Desenvolvimento e avaliação de nanosistemas de bases polimérica para aplicação em terapia génica

Imagem Luís Henrique Eufrásio da Silva Cabanas Avaliação da capacidade de transporte e entrega de material genético associada a diferentes nanossistemas de base polimérica Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica na Especialidade de Instrumentação e Biomateriais Março de 2018 Imagem Luís Henrique Eufrásio da Silva Cabanas Avaliação da capacidade de transporte e entrega de material genético associada a diferentes nanossistemas de base polimérica Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica. Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Vetores e Terapia Génica do Centro de Neurociências e Biologia Celular (CNC), sob a orientação científica do Doutor Henrique Faneca (CNC) e co-orientação da Doutora Rosemeyre Cordeiro (CNC). Março de 2018 ii iii Agradecimentos A elaboração desta dissertação contou com diferentes altos e baixos, tendo havido, também, alguns percalços. Gostaria de começar por agradecer ao Doutor Henrique Faneca pela oportunidade, disponibilidade, paciência e conhecimentos transmitidos ao longo desta viagem. À Rose, que me acompanhou também da melhor forma, seja na vertente teórica ou na transmissão de conhecimento das práticas laboratoriais, estando sempre disponível para ajudar. Um agradecimento muito especial à Daniela, que me acompanhou ao longo de todo o processo, tendo prestado uma ajuda de valor incalculável e sem qualquer obrigação para comigo. Aos meus pais, por, como sempre até aqui, me terem dado a oportunidade de estudar e de fazer as coisas sem dificuldades acrescidas, amparando as minhas pequenas quedas e dando toda a força do mundo para tentar sempre fazer melhor. Por fim, mas não menos importante, aos meus amigos que, sem muitas vezes o saberem, me deram lições que serviram e continuarão a servir para os meus sucessos pessoais e que, de uma forma ou de outra, estiveram sempre ao meu lado quando precisei. iv v Conteúdo Índice de Figuras vii Índice de Tabelas xii Resumo xiii Abstract xv Lista de Siglas xvii 1 Introdução 1 1.1 História da Terapia Génica 1 1.2 Sistemas de transporte e entrega de material genético 4 1.2.1 Vetores virais 5 1.2.1.1 Vetores derivados de Adenovírus 7 1.2.1.2 Vetores derivados de Vírus Adeno-Associados 7 1.2.1.3 Vetores derivados de Herpes Simplex Virus (HSV) 8 1.2.1.4 Vetores derivados de Retrovírus 9 1.2.1.5 Vectores derivados de Lentivírus 9 1.2.2 Vetores Não-Virais 10 1.2.2.1 Métodos Físicos 11 1.2.2.2 Métodos Químicos 13 1.3 Nanopartículas Poliméricas 16 1.3.1 Conjugação do PEG com polímeros catiónicos 22 1.3.2 Targeting e uptake das nanopartículas 24 1.3.3 Escape endolisossomal e transporte citoplasmático 25 1.3.4 Importação do material genético para o núcleo celular 26 1.4 Objetivos 28 2 Materiais e Métodos 30 2.1 Materiais 30 2.2 Métodos 30 vi 2.2.1 Cultura de células 30 2.2.2 Preparação dos poliplexos 31 2.2.3 Capacidade de Transfeção – Ensaio de Luminescência 31 2.2.4 Ensaio de Viabilidade Celular 33 2.2.5 Caracterização Físico-Química das formulações 33 2.2.5.1 Análise da difusão dinâmica da luz e Potencial Zeta 34 2.2.5.2 Ensaio de intercalação do Brometo de Etídio 35 2.2.5.3 Ensaio de eletroforese em gel de agarose 36 3 Resultados e Discussão 37 3.1 Capacidade de transfeção das nanopartículas em COS 7 – Ensaio de Luminescência 38 3.2 Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular COS 7 – Ensaio de viabilidade celular 51 3.3 Citotoxicidade dos polímeros 59 3.4 Capacidade de transfeção das nanopartículas em HepG 2 – Ensaio de Luminescência 62 3.5 Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular HepG 2 – Ensaio de viabilidade celular 65 3.6 Caracterização Físico-Química dos poliplexos 69 3.6.1 Tamanho e potencial zeta dos poliplexos 69 3.6.2 Proteção e condensação do material genético 75 4 Conclusão e Perspetivas Futuras 80 4.1 Conclusão 80 4.2 Perspetivas Futuras 85 5 Referências 87 vii Índice de Figuras Figura 1Principais marcos na história da terapia génica (Adaptado de History of Gene Therapy. Gene. 2013; 525 (2): 162-169). 2 Figura 2Representação gráfica das principais condições estudadadas em ensaios de terapia génica (Visualizado em http://www.abedia.com/wiley/indications.php). 3 Figura 3Barreiras para entrega de genes in vivo (Retirado de Non-Viral vectors for gene-based therapy. Nat Publ Gr. 2014; 15(8): 541-555). 5 Figura 4Principais tipos de vírus utilizados como vectores de material genético (Retirado de Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 2003;21(3):117-122). 6 Figura 5Formação de lipoplexos (Retirado de Chemical vectors for gene delivery: uptake and intracellular trafficking. 2010:640-645). 14 Figura 6Ilustração esquemática da conjugação de lipossomas e ligandos (Retirado de Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 2014;4(3):240-255). 15 Figura 7Polímero carregado positivamente e DNA carregado negativamente formam estruturas denominadas de poliplexos. (Retirado de Design and development of polymers for gene delivery. Nat Rev Drug Discov. 2005;4(7):581-593). 17 Figura 8Estruturas químicas dos polímeros catiónicos mais utilizados em terapia génica (Adaptado de Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Publ Gr. 2014;15(8):541-555). 19 Figura 9Estrutura do polímero poli (2-aminoetil metacrilato) (Adaptado de Poly (2-aminoethyl methacrylate) with well-defined chain length for DNA vaccine delivery to dendritic cells. Biomacromolecules. 2011;12(12):4373-4385). 22 Figura 10Estrutura química do polietilenoglicol (PEG). 22 viii Figura 11Mecanismos segundo os quais se crê que o PEG aja aquando conjugado com nanopartículas (Retirado de PEGylation of nanocarrier drug delivery systems: State of the art. J Biomed Nanotechnol. 2008;4(2):133-148). 24 Figura 12Equação representativa do processo de bioluminescência. 31 Figura 13Estruturas químicas do homopolímero PAMA (à esquerda) e do copolímero em bloco PEG-b-PAMA (à direita). 37 Figura 14Efeito da composição e da razão de carga N/P (polímero/ material genético) dos poliplexos na sua atividade de transfeção em células COS-7 na ausência de soro. Os diferentes polímeros PAMA (a) e copolímeros PEG-β-PAMA (b) foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos rácios N/ P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção dos Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em RLU de luciferase por mg de proteína celular total (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). 39 Figura 15Efeito da presença de soro na atividade de transfeção de poliplexos preparados a partir do homopolímero PAMA (a) e do copolímero PEG-βPAMA (b) na linha celular COS 7. Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos rácios N/P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na subsecção Métodos na secção dos Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em RLU de luciferase por mg de proteína celular total (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). 42 Figura 16Efeito da razão de carga e da presença do PEG na atividade biológica dos poliplexos preparados a partir do par PAMA17600/ PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/ PEG-b-PAMA29900 na presença e ausência de soro em células COS 7. Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos três rácios N/P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em unidades RLU de luciferase por mg de proteína celular total (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). 49 Figura 17Efeito do peso molecular dos polímeros e da razão de carga (N/P) dos poliplexos na viabilidade células COS 7. Os poliplexos foram preparados a partir do xv Abstract Modernizing the different Biotechnology techniques led to several advances regarding areas such as genetics, taking these part in a broad spectrum of sciences, including medicine. The combination of areas such as medicine and genetics results, amongst other things, in the enhancement of techniques like gene therapy, assuming itself as one of the techniques with greater potential for treating or healing different patologies by correcting the expression of different genes responsible for them. The efficacy of gene therapy is intimately connected with the different systems of transport and delivery of genetic material used, having these the obligation to promote a competent and, above all, safe delivery of the genetic material. Having this in mind, different types of vectors have already been studied, both viral and non viral, coming to the conclusion that, despite the low transfection efficacy regarding viral vectors, non viral systems are safer, combining that with different characteristics, such as versatility, packaging capacity, ability to be chemically functionalized and low immunogenicity. Regarding the set of non viral vectors, polymeric nanosystems appear as one of the most promising strategies. Taking this in account, during this project, the delivery of genes promoted by polyplexes formed with the cationic polymer poly (methacrylate 2-aminoethyl) was evaluated, studying the influence that the polymer’s molecular weight, the copolymerization with polyethylene glycol (PEG) and the polyplexes’ charge ratio (N/P) have in parameters as the biological activity of the polyplexes and the cytotoxicity of both polyplexes and polymers. In order to proceed to a thorough study and to collect further conclusions, a physico chemical characterization of the nanoparticles has also been done, consisting this in the evaluation of the zeta potential and size of the polyplexes, as well as in the polymer’s condensing capacity after the formation of complexes. The evaluation of the polyplexes’ biological activity studied in the presence and absence of serum, showed that the presence of this component enhances the transfection levels, highlighting, in this parameter, the polyplexes based in the copolymer PEG-b-PAMA29900. These results show that the copolymerization with PEG led to better results, specially concerning biological activity, being these higher than the xvi ones obtained with the gold standard PEI polyplexes. The presence of PEG enhanced several improvements in the polyplexes’ cytotoxicity, not being able to produce better results than the ones obtained with the control (PEI), though. PEG-b-PAMA29900 polyplexes’ physico chemical characterization showed a good DNA protection, a positive zeta potential and a size that may allow nanoparticles to last longer in circulation and benefit from enhanced permeation and retention (EPR) effect. Key words: gene therapy, cationic polymer, polyplexes, genetic material transport and delivery systems, cancer. xvii Lista de Siglas ATPAdenosina tri-fosfato ATRPPolimerização radicalar por transferência atómica BSAAlbumina de soro bovino COS 7CV-1 in origin, and carrying the SV40 genetic material DLSDynamic Light Scattering DMEM-HGDulbecco’s Modified Eagle Medium – high glucose DNADeoxyribonucleic acid DTTDithiothreitol EDTAEthylenediaminetetraacetic acid EtBrEthidium bromide FBSFetal bovine serum HCCHepatocarcinoma celular LucLuciferase MnPeso molecular N/PRácio azoto/fosfato PAMAPoli (2-aminoetil metacrilato) PBSPhosphate-buffered saline PdIPolidispersion index PDMAEMAPoly(2-dimethylaminoethyl methacrylate) pDNAPlasmide deoxyribonucleic acid PdIÍndice de polidispersão PEGPolietilenoglicol PEG-b-PAMAPolietileno glicol beta poli (2-aminoetil metacrilato) PEIPolietilenimina PβAEPoli (β-amino éster) RLURelative light units RNARibonucleic acid SDSSodium dodecyl sulfate TBETris/Borate/EDTA xviii xix 1 1 Introdução 1.1 História da Terapia Génica O avanço dos estudos na área da genética é transversal a outros campos, como o caso da medicina e, por conseguinte, o da Terapia Génica, consistindo esta técnica na inserção de material genético exógeno numa célula específica, tendo em vista a correção da expressão dos genes responsáveis pela condição patológica, conferindo essas modificações possibilidade de tratamento ou cura da patologia em causa1. Para se atingir o objetivo proposto com a terapia génica, é necessário que o material genético chegue íntegro ao interior das células-alvo, sendo para o efeito necessários sistemas de transporte e entrega de material genético2, tema central da presente dissertação. Existem duas classificações possíveis para a terapia génica: terapia génica de células somáticas, incapaz de produzir uma hereditariedade da resposta, e terapia génica de células germinativas1, capaz de gerar uma hereditariedade das modificações genómicas2. A aplicação de técnicas de terapia génica levanta bastantes questões a nível ético, forçando a uma legislação bastante apertada que permite a sua realização apenas em células somáticas3. Genericamente, existem duas formas de se conduzir este tipo de terapia, sendo elas: in vivo ou ex vivo, consoante a entrega de genes é feita diretamente no paciente ou em células retiradas do paciente e reimplantadas novamente1. O conceito de Terapia Génica, como o conhecemos, surge nos primórdios da década de 70 do passado século4, havendo a necessidade de assinalar diversos marcos importantíssimos para a construção e desenvolvimento da técnica em si, encontrandose estes esquematizados na Figura 1. Os primeiros ensaios clínicos em humanos foram realizados em dois elementos do sexo feminino com um distúrbio no ciclo da ureia, utilizando-se o vírus Papilloma Shope como agente responsável pela introdução do gene codificador da arginase nas duas pacientes5,6, já que alguns produtos deste ciclo são catalisados por esta enzima. Apesar do ensaio se ter revelado um insucesso, veio-se provar mais tarde que o genoma deste vírus não continha sequências que codificavam a arginase, desmentindo as primeiras conclusões. 2 Figura 1Principais marcos na história da terapia génica (Adaptado de History of Gene Therapy. Gene. 2013; 525 (2): 162-169). Em 1990, Martin Cline executou pela primeira vez um ensaio de terapia génica utilizando DNA recombinante em dois pacientes com uma deficiência genética que resulta numa condição denominada de β-talassemia3, motivado por resultados positivos obtidos anteriormente na transferência de material genético exógeno em células estaminais de medula óssea de ratos7. Apesar da realização dos ensaios, o Conselho de Revisão Institucional demonstrou as suas preocupações face à sua eficácia8,9. Em 1990 é aprovado oficialmente, pela US Food and Drug Administration (FDA), o primeiro ensaio clínico usando um gene terapêutico, conduzido por Michael R. Blaese10. Os sujeitos-alvo deste estudo foram dois pacientes com uma imunodeficiência severa combinada causada por um défice de adenosina deaminase. O tratamento proposto envolvia a manipulação genética ex vivo dos glóbulos brancos dos pacientes, de forma a ser introduzido o gene responsável por codificar a enzima anteriormente referida. Graças aos resultados obtidos, a mesma terapia é pouco depois colocada em prática na União Europeia11, iniciando-se, por esta altura, diversos ensaios de transferência génica tendo como objetivo a criação de terapias para outras doenças. No entanto, e apesar do avanço verificado no campo da terapia génica, assiste-se, em 1999, à trágica morte de Jesse Gelsinger, estando esta relacionada com a administração de um vetor adenoviral12. 3 Atualmente, o cancro é a doença mais visada pelas técnicas de terapia génica, sendo cerca de 65 % dos ensaios clínicos realizados direcionados para doenças do foro oncológico3, como se observa pela Figura 2. Existem também resultados promissores quanto à aplicação de técnicas de terapia génica em doenças hereditárias como a amaurose congenital de Leber13, β talassemia14,15, imunodeficiência severa combinada grave associada ao cromossoma X (SCID-X116, entre outras. Figura 2Representação gráfica das principais condições estudadadas em ensaios de terapia génica (Visualizado em http://www.abedia.com/wiley/indications.php). Alguns produtos de base génica foram já aprovados, como o Gendicine™, desenvolvido pela SiBiono Gene Tech Co., aprovado em 2003 na China, sendo este constituído por um adenovírus manipulado geneticamente sem capacidade replicativa17,18, que visa combater o carcinoma das células escamosas da cabeça e pescoço; o Oncorine™, aprovado em 2005 no mesmo país e desenvolvido pela Sunway Biotech Co. Ltd, que se destina a pacientes com cancro naso faríngico refratário em estágios avançados, sendo constituído por um tipo de adenovírus com capacidade de replicação condicionada; o Cerepro®, desenvolvido pela Ark Therapeutics Group PLC e certificado na União Europeia em 2004, é constituído por um adenovírus contendo o gene da timidina cinase, tendo como objetivo o tratamento do glioblastoma multiforme19, tratando-se do primeiro medicamento a completar um ensaio clínico de fase III3; o Glybera®, desenvolvido pela Amsterdam Molecular Therapeutics, faz uso de um vetor viral adenoassociado para tratar a deficiência severa da lipase, tendo sido aprovado em 20123. 4 1.2 Sistemas de transporte e entrega de material genético O desenvolvimento das técnicas de terapia génica está dependente da existência de métodos eficazes de transferência de material genético. Por definição, um vetor é uma estrutura que contém o gene terapêutico de interesse, tendo diversas funções, como a proteção do gene, a mediação da entrada do mesmo nas células-alvo e, no caso da utilização de pDNA, oferecer a garantia de uma transcrição estável do gene aquando da sua chegada ao núcleo celular20. A utilização de nanossistemas para transporte e entrega de material genético visa melhorar o processo de transferência génica, tornando-o mais eficiente, específico e seguro21. Um vetor, para se considerar ideal, deve obedecer a um conjunto de características, como por exemplo, não levar a uma resposta imunitária aguda; capacidade ilimitada de empacotamento do transgene; conduzir a uma expressão prolongada do gene terapêutico; deve ser específico; deve ser capaz de entregar o material genético a células quiescentes e em divisão; deve ser de fácil preparação; baixo custo e estar disponível comercialmente a concentrações elevadas; e deve também permitir que, após entrada no núcleo, o material genético permaneça numa posição epissomal ou integre uma região específica do genoma22. A introdução de material genético exógeno em células visa regular a expressão génica nas mesmas, podendo este ser de diferentes tipos, como por exemplo DNA, RNA, small interfering RNA (siRNA), micro RNA (miRNA) ou oligonucleótidos antisense (ASON)23. O tipo de material genético a transportar é, também, um dos fatores de seleção do vetor a utilizar, já que existem diferentes desafios para a entrega de cada um dos tipos de material genético referidos, de acordo com as características físicoquímicas das diferentes macromoléculas. Independentemente do tipo de material genético a transportar, os vetores têm de ultrapassar diversos obstáculos, como por exemplo a degradação enzimática, a excreção por parte do sistema renal, a deteção por parte do sistema imunitário e, após a entrada na célula, a degradação por parte do sistema endolisossomal23, processos ilustrados na Figura 3. 5 Figura 3Barreiras para entrega de genes in vivo (Retirado de Non-Viral vectors for gene-based therapy. Nat Publ Gr. 2014; 15(8): 541-555). Os vetores podem ser classificados de uma forma abrangente como vetores virais ou não-virais. Tal como o nome sugere, englobam-se dentro dos vetores virais todos os vetores que utilizam um vírus como transportador de material genético, ficando os restantes inseridos nos grupos de vetores não-virais. As principais diferenças entre si serão abordadas com mais detalhe nos próximos subcapítulos. 1.2.1 Vetores virais Os vírus podem ser considerados verdadeiras máquinas biológicas que, eficientemente, ganham acesso às células de forma a tirarem proveito da sua maquinaria e facilitarem a sua replicação24. Para serem usados em terapia génica, é 12 Técnica Descrição Vantagens Desvantagens Aplicações Eletroporação Aplicação de um campo elétrico. Eficácia; Mantém os tecidos intactos; Células divisíveis e não divisíveis; Transfeta um grande número de células. Baixa viabilidade celular; Inflamação; Deposição de metais; Custo; Invasivo. Entrega de genes in vivo; Combinação com quimioterapia; Uso em células estaminais. Sonoporação Ultrassons de alta intensidade; Induz formação de poros devido ao movimento de um fluído. Não invasiva; Baixo controlo da entrada do DNA; Eficácia. Absorção transdérmica de medicamentos; Entrega de genes in vivo; Imagiologia. Irradiação com laser Perfuração de células através da variação da frequência de um laser. Seleção e imobilização da célula pretendida. Custo. Necessita de mais investigação. Injeção hidrodinâmica Aproveitamento da força física gerada por uma injeção rápida de um grande volume para aumentar a permeabilidade celular. Eficiência; Níveis altos de expressão do transgene; Simplicidade. Volume injetado é demasiado grande; Funções génicas; Medicamentos de base génica; Entrega intrahepática de genes. Magnetofection Criação de um campo magnético para direcionar a entrega de material genético. Não invasivo; Precisão. Baixa citotoxicidade; Alta eficiência. Magnetes externos têm de ser fortes; Reprogramação celular; Transfeção de culturas primárias. A microinjeção é ainda considerada o método físico mais eficiente e direto de entrega de genes44, apesar das desvantagens inerentes ao mesmo. Tem-se vindo a assistir a um claro desenvolvimento dos métodos físicos de entrega de material genético, no entanto, o modus operandi destes assentará sempre na deformação da membrana celular, ameaçando a viabilidade das células44, o que será sempre um obstáculo à aplicação deste tipo de técnicas. Existem diversos estudos que planeiam trazer novas tecnologias para o mercado. Algumas dessas técnicas, como por exemplo 13 a entrega de genes através de vibração molecular induzida por um campo elétrico, surgem como alternativa à eletroporação44. Esta técnica não compreende a aplicação de uma corrente elétrica nas células, sendo a entrada do material genético exógeno facilitada pela vibração induzida pelos elétrodos44,45. Existem algumas vantagens associadas a esta técnica, como por exemplo a alta eficiência de transfeção aliada a uma baixa citotoxicidade, para além da promoção de uma expressão do transgene bastante estável44. 1.2.2.2 Métodos Químicos Os vetores químicos são outra subclasse de sistemas de transporte e entrega de material genético pertencente aos vetores não virais. Estas estruturas têm sido intensivamente estudadas devido às vantagens que apresentam em relação aos vetores virais, como por exemplo, a segurança, a capacidade de transportarem material genético de maiores dimensões, a baixa toxicidade e a facilidade de produção44. Dentro desta subclasse, destacam-se alguns sistemas, como os lipossomas, os polímeros catiónicos, o fosfato de cálcio e, por fim, as nanopartículas híbridas constituídas por lípidos e polímeros40,46. Até à data, os sistemas de transporte mais estudados e utilizados são os de base polimérica e os de base lipídica47. 1.2.2.2.1 Co precipitação de fosfato de cálcio O método de co-precipitação de fosfato de cálcio é uma opção bastante atrativa devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, capacidade de adsorver material genético e eficiência face ao custo46,48,49. Esta técnica surge aquando da exploração da distribuição intracelular de DNA internalizado devido à precipitação de fosfato de cálcio, advindo daí evidências que sugeriam a existência de uma via na qual vesículas intermediárias transferiam DNA exógeno do complexo endolisossomal até ao núcleo49. No entanto, as condições sob as quais surgem co-precipitados de material genético e fosfato de cálcio suficientemente eficazes para transfecções são bastante exigentes a nível físico-químico, estando a eficácia da transfeção e os níveis de expressão 14 do transgene sujeitos às condições a que a reação acontece46, o que, aliado a uma pobre reprodutibilidade50,51, constituem as maiores desvantagens desta técnica. 1.2.2.2.2 Lipossomas catiónicos Os lipossomas catiónicos possuem a vantagem de interagir eletrostaticamente com o material genético carregado negativamente, formando lipoplexos21 (ilustrados na Figura 5). Estas estruturas conferem algumas vantagens à utilização deste tipo de vetores, já que facilitam o uptake celular, melhoram a entrega dos genes a nível intracelular e protegem o material genético de degradação enzimática21. Figura 5Formação de lipoplexos (Retirado de Chemical vectors for gene delivery: uptake and intracellular trafficking. 2010:640-645). De todos os vetores não-virais referidos até agora, os baseados em lípidos catiónicos são os mais estudados e utilizados46,21, visto apresentarem um grande leque de vantagens aquando do transporte e entrega de material genético. A estrutura dos lípidos catiónicos compreende três componentes: a cabeça hidrofílica, âncora hidrofóbica e o espaçador52, que liga estas duas partes. Tendo em conta que a parte hidrofílica dos lípidos é constituída por grupos amina, a sua carga é positiva, o que é crucial para as interações eletrostáticas com o material genético (carregado negativamente) que estão na base da formação dos lipoplexos. Atendendo ao número de cargas da cabeça hidrofílica, os lípidos catiónicos podem ser classificados como monovalentes ou multivalentes, sendo estes últimos os usados com mais sucesso21. As propriedades dos espaçadores são bastante importantes na escolha de lípidos catiónicos como sistemas de transporte de material genético, já que, para além de serem responsáveis pela “ponte” entre a cabeça hidrofílica e o domínio hidrofóbico, 15 determinam também a toxicidade, a biodegradabilidade e a eficiência na transfeção apresentadas por estas estruturas53,54. Consideram-se os lipossomas catiónicos bastante promissores para aplicação em técnicas de terapia génica devido a algumas particularidades que possuem, como o facto de apresentarem baixa toxicidade e imunogenicidade, em relação aos vetores virais, e possuírem bastante versatilidade55 também em relação aos mesmos. Para além disto, são facilmente preparados e apresentam grande capacidade de transporte e entrega de grandes quantidades de material genético46. A conjugação de ligandos aos lipossomas aumenta a especificidade destes sistemas de transporte de material genético56, conforme ilustrado na Figura 6. Figura 6Ilustração esquemática da conjugação de lipossomas e ligandos (Retirado de Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 2014;4(3):240-255). Apesar de desempenharem um papel importante na citotoxicidade apresentada por este tipo de sistemas, a presença de cargas positivas é essencial para a ligação dos lipoplexos à superfície das células que se visa transfetar, por via de interações eletrostáticas21. Atualmente, acredita-se que a maior parte dos lipoplexos são internalizados por endocitose57,58, verificando-se, no entanto, que uma das maiores barreiras à entrega de material genético associada aos lipoplexos é a ineficiente dissociação entre o material genético e o componente lipídico aquando da chegada ao invólucro nuclear21. Apesar de apresentarem vantagens em relação aos vetores virais, urge melhorar propriedades como a eficiência de transfeção e a citotoxicidade destes nanossistemas46. A toxicidade apresentada por estes sistemas de transporte advém tanto da presença de cargas positivas capazes de interagir inespecificamente com 16 componentes celulares, como da natureza do espaçador46,59. No entanto, estas desvantagens conseguem ser colmatadas, havendo duas formas de o realizar: modificando a componente hidrofílica do lípido ou alterando o grupo do espaçador. No último caso pode-se, por exemplo, utilizar espaçadores compostos por ésteres ou amidas, o que confere maior biodegradabilidade aos lipossomas, diminuindo a sua toxicidade46. Em suma, a utilização de lipossomas catiónicos reúne bastante aceitação por parte da comunidade científica devido às vantagens citadas anteriormente, o que não invalida a necessidade de continuar a procura por outros tipos de sistemas de transporte e entrega de material genético. Neste sentido, surgem os polímeros como vetores nãovirais, classe essa que possui um enorme potencial. Tendo em conta que o tema central desta dissertação é a utilização deste tipo de estruturas, será dedicado um subcapítulo da introdução para uma discussão mais pormenorizada das mesmas. 1.3 Nanopartículas Poliméricas A utilização de polímeros catiónicos como nanossistemas para entrega de material genético é uma das estratégias que tem vindo a ganhar alguma preponderância, o que é explicado, entre outras características, pela versatilidade destas estruturas. Através de modificações da sua estrutura, é possível alterarem-se algumas das propriedades dos polímeros60, influenciando assim a sua toxicidade e/ou atividade biológica21. Para além disto, os polímeros catiónicos assumem-se como vetores seguros, biodegradáveis e pouco tóxicos, quando comparados com a totalidade dos vetores virais utilizados até aos dias de hoje46. Para além disto, acrescentam a capacidade de transportar uma maior quantidade de material genético61. Por norma, os polímeros catiónicos possuem uma elevada densidade de cargas positivas (proveniente dos grupos amina), o que promove a ocorrência de interações eletrostáticas com as cargas negativas dos ácidos nucleicos, levando à formação de partículas com tamanhos à volta dos 100 nm21,47,60, designadas de poliplexos (Figura 7). Estes têm a capacidade de proteger o material genético contra a ação das nucleases presentes no meio; de estabelecer interações eletrostáticas com a 17 membrana celular, facilitando o seu uptake que ocorre através de endocitose; e, por último, de promover o escape endolisossomal21. Figura 7Polímero carregado positivamente e DNA carregado negativamente formam estruturas denominadas de poliplexos. (Retirado de Design and development of polymers for gene delivery. Nat Rev Drug Discov. 2005;4(7):581-593). Ainda assim, existem algumas desvantagens quanto ao uso de polímeros catiónicos, já que estes induzem alguma citotoxicidade que se julga ser proveniente da densidade de cargas positivas e do peso molecular62,63,64. Para além das características inerentes ao uso de polímeros catiónicos, existem ainda outros tipos de obstáculos que comprometem a eficiência da transfeção e o targeting das nanopartículas in vivo, já que o material genético atravessa uma série de barreiras até chegar, em primeiro lugar, às células-alvo e, depois, ao núcleo das mesmas (no caso de pDNA). As nanopartículas poliméricas podem ser administradas localmente, como acontece com o caso de injeções intratumorais, por via sistémica ou por via oral. O sistema imunitário, em particular, o sistema reticuloendotelial, constituído por macrófagos e monócitos, é responsável pela identificação e destruição de compostos estranhos ao nosso corpo, participando na eliminação de nanopartículas poliméricas em 18 circulação65. Essa eliminação ocorre através de fagocitose, sendo esta induzida pela associação entre as proteínas opsoninas e, neste caso, as nanopartículas poliméricas65. Existe ainda a possibilidade das nanopartículas poliméricas interagirem nãoespecificamente com as proteínas do soro, já que estas são carregadas negativamente, formando agregados que serão excretados pelo sistema reticuloendotelial66. Para além do referido anteriormente, as nanopartícuas deverão apresentar um diâmetro superior a 10 nm, de forma a não serem filtradas pelo sistema renal67. Para os casos de administração oral das nanopartículas, a chegada destas ao seu local de ação ainda é mais complexa, já que, antes de entrarem na circulação têm de superar as condições adversas encontradas no trato gastrointestinal. Após ingestão, as formulações deparam-se de imediato com um pH baixo no estômago, para além da ação de todas as enzimas digestivas que podem degradar os agentes terapêuticos não protegidos. Na chegada ao intestino, apesar da subida do pH, permanece a ação de diversas enzimas digestivas. O transporte através das células epiteliais do intestino é um processo complexo, que envolve diferentes barreiras físicas e químicas, como o caso das tight junctions e da presença de uma rede glicoproteica a encapsular as células do epitélio intestinal65. A atividade biológica de polímeros pode ser modulada, o que levou a que, nos anos mais recentes, tenham surgido vários estudos com este tipo de nanossistemas para transporte e entrega de material genético. Essa modulação pode ser conseguida através de duas estratégias principais: a associação de ligandos, aumentando a especificidade das formulações para determinadas células-alvo; e a conjugação com moléculas, como o polietilenoglicol (PEG), que modificam o comportamento das nanopartículas in vitro e in vivo. Existem inúmeros polímeros utilizados para fins de terapia génica, no entanto, os mais estudados são a polietilenimina (PEI), a poli (L-lisina), os polimetacrilatos (como o PDMAEMA), o quitosano e os poli (β-amino ésteres), cujas estruturas estão ilustradas na Figura 8. 19 Figura 8Estruturas químicas dos polímeros catiónicos mais utilizados em terapia génica (Adaptado de Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Publ Gr. 2014;15(8):541-555). A polietilenimina (PEI) é o polímero catiónico mais utilizado tanto in vitro como in vivo para transporte de material genético68. A polietilenimina pode ter uma estrutura linear ou ramificada. A PEI altamente ramificada forma complexos polímero/DNA mais pequenos69,70,71. Polímeros deste tipo protegem de forma muito competente o material genético, evitando a sua degradação enzimática. Para além desta propriedade, a eficácia na transfeção e a citotoxicidade apresentada pelos poliplexos compostos por polietileniminas é influenciada por características como o peso molecular, o grau de ramificação, o potencial zeta e o tamanho das nanopartículas72, 73. Com um aumento do peso molecular, a eficácia da transfeção da PEI aumenta, no entanto, é potenciada a citotoxicidade dos complexos74, o que se deve a um aumento da interação entre as cargas positivas dos poliplexos e a membrana plasmática, promovendo a destabilização desta última. Existem duas teorias explicativas para o facto dos poliplexos de base PEI serem dos vetores não-virais mais eficientes, levando até à denominação de gold standard no que a vetores poliméricos diz respeito. Em primeiro lugar, o efeito “esponja de protões”75, sendo crucial para a fuga da via endolisossomal, que será explicado detalhadamente na subsecção 1.3.3 Escape endolisossomal e transporte citoplasmático desta introdução. Outra teoria reporta evidências de uma barreira física promovida pela estrutura ramificada e tamanho do polímero, impedindo a degradação enzimática do material genético74. As polilisinas (PLL) são polipeptídeos com o aminoácido lisina a constituir a unidade de repetição, conforme sugere o nome. A polilisina é um polímero biodegradável, o que se considera uma grande vantagem para aplicações in vivo76. Para além disso, esta classe de polímeros permite modificações controláveis a nível do seu 20 tamanho molecular, forma e a possibilidade de ser modificada quimicamente77. Contudo, os poliplexos preparados com este polímero apresentam uma fraca eficiência na transfeção, o que se deve a um baixo escape da via endolisossomal78. Para além da baixa eficiência na transfeção, a polilisina apresenta níveis consideráveis de imunogenicidade e toxicidade, devido à constituição da cadeia principal com aminoácidos79. Dentro da classe de polímeros conhecida como polimetacrilatos, destaca-se o poli (metacrilato de etilo-2-dimetilamino) (PDMAEMA), que oferece resultados bastante promissores no âmbito do transporte e entrega de material genético. O PDMAEMA é um polímero duo-responsivo (temperatura e pH)80 que tem sido estudado de forma bastante intensiva. De todos os fatores estudados, chegou-se à conclusão que o peso molecular desempenha um papel ativo na atividade biológica desta formulação, já que PDMAEMAs de maiores pesos moleculares levam à formação de nanopartículas mais pequenas que, apesar de serem mais citotóxicas que as geradas por PDMAEMAs de pesos moleculares mais baixos81, promovem níveis mais altos de expressão do gene repórter. Este polímero é constituído por aminas de estrutura terciária e atinge níveis de eficiência de transfeção muito próximos dos exibidos pelo gold standard PEI, ainda assim, apresenta algumas desvantagens, como a sua citotoxicidade81. O quitosano é um polímero natural que deriva da desacetilação alcalina da quitina, sendo um dos vetores não-virais mais utilizados devido à sua baixa toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade82. Existem alguns fatores determinantes na eficiência de transfeção conduzida pelo quitosano, destacando-se entre eles o grau de desacetilação e o peso molecular, bem como algumas condições a que o processo ocorre, como o pH83. Ainda assim, existem resultados contraditórios no que toca ao peso molecular ideal para se atingir uma boa atividade biológica com este polímero. A sua eficiência de transfeção está bastante abaixo do ideal, o que levou à procura de outras formulações derivadas do quitosano, como o quitosano carboximetilado84 e os copolímeros de arginina-quitosano85 ou o PEG-trimetil quitosano86, sendo estes apenas alguns exemplos. Os poli (βamino ésteres) (PβAEs) são polímeros sintéticos que se destacam pela sua biodegradabilidade e biocompatibilidade87. A síntese desta classe de polímeros é bastante simples, residindo numa reação de adição de Michael entre uma amina 21 primária ou bis (amina secundária) e um diacrilato88. Existe uma grande diversidade de aminas e diacrilatos, o que torna possível a criação de bibliotecas de polímeros, de modo a que se possam ajustar as suas características físico-químicas, como a densidade de carga, solubilidade na água, cristalinidade e perfil de degradação, conforme a aplicação desejada89. Uma das características mais apelativas dos PβAEs é o facto de serem degradados em condições fisiológicas por hidrólise das ligações éster presentes na cadeia principal do polímero, dando origem a partículas biologicamente inertes (βaminoácidos)87,90,91, o que confere uma baixa toxicidade às formulações, sendo que, no entanto, essa toxicidade aumenta com o número de carbonos presentes nas cadeias principais e laterais do polímero92. Existem diversos fatores que influenciam a ação dos PβAEs, destacando-se o papel que as terminações desempenham tanto na citotoxicidade exibida como na eficácia de transfeção destes polímeros, podendo as mesmas ser constituídas por grupos amina ou acrilato, entre outros88. O trabalho desenvolvido neste projeto assenta na utilização do polímero poli (2-aminoetil metacrilato), cuja estrutura se encontra ilustrada na Figura 9, bem como da sua conjugação com o polímero hidrofílico PEG. O poli (2-aminoetil metacrilato) resulta de uma polimerização do monómero metacrílico 2-aminoetil metacrilato, possuindo este aminas primárias na sua constituição93. Apesar de não fazerem parte do lote de polímeros mais utilizados em técnicas de terapia génica, os polímeros baseados em aminas primárias foram já empregues no transporte de material genético75,94, já que estes permitem a condensação eficiente de compostos carregados negativamente, como o pDNA95, ajustam a capacidade de tampão do polímero e melhoram a estabilidade dos complexos96. O tamanho das cadeias poliméricas influencia o comportamento destes polímeros quando aplicados como vetores de material genético, reportando-se um aumento da eficiência de transfeção in vivo e in vitro com o aumento das cadeias poliméricas, já que as nanopartículas formadas são mais pequenas e estáveis face a destabilizações eletrostáticas, juntando o facto de haver um aumento do uptake celular e nuclear de pDNA95. Por outro lado, cadeias poliméricas mais pequenas mostraram favorecer a libertação de material genético a nível intracelular e intranuclear95. 28 1.4 Objetivos O potencial do uso de técnicas de terapia génica para prevenir, tratar ou curar diversas doenças é inegável. No entanto, existem diversos riscos associados, já que aquando da realização deste tipo de procedimentos se manipula a genética do próprio ser humano. Por outro lado, a sua aplicação envolve sistemas de transporte e entrega de material genético. Neste contexto, surgiu a possibilidade de utilizar polímeros como nanossistemas transportadores de material genético. Estes nanossistemas apresentam algumas vantagens quando comparados com nanossistemas virais, como a sua versatilidade, a sua baixa imunogenicidade e a capacidade de transportarem sequências de tamanhos maiores. Ainda assim, existem aspetos a corrigir, de forma a otimizar a função dos nanossistemas poliméricos, sendo o parâmetro principal a eficácia da transfeção, que está distante da apresentada pelos vetores virais. Assim sendo, este trabalho visa testar as alterações que a peguilação do polímero poli (metacrilato de 2-aminoetil), bem como o seu peso molecular e razão de carga dos poliplexos em si baseados, induzem a nível da sua atividade de transfeção e citotoxicidade. Pretende-se também compreender as alterações a nível físico-químico que a copolimerização com PEG promove, podendo estas ajudar a explicar o comportamento dos nanossistemas estudados. De forma a realizar um estudo mais detalhado das formulações, as mesmas foram testadas em duas linhas celulares, de forma a compreender se a peguilação dos polímeros é eficaz em mais do que um tipo de células-alvo e se as alterações nos perfis de atividade biológica e citotoxicidade induzidas pelos diferentes tamanhos e razões de carga dos poliplexos se mantêm em mais do que uma linha celular. 29 30 2 Materiais e Métodos 2.1 Materiais Os diferentes polímeros utilizados neste trabalho foram sintetizados través da técnica de polimerização radicalar por transferência atómica (ATRP) pelo grupo de síntese e caracterização de polímeros no departamento de Engenharia Química. Chegou-se ao peso molecular médio (Mn) dos polímeros (com exceção do copolímero PAMA26900) através da técnica de espetroscopia de ressonância magnética nuclear. Esta é uma técnica bidimensional de ressonância magnética nuclear que fornece informação acerca das orientações relativas e distâncias internucleares de moléculas vizinhas em sólidos poli-cristalinos e não-cristalinos138, fazendo parte do lote de técnicas mais utilizadas em investigação relacionada com polímeros, já que permite simplificar o comportamento que este tipo de moléculas assume. 2.2 Métodos 2.2.1 Cultura de células Os ensaios realizados ao longo deste projeto foram conduzidos em nas linhas celulares COS-7 e HepG2. A linha COS-7 deriva de tecido renal do Macaco Verde Africano, Cercopithecus aethiops. Estas células apresentam um crescimento bastante semelhante ao dos fibroblastos e são frequentemente indicadas para avaliação de novos vetores não virais. A linha celular HepG2 deriva de tecido hepático de um adolescente de 15 anos com hepatocarcinoma. Ambas as linhas celulares foram mantidas em cultura a 37 ºC num ambiente com uma saturação de CO2 de 5% em meio de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s médium-high glucose (DMEM-HG) (Sigma-Aldrich, MO, USA), suplementado com 10 % (v/v) de soro fetal bovino inativado por calor (FBS, Sigma-Aldrich, MO, USA), penicilina (100 U.mL-1) e estreptomicina (100 μg.mL-1). As células foram passadas duas vezes por semana quando atingiam uma confluência de cerca de 80 %, de modo a manterem-se 31 na fase exponencial de crescimento. Este procedimento inicia-se com a remoção do meio de cultura, procedendo-se imediatamente a uma lavagem com PBS. Após remoção do PBS, as células foram incubadas com 3 mL de tripsina a 0,05 % (Sigma, St. Louis, MO) até se observar o seu destacamento, sendo imediatamente adicionados 7 mL de meio de cultura para inativar a ação da tripsina. As células foram passadas para frascos novos com diluições de 1:10 e de 1:4 para as células COS 7 e HepG 2, respetivamente. 2.2.2 Preparação dos poliplexos As soluções poliméricas foram preparadas em água Milli-Q a pH 3 e a uma concentração de 3 mg/ ml. Os poliplexos foram obtidos através da mistura destas soluções poliméricas com uma solução de plasmídeo de ADN (pDNA), de modo a se obter 1 µg de pCMV.Luc em 50 µL de poliplexos. Foram testados vários rácios de carga polímero/ADN (N/P, +/-). Os poliplexos foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente e usados imediatamente a seguir. 2.2.3 Capacidade de Transfeção – Ensaio de Luminescência De forma a avaliar a capacidade de transfeção dos (co)polímeros, estes foram complexados com um pADN que contém o gene que codifica a luciferase (pCMV.Luc). Na presença de ATP, a luciferase converte a luciferina em oxiluciferina, havendo uma consequente libertação de luz, conforme ilustrado na Figura 12. Através da avaliação da luz libertada, é possível estabelecer-se uma relação entre este parâmetro e a quantidade de luciferase presente na amostra, inferindo-se, desta forma, a capacidade de transfeção dos diferentes polímeros. 𝐿𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 + 𝑂2 + 𝐴𝑇𝑃 𝐿𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑎𝑠𝑒 → 𝑂𝑥𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑓𝑒𝑟𝑖𝑛𝑎 + 𝐶𝑂2 + 𝐴𝑀𝑃 + 𝑃𝑃 + 𝐿𝑢𝑧 Figura 12Equação representativa do processo de bioluminescência. Para estes ensaios de transfeção, as células foram plaqueadas quando atingiam uma confluência entre os 70 e 80 % (fase ótima de crescimento). 24 horas antes 32 dos ensaios foram plaqueadas 3,5 x 104 e 8,0 x 104 células por poço de células COS 7 e HepG 2, respetivamente. Após as 24 horas, as células apresentavam uma confluência entre 50 e 70%. Prepararam-se os poliplexos conforme descrito na subsecção 2.2.2. Preparação dos poliplexos e removeu-se o meio de cultura, substituindo-o por 300 µL de meio de cultura completo por poço da placa. Posteriormente, adicionaram-se 50 µL de poliplexos a cada poço (de acordo com as diferentes razões de carga N/P), de forma a garantir que cada condição continha 1 µg de pCMV-Luc. Finalizado este procedimento, incubaram-se as células durante 4 horas a 37 ˚C numa atmosfera com uma saturação de CO2 de 5 %. Após a incubação removeu-se o meio de cultura e transferiu-se 1 mL de meio DMEM-HG completo para cada poço da placa, incubando-se as células durante 48 horas de acordo com as condições descritas anteriormente. Após as 48 horas de incubação procedeu-se à avaliação da citotoxicidade (procedimento experimental descrito na subsecção 2.2.4. Ensaio de Viabilidade Celular) e à leitura da bioluminescência das formulações. Para se proceder à leitura da bioluminescência, as células foram lavadas duas vezes com PBS e introduziram-se 150 µL de tampão de lise [1 mM ditiotreitol; 1 mM EDTA; 25 mM tris-fosfato (a pH 7,8); 8 mM MgCl2; 15 % (v/v) glicerol; 1 % (v/v) Triton X-100] em cada poço, de forma a lisar as células colocando-se seguidamente as placas a -80 ˚C durante, pelo menos, 15 minutos. De seguida, transferiu-se cada condição para eppendorfs devidamente etiquetados e procedeu-se a uma centrifugação a 10.000 rpm e a 4 ˚C durante 5 minutos. Mantiveramse os eppendorfs em gelo enquanto se transferiam 50 µL de cada condição para uma placa de 96 poços branca. A medição da produção de luz mediada pela luciferase foi realizada no luminómetro Lmax II 384 (Molecular Devices, USA). A leitura foi realizada a 37 ˚C logo após a injeção de 100 µL de solução de luciferina a 167 µM (Sigma-Aldrich, USA) seguida de 100 µL de uma solução de tampão de leitura (1 mM DTT; 1 mM EDTA; 25 mM tris-fosfato (a pH 7,8); 8 mM MgCl2; 15 % (v/v) glicerol] contendo 2 mM de ATP a 2 mM. A quantificação da quantidade de proteína presente em cada condição foi realizada através do kit DC Protein Assay (Biorad, CA, USA), utilizando a albumina de soro bovino (BSA) (Sigma-Aldrich, USA) como padrão e segundo o protocolo 33 recomendado pelo fabricante. Os resultados foram expressos em unidades relativas de luz emitida por miligrama de proteína total ((RLU)/mg de proteína total). 2.2.4 Ensaio de Viabilidade Celular A citotoxicidade das formulações foi avaliada através do ensaio de Alamar Blue modificado. Este é um ensaio colorimétrico que avalia o metabolismo celular, no qual se utiliza resazurina (corante de tonalidade azul escura) que, quando reduzido a resorufina, adquire uma tonalidade cor de rosa. Assim, as células metabolicamente ativas (e consequentemente viáveis) têm potencial redutor, reduzindo a resazurina a resorufina, o que fará com que o meio adquira uma tonalidade cor de rosa altamente fluorescente. Estabelece-se, depois, uma correlação entre a absorvância do meio e a viabilidade celular. O procedimento consiste na remoção do meio de cultura, substituindo-se por 300 µL por poço de uma solução de meio com 1% (v/v) de resazurina (Sigma-Aldrich, MO, USA) Os controlos positivos (C+) e negativos (C-) consistem em poços com células não tratadas e poços sem células, respetivamente. Incubam-se as células a 37 ˚C numa atmosfera com uma saturação de 5 % de CO2 durante cerca de 1 hora, até se assistir a uma coloração rosa nos poços relativos ao controlo positivo (células não tratadas). Após esse período são transferiram-se 180 µL de cada condição para uma placa transparente de 96 poços e mediu-se a absorvância do meio a 570 e 600 nm num espetrofotómetro SPECTRA-max PLUS 384 (Molecular Devices, USA). A viabilidade celular foi calculada com recurso ao seguinte modelo matemático: 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%)= (𝐴570 − 𝐴600)− (𝐶570 −− 𝐶600 −) (𝐶570 +− 𝐶600 +)− (𝐶570 −− 𝐶600 −)×100 2.2.5 Caracterização Físico-Química das formulações As formulações foram caracterizadas físico quimicamente avaliando-se três parâmetros: a carga superficial, o tamanho das partículas e a capacidade de proteção/condensação do DNA pelos polímeros. Estes ensaios foram realizados para 34 complementar a informação recolhida nos ensaios de viabilidade celular e da atividade biológica. 2.2.5.1 Análise da difusão dinâmica da luz e Potencial Zeta De forma a determinar o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas, recorreu-se à técnica de difusão dinâmica da luz (DLS), que, tal como o nome indica, se baseia na dispersão da luz pelas nanopartículas em suspensão. A análise do diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas é feita através de uma distribuição de tamanhos que é baseada no número de partículas constituintes de cada população presente na solução, no volume das mesmas ou na intensidade da luz dispersa por estas. No presente trabalho a distribuição de tamanhos foi feita com base na intensidade da luz dispersa pelas nanopartículas em suspensão. O cálculo do tamanho das formulações e do PdI (índice de polidispersão) é feito com o estabelecimento de uma função de autocorrelação que mede as diferenças na intensidade de luz dispersa temporalmente. A correlação é calculada até a semelhança ser igual a 0, estabelecendo-se uma função do tipo exponencial. Essa função contém o coeficiente de correlação que é necessário para o cálculo do diâmetro hidrodinâmico através da equação de Stokes-Einstein. Para o efeito, prepararam-se os poliplexos conforme descrito na subsecção 2.2.2. Preparação dos poliplexos, adicionou-se 1 mL de água destilada e procedeu-se à leitura no equipamento Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK) a 25 ˚C e com um ângulo de dispersão oposto de 173˚. Realizaram-se dois ensaios independentes e as leituras foram feitas em triplicado. A análise do potencial zeta permite saber a carga superficial das nanopartículas em solução, utilizando-se, para o efeito, uma célula com dois elétrodos. Aplica-se um campo elétrico às partículas e mede-se a mudança de fase na luz dispersa pelas nanopartículas em movimento devido ao campo elétrico aplicado, fenómeno conhecido como eletroforese. A mudança de fase é proporcional à mobilidade eletroforética das partículas, parâmetro a partir do qual se calcula o potencial zeta. As medições do potencial zeta foram realizadas sequencialmente às do tamanho, utilizando-se para o efeito o mesmo equipamento Zetasizer Nano-ZS (Malvern 35 Instruments, UK) acoplado a um laser de eletroforese doppler utilizando o modelo de Smoluchovski. Os resultados obtidos para o tamanho e para o potencial zeta foram analisados com recurso ao software Zetasizer 7.02. 2.2.5.2 Ensaio de intercalação do Brometo de Etídio O ensaio de intercalação com a sonda brometo de etídio (EtBr) visa avaliar a capacidade de proteção/condensação do DNA dos poliplexos. Para tal, avalia-se o acesso que a sonda tem ao material genético, estabelecendo-se um valor percentual para o mesmo. O brometo de etídio é um agente intercalante do DNA, que produz um elevado aumento de fluorescência quando ligado a ácidos nucleicos, permitindo a quantificação de fluorescência inferir sobre a capacidade de condensação do material genético conferida pelo poliplexo em estudo. Para o ensaio, prepararam-se os poliplexos de acordo com a subsecção 2.2.2. Preparação dos poliplexos e, após os 15 minutos de incubação, transferiram-se 50 µL de cada condição para uma placa preta de 96 poços (Costar, CA, USA). Pipetaram-se 50 µL de EtBr em cada condição, de modo a atingir uma concentração final de 400 nM. As condições controlo foram água Milli-Q (fluorescência residual) e 1 µg de DNA (fluorescência máxima emitida). Incubaram-se as amostras durante 10 minutos, período após o qual se procedeu à leitura da fluorescência num fluorímetro SpectraMax Gemini EM (Molecular Devices, USA) com comprimentos de onda de excitação e emissão de 518 nm e 605 nm, respetivamente. Para se calcular o acesso da sonda ao material genético subtraiu-se a fluorescência residual a cada valor obtido para as amostras e exprimiu-se o resultado como percentagem do controlo positivo. 36 2.2.5.3 Ensaio de eletroforese em gel de agarose O ensaio de eletroforese em gel de agarose visa complementar a informação recolhida no ensaio de intercalação do EtBr acerca da capacidade de condensação/proteção dos polímeros em estudo. Para o efeito, prepararam-se os poliplexos conforme descrito na subsecção 2.2.2. Preparação dos poliplexos, sendo que após os 15 minutos de incubação se adicionaram 20 µL de cada amostra a 5 µL de loading buffer [15% (v/v) Ficoll 400; 0,05% (m/v) azul de bromofenol; 1% (m/v) SDS; 0,1 M EDTA (a pH 7,8)]. Posteriormente, transferiram-se 20 µL de cada uma das condições (já em solução com o loading buffer) para o gel de agarose a 1% previamente preparado em solução de TBE [89 mM de Trisbase (a pH 8,6); 89 mM de ácido bórico; 2,5 mM de EDTA] e com uma concentração de 1 µg de EtBr por mL de gel. Após a introdução das amostras nos poços o gel foi colocado a uma diferença de potencial de 80 mV durante 45 minutos. Mediu-se depois a intensidade da fluorescência das bandas relativas a cada condição experimental no sistema GelDoc (Bio-Rad, USA), utilizando o software QuantityOne. 37 3 Resultados e Discussão Com este trabalho, pretendeu-se desenvolver um nanossistema de base polimérica, para transporte e entrega de material genético, que aliasse uma boa capacidade de transfeção a uma reduzida citotoxicidade, de modo a constituir um vetor não viral adequado para potencial aplicação em terapia génica. Como tal, testaram-se diversas formulações poliméricas preparadas com vários polímeros poli (metacrilato de 2-aminoetil) (PAMA) e copolímeros polietilenoglicol-poli (metacrilato de 2-aminoetil) (PEG-β-PAMA), de estruturas químicas ilustradas na Figura 13. Os polímeros foram sintetizados de acordo com o descrito na subsecção 2.1 Materiais da secção 2 Materiais e Métodos. Figura 13Estruturas químicas do homopolímero PAMA (à esquerda) e do copolímero em bloco PEGb-PAMA (à direita). As diversas formulações de nanossistemas foram primeiramente avaliadas na linha celular COS 7, determinando-se a atividade de transfeção e respetiva citotoxicidade de acordo com os diferentes pesos moleculares dos polímeros, e as diferentes razões de carga dos poliplexos. Visou-se também avaliar as diferenças entre os polímeros catiónicos e os copolímeros, de forma a determinar o efeito da incorporação do PEG nos polímeros catiónicos e a selecionar as formulações com os melhores comportamentos in vitro. Após seleção, testaram-se as melhores formulações na linha celular HepG2 – células humanas de carcinoma hepatocelular. Estudaram-se também as propriedades físico-químicas das formulações que se destacaram, de modo a tentar perceber o potencial comportamento das mesmas em aplicações in vivo. 44 No caso de não haver uma dissociação precoce dos poliplexos, para um peso molecular mais baixo, a sua carga superficial pode não ser suficientemente positiva, influenciando negativamente o uptake das nanopartículas, servindo este argumento para os poliplexos resultantes do homopolímero PAMA6300. No caso das nanopartículas preparadas a partir dos homopolímeros PAMA17600 e PAMA26400, destacaram-se as formulações preparadas nas razões de carga (+/-) 50/1 e 25/1 para os polímeros PAMA17600 e PAMA26400, respetivamente. Face à ausência de soro, a capacidade de transfeção dos poliplexos formados a partir do homopolímero PAMA17600 sofreu alterações, principalmente no que toca ao efeito da razão de carga, verificando-se também um aumento dos níveis mais altos de expressão do transgene. No caso das nanopartículas preparadas a partir do homopolímero PAMA26400, a presença de soro também trouxe uma influência positiva, já que se atingiram valores superiores de atividade biológica, com exceção dos poliplexos preparados na razão de carga (+/-) 10/1. Apesar das alterações observadas na presença de soro, os níveis máximos de expressão do transgene obtidos com os poliplexos preparados a partir dos homopolímeros PAMA17600 e PAMA26400 são semelhantes. No caso do PAMA17600, observa-se um aumento da capacidade de transfeção na presença de soro com a razão de carga. Ora, com o aumento da razão de carga, as interações eletrostáticas estabelecidas tornam-se mais fortes devido a uma maior quantidade de polímero catiónico presente, estando este fator implicado na diminuição da capacidade de transfeção dos poliplexos formados na razão de carga (+/-) 10/1 relativamente aos formados em razões de carga (+/-) superiores, já que, com uma condensação menos eficiente do material genético, é permitido às proteínas do soro (carregadas negativamente) desestabilizar os poliplexos e influenciar negativamente os níveis de expressão do transgene, conforme alguma literatura sugere21. No entanto, e conforme já foi referido, reportou-se um aumento dos níveis de expressão do transgene com a razão de carga na presença de soro, sendo esta tendência inversa ao obtido na ausência de soro. Este facto, aponta para uma possível contribuição positiva das proteínas constituintes do soro nos poliplexos preparados a partir do polímero PAMA17600 nas razões de carga (N/P) 25/1 e 50/1. Ora, com o aumento da razão de carga, aumenta-se consequentemente a quantidade de polímero catiónico presente, o que vai permitir o estabelecimento de interações eletrostáticas com as proteínas do soro 45 carregadas negativamente, o que pode aumentar a capacidade de transfeção dos poliplexos preparados a partir do polímero PAMA17600 nas razões de carga (N/P) 25/1 e 50/1. A carga superficial dos poliplexos preparados na razão de carga 10/1 é mais baixa do que para os derivados nas razões de carga de 25/1 e 50/1, o que pode estar na origem da diminuição da capacidade de transfeção aquando da utilização das formulações elaboradas nestas características (razão de carga 10/1), por via de não se estabelecerem suficientes interações eletrostáticas entre a superfície dos poliplexos e a membrana celular, influenciando negativamente a sua internalização. Ainda assim, existem outras possíveis razões para o aumento da capacidade de transfeção destas nanopartículas com a razão de carga que valem a pena analisar. Veja-se, com o aumento das cargas positivas, é promovido um aumento do polímero catiónico, existindo evidências de que cadeias poliméricas livres aumentam a entrega de genes a nível intracelular, já que estas potenciam o efeito de esponja de protões141 levando, por conseguinte, à libertação do material genético, sendo, no entanto, este argumento descartado por via dos resultados obtidos na ausência de soro, onde um aumento de cadeias poliméricas livres não conduziu a um aumento dos níveis de expressão do transgene, antes pelo contrário, o que indica que, muito provavelmente, o fator primordial para o aumento da atividade biológica das formulações com a razão de carga, é a presença de soro e consequente interação dos poliplexos com as proteínas que o constituem, já que o excesso de cadeias livres de polímero catiónico leva a uma interação com as proteínas do soro carregadas negativamente. As nanopartículas preparadas a partir do homopolímero PAMA26400 apresentam um perfil de atividade biológica dentro do esperado, já que este parâmetro atinge o seu máximo nas formulações de razão de carga 25/1. Ora, sendo este o polímero de maior peso molecular, é de esperar o estabelecimento de interações eletrostáticas suficientemente fortes entre o mesmo e o material genético, o que se espera que leve a uma maior proteção do material genético. No entanto, e como já foi abordado na subsecção 1.3. Nanopartículas Poliméricas, existem diversos obstáculos a uma entrega eficaz de material genético com vetores não-virais. Um deles é a descomplexação das nanopartículas, levando à libertação do material genético. Com o aumento da condensação do material genético, torna-se mais difícil a libertação do mesmo, de forma a levar à sua transcrição no núcleo celular, o que diminuirá a 46 expressão do gene repórter. Atendendo aos resultados do ensaio de exclusão do brometo de etídio, esta é uma hipótese bastante plausível. Ainda assim, depois de analisados os resultados da viabilidade celular, constatou-se que as nanopartículas preparadas na razão de carga 50/1 possuem uma citotoxicidade elevadíssima, o que compromete a transfeção levada a cabo por estas formulações. No entanto, estes resultados vão de encontro ao esperado, já que é reportada uma clara influência do peso molecular e tamanho das cadeias poliméricas no uptake celular, bem como no escape endossomal, desempacotamento do DNA e internalização nuclear118. Apesar da influência do peso molecular na consequente formação de poliplexos mais estáveis, crêse que mais importante ainda para uma boa transfeção é a descomplexação dos poliplexos com consequente libertação do material genético142, o que, a juntar à citotoxicidade exibida, pode estar relacionado com a diminuição da capacidade de transfeção na razão de carga de 50/1 dos poliplexos formados a partir do polímero PAMA26400. Uma boa capacidade de ligação entre o polímero e o material genético leva a uma boa estabilidade no meio extracelular, ao passo que uma ligação mais fraca entre estes dois componentes conduz a uma mais fácil libertação do material genético a nível intracelular, havendo a necessidade de encontrar um equilíbrio entre estes dois parâmetros para uma entrega adequada de material genético. Geralmente, a presença de soro afeta negativamente a transfeção com nanopartículas poliméricas21, fator esse que se deve à interação entre os polímeros catiónicos e alguns constituintes do soro, como é o caso de algumas proteínas carregadas negativamente. Assim, surge a necessidade de estudar estratégias que permitam contornar os obstáculos impostos pela presença de soro, sendo uma das mais promissoras a conjugação de polímeros catiónicos com o polímero hidrofílico PEG. Copolímeros deste tipo possuem uma maior estabilidade coloidal, potencialmente aumentando o tempo de circulação in vivo, já que é combatida a agregação de nanopartículas112 e consequente excreção da corrente sanguínea por parte do sistema reticuloendotelial. Assim sendo, propôs-se estudar o comportamento de copolímeros com polietilenoglicol possuindo, para o efeito, pesos moleculares e graus de polimerização próximos dos evidenciados pelos homopolímeros PAMA, conforme ilustrado na tabela 2, visto que se pretendeu estudar o efeito da conjugação do polímero hidrofílico PEG 47 com o homopolímero PAMA. Avaliou-se a atividade biológica das diferentes formulações de forma análoga ao descrito anteriormente e os resultados obtidos encontram-se representados na figura 15b. Na presença de soro, os poliplexos formados a partir dos diferentes copolímeros demonstram claras melhorias na expressão do transgene face ao observado na ausência de soro, sendo a exceção o polímero PEG-b-PAMA29900 complexado com material genético na razão de carga (+/-) 10/1. Podemos inferir, então, que a presença do PEG contribui positivamente para o comportamento dos poliplexos na presença de soro, não tomando em consideração os poliplexos preparados a partir do copolímero PEG-b-PAMA8600, já que estes induzem níveis de expressão do transgene reduzidos. A peguilação dos complexos está descrita como sendo um promotor do aumento da estabilidade coloidal, o que se deve em grande parte à inibição de interações não específicas com constituintes do meio de cultura143,144. De uma forma geral, a atividade biológica exibida pelas formulações derivadas do polímero PEG-b-PAMA8600 é reduzida quando comparada com outros poliplexos derivados dos diferentes copolímeros. Sendo o peso molecular do polímero relativamente baixo, perspetiva-se que os resultados obtidos possam ter origem na influência do PEG na densidade de carga do polímero, pois, apesar do potencial zeta ser positivo, a presença do PEG altera a densidade de cargas positivas, o que poderá interferir negativamente com o uptake celular das nanopartículas. Por outro lado, a peguilação de poliplexos pode resultar em perturbações no efeito esponja, o que diminui o escape endossomal dos mesmos, e no aumento da estabilidade coloidal, podendo este fator dificultar a descomplexação entre o polímero e o material genético112 e, consequentemente, a sua libertação no interior da célula. No caso do copolímero PEG-b-PAMA20400, a capacidade de transfeção aumenta com a razão de carga N/P, exibindo os poliplexos preparados na razão de carga (N/P) 50/1 uma atividade biológica superior à demonstrada pelos poliplexos preparados com o homopolímero análogo PAMA17600, realçando o efeito positivo que a peguilação induziu também neste caso, conforme descrito para outros vetores poliméricos conjugados com este composto tanto in vitro145 como in vivo146. Para as nanopartículas formadas a partir do polímero PEG-b-PAMA20400, crêse existir um bom compromisso entre o peso molecular do polímero catiónico e a ação 48 do PEG, ou seja, o aumento do peso molecular e do grau de polimerização das cadeias pode ser suficiente para assegurar a densidade de carga necessária para complexar o material genético, garantindo, simultaneamente, que o PEG promova, possivelmente, um aumento da estabilidade coloidal. Demonstra-se, então, que para o copolímero de peso molecular intermédio, PEG-b-PAMA20400, a ação dos poliplexos é influenciada pela presença de soro e pela quantidade de cargas positivas, já que, com o aumento da razão de carga, se verifica um aumento da quantidade de cadeias poliméricas livres que, analogamente ao caso do homopolímero PAMA17600, se pode traduzir num aumento da interação com as proteínas do soro carregadas negativamente e consequente aumento dos níveis de expressão do transgene. A presença de soro aparenta ser um fator primordial neste caso, já que os poliplexos preparados a partir do polímero PEG-bPAMA20400 nas três razões de carga não possuem atividade biológica digna de registo na ausência de soro, ao contrário do que acontece na presença deste constituinte. Estes resultados sugerem, no entanto, que o PEG não consegue inibir totalmente as interações entre o polímero catiónico e as proteínas do soro, talvez por via do segmento catiónico ter um peso bastante superior ao do polietilenoglicol. Os poliplexos resultantes do copolímero PEG-b-PAMA29900 apresentam um comportamento diferente do observado para as nanopartículas formadas com os polímeros e copolímeros de pesos moleculares intermédios. No caso do copolímero em questão, o máximo da atividade biológica na presença de soro é manifestado na razão de carga (+/-) 25/1, conforme o sucedido para o homopolímero de peso molecular semelhante. Ainda assim, a capacidade de transfeção destas nanopartículas superiorizase à dos poliplexos derivados do homopolímero com peso molecular mais próximo, para além de ser aproximadamente 340 vezes superior à atividade biológica do controlo utilizadopoliplexos preparado com a PEI. Neste caso, é ainda esperado que, nas razões de carga mais elevadas, o aumento do peso molecular promova um excesso de condensação do material genético, o que pode induzir a diminuição da atividade biológica na razão de carga (+/-) 50/1 por via de uma descomplexação menos eficaz entre o polímero e o material genético e, logo, menor libertação do DNA. Outra possível razão para a diminuição da atividade biológica dos poliplexos preparados com este copolímero na razão de carga (+/-) 50/1 é a citotoxicidade exibida, conforme será 49 discutido no capítulo 3.2. Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular COS 7Ensaio de viabilidade celular. Após o screening inicial da atividade biológica protagonizada por polímeros e copolímeros de diferentes pesos moleculares e graus de polimerização, selecionaramse as formulações com uma maior capacidade de transfeção. De forma a prosseguir os estudos comparativos, agruparam-se as formulações em pares consoante o seu peso molecular. Dentro do par, visa-se analisar a influência que o PEG tem no comportamento das nanopartículas. Destacaram-se as formulações derivadas dos polímeros PAMA17600, PEG-b-PAMA20400, PAMA26400 e PEG-b-PAMA29900. Lu ciferase A ctivity (R LU )/p ro tein (m g ) P A M A 1 7600 10/1 P A M A 17600 25/1 PA M A17600 50/1 PAM A 2640 0 10/1 P A MA26400 25/1 P A MA26400 50/1 PE I 25 /1 0 2.010 6 4.010 6 6.010 6 5.010 7 1.010 8 1.510 8 2.010 8Sem S oro C om S oro a) Lu ciferase A ctivity (R LU )/p ro tein (m g ) PEG -b -P AM A 20400 10/1 PEG -b-PA M A20400 25/1 PEG -b-P A M A 20400 50/1 PEG -b-PA M A29900 10/1 PEG -b-PA M A29900 25/1 PEG-b-P A MA29900 50/1 PEI 25/1 0 2.010 6 4.010 6 6.010 6 5.010 7 1.010 8 1.510 8 2.010 8Sem S oro C om S oro b) Figura 16Efeito da razão de carga e da presença do PEG na atividade biológica dos poliplexos preparados a partir do par PAMA17600/ PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/ PEG-b-PAMA29900 na presença e ausência de soro em células COS 7. Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos três rácios N/P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em unidades RLU de luciferase por mg de proteína celular total (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Na figura 16, é possível analisar de forma mais detalhada o comportamento dos pares polímero/copolímero que se destacaram no screening inicial tanto na presença como na ausência de soro. Conforme referido anteriormente, o par PAMA17600/PEG-b-PAMA20400 apresenta uma crescente atividade de transfeção com a razão de carga, superiorizando-se os poliplexos preparados a partir do copolímero na razão de carga (+/-) 50/1, o que, para além dos argumentos já referidos, poderá estar relacionado com o perfil de citotoxicidade das nanopartículas, já que este parâmetro assume valores reduzidos mesmo nas maiores razões de carga, conforme será discutido 50 na subsecção seguinte 3.2 Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular COS 7Ensaio de viabilidade celular. No caso dos poliplexos preparados a partir do par PAMA26400/ PEG-bPAMA29900, o máximo da atividade de transfeção ocorre na razão de carga (+/-) polímero/ material genético de 25/1, o que se pode dever a um excesso de condensação do DNA e a uma elevada citotoxicidade dos poliplexos preparados na razão de carga (+/- ) 50/1, causando uma diminuição dos níveis de expressão do transgene. No entanto, existem outros fatores a ter em conta na análise da capacidade de transfeção destas formulações, como a estabilidade coloidal dos poliplexos, já que estes, apesar de conjugados com o PEG, podem sofrer alterações a nível estrutural por via da interação com as proteínas constituintes do soro, o que poderá prejudicar a internalização e o tráfego intracelular das nanopartículas. Essa análise será feita com maior detalhe na subsecção 3.6.1 Tamanho e potencial zeta dos poliplexos. Na maior parte dos casos, a presença do polietilenoglicol influencia negativamente a atividade biológica das formulações, seja através da redução da interação das nanopartículas com a membrana celular (como se reporta para alguns polímeros112) ou de uma inibição do efeito de esponja de protões128 e da descomplexação dos poliplexos por via da estabilidade das nanopartículas conjugadas com o PEG112. No entanto, para o par de maior peso molecular, observa-se que os poliplexos preparados a partir do copolímero e do homopolímero exibem, na presença de soro, uma atividade biológica superior na razão de carga N/P 25/1, o que permite inferir que, face ao aumento do peso molecular, a maior atividade biológica foi obtida para uma razão de carga (+/-) inferior ao observado com o copolímero PEG-b-PAMA20400. Discutiram-se diversas razões para as diferenças evidenciadas pelas várias formulações no que diz respeito à sua capacidade de transfeção, advindo parte deste lote das características físico químicas dos poliplexos ou de mudanças na sua estrutura, ambos casos indutivos de mudanças comportamentais dos nanossistemas de transporte e entrega de material genético quando testados in vitro e, principalmente, in vivo. Ainda assim, existem diferentes razões a considerar para o aumento da atividade biológica, na presença de soro, com a razão de carga polímero/material genético e com o efeito do peso molecular. Uma dessas possíveis razões é a interação das nanopartículas com as proteínas do soro, como é o caso da albumina, podendo haver uma influência positiva 51 na atividade de transfeção desencadeada pela presença desta proteína que, como se sabe, é carregada negativamente, o que permite a ocorrência de interações eletrostáticas com o polímero catiónico. Ainda assim, o mecanismo ao certo pelo qual a interação com esta proteína aumenta a atividade biológica de nanopartículas ainda não é totalmente evidente147. A composição dos complexos pode desempenhar um papel importante, os complexos conjugados com a albumina podem ligar-se de forma não específica a recetores da membrana celular capazes de mediar a internalização celular147, para além do facto da protonação parcial desta proteína a pH endossomal e do facto da albumina poder interagir com a membrana do endossoma poder resultar na desestabilização do mesmo, libertando o material genético148. Existem estudos que relatam um aumento do tempo de circulação in vivo de complexos com polietilenoglicol graças à ligação com a albumina, seja por via da alteração da conformação das moléculas de PEG para uma estrutura impeditiva de interações entre os complexos e as proteínas do soro, ocupação dos locais de ligação entre os complexos e as proteínas do soro ou por um aumento da hidrofilicidade do PEG promovido pela albumina149. Para além da existência de resultados que demonstram o aumento da capacidade de transfeção de poliplexos aos quais se adicionou albumina, o que se poderá dever ao aumento da internalização dos poliplexos por endocitose mediada por recetores150. 3.2 Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular COS 7 – Ensaio de viabilidade celular A procura de um nanossistema de transporte e entrega de material genético ideal envolve considerar a segurança da aplicação do mesmo. Por via da citotoxicidade apresentada por alguns polímeros23, era de grande importância analisar a viabilidade celular após tratamento com as formulações em estudo. Como tal, realizaram-se ensaios de viabilidade celular cujo procedimento seguiu o descrito na secção 2 Materiais e Métodos. Procedeu-se a um screening inicial, onde se avaliou a viabilidade celular após transfeção na ausência de soro com os mesmos poliplexos para os quais se avaliou a atividade biológica. 52 Viab ilidade C elular (% do con tro lo) P A M A6300 10/1 P A M A6300 25/1 P A M A6300 50/1 PA M A 17600 10/1 PA M A 17600 25/1 PA M A17600 50/1 PA M A 26400 10/1 PA M A 26400 25/1 PA M A26400 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 a) Viabilid ade C elular (% d o controlo) PEG -b-P A M A 8600 10/1 PEG -b-P A M A 8600 25/1 PE G -b-P A M A 8600 50/1 PE G -b-P A M A20400 10/1 PE G -b-P A M A20400 25/1 PE G -b-P A M A20400 50/1 PE G -b-P A M A29900 10/1 PE G -b-P A M A29900 25/1 PEG -b-P A M A29900 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 b) Figura 17Efeito do peso molecular dos polímeros e da razão de carga (N/P) dos poliplexos na viabilidade células COS 7. Os poliplexos foram preparados a partir do homopolímero PAMA (a) e do copolímero PEGβ-PAMA (b). Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos rácios N/ P 53 indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção dos Materiais e Métodos . Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos na forma de percentagem de viabilidade celular relativamente ao controlo (células não tratadas) (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Existem diversos fatores associados à citotoxicidade demonstrada por polímeros catiónicos, destacando-se entre eles o peso molecular, estrutura e a densidade de resíduos catiónicos151. Através da análise dos resultados apresentados na Figura 17, reporta-se uma clara influência da composição dos polímeros e da razão de carga dos poliplexos na sua citotoxicidade na ausência de soro. Ainda assim, o perfil de citotoxicidade é igual tanto para as nanopartículas resultantes dos homopolímeros como dos copolímeros, demonstrando-se um incremento da citotoxicidade com o aumento da razão de carga, sendo este um resultado esperado, já que o aumento da razão de carga leva a uma maior quantidade de resíduos catiónicos a interagir com a membrana celular, conduzindo à sua desestabilização. Os danos induzidos pela carga positiva da superfície dos poliplexos têm também um impacto importante a nível intracelular, já que os complexos carregados positivamente têm a capacidade de permeabilizar a membrana das mitocôndrias, levando à libertação do citocromo c e consequente indução de mecanismos apoptóticos152, 153. Não se observou um efeito pronunciado do peso molecular na citotoxicidade dos poliplexos preparados a partir dos homopolímeros, ainda que as nanopartículas resultantes do polímero PAMA6300 nas razões de carga 25/1 e 50/1 apresentem uma citotoxicidade inferior às preparadas nas mesmas razões de carga com homopolímeros de maior peso molecular. O perfil de citotoxicidade dos poliplexos preparados com o copolímero PEGb-PAMA nos diferentes pesos moleculares é igual ao observado para as nanopartículas preparadas a partir dos homopolímeros, havendo um aumento da citotoxicidade com a razão de carga. Era esperado que a conjugação com o polímero PEG alterasse este parâmetro, por via de uma redução na carga superficial das nanopartículas, o que foi manifestamente visível apenas para as preparações de menor peso molecular, conforme se constata analisando a viabilidade celular após tratamento com os poliplexos preparados a partir do copolímero PEG-b-PAMA8600. Para as restantes formulações, a presença do polietilenoglicol não produziu diferenças significativas, o que reforça a ideia já exposta anteriormente de que, para pesos moleculares elevados, 60 Viabilidade C elular (% do co ntrolo) PEI P A M A26400 PA M A17600 PEG -b -P A M A29900 PEG -b-P A M A20400 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 g/m L 100 g/m L 50 g/m L 10 g/m L 5g/m L Figura 19Efeito da concentração dos diferentes polímeros e copolímeros na viabilidade de células COS 7 na presença de soro. O procedimento experimental segue o descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes Os dados encontram-se expressos na forma de percentagem de viabilidade celular relativamente ao controlo (células não tratadas) (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Através da observação do gráfico ilustrado na Figura 19, concluiu-se que o perfil de citotoxicidade dos polímeros aproxima-se do observado para os poliplexos, assistindo-se a uma progressiva diminuição da viabilidade celular com o aumento da concentração de polímero catiónico, conforme seria de esperar. Até à concentração de 10 µg/mL, todos os polímeros apresentam uma citotoxicidade reduzida (inferior a 20%). A partir desta concentração, o comportamento dos homopolímeros e dos copolímeros difere, já que a citotoxicidade dos primeiros aumenta de forma muito mais acentuada, com a exceção da concentração de polímero de 200 µg/mL, para a qual a morte celular é praticamente total, independentemente do polímero utilizado. Esperar-se-ia que o polímero PAMA26400 possuisse uma citotoxicidade superior ao homopolímero de menor peso, PAMA17600, possivelmente justificada pelo aumento da quantidade de cargas positivas a interagir com os glicosaminoglicanos celulares157, levando a uma 61 consequente desestabilização da membrana e morte celular, não se verificando, no entanto, essa tendência para o espetro de concentrações estudado. O perfil de citotoxicidade dos copolímeros é diferente do apresentado pelos homopolímeros, o que deverá estar relacionado com a presença do PEG e o efeito que este elemento poderá ter nas interações eletrostáticas entre o polímero catiónico e a membrana celular. Excetuando-se a concentração máxima de copolímero de 200 µg/ mL, a citotoxicidade dos copolímeros PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 tem um máximo para o copolímero de maior peso molecular, rondando os 90 % para a concentração de 100 µg/ mL. Ainda assim, a presença do polietilenoglicol não mascara por completo o efeito do peso molecular, já que o copolímero PEG-b-PAMA20400 apresenta uma citotoxicidade inferior à do seu homólogo de maior peso molecular. É importante referir que a realização de ensaios de viabilidade celular a seguir a tratamento apenas com polímeros são importantes, de forma a criar o pior cenário possível, já que, de forma geral, a citotoxicidade das formulações diminui aquando da formação de complexos com material genético158. Os resultados obtidos confirmam esta tendência, já que a concentração de polímero no poço corresponde a aproximadamente 40 µg/mL e 80 µg/mL para os poliplexos formados nas razões de carga de 25/1 e 50/1, respetivamente. Verifica-se, por exemplo, que a citotoxicidade diminui aquando da formação de poliplexos com o homopolímero PAMA26400, já que a complexação deste com material genético na razão de carga 50/1 leva a uma concentração de polímero no poço de 80 µg/mL, causando, no entanto, uma morte celular semelhante à obtida após tratamento com o polímero (não complexado) a uma concentração de 50 µg/ mL. Os mecanismos exatos através dos quais os polímeros induzem morte celular não são ainda certos, havendo, no entanto, alguns possíveis indícios. Conforme já foi referido, a biocompatibilidade pode ser afetada por vários fatores, como o peso molecular, a densidade de cargas, estrutura e flexibilidade conformacional151,154, sendo o peso molecular o fator de maior influência dentro de polímeros de igual estrutura, como se verifica neste projeto. O tipo de aminas existentes também pode desempenhar um papel importante na citotoxicidade dos polímeros, estando este parâmetro intimamente ligado ao arranjo tridimensional dos segmentos catiónicos. Apesar de haver a indução de vários mecanismos pro apoptóticos por parte dos poliplexos, existem 62 estudos indicativos de uma morte necrótica induzida tanto por polímeros catiónicos como por polímeros complexados com material genético159. 3.4 Capacidade de transfeção das nanopartículas em HepG 2 – Ensaio de Luminescência Após seleção das formulações mais promissoras com base na conjugação dos resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular e de atividade biológica, complementaram-se os estudos feitos até então com uma análise do comportamento das nanopartículas noutra linha celular. Procederam-se a estudos na linha celular HepG 2 que, como se sabe, está altamente envolvida nos estudos de terapia génica para combate a condições tumorais hepáticas, como o hepatocarcinoma celular (HCC), a segunda maior causa de morte por cancro no mundo160. Avaliou-se, então, a capacidade de transfeção e a citotoxicidade das nanopartículas seguindo os mesmos protocolos feitos para a linha celular COS 7, diferindo apenas no facto de não ter sido feito um screening inicial, aproveitando-se, ao invés, a informação proveniente dos resultados obtidos anteriormente. Desta forma, testaram-se os poliplexos formados a partir dos polímeros e copolímeros de maior peso molecular, agrupando-se os mesmos em pares polímero/copolímero, já que estas foram as formulações com resultados mais promissores na linha celular COS-7. 63 A tividade B io lógica ((R LU )/proteína (m g)) P A M A 17600 10/1 P A M A 17600 25/1 P A M A 17600 50/1 P A M A 26400 10/1 P A M A 26400 25/1 PA M A 26400 50/1 PEI 25/1 0 1.010 5 2.010 5 3.010 5 4.010 5 a) A tividade B iológica ((R LU )/p ro teína (m g)) PE G -b-P A M A 20400 10/1 PE G -b-P A M A 20400 25/1 PEG -b-P A M A20400 50/1 PE G -b-P A M A 29900 10/1 PEG -b-P A M A29900 25/1 PE G -b-P A M A 29900 50/1 PEI 25/1 0 2.010 5 4.010 5 6.010 5 2.010 6 4.010 6 6.010 6 8.010 6 b) Figura 20Efeito da razão de carga e da presença do polímero PEG na atividade biológica dos poliplexos preparados a partir dos homopolímeros PAMA (a) e dos copolímeros PEG-β-PAMA (b) na linha celular HepG 2 na presença de soro. Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos rácios N/P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção dos Materiais e Métodos. Os resultados são 64 representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em RLU de luciferase por mg de proteína celular total (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Pela observação da Figura 20, conclui-se que, de uma forma geral, as nanopartículas em estudo não transfetam a linha celular HepG2 de igual forma à linha celular COS 7, apresentando níveis de atividade biológica inferiores. No caso dos poliplexos formados a partir do homopolímero, reporta-se uma diminuta influência do peso molecular na capacidade de transfeção, não havendo diferenças entre os níveis de atividade biológica das nanopartículas formadas pelos polímeros PAMA17600 e PAMA26400. No caso destas nanopartículas, sublinha-se ainda uma fraca influência da razão de carga nos níveis de expressão do transgene, não sendo, por isso, considerável. As nanopartículas formadas a partir dos copolímeros exibem também uma baixa capacidade de transfeção, considerando apenas as razões de carga (+/-) polímero/material genético mais baixas (10/1 e 25/1), ainda assim, os níveis de expressão do transgene aumentam significativamente para os poliplexos formados na razão de carga de 50/1, verificando-se esta característica para as nanopartículas formadas a partir tanto do copolímero PEG-b-PAMA20400 como do copolímero PEG-bPAMA29900. Este aumento da expressão do transgene com a razão de carga e, consequentemente, com a quantidade de polímero presente, seria expectável, já que, conforme referido nos ensaios realizados na linha celular COS 7, o aumento da razão de carga promove um aumento da densidade de cargas positivas, o que se pode verificar como um fator indutivo da internalização dos poliplexos. A acentuada presença de cadeias poliméricas livres, como acontece com o aumento da razão de carga (+/-) polímero/material genético, tem efeitos a nível intracelular, conforme já foi referido, já que estas desempenham um papel importante no efeito de esponja de protões responsável pelo escape endossomal do material genético. Para além do efeito induzido pela maior quantidade de polímero catiónico, destaca-se a presença do polímero PEG nas formulações com maior capacidade de transfeção, o que leva à conclusão de que a conjugação com este polímero hidrofílico leva a um aumento da expressão do transgene, o que pode acontecer por via da proteção que este confere face a interações não específicas com proteínas do meio de cultura e à estabilização estérea conferida pelo mesmo161,162. 65 Fazendo uma análise comparativa entre a atividade biológica das formulações em estudo nas linhas celulares COS 7 e HepG 2, observa-se que, no caso dos poliplexos formados a partir do polímero PEG-b-PAMA20400, o máximo da expressão do transgene mantém-se na razão de carga (+/-) polímero/material genético 50/1, ao passo que, no caso das nanopartículas originadas a partir do polímero PEG-b-PAMA29900, assiste-se a um shift do máximo da expressão do gene repórter para a razão de carga (+/-) 50/1. Comparando o comportamento das nanoformulações em cada uma das linhas celulares, chega-se à conclusão que esta movimentação do pico de atividade biológica poder-se-á relacionar com a citotoxicidade dos poliplexos, mostrando esta ser bastante baixa mesmo para as razões de carga mais altas, conforme poderá ser verificado na subsecção seguinte. De forma a melhor avaliar o comportamento dos nanossistemas nesta linha celular, comparam-se os níveis de expressão do transgene levados a cabo pelos poliplexos em estudo com a atividade biológica das nanopartículas controlo, tendo estas a sua origem no polímero PEI, considerado o gold standard dos nanossistemas de transporte e entrega de material genético. Os poliplexos formados a partir dos polímeros PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900, apresentam uma capacidade de transfeção que se destaca claramente dos níveis atingidos pelos poliplexos formados a partir do polímero gold standard, havendo uma diferença de 16 vezes no primeiro dos casos e de 40 vezes no último. 3.5 Citotoxicidade dos poliplexos na linha celular HepG 2 – Ensaio de viabilidade celular De forma a selecionar um nanossistema de transporte e entrega de material genético adequado, não se deve apenas dar ênfase à atividade biológica das nanopartículas, mas sim identificar um compromisso entre a eficiência e a sua citotoxicidade, aliando estas às características físico-químicas das nanoformulações, que decidirão o tipo de aplicação mais adequado. Por conseguinte, procedeu-se a uma 66 avaliação da viabilidade celular da linha HepG 2 na presença de soro após tratamento com os poliplexos selecionados, conforme foi feito nos ensaios de luminescência levados a cabo nesta mesma linha celular. 67 Viabilidad e C elular (% d o controlo) PA M A 17600 10/1 PA M A 17600 25/1 PA M A 17600 50/1 PA M A 26400 10/1 PA M A 26400 25/1 PA M A 26400 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 a) Viabilid ad e C elular (% do con trolo ) PE G -b -P A M A 20400 10/1 PE G -b -P A M A20400 25/1 PE G -b -P A M A 20400 50/1 PE G -b -P A M A 29900 10/1 PEG -b -P A M A29900 25/1 PEG -b -P A M A29900 50/1 PEI 25/1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 b) Figura 21Efeito da presença de soro na viabilidade celular após o tratamento com diversos poliplexos preparados a partir dos homopolímeros PAMA (a) e dos copolímeros PEG-β-PAMA (b) na linha celular HepG 2. Os diferentes polímeros e copolímeros foram complexados com 1 µg de pCMV.Luc nos rácios N/P indicados. O 68 procedimento experimental segue o descrito na secção dos Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos na forma de percentagem de viabilidade celular relativamente ao controlo (células não tratadas) (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Como se sabe, a citotoxicidade dos poliplexos depende de vários fatores, como por exemplo o peso molecular, a densidade de carga positiva e a estrutura dos polímeros151,154, verificando-se uma maior influência do peso molecular entre polímeros estruturalmente iguais. Tendo em conta os fatores que pesam para as características citotóxicas dos poliplexos, seria de esperar que o aumento do peso molecular ou da razão de carga produzissem efeitos visíveis na viabilidade celular após tratamento com as nanopartículas, já que haveria um aumento das interações eletrostáticas entre o polímero e a membrana celular, fator que se pensa ser indutivo da citotoxicidade dos poliplexos151. No entanto, e de uma forma geral, as formulações derivadas dos homopolímeros apresentam uma citotoxicidade reduzida, inferior a 20 %, conforme se pode observar na Figura 21. Ainda assim, os poliplexos preparados a partir do polímero PAMA26400 na razão de carga (+/-) 50/1 causam uma morte celular de, aproximadamente, 30 %, sendo este o valor mais alto para as formulações preparadas a partir dos homopolímeros. Estes valores poderão advir da influência do maior peso molecular e de uma elevada razão de carga, o que motiva um aumento das interações eletrostáticas entre os polímeros catiónicos e a membrana celular face às restantes nanopartículas derivadas dos homopolímeros. No que concerna os poliplexos formados a partir dos copolímeros, observase uma citotoxicidade não superior a 20 % para praticamente todas as nanoformulações, não havendo uma grande variação nos valores dos poliplexos formados a partir do copolímero PEG-b-PAMA20400. No caso das nanoformulações originadas a partir do copolímero de maior peso molecular, assiste-se a um ligeiro efeito da razão de carga na viabilidade celular, já que se registou um menor valor de citotoxicidade para os poliplexos formados na razão de carga (+/-) de 10/1. Apesar da presença do polietilenoglicol, crê-se que o tamanho do segmento catiónico e a sua quantidade influenciem a viabilidade celular através do nível de desestabilização da membrana celular induzido. No entanto, e ainda que de uma forma bastante ligeira, as formulações derivadas dos copolímeros induzem uma citotoxicidade inferior à dos poliplexos 69 formados a partir dos homopolímeros, conforme seria de esperar pela presença do PEG, já que se espera que este componente mascare parcialmente as cargas positivas das cadeias poliméricas, para além de minimizar interações não específicas com proteínas do soro69. 3.6 Caracterização Físico-Química dos poliplexos Os polímeros catiónicos constituem um dos tipos de vetores não virais mais utilizados na entrega de genes. Uma das principais características destes nanossistemas é a sua versatilidade, já que podem ser adaptados face às aplicações pretendidas. Por vezes, as alterações levadas a cabo nestas estruturas visam a manipulação de determinadas propriedades físico-químicas, de forma a modificar o comportamento destes nanossistemas in vitro e in vivo. Foram avaliadas algumas características físicoquímicas das nanopartículas em estudo ao longo deste projeto, como por exemplo o tamanho dos poliplexos, a sua capacidade de proteção do material genético e a carga superficial, afirmando-se estes como fatores fulcrais para a eficácia dos poliplexos quer in vitro quer in vivo56. 3.6.1 Tamanho e potencial zeta dos poliplexos O tamanho das nanopartículas analisou-se segundo a técnica de Dynamic Light Scattering, conforme elucidado na subsecção Dynamic Light Scattering e Potencial Zeta correspondente ao capítulo Materiais e Métodos, seguindo-se o protocolo conforme descrito. O diâmetro hidrodinâmico dos poliplexos é uma característica com bastante influência na definição dos mecanismos de uptake celular163. Além disso, o tamanho das nanopartículas é um fator altamente influenciador do comportamento que os nanossistemas apresentarão in vivo, definindo se os poliplexos sairão da circulação ou serão excretados pelo sistema renal164, bem como o perfil de acumulação das nanopartículas em órgãos como o fígado, baço e medula165. 76 em gel de agarose, seguindo os dois o procedimento descrito na secção dos 2 Materiais e Métodos. A cesso d a sonda (% do con trolo) P A M A17600 P A M A 26400 PEG -b-P A M A20400 PEG -b-P A M A29900 PE I 0 10 20 30 10/1 25/1 50/1 Figura 25-Acesso do brometo de etídio ao material genético das nanopartículas preparadas a partir dos homopolímeros PAMA e dos copolímeros PEG-β-PAMA em diferentes razões de carga polímero/material genético. Os diferentes polímeros foram complexados com 1µg de pCMV.Luc nos três rácios N/P indicados. O procedimento experimental segue o descrito na secção Materiais e Métodos. Os resultados são representativos de pelo menos 3 ensaios independentes. Os dados encontram-se expressos em percentagem relativamente a um controlo positivo (correspondente ao acesso da sonda a material genético não protegido) (média ± desvio padrão, obtida de triplicados). Na Figura 25 encontram-se ilustrados os resultados obtidos no ensaio de intercalação do brometo de etídio. Avaliou-se a capacidade de condensação de DNA dos poliplexos formados a partir dos homopolímeros e copolímeros em três razões de carga, sendo os resultados comparados com os obtidos para os poliplexos controlo, derivados do polímero PEI. A capacidade de proteção de um polímero está intimamente relacionada com a sua estrutura devido, por exemplo, à influência que os resíduos catiónicos têm na formação dos poliplexos113. 77 De uma forma geral, não se registam diferenças de grande relevo na proteção conferida pelos polímeros ao material genético, estando o acesso da sonda confinado, aproximadamente, entre os 10 e os 20 %, sendo estes valores adequados, já que se pretende um compromisso entre uma proteção competente e uma libertação eficaz do material genético. Destaca-se uma natural influência da razão de carga nos resultados obtidos, já que com o seu incremento, aumenta-se o número dos resíduos catiónicos presentes, levando, na maior parte das formulações, a uma melhor proteção do material genético, conforme se pode averiguar pela observação da Figura 25. Nos ensaios anteriores de atividade biológica e citotoxicidade, destacaramse os pares polímero/copolímero PAMA17600/PEG-b-PAMA20400 e PAMA26400/PEG-bPAMA29900 nas razões de carga (+/-) 50/1 e 25/1, respetivamente, estando os valores de proteção conferida por estes polímeros numa gama muito próxima, situando-se acima dos 80 %. Comparando com os resultados obtidos para os poliplexos preparados a partir do polímero gold standard, não se registam grandes diferenças, principalmente olhando para a razão de carga (+/-) 25/1 – estabelecida como a razão de carga com maior eficácia de transfeção. Através desta proximidade de valores entre os nanossistemas que se destacaram, é possível inferir que as diferenças nos seus comportamentos in vitro não poderão ser explicadas recorrendo maioritariamente a argumentos de proteção do material genético. É importante salientar ainda que a presença do polietilenoglicol não revelou uma influência crucial nos resultados obtidos, não havendo, na maior parte dos casos, diferenças significativas entre a condensação de DNA conferida pelos poliplexos derivados dos homopolímeros e dos copolímeros. Como complemento ao ensaio de intercalação do brometo de etídio, avaliou-se a condensação dos polímeros recorrendo a um ensaio de eletroforese em gel de agarose, encontrando-se os resultados obtidos ilustrados na Figura 26. 78 Figura 26-Resultados de ensaio de gel em agarose para as formulações selecionadas. O homopolímero PAMA26400 e o copolímero PEG-b-PAMA29900 foram ambos complexados com 1 µg de pCMV.Luc nas três razões de carga indicadas. Utilizou-se DNA livre e poliplexos preparados a partir do polímero PEI como controlo para este ensaio. O procedimento seguiu de acordo com o descrito na secção Materiais e Métodos. A técnica da eletroforese em gel de agarose baseia-se na ação de um campo elétrico e consequente migração do material genético carregado negativamente para o pólo positivo. Consequentemente, se houver uma condensação eficaz do DNA por parte do polímero, haverá uma menor migração do material genético. Escolheu-se o par homopolímero/copolímero PAMA26400 e PEG-b-PAMA29900, correspondente à formulação mais promissora, para realizar este ensaio, e recorreu-se aos poliplexos controlo formados a partir do polímero gold standard para comparação. Corroborando os resultados obtidos no ensaio de intercalação do brometo de etídio, o ensaio em gel de agarose mostrou uma complexação eficaz do material genético com o polímero, já que não se observa migração das bandas. Comparando a intensidade das bandas do DNA livre (controlo), conclui-se que esta é superior à das bandas referentes aos poliplexos, sendo este mais um indicador de uma boa condensação e consequente proteção do material genético por parte dos polímeros em estudo. 79 80 4 Conclusão e Perspetivas Futuras 4.1 Conclusão As diferentes técnicas de terapia génica têm como objetivo o tratamento/cura de um grande leque de condições patológicas de origem genética, hereditárias e/ou adquiridas. O objetivo desta técnica é a expressão estável e segura de um gene de interesse num determinado tecido. É, então, de importância primordial, desenvolver sistemas capazes de transportar e entregar o material genético de uma forma eficaz e segura às células alvo. Com o desenvolvimento das técnicas de síntese química e biotecnologia, iniciou-se a utilização de polímeros como vetores de transporte e entrega de material genético. Estes sistemas possuem algumas características vantajosas, como por exemplo a versatilidade, já que permitem a manipulação da sua estrutura físico-química consoante a aplicação desejada; a grande capacidade de condensação/transporte de material genético; e a biocompatibilidade. Juntando estas características a uma fácil produção, estes vetores assumem um potencial enorme no contexto de transporte e entrega de material genético, não obstante o facto de ainda apresentarem algumas limitações. Com o trabalho desenvolvido neste projeto, pretendeu-se avaliar a influência das propriedades físico-químicas de uma família de polímeros, bem como de modificações na sua estrutura, através da conjugação com o polímero hidrofílico polietilenoglicol, na sua capacidade de transfeção. Com este propósito, os diferentes ensaios foram executados na ausência e presença de soro, sendo este um constituinte capaz de mimetizar parcialmente as condições que os nanossistemas encontram quando administrados in vivo. Os resultados obtidos demonstraram que, tanto na ausência como na presença de soro, a atividade biológica dos polímeros PAMA e copolímeros PEG-b-PAMA depende do seu peso molecular e da razão de carga na qual são formados os poliplexos. Na ausência de soro, destacou-se a expressão do transgene levada a cabo com os poliplexos preparados a partir dos homopolímeros PAMA17600 e PAMA26400 nas 81 razões de carga de (+/-) 10/1, para o primeiro, e (+/-) 10/1 e (+/-) 25/1, para o último, superiorizando-se estes valores aos obtidos com os poliplexos controlo. Para as mesmas condições, e de forma geral, os poliplexos preparados a partir dos copolímeros mostraram uma capacidade de transfeção inferior aos anteriores, destacando-se apenas o polímero PEG-b-PAMA29900 complexado com material genético na razão de carga (+/-) 10/1. Os ensaios realizados na presença de soro mostraram uma alteração no perfil da capacidade de transfeção dos diferentes poliplexos, aumentando, de forma geral, este parâmetro com a razão de carga dos poliplexos, ao contrário do sucedido na ausência de soro. Na presença de soro, verificaram-se maiores níveis de expressão do transgene para poliplexos formados a partir de polímeros e copolímeros de maior peso molecular. No caso dos poliplexos formados a partir dos homopolímeros, a presença de soro levou à obtenção de níveis superiores de transfeção para algumas formulações, tendo-se destacado os polímeros PAMA17600 e PAMA26400 complexados com material genético nas razões de carga (+/-) 50/1, no primeiro caso, e (+/-) 25/1 e (+/-) 50/1, no último, exibindo estas nanopartículas uma atividade biológica muito superior à dos poliplexos controlo, formados a partir do polímero gold standard. No caso das nanopartículas formadas a partir dos copolímeros, a presença de soro também promoveu melhorias significativas na sua atividade biológica, aumentando a expressão do transgene para todos os poliplexos com capacidade de transfeção na ausência de soro, excetuando-se as nanopartículas preparadas a partir do copolímero PEG-b-PAMA29900 na razão de carga de 10/1, para as quais a atividade biológica na ausência de soro é superior. Destacaram-se as nanopartículas formadas a partir dos copolímeros PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 nas razões de carga de 50/1 e 25/1, respetivamente, tendo estas apresentado níveis de expressão do transgene 204 e 349 vezes superiores, respetivamente, ao dos poliplexos formados a partir da PEI. A análise da citotoxicidade dos poliplexos foi também levada a cabo tanto na ausência como na presença de soro, de forma a complementar os resultados obtidos para a atividade biológica das nanopartículas. Na ausência de soro, verificou-se uma grande influência da razão de carga na citotoxicidade dos poliplexos formados a partir dos diferentes homopolímeros e copolímeros. No caso dos homopolímeros, observouse alguma influência do peso molecular, notando-se apenas claras diferenças entre os 82 poliplexos preparados nas razões de carga mais altas com o polímero PAMA6300 e os restantes polímeros, registando-se um aumento da citotoxicidade para os polímeros de maior peso molecular. Entre os homopolímeros PAMA17600 e PAMA26400 não há diferenças significativas, mantendo-se o aumento da citotoxicidade com a razão de carga para os dois casos. A presença de soro induziu uma diminuição substancial da citotoxicidade dos poliplexos preparados a partir dos homopolímeros. No entanto, de uma maneira geral, registou-se um aumento da citotoxicidade com o peso molecular dos polímeros, sendo a única exceção os poliplexos preparados a partir do homopolímero PAMA26400 na razão de carga (+/-) de 10/1. A citotoxicidade dos poliplexos preparados a partir dos copolímeros, para além de influenciada pela razão de carga dos nanossistemas, mostrou também aumentar com o peso molecular dos copolímeros utilizados na transfeção na ausência de soro. Analogamente aos homopolímeros, a presença de soro resultou num aumento significativo da viabilidade celular após tratamento com os diferentes poliplexos formados a partir dos copolímeros. Além disso, a presença do PEG mascarou o efeito da razão de carga dos nanossistemas preparados a partir dos copolímeros PEG-b-PAMA8600 e PEG-b-PAMA20400, prevalecendo apenas o efeito do peso molecular na citotoxicidade dos poliplexos. No caso das nanoformulações copoliméricas de maior peso molecular, o PEG não mascarou o efeito da razão de carga, registando-se um aumento da citotoxicidade das nanopartículas com a mesma. À exceção dos poliplexos preparados a partir do copolímero PEG-b-PAMA29900 na razão de carga 50/1, todos as restantes formulações apresentaram uma citotoxicidade semelhante ou inferior à dos nanossistemas controlo preparados a partir do polímero PEI. A análise da citotoxicidade dos polímeros sem a formação de complexos com material genético trouxe resultados concordantes com a análise da citotoxicidade dos poliplexos, já que um aumento da concentração de polímero resultou num aumento da citotoxicidade, verificando-se esta condição para todos os casos. Ainda assim, existe alguma disparidade entre os valores obtidos para os homopolímeros e os copolímeros, mostrando-se os copolímeros muito menos citotóxicos. Considerando os homopolímeros, um aumento do peso molecular potencia a citotoxicidade dos mesmos, conduzindo o polímero PAMA26400 a níveis de aproximadamente 100 % de morte celular no máximo de concentração estudado. No caso dos copolímeros, a presença do PEG 83 resulta numa diminuição da citotoxicidade dos mesmos, excetuando-se a concentração de 200 µg/ mL, para a qual a morte celular é total, havendo, no entanto, um aumento da citotoxicidade com a concentração de polímero e com o peso molecular do mesmo, conforme esperado. As formulações selecionadas após o screening inicial foram depois estudadas numa linha celular humana, recorrendo-se, para o efeito, à linha celular HepG 2. O estudo da atividade biológica nesta linha celular foi feito na presença de soro, revelando que algumas das formulações em estudo são capazes de induzir níveis bastante altos de expressão do transgene. Registou-se, em primeiro lugar, uma grande diferença entre os resultados obtidos para os poliplexos formados a partir dos homopolímeros e dos copolímeros, registando-se uma reduzida capacidade de transfeção para os primeiros. Verificou-se, ainda assim, uma ligeira influência da razão de carga na atividade biológica dos poliplexos preparados com os homopolímeros. As nanopartículas formadas a partir dos copolímeros induziram níveis de expressão do transgene bastante elevados nas células HepG 2, ainda que ligeiramente inferiores aos obtidos na linha celular COS 7. Constatou-se um aumento da capacidade de transfeção com o aumento do peso molecular, sendo estes dados particularmente visíveis nas razões de carga 25/1 e 50/1, para as quais a capacidade de transfeção dos complexos formados a partir do copolímero PEG-b-PAMA29900 é bastante superior à dos complexos formados a partir do copolímero PEG-b-PAMA20400. Os poliplexos referidos destacaram-se claramente em relação à formulação controlo, levando a níveis de expressão do transgene 40 vezes superiores, no caso dos poliplexos preparados com o polímero PEG-b-PAMA29900 na razão de carga (+/-) 50/1. A citotoxicidade dos poliplexos nesta linha celular não mostrou dependência do peso molecular dos polímeros ou da razão de carga dos poliplexos tanto para os homopolímeros como para os copolímeros. Globalmente, os níveis de citotoxicidade obtidos foram bastante reduzidos, principalmente tendo em conta as formulações que levaram aos maiores níveis de expressão do transgene, registando-se, para estas, uma citotoxicidade inferior a 20 %. O facto das nanopartículas apresentarem uma citotoxicidade bastante reduzida nesta linha celular pode justificar parcialmente o shift que se verificou no máximo de transfeção do copolímero PEG-b-PAMA29900 para a razão de carga (+/-) 50/1. 84 A caracterização físico-química das nanopartículas não mostrou grandes diferenças entre as várias formulações. A nível de tamanho, os nanossistemas apresentaram resultados muito próximos, situando-se entre os 97 e os 166 nm, sendo estes valores adequados para aplicações in vivo. O potencial zeta assumiu os valores positivos esperados, encontrando-se estes entre os 30 e os 40 mV para as nanopartículas com melhores resultados de atividade biológica. Aquando da avaliação da variação do tamanho das nanopartículas com o tempo, na presença de soro, observou-se que os poliplexos formados a partir do polímero PAMA17600 sofrem as maiores alterações para esta grandeza, o que pode justificar o facto de não levarem a níveis de expressão do transgene tão bons como as restantes nanopartículas em destaque. Os ensaios de exclusão de brometo de etídio indicaram que os polímeros têm uma capacidade de proteção do material genético bastante boa, estando o acesso da sonda compreendido entre os 8 e os 18 % para as formulações com elevada capacidade de transfeção e citotoxicidade reduzida, correspondendo o valor mais baixo ao polímero PEG-b-PAMA29900, não existindo grandes diferenças entre a presença e a ausência de PEG. Com o objetivo de complementar os resultados obtidos nos ensaios de exclusão do brometo de etídio, os ensaios de gel em agarose revelaram uma condensação eficiente do material genético por parte das nanoformulações em destaque, não se evidenciando diferenças de relevo através da conjugação com polietilenoglicol. Os resultados obtidos ao longo deste projeto permitiram identificar alguns fatores que influenciam a capacidade de transporte e entrega de material genético dos poliplexos, bem como o seu comportamento a nível de citotoxicidade. O peso molecular dos polímeros mostrou ser relevante, destacando-se, também, a razão de carga de complexação dos mesmos com o material genético. A modificação estrutural do polímero, através da conjugação com o polietilenoglicol, trouxe melhorias a nível da capacidade de transfeção e de viabilidade celular após tratamento com as nanopartículas, na presença de soro, podendo estas melhorias estar relacionadas com fatores estruturais/conformacionais das nanopartículas, visto que a sua caracterização físico-química não mostrou grandes diferenças a nível de carga superficial, tamanho e 85 capacidade de proteção do material genético. Em concordância com alguma literatura, existe também a possibilidade de melhorias na capacidade de transfeção de algumas nanopartículas através da interação com constituintes do soro, seja através de mudanças conformacionais, redução da carga superficial, ou até interação com recetores celulares específicos. As nanopartículas conjugadas com PEG apresentaram claras melhorias nos níveis de capacidade de transfeção na presença de soro. Por fim, e apesar da necessidade de aprofundar estes estudos, as nanopartículas aqui avaliadas mostram claras capacidades para superar os diferentes obstáculos aquando do transporte e entrega de material genético in vitro, mostrando, inclusive, níveis bastante bons de biocompatibilidade, demostrando o seu potencial para aplicação in vivo. 4.2 Perspetivas Futuras Através do trabalho desenvolvido ao longo deste projeto, destacaram-se as nanopartículas preparadas com os copolímeros PEG-b-PAMA20400 e PEG-b-PAMA29900 nas razões de carga (+/-) de 50/1 e 25/1, respetivamente. Assim sendo, as propostas de trabalho futuro compreendem apenas a utilização destes nanossistemas: • Estudo dos mecanismos de endocitose, podendo estes esclarecer o comportamento das nanopartículas e identificar possíveis barreiras à sua utilização como vetores de transporte e entrega de material genético; • Conjugação com o PEG de forma não covalente (por adsorção, por exemplo), para permitir verificar se existirão diferenças a nível físico-químico e consequentes melhorias na capacidade de transfeção e níveis de citotoxicidade dos poliplexos, ultrapassando o fator peso do polímero catiónico; • Análise aprofundada da influência dos componentes do soro in vitro, permitindo inferir em que medida estes influenciam a transfeção, através de, por exemplo, realização de transfeções com diferentes teores de albumina; • Garantir a especificidade das nanopartículas através da conjugação com ligandos à superfície dos poliplexos; 92 61. Dincer S, Türk M, Pişkin E. 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