Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas

I Equation Chapter 1 Section 1 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de Tecnologías Industriales Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas Dep. Ingeniería y Ciencia de los Materiales y del Transporte Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Autor: Elena Quesada Ortega Tutores: Yadir Torres Hernández Cristina Domínguez Trujillo Sevilla, 2016 I Trabajo Fin de Grado Ingeniería de Tecnologías Industriales Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas Autor: Elena Quesada Ortega Tutores: Yadir Torres Hernández Cristina Domínguez Trujillo Dep. Ingeniería y Ciencia de los Materiales y del Transporte Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 III Trabajo Fin de Grado: Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas Autor: Elena Quesada Ortega Tutores: Yadir Torres Hernández Cristina Domínguez Trujillo El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2016 El Secretario del Tribunal V Dedicatoria A Pepe, Úrsula y Mati, los mejores abuelos que alguien pueda desear. A mis padres y mis hermanas, por estar siempre ahí. VII Agradecimientos El trabajo fin de grado no sólo es fruto del esfuerzo personal del autor, sino que necesita de la ayuda de muchas personas, tanto en lo profesional como en lo personal. Con estas líneas quisiera mostrar mi agradecimiento a todas ellas. A Yadir y Cristina, por su gran labor tutora, ya que gracias al conocimiento que me han transmitido he sido capaz de realizar este trabajo fin de grado. Del mismo modo, destacar el trato cercano que he recibido por su parte desde el principio, consiguiendo de este modo que todo el tiempo que ha durado esta investigación se haya afrontado con el mejor ánimo posible. A Mercedes, Jesús y Miguel, los técnicos de laboratorio, tanto por su profesionalidad como su incansable labor docente. Sin ellos parte de este trabajo no habría podido realizarse de la manera idónea. Al profesor José Antonio, a mis compañeros José Manuel y Paloma, así como todo el grupo de investigación. Gracias a su ayuda el proyecto sigue a delante, siendo posible llevar a cabo los objetivos marcados. Al Ministerio de Ciencia e Innovación de España, a través de su apoyo financiero mediante esta subvención: MAT2010-20855. Del mismo modo, a la Junta de Andalucía a través de la subvención No. P12-Rep-1401, la cual fue financiada en parte por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional. A mis padres, Paqui y Cristóbal, por saber transmitirme el valor del esfuerzo, del trabajo y de la perseverancia, así como por todo su apoyo incondicional a lo largo de toda mi vida y concretamente durante el desarrollo de este trabajo fin de grado. A mis amigos, a los que me acompañan en todo momento y escuchan mis preocupaciones y sobre todo a aquellos que han sabido alentarme incluso en los momentos que más oscuro se ha visto el camino durante este curso. . Elena Quesada Ortega Sevilla, 2016 Índice XIV A. Morfología de los polvos en estado de recepción .......................................................... 31 B. Tamizado.................................................................................................................. 32 C. Morfología de los distintos rangos de NH4HCO3 ............................................................. 33 D. Granulometría de los polvos de bicarbonato de amonio tamizados. ................................ 33 4.1.3 Reactivos químicos para el ataque ............................................................................... 34 4.2 Procedimientos experimentales.......................................................................................... 35 4.2.1 Fabricación y caracterización de los substratos de Ti c.p. porosos .................................... 35 A. Preparación de la mezcla del Titanio c.p. y el espaciador ................................................ 35 B. Proceso de compactación de la mezcla ........................................................................ 37 C. Eliminación del espaciador ......................................................................................... 40 D. Sinterización de los compactos.................................................................................... 40 E. Caracterización del substrato de Titanio poroso ............................................................ 41 4.2.2 Modificación y caracterización de la topografía de la superficie de los discos de titanio porosos. 51 A. Protocolo de modificación superficial mediante ataque químico ..................................... 51 B. Caracterización de la superficie atacada químicamente .................................................. 52 5 Resultados y Discusiones ..................................................................................................... 53 5.1. Fabricación y caracterización de substratos de Ti c.p. porosos................................................... 53 5.1.1 Propiedades físicas .................................................................................................... 53 5.1.2 Caracterización de la porosidad ................................................................................... 56 5.1.3 Comportamiento mecánico ........................................................................................ 64 5.1.4 Rugosidad de la superficie externa de titanio y del interior de los poros ........................... 65 5.2. Modificación superficial mediante ataque químico .................................................................. 70 5.2.1 Macrofotografías de las superficies .............................................................................. 70 5.2.2 Pérdida de masa para las diferentes condiciones de ataque............................................ 71 5.2.3 Rugosidad de la superficie y el interior de los poros ....................................................... 72 C. Influencia del tamaño de poro para un mismo tiempo de poro ....................................... 78 6 Conclusiones ...................................................................................................................... 83 7 Trabajos Futuros ................................................................................................................. 85 Referencias ................................................................................................................................. 87 Anexos ....................................................................................................................................... 99 XV ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.- Comparativa entre los distintos métodos de impresión directa litográfica por láser [57] ............ 14 Tabla 2.- Objetivo perseguido según el ion utilizado en el proceso de implantación iónica. .................... 18 Tabla 3.- Composición en tanto por ciento en peso (%p/p) de los elementos presentes en los polvos de titanio. ....................................................................................................................................................... 29 Tabla 4.- Composición química (% en peso) de los cuatro grados de Ti c.p. existentes para las aplicaciones biomédicas. ...................................................................................................................................... 29 Tabla 5.- Propiedades mecánicas exigidas a los diferentes grados de Ti c.p. para aplicaciones biomédicas. ....................................................................................................................................................... 30 Tabla 6.- Propiedades del bicarbonato de amonio.............................................................................. 31 Tabla 7.- Proporciones de los diferentes rangos de tamaño en 100 g de polvo de bicarbonato en estado de recepción. ........................................................................................................................................ 33 Tabla 8.- Estudio de la granulometría de los polvos de bicarbonato de amonio ..................................... 34 Tabla 9.- Parámetros para compactación de polvos. .......................................................................... 39 Tabla 10.- Parámetros técnicos utilizados en el microscopio Sensofar S neox ....................................... 51 Tabla 11.- Altura y diámetro medio para cada tamaño de poro antes y después de sinterizar y valores de las contracciones de diámetro, altura y volumen para cada tamaño de poro. ................................................... 54 Tabla 12.- Diferencia de la variación de densidad entre los diferentes métodos de obtención. ................. 55 Tabla 13.- Aumento de la densidad de los substratos respecto a la esperada según el tamaño de poro ...... 56 Tabla 14.- Diferencia relativa entre procesos de medida de porosidad.................................................. 57 Tabla 15.- Porosidad total e interconectada de los substratos tras cada etapa de fabricación según el tamaño de poro. Sinterización mediante medidas geométricas y desbaste mediante el método de Arquímedes. ......... 57 Tabla 16.- Parámetros obtenidos a partir de análisis de imagen para cada tamaño de poro. ..................... 59 Tabla 17.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 100-200 µm. ....................................................... 62 Tabla 18.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 250-355 µm. ....................................................... 62 Tabla 19.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 355-500 µm ........................................................ 62 Tabla 20.- Parámetros mecánicos característicos según el tamaño de poro de los substratos y del hueso [160] ....................................................................................................................................................... 64 Tabla 21.- Parámetros correspondientes a la rugosidad de la superficie plana y los poros para cada tamaño de poro 20x ...................................................................................................................................... 67 Tabla 22.- Macrofotografías de los substratos con diferentes porosidades y tiempos de ataque. ............... 70 Tabla 23.- Comparación entre la porosidad de las muestras y su pérdida de masa.................................. 71 XVII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1- Gráfico sobre el crecimiento global del mercado ortopédico según cada sector [1]..................... 1 Figura 2.- Proceso de apantallamiento de tensiones ............................................................................. 3 Figura 3.- Crecimiento del hueso hacia el interior de los substratos a través de poros. .............................. 3 Figura 4 .- Representación microorganismos adheridos a la superficie del implante................................. 4 Figura 5 .- Evolución del tejido óseo alrededor del implante hasta oseointegrarse.................................... 4 Figura 6.- Sucesión de procesos que ocurren al colocar un material dentro del cuerpo [167] ..................... 7 Figura 7 – Influencia de la topografía de la superficie de los implantes en la interacción biológica en la interfase [22]. ..................................................................................................................................... 8 Figura 8.- Clasificación de los métodos de modificación superficial. ..................................................... 9 Figura 9.- Diferentes patrones litográficos empleados para el confinamiento de células [158]. ................ 12 Figura 10.- Ilustraciones de los procesos básicos de evaporación, recubrimiento iónico y pulverización catódica [79]..................................................................................................................................... 17 Figura 11.- Esquema del equipo utilizado para la descarga de plasma incandescente [94]....................... 19 Figura 12.- Esquema de dispositivo de anodización [167] .................................................................. 20 Figura 13.- Esquema de los diferentes procesos durante el crecimiento del recubrimiento por CVD [26].. 24 Figura 14.- Morfología de los polvos de Titanio SE-JONG 4 obtenida mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)................................................................................................................................... 30 Figura 15.- Microestructura de los polvos de Titanio SE-JONG 4. ...................................................... 30 Figura 16.- Distribución granulométrica del polvo de titanio SE-JONG 4............................................. 31 Figura 17.- Morfología de los polvos de bicarbonato de amonio obtenida mediante SEM....................... 31 Figura 18.- Túrbula. ...................................................................................................................... 32 Figura 19.- Ultrasonidos. ............................................................................................................... 32 Figura 20.- Tamizado. ................................................................................................................... 33 Figura 21.- Tamaño de partícula del polvo obtenido en el rango tamizado de 100-200 (izq.), 250-355 µm (centro) y de 355-500 µm (dcha.). ....................................................................................................... 33 Figura 22.- Distribución granulométrica del polvo de bicarbonato de amonio Alfa Aesar en estado de recepción (a) y tamizado con tamaño comprendido entre 100-200 µm (b), 250-355 µm (c) y 355-500 µm (d). ....................................................................................................................................................... 34 Figura 23.- Curva de compactación de titanio y bicarbonato de amonio ............................................... 35 Figura 24.- Balanza de precisión OHAUS Explorer Pro. .................................................................... 36 Figura 25.- Esquema de la geometría de las muestras fabricadas para compresión (a) y para ataque químico (b). .................................................................................................................................................. 36 Figura 26.- Elementos para compactar polvos .................................................................................. 37 Figura 27.- SUZPECAR 600KN sin y con matriz. ............................................................................ 38 Figura 28.- Panel de control de SUZPECAR 600KN......................................................................... 38 Índice de Figuras XVIII Figura 29.- Prensa Malicet et Blin U-30 .......................................................................................... 39 Figura 30.- Estufa Carbolite. .......................................................................................................... 40 Figura 31.- Tubo y lana de vidrio.................................................................................................... 40 Figura 32.- Horno de alto vacío utilizado para la sinterización. ........................................................... 41 Figura 33.- Curva de sinterización. ................................................................................................. 41 Figura 34.- División imaginaria de los compactos. ............................................................................ 42 Figura 35.- Balanza OHAUS Explorer Pro. ..................................................................................... 43 Figura 36.- Desbastadora de la casa STRUERS. ............................................................................... 44 Figura 37.- Pulidora de la casa STRUERS. ...................................................................................... 44 Figura 38.- Limpieza en ultrasonidos. ............................................................................................. 45 Figura 39.- Soporte SEM con muestras colocadas............................................................................. 46 Figura 40.- Carbono para hacer las muestras conductoras. ................................................................. 46 Figura 41.- Microscopio electrónico de barrido Jeol JSM-6490LV ..................................................... 47 Figura 42.- Probeta con teflón lista para el ensayo de compresión ....................................................... 47 Figura 43.- Máquina de compresión INSTRON 5505 ....................................................................... 47 Figura 44.- Utensilios para dejar paralelas las caras de las probetas ..................................................... 48 Figura 45.- Determinación del límite elástico. .................................................................................. 48 Figura 46.- Zona lineal de la curva tensión deformación. ................................................................... 48 Figura 47.- Microscopio confocal SENSOFAR S NEOX .................................................................. 49 Figura 48.- SensoScan 6.2 ............................................................................................................. 49 Figura 49.- Esquema de toma de imágenes mediante confocal- .......................................................... 50 Figura 50.- Esquema del procedimiento para atacar y extraer las muestras. .......................................... 51 Figura 51.- Montaje del baño maría para calentar la solución y realizar el ataque químico. ..................... 51 Figura 52.- Cambio de color del ácido según los distintos tiempos de ataque, a) todos los ataques y b) 125 s y 625 s de 355-500 µm ...................................................................................................................... 52 Figura 53.- Comparación contracción del diámetro según la altura para cada tamaño de poro antes y después de sinterizar. ..................................................................................................................................... 53 Figura 54.- Variación de diámetro, altura y volumen para cada tamaño de poro antes y después de sinterizar. ....................................................................................................................................................... 54 Figura 55.- Análisis de la variación de la densidad por proceso para cada tamaño de espaciador ............. 55 Figura 56.- Variación de densidad debida al proceso de sinterización y desbaste para cada tamaño de poro ....................................................................................................................................................... 56 Figura 57.- Variación de porosidad total según el tamaño de poro y tras las distintas etapas de fabricación de los substratos. ................................................................................................................................... 58 Figura 58.- Variación de la porosidad según cada etapa para cada tamaño de poro. ............................... 58 Figura 59.- Variación debida al desbaste de la porosidad total e interconectada con el tamaño de grano. .. 59 Figura 60.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 100-200 µm para análisis de imagen........ 60 Figura 61.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 250-355 µm para análisis de imagen........ 60 Figura 62.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 355-500 µm para análisis de imagen........ 61 XIX Figura 63.- Imágenes tomadas a la superficie de substrato macizo (a) y porosos con tamaño de poro 100-200 µm (b), 250-355 µm (c) y 355-500 µm (d) mediante SEM a 50X. ........................................................... 63 Figura 64.- Curvas tensión-deformación para cada tamaño de poro ..................................................... 64 Figura 65.- Comparación macroscópica de las muestras antes y después del ensayo de compresión......... 65 Figura 66.- Imágenes generales de la superficie de las muestras. a) 100-200 µm 10x confocal. b) 250-355 µm 10x confocal. c) 355-500 µm 10x confocal. d) 100-200 µm 100x SEM. e) 250-355 µm 100x SEM. f) 355- 500 µm 100x SEM. ........................................................................................................................... 65 Figura 67.- Imágenes de la zona plana de titanio presente entre los poros de las muestras. a) 100-200 µm 20x confocal. b) 250-355 µm 20x confocal. c) 355-500 µm 20x confocal. d) 100-200 µm 1000x SEM. e) 250-355 µm 1000x SEM. f) 355-500 µm 1000x SEM. ....................................................................................... 66 Figura 68.- Imágenes de los poros de cada muestra. a) 100-200 µm 20x confocal. b) 250-355 µm 20x confocal. c) 355-500 µm 20x confocal. d) 100-200 µm 1000x SEM. e) 250-355 µm 1000x SEM. f) 355-500 µm 1000x SEM. ..................................................................................................................................... 67 Figura 69.- Gráficas de los parámetros correspondientes a la rugosidad de la superficie plana y los poros para cada tamaño de poro 20x. ................................................................................................................... 68 Figura 70.- Perfiles de rugosidad correspondientes a la zona plana de Ti presente entre los poros a 20x: a) 100-200 µm, b) 250-355 µm y c) 355-500 µm ...................................................................................... 68 Figura 71.- Perfiles de rugosidad de la superficie interna de los poros a 20x: a) 100-200 µm, b) 250-355 µm y c) 355-500 µm ............................................................................................................................... 69 Figura 72.- Porcentajes de pérdidas de masa según el tiempo de ataque y el tamaño de los poros. ........... 71 Figura 73.- Influencia de la rugosidad interna de los poros sobre el ataque químico de las muestras......... 71 Figura 74.- Evolución general de los substratos al aumentar el tiempo de ataque. Imágenes obtenidas mediante SEM a 100x aumentos. ........................................................................................................ 72 Figura 75.- Evolución de la zona plana de las probetas con tamaño de poro 100-200 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. ........................................... 73 Figura 76.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 100-200 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. ........................................... 74 Figura 77.- Evolución de la zona plana de las probetas con tamaño de poro 250-355 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. ........................................... 75 Figura 78.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 250-355 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. ........................................... 75 Figura 79.- Evolución de la zona plana de las probetas con tamaño de poro 355-500 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. ........................................... 76 Figura 80.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 355-500 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s ............................................ 77 Figura 81.- Análisis de composición de impurezas presentes en el substrato de 355-500 µm atacado durante 625 s................................................................................................................................................ 77 Figura 82.- Evolución de la zona plana de las probetas atacadas durante 125 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. ................................................................................................................................................. 78 Figura 83.- Evolución del interior de los poros de las probetas atacadas durante 125 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm...................................................................................................................................... 78 Figura 84.- Evolución de la zona plana de las probetas atacadas durante 625 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. ................................................................................................................................................. 79 Índice de Figuras XX Figura 85.- Evolución de la superficie interna del poro de las probetas atacadas durante 625 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. ............................................................................................................................ 80 Figura 86.- Parámetros de rugosidad graficados para facilitar el análisis de los resultados. ..................... 81 1 1 INTRODUCCIÓN El mercado ortopédico mundial se encuentra en crecimiento en la actualidad. El aumento de la esperanza de vida, hábitos más activos en la sociedad o la mejora de la tecnología, entre otros se pueden señalar como principales causas de dicho desarrollo el envejecimiento de la población. La anterior afirmación puede basarse en hechos contrastables, como que el número de caderas reemplazadas en EE.UU. se haya disparado debido a la osteoartritis, cada vez más común en pacientes de mediana edad. O por otro lado, apoyarse en estudios estadísticos y de mercado, como el que se muestra en la Figura 1. Dicho estudio engloba el mercado ortopédico mundial, dividido en diferentes secciones, desde el año 2013 hasta el 2020 [1]. Del mismo, se extrae la idea de un gran crecimiento del mercado en los años venideros y por consiguiente una gran inversión de capital para la investigación que tenga por objeto desarrollar este sector. «El científico no tiene por objeto un resultado inmediato. Él no espera que sus ideas avanzadas sean fácilmente aceptadas. Su deber es sentar las bases para aquellos que están por venir y señalar el camino». - Nikola Tesla - Figura 1- Gráfico sobre el crecimiento global del mercado ortopédico según cada sector [1]. Introducción y Objetivos 2 El marco mundial lo dejamos a un lado para centrar el tema en España, la Constitución Española [2] en el artículo 43 reconoce el derecho a la protección de la salud y establece que compete a los poderes públicos organizar y tutelar la salud pública a través de medidas preventivas y de las prestaciones y servicios necesarios. Dentro de ese marco, se publicó el 16 de septiembre de 2006, en el Boletín Oficial del Estado, el Real Decreto 1030/2006 [3]. En él se establece la cartera de servicios comunes del Sistema Nacional de Salud y el procedimiento para su actualización. El documento anterior, citando tanto la Constitución como diversas leyes que lo preceden, con el objetivo de remarcar su legitimidad, pretende garantizar la protección de la salud, la equidad y la accesibilidad a una adecuada atención sanitaria. Para ello, enumera a lo largo de su extensión el contenido de la cartera de servicios comunes de las prestaciones sanitarias de salud pública, entre las cuales se encuentra la ortoprotésica. El citado Real Decreto establece que esta prestación se facilitará por los servicios de salud o dará lugar a ayudas económicas, en el año 2012 se publicó el Real Decreto 1506/2012 [4], del 2 de noviembre, por el que se regula la cartera común suplementaria de prestación ortoprotésica del Sistema Nacional de Salud y se fijan las bases para el establecimiento de los importes máximos de financiación en prestación ortoprotésica. De este modo se abre otra cuestión que anima a ampliar la investigación dentro de nuestro país; desarrollar prótesis que puedan ser admitidas dentro del catálogo ofertado por el Sistema Nacional de Salud. El Informe anual del Sistema Nacional de Salud 1 de 2013 (último hasta la fecha) [5] trata temas tan importantes como recursos asistenciales, actividad, calidad y accesibilidad de los servicios sanitarios y farmacia, entre otros. Uno de los apartados anteriores trata las Estrategias del Sistema Nacional de Salud, quedando de manifiesto la importancia de dichas estrategias dentro del SNS español. En el año 2013, estaban implantadas en todas las comunidades y ciudades autónomas once estrategias diferentes, dentro de las cuales se halla la Estrategia en enfermedades reumáticas y musculoesqueléticas 2 del Sistema Nacional de Salud [6]. Las enfermedades reumáticas incluyen más de 200 enfermedades que tienen en común la presencia de manifestaciones clínicas en el aparato locomotor. El término enfermedades musculoesqueléticas hace referencia a todas aquellas que afectan a huesos, articulaciones, estructuras periarticulares y músculos. Incluyendo además, todo tipo de artritis, dolor lumbar, enfermedades óseas, reumatismos de partes blandas con dolor regional o generalizado y enfermedades sistémicas del tejido conectivo. Todas las enfermedades englobadas bajo estos términos, se caracterizan por su alta prevalencia en la población general, su tendencia frecuente a la cronicidad y su potencial para ocasionar discapacidad. La primera causa de discapacidad física en el mundo occidental (de origen no mental) señalada por la OMS son las enfermedades reumáticas en su conjunto. Cada año se producen aproximadamente 7 fracturas osteoporóticas de cadera por cada 1.000 habitantes mayores de 60 años (según el INE más de 17% de la población española es mayor de 65 años, dando lugar a más de 56 000 fracturas de este anualmente) [7] y se registran 11 casos por 10.000 de hospitalización por fractura de fémur en nuestro país [8] (lo que según datos del Informe anual del SNS da lugar a 4 000 al año). El objetivo de la estrategia en ERyMEs del SNS es prevenir la aparición de las mismas, disminuir la morbilidad asociada para reducir el deterioro de la capacidad funcional y mejorar la calidad de vida de las personas con que las padeces. Esta meta pretende conseguir a través de la promoción de la salud, la prevención de la enfermedad y la atención integrada y multidisciplinar. Se reserva además una sección a la investigación, donde se citan las principales líneas de investigación relacionadas con el tema en España como son la Red de Investigación en Inflamación y Enfermedades Reumáticas, la de investigación cooperativa en envejecimiento y fragilidad, el centro de investigación biomédica en red (CIBER) de Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina y el Ciber de epidemiología y salud pública. El gran número de investigaciones llevadas a cabo sobre implantes y prótesis, siguen sin ser suficientes para erradicar los problemas presentes en los mismos y garantizar su fiabilidad. Los estudios previos muestran 1 Sistema Nacional de Salud pasa a ser nombrado como SNS siempre que no se encuentre dentro del título o apartado de algún documento. 2 Enfermedades reumáticas y musculoesqueléticas pasa a ser nombrado como ERyMEs. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 3 ejemplos en los que se deja patente el fallo del 16,9% de las sustituciones totales de tobillo [9] o de entre el 15 y 5% de los implantes dentales, según el tipo de material con el que se hagan [10]. Los materiales para el remplazo óseo presentan grandes dificultades para evitar el apantallamiento de tensiones (stress shielding). Los requisitos de algunas prótesis -como pueden ser las de cadera o de rodillano son los mismos que unos años atrás. Por ejemplo, la población posee una masa corporal un 20% mayor que unas décadas atrás [11]. Éste y otros motivos, nombrados al inicio de la introducción, muestran la necesidad de optimizar la carga máxima soportada, así como la vida útil, según la persona demandante [11]. El fenómeno de apantallamiento de tensiones tiene lugar en aquellas prótesis diseñadas con materiales muy resistentes y rígidos comparados con el hueso. La mayor rigidez del implante da lugar a una distribución de la carga desproporcionada, siendo soportada mayoritariamente por la prótesis y quedando el hueso sin apenas esfuerzo que soportar. De este modo, se produce un remodelamiento del material óseo, que se encuentra en continuo cambio, deteriorando su calidad [12]. Los implantes que soportan carga y que poseen un módulo elástico superior al del hueso conducen a la reabsorción del hueso por pérdida de estímulo, así como a la pérdida de los implantes por desprendimiento del hueso y un retardo en la curación de los huesos [13].Una de las opciones para solventar dicho problema consiste en la fabricación de prótesis porosas, de forma que se reduce el módulo de Young de la misma hasta un valor más cercano al del hueso. El resultado supone una distribución más homogénea de tensiones entre el hueso y el implante [14] [15]. Al mismo tiempo, esta solución favorece el crecimiento del hueso hacia el interior del implante, siempre y cuando el tamaño de los poros sea el apropiado (Figura 3). Según investigaciones previas, dicho tamaño ha de ser al menos del orden de la porosidad del hueso trabecular y las osteonas (decenas de micrómetros), de lo contrario el crecimiento hacia el interior no ocurrirá [16]. Sin embargo, aún no ha quedado totalmente definido el tamaño óptimo de poro para humanos. Existen diferentes rangos recomendados, entre los que se encuentran por ejemplo 75-250 µm [17] ó 200-300 µm [18]. El rango comúnmente aceptado se encuentra en torno a 100- 500 µm. Si el tamaño de los poros estuviera comprendido entre 0,5-1 mm, asemejarían una superficie macroestructurada en lugar de una superficie tridimensional con porosidad interconectada, disminuyendo por tanto la resistencia a cizalladura de la intercara. Por estos motivos, en este trabajo se caracterizarán substratos Figura 3.- Crecimiento del hueso hacia el interior de los substratos a través de poros. Crecimiento del hueso hacia el interior Hueso Zona de apantallamiento de tensiones Hueso denso Tensiones debidas al peso corporal Tensiones debidas al peso corporal Figura 2.- Proceso de apantallamiento de tensiones Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 10 velocidad de 10-30 m/s. Generalmente se lleva a cabo con SiC, alumina o diamante para llegar a tener una superficie extremadamente uniforme y especular, es decir con un Ra en torno 0,1 µm o menos. Además, la humedad del paño ha de ser la adecuada, ya que si la humedad es excesiva la acción abrasiva se retardará demasiado. Por el contrario, si es escasa la probeta tenderá a mancharse. [27] 3.1.2 Molienda (grinding) El proceso de modificación superficial de molienda elimina material de la superficie mediante un abrasivo, en este caso duro. Sin embargo, la molienda requiere el uso de partículas gruesas como abrasivo medio para eliminar la superficie de una manera mucho más rápida. De esta forma, se origina una topografía superficial relativamente abrupta y basta. Por ejemplo, si utilizamos un abrasivo de grado 60 nos conducirá a Ra en torno a valores de 1 µm, y con el grado más grueso de partículas, la rugosidad superficial podrá alcanzar valores incluso entre 5 y 6 µm [27]. Sin embargo, aunque se puede crear una superficie que facilite el crecimiento de hueso nuevo y la adhesión de células, la rugosidad superficial no es completamente uniforme e idéntica en toda la superficie [28]. Los abrasivos más comunes son Al2O3 y SiC. Sin embargo el uso de ese tipo de partículas puede derivar en la contaminación de la superficie lo que introduciría una toxicidad local y una reacción inflamatoria por la disolución de iones Al2O3 en el hueso receptor. Se deduce que estos restos de abrasivos pueden llegar a dañar la mineralización y reparación del hueso. Por ello, se dirigen las miradas hacia otros abrasivos potenciales como los biomateriales calcio fosfatados, en particular la hidroxiapatita (HA) y el β-tricalcio fosfato (β-TCP). Estudiando la mezcla de estos dos últimos materiales se ha llegado a una nueva fase que puede ser usada como abrasivo, el fosfato cálcico bifásico. Con este abrasivo se consigue una molienda que aumenta la rugosidad superficial del titanio [29]. 3.1.3 Granallado o arenado El granallado, también conocido como limpieza abrasiva, es otro tratamiento superficial que persigue crear topografías distintas en la superficie, lanzando hacia las mismas partículas cerámicas duras. Las partículas cerámicas se proyectan a través de una tobera a alta velocidad, generando diferentes rugosidades según el tamaño de las partículas. Como cada grano de granalla golpea la superficie de la pieza, actúan como martillos de bola, dejando un pequeño impacto esférico, de modo que la capa interna del material intenta devolver la capa superficial a su forma original. Esto produce un área de tensión compresiva causada por el impacto de la granalla. La superposición de impactos genera una mayor distribución de la alta tensión compresiva interna en la superficie del componente. La probabilidad de roturas en el material chorreado queda reducida, aumentando considerablemente la dureza de la superficie al mismo tiempo [30]. La técnica descrita, en general, se aplica con el fin de limpiar la superficie de contaminantes, aumentar el área superficial efectiva y producir tensiones superficiales residuales beneficiosas en la superficie. Como resultado, las superficies así tratadas exhiben mayor energía superficial, lo que potencia las actividades químicas y físicas de la superficie, incrementan la adhesión de tejido al implante y mejoran tanto la vida como el límite de fatiga [27]. El material que se lanza debe ser químicamente estable, biocompatible y no interponerse en la oseointegración. Las partículas cerámicas más utilizadas son la alumina, el óxido de titanio y el fosfato cálcico [30]. Según el material que se proyecte hacia el implante, este podrá quedar embebido en la superficie de impacto. Incluso tras la limpieza en ultrasonidos, pasivación ácida y esterilización, algunos granos permanecerán allí. La alumina es insoluble en ácido y retirarla de la superficie del titanio es muy trabajoso. De hecho, en algunos casos la alumina se ha trasladado al tejido circundante, interfiriendo de este modo con la oseointegración. Además, dicha heterogeneidad química, decrementa la resistencia a la corrosión del titanio en un ambiente fisiológico [31]. Los estudios experimentales muestran como microimplantes en humanos granallados con TiO2 incrementan el contacto hueso-implante si los comparamos con los mecanizados [32] [33] [34]. Otros estudios comparativos han dado resultados muy favorables 10 años después de la introducción del implante granallado en el organismo, Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 11 con unos niveles de hueso marginal y porcentajes de conservación superiores a los implantes mecanizados [35] [36] [37]. Los modelos realizados en conejos demuestran que los implantes granallados con alumina o con óxido de titanio dan valores de contacto implante-hueso similares. Sin embargo, en lo que respecta a la fijación mecánica incrementa drásticamente en comparación con superficies de titanio lisas. Estos estudios corroboran como la rugosidad superficial aumenta el torque necesario para extraer los implantes dentales (fijación mecánica) pero no la fijación biológica [38] [39]. El análisis del granallado muestra que puede tener inconvenientes según el material de las partículas que se lancen. Estos inconvenientes se reducen al utilizar una tercera alternativa, consistente en usar material biocompatible, oseoconductivo y reabsorbible como son los fosfatos cálcicos. La hidroxyapatita, βtricalciofosfato y mezclas de ambos, son distintos tipos de fosfatos cálcicos considerados muy útiles. Además de ser reabsorbibles, algunos estudios han demostrado que el contacto implante-hueso es similar al observado en otras superficies granalladas [40]. Existen distintos tipos de granallado: por turbina, en el que se convierte la energía de un motor eléctrico en energía abrasiva cinética, utilizando para ello la rotación de una turbina, o chorreado por aire, en el que el abrasivo se acelera de forma neumática mediante aire comprimido, y se proyecta a través de boquillas sobre el componente. El sistema de granallado por turbina centrífuga es mucho más productivo que el de aire comprimido, logrando una mayor uniformidad en la preparación superficial. 3.1.4 Granallado con agua a alta presión El granallado con agua a alta presión es una técnica de mecanizado no convencional. Este procedimiento se lleva sometiendo la pieza a la presión del chorro de agua al aire libre o bajo agua. A la rugosidad que se obtiene de este proceso, ha de sumarse la limpieza de la superficie que se obtiene tras el mismo. Las tenisones residuales de compresión generadas en la pieza dependerán de los parámetros utilizados para la programación del chorro de agua, el material y la configuración del sistema [41]. Los primeros en proponer el uso del chorro de agua para la preparación de las superficies de implantes ortopédicos metálicos fueron Arola y McCain [43]. De esta forma, no se compromete la resistencia a fatiga del componente aunque se esté eliminando material. Se incluían partículas abrasivas en el chorro de agua que, simultáneamente, generaban rugosidad y endurecían la superficie del Ti6Al4V mediante erosión hidrodinámica controlada. Se encontró así una distribución dispersa de partículas de abrasivo que permanecían en la superficie a pesar de ser sometida a una limpieza ultrasónica. En 2002, el mismo grupo de investigación [42] presentó los resultados del procesado con chorro de agua sobre Ti y Ti6Al4V sin partículas abrasivas. En esa ocasión se varió la presión de agua de 140 a 280 MPa y se aplicó una velocidad de avance del chorro de 3,81 m/min. Al comparar los resultados obtenidos en el mismo material empleando partículas abrasivas, se encontró que el chorro de agua pura generaba menor rugosidad y tensiones residuales, mientras que con abrasivo, el 7% de la superficie quedaba cubierta con partículas. Más adelante, se demostró que el procesado con chorro de agua puede mejorar la resistencia a la fatiga del acero inoxidable AISI 304 y la aleación Ti6Al4V [43]. Posteriormente, se ha llevado a cabo una investigación experimental utilizando varios materiales para evaluar la rugosidad superficial y el campo de tensiones residuales resultantes del proceso de granallado por agua a alta presión con abrasivos. De dicho estudio se extraen dos conclusiones. Por un lado que el rango de rugosidad superficial promedio que se puede alcanzar va desde aproximadamente 2,5 µm hasta cerca de 15 µm. Esta rugosidad aumenta con la presión del chorro de agua, con el tamaño de las partículas abrasivas, pero no se ve influenciada por el estado pretensionado del material al que se le aplique esta técnica de modificación superficial. Por otro lado, la mínima tensión residual obtenida para las diferentes condiciones en las que se puede aplicar el tratamiento alcanza aproximadamente 500 MPa, aumentando dicho valor con el tamaño de las partículas abrasivas y del pretensado elástico. Además, la profundidad a la que afecta las tensiones residuales de compresión varía dentro de un rango que va desde 80 hasta cerca de 600 µm. Dicha profundidad aumenta con el tamaño de las partículas y la presión del agua, no viéndose afectada por el pretensionado. [44] Por último en 2012, se ha realizado un trabajo experimental acerca de las tensiones residuales en la superficie y la subsuperficie tras un tratamiento de granallado. Concretamente, se trataba de utilizar un chorro de agua a presión con partículas abrasivas, mediante el cual se aplicaba carga y desplazamiento a flexión controlado. Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 12 Además hacía uso de un modelo de elementos finitos con el fin de explorar la influencia de las condiciones de contorno en la aplicación de precarga a flexión para la distribución de tensiones residuales en tratamientos basado en partículas. De los resultados se concluye que las condiciones de contorno no tienen influencia substancial en lo que a profundidad de las tensiones residuales se refiere, los valores de tensiones residuales son un 50 % mayores si controlamos en carga que si controlamos en desplazamiento el estado pretensionado, entre otras conclusiones [45]. 3.1.5 Síntesis por irradiación dirigida Las técnicas de modificación superficial basadas en irradiación impulsada proporcionan la posibilidad de diseñar superficies nanoestructuradas con un orden notable o aleatorio. Los sistemas de irradiación dirigida se han limitado a procesos de daño permanente por operar con regímenes de energía y caudal que limitan la autoorganización 3 de estructuras de unos nanómetros de espesor. Sin embargo, otros procesos de radiación energética, tales como los haces de iones pesados de baja energía se pueden utilizar para inducir estructuras estampadas y topografía única en la nanoescala por medio de pulverización catódica y otros procesos relacionados con la superficie [46] [47] [48] [49]. La síntesis por irradiación dirigida (DIS) facilita los mecanismos de síntesis atérmicos que se producen en la superficie nanoestructurada, así como las transformaciones de fase metaestable en las nanoescalas. Esto conlleva que se pueda implementar una rugosidad heterogénea a nivel nanoscópico, cuyo diseño esté enfocado a influenciar el comportamiento de las células. Los trabajos realizados hasta el momento están dirigidos a identificar los mecanismos dependientes de la composición que conducen a la auto-organización en las nanoestructuras generadas por irradiación dirigida, lo que permitiría tener capacidad de ajuste y control de las propiedades químicas y electrónicas [50]. Este proceso se emplea para crear nanoestructuras en las superficies de metales, semiconductores y polímeros. La última patente de un equipo que sea capaz de llevar a cabo la síntesis por irradiación dirigida está basada en mezclar la acción de la irradiación superficial producida por un haz de electrones y la exposición de las partículas a una fuente térmica. Con esta unión se consigue inducir complejas macro y nanoestructuras gracias a las cuales se mejoran las propiedades ópticas, electrónicas, biológicas y/o magnéticas. Este método será capaz de fabricar estructuras en la superficie de un substrato mediante el control de los parámetros del haz de iones y la fuente térmica que se correspondan con la nanoestructura tipográfica deseada. Primero incidirá el haz de electrones y posteriormente la fuente térmica para producir una pluralidad de nanoestructuras. [51] En el caso del titanio, DIS es una técnica única para obtener los parámetros óptimos de micro y nano rugosidad en la mejora de la adhesión y proliferación de osteoblastos y proteínas, lo que implica una mejor oseointegración de los implantes de titanio. Concretamente, tanto la rugosidad vertical como la horizontal se pueden controlar simultáneamente a escalas nano y micrométricas con este procedimiento. [51] 3.2. Métodos litográficos La denominación de técnicas litográficas de modificación superficial engloba todos aquellos procedimientos que, modificando la topografía a escalas micrométrica y nanométricas, obtengan diferentes rugosidades. Siendo conscientes de que la formación del hueso y su comportamiento depende de varias escalas, se aprecia cómo estas 3 La auto-organización es un proceso en el que algún tipo de orden o coordinación global surge de las interacciones locales entre los componentes de un sistema inicialmente desordenado. Figura 9.- Diferentes patrones litográficos empleados para el confinamiento de células [158]. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 13 técnicas pueden contribuir a biofuncionalizar los materiales mediante la modificación de la superficie. Gracias a este proceso es posible crear diseños geométricos muy precisos que cuenten con rugosidades nanométricas denominados patrones. El término litografía hacía referencia a la técnica de impresión por estampación de una matriz de piedra, que se basa en el principio de rechazo natural que se produce entre el agua y la grasa cuando entran en contacto. La diversa adherencia que consiguen las sustancias afines al agua y las que no lo son es la herramienta fundamental para implementa esta técnica. Al rechazar el agua la tinta grasa, ésta no se va a imprimir. El desarrollo actual de la microelectrónica, posibilitan que los procesos litográficos para modificación superficial de materiales estén avanzando rápidamente debido a su conexión con las técnicas derivadas de la industria microelectrónica [52]. Los patrones que se generan pueden ser principalmente divididos en ordenados o desordenados. Los desordenados son aquellos modelos que aparecen de manera espontánea durante el proceso, ejemplo de estos serían los obtenidos mediante litografía coloidal. Las superficies con relieves de este tipo, tienden a dar rasgos organizados y orientados aleatoriamente, con la geometría imprecisa o no controlada. Son técnicas más simples, rápidas y baratas que aquellas que dan lugar a topografías ordenadas. Los procesos que darían lugar a estas últimas son por ejemplo la fotolitografía o la litografía a través de haz de electrones. Gracias a estas técnicas se obtienen patrones geométricamente precisos y bien ordenados [53]. Se han realizado comparaciones entre implantes modificados superficialmente a través de litografía con haz de electrones e implantes en cuya superficie se hayan generado nanoestructuras desordenadas. Los resultados muestran que la adhesión celular se ve reducida en aquellas topografías regulares, mientras que la existencia de protuberancias ordenadas en una dimensión pero antisimétricas (convexas en la punta y cóncavas en la parte inferior) ayudan a incrementar la adhesión. De este modo se revela la importancia del orden a la hora de diseñar patrones [54]. 3.2.1 Fotolitografía La fotolitografía fue una de las primeras técnicas de creación de patrones superficiales introducida para controlar el comportamiento de las células [55]. Normalmente un proceso fotolitográfico comprende los siguientes pasos: a) Preparar el substrato, limpiando y aplanando la superficie en la que se vaya a aplicar el proceso b) Revestir la superficie preparada con una fotorresina compuesta por un polímero, sensibilizador y un disolvente. c) Colocar la fotorresina bajo una máscara, normalmente de cuarzo o metal, para que quede expuesto el patrón que se desea. d) Transferir el patrón al substrato mediante el proceso de grabado e) Eliminar la fotoprotección El polímero de la fotorresina cambia su estructura cuando es expuesto a una radiación; el disolvente permite su aplicación y formación de un fina película sobre la superficie del material; los sensibilizadores controlan las reacciones fotoquímicas en la fase polimérica. La fotorresina puede ser positiva o negativa. Positiva cuando la solubilidad de las regiones expuestas a la radiación en un solvente, llamado revelador, es mucho mayor que para la región no expuesta (produce una imagen positiva de la máscara). Negativa si la solubilidad en el revelador de las regiones expuestas a la radiación es mucho menor que para la región no expuesta (produce una imagen negativa de la máscara). Por el momento, este método es capaz de crear patrones ordenados de un tamaño similar al de las células (1 µm es la resolución menor que se puede conseguir). 3.2.2 Litografía de escritura directa mediante láser El gradual avance de la fotolitografía, ha desarrollado un modo directo (sin necesidad de utilizar máscara) empleando un haz de luz focalizada para fabricar el patrón directamente en la superficie del material. En este tipo de fotolitografía el láser es la fuente de luz más comúnmente aplicada para aportar el haz de alta intensidad [56]. La luz ha de inducir dos tipos de reacciones en la superficie del material: por un lado una reacción Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 14 fotoquímica para las superficies fotoactivas [57] y por otro, una reacción física que implique corte, fundición o deformación del substrato por la alta energía del láser [58]. En la Tabla 1 aparece una comparativa entre distintos tipos de procesos que utilizan este tipo de técnica. 3.2.3 Litografía por haz de electrones La litografía por haz de electrones se ha empleado para generar topografías superficiales a escala nanométrica, gracias a un principio similar a la fotolitografía, con el fin de estudiar el crecimiento y comportamiento celular [59] [60]. Esta técnica permite realizar topografías a menor escala que la fotolitografía, ya que el haz de electrones es considerada como una onda de Broglie 4 , cuya longitud de onda es mucho menor que la del haz de luz (entre 3-5 nm) [60] [61]. Este proceso consiste en el bombardeo de electrones con alto nivel de energía contra la superficie de un material electronsensible que será reticulado, polimerizado o alterado químicamente por el haz de electrones. Se pueden utilizar materiales sensibles tanto positivos como negativos, aunque los negativos dan resultados menos precisos. A diferencia de la fotolitografía, con esta técnica no se requiere el uso de máscara, sino que se programa el patrón en la unidad controlando de manera precisa el recorrido del haz de electrones sobre la superficie. La precisión de esta técnica es alta, a pesar de ello, estudiar el comportamiento de poblaciones de bacterias implica un diseño de alta densidad de un único tipo de detalle (valles, montañas, postes, etc.). Esto hace que la precisión caiga hasta 30-40 nm [60]. Se han llevado a cabo diversos estudios gracias a este método de modificación superficial [62] [63], entre los cuáles, por ejemplo, se ha estudiado el diámetro de hueco y el tamaño entre ellos que sería beneficioso para ayudar a la adhesión de tejido celular en el implante, inhibiendo simultáneamente la adhesión de bacterias [64]. El procedimiento es costoso y lento, motivo por el cual se han buscado soluciones para aumentar su eficiencia. En lugar de generar patrones nanométricos en cada implante, esta técnica finalmente se utiliza para 4 Louis de Broglie propuso que, al igual que la radiación electromagnética lleva asociada un corpúsculo o partícula, el fotón, de forma que las propiedades ondulatorias, λ y ν, proporcionan la energía y el momento a través de E = hν, p = h/λ; Toda partícula de energía E y momento P lleva asociado un movimiento ondulatorio de longitud de onda λ = h/p. Así pues, los conceptos corpusculares (E y p) y los ondulatorios /λ, ν) se relacionan entre sí a través de la constante de Planck. Técnica Resolución Aplicaciones Materiales compatibles Limitaciones Sinterizado selectivo/ Fusión selectiva 50 µm Protésicas Ingeniería tisular Cerámicos Poliméricos Metálicos Alta temperatura Fabricación laminar Sinterizado por micro-laser 20 µm Protésicas Cerámicos Metálicos Fabricación laminar Alta temperatura Mecanizado láser 15 nm Microfluidos Stents Ingeniería tisular Cerámicos Poliméricos Metálicos Proceso descendente Escritura directa por evaporación con láser pulsado 10 µm Microelectrónicas Sensores químicos Ingeniería tisular Cerámicos Poliméricos Metálicos Biomoleculares Múltiples parámetros para el proceso Fabricación laminar Estereolitografía 1 µm Protésicas Ingeniería tisular Poliméricos Cerámicos compuestos Biomoleculares compuestos Fotopolimerización Fabricación laminar Bifotón polimerización < 100 nm Liberación de fármacos protésicos Ingeniería tisular Poliméricos Cerámicos compuestos Fabricación laminar Fotopolimerización Tabla 1.- Comparativa entre los distintos métodos de impresión directa litográfica por láser [57] Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 15 obtener geometrías sobre materiales poliméricos. Estas geometrías serán reproducidas posteriormente mediante técnicas más rápidas sobre las prótesis, aumentando la velocidad de fabricación de la litografía por haz de electrones y aumentando también la precisión del segundo proceso utilizado [53]. 3.2.4 Litografía blanda El proceso de modificación superficial de litografía blanda consiste en un compendio de técnicas relacionadas, cada una de las cuales utiliza estampas o canales fabricados en un elastómero (de donde procede el término blanda para definirla). La función del elastómero es transferir el patrón al material. Los distintos tipos de procedimientos englobados bajo el nombre de litografía blanda, presentan ciertos elementos comunes. En primer lugar, siempre ha de haber estampas elastoméricas fabricadas a partir de líquido polimérico, de un elastómero moldeado en una matriz con el patrón deseado en relieve. Para la producción de dichas matrices se suele utilizar la fotolitografía explicada anteriormente. Un elastómero comúnmente empleado es el polidimetilsiloxano (PDMS) por ser biocompatible y permeable a los gases. Además se tiene la experiencia de haber empleado matrices de este tipo durante meses, con más de 100 repeticiones, sin una degradación notable [65]. A parte de estas estampas, es necesario el uso de máscaras y un método de prototipado rápido, siendo esto último la característica fundamental. Las ventajas destacables de estos procesos son la rapidez, fabricación sencilla sin una alta inversión de capital y despreocupación de los parámetros del proceso. La utilización de este tipo de técnicas es alta, junto con la deposición de sol-gel, ya que concede libertad para la fabricación de formas y espesores de elementos micrométricos. Se consigue así, suprimir las dificultades derivadas de la fotolitografía directa en sol-gel, que da lugar a formas arbitrarias y grandes espesores [66]. Mediante la combinación de estos procesos se ha demostrado la posibilidad de crear micropatrones en las superficies con partículas bioactivas, que sirvan de guía para la regeneración del tejido [67]. Por otro lado, actualmente se investiga la influencia del comportamiento de los osteoblastos sobre los microsurcos en el TiO2 conseguidos gracias a la acción conjunta de ambos [68]. Además, se están desarrollando nuevas técnicas que combinan nanolitografía coloidal y microlitografía suave para producir polietilenglicol con microhuecos en la superficie, en el que se encajan nanopartículas de oro ordenadas. El objetivo, entre otros, es aumentar el control sobre el comportamiento de las células mediante la funcionalización de superficies controladas nanométricamente [69]. Por otro lado, también se encuentra en la literatura el estudio de la influencia de los surcos y pilares generados por estas técnicas en la diferenciación de células madre mesenquimales de la médula ósea en los huesos humanos [70]. Como ejemplos cabe citar el moldeado por microtransferencia, moldeado por réplica, micromoldeado en capilares, micromodelado asistido por disolvente o impresión por microcontacto [71]. 3.2.5 Litografía coloidal El término coloide hace referencia a un material que existe en un estado finamente dividido. Generalmente es una partícula sólida, pero también puede ser una gotita de líquido o una burbuja de gas. Las dimensiones de la mayoría de los coloides están entre los 5 y los 1 000 nm [72]. La litografía coloidal como técnica de modificación superficial, la litografía coloidal emplea una solución que actúa como máscara. La solución se dispersa como una monocapa sobre el substrato y se autoensambla electrostáticamente a él. El área adyacente a las partículas coloidales es bombardeada por un haz de iones que reaccionan con las partículas, creando el patrón deseado en el substrato [71]. 3.3. Métodos físicos Los métodos físicos son utilizados en su mayoría para modificar las características de la superficie sin que ocurran reacciones químicas. La energía y carga superficial, es decir, el grado de atracción o repulsión que la superficie del implante ejerce sobre el medio, interesan ser alteradas para conseguir una mejor oseointegración o por el contrario, en otras situaciones nos interesa que el implante no se adhiera demasiado al organismo de cara a una futura extracción. Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 16 El desarrollo de algunas de las técnicas que pueden ser agrupadas bajo esta denominación, se realiza a continuación. La característica principal que identifica los métodos físicos es la obtención de la capa superficial modificada o la capa añadida a la superficie del substrato de titanio mediante la energía térmica, cinética o eléctrica involucradas en el proceso [73]. 3.3.1 Depósito de películas delgadas mediante vaporización El recubrimiento en este tipo de procesos se obtiene mediante la fusión térmica de los materiales que lo conforman, de manera que éstos pasan a ser pequeñas gotas pulverizadas sobre el substrato a alta velocidad. En este caso, el recubrimiento se lleva a cabo mediante energía cinética. El objetivo de esta técnica es incrementar la resistencia al desgaste y la corrosión, así como mejorar las propiedades biológicas. Se suelen recubrir los substratos con capas de espesores entre 30 y 200 µm de diferentes materiales como titanio, hidroxiapatita, silicato cálcico, Al2O3, ZrO2 o TiO2 [73]. Los pasos a seguir en un proceso de vaporización son: 1.- Limpieza de la superficie a recubrir. 2.- Preparación de dicha superficie (generalmente mediante un granallado con corindón sintético o granalla angular metálica). 3.- Proyección de la capa de anclaje, o de la capa directamente en el caso de que esta última sea autoanclante. 4.- Mecanizado o rectificado final del recubrimiento si es necesario [74]. La vaporización de oxy-fuel a alta velocidad, la vaporización por detonación, la vaporización por arco, la vaporización por flama o la vaporización por plasma 5 entre otros, se engloban dentro de estos procedimientos. El método de vaporización térmica, concretamente por plasma, inyecta el material en polvo con el que se vaya a recubrir el substrato en el cañón de plasma a alta temperatura [75]. Las partículas de titanio son proyectadas hacia la superficie, donde se condensan y se fusionan entre ellas y con las partículas de pertenecientes a la superficie. Así se forma la capa de unos 30 µm de espesor, con una rugosidad promedio de 7 µm, valor que se ha demostrado que aumenta la resistencia de tracción en la superficie implante-hueso [76]. En comparación con otros procesos a altas temperaturas, su empleo disminuye el riesgo de degradación del substrato y del recubrimiento [74] Al ser uno de los procesos que más incrementa el perfil de rugosidades de la superficie y consecuentemente el área superficial, se recomienda su uso en zonas donde la densidad del hueso sea baja. Sin embargo, cuando se utiliza en zonas expuestas a fluidos orales, los huecos de tamaños próximos a 50 µm pueden facilitar la introducción de patógenos, a pesar de ser los tamaños efectivos para mejorar la oseointegración [77], (aunque en la literatura se ha demostrado que mediante poros de diámetro igual o superior a 50 µm la oseointegración mejora, la comunidad científica propone trabajar con huecos mayores, que ronden entre 100-200 µm). El uso de estas técnicas, destaca dentro del campo de los biomateriales, para facilitar un aumento de la resistencia a corrosión. Es conocido que el titanio es resistente a la corrosión debido a la capa de TiO2 que se le forma en la superficie para protegerlo. Sin embargo, si se trabaja directamente con el material conteniendo dicho compuesto, se mejorará su respuesta indudablemente. De este modo, se nanoestructura el recubrimiento para llegar a una superficie mimetizada que aumente la adhesión de osteoblastos, incrementando la biocompatibilidad del implante [78]. 3.3.2 Depósito de partículas delgadas por evaporación física Los materiales que se desean depositar sobre el substrato, son evaporados o pulverizados mediante deposición catódica para formar átomos, moléculas o iones que se transportaran a la superficie del objeto. Allí, 5 Según la RAE, podemos denominar plasma a todo gas ionizado que se produce a temperaturas extremadamente elevadas y que contiene cargas positivas y negativas enun número aproximadamente igual. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 17 a veces transcurren algunas reacciones entre estos materiales y la superficie del substrato o se condensan, dando lugar a la formación de una pequeña capa cobertora. Los parámetros y pasos importantes en esta técnica son: 1) Síntesis del material que va a ser depositado (transición de una fase sólida o líquida a una fase vapor y en algunos casos una reacción entre los componentes de la fase) 2) Transporte de las partículas de la fuente al substrato y condensación de los gases en la capa para la nucleación y el crecimiento. 3) Energía de las partículas, densidad, temperatura del substrato y propiedades reactivas del gas. La técnica engloba procesos caracterizados por: generar recubrimientos de alta densidad y fuerte adhesión, así como capas multicomponente; llevarse a cabo con el substrato a baja temperatura y emplear un sinfín de materiales tanto como recubrimiento como de substrato [79]. Se utiliza esta técnica para conseguir aumentar la biocompatibilidad, la bioactividad, y la resistencia a la corrosión y al desgaste [80]. Se suelen generan capas de espesores de alrededor de 1µm de TiN, TiC o TiCN. La deposición por evaporación física se puede llevar a cabo mediante tres procedimientos diferentes. En primer lugar, a través de evaporización en vacío. Este proceso consiste en calentar el material a depositar directamente por resistencias, radiación, haz de electrones o un arco de descarga. La presión del vapor generado ha de mantenerse entre 0,1 y 1 Pa, y no a una atmósfera como ocurre durante la ebullición. Los átomos son transportados sin colisiones hasta el substrato donde condensan. Con el fin de conseguir uniformidad en la capa, se mantiene la deposición en rangos de 10–25 000 nm/min. [81]. El proceso de recubrimiento iónico, proceso híbrido, consiste en el bombardeo energético de la superficie del substrato mediante partículas evaporadas como en el procedimiento anterior. A diferencia de la técnica anterior, las partículas de vapor en su camino hacia la superficie del substrato pasan a través de una cámara, que los redirige y aumenta su energía. El substrato se ve alterado por la gran energía de las partículas, quedando con tensiones residuales y sufriendo modificación en la microestructura, al ser recubierto por la fina capa. La tasa de deposición al igual que en la evaporación se encuentra entre 10– 25000 nm/min [79] [81]. La pulverización catódica, por su parte, procede al bombardeo de la superficie del implante mediante iones de gas positivos procedentes de una descarga incandescente eléctrica. Como consecuencia, grupos de átomos se desagregan, pasando a fase vapor y depositándose sobre el substrato. Debido a que las cerámicas y los materiales refractarios son difíciles de depositar a través de evaporación, este método resulta ser muy efectivo. Este método tenía como inconveniente una adhesión insuficiente, ya que se ha observado como capas de hidroxiapatita y titanio depositadas mediante este método se han disuelto tras tres semanas inmersas en fluidos que simulan los humanos [82]. Sin embargo, estudios posteriores han desarrollado nuevos protocolos para depositar recubrimientos mediante pulverización catódica, consiguiendo una alta adhesión (no menguante) y resistencia a los fluidos fisiológicos humanos tras 14 semanas de inmersión [83]. Figura 10.- Ilustraciones de los procesos básicos de evaporación, recubrimiento iónico y pulverización catódica [79] Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 18 La incapacidad de crear depósitos poliméricos (salvo alguna excepción), un alto coste inicial y alto nivel de conocimiento para la utilización de los equipos [79], son algunas de las desventajas destacables de los procesos de deposición por evaporación física. 3.3.3 Implantación iónica La implantación iónica consiste en un proceso llevado a cabo en vacío, por lo que resulta ser un procedimiento muy limpio capaz de sinterizar capas de alta pureza. Esta técnica conlleva que iones energéticos sean introducidos en la capa superficial del substrato mediante bombardeo. La energía de los mismos hace posible el empleo de un amplio rango de especies atómicas. La energía de los iones se selecciona de tal modo que no genere daño profundo al material contra el que son lanzados. De esta forma, las modificaciones tienen lugar en la superficie del substrato y en una capa interna de 1 µm de espesor. Puesto que no existe una interfase clara entre el substrato y la capa implantada de iones, la adhesión del recubrimiento es muy alta. Los principales parámetros a variar en esta técnica son las especies iónicas lanzadas, la energía del haz, el número total de iones con los que se bombardea el material y la densidad del haz. El gran control que existe sobre estos parámetros permite manejar de manera precisa los efectos finales que se producen en el substrato [84]. Ion implantado Objetivo perseguido Nitrógeno Aumentar la resistencia al desgaste. Calcio Aumentar la conductividad del hueso. Calcio y fósforo Mejorar biocompatibilidad (remodelación del hueso [85]). Plata Aplicaciones antibacterianas. Magnesio y titanio Aumentar de la superficie del implante ocupada por células [86]. Argón Reducir la inflamación del tejido como respuesta al poliuretano, excepto en Ti [87]. Estroncio y silicio Mejorar las propiedades oseoconductivas. Tabla 2.- Objetivo perseguido según el ion utilizado en el proceso de implantación iónica. La implantación iónica es utilizada para obtener características muy efectivas en biomateriales. Por una parte, como ya hablamos en la introducción, unos de los problemas principales de los implantes es la diferencia entre el módulo de Young del hueso y del implante. Esta diferencia, aparte de a través de materiales porosos, puede ser reducida gracias a que la implantación iónica conlleva una composición gradual, implicando la reducción de concentrador de tensiones [88]. Además, la implantación iónica implica un endurecimiento de las capas superficiales del substrato [89], aumento de la resistencia al desgaste [90], mejora de la respuesta ante creep, incremento de la resistencia a fretting y a fatiga [91] y acentuación de la tenacidad a fractura [92], así como de la resistencia a corrosión [93]. 3.3.4 Descarga de plasma incandescente El tratamiento por descarga de plasma incandescente es una técnica empleada para limpiar, activar la superficie y en algunos casos esterilizar el substrato mediante la utilización de gas plasma a baja temperatura [81]. La técnica utiliza una corriente continua de plasma a baja presión (de ahora en a delante se denominará tratamiento de plasma). La muestra a la que se le aplica este proceso siempre estará cargada negativamente (cátodo). Se elige un electrodo de simetría cilíndrica como el de la Figura 11, en lugar de poseer simetría planar, para poder tratar piezas cilíndricas, como pueden ser los tornillos de los implantes dentales. El substrato o la pieza se centra en el interior de dos cilindros de Ti. El cilindro interior, conectado a tierra o a un alto voltaje negativo, está eléctricamente aislado tanto de la muestra como del cilindro exterior. Si está conectado a tierra, se comporta como ánodo, dando lugar a un diodo. Si por el contrario, está conectado a un alto potencial negativo, produciendo un triodo. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 19 Para evitar la contaminación debida al bombardeo de elementos externos hacia el substrato, todo lo que quede a la vista de la muestra se fabrica de Ti. El tratamiento de plasma se lleva a cabo a través de una bomba de alto vacío que permite un sistema con presiones <10-7 Pa. El uso de alto vacío conlleva minimizar la contaminación por gas residual, problema común sobre todo es superficies reactivas. Existen dos cámaras en el sistema conectadas a través de una válvula. El sistema de alto vacío está registrado por un ordenador, de modo que se pueden grabar los parámetros durante el proceso. Las fuentes para impulsar esta técnica son dos: descarga magnetrónica y descarga por radio-frecuencia. La primera utiliza campos magnéticos conjuntamente con el cátodo, de modo que los iones pueden difundirse únicamente a través de colisiones y oscilaciones de plasma. Este tipo de descargas son muy eficientes. Por su parte, la descarga por radio-frecuencia consiste en aplicar una frecuencia de operación (13,65 MHz), con la cual sólo los electrones pueden seguir las variaciones temporales aplicadas por el potencial. De este modo el proceso se entiende como el movimiento del gas de electrones hacia delante y hacia atrás por la frecuencia aplicada, mientras los iones quedan estacionarios [94]. Las superficies expuestas son bombardeadas por electrones e iones durante la descarga de plasma incandescente. El número de los mismos que impactan con el material depende de los parámetros de ajuste del proceso. La influencia de la descarga de plasma incandescente de nitrógeno, oxígeno y carbonitruros sobre la aleación de TiAlMn, ha sido estudiada. Estos tratamientos producen capas superficiales de carácter difusivo por las cuales se observa una alta dureza, buena resistencia al desgaste y a la corrosión, así como un incremento del límite de fatiga. Los mejores resultados son los mostrados al añadir carbonitruros [95]. Los resultados de los estudios llevados a cabo, en lo referente a la integración de osteoblastos, muestran que tras la aplicación de un proceso de este tipo a la superficie de implantes, la adhesión y la diferenciación de dichas células son posibles [96]. Otras investigaciones concluyen con datos que muestran que gracias a esta técnica, la cantidad de proteínas con secuencia de RGD absorbidas aumenta, derivando en un aumento de la adhesión, tanto de osteoclastos como de osteoblastos. Todo esto se debe al aumento de energía superficial que supone la descarga de plasma incandescente [97]. Por estos y otros estudios se ha considerado una técnica de modificación superficial prometedora dentro del campo de los biomateriales [98] [99]. 3.4. Métodos electroquímicos Los métodos electroquímicos se llevan a cabo, conectando un dispositivo metálico al polo positivo de un circuito eléctrico, para posteriormente sumergir el dispositivo en una solución electrolítica que contenga sustancias iónicas u oxidantes. Esta metodología requiere la incorporación de iones a la superficie del material Figura 11.- Esquema del equipo utilizado para la descarga de plasma incandescente [94] Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 26 (2) Ataque químico mediante solución alcalina El presente método hace posible la formación de una capa de hidroxiapatita ósea biológicamente activa sobre la superficie de materiales cerámicos bioactivos. El tratamiento alcalino y térmico consiste en sumergir el substrato en una solución de hidróxido sódico (NaOH) o potásico (KOH) durante 24 horas, y se limpia. Posteriormente, los substratos son secados, para finalmente elevar su temperatura entre 600-800 ºC durante 1 hora. El aumento de temperatura tan acusado deberá ser llevado a cabo con presiones controladas, ya que de lo contrario el titanio tenderá a oxidarse. La capa de titanato de sodio que se forma comienza a liberar iones Na+ al fluido cercano, mediante el intercambio con los iones H3O+ existentes en el fluido para formar TiOH. Las moléculas de TiOH interaccionan inmediatamente con los iones de calcio disueltos en el fluido, formándose titanato de calcio. A medida que los iones de calcio se acumulan sobre la superficie, ésta gana carga positiva de forma gradual. Como resultado, las cargas positivas atraen al fosfonato disuelto en los fluidos biológicos, dando lugar a fosfonato cálcico amorfo. Puesto que la apatita es la fase estable en el organismo humano, el fosfonato de calcio se transforma espontáneamente en dicho material. Con este tipo de ataque mediante microscopía óptica es posible la visualización de grietas generadas en el substrato una vez transcurrido el proceso. Tras los ensayos in vitro se aprecia como las capas finas y suaves muestran mejor estabilidad física y adhesión ósea que las gruesas y toscas [140]. Se observa además cómo la hidroxiapatita se deposita tanto en el exterior como en el interior de los poros superficiales de los implantes, lo que supone la capacidad de inducir crecimiento de tejido en el interior de los poros [141]. Recientes investigaciones acerca de este tratamiento, tienden a combinarlo con técnicas electroquímicas para mejorar las propiedades finales de los substratos, buscando un aumento de la adhesión al hueso mientras se crea una capa de óxido suficiente para mejorar la bioactividad [142]. (3) Ataque químico mediante solución ácida El presente tipo de tratamiento químico, en mucha bibliografía aparece erróneamente clasificado como técnica de limpieza previa a otro proceso de modificación superficial, con la que se elimina el óxido y la contaminación que pueda aparecer sobre los materiales a modificar [73] [81]. Sin embargo, al profundizar en el estudio de este método se obtiene información que, lejos de apuntar a esta dirección, subraya las virtudes de esta técnica como vía económica y efectiva de bioactivar implantes. Al principio, esta técnica se combinaba con el arenado para conseguir mejores resultados en lo que a contacto con el hueso se refiere, aumentando la formación del mismo sobre la superficie del implante [143] [144]. Sin embargo, distintos estudios han rechazado compaginar ambos procesos por haber observado la inclusión de pequeñas partículas procedentes del arenado en el material del implante, convirtiéndose en una de las causas del debilitamiento del tejido [145]. A raíz del suceso anterior, se encamina el estudio de ataques químicos ácidos hacia nuevas técnicas en las que se persiguen los mismos objetivos de manera autónoma, sin involucrar un segundo método de modificación superficial que pueda adherir partículas ajenas al implante [146]. El objetivo es obtener micro-rugosidades en la superficie atacada, promoviendo una rápida oseointegración. Se ha demostrado que los implantes atacados con ácido presentan una mayor resistencia a la extracción mediante par inverso frente a los tratamientos mecánicos. Mayores fuerzas de extracción se traducen en un mayor contacto entre el hueso y el implante, implicando una mejor oseointegración [147]. El ataque químico se puede definir como un método de eliminación de material, a través del cual se crean “hoyos” en la superficie del material tratado. Es una técnica de particular interés puesto que una superficie microestructurada (una rugosidad fina con hoyos en torno a 1-3 µm de tamaño y una de mayor rugosidad que alcanza valores que rondan los 6-10 µm), parece mejorar la integración endógena temprana y la estabilidad del implante [148]. Ciertos estudios han comparado los efectos del ataque químico ácido con los originados al combinar recubrimientos de fosfato. Se ha obtenido existencia de osteoblastos cercanos a los ambos implantes, un contacto similar entre el implante y el hueso y una mayor deposición de mineral sobre la muestra sin recubrimiento [149]. Durante el desarrollo de este método de modificación superficial, se han utilizado diferentes soluciones para conseguir el objetivo perseguido. Una de las mezclas más novedosas y económicas está basada en una solución de ácido fosfórico y fluoruro de sodio, con la cual, el titanio obtiene menores niveles de hidrógeno mientras se Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 27 aumenta la deposición de fosfonato cálcico. Se alcanzan de esta forma rugosidades similares a las obtenidas mediante otras soluciones convencionales [150]. La introducción de otro avance método es la utilización de un tratamiento con ácido nítrico y otro tratamiento ácido mixto para conseguir depositar hidroxiapatita biomimética. Se emplean temperaturas menores y tiempos menores al emplear el tratamiento mixto que empleando ácido nítrico, realizando una modificación superficial alternativa al tratamiento alcalino [151] [152]. Los tratamientos químicos ácidos no generan topografías superficiales estándars, es decir, se obtienen diferentes perfiles de rugosidad, así como diferentes manifestaciones en la superficie (huecos, grietas, islas,…) según la variación de los distintos parámetros. El tratamiento previo, composición del ácido al que se expone la muestra, temperatura del ácido, post-tratamiento o tiempo de exposición al ácido son las variables principales a controlar en el proceso [150]. Algunos estudios aseguran que si se ataca con la misma temperatura, la superficie mantendrá el aspecto irregular. Dichas irregularidades crecen en tamaño y profundidad cuando aumenta el tiempo de ataque. Por tanto, es la temperatura la que influye de manera determinante sobre la rugosidad media [153]. Aunque ciertos estudios parecen indicar la influencia de la variación de determinados parámetros a la superficie atacada del material, el campo a investigar es muy amplio aún. En esto se basa la parte experimental de este proyecto, tratando de profundizar en el efecto de algunos de los parámetros de esta técnica, como son el tamaño de poro y el tiempo de ataque químico sobre el mismo. Estado del Arte sobre las Técnicas de Manipulación de la Rugosidad y la Textura de la superficie del Implante 28 29 4 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1 Materiales Los materiales de los que se parte para la realización de este trabajo fin de grado son los siguientes: 4.1.1 Polvos de titanio El polvo de titanio utilizado en la fabricación de los compactos ha sido obtenido mediante un proceso de hidrogenación / deshidrogenación y su fabricante es SE-JONG Materials Co. Ltd., Corea. La designación del polvo es Ti-325mesh, su pureza y los elementos que presenta en trazas se encuentran especificados en la Tabla 3. Comparando los contenidos de impurezas con las especificaciones de la ASTM B265-06a se observa que se asemejan a los valores establecidos para el grado IV, aunque en este caso superan ligeramente los máximos especificados en dicha norma [154] Pureza Ti O N Fe Si Otros >99,5 <0,45 <0,08 <0,038 <0,035 0,003 Mg 0,0006 Mn Tabla 3.- Composición en tanto por ciento en peso (%p/p) de los elementos presentes en los polvos de titanio. La norma ASTM F67-00 define cuatro grados de titanio para su aplicación biomédica. La composición química de cada grado se especifica en la Tabla 4. Tipo Ti c.p. Nmáx Cmáx Hmáx Femáx Omáx Ti Ti c.p. Grado I 0,0300 0,1000 0,0125 0,2000 0,1800 Balance Ti c.p. Grado II 0,0300 0,1000 0,0125 0,3000 0,2500 Balance Ti c.p. Grado III 0,0500 0,1000 0,0125 0,3000 0,3500 Balance Ti c.p. Grado IV 0,0500 0,1000 0,0125 0,5000 0,4000 Balance Tabla 4.- Composición química (% en peso) de los cuatro grados de Ti c.p. existentes para las aplicaciones biomédicas. Una vez analizada la composición de los polvos de titanio empleados en la fabricación de los compactos, se pueden clasificar como Ti c.p. de grado IV según las especificaciones de la norma ASTM F67-00. En esta norma “La diferencia entre ganar y perder a menudo consiste en no abandonar”. - Walt Disney - Materiales y Procedimiento Experimental 30 se recogen también las propiedades mecánicas requeridas para cada grado, dichas propiedades se muestran en la Tabla 5. Adicionalmente, para el titanio macizo la resistencia a la compresión es de 650 MPa. Tipo Ti c.p. Resistencia a la tracción mín. [MPa] Límite elástico al 0.2% mín. [MPa] Elongación en 4D mín. [%] Ti c.p. Grado I 240 170 24 Ti c.p. Grado II 345 275 20 Ti c.p. Grado III 450 380 18 Ti c.p. Grado IV 550 483 15 Tabla 5.- Propiedades mecánicas exigidas a los diferentes grados de Ti c.p. para aplicaciones biomédicas. La caracterización del polvo de titanio incluye el estudio de su granulometría, su morfología y su microestructura. A. Morfología y microestructura La forma de las partículas es muy irregular y la rotura frágil de las mismas no ha implicado bordes facetados, sino con muchos salientes y arrugas. Cabe señalar también que las partículas aparecen agrupadas, las pequeñas unidas a algunas de mayor tamaño. Figura 15.- Microestructura de los polvos de Titanio SE-JONG 4. Figura 14.- Morfología de los polvos de Titanio SE-JONG 4 obtenida mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 31 B. Granulometría de los polvos de Ti c.p. La ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. presenta la distribución Gaussiana usando difracción áser (Malvern, Mastersizer 2000) para la medición de la granulometría del polvo de titanio. El estudio de la granulometría de los polvos de titanio muestra: un 10 % de las partículas posee un diámetro inferior a 9.7 μm, un 50 %, inferior a 23.3 μm y un 90 %, inferior a 48.4 μm y un D[4,3] de 59 μm. 4.1.2 Polvos de bicarbonato de amonio La fabricación de los compactos se lleva a cabo utilizando como espaciador polvo de bicarbonato de amonio. El bicarbonato de amonio empleado corresponde con el suministrado por Alfa Aesar, con una puresa del 99.9%. Sus propiedades más representativas se encuentran en la Tabla 6. Fórmula Densidad [g/cm3] Punto de fusión [ᵒC] Sensibilidad (NH4)HCO3 1,6 620 subl. Soluble en agua fría. Se descompone con el agua caliente. Insoluble en alcohol y acetona. Tabla 6.- Propiedades del bicarbonato de amonio. A. Morfología de los polvos en estado de recepción La imagen tomada por SEM muestra cómo las partículas presentan una forma sin excesivas irregularidades y con bordes facetados. Esto se debe a la estructura cristalina del bicarbonato de amonio (Figura 17). Figura 17.- Morfología de los polvos de bicarbonato de amonio obtenida mediante SEM. Figura 16.- Distribución granulométrica del polvo de titanio SE-JONG 4. Materiales y Procedimiento Experimental 32 B. Tamizado La búsqueda tanto del crecimiento del hueso hacia el interior de los implantes (ingrowth), como de la infiltración de posibles recubrimientos sin perder resistencia mecánica por tener poros demasiado grandes, hace necesario diferenciar el tamaño de espaciador ha utilizar. Por tanto, el polvo de bicarbonato se tamiza de forma que se obtienen 3 rangos distintos de tamaños de partícula, quedando lo más uniforme posible. Los rangos son de 100 μm a 200 μm, de 250 μm a 355 μm y de 355 μm a 500 μm. El tamizado comienza agitando los polvos de NH4HCO3 para conseguir homogeneizar y desapelmazar las posibles aglomeraciones de la cantidad de espaciador deseada. El objetivo de esta acción es la realización de un buen tamizado posterior, ya que si existe unión entre varias partículas, el último tamiz por el que pasarán no se corresponderá con su verdadero tamaño. Si esto sucediera, el tamaño de poro de los substratos obtenidos no concordaría con el rango establecido. Para agitar los polvos, se comienza por pesar la cantidad de polvo que se desea tamizar y se vierte en un frasco. Se cierra dicho frasco y con cuidado se posiciona en la túrbula. Se acciona la máquina girando la rueda de la izquierda y se deja mezclar durante 40 minutos. Figura 18.- Túrbula. Los tamices necesitan ser limpiados antes de usarlos para eliminar cualquier partícula que haya podido quedar encajada durante tamizados anteriores. De este modo se impide que los substratos se contaminen. Dicha limpieza se realiza mediante ultrasonidos. Se comprueba que el agua del baño esté limpia, si no es el caso, se remplaza por agua nueva. Una vez el equipo esté en condiciones adecuadas, se introduce cada tamiz por separado durante 10 minutos, tras los que se seca concienzudamente para evitar que los polvos de espaciador queden adheridos a las paredes del tamiz. La tapadera (tamiz ciego) se esteriliza con alcohol, un secado basto con papel y un segundo secado mediante el uso de un secador. Figura 19.- Ultrasonidos. Una vez que todos los tamices se hayan limpiado y secado correctamente, se colocan los de 100 µm, 200 µm, 250 μm, 355 μm y 500 μm en el vibrador en el orden correspondiente para obtener los polvos en los rangos deseados (100-200 μm, 250-350 μm y 355-500 μm) y por último se posiciona la tapadera para evitar perder las partículas durante la vibración. Se agarran los tamices mediante dos mordazas, con el fin de que queden bien sujetos. Se vierten los polvos de bicarbonato de amonio en el tamiz superior y se enciende el vibrador, que ha de funcionar durante 10 minutos. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 33 Figura 20.- Tamizado. A continuación, se procede a la clasificación de los polvos de bicarbonato de amonio obtenido en los diferentes tamices en sus rangos correspondientes y se colocan en recipientes separados. La Tabla 7 contiene las proporciones que se obtienen de cada rango de tamaño de partícula a partir del polvo en estado de recepción al tamizar. Rango de Tamaño % < 100 µm 13,3 100 - 200 µm 28,9 200 - 250 µm 5,4 250 - 355 µm 22,2 355 - 500 µm 21,6 > 500 µm 7,7 Tabla 7.- Proporciones de los diferentes rangos de tamaño en 100 g de polvo de bicarbonato en estado de recepción. C. Morfología de los distintos rangos de NH4HCO3 La forma alargada de los granos puede ocasionar cierto error en cuanto a los resultados de tamaño de grano obtenidos en la granulometría y el tamaño de los granos según el tamizado. Esto se debe a que un grano con un determinado tamaño medio pero con una forma muy alargada puede pasar a un tamiz de menor tamaño si se sitúa con la cara de menor tamaño perpendicular al tamiz. Por tanto, puede ocurrir que el tamaño de grano medio que se obtenga de la granulometría sea mayor que el esperado por el tamaño del tamiz. D. Granulometría de los polvos de bicarbonato de amonio tamizados. La esquina superior izquierda de la Figura 22 presenta la distribución Gaussiana usando difracción láser para obtener la granulometría del bicarbonato de amonio en estado de recepción. Mientras que el resto de gráficas de Figura 21.- Tamaño de partícula del polvo obtenido en el rango tamizado de 100-200 (izq.), 250-355 µm (centro) y de 355-500 µm (dcha.). Materiales y Procedimiento Experimental 34 la figura muestran la distribución Gaussiana empleando también difracción láser para las granulometrías de los distintos polvos tamizados que serán utilizados como espaciador. En la Tabla 8 se presentan los resultados del estudio de granulometría de los polvos de bicarbonato de amonio en estado de recepción y según el tamaño tamizado usando difracción láser. Se observa cómo los polvos de NH4HCO3 son más finos que los de titanio c.p. y que por lo general el rango de marcado por los tamices es menor del que muestra la granulometría, por lo que al fabricar los substratos, el tamaño de los poros será algo mayor de lo esperado. Tamaño según tamiz Tamaño de partículas (µm) 10% 50% 90% D[4,3] Estado recep. < 88,6 < 311,8 < 664,0 348,2 100-200 µm < 118,7 < 184,4 < 286,4 195,3 250-355 µm < 246,3 < 376,9 < 571,8 395,2 355-500 µm < 354,6 < 524,3 < 763,9 544,6 Tabla 8.- Estudio de la granulometría de los polvos de bicarbonato de amonio 4.1.3 Reactivos químicos para el ataque La mezcla reactiva utilizada en el ataque de los substratos para obtener las distintas rugosidades en la superficie de las muestras está compuesta por: agua destilada, un inhibidor y 22 ml/l de ácido fluorhídrico. El ácido fluorhídrico es un ácido inorgánico muy fuerte, constituido por una solución acuosa de fluoruro de hidrógeno. Se obtiene por la reacción de fluoruro de calcio con ácido sulfúrico. Es un líquido incoloro, tóxico y altamente corrosivo. Al tratarse de una sustancia irritante, corrosiva y tóxica, ingerirlo, inhalarlo o mantener contacto directo con él producirá efectos adversos. Para evitar dichos efectos al trabajar con HF se debe tomar ciertas medidas de protección. Las manipulaciones a pequeña escala se realizan bajo una campana aspirante, en un lugar bien ventilado y se utilizan materiales de plástico para manipularlo y almacenarlo, ya que puede corroer los vidrios. Figura 22.- Distribución granulométrica del polvo de bicarbonato de amonio Alfa Aesar en estado de recepción (a) y tamizado con tamaño comprendido entre 100-200 µm (b), 250-355 µm (c) y 355-500 µm (d). a) b) c) d) Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 35 4.2 Procedimientos experimentales 4.2.1 Fabricación y caracterización de los substratos de Ti c.p. porosos La fabricación de los substratos de Ti c.p. porosos consta de distintas etapas, explicadas a continuación. A. Preparación de la mezcla del Titanio c.p. y el espaciador La mezcla de ambos polvos se realiza con una proporción en volumen del 50% de titanio y 50% de NH4HCO3 para conseguir substratos con porosidad del 50%. Las probetas a utilizadas se pueden distinguir en:  Probetas de Ti c.p. macizas de 5 mm de altura y 12 mm de diámetro, para atacarlas químicamente.  Probetas de 50% en volumen de Ti c.p. y 50% de bicarbonato de amonio, de 5 mm de altura y 12 mm de diámetro (se realizarán para los tres tamaños de bicarbonato de amonio), para atacarlas químicamente.  Probetas de Ti c.p. macizas de 8 mm de diámetro y altura 0,9 veces el diámetro, es decir 7,2 mm, para ensayos de compresión.  Probetas de 50% en volumen de Ti c.p. y 50% de bicarbonato de amonio de 8 mm de diámetro y altura 0,9 veces el diámetro, es decir 7,2 mm (se realizarán para los tres tamaños de bicarbonato de amonio), para ensayos de compresión. La cantidad de polvo de cada material necesaria para cada probeta, se obtiene mediante la regla de mezclas explicada a continuación, que parte de las densidades de los distintos elementos: ρTi = 4,507 g/cm3 ρNH4HCO3 = 1,586 g/cm3 Se calcula la densidad que tendrá una mezcla de titanio en polvo con bicarbonato de amonio 50% en volumen mediante la ecuación ( I ), obteniendo un valor de densidad de 3,0465 g/cm3, 𝜌𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 = 𝑉𝑇𝑖(%)∗ 𝜌𝑇𝑖 +𝑉𝑁𝐻4𝐻𝐶𝑂3∗𝜌𝑁𝐻4𝐻𝐶𝑂3 ( I ) La mezcla será compactada a una presión de 800 MPa, por lo que se hace necesario corregir la densidad y calcular la masa adecuada para lograr el tamaño de compacto deseado después de la compactación. La densidad corregida se extrae de la curva de compactación del titanio y bicarbonato de amonio, siendo ésta el 85% de la original, es decir 2,59 g/cm3. Figura 23.- Curva de compactación de titanio y bicarbonato de amonio Materiales y Procedimiento Experimental 42 A continuación, se elige la cara que aparentemente es más simétrica, redonda y sin pérdida de bordes para que sea la de referencia. Se divide mediante líneas imaginarias la muestra en ocho sectores (como en la Figura 34), para medir cuatro diámetros en la cara de referencia (superior) y dos diámetros tanto en la parte central como en la inferior. La altura de los substratos se obtiene en el borde de cada división de los cilindros. Posteriormente, se pesan en una balanza de precisión. Figura 34.- División imaginaria de los compactos. A efectos de cálculo, se utiliza el valor promedio de cada dimensión con aproximaciones hasta las décimas. Este procedimiento se realiza antes y después de la etapa de sinterizado, de forma que se comparen los siguientes parámetros para cada tamaño de poro: diámetro a diferente altura (para comprobar si se produce en este tipo de probetas contracción en forma de reloj de arena), diámetro medio, altura media y volumen. Se calculará el volumen de cada muestra después de eliminar el espaciador (Ve) y tras la sinterización (Vs) (ecuación ( III )). Para el cálculo de contracciones (Cx) se resta el parámetro antes de sinterizar y después de sinterizar y se normaliza dividiendo entre el valor antes de sinterizar (ecuación ( IV )). 𝑉𝑥= 𝜋 𝑑2 4 ∙ ℎ ( III ) 𝐶𝑥(%)= 𝑋𝑒−𝑋𝑠 𝑋𝑒 ( IV ) La densidad de la muestra tras eliminar el espaciador y tras la sinterización se halla con estos volúmenes. Únicamente necesitamos pesar la masa de las mismas tras ambos procesos (D), de modo que la densidad (ρ) se hallaría mediante la ecuación ( V ). 𝜌= 𝐷 𝑉 ( V ) La densidad también puede calcularse a través del método de Arquímedes con impregnación mediante agua destilada, al ser el más sencillo y fiable desde el punto de vista experimental. El método de Arquímedes viene descrito en la norma ASTM C373-88. Se aplica antes y después de preparar las muestras metalográficamente. No se utiliza antes de sinterizar para evitar que la muestra se dañe. Para aplicar este método, se comienza por pesar la probeta en una balanza de precisión. Este valor corresponde a la masa de la probeta en seco D (masa en gramos). Se calienta la probeta en agua destilada durante 5 horas y se deja reposar en agua durante 24 horas. Posteriormente, se pesa la probeta impregnada sumergida en agua. Este valor corresponde a la masa de la probeta sumergida S (masa en gramos). Se saca la probeta sumergida y se vuelve a introducir en agua para que recupere el agua que haya podido perder. Se vuelve a extraer del agua y se elimina el exceso de agua con un paño húmedo. Se pesa la probeta sin el agua sobrante. Este valor corresponde a la masa de la probeta saturada M (masa en gramos). Cada una de las medidas se toma tres veces con el fin de optimizar el procedimiento y minimizar la incertidumbre de medida de la porosidad de las muestras. La balanza utilizada en las medidas de masa es una balanza digital de precisión OHAUS EXPLORER PRO modelo EP114C con una sensibilidad de 0.00001 g (Figura 35). Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 43 Figura 35.- Balanza OHAUS Explorer Pro. Sabiendo que la densidad del agua es 1g/cm3, y haciendo uso de los diferentes pesos calculados, se calcula la densidad, ρ, mediante la ecuación ( VI )¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. 𝜌= 𝐷 𝑀−𝑆 𝜌𝑎𝑔𝑢𝑎 ( VI ) b. Caracterizacio n de la porosidad La porosidad de las muestras se obtiene a través de diversos métodos. Cada uno de los métodos se aplica para unas condiciones del substrato específicas. Por un lado, gracias a las medidas geométricas utilizadas para calcular las contracciones volumétricas, se calcula la porosidad tras la eliminación del espaciador y tras la sinterización. Además de la altura y el diámetro, se requiere conocer la densidad del titanio c.p. y la masa del substrato (D). Con estos datos se obtiene el volumen poroso (Vp, ( VII )), el volumen macizo (Vm, ( VIII )), la relación de volúmenes (Rv, ( IX )) y la porosidad (P, ( X )). 𝑉𝑝 = 𝐷 𝜌𝑇𝑖 ( VII ) 𝑉𝑚 = 𝜋 𝑑2 4∗ℎ ( VIII ) 𝑅𝑣 = 𝑉𝑝 𝑉𝑚 ( IX ) 𝑃 = (1−𝑅𝑣)∗100 ( X ) El análisis de imagen es otro método empleado para calcular la porosidad de las muestras. Esta técnica conlleva la necesidad de una buena preparación metalográfica de los substratos para que el microscopio óptico metalográfico sea capaz de obtener imágenes adecuadas. La preparación metalográfica consta de tres pasos: desbaste, pulido y limpieza. El objetivo del proceso de desbaste es conseguir que en la superficie de la muestra existan rayas en una única dirección; la del último paso del desbaste. Se realiza en una desbastadora de la casa STRUERS (Figura 36). Materiales y Procedimiento Experimental 44 Figura 36.- Desbastadora de la casa STRUERS. Durante el proceso de desbaste ha de utilizarse agua como refrigerante y lubricante. Se comienza con la lija número 120. La lija debe estar siempre bien húmeda. Se debe desbastar en una sola dirección, ya que el proceso termina cuando en toda la superficie de la muestra se observen las típicas líneas de desbaste orientadas en la dirección del movimiento fijado (sólo si fuera necesario, se debe comprobar usando un microscopio, si no se tiene experiencia). No existe un tiempo determinado de desbaste para cada etapa, sino un proceso iterativo hasta conseguir el objetivo descrito anteriormente en el menor tiempo posible. Las lijas se cambian al detectar problemas en el acabado de la muestra. El proceso se repite con las siguientes lijas de grano cada vez más fino, comenzando por 240, 600, 1200, 2500 y finalizando con 4000. En cada paso, el desbaste se debe realizar en la dirección perpendicular al desbaste realizado con la lija anterior. La aparición de cuñas durante el proceso de desbaste es muy probable en el caso de las probetas porosas, por lo que se debe cuidar que la superficie del compacto se mantenga paralela a la lija. El objetivo, entre otros, es abrir la superficie del substrato, así como los posibles poros que pueda contener. El pulido mecanoquímico emplea sílica coloidal (OP-S) y Peróxido de Hidrógeno (30% de concentración) como suspensión abrasiva. Se prepara una “mezcla fresca” (no sirve de un día para otro) con 90 ml de sílica y 10 ml de peróxido de hidrógeno. El paño de pulido es MD CHEN (paño negro) y debe haberse humedecido y lavado previamente (para eliminar partículas que vuelvan a rayar la superficie de la muestra). La mezcla preparada se va vertiendo poco a poco durante esta etapa. La muestra se mueve en forma de espiral, sin aplicar prácticamente presión y en sentido contrario al giro del paño. La máquina utilizada para el pulido es de la casa STRUERS (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). El tiempo de pulido es e 15 minutos a una velocidad de 200 revoluciones por minuto, hasta conseguir una superficie especular. Una vez se está llegando al final de la etapa de pulido se añade agua. La muestra debe quedar sin rayas o estrías de desbaste (lo que hay que comprobar en el microscopio tras la limpieza) y con una porosidad similar a la que debe tener según el espaciador empleado para dar por finalizada esta etapa. La siguiente etapa corresponde a la limpieza. Nada más acabar el paso anterior, se sitúa la muestra bajo un chorro de agua a presión hasta que todos los restos de sílica posibles hayan sido retirados. Tras este paso, se introduce la pieza en un vaso de precipitados con agua destilada, colocando la cara pulida hacia arriba, para Figura 37.- Pulidora de la casa STRUERS. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 45 transportarlo hasta la zona de los ultrasonidos. Se coloca un vaso de precipitado con una red de plástico al fondo para evitar rayar la muestra pulida. Se añade agua destilada y jabón de ultrasonidos y se sumerge la pieza con la cara pulida hacia abajo, para que los restos de sílica caigan por gravedad. Se introduce el vaso en ultrasonidos durante 10 minutos. Al transcurrir dicho tiempo, se extrae la pieza, se rocía con etanol y se introduce con la cara pulida hacia arriba en un vaso de precipitado preparado con etanol. Se introduce el vaso en ultrasonidos durante otros 10 minutos. Por último, se extrae la probeta y se seca bajo el secador de aire caliente. Los substratos preparados metalográficamente se pueden estudiar mediante el protocolo de análisis de imagen con la ayuda de un microscopio óptico metalográfico NIKON EPIPHOT, provisto de una cámara JENOPTIK PROGRES C3. Las fases son: toma de imágenes, tratamiento de cada una de las imágenes y análisis de los datos. La toma de imágenes comienza colocando la muestra con ayuda de las pinzas en el plato del microscopio. Se elige la lente con los aumentos necesarios (5x) y se abre el programa Image-Pro Plus 6.2. Se selecciona capturar imagen (icono: cámara de vídeo). Se configura la resolución de adquisición y de la imagen y color (24 bits). Se selecciona Preview para ver la imagen en tiempo real, y poder así ajustar la luz y el enfoque para que se vea correctamente. Se selecciona Auto-Balance White y en la ventana que se abre, Compute. Una vez realizados los ajustes pertinentes, se desplaza la lente con el joystick hasta la zona deseada y se toma la imagen con el botón Snap. Normalmente se toman imágenes de la zona superior izquierda (1), derecha (2), inferior derecha (3), izquierda (4) y de la zona central (5). Por último se guardan las imágenes. Para continuar con el tratamiento de cada imagen se selecciona convertir a escala de grises 16 del menú Edit. En el menú Measurements, en calibración se escoge Select Spatial. Se abre una ventana y se indica la cámara y los aumentos de la lente con la que se ha tomado la imagen (ej. Progres C3 x5). De esta forma se asocia el píxel con una unidad de medida. En el menú Measurements, se selecciona Count & Size. Clicando en Select Range, aparece otra ventana emergente, de manera que hay que desplazar el curso a lo largo de la barra hasta que todos los poros se quedan bien cubiertos de rojo. Una vez cerrada la ventana, se escogen los parámetros a medir del menú Measure. En este caso, se analizan las variables de Area, Aspect, Diameter (mean), Perimeter, Roundness, Per Area (Obj. /Total) y Perimeter (convex). Pulsamos aceptar y seleccionamos Count. Mediante una macro, se genera un archivo de texto y abriendo Excel, se importan los datos a partir de dicho fichero. La suma de todos los elementos de la columna Area, Per Area y el área máxima se calculan tras la toma de datos de la última imagen (siempre y cuando se trate de imágenes de una única probeta), y se guarda el Excel. Por último, tiene lugar el análisis de los datos para obtener la porosidad. Se hace una sumatorio para cada imagen de la columna correspondiente al área de cada porcentaje de frente al área total (Obj./Total). Una vez calculada dicha suma, se hace un promedio de las distintas imágenes, que dará lugar a la porosidad promedio tras la preparación metalográfica de un substrato. Además de la porosidad, se obtienen los parámetros de diámetro equivalente y factor de forma. Para ello, se asemeja el dato del área de cada objeto medido al área de un círculo, despejando posteriormente el diámetro que le correspondería a ese objeto y haciendo la media de los diámetros de los objetos de las 5 imágenes. Se obtiene así el diámetro equivalente. Por otro lado, el factor de forma se define como aquel parámetro a través del cual se mide la esfericidad del poro, siendo 1 una esfera y 0 un volumen completamente amorfo. Este parámetro sería el inverso de Roundness, y de igual forma que para el diámetro equivalente, se hace la media para hallar el valor para la totalidad del substrato en cuestión. Figura 38.- Limpieza en ultrasonidos. Materiales y Procedimiento Experimental 46 Sin embargo, los datos hallados de esta forma incluyen dos poblaciones de poros diferentes, una debida al propio proceso de compactación del Ti c.p. y otra debida a los poros dejados por el espaciador. Para obtener los datos del diámetro equivalente medio y el factor de forma medio de los poros obtenidos por gracias al espaciador, se diferencian los poros en dos grupos. Por un lado, aquéllos cuyo diámetro equivalente sea mayor que 50 µm y por otro, los que poseen un diámetro equivalente menor. A partir de esta división, se obtienen los valores coherentes con el tamaño de espaciador de diámetro equivalente d y de factor de forma. A través de las medidas obtenidas mediante el método de Arquímedes de masa en seco (D), sumergida (S) y saturada (M), es posible obtener el porcentaje de porosidad total (P) y de porosidad interconectada (Pi) gracias a las ecuaciones ( XI ) y ( XII ): 𝑃 =100 ∙ (1− 𝐷 (𝑀−𝑆)∙𝜌𝑇𝑖) ( XI ) 𝑃𝑖= 𝑀−𝐷 𝑀−𝑆 ∙100 ( XII ) La porosidad también se puede caracterizar a través de imágenes obtenidas por microscopía de barrido electrónico, conocida como SEM [155]. Esta técnica se basa en el principio de la microscopía óptica en la que se sustituye el haz de luz por un haz de electrones. Con esto se consiguen hasta 100 Å de ampliación, una resolución muy superior a cualquier instrumento óptico. Su funcionamiento consiste en hacer incidir un haz de electrones que va barriendo la superficie de la muestra. Puesto que el substrato no es conductor, se requiere el uso de cinta de carbón de doble cara, de forma que la muestra se adhiera sobre unos cilindros de apoyo (Figura 40). Dichos cilindros se posicionan posteriormente en un soporte específico del equipo (Figura 39). El microscopio de barrido electrónico Jeol JSM-6490LV (Figura 41) se encuentra internamente equipado con unos detectores que recogen la energía y la traducen en imágenes y datos:  Detector de electrones secundarios (SEI - “Secondary Electron Image”): Para obtener imágenes de alta resolución.  Detector de electrones electrodispersados (BEI - “Backscattered Electron Image”): Para obtener imágenes con menor resolución pero con mayor contraste para obtener la topografía de la superficie.  Detector de energía dispersa (EDS – “Energy Dispersive Spectrometer”): Detecta los rayos x generados y permite realizar un análisis de la composición de la muestra. Figura 40.- Carbono para hacer las muestras conductoras. Figura 39.- Soporte SEM con muestras colocadas. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 47 Figura 41.- Microscopio electrónico de barrido Jeol JSM-6490LV Para la caracterización de la porosidad nos fijaremos en las imágenes tomadas a 50x, 100x y 200x. c. Comportamiento meca nico Las curvas de compresión típicas de las espumas metálicas (materiales metálicos porosos) se caracterizan por un estado de deformación elástica al comienzo de la deformación, seguido de otro tramo con distinto módulo de Young, dónde ocurre la compresión y distorsión de los poros. Finalmente, se incrementa bruscamente el esfuerzo teniendo lugar la densificación y el cambio de comportamiento de compresión del material. La caracterización del comportamiento mecánico de las muestras se realiza mediante ensayos de compresión basados en la norma ASTM E9. A través de los test en el laboratorio se obtienen dos módulos de Young (uno sin corregir y otro corregido) y el límite elástico o de fluencia. De este modo se puede analizar qué tamaño de espaciador consigue unas propiedades más similares a las del hueso humano. El ensayo de compresión consiste en aplicar carga uniaxial de compresión gradualmente creciente a una probeta de tamaño estándar hasta que ocurra la fractura. Durante el ensayo se recogen datos de carga aplicada (en kg) y del acortamiento mediante el programa Merlin. El ensayo se lleva a cabo gracias a una máquina de compresión INSTRON 5505 (Figura 43). Las caras de las probetas deben ser paralelas, para lo que se procede al desbaste de las mismas mediante una lija con tamaño de grano 240 y los utensilios que muestra la Figura 44. De este modo, introduciendo la probeta primero por una cara y seguidamente por la otra, se aplanan y se ponen paralelas ambas superficies, eliminando la posible rebaba que pueda haber quedado del proceso de compactación. Además, los extremos de la probeta y las caras de los bloques de apoyo deben limpiarse con acetona o cualquier otro solvente adecuado inmediatamente antes del ensaye para quitar la grasa y el aceite que puedan influir en la restricción friccional de las superficies extremas. Por otro lado, para evitar el abarrilamiento producido por la fricción de las muestras Figura 43.- Máquina de compresión INSTRON 5505 Figura 42.- Probeta con teflón lista para el ensayo de compresión Materiales y Procedimiento Experimental 48 con los soportes durante el ensayo de compresión, se rodean las muestras con teflón para facilitar que las caras resbalen (por sencillez, en lugar de colocar teflón únicamente en las caras, se rodean los substratos). El ensayo se ha realiza mediante control por desplazamiento. La velocidad del ensayo depende de la altura de la probeta y es de 0.005 multiplicada por la altura inicial de la muestra en mm (mm/minuto). Para procesar los datos, en primer lugar el acortamiento se obtiene en forma de extensión. Se calcula la deformación dividiendo la extensión entre la altura de la probeta (aunque se hayan fabricado unas probetas con una altura determinada, tras la preparación dicha altura se ve reducida y es necesario volver a medirla). Por otro lado, la carga en kg ha de ser expresada en Unidades del Sistema Internacional (MPa), para lo que se divide entre la sección y se multiplica por 106. Se grafica entonces la deformación frente a la tensión. El módulo de Young se calcula como la pendiente de la curva en el tramo elástico, Figura 46. Se eliminan los tramos iniciales de las curvas obtenidas, no lineales, correspondientes a la deformación del teflón utilizado como lubricante Como resultado, se obtienen las curvas con un origen común. A partir de este nuevo origen se considera una recta tangente a la curva en el intervalo de tensiones lineales Δσ y se determina el correspondiente intervalo de deformaciones lineales Δε. Definidos estos intervalos se calcula el módulo de Young como el cociente tensión/deformación. Este valor se corrige teniendo en cuenta la rigidez de la máquina de ensayo, INSTRON 5505, cuyo valor es de 87.895 kN/mm. Introduciendo esta corrección se obtiene el módulo de Young del ensayo de compresión Ec. El límite elástico σy se determina considerando una recta paralela al tramo lineal de la curva, partiendo de una deformación del 0.2% (0.002 de deformación unitaria). El punto de corte con la curva determina el valor del límite elástico, Figura 45. d. Rugosidad de la su perficie y el interior de los poros La caracterización de la rugosidad de la superficie se basa tanto en las imágenes tomadas mediante microscopía electrónica de barrido como en las tomadas con confocal láser. Figura 44.- Utensilios para dejar paralelas las caras de las probetas Figura 46.- Zona lineal de la curva tensión deformación. Figura 45.- Determinación del límite elástico. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 49 Mediante el funcionamiento del SEM explicado anteriormente en el apartado “b” de este mismo punto, se obtienen imágenes para 50x, 100x, 200x, 500x, 1000x, 2000x, 4000x y 8000x. Se diferencia entre parte plana y poro en aquellos aumentos en los que al tomar la imagen no se captan ambas zonas. Además, para aquellas probetas con rasgos característicos se toma más de una imagen para una buena caracterización. Por otro lado, el equipo utilizado para la medición de la rugosidad 3D es el microscopio confocal SENSOFAR S NEOX (Figura 47). Algunas de sus características más importantes son las siguientes:  Precisión máxima = 0.10 μm.  Aumentos máximos de 150x.  Pendiente máxima de la superficie = 86°  Fuentes de luz LED: roja (630 nm); verde (530 nm); azul (460 nm) y blanca (550 nm).  Resolución de la imagen: 1360 x 1024 píxeles.  Altura máxima de la muestra = 40 mm.  Tamaño máximo de la muestra en XY = 700 x 600 mm. El software de adquisición y análisis de los datos se denomina SensoSCAN (Figura 48). El modo confocal es el adecuado para este tipo de muestras, aunque también exista la opción de utilizar variación de foco o interferométrico morado. La toma de datos se realiza de manera metódica para aumentar la probabilidad de adquirir imágenes adecuadas, ya que la tarea puede resultar muy tediosa según la rugosidad y el tipo de muestra a caracterizar. Se procede de la siguiente manera: 1. Se toma una imagen macroscópica de la superficie de la muestra a 10x aumentos que sirva de referencia. Gracias a dicha imagen, se facilita la colocación del objetivo sobre la superficie (plana o poro) que se desea caracterizar. i. Se procede a enfocar en el modo “Bright field”, aproximando el objetivo a la muestra hasta que se visualice algún detalle sobre la pantalla correspondiente a la cámara. ii. Se clica sobre autobrillo y autoenfoque. iii. Se centra el objetivo para realizar la macrofotografía a color. 2. Se adquiere una imagen a 10x que recoja la topografía de parte plana de matriz de Ti presente entre ellos i. Se cambia a modo “Confocal”, y se vuelve a clicar sobre autoenfoque y autobrillo. Figura 47.- Microscopio confocal SENSOFAR S NEOX Figura 48.- SensoScan 6.2 Materiales y Procedimiento Experimental 50 ii. Se selecciona el método “z-scan absoluto”, para seleccionar la variación de cota de los planos sobre los que se aplica el láser. iii. Se selecciona la cota superior, elevando el objetivo hasta que desaparezca cualquier signo de la pantalla. iv. Se acota inferiormente, haciendo descender le objetivo hasta que vuelva a quedar la pantalla en negro. Muy importante realizar pasos 3 y 4 de manera lenta y cuidadosa, para no olvidar ningún detalle de la superficie al delimitar las alturas v. Se pulsa “Acquire”. La imagen adquirida se califica como válida si el porcentaje medido es superior al 75%, en caso contrario se toma una nueva imagen de esa zona. La zona a analizar se cambia en caso de obtener una medida inferior a 75% dos veces. 3. Se guarda la imagen con distintas variaciones. i. La primera se guarda sin restaurar, es decir, los puntos donde no ha llegado adecuadamente la luz del láser, y por tanto no se han medido, quedan sin aparecer en la imagen. ii. La segunda se guarda restaurada, con el “restore” aplicado. Mediante estadística, se generan cotas para aquellos puntos no medidos. iii. La tercera se guarda con un perfil. Para ello aplicamos un corte en la imagen restaurada y se adquiere el perfil de rugosidad característico de la zona de estudio. 4. Se toma una imagen a 20x de la misma zona. i. Se vuelve a la pestaña inspección. ii. Se cambia el objetivo tanto físicamente, como en el software. iii. Se cuadra la zona que se desea medir. iv. Repetimos [i, ii, iii, iv, v] del paso 2 y el paso 3 completo. 5. Se repite paso 2,3 y 4 pero en este caso centrando el objetivo en tomar datos de un poro. 6. Se realiza una última imagen a 50x únicamente al poro, para caracterizar la rugosidad de las paredes del mismo (pasos 2 y 3) A continuación, se exportan las imágenes sin restaurar al software de análisis de datos SensoMap para tratarlas de manera adecuada y obtener los parámetros de rugosidad precisos. i. Se extrae la capa topográfica. ii. Se nivela la superficie de la muestra para eliminar las inclinaciones reales de la misma. iii. Se corrigen los puntos no medidos y se separa la ondulación de la rugosidad aplicando el filtro indicado en la norma ISO 25178. iv. Se realiza una vista 3D de la imagen corregida adecuadamente. Figura 49.- Esquema de toma de imágenes mediante confocal- Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 51 v. En el caso del poro, se extrae el área del mismo para que los parámetros hagan referencia únicamente a su superficie. vi. Se obtienen los valores de rugosidad superficial Sa, Sq y Sz. Según indica la norma UNE-EN ISO 25178-6 es necesario indicar ciertos datos de cada medición a la hora de dar los parámetros de rugosidad obtenidos. Estos datos son la resolución vertical, la resolución lateral y la pendiente máxima que es capaz de medir según el objetivo utilizado. Los valores se encuentran recogidos en la en la Tabla 10. Objetivo Parámetros Res. Lateral (nm) Res. Vertical (nm) Max. Pendiente (º) 10x 1060 25 14 20x 706,7 8 21 50x 397,5 3 42 Tabla 10.- Parámetros técnicos utilizados en el microscopio Sensofar S neox 4.2.2 Modificación y caracterización de la topografía de la superficie de los discos de titanio porosos. A. Protocolo de modificación superficial mediante ataque químico La modificación superficial mediante ataque químico con ácido fluorhídrico se lleva a cabo una vez preparadas y caracterizadas las muestras. Se atacan dos substratos por cada tipo de muestras (macizas y con distintos tamaños de poro), a 125 segundos y a 625 segundos. Una novedad introducida en este trabajo es la realización de ataques no consecutivos. Esto garantiza que se tendrá acceso en todo momento tanto a la muestra atacada durante 125 s, como a la atacada durante 625 s. La caracterización de los substratos atacados es más precisa, debido a que ambos ataques se han realizado de manera continua, reproduciendo fielmente una futura fabricación. Anteriormente, se han realizados análisis sobre la evolución de la superficie de una probeta, al atacarla durante diferente tiempo de manera consecutiva [156]. Los tiempos estudiados se eligieron siguiendo una progresión geométrica de razón 5. Los tiempos utilizados en este proyecto se eligieron en base a los resultados obtenidos. Para comenzar, se calienta agua para realizar el baño maría a 52,5 ºC o una temperatura cercana que consiga que los viales que contienen el ácido preparado alcancen 50 ºC al ser sumergidos en el agua. Mientras se calienta, Figura 50.- Esquema del procedimiento para atacar y extraer las muestras. Figura 51.- Montaje del baño maría para calentar la solución y realizar el ataque químico. Resultados y Discusiones 58 Por otro lado, la porosidad observada en la gráfica de la Figura 57 presenta una variación mucho mayor tras la sinterización que tras el desbaste, corroborando los resultados extraídos del análisis de la densidad una vez más. La variación relativa a cada proceso se relacionada con el tamaño de poro en la gráfica de la Figura 58. Siguiendo la misma tendencia que la densidad, la variación de porosidad tras la sinterización es mayor cuanto mayor sea el tamaño de poro de los substratos. La tendencia observada tras el desbaste, pese a que se produce menor variación tras el desbaste cuanto mayor sea el tamaño de poro de las muestras, no se puede generalizar. Figura 58.- Variación de la porosidad según cada etapa para cada tamaño de poro. Figura 57.- Variación de porosidad total según el tamaño de poro y tras las distintas etapas de fabricación de los substratos. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 59 En la Tabla 15 se representa la porosidad interconectada para cada tamaño de grano. Para facilitar el análisis, se observan dichos valores comparados con la porosidad total antes y tras el desbaste para comprender como evoluciona dicho parámetro (Figura 59). También se ha aprovechado para comparar cada substrato con la porosidad ideal (50%). La porosidad interconectada disminuye con el tamaño de poro. Esto es consecuencia a que la sinterización afecta más en ese sentido a los poros pequeños, tendiendo a unirlos para disminuir su energía superficial. La porosidad interconectada disminuye tras el desbaste, como ocurría con la total, hasta que simultáneamente en el substrato existen tamaños de poro bastante grandes y la porosidad interconectada antes del desbaste es un 12% menor que la total. La apertura de los poros de la superficie tiene lugar durante el desbaste. Este hecho no afecta en gran medida a la porosidad interconectada hasta que el tamaño de poro es tal que la proximidad entre poros en la superficie de las muestras es pequeña comparada con su tamaño. Es el caso de las muestras con tamaños de poros comprendidos entre 355-500 µm. Por otro lado, cuanta menos porosidad interconectada se tenga antes del desbaste, más poros susceptibles a interconectarse existen en las muestras. Por lo tanto, al aumentar el número de poros con esta posible tendencia y disminuir la distancia que existe entre ellos, la porosidad interconectada resulta ser mayor. La porosidad superficial de las muestras, el factor de forma, gracias al cual se podrá comprobar la similitud de los poros con esferas y el diámetro equivalente de los poros medidos se obtienen mediante análisis de imagen para cada tamaño tipo de muestra. Dichos valores se encuentran recogidos en la Tabla 16. Tamaño de poro (µm) Análisis de imagen ambas poblaciones Porosidad (%) Error (%) Factor de forma Error Ff Diámetro eq. (µm) Error D.eq. (µm) Nº objetos por muestra 100-200 51,5 ± 1,28 0,81 ± 0,059 84,3 ± 14,96 441 ± 87 250-355 49,9 ± 1,94 0,88 ± 0,044 68,3 ± 25,67 363 ± 177 355-500 48,3 ± 4,28 0,96 ± 0,004 28,4 ± 6,08 564 ± 134 Tabla 16.- Parámetros obtenidos a partir de análisis de imagen para cada tamaño de poro. Figura 59.- Variación debida al desbaste de la porosidad total e interconectada con el tamaño de grano. Resultados y Discusiones 60 La porosidad obtenida tras la preparación metalográfica de los substratos mediante la técnica de análisis de imagen es mayor que la obtenida gracias al método de Arquímedes. Como se comentó anteriormente, la porosidad obtenida proporcionada por análisis de imagen no es exacta, debido a que únicamente tiene en cuenta parte de la superficie de las muestras, siendo imposible por tanto estimar el volumen poroso que existe en el interior de los substratos. El estudio de las imágenes obtenidas para cada tamaño de poro (Figura 60, Figura 61, Figura 62), indica la existencia de dos poblaciones de poros diferenciadas (cómo se adelantó en el apartado experimental). Aquellos poros con diámetro menor y una forma más esférica son consecuencia del proceso de pulvimetalurgia a partir del cual se obtienen las probetas. Aquellos con diámetro equivalente claramente superior (observables a simple vista) y cuya forma sea menos esférica, se corresponden con los generados gracias al espaciador. Figura 60.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 100-200 µm para análisis de imagen. Figura 61.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 250-355 µm para análisis de imagen. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 61 El resultado final difiere mucho de lo esperado debido a que en el primer análisis se han contabilizado ambas poblaciones para obtener el diámetro equivalente. De igual modo el factor de forma obtenido sugiere una forma de poro esférica mientras la realidad muestra cómo, en general, los poros no se asemejan a círculos perfectos. La variación entre los valores esperados y los obtenidos para diámetro equivalente y factor de forma, aumenta a medida que el tamaño de poro crece. Esta tendencia es consecuencia de que en las imágenes tomadas aparezca una menor población de poros debidos al espaciador conforme aumenta el tamaño del poro. Por lo tanto, pese a que el valor de diámetro equivalente obtenido tenga menos error para tamaño de poro de 355-500 µm, su módulo se aleje del esperado. Para evitar llegar a conclusiones erróneas, se realiza un segundo análisis de imagen. Este análisis de imagen consiste en diferenciar las poblaciones de poros a partir de un valor de diámetro equivalente. Se toma como frontera entre las poblaciones de poros 50 µm, para todos los substratos. Podría variarse dicho límite según el tamaño de poro del substrato en cuestión. Sin embargo, esto no sería correcto ya que puede que de ese modo estemos dejando fuera algunos poros debido al espaciador. En primer lugar, se estudia la variación entre ambos análisis para cada tamaño de poro y al final se compararán los factores de forma de los tres tamaños entre sí. De este segundo análisis para el tamaño de poro 100-200 µm, se extraen las siguientes conclusiones. El factor de forma disminuye, como se preveía. El diámetro equivalente medio ha aumentado como era de esperar, situándose ahora sí, dentro del rango que le corresponde. El error del factor de forma ha disminuido, mientras que el correspondiente al diámetro equivalente ha aumentado. Al no tener en cuenta todos aquellos poros no relacionados con el espaciador, cuyo factor de forma es más cercano a 1, el factor de forma del resto de poros disminuye. Sin embargo, en lo que a diámetro equivalente respecta, la población de poros caracterizada sí pertenece al rango esperado pese a que su error aumente por ampliar el rango al que pertenecen la mayoría de los poros analizados. Figura 62.- Imágenes de substrato poroso con tamaño de poro 355-500 µm para análisis de imagen. Resultados y Discusiones 62 El factor de forma también disminuye en el caso de substratos con tamaño de poro perteneciente a 250-355, de igual modo que correspondiente error. Esto también ocurría para el caso de tamaño de poro anterior. El diámetro equivalente aumenta, situándose en un valor dentro del rango requerido. El error del diámetro equivalente en esta ocasión disminuye. Se ha pasado a medir el 19 % de los poros presentes en las imágenes. Al eliminar una gran cantidad de poros pequeños y pertenecer casi todos los poros considerados al rango deseado, el error disminuye. Tamaño de poro 250-355 µm Análisis de imagen población NH4HCO3 Factor de forma Error Ff Diámetro eq. (µm) Error D.eq. (µm) Nº objetos medidos por muestra Sin distinguir 0,88 ± 0,04 68,28 ± 25,67 363 ± 177 Distinguiendo 0,67 ±0,01 261,54 ±9,1 69 ± 10 Tabla 18.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 250-355 µm. El análisis de los datos de los substratos con tamaño de poro comprendido entre 355-500 µm, se observa como la variación entre el número de poros medidos antes y tras hacer la distinción de poblaciones, es la más acusada de los tres casos. El hecho de que el 94% de los poros medidos antes de hacer la distinción de poblaciones, correspondieran a poros pequeños, explica por qué antes el factor de forma era tan cercano a 1 y con un error tan bajo. Dicho error aumenta tras hacer la distinción, ya que la diferencia entre las formas de los poros debidos al espaciador es mayor. El diámetro equivalente medio no se encuentra dentro del rango esperado. Esto se debe a la incapacidad de los poros de mantener su volumen, una vez eliminado el espaciador, durante la sinterización y el posterior desbaste (aunque en menor medida). Tamaño de poro 355-500 µm Análisis de imagen población NH4HCO3 Factor de forma Error Ff Diámetro eq. (µm) Error D.eq. (µm) Nº objetos medidos por muestra Sin distinguir 0,96 ± 0,004 28,37 ± 6,08 564 ± 134 Distinguiendo 0,71 ±0,029 293,42 ±28,2 32 ± 5 Tabla 19.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 355-500 µm La probabilidad de propagación de grietas en el interior de los poros disminuye al aumentar el factor de forma. Este dato analizado junto con la porosidad interconectada, debe tratarse al analizar el comportamiento mecánico de las muestras. La distinción de poblaciones de poros no se ha ejecutado de la manera más adecuada. En futuros trabajos deberá optimizarse dicho análisis, diferenciando los tamaños durante la toma de datos al realizar el análisis de imagen. Tabla 17.- Comparación de los datos obtenidos mediante análisis de imagen distinguiendo y sin distinguir las distintas poblaciones de poros para tamaño de poro 100-200 µm. Tamaño de poro 100-200 µm Análisis de imagen población NH4HCO3 Factor de forma Error Ff Diámetro eq. (µm) Error D.eq. (µm) Nº objetos medidos por muestra Sin distinguir 0,81 ± 0,06 84,30 ± 14,96 441 ± 87 Distinguiendo 0,67 ±0,03 161,14 ±28,5 178 ± 5 Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 63 Para finalizar la discusión de la porosidad, se procesan imágenes más precisas de las superficies de las muestras mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Figura 63). En dichas imágenes, se observa claramente cómo la porosidad pequeña existente en todos los substratos, incluyendo los macizos, poseen una forma circular y un tamaño claramente menor a la porosidad debida al espaciador. Es posible diferenciar el tamaño de poro al que corresponden los substratos al observar estas imágenes. Cabe destacar que la superficie interna de los poros no es lisa, sino que posee cierta rugosidad que puede conllevar una concentración de tensiones en contra posición al posible aumento en la oseointegración. Figura 63.- Imágenes tomadas a la superficie de substrato macizo (a) y porosos con tamaño de poro 100-200 µm (b), 250-355 µm (c) y 355-500 µm (d) mediante SEM a 50X. a) b) c) d) Resultados y Discusiones 64 5.1.3 Comportamiento mecánico Los ensayos de compresión realizados sobre los substratos, están basados en la norma ASTM E9. Las curvas tensión-deformación obtenidas son las que se muestran en la Figura 64. Los datos obtenidos tras procesar dichas gráficas representan la caracterización mecánica realizada a las probetas. Los resultados se pueden observar en la Tabla 20. Tamaño de poro (µm) Parámetros mecánicos muestras E (Gpa) Ec (Gpa) Límite de fluencia (Mpa) 100-200 3,2 26 126,9 250-355 2,3 23,1 117,8 355-500 2 19,7 97,6 Hueso - 22/25 150/170 El módulo de Young de las probetas cuyo tamaño de poro se encuentra entre 100-200 µm y 250-355 µm es semejante al del hueso. Sin embargo, ningún límite de fluencia alcanza el valor de la resistencia del hueso cortical. Este hecho no invalida los resultados obtenidos, ya que tras el crecimiento del hueso hacia el interior del implante, este valor de límite de fluencia incrementará. El factor más influyente sobre la resistencia y rigidez de substratos con porosidad semejante, es el tamaño de poro. Dichas características mecánicas disminuyen a medida que aumenta el tamaño de poro de las muestras. La cantidad de matriz de Ti conectada es mayor cuanto menor es el poro, presentando así valores mayores de resistencia y rigidez. Tabla 20.- Parámetros mecánicos característicos según el tamaño de poro de los substratos y del hueso [158] 0 50 100 150 200 250 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Tensión (Mpa) Deformación Curvas tensión-deformación 100-200 µm 250-355 µm 355-500 µm Figura 64.- Curvas tensión-deformación para cada tamaño de poro Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 65 5.1.4 Rugosidad de la superficie externa de titanio y del interior de los poros Mediante confocal láser se analizan una gran cantidad de parámetros, gracias a los cuales se caracteriza detalladamente la rugosidad superficial de las muestras. Los valores numéricos más representativos serían la altura media aritmética (Sa), la altura media cuadrática (Sq) y la altura máxima medida (Sz). Estos datos se han obtenido, tal y como se recoge en el apartado experimental, tanto para la parte plana de las muestras porosas como para el interior de los poros, a distintos aumentos, y tras la realización de una serie de operaciones para eliminar diferencia de alturas debidas a la inclinación de la muestra, por ejemplo. Además, se cuenta también con imágenes SEM, gracias a las cuales se puede analizar la rugosidad cualitativa de la superficie de las probetas. Las imágenes de todos los substratos se han tomado diferenciando las zonas de estudio. Parte general: Figura 65.- Comparación macroscópica de las muestras antes y después del ensayo de compresión. Figura 66.- Imágenes generales de la superficie de las muestras. a) 100-200 µ m 10x confocal. b) 250-355 µm 10x confocal. c) 355-500 µm 10x confocal. d) 100-200 µm 100x SEM. e) 250-355 µm 100x SEM. f) 355-500 µm 100x SEM. Resultados y Discusiones 66 Las imágenes obtenidas a pocos aumentos (Figura 66 a), b) y c)) muestran cómo en las probetas coexisten zonas planas de titanio y zonas porosas. El cálculo de la rugosidad contemplaría de esta forma tanto las paredes del poro como la parte plana lo que se traduce en un incremento la rugosidad, y en distintas tendencias en los parámetros según los aumentos a los que esté tomada la imagen (ver ANEXO: parámetros de rugosidad SensoMap). El microscopio electrónico de barrido a pocos aumentos (50x, 100x y 200x) también obtiene zonas en las que se observan tanto matriz de titanio como los poros producidos por el espaciador y el proceso de fabricación (Figura 66 c, d y e). Las imágenes permiten determinar rasgos comunes entre las distintas probetas. Por un lado, no se aprecia aún la rugosidad relativa a la zona plana de las probetas, mientras que la rugosidad interna de los poros es apreciable desde 50x (ver ANEXO: imágenes SEM). Se deduce por tanto, que la rugosidad de los poros es mayor que la rugosidad correspondiente a la parte plana de titanio presente entre ellos. La Figura 66 confirma la variación de tamaño para la gran mayoría de los poros, al pasar de un rango de espaciador a otro. Sin embargo, como se concluyó en análisis de imagen, algunos poros poseen un tamaño mayor del deseado. Concretando para el caso de 355-500 µm, se observa existencia tanto de poros que pertenecen al rango tamizado, como de otros de un tamaño menor, La razón es que a medida que aumenta el tamaño de los poros, la contracción de su volumen se hace más apreciable. La diferencia entre el contorno de los poros generados por el espaciador y los debidos al proceso de fabricación de las muestras también se observa en las imágenes anteriores. Se puede afirmar que mientras el perímetro de estos últimos es regular (“poros lisos”), el borde de los primeros es totalmente irregular, incrementando la rugosidad de la superficie. Aunque la mezcla de Ti c.p. y NH4HCO3 fue agitada para homogeneizarla, la población de poros de mayor tamaño tiene una distribución heterogénea, al igual que la población de poros esféricos, derivando en una rugosidad no uniforme de la superficie. Parte plana: La zona plana se caracteriza hasta 1000x aumentos, ya que a partir del mismo se dejan de apreciar aspectos relevantes sobre la superficie de las probetas. En la Figura 67 d), e) y f) se aprecia cierta nano y micro-rugosidad (más patente en las muestras de 355-500 µm), esparcida por casi la totalidad de la superficie. En las mismas se observa el aumento de rugosidad al aumentar el tamaño de poro. Figura 67.- Imágenes de la zona plana de titanio presente entre los poros de las muestras. a) 100-200 µm 20x confocal. b) 250-355 µm 20x confocal. c) 355-500 µm 20x confocal. d) 100-200 µm 1000x SEM. e) 250-355 µm 1000x SEM. f) 355- 500 µm 1000x SEM. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 67 Parte poro: Para medir de una manera más precisa la rugosidad existente en el interior de los poros, se analizan también imágenes a 50x aumentos, tratando de enfocar la pared del poro, además de lo estudiado para la matriz remanente de Ti (ver ANEXO: parámetros de rugosidad SensoMap). Las imágenes de la Figura 68 revelan la presencia de superficie estratificada, no apreciada en la superficie del titanio remanente. Estos estratos pueden ser consecuencia de dos factores: de la interacción entre las superficies de titanio y de bicarbonato de amonio o bien resultado del pulido químico. Este pulido químico, en la superficie plana está aplicado conjuntamente con un pulido mecánico que podría ocasionar la eliminación de estos estratos. Las imágenes de la superficie interna de los poros tomadas a 500X o 1000X, muestran la existencia de microrugosidad en las paredes del poro. Por su parte, en las imágenes tomadas a 8000X, presentan cualitativamente nano-rugosidad heterogénea al comparar las distancias entre estratos con la escala de la imagen. Esto es un gran resultado ya que implica la existencia de una doble escala de rugosidad, característica muy positiva con vistas a la posible interacción de las proteínas con la nano-rugosidad y de las células con la micro-rugosidad [22]. Comparaciones: El análisis de las gráficas de la Figura 69, permiten afirmar que, en general, no existe una tendencia clara entre aumento y disminución de los parámetros rugosidad de la superficie plana con la variación del tamaño de grano en los substratos. Sin embargo, los parámetros obtenidos siempre son mayores para zonas porosas que para las zonas de matriz remanente de titanio, lo que refuerza la observación realizada en el estudio de la parte general. Este efecto puede ser consecuencia de la diferencia entre el pulido de la superficie de la muestra y el interior de los poros. Mientras que la superficie se pule mecanoquímicamente, el interior de los poros únicamente se pule gracias a la sílica. Tamaño de poro (µm) Zona plana 20x Zona poro 20x Sa (µm) Sq (µm) Sz (µm) Sa (µm) Sq (µm) Sz (µm) 100-200 5,0 9,0 97,6 24,0 26,2 133,4 250-355 3,4 8,8 147,2 28,4 32,0 179,1 355-500 0,7 1,1 79,2 20,9 27,1 353,2 Tabla 21.- Parámetros correspondientes a la rugosidad de la superficie plana y los poros para cada tamaño de poro 20x Figura 68.- Imágenes de los poros de cada muestra. a) 100-200 µm 20x confocal. b) 250-355 µm 20x confocal. c) 355- 500 µm 20x confocal. d) 100-200 µm 1000x SEM. e) 250-355 µm 1000x SEM. f) 355-500 µm 1000x SEM. d) e) f) Resultados y Discusiones 74 y la posterior contracción por sinterización. Cualitativamente, existe una rugosidad micrométrica y otra nanométrica, presente cuando se comparan los detalles de la imagen con la escala. El ataque influye sobre la superficie interna de los poros tratando de uniformarla. Se aprecia una evolución entre la Figura 76 a), b) y c). El mapa de colores en el interior de los poros tiende hacia una homogenización de las cotas de la superficie de fuera a dentro, generando lo que podrían ser taludes. Las imágenes obtenidas mediante SEM permiten estudiar los detalles de los poros, no apreciables en las de confocal. La Figura 76 e) muestra rugosidad nanométrica localizada en distintas zonas del poro, generada gracias a un ataque de 125 segundos. Los estratos a su vez también han aumentado en número y se observan de manera más nítida. Al igual que sobre la superficie plana, se han generado figuras geométricas, aunque de forma más suave esta vez. La nano-rugosidad va disminuyendo a medida que el tiempo de ataque aumenta. La figura f) puede dar la sensación de no poseer nano-rugosidad, sin embargo tras un análisis más detallado sí se observa. La figura f) posee marcas geométricas más evidentes, una superficie menos estratificada y confirma una tendencia hacia la uniformidad de la superficie a mayor tiempo de exposición. La superficie de titanio presente entre los poros del substrato, presenta una distribución dispersa y aleatoria pero al mismo tiempo uniforme, de figuras geométricas procedentes del ataque químico. Dicho ataque ha revelado los límites de grano que constituyen la muestra. La población de pequeños poros, muy presente en la figura a, queda camuflada en la figura b) y c). Sin embargo, las figuras e) y f), en las que se observa la superficie en detalle, permiten diferenciar ambos rasgos. f ) c ) a) b) c) d) e) f) Figura 76.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 100-200 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 75 El incremento del tiempo de exposición a 625 segundos, deriva en un aumento de marcas geométricas consecuencia del ataque, desplegándose a lo largo de toda la superficie. Cabe destacar solapamiento entre ellas en ciertas zonas, así como ciertos valles y mesetas que se han generado. 250-355 f ) c ) a ) b ) c) d ) e ) f ) Figura 77.- Evolución de la zona plana de las probetas con tamaño de poro 250-355 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. f ) a) b) c) d) e) f) Figura 78.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 250-355 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. Resultados y Discusiones 76 En estas muestras en ningún momento parece observarse rugosidad nanométrica. Sin embargo, la figura f) manifiesta aún la existencia de los estratos comentados en las figuras del apartado 5.1.4. El estudio de la superficie interna del poro, no muestra diferencia una vez transcurridos 125 segundos de exposición al ataque químico (Figura 78 a) y b)). El incremento del tiempo, deriva en una homogenización del fondo del poro (Figura 78 c)). Además, las paredes del mismo, en lugar de ser abruptas tienden a adquirir aspecto de taludes. Por otro lado, las marcas geométricas apenas son observables en el interior de los poros a 125 segundos; sin embargo, al incrementar el tiempo de ataque a 625 segundos se perciben sobre toda su superficie. De igual modo, la nano-rugosidad se distingue perfectamente a mayor tiempo de exposición (Figura 78 e) y f)). El estudio general de la Figura 78 remarca la ausencia de superficie estratificada en el interior de estos poros. La Figura 79 a) muestra una superficie inclinada, cuyo desnivel se elimina gracias a SensoMap antes de obtener los parámetros numéricos de la rugosidad. La población de poros de reducido tamaño presente sobre toda la superficie de la muestra sin atacar, se confunde con las marcas producidas por el ataque de 125 segundos (Figura 79 b)). La superficie de la probeta en dicha imagen, presenta pequeñas aglomeraciones de figuras geométricas de forma alargada (en general), distribuidas de manera aleatoria e independiente. Dichas marcas se pueden observar aisladas unas de otras cubriendo la superficie casi por completo. Las figuras geométricas crecen a medida que aumenta el tiempo de exposición al ácido. El espacio entre ellas queda reducido, produciéndose solapamientos sobre la superficie de la muestra (Figura 79 c)). El ataque de la superficie revela los límites de grano de la microestructura (Figura 79 b)). Los límites se camuflan bajo las marcas del ataque a medida que aumenta el tiempo de exposición (Figura 79 c)) Las superficie de estos substratos no presenta estratos como en los casos anteriores (Figura 79 d) y e)). La Figura 79 f) sin embargo, presenta una pequeña estratificación en el interior de algunas figuras geométricas. La superficie adquiere líneas levemente espaciadas transcurridos 625 segundos de ataque. Se ha conseguido tanto nano como micro-rugosidad, a diferencia de la muestra atacada 125 s (Figura 79 e)), en la que únicamente se observa micro-rugosidad. 355-500 f ) c ) a) b) d) e ) f ) e) f) c) Figura 79.- Evolución de la zona plana de las probetas con tamaño de poro 355-500 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 77 Las paredes del poro tienden a asemejarse a taludes transcurridos 125 segundos (Figura 80 b)), diferenciándose de este modo del aspecto abrupto que poseían con anterioridad (Figura 80 a)). La superficie interna del poro pierde su rugosidad original aunque la profundidad se mantenga, pudiendo esta última incluso aumentar debido al incremento del tiempo de exposición. La pérdida de rugosidad comentada en el párrafo anterior, también se aprecia perfectamente sobre la Figura 80 d), e) y f). Los estratos característicos, siguen apareciendo en la superficie pero poco marcados en los tres casos. Sin embargo, el ataque químico sí ha generado nano-rugosidad sobre la superficie de los poros, incluso a partir de 125 segundos. El último rasgo representativo de la muestra atacada durante 625 segundos es la presencia de finas líneas a lo largo de la superficie, muy próximas entre ellas (Figura 80 f)). La Figura 80 f), inesperadamente, posee restos de otro material. Esta muestra ha sido la única que presenta partículas externas. El análisis de composición revela que está compuesta por una mezcla de Ti (91 %) y C (9%). La composición de la partícula la conecta con la cera utilizada para lubricar la matriz. Dicha cera se mezcló con el polvo de Ti, y finalmente se obtuvieron partículas de este tipo. El carbono es un elemento biológicamente estable, por lo que aunque hay que evitar la unión, no se plantean cambios en la lubricación de la matriz, por ser un paso muy crítico en el proceso de fabricación de los substratos y los resultados no verse alterados por este hecho. f ) c ) a) b) c) d) e ) f ) e) f) Figura 80.- Evolución de la zona porosa de las probetas con tamaño de poro 355-500 µm. a) Confocal 0 s b) Confocal 125 s c) Confocal 625 s d) SEM 0 s, e) SEM 125 s y f) SEM 625 s Figura 81.- Análisis de composición de impurezas presentes en el substrato de 355-500 µm atacado durante 625 s. Resultados y Discusiones 78 C. Influencia del tamaño de poro para un mismo tiempo de poro La primera diferencia que se manifiesta del efecto del ataque sobre las muestras de distintos tamaños de poro es la distribución de las marcas generadas (Figura 82). Las muestras de 100-200 µm y 250-355 µm presentan 125 segundos f ) c ) a) b) c) d) f ) e) f) Figura 82.- Evolución de la zona plana de las probetas atacadas durante 125 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. f ) c ) a) b) c) d) e ) f ) e) f) Figura 83.- Evolución del interior de los poros de las probetas atacadas durante 125 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 79 una distribución uniforme, cubriendo la superficie y dejando espacio entre ellas. Por el contrario, el substrato de 355-500 µm presenta aglomeraciones en algunas zonas. Con respecto al tamaño de las formas geométricas que se originan, parece ser mayor al aumentar el tamaño de los poros de las muestras. Por otro lado, las mesetas características de la superficie de 100-200 230 µm (Figura 82 a)) no aparecen en el resto de muestras. Los límites de grano se revelan en todas las probetas, estando más definidos en la figura a y b y algo menos apreciables en algunas zonas de la c. El efecto del ataque es más notable en los substratos de mayor tamaño de poro. Todos los tamaños de poro presentan tendencia a asemejar sus paredes a taludes, siendo más palpable dicho efecto en el tamaño correspondiente a 355-500 µm. Por su parte, los límites de grano se aprecian en los tres. La superficie interna del poro solo muestra estratos en la muestra de 100-200 µm. Sin embargo, la nanorugosidad topográfica se observa en los tres, manifestando más similitudes entre los rangos de tamaño de poro de 250-355 µm y la de 355-500 µm. Las figuras geométricas se perciben en el interior de los poros para cada uno de los substratos. Sin embargo, se desdibujan a medida que aumenta el tamaño del poro. La superficie de los substratos con tamaño de poro comprendido entre 100-200 µm poseen las marcas de ataque mejor distribuidas por la superficie, es decir, no se producen solapamientos entre ellas ( Figura 84 a)). Sin embargo, la dificultad para encontrar figuras geométricas independientes se incrementa al aumentar el tamaño del poro de los substratos ( Figura 84 b) y c)), del mismo modo que el número de ellas presentes sobre la superficie. Las mesetas son rasgo característico de los tres tipos de probetas diferentes. La conclusión extraída es que pese a ser un tiempo superior a 125 segundos, existen zonas menos propensas a sufrir el ataque. 625 segundos f ) c ) a ) b ) c) d ) e ) f ) e ) f ) Figura 84.- Evolución de la zona plana de las probetas atacadas durante 625 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355- 500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. Resultados y Discusiones 80 Los poros de tamaño reducido resultan indiferenciables en las muestras atacada durante 625 segundos observando las imágenes de confocal. Sin embargo, las imágenes obtenidas mediante SEM al utilizar mayores aumentos, permiten distinguirlos. El límite de grano, sin embargo no se aprecia en ninguna de las 6 imágenes de la Figura 84, aunque en las de SEM puede llegar a intuirse. La tendencia a generar taludes en los bordes internos de los poros se puede apreciar en los tres tipos de substrato ( Figura 85). Esta zona muestra una gran cantidad de rasgos topográficos diferentes (finas líneas, poros, figuras geométricas, picos, pequeñas mesetas, poros, nano-rugosidad distribuida o uniformemente (e) o en lugares concretos (f)). La rugosidad previa del poro desaparece en mayor medida al aumentar el tamaño de los poros de las muestras. Lo más destacable para este tiempo de ataque es la topografía de la probeta de 250-355 µm. Dicho substrato es el que incluye sobre la superficie interna de sus poros un relieve más característico. La nano-rugosidad presente en una mayor área y su combinación con la micro-rugosidad, señala el interior de los poros de esta muestra como superficie propensa a una buena oseointegración. Los anexos de este trabajo presentan imágenes de SEM, gracias a las cuales se aprecian detalles mucho más pequeños. Además de vistas 3D de las muestras obtenidas mediante SensoMap en confocal láser. Las gráficas mostradas a continuación tratan de cerrar cuantitativamente el análisis de la rugosidad de la superficie según tiempo de ataque y tamaño de substrato ( Figura 86). La probeta maciza disminuye su rugosidad con el paso del tiempo. La parte porosa de los substratos, para todos los tamaños y todos los tiempos muestra una rugosidad superior a la presente en la parte plana. La rugosidad aumenta con el tiempo de ataque por lo general. Sin embargo, pese a existir dicha tendencia en la mayoría de los casos, se observan comportamientos independientes al tiempo de ataque. Dichas anomalías corresponden a rugosidad interna del poro de 250-355 µm, rugosidad de la zona plana de 100-200 µm, cota máxima en el interior del poro de 350-500 µm). La presencia de mesetas sin atacar en la superficie plana de las muestras con tamaño de poro 100-200 µm tras 125 s Figura 75 a), se corrobora observando la mayor rugosidad de esta muestra plasmada en las gráficas Sa plana (20x) y Sq plana (20x). El posterior aumento de la superficie atacada, así como su uniformidad coincide con la disminución del parámetro mostrado en las mismas gráficas. f ) c ) a) b) c) d) e ) f ) e) f) Figura 85.- Evolución de la superficie interna del poro de las probetas atacadas durante 625 s. a) Confocal 100-200 µm b) Confocal 250-355 µm c) Confocal 355-500 µm d) SEM 100-200 µm, e) SEM 250-355 µm y f) SEM 355-500 µm. Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 81 El aumento pronunciado de la rugosidad de la superficie plana de las muestras con tamaño de poro 250-355 µm, refuerza lo observado en la Figura 77, efecto mucho más observable sobre las de 355-500 µm, corroborando también con el análisis de la Figura 79. La evolución de la zona porosa de la probeta de tamaño de poro de 250- 355 µm, también justifica la mayor apreciación de las figuras geométricas sobre la muestra atacada durante 625 s. Figura 86.- Parámetros de rugosidad graficados para facilitar el análisis de los resultados. Resultados y Discusiones 82 83 6 CONCLUSIONES Los resultados obtenidos durante la realización de este trabajo fin de grado, permiten enunciar las siguientes conclusiones. La optimización de los protocolos de fabricación, caracterización y ataque de los substratos, han permitido emplear el tiempo de manera inteligente, reduciendo la duración de algunos procesos y aumentando al mismo tiempo lar reproducibilidad de los mismos. El estudio de las características físicas muestra:  La ausencia de contracción en forma de reloj de arena en las muestras fabricadas.  Una dependencia directa de la contracción con el tamaño y número de poros presentes en las piezas.  La semejanza entre las mediciones realizadas a través del método de Arquímedes y medidas geométricas, lo que conlleva. la validación tanto de los métodos empleados como de los datos obtenidos.  El incremento de la densidad de las probetas tras la sinterización dependiente del tamaño de poro de los substratos. Dicha densidad aumenta cuando lo hace el tamaño de poro de los mismos.  Una mayor densidad de la esperada al aumentar el tamaño de poro, a igualdad de porosidad. El análisis de la porosidad presenta:  Una correlación entre los resultados obtenidos sobre la densidad de las muestras y la porosidad de las mismas.  Una mayor porosidad interconectada en las probetas de 100-200 µm, como consecuencia de la sinterización.  La existencia de dos poblaciones de poros diferenciadas, haciendo su separación para estudiarlas mediante análisis de imagen.  Los resultados de análisis de imagen confirman que el tamaño de poro de las muestras correspondientes a 100-200 µm y 250-355 µm es el esperado, no ocurriendo lo mismo para el tamaño de poro de 355-500. En este caso, el tamaño de los poros resulta ser menor. La caracterización mecánica de las muestras sitúa el módulo de Young de las probetas de 100-200 µm semejante al del hueso. Por otro lado, tanto la resistencia como la rigidez disminuyen al aumentar el tamaño de grano. Por último, se observa la discrepancia entre el límite de fluencia de las muestras y el del hueso. 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Mejora de la capacidad de oseointegración de muestras de titanio poroso para aplicaciones biomédicas 99 Anexos Los anexos adjuntos son:  Anexo I: Imágenes SEM.  Anexo II: Imágenes 3D y rugosidades SensoMap. Las imágenes que se incluyen en ambos, así como los datos numéricos presentes en el último, sirven de apoyo a las ideas desarrolladas durante el texto. La frase: “No se aprecian diferencias’’ quiere decir que esa imagen no se tomó por no presentar ningún detalle de relevancia para el estudio. 0 segundos 125 segundos 625 segundos 50X 100X 200X 500X 1000X 2000X NO SE APRECIAN DIFERENCIAS 4000X NO SE APRECIAN DIFERENCIAS 8000X NO SE APRECIAN DIFERENCIAS NO SE APRECIAN DIFERENCIAS SUPERFICIE GENERAL Y PLANA 355-500 µm 106 0 SEGUNDOS 125 SEGUNDOS 625 SEGUNDOS 500X 1000X 2000X 4000X 8000X SUPERFICIE INTERNA DE LOS POROS 355-500 µm 107 108 125 SEGUNDOS 625 SEGUNDOS Plana 10X Plana 20X SUPERFICIE 3D SENSOMAP MACIZA 109 0 SEGUNDOS 125 SEGUNDOS 625 SEGUNDOS Plana 10X Plana 20X Poro 10X NO SE APRECIAN DIFERENCIAS Poro 20X Poro 50X SUPERFICIE 3D SENSOMAP 100-200 µm 110 0 SEGUNDOS 125 SEGUNDOS 625 SEGUNDOS Plana 10X Plana 20X Poro 10X NO SE APRECIAN DIFERENCIAS Poro 20X Poro 50X SUPERFICIE 3D SENSOMAP 250-355 µm 111 0 SEGUNDOS 125 SEGUNDOS 625 SEGUNDOS Plana 10X Plana 20X Poro 10X Poro 20X Poro 50X SUPERFICIE 3D SENSOMAP 355-500 µm 112 Parámetros de las rugosidades SensoMap 113