Determinación del daño genotóxico y oxidativo en el ADN de células caco-2 tras la exposición a cilindrospermopsina

TRABAJO FIN DE GRADO “DETERMINACIÓN DEL DAÑO GENOTÓXICO Y OXIDATIVO EN EL ADN DE CÉLULAS CACO-2 TRAS LA EXPOSICIÓN A CILINDROSPERMOPSINA” Lourdes López Gil Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Julio 2017 ~ 1 ~ Trabajo Fin de Grado de carácter experimental Grado en Farmacia “DETERMINACIÓN DEL DAÑO GENOTÓXICO Y OXIDATIVO EN EL ADN DE CÉLULAS CACO-2 TRAS LA EXPOSICIÓN A CILINDROSPERMOPSINA” Tutoras: Dra. Ángeles Jos Gallego y Dra. María Puerto Rodríguez Área de Investigación: Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Área de Toxicología Lourdes López Gil 6 de julio de 2017 ~ 2 ~ Resumen Las cianobacterias se encuentran distribuidas globalmente, siendo las aguas dulces su hábitat más común. Dichos microorganismos son capaces de sintetizar numerosos metabolitos, entre ellos los denominados cianotoxinas. Dentro de dichas toxinas destaca la Cilindrospermopsina (CYN), cianotoxina emergente de los últimos años, siendo responsable de episodios hepatoentéricos en Australia y Brasil. La CYN, con una estructura de alcaloide tricíclico, posee distintos mecanismos de acción, tales como la inhibición de la síntesis de proteínas y del glutatión, el incremento de especies reactivas de oxígeno y la capacidad para actuar como agente genotóxico. Sin embargo, hasta la fecha, estudios que se centren en la determinación de sus efectos genotóxicos y epigenéticos son escasos y contradictorios. Es por ello, que el presente trabajo indaga acerca del potencial genotóxico de la CYN, usando como modelo experimental la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco- 2, la cual se expuso a concentraciones de CYN de 0, 0,625, 1,25 y 2,5 μg/ml durante 24 y 48 h. Se ha utilizado el ensayo cometa estándar, para la evaluación del daño genotóxico directo, y su versión modificada con las enzimas Formamido pirimidina ADN glicosilasa (FPG) y Endonucleasa III (Endo III). Estas enzimas permiten reconocer las bases del material genético que se hayan oxidado, evaluando de esa forma el proceso de oxidación de las bases púricas y pirimidínicas, respectivamente. Los resultados obtenidos mostraron que la CYN no produce daño genotóxico directo en la hebra de ADN de las células Caco-2 a ninguna de las concentraciones de exposición empleadas. Del mismo modo, la incubación con las enzimas de restricción no mostró oxidación en las hebras de ADN. Estos resultados son de gran utilidad para esclarecer el perfil toxicológico de esta cianotoxina emergente. Sin embargo, sería necesario completar dicho estudio con otros ensayos de genotoxicidad para confirmar los resultados negativos que hemos obtenido tras la exposición de Caco-2 a CYN. PALABRAS CLAVE: Cilindrospermopsina, genotoxicidad, daño oxidativo, ensayo cometa. ~ 3 ~ Índice Índice ...................................................................................... 3 Introducción ........................................................................... 4 Objetivos .............................................................................. 11 Materiales y métodos .......................................................... 12 Suministros y productos químicos ......................................................... 12 Línea celular .......................................................................................... 12 Concentraciones de exposición de CYN ................................................. 12 Ensayo cometa ...................................................................................... 13 Realización del experimento ................................................................. 14 Estadística ............................................................................................. 16 Resultados ............................................................................ 17 Discusión .............................................................................. 20 Conclusiones ........................................................................ 24 Agradecimientos .................................................................. 25 Bibliografía ........................................................................... 26 Anexo I ................................................................................. 35 ~ 4 ~ Introducción Las cianobacterias son organismos procariotas fotosintéticos presentes prácticamente en cualquier ecosistema, tanto en hábitats acuáticos como terrestres, a excepción de aguas en las que no penetra la luz solar (Agrawal y Singh, 2000). Existen evidencias geológicas de su existencia desde hace 3,5 billones de años, lo cual significa que son una de las formas de vida más antiguas, y por tanto más evolucionadas, ya que se han ido adaptando según cambiaba el entorno que habitaban (Schopf, 2000). La proliferación de sus floraciones ha sido constatada en las aguas de todo el planeta, como consecuencia de un incremento observable de la eutrofización (Quesada y cols., 2006; Fathaili y cols., 2010; Messineo y cols., 2010). Cuando estas floraciones se desarrollan en aguas superficiales y potables, suponen un riesgo para la salud de los seres humanos y la sostenibilidad del medio ambiente (Schopf, 2000). Numerosas especies de cianobacterias han desarrollado la capacidad de sintetizar una amplia variedad de estructuras y metabolitos, conocidos con el nombre de cianotoxinas, la mayor parte de ellas con función desconocida, pero que han sido puestas de manifiesto como tóxicas para diferentes organismos (Welker y Von Döhren, 2006; Rezanka y Dembitsky, 2006; Smith y cols., 2008). Ya que, como se ha mencionado con anterioridad, las cianobacterias son uno de los grupos procariotas más antiguos y ampliamente distribuidos, se deduce que la biosíntesis de las cianotoxinas podría formar parte de una adaptación evolutiva para conseguir la supervivencia dentro del ecosistema (Rzymski y Poniedziałek, 2014). La clasificación de las cianotoxinas puede hacerse en base a cuatro grandes grupos: hepatotoxinas, neurotoxinas, citotoxinas y dermotoxinas (Carmichael y Li, 2006). En este trabajo, nos centraremos en una toxina que ha emergido recientemente como una de las cianotoxinas citotóxicas más importantes presentes en las aguas dulces de todo el mundo: la cilindrospermopsina (CYN) (De la Cruz y cols., 2013). Por su estructura, la CYN se incluye dentro del grupo de los alcaloides (Figura 1A). Esta toxina contiene un grupo guanidino tricíclico combinado con un grupo hidroximetiluracilo. La totalidad del esqueleto molecular de la CYN fue resuelto por ~ 5 ~ espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear por Othani y cols. en 1992. En lo referente a sus propiedades químicas, la CYN es un zwitterión o ión híbrido, es decir, un compuesto químico eléctricamente neutro pero que posee cargas formales positivas y negativas sobre átomos diferentes (Chiswell y cols., 1999). Esto hace que la toxina posea un carácter hidrofílico y sea estable a diferentes rangos de luz (incluida la luz ultravioleta), temperatura y condiciones de pH (De la Cruz y cols., 2013). Debido a su alta solubilidad en agua y su mínima tasa de biodegradación, cabe esperar que grandes cantidades de la toxina puedan ser encontradas en el agua (Wormer y cols., 2010). Este hecho fue observado por primera vez por Norris y cols. (2001) en un estudio experimental con cultivos de Cylindrospermopsis raciborskii. En diferencia a otras cianotoxinas tales como las microcistinas, la forma extracelular de la CYN predomina mayoritariamente sobre la forma intracelular (Buratti y cols., 2017). Además, ha sido declarada la existencia de dos isómeros naturales: 7- epicilindrospermopsina (7-epiCYN), epímero de CYN en el puente de hidroxilo (Figura 1B), y 7-deoxicilindrospermopsina (7-deoxiCYN), variante de CYN ausente de grupo hidroxilo en el carbono 7 (Figura 1C) (Pearson y cols., 2010). Posteriormente, se identificaron otras dos variantes de CYN: 7-desoxi-desulfo-CYN y 7-desoxi-desulfo-12- acetil-CYN, cuyas estructuras aún no se han dilucidado con exactitud (Wimmer y cols., 2014). ~ 6 ~ A. Cilindrospermopsina B. 7-epicilindrospermopsina C. 7-deoxicilindrospermopsina Figura 1. Estructuras de la CYN (A) y sus isómeros: 7-epicilindrospermopsina (B) y 7- deoxicilindrospermopsina (C) (De la Cruz y cols., 2013). La síntesis de CYN tiene lugar en numerosas especies de cianobacterias, siendo Cylindrospermopsis raciborskii (Figura 2) la mayor productora de CYN (Buratti y cols., 2017), y en otras en menor medida como Umezakia natans (Harada y cols., 1994), Aphanizomenon ovalisporum (Banker y cols., 1997), Anabaena bergii (Schembri y cols., 2001), Raphidiopsis curvata (Li y cols., 2001a), Aphanizomenon flos-aquae (Preußel y cols., 2006), Anabaena lapponica (Spoof y cols., 2006), y Lyngbya wollei (Seifert y cols., 2007). Existen evidencias de que dichas especies están ampliamente distribuidas por los cinco continentes (Moreira y cols., 2012). ~ 13 ~ distinguió como el marcador más sensible, cuyo valor de concentración efectiva media (EC50) fue 2,5 µg/ml. La EC50 se seleccionó como la mayor concentración de exposición de CYN, seguidas de EC50/2 y EC50/4. Las tres concentraciones elegidas para realizar el ensayo cometa fueron 2,5 μg/ml, 1,25 μg/ml y 0,625 μg/ml de CYN, las cuales se prepararon en disolución con medio MEM sin suero partiendo de un vial comercial de CYN cuya concentración era 1000 μg/ml. • Ensayo cometa El ensayo cometa, también conocido como electroforesis en gel de células individuales, se ha convertido en uno de los métodos más habituales para determinar daños en el ADN celular (Collins, 2004). El experimento permite detectar roturas de cadena, dobles o simples, y sitios lábiles del ADN de cualquier célula eucariota, y además, posibilita el análisis del daño genotóxico a nivel de células individuales (Azqueta y cols., 2014). Tal es la simplicidad, sensibilidad, versatilidad, rapidez y economía de esta técnica que se puede aplicar en estudios de genotoxicidad, biomonitorización humana y epidemología molecular (Collins, 2004). El principio básico del ensayo cometa se fundamenta en la capacidad de migración, en presencia de un campo eléctrico, de los fragmentos de ADN dañados con carga negativa a través de un gel de agarosa hacia el ánodo o polo positivo (Gunasekarana y cols., 2015). La imagen, obtenida en el microscopio de fluorescencia, se asimila a un cometa con la intensidad de la cola dependiente de la frecuencia y magnitud de las roturas producidas en la hebra de ADN, hecho que será indicativo de la genotoxicidad de la sustancia estudiada (Azqueta y cols., 2014) (Figura 3). Además, ciertas modificaciones pueden ser introducidas para detectar distintos tipos de daño genotóxico. Una de ellas es el uso de enzimas de restricción específicas, las cuales detectarán y cortarán la cadena de ADN en aquellos sitios donde se haya producido oxidación de bases nitrogenadas. Las enzimas de restricción usadas en el presente trabajo son: Fpg, la cual escindirá aquellas bases púricas que se hayan oxidado (Collins, 2004), tales como la 8-oxo-7,8-dihidro-2-deoxiguanosina, considerada como un marcador común de daño oxidativo en el ADN (Maatouk y cols., 2004; Andersson y ~ 14 ~ Hellman, 2005; Azqueta y cols., 2014), y Endo III, que detecta las bases pirimidínicas oxidadas (Collins, 2004). Figura 3. Imagen de un “cometa” observado al microscopio de fluorescencia. • Realización del experimento Las células Caco-2 fueron sembradas en placas de 24 pocillos con medio MEM sin SFB y, tras 24h, se expusieron a concentraciones de CYN crecientes (0-2,5 μg/ml) durante 24 ó 48 h. Además, un control negativo (medio sin SFB) y un control positivo (100 μM de H2O2 durante 5 minutos a 4ºC) fueron incluidos para monitorizar los ensayos. Tras el tiempo de exposición a la toxina (24 ó 48 h), el medio MEM fue retirado, y las células fueron lavadas con PBS, tripsinizadas y neutralizadas de nuevo con PBS. La disolución celular se centrifugó y el pellet fue resuspendido con PBS. Posteriormente, se llevó a cabo el ensayo de exclusión del colorante azul tripán para determinar una densidad celular exacta de 2,5 x 105 células/ml. La suspensión celular se mezcló con 140 μl de agarosa de bajo punto de fusión, y las células se sembraron en 12 gotas de 5 µl respectivamente, repartidas a lo largo del portaobjetos y solidificadas durante 5 min a 4º C. Los portas se sumergieron en solución de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Trizma, 1% Tritón, pH=10) durante toda la noche (Mellado-García y cols., 2015). Una vez retirada la solución de lisis, los portas son lavados 3 veces durante 5 minutos con tampón F (HEPES 40 mM, KCl 0,1 M, EDTA 0,5 mM, Albúmina de Suero Bovino 0,2 mg/mL, a pH 8,0 ajustado con 6 M KOH). Posteriormente, se procedió a la incubación de los dos primeros geles de cada portaobjetos con solución de lisis para la ~ 15 ~ realización del ensayo cometa estándar y con tampón F y enzimas de restricción el resto de los geles. Este último caso se realiza para determinar la oxidación de las bases púricas y pirimidínicas, mediante el ensayo cometa modificado (Figura 4). Las concentraciones de incubación de cada enzima fueron optimizadas, y se determinó que la enzima Fpg se incubaría a una concentración de 0,125 U/ml, y la enzima Endo III a una concentración de 18 U/ml. Figura 4. Esquema de un portaobjetos con todas las incubaciones realizadas en nuestro ensayo cometa. Seguidamente, los portaobjetos se incubaron a 37˚C durante 30 minutos. Pasado ese tiempo, se procedió a la desnaturalización de las células mediante la inclusión de los portaobjetos en solución de electroforesis (300 mM NaOH y 1 mM de EDTA) durante 20 minutos a 4˚C. Posteriormente se lleva a cabo la electroforesis, para que el ADN dañado de las células previamente desnaturalizadas migre hacia el polo positivo en respuesta al campo eléctrico al que se las somete, en las siguientes condiciones: a un voltaje de 25 V y a una intensidad de corriente entre 350-400 mA, durante 20 minutos a 4˚C (Llana-Ruiz-Cabello y cols., 2014). Finalizada la electroforesis, ~ 16 ~ se procedió a la neutralización de los núcleos mediante lavados con H2O destilada y PBS durante 10 min cada producto, y posterior deshidratación con etanol al 70% y etanol absoluto durante 15 minutos cada uno. Por último, el ADN fue teñido con Tampón TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, a pH 7,5) y SYBR Gold (Invitrogen, Termofisher, MA USA), y se visualizó con el microscopio de fluorescencia Olympus BX61 acoplado a un sistema de análisis de imagen (DP controller-DP manager) del Servicio de Microscopía del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación (CITIUS). Se seleccionaron al menos 100 núcleos de manera aleatoria por concentración, y éstos fueron analizados con un Software de Análisis de Imagen (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, UK). • Estadística Todos los experimentos fueron llevados a cabo al menos tres veces y en duplicado por concentración. El porcentaje de daño en el ADN se evaluó mediante el programa estadístico Graphpad instant®. El análisis estadístico se desarrolló utilizando el análisis de varianza ANOVA, seguido del test paramétrico Tukey-Kramer y el test no paramétrico Kruskal-Wallis. Las diferencias se consideraron significativas a partir de un valor de p < 0,05. ~ 17 ~ Resultados En el ensayo cometa estándar, los resultados obtenidos muestran que la CYN no produce rotura directa de la hebra de ADN en la línea celular humana Caco-2 a ninguna de las concentraciones ensayadas tras 24 o 48 h de exposición (Figura 5). Sin embargo, cuando las células fueron expuestas a 100 μM de H2O2, se observaron diferencias significativas del % de rotura de las hebras de ADN con respecto al control negativo, revelando la efectividad y validez del ensayo. Figura 5. Daño genotóxico directo producido por CYN a concentraciones de 0,625, 1,25 y 2,5 μg/ml tras 24 y 48 h de exposición. El marcador de genotoxicidad utilizado para evaluar las roturas del material genético fue el % de ADN en cola. Todos los valores se expresan como la media + s.d. * diferencias significativas con respecto al grupo control (p < 0,05). ~ 18 ~ Con respecto al daño oxidativo que la CYN podría producir en las bases pirimidínicas tras la incubación con la enzima Endo III, los resultados obtenidos no mostraron incremento del daño en el ADN tras 24 y 48h de exposición con respecto al grupo expuesto solo con tampón F (columnas no mostradas) a 24 y 48 h de exposición (Figura 6). Si observamos en el tratamiento de las células Caco-2 con H2O2 y posterior incubación con Endo III, diferencias significativas son observables en ambos tiempos de exposición. Figura 6. Daño genotóxico producido por el reconocimiento de las bases pirimidínicas oxidadas mediante la incubación con la enzima de restricción Endo III. Los niveles de oxidación de las bases pirimidínicas se expresaron como % de ADN en cola. Todos los valores se expresan como la media + s.d. * diferencias significativas con respecto al grupo control (p < 0,05). ~ 19 ~ Con respecto a la oxidación de las bases púricas tras la exposición a CYN y posterior incubación con la enzima Fpg, los resultados muestran la ausencia del daño oxidativo de dichas bases nitrogenadas tras 24 y 48 h de exposición (Figura 7). Sin embargo, sí se aprecian estas diferencias cuando las células son tratadas con H2O2 e incubadas con FPG. Figura 7. Daño genotóxico producido por el reconocimiento de las bases púricas oxidadas mediante la incubación con la enzima de restricción FPG. Los niveles de oxidación de las bases púricas se expresaron como % de ADN en cola. Todos los valores se expresan como la media + s.d. * diferencias significativas con respecto al grupo control (p < 0,05). ~ 20 ~ Discusión Los estudios que se centran en el mecanismo de acción genotóxica de la CYN y su consecuente repercusión potencial en la población son, hasta la fecha, escasos e inconcluyentes. Por tanto, en el presente trabajo se ha evaluado por primera vez la genotoxicidad directa y el daño oxidativo en la hebra de ADN que la CYN podría llegar a producir en la línea celular de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, mediante el ensayo cometa estándar y modificado con las enzimas Fpg y Endo III, para así aportar información acerca del perfil toxicológico de esta cianotoxina y poder de esta forma realizar una mejor evaluación del riesgo para la población derivado de su exposición por vía oral. Los resultados muestran que la exposición a CYN desde 0 μg/ml hasta 2,5 μg/ml no produce daño genotóxico directo en la hebra de ADN de las células Caco-2 a ninguna concentración ni tiempo de exposición, siendo éstos 24 y 48 h. Resultados similares fueron observados por Fessard y Bernard, (2003), quienes realizaron también el ensayo cometa en células de ovario de hámster chino (CHO K1) exponiendo a concentraciones de CYN de 0.5 y 1 μg/ml, a 24 h de exposición. Dichos investigadores concluyeron que, aunque las células sufrieron alteraciones morfológicas tras la exposición a la cianotoxina, no se generó daño genotóxico directo en la hebra de ADN. Dado que, según la bibliografía, la activación metabólica de CYN a través del CYP450 es necesaria para producir los efectos genotóxicos (Runnegar y cols., 1995; Norris y cols., 2001; Norris y cols., 2002), la ausencia de un sistema metabólico microsomal explicaría la falta del incremento del % ADN en la cola, en comparación con el grupo control negativo. En este sentido, a pesar que las células Caco-2 se caracterizan por su competencia metabólica, la expresión del sistema enzimático CYP450 es inferior si las equiparamos con otro tipos de células tales como los enterocitos humanos (Sambuy y cols., 2005). Liebel y cols. (2011) también realizaron el ensayo cometa con hepatocitos de Prochilodus lineatus, exponiéndolos a concentraciones de CYN de 0,1 a 10 μg/ml ~ 21 ~ durante 72 h, y se concluyó que la exposición a CYN en este cultivo celular no producía daño en el ADN. Estos resultados negativos podrían deberse al tipo de célula y a la toxicidad interespecífica de la cianotoxina (Humpage y cols., 2000; Lankoff y cols., 2007). Además, pueden influir los largos tiempos de exposición utilizados en el experimento, periodo en el cual las células podrían ser capaces de reparar el daño genotóxico (Browner y cols., 2004). Sin embargo, Humpage y cols. (2005) observaron que, en células hepáticas de ratón, CYN produce daño en el ADN a todas las concentraciones ensayadas (0,05-0,5 μM) tras 18 h de exposición. De forma similar, cuando células de linfocitos de sangre periférica humana (HPBL) fueron expuestas a concentraciones de CYN de 0 a 0,5 μg/ml durante 4 y 24 h de exposición, se observó rotura de la hebra de ADN a 4 h, a 0,5 μg/ml, y a 24 h, a 0,05 y 0,1 μg/ml (Zegura y cols., 2011). Los resultados positivos obtenidos tanto en células hepáticas como en sangre periférica se atribuyeron a la capacidad de ambas células de metabolizar la CYN a través del sistema enzimático CYP450 (Humpage y cols., 2005; Zegura y cols., 2011). También se evaluó el daño genotóxico que la CYN podría producir en la línea celular HepG2, células metabólicamente competentes dado su origen hepático. Dichas células se expusieron a concentraciones de la cianotoxina de 0 a 0,5 μg/ml a 4, 12, 24 y 72 h. La rotura de las hebras del material genético se produjo a las dos concentraciones más altas ensayadas, a 12, 24 y 72 h de exposición. Se planteó la hipótesis de que la razón por la cual a las 4 h de exposición no se había producido daño en el ADN podría ser por la lenta absorción de la toxina por las células, la cual se produciría probablemente por difusión pasiva (Štraser y cols., 2011; Štraser y cols., 2013a, b). Las células HepG2 también fueron utilizadas para evaluar el daño genotóxico directo que podía llegar a producir un extracto de Cylindrospermopsis raciborskii, en el cual se confirmó la presencia de CYN. Dicho extracto provocó rotura en las hebras del material genético en las células HepG2 a 48 y 72 h de exposición (Fonseca y cols., 2012). Otros ensayos de genotoxicidad, tales como el ensayo de micronúcleos, han sido utilizados para evaluar la capacidad de la CYN para producir efectos clastogénicos ~ 22 ~ y aneugénicos. La CYN ha incrementado la formación de células con micronúcleos en linfocitos WIL2-NS (Humpage y cols., 2000), Caco-2 (Bazin y cols., 2010), HepG2 (Štraser y cols., 2011) y células de pescado CLC (Sieroslawska y Rymuszka, 2014). Por el contrario, en otras líneas celulares se han obtenido resultados negativos, tales como CHO K1 (Lankoff y cols., 2007) y HepaRG (Bazin y cols., 2010). Una de las principales vías de toxicidad postulada de CYN es el incremento de especies reactivas de oxígeno (ERO), mecanismo del cual se han realizado diversos estudios in vitro (Gutiérrez-Praena y cols., 2012a; Gutiérrez-Praena y cols., 2012b; López-Alonso y cols., 2013; Liebel y cols., 2015; Poniedziałek y cols., 2015). Las ERO son especies químicas que contienen en su configuración uno o más electrones desapareados, lo que los convierte en compuestos altamente inestables, y por ello necesitan ceder o tomar un electrón de una molécula contigua para así ser capaces de estabilizarse (Sierra-Vargas y cols., 2004). Entre las ERO más comunes se incluyen iones de oxígeno y radicales libres, tales como superóxido e hidroxilo. El estrés celular puede conducir a niveles elevados de ROS y, debido a su naturaleza altamente reactiva, pueden inducir modificaciones en moléculas proteicas y lipídicas, un fenómeno conocido como estrés oxidativo (Martínez-Sánchez, 2005). Un exceso de ERO puede provocar necrosis celular y daño en el ADN y, en consecuencia, apoptosis (Roos y Kaina, 2006). Además, es sabido que las reacciones enzimáticas del CYP450 son una fuente significativa de la formación de ERO (Olinski y cols., 2002). Debido a la necesaria activación metabólica de CYN por parte del CYP450, estas reacciones pueden ser otra vía de formación de ERO tras la exposición a CYN (Humpage y cols., 2005; Bazin y cols., 2010; Straser y cols., 2011). Sin embargo, aún se desconoce si dichas ERO son capaces de oxidar las hebras de ADN, y a largo plazo, pueden originar efectos cancerígenos. Por ello, con la finalidad de dilucidar la implicación de las ERO sobre un posible daño oxidativo en las bases nitrogenadas del ADN, hemos incluido en nuestro experimento la versión del ensayo cometa modificada con las enzimas Fpg y Endo III. Dichas enzimas detectan y escinden las bases nitrogenadas púricas y pirimidínicas oxidadas, respectivamente (Gunasekarana y cols., 2015). En nuestro ensayo cometa modificado, la incubación con las enzimas de restricción no produjo un incremento en la cantidad de roturas en la hebra de ADN ~ 29 ~ action of the cyanobacterial toxin, cylindrospermopsin. 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