OsHKT2;2, que muestra un 93% de homología con OsHKT2;1, cotransporta Na + y K + en levadura, oocitos de Xenopus y en células BY2 de tabaco, además de ser capaz de uniportar Na + en estas últimas cuando la concentración de este catión en el medio se encuentra en el rango milimolar (Horie et al., 2001; Yao et al., 2010). OsHKT2;1 cataliza la toma de Na + de alta afinidad en condiciones de baja salinidad y déficit de K + (cuando la toma de Na + es beneficiosa para suplir al K + en el mantenimiento de la turgencia y crecimiento celular) pero se reprime rápidamente ante estrés salino para evitar la toxicidad sódica (Horie et al., 2001; Garciadeblás et al., 2003; Horie et al., 2007; Horie et al., 2011). OsHKT1;1 y OsHKT1;3 muestran permeabilidad exclusiva para Na + en oocitos de Xenopus, con corrientes exclusivamente de entrada en el caso de OsHKT1;1 o de entrada y salida en el de OsHKT1;3 (Jabnoune et al., 2009). OsHKT2;4 es un transportador de membrana plasmática con capacidad para transportar K + pero no Na + y que muestra cierta permeabilidad a Ca 2+ y Mg 2+ , si bien ésta es inhibida competitivamente por el K + (Horie et al., 2011). En cebada HvHKT2;1, cuya expresión se induce en condiciones de déficit de K + en toda la planta y a altas concentraciones de Na + en parte aérea, es capaz de transportar Na + y K + al expresarse heterólogamente en levadura. Plantas transgénicas de Arabidopsis sobreexpresando este gen mostraron mayor compartimentación de Na + que se tradujo en mayor resistencia a estrés salino, sugiriendo que esta proteína favorece la inclusión de este catión en el tejido foliar (Haro et al., 2005; Mian et al., 2011). En Thellungiella salsuginea se han clonado dos transportadores de tipo HKT: TsHKT1;1 y TsHKT2;1. El segundo muestra un mayor nivel de expresión y complementó mejor los fenotipos de sensibilidad a Na + y déficit de K + al ser sobreexpresado en el mutante hkt1;1 de Arabidopsis. La preferencia de TsHKT2;1 por K + frente a Na + en ensayos de expresión heteróloga en levadura sugiere una contribución a la halotolerancia de T. salsuginea mediante el mantenimiento de la toma de K + a elevadas concentraciones de Na + en el medio (Ali et al., 2012). El único representante de esta familia en Arabidopsis es AtHKT1;1. Funciona como uniportador específico de Na + en oocitos de Xenopus y levadura pero puede complementar a un mutante de E. coli deficiente en la toma de K + (Uozumi et al., 2000). Los mutantes hkt1 muestran hipersensibilidad a sal y mayor contenido en Na + en parte aérea, aunque menor en raíz (Rus et al., 2001; Mäser et al., 2002; Berthomieu et al., 2003; Rus et al., 2006). En principio, dada la supresión parcial del fenotipo de sos3 por parte de la mutación hkt1, se propuso su papel en la entrada de Na + a través de la raíz (Rus et al., 2001). Sin embargo, medidas posteriores de la toma de Na + en raíces demostraron que la toma de este catión no  31 era menor en el mutante (Berthomieu et al., 2003; Sunarpi et al., 2005). Dada su afinidad por el Na + , su localización en células del parénquima del xilema y floema y el fenotipo de los mutantes, su función se ha relacionado con el transporte de Na + a larga distancia. En un principio se postuló que realizaría esta función mediante la recirculación de Na + a través del floema, si bien estudios posteriores descartaron esta hipótesis al demostrar el papel de HKT1;1 en la descarga de Na + del xilema a las células parenquimáticas, acción que se coordinaría con la carga de este catión en el xilema por SOS1 (Berthomieu et al., 2003; Sunarpi et al., 2005; Rus et al., 2006; Davenport et al., 2007; Olías et al., 2009). Se han realizado numerosos estudios sobre el efecto de la alteración del nivel de expresión de este transportador en la homeostasis iónica. Si bien su sobreexpresión constitutiva tanto en arroz como en Arabidopsis produce plantas hipersensibles a altas concentraciones de Na + y déficit en K + , su sobreexpresión en tipos celulares específicos de la raíz como la estela o el periciclo mejoró la halotolerancia mediante la disminución del contenido en Na + de la parte aérea y el aumento del de K + (Rus et al., 2004; Møller et al., 2009; Plett et al., 2010; Xue et al., 2011). En la naturaleza se han encontrado entradas de Arabidopsis, como los ecotipos Ts-1 y Tsu-1, en los que alelos hipofuncionales de HKT1;1 mejoraban la halotolerancia de la planta. Estos alelos, cuya frecuencia aumenta en toda Europa en costas y zonas salinizadas, incrementan el contenido de Na + en la parte aérea a niveles subtóxicos que la planta es capaz de compartimentar en la vacuola sin llegar a saturarse como sucede en los mutantes hkt1;1 (Rus et al., 2004; Baxter et al., 2010). El tratamiento de plantas de Arabidopsis con la rizobacteria GB03 mejora la halotolerancia mediante la regulación de la expresión de HKT1;1: la aumenta en parte aérea para reducir su contenido en Na + y la reduce en raíz para aumentar el de K + (Zhang et al., 2008). Además, HKT1;1 regula la distribución de K + a través de la planta, favoreciendo la mayor acumulación en parte aérea y menor en raíz de este catión. Puesto que este transportador no muestra afinidad por el K + , este efecto parece ser indirecto y debido a la acumulación de Na + en las células del parénquima xilemático, que activaría por despolarización a los canales de salida de K + . (Rus et al., 2004; Sunarpi et al., 2005; Møller et al., 2009; Xue et al., 2011). I.7.1.3. Vía apoplástica. La última vía de entrada de Na + es a través del apoplasto. En plantas de arroz, la tolerancia a Na + es independiente de Ca 2+ y existe una correlación entre toma de Na + y flujo apoplástico (Yadav et al., 1996; Yeo et al., 1999). Estos datos parecen indicar que en arroz la principal fuente de entrada de Na + no es a través de la vía simplástica, sino de discontinuidades en la endodermis en ápices radiculares o puntos de emergencia de raíces secundarias. La contribución de esta tercera vía de entrada de Na + varía mucho entre especies. En trigo, este flujo es diez veces menor que en arroz (García et al., 1997). En plantas de Arabidopsis cultivadas en medios con bajas concentraciones de Ca 2+ , las tres vías contribuyen por igual (Essah et al., 2003).  32 I.7.2. Compartimentación de Na + en la vacuola. La compartimentación del exceso de Na + en las vacuolas, además de contribuir a la expansión celular en un medio hipertónico, es un mecanismo de vital importancia en la tolerancia de las plantas al estrés salino. El Na + es de este modo excluido del citosol, donde su sobreacumulación es tóxica para numerosas enzimas. Además, la compartimentación en la vacuola permite su ajuste osmótico, facilitando la toma de agua (Hasegawa et al., 2000; Blumwald et al., 2000). El transporte de Na + a través del tonoplasto requiere energía, por lo que está acoplado al gradiente electroquímico de H + establecido por la H + -ATPasa de tipo V y la H + - PPasa (Blumwald et al., 2000). El primer intercambiador Na + /H + vacuolar de plantas en identificarse fue AtNHX1 (Gaxiola et al., 1999). Muestra similitud en su secuencia con los antiportadores Na + /H + NHE de mamíferos y ScNHX de levadura (Nass et al., 1997; Counillon y Pouysségur, 2000), Presenta además la secuencia consenso FF(I/L)(Y/F)LFLLPPI de unión a amilórido, que funciona como inhibidor de esta familia de proteínas (Putney et al., 2002; Sato y Sakaguchi, 2005). El análisis del genoma de Arabidopsis indicó la presencia de 6 transportadores de tipo NHX, que se pueden clasificar en dos grupos: los de clase I (AtNHX1-4) se localizan en la vacuola y catalizan intercambio Na + /H + y K + /H + con la misma afinidad, mientras los de clase II (AtNHX5 y 6) son endosomales y muestran preferencia por el K + (Yokoi et al., 2002b; Venema et al., 2003; Pardo et al., 2006; Jiang et al. 2010; Bassil et al., 2011). La sobreexpresión de NHX3 en plantas de Arabidopsis mejora su germinación y crecimiento en condiciones de alta salinidad, además de aumentar su capacidad antiportadora K + /H + . Los mutantes de pérdida de función nhx3 muestran déficit de crecimiento en medios pobres en K + , así como menor acumulación de este catión y mayor de Na + que las plantas silvestres (Liu et al., 2010). Los mutantes nhx4 presentan resistencia a elevadas concentraciones de Na + y menor acumulación de este catión, mientras que la expresión heteróloga de NHX4 en E. coli aumenta su sensibilidad a Na + , especialmente si se utiliza la proteína truncada en su extremo carboxiterminal, que parece funcionar como dominio regulador. A la vista de los fenotipos, se ha sugerido la implicación de estas proteínas en la regulación de la homeostasis de K + y Na + respectivamente (Wang et al., 2007; Li et al., 2009; Liu et al., 2010). AtNHX5 y AtNHX6 pertenecen al mismo clado de transportadores endosomales que SlNHX2 de tomate, ScNHX1 de levadura y NHE6,7 y 9 humanos, a diferencia de los AtNHX1-4 de Arabidopsis (Brett et al., 2005; Pardo et al., 2006). Dada su gran similitud de secuencia (homología >68%) y patrón de expresión, así como la ausencia de fenotipos de los mutantes simples nhx5 y nhx6, se concluyó que ambas proteínas son funcionalmente redundantes, por lo que se obtuvo el doble mutante nhx5 nhx6. Éste presentaba menor crecimiento en roseta y raíces, desarrollo retrasado y sensibilidad a NaCl. El tráfico de vesículas se encontraba inhibido entre la red trans-Golgi y el compartimento prevacuolar y un análisis transcriptómico reveló alteraciones en la transcripción de genes relacionados con la respuesta a ABA y con el tráfico de vesículas.  33 Estos resultados, junto con la localización de ambas proteínas en los compartimentos endosomales del Golgi y la red trans-Golgi sugieren la función de ambos transportadores en la regulación del pH y la homeostasis de K + necesarios para el correcto transporte endosómico (Bassil et al., 2011a). Estudios realizados con el mutante de pérdida de función de AtNHX1 por inserción de T-DNA mostraron que las plantas mutantes eran más sensibles a estrés salino, con menor actividad antiportadora Na + /H + y K + /H + y desarrollo foliar alterado con menor frecuencia de células epidérmicas grandes, sugiriendo su contribución tanto a la homeostasis de estos dos cationes como a procesos de desarrollo y ciclo celular (Apse et al., 2003). El análisis transcriptómico de este mutante sometido a estrés salino puso de manifiesto su papel en el mantenimiento de la homeostasis iónica, respuesta a estrés hídrico y tráfico de vesículas, habiéndose demostrado ya anteriormente esta última función en su homólogo en levadura Nhx1 (Ali et al., 2004; Sottosanto et al., 2004, 2007). La expresión heteróloga de AtNHX1 en la cepa de levadura mutante nhx1 suprimió el fenotipo de sensibilidad a Na + y Li + (Gaxiola et al., 1999; Quintero et al., 2000) y la sobreexpresión de distintos transportadores NHX se empleó como herramienta biotecnológica para la mejora de la tolerancia a estrés salino en numerosas especies (Apse et al., 1999; Zhang et al., 2001; Zhang y Blumwald, 2001; Ohta et al., 2002; Fukuda et al., 2004; Xue et al., 2004; Wu et al., 2005), lo que llevó a la extendida creencia de que las proteínas NHX se encargan de la compartimentación vacuolar del exceso de Na + en plantas sometidas a estrés salino. Sin embargo, el análisis de los contenidos iónicos produjo resultados contradictorios, ya que no existe una correlación evidente entre la mayor tolerancia a salinidad mostrada por las distintas especies y su mayor acumulación de Na + en las vacuolas. (Pardo et al., 2006; Rodríguez-Rosales et al., 2009; Jiang et al., 2010). Ensayos de transporte con vesículas de tonoplasto aisladas de tomate, proteoliposomas artificiales en los que AtNHX1 era el único transportador y vacuolas de una cepa de levadura carente de los antiportadores endógenos del tonoplasto demostraron que AtNHX1 cataliza los antiportes Na + /H + y K + /H + con la misma afinidad (Zhang y Blumwald, 2001; Venema et al., 2002; Hernández et al., 2009). Además, la unión en condiciones fisiológicas, pH ligeramente ácido y presencia de Ca 2+ de AtCAM15, una proteína similar a calmodulina, favorece la afinidad de AtNHX1 por el K + respecto al Na + (Yamaguchi et al., 2005). En ensayos realizados en nuestro laboratorio (Leidi et al., 2010), la sobreexpresión de AtNHX1 en tomate produjo plantas con mayor tolerancia a choque salino y mayor toma de K + , aunque mostraron síntomas de déficit como la inducción de HAK5. Análisis electrofisiológicos y por SEM/EDX demostraron que las plantas transgénicas acumulaban más K + en la vacuola y menos en el citosol sin verse afectadas en los contenidos de Na + . AtNHX2 muestra una homología del 87,5% con AtNHX1. Ambas son las que más se expresan en toda la planta, con expresión ubicua y muy similar que se induce por estrés salino, KCl, estrés osmótico y ABA. Dadas sus similitudes, se cree que existe solapamiento funcional entre las dos proteínas (Quintero et al., 2000; Shi y Zhu, 2002; Yokoi et al., 2002b; Li et al., 2004; Bassil et al., 2011b; Barragán et al., 2012). En ensayos realizados en nuestro laboratorio,  34 los mutantes simples nhx1 y nhx2 mostraron fenotipos similares, con ligera reducción de la germinación a elevadas concentraciones de NaCl, acumulación de Na + en cultivo hidropónico menor en parte aérea y mayor en raíz, y alta sensibilidad a concentraciones de K + extremas, lo que sugiere su implicación en la homeostasis de K + en la planta (Barragán et al., 2012). La posible redundancia funcional entre NHX1 y NHX2 llevó a la obtención y caracterización del doble mutante nhx1 nhx2. En ausencia de estrés, mientras los mutantes simples nhx1 y nhx2 no mostraban ningún fenotipo, el doble mutante presentó menor tamaño de la roseta, células más pequeñas, hipocotilos más cortos en plántulas etioladas, estambres anormales y silicuas más pequeñas y escasas. Ensayos de SEM/EDX en hojas y de microscopía confocal en raíces inyectadas con el tinte PBFI-AM demostraron la menor capacidad del doble mutante para compartimentar K + en las vacuolas, así como el pH más ácido de éstas, y la presencia de estomas aberrantes. (Bassil et al., 2011b; Barragán et al., 2012). Los ensayos electrofisiológicos en células epidérmicas de raíz mostraron un mayor contenido de K + en el citosol, donde se acumuló al no poder ser importado a la vacuola, lo que se tradujo en una menor toma de Rb + por sistemas de transporte de alta afinidad (Barragán et al., 2012). Aunque el polen del doble mutante no mostraba diferencias con el de la línea silvestre en su germinación y viabilidad, se observó por SEM/EDX la menor elongación de los filamentos del estambre, así como una severa reducción de la dehiscencia en las anteras, lo que se tradujo en la menor producción de semillas y silicuas observada (Bassil et al., 2011b). En ensayos en cultivo hidropónico realizados en nuestro laboratorio (Barragán et al., 2012), la sensibilidad a NaCl del doble mutante fue similar a la de la línea silvestre, mientras que su crecimiento disminuía progresivamente al aumentar la concentración de K + del medio de cultivo, aliviándose parcialmente este efecto mediante la suplementación con NaCl. Estos resultados son similares a los obtenidos por Bassil et al (2011b) in vitro. Dado el elevado nivel de expresión de NHX1 y NHX2 en células guarda, así como la alteración de las relaciones hídricas observada en el doble mutante nhx1 nhx2, se decidió analizar su tolerancia a estrés osmótico y su conductividad estomática (Barragán et al., 2012). El choque osmótico inducido mediante tratamiento con polietilenglicol (PEG) produjo una reducción del contenido de agua mucho mayor en la línea nhx1 nhx2, que no sobrevivió al tratamiento y mostró una respuesta estomática (evaluada mediante la determinación de la conductividad utilizando un analizador infrarrojo de gases) más lenta. La tasa de fotosíntesis se vio muy afectada en el doble mutante sometido a tratamiento osmótico y la medida de la presión celular a lo largo del día reveló menor turgencia celular en el doble mutante, así como menor capacidad para osmorregular ante estrés osmótico o con los ritmos circadianos. En conjunto, estos resultados demuestran el papel de los antiportadores NHX1 y NHX2 en el mantenimiento de la homeostasis de K + en el tonoplasto, esencial para la expansión celular, producción de semillas y mantenimiento de las relaciones hídricas en la planta.  35 I.7.3. Expulsión y transporte a larga distancia de Na + . El exceso de Na + que llega al citoplasma de las células se elimina por extrusión o por compartimentación vacuolar. En células maduras, ambos mecanismos se coordinan para que la entrada de Na + no supere la capacidad de almacenamiento. Las células meristemáticas carecen de sistema vacuolar desarrollado, por lo que en ellas el mecanismo más eficiente de exclusión del Na + es la extrusión. La expulsión del Na + desde una célula podría ser perjudicial para las células de su alrededor, debiendo distribuirse este catión por la planta a través del xilema y el floema de una forma coordinada para evitar sus efectos tóxicos (Tester y Davenport, 2003). En base a ensayos de transporte, su patrón de expresión y el fenotipo de los mutantes de pérdida de función, se ha implicado al antiportador Na + /H + SOS1 en estos dos procesos (Wu et al., 1996; Zhu et al., 1998; Liu y Zhu, 1998; Shi et al., 2000; Qiu et al., 2002; Shi et al., 2002; Qiu et al., 2003)(ver apartado I.7.3.1). Mediante ensayos inmunológicos y la fusión traduccional de SOS1 con el gen testigo GFP, se comprobó la localización de esta proteína en la membrana plasmática de la célula (Shi et al., 2002; Qiu et al., 2002). A su vez, la fusión de su promotor al gen GUS reveló un gran nivel de expresión de SOS1 en células epidérmicas de los ápices radicales, así como en las células del parénquima del xilema en raíces y tallos. En el ápice de la raíz juega un papel crucial en la extrusión de Na + para evitar su sobreacumulación, ya que las células epidérmicas están indiferenciadas y carecen de un sistema vacuolar desarrollado que les permita compartimentar el exceso de este catión (Shi et al., 2002). Por otra parte, la expresión en las células del parénquima que bordean al xilema sugería su implicación en el transporte de Na + a larga distancia. Cultivado a altas concentraciones de sal (100 mM NaCl) el mutante sos1 acumula más Na + que la línea silvestre, mostrando un mayor contenido de este catión en la savia del xilema (Shi et al., 2002). Sin embargo, sometido a estrés salino moderado (25 mM NaCl), el mutante acumula menos Na + (Ding y Zhu, 1997). A raíz de estos resultados aparentemente contradictorios se sugirió que SOS1 actuaría cargando el Na + en el xilema para su almacenaje en células del mesófilo ante estrés moderado. El intercambio Na + /H + en el xilema se favorecería energéticamente por el pH ligeramente ácido de la savia (Fisher et al., 2000). Posteriormente, la caracterización de HKT1;1 como transportador de Na + implicado en la descarga de este catión a las células parenquimáticas del xilema (Rus et al., 2001; Berthomieu et al., 2003; Sunarpi et al., 2005; Rus et al., 2006; Davenport et al., 2007)(ver apartado I.7.1.2) llevó al establecimiento de un modelo más completo en el que las proteínas SOS1 y HKT1;1 coordinarían sus flujos opuestos de carga y descarga de Na + en el xilema para conseguir la homeostasis de este catión en la planta (Pardo et al., 2006). Estudios recientes en tomate demostraron que SOS1 favorece, en condiciones de alta salinidad, la acumulación de Na + en el tallo y evita su acumulación en raíz a salinidad moderada o en las hojas a cualquier concentración de sal (Olías et al., 2009). Estos resultados son coherentes con un modelo en el que SOS1 cargaría Na + en el xilema de la raíz,  36 mientras HKT1;1 lo descargaría en el tallo para evitar su llegada a tejidos fotosintéticos. A su vez, SOS1 excluiría el Na + de las hojas jóvenes hacia el apoplasto para evitar la acumulación de este catión en el citosol de células sin un buen sistema vacuolar, mientras HKT1;1 actuaría descargándolo en hojas completamente expandidas. Conclusiones similares se han alcanzado con el estudio de plantas de Thelungiella salsuginea en las que se suprimió la expresión de SOS1 (Oh et al., 2009). En esas plantas se produjo una acumulación preferente de Na + en las células de parénquima del xilema hasta alcanzar una proporción Na + /K + doce veces mayor en las plantas control. Se ha sugerido que esta acumulación indebida de Na + podría interferir con la carga de K + en el xilema para su translocación al tallo, explicando así el fenotipo de falta de crecimiento del mutante sos1 en bajo K + (Wu et al., 1996) (ver aparatado I.7.3.3.). Otra proteína implicada en el transporte de Na + a larga distancia es el antiportador Na + /H + CHX21 (Hall et al., 2006). Localizado en la membrana plasmática de células de la endodermis de la raíz, parece contribuir también, al igual que SOS1, a la carga de Na + en el xilema, mostrando un menor contenido de este catión en xilema y parte aérea el mutante chx21.  43 apartado I.7.2., el modelo actual establece que la función principal de HKT1 es la descarga de Na + del xilema para controlar el transporte de este catión. Coordinándose con SOS1, regularía la correcta distribución de Na + a lo largo de la planta (Sunarpi et al., 2005; Rus et al., 2006; Pardo et al., 2006; Davenport et al., 2007; Olías et al., 2009). Las mutaciones sos favorecen la sobreacumulación de Na + en la raíz y hkt1;1 en la parte aérea, impidiendo o favoreciendo respectivamente la toma de K + . En un doble mutante sos3 hkt1, en cambio, se obtuvo una distribución de Na + y K + más equilibrada y similar a la de la línea silvestre (Rus et al., 2004). El nivel del transcrito de muchos transportadores de K + se altera en presencia de estrés salino. AtKC1 en Arabidopsis y KMT1 en Mesembryanthemum crystallinum se inducen, mientras que HAK5 en Arabidopsis y MKT1 en M. crystallinum se reprimen (Su et al., 2001, 2002; Pilot et al., 2003; Nieves-Cordones et al., 2010). Se cree que la excesiva acumulación de Na + en las raíces de los mutantes sos podría inhibir transportadores de K + responsables de su toma y distribución a larga distancia (Pardo et al., 2006), habiéndose demostrado ya que el canal de entrada de K + AKT1 constituye una diana de toxicidad por Na + . El estrés salino moderado causó una severa inhibición del crecimiento y la permeabilidad a K + en raíces del mutante sos1 de Arabidopsis pero no en la línea silvestre. Además, la adición de una solución de NaCl 10 mM en el citosol de células de raíz de plantas silvestres inhibió las corrientes de entrada de K + en ensayos patch-clamp (Qi y Spalding, 2004). A salinidad elevada, incluso se pueden producir pérdidas de K + a través de este canal (Nieves-Cordones et al., 2010). La despolarización de la membrana plasmática debida a la excesiva acumulación de Na + también podría producir la activación anormal de los canales de salida de K + dependientes de voltaje. En Thelungiella salsuginea, el silenciamiento por RNAi del ortólogo de AtSOS1, ThSOS1, produjo plantas hipersensibles a Na + que mostraban una acumulación más rápida de este catión, mayor pérdida de agua en parte aérea ante estrés salino y eliminación más lenta del exceso de Na + de la raíz después de finalizar el tratamiento salino que la línea silvestre. El uso del tinte específico para Na + “CoroNa-Green” demostró que en las líneas thsos1 aumentaba el contenido de este catión en el ápice radical, llegando a acumularse a largo plazo en la estela y formar una barrera sódica. La mayor acumulación de Na + en la estela produjo un incremento en la muerte celular, determinado mediante la tinción con yoduro de propidio. La medida de los contenidos iónicos por SEM-EDX demostró que la falta de un antiportador ThSOS1 funcional interfería con la carga de K + en el xilema, siendo el contenido de este catión 12 veces menor en el parénquima del xilema en raíces de la línea thsos1 que en las de la silvestre. Esta menor carga en el xilema no se tradujo en una menor acumulación de este catión en la parte aérea, sino que los contenidos de K + fueron ligeramente mayores en la línea mutante para todos los tipos celulares analizados. Sin embargo, debido a la mayor toma de Na + , los cocientes Na + :K + fueron también mayores en la línea thsos1 que en la silvestre. (Oh et al., 2009). Finalmente, la ruta SOS podría controlar la nutrición de K + de forma indirecta, a través de la regulación de la H + -ATPasa de membrana plasmática (Shabala et al., 2005). Plantas mutantes sos1, sos2 y sos3 mostraron, en ausencia de estrés salino, menor flujo de H + que la  44 línea silvestre. El potencial de membrana no se vio afectado excepto en el ápice radical, donde resultó inferior en el mutante sos1 que en la línea silvestre. Estos datos sugieren que SOS1 activaría el bombeo de H + a través de la H + -ATPasa, lo que favorecería la toma de K + . I.7.3.4. Sobreexpresión de SOS1 y mejora de la tolerancia a salinidad. En mejora genética de la halotolerancia, se ha utilizado mucho la sobreexpresión de genes inducidos por estrés y/o requeridos para la tolerancia. Las proteínas LEA (del inglés, Late Embryogenesis Abundant) se acumulan durante la formación de las semillas. La sobreexpresión de HVA1 de cebada y DHN-5 de trigo mejoró la halotolerancia de plantas de arroz y Arabidopsis respectivamente (Xu et al., 1996; Brini et al., 2007), si bien se desconoce su modo de acción. El estrés osmótico induce también la acumulación de osmolitos, con función osmoprotectora, y en la degradación de ROS. Por ingeniería genética se han desarrollado plantas con mejor tolerancia a salinidad mediante la sobreexpresión de manitol (Tarczynski et al., 1992), prolina (Kishor et al., 1995), ononitol (Sheveleva et al., 1997), glicinbetaína (Holmstrom et al., 2000), trehalosa (Garg et al., 2002), fructano (Pilon-Smits et al., 1995), ectoína (Nakayama et al., 2000) o sorbitol (Gao et al., 2001). También se ha conseguido una mayor halotolerancia mediante la sobreexpresión de genes reguladores de rutas de señalización como factores de transcripción DREB/CBF (Jaglo-Ottosen et al., 1998; Liu et al., 1998; Kasuga et al.,1999) y kinasas MAPK o CDPK (Kovtun et al., 2000; Saijo et al., 2000; Moon et al., 2003; Teige et al., 2004). Otra estrategia utilizada ha sido la manipulación de enzimas implicadas en protección frente a estrés oxidativo como glutatión-S-transferasa, peroxidasa, superóxido dismutasa, ascorbato peroxidasas y glutatión reductasas (Gupta et al., 1993; Roxas et al., 1997; Lee et al., 2007b). En cambio, los intentos de mejorar la halotolerancia de las plantas mediante proteínas que mantienen su homeostasis iónica han sido más escasos. La expresión ectópica de HAL1 y calcineurina resultaron en la obtención de plantas de tomate y tabaco halotolerantes (Pardo et al., 1998; Gisbert et al., 2000). Adicionalmente, la sobreexpresión del antiportador catión/H + vacuolar AtNHX1 o la H + -pirofosfatasa AVP1 demostraron mejorar la tolerancia de Arabidopsis (Aspe et al., 1999; Gaxiola et al., 2001) y tomate (Zhang et al., 2001) frente a estrés salino, si bien algunos de estos resultados no se han reproducido en ensayos similares en nuestro laboratorio (Leidi et al., 2009; Barragán et al., 2012). La sobreexpresión de SOS1 controlada por el promotor CaMV35S, considerado a menudo de expresión constitutiva pero con expresión preferente en el parénquima del xilema, mejoró en Arabidopsis la tolerancia a salinidad en distintos ensayos realizados en callos, semillas en germinación, plántulas y plantas adultas. Las plantas mostraron mayor inducción del transcrito de SOS1 en presencia de estrés salino y menor acumulación de Na + en parte aérea y savia del xilema. (Shi et al., 2003; Yang et al., 2009).  45 I.7.3.5. Ruta SOS y estrés oxidativo. El análisis de la secuencia de SOS1 predijo que codificaba una proteína de 127 kDa, con 12 dominios transmembrana y una larga cola hidrofílica en el extremo carboxiterminal, situada presumiblemente en el citosol (Shi et al., 2000). Se ha sugerido que esta cola podría actuar como sensor de Na + (Zhu et al., 2002) o que podría interactuar con proteínas reguladoras como sucede en otros transportadores (Putney et al., 2002). Ya se ha demostrado que SOS1, cuyo mRNA se estabiliza en presencia de estrés salino mediante la acción de ROS, tiene cierto papel en la tolerancia a estrés oxidativo mediante la interacción de su extremo carboxiterminal con el regulador transcripcional de genes de respuesta a estrés oxidativo RCD1 (Katiyar-Agarwal et al., 2006; Chung et al., 2008). El gen RCD1 (Radical-induced Cell Death 1) se identificó primero por su habilidad para complementar la sensibilidad a ROS en levadura (Belles-Boix et al., 2000). Rastreos posteriores en planta buscando mutantes sensibles a O 3 y resistentes a metil viológeno llevaron al aislamiento de las líneas rcd1-1 y rcd1-2 (Overmyer et al., 2000; Fujibe et al., 2004). Un análisis de su secuencia reveló que la proteína RCD1 presentaba dos dominios muy conservados: el globular de interacción proteína-proteína WWE en su extremo aminoterminal y el catalítico de poli(ADP-ribosa) polimerasa, que podría estar implicado en reacciones de modificación de proteínas (Ahlfors et al., 2004). Posteriormente se descubrió que contenía el dominio RST, también presente en el componente del complejo de iniciación de la transcripción TAF4 (Jaspers et al., 2010). El extremo carboxiterminal de SOS1 es capaz de interactuar con RCD1, participando en la tolerancia de las plantas a estrés oxidativo. RCD1 también juega un papel en la tolerancia a estrés salino, si bien cumple esta función independientemente de SOS1 (Katiyar-Agarwal et al., 2006). El mutante sos1-1 comparte con rcd1-1 su extrema halosensibilidad, así como su sensibilidad a H 2 O 2 y resistencia a metil viológeno (Katiyar-Agarwal et al., 2006). SOS1 interviene también en la detoxificación del estrés oxidativo induciendo la expresión de ENH1 en el cloroplasto durante estrés salino (Zhu et al., 2007), mientras que SOS2, además de activar a esta proteína cloroplástica, interacciona con NDPK2, CAT2 y CAT3, para regular la señalización por H 2 O 2 (Verslues et al., 2007).  46 II. Objetivos    II. OBJETIVOS. 1. Caracterización in planta de candidatos a alelos hiperactivos de SOS1 aislados en levadura mediante la obtención de plantas transgénicas sobreexpresando dichos alelos. 2. Aislamiento de nuevos alelos hiperactivos de SOS1 mediante la realización de un rastreo de semillas transgénicas de Arabidopsis. 3. Profundización en el conocimiento de la implicación del antiportador Na + /H + SOS1 en la adquisición de K + por la planta. 4. Estudio de posibles funciones de SOS1 independientes de su papel en la homeostasis iónica mediante la caracterización de un alelo mutado en un residuo muy conservado en transportadores de Na + . II. Objetivos        III. MATERIALES Y MÉTODOS. M.1. Material biológico. M.1.1. Bacterias. M.1.1.1. Cepas de bacterias utilizadas. Escherichia coli. Para la propagación de plásmidos se emplearon las cepas: Nombre de la cepa Genotipo Referencia XL1- Blue VXS( KVG5 UHF$ HQG$ J\U$W KL UHO$ ODF ) >SUR$% ODF,T ODF=¨0 7QWHWU@ Bullock et al. (1987) XL10 Gold 7HW5 ∆ PFU$ ∆ PFU&%KVG605 PUUHQG$VXS(WKLUHF$ODF+WH >)¶SUR$%ODF, T = ∆ '07Q7HW5$P\ &DP U @ Stratagene, La Jolla (CA) TOP10 PFU$ ǻPUUKVG506PFU%& ǻODF; GHR5 UHF$ DUD'ǻDUDOHX JDO.USV/HQG$QXS* Invitrogen DH5αIKX$ǻDUJ)ODF=8SKR$JOQ9ĭ ǻODF=0J\U$UHF$UHO$HQG$WKL KVG5 Taylor et al. (1993) La mutagénesis in vivo de plásmidos se llevó a cabo mediante su propagación en la cepa XL1-Red. Nombre de la cepa Genotipo Referencia XL1- Red HQG$J\U$QDO 5 WKLUHO$ODFJOQ9 KVG5U .  P .  PXW6PXW7PXW'7Q Stratagene, La Jolla (CA) Agrobacterium tumefaciens. Para la transformación de primordios seminales de Arabidopsis thaliana, se empleó la cepa GV3101, portadora de los genes vir en el plásmido pMP90.    Nombre de la cepa Genotipo Referencia GV3101 C58 RifR::pMP90 Koncz y Shell, 1986 M.1.1.2. Medios y condiciones de crecimiento. Todos los medios se esterilizaron mediante su autoclavado durante 20 minutos a 120 ºC y 2 atmósferas de presión. Los medios sólidos se conservaron a 4 ºC durante un máximo de dos meses, mientras que los líquidos se mantuvieron a temperatura ambiente. Medio Lysogenic Broth (LB) Extracto de levadura 0.5% (p/v) Bacto-triptona 1% (p/v) NaCl o KCl 1% (p/v) Para preparar medio LB sólido se añadieron 15 g/l de Bacto-agar (Difco). La selección de plásmidos en cepas bacterianas se llevó a cabo añadiendo a los medios enfriados a a50 ºC antibióticos esterilizados por filtración (0.22 µm) Para preparar células competentes de E. coli, las bacterias crecieron en medio Φ ΦΦ Φ MedioΦ ΦΦ Φ  Extracto de levadura 0.5% (p/v) Bacto-triptona 2% (p/v) MgSO 4 15 mM KCl 10 mM Para recuperar las células de E. coli después de un protocolo de transformación, se utilizó el medio SOC    Medio SOC Bacto-triptona 2% (p/v) Extracto de levadura 0.5% (p/v) NaCl 10 mM KCl 25 mM MgCl 2 10 mM MgSO 4 10 mM Glucosa 20 mM Para preparar células competentes de Agrobacterium tumefaciens, las bacterias se incubaron en medio YEP. Medio YEP Bacto-peptona 1% (p/v) Extracto de levadura 1% (p/v) NaCl 0.5% (p/v) Preparación de los distintos antibióticos. Ampicilina: se preparó una solución stock a una concentración de 100 mg/ml en agua de calidad milli-Q. Esta solución se esterilizó utilizando filtros de 0.22 µM (Millipore Corp., Bedford, Massachussets, EEUU). Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 1 µl de esta solución a cada ml de medio, de forma que la concentración final de ampicilina fue de 100 µg/ml. Espectinomicina: se preparó una solución stock a una concentración de 100 mg/ml en agua de calidad milli-Q. Esta solución se esterilizó utilizando filtros de 0.22 µM (Millipore Corp., Bedford, Massachussets, EEUU). Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 0.5 µl de esta solución a cada ml de medio para E. coli o 1 µl de la solución a cada ml de medio para A. tumefaciens. Gentamicina: se preparó una solución stock a una concentración de 20 mg/ml en agua de calidad milli-Q. Esta solución se esterilizó utilizando filtros de 0.22 µM (Millipore Corp.,    Bedford, Massachussets, EEUU). Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 1 µl de esta solución a cada ml de medio, de forma que la concentración final de gentamicina fue de 20 µg/ml. Higromicina: se preparó una solución stock a una concentración de 20 mg/ml en agua de calidad milli-Q. Esta solución se esterilizó utilizando filtros de 0.22 µM (Millipore Corp., Bedford, Massachussets, EE. UU.). Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 1.25 µl de esta solución a cada ml de medio, de forma que la concentración final de higromicina fue de 25 µg/ml. Kanamicina: se preparó una solución stock a una concentración de 50 mg/ml en agua de calidad milli-Q. Esta solución se esterilizó utilizando filtros de 0.22 µM (Millipore Corp., Bedford, Massachussets, EEUU). Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 1 µl de esta solución a cada ml de medio, de forma que la concentración final de kanamicina fue de 50 µg/ml. Rifampicina: se utilizó a una concentración de 50 µg/ml en cultivos de A. tumefaciens para evitar contaminaciones de E. coli. Para su preparación, se disolvió el antibiótico en metanol a una concentración de 30 mg/ml. El antibiótico es fotosensible, por lo que se conservó en tubos de propileno estériles y protegidos de la luz. Tetraciclina: se disolvió el antibiótico en etanol absoluto a una concentración de 10 mg/ml y se conservó en tubos Eppendorf estériles y protegidos de la luz. Se suplementaron los medios de cultivo añadiendo 1 µl de esta solución a cada ml de medio, de forma que la concentración final de tetraciclina fue de 10 µg/ml. Las cepas de E. coli se incubaron durante 24 h a 37 ºC, mientras que las A. tumefaciens se incubaron a 28 ºC durante 48 h. Las bacterias conteniendo los plásmidos de interés se conservaron añadiendo al cultivo glicerol estéril a una concentración final del 15% y se guardaron a -70 ºC. M.1.2. Levaduras. M.1.2.1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas. S. cerevisiae AXT3K (∆ena1::HIS3::ena4,∆nha1::LEU2,∆nhx1::KanMX4; Quintero et al., 2002). Deriva de la estirpe silvestre W3031B (MATαura3-1 leu2-3, 112 his3-11,15 trp1-1 ade2- 1 can1-100). Carece de los principales transportadores de Na + necesarios para su tolerancia salina: las ATPasas de Na + ENA1-4, el antiportador Na + K + /H + NHA1 de la membrana plasmática (Haro et al., 1991; Wieland et al., 1995; Bañuelos et al., 1998), y el antiportador Na + /H + NHX1 situado en endosomas (Nass et al., 1997; Darley et al., 2000; Quintero et al., 2000). Su fenotipo es de halosensibilidad severa, por lo que ha sido de gran utilidad para la caracterización funcional de transportadores de Na + procedentes de plantas (Dreyer et al., 1999).    minutos. Tras centrifugar durante 10 minutos a 13,000 rpm (Biofuge Pico, Heraeus), se lavó el precipitado con etanol al 70% (v/v), se secó al vacío y se resuspendió en el volumen deseado de TE o agua. M.2.4. Electroforesis de DNA en geles de agarosa. Se realizó según se describe en Sambrook et al. (1989). El DNA se analizó en geles horizontales de agarosa (0.4-2%) preparados con TBE o TAE, añadiendo 0.05 µg/ml de bromuro de etidio para teñir el DNA a la luz UV. El gel se sumergió en el mismo tampón utilizado para su preparación y se aplicó un voltaje de 1-10 V/cm. El tamaño de los fragmentos se estimó por comparación con un marcador de peso molecular comercial (1 kb DNA ladder, Invitrogen) o con DNA del fago λ digerido con HindIII. TBE 10X TAE 50X Tris Base 108 g/l Tris Base 242 g/l Ácido bórico 55 g/l Ácido acético glacial 5.71% (v/v) EDTA-Na 2 pH 8.0 10 mM EDTA-Na 2 pH 8.0 50 mM M.2.5. Extracción de bandas de DNA en geles de agarosa. La banda de interés se recortó del gel de TAE y se purificó utilizando el kit PerfectPrep. Gel Cleanup (Eppendorf) siguiendo las indicaciones del fabricante. M.2.6. Manipulación enzimática del DNA. En general, se siguieron los protocolos descritos por Sambrook et al. (1989). M.2.6.1. Digestión del DNA con enzimas de restricción. Las digestiones se realizaron siempre en los tampones y condiciones recomendados por el fabricante. Se prepararon soluciones de DNA a una concentración de hasta 100 ng/µl en un volumen de 20-100 µl y se añadió al menos 1 U de enzima por cada µg de DNA. Cuando hubo que digerir con más de una enzima, tras inactivar la primera enzima utilizada, se precipitó el DNA con etanol-acetato de sodio como se describe en el apartado M.2.3. M.2.6.2. Desfosforilación de los extremos 5’ del DNA. Mediante este procedimiento se eliminaron los grupos fosfato de los extremos 5’ de los plásmidos utilizados como vectores de clonación, con el fin de evitar su religación. Se añadieron 1-2 U de fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIPasa, Roche) y se incubó la    mezcla a 37 ºC durante 15 minutos. La fosfatasa alcalina se inactivó añadiendo 4 µl de EDTA y 10 µl de SDS 10%, llevando el volumen a 100 µl con agua milli-Q y realizando una extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) seguida de una precipitación con etanolacetato de sodio (ver apartado M.2.3). M.2.6.3. Generación de extremos romos del DNA. Este procedimiento permite la ligación de fragmentos de DNA producidos con distintas enzimas que generan extremos incompatibles. Para convertir en romos extremos protuberantes en 5’, se rellenó con la enzima Klenow (Sambrook et al., 1989). Para los extremos protuberantes en 3’, se usó la DNA polimerasa del bacteriófago T4, que presenta una fuerte actividad exonucleasa 3’->5’ sobre el DNA monocatenario (Sambrook et al., 1989). M.2.6.4. Ligación de fragmentos de DNA. Se preparó una mezcla de reacción con 1 U de DNA ligasa del bacteriófago T4 (Invitrogen), el tampón suministrado por el fabricante en la cantidad recomendada y los fragmentos de DNA que se deseaban ligar, en un volumen máximo de 20 µl. Las cantidades de inserto y vector se calcularon utilizando la fórmula: 50ng de plásmido x longitud del inserto (Kb) longitud del plásmido (Kb) 2 1=ng de inserto.   Siendo 2:1 la relación molar de inserto respecto a vector. Las ligaciones se incubaron a 16 ºC durante un mínimo de 5 horas y posteriormente se transformaron células competentes de E. coli con 10 µl de la mezcla de reacción. En el caso de realizar la ligación directa de productos de PCR procedentes de amplificación con Pfu, se utilizó el Blunt ® PCR Cloning Kit, siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante para su clonado en el vector Blunt ® PCR. M.2.6.5. Amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR con Taq polimerasa. Para cada reacción se utilizaron ~100 ng de DNA, 0.25 µM de cada cebador, 2 mM dNTPS (dATP + dCTP + dGTP + dTTP, Boehringer Manheim), 2.5 o 5 µl de buffer de Taq (Sambrook et al., 1989) y 0.5-1 U de Taq DNA polimerasa en un volumen final de 25 o 50 µl. En general, se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: 5 minutos a 95 ºC para desnaturalizar el DNA, 25-35 ciclos con la secuencia: 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 50- 65 ºC (5 ºC por debajo de la Tm de los oligonucleótidos usados) y 1-3 minutos (1 minuto por    cada kilobase del fragmento amplificado) a 72 ºC, para la síntesis del DNA, y finalmente 5 minutos a 72 ºC. Buffer de Taq KCl 50 mM Tris-HCl pH 8.0 10 mM MgCl 2 1.5 mM Gelatina 0.01% (p/v) M.2.6.6. PCR con DNA polimerasa de alta fidelidad. La DNA polimerasa Pfu (Stratagene) es una enzima de alta fidelidad que presenta una tasa de error muy baja (1,3x10 -6 mutaciones/pb/duplicación), lo que la convierte en idónea para el clonado de productos de PCR. Las reacciones de PCR se hicieron siguiendo las instrucciones del fabricante. M.2.6.7. Mutagénesis dirigida mediante PCR. Se empleó la polimerasa de Pfu, tal y como se indica en el apartado anterior. Esta polimerasa tiene una tasa de error muy baja debido a su capacidad de corrección de errores durante la replicación. Para facilitar la unión con el molde de los oligonucleótidos diseñados, se tuvo la precaución de flanquear la mutación a ambos lados con al menos 15 nucleótidos que hibridaban completamente con la secuencia original. El producto de PCR se clonó directamente con el sistema de clonación comercial Zero Blunt ® PCR Cloning Kit (Invitrogen). M.2.7. Mutagénesis aleatoria de plásmidos in vivo. Para la obtención de genotecas de cDNA portadores de mutaciones puntuales al azar, se utilizó la estirpe de E. coli XL1-Red (Agilent Technologies Inc.). Esta cepa es deficiente en tres de las principales vías de reparación de daños ocurridos durante la replicación del DNA por contener tres mutaciones: mutS (propensa a errores en la reparación de malapareamientos), mutD (deficiente en actividad exonucleasa 3’->5’ de la DNA polimerasa III) y mutT (incapaz de hidrolizar 8-oxodGTP). La tasa de mutagénesis de esta cepa es 5,000 veces mayor que la de cepas silvestres de E. coli, obteniéndose aproximadamente 1 mutación por cada 3 kb de DNA propagado. Los plásmidos portadores de los genes de interés se utilizaron para transformar la cepa XL1-Red siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. El conjunto de colonias obtenidas se recogió e incubó en un matraz con LB durante 4 horas, precipitándose las células para la obtención de la genoteca por preparación de DNA plasmídico.    M.3. Purificación y análisis de RNA. M.3.1. Extracción de RNA total de plantas. La extracción se realizó utilizando el método del TRIZOL Reagent (Amersham Pharmacia Biotech). Se recogieron muestras de tejido, se introdujeron en un tubo Eppendorf y se congelaron en nitrógeno líquido. A continuación se trituró cada muestra con un émbolo de plástico hasta convertir el material en un polvo fino. Se añadió 1 ml de TRIZOL, se incubaron las muestras 5 minutos a 25 ºC y se centrifugaron 10 minutos a 12,000 rpm y 4 ºC (Biofuge PrimoR, Heraeus) para eliminar el DNA genómico, polisacáridos y material insoluble. Se tomó el sobrenadante y se le añadieron 200 µl de cloroformo, incubándose la mezcla durante 2-3 minutos a 25 ºC. Se centrifugó durante 15 minutos a 12,000 rpm y 4 ºC (Biofuge PrimoR, Heraeus) y se tomó la fase acuosa, en la que se precipitó el RNA con 250 µl de isopropanol y 250 µl de una solución 1.2 M de citrato de sodio y 0.8 M de NaCl. Se incubó 10 minutos a 25 ºC y se centrifugó durante 10 minutos a 12,000 rpm y 4 ºC (Biofuge PrimoR, Heraeus). El precipitado de RNA se lavó con etanol 70% (v/v), se secó al vacío y se resuspendió en agua de calidad milli-Q previamente tratada con 0.1% (v/v) DEPC, calentándose la muestra durante 10 minutos a 55 ºC para facilitar su resuspensión. Todas las soluciones utilizadas se trataron con 0.1% DEPC (v/v) y el material se autoclavó dos veces. Se utilizaron guantes en todo momento. TRIZOL Fenol neutro 3.8% (v/v) Tiocianato de guanidinio 800 mM Tiocianato de amonio 400 mM Acetato sódico pH 5.0 100 mM Glicerol 5% (v/v) DEPC (Dietilpirocarbonato): es una sustancia muy tóxica, por lo que debe manipularse siempre en una campana de extracción de gases. Se añadió a las soluciones al 0.1% (v/v), se mantuvo durante al menos 12 horas en agitación a temperatura ambiente y se inactivó autoclavando durante 20 minutos a 120 ºC y 2 atmósferas de presión. M.3.2. Electroforesis de RNA. Para verificar la calidad del RNA, se analizó una alícuota mediante electroforesis en un gel de TAE con 0.8% de agarosa (p/v) preparado con agua milli-Q tratada con 0.1%(v/v) de    DEPC en una cubeta previamente lavada con 10% (v/v) SDS y tratada durante 30 minutos con 3% (v/v) de H 2 O 2 . M.3.3. Cuantificación de RNA. La concentración del RNA en la solución se estimó midiendo la absorbancia a 260 nm (Sambrook et al., 1989). Para ello se utilizó el espectrofotómetro NanoDrop ® (ND-1000 Spectrophotometer), de la misma forma que para la determinación de la concentración de DNA (apartado M.2.2.). M.3.4. RT-PCR. Con esta técnica se cuantificó la abundancia del RNA mensajero (mRNA). Se usó el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones indicadas por el fabricante para sintetizar cDNA a partir de mRNA de plantas. El cDNA se generó utilizando la retrotranscriptasa Quantiscript y una mezcla optimizada de oligo-dT y cebadores aleatorios que permiten la síntesis de cDNA desde todas las regiones del mRNA, incluyendo el extremo 5’. Para comparar la acumulación del transcrito de los distintos genes en cada línea ensayada, se realizaron amplificaciones estándar por PCR usando el cDNA obtenido como molde y cebadores específicos para el gen cuyo nivel de expresión se pretendía cuantificar. Para normalizar la calidad y cantidad del cDNA obtenido, se amplificó este cDNA con oligonucleótidos específicos para los genes de expresión constitutiva en Arabidopsis β- TUBULINA-4 (TB4-5’/TB4-3’) y ACTINA-8 (Act8_f/Act8_r). M.4. Transformación de los distintos organismos utilizados. M.4.1. Transformación de E. coli. M.4.1.1. Preparación de células competentes de E. coli. Se utilizó el método descrito por Hanahan (1983). Se inocularon 5 ml de medioΦo medio LB con una colonia de la estirpe apropiada y se incubaron a 37 °C hasta alcanzar una D.O. 600 de 0.3. Con este precultivo, se inocularon 100 ml de medioΦo medio LB, precalentado a 37 °C, que se incubó con agitación de 300-350 rpm hasta alcanzar una D.O. 600 de 0.5.Las células se recogieron centrifugando este cultivo a 2,500 g durante 5 minutos a 4 °C (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron-Hermle A6.14) y se resuspendió el sedimento en 30 ml de solución TFB1 fría. Tras 15 minutos de incubación en hielo, las células se centrifugaron de nuevo en las condiciones descritas anteriormente y se resuspendieron en 4 ml de solución TFB2 fría. Finalmente se dispensaron en alícuotas de 100-200 µl, que se congelaron a –70 °C hasta su uso.    Solución TFB1. RbCl 100 mM MnCl 2 50 mM Acetato potásico 30 mM CaCl 2 10 mM Glicerol 15% (v/v) Se ajustó el pH a 5.8 con una solución 0.2 M de ácido acético, se esterilizó por filtración y se conservó a -20 ºC. Solución TFB2. CaCl 2 75 mM MOPS pH 7.0 10 mM RbCl 10 mM Glicerol 15% (v/v) Se esterilizó por filtración y se conservó a -20 ºC. M.4.1.2. Transformación de células de E. coli competentes por choque térmico. Se añadieron 10-100 ng de DNA plasmídico en un volumen máximo de 10 µl a alícuotas de 100-200 µl de células competentes y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Se aplicó un choque térmico de 42 ºC durante 30-60 segundos y, tras añadir 1 ml de SOC, se incubaron durante 60 minutos a 37 ºC. Transcurrido este tiempo, las células se recogieron por centrifugación a 13,000 rpm durante 1 minuto (Biofuge Pico, Heraeus) y se extendieron con bolas de vidrio de 4 mm de diámetro en placas de LB suplementadas con el antibiótico necesario. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37 ºC. M.4.1.3. Preparación de células electrocompetentes de E. coli. En las operaciones en las que se necesitó una eficiencia de transformación de ~10 9 - 10 10 , se prepararon células competentes transformables por electroporación según el protocolo descrito por Ausubel et al. (1987). Se inocularon 5 ml de medioΦo medio LB con una colonia de la estirpe apropiada y se incubaron a 37°C duran te toda la noche. Este precultivo se utilizó para inocular 500 ml de medioΦo medio LB, que se incubó a 37 ºC en agitación a 300 rpm hasta alcanzar una O.D. 600 de ~0.5-0.7. Las células se enfriaron en hielo durante 20 minutos y se recogieron centrifugando a 4,000 g y 4 ºC durante 15 minutos (Varifuge 20 RS, Heraeus,    rotor Kontron-Hermle A6.14). Se resuspendió el sedimento sucesivamente en 500, 250 y 20 ml de glicerol 10% (v/v) enfriado en hielo, recogiéndose las células después de cada resuspensión centrifugando a 4,000 g y 4 ºC durante 15 minutos (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron- Hermle A6.14). El sedimento del último centrifugado se resuspendió en 1-2 ml de glicerol 10% (v/v), se almacenó en alícuotas de 100-200 µl y se conservó a -70 ºC. M.4.1.4. Transformación de células de E. coli competentes por electroporación. Se descongelaron las células en hielo. Para cada muestra, se colocó en hielo un tubo Eppendorf de 1.5 ml y una cubeta de electroporación de 0.1 cm. Se añadieron al tubo Eppendorf 40 µl de la suspensión de células y 1-2 µg de DNA y se incubó la mezcla en hielo durante 1 minuto. La mezcla se transfirió al fondo de la cubeta de electroporación y se le aplicó un pulso de 1.8 kV utilizando un electroporador MicroPulser™ (BioRad). Inmediatamente después se añadió 1 ml de medio SOC a la cubeta, se transfirió la suspensión a un tubo de propileno de 17x100 mm y se incubó a 37 ºC y 225 rpm durante 1 hora. Transcurrido ese tiempo, las células se sembraron en medio selectivo. M.4.2. Transformación de A. tumefaciens. M.4.2.1. Preparación de células competentes de A. tumefaciens. Se utilizó el protocolo de Holsters et al. (1978). Se inocularon 5 ml de medio YEP con una colonia de la estirpe adecuada y se incubaron durante toda la noche a 28 ºC. Se tomaron 2 ml de este precultivo y se utilizaron para inocular 80 ml del mismo medio, que se incubó a 28 ºC hasta alcanzar una D.O. 600 de 0.5-1. Se recogieron las células por centrifugación a 3,000 g y 4 ºC (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron-Hermle A6.14) durante 10 minutos y se resuspendieron en 1.6 ml de CaCl 2 frío. Finalmente se dispensaron en alícuotas de 100-200 µl, que se congelaron a –70 °C hasta su uso. M.4.2.2. Transformación de células de A. tumefaciens competentes por choque térmico. Se añadió al menos 1 µg de DNA plasmídico a 100 µl de células competentes y se congelaron en nitrógeno líquido. Se descongelaron incubando a 37 ºC durante 5 minutos, se les añadió 1 ml de medio YEP y se incubaron en agitación suave a 28 ºC durante 3 horas. Transcurrido este tiempo, las células se recogieron por centrifugación a 13,000 rpm durante 1 minuto (Biofuge Pico, Heraeus) y se extendieron con bolas de vidrio de 4 mm de diámetro en placas de LB suplementadas con el antibiótico necesario. Las placas se incubaron durante 48 horas a 28 ºC. Los transformantes se confirmaron haciendo una preparación de DNA    plasmídico (apartado M.2.1.1.2.), retransformando E. coli (apartado M.4.1.2.) y analizando con enzimas de restricción el plásmido obtenido siguiendo el método del apartado M.2.1.1.1. M.4.2.3. Preparación de células electrocompetentes de A. tumefaciens. En las operaciones en las que se necesitó una eficiencia de transformación de ~10 9 - 10 10 , se prepararon células competentes transformables por electroporación según el protocolo descrito por Lin (1995). Se inocularon 5 ml de medio YEP con una colonia de la estirpe adecuada y se incubaron durante toda la noche a 28 ºC. Se tomaron 2 ml de este precultivo y se utilizaron para inocular 1.5 l del mismo medio, que se incubó a 28 ºC y 300 rpm hasta alcanzar una D.O. 600 de 0.5-1. Las células se recogieron centrifugando a 3,000 g y 4 ºC durante 10 minutos (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron-Hermle A6.14) y se colocaron en hielo, donde se lavaron dos veces sucesivas resuspendiendo en ~50 ml de glicerol 10% (v/v) estéril y enfriado en hielo, llevando el volumen a 500 ml con la misma solución y centrifugando a 3,000 g y 4 ºC durante 10 minutos (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron-Hermle A6.14). El sedimento se resuspendió en 500 µl de sorbitol 1 M estéril y enfriado en hielo, y se repartió en tubos Eppendorf de 1.5 ml en alícuotas de 200 µl, que se almacenaron a -70 ºC. M.4.2.4. Transformación de células de A. tumefaciens competentes por electroporación. Se añadieron 1-2 µg de DNA en un volumen máximo de 5 µl a un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se colocó en hielo. Por cada muestra, se añadió 1 ml de YEP a un tubo de 17x100 mm y se colocó una cubeta de electroporación de 0.1 cm en hielo. A cada muestra se le añadieron 20 µl de células competentes descongeladas en hielo y se mezcló con suavidad. La mezcla se transfirió al fondo de una cubeta de electroporación y se le aplicó un pulso de 2.2 kV utilizando un electroporador MicroPulser™ (BioRad). Inmediatamente después se utilizó el medio YEP en el tubo de 17x100 mm para transferir las células de la cubeta al tubo. Éste se incubó a 28 ºC y 250 rpm durante 3 horas y las células se sembraron finalmente en medio selectivo. M.4.3. Transformación de levaduras. Se utilizó el método del acetato de litio, como se describe en Elble (1992), basado en el método desarrollado por Ito et al. (1983). Se inoculó una colonia en 5 ml de medio YPD y se dejó en agitación toda la noche a 28 ºC. Se tomaron ~ 2 x 10 8 células (D.O. 600 0.5 equivale a ~ 5 x 10 6 células/ml), se recogieron por centrifugación y se les añadieron 1 µg de DNA plasmídico y 500 ml de PLATE. Se incubaron las células en esta solución durante 24 horas a 25 ºC y, transcurrido este tiempo, se recogieron por centrifugación a 13,000 rpm durante 1 minuto (Biofuge Pico, Heraeus) y se extendieron con bolas de vidrio de 4 mm de diámetro en placas de medio YNB selectivo.    Solución PLATE PEG 4000 40% (v/v) Acetato de Litio 100 mM Tris-HCl pH 8.0 10 mM EDTA-Na 2 pH 8.0 1 mM M.4.4. Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis. M.4.4.1. Preparación de las células de A. tumefaciens. Se siguió el protocolo descrito por Bechtold et al. (1993). Se inoculó una colonia de A. tumefaciens portadora de la construcción deseada en 5 ml de LB suplementado con kanamicina y se incubó durante 48 horas a 28 ºC en agitación. Con este precultivo se inocularon 500 ml de medio LB suplementado con kanamicina contenidos en un matraz de 2 litros y se incubó ~16-20 horas a 28 ºC en agitación hasta alcanzar una O.D. 600 de 1.4-2. Las células se recogieron a 3,000 g y 4 ºC durante 10 minutos (Varifuge 20 RS, Heraeus, rotor Kontron-Hermle A6.14) y se resuspendieron en solución de transformación de preparación reciente hasta llevarlas a una O.D. 600 de ~0.8 Solución de transformación. Sacarosa 5 g/l Sales MS 2.2 g/l Silwet L-77 0.02% (v/v) El pH se ajustó a 5.7 utilizando KOH. M.4.4.2. Transformación de plantas de A. thaliana. Se requieren plantas cultivadas en suelo y que estén iniciando la floración en el momento de ser transformadas (5-6 semanas desde la germinación). Durante los días previos a la transformación, se podaron los escapos principales para producir una pérdida de la dominancia apical y promover el crecimiento de más tallos desde la roseta. El día de la transformación, se eliminaron todas las flores abiertas y las silicuas formadas. La agroinfección se llevó a cabo sumergiendo los primordios florales en la suspensión de Agrobacterium, obtenida como se describe en el apartado anterior, durante 30 segundos (Clough y Bent, 1998). A continuación se cubrió la parte aérea de la planta con plástico transparente para mantener una humedad elevada en la zona agroinfectada y se mantuvo en la oscuridad    durante 16 horas. Transcurrido este tiempo se retiró el plástico, se dispusieron los Aracons TM (Lehle Seeds, Round Rocks, TX, EE. UU.) y se continuó con la irrigación normal de la planta durante 3 semanas. M.4.4.3. Selección de transformantes y propagación. Las semillas transgénicas (T1) se hicieron germinar in vitro sembrándolas en placas de MS suplementado con 50 µg/ml de kanamicina o 25 µg/ml de higromicina. Para la selección con kanamicina, las placas se incubaron como se describe en el apartado M.3.1.3. A los 7 días, se tomaron las plántulas con resistencia al antibiótico (con presencia de cotiledones verdes y desarrollo de raíz) y se transfirieron a placas de MS sin antibiótico utilizando pinzas esterilizadas por calor. Se incubaron verticalmente y, a los 4-5 días, se transfirieron a suelo y se cultivaron hasta recolectar sus semillas (T2). Para la selección con higromicina, las placas se incubaron apiladas, con poca iluminación y ~20 ºC de temperatura. A los 7 días, se tomaron las plántulas con resistencia al antibiótico (con el hipocotilo elongado) y se transfirieron a placas de MS sin antibiótico utilizando pinzas esterilizadas por calor. Se incubaron verticalmente y, a los 4-5 días, se transfirieron a suelo y se cultivaron hasta recolectar sus semillas (T2). M.4.4.4. Presencia, expresión y número de copias del transgén. M.4.4.4.1. Presencia. Para determinar la presencia del transgén, se tomaron 1 o 2 hojas de la roseta basal de la planta y se realizó una extracción de DNA como se describe en el apartado M.2.1.2. Éste se utilizó como molde para reacciones de PCR con oligonucleótidos propios del transgén y del gen NPTII, que confiere resistencia a kanamicina. M.4.4.4.2. Expresión. Para determinar de forma cualitativa la expresión del transgén, se tomaron 1 o 2 hojas de la roseta basal de la planta y se realizó una extracción de RNA como se describe en el apartado M.3.1. Se generó cDNA a partir del RNA obtenido (ver apartado M.3.4.) y se empleó como molde en reacciones de RT-PCR con oligonucleótidos propios del transgén. Para evaluar la cantidad y calidad del cDNA de las distintas líneas se utilizaron oligonucleótidos que amplificaban fragmentos de los genes de expresión constitutiva en Arabidopsis β-TUBULINA-4: TB45’/ TB4-3’ y ACTINA-8 (Act8_f/Act8_r). IV. Resultados. mediante transformación de plantas del ecotipo Columbia-0 con el vector pROK2. La inserción de T-DNA se encuentra entre los nucleótidos 813 y 1,371 desde el codón de inicio de AKT1 (Alonso et al., 2003). El doble mutante se obtuvo realizando un cruzamiento clásico entre las líneas homocigotas sos1-1 y akt1-2 (ver apartado M.5.). Las plantas F1 obtenidas en la descendencia de este cruzamiento eran todas heterocigotas para ambas mutaciones, por lo que se autofecundaron para obtener la descendencia de semillas segregantes F2, entre las que se buscaron los dobles mutantes homocigotos akt1 sos1. Para ello, la descendencia F2 se sembró en suelo y, una vez las plantas hubieron desarrollado al menos 4 hojas verdaderas, se extrajo el DNA de 50-75 mg de tejido foliar y se realizó un genotipado por PCR. Se utilizaron las parejas de oligonucleótidos AKT1_f/AKT1_r, que amplifican una región de 727 pb únicamente en el alelo silvestre de AKT1, y AKT1_r/LBb1.3, de los cuales el primero hibrida a 60 pb del punto de inserción y el segundo a 294 pb del extremo del borde izquierdo del T-DNA y está dirigido hacia el exterior. El oligonucleótido LBb1.3 es el que utilizaron los suministradores de estas semillas para localizar los puntos de inserción en cada línea de mutantes (http://signal.salk.edu/pBIN-pROK2.txt-new). Con esta pareja de oligonucleótidos se amplifica una banda de 354 pb únicamente en el alelo mutante. Si la línea es homocigota para la inserción, no se amplifica ninguna banda con la pareja de oligonucleótidos AKT1_f/AKT1_r, ya que ésta sería demasiado grande (incluiría la región comprendida entre los oligonucleótidos más el T-DNA) para amplificarse en las condiciones seleccionadas en la reacción de PCR. El mutante sos1-1 contiene una deleción de 14 pb entre los nucleótidos 1330 y 1343 desde el codón de inicio de SOS1 (Shi et al., 2000). Para distinguir el alelo mutante sos1-1 del silvestre se diseñaron los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, que amplifican una región de 144 pb alrededor de la deleción. De este modo, el DNA de la línea silvestre amplificaría un fragmento de 144 pb, mientras que el del mutante sos1-1 amplificaría uno de 130 pb, distinguible del anterior por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (Figura R.1.2 (a)). De una población de 40 líneas independientes se aislaron 2 líneas dobles mutantes por amplificar sólo los alelos silvestres de SOS1 y AKT1 (Figura R.1.2 (b)). El porcentaje (5%) se ajusta a la segregación esperada de 1/16. IV. Resultados. Figura R1.2. Genotipado de la F2 del cruce de dos líneas parentales homocigotas para las mutaciones sos1-1 y akt1-2. Se cruzaron ambas líneas homocigotas y la descendencia se sembró en tierra para obtener la F2, de la que se extrajo el DNA. En el panel a se muestra la representación esquemática de los alelos mutantes sos1-1 (donde el rombo gris representa la deleción de 14 pb) y akt1-2 (donde la flecha negra representa la inserción de T-DNA), y se describen las amplificaciones realizadas. En el panel b se ilustra el resultado de estas amplificaciones para la línea silvestre Col-0 gl1 (wt), los dos alelos mutantes simples (sos1-1 y akt1-2) y el alelo mutante doble (akt1xsos1). R.1.1.3. Caracterización fisiológica del mutante akt1 y del doble mutante akt1 sos1 en cultivo hidropónico. La solución nutritiva (apartado R.1.1.1) se suplementó con distintos volúmenes de K 2 SO 4 0.5 M para preparar medios a las concentraciones de K + de 10 µM, 100 µM, 1 mM y 10 mM, que se utilizaron en el cultivo hidropónico de plantas de la línea silvestre Col-0 gl1, las dos líneas mutantes simples sos1-1 y akt1-2, y el mutante doble akt1 sos1. Plántulas de 7 días germinadas en agua Elix se transfirieron a estas soluciones, en presencia o ausencia de Na + (5 mM NaCl), y se fotografiaron a las 3 semanas. En presencia de Na + (Figura R.1.3 (a)), volvió a observarse el defecto de crecimiento, atenuado al aumentar la concentración de K + , para el mutante sos1-1. El mutante akt1-2 mostró un crecimiento ligeramente menor que la línea silvestre entre 10 µM y 1 mM de K + , ya que es precisamente éste el rango en el que actúa AKT1 (Lagarde et al., 1996; Hirsch et al., 1998). Para todas las concentraciones de K + ensayadas, el doble mutante akt1 sos1 exhibió un fenotipo incluso más severo que el del mutante simple sos1-1, demostrando un efecto aditivo de la menor toma de K + derivada de la falta de un canal AKT1 funcional sobre el defecto de crecimiento producido por la mutación sos1-1. Además, es probable que la falta de función de AKT1 resulte en la hiperpolarización de la membrana plasmática, contribuyendo así a una mayor entrada de Na + . Por otra parte, la IV. Resultados. debilidad del fenotipo producido por la mutación akt1-2 en comparación con el causado por la mutación sos1-1 demuestra que la hipotética inhibición de la toma de K + a través de AKT1 por la sobreacumulación de Na + en la raíz de plantas portadoras de la mutación sos1-1 no es la principal causa de su defecto en el crecimiento, refutando la hipótesis de Qi y Spalding (2004). La línea mutante sos1-1 no mostró ningún fenotipo en ausencia de Na + (Figura R.1.3 (b)), sino que se desarrolló al mismo nivel que el control Col-0 gl1, como ya se vio en el apartado R.1.1. La línea mutante akt1-2, por su parte, volvió a presentar un crecimiento dependiente de K + que, excepto en el medio con 10 µM de K + , fue equiparable al mostrado en presencia de Na + . Bajo esta concentración de K + , todas las líneas crecieron igual en ausencia de Na + debido a que la toma de K + no se lleva a cabo a través de AKT1 en este rango de concentraciones, sino por HAK5 (Lagarde et al., 1996; Hirsch et al., 1998). Sin embargo, ambas líneas con la proteína SOS1 funcional (Col-0 gl1 y akt1-2) mostraron un crecimiento ligeramente mejor en presencia de Na + . Este resultado era previsible, ya que el Na + a concentraciones subtóxicas puede ser beneficioso porque permite su uso como osmolito en las vacuolas (Zhu et al., 1997), favoreciendo el crecimiento de las plantas. Finalmente, el doble mutante akt1 sos1 no mostró ningún efecto aditivo respecto al mutante simple akt1-2, como cabría esperar teniendo en cuenta la ausencia de fenotipo de la mutación sos1-1 al eliminar el Na + del medio. Figura R.1.3. Cultivo hidropónico en presencia y ausencia de sodio. Se cultivaron plantas de la línea silvestre Col-0 gl1, las líneas mutantes simples sos1-1 y akt1-2 y la línea doble mutante akt1 sos1 en solución nutritiva control (a) y suplementada con 5 mM de Na + (b) con concentraciones crecientes de K + . A las 3 semanas se fotografiaron plantas representativas para cada línea y tratamiento. Las plantas provenientes de los medios con las mayores concentraciones de K + (1 y 10 mM) se dejaron crecer dos semanas más para obtener una mayor cantidad de material vegetal y los fenotipos se mantuvieron. Al final del tratamiento, las plantas se fotografiaron y pesaron (Figura R.1.4). Las diferencias de peso fresco entre líneas fueron similares para cada tratamiento tanto en parte aérea como en raíz, si bien ésta última acusó más, en general, el crecimiento a baja concentración de K + . Dado el severo fenotipo mostrado por el doble mutante IV. Resultados. akt1 sos1 en el medio con 5 mM de Na + y 1 mM de K + , apenas se pudieron tomar muestras de parte aérea y fue imposible tomarlas de raíz. Para maximizar la cantidad de material vegetal obtenida, principalmente en raíz, se realizó también un experimento alternativo en el que plantas crecidas durante 3 semanas en solución estándar sin Na + y con 1 mM de K + se sometieron a 10 mM NaCl durante dos semanas, tomándose muestras de raíz y parte aérea al finalizar el tratamiento. Figura R.1.4. Crecimiento de las plantas al final del tratamiento. Se descartaron las plantas cultivadas en las soluciones con concentraciones de K + menores de 1 mM y el resto (Figuras R.1.3. y R.1.4.) se cultivaron durante 2 semanas más en medio fresco, fotografiándose (a) y pesándose la parte aérea (b) y la raíz (c) al final del tratamiento. R.1.1.4. Determinación de los contenidos iónicos. Para comprobar si las diferencias fenotípicas descritas anteriormente se correspondían con diferencias en la acumulación y translocación de iones, se tomaron muestras de raíz y parte aérea de plantas de 5 semanas (Figura R.1.4) y se determinaron las concentraciones de Na + y K + en los tejidos utilizando un espectrómetro de absorción atómica (ver apartado M.7.5.). Los datos obtenidos con las medidas de Na + (Figuras R.1.5 (a) y (b) y R.1.6 (a) y (b)) coinciden con los esperados: en general, las plantas portadoras de la mutación sos1-1 presentaron un contenido mayor de este catión. En parte aérea y ausencia de Na + (Figuras R.1.5 (a) y R.1.6 (a)), estas diferencias fueron muy pequeñas y podrían deberse a pequeñas trazas de Na + presentes como contaminante en las distintas sales utilizadas para preparar la solución stock. Las diferencias sólo fueron algo mayores en la raíz (Figura R.1.5 (b) y R.1.6 (b)), donde el Na + entra por el apoplasto hasta que llega a la barrera impermeable formada por IV. Resultados. la banda de Caspari (Azaizeh y Steudle, 1991; Cruz et al., 1992) y no puede ser bombeado al exterior en las plantas portadoras de la mutación sos1-1, acumulándose en el córtex (Shi et al., 2002). En presencia de Na + 5 mM (Figura R.1.5 (a) y (b)), el contenido en este catión no mostró diferencias entre las líneas con un alelo funcional de SOS1. La mutación sos1-1 provocó una toma masiva de Na + que se tradujo en una gran acumulación de este catión en raíz y parte aérea. El incremento de la concentración de K + en el medio redujo considerablemente el contenido en Na + , al dificultar la toma de este catión (Niu et al., 1995). Los resultados fueron similares en el tratamiento alternativo con 10 mM de Na + (Figura R.1.6 (a) y (b)) mostrando todas las líneas un lógico aumento en la acumulación de Na + tanto en raíz como en parte aérea. En ausencia de Na + , existe una correlación entre el contenido de K + y el fenotipo observado en las distintas líneas (Figuras R.1.5 (c) y (d) y R.1.6. (c) y (d). La presencia de la mutación akt1-2 produjo una menor acumulación de K + pero este efecto desapareció al aumentar la concentración de este catión en el medio. La presencia de la mutación sos1-1 no parece influir en la toma de K + en ausencia de Na + , mostrando el mutante simple sos1-1 unos contenidos equiparables a los de la línea silvestre Col-0 gl1, mientras los del mutante doble akt1 sos1 fueron similares a los del mutante simple akt1-2. Los contenidos iónicos fueron similares en parte aérea y raíz, indicando que las diferencias entre líneas se deben fundamentalmente a la adquisición de K + y no a su distribución a través de la planta. En presencia de Na + 5 mM, sin embargo (Figura R.1.5 (c) y (d)), los contenidos de K + difirieron de los esperados y no se correspondieron con los severos fenotipos observados en las plantas. El mutante simple sos1-1 presentó un contenido de K + mayor que la línea silvestre en parte aérea y, aparentemente, menor en raíz, lo que sugeriría una alteración en el transporte a larga distancia de este macronutriente. Además, no se vieron diferencias en el contenido de este catión entre el mutante simple akt1-2 y el doble mutante akt1 sos1 a pesar de la severidad del fenotipo mostrado por esta última línea. IV. Resultados. Figura R.1.5. Contenidos iónicos en parte aérea y raíz. Se tomaron muestras de las plantas al final del tratamiento (Figura R.1.4.) y se determinó por espectrometría de absorción atómica el contenido de Na + y K + en parte aérea (a) y raíz (b). Algo parecido sucedió en el experimento alternativo en el que plantas crecidas en medio hidropónico sin Na + y con 1 mM de K + se sometieron a 10 mM NaCl durante dos semanas (Figura R.1.6). El mutante sos1-1 pasó de mostrar un contenido de K + en parte aérea significativamente menor que el de Col-0 gl1 en ausencia de Na + a equiparar su acumulación de este catión con la de la línea silvestre tras el tratamiento con 10 mM Na + . Nuevamente, las líneas portadoras de la mutación akt1-2 mostraron una severa reducción en la acumulación de K + , tanto en presencia como en ausencia de tratamiento salino (Figura R.1.6. (c)). La mayor cantidad de material vegetal recolectada permitió confirmar que el contenido de K + en la raíz disminuye al someter al mutante sos1-1 a concentraciones moderadas de Na + (Figura R.1.6 (d)), sugiriendo de nuevo un aumento en la translocación de K + como consecuencia de dicho tratamiento. En el caso del doble mutante sos1 akt1, aunque esta vez sí se pudo recolectar suficiente material vegetal, se obtuvieron valores muy bajos al determinar el contenido en ambos cationes. Los bajos contenidos iónicos indican que el tratamiento salino causó daños tan severos que la funcionalidad de la raíz se vio afectada, por lo que las medidas no se incluyeron en la gráfica. En cambio, el alto contenido de Na + medido en las raíces del mutante sos1-1 indica una completa funcionalidad de este órgano, validando las bajas medidas de K + obtenidas. En conjunto, los resultados de ambos ensayos demuestran que el fenotipo observado en las líneas portadoras de la mutación sos1-1 no se debía a una menor toma de K + a través de AKT1, sino a la excesiva acumulación de Na + . El efecto aditivo observado en el mutante doble akt1 sos1 parece deberse a la suma de la acumulación masiva de Na + y la IV. Resultados. menor toma de K + , que produciría una reducción del cociente K + :Na + respecto al del mutante sos1-1. Por otra parte, el mayor contenido en K + del mutante sos1-1 en parte aérea, junto con su menor concentración en la raíz, indica una alteración en el transporte de K + a larga distancia, lo que podría deberse a una activación del canal de salida de K + SKOR por despolarización de las células parenquimáticas que rodean al xilema como consecuencia del exceso de Na + . Un efecto similar ha sido descrito en mutantes de pérdida de función para los transportadores AtHKT1;1 y OsHKT1;5, en los que aunque la mayor acumulación de Na + en el xilema se vio acompañada por una previsible reducción en el contenido en K + , la magnitud de ésta fue menor de lo esperado. (Ren et al., 2005; Sunarpi et al., 2005). Horie et al. (2009) propusieron que el exceso de Na + estaba favoreciendo indirectamente la liberación de K + de las células parenquimáticas del xilema a través de canales de salida de K + , ya que se ha demostrado la activación de algunos como KOR y NOR de cebada o SKOR de Arabidopsis por despolarización celular (Wegner y Raschke, 1994; Wegner et al., 1997; Gaymard et al., 1998) Figura R.1.6. Contenidos iónicos en parte aérea y raíz. Se tomaron muestras de las plantas al final del tratamiento y se determinó por fotometría de llama el contenido de Na + y K + en parte aérea (a) y raíz (b). IV. Resultados. R.1.2. Expresión en planta y levadura de un alelo de SOS1 mutado en el residuo conservado de ácido aspártico en posición 201 que inhabilita el transporte de Na+. En la naturaleza existen proteínas receptoras emparentadas con transportadores llamadas “transceptores”. Algunas conservan totalmente la función de transporte (ej: Gap1 y Pho84 de levadura), otras son fundamentalmente receptoras con una actividad transportadora residual (ej: UhpC de E. coli) y otras son similares a transportadores en su estructura pero carecen por completo de función transporadora (ej: Snf3 y Ssy1 de levdura). Al igual que los transportadores, alternan entre dos conformaciones para exponer o no el sitio de unión al sustrato al medio extracelular. La unión del sustrato ocasiona un cambio de conformación que permite desencadenar rutas de señalización y, en algunos casos, transporte del sustrato (Thevelein y Voordeckers, 2009). La más estudiada es Gap1 de levadura, que activa la ruta PKA para estimular rápidamente el metabolismo fermentativo en presencia de aminoácidos y otras fuentes nitrogenadas (Donaton et al., 2003). Como ya se ha indicado anteriormente, la proteína SOS1 consta de una larga cola hidrofílica que, además de interactuar con el regulador transcripcional de genes de respuesta a estrés oxidativo RCD1 (Katiyar-Agarwal et al., 2006), podría hacerlo con otras proteínas reguladoras, actuar como sensor de Na + o desempeñar otras funciones reguladoras aún desconocidas y que convertirían a SOS1 en un transceptor (Zhu et al., 2002; Putney et al., 2002). La presencia de un residuo de ácido aspártico junto a uno de asparagina en un dominio transmembrana está muy conservada en antiportadores Na + /H + de procariotas y eucariotas, habiéndose demostrado su implicación en el transporte de Na + a pH fisiológico en NHX de levadura y NHE1 de humanos (Bowers et al., 2000; Murtazina et al., 2001). Puesto que este aminoácido existe en el sexto dominio transmembrana de SOS1 ocupando la posición 201, se especuló que también podría ser esencial para el transporte de Na + y que la proteína con este aminoácido mutado perdería la permeabilidad para Na + pero conservaría las hipotéticas interacciones con proteínas reguladoras en su extremo carboxiterminal al no afectar esta mutación a la estructura global de la proteína, por lo que se convertiría en un práctica herramienta para identificar nuevas funciones de SOS1 no relacionadas con su regulación de la homeostasis iónica. R.1.2.1. Caracterización funcional del alelo mutado SOS1_D201N en levadura. El ácido aspártico en la posición 201 se mutó a asparagina mediante PCR (ver apartado M.2.6.7.). Partiendo del cDNA de SOS1 clonado en pYPGE15, se amplificaron dos fragmentos de unas 0.65 kb del extremo aminoterminal con las parejas de oligonucleótidos 5BHSOS1_f/SOS1DN_r y SOS1DN_f/3BHSOS1_r, utilizando la polimerasa de alta fidelidad Pfu. Los oligonucleótidos SOS1DN_f y SOS1DN_r hibridan con el cDNA de SOS1 entre los nucleótidos 586 y 617 pero contienen un cambio de base en la posición 601, que se traduce en una mutación del codón GAT (ácido aspártico) a AAT (asparagina). Ambos fragmentos, purificados de un gel de TAE, se utilizaron como molde en una amplificación con Pfu y los IV. Resultados. oligonucleótidos 5BHSOS1_f y 3BHSOS1_r. El producto de PCR, de 1.4 kb, se purificó de un gel de TAE y se clonó usando el Blunt ® PCR Cloning Kit (Invitrogen). Para la inserción de este alelo en el vector de expresión en levadura pYPGE15, se liberó un fragmento XbaI/BamHI de 1.3 kb portador de la mutación en el vector Blunt ® PCR y se sustituyó con él el fragmento correspondiente del alelo silvestre clonado en el vector pYPGE15 (Quintero et al., 2002) (ver apartados M.2.6.1. y M.2.6.4.). En primer lugar, se realizó la caracterización funcional del alelo mutado en la cepa halosensible de S. cerevisiae AXT3K (∆ena1-4 ∆nha1 ∆nhx1). En levadura, la extrusión de Na + del citosol se lleva a cabo por las ATPasas de Na + ScENA1-4 y el antiportador Na + ,K + /H + ScNHA1, ambos situados en la membrana plasmática (Haro et al., 1991; Wieland et al., 1995; Bañuelos et al., 1998), mientras la compartimentación de Na + es debida al antiportador Na + /H + endosomal ScNHX1 (Nass et al., 1997; Darley et al., 2000; Quintero et al., 2000). La cepa AXT3K carece de los transportadores de Na + esenciales para la halotolerancia, por lo que es incapaz de crecer en medios con una concentración de NaCl mayor de 50 mM (Quintero et al., 2002).Tanto el alelo silvestre SOS1 como el mutado SOS1_D201N se expresaron en esta cepa, en presencia y ausencia del complejo SOS2/SOS3, en medio AP normal o suplementado con NaCl 50 mM (Figura R.1.7) (ver apartados M.4.3. y M.6.). El alelo silvestre SOS1 fue por sí mismo capaz de suprimir parcialmente el fenotipo de halosensibilidad, efecto que se incrementó considerablemente por la coexpresión con el complejo SOS2/SOS3. Sin embargo, el alelo mutado SOS1_D201N fue incapaz de suprimir este fenotipo, mostrando los transformantes una halotolerancia comparable a la observada en los controles transformados con el vector pYPGE15 vacío y mucho menor que la aportada por el alelo silvestre, tanto en presencia como en ausencia del complejo SOS2/SOS3. Estos resultados demuestran la importancia de este aminoácido en el transporte de Na + , ya que, al menos en levadura, se revela como un residuo esencial en la funcionalidad del antiportador SOS1. IV. Resultados. Figura R.1.7. Caracterización funcional del alelo SOS1_D201N en levadura. Transformantes de la cepa de levadura halosensible AXT3K expresando el antiportador mutado SOS1_D201N y el silvestre SOS1, en presencia y ausencia del complejo SOS2/SOS3, se cultivaron en medio YNB líquido hasta saturación. Se distribuyeron 5 µl de diluciones decimales seriadas en medio AP suplementado con 1 mM de KCl y las concentraciones indicadas de NaCl, y se incubaron a 28 ºC. Los plásmidos utilizados para la expresión de las proteínas SOS fueron pYPGE15 para los alelos de SOS1 y pFL32T para el complejo SOS2/SOS3. R.1.2.2. Transformación de la línea sos1-1 de Arabidopsis con el alelo SOS1_D201N. Una vez comprobada la incapacidad de la proteína SOS1_D201N para mediar la extrusión de Na + en levadura, se procedió a la transformación con el alelo SOS1_D201N del mutante sos1-1 de Arabidopsis para diseccionar la importancia relativa del transporte de Na + en relación con otras funciones reguladoras de la proteína SOS1 en la célula vegetal que fueran independientes de su función como transportador iónico. Partiendo del fragmento de cDNA mutado y clonado en el vector Blunt ® PCR, se liberó con las enzimas XbaI y BamHI la banda de 1.3 kb portadora de la mutación y se sustituyó con ella el fragmento equivalente del cDNA del alelo silvestre de SOS1 clonado en el vector binario de expresión en Arabidopsis pBI321 (Shi et al., 2000) (ver apartados M.2.6.1. y M.2.6.4.). El mutante sos1-1 presenta una deleción de 14 pb que produce un fallo temprano en la traducción del antiportador SOS1 por cambio de fase. Como consecuencia, las plantas mutantes presentan un fenotipo de halosensibilidad severa en condiciones de salinidad moderada (Wu et al., 1996; Shi et al., 2000; Qiu et al., 2002). Este fenotipo puede aliviarse mediante la expresión del transportador silvestre AtSOS1 e incluso, en menor grado, de su ortólogo en arroz OsSOS1 (Shi et al., 2000; Martínez-Atienza et al., 2007a). Con el fin de confirmar la funcionalidad del alelo mutante in planta, se transformó con él la línea mutante de Arabidopsis sos1-1. La cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 se transformó con el alelo mutado SOS1_D201N, con pBIAtSOS1 (Shi et al., 2000) y con el vector pBI321 vacío (usados como control positivo y negativo respectivamente), y se utilizó para infectar plantas de la línea mutante sos1-1 (ver apartados M.4.2.2. y M.4.4.). Se seleccionaron líneas transgénicas T1 para las distintas construcciones por germinación en MS suplementado con 50 µg/ml de kanamicina y se confirmó la presencia del transgén por PCR con los oligonucleótidos CaMV35S_f/SOSDN_r, que amplifican una banda de 0.65 kb en el extremo aminoterminal del cDNA. Alternativamente, se confirmó el fondo genético sos1-1 amplificando con los oligonucleótidos sos1-1_f/sos1-1_r, que permiten distinguir el alelo mutante del alelo silvestre en geles de TBE con agarosa al 2% (Shi et al., 2000) (Figura R.1.8. (c)). Para asegurar que se estaba produciendo una acumulación significativa del mRNA de SOS1, se cuantificó su nivel de expresión mediante RT-PCR semicuantitativa (Figura R.1.8). Se extrajo el RNA total (ver apartado M.3.1.) de la línea mutante sos1-1 y de 8 líneas independientes de este mutante transformado con el alelo SOS1_D201N y el cDNA, obtenido mediante la utilización del kit Quanti Tect Reverse Transcription Kit (Qiagen), se utilizó como molde en una amplificación con la pareja de oligonucleótidos específicos del transgén IV. Resultados. proteína truncada (Quintero et al., 2011). Se procedió a continuación al clonado de estos cuatro alelos en el vector de Arabidopsis pBI321, que expresa genes bajo el control del promotor constitutivo CaMV35S. Para ello, se liberaron las regiones portadoras de mutaciones y se sustituyó con ellas el mismo fragmento del gen silvestre SOS1 en el vector binario de expresión pBIAtSOS1 (Shi et al., 2000) (ver apartados M.2.6.1, M.2.5. y M.2.6.4.). Las construcciones pBI321:SOS1_A399V y pBI321:SOS1_E261K se realizaron por sustitución con el fragmento portador de la mutación XbaI/BamHI de 1.2 kb. En la construcción pBI321:SOS1_P985S se sustituyó con el fragmento portador de la mutación XhoI/HpaI de 0.9 kb. La construcción pBI321:SOS1 ∆ 998 fue realizada en nuestro laboratorio por la Dra. Juliana Martínez-Atienza. Las tres primeras construcciones se distinguieron del alelo silvestre por secuenciación con oligonucleótidos específicos, mientras que en la última se realizó una digestión diagnóstica con HindIII. En primer lugar, se utilizaron estas construcciones para transformar a la línea mutante de Arabidopsis sos1-1 mediante la infiltración con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens. Se seleccionaron plántulas T1 transgénicas de 7 días por su crecimiento en medios con 50 µg/ml kanamicina y se transfirieron a tierra para obtener su descendencia. Se confirmó la presencia del transgén en la T2 por PCR con los oligonucleótidos CaMV35S_f/SOSDN_r para amplificar el extremo aminoterminal o con SOS1Xho_f/NOSTerm_r para el extremo carboxiterminal, y el fondo genético sos1-1 amplificando con los oligonucleótidos sos1-1_f/sos1-1_r (Shi et al., 2000) (Figuras R.2.2 (c) a R.2.5 (c)). Los ensayos de halotolerancia se realizaron mediante la transferencia de plántulas T2 de 7 días, previamente seleccionadas en MS con 50 µg/ml de kanamicina, a medio MS normal y suplementado con 75 mM NaCl. A los 7 días, se fotografiaron las placas (Figuras R.2.2 (a) a R.2.5 (a)) y se midió el crecimiento de las raíces (Figuras R.2.2 (b) a R.2.5 (b)) (ver apartado M.7.1.). En general, los 4 alelos ensayados fueron capaces de complementar la mutación sos1- 1, indicando su funcionalidad in planta, pero no mostraron ninguna capacidad de aumento de la halotolerancia en comparación con el alelo silvetre de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.2. Complementación del mutante de Arabidopsis sos1-1 con el alelo SOS1_A399V. Plántulas de 7 días germinadas en MS suplementado con kanamicina se transfirieron a placas de MS suplementado con NaCl 75 mM, fotografiándose (a) y midiéndose la elongación de la raíz (b) a los 7 días de tratamiento. (a) Izquierda, una planta de la línea sos1-1 transformada con el vector pBI321 vacío. Centro, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el alelo silvestre AtSOS1 bajo el promotor constitutivo 35S. Derecha, tres líneas independientes de sos1-1 expresando el alelo mutado SOS1_A399V bajo el control del mismo promotor, mostrándose dos plantas por línea. (b) Elongación de la raíz al final del tratamiento para todas las líneas ensayadas. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 6 líneas independientes transformadas con el alelo mutante SOS1_A399V y la línea control Col-0 gl1 (wt). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos SOS1Xho-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.3. Complementación del mutante de Arabidopsis sos1-1 con el alelo SOS1_E261K. Plántulas de 7 días germinadas en MS suplementado con kanamicina se transfirieron a placas de MS suplementado con NaCl 75 mM, fotografiándose (a) y midiéndose la elongación de la raíz (b) a los 7 días de tratamiento. (a) Izquierda, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el vector pBI321 vacío. Centro, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el alelo silvestre AtSOS1 bajo el promotor constitutivo 35S. Derecha, tres líneas independientes de sos1-1 expresando el alelo mutado SOS1_E261K bajo el control del mismo promotor, mostrándose dos plantas por línea. (b) Elongación de la raíz al final del tratamiento para todas las líneas ensayadas. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 3 líneas independientes transformadas con el alelo mutante SOS1_E261K y la línea control Col-0 gl1 (wt). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos SOS1Xho-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.4. Complementación del mutante de Arabidopsis sos1-1 con el alelo SOS1_P985S. Plántulas de 7 días germinadas en MS suplementado con kanamicina se transfirieron a placas de MS suplementado con NaCl 75 mM, fotografiándose (a) y midiéndose la elongación de la raíz (b) a los 7 días de tratamiento. (a) Izquierda, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el vector pBI321 vacío. Centro, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el alelo silvestre AtSOS1 bajo el promotor constitutivo 35S. Derecha, tres líneas independientes de sos1-1 expresando el alelo mutado SOS1_P985S bajo el control del mismo promotor, mostrándose dos plantas por línea. (b) Elongación de la raíz al final del tratamiento para todas las líneas ensayadas. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 5 líneas independientes transformadas con el alelo mutante SOS1_P985S y la línea control Col-0 gl1 (wt). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos SOS1Xho-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.5. Complementación del mutante de Arabidopsis sos1-1 con el alelo SOS1 ∆ 998. Plántulas de 7 días germinadas en MS suplementado con kanamicina se transfirieron a placas de MS suplementado con NaCl 75 mM, fotografiándose (a) y midiéndose la elongación de la raíz (b) a los 7 días de tratamiento. (a) Izquierda, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el vector pBI321 vacío. Centro, dos plantas de la línea sos1-1 transformada con el alelo silvestre AtSOS1 bajo el promotor constitutivo 35S. Derecha, 6 líneas independientes de sos1-1 expresando el alelo mutado SOS1∆998 bajo el control del mismo promotor, mostrándose dos plantas por línea. (b) Elongación de la raíz al final del tratamiento para todas las líneas ensayadas. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 6 líneas independientes transformadas con el alelo mutante SOS1 ∆ 998 y la línea control Col-0 gl1 (wt). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1- 1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos SOS1Xho-f y NOSTerm-r, detecta la presencia del transgén de SOS1 completo y truncado. R.2.2. Expresión in vitro de candidatos a alelos hiperactivos en plantas silvestres de Arabidopsis. Las construcciones presentadas en el apartado R.2.1, una vez confirmada su funcionalidad in planta, se utilizaron para transformar plantas de la línea silvestre de Arabidopsis Col-0 gl1 y determinar si la sobreexpresión de dichos alelos producía un aumento en la halotolerancia superior al aportado por el alelo silvestre. De nuevo, se utilizó la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 para la agroinfiltración de plantas y se seleccionaron líneas transgénicas T1 para las distintas construcciones por germinación en MS suplementado con 50 µg/ml de kanamicina. La presencia del transgén y el fondo genético silvestre se comprobaron utilizando los oligonucleótidos descritos en el apartado anterior (Figuras R.2.6(c) a R.2.9 (c)). Dada la imposibilidad de encontrar diferencias en halotolerancia incluso entre los controles midiendo la elongación de la raíz a cualquier concentración de NaCl utilizada y la dificultad de hacerlo por germinación en medio con sal o por irrigación de plantas en suelo (Shi IV. Resultados. et al., 2003) (datos no mostrados), se utilizó el procedimiento descrito por Yang et al. (2009), consistente en transferir plántulas homocigotas T3 de 6 días germinadas en MS sólido a medio MS líquido normal o suplementado con NaCl 200 mM e incubar en agitación durante 7 días. La halotolerancia se midió indirectamente, cuantificando el nivel de clorofila según se describe en Lichtenthaler (1987) (Figuras R.2.6 (b) a R.2.9 (b)) (ver apartados M.7.2. y M.7.3.). Figura R.2.6. Sobreexpresión del alelo SOS1_A399V en la línea silvestre Col-0 gl1. Plantas de 6 días germinadas en MS se transfirieron a matraces con MS líquido, normal y suplementado con NaCl 200 mM. A los 7 días, se fotografiaron las plantas (a), se pesaron en grupos de 6-10 y se extrajo la clorofila añadiendo 1 ml de acetona al 80%. A las 24 horas, se determinó el contenido en clorofila (b) midiendo la absorbancia a 646 y 663 nm en un espectrofotómetro. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 10 líneas independientes transformadas con el alelo mutado SOS1_A399V y la línea mutante sos1-1 (c-). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos CaMV35S-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.7. Sobreexpresión del alelo SOS1_E261K en la línea silvestre Col-0 gl1. Plantas de 6 días germinadas en MS se transfirieron a matraces con MS líquido, normal y suplementado con NaCl 200 mM. A los 7 días, se fotografiaron las plantas (a), se pesaron en grupos de 6-10 y se extrajo la clorofila añadiendo 1 ml de acetona al 80%. A las 24 horas, se determinó el contenido en clorofila (b) midiendo la absorbancia a 646 y 663 nm en un espectrofotómetro. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 14 líneas independientes transformadas con el alelo mutado SOS1_E261K y la línea mutante sos1-1 (c-). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos CaMV35S-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. IV. Resultados. Figura R.2.8. Sobreexpresión del alelo SOS1_P985S en la línea silvestre Col-0 gl1. Plantas de 6 días germinadas en MS se transfirieron a matraces con MS líquido, normal y suplementado con NaCl 200 mM. A los 6 días, se fotografiaron las plantas (a), se pesaron en grupos de 6-10 y se extrajo la clorofila añadiendo 1 ml de acetona al 80%. A las 24 horas, se determinó el contenido en clorofila (b) midiendo la absorbancia a 646 y 663 nm en un espectrofotómetro. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 13 líneas independientes transformadas con el alelo mutado SOS1_P985S y la línea mutante sos1-1 (c-). La amplificación superior, usando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos CaMV35S-f y SOSDN-r, detecta la presencia del transgén de SOS1. Figura R.2.9. Sobreexpresión del alelo SOS1 ∆ 998 en la línea silvestre Col-0 gl1. Plantas de 6 días germinadas en MS se transfirieron a matraces con MS líquido, normal y suplementado con NaCl 200 mM. A los 6 días, se fotografiaron las plantas (a), se pesaron en grupos de 6-10 y se extrajo la clorofila añadiendo 1 ml de acetona al 80%. A las 24 horas, se determinó el contenido en clorofila (b) midiendo la absorbancia a 646 y 663 nm en un espectrofotómetro. (c) Genotipado por PCR de las líneas transgénicas. De izquierda a derecha, se muestran las bandas correspondientes a la línea transformada con el vector vacío (v), con el alelo silvestre SOS1 (S), 8 líneas independientes transformadas con el alelo mutado SOS1 ∆ 998 y la línea mutante sos1-1 (c-). La amplificación superior, utilizando los oligonucleótidos sos1-1_f y sos1-1_r, permite distinguir entre el alelo sos1-1 y el alelo silvestre de SOS1, mientras que la amplificación inferior, con los oligonucleótidos SOS1Xho-f y NOSTerm-r, detecta la presencia del transgén de SOS1 completo y truncado. Los fenotipos obtenidos en levadura no se reprodujeron en planta. Los alelos SOS1_A399V, SOS1_E261K y SOS1_P985S sólo fueron capaces de aportar un grado de halotolerancia mayor que el conferido por la sobreexpresión del alelo silvestre SOS1 en 2 de 9, 3 de 11 y 2 de 12 líneas evaluadas respectivamente. Como ya se ha indicado anteriormente, la expresión de proteínas en sistemas heterólogos ofrece muchas ventajas por su mayor rapidez y comodidad, si bien factores como el distinto nivel de expresión génica, o la alteración en regulaciones post-transcripcionales o post-traduccionales debida a la falta en el sistema heterólogo de proteínas reguladoras (activadores, inhibidores, factores de transcripción…) IV. Resultados. producen a menudo diferentes niveles de actividad. Además, mientras la levadura es un organismo unicelular, la planta presenta una mayor complejidad ya que posee tejidos diferenciados a nivel tanto morfológico como funcional. Sólo el alelo con la deleción en su extremo carboxiterminal, SOS1_ ∆ 998, produjo una ligera mejora en el fenotipo en 6 de 9 líneas evaluadas, si bien el efecto es sustancialmente menor que el observado en levadura. Este alelo truncado carece del extremo carboxiterminal que, en la proteína completa, constituye un dominio autoinhibitorio que mantiene al antiportador en un estado inactivo. La deleción del extremo carboxiterminal mantendría a SOS1 constitutivamente activa, requiriéndose para la activación de la proteína completa la fosforilación mediante el complejo SOS2/SOS3 de la serina en la posición 1138 y siendo necesaria también la presencia de la serina que ocupa la posición 1136 (Pardo et al., 2006; Quintero et al., 2011). El Li + se usa habitualmente en el laboratorio como catión tóxico análogo al Na + , con el que comparte muchos sistemas de transporte y dianas, ya que debido a su alta toxicidad se puede añadir a los medios de cultivo en concentraciones tan bajas que no causen estrés osmótico a la planta (Serrano et al., 1999; Nublat et al., 2001). Aunque numerosos ensayos de transporte demuestran que la proteína SOS1 es un antiportador Na + /H + con poca afinidad por otros cationes monovalentes como K + o Li + (Quintero et al., 2002; Shi et al., 2002), el mutante sos1-1 muestra también cierto grado de sensibilidad a este último catión (Wu et al., 1996). Muchos antiportadores Na + /H + filogenéticamente emparentados con SOS1 presentan distintos grados de afinidad por Li + como NhaP de Synechocystis, Aphanotece halophytica y Saccharomyces cerevisiae, Cnh1p de Candida albicans, Sod2-p de Zygosaccharomyces rouxii y Schizosaccharomyces pombe, NHE de glóbulos rojos de mamíferos o NHX8 de Arabidopsis, homóloga a SOS1 en un 72%, siendo la presencia de ciertos dominios y aminoácidos determinante en su especificidad iónica (Hamada et al., 2001; Waditee et al., 2001; Kinclová et al., 2002; Dunham et al., 2005; An et al., 2007). En nuestro laboratorio se han clonado los genes homólogos al antiportador SOS1 de Arabidopsis en arroz y trigo duro. Aunque la sensibilidad a Na + de la línea sos1-1 de Arabidopsis no pudo ser suprimida por el homólogo SOS1 de trigo duro y lo fue sólo parcialmente por el de arroz, ambas proteínas fueron capaces de suprimir su sensibilidad a Li + (Martínez-Atienza et al., 2007a; Feki et al., 2011; Quintero et al., sin publicar). A la vista de estos precedentes, se postuló que el comportamiento similar al alelo silvestre de la mayoría de alelos evaluados en planta frente a Na + podría deberse a que se habían seleccionado alelos tolerantes a estrés osmótico, ya que la aplicación de altas concentraciones de NaCl conlleva la imposición de este tipo de estrés además del iónico, Para comprobar esta hipótesis, se decidió estudiar la tolerancia de las líneas transgénicas frente a Li + , ya que permite discriminar entre ambos componentes del estrés salino. Semillas T3 homocigotas de las distintas líneas transformadas con cada uno de los 4 alelos se sembraron en medio MS sólido normal o suplementado con LiCl 30 mM, fotografiándose las plántulas a los 7 días (Figuras R.2.10 a R.2.13). Varias líneas independientes de los 4 alelos mostraron una mayor germinación que el control positivo, destacando el mejor comportamiento de los alelos de clase I (4 de 7 líneas en SOS1_A399V y IV. Resultados. 8 de 12 en SOS1_E261K) frente a los de clase II (4 de 10 líneas en SOS1_P985S y 4 de 9 en SOS1ǻ998). Figura R.2.10. Germinación de líneas sobreexpresando el alelo SOS1_A399V en LiCl. Semillas de las distintas líneas de Col-0 gl1 transformadas con el alelo mutante SOS1_A399V se sembraron en medio MS normal y suplementado con LiCl 30 mM, fotografiándose a los 7 días. Figura R.2.11. Germinación de líneas sobreexpresando el alelo SOS1_E261K en LiCl. Semillas de las distintas líneas de Col-0 gl1 transformadas con el alelo mutante SOS1_E261K se sembraron en medio MS normal y suplementado con LiCl 30 mM, fotografiándose a los 7 días. IV. Resultados. agua (obtenido mediante la expresión %H 2 O = 100·(Pf-Ps)/Pf) que el control positivo transformado con el alelo silvestre. Por el contrario, los otros 3 alelos, SOS1_A399V, SOS1_E261K y SOS1_P985S mostraron peor aspecto (Figuras R.2.18 a R.2.21) y menor contenido en agua (Figuras R.2.22 (a) y R.2.23 (a)) que el control positivo con SOS1 silvestre al finalizar el tratamiento con NaCl. El tratamiento con LiCl también mostró resultados parecidos a los obtenidos en medio MS líquido: varias de las líneas independientes de los alelos SOS1_A399V, SOS1_E261K y SOS1_ ∆ 998 presentaron una tolerancia ligeramente mayor (observada tanto fenotípicamente como mediante la medida del contenido en agua) que el control sobreexpresando el alelo silvestre, mientras la tolerancia del alelo SOS1_P985S fue similar. Estos resultados confirman tanto la mayor tolerancia a Na + conferida por el alelo SOS_1 ∆ 998 observada in vitro como el mejor comportamiento frente a Li + mostrado por la mayoría de alelos de SOS1, validando por lo tanto los datos obtenidos con las plantas en cultivo líquido. Figura R.2.18. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas transformadas con el alelo SOS1_A399V. Tras la germinación, plantas de las líneas indicadas se transfirieron a bandejas con solución nutritiva (sin Na + , 1 mM K + ). A las 3 semanas, se transfirieron a medio nuevo, normal, suplementado con 20 mM LiCl o con 120 mM NaCl, y se fotografiaron a los 6 días. IV. Resultados. Figura R.2.19. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas transformadas con el alelo SOS1_E261K. Tras la germinación, plantas de las líneas indicadas se transfirieron a bandejas con solución nutritiva (sin Na+, 1 mM K+). A las 3 semanas, se transfirieron a medio nuevo, normal, suplementado con 20 mM LiCl o con 120 mM NaCl, y se fotografiaron a los 6 días. Figura R.2.20. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas transformadas con el alelo SOS1_P985S. Tras la germinación, plantas de las líneas indicadas se transfirieron a bandejas con solución nutritiva (sin Na+, 1 mM K+). A las 3 semanas, se transfirieron a medio nuevo, normal, suplementado con 20 mM LiCl o con 120 mM NaCl, y se fotografiaron a los 6 días. Figura R.2.21. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas transformadas con el alelo SOS1_ǻ998. Tras la germinación, plantas de las líneas indicadas se transfirieron a bandejas con solución nutritiva (sin Na + , 1 mM K + ). A las 3 semanas, se transfirieron a medio nuevo, normal, suplementado con 20 mM LiCl o con 120 mM NaCl, y se fotografiaron a los 6 días. R.2.6 Determinación de los contenidos iónicos. Para comprobar si los fenotipos observados se debían a diferencias en la acumulación de los cationes K + , Li + y Na + , se procedió a la determinación de los contenidos iónicos en parte aérea. Los iones de las muestras desecadas se extrajeron añadiendo la cantidad fija de 1 ml de agua milli-Q e incubando durante 1 hora a 95ºC. El extracto se diluyó a una concentración IV. Resultados. adecuada en agua milli-Q y se determinaron los contenidos de K + , Li + y Na + utilizando un espectrómetro de absorción atómica (ver apartado M.7.5.). Los contenidos de K + mostraron gran variabilidad dentro de una misma línea, indicando poca uniformidad en el ensayo realizado con alelos de clase I (Figura R.2.22. (b)). En general todas las líneas mostraron unos contenidos sin diferencias significativas ni entre sí ni entre tratamientos, descartando tanto el papel de SOS1 en la toma de este catión como la implicación del efecto deletéreo de los cationes tóxicos sobre la toma de K + en las ligeras diferencias fenotípicas observadas. La sobreexpresión del alelo silvestre SOS1 redujo ligeramente la acumulación de Li + en la parte aérea (Figura R.2.22. (c)), efecto que fue un poco mayor en las líneas transformadas con SOS1_E261K. Aunque en las líneas transformadas con SOS1_A399V se vio una mayor acumulación de Li + , el mayor cociente K + :Li + (Figura R.2.24 (c)) podría explicar la ligera halotolerancia observada. La sobreexpresión de SOS1 redujo la acumulación de Na + con respecto a la línea silvestre en el tratamiento con 120 mM NaCl (Figura R.2.22. (d)). En consonancia con la falta de halotolerancia conferida por los alelos SOS1_E261K y SOS1_A399V, la acumulación en las líneas transformadas con ellos fue mayor que en el control positivo, efecto que se vio más claramente al representar el cociente K + :Na + (Figura R.2.24 (d)). Figura R.2.22. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas sobreexpresantes transformadas con los alelos SOS1_A399V y SOS1_E261K. Al finalizar el tratamiento (figuras R.2.18. y R.2.19.), se tomaron muestras de la parte aérea de las plantas y se determinó su peso fresco. Las muestras se incubaron durante 5 h en estufa a 65 ºC y se determinó su peso seco. El porcentaje de agua al final del tratamiento (a) se obtuvo dividiendo entre el peso fresco la diferencia entre los pesos fresco y seco. Para la extracción de iones, se añadió 1 ml de agua de calidad milli-Q a las muestras y se incubaron a 95ºC durante 1 h. Con diluciones del extracto se midieron en un espectrómetro de absorción atómica los contenidos de K + (b), Li + (c) y Na + (d) y se calculó el porcentaje que cada uno representaba en el peso seco de la muestra.. En el experimento realizado con alelos de clase II, volvió a verse una gran variabilidad dentro de cada línea en la acumulación de K + (Figura R.2.23 (b)). Mientras los contenidos fueron similares para todas las líneas entre sí y entre el tratamiento control y con 20 mM LiCl, el tratamiento con 120 mM NaCl sí mostró una clara reducción en la acumulación de K + en todas las líneas. Puesto que la duración y concentración salina del tratamiento fueron las mismas que en el caso de los alelos de clase I, estas diferencias parecen ser de tipo experimental (ej: la distinta posición de la bandeja en la cámara de cultivo indujo una mayor transpiración de las plantas). Los contenidos de Li + mostraron menos diferencias entre líneas que en el experimento anterior (Figura R.2.23 (c)), incluso al representar el cociente K + :Li + (Figura R.2.24 (c)). Las IV. Resultados. medidas para la acumulación de Na + (Figura R.2.23. (d)) no mostraron diferencias acordes con los fenotipos observados, indicando un posible error en las condiciones del experimento. Figura R.2.23. Tratamiento con LiCl y NaCl en medio hidropónico para las líneas sobreexpresantes transformadas con los alelos SOS1ǻ998 y SOS1_P985S. Al finalizar el tratamiento (figuras R.2.21. y R.2.22.), se tomaron muestras de la parte aérea de las plantas y se determinó su peso fresco. Las muestras se incubaron durante 5 h en estufa a 65 ºC y se determinó su peso seco. El porcentaje de agua al final del tratamiento (a) se obtuvo dividiendo entre el peso fresco la diferencia entre los pesos fresco y seco. Para la extracción de iones, se añadió 1 ml de agua de calidad milli-Q a las muestras y se incubaron a 95ºC durante 1 h. Con diluciones del extracto se midieron en un espectrómetro de absorción atómica los contenidos de K + (b), Li + (c) y Na + (d). Figura R.2.24. Cocientes K + :Li + y K + :Na + . Se calcularon los cocientes K + :Li + (a y c) y K + :Na + (b y d) al finalizar los tratamientos con las plantas transformadas con los alelos SOS1_E261K y SOS1_A399V (a y b) y SOS1_P985S y SOS1ǻ998 (c y d). IV. Resultados. R.2.7 Rastreo de alelos hiperactivos de SOS1 en Arabidopsis. Puesto que los alelos hiperactivos aislados en levadura no mantuvieron, en general, su fenotipo de mayor tolerancia a Na + in planta, se decidió realizar un nuevo rastreo de alelos hipermorfos directamente en Arabidopsis para evitar el problema de la no reproducibilidad de los fenotipos hallados en levadura. La transformación con genotecas de cDNA puede producir fenotipos dominantes de pérdida de función por cosupresión de genes mediante sobreexpresión de cDNAs truncados o antisentido (LeClere y Bartel, 2001). Esta posible desventaja se superó con el diseño del sistema FOX (Full-length cDNA Overexpresser), de expresión de cDNAs completos bajo el control del promotor CaMV35S (Ichikawa et al., 2006; Nakamura et al., 2007). Sin embargo, la activación constitutiva de genes puede interferir en la proliferación y desarrollo celular, produciendo plantas enanas y/o estériles (Kasuga et al., 1999; Gilmour et al., 2000). El sistema COS (Controlled cDNA Overexpression System) se creó para evitar los problemas derivados de la activación constitutiva de genes. El plásmido pER8 contiene el activador transcripcional inducible por estradiol XVE, construido mediante la fusión del dominio de unión a DNA del represor bacteriano LexA, el dominio acídico transactivador de VP16 y la región reguladora del receptor humano de estrógenos. En plantas de tabaco y Arabidopsis transformadas con el gen marcador GFP controlado por el promotor 35S y clonado en este vector, la expresión del transgén se vio estrictamente controlada por la adición de estradiol al medio, no observándose niveles del transcrito detectables en ausencia de esta hormona (Zuo et al., 2000). El vector pER8-GW, versión Gateway del anterior, se utilizó para identificar varios cDNAs que conferían fenotipos dominantes de resistencia a estrés en tres rastreos distintos: tolerancia a sal, insensibilidad a ABA y activación del gen ADH1-LUC inducida por estrés (Papdi et al., 2008). En nuestro rastreo, se utilizó el sistema COS en la búsqueda de alelos hiperactivos de SOS1 in planta (Figura R.2.25), empleándose la tecnología Gateway ® para la construcción de la genoteca. El cDNA completo de SOS1 se amplificó por PCR con los oligonucleótidos attB1- SOS1_f y attB2-SOS1_r, que le unen los sitios attB en ambos extremos (ver apartados M.2.6.6. y M.2.5.). El producto de PCR se purificó mediante centrifugación con TE y una solución 30% PEG y 30 mM MgCl 2 para eliminar los oligonucleótidos y se transfirió, mediante recombinación mediada por BP clonasa™ (Invitrogen), al plásmido con sitios attP, pDONR™201. El cDNA clonado en este vector se propagó en la cepa mutagénica de E. coli XL1-Red (ver apartado M.2.7.), recuperándose una población de cDNA mutagenizado aleatoriamente de aproximadamente 100,000 colonias independientes. Para estimar la tasa de mutagénesis debida a la propagación del plásmido en la cepa de E. coli XL1-Red, se transformaron células competentes de E. coli XL10 Gold con la genoteca mutagenizada y se seleccionaron 48 colonias independientes de transformantes. Una vez extraído el plásmido, se secuenció el extremo 5’ del cDNA utilizando el oligonucleótido pDONR_f y se contaron las mutaciones (8 en IV. Resultados. un total de ~24000 pb secuenciadas), estimándose una tasa mutagénesis de 1 mutación por cada 3000 pb. Puesto que el cDNA de SOS1 tiene una longitud de 3.4 kb, se espera aproximadamente 1 mutación en el cDNA de cada plásmido independiente. La genoteca se transfirió, por recombinación entre sitios attL y attR con LR clonasa™ (Invitrogen), al vector de sobreexpresión controlada de cDNA pER8-GW, portador de sitios attR. Mediante el uso de la cepa de Agrobacterium GV3101, se realizó una transformación a gran escala de plantas silvestres de Arabidopsis Col-0 gl1 con la colección de alelos mutantes clonada en este vector (ver apartados M.4.2.4. y M.4.4.). La descendencia T1 proveniente de la transformación se recolectó y se seleccionaron individuos por su tolerancia a NaCl (Figura R.2.25). Unas 900,000 semillas T1 se sembraron en medio MS suplementado con 25 µg/ml de higromicina B y se incubaron a temperatura ambiente y con baja iluminación. Las plántulas transgénicas (unas 20,000), seleccionadas a los 7 días por presentar el hipocotilo elongado, se transfirieron a MS suplementado con 200 mM de NaCl y 4 µM de estradiol. A los 4 días, las plántulas con cotiledones verdes (unas 150) se transfirieron a MS normal, donde se dejaron crecer durante 2 días, y finalmente a tierra para obtener su descendencia por autofecundación (ver apartados M.1.3.2. y M.1.3.3.). Figura R.2.25. Transformación de Arabidopsis con genoteca de SOS1 mutado aleatoriamente. El producto de PCR attB-SOS1, después de ser clonado por recombinación BP en el vector pDONR201, se propagó en la cepa mutagénica de E. coli XL1-Red. Se obtuvo así una genoteca de alelos con mutaciones al azar, que se clonó por recombinación LR en el vector de sobreexpresión controlada de cDNA pER8-GW. Esta genoteca, una vez introducida en A. tumefaciens, se utilizó para realizar una transformación a gran escala de plantas silvestres de Arabidopsis Col-0 gl1. Una vez obtenida la descendencia T2, se procedió a la confirmación de fenotipos mediante la repetición del procedimiento seguido para la T1, si bien debido a la menor densidad de plántulas por placa se redujo la concentración de NaCl de 200 a 150 mM. Para descartar transformantes en los que la mayor halotolerancia se debiera al propio proceso de transformación, que es mutagénico, y no a la sobreexpresión de un alelo hiperactivo de SOS1, IV. Resultados. las plántulas se transfirieron también a MS con NaCl pero sin estradiol, eliminándose las líneas para las que el fenotipo se mantenía en este medio. Se cuantificó la tolerancia a sal, expresándose tanto en porcentaje de plantas con algún cotiledón verde como en porcentaje de cotiledones verdes dentro del total, y se seleccionaron 7 líneas en las que estos parámetros fueron mayores del 50% (Figura R.2.26 (a) y (b)). Figura R.2.26. Rastreo de semillas para identificar alelos hiperactivos de SOS1. Las semillas provenientes de la transformación se sembraron en medio con 25 µg/ml de higromicina y se incubaron con poca iluminación durante 6 días, seleccionándose las plántulas transgénicas por presentar hipocotilo elongado (a). Éstas se transfirieron a medio MS suplementado con NaCl 200 mM y estradiol 4 µM para inducir la expresión del cDNA. A los 4 días, se seleccionaron las plántulas con cotiledones verdes (b) y se transfirieron a tierra para propagar las líneas transgénicas. Tras obtener la F2 (c), se repitió el procedimiento visto en (a) y (b) para confirmar fenotipos de halotolerancia. Se incluyó también un control sin estradiol para descartar líneas en las que la halotolerancia podría estar debida a la inserción del transgén y no a la expresión del cDNA de SOS1. R.2.8 Secuenciación del transgén en los candidatos seleccionados. Se extrajo DNA genómico de las 7 líneas seleccionadas (ver apartado M.2.1.2) y se amplificó el cDNA completo del transgén por PCR con la pareja de oligonucleótidos específicos del vector pER8-GW ER8A_f/ER8B_r y la polimerasa iProof ™ High-Fidelity DNA Polymerase. La banda de 3.4 kb se cortó de un gel de agarosa y se purificó (ver apartados M.2.4 y M.2.5), secuenciándose el producto completo con los oligonucleótidos ER8A_f, NHE4P1_f, SOSDN_f, SOS1+1326_f, SOS1Xho_f, SOS1A_f, SOS1B_f y 998BamHI_f. Los resultados se analizaron con el programa Seqman incluido en el paquete informático DNA Star. IV. Resultados. Figura R.2.27. Confirmación de la halotolerancia de las líneas seleccionadas. Las líneas F2 procedentes de plantas F1 seleccionadas se evaluaron por para confirmar su halotolerancia. Para ello, se sembraron las semillas en medio con 25 µg/ml de higromicina y se incubaron con poca iluminación durante 6 días, seleccionándose las plántulas transgénicas por presentar hipocotilo elongado. Éstas se transfirieron a medio MS suplementado con NaCl 150 mM y estradiol 4 µM para inducir la expresión del cDNA. A los 4 días, se fotografiaron las plantas y se evaluó la halotolerancia de las distintas líneas contando el número de cotiledones verdes y se descartaron aquéllas en las que este porcentaje fuera inferior al 50%. Se incluyó también un control sin estradiol para descartar líneas en las que la halotolerancia podría estar debida a la inserción del transgén y no a la expresión del cDNA de SOS1. El cDNA del transgén se amplificó con la pareja de oligonucleótidos específicos del vector pER8-GW ER8A/ER8B y la polimerasa de alta fidelidad iProof, se purificó la banda de un gel de agarosa y se secuenció el cDNA completo. (a) Comparación de la línea tolerante 77 con una que no lo es (73) en medio con 150 mM NaCl, con y sin estradiol. (b) Tabla en la que se muestran las distintas líneas seleccionadas, sus porcentajes de supervivencia (expresados como porcentaje de plantas con algún cotiledón verde y como porcentaje de cotiledones verdes al finalizar el tratamiento) y las mutaciones identificadas en los cDNAs. Una representación de la proteína SOS1 con la localización de todas las mutaciones puede verse en la figura R.2.28. En 5 de las 7 líneas (3, 15, 33, 72 y 77) se observó una mutación de la guanina en la posición 2020 a adenina, produciendo una transición del aminoácido valina a isoleucina en la posición 714, cerca del dominio putativo de unión a nucleótidos cíclicos (CNBD, del inglés Cyclic Nucleotide Binding Domain), lo que posiblemente esté impidiendo la interacción de éste con el dominio carboxiterminal autoinhibitorio y manteniendo a la proteína constitutivamente activa. Interesantemente, la mutación de una valina a isoleucina, esta vez en el inicio del dominio CNBD, también se aisló en nuestro laboratorio en el rastreo de alelos hiperactivos de SOS1 en levadura, así como repetidas veces entre los segmentos transmembrana 8 y 12 en un rastreo de mutantes de NHX1 tolerantes a NaCl y LiCl (Hernández et al., 2009). En la línea número 5, la mutación de adenina a guanina produjo un cambio del ácido glutámico en la posición 261, presumiblemente situado en el IV. Resultados. segmento transmembrana número 7, a glicina. Cabe destacar que aunque el fenotipo no se repitió en planta, una mutación en este aminoácido ya había sido identificada en el rastreo realizado en levadura en nuestro laboratorio (Quintero et al., 2011), demostrando su importancia para la función de la proteína. Finalmente, la línea número 26 contiene un cambio de timina por citosina en la posición 3163, mutando la fenilalanina de la posición 1055 a leucina. Si bien en el rastreo realizado en levadura no se encontró ninguna mutación tan aguas abajo, la mayoría de alelos de clase II aislados consistían en mutaciones en el dominio autoinhibitorio. Puesto que este aminoácido se encuentra también situado en este dominio, la mutación estaría impidiendo la interacción de este dominio con el CNBD, codificándose también una proteína constitutivamente activa. Figura R.2.28. Representación de las mutaciones aisladas dentro de la proteína. Se muestra la estructura de SOS1, indicándose las tres mutaciones aisladas en el rastreo.    V. DISCUSIÓN. D.1. Intervención del antiportador Na + /H + SOS1 en la homeostasis de K + . Aunque se ha avanzado mucho en el conocimiento de la ruta SOS, los esfuerzos se han centrado en investigar la estructura, función y regulación de SOS1 por SOS2 y SOS3 en relación con el transporte de Na + y su contribución a la tolerancia salina, mientras que el fenotipo de los mutantes sos de déficit de crecimiento en medios pobres en K + encontrado en el primer rastreo no ha sido, generalmente, estudiado en detalle. Sólo un estudio de Qi y Spalding (2004) relacionaba la presencia de una proteína SOS1 funcional con la toma de K + a través de AKT1, ya que al inhibirse este canal en presencia de concentraciones moderadas de Na + en la raíz, se impedía la adquisición de K + de una forma mucho más severa en la línea mutante sos1 que en plantas silvestres sometidas a tratamiento salino. Posteriormente, la supresión por parte de AtSOS1 del fenotipo de un mutante de E. coli deficiente en la toma de K + (Garciadeblás et al., 2007) demostraba el transporte directo de este catión por SOS1 en bacteria, aunque se sugería que este efecto podría deberse a su expresión heteróloga. A la vista de estos antecedentes, y puesto que tanto las sales MS como el bacto-agar contienen trazas de Na + , se postuló en nuestro laboratorio, en concordancia con la hipótesis de Qi y Spalding, que el Na + presente como contaminante en los medios de cultivo podría ser suficiente para acumularse en la raíz del mutante sos1, produciendo la inhibición de AKT1 y el subsiguiente fenotipo de bajo crecimiento en medios pobres en K + . Con la formulación de una solución nutritiva basada en la de Hewitt y Notton (1966)(apartado R.1.1) con ausencia total de Na + y una concentración de K + de 1 mM, se confirmó la implicación del Na + en el fenotipo del mutante sos1 a baja concentración de K + . La línea mutante sos1-1 crecía igual que la silvestre Col-0 gl1 en ausencia de Na + , mientras que la adición de este catión producía un severo fenotipo de reducción de crecimiento que sólo pudo ser atenuado parcialmente aumentando la concentración de K + en el medio a 10 mM (Figura R.1.1). El resultado anterior descartaba que SOS1 interviniera de forma directa en la toma de K + , y era compatible con la teoría propuesta por Qi y Spalding, pero no demostraba que AKT1 fuera el transportador implicado. En una aproximación más completa y directa (apartado R.1.3), además de aumentar el rango de concentraciones de K + en los medios de cultivo, se decidió incluir la línea mutante para AKT1, así como el doble mutante akt1 x sos1, que se obtuvo por cruzamiento clásico entre las líneas sos1-1 y akt1-2 (Figura R.1.2). Los fenotipos de la línea mutante sos1-1 y la silvestre Col-0 gl1 se mantuvieron en presencia de Na + 5 mM (Figura R.1.3). La línea mutante akt1-2 mostró una ligera disminución de su crecimiento en los medios suplementados con 100 µM y 1 mM de K + , precisamente el rango de actuación de AKT1 (Lagarde et al., 1996; Hirsch et al., 1998), mientras que el doble mutante akt1 x sos1 creció peor que el mutante sos1-1 y mucho peor que el akt1-2 en todas las condiciones, indicando un efecto aditivo de ambas mutaciones. Este resultado, junto con la debilidad del fenotipo de la mutación akt1-2 en condiciones de déficit de K + respecto al de sos1-1 en presencia de Na + , demostraba que la hipotética inhibición de AKT1 por el exceso de Na + no era la principal causa    toxicidad y transportadores (Wu et al., 1996; Serrano et al., 1999; Nublat et al., 2001). Puesto que muchos antiportadores Na + /H + similares a AtSOS1 muestran afinidad también por Li + en función de la presencia de ciertos dominios y aminoácidos, incluyendo OsSOS1 y TdSOS1, clonados en nuestro laboratorio, se decidió realizar experimentos para caracterizar los distintos alelos mutantes también frente a este otro catión (Apartado R.2.2). Tanto en ensayos de germinación (Figuras R.2.10 a R.2.13) como de cultivo en medio líquido (Figuras R.2.14 a R.2.17), varias de las líneas independientes transformadas con los 4 alelos produjeron un incremento en la halotolerancia mayor que el conseguido mediante la sobreexpresión del alelo silvestre, siendo en general mejores los resultados obtenidos con los alelos de clase I que con los de clase II. Aunque existen diferencias en el nivel de tolerancia a Li + entre líneas transformadas con el mismo alelo, la cuantificación del nivel de expresión del transgén mediante RT-PCR semicuantitativa descarta que se deban a diferencias en la transcripción, por no haberse encontrado una correlación clara entre nivel de acumulación del mRNA correspondiente al transgén y la tolerancia a Li + (Figuras R.2.14 (c) a R.2.17 (c)). La mayor tolerancia a Li + mostrada por plantas silvestres sobreexpresando distintos alelos de SOS1 sugiere que la proteína SOS1 presenta cierta afinidad por este catión in planta. NHX8, el único transportador específico de Li + que se conoce en Arabidopsis, no muestra alteraciones en su nivel de expresión en los mutantes sos (Gong et al., 2001; An et al., 2007) y el K + , cuyo papel en el mantenimiento de la homeostasis iónica es sobradamente conocido (Niu et al., 1995; Hasegawa et al., 2000; Serrano y Rodríguez-Navarro, 2001; Zhu et al., 2003; Gierth et al., 2007), no constituye un sustrato de SOS1 como demuestran ensayos de transporte y experimentos en levadura (Quintero et al., 2002; Shi et al., 2002), así como los tratamientos en medio hidropónico expuestos en el apartado R.1 de la presente Tesis, por lo que los fenotipos observados parecen debidos a la capacidad de SOS1 de transportar Li + . La capacidad de SOS1 para utilizar el Li + como sustrato se había subestimado hasta la fecha (Quintero et al., 2002; Shi et al., 2002) porque posiblemente requiera proteínas reguladoras o sistemas de modificación post-transcripcional y post-traduccional, ausentes tanto en proteoliposomas artificiales como en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La afinidad de SOS1 por Li + , presumiblemente más baja que la mostrada por el Na + , sería compensada por la mayor cantidad de esta proteína debida a su sobreexpresión constitutiva y, adicionalmente, a las mutaciones que la volverían más activa y/o afín por este catión tóxico. Puesto que las plantas cultivadas in vitro reducen su tasa de transpiración y con ello su acumulación de iones en la parte aérea (Flowers, 2004), se realizó también la caracterización de los 4 alelos en medio hidropónico (Apartado R.2.4) para obtener un conocimiento más preciso de su contribución a la homeostasis iónica. El uso de solución suplementada con 1 mM de K + permite determinar la posible implicación del antiportador SOS1 no sólo en la respuesta a estrés salino sino también en el mantenimiento de la homeostasis potásica. Nuevamente, mientras los 4 alelos mostraron mayor tolerancia que el control positivo en los tratamientos con LiCl 20 mM, sólo la línea transformada con SOS1 ∆ 998 aportó un mayor grado de halotolerancia en medio con NaCl 120 mM (Figuras R.2.18 a R.2.22). La medida del contenido    en agua al final del tratamiento permitió cuantificar de una forma más clara estas diferencias en los fenotipos, validándose los resultados obtenidos in vitro. Los contenidos de K + fueron similares para todas las líneas y tratamientos (Figuras R.2.20 (b) y R.2.23 (b)), con una ligera reducción de su acumulación en las plantas tratadas con Na + debido a la gran cantidad a la que este ión se añadió a la solución nutritiva (120 mM). La similitud de contenidos entre líneas descarta nuevamente el papel de SOS1 en la adquisición de K + , mientras que la similitud entre tratamientos demuestra que el efecto deletéreo de los mismos se debe a la toxicidad de los iones y no a su interferencia con la adquisición de K + . Además, los contenidos de K + se han utilizado para reducir las diferencias entre medidas individuales mediante la obtención de los cocientes K + :Li + y K + :Na + . El menor contenido de Li + en la parte aérea de las plantas sobreexpresando algún alelo de SOS1 no sólo vuelve a demostrar la afinidad de la proteína por este catión in planta, sino también que la mejor tolerancia se consigue principalmente mediante su expulsión a través de la raíz y no su compartimentación en la parte aérea, posiblemente debido a que la baja concentración a la que se añade el Li + no llega a saturar la capacidad de la raíz para expulsarlo (Figura R.2.20 (c) y R.2.23 (c)). En concordancia con el mejor comportamiento observado en varias de las líneas transformadas con los distintos alelos mutantes, la acumulación de Li + fue en general menor en las líneas transformadas con estos alelos que en el control positivo sobreexpresando el alelo silvestre. En algunos casos, se pudo observar más claramente la mejor homeostasis iónica de algunas líneas al representar el cociente K + :Li + (Figura R.2.24 (a) y (c)). El análisis de los contenidos en Na + produjo resultados contradictorios al compararse los dos experimentos. En el experimento realizado con los alelos de clase I, la peor tolerancia a este catión mostró correlación con su mayor acumulación en las plantas transformadas con los alelos SOS1_A399V y SOS1_E261K (Figura R.2.20 (d)), lo que se aprecia más claramente al representar el cociente K + :Na + (Figura R.2.24 (b)). Las plantas transgénicas acumularon Na + a niveles comparables a los de la línea silvestre Col-0 gl1, sugiriendo que estas mutaciones reducen la afinidad de la proteína por el Na + en favor del Li + . En el experimento realizado con los alelos de clase II, el tratamiento con Na + 120 mM produjo una reducción en la toma de K + que fue ligeramente mayor que la observada en el experimento anterior, mientras las plantas tomaron una mayor cantidad de Na + . Puesto que tanto la composición de los medios como la duración del tratamiento fueron iguales en ambos experimentos, estas diferencias podrían deberse a la distinta posición de las bandejas dentro de la cámara de cultivo, habiéndose aumentado en consecuencia la tasa de transpiración de las plantas y con ello la acumulación de Na + , con efecto inhibidor sobre la toma de K + . Debido a estas diferencias experimentales, los contenidos en Na + fueron distintos a los del experimento realizado con los alelos de clase I (Figura R.2.23 (d)). La línea silvestre Col-0 gl1 mostró un contenido en este catión menor que el control positivo sobreexpresando SOS1 y los fenotipos de las líneas transformadas con los alelos de clase II (ligera halotolerancia para el alelo SOS1 ∆ 998 y sensibilidad para SOS1_P985S) no se vieron correlacionados con la acumulación de este catión. La mayor    transpiración de las plantas, que como hemos visto produjo una reducción en el cociente K + :Na + , podría haber facilitado la acumulación de Na + a concentraciones letales en las líneas más sensibles antes de finalizar el tratamiento, mientras que las más resistentes acumularían este catión a menor velocidad y lo tolerarían en mayor concentración, creciendo durante más tiempo. A raíz de este dato, conviene analizar cautelosamente los resultados obtenidos para los alelos de clase II, ya que aunque ambos muestran menor acumulación de Na + que el control positivo, este menor contenido podría ser la causa de la mayor tolerancia observada en el mutante SOS1 ∆ 998, que al igual que en levadura mostraría una mayor actividad antiportadora Na + /H + debido a la ausencia del dominio autoinhibitorio (Quintero et al., 2011), mientras que el fenotipo de sensibilidad de SOS1_P985S sugiere que, al igual que sucede en la línea silvestre, la acumulación de Na + produce un colapso en la planta que le impide seguir creciendo y acumulando iones. La búsqueda de alelos hiperactivos de SOS1 también se abordó directamente in planta, mediante la transformación a gran escala de plantas silvestres de Arabidopsis con una genoteca de cDNA de SOS1 mutagenizado aleatoriamente mediante su propagación en la cepa de E. coli XL1-Red y clonado en el vector de sobreexpresión controlada de cDNA pER8- GW (Papdi et al., 2008). De una población de 900,000 semillas T1, se aislaron 150 líneas de plantas capaces de germinar en medio MS suplementado con NaCl 200 mM, de las cuales 7 mantuvieron el fenotipo al ser reevaluada su descendencia T2. Se amplificó el cDNA de SOS1 con el que se había transformado cada una de las líneas seleccionadas y se purificó la banda para secuenciar el cDNA completo. En 5 de las 7 líneas (3, 15, 33, 72 y 77) se observó una mutación de la guanina en la posición 2020 a adenina, produciendo una transición del aminoácido valina a isoleucina en la posición 714. Ambos aminoácidos son hidrofóbicos, neutros y con cadenas laterales alifáticas ramificadas, diferenciándose sólo en el mayor tamaño de ésta en la isoleucina. Aunque son muy poco reactivos, la estructura rígida de sus cadenas laterales restringe la conformación que puede adoptar la cadena peptídica. Por otra parte la mutación se encuentra próxima al dominio putativo de unión a nucleótidos cíclicos (CNBD, del inglés Cyclic Nucleotide Binding Domain) (Quintero et al., 2011). La sustitución de valina por isoleucina podría alterar la morfología de la proteína en la cercanía de esta región, dificultando la interacción de este dominio con el carboxiterminal autoinhibitorio y manteniendo a SOS1 constitutivamente activa. La colección de mutantes podría haberse enriquecido artificialmente en esta mutación debido a la selección de distintas semillas provenientes del mismo evento de transformación o a una mayor proliferación de las células de Agrobacterium portadoras de esta construcción. En la línea número 5, la mutación de adenina a guanina produjo un cambio del ácido glutámico en la posición 261 a glicina. Este aminoácido, muy conservado en proteínas SOS y predeciblemente situado en el segmento transmembrana número 7, ya había sido aislado en el rastreo en levadura (Quintero et al., 2011), resaltando su importancia en la función de la proteína. Mientras en el alelo seleccionado en levadura la carga positiva de este aminoácido se vio sustituida por la carga negativa de la lisina, en este caso se da una sustitución por un aminoácido pequeño y sin carga. Quizás estos cambios en la carga    de los aminoácidos determinen que, in planta, las proteínas mutantes muestren mayor afinidad por Li + o Na + . Finalmente, la línea número 26 contiene un cambio de timina por citosina en la posición 3163, mutando la fenilalanina de la posición 1055 a leucina. Aunque ambos aminoácidos son de carga neutra, la gran diferencia de tamaños entre las cadenas laterales sugiere un efecto estérico sobre la estructura de la proteína. Dada la posición de esta mutación en la cercanía del dominio autoinhibitorio carboxiterminal de SOS1 (Quintero et al., 2011), la sustitución de fenilalanina por leucina podría impedir la interacción de este dominio con el dominio CNBD, manteniendo la proteína constitutivamente activa.    VII Conclusiones    VII CONCLUSIONES.    1. El fenotipo de sensibilidad a bajo K + descrito para los mutantes sos1 es condicional a la presencia de Na + en el medio, comportándose éstos como la línea silvestre en ausencia de este catión. 2. El doble mutante akt1 sos1 se comporta como un mutante simple akt1 en ausencia de Na + pero su fenotipo es más severo que el de ambos mutantes simples en presencia de este catión. 3. El fenotipo observado en el mutante sos1 en medios pobres en K + y presencia de Na + no se debe a una menor acumulación de K + , sino a una reducción en el cociente K + :Na + . 4. Aunque los 4 candidatos a alelos hiperactivos ensayados son capaces de complementar al mutante sos1-1, sólo SOS1_ ∆ 998 es capaz de mejorar en la línea silvestre la halotolerancia conseguida mediante la sobreexpresión del cDNA de SOS1. 5. Los 4 alelos ensayados mejoraron en cierto grado la tolerancia de la línea silvestre a Li + , siendo el efecto mayor para los alelos SOS1_A399V y SOS1_E261K. 6. En un rastreo realizado in planta, se aislaron por su mayor tolerancia a NaCl los alelos mutantes SOS1_E261G, SOS1_V714I y SOS1_F1055L. 7. El ácido aspártico en la posición 201 de SOS1 es esencial para la tolerancia a Na + en mutantes halosensibles de levadura y Arabidopsis. 8. El alelo mutante SOS1_D201N es también incapaz de suprimir los fenotipos del mutante sos1-1 con respecto al estrés oxidativo. VII. Bibliografía.    VII. BIBLIOGRAFÍA Achard, P., Cheng, H., De Grauwe, L., Decat, J., Schoutteten, H., Moritz, T., Van der Straeten, D., Peng, J., Harberd, N.P. (2006). Integration to plant responses to environmentally activated pytohormonal signals. Science 311, 91. Achard, P., Gong, F., Cheminant, S., Alioua, M., Hedden, P. Genschik, P. (2008a) The coldinducible CBF1 factor-dependent signaling pathway modulates the accumulation of the growth-repressing DELLA proteins via its effect on gibberellin metabolism.Plant Cell 20, 2117–2129. Achard, P., Renou, J.P., Berthome, R., Harberd, N.P. and Genschik, P.(2008b) Plant DELLAs restrain growth and promote survival of adversityby reducing the levels of reactive oxygen species. Curr. Biol. 18, 656–660. Ache, P., Becker, D., Ivashikina, N., Dietrich, P., Roelfsema, M.R., Hedrich, R. (2000). GORK, a delayed outward rectifier expressed in guard cells of Arabidopsis thaliana, is a K + -selective, K + -sensing ion channel. 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