Economía circular del suero de leche: bioproceso para su conversión en bioestimulantes y biofertilizantes agronómicos

Economía circular del suero de leche: bioproceso para su conversión en bioestimulantes y biofertilizantes agronómicos Alejando Caballero 1, José María Orts Gómez 2, Jesús López Rodríguez 3, Luis Martín Presas 4 y Juan Parrado 5 Autor de Correspondencia: [email protected] Resumen: El suero de leche, debido a su alta carga orgánica y su elevada producción, representa un desafío significativo en términos de gestión ambiental. Sin embargo, también constituye una oportunidad para su valorización gracias a su excelente composición química. Este trabajo propone un bioproceso basado en la economía circular, que permite la valorización completa del suero, mediante su conversión en productos de alto valor añadido para el sector agrícola, específicamente un Bioestimulante/Biofertilizante (BB). El bioproceso es de naturaleza fermentativa/enzimática y utiliza bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPb), en particular bacterias lácticas (BAL), como herramienta biológica. El nuevo BB, presenta una composición química radicalmente diferente al suero de leche. Su principal componente son ácidos orgánicos (ácido láctico), seguido de hidrolizados de proteínas (ambos presentan propiedades bioestimulantes) y por último a nivel biológico, la biomasa bacteriana (BAL) con propiedades PGPb, con actividad biofertilizante. En resumen, esta propuesta de valorización del suero de leche mediante un enfoque biotecnológico promueve una agricultura más sostenible y eficiente, a la vez que fomenta la economía circular al transformar un residuo ambientalmente problemático en un recurso valioso. Palabras clave: Suero, bacterias lácticas, Biofertilizante, Bioestimulante Circular economy of whey: bioprocess for its conversion into agronomic biostimulants and biofertilizers Alejando Caballero 1, José María Orts Gómez 2, Jesús López Rodríguez 3, Luis Martín Presas 4 y Juan Parrado 5 Abstract: Whey, due to its high organic load and significant production levels, represents a major challenge in terms of environmental management. However, it also presents an opportunity for valorization because of its excellent chemical composition. 1 Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (España), CÓDIGO ORCID 00000002-7420-2153. [email protected] 2 Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (España), CÓDIGO ORCID. 00000003-0186-2107 España), [email protected]; 3 Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (España), [email protected]; 4 Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (España), [email protected] 5 Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (España), parr[email protected] CÓDIGO ORCID. 0000-0002-1462-408X 53 C3-BIOECONOMY, Revista de Investigación y Transferencia en Bioeconomía Circular y Sostenible Nº5 (2024) This work proposes a bioprocess based on circular economy, enabling the complete valorization of whey by converting it into high-value-added products for the agricultural sector, specifically a Biostimulant/Biofertilizer (BB). The bioprocess is fermentative/enzymatic in nature and employs plant growth-promoting bacteria (PGPb), particularly lactic acid bacteria (LAB), as a biological tool. The new BB has a chemical composition radically different from whey. Its main components are organic acids (lactic acid), followed by protein hydrolysates, both of which exhibit biostimulant properties. Additionally, at the biological level, the bacterial biomass (LAB) contributes PGPB properties, acting as a biofertilizer. In summary, this proposal for the valorization of whey through a biotechnological approach promotes more sustainable and efficient agriculture while fostering a circular economy by transforming an environmentally problematic waste into a valuable resource. Key Words: Whey, lactic bacteria, biofetilizer, bioestimulant 1. INTRODUCCIÓN El suero de quesería o lactosuero que se origina tras la coagulación de la leche en la fabricación del queso representa cerca del 85-90 % del volumen de la leche utilizada para fabricar queso y contiene aproximadamente el 55% de sus nutrientes. Está compuesto principalmente por agua (93-95%), materia orgánica (alrededor del 50% de los nutrientes de la leche original, mayoritariamente, proteínas y lactosa) y sales minerales. La producción anual de suero a nivel mundial es de aproximadamente 180 millones de toneladas (Ghasemi et al. 2017). Debido a su alto contenido orgánico (González Siso, 1996) eliminarlo como residuo plantea un gran problema ambiental, ya que su correcto tratamiento antes de su vertido al medio, es un requisito legal (Kalyuzhnyi et al., 1997). En España, el vertido directo del lactosuero no está permitido (Real Decreto Legislativo 1/2001, de 20 de julio, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley de Aguas) y se exige a las queserías productoras la gestión de este subproducto, bien tratándolo o reutilizándolo en sus propias instalaciones o entregando el suero a empresas gestoras para su empleo o transformación en el marco de la Ley 10/1998 de Residuos. La gestión de los lactosueros es uno de los mayores desafíos a los que se tienen que enfrentar las queserías debido al gran volumen que se genera (hasta 9 54 Caballero, A., Orts Gómez, J.M., Lopez Rodríguez, J., Martín Presas, L. y Parrado, J. veces el volumen del queso elaborado) y con altísimos niveles de DQO (entre 40,000 y 60,000 mg/l) lo que requiere de tratamientos para eliminar posibles efectos contaminantes, estos son difícilmente asumibles por las pequeñas y medianas queserías debido a su complejidad y a los altos gastos de operación. Actualmente, los sistemas más utilizados son, su eliminación por digestión anaerobia, digestión aerobia, y lagunaje, donde los dos primeros sistemas de tratamiento quedan exclusivamente reservados para las queserías de mayor tamaño, quedando para las de tamaño más pequeño como sistema más utilizado, el lagunaje. La principal alternativa a los tratamientos indicados, en las pequeñas queserías, son el uso directo en alimentación animal local y la recogida por parte de un gestor de residuos. En resumen, las empresas queseras de mayor capacidad cuentan con instrumentos tecnológicos para la gestión de estos subproductos, pero las queserías más pequeñas deben buscar soluciones que se adapten a sus capacidades. 1.1. Suero y fertilización El suero contiene nutrientes beneficiosos para los cultivos como nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, magnesio y azufre y tiene potencial como fertilizante. Así, la aplicación directa de suero ha sido durante mucho tiempo una práctica agronómica (Mawson, 1994). La aplicación del suero quesero al suelo agrícola ha sido considerado un método eficaz para aumentar el contenido de materia orgánica y aumentar la capacidad de retención de agua (Aboukila et al., 2018), ya que las cantidades y proporciones de estos nutrientes lo convierten en un sustituto o complemento adecuado de los fertilizante inorgánicos (Zibilske, 1998). Muchos estudios se han centrado en el efecto directo del suero en las propiedades químicas del suelo así como en el crecimiento y parámetros relacionados con la productividad de las plantas, concluyendo que el suero se puede utilizar como estimulante de las plantas. Por otro lado, estudios fitoquímicos de plantas fertilizadas con suero han demostrado la capacidad de 55 C3-BIOECONOMY, Revista de Investigación y Transferencia en Bioeconomía Circular y Sostenible Nº5 (2024) éste para estimular la inducción de la biosíntesis y la acumulación de principios activos vegetales (Grosu, 2012). No obstante, el suero presenta una limitación en su potencial como fertilizante, debido a la baja biodisponibilidad de la lactosa, tanto para las plantas como para los microorganismos ambientales. Por ello, el desarrollo de procesos que salven este inconveniente permitirá incrementar significativamente su eficacia en aplicaciones agronómicas. 1.2. Bioestimulantes y biofertilizantes Los bioestimulantes (BSs) son compuestos orgánicos (como péptidos, aminoácidos, polisacáridos, ácidos húmicos, fitohormonas, etc.) que, cuando se aplican en pequeñas cantidades, mejoran los procesos fisiológicos de las plantas. Los bioestimulantes aumentan la eficiencia en el uso de nutrientes y ayudan a las plantas a tolerar el estrés abiótico, lo que mejora la calidad y el rendimiento de los cultivos (du Jardin 2015). Por otro lado, los biofertilizantes (BFs) son inoculantes vivos, como bacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPb), hongos micorrícicos o algas verdes que se utilizan para promover el crecimiento y la salud de las plantas, y proporcionan nutrientes directamente a los cultivos. Los bioestimulantes/biofertilizantes son una alternativa sostenible y respetuosa con el medio ambiente para aumentar la productividad agrícola y reducir la dependencia de fertilizantes químicos. 1.3. Bacterias lácticas (BAL) y biofertilzación Las BAL son un grupo de bacterias Gram positivas, no esporuladas, anaeróbicas facultativas, con forma de bastón (bacilos) o esféricas (cocos) que incluyen 6 familias y 38 géneros en el Orden de Lactobacillales (Holzapfel, Abriouel y Wood 2014). Éstas producen ácido láctico (LA) como principal producto final del metabolismo sacarolítico (SAEED y SALAM, 2013). Es un grupo amplio y heterogéneo, compuesto principalmente por los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus, y también en menor medida por Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, 56 Caballero, A., Orts Gómez, J.M., Lopez Rodríguez, J., Martín Presas, L. y Parrado, J. Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus y Weisella. Las LAB son miembros ubicuos de muchos microbiomas vegetales, plantas colonizadoras, suelos y rizosfera. Por lo tanto, las LAB podrían aislarse de una gran variedad de ambientes, incluido el suelo, residuos de plantas y diferentes desechos. Las BAL presentan propiedades biofertilizantes, de entre las que se encuentran la fijación de nitrógeno atmosférico, el cual se transforma a amoníaco para que sea disponible para las plantas (Giassi et al., 2016) Se ha demostrado que las BAL solubilizan el fosfato mediante la producción de ácidos orgánicos como el ácido láctico (Giassi et al., 2016), las plantas solamente son capaces de adquirir el fósforo en su forma inorgánica , por lo que su disponibilidad depende de la solubilización de éste (Beltrán Pineda, 2015). Las BAL producen fitohormonas (Kumar et al. 2022), como la giberelina (GA) y auxinas como el ácido indol-3-acético (AIA), los cuales desempeñan diversas funciones en la promoción del crecimiento de las plantas (Lamont et al. 2017), estas producen un aumento de la actividad metabólica que ayuda a la defensa, el normal funcionamiento celular y el manejo del estrés abiótico (Khan et al. 2020). Por otra parte, las fitohormonas influyen en el crecimiento de las plantas mejorando la longitud y la superficie radicular, lo que incrementa la calidad de su nutrición y la absorción de agua. 2. MÉTODO/DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA DE INNOVACIÓN 2.1 Aislamiento de bacterias lácticas El suero de leche objeto de estudio procedía de la empresa Vega e Hijos (Sevilla), cuyas bacterias lácticas fueron aisladas mediante su cultivo en medios específicos sólidos (MRS-glucosa) con adición de lactosa, en función de las diferentes morfologías de las colonias. La identificación fue realizada mediante secuenciación génica de la región 16S del ARNr. Ésta se alineó con las secuencias de las cepas tipo más relacionadas utilizando el servicio Ez-Taxon-e (www.ezbiocloud.net/eztaxon)(Yoon et al. 2017). Posteriormente, se determinaron las similitudes por pares (Meier-Kolthoff 2013). 57 C3-BIOECONOMY, Revista de Investigación y Transferencia en Bioeconomía Circular y Sostenible Nº5 (2024) 2.2 Propiedades biofertilizantes La caracterización de las diferentes propiedades biofertilizantes de las diferentes BAL se realizó con los siguientes ensayos a) producción de ácido indolacético (IAA) (Gordon y Weber 1950) b) Solubilización de fosfato (Nautiyal 1999) c) fijación de nitrógeno, las bacterias se cultivaron en un medio mínimo libre de nitrógeno (Nautiyal 1999) durante 72 h a 28 °C. d) La producción de sideróforos se evaluó en placas de agar CAS (Chrome Azurol S) (Schwyn y Neilands 1987). La formación de biofilms se evaluó siguiendo el método previamente descrito (Del Castillo et al. 2012). 2.3 Análisis tamaño molecular proteico/peptídico El análisis de tamaño molecular de las proteínas y péptidos de los sueros y los fermentados se realizó por cromatografía de exclusión molecular, utilizando un HPLC JASCO LC-4000 con una columna de exclusión por tamaño Superdex Peptide™ 10/300 GL, que tiene un rango de separación óptimo de 0,1 a 7 kilo daltons (kDa). La detección de las moléculas se llevó a cabo a longitud de onda de 280 nm, utilizando un módulo detector UV/Vis JASCO UV-4075. 2.4 Bioproceso El esquema general de proceso de valorización (Figura 1) se divide en una etapa inicial de fermentación, seguida por un proceso de estabilización mediante separación de la biomasa (Lactobacillus rhamnosus), constituyendo ésta la fracción biofertilizante, seguida por una etapa de concentración de la fracción bioestimulante (suero fermentado sin bacterias) compuesta por los metabolitos bioestimulantes, como son el ácido láctico y las proteínas hidrolizadas, en forma de péptidos como se muestra en la Figura 2. El bioproceso fermentativo a escala de laboratorio se realizó en un fermentador convencional con una capacidad total de 5L, control de pH, agitación y temperatura (Sartorius Biostat A, Germany). Se realizaron distintas fermentaciones con el objetivo de optimizar los parámetros pH, temperatura y aireación. En cada una de las fermentaciones realizadas únicamente se modificaba un parámetro a estudiar, manteniendo los valores del resto de parámetros en: pH 5.5, temperatura 40ºC, agitación 300 rpm y aireación 1.5 58 Caballero, A., Orts Gómez, J.M., Lopez Rodríguez, J., Martín Presas, L. y Parrado, J. v.v.m. La concentración de ácido láctico fue elegida como indicador de la productividad de la fermentación. Parámetros estudiados: •Temperatura (ᵒC): 38, 40, 42 •pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8 •Aireación (v.v.m.) 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 El suero fermentado fue posteriormente procesado para su estabilización mediante tecnología de membranas a través de utrafiltración y ósmosis inversa. El escalado se realizó en las instalaciones de planta piloto pertenecientes al grupo AGR-212 situada en Mataderos del Sur (Salteras, España) empleando un fermentador con una capacidad total de 100L y, seguidamente, en dos fermentadores con una capacidad total de 3 y 8 m3, acoplados a sistemas de ultrafiltración y ósmosis inversa. 3. RESULTADOS 3.1 Composición química del suero Tabla 1. Composición química del suero de leche y del suero fermentado. Fuente: Elaboración propia. *En forma de péptidos Suero de leche (g/l) Suero fermentado (g/l) Biomasa BAL 0.05±0.01 3.2 ± 0.7 Proteínas 9.8 ± 2 9.16 ±1.8* Ácido Láctico Lactosa Minerales 5.0 ± 0.5 51.0 ± 3.1 2.2 ± 0.3 42.0 ± 0.2 1.7 ± 0.2 2.4 ± 0.2 El suero de leche utilizado como materia prima en este trabajo presenta una composición química típica (Tabla 1), compuesta principalmente por carbohidratos, principalmente lactosa (50 ± 3,9 g/L), y proteínas solubles (10 ± 2 g/L). El suero también contiene menores cantidades de ácido láctico (5,2 ± 0,6 g/L), un producto de la fermentación microbiana espontánea de la lactosa durante el almacenamiento [34]. 59 C3-BIOECONOMY, Revista de Investigación y Transferencia en Bioeconomía Circular y Sostenible Nº5 (2024) 3.2 Aislamiento de bacterias lácticas Se identificaron cuatro especies cultivables principales a partir de un aislamiento microbiano realizado dentro del consorcio presente en el suero de leche, cuyos resultados son mostrados en la Tabla 2. Todas las LAB aisladas corresponden al género Lactobacillus, siendo de especial relevancia Lactobacillus rhamnosus, bacteria que ofrece importantes ventajas para la salud animal/humana por ser un probiótico de interés y como bacteria con capacidad biocontroladora de patógenos en plantas (Akhtar et al. 2023; Braos et al. 2020). Tabla 2. Identificación de las bacterias lácticas aisladas del ARNr del 16S, mostrando la especie más cercana según la base de datos de EzBioCloud y NCBI. Fuente: Elaboración propia Cepa Especie % ID 1 Lactobacillus rhamnosus 100% 2 Lactobacillus fermentum 100% 3 Lactobacillus hilgardii 100% 4 Lactobacillus helveticus 99,78% 3.3 Identificación de sus propiedades como BIOFERTILIZANTES Una vez identificadas, se realizó una selección de la cepa de lactobacteria con mayor actividad biofertilizante. Se procedió a evaluación de las actividades PGPb, y se observa que todas las bacterias fueron capaces de crear biofilms, propiedad que permite a las bacterias fijarse y colonizar distintas superficies como las raíces (Tabla 3). A su vez, todas las bacterias identificadas fueron capaces de solubilizar fosfatos, siendo el mayor solubilizador la cepa de Lactobacillus rhamnosus, con un halo de 2,3 cm de diámetro (Tabla 3). La mayoría fueron capaces de producir auxinas (IAA), destacando Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus helveticus por mostrar altos valores de AIA (8,667 y 9,273 mg·L-1 respectivamente). La fijación de nitrógeno y producción de sideróforos fue sólo positiva para Lactobacillus rhamnosus; el resto de las cepas resultaron negativas Tabla 3). 60 Caballero, A., Orts Gómez, J.M., Lopez Rodríguez, J., Martín Presas, L. y Parrado, J. Tabla 3. Propiedades PGP presentes en las bacterias aisladas. Fuente: Elaboración propia Cepa Solubilización de fosfato (mm) Sideróforos (mm) IAA (mg/l) Fijación de nitrógeno Biofilm Lactobacillus rhamnosus 2.3 0.8 8,667 + + Lactobacillus fermentum 2.1 - - - + Lactobacillus hilgardii ± - + - + Lactobacillus helveticus + - 9,237 - + En conclusión, las bacterias aisladas de los sueros de leche pueden ser utilizadas para la obtención de productos con capacidad biofertilzantes y bioestimulantes. Por otra parte, son BAL adaptadas localmente al crecimiento en el suero de leche; esto representa una ventaja para la producción industrial, en comparación con la utilización de una BAL obtenida de una colección microbiana. De todas ellas la bacteria aislada del suero de leche, elegida como herramienta biológica para realizar la optimización del bioproceso por presentar mejores propiedades biofertilizantes es Lactobacillus rhamnosus. 3.3 Optimización del bioproceso El bioproceso de valorización de suero para la obtención de bioestimulantes/biofertilizantes., fue optimizado a escala de laboratorio, en un fermentador con control de pH y temperatura. Se evaluó a través de la evaluación de la productividad de la generación de ácido láctico, hallando los valores óptimos de los parámetros estudiados, que se muestran a continuación. 1. pH. El pH óptimo de pH 7 es el que mayor productividad presentó (1.16 mg ml-1 h-1), cuyo rendimiento de conversión de lactosa en ácido láctico fue del 100 %. Se observó que a partir de un valor de pH 7.5 la productividad de ácido láctico disminuyó significativamente, siendo mínima a pH 8. El rango de 61 C3-BIOECONOMY, Revista de Investigación y Transferencia en Bioeconomía Circular y Sostenible Nº5 (2024) MEIER-KOLTHOFF, Jan P., GÖKER, Markus, SPRÖER, Cathrin y KLENK, Hans Peter, 2013. When should a DDH experiment be mandatory in microbial taxonomy? Archives of Microbiology, vol. 195, no. 6, pp. 413-418. ISSN 03028933. DOI 10.1007/s00203-013-0888-4. NAUTIYAL, C. Shekhar, 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters, vol. 170, no. 1, pp. 265-270. ISSN 03781097. DOI 10.1016/S0378-1097(98)005552. SCHWYN, Bernhard y NEILANDS, J.B., 1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry, vol. 160, no. 1, pp. 47-56. ISSN 10960309. DOI 10.1016/0003-2697(87)90612-9. 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