Autofagia en el estrés e interacciones con la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC): efecto de las modificaciones postraduccionales de la proteína sobre su estabilidad y su reclutamiento a la vía autofágica

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Y ECOLOGÍA Tesis doctoral presentada por Guillermo Baena Vaca Sevilla, 2019 EFECTO DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE LA PROTEÍNA SOBRE SU ESTABILIDAD Y SU RECLUTAMIENTO A LA VÍA AUTOFÁGICA AUTOFAGIA EN EL ESTRÉS E INTERACCIONES CON LA FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC) EFECTO DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE LA PROTEÍNA SOBRE SU ESTABILIDAD Y SU RECLUTAMIENTO A LA VÍA AUTOFÁGICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Y ECOLOGÍA Tesis doctoral presentada por GUILLERMO BAENA VACA para optar al Grado de Doctor en Biología Sevilla, 2019 Dirigida por: Dra. Sofía García-Mauriño Ruiz-Berdejo Dr. José Antonio Monreal Hermoso A Tati “…All we have to decide is what to do with the time that is given to us.” Gandalf the Grey (J.R.R. Tolkien) “…Lo único que podemos decidir es qué hacer con el tiempo que se nos ha dado.” Gandalf el Gris (J.R.R. Tolkien) 5 Este trabajo se ha realizado en el Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Área de Fisiología Vegetal, de la Facultad de Biología de la Universidad de Sevilla. La tesis doctoral ha sido realizada como parte del proyecto de investigación de excelencia de la Consejería de Economía e Innovación de la Junta de Andalucía: Reciclar o morir: autofagia, ubiquitina y PEPC (fosfoenolpiruvato carboxilasa) en estrés nutricional, hídrico/salino y oxidativo (P12-FQM-489), siendo el doctorando beneficiario del contrato predoctoral de tres años (diciembre 2015 – diciembre 2018) para el personal investigador en formación asociado al anterior proyecto. Además, la financiación de la tesis doctoral fue complementada con cargo a los siguientes proyectos y ayudas:  Proyecto de investigación fundamental del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España: Gene expression and protein regulation of PEPC, PEPC-kinase and peptide-dependent PEPC protease: role in development and germination of sorghum seed and salt resistance (AGL2012-35708).  Proyecto I+D de excelencia del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España: Control autofágico de elementos claves del metabolismo: la fosfoenolpiruvato carboxilasa de sorgo en estrés y en semillas (AGL2016-75413-P).  Ayudas de la Junta de Andalucía a grupos PAI: grupo de investigación Fosforilación de proteínas y metabolismo del carbono (BIO298). Durante la realización de la tesis doctoral, el doctorando llevó a cabo dos estancias de investigación en el extranjero:  Estancia de 90 días (1 de septiembre de 2016 – 29 de noviembre de 2016) en el grupo de Abiotic stress del Centre for Tropical Crops and Biocommodities (CTCB). Queensland University of Technology (QUT), Brisbane, Australia. Aprendizaje de métodos para la detección de la activación de la autofagia en sorgo. Directores: Dr. Brett Williams y Dr. Sagadevan Mundree. Financiación: proyecto P12-FQM489 (mencionado anteriormente).  Estancia de 90 días (1 de septiembre de 2017 – 29 de noviembre de 2017) en el grupo de The role of autophagy in plant development and stress tolerance del Gregor Mendel Institute (GMI), Viena, Austria. Aprendizaje de técnicas de autofagia en plantas y de interacción con proteínas autofágicas. Director: Dr. Yasin Dagdas. Financiación: ayuda para movilidad internacional del personal dedicado a la investigación (I.3A1 – VIPPIT-US). 6 Los resultados obtenidos durante la realización de esta tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones y comunicaciones a congresos: Publicaciones:  Baena G, Feria AB, Echevarría C, Monreal JA, García-Mauriño S (2017). Salinity promotes opposite patterns of carbonylation and nitrosylation of C4 phosphoenolpyruvate carboxylase in sorghum leaves. Planta 246, 1203-1214. Comunicaciones a congresos:  Baena G, López-Álvarez M, Arias-Baldrich C, Monreal JA, García-Mauriño S (2015). Interplay between carbonylation and S-nitrosylation of C4 PEPC in sorghum leaves. Póster presentado al XIV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal; 14-17 de junio de 2015; Toledo, España.  Baena G, López-Álvarez M, Arias-Baldrich C, Echevarría C, Monreal JA, García-Mauriño S (2016). S-nitrosylation protects C4 PEPC from carbonylation in sorghum leaves. Póster presentado al Plant Biology Europe FESPB/EPSO Congress; 26-30 de junio de 2016; Praga, República Checa.  Baena G, de la Osa C, Feria AB, Echevarría C, Monreal JA, García-Mauriño S (2017). Expression markers of autophagy in sorghum. Póster presentado a la reunion Plant Autophagy: improving crop and energy production (Transautophagy COST-CA 15138); 23-24 de marzo de 2017; Madrid, España.  Baena G, Williams B, Liu N, Mundree S, Monreal JA, García-Mauriño S (2017). Methods for detection of autophagy in Sorghum bicolor L. Comunicación oral presentada al XV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal; 26-29 de junio de 2017; Barcelona, España.  Rodríguez-Muro AM, Baena G, Monreal JA, García-Mauriño S, Feria AB (2017). Phosphoenolpyruvate carboxylase activity and its posttranslational modifications in two SALK t-DNA lines of genes related to autophagy in stress conditions. Póster presentado al XV Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal; 26-29 de junio de 2017; Barcelona, España.  Baena G, Feria AB, de la Osa C, Gandullo J, Monreal JA, García-Mauriño S (2018). Is phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) processed by selective autophagy? Póster presentado al Plant Biology Europe FESPB/EPSO Congress; 18-21 de junio de 2018; Copenhague, Dinamarca.  Monreal JA, Ruiz-Ballesta I, Arias-Baldrich C, Baena G, de la Osa C, Feria AB, García-Mauriño S (2018). Post-translational modifications (PTMs) in plant proteins: phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) as a case of study. Póster presentado al Plant Biology Europe FESPB/EPSO Congress; 18-21 de junio de 2018; Copenhague, Dinamarca. ÍNDICE Índice 8 ÍNDICE DE FIGURAS ABREVIATURAS I. RESUMEN II. ABSTRACT III. INTRODUCCIÓN 1. Modificaciones postraduccionales 1.1. Fosforilación 1.2. Modificaciones lipídicas 1.3. Óxido nítrico y S-nitrosilación 1.3.1. Síntesis de NO 1.3.2. Reacciones y modificaciones de proteínas basadas en NO 1.3.3. La S-nitrosilación como modificación postraduccional 1.4. Especies reactivas de oxígeno y carbonilación de proteínas 1.4.1. Generación de grupos carbonilos en proteínas 1.4.2. Carbonilación de proteínas en plantas 1.4.3. Interacción entre el NO y la carbonilación 1.5. Ubiquitinación de proteínas 1.5.1. Modificadores ubiquitin-like 2. La fosfoenolpiruvato carboxilasa 2.1. Estructura 2.2. Familia génica de la PEPC 2.3. Funciones de la PEPC 2.3.1. Reacción enzimática de la PEPC 2.3.2. La PEPC en la fotosíntesis de tipo C4 y CAM 2.3.3. La PEPC en otros contextos metabólicos 2.4. Regulación de la actividad PEPC 2.4.1. Regulación transcripcional 2.4.2. Regulación postraduccional 2.5. Degradación de la PEPC 3. Autofagia en plantas 3.1. La maquinaria autofágica 3.1.1. Inducción 3.1.2. Reclutamiento de membrana 3.1.3. Nucleación de la vesícula 3.1.4. Expansión del fagóforo 3.1.5. Transporte y fusión del autofagosoma a la vacuola 3.1.6. Degradación del autofagosoma 3.2. Autofagia selectiva 3.2.1. NBR1 3.2.2. Tipos de autofagia selectiva 3.3. Métodos de monitorización de la autofagia en plantas 3.3.1. Métodos de microscopía 3.3.2. Métodos bioquímicos 3.3.3. Inhibidores de la autofagia 3.4. La autofagia en el desarrollo, metabolismo y respuesta a estrés 3.5. Interés en el estudio de la implicación de la autofagia y las PTMs en la degradación de la PEPC 12 15 19 23 27 27 27 28 30 30 31 32 37 38 39 41 42 44 44 45 47 49 49 49 51 54 54 55 63 64 65 66 67 68 70 71 72 72 73 74 79 79 82 84 86 89 Índice 9 IV. OBJETIVOS V. OBJECTIVES VI. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Material vegetal y condiciones de cultivo 1.1. Sorghum bicolor 1.2. Arabidopsis thaliana 1.3. Nicotiana benthamiana 1.3.1. Plantas 1.3.2. Cultivos de células 2. Obtención de extractos crudos 3. Purificación de proteínas 3.1. Purificación de la PEPC C4 de hojas de sorgo 3.2. Producción y purificación de ATG8a recombinante a partir de E. coli 3.3. Producción y purificación de GST-NBR1 recombinante a partir de E. coli 4. Ensayos enzimáticos 4.1. Determinación de la actividad PEPC 5. Técnicas analíticas 5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 5.2. Tinción con azul de Coomassie 5.3. Preparación y detección de proteínas carboniladas 5.4. Detección de proteínas S-nitrosiladas 5.4.1. El método de biotin switch 5.4.2. Purificación de proteínas nitrosiladas 6. Métodos inmunológicos 6.1. Tipos de anticuerpos utilizados en este trabajo 6.2. Inmunoblot 6.3. Purificación de anticuerpos 6.4. Inmunoprecipitación de la PEPC 6.5. Coinmunoprecipitaciones 6.5.1. Coinmunoprecipitación con GST-NBR1 6.5.2. Coinmunoprecipitación con GFP-ATG8 7. Técnicas moleculares 7.1. Extracción de ARN 7.2. Extracción de ADN 7.3. Retrotranscripción de ARN a ADNc 7.4. Experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 7.4.1. PCR a tiempo final 7.4.2. PCR a tiempo real (qPCR) 7.5. Clonaciones y construcciones 7.5.1. GST-NBR1 7.5.2. mCherry-PPC3 7.5.3. BFP-NBR1 7.5.4. mCherry-βC1 7.5.5. GFP-ATG8 7.5.6. EV-mCherry y EV-GFP 92 94 96 96 96 97 97 97 98 98 99 99 100 101 101 101 102 102 102 102 103 103 103 104 104 105 106 106 107 107 107 108 108 108 108 108 108 109 110 110 111 112 112 113 114 Abreviaturas 16 FPLC Fast protein liquid chromatography g Fuerza g GFP Green fluorescent protein GSNO Nitrosoglutatión GST Glutatión S-transferasa HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)etanosulfónico IP Inmunoprecipitado Kd Constante de disociación kDa Kilodalton Ki Constante de inhibición KM Constante de Michaelis-Menten MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico MDC Monodansilcadaverina MDH Malato deshidrogenasa MG132 Bencil N-[(2S)-4-metil-1-[[(2S)-4-metil-1-[[(2S)-4-metil-1-oxopentano-2il]amino]-1-oxopentano-2-il]amino]-1-oxopentano-2-il]carbamato MST Termoforesis a microescala MV Metil viológeno NAD(P)(H) Nicotina adenina dinucleótido (fosfato) (reducido) NASC Nottingham Arabidopsis Stock Centre NBR1 Neighbor of BRCA1 gene 1 protein NCBI National Center for Biotechnology Information NOS Óxido nítrico sintasa NR Nitrato reductasa N-terminal Amino terminal OAA Oxalacetato p107 Polipéptido de PEPC de 107 kDa p110 Polipéptido de PEPC de 110 kDa PA Ácido fosfatídico PAR Radiación fotosintéticamente activa pb Pares de bases PBS Tampón fosfato salino PCR Reacción en cadena de la polimerasa PE Fosfatidiletanolamina PEP Fosfoenolpiruvato PEPC Fosfoenolpiruvato carboxilasa PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa Pi Fosfato inorgánico PI3K Fosfatidilinositol-3-quinasa PI3P Fosfatidilinositol-3-fosfato Pl. D Fosfolipasa D Abreviaturas 17 PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PPC Isoforma/isogen de PEPC PPCK Isoforma/isogen de PEPCK PTM Modificación postraduccional PTPC PEPC de tipo planta p/v Relación peso/volumen qPCR PCR cuantitativa o a tiempo real RCB Rubisco-containing bodies RFP Red fluorescent protein ROS Especies reactivas de oxígeno Rubisco Ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa SAV Senescence-associated vacuoles SDS Dodecilsulfato sódico SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida SN Sobrenadante S-NO S-nitrosotiol SNP Nitroprusiato sódico SnRK1 Sucrose non-fermenting 1-related kinase 1 SSLG Small starch-like granules TBS Tampón tris salino TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina TGM Tampón tris glicina metanol TOR Target of rapamycin Tris 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol Tyr-nitración Nitración de tirosina U Unidad de actividad enzimática UBA Dominio de unión a ubiquitina Vmax Velocidad máxima de reacción enzimática v/v Relación volumen/volumen RESUMEN Resumen 19 La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica multifuncional que está implicada en procesos clave del metabolismo del carbono y del nitrógeno. Esta enzima está regulada por distintas modificaciones postraduccionales (PTMs), las cuales modifican la enzima y modulan su actividad de forma compleja. En cuanto a su degradación, una fracción de la cantidad total de PEPC se degrada por el sistema ubiquitina-proteasoma, pero no se ha descrito una ruta alternativa de degradación ni mecanismos de regulación de la misma. Este trabajo profundiza en los elementos reguladores de la estabilidad de la PEPC C4 fotosintética de sorgo, así como de las isoformas C3 de la misma. Para ello, se ha analizado la repercusión de las PTMs sobre la estabilidad de la proteína, y se ha estudiado el papel de la autofagia, selectiva y masiva, en la degradación de la PEPC. Numerosas evidencias experimentales muestran que existe una interacción entre la oxidación proteica, derivada de las especies reactivas de oxígeno (ROS), y la Snitrosilación de proteínas, derivada del óxido nítrico (NO). Previamente se había descrito que el NO incrementaba la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa (PEPCK) en hojas de sorgo, fomentando la fosforilación de la PEPC fotosintética. En este trabajo, se ha encontrado en hojas de sorgo una interacción, in vitro e in vivo, entre la carbonilación de la PEPC C4, que la inactivaba, y la Snitrosilación de la misma, que aumentaba la resistencia a la posterior carbonilación y, por tanto, preservaba su actividad. Además, en plantas sometidas a un choque salino, la carbonilación de la PEPC aumentó a la vez que la S-nitrosilación disminuyó. A continuación, se detectó un aumento de la S-nitrosilación de la PEPC acompañado de un descenso en la carbonilación. Estos resultados sugieren que la S-nitrosilación puede contribuir a mantener la actividad de la PEPC C4 en hojas de sorgo estresadas por sal. De este modo, la síntesis de NO inducida por la salinidad protegería a la PEPC fotosintética de la inactivación oxidativa. Al mismo tiempo, al promover su fosforilación, garantizaría el funcionamiento óptimo de la enzima en condiciones subóptimas. En plantas C3 existen varias rutas de degradación de componentes cloroplastídicos en la vacuola. Algunas de estas rutas están relacionadas con la autofagia y otras no. En ellas, la rubisco y otras proteínas son incluidas en vesículas que posteriormente se transportan a la vacuola y se degradan para reciclar el nitrógeno. Por otro lado, el ácido fosfatídico (PA) provoca la exposición del extremo Cterminal de la PEPC de tipo C4, reconocido por una proteasa. Cuando el PA se une a la proteína, induce el reclutamiento de ésta a membrana, acompañado de su inactivación. En maíz, la PEPC de tipo C4 se une a la membrana del cloroplasto al mismo tiempo que pierde su actividad. Esto sugiere que en plantas C4 la PEPC puede estar relacionada con las vías de degradación vacuolar de componentes del cloroplasto, ya que, al igual que la rubisco, constituye una fuente importante para el reciclaje de nitrógeno. Resumen 20 La autofagia es un proceso muy conservado que se encarga de la degradación, masiva o selectiva, de componentes celulares a través de su encapsulación en vesículas de doble membrana, denominadas autofagosomas, y posterior degradación en la vacuola. La autofagia, al igual que la PEPC, tiene un papel principal en el metabolismo del carbono y el nitrógeno. Además, esta vía se activa en respuesta a la deficiencia de estos dos elementos. Como la actividad PEPC está estrictamente controlada postraduccionalmente, es probable que su degradación también se encuentre muy regulada. La autofagia selectiva constituye una vía de degradación precisa y controlada, y su regulación es dirigida por receptores de cargo como NBR1, cuyo principal sustrato de reconocimiento es la ubiquitina. La PEPC es monoubiquitinada in vivo, pero su función fisiológica aún no está clara. Esta PTM aumenta en raíces estresadas por amonio y en semillas en germinación, y éstos son procesos en los que la autofagia está implicada. En este trabajo, en primer lugar, se han desarrollado métodos para la detección y el estudio de la autofagia en sorgo; y, en segundo lugar, se ha investigado la degradación autofágica de la PEPC y su relación con la monoubiquitinación de la proteína de tipo C3. En sorgo, la autofagia se activó en condiciones de estrés salino, nutricional y oxidativo, y la visualización de autofagosomas mediante microscopía confocal y electrónica constituyó un método efectivo para monitorizarla. Las medidas de expresión de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b permitieron detectar la activación de la autofagia en condiciones de estrés oxidativo y estrés nutricional por deficiencia de carbono y fósforo, pero no por deficiencia de nitrógeno y hierro. El desarrollo de estos métodos abre la puerta al estudio de procesos relacionados con la autofagia en sorgo. Por el contrario, se encontró que la proteína vírica βC1 mostró interacciones inespecíficas que hacen que no sea una herramienta idónea para estudios de autofagia. Además, el péptido que contiene el dominio de unión a ATG8 de βC1 no interaccionó in vitro con la proteína ATG8a de arabidopsis, presumiblemente por requerir algún elemento adicional, como la fosforilación, para ello. Por lo tanto, tampoco es una herramienta útil para la detección de autofagosomas in vivo. Diversos resultados experimentales demostraron que una fracción de la proteína PEPC se procesa por la vía autofágica. Por un lado, se observó una disminución de la cantidad de PEPC en raíces de sorgo con déficit de nitrógeno y en células de Nicotiana benthamiana con déficit de carbono, condiciones en las que se activa la autofagia. El uso de inhibidores de la autofagia en estas condiciones bloqueó dicha degradación. Además, en líneas SALK de arabidopsis deficientes en proteínas autofágicas (líneas atg2 y atg5) se observó un aumento de la cantidad total de PEPC. Estos resultados sugieren que una parte del total de proteína PEPC es degradada por autofagia, siendo la primera ocasión en que se observa este tipo de degradación para la PEPC. Resumen 21 En cuanto a la monoubiquitinación de la PEPC, disminuyó tras el uso de un activador de la autofagia, la trehalosa, en plantas de arabidopsis, y aumentó en plantas de arabidopsis atg2 y atg5. En células de N. benthamiana, donde la PEPC se encuentra principalmente desubiquitinada, el uso del 3-MA (inhibidor de la formación de autofagosomas) provocó un aumento significativo de esta PTM. Estos resultados sugieren que la monoubiquitinación de la PEPC sirve como marcaje para su degradación por autofagia, lo que constituiría la primera función descubierta para la monoubiquitinación de la PEPC que la relaciona con una ruta de señalización, en este caso degradativa. Por otro lado, la proteína NBR1, un receptor de cargo que participa en la autofagia, se unió a la PEPC en hojas de sorgo, en plantas de arabidopsis atg5, y en células de N. benthamiana en las que la autofagia se había inhibido con 3-MA. Además, NBR1 también interaccionó con una PEPC parcialmente degrada en hojas, raíces y semillas de sorgo, hojas y raíces de arabidopsis y células de N. benthamiana. Estos resultados implican a NBR1 como elemento conector entre la PEPC y la vía autofágica. Los resultados expuestos en este trabajo ponen de manifiesto una implicación de la S-nitrosilación en mantener la estabilidad de la PEPC de tipo C4 de hojas de sorgo, así como evidencian la degradación de la PEPC de tipo C3 vía autofagia. De forma similar, la PEPC C4 también podría degradarse por autofagia, aunque en este caso, la proteína no se monoubiquitina. Futuros experimentos podrán determinar si la interacción con el PA y el reclutamiento a membrana están relacionados con la inclusión de la proteína en vesículas de degradación vacuolar, al igual que la rubisco, para reciclar el nitrógeno. ABSTRACT Abstract 23 Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC; EC 4.1.1.31) is a multifunctional, cytosolic enzyme implicated in key processes in carbon and nitrogen metabolism. The diversity of its post-translational regulation is remarkable, as PEPC can be modified by numerous post-translational modifications (PTMs), meaning that its functions can be tightly regulated. The degradation of a portion of total PEPC is carried out by the ubiquitin-proteasome system. However, neither an alternative pathway of PEPC degradation nor a regulation system has been described to date. This work investigates the mechanisms that regulates the stability of sorghum photosynthetic C4 PEPC, as well as C3 isoforms. To achieve this, the implications of PTMs on PEPC stability, and the role of both bulk and selective autophagy in the degradation of the protein, were analyzed. There is increasing evidence demonstrating interplay between ROS-based protein oxidation and nitric oxide (NO)-based protein S-nitrosylation. Previous work had shown that NO increased PEPC kinase (PEPCK) activity, promoting the phosphorylation of PEPC in sorghum leaves. The present work evidences interplay between PEPC carbonylation -which inactivated the proteinand S-nitrosylation in vitro and in vivo. S-nitrosylated PEPC displayed increased resistance towards subsequent carbonylation. Under salt shock, carbonylation of PEPC increased in parallel with decreased S-nitrosylation of the enzyme. Subsequent increase of Snitrosylation was accompanied by decreased carbonylation. Taken together, the results suggest that S-nitrosylation could contribute to maintain C4 PEPC activity in saltstressed sorghum plants. Therefore, salt-induced NO synthesis would protect photosynthetic PEPC activity from oxidative inactivation while promoting its phosphorylation, which will guarantee its optimal functioning in suboptimal conditions. In C3 plants, several pathways of vacuolar degradation of chloroplast components -autophagic or nothave been described. In these mechanisms, rubisco, membrane-binding proteins, and other chloroplastic proteins are included in vesicles which are eventually transported into the vacuole. Phosphatidic acid (PA) is a phospholipid and signaling molecule that triggers the exposition of the C-terminus domain of PEPC, which is then recognized by a protease. The binding of PA to PEPC also recruits the protein to membranes. In maize, C4 PEPC can bind chloroplast membranes, which is accompanied by loss of activity. This suggests that PEPC degradation could be related to vacuolar degradation pathways of chloroplastic components in C4 plants since PEPC constitutes an important source for nitrogen recycling in these plants, in a similar manner to rubisco. Autophagy is a highly conserved process that is used for the bulk and selective cleavage and recycling of cellular components, following encapsulation in doublemembrane vesicles, termed autophagosomes, and later degraded in the vacuole. Both Abstract 24 autophagy and PEPC have a central role in carbon and nitrogen metabolism. Moreover, the autophagic pathway is activated in response to stress induced by carbon and nitrogen starvation. PEPC is tightly regulated by post-translational modifications, which may also act to control its degradation. Selective autophagy constitutes a precise and controlled degradation pathway, with its regulation controlled by cargo receptors such as NBR1, which principally recognizes ubiquitinated proteins. PEPC is monoubiquitinated in vivo but its physiological function is not clear. PEPC monoubiquitination increases during ammonium stress and in germinating seeds; processes in which autophagy is implicated. In this work, methods to detect and study autophagy in sorghum were developed, and subsequently the autophagic degradation of PEPC, and its relation to monoubiquitination of this protein, was investigated. In sorghum, autophagy was activated under salt stress, nutritional stresses and oxidative stress, and visualization of autophagosomes by confocal and electron microscopy constituted an effective method to monitor the autophagic process. Measuring the expression levels of SbATG18a, SbATG6a and SbATG6b genes allowed the detection of autophagy activation under oxidative stress as well as carbon and phosphorus deficiencies, but not under nitrogen or iron deficiencies. The development of these methods allows the study of processes related to autophagy in sorghum plants. Notably, viral protein βC1 showed unspecific interactions, meaning that it is not a suitable tool for autophagy studies. The peptide containing the ATG8-binding domain of this protein did not interact in vitro with arabidopsis ATG8a. This is presumably caused by the requirement of an additional element, such as phosphorylation, to facilitate the interaction. Therefore, this peptide would not be useful as a tool for autophagosome detection in vivo. Results showed a decrease in the amount of PEPC in sorghum roots under nitrogen starvation, and in Nicotiana benthamiana cells under sucrose starvation. Both are conditions in which autophagy is activated. The use of autophagy inhibitors under these conditions blocked the degradation of PEPC. Moreover, an increase in total amount of PEPC was observed in arabidopsis SALK lines deficient in autophagic proteins (atg2 and atg5). These results suggest that a portion of total PEPC is processed by autophagy. This is the first time this type of degradation has been observed for PEPC. Monoubiquitination of PEPC decreased after the use of trehalose, an activator of autophagy, in arabidopsis plants. The level of monoubiquitination steadily increased in arabidopsis atg2 and atg5. In N. benthamiana cells, where PEPC is found to be mostly deubiquitinated, the use of 3-MA (an inhibitor of the formation of autophagosomes) triggered a significant increase in PEPC monoubiquitination. This suggests that monoubiquitination of PEPC is tagging the protein for selective autophagy. This would Abstract 25 be the first function described for monoubiquitinated PEPC in relation to a signaling pathway. Furthermore, the NBR1 protein interacted with PEPC in sorghum leaves, arabidopsis atg5 plants, and 3-MA-treated N. benthamiana cells. NBR1 also interacted with a partially degraded PEPC in sorghum leaves, roots and shoots, arabidopsis shoots and roots, and N. benthamiana cells. These findings implicate NBR1 as a link between PEPC and autophagy. Results presented in this work demonstrate a role for S-nitrosylation in maintaining the stability of sorghum leaf C4 PEPC, and also evidence the degradation of C3 PEPC by autophagy. C4 PEPC may also be degraded by autophagy. Future experiments will seek to determine if the interaction with PA and subsequent recruitment to membranes are related to the inclusion of PEPC, as occurs with rubisco, in vesicles that are eventually transported into the vacuole for degradation as part of nitrogen recycling. Introducción 32 Rubbo y Radi, 2008). No obstante, la más importante de las modificaciones mediadas por NO es la S-nitrosilación, la unión covalente de un grupo NO a un grupo tiol de un residuo proteico de cisteína para formar un S-nitrosotiol (S-NO) (Spadaro et al., 2010). Asimismo, el NO es soluble en agua y aún más soluble en solventes hidrofóbicos. Por lo tanto, esta molécula puede pasar a través de la doble membrana hidrofóbica por difusión simple, sin necesidad de ningún transportador de membrana especializado, lo que confiere al NO propiedades biológicas únicas como molécula señalizadora (Fancy et al., 2017). Tyr-nitración de proteínas Como se ha mencionado anteriormente, en general la unión de un grupo NO2+ a la cadena lateral de un residuo de tirosina se conoce como Tyr-nitración. En teoría, la Tyr-nitración debería ser reversible para poder influenciar la transducción de señales independientemente de la fosforilación (Kolbert et al., 2017). En un principio, se consideraba una modificación termodinámicamente estable e irreversible, pero posteriormente se describieron mecanismos desnitradores (Kuo et al., 1999) y actividad desnitrasa (Deeb et al., 2013) en animales, y se puso de manifiesto una desnitración no enzimática en el caso del 8-Nitro-cGMP (Akaike et al., 2010). Sin embargo, en plantas no se ha descubierto ninguna enzima desnitrasa hasta el momento, así que la reversibilidad de la Tyr-nitración continúa incierta. Se ha descrito que la Tyr-nitración aumenta la susceptibilidad de las proteínas a la proteólisis (Souza et al., 2000), funcionando como un mecanismo de señalización que puede ser activado en condiciones de estrés (Corpas et al., 2009a; Leitner et al., 2009). Aun así, existen algunos ejemplos en los que esta modificación no afecta a la actividad (Kolbert et al., 2017). Otra consecuencia de la Tyr-nitración es la posible interacción con la fosforilación de tirosinas, aunque no hay ninguna evidencia convicente hasta la fecha, más allá de una función redundante de ambas modificaciones en la α-tubulina (Kolbert et al., 2017). 1.3.3. La S-nitrosilación como modificación postraduccional La S-nitrosilación consiste en la reacción del NO con el átomo de sulfuro de un residuo de cisteína para formar una unión covalente S-NO (Fig. 1). Esta modificación requiere previamente que el NO reaccione con el O2 a través de la formación de óxidos con alto nitrógeno, principalmente N2O3, que luego se va a disociar en NO+. Por eso, convencionalmente, el término S-nitrosilación se refiere al ataque electrofílico del NO+ sobre el tiolato. Si bien, también hay evidencias de que la formación de la unión S-NO resulta del ataque nucleofílico al sulfuro del residuo de cisteína, que es relativamente electropositivo, por parte de NO-; o bien de la reacción entre el radical tiilo (RS·) y el NO· (Wang et al., 2006; Lindermayr y Durner, 2009). Introducción 33 Aparte de estos mecanismos, la transnitrosilación parece ser un proceso importante para explicar la nitrosilación de residuos de cisteína que no presentan tioles en condiciones óptimas (Fig. 1). La transnitrosilación consiste en el cambio directo de NO+ de una proteína S-nitrosilada al tiolato de otra proteína. Este proceso envuelve Snitrosotioles con bajo peso molecular como el nitrosoglutatión (GSNO), el cual se forma primariamente mediante la S-nitrosilación del glutatión, un regulador principal del estado rédox celular. Por lo tanto, el GSNO es un S-NO de bajo peso molecular importante que sirve como reservorio endógeno de NO para la S-nitrosilación en células (Wang et al., 2006). Aunque la mayoría de proteínas contienen residuos de cisteína, solo algunas de ellas son reguladas específicamente por S-nitrosilación in vivo. Esta especificidad se rige por varios factores. En primer lugar, la formación de S-NO puede estar favorecidas en residuos de cisteína más ionizables, como los que están rodeados por residuos de aminoácidos ácidos y básicos (Astier et al., 2011). Basándose en esta observación, Stamler y colaboradores definieron un motivo consenso para la S-nitrosilación (Stamler et al., 1997). De hecho, para que sea un motivo S-nitrosilable vale con que los residuos ácidos o básicos sean adyacentes a la cisteína reactiva en la secuencia primaria, o bien con que se encuentren próximos a ella en la estructura tridimensional de la proteína (Liu et al., 2010). En segundo lugar, los compartimentos hidrofóbicos dentro de las proteínas promueven la S-nitrosilación de los residuos de cisteína que se encuentran en ellos. Este concepto se basa en el hecho de que los centros hidrofóbicos en las proteínas Figura 1. Principios básicos de la S-nitrosilación. La S-nitrosilación ocurre en residuos de cisteína específicos y está mediada por especies reactivas de nitrógeno como el NO·, NO+ o N2O3, así como por agentes transnitrosiladores como el nitrosoglutatión (GSNO). Una vez formados, los S-nitrosotioles son muy lábiles y sensibles a la luz y a los cambios rédox. Además, la desnitrosilación puede ser catalizada enzimáticamente por el sistema tiorredoxina/tiorredoxina reductasa (Trx/TR) (Astier et al., 2011). Sustrato de la S-nitrosilación S-nitrosotiol Agentes Snitrosilantes NO·, NO+, NOx Transnitrosilación enzimática GSNO, Luz, cambios rédox Desnitrosilación enzimática Sistema Trx/TR Introducción 34 tienen la capacidad de concentrar NO y O2 y habilitar así la formación de agentes Snitrosilantes (Seth y Stamler, 2010). Igualmente, a partir de este hecho se desarrolló un novedoso software para la predición de sitios S-nitrosilables (Xue et al., 2010). Más generalmente, cualquier factor que aumente la nucleofilia del átomo de sulfuro de los residuos de cisteína, incluyendo el plegamiento o regulación alostérica de la proteína, tienen a fomentar la S-nitrosilación. Aparte de los aspectos intramoleculares, la colocalización de las proteínas con las fuentes de NO también se asume que contribuye a la especificidad de la S-nitrosilación (Astier et al., 2011). Como la mayoría de las PTMs de proteínas, la S-nitrosilación es un mecanismo reversible. La unión S-NO que se forma es lábil y sensible a la luz y al estado rédox (Fig. 1). En consecuencia, el S-NO puede perderse por la acción de agentes reductores intracelulares como el glutatión, el ascorbato o incluso iones metálicos reducidos. No obstante, atendiendo a la importancia de la S-nitrosilación en numerosos procesos biológicos, la desnitrosilación de proteínas debe estar sujeta a una regulación precisa y controlada. En este sentido, se ha descrito actividad desnitrosilasa en varias enzimas animales, siendo el sistema tiorredoxina/tiorredoxina reductasa (Trx/TR) particularmente relevante (Benhar et al., 2009). En plantas también se ha descrito una actividad desnitrosilasa por parte de tiorredoxinas en arabidopsis (Despres et al., 2003; Tada et al., 2008; Kneeshaw et al., 2014) así como por parte de una enzima denominada GSNO reductasa (GSNOR), siendo en este último caso la desnitrosilación específica para el GSNO, lo que conlleva una reducción de los niveles de GSNO y, por tanto, un descenso en el nivel de S-nitrosilación celular total (Malik et al., 2011). Con respecto a GSNOR, recientemente se ha demostrado que puede ser modificada oxidativamente o S-nitrosilada (Kovacs et al., 2016; Guerra et al., 2016), y que estas modificaciones están reguladas por especies reactivas de oxígeno, existiendo de este modo una intercomunicación entre las especies reactivas de oxígeno y las de nitrógeno (Lindermayr, 2017). Función de la S-nitrosilación en proteínas Se han identificado proteínas S-nitrosiladas que participan en un amplio rango de funciones celulares como el metabolismo, señalización, respuestas a estrés, defensa ante patógenos, homeostasis rédox y arquitectura celular (Astier et al., 2011). Cuando la hemoglobina no simbiótica (AHb1) de arabidopsis es S-nitrosilada, ésta participa activamente en la eliminación de NO durante el estrés nitrosativo de la planta cuando es sometida a hipoxia, sin embargo, esta función no la realiza en otros estreses, lo que indica que es específica de algunos estreses concretos (Perazzolli et al., 2004). La peroxirredoxina II E (PrxIIE) posee actividad ONOOreductasa y su Snitrosilación in vitro hace que pierda su función. In planta, la S-nitrosilación de PrxIIE hace que aumenten los niveles de Tyr-nitración, lo que revela un rol de la modificación Introducción 35 de esta enzima en controlar los niveles endógenos de ONOO- (Romero-Puertas et al., 2007). La proteína de unión a ácido salicílico 3 (SABP3) es una enzima cloroplastídica que, como su nombre indica, se une a ácido salicílico y además tiene actividad anhidrasa carbónica, lo que contribuye a la respuesta de defensa a patógenos. La Snitrosilación de esta proteína disminuye tanto la unión a ácido salicílico como su actividad, lo que hace que la planta sea más sensible al patógeno (Wang et al., 2009b). NPR1 y TGA1 son reguladores clave, controlados por rédox, de la resistencia sistémica adquirida en plantas. Los monómeros de NPR1 interaccionan con la forma reducida de TGA1, que es un factor de transcripción que activa promotores de genes de defensa. La conformación de TGA1 está organizada por cuatro residuos de cisteína. En condiciones oxidantes, TGA1 forma puentes disulfuro entre sus cisteínas, derivando a una conformación inactiva. Sin embargo, cuando TGA1 es S-nitrosilada su conformación es alterada y no se inactiva, pudiendo unirse al ADN y llevando a cabo su función activadora. Además, NPR1 también puede ser S-nitrosilada, y esto hace que la interacción entre ambas proteínas sea más efectiva, lo cual es necesario para que TGA1 lleve a cabo su función (Lindermayr et al., 2010). También hay otros factores de transcripción en arabidopsis, como MYB2 y VND7, de los cuales se ha demostrado justo lo contrario, la S-nitrosilación inhibe la unión al ADN de éste (Serpa et al., 2007; Kawabe et al., 2018). La enzima glicolítica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) es inhibida mediante S-nitrosilación in vitro en arabidopsis y tabaco (Nicotiana tabacum L.) (Holtgrefe et al., 2008; Wawer et al., 2010). También se ha descrito un aumento rápido y pasajero de la S-nitrosilación de la GADPH en respuesta a estrés salino (Wawer et al., 2010). Otras enzimas de las que se ha descrito su inhibición por S-nitrosilación son la Sadenosil-metionina sintetasa 1 (SAMS1), la glicina descarboxilasa (GDC), la ribulosa bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (rubisco), la fructosa-1,6-bisfosfatasa y la fosfoinosítido-dependiente quinasa 1 (PDK1) (Astier et al., 2011; Liu et al., 2017a; Serrato et al., 2018). ABI5 es un factor de transcripción, regulado por ácido abscísico (ABA), que mantiene reprimido el crecimiento de la semilla en germinación de arabidopsis. La Snitrosilación de ABI5 facilita su degradación y estimula la germinación (Albertos et al., 2015), lo que establece un vínculo entre el NO y la hormona ABA. En el caso de GSNOR, descrita previamente, se ha puesto de manifiesto que cuando es S-nitrosilada en respuesta a hipoxia su conformación cambia y su motivo AIM o motivo de interacción con ATG8 (proteína relacionada con la autofagia 8) se hace accesible para la maquinaria autofágica, de manera que se induce su degradación por autofagia selectiva (Zhan et al., 2018). Del mismo modo, este estudio establece in vínculo entre la señalización por NO y la autofagia. Introducción 36 Otra enzima regulada por S-nitrosilación es la NR, de modo que el propio NO producido por ésta puede regularla negativamente. De este modo, Fu y colaboradores establecieron una conexión entre la S-nitrosilación de la NR y la biosíntesis de NO durante ataques de patógenos y estreses abióticos (Fu et al., 2018). Por último, en el caso de la ascorbato peroxidasa (APX) la S-nitrosilación, mediada por estrés salino, aumenta su actividad mientras que la Tyr-nitración la inactiva (Begara-Morales et al., 2014). En general, la S-nitrosilación es una PTM que participa en un amplio rango de procesos metabólicos, de desarrollo, de señalización y de respuesta a estrés en las plantas y sus efectos en las proteínas diana son diversos, pudiendo encontrar efectos opuestos en dos proteínas diferentes. Los ejemplos mencionados muestran que la Snitrosilación de proteínas puede inhibir o aumentar la actividad enzimática, y favorecer su degradación por diferentes vías o impedir su oxidación irreversible, dependiendo de la proteína (Astier et al., 2012). Detección e identificación de proteínas S-nitrosiladas Como se ha mencionado anteriormente, la S-nitrosilación es una modificación covalente muy lábil, lo que dificulta notablemente su detección. Una opción es medir el nivel de NO liberado por la proteína de interés, una vez inmunoprecipitada a partir de extractos proteicos (Mannick y Schonhoff, 2008), aunque la técnica más usada actualmente es la de biotin switch, que ha probado ser una técnica muy eficiente para detectar proteínas S-nitrosiladas in vivo (Jaffrey y Snyder, 2001). La ventaja de este método es que evita el hándicap de la labilidad inherente de los grupos S-NO de las proteínas. En general, la estrategia consiste en reemplazar el grupo S-NO de la proteína S-nitrosilada por una biotina. En el primer paso, se utiliza metil-metano tiosulfonato (MMTS) sobre los extractos de proteínas para éste bloquee las cisteínas libres de las proteínas mediante S-metiltiolación. Esto se hace en presencia de sodio dodecil sulfato y calor (50 °C) para favorecer la desnaturalización de las proteínas y así tener acceso a todos los grupos tiol de todas las cisteínas. En el segundo paso, luego de eliminar el exceso de MMTS, se tratan los extractos con ascorbato, que reduce todas las cisteínas Snitrosiladas, dejando sus grupos tiol libres. En el último y tercer paso, los nuevos tioles libres, que originalmente eran los que estaban S-nitrosilados, son biotinilados con un agente biotinilante específico de sulfhidrilos, que normalmente es N-[6- (biotinamido)hexil]-3’-(2’-piridilditio)propionamida (biotina-HPDP) (Fig. 2). Es importante que los pasos 2 y 3 se lleven a cabo simultáneamente, para permitir un marcaje con biotina inmediato una vez que los tioles son liberados del NO. Una vez eliminado el exceso de ascorbato y biotina-HPDP, las proteínas biotilinadas resultantes pueden detectarse mediante inmunoblot con anticuerpos anti-biotina, o bien para llevar a cabo un análisis más preciso, pueden ser purificadas para detectar una proteína en concreto y/o para ser analizadas mediante espectrometría de masas. Este paso de Introducción 37 purificación puede hacerse mediante resinas de neutravidina o estreptavidina, que son proteínas de unión a biotina, a partir de las cuales se puede eluir por reducción usando β-mercaptoetanol o DTT (Jaffrey y Snyder, 2001; Astier et al., 2011, Lamotte et al., 2015). 1.4. Especies reactivas de oxígeno y carbonilación de proteínas Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas que contienen oxígeno y son químicamente reactivas. El oxígeno es la fuente principal de daños oxidativos en plantas (Apel y Hirt, 2004), y las principales ROS son el anión superóxido (O2-), el radical hidroxilo (·OH), el anión hidroxilo (OH-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el oxígeno singlete (1O2), siendo todos producidos en diversos procesos biológicos (Foyer y Noctor, 2003). Por lo tanto, la respiración aeróbica está indudablemente asociada con la producción de ROS. En condiciones fisiológicas, esta producción es compensada por la detoxificación por parte de antioxidantes. Un aumento de estrés oxidativo sin que haya un incremento paralelo de antioxidantes desencadena inequívocamente daños a componentes celulares como proteínas, lípidos y ADN. Un estrés oxidativo prolongado y por lo tanto acumulación de modificaciones oxidativas en las biomoléculas se vincula con alteraciones en el metabolismo e inducción de apoptosis y muerte celular (Curtis et al., 2013). Existen PTMs de proteínas por parte de numerosas ROS, y se trata de un grupo de modificaciones cuyo descubrimiento es relativamente reciente y que tiene relevancia suficiente como para considerarlo cuando se realiza un análisis proteómico. No obstante, el campo de estudio de la proteómica rédox es complejo precisamente debido al gran número de diversas ROS que pueden formar PTMs y el amplio rango de aminoácidos que son susceptibles a éstas (Bond et al., 2011). Entre las macromoléculas que son sensibles a las ROS, las proteínas son las que más tienden a oxidarse, sobre todo vía carbonilación (Davies, 2005). Esta PTM está considerada un marcador de la oxidación de proteínas y, por lo tanto, del estrés oxidativo. Es originada por la oxidación directa de prolina, lisina, arginina o treonina, siendo la lisina el residuo más propenso a la carbonilación (Rao y Møller, 2011). El efecto inicial de la carbonilación sobre las proteínas consiste en la pérdida de función, y posteriormente desemboca en procesos de degradación de la proteína Figura 2. Representación esquemática de la técnica de biotin switch para la detección de proteínas modificadas por S-nitrosilación. Los tioles libres de las proteínas son bloqueados con MMTS, las uniones S-NO son reducidas con ascorbato para formar nuevos tioles libres, que finalmente son ligados a biotina mediante el agente biotinilante biotina-HPDP para formar proteínas marcadas con biotina (Aroca et al., 2015). Introducción 38 oxidada (Nyström, 2005). En esta degradación participa, como es común, el proteasoma, y parece que ocurre a través del proteasoma 20S sin mediación de ATP ni ubiquitina, en vez del proteasoma 26S (Polge et al., 2009; Kastle y Grune, 2011). Además, las proteínas carboniladas pueden degradarse vía autofagia (Xiong et al., 2007). Como es obvio, estas vías de degradación no sólo eliminan proteínas carboniladas, aunque la vía del proteasoma 20S parece degradar preferentemente proteínas oxidadas antes que proteínas no modificadas (Polge et al., 2009). Por lo tanto, la carbonilación podría representar una vía alternativa para enviar a ciertas proteínas hacia su degradación proteolítica, como por ejemplo proteínas mal traducidas, aberrantes, dañadas, o incluso proteínas que ya no se requieren en las células vegetales (Nyström, 2005). Así, esta modificación podría tener un rol principal en el mantenimiento de la calidad proteica y en la dinámica del proteoma. De este modo, la inducción de mecanismos proteolíticos como la vía del proteasoma 20S en contextos fisiológicos concretos propensos a la carbonilación terminaría reciclando aminoácidos y eliminando proteínas no necesarias más que causando daños oxidativos. Como ya se ha dicho, existen diversos estudios que sugieren que la carbonilación de proteínas podría participar en la transducción de señales. En este sentido, en animales se ha sugerido la existencia de un mecanismo de descarbonilación a través de reducción dependiente de tiol (Wong et al., 2010). Otra hipótesis sería que los péptidos que resultan de la degradación de proteínas carboniladas participaran en la señalización por ROS, actuando como mensajeros secundarios (Møller y Sweetlove, 2010). Sin embargo, tales procesos aún se encuentran sin probar en plantas. 1.4.1. Generación de grupos carbonilos en proteínas Los derivados carbonilo se forman por el ataque oxidativo catalizado por metales a las cadenas laterales de los aminoácidos nombrados anteriormente. Además, se pueden formar grupos carbonilo en residuos de lisina, cisteína e histidina a través de reacciones secundarias con compuestos de carbonilo que son reactivos sobre carbohidratos (productos de glicoxidación), lípidos o los productos finales de la glucosilación o la lipoxidación avanzadas (Nyström, 2005). Cuantitativamente, los productos más importantes de la reacción de carbonilación son el semialdehído glutámico desde arginina y prolina, y el semialdehído aminoadípico desde lisina (Requena et al., 2003). Comparado con otras modificaciones oxidativas, los grupos carbonilo son relativamente difíciles de inducir y se trata de un proceso oxidativo irreversible (Dalle-Donne et al., 2003). Por eso, la forma que tienen las células de deshacerse de las proteínas carboniladas es mediante degradación. La carbonilación inducida por estrés no afecta a todo el proteoma por igual, sino que existe un patrón general de especificidad de carbonilación entre las proteínas de diferentes organismos (Nyström, 2005). Aunque la base molecular de esta especificidad Introducción 39 de algunas proteínas aún no está documentada, es obvio que la oxidación catalizada por metales es un problema intrínseco para proteínas que contienen metales de transición. Por otro lado, algunas proteínas se han clasificado como sensibles a la oxidación principalmente porque se localizan en las proximidades de sitios de generación de ROS (Nyström, 2005). Existen diferentes métodos para detectar y cuantificar grupos carbonilo en las proteínas, y la mayoría de ellos incluyen la derivatización del grupo carbonilo con 2,4dinitrofenilhidracina (DNPH) (Dixon, 1964) y la posterior inmunodetección de la hidrazona resultante con anticuerpos (Levine, 2002). 1.4.2. Carbonilación de proteínas en plantas En plantas no se conoce mucho acerca de la carbonilación de proteínas y su rol en los procesos fisiológicos de las plantas. Aun así, esta PTM se ha identificado en todas las etapas del ciclo de vida de la planta (Lounifi et al., 2013). Entre las proteínas de plantas que mostraron una alta sensibilidad a la carbonilación se encuentran la rubisco y las proteínas de almacenamiento en semillas 12S-cruciferinas (Johansson et al., 2004; Job et al., 2005). Varias proteínas carboniladas previamente caracterizadas en mamíferos, levaduras y bacterias también se encontraron carboniladas en plantas, lo que apoya la hipótesis de que la carbonilación de proteínas es algo más que un proceso aleatorio, y que participa en el control de funciones biológicas comunes a diferentes organismos (Lounifi et al., 2013). Varios estudios se han enfocado en la biología de la semilla, descubriendo una implicación de la carbonilación en las transiciones fisiológicas de ésta. En concreto, se ha descrito un aumento de proteínas carboniladas en semillas en germinación en comparación con las semillas latentes, siendo este aumento paralelo a un incremento de ROS (Job et al., 2005; Oracz et al., 2007, Arc et al., 2011). De hecho, si se trata a semillas latentes con donadores de ROS, la dormancia se ve suavizada (Oracz et al., 2007; Leymarie et al., 2012), y mutantes deficientes en actividad NADPH oxidasa producen más semillas latentes que el fenotipo silvestre (Leymarie et al., 2012). La carbonilación de proteínas también parece ser un buen marcador del envejecimiento de semillas, que es lo que les ocurre cuando se exponen a un almacenamiento prolongado y se ven deterioradas. En semillas de arabidopsis y arroz (Oryza sativa L.), se ha descrito que la acumulación de proteínas carboniladas incrementa progresivamente, paralelamente a la pérdida de la capacidad de germinar (Tesnier et al., 2002; Rajjou et al., 2008; Kalemba y Pukacka, 2014). Después de la imbibición, la germinación de las semillas de arabidopsis conlleva cambios drásticos en los patrones de carbonilación. La mayoría de proteínas carboniladas presentes en semillas secas muestran una menor carbonilación en esta etapa (Job et al., 2005; ElMaarouf Bouteau y Bailly, 2008), mientras que otras proteínas abundantes y no Introducción 40 carboniladas en semillas secas incrementan su grado de carbonilación, probablemente como parte del cambio metabolico que tiene lugar durante la germinación (Job et al., 2005). Posteriormente a la germinación, el grado de carbonilación de proteínas parece aumentar a medida que las hojas de la roseta de arabidopsis se hacen más viejas hasta el final del desarrollo vegetativo (Johansson et al., 2004) y también se ha encontrado un aumento en la carbonilación durante la maduración del fruto del kiwi (Minas et al., 2012), hechos que indican que la carbonilación podría actuar como señal en las transiciones fisiológicas en plantas. Otra implicación de la carbonilación se ha visto en el ciclo de Calvin, donde modifica a ciertas enzimas inactivándolas bajo condiciones de estrés, pudiendo participar en la adaptación de las plantas al estrés a través de la inactivación del ciclo de Calvin (Lounifi et al., 2013). También se ha descrito una mayor cantidad de proteínas carboniladas en la mitocondria que en cloroplastos o peroxisomas, lo que sugiere que éstas son más susceptibles al daño oxidativo (Lounifi et al., 2013). En cuanto a la especificidad, aunque en general se piensa que esta modificación afecta a las proteínas indiscriminadamente, se han encontrado mediante análisis de secuencia motivos preferenciales de carbonilación. Según estos autores, la carbonilación ocurriría principalmente en regiones que posean al menos tres residuos arginina, lisina, prolina o treonina dentro de un grupo de cuatro aminoácidos, o bien cuatro de ellos dentro de un grupo de siete (Maisonneuve et al., 2009; Rao y Møller, 2011). En arabidopsis, todas las proteínas carboniladas identificadas poseen al menos un motivo que concuerda con el descrito (Rao y Møller, 2011). Sin embargo, la conformación de la proteína también puede influir en la susceptibilidad de la proteína y se ha caracterizado que en una misma proteína, la carbonilación ocurre preferentemente en un tipo de subunidad a pesar de que todos los tipos contengan el motivo de carbonilación (Job et al., 2005; Rajjou et al., 2008). Se conoce que tanto el estrés abiótico como el biótico inducen la producción de ROS en plantas, y por tanto ambos conllevan un posterior estrés oxidativo (Apel y Hirt, 2004). Por lo tanto, una respuesta temprana de la planta al estrés se asocia con un estallido oxidativo que desemboca en la carbonilación de proteínas (Oracz et al., 2007; Xiong et al., 2007). Se ha descrito un aumento en la carbonilación de proteínas en condiciones de estrés hídrico, salinidad, toxicidad por metales pesados, elevado CO2, radiación gamma y estreses bióticos (Lounifi et al., 2013; Mano et al., 2014). Además, el grado de carbonilación está directamente correlacionado con el tiempo de exposición al estrés y la cantidad de ROS generadas, por lo cual se puede considerar a esta PTM como un importante indicador de la severidad del estrés oxidativo en plantas (Lounifi et al., 2013). Introducción 41 En definitiva, la carbonilación actúa como indicador del equilibrio entre el estrés oxidativo y la capacidad de la planta de contrarrestarlo. Inicialmente, esta modificación se encarga de inactivar las proteínas que no son esenciales para sobrevivir. Sin embargo, si las enzimas detoxificadoras se ven sobrepasadas, la acumulación de ROS va progresivamente apagando las actividades enzimáticas que queden y, en último lugar, contribuyen a la muerte celular. 1.4.3. Interacción entre el NO y la carbonilación En primer lugar, la cisteína se encuentra entre los residuos susceptibles de ser tanto S-nitrosilados como carbonilados, por lo tanto las ROS y el NO podrían competir por los residuos de cisteína y por eso es probable que existe un vínculo entre la oxidación y la nitrosilación. En mamíferos se ha observado que la oxidación podía debilitar la plasticidad sináptica mediante la inhibición de la S-nitrosilación de manera competitiva (Kakizawa et al., 2012). Del mismo modo, hay evidencia de que esta interacción también ocurre en plantas. Por ejemplo, una aplicación de NO exógeno o bien antes o durante el estrés abiótico previene la carbonilación inducida por el estrés. En las semillas de Antiaris toxicaria Lesch. el NO mejora su resistencia a deshidratación mediante la activación de enzimas de la vía ascorbato-glutatión, lo que impide la acumulación de ROS y fomenta la S-nitrosilación frente a la carbonilación (Bai et al., 2011). De forma similar, en hojas de cítricos tratadas con sal, el incremento observado en proteínas carboniladas se previno con un pretratamiento tanto de donadores de NO como de H2O2 (Tanou et al., 2009, 2012), y se han localizado en estas plantas varias proteínas –implicadas en fotosíntesis, defensa y energíaque pueden ser modificadas por ambos tratamientos, lo que indica un fuerte solapamiento entre estas dos respuestas (Tanou et al., 2010). Tanou y colaboradores sugirieron que los cambios conformacionales inducidos en ciertas proteínas por la S-nitrosilación podrían bloquear la estructura de éstas en un estado en el que no sería sensible a la carbonilación irreversible inducida por ROS (Tanou et al., 2009). Esta hipótesis coincide con los resultados existentes en células humanas que muestran que la S-nitrosilación puede aportar protección en las proteínas contra el estrés oxidativo (Sun et al., 2007). Una explicación alternativa sería que la S-nitrosilación impide la producción de ROS y esto suprime la carbonilación. En este sentido, se ha puesto de manifiesto que el NO puede detoxificar el radical ·OH, la ROS más perjudicial (Beligni y Lamattina, 2002). Otra opción, que no excluye a las demás, es que la S-nitrosilación pueda actuar como un sistema de defensa antioxidante en plantas ya que muchas enzimas antioxidantes contienen cisteínas activas, tales como la catalasa, la glutatión peroxidasa, la glutatión reductasa, la ascorbato peroxidasa y la tiorredoxina (Netto et Introducción 48 Baldrich et al., 2017), y su expresión en semillas es muy baja aunque se ha detectado la presencia del transcrito en ellas (Ruiz-Ballesta et al., 2016). Las PTPCs de sorgo caracterizadas hasta el momento tienen estructuras primarias y propiedades funcionales y reguladoras similares, por lo que las diferencias entre ellas se establecen a nivel de expresión en los distintos órganos de la planta y en respuesta a diferentes estímulos (Lepiniec et al., 1993). Por el contrario, es la BTPC la que presenta mayor divergencia respecto a sus homólogas, tanto estructural como funcional (O’Leary et al., 2009; Peng et al., 2012; Ting et al., 2017). La familia génica que codifica PEPC en la planta modelo Arabidopsis thaliana está compuestas por cuatro genes. Según el análisis de la secuencia, los genes AtPPC1, AtPPC2 y AtPPC3 codifican una PTPC, mientras que AtPPC4 codifica una BTPC (Sánchez y Cejudo, 2003; Sánchez et al., 2006). Los genes de PEPC en arabidopsis muestran una expresión diferencial en función del órgano de la planta, y también en respuesta a estreses ambientales. De esta manera, el transcrito de AtPPC1 se encuentra en todos los órganos y AtPPC2 y AtPPC3 se expresan mayoritariamente en hojas y raíces, respectivamente. Sin embargo, la expresión de AtPPC4 se localiza en flores y silicuas, y es prácticamente indetectable en hojas y raíces (Sánchez y Cejudo, 2003; Feria et al., 2016), aunque en sí se ha descrito un aumento de su expresión en raíces en condiciones de estrés salino e hídrico (Sánchez et al., 2006). Figura 4. Filogenia de la familia génica de la PEPC. “Sb” indica genes de Sorghum bicolor, “Sv” indica genes de Sorghum vulgare, “Os” indica genes de Oryza sativa y “Zm” indica genes de Zea mays. Las topologías fueron generadas como consenso de 100 réplicas de alineamientos por bootstrap usando el programa MEGA (adaptado de Paterson et al., 2009). Introducción 49 2.3. Funciones de la PEPC 2.3.1. Reacción enzimática de la PEPC La PEPC cataliza la β-carboxilación irreversible del fosfoenolpiruvato (PEP) en presencia de HCO3para formar oxalacetato y fosfato inorgánico (Pi), usando Mg2+ como cofactor. Posteriormente, el oxalacetato es rápidamente convertido en malato mediante la enzima malato deshidrogenasa. El malato es considerado el primer compuesto estable de la reacción, siendo una molécula de gran interés al transportar carbono y poder reductor (Chollet et al., 1996; Lepiniec et al., 1994). El mecanismo de reacción más aceptado consta de tres fases (Fig. 5). En la primera fase, se produce anión enolato de piruvato y carboxifosfato a partir de PEP y HCO3en una reacción parcialmente reversible. En la segunda fase, el anión enolato se isomeriza y el carboxifosfato es descompuesto en dióxido de carbono (CO2) y Pi dentro del sitio activo de la enzima. En la tercera y última fase, el CO2 realiza un ataque electrofílico al anión enolato para formar el oxalacetato, liberándose el Pi irreversiblemente (Andreo et al., 1987; Janc et al., 1992; Chollet et al., 1996; Izui et al., 2004). 2.3.2. La PEPC en la fotosíntesis de tipo C4 y CAM Todos los eucariotas fotosínteticos reducen el CO2 fotosintético a carbohidratos mediante el ciclo de Calvin o ciclo C3, cuya primera reacción está catalizada por la rubisco, generando como primer producto estable un compuesto de tres átomos de carbono denominado ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) (Hatch y Slack, 1970). En el caso de las plantas C4 y CAM, se produce un ciclo adicional con nuevas rutas bioquímicas, donde la enzima clave y responsable de la fijación inorgánica del carbono es la PEPC, Figura 5. Representación química del mecanismo de reacción de la PEPC. OAA: oxalacetato; MDH: malato deshidrogenasa (adaptada de Izui et al., 2004). Introducción 50 desarrollando así un exitoso mecanismo concentrador de CO2 alrededor de la rubisco. Las plantas C4 y CAM han evolucionado convergentemente para adaptarse a una reducción de CO2 en el medioambiente (Christin et al., 2007; Raven et al., 2008; Christin et al., 2014), y aunque los mecanismos concentradores de cada planta son diferentes, los ciclos bioquímicos son similares (Osmond, 1978; Hatch, 1987). De esta manera, estas plantas reducen la fotorrespiración y el gasto energético asociado, consiguiendo un mayor rendimiento fotosintético y una mayor eficiencia en el uso del agua y los nutrientes (Nimmo, 2000; Edwars et al., 2001). En la primera fase de la asimilación fotosintética del CO2, la isoenzima fotosintética de la PEPC, que se encuentra en concentraciones muy altas en el citosol de las células del mesófilo de las plantas C4 y CAM, cataliza la reacción de carboxilación produciendo un ácido de 4 átomos de carbono que posteriormente es descarboxilado generando un compuesto de 3 átomos de carbono y CO2 libre. Este último CO2 será el que servirá de sustrato para fijación secundaria por parte de la rubisco (Gil, 1995; Sage et al., 2012). En las plantas CAM se produce una separación temporal entre ambas carboxilaciones, mientras que en las plantas C4 la separación es espacial puesto que las carboxilaciones suceden en tipos celulares distintos: las células de la vaina, en las que se localiza la rubisco; y las células del mesófilo, que se disponen en una corona concéntrica a su alrededor y donde se localiza la PEPC. Esto da lugar a una anatomía foliar característica de las plantas C4 denominada anatomía Kranz o en corona (Haberlandt, 1884; Sage et al., 2012). En la ruta C4, el oxalacetato es rápidamente reducido a malato por la enzima NADP+-malato deshidrogenasa en los cloroplastos de la célula del mesófilo, o transaminado a aspartato en el citosol por la aspartato transaminasa, en función de la especie C4. Posteriormente, los ácidos C4 (malato o aspartato) son transportados a las células de la vaina donde son descarboxilados a piruvato o alanina, liberándose el CO2 en el interior de estas células. La reacción de descarboxilación pueden llevarla a cabo tres enzimas distintas que definen los tres subtipos fisiológicos de plantas C4: la enzima málico dependiente de NADP+ (tipo NADP-ME), la enzima málico dependiente de NAD+ (tipo NAD-ME) o la PEP-carboxiquinasa (tipo PCK) (Azcón-Bieto y Talón, 2008; Sage et al., 2012). En el sorgo, la descarboxilación del malato la realiza la enzima málico dependiente de NADP+. El CO2 liberado en la reacción es fijado por la rubisco, y el piruvato regresa a los cloroplastos de las células del mesófilo para regenerar el aceptor primario, el PEP, por acción de la piruvato ortofosfato diquinasa (PPDK) (Fig. 6). Estas modificaciones en el metabolismo fotosintético confieren a las plantas C4 una serie de propiedades que, en conjunto, se denominan síndrome Kranz. Entre estas propiedades destacan unos bajos niveles de fotorrespiración, un punto de compensación de CO2 mínimo, insensibilidad de la fotosíntesis a las variaciones en las concentraciones de O2 y CO2 del medio e insaturación de las tasas fotosintéticas por la intensidad lumínica. Introducción 51 Además, sus enzimas tienen elevados óptimos térmicos y son plantas con una mayor eficiencia en el uso del nitrógeno y del agua en comparación con las plantas C3 (Gil, 1995). En el metabolismo fotosintético CAM, durante la noche cuando las tasas de evapotranspiración son bajas, la PEPC cataliza la fijación del CO2 atmosférico y/o respiratorio en el citosol. El producto final es el ácido málico que se almacena en la gran vacuola central. Durante el día, los estomas están cerrados y la rubisco fija el CO2 que se genera en la descarboxilación del málico sintetizado por la PEPC durante la noche (Borland y Taybi, 2004). El cierre estomático diurno confiere a estas plantas una altísima eficiencia en el uso del agua. 2.3.3. La PEPC en otros contextos metabólicos En plantas superiores, la PEPC se localiza en hojas, raíces, semillas y nódulos (O'Leary, 1982). Esta naturaleza ubicua de la enzima se justifica, probablemente, por la naturaleza de su producto final estable, el malato, que puede ser usado como fuente de carbono y poder reductor en numerosas vías metabólicas. Figura 6. Representación de la vía fotosintética C4 de tipo NADP-ME. El CO2 entra en la célula del mesófilo y genera HCO3 - a través de la anhidrasa carbónica en el ambiente acuoso del citosol. Mediante la PEPC, el ion bicarbonato reacciona con el PEP para formar un ácido de cuatro carbonos (C4), el oxalacetato (OAA). Éste es convertido mediante la málico deshidrogenasa (MDH) en un segundo ácido C4, el malato, que es transportado a la célula de la vaina. Allí, el malato es descarboxilado por la NADP-ME y el CO2 liberado es fijado por la rubisco en el ciclo de Calvin. El ácido C3 (piruvato) producido en la descarboxilación del malato se transporta de vuelta a la célula del mesófilo para regenerar el PEP (Sage et al., 2012). Introducción 52 Debido a la baja Km de la PEPC por el sustrato bicarbonato (en el rango de μM), esta enzima interviene, como norma general, en la economía del carbono de la célula. La PEPC participa en multitud de contextos fisiológicos incluyendo el movimiento estomático (Outlaw, 1990), la homeostasis del pH celular y la absorción y transporte de iones en las raíces (Ben-Zioni et al., 1970). También interviene en la fijación de nitrógeno atmosférico por leguminosas, en la interacción del tubo polínico y el estilo, en la maduración y germinación de la semilla y en la maduración del fruto (Chollet et al., 1996; Echevarría y Vidal, 2003; Izui et al., 2004; O'Leary et al., 2011b; Ruiz-Ballesta et al., 2014, 2016). Además, la PEPC tiene una función anaplerótica consistente en la reposición de intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs, especialmente cuando la demanda de esqueletos carbonados para la biosíntesis de aminoácidos es alta (Huppe y Turpin, 1994; Sweetlove et al., 2010). Esta función es especialmente importante en tejidos no fotosintéticos (Latzko y Kelly, 1983), tanto de plantas C3 como C4 (Giordano, 2001). Durante la síntesis de aminoácidos, los ácidos orgánicos procedentes del ciclo de Krebs son transportados desde la mitocondria al estroma del cloroplasto o al citosol para la asimilación de NH4+ en el ciclo GS/GOGAT, disminuyendo la tasa de regeneración de oxalacetato y/o malato en la mitocondria (Champigny y Foyer, 1992). En este sentido, la reacción catalizada por la PEPC puede ser considerada como el inicio de una rama de la ruta glucolítica (Fig. 7). Durante la reducción del nitrato, que consume protones, la actividad PEPC aumenta el contenido de ácidos orgánicos, lo que reduce la alcalinización y contribuye a la homeostasis del pH citosólico. Además, el oxalacetato producido por la PEPC puede ser usado para transportar hasta el citosol el poder reductor requerido por la nitrato reductasa, a través de la bomba oxalacetato/malato que se encuentra entre el cloroplasto y el citosol (Oaks, 1994). También se observa una clara relación entre la actividad PEPC y la actividad glutamina sintetasa, estando esta última controlada por los niveles de glutamina (Dever et al., 1995), y la expresión de la PEPC coordinada con la nitrato reductasa (Müller et al., 2001). Todo esto pone en evidencia una coordinación entre el metabolismo del carbono y del nitrógeno regulada de forma precisa para mantener una adecuada relación carbono/nitrógeno. Por otro lado, la PEPC contribuye a facilitar una rápida carboxilación anaplerótica del PEP para ayudar en la síntesis y exudación masiva de ácidos orgánicos. Estos ácidos orgánicos son necesarios en el metabolismo de las raíces de esta planta cuando se ven sometidas a estrés por deficiencia de fosfato, hierro y toxicidad por aluminio (López-Millán et al., 2000; Shane et al., 2013; Arias-Baldrich et al., 2015; Feria et al., 2016; Doshi et al., 2017). Diversos trabajos de investigación de nuestro grupo han aportado información referente a las funciones de las diversas isoenzimas PEPC en contextos metabólicos distintos de la fotosíntesis. En relación con las respuestas al déficit de fósforo, el Introducción 53 análisis de líneas SALK de arabidopsis carentes de isoenzimas PEPC o PEPCK específicas ha puesto de manifiesto que la respuesta en raíces está relacionada con las isoenzimas PPC3 y PPCK2 (Feria et al., 2016). Tanto en salinidad (Pérez-López et al., 2018) como en estrés por amonio (Arias-Baldrich et al., 2017) la actividad PEPC aumentó en las raíces de sorgo, y esa respuesta está relacionada específicamente con la isoenzima PPC3. Esa misma isoenzima tiene una gran relevancia durante el desarrollo y germinación de las semillas de sorgo (Ruiz-Ballesta et al., 2016). Además, en arabidopsis la carencia de isoenzimas PEPC específicas causó alteraciones del metabolismo del carbono y el nitrógeno, acumulación de nitrato y aminoácidos, disminución de proteínas, descenso del peso de las semillas, retraso en la germinación, reducción de intermediarios del ciclo de Krebs y decremento de la relación ácidos grasos poli-insaturados/no poli-insaturados (Sánchez et al., 2015). Figura 7. Interacciones entre el metabolismo del carbono y del nitrógeno. El esquema destaca el importante papel de dos enzimas al final de la glucólisis citosólica de las plantas, la PEPC y la piruvato quinasa citosólica (PKc), al controlar las provisiones de sustratos respiratorios para la mitocondria así como para generar los intermediarios requeridos para la asimilación de amonio en la vía GS/GOGAT de los plástidos y para la aspartato amino transferasa en el citosol. El control coordinado de la PEPC mediante efectores alostéricos constituye un mecanismo para la regulación del flujo glucolítico y el reparto de PEP durante la asimilación de amonio. Además, también se señala la capacidad del PEP de controlar la glucólisis (O'Leary et al., 2011b). Introducción 54 Los cambios en el reparto del carbono en el punto de ramificación del PEP son cruciales para permitir a las células vegetales sincronizar su metabolismo con las variaciones en las condiciones ambientales. El control de la actividad PEPC ocurre a niveles transcripcionales/traduccionales y postraduccionales. Diferentes estudios han puesto en evidencia que un suplemento de azúcares exógenos, y el fosfato y el nitrógeno disponibles influyen en la abundancia y el estado de fosforilación de la PEPC en diferentes plantas (Duff et al., 1995; Sima et al., 2001; Nakagawa et al., 2003; Rajagopalan et al., 2004; Murmu et al., 2007; Chen et al., 2008; Feria et al., 2008; Gregory et al., 2009; O'Leary et al., 2011b). 2.4. Regulación de la actividad PEPC En la regulación de la actividad PEPC se establecen principalmente dos niveles de control, uno a nivel transcripcional y otro a nivel postraduccional. 2.4.1. Regulación trancripcional A nivel transcripcional, la PEPC está regulada por varios factores destacando la luz como uno de los principales y mejor conocidos. Esta respuesta, que se da tanto en plantas C4 (Thomas et al., 1994; Lepiniec et al., 2003) como en plantas C3 (Matsuoka y Yamamoto, 1989), está mediada por el fitocromo y se produce en la transición de planta etiolada a planta verde. La luz también afecta a la fluctuación circadiana de los niveles de ARNm de PEPC. Sin embargo, estas fluctuaciones no se ven reflejadas en la cantidad de proteína, que se mantiene constante (Thomas et al., 1990). El fitocromo también participa en la expresión de la PEPC en la planta CAM facultativa Mesembryanthemum crystallinum L. (Cushman y Bohnert, 1999). Otros factores ambientales como temperatura, salinidad, estrés hídrico o la aplicación exógena de ABA aumenta la expresión de la PEPC en esta planta (Herppich et al., 1992). En sorgo, se han descrito aumentos de expresión de la PEPC en estrés hídrico, salinidad y estrés por amonio (Buchanan et al., 2005; Arias-Baldrich et al., 2017). En plantas de tipo C3 como en la cebada (Hordeum vulgare L.), el estrés salino y el ABA reducen la asimilación de CO2, el contenido en clorofilas, proteínas y la actividad rubisco y, por el contrario, se estimula la actividad PEPC (Popova et al., 1995). En plántulas de trigo (Triticum aestivum L.), la salinidad y el estrés por LiCl, además de otros estreses como hipoxia o frío, también provocan un aumento en la expresión de la PEPC en la raíz, aunque se desconoce si el ABA interviene en este efecto (González et al., 2003). En arabidopsis, la salinidad y la deficiencia de P inducen un aumento en la expresión de la PEPC, siendo este aumento más marcado en raíces que en parte aérea (Feria et al., 2016). Finalmente, otras hormonas como las citoquininas, en conjunción o no con el balance de nitrógeno de la planta, también pueden modificar la expresión de la PEPC (Peters et al., 1997). Introducción 55 2.4.2. Regulación postraduccional Regulación alostérica La mayoría de las PTPCs están sujetas a regulación alostérica por una amplia variedad de metabolitos. Sin embargo, las propiedades cinéticas y alostéricas específicas de la enzima son variables y parecen estar adaptadas a las funciones fisiológicas de cada isoenzima. Un buen ejemplo de esta adaptación es que en las PEPCs de clase 1 de las plantas C4 los valores de IC50 (malato) y Km (PEP) son mayores con respecto a los de las enzimas de las plantas C3 (Svensson et al., 2003; O'Leary et al., 2011b). En maíz, si se compara una PEPC de tipo C3 de raíz con la fotosintética, esta última tiene unos valores de Km, a pH 7,3, que es 30 veces superior a la de raíz para el PEP, 10 veces superior para el Mg2+ y el doble para el HCO3- (Dong et al., 1998). Generalmente las PTPCs de dicotiledóneas son activadas alostéricamente por glucosa-6-fosfato e inhibidas por malato o aspartato, especialmente a valores de pH subóptimos (del orden de 7,1 a 7,3) que se aproximan al valor del pH citosólico (Andreo et al., 1987; Echevarría et al., 1994). La glucosa-6-fosfato incrementa la Vmax de la PEPC, produciendo una bajada de la Km para el PEP y reduciendo la sensibilidad de la enzima al inhibidor malato (Echevarría et al., 1994). Su lugar de unión se encuentra en un bolsillo en la estructura cercano al sitio activo y que contiene un sulfato de unión que interacciona con 4 aminoácidos, siendo uno de ellos perteneciente a la subunidad adyacente (Izui et al., 2004). El sitio de unión para el malato y aspartato, sin embargo, se encuentra cerca del extremo C-terminal del barril β, interaccionando directamente con cuatro aminoácidos, entre los que se encuentran una arginina que es esencial para el sitio activo, una asparagina que forma parte de la cola C-terminal de la enzima y una arginina que en PEPCs de tipo C4 se encuentra sustituida por glicina de modo que la inhibición es menor (Matsumura et al., 2002; Paulus et al., 2013). En plantas monocotiledóneas, además de los metabolitos citados anteriormente, aminoácidos neutrales como glicina, alanina y serina también son activadores alostéricos (Nishikido y Takanashi, 1973; Stiborová y Leblová, 1985; Garson y Gray, 1991; Bandarian et al., 1992; Tovar-Méndez et al., 2000; Izui et al., 2004; Güemez-Toro et al., 2012). Recientemente se ha descrito que la interacción de estos aminoácidos neutrales tiene lugar en un lugar cercano pero diferente al sitio de unión de la glucosa6-fosfato y que interactúa a la vez con dos subunidades de un dímero dentro del tetrámero. Esta interacción sólo ocurre en la PEPC C4 de plantas monocotiledóneas, específicamente en el aminoácido en posición 100 que puede ser una serina o una glicina, mientras que en plantas dicotiledóneas se trata de una lisina. Además, en condiciones fisiológicas donde el Mg2+ y el PEP se encuentran por debajo de la concentración de saturación, la activación alostérica por glicina o serina parece ser crucial para que se alcancen los niveles típicos de una PEPC C4 ya que son capaces de Introducción 56 activar llevar a la enzima a los mismos niveles de actividad que la glucosa-6-fosfato, e incluso contrarrestar el efecto inhibidor del malato en un grado mayor que la glucosa6-fosfato (González-Segura et al., 2018). Por el contrario, la PEPC de E. coli presenta una regulación más compleja, siendo activada por acetil-coenzima A, fructosa-1,6-bisfosfato, ácidos grasos de cadena larga y guanosina-3'-difosfato-5'-difosfato, e inhibida por aspartado o malato (Izui et al., 1981, 2004). La PEPC de clase 2, y por lo tanto las BTPCs tiene distintas propiedades ya que es bastante menos sensible a los inhibidores alostéricos comparada con la PEPC de Clase 1 (O'Leary et al., 2009; O'Leary et al., 2011; Ting et al., 2017). Existe un modelo propuesto de activación competitiva de la PEPC, en donde los activadores alostéricos como la glucosa-6-fosfato se unen al sitio activo de una subunidad, induciendo un cambio conformacional y activando posteriormente a las demás subunidades (Tovar-Méndez et al., 1998; Schlieper et al., 2014). La afinidad de la enzima por el PEP y el Mg2+ es notablemente mayor a un pH entre 7 y 8, siendo el pH óptimo in vitro de 8 (Gadal et al., 1996; Osuna et al., 1996). Por lo tanto, in vivo, la enzima va a depender del balance entre los efectores negativos y positivos y de la modulación por el pH citosólico (Gadal et al., 1996). La mayoría de factores que interaccionan y actúan en la regulación de la PEPC son opuestos al efecto negativo ejercido por el malato y el aspartato (Jeanneau et al., 2002). La regulación de la actividad de la PEPC está influenciada por el estado oligomérico de la enzima, siendo el tetrámero la conformación óptima (Chollet et al., 1996). Los cambios en el estado de oligomerización in vitro se asocian a factores tales como la dilución de la enzima, cambios en la concentración de sales en el medio de ensayo, la concentración de malato o baja temperatura. Sin embargo, la contribución real de esta regulación a la actividad de la enzima in vivo no se conoce. Sí hay evidencias de que en plantas CAM es la conformación tetramérica la que se encuentra actuando durante la fase nocturna de fijación de CO2 (Chollet et al., 1996). Además, la PEPC podría estar sometida a una regulación rédox (Iglesias y Andreo, 1984; Chardot y Wedding, 1992) debido a la abundancia de cisteínas, algunas altamente conservadas, en todas las PEPCs (Chollet et al., 1996). No obstante, hasta la fecha no se ha descrito ninguna cascada de óxido-reducción tipo ferredoxinatiorredoxina implicada en la regulación de la PEPC. También se ha descrito que compuestos como el ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol o glutatión cambian débilmente la sensibilidad al malato in situ. Sin embargo, ninguno de estos compuestos tiene efecto in vitro. Este efecto no se debe a ningún proceso mediado por tiorredoxina o dependiente de fosforilación. Se ha propuesto que el glutatión podría contribuir a la protección de la enzima frente al malato debido a que es un compuesto tiólico Introducción 57 fisiológico que se encuentra en el citosol, principalmente en estado reducido (Pierre et al., 2004). Regulación por fosforilación reversible El fenómeno de fosforilación reversible de la PEPC se puso en evidencia por primera vez en la planta CAM Bryophyllum fedtschenkoi (Raym.-Hamet & H. Perrier) Lauz. (Nimmo et al., 1984), y posteriormente en maíz (Budde y Chollet, 1986) y sorgo (Guidici-Orticoni et al., 1988). Todas las PTPCs, fotosintéticas y no fotosintéticas, están sometidas a regulación por fosforilación reversible en un residuo de serina localizado en el extremo N-terminal de la proteína. La fosforilación la lleva a cabo una pequeña proteína con actividad quinasa denominada fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa (PEPCK), de la que hay varias isoformas según la especie vegetal, y conlleva una activación enzimática a pH fisiológico gracias a que disminuye la sensibilidad de la PEPC a sus inhibidores alostéricos a la par que aumenta su afinidad por el PEP y la sensibilidad a sus activadores alostéricos (Echevarría y Vidal, 2003; Nimmo, 2003). La serina fosforilable se encuentra en el motivo E/DR/KxxS*IDAQL/MR, común a todas las PTPCs secuenciadas hasta la fecha, pero ausente en las BTPCs y en la PEPC de E. coli (Lepiniec et al., 1994; Chollet et al., 1996; Kai et al., 1999; Sánchez y Cejudo, 2003; O'Leary et al., 2011b). Los múltiples estudios realizados sobre dicha PTM, incluyendo la clonación de la PEPCK de plantas C3, C4 y CAM, han contribuido a que la regulación por fosforilación reversible de la PEPC sea, hasta la fecha, uno de los ejemplos mejor conocidos de regulación por fosforilación de una enzima en el reino vegetal. La fosforilación de la PEPC fotosintética de sorgo produce un débil efecto sobre la Km de la enzima pero duplica la Vmax, aumenta siete veces la Ki para su inhibidor malato y 4,5 veces la Ka para la glucosa-6-fosfato en condiciones de pH y concentración de PEP subóptimos (Echevarría et al., 1994; Duff y Chollet, 1995). La PEPC es desfosforilada por una proteína fosfatasa de tipo 2A (PP2A) (Carter et al., 1990). Las variaciones en el estado de fosforilación de la PEPC parecen ser consecuencia de fluctuaciones en la actividad PEPCK, ya que los niveles de actividad fosfatasa se mantienen relativamente constantes en las transiciones luz-oscuridad (Echevarría et al., 1990). Existen diferentes estudios de mutagénesis dirigida para estudiar esta fosforilación. En la PEPC C4 recombinante de sorgo se puso de manifiesto que el efecto de la fosforilación puede ser simulado por la introducción de una carga negativa sustituyendo el residuo de serina del extremo N-terminal de la enzima por ácido aspártico. La incorporación de dicha carga negativa se traduce igualmente en un aumento en la velocidad catalítica y una disminución de la sensibilidad al malato (Wang et al., 1992; Duff y Chollet, 1995; Chollet et al., 1996). Otras mutaciones como la sustitución de un residuo básico de lisina, situado 3 aminoácidos antes de la serina Introducción 64 También se conoce que al menos una parte del total de proteína PEPC es degradada mediante el sistema poliubiquitina-proteasoma (Schulz et al., 1993). En Vicia faba L., la PEPC de las células guarda son proteolizadas mediante este mismo sistema durante el cierre estomático, en una vía de señalización en la que participa el inositol1,4,5-trifosfato, que a su vez es inducido por ABA (Klockenbring et al., 1998). Aunque el efecto principal de la salinidad en hojas de sorgo es aumentar la actividad PEPCK, también activa mecanismos que disminuyen la proteólisis de la PEPC (García-Mauriño et al., 2003). Como ya se ha mencionado, las PTMs relacionadas con el NO regulan en muchos casos la estabilidad de las proteínas. En este sentido, la salinidad aumenta la síntesis de NO específicamente en las células del mesófilo de las hojas de sorgo (Monreal et al., 2013b). Dicho fenómeno podría ser el responsable del cambio de estabilidad de la PEPC. Por otro lado, nuestro grupo ha caracterizado la degradación de la PEPC C4 por una cisteín-proteasa en un proceso que depende de la exposición del extremo Cterminal de la proteína (Gandullo, 2010). El extremo C-terminal de la PEPC tiene una secuencia altamente conservada que incluye los últimos 19 aminoácidos normalmente inmersos en un bolsillo hidrofóbico de la proteína y, por tanto, poco expuestos. Dicha secuencia regula la degradación de la PEPC por la citada proteasa. La interacción del PA con la PEPC aumenta la exposición del extremo C-terminal, por lo que representa un posible mecanismo de activación in vivo de la proteólisis de la PEPC. Ésta podría estar asociada con el recambio de PEPC degradada en condiciones de estrés que, en muchos casos, se ha documentado que causan la activación de la fosfolipasa D y la síntesis de PA. 3. AUTOFAGIA EN PLANTAS La autofagia es un mecanismo universal que poseen las células eucariotas para reciclar nutrientes, degradar componentes dañados o tóxicos, o para reciclar materiales celulares como paso previo a la muerte celular (Bassham, 2007). En plantas, han sido descritos dos vías principales de autofagia: la microautofagia y la macroautofagia. En la microautofagia, el material es engullido directamente por la vacuola mediante una invaginación del tonoplasto, liberando su lumen una vesícula que contiene los componentes citoplasmáticos (Bassham, 2007). Este proceso puede ser selectivo o no selectivo en cuanto a los componentes transportados a la vacuola (Schreiber y Peter, 2014). Se han observado procesos microautofágicos durante la acumulación de proteínas de almacenamiento en semillas de trigo en desarrollo y también en la degradación de gránulos de almidón y proteínas de almacenamiento que ocurre en semillas en germinación de plantas del género Vigna (Bassham, 2007). Durante el desarrollo de la planta, en las células meristemáticas carentes de vacuola, se ha sugerido que la microautofagia podría ser responsable del transporte directo desde el Introducción 65 citosol a la provacuola de componentes necesarios para la maduración de ésta (Bassham et al., 2006). También se ha descrito su implicación en procesos de senescencia (Bassham et al., 2006; Floyd et al., 2015) y en la degradación de los peroxisomas y de partes del núcleo, denominadas pexofagia y nucleofagia respectivamente (Schreiber y Peter, 2014). La macroautofagia es el proceso autofágico más ampliamente estudiado y utilizado por las plantas, cuyo término es normalmente simplificado por la comunidad científica refiriéndose a ella simplemente como autofagia. A diferencia de la microautofagia, se inicia en el citoplasma con la formación de membranas en forma de copa, denominados fagoforos, que encierran el material que va a ser degradado (Bassham, 2007). Recientemente se ha propuesto que el origen de estas membranas en plantas proviene del retículo endoplasmático (Zhuang et al., 2016, 2017). Estos fragmentos de membrana van alargándose y finalmente se fusionan entre ellos para formar un autofagosoma de doble membrana que contiene el material citoplasmático a degradar. Posteriormente, la membrana externa del autofagosoma se fusiona con el tonoplasto, liberando hacia el interior de la vacuola un cuerpo autofágico constituido por la membrana interna y el contenido a degradar en el interior. Las hidrolasas ácidas vacuolares se encargan de degradar el cuerpo autofágico, y los productos de la degradación son transportados de nuevo al citosol (Bassham, 2007). La autofagia ha sido un tema de estudio al alza en el campo de la fisiología vegetal en los últimos años, y se ha descrito su implicación en prácticamente todos los aspectos del ciclo de vida de las plantas, y especialmente en respuesta a estreses. La autofagia puede ser un proceso no selectivo que se encarga de la degradación masiva de elementos citosólicos, o bien puede ocurrir la autofagia selectiva, un proceso del cual se han descrito numerosos elementos que se encargan de la señalización en esta vía para que el cargo –o elemento a degradar– sea encerrado dentro del autofagosoma. Los tipos de cargo pueden ser llamativamente diversos: proteínas específicas, complejos moleculares como los ribosomas o proteasomas, agregados proteicos, fragmentos del retículo endoplasmático o del núcleo, orgánulos enteros (mitocondria, peroxisomas y cloroplastos) e incluso patógenos invasores (Marshall y Vierstra, 2018). 3.1. La maquinaria autofágica A partir de numerosos estudios en una gran variedad de organismos durante las últimas dos décadas, se ha logrado conocer en su mayor parte el funcionamiento del mecanismo de autofagia. Entre estos estudios, los de Yoshinori Ohsumi, premiado con el Premio Nobel en Fisiología o Medicina en 2016, y colaboradores fueron particularmente importantes porque identificaron el loci ATG (AUTOPHAGYRELATED) en levaduras, que es esencial para la macroy microautofagia, la degradación de los peroxisomas y la vía de señalización citoplasma-vacuola (Ohsumi, Introducción 66 2001). El análisis de más de 40 proteínas reveló una ruta canónica para la macroautofagia, con varios componentes compartidos con la microautofagia. Varios de estos componentes forman parte de complejos que se encargan de estimular la inducción de la autofagia escalonadamente en función del estado de desarrollo o nutricional de la célula. Las fases en las que se divide la autofagia son: inducción, reclutamiento de membrana, nucleación de la vesícula, expansión del fagoforo y cierre, fusión del autofagosoma con la vacuola, y por último rotura de la membrana del autofagosoma y digestión de su contenido (Fig. 8). Durante la investigación de la autofagia en plantas ha sido de especial importancia el hecho de que la mayoría de proteínas ATG de levaduras tiene claros ortólogos en especies como arabidopsis, arroz, maíz, tabaco, mijo [Setaria itálica (L.) P. Beauv.] y el alga Chlamydomonas reinhardtii, lo que ha facilitado un rápido entendimiento de este sistema vegetal. Además, varías de las proteínas de plantas son codificadas por pequeñas familias génicas, lo que implica que ha habido una expansión del sistema de plantas y/o una división de funciones de algunos componentes individuales (Marshall y Vierstra, 2018). 3.1.1. Inducción Como se muestra en la Fig. 8, la autofagia comienza cuando ambas señales, nutricional y de desarrollo, convergen para provocar el ensamblaje del complejo ATG1 quinasa. En este proceso es especialmente importante el regulador negativo TOR (target of rapamycin), que es una quinasa serina/treonina que junto con sus efectores RAPTOR y LST8 (lethal with sec thirteen protein 8) se encuentra activa en condiciones de nutrición suficiente (Dobrenel et al., 2016). En esta situación, TOR activa el crecimiento celular y la traducción de proteínas, y reprime la autofagia; pero en condiciones de deficiencia nutricional TOR está inactivo (Dobrenel et al., 2016). La quinasa TOR es capaz de bloquear la autofagia mediante la fosforilación de ATG13, que es un activador de ATG1. Esta fosforilación hace que ATG13 no pueda asociarse con ATG1, mientras que si TOR es inactivado ocurre una rápida desfosforilación de ATG13, lo que permite la unión a ATG1 (Fig. 8) (Suttangkakul et al., 2011). En consecuencia, la sobreexpresión de TOR en plantas suprime la autofagia, mientras que la inactivación de TOR mediante silenciamiento por ARNi, inhibidores químicos como la rapamicina y AZD8055, o la deleción de los genes de RAPTOR o LST8 intensifican la autofagia (Liu y Bassham, 2010; Pu et al., 2017). Sin embargo, recientemente se ha puesto en evidencia que existe otra vía de activación de autofagia independiente de TOR que es inducida por estrés oxidativo o por estrés del retículo endoplasmático (Pu et al., 2017). La proteína quinasa A (PKA) y SnRK1 (sucrose non-fermenting 1-related kinase 1) proporcionan alternativas adicionales al regular la inducción de la autofagia en pasos Introducción 67 previos al de TOR. Por ejemplo, la sobreexpresión y el silenciamiento mediado por ARNi de la subunidad catalítica de SnRK1, llamada AKIN10, acelera y reprime respectivamente la inducción de la autofagia bajo condiciones de falta de nutrientes (Marshall y Vierstra, 2018). Además, existen otros dos componentes del complejo quinasa ATG1/ATG13, ATG11 y ATG101, que sirven de conexión entre este complejo y otros elementos posteriores de la vía autofágica, estimulando su función a través de eventos de fosforilación (Suttangkakul et al., 2011; Li et al., 2014). En arabidopsis, ATG1 tiene tres isoformas: ATG1a, ATG1b y ATG1c; ATG13 posee dos: ATG13a y ATG13b. Los genes ATG1a y ATG13a son los que más se expresan entre sus parálogos. La expresión de ATG1b y ATG1c se localiza mayoritariamente en el polen (Suttangkakul et al., 2011). ATG11 y ATG101, junto con ATG1a y ATG13a y ATG13b se expresan ampliamente en numerosos tejidos de arabidopsis y en varios estadios de desarrollo (Li et al., 2014). 3.1.2. Reclutamiento de membrana El reclutamiento de membrana es uno de los pasos que son activados por el complejo ATG1/ATG13, siendo esencial la presencia de ATG11 en él (Kang et al., 2018). En este paso, se distribuyen lípidos por el fagoforo, lo cual es dirigido por la proteína transmembrana ATG9 junto con sus factores cíclicos, ATG2 y ATG18 (Xiong et al., 2005; Zhuang et al., 2017), aunque la función de estos últimos aún no se conoce con precisión. Se ha descrito en arabidopsis que ATG9 regula el transporte de membrana desde el retículo endoplasmático, siendo la isoforma ATG18a la que efectúa este transporte hacia el autofagosoma, un transporte que también es dependiente de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) (Zhuang et al., 2017). Luego de cumplir su función y una vez que el autofagosoma está completo, tanto ATG9 como ATG18a son reciclados y disociados de éste (Zhuang et al., 2017). En cualquier caso, el retículo endoplasmático no es el único origen de la membrana autofágica, ya que en algunos mutantes atg9 no se bloquea por completo el flujo autofágico, observándose señales de membrana autofagosómica no relacionadas con el retículo endoplasmático (Zhuang et al., 2017). De ATG2 se sabe que en levaduras interacciona en con ATG9 en el complejo ATG9/ATG18 y que su función es llevada a cabo en un paso posterior al de éstos, durante la biogénesis de las vesículas autofágicas (Kang et al., 2018). Además, en arabidopsis el fenotipo mutante atg2 es más severo que el de atg9 y atg11, y acumula numerosas vesículas autofágicas que no pueden ser transportadas a la vacuola (Kang et al., 2018). Mientras que ATG2 y ATG9 son codificados por genes únicos, ATG18 posee hasta 8 isogenes en arabidopsis (Di Berardino et al., 2018) y 10 en maíz, aunque dos de ellos son transcripcionalmente inactivos (Li et al., 2015). Además, se ha descrito que los Introducción 68 mutantes atg18a de arabidopsis son más sensibles al estrés salino e hídrico que el silvestre (Liu et al., 2009). 3.1.3. Nucleación de la vesícula La nucleación de la vesícula o fagoforo incipiente ocurre cuando los fragmentos de membrana reclutados en los pasos anteriores por el complejo ATG9/ATG18 comienzan a ensamblarse y a tomar forma de copa en su conjunto. Este paso implica el recubrimiento del fagoforo con fosfatidilinositol-3-fosfato (PI3P) por parte de un complejo que contiene la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) de clase III, VPS34 (vacuolar protein sorting 34), ATG6 (también denominada VPS30 y Beclin1), ATG14 o VPS38, y VPS15 (Fig. 8). En concreto, este complejo es responsable de fosforilar al lípido fosfatidilinositol, formando el PI3P (Marshall y Vierstra, 2018). Los mutantes de arabidopsis deficientes en VPS34, ATG6 o VPS15 son letales (Marshall y Vierstra, 2018). No obstante la regulación de este proceso de nucleación, en el que ATG6 parece tener un papel fundamental, aún no está bien definido en plantas (Qi et al., 2017). En mamíferos, se conoce que el homólogo de ATG1 fosforila al homólogo de ATG6 y esto hace que se estimule la producción de PI3P por parte de la PI3K. Este PI3P actúa como sitio de reconocimiento o acoplamiento para otras proteínas reguladoras y como un complejo quinasa de lípidos que facilita la nucleación de las membranas autofágicas (Qi et al., 2017). En arabidopsis una de las proteínas reclutadas por el PI3P es SH3P2 (SH3 domain-containing protein 2), que también se une a ATG8 y que participa activamente en el proceso de deformación de la membrana necesario en la nucleación (Fig. 8) (Zhuang et al., 2013). Es importante tener en cuenta que no todas las proteínas autofágicas tienen que ser específicas de esta vía, sino que pueden actuar simultáneamente en otro proceso. ATG6 es el ejemplo mejor conocido que presenta esta situación. En levaduras se conoce que es esencial para el transporte biosintético a la vacuola (Bassham, 2007). Y en plantas, parece que también es una proteína multi-funcional. Un mutante knockout atg6 de arabidopsis es defectuoso en la germinación del tubo polínico, probablemente debido a un defecto en el tráfico vacuolar, y en tabaco se ha descrito una implicación de ATG6 en la regulación de la muerte celular programada (Bassham, 2007). En cualquier caso, la regulación de ATG6 es sometida a un control estricto por parte de varios componentes de distintas vías. Dentro de la vía de la autofagia, aparte de su interacción con el complejo de ATG1/ATG13, y con los componentes de su complejo de fosforilación de lípidos, la estabilidad de ATG6 también está regulada en arabidopsis por proteínas de la familia TRAF (tumor necrosis factor receptor-associated factor) (Qi et al., 2017). Introducción 69 Figura 8. Representación esquemática de los pasos conocidos o propuestos en autofagia. 1. Inducción; 2. Reclutamiento de membrana; 3. Nucleación de la vesícula; 4. Expansión del fagoforo y cierre; 5. Fusión del autofagosoma con la vacuola; 6. Digestión. Casi todos los componentes representados (excepto ATG16 y PKA) han sido investigados formalmente en plantas. 3-MA: 3-metiladenina; AICAR: 5-aminoimidazol-4carboxamida ribonucleósido monofosfato; ATG: autophagy-related; ConA: concanamicina A; ESCRT: endosomal sorting complexes required for transport; MT: microtúbulo; NAA: ácido 1-naftalenoacético; PE: fosfoatidiletanolamina; PI3K: fosfatidilinositol-3-quinasa; PI3P: fosfatidilinositol-3-fosfato; PKA: proteína quinasa A; SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor; SnRK1: sucrose nonfermenting 1-related kinase; T6P: trehalosa-6-fosfato; TOR: target of rapamycin (Marshall y Vierstra, 2018). Introducción 70 3.1.4. Expansión del fagoforo Una vez que los fragmentos de membrana se han ensamblado, el siguiente paso de la vía autofágica consiste en completar la formación del autofagosoma mediante su expansión y cierre. Para ello, ocurre un proceso de conjugación análogo al del sistema de ubiquitina que terminar con el fagoforo recubierto con la proteína ubiquitin-like ATG8, conocida en animales como MAP1LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) o GARABAP (gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein). Esta proteína primariamente se encuentra en forma de precursor inactivo, hasta que es procesada por la cisteín-proteasa ATG4, que la corta en su C-terminal de modo que queda expuesta una glicina muy conservada entre todos los miembros de la familia de ATG8 (Yoshimoto et al., 2004). Entonces, la proteína ATG8 madura es activada en esta glicina por la proteína ATG7, siendo esta reacción dependiente de ATP; y luego es transferida a la enzima conjugadora ATG3. Por último, un complejo ligasa hexamérico formado por ATG5, ATG16 y una segunda proteína ubiquitin-like, ATG12, se encarga de conectar ATG8 con el lípido fosfatidiletanolamina (PE) a través de un enlace éter. Mediante el PE, ATG8 queda unido a la membrana del autofagosoma (Fig. 8) (Marshall y Vierstra, 2018). Para el montaje del complejo ligasa también es requerida la proteína ATG7, que junto con la enzima conjugadora ATG10 se encargan de unir la glicina C-terminal de ATG12 a una lisina conservada de ATG5 (Fig. 8). Este conjugado entre ATG12 y ATG5 posteriormente se une a la proteína dimérica de andamiaje ATG16, que se encarga de mantener al conjugado cerca del fagoforo para estimular la lipidación de ATG8 (Fig. 8) (Doelling et al., 2002; Thompson et al., 2005; Phillips et al., 2008; Chung et al., 2010). El aducto ATG8-PE recubre todo el fagoforo en expansión y ayuda a cerrar la vesícula reclutando, junto con PI3P, a proteínas con dominio SH3 como SH3P2. Los dímeros de SH3P2 cooperan para estimular la curvatura del fagoforo usando el dominio SH3 para unirse a PI3P y el dominio curvado BAR (bin/amphiphysin/rys) para deformar la membrana (Zhuang et al., 2013). Finalmente, los aductos ATG8-PE que se encuentran dispuestos hacia fuera, en la membrana externa, son deslipidados por ATG4 y liberados para su reutilización (Yoshimoto et al., 2004), mientras que aquellos que quedan atrapados dentro del autofagosoma al encontrarse en la membrana interna son digeridos por la vacuola. Hay que añadir que ATG8, así como ATG5, también se han localizado en la membrana de las invaginaciones del tonoplasto durante la microautofagia (Thompson et al., 2005; Floyd et al., 2015). En el caso de ATG4, en arabidopsis se ha descrito que está regulado por el estado rédox, ya que la actividad de ambas isoformas es reversiblemente inhibida in vitro por ROS (Woo et al., 2014). El mismo efecto se ha demostrado en Chlamydomonas (Pérez- Introducción 71 Pérez et al., 2016). En arabidopsis coexisten dos isoformas de este gen, ATG4a y ATG4b (Yoshimoto et al., 2004), mientras que ATG5 y ATG7 son genes únicos cuyos mutantes knockout suelen ser los más utilizados para estudiar plantas deficientes en autofagia (Zhou et al., 2013) aunque el mutante ATG2 es más severo (Kang et al., 2018). ATG12a y ATG12b son las dos isoformas en arabidopsis (Chung et al., 2010). En cuanto a ATG8, en general existen diversas isoformas que incluso se separan en clados específicos a nivel de familia (Kellner et al., 2016). En arabidopsis existen 9 isoformas (ATG8a-i), y con diferente patrón de expresión y funciones entre ellas (Thompson et al., 2005; Sláviková et al., 2005), y el sorgo es una de las plantas vasculares con menos isoformas: solo 3 (Kellner et al., 2016). En todo el proceso de formación del autofagosoma parece ser que la actina también participa, ya que se ha descrito una implicación del complejo de nucleación de actina ARP2/3 (actin-related protein 2/3), junto con NAP1 (NCK-associated protein 1) (Marshall y Vierstra, 2018). Además, hay evidencias de una implicación de la actina en los pasos concernientes a ATG11 y ATG9 en levaduras, así como en gran parte de proceso de formación del autofagosoma en mamíferos (Coutts y La Thangue, 2016). Es también importante señalar que se ha demostrado que ATG8 y ATG1 interaccionan, evidenciando así constante conexión e interacción entre todos los pasos de la formación del autofagosoma (Suttangkakul et al., 2011), además de la posibilidad de que el complejo ATG1/ATG13 también participe en los pasos finales de la autofagia (Michaeli et al., 2015) 3.1.5. Transporte y fusión del autofagosoma a la vacuola Una vez formados y recubiertos de ATG8 y PI3P, los autofagosomas son transportados a la vacuola probablemente usando la red de microtúbulos controlada por la maquinaria ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport), y se fusionan con el tonoplasto mediante los factores v-SNARE (vesicular soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), que están relacionados con dicha maquinaria (Fig. 8) (Marshall y Vierstra, 2018). Una vez producida esta fusión con la membrana externa del autofagosoma, el cuerpo autofágico es liberado dentro de la vacuola. Otros componentes de los que se ha descrito su implicación en el transporte y fusión a la vacuola son la proteína de exocitosis EXO70B1 y los siguientes componentes de la maquinaria ESCRT: CFS1 (cell death-related endosomal fyve/sylf protein 1), VPS2.1 (vacuolar protein sorting 2.1) y FREE1 (fyve-domain protein required for endosomal sorting 1) (Marshall y Vierstra, 2018). Este último, FREE1, se une a P13P y se puede asociar a ATG6 en el complejo PI3K (Gao et al., 2015). Introducción 72 3.1.6. Degradación del autofagosoma Una vez que los cuerpos autofágicos son depositados en el interior de la vacuola, su membrana y contenido son degradados por una multitud de hidrolasas vacuolares activas contra lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos. Una proteasa destacada es la proteasa caspase-like VPE-γ (vacuolar processing enzyme γ), que es capaz de activar numerosas proenzimas y que está regulado positivamente durante la senescencia en células que están sometidas a mega-autofagia (Fig. 8) (Marshall y Vierstra, 2018). 3.2. Autofagia selectiva Inicialmente se consideraba que la autofagia era un proceso no selectivo, es decir, un proceso de degradación masiva donde los autofagosomas formados encerraban porciones aleatorias del citoplasma para transportarlos a la vacuola para su degradación y consiguiente reutilización de nutrientes (aminoácidos, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos) por la misma célula o para su exportación a otras partes de la planta (Bassham, 2007, 2014). Y de hecho, está descrito que este mecanismo ocurre al menos durante la respuesta a falta de nutrientes y durante la senescencia (Bassham et al., 2006; Guiboileau et al., 2012), muy probablemente mediante señalización por SnRK1, TOR y ATG1 (Marshall y Vierstra, 2018). Además, la autofagia también se encuentra activa a un nivel basal en todas las células vegetales y en todos los estadios del desarrollo, presumiblemente eliminando desechos celulares (Marshall y Vierstra, 2018). No obstante, durante la última década ha venido volviéndose cada vez más obvio el hecho de que existen varias rutas de autofagia selectiva. En general, esta selectividad o especificidad viene mediada por la forma lipidada de ATG8, que tiene la capacidad de asociarse a un gran número de receptores autofágicos con afinidad por un cargo específico (Marshall y Vierstra, 2018). Esta asociación se produce a través de un motivo de interacción que poseen numerosas proteínas denominado AIM (ATG8interacting motif) (Noda et al., 2010). Este motivo consiste en una secuencia consenso central, W/F/Y-X-X-V/I/L, que a menudo aparece rodeada por residuos ácidos (Noda et al., 2010). Como se ha mostrado recientemente en una estructura por cristalografía de la isoforma ATG8CL de patata (Solanum tuberosum L.) unida a la secuencia AIM del efector PexRD54 de Phytophthora infestans, el motivo se une a un dominio hidrofóbico de la proteína ATG8 conocido como LDS (LIR/AIM docking site), que se caracteriza por dos bolsillos hidrofóbicos que acomodan a los grupos W/F/L y V/I/L (Maqbool et al., 2016). A partir de la secuencia consenso, se han desarrollado herramientas in silico para predecir motivos AIM en las secuencias proteicas (Kalvari et al., 2014; Xie et al., 2016), pero éstas todavía tendrían que ser validadas experimentalmente debido a la naturaleza cambiante de esta secuencia corta. Introducción 73 En los últimos años se ha ido ampliando el catálogo de proteínas que contienen algún AIM, muchas de las cuales son receptores de cargos. Curiosamente, algunas de estas proteínas también tienen afinidad por la ubiquitina, lo cual entrelaza de manera consistente a la ubiquitinación con la autofagia. Todos estos receptores de cargos proporcionan mecanismos para eliminar proteínas específicas, complejos proteicos, agregados proteicos, orgánulos e incluso patógenos invasores (Marshall y Vierstra, 2018). Además, como algunos de los propios componentes de la formación del autofagosoma contienen AIMs (ATG1, ATG3 y ATG11), la interacción resultante con ATG8 sirve para auto-regular negativamente la autofagia a través de la autodegradación (Marshall y Vierstra, 2018). 3.2.1. NBR1 Como se ha mencionado anteriormente, la autofagia selectiva se produce a través de receptores de cargos o adaptadores que median la unión indirecta del cargo a degradar con proteínas de la maquinaria autofágica como ATG8. Los primeros receptores de cargos fueron identificados en mamíferos: p62, NDP52 y Nix/Bnip3L (Svenning et al., 2011), y posteriormente se caracterizó NBR1 (neighbor of BRCA1 gene) como un receptor de cargo que cooperaba con p62 en la degradación autofágica de sustratos ubiquitinados (Svenning et al., 2011). p62 actúa en mamíferos como un receptor para la degradación autofágica de agregados proteicos, proteínas solubles, anillos del cuerpo medio, mitocondrias dañadas, peroxisomas, bacterias intracelulares, remanentes de membranas fagocíticas, precursores bacteriocidas y proteínas de la cápsida de virus (Svenning et al., 2011). A NBR1 se le suponen funciones parecidas ya que ambas proteínas comparten una organización de sus dominios similar, con el mismo dominio PB1 N-terminal seguido de un dominio dedos de zinc de tipo ZZ, un dominio LIR (equivalente al motivo AIM en mamíferos) y un dominio UBA (ubiquitin-associated) que puede interaccionar con monoy poliubiquitinación (Svenning et al., 2011). La diferencia principal entre ambas proteínas es que el dominio N-terminal de p62 confiere capacidad de polimerización de la proteína mientras que el de NBR1 no (aunque ésta lo hace a través de otro dominio), formando un homo-oligómero determinante para la degradación por autofagia. Sin embargo, NBR1 sí puede interaccionar con p62 a través de su dominio N-terminal, formando un heterodímero (Svenning et al., 2011). En ensayos de pull-down con GST (glutatión S-transferasa), el dominio UBA de NBR1 de mamíferos aislado interacciona fuertemente con GST monoubiquitinado y con GST poliubiquitinado (4 moléculas de ubiquitina), mientras que la proteína completa NBR1 se une débilmente a GST poliubiquitinado y no se une a la forma monoubiquitinada (Kirkin et al., 2009). Por su parte, p62 se une mucho más Introducción 80 Otras proteínas como ATG1, ATG13 y ATG11 también pueden ser usadas como marcadores para localizar los autofagosomas junto a una proteína de fusión. ATG5 y SH3P2, sin embargo, se localizan en la formación de los fagoforos y una vez que el autofagosoma está completo desaparecen (Bassham, 2014). Tintes fluorescentes que se acumulan dentro de los autofagosomas Aunque GFP-ATG8 es considerado un marcador ideal para visualizar los autofagosomas, la gran desventaja es que la proteína de fusión debe ser expresada bien transitoriamente o bien creando plantas transgénicas, lo cual es más complicado y costoso cuando se trabaja con monocotiledóneas como el sorgo. Por ello, existen otros marcadores fluorescentes para los autofagosomas que, aunque son menos selectivos Figura 10. Visualización de la proteína de fusión GFP-ATG8 en el microscopio confocal. Las imágenes se obtuvieron de células epidérmicas de hojas de plantas de arabidopsis transgénicas que expresan GFPATG8 recién cortadas (arriba) o cortadas y luego incubadas en 10 mM MES-NaOH (pH 5,5) añadiendo 1 μM concanamicina A durante 20 h en oscuridad (abajo). El recuadro pequeño muestra una magnificación de los cuerpos autofágicos. Barras de escala = 50 μm en las imágenes principales y 5 μm en la magnificación (Ishida et al., 2008). Introducción 81 que GFP-ATG8, pueden ser usados para teñir este tipo de plantas y visualizar los autofagosomas en el microscopio confocal (Bassham, 2014). Estos tintes básicamente se basan en la asunción de que el lumen del autofagosoma es ácido, y por lo tanto puede acumular tintes acidotrópicos. Esta teoría se apoya por el hecho de que los autolisosomas (correspondientes a los autofagosomas en animales) poseen actividad fosfatasa ácida, una H+-ATPasa vacuolar y actividad cisteína proteasa. Aunque no se conoce cuál es el origen de estas enzimas en plantas, parece razonable que los autofagosomas vegetales se acidifiquen en algún punto de su formación o maduración (Bassham, 2014). Algunos marcadores de autofagosomas comúnmente usados son los tintes acidotrópicos Lysotracker, quinacrina, Neutral Red y Lucifer Yellow, acumulándose todos y fluoresciendo en compartimentos ácidos (Bassham, 2014). Suelen teñir también la vacuola, pero mucho más débilmente que los autofagosomas/autolisosomas. El segundo tipo de tinte fluorescente para autofagosomas es la monodansilcadaverina (MDC), que se acumula y fluoresce dentro de compartimentos rodeados de membrana que tienen un lumen ácido y una membrana rica en lípidos. Ambas características son típicas de los autofagosomas, y ya se ha demostrado que tiñen los autofagosomas en células animales y vegetales (Contento et al., 2005; Bassham, 2014), incluyendo monocotiledóneas (Williams et al., 2015), y que se colocaliza con el marcador GFPATG8 en condiciones de deficiencia nutricional (Contento et al., 2005). Los tintes fluorescentes deben ser utilizados con precaución porque son capaces de teñir otros compartimentos ácidos aparte de los autofagosomas. Además, al requerir un lumen ácido, presumiblemente teñirán una etapa tardía de la maduración del autofagosoma, y no pueden ser utilizados para analizar los pasos de la formación (Le Bars et al., 2014). Hace cuatro años, Merkulova y colaboradores compararon el marcaje por GFP-ATG8 con la tinción por MDC y Lysotracker Red en raíces de arabidopsis en condiciones de falta de sacarosa y concluyeron que había colocalización (Merkulova et al., 2014), lo cual contrasta con el trabajo previo donde sí se había visualizado la colocalización de ambos marcadores (Contento et al., 2005). No obstante, en el trabajo reciente sólo se retiró la sacarosa durante 4 h, que es mucho menos tiempo que los tiempos que se utilizan más comúnmente (Yoshimoto et al., 2004; Xiong et al., 2005; Phillips et al., 2008) que tienen en cuenta que muchas células vegetales tienen reservas de nutrientes que se gastan antes de que comience la respuesta a la deficiencia. Además, la iniciación de la autofagia podría ocurrir dentro de estas 4 h, pero puede que este periodo de tiempo no sea suficiente para que los autofagosomas alcancen un grado de maduración suficiente, lo que explicaría los autofagosomas en formación que son marcados por GFP-ATG8 y no por los tintes. Esto también explicaría por qué hay tan poca tinción por MDC y Lysotracker en el artículo reciente (Merkulova et al., 2014) en comparación con otros estudios donde es evidente una amplia tinción de Introducción 82 estructuras (Xiong et al., 2005; Liu et al., 2005; Patel y Dinesh-Kumar, 2008; Liu et al., 2009). Autofagia selectiva Del mismo modo, usando proteínas de fusión unidas a proteínas candidatas, se puede visualizar una colocalización con GFP-ATG8 o incluso con NBR1, u otro receptor de cargo, unido a otra proteína de fusión lo que daría una idea de si la proteína candidata es degradada por autofagia o no. Esta colocalización debería producirse en las estructuras en forma de puntos, es decir, dentro de los autofagosomas que se encuentren bien en el citoplasma, bien en el interior de la vacuola (Bassham, 2014). No obstante, esta interacción debe ser confirmada mediante otros ensayos de interacción entre proteínas. Otra posibilidad para estudiar las relaciones autofágicas de proteínas candidatas es el ensayo de complementación por fluorescencia bimolecular (BiFC), en el que se requiere que las dos proteínas interaccionen para poder visualizar la fluorescencia, y en este caso una de ellas serían proteínas autofágicas como ATG8 o NBR1 (Marshall y Vierstra, 2018). Microscopía electrónica La morfología de doble membrana de los autofagosomas originados por deficiencia nutricional y que luego se fusionan con la vacuola fue descrita muy pronto usando microscopía electrónica (Aubert et al., 1996), y posteriormente fue confirmado en arabidopsis (Rose et al., 2006). La microscopía electrónica aún es considerada uno de los mejores métodos para demostrar la presencia de autofagia, siendo las principales desventajas el tiempo y la dificultad técnica de preparación de las muestras, y la imposibilidad de visualizar muestras en vivo y así estudiar la dinámica celular. Además de poder observarse la morfología de los autofagosomas (Fig. 11), este método puede usarse, en combinación con inhibidores que bloquean la degradación, para identificar el contenido de los autofagosomas. Y del mismo modo que con el microscopio confocal, puede realizarse una cuantificación del número de autofagosomas por célula o por área (Bassham, 2014). 3.3.2. Métodos bioquímicos Existen métodos bioquímicos que constituyen una alternativa consistente a la visualización directa por microscopía, aunque algunos han presentado más dificultades y problemas a la hora de implementarlos en plantas, en comparación con animales. Introducción 83 Inmunoblot de ATG8 Como se ha descrito anteriormente, un paso clave en la formación del autofagosoma es la unión covalente de ATG8 a PE. Esta característica ha sido ampliamente usada para determinar la actividad de la vía autofágica comparando la cantidad de ATG8 libre con la cantidad de la forma lipidada (Bassham, 2014), y a raíz de ahí se han desarrollado diferentes anticuerpos contra la proteína ATG8a de arabidopsis, que funcionan en un amplio rango de plantas (Williams et al., 2015). Un hándicap de este método es la presencia de múltiples isoformas de ATG8, aunque los anticuerpos diseñados reconocen a la mayoría de isoformas e incluso a posibles productos de su degradación. Lo que sí constituye un inconveniente es que este tipo de anticuerpos tienen un alto grado de inespecificidad por lo que reconocen gran variedad de bandas, incluyendo alguna del mismo tamaño que la forma lipidada, lo que complica el análisis (Bassham, 2014). Una solución inicial fue analizar las formas lipidada y no lipidada mediante inmunoblots de geles corridos en presencia de urea, que hace que el conjugado ATG8-PE migre más rápidamente que la forma no conjugada durante la electroforesis debido a las cargas, aunque posea mayor peso molecular (Klionsky et al., 2014). Aun así, la forma lipidada no podía ser identificada correctamente debido a que se detectaban múltiples bandas, así que el método se Figura 11. Visualización de autofagosomas por microscopía electrónica. Hojas de Tripogon loliiformis de tres meses fueron divididas en segmentos de 1 cm, infiltradas al vacío con una solución que contenía 5 mM de trehalosa y 1 μM de concanamicina A e incubadas durante 24 h. Los autofagosomas se visualizaron por microscopía electrónica de transmisión (Williams et al., 2015). Introducción 84 mejoró con el uso de fosfolipasa D, que elimina el lípido y por lo tanto revierte el tamaño a la forma no lipidada por lo que se puede identificar fácilmente cuál es la forma lipidada (Bassham, 2014; Williams et al., 2015). En arabidopsis, no obstante, no se recomienda determinar el grado de autofagia según la cantidad de ATG8-PE en los inmunoblots porque algunas isoformas son lipidadas incluso en condiciones control (Bassham, 2014). La situación en el maíz es mejor porque sólo existen 5 genes que codifican ATG8, y el patrón es fácilmente visualizado con geles de urea y el uso de fosfolipasa D (Bassham, 2014). En el sorgo, al haber sólo 3 genes que codifican ATG8 (Kellner et al., 2016), la ejecución de este ensayo debería ser similar. Una alternativa a este método consiste en el uso de la proteína de fusión GFPATG8, mediante la cual se podría detectar la forma lipidada más fácilmente con anticuerpos contra GFP después de la separación electroforética en geles de urea (Bassham, 2014). Otra opción es la inmunodetección de la forma libre de GFP, ya que la fusión GFP-ATG8 es procesada en la vacuola, de modo que la cantidad de GFP libre, fácilmente detectado al tener diferente tamaño, da una idea del flujo de autofagia que tiene lugar en la planta (Shin et al., 2014). Autofagia selectiva Como complemento para confirmar la colocalización de fluorescencias por microscopio confocal, se pueden llevar a cabo experimentos de co-inmunoprecipitación o pull-down para verificar la interacción entre dos proteínas (Zhou et al., 2013; Marshall y Vierstra, 2018). Normalmente una de las proteínas es ATG8 o algún receptor de cargo como NBR1 unidos a una proteína de fusión que permita utilizar anticuerpos acoplados a diferentes partículas que permitan la inmunoprecipitación. Otra opción es el sistema del doble híbrido en levadura (Marshall y Vierstra, 2018). 3.3.3. Inhibidores de la autofagia Los métodos de microscopía descritos anteriormente permiten la visualización de los autofagosomas u otros intermediarios autofágicos, así como el inmunoblot con anticuerpos ATG8 da información acerca de cantidad de aducto ATG8-PE y, por tanto, de la cantidad de autofagosomas formados. Sin embargo, todos estos ensayos proporcionan una medida estática de la autofagia, y el número de autofagosomas o la cantidad de ATG8-PE presentes sólo reflejan el balance entre la tasa de formación y la tasa de degradación de los autofagosomas (Bassham, 2014). Es decir, una acumulación de autofagosomas podría explicarse tanto por un aumento en la tasa de formación por activación de la autofagia como por un descenso de la tasa de degradación, y por lo tanto la suposición de que un aumento en el número de autofagosomas implica la activación de la autofagia podría ser erróneo. Aunque sea más complicado de medir, la Introducción 85 actividad autofágica se define mejor como el flujo a través de la ruta completa de la autofagia (Bassham, 2014). Para definir este flujo autofágico entran en juego los inhibidores de la autofagia, entre los cuales la concanamicina A (concA) (Tabla 1) es el que tiene más relevancia. La concanamicina A inhibe la ATPasa de protones vacuolar presente en la red trans-Golgi, los endosomas y la vacuola, previniendo la acidificación vacuolar e interrumpiendo el tráfico de vesículas entre la red trans-Golgi y la vacuola (Matsuoka et al., 1997). Por consiguiente, la degradación de macromoléculas dentro de la vacuola es bloqueada debido al elevado pH y posiblemente también debido a la pérdida del transporte de algunas hidrolasas a la vacuola. Bajo estas condiciones, después de que los autofagosomas se fusionen con el tonoplasto, los cuerpos autofágicos, de una sola membrana y que contienen el cargo a degradar, son estables en el lumen de la vacuola y son acumulados en proporción a la actividad autofágica (Yoshimoto et al., 2004). De este modo, todos los autofagosomas que se formen y entren en la vacuola desde que la concanamicina A surta efecto podrán ser visualizados y contados mediante los métodos de microscopía descritos anteriormente, así como la cantidad de conjugado ATG8-PE formado mediante el inmunoblot. Nombre del inhibidor Mecanismo de acción Concentraciones efectivas Comentarios 3-metiladenina (3MA) Inhibidor de la PI3K 2,5-10 mM Puede tener efectos pleiotrópicos relacionados con roles no autofágicos del complejo PI3K 5-aminoimidazol-4carboxamida ribonucleósido monofosfato (AICAR) Activador de SnRK1 10 mM Los efectos de otras dianas de este compuesto incluyen la activación de la glutamina sintasa, la NADH-nitrato reductasa y la sacarosa-fosfato sintasa AZD8055 Inhibidor de la quinasa TOR 1-10 μM Tiene 1000 veces más especificidad por TOR que por otras quinasas Concanamicina A (concA) Inhibidor de la H+- ATPasa vacuolar 100 nM (células); 1 μM (plantas) Estabiliza los cuerpos autofágicos en la vacuola, facilitando su detección; también se puede usar bafilomicina A E64c/E64d Inhibidores de cisteín proteasas 10 μM (células); 100 μM (plantas) Estabiliza los cuerpos autofágicos en la vacuola, facilitando su detección LY294002 Inhibidor de la PI3K 30-100 μM Es considerado un inhibidor muy específico (más que la wortmanina; puede tener efectos pleiotrópicos relacionados con roles no autofágicos del complejo PI3K Ácido 1naftalenoacético Activador de la quinasa TOR 20 nM Puede tener efectos pleiotrópicos relacionados con roles no autofágicos de la señalización por auxinas/TOR Rapamicina Inhibidor de la quinasa TOR 10 μM Inicialmente se pensaba que era inactivo en plantas, pero hay evidencias recientes que sugieren lo contrario Trehalosa-6-fosfato Inhibidor de SnRK1 100 μM Puede tener efectos pleiotrópicos relacionados con roles no autofágicos de SnRK1 Torina1/torina2 Inhibidores de la quinasa TOR 250 nM - 10 μM Considerados menos específicos que AZD8055 pero aún así tienen 300 veces más afinidad por TOR que por otras quinasas Wortmanina Inhibidor de la PI3K 1-10 μM También puede inhibir las fosfatidilinositol-4-quinasas a concentraciones más elevadas; puede tener efectos pleiotrópicos relacionados con roles no autofágicos del complejo PI3K Tabla 1. Inhibidores y activadores comúnmente usados en el estudio de la autofagia en plantas. P13K: fosfatidilinositol-3-quinasa (adaptado de Marshall y Vierstra, 2018). Introducción 86 La adición de concA permite distinguir entre un aumento en la formación de autofagosomas, en cuyo caso se van a acumular muchos más autofagosomas en presencia de concA que en su ausencia, y un bloqueo de su degradación, en cuyo caso la concA no tiene efecto sobre el número de autofagosomas acumulados (Bassham, 2014). De hecho, cuando se realiza un ensayo de visualización de autofagosomas en condiciones de estrés, por lo general no se localizan muchos más autofagosomas que el nivel basal de las condiciones control. Y eso es debido a que aunque la tasa de formación aumente debido a la activación de la autofagia, la degradación funciona a pleno rendimiento y, tal como se van formando y madurando los autofagosomas, rápidamente son degradados en la vacuola y desaparecen. Por el contrario, tras la adición de concA típicamente se observa un aumento marcado en el número de autofagosomas detectados en condiciones de estrés (Chung et al., 2010; Bassham, 2014; Marshall y Vierstra, 2018). Otros inhibidores de uso común en el estudio de la autofagia están descritos en la tabla 1. Entre ellos, se puede destacar a la 3-metiladenina (3-MA) (Seglen y Gordon, 1982), que bloquea la formación de los autofagosomas mediante la inhibición de la PI3K. 3.4. La autofagia en el desarrollo, metabolismo y respuesta a estrés Hay numerosos estudios en una gran variedad de mutantes defectivos en la autofagia que han proporcionado una imagen consistente de los roles de la autofagia en el crecimiento y desarrollo de las plantas. La autofagia es un proceso clave en la formación de la vacuola en las células vegetales. En las células meristemáticas que aún no tienen vacuola, se forman numerosos autofagosomas de doble membrana que envuelven grandes porciones de citoplasma (Bassham et al., 2006). Durante el desarrollo de las semillas, las vacuolas de almacenamiento de proteínas reemplazan a las vacuolas vegetativas o líticas normales. Durante este proceso de reemplazo, las rutas autofágicas se encuentran operando llevando a cabo alguna función (Bassham et al., 2006). También se ha descrito la acumulación de algunos precursores de proteínas y algunas proteasas que son depositadas en la vacuola por autofagia en un paso previo necesario antes de llevar a cabo su función. En el caso de los precursores de proteasas, se acumulan en vesículas derivadas del retículo endoplasmático y se encuentran preparadas para ejecutar su función si se requieren cambios drásticos y repentinos de la actividad proteolítica, como en la removilización de proteínas de almacenamiento o en la muerte celular programada (Bassham et al., 2006). En relación a la muerte celular programada vinculada con la respuesta hipersensible a patógenos, se ha demostrado que la autofagia participa en la respuesta inmune de las plantas. La autofagia puede encargarse de eliminar las señales de Introducción 87 muerte celular que viajan más allá del área de infección del patógeno y también de limpiar y reciclar el daño celular causado durante la respuesta (Bassham et al., 2006). En cualquier caso, ninguna de estas funciones es totalmente crucial para la planta bajo condiciones control, ya que los mutantes defectivos en proteínas autofágicas (atg8, atg7, atg5, etc.) son perfectamente capaces de completar su ciclo vital y producir semillas viables bajo condiciones de crecimiento óptimo. De hecho, algunos procesos de desarrollo donde se supone que la autofagia es requerida son completados de forma normal en estos mutantes, como la biogénesis del xilema o u otros eventos de muerte celular programada como la degeneración del estomio y el tapete en la antera, y sólo se observan defectos leves (Marshall y Vierstra, 2018). Sólo en arroz ocurre un fenotipo letal por falta de autofagia, pero esta letalidad es causada por un fallo en el desarrollo del polen y no por procesos metabólicos (Marshall y Vierstra, 2018). Cuando realmente los fenotipos de autofagia defectiva aparecen es cuando las plantas crecen en condiciones de estrés. En estas condiciones, surge el fenotipo típico de los mutantes de autofagia, que se caracteriza por un crecimiento lento, senescencia temprana, baja fertilidad y supervivencia reducida (Marshall y Vierstra, 2018). En estas condiciones se pueden discernir claramente dos tipos de componentes de la maquinaria autofágica: aquellos cuyos mutantes están severamente afectados y por lo tanto son componentes centrales (p. ej. ATG3, ATG5, ATG7 y ATG10), y aquellos que tienen una función más periférica y cuyos mutantes se ven menos afectados por el estrés (p. ej. la quinasa ATG1 y NBR1) (Marshall y Vierstra, 2018). Durante la senescencia de las hojas, la autofagia tiene roles opuestos. Uno es mantener la longevidad mediante el reciclaje de nutrientes y el otro es participar en la degradación sistemática de los tejidos mientras los nutrientes son exportados a otras zonas de crecimiento y almacenamiento (Masclaux-Daubresse et al., 2017). En este sentido, se ha descrito un rol esencial de la autofagia en la translocación del nitrógeno y el hierro a las semillas en desarrollo de arabidopsis (Guiboileau et al., 2012; Pottier et al., 2018). La fertilidad reducida en plantas deficientes en autofagia puede tener dos explicaciones posibles. Una es que se deba a una translocación de nutrientes hacia la semilla muy reducida, y la otra es que la ausencia de autofagia haga que no se ejecuten los procesos necesarios para la formación de las vacuolas de almacenamiento de proteínas y/o la deposición de las proteínas de reserva en ellas (Marshall y Vierstra, 2018). Por otro lado, la sobreexpresión de ATG5 y ATG7 en arabidopsis, o de diferentes isogenes ATG8 en arabidopsis y maíz aumentó la producción de semillas; mejoró la tolerancia a sequía, déficit de nitrógeno y estrés oxidativo; y estimuló la resistencia a patógenos necrotróficos. Todo esto sugiere que estimular la movilización de nutrientes Introducción 88 a través de la autofagia puede tener beneficios agronómicos (Xia et al., 2012; Li et al., 2016; Minina et al., 2018). Aunque las diferencias fenotípicas de los mutantes de autofagia parecen limitadas, existen algunos estudios metabolómicos que revelan un impacto mucho mayor en el metabolismo vegetal, incluso en condiciones control. El primero de estos estudios comparó hojas de la roseta de arabidopsis del silvestre con las de mutantes de autofagia en condiciones déficit de nitrógeno (Masclaux-Daubresse et al., 2014). Los mutantes acumulaban menos hexosas (glucosa, fructosa, manosa y galactosa) pero más de sus alcoholes (manitol y sorbitol) y ácidos (gluconato, galacturonato, ribonato y treonato), lo que sugiere un defecto en la gestión rédox de los azúcares. También se hiperacumulaban numerosos aminoácidos: glutamato, aspartato, metionina, fenilalanina, valina, leucina e isoleucina; y también siquimato, que es el precursor de los aminoácidos aromáticos y un punto de partida para la biosíntesis del ácido salicílico. Este tipo de acumulación implica que el catabolismo de los aminoácidos está modificado en los mutantes de autofagia, lo que explicaría por qué hiperacumulan compuestos ricos en nitrógeno como amonio y aminoácidos en las rosetas (Guiboileau et al., 2013; Masclaux-Daubresse et al., 2014). De hecho, la acumulación de siquimato fue el indicador más consistente de la deficiencia de autofagia, y esto se observó independientemente del fondo genético y de la disponibilidad de nitrógeno. Además, los datos transcriptómicos mostraron que las vías de producción de glutatión, metionina, rafinosa y galacturonato también estaban perturbadas en los mutantes de autofagia (Masclaux-Daubresse et al., 2014), así como la acumulación de antocianinas (Marshall y Vierstra, 2018). Los datos de otro estudio metabolómico, en este caso en plántulas etioladas de arabidopsis germinadas sin sacarosa como déficit de carbono, mostraron niveles reducidos de aminoácidos libres y ácidos orgánicos como el malato, fumarato y deshidroascorbato (Avin-Wittenberg et al., 2015). El análisis del flujo metabólico sugirió un aumento en la respiración y un descenso en la biosíntesis neta de proteínas en los mutantes de autofagia en comparación con el silvestre. La composición de lípidos de los mutantes también cambió, con aumentos en los triacilgliceroles y los ácidos grasos libres. También se registraron altos niveles de fosfatidilinositol, posiblemente indicando un intento de los mutantes de compensar la falta de autofagia aumentando el sustrato para el complejo PI3K (Avin-Wittenberg et al., 2012). Un estudio metabolómico más reciente comparó un mutante atg12 de maíz con el silvestre en condiciones de déficit de nitrógeno y se encontraron aumentos drásticos de ácidos grasos libres y oxilipinas, lo que implica fuertes perturbaciones en el metabolismo de lípidos en los mutantes de autofagia (Marshall y Vierstra, 2018). Este estudio también examinó el perfil proteómico, encontrando un incremento en los Introducción 89 niveles de proteíns ribosómicas, mitocondriales, y del proteasoma y peroxisoma (Marshall y Vierstra, 2018). 3.5. Interés del estudio de la implicación de la autofagia y las PTMs en la degradación de la PEPC La PEPC es una enzima clave en el metabolismo del carbono y del nitrógeno, y es por ello por lo que está sometida a un estricto control postraduccional, sobre todo en condiciones adversas para las plantas. Es lógico pensar que su degradación también pueda estar estrictamente regulada en estas condiciones, y la autofagia selectiva es un proceso mediante el cual la degradación de muchos elementos celulares se lleva a cabo de forma precisa y controlada. En este sentido, existen dos motivos principales que conducen a formular la hipótesis de que determinadas isoenzimas PEPC sean degradadas a través de alguna vía autofágica, en condiciones concretas. En primer lugar, la monoubiquitinación de la PEPC no tiene ninguna función fisiológica conocida hasta la fecha, aparte de la función inhibidora de la actividad de la enzima descrita por O’Leary y colaboradores (O’Leary et al., 2011b), habiéndose presentado en multitud de plantas y tejidos y en varias isoenzimas de tipo C3. Además, se ha descrito que esta PTM aumenta en condiciones de estrés, como en el estrés por amonio (Arias-Baldrich et al, 2017), y en tejidos en desarrollo donde la actividad catabólica es alta, como en las semillas de sorgo en germinación (Ruiz-Ballesta et al., 2016). Son contextos en los que la inducción de la autofagia sería normal. Y precisamente algunos receptores de cargo de vías autofágicas, como NBR1, tienen dominios de reconocimiento de sustratos ubiquitinados en general, y monoubiquitinados en particular (Kirkin et al., 2009; Svenning et al., 2011), lo que abre la posibilidad de que una posible función de la monoubiquitinación de la PEPC sea su reconocimiento por parte de este tipo de receptores autofágicos. En segundo lugar, dentro de la clorofagia ha sido descrita una vía de degradación autofágica de la rubisco por parte de los RCBs, además de dos otras vías de degradación vacuolar independientes de autofagia como son las SAVs y las CCVs (Otegui, 2018). Este tipo de mecanismos están encaminados a controlar la degradación de la proteína más abundante en plantas, y por lo tanto a reciclar gran cantidad de nitrógeno. Sin embargo, estas vías han sido descritas en plantas C3, y no se han estudiado en plantas C4. En el caso del sorgo, al ser una planta C4, la cantidad de proteína PEPC es muy alta y similar a la cantidad de rubisco, con lo que se podría pensar que un mecanismo parecido a los RCBs, las SAVs o las CCVs pudieran llevar a cabo la degradación de la PEPC. Aunque la PEPC es una enzima citosólica, mientras que la rubisco se encuentra en el estroma de los cloroplastos, existen evidencias experimentales de su asociación a membranas de orgánulos o al plasmalema. En maíz, la unión de la PEPC a la membrana del cloroplasto ocurre en paralelo a una Materiales y métodos 96 1. MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO 1.1. Sorghum bicolor Las plantas de sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench, cultivar PR87G57, Pioneer HiBred España] fueron cultivadas hidropónicamente bajo un ciclo día/noche de 12 h de luz (25 °C, 60% de humedad relativa) y 12 h de oscuridad (20 °C, 70% de humedad relativa). La intensidad de luz fue de 350 μmol de fotones m-2 s-1 PAR. Para tratamientos a corto plazo, las semillas de sorgo se esterilizaron con lejía al 2% (v/v) durante 30 min. Luego, éstas se lavaron dos veces con agua destilada, seguido de un lavado con 10 mM HCl y otros cinco lavados con agua destilada (Abdul-Baki, 1974). La imbibición se llevó a cabo colocando las semillas en placas de Petri con papeles de filtro empapados en agua destilada, manteniéndolas durante 2-3 días a 25 °C en oscuridad. Una vez germinadas, se transfirieron las semillas a sistemas Araponic® (Tocquin et al., 2003), usando agarosa al 0,65% (p/v) como sustrato en los soportes para semillas y solución nutritiva que contenía nitrato como fuente de nitrógeno (medio control; Hewitt, 1966) como medio líquido durante una semana. Para tratamientos a largo plazo, las semillas de sorgo fueron germinadas en vermiculita durante 10 días, y posteriormente se transfirieron las plantas a cultivos hidropónicos con medio control durante 2-3 semanas. Cuando se indica, el medio control se sustituyó por medio con deficiencia en algún nutriente. La tabla 2 muestra la composición de las distintas soluciones nutritivas para el sorgo. Tabla 2. Composición del medio de cultivo de sorgo. Composición del medio de cultivo de sorgo (Hewitt, 1966) para condiciones control y de deficiencia de nitrógeno (-N), fósforo (-P) y hierro (-Fe). Macronutrientes Concentración (mM) KNO3 Ca(NO3)2·4H2O SO4Mg·7H2O PO4H2Na·2H2O CaCl2 K2SO4 Control 5 5 2 1,34 - - -N - - 5 5 -P 5 5 - - - Micronutrientes MnSO4·H2O CuSO4·5H2O Na2MoO4 ZnSO4·7H2O H3BO3 CoSO4·7H2O ClNa FeNa-EDTA 10-2 10-3 5·10-4 10-3 5·10-2 2·10-4 1 0,1 (-Fe: 0) Los tratamientos descritos como “deficiencia de nitrógeno” se llevaron a cabo utilizando el medio correspondiente durante 2 días en plántulas de 10 días de edad. Además del sorgo silvestre, se utilizó un sorgo ARNi-SbPPC3 (Sbppc3) que fue generado por la técnica del ARN de interferencia (ARNi), llevada a cabo por el Servicio de Transformación de Plantas de la Universidad de Missouri (EE.UU.). El vector pFCG161, diseñado para el silenciamiento génico en cereales, fue usado para construir el casete hpARNi que contenía un fragmento de 300 pb proveniente del gen PPC3 de sorgo (Sb04g008720) en la orientación sentido y anti-sentido. El vector obtenido se usó para transformar embriones de sorgo y generar plantas con este gen silenciado. Se Materiales y métodos 97 obtuvieron 14 líneas T1 independientes distintas de las cuales se seleccionaron las 2 que poseían el nivel de transcrito de SbPPC3 afectado más severamente. A continuación, se autopolinizaron y se recolectaron todas las líneas T2 homocigotas para los análisis. El cultivar silvestre que se utilizó para generar estas líneas fue P898012. 1.2. Arabidopsis thaliana Las plantas de arabidopsis [Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. cv. Columbia (Col-0), Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)] se cultivaron hidropónicamente con un ciclo día/noche de 8 h de luz (22 °C, 60% de humedad relativa) y 16 h de oscuridad (18 °C, 70% de humedad relativa) en un fitotrón FitoClima S600 (Aralab). La intensidad de luz fue de 100 μmol de fotones m-2 s-1 PAR. Las semillas se esterilizaron con lejía al 2% (v/v) durante 20 min y se lavaron varias veces con agua destilada (McCourt y Keith, 1998). Luego, las semillas se mantuvieron en oscuridad a 4 °C durante al menos 3 días para sincronizar la germinación antes de transferirlas a sistemas Araponic® (Tocquin et al., 2003) con un sustrato en los soportes de semillas que contenía un 50% (v/v) de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) y un 0,65% (p/v) de agar, y medio MS completo como medio líquido durante 6-8 semanas. Cuando se indica, el medio MS control se sustituyó por medio con deficiencia en algún nutriente. La tabla 3 muestra la composición de las distintas soluciones nutritivas para arabidopsis. Tabla 3. Composición del medio de cultivo de arabidopsis. Composición del medio de cultivo de arabidopsis (Murashige y Skoog, 1962) para condiciones control y de deficiencia de nitrógeno (-N). Macronutrientes Concentración (mM) KNO3 Ca(NO3)2·4H2O SO4Mg·7H2O PO4H2Na·2H2O CaCl2 K2SO4 Control 6 4 1 2 - - -N - - 5 5 Micronutrientes MnSO4·H2O CuSO4·5H2O Na2MoO4 ZnSO4·7H2O H3BO3 CoSO4·7H2O ClNa FeNa-EDTA 10-2 10-3 5·10-4 10-3 5·10-2 2·10-4 1 0.1 Además de Col-0, se utilizaron cuatro líneas SALK (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC). Dos de ellas, atg2 y atg5, deficientes en las correspondientes proteínas, fueron cedidas por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). Las otras dos, atg18a (SALK_N684432) y nbr1 (SALK_N635513), se adquirieron directamente del NASC, y la presencia de la mutación insercional en el locus correspondiente y la homocigosidad de ésta fueron confirmadas por PCR (Alonso et al., 2003). 1.3. Nicotiana benthamiana 1.3.1. Plantas Las plantas de Nicotiana benthamiana Domin fueron cultivadas en sustrato sólido con un ciclo día/noche de 12 h de luz (25 °C, 60% de humedad relativa) y 12 h de Materiales y métodos 98 oscuridad (20 °C, 70% de humedad relativa). La intensidad de luz fue de 350 μmol de fotones m-2 s-1 PAR. Durante la primera semana después de la siembra, las semillas se mantuvieron tapadas con film transparente para favorecer la germinación de éstas. Las plantas de N. benthamiana se mantuvieron creciendo durante 4-5 semanas antes de ser utilizadas para la infiltración con Agrobacterium tumefaciens. 1.3.2. Cultivos de células Se esterilizaron semillas de N. benthamiana con lejía al 2% (v/v) durante 20 min y se lavaron varias veces con agua destilada (McCourt y Keith, 1998). Estas semillas fueron germinadas en placas con medio sólido que contenía un 50% (v/v) de medio MS (Murashige y Skoog, 1962), sacarosa al 2% (p/v) y agar al 1% (p/v). Transcurridas 3 semanas desde la germinación, los tejidos de las raíces se seccionaron en segmentos y se transfirieron a nuevas placas con medio de inducción de callos que contenía MES 0,5 g l-1 pH 5,7, glucosa al 2% (p/v), agar al 0,8% (p/v), MS Basal Medium (Sigma) 4,4 g l-1, ácido 2,4-diclorofenoxiacético 0,5 mg l-1 y kinetina 0,05 mg l-1 durante 2-3 semanas hasta la obtención de callos vegetales. Posteriormente, se transfirieron fragmentos de callos de 0,3 g a un matraz con 20 ml de medio de cultivo celular, que contenía medio MS que incluye vitaminas Gamborg B5 (Duchefa) 4,4 g l-1 pH 5,8, ácido α-naftalenacético 0,5 mg l-1, kinetina 0,05 mg l-1 y sacarosa al 3% (p/v), y se cultivaron bajo un ciclo de día/noche de 12 h de luz (22 °C, 60% de humedad relativa) y 12 h de oscuridad (18 °C, 70% de humedad relativa) en agitación orbital continua a 150 rpm. La intensidad de luz fue de 100 μmol de fotones m-2 s-1 PAR. Después de 10 días, las células generadas se transfirieron a un matraz con 80 ml de medio de cultivo celular nuevo. El mantenimiento del cultivo celular se realizó transfiriendo el 25% del cultivo anterior a un matraz con medio de cultivo celular nuevo una vez a la semana. Todo el proceso tuvo lugar en condiciones de esterilidad. La composición del medio MS que incluye vitaminas Gamborg B5 (Duchefa), utilizado para preparar el medio de cultivo celular es la siguiente: CaCl2 2,99 mM, KH2PO4 1,25 mM, KNO3 18,79 mM, MgSO4 1,5 mM y NH4NO3 20,61 mM como macronutrientes; glicina 26,64 μM, mio-inositol 554,94 μM, ácido nicotínico 4,06 μM, piridoxina-HCl 2,43 mM y tiamina-HCl 0,3 mM como vitaminas; y los micronutrientes de la tabla 3. Para preparar el medio sin fósforo, se eliminó el KH2PO4 del medio; para preparar el medio sin nitrógeno, se eliminaron el KNO3 y el NH4NO3. 2. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS En general, y si no se indica lo contrario, los extractos proteicos de hojas de sorgo se obtuvieron homogeneizando 0,2 g de peso fresco en un mortero a 4 °C con 1 ml de tampón de extracción que contenía Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol al 5% (v/v), ácido Materiales y métodos 99 etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM y MgCl2 10 mM, y que fue suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mM, quimostatina 16,5 μM y leupeptina 2,2 μM como inhibidores de proteasas, y β-mercaptoetanol 14 mM o ditiotreitol (DTT) 10 mM. El homogenado se centrifugó a 17 000 g durante 5 min a 4 °C. En el caso de extractos de raíces de sorgo y de hojas y raíces de arabidopsis, se homogeneizaron 0,5 g de peso fresco en 1 ml de tampón de extracción. Para los extractos proteicos de células de N. benthamiana se trituraron 0,5 g de células, filtradas previamente con membrana de filtro de 0,45 μm (Sigma), en un 1ml de tampón de extracción. 3. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 3.1. Purificación de la PEPC C4 de hojas de sorgo La purificación de la PEPC C4 desfosforilada de hojas de sorgo se llevó a cabo a partir de plantas adaptadas a oscuridad. Se homogeneizaron 20 g de hojas en 100 ml de tampón A, que contenía Hepes-KOH 50 mM pH 8,0, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, EDTA 5 mM, ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) 1 mM, glicerol al 10% (v/v), Triton X-100 al 0,1% (v/v), PMSF 1 mM, leupeptina 2,2 μM y quimostatina 16,5 μM, a 4 °C. El homogenado se centrifugó a 48 000 g durante 15 minutos a 4 °C. Luego se añadió al sobrenadante polietilenglicol 8000 al 8,5% (p/v), se dejó en agitación durante 30 min a 4 °C y se volvió a centrifugar a 48 000 g durante 30 minutos a 4 °C. Un segundo paso de polietinlenglicol 8000 se llevó a cabo, pero en este caso al 20% (p/v), y se centrifugó como en el paso anterior. Las columnas descritas a continuación fueron utilizadas usando un FPLC NGC™ Chromatography System (Bio-Rad). El pellet obtenido se resuspendió en tampón B que contenía Hepes-KOH 50 mM pH 8,0 y KH2PO4 5 mM, y la solución resultante fue cargada a 2 ml min-1 en una columna de hidroxiapatita cerámica de tipo II (Bio-Rad) de 10 ml de volumen, preequilibrada en tampón B. La columna fue lavada con tampón B al que se añadió NaCl 150 mM hasta que el valor de absorbancia A280 descendió hasta estabilizarse en un valor basal. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluidas mediante un gradiente de tampón C que contenía Hepes-KOH 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM y KH2PO4 0,5 M. Las fracciones correspondientes al pico de actividad PEPC se agruparon y se concentraron usando un Amicon Ultra-15 con filtro de 100 kDa (Millipore). A continuación, la muestra fue cargada a 1 ml min-1 en una columna Fractogel EMD DEAE (S) de 10 ml (Merck) pre-equilibrada en tampón D que contenía Tris-HCl 100 mM pH 8,0, MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, DTT 1 mM, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, glicerol al 10% (v/v), PMSF 1 mM, leupeptina 2 μM y quimostatina 16 μM. Las proteínas fueron eluidas con un gradiente lineal (50 ml) de tampón E que contenía tampón D con KCl 1M. Las fracciones correspondientes al pico de actividad PEPC se Materiales y métodos 100 agruparon y se concentraron de nuevo con un Amicon Ultra-15 con filtro de 100 kDa. El sobrenadante se llevó hasta un volumen de 5 ml con tampón D y se cargó a 1 ml min-1 en una columna Macro-Prep High Q Support (Bio-Rad). Las proteínas retenidas en la columna fueron eluidas con un gradiente lineal (25 ml) de tampón E. Las fracciones correspondientes al pico de actividad PEPC se agruparon y se concentraron de nuevo con un Amicon Ultra-15 con filtro de 100 kDa, y el sobrenadante obtenido se llevó hasta un volumen de 1 ml con Tris-HCl 100 mM pH 8,0. La solución final de PEPC se mantuvo en 50% de glicerol a -20 °C. 3.2. Producción y purificación de ATG8a recombinante a partir de E. coli La proteína ATG8a fue producida y purificada a partir de una línea de E. coli BL21 transformada con el plásmido pETG30A que contenía la proteína ATG8a de arabidopsis unida a la proteína glutatión S-transferasa (GST), cedida por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). Las bacterias de esta línea fueron cultivadas a 37 °C en 1 L de medio líquido hasta que alcanzó una densidad óptica a 600 nm de entre 0,6 y 0,8. La inducción de la expresión de la proteína recombinante GSTATG8a se inició añadiendo IPTG 0,2 mM y se mantuvo toda la noche a 37 °C en agitación. El cultivo se centrifugó a 1500 g durante 20 min y el pellet se resuspendió en 10 ml de tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, glicina 50 mM, glicerol al 5% (v/v), benzonasa 2 μl/ml e inhibidores de proteasas en tableta (una tableta por cada 50 ml) y se sonicó (amplitud 60%) durante 4 minutos realizando pausas de 1 segundo por cada segundo transcurrido de sonicado. Se volvió a centrifugar durante 30 min a 10 000 g y 4 °C y se tomó la fase soluble que se transfirió a una columna GST-trap (GE Healthcare) previamente equilibrada con tampón A que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, glicina 50 mM y glicerol al 5% (v/v). La columna fue lavada con tampón A hasta que el valor de absorbancia A280 descendió hasta estabilizarse en un valor basal. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluidas mediante un gradiente de glutatión con tampón de elución que contenía TrisHCl 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, glicina 50 mM, glicerol al 5% (v/v) y glutatión 10 mM. La solución obtenida se incubó durante toda la noche a 4 °C en agitación con 1 mg/ml proteasa 3C (ThermoFisher). A continuación, se transfirió la solución a una columna de exclusión molecular (Gel Filtration Column, Bio-Rad) previamente equilibrada con tampón C que contenía HEPES 20 mM pH 7,5 y NaCl 150 mM. Las fracciones correspondientes a los picos de absorbancia A280 se recolectaron y se analizaron por inmunoblot. Se obtuvieron dos picos, uno correspondiente a GST y el otro a ATG8a, cuyas soluciones finales se mantuvieron en 50% glicerol a -80 °C. Las columnas descritas en este apartado fueron utilizadas usando un FPLC NGC™ Chromatography System (Bio-Rad). Materiales y métodos 101 3.3. Producción y purificación de GST-NBR1 recombinante a partir de E. coli A partir de la clonación de GST-NBR1 descrita en el apartado 6.5.1, el plásmido se purificó mediante miniprep y se utilizó para transformar E. coli BL21. Las colonias positivas se cultivaron a 37 °C en 100 ml de medio líquido hasta que las células alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de entre 0,6 y 0,8. La inducción de la expresión de la proteína recombinante GST-NBR1 se inició añadiendo isopropil-β-D-1tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y se mantuvo durante 6 h más a 37 °C en agitación. El cultivo de E. coli se centrifugó a 1500 g durante 20 min y el pellet se resuspendió en 3 ml de un tampón de extracción que contenía Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,02% (v/v), Tween-20 al 0,05% (v/v), EDTA 5 mM, ácido trietilenglicoldiaminotetraacético (EGTA) 1 mM y DTT 5 mM suplementado con PMSF 1 mM, quimostatina 16,5 μM y leupeptina 2,2 μM. Posteriormente se sonicó (amplitud 60%) durante 6 minutos con pausas de 10 segundos cada 20 segundos de sonicado. Se volvió a centrifugar a 10 000 g durante 15 min a 4 °C y se tomó la fase soluble, que se transfirió a 200 μl de la resina Glutatión Sefarosa 4B (GE Healthcare), previamente equilibrada con el tampón de extracción, y se dejó toda la noche incubando en agitación a 4 °C. A continuación, se centrifugó a 500 g durante 5 min a 4 °C y se realizaron 4 lavados con tampón de lavado que contenía Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM y DTT 5 mM. Por último, se añadieron 100 μl de tampón de lavado y se comprobó mediante inmunblot que la proteína GST-NBR1 se encontraba unida a la resina. Esta resina se utilizó en los experimentos de coinmunoprecipitación con GST-NBR1. 4. ENSAYOS ENZIMÁTICOS 4.1 Determinación de la actividad PEPC La actividad fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) se realizó utilizando un ensayo acoplado a la enzima malato deshidrogenasa (MDH). La MDH reduce el oxalacetato producido por la PEPC a L-malato con oxidación de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), teniendo esta reacción una estequiometría equimolar. Se registró la oxidación del NADH en un lector de placas (Molecular Devices) a 340 nm en 0,2 ml de un medio de reacción que contenía HEPES-KOH 0,1 M pH 8, PEP 2,5 mM, NaHCO3 1 mM, MgCl2 5 mM, NADH 0,2 mM y 5 U ml-1 de MDH (Echevarría et al., 1994), siendo el coeficiente de extinción del NADH a 340 nm de 6,23 μmol-1 ml cm-1. El ensayo se inició con la adición del extracto crudo o solución que contiene PEPC, y se registró la desaparición del NADH durante 5 minutos a 30 °C. Una unidad de enzima Materiales y métodos 102 (U) se define como la cantidad de PEPC que cataliza la carboxilación de 1 μmol de PEP por minuto a pH 8 y 30 °C. 5. TÉCNICAS ANALÍTICAS 5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) Las electroforesis en geles de poliacrilamida o SDS-PAGE se realizaron en condiciones desnaturalizantes según el método descrito por Laemmli (Laemmli, 1970), usando geles discontinuos formados por un gel de compactación al 4% de acrilamida/bisacrilamida (p/v) y un gel de separación con una concentración entre el 8 y el 15% (p/v), dependiendo del peso molecular de la proteína a estudiar. Las muestras fueron suplementadas con tampón de disociación compuesto por Tris-HCl 50 mM pH 6,8, glicerol al 10% (v/v), dodecilsulfato sódico (SDS) al 2% (p/v), β-mercaptoetanol 100 mM y azul de bromofenol al 0,1% (p/v); y se desnaturalizaron durante 5 min a 95 °C. El gel de separación se preparó con un tampón Tris-HCl 375 mM pH 8,8, persulfato amónico al 0,5% (p/v) y TEMED 6 mM. El gel de compactación contenía los mismos componentes excepto que el tampón utilizado fue un Tris-HCl 125 mM pH 6,8. En el caso de los geles para la detección de ATG8-PE, se añadió urea 6 M tanto al gel de separación como al de compactación. Los geles se desarrollaron en una cubeta Mini-Protean® III-2D Cell (Bio-Rad) con tampón de electroforesis que contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS al 0,1% (p/v), a voltaje constante de 200 V durante 50 min. El peso molecular de la PEPC se determinó utilizando como marcadores proteínas pre-teñidas de pesos moleculares conocidos (gTP-bio RGB Prestained Protein Ladder, Bio-Rad). 5.2. Tinción con azul de Coomassie Despues del desarrollo de la electroforesis, los geles se sumergieron durante 1 h en solución de tinción que contenía etanol al 45% (v/v), ácido acético al 10% (v/v) y Coomasie Blue G-250 al 0,27% (p/v). Posteriormente se destiñeron con solución de destinción que contenía etanol al 45% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v). 5.3. Preparación y detección de proteínas carboniladas La carbonilación de la PEPC in vitro se llevó a cabo incubando PEPC C4, purificada de hojas de sorgo, durante 1-20 min a 25 °C con ascorbato de sodio 25 mM y CuSO4 1 mM (Marx y Chevion 1986). La carbonilación de proteínas in planta se realizó suministrando a hojas cortadas metil viológeno (MV) 0,1-5 mM durante 1-12 horas por corriente transpiratoria en la luz (350 μmol de fotones m-2 s-1 PAR). Los presencia de grupos carbonilos en las proteínas se detectó mediante la derivatización de extractos proteicos con 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) y la Materiales y métodos 103 posterior detección inmunológica de los grupos DNP con anticuerpos comerciales antiDNP (Sigma) (Nakamura y Goto, 1996; Levine et al., 2000; Pyngrope et al., 2013). Alícuotas de 100-300 μg de proteínas se mezclaron con un volumen de DNPH 10 mM en HCl 2 M, y se incubaron durante 1 h a 25 °C. Se añadieron diez volúmenes ácido tricoloracético (TCA) al 10% (p/v) en acetona a cada muestra, y se mantuvieron a -20 °C durante 1 h. Las muestras se centrifugaron entonces a 5000 g durante 5 min, y los precipitados formados se lavaron tres veces con una mezcla 1:1 (v/v) de etanol:acetato de etilo. Finalmente, estas proteínas precipitadas se resuspendieron en PBS 10 mM, que contenía fosfato sódico 10 mM pH 7,4 y NaCl 137 mM, y se usaron para la posterior electroforesis y inmunoblot. 5.4. Detección de proteínas S-nitrosiladas 5.4.1. El método de biotin switch La detección de proteínas S-nitrosiladas se llevó a cabo mediante el método de biotin switch (Begara-Morales et al., 2013). Los extractos proteicos se obtuvieron triturando 0,2 g de tejido de hojas de sorgo en 1 ml de tampón HEN, que contenía HEPES-KOH 25 mM pH 7,7, EDTA 1 mM y neocuproína 0,1 mM. El control positivo se preparó incubando la muestra con 1 mM del agente nitrosilante S-nitrosocisteína (CSNO) durante 1 h a 4 °C en oscuridad. A continuación, se añadieron tres volúmenes de tampón de bloqueo, que contenía HEPES-KOH 25 mM pH 7,7, EDTA 1 mM, SDS al 3% (p/v) y S-metilmetanotiosulfonato (MMTS) 28 mM pre-disuelto en dimetilformamida (DMF) seca, para desnaturalizar las proteínas y bloquear los grupos tiol libres. Las muestras se incubaron entonces durante 20 min a 50 °C, dando un vórtex cada 10 min. El exceso de MMTS se retiró precipitando las muestras con acetona, y las proteínas se resuspendieron en 0,1 ml de tampón HENS, que contenía HEPES-KOH 250 mM pH 7,7, EDTA 1 mM, neocuproína 0,1 mM y SDS al 1% (p/v), por cada mg de proteína. La biotinilación se consiguió añadiendo N-[6-(biotinamido)- hexil]-3-(2-piridiltio)-propionamida (biotina-HPDP) y ascorbato 0,1 mM, e incubando a temperatura ambiente durante 1,5 h en oscuridad. Luego, las proteínas se volvieron a precipitar con acetona para eliminar el exceso de biotina, se resuspendieron en HENS y, en el caso de experimentos in vitro o in planta, se separaron por SDS-PAGE (excluyendo al β-mercaptoetanol del tampón de disociación) y se analizaron por inmunoblot detectando las proteínas biotiniladas con anticuerpos comerciales antibiotina (Sigma). 5.4.2. Purificación de proteínas nitrosiladas En el caso de experimentos in vivo, al haber menor cantidad de proteína nitrosilada, los anticuerpos anti-biotina no son lo suficientemente sensibles y se precisa una concentración de dichas proteínas para poder detectarlas. La concentración y purificación de proteínas nitrosiladas se llevó a cabo con resina agarosa Neutravidina® Materiales y métodos 104 (Thermo Scientific), según lo descrito por Correa-Aragunde y colaboradores (2013). Para ello, previamente se sometieron al método de biotin switch 100 μg de proteínas y, una vez marcadas con biotina, se precipitaron con acetona para eliminar el exceso de biotina y, a continuación, se resuspendieron en 100 μl de HEN10 (HEPES-KOH 10 mM pH 7,7, EDTA 1 mM y neocuproína 0,1 mM). Una alícuota de 20 μl de la muestra obtenida se reservó para usarla como control de carga (CC) en el SDS-PAGE. A los 80 μl restantes se les añadieron tres volúmenes de tampón de neutralización, que contenía tampón HEN, NaCl 100 mM y Triton X-100 al 0,5% (v/v), y la mezcla se transfirió a tubos nuevos, que contenían 15 μl de Neutravidina® previamente lavada tres veces con tampón de neutralización, y se mantuvo en agitación durante toda la noche a 4 °C. Los sobrenadantes (SN) obtenidos tras la centrifugación de las muestras durante 1 min a 200 g se precipitaron con acetona, se resuspendieron en HENS y se utilizaron para monitorizar las proteínas no unidas a la Neutravidina®. La resina se lavó 4 veces con tampón de neutralización 600, que contenía HEN, NaCl 600 mM y Triton X-100 al 0,5% (v/v); y las proteínas unidas (EL) se eluyeron con β-mercaptoetanol al 1% (v/v) en tampón HEN10. Para cada muestra, CC, EL y SN se separaron por SDS-PAGE y se analizaron por inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC. 6. MÉTODOS INMUNOLÓGICOS 6.1. Tipos de anticuerpos utilizados en este trabajo 1. Anticuerpos anti-PEPC: anticuerpos policlonales dirigidos contra la totalidad de la PEPC C4 de hojas de sorgo. Producidos en conejo en los Servicios Generales de Investigación de la Universidad de Sevilla. La dilución utilizada fue de 1:3000. 2. Anticuerpos anti-DNP: anticuerpos policlonales dirigidos contra grupos dinitrofenol (DNP). Anticuerpos comerciales producidos en conejo (Sigma). La dilución utilizada fue de 1:500. 3. Anticuerpos anti-biotina: anticuerpos monoclonales dirigidos contra biotina. Anticuerpos comerciales producidos en ratón (Sigma). La dilución utilizada fue de 1:1000. 4. Anticuerpos anti-ATG8: anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína ATG8a de arabidopsis. Anticuerpos comerciales producidos en ratón (Abcam). La dilución utilizada fue de 1:750. 5. Anticuerpos anti-RFP: anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína roja fluorescente (RFP) recombinante. Reconocen todas las variantes de la proteína RFP, incluyendo mCherry. Anticuerpos comerciales producidos en rata (Chromotek). La dilución utilizada fue de 1:1000. 6. Anticuerpos anti-GFP: anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína verde fluorescente (GFP) recombinante. Anticuerpos comerciales producidos en rata (Chromotek). La dilución utilizada fue de 1:1000. Materiales y métodos 105 7. Anticuerpos anti-tubulina: anticuerpos cedidos por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). La dilución utilizada fue de 1:1000. 8. Anticuerpos anti-GST: anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína GST recombinante. Anticuerpos comerciales producidos en ratón (Santa Cruz Biotechnology). La dilución utilizada fue de 1:1000. 9. Anticuerpos anti-ubiquitina: anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína ubiquitina recombinante, clon P4D1-A11. Anticuerpos comerciales producidos en ratón (Merck). La dilución utilizada fue de 1:500. 6.2. Inmunoblot Una vez finalizada la electroforesis, el gel de poliacrilamida se sumergió durante 20 min en tampón TGM, que contenía Tris-HCl 48 mM, glicina 39 mM, SDS al 0,037% (p/v) y metanol al 5% (v/v) (en el caso de inmunoblot para detectar la proteína ATG8 el porcentaje de metanol fue del 20%), en agitación. Los polipéptidos se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm de diámetro de poro (GE Healthcare) o bien a una membrana de PVDF de 0,2 μm de diámetro de poro (GE Healthcare) mediante uno de los siguientes aparatos de transferencia: Semidry Transfer Blot (BioRad) o Trans Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad). En el caso del primer aparato, las transferencias se realizaron durante 45 min a un voltaje constante de 10 V y una corriente límite de 5,5 mA cm-2 de membrana. En el caso del segundo aparato, las transferencias se realizaron durante 20 min a un voltaje constante de 25 V y una intensidad límite de 1,0 A, excepto en el caso de inmunoblot para detectar la proteína ATG8, en cuyo caso las transferencias se realizaron durante 5 min a un voltaje constante de 25 V y una intensidad límite de 1,3 A. Una vez finalizada la transferencia, la membrana se incubó durante 1 h en agitación continua con tampón TBS que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y NaCl 150 mM suplementado con leche desnatada en polvo al 5% (p/v) para saturar los sitios inespecíficos de ésta. Posteriormente se realizaron varios lavados con TBS y se procedió a la incubación con anticuerpos primarios (apartado 6.1) durante 3 h a temperatura ambiente o bien durante toda la noche a 4 °C, siempre en agitación continua. Después de la incubación con anticuerpos primarios se lavó la membrana 3 veces con tampón TBS Tween, que contenía tampón TBS y Tween-20 al 0,1% (v/v), y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa, que pudieron ser anti-conejo (Invitrogen), anti-ratón (Novus) o anti-rata (CST) dependiendo de los anticuerpos primarios; también con agitación constante. Luego, se volvió a lavar la membrana 3 veces con tampón TBS Tween y por último se reveló mediante quimioluminiscencia con uno de los siguientes kits de revelado: SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminiscent Substrate (Thermo Scientific) o Materiales y métodos 112 choque térmico, y las colonias positivas se usaron para transformar hojas de tabaco mediante infiltración. 7.5.3. BFP-NBR1 La proteína recombinante BFP-NBR1 se clonó en un vector de expresión en plantas a través del sistema de clonación GreenGate (Lampropoulos et al., 2013). La secuencia del extremo C-terminal de NBR1 se amplificó a partir del vector ya clonado en el sistema Gateway® usando cebadores específicos que contenían los sitios de recombinación con el plásmido de entrada (Tabla 4). El producto de fue confirmado por tamaño y fue introducido en el vector de clonación pGGC basado en el plásmido pUC19. Esta construcción se utilizó para transformar E. coli DH5α competente y a partir de las colonias positivas, confirmadas por PCR y secuenciación, se purificó el plásmido mediante miniprep. Este plásmido se usó en una reacción GreenGate para introducir la secuencia de PPC3 en un vector de destino pGGZ basado en el plásmido pGreen-IIS unida a BFP bajo el control del promotor y el terminador del gen UBQ10 (Fig. 13C). La construcción en el vector de destino se usó para transformar E. coli DH5α competente y a partir de las colonias positivas, confirmadas por PCR, se purificó el plásmido mediante miniprep. El plásmido purificado se usó, junto con el plásmido auxiliar pSOUP, para cotransformar A. tumefaciens GV3101 competente por choque térmico, y las colonias positivas se usaron para transformar hojas de tabaco mediante infiltración. 7.5.4. mCherry-βC1 La proteína recombinante mCherry-βC1, en su versión corta y larga así como las correspondientes versiones mutadas, se clonaron en un vector de expresión en plantas a través del sistema de clonación GreenGate (Lampropoulos et al., 2013). Las secuencias fueron sintetizadas experimentalmente a partir del alineamiento de parejas de cebadores específicos (Tabla 4). Las parejas de cebadores para la clonación de las versiones de βC1 se utilizaron directamente realizando un alineamiento entre los cebadores a 95 °C durante 3 min y posteriormente reduciendo la temperatura hasta 22 °C a 0,1 °C s-1. El producto del alineamiento fue confirmado por tamaño y fue introducido en el vector de clonación pGGC basado en el plásmido pUC19. Esta construcción se utilizó para transformar E. coli DH5α competente y a partir de las colonias positivas, confirmadas por PCR y secuenciación, se purificó el plásmido mediante miniprep. Este plásmido se usó en una reacción GreenGate para introducir las distintas secuencias de βC1 en vectores de destino pGGZ basados en el plásmido pGreen-IIS unidas a mCherry bajo el control del promotor y el terminador del gen UBQ10 (Fig. 13D). Materiales y métodos 113 La construcción en el vector de destino se usó para transformar E. coli DH5α competente y a partir de las colonias positivas, confirmadas por PCR, se purificó el plásmido mediante miniprep. El plásmido purificado se usó, junto con el plásmido auxiliar pSOUP, para cotransformar A. tumefaciens GV3101 competente por electroporación, y las colonias positivas se usaron para transformar hojas de tabaco mediante infiltración. 7.5.5. GFP-ATG8 Las líneas de A. tumefaciens GV3101 que contenían los plásmidos de expresión en plantas pGGZ (basado en el plásmido pGreen-IIS) del sistema GreenGate, con las construcciones GFP-ATG8a, GFP-ATG8b, GFP-ATG8c, GFP-ATG8d, GFP-ATG8e, GFP-ATG8f, GFP-ATG8g, GFP-ATG8h y GFP-ATG8i, bajo el promotor y terminador del gen UBQ10, fueron donadas por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). Las secuencias procedían de los distintos isogenes ATG8 de arabidopsis. Figura 13. Vectores de expresión utilizados en este trabajo. A. Vector de expresión en E. coli pGEX que contiene la proteína recombinante NBR1 unida GST. B. Vector de expresión en plantas pGreen-IIS que contiene la proteína recombinante SbPPC3 unido a mCherry bajo el control del promotor y terminador de la ubiquitina 10. C. Vector de expresión en plantas pGreen-IIS que contiene el extremo C-terminal de la proteína SbNBR1 unido a BFP bajo el control del promotor y terminador de la ubiquitina 10. D. Vector de expresión en plantas pGreen-IIS que contienen βC1 unido a mCherry bajo el control del promotor y terminador de la ubiquitina 10. Para el resto de versiones de βC1 la construcción es la misma. Materiales y métodos 114 7.5.6. EV-mCherry y EV-GFP Las líneas de A. tumefaciens GV3101, que contenían los plásmidos de expresión en plantas pGGZ (basado en el plásmido pGreen-IIS) del sistema GreenGate, con las construcciones EV-mCherry y EV-GFP, bajo el promotor y terminador del gen UBQ10, fueron donadas por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). Estas construcciones se diseñaron para la expresión de las proteínas fluorescentes mCherry y GFP solas, sin ninguna secuencia codificante unida a ellas, y se utilizaron como control negativo. 7.6. Termoforesis a microescala (MST) La termoforesis a microescala es una técnica novedosa que se usa para determinar la afinidad entre moléculas. Se basa en la detección de cambios termoforéticos debidos a interacción entre las moléculas testadas. Se utilizó la proteína ATG8a de arabidopsis purificada en el apartado 3.2, a la que se le aplicó la tinción fluorescente Monolith™ NT Protein Labeling kit BLUE-MALEIMIDE (NanoTemper Technologies). Los péptidos βC130-40, βC130-40V32A, PexRD54 y PexRD54AIM2, sintetizados experimentalmente, fueron cedidos por el Dr. Yasin Dagdas del Gregor Mendel Institute (Viena, Austria). Las medidas de afinidad se realizaron con 28 nM de la proteína recombinante ATG8a disuelta en agua con un 0,05% de Tween-20 (v/v), que fueron incubadas con los péptidos βC130-40, βC130-40V32A, PexRD54 y PexRD54AIM2 en diluciones seriadas. En los casos de βC130-40 y βC130-40V32A, se utilizó una concentración inicial de 10 mM y 16 diluciones seriadas hasta 305 nM. Para PexRD54 y PexRD54AIM2 se usó una concentración inicial de 2 mM y 16 diluciones seriadas hasta 61 nM. Todas las mezclas experimentales se incubaron durante 30 min antes de transferir las muestras a capilares NT.115 Hydrophobic Treated Capillaries (NanoTemper Technologies). Las medidas se realizaron en un instrumento Monolith™ NT.115 BLUE/RED (NanoTemper Technologies) a 25 °C, con unos tiempos de láser apagado/encendido/apagado de 5 s/ 30 s/ 5 s, una potencia de excitación LED de 70% y una potencia MST del láser infrarrojo del 20%. Los datos de tres experimentos independientes fueron ajustados al modelo de unión simple mediante el software NT.Analysis versión 1.5.41 (NanoTemper Technologies) usando la señal de la termoforesis + T-Jump. 8. MICROSCOPÍA 8.1. Microscopía confocal Para la detección de autofagosomas en plantas de sorgo, las hojas se cortaron en secciones de 1 cm y se sumergieron en monodansilcadaverina (MDC, Sigma) 100 μM en PBS, incubándolas durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Las raíces se sumergieron directamente en la MDC y se incubó en las mismas condiciones. Materiales y métodos 115 Luego, las muestras se lavaron dos veces con PBS durante 15 min y las hojas se volvieron a seccionar a mano usando una cuchilla, de manera que se obtuviera un corte transversal de éstas. Las muestras se observaron usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710 usando un filtro DAPI con excitación a 405 nm y emisión a 452 nm. Para la detección de autofagosomas mediante GFP-ATG8, y de mCherry-βC1, mCherry-PPC3 y BFP-NBR1 en hojas de N. benthamiana infiltradas con A. tumefaciens, éstas se cortaron en secciones cuadradas de 0,5 cm de lado. Las muestras se observaron usando un microscopio confocal Zeiss LSM 710, usando para GFP un láser a 488 nm y un filtro de emisión de 504-533 nm, para mCherry un láser a 561 nm y un filtro de emisión de 610-630 nm, y para BFP un láser a 405 nm y un filtro de emisión de 441-470 nm. La clorofila A se detectó usando el láser a 488 nm y un filtro de emisión de 658-690 nm. 8.2. Detección de autofagosomas por microscopía electrónica En la preparación de las muestras para la microscopía electrónica, secciones de hoja y de raíz de sorgo fueron fijadas con glutaraldehído al 3% (p/v) en cacodilato de sodio 0,1 M, seguido de una post-fijación con tetróxido de osmio al 1% (p/v) en cacodilato de sodio 0,1 M. A continuación, las muestras se lavaron con agua ultrapura y fueron deshidratadas mediante la incubación en una serie de soluciones de etanol con un gradiente positivo de concentración. Por último, se embebieron en resina EMbed-812. Se produjeron secciones ultrafinas en un ultramicrotomo Leica UC7 y las muestras fueron visualizadas en uno de los dos siguientes microscopios electrónicos de transmisión: JEOL JEM-1400 o Zeiss Libra 120, a un voltaje de aceleración de 80 kV. 9. OTROS MÉTODOS 9.1. Infiltración de hojas de N. benthamiana con A. tumefaciens Las líneas de A. tumefaciens fueron cultivadas en 15 ml de medio líquido durante 48 h a 28 °C con agitación constante. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron a 1000 g durante 5 min y se resuspendieron en 1 ml de AgroBuffer, que contenía MES 5 mM pH 5,6 y MgCl2 10 mM. Este proceso se repitió una vez más, y luego se midió la densidad óptica de la muestra a 600 nm. Para la infiltración en hojas de N. benthamiana, se utilizaron las siguientes densidades ópticas en el caso de experimentos para microscopía confocal: isoformas de GFP-ATG8: 0,1-0,2; mCherry-βC1 y versiones: 0,05; mCherry-PPC3: 0,5; BFP-NBR1: 0,5; EV-mCherry: 0,05; EV-GFP: 0,05. En el caso de experimentos para coinmunoprecipitaciones, se usaron las siguientes densidades ópticas: isoformas de GFP-ATG8: 1; mCherry-βC1 y versiones: 0,5; EV-mCherry: 0,1; EV-GFP: 0,1. En el caso de que se coinfiltrara dos o más construcciones, se mezclaron en la misma solución las dos líneas de A. tumefaciens que contenían las construcciones indicadas, manteniendo para cada una la densidad óptica correspondiente. Materiales y métodos 116 Por último, se realizó la infiltración en hojas de N. benthamiana de 5-6 semanas de edad realizando un pequeño corte con una aguja estéril en el envés de la hoja, e introduciendo la solución preparada con A. tumefaciens mediante una jeringuilla estéril de 1 ml a través de la incisión, aplicando al mismo tiempo presión manualmente por la parte correspondiente del haz. Las plantas infiltradas se mantuvieron en las condiciones de cultivo indicadas en el apartado 1.3.1 durante 72 horas. 9.2. Cuantificación de proteínas y medidas de pH Cuando se menciona, la determinación de proteínas en los extractos proteicos se realizó según el método colorimétrico descrito por Bradford (Bradford, 1976). Las medidas de pH se realizaron en un medidor de pH GLP21 provisto de un electrodo (Crison). 10. SOFTWARE INFORMÁTICO Los árboles filogenéticos fueron construidos usando secuencias obtenidas del National Center of Biotechnology Information (NCBI), encontradas usando BLAST, y utilizando el software MEGA7 (Kumar et al., 2016) con el método neighbor-joining. Los árboles fueron inferidos usando el método de Máxima Verosimilitud basado en el modelo de Kimura de 2 parámetros (Kimura, 1980). En los alineamientos múltiples se usó ClustalW. Para el análisis estadístico se utilizó el SigmaPlot 12.0 (Systat Software), siendo los datos analizados mediante el t-test. En los análisis de imagen provenientes de inmunoblots se utilizaron dos programas: MultiGauge V3.0 (Fujifilm) e ImageStudio Lite V5.2 (LI-COR), y para el análisis y edición de imágenes provenientes de microscopía se usó el software ZEN (Zeiss). Para el análisis de datos provenientes de qPCR se utilizó el software CFX Manager V1.6 (Bio-Rad). RESULTADOS Resultados 118 1. SALINITY PROMOTES OPPOSITE PATTERNS OF CARBONYLATION AND NITROSYLATION OF C4 PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE IN SORGHUM LEAVES Non-photosynthetic PEPC isoforms can be modulated both by phosphorylation and/or monoubiquitination (Ruiz-Ballesta et al., 2014, 2016; Arias-Baldrich et al., 2017). The latter post-translational modification (PTM) has not been reported for the photosynthetic C4 isoform so far. Fig. 14 shows the characteristic double band that is immunodetected by anti-PEPC antibodies in sorghum seeds and roots. The upper band is recognized by anti-ubiquitin antibodies (Ruiz-Ballesta et al., 2014, 2016; AriasBaldrich et al., 2017) and it is absent in sorghum leaves (Fig. 14). In the present chapter, two new post-translational modifications of the C4 PEPC of sorghum leaves are characterized: carbonylation and S-nitrosylation, as well as interactions between them. 1.1. PEPC is carbonylated in vitro and in vivo Measuring protein carbonylation level is usually used to evaluate oxidative modification of proteins. Detection and quantification of carbonylated proteins is accomplished after derivatization of the carbonyl groups. The most commonly employed derivatizing reagent is 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) (Dixon, 1964). The DNPH-derivatized proteins can be detected by immuno-blotting of SDS-PAGE separated proteins using commercial antibodies raised against DNP groups (Levine, 2002). Carbonylated proteins can be prepared with copper and ascorbate (Marx and Figure 14. Monoubiquitination of root and seed sorghum PEPC (C 3 isoforms) that is absent in leaf PEPC (C 4 isoform). Extracts were prepared with leaves and roots of control and ammonium-treated plants (supplied with 5 mM (NH 4 4)2SO4 instead of nitrate, for 21 days), and with sorghum seeds that had been kept in distilled water for 20 h. A. 10 mU of PEPC were used for SDS-PAGE and immunoblot with anti-PEPC antibodies. B. Leaf extracts from control and ammonium-treated plants were diluted as indicated. Resultados 119 Chevion, 1986). Indeed, the incubation of purified C4-type PEPC from sorghum leaves with 25 mM sodium ascorbate and 0.1 mM CuSO4 increased the amount of immunoreactive DNP-PEPC (Fig. 15A) by 3.6-fold (Fig. 15B). The treatment caused a time-dependent inactivation of the enzyme (Fig. 15C). To promote the oxidative modification of PEPC in planta, excised leaves were supplied with methyl viologen (MV) by transpiratory steam in the light (Fig. 16). MV causes an overproduction of ROS within chloroplasts, subjecting the plant to a severe oxidative stress. The supply of 5 mM MV caused a progressive increase of protein carbonylation level (Fig. 16A) accompanied by a parallel decrease of PEPC activity (Fig. 16B). At lower concentrations (0.1 and 0.5 mM), MV supplied for 12 h likewise increased the relative amount of carbonylated PEPC (Fig. 16C) and decreased enzyme activity (Fig. 16D). The loss of activity was not a result of protein cleavage (Fig. 17). The identity of the 105 kDa protein recognized by anti-DNP antibodies was confirmed by immunoprecipitation with anti-C4 PEPC antibodies (Fig. 16E, F). Fig. 16E shows that Figure 15. In vitro carbonylation of PEPC causes activity loss. Purified sorghum leaf PEPC (300 mU, 200 U mg -1 protein) was incubated in 100 μl of 0.1 M phospate-buffered saline (PBS), pH 7.5, 0,15 NaCl, in the presence (T, treatment) or absence (C, control) of 25 mM sodium ascorbate and 0.1 mM CuSO 4 . A. Detection of carbonylated PEPC. After 20 min of incubation at 25 ° C, proteins were processed as described in “Materiales y métodos”, analyzed by SDS-PAGE and immuno-blotted with anti-DNP (aliquots corresponding to 100 mU PEPC) and anti-PEPC antibodies (aliquots corresponding to 2 mU PEPC). B. Quantitative data (mean ± SE, n = 4) of the carbonylation. The ratio of the signal obtained with anti-DNP and anti-PEPC antibodies was calculated, and an arbitrary value of 1 was ascribed to the ratio of the control. C. Time-course of PEPC inactivation. 100% activity corresponded to 7.29 ± 1.05 U mg -1 . Values are expressed as mean ± SE ( n = 4). Bars at a P < 0.05 versus control (t test); at b P < 0.01 versus control (t test). 0 5 10 15 20 20 40 60 80 100 120 Control Treatment 0 1 2 3 4 A PEPC activity (%) TIME (min) b b C a C T anti-DNP anti-PEPC PEPC PEPC B RATIO (anti-DNP/anti-PEPC) a Control Treatment Resultados 120 the amount of immunoprecipitated protein that was recognized by anti-PEPC antibodies was alike in control and MV-treated plants (IP bands, anti-PEPC). On the contrary, the signal corresponding to carbonylated proteins increased in MV-treated plants with respect to control plants (IP bands, anti-DNP). The quantification of IP bands showed that the ratio of carbonylated to total PEPC (anti-DNP/anti-PEPC) was significantly increased by the treatment with MV (Fig. 16F). Figure 16. The supply of MV to sorghum excised leaves promotes PEPC carbonylation and loss of activity. A, B. Fully expanded leaves were excised and supplied with distilled water (control) or 5 mM MV (treatment) by transpiratory steam in the light (350 μmol photons m -2 s-1 PAR). A. Immunodetection of carbonylated PEPC. Leaf extracts (0.2 g) were prepared at different times, as described in “Materiales y métodos”. Immunoblots (75 μg protein per lane) were probed with anti-DNP and anti-PEPC antibodies. B. Time-course of PEPC inactivation. 100% of activity corresponded to 1.7 ± 0.3 U mg -1 protein. Values are expressed as mean ± SE ( n = 4). C, D. Excised leaves were supplied with 0, 0.1 or 0.5 mM MV for 12h in the light. C. Proteins (aliquots corresponding to 100 mU PEPC) were processed as described in “Materiales y métodos”, analyzed by SDS-PAGE and immuno-blotted with anti-DNP and anti-PEPC antibodies. Values are expressed as mean ± SE ( n = 4). D. PEPC activity. Values are expressed as mean ± SE (n = 4). 100% of activity corresponded to 0.75 ± 0.26 U mg -1 . E, F. Extracts (0.2 g) from control and 0.1 mM MV-supplied leaves (24 h) were immunoprecipitated as described in “ Materiales y métodos”, and then treated with DNPH. E. Immunoprecipitates (IP) and supernatants (SN) were immuno-blotted with anti-DNP (aliquots corresponding to 60 μg) and anti-PEPC (aliquots corresponding to 15 μg) antibodies. F. Quantitative data (mean ± SE) from independent experiments ( n = 4). Bars at a P < 0.05 versus control (t test); at b P < 0.01 versus control ( t test). Arrows show PEPC. 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 Control 0.1 mM MV 0.5 mM MV 0 1 2 3 4 5 6 7 20 40 60 80 100 120 Control MV 1h 3h 5h 7h Control MV anti-DNP anti-PEPC anti-PEPC anti-DNP PEPC activity (%) AB TIME (h) CD EF b b PEPC activity (% of control) RATIO (anti-DNP/anti-PEPC) RATIO (anti-DNP/anti-PEPC) Control 0.1 mM MV Control 0.1 mM MV 0.5 mM MV a a MW Control MV (100kDa) IP SN IP SN a anti-DNP anti-PEPC a a Resultados 121 The effect of MV was measured in the presence of the ubiquitin-proteasome pathway inhibitor MG132 (Lee and Goldberg, 1998) and the autophagy inhibitor concanamycin A (concA) (Matsuoka et al., 1997). Both inhibitors decreased specific PEPC activity, presumably due to accumulation of altered proteins that were cleared by these two pathways (Fig. 18). The observation that MG132, but not concA, increased the amount of PEPC protein necessary to obtain a fixed PEPC activity, suggested that inactive, carbonylated PEPC was cleared by the ubiquitin-proteasome pathway. These results show that PEPC is carbonylated both in vitro and in planta, and this oxidative modification of the protein causes its inactivation. anti-DNP anti-PEPCase PEPCase 0 0.1 0.5 0 0.1 0.5 MV (mM) MV (mM) Figure 17. MV promotes the carbonylation of PEPC without causing the cleavage of the enzyme. Excised leaves were supplied with 0, 0.1 or 0.5 mM MV for 12 h in the light (350 μmol photons m -2 s-1 PAR). Leaf extracts (0.2 g) were prepared as described in “Materiales y métodos”. Immunoblots (75 μg protein per lane) were probed with anti-DNP and anti-PEPC antibodies. Figure 18. Effect of MG132 and concA on the accumulation of inactive PEPC in MV-treated leaves. Excised leaves were supplied overnight with distilled water (control) or 0.2 mM MG132 or 1 μM concA (concA). Then were supplied, when indicated, with 5 mM MV and illuminated for 3 h. PEPC activity was measured in crude extracts, and aliquots containing 8 mU were subjected to SDS-PAGE and immunoblotted with anti-PEPC antibodies. Numbers in the table are means ± SE of two independent experiments. PEPCase 135 100 75 63 180 245 48 MW Control MG-132 Conc A -MV +MV -MV + MV -MV + MV Control Control MV MG-132 MG-132 MV Conc A Conc A MV anti-PEPCase signal (8 mU) 1.0 0 1.2 0 1.1 0.9 1.6 0.1 1.1 0.1 1.2 0.4 PEPCase activity (U mg-1 protein) 1.0 0.2 0.7 0.1 1.2 0.2 0.6 0.1 1.0 0.4 0.5 0.1 Control Control MV MG132 MG132 MV Conc A Conc A MV anti-PEPCase signal (8 mU) 1.0 ±0.0 1.2 ±0.0 1.1 ±0.9 1.6 ±0.1 1.1 ±0.1 1.2 ±0.4 PEPCase activity (U mg-1 protein) 1.0 ±0.2 0.7 ±0.1 1.2 ±0.2 0.6 ±0.1 1.0 ±0.4 0.5 ±0.1 Resultados 128 monocotiledónea con metabolismo C4, presentó este segundo gen ATG6 (XM_012845763) que puede ser incluido en el mismo clado que SbATG6b (Fig. 24). SbATG18a (Sb03g044990), que es homólogo a AtATG18a (At3g62770) de acuerdo a BLAST, también fue analizado filogenéticamente junto a secuencias de nucleótidos de genes ATG18a y ATG18a-like de varias plantas y animales. El análisis filogenético determinó que el gen SbATG18a es un homólogo del gen ATG18a de plantas (Fig. 25). Figura 24. Relaciones filogenéticas entre genes ATG6 eucarióticos. El árbol filogenético fue generado con el programa MEGA7 usando el método neighbor-joining. El análisis de bootstrap se realizó a partir de 1000 réplicas. Los números en las ramas indican los valores de bootstrap (porcentaje). Las secuencias fueron obtenidas del NCBI ( National Center for Biotechnology Information). El gen PPC1 de Sorghum bicolor se utilizó como grupo externo. Monocotiledóneas (ATG6a) Monocotiledóneas (ATG6b) Dicotiledóneas Animales AM075827 Triticum aestivum (TaATG6a) XM 020319307 Aegilops tauschii AM075824 Hordeum vulgare KF294802 Triticum aestivum (TaATG6b) XM 015774902 Oryza sativa (OsATG6c) XM 015767222 Oryza sativa (OsATG6a) XM 015774422 Oryza sativa (OsATG6b) XM 004971054 Setaria italica AM075825 Sorghum bicolor (SbATG6a) NM 001112413 Zea mays AM075826 Saccharum officinarum XM 002458279 Sorghum bicolor (SbATG6b) XM 012845763 Setaria italica AM075834 Solanum tuberosum KR336563 Nicotiana tabacum NM 001340123 Arabidopsis thaliana AM075832 Malus x domestica AM075835 Vitis vinifera NM 142952 Drosophila melanogaster NM 200872 Danio rerio NM 001313999 Homo sapiens NM 019584 Mus musculus XM 002438476 Sorghum bicolor (SbPEPC1) PC1) Figura 25. Relaciones filogenéticas entre genes ATG18a eucarióticos. El árbol filogenético fue generado con el programa MEGA7 usando el método neighbor-joining. El análisis de bootstrap se realizó a partir de 500 réplicas. Los números en las ramas indican los valores de bootstrap (porcentaje). Las secuencias fueron obtenidas del NCBI ( National Center for Biotechnology Information). El gen PPC1 de Sorghum bicolor se utilizó como grupo externo. NM 001301515 Zea mays ATG18a-like XM 002458998 Sorghum bicolor (SbATG18a) XM 004971122 Setaria italica (SiATG18a) XM 015765710 Oryza sativa (OsATG18a) AK364793 Hordeum vulgare (HvATG18a) AK331612 Triticum aestivum ATG18a-like XM 020307444 Aegilops tauschii (AtATG18a) XM 002263940 Vitis vinifera (VvATG18a) XM 016654230 Nicotiana tabacum ATG18a-like KC800804 Malus domestica (MdATG18a) NM 116142 Arabidopsis thaliana (AtATG18a) XM 002531820 Ricinus communis (RcATG18a) XM 006479844 Citrus sinensis (CsATG18a) NM 001300048 Drosophila melanogaster (DmATG18a) XM 002438476 Sorghum bicolor (SbPEPC1) Monocotiledóneas Dicotiledóneas PC1) Resultados 129 Se realizaron análisis de expresión por PCR cuantitativa a tiempo real de SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b en hojas y raíces de plántulas de sorgo bajo deficiencia de nitrógeno, carbono, fósforo y hierro, así como bajo estrés oxidativo inducido por el suministro de 10 μM de metil viológeno (MV). No se encontraron cambios de expresión bajo deficiencia de nitrógeno para ninguno de los tres genes. Por el contrario, la deficiencia de carbono aumentó sustancialmente los niveles de expresión de los tres genes tanto en hoja como en raíces, siendo significativa esta diferencia para SbATG18a y SbATG6a en hojas y para los tres genes en raíces (Fig. 26). La deficiencia de fósforo incrementó significativamente la expresión de los tres genes en hojas (Fig. 26A), mientras que en raíces no hubo diferencias significativas (Fig. 26B). Aunque la deficiencia de hierro elevó la expresión de los tres genes tanto en hojas como en raíces, estas diferencias no fueron significativas (Fig. 26). El estrés oxidativo mediado por MV aumentó la expresión de los tres genes en hojas y en raíces, siendo este aumento significativo para SbATG6a en hojas y para los tres genes en raíces (Fig. 26). Por último, se midieron los niveles de expresión de SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b en plantas sometidas a choque salino. Las plántulas de sorgo fueron tratadas con 172 mM NaCl (10 g/l NaCl), lo que provocó un aumento progresivo de los niveles de ARNm en hojas de los tres genes testados durante las primeras 48 h (Fig. 27A). En raíces, por el contrario, el tratamiento de choque salino no cambió la expresión de los tres genes (Fig. 27B). En conjunto, los resultados de las medidas de expresión de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b muestran un aumento de estas expresiones sólo en algunas de las condiciones en las que se activa la autofagia. Además, los cambios de expresión de estos tres genes pueden ser distintos en las hojas y en las raíces de sorgo. Figura 26. Análisis de qPCR de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b bajo estrés abiótico. El ARN total se extrajo de hojas (A) y raíces (B) de plantas de sorgo de 10 días de edad. El nivel relativo de ARNm de cada gen individual se normalizó con respecto al gen Sb ACTINA . Las plantas se cultivaron en solución nutritiva completa (control) y en solución nutritiva sin nitrógeno (-N), sin fósforo (-P) y sin hierro (-Fe) durante 2 días. La deficiencia de carbono se indujo manteniendo a las plantas en oscuridad durante 2 días (-C). El estrés oxidativo se indujo suplementando la solución nutritiva completa con MV 10 μM durante 2 días (MV). Los datos se representan con respecto al control (porcentaje). Los resultados son la media ± EE de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con respecto al control ( t test, P < 0,05). A 0 100 200 300 400 500 600 Control -N -C MV -P -Fe Expresión relativa (%) Tratamiento Hojas SbATG18a SbATG6a SbATG6b * * * ** * B 0 100 200 300 400 500 600 700 Control -N -C MV -P -Fe Expresión relativa (%) Tratamiento Raíces SbATG18a SbATG6a SbATG6b * * * * * * Resultados 130 2.2. Visualización de autofagosomas de sorgo por microscopía confocal Uno de los métodos más utilizados para el estudio de la autofagia en plantas es la visualización directa de los autofagosomas mediante microscopía confocal, y en especial la utilización de la proteína de fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) y ATG8 (GFP-ATG8) como marcador fluorescente en los autofagosomas (Bassham, 2014). En el caso del sorgo, al ser más compleja y costosa su transformación para conseguir expresar esta proteína de fusión, se ha utilizado como alternativa un tinte fluorescente: la monodansilcadaverina (MDC) (Contento et al., 2005). Este tinte se acumula y emite fluorescencia dentro de compartimentos rodeados de membrana que poseen un lumen ácido y una membrana rica en lípidos, características típicas de los autofagosomas, visualizándose al microscopio confocal como estructuras punteadas fluorescentes dentro de las células. Conjuntamente se usó el inhibidor de la degradación vacuolar de autofagosomas concanamicina A (concA), con el objetivo de que los autofagosomas formados se acumularan en la vacuola (Yoshimoto et al., 2004). Se visualizaron hojas y raíces de sorgo en diferentes condiciones de estrés que inducen la autofagia: deficiencia de nitrógeno, deficiencia de carbono, choque salino y estrés oxidativo inducido por H2O2. El número de estructuras punteadas aparecieron en número reducido en hojas (Fig. 28A) y raíces (Fig. 28B) del control, tanto en presencia como en ausencia de concA. El número de puntos fluorescentes de MDC (indicados por flechas amarillas) aumentó en hojas y raíces con deficiencia de nitrógeno y carbono y tratadas con H2O2, mientras que el choque salino elevó este número en hojas, pero no en raíces (Fig. 28). Estos resultados indican que la tinción con MDC es válida para la detección de la autofagia en hojas y raíces de sorgo ya que muestra un incremento de puntos fluorescentes, correspondientes a los autofagosomas, en condiciones en las que la autofagia es inducida. Figura 27. Análisis de qPCR de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b bajo choque salino. El ARN total se extrajo de hojas (A) y raíces (B) de plantas de sorgo de 10 días de edad. El nivel relativo de ARNm de cada gen individual se normalizó con respecto al gen Sb ACTINA. A tiempo 0, a las plantas se les suministró solución nutritiva completa suplementada con NaCl 172 mM durante 3, 6, 24 y 48 h. Los datos se representan con respecto al control (porcentaje). Los resultados son la media ± EE de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estad í sticamente significativas con respecto al control a 0 h (t test, P < 0,05). 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 3 6 24 48 Expresión relativa (%) Tiempo (h) Hojas SbATG18a SbATG6a SbATG6b * * * A 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 3 6 24 48 Expresión relativa (%) Tiempo (h) Raíces SbATG18a SbATG6a SbATG6b B Resultados 131 Figura 28. Visualización de autofagosomas por microscopía confocal mediante tinción con MDC en sorgo. Muestras de hojas (A) y raíces (B) de sorgo de 10 días de edad en condiciones control y de deficiencia de nitrógeno (-N), carbono (-C), estrés oxidativo inducido por H 2O2 10 μM (H2O2) y choque salino (NaCl) durante 2 días fueron teñidas con MDC 100 μM tal y como se describe en Materiales y métodos. Las plantas fueron tratadas con 1 μM concA (concA+), o no (concA-), durante 2 días antes de su visualización para inhibir la degradación de los autofagosomas. La visualización de las muestras se realizó en un microscopio confocal Zeiss LSM 7 Duo usando un filtro DAPI con excitación y emisión a 405 y 452 nm, respectivamente. Se muestra una imagen representativa para cada tratamiento. Las flechas amarillas indican autofagosomas. Control concA- -N concA+ Control concA+ -C concA+ H2O2 concA+ NaCl concA+ A BControl concA- -N concA+ Control concA+ -C concA+ H2O2 concA+ NaCl concA+ Resultados 132 2.3. Visualización de autofagosomas de sorgo por microscopía electrónica Otro método comúnmente utilizado para la visualización directa de autofagosomas en plantas es la microscopía electrónica (Rose et al., 2006). Normalmente se usa como un modo de confirmación de que las estructuras punteadas teñidas por MDC son realmente autofagosomas, visualizándose como estructuras de doble membrana en el caso de que se encuentren en el citoplasma. Por ello, se utilizó el microscopio electrónico de transmisión para visualizar autofagosomas en muestras de plántulas de sorgo. Además, se realizó un recuento de autofagosomas por célula en cada muestra para poder compararlas. Se visualizaron hojas (Fig. 29A) y raíces (Fig. 29B) de sorgo en diferentes condiciones de estrés que inducen la autofagia: deficiencia de nitrógeno, deficiencia de carbono, choque salino y estrés oxidativo inducido por H2O2. Los autofagosomas (indicados por flechas rojas) se visualizaron como vesículas de doble membrana fuera de la vacuola, y la mayoría de ellos con contenido dentro (Fig. 30). El número medio de autofagosomas por célula en las muestras control sin concA fue de 3,58±0,88 y 1,48±0,48 en hojas y raíces de sorgo, respectivamente (Fig. 31A, B, Control concA-). El tratamiento con concA aumentó levemente la cantidad media de autofagosomas en raíces (Fig. 31B, Control concA+), y la mantuvo en hojas (Fig. 31A, Control concA+). Todos los tratamientos aumentaron la densidad media de autofagosomas tanto en hojas como en raíces, siendo el tratamiento con H2O2 el que mostró una mayor densidad de autofagosomas, llegando hasta 12,80±2,00 autofagosomas por célula en hojas y a 15,15±2,30 en raíces (Fig. 31A, B). Se obtuvieron diferencias significativas con respecto al control con concA en hojas con deficiencia de nitrógeno y tratadas con H2O2. Estos resultados indican que la visualización de autofagosomas por microscopía electrónica de transmisión constituye un método adecuado para la detección de un aumento en la densidad de autofagosomas en plantas de sorgo en condiciones que activan la autofagia. 2.4. Inmunodetección del aducto ATG8-PE en plantas de sorgo Uno de los pasos clave en la formación de los autofagosomas es la unión covalente de la proteína ATG8 a fosfatidiletanolamina (PE). Esta unión ATG8-PE migra más rápido en electroforesis en geles de acrilamida en presencia de urea, diferenciándose así de la forma libre de ATG8 (Bassham, 2014). Partiendo de esta base, se han utilizado anticuerpos contra la proteína ATG8a de arabidopsis para detectar en inmunoblots diferencias en la cantidad de conjugado ATG8-PE en extractos crudos de hojas de plantas de sorgo sometidas a estrés nutricional por falta de nitrógeno y carbono, y a estrés oxidativo inducido por H2O2. Además, una réplica de cada muestra fue incubada a 37 °C durante 1 h con fosfolipasa D para eliminar el lípido unido a ATG8, como control de que la banda corresponde realmente a ATG8-PE. Resultados 133 AControl concA+ NaCl concA+ -N concA+ -C concA+ H2O2concA+ BControl concAControl concA+ NaCl concA+ -N concA+ -C concA+ H2O2concA+ Control concAFigura 29. Visualización de autofagosomas por microscopía electrónica de transmisión en sorgo. Muestras de hojas (A) y raíces (B) de plantas de sorgo de 10 días de edad en condiciones control y de deficiencia de nitrógeno (-N), carbono (-C), estrés oxidativo inducido por H 2O2 10 μM (H2O2) y choque salino (NaCl) durante 2 días fueron fijadas tal y como se describe en Materiales y métodos. Las plantas fueron tratadas con concA 1 μM (concA+), o no (concA-), durante 2 días antes de su fijación para inhibir la degradación de los autofagosomas. La visualización de las muestras se realizó en un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 a un voltaje de aceleración de 80 kV. Se muestra una imagen representativa para cada tratamiento. Las flechas rojas indican autofagosomas. Resultados 134 En la Fig. 32 se observan dos bandas de ATG8, una correspondiente a la forma libre de ATG8, la superior, mientras que la inferior corresponde a la forma lipidada ATG8-PE, ya que desaparece cuando el extracto ha sido incubado con fosfolipasa D. En cuanto a los tratamientos, se observa un aumento en la cantidad de conjugado ATG8PE cuando se utiliza concA para inhibir la degradación de los autofagosomas (Fig. 32). No obstante, las diferencias son leves si se comparan las condiciones control (Fig. 32, Control concA+) con las condiciones de estrés (Fig. 32A, -N concA+, -C concA+; Fig. 32B, -N concA+, H2O2 concA+), en las que sólo se aprecia un leve aumento del conjugado en deficiencia de nitrógeno y estrés oxidativo inducido por H2O2. Estos resultados indican que la inmunodetección del aducto ATG8-PE en sorgo con Figura 30. Visualización de autofagosomas por microscopía electrónica de transmisión en sorgo. Imágenes ampliadas de autofagosomas en distintas muestras. Los tratamientos son los que aparecen en la Fig. 29. Raíces control concA+ Hojas H2O2 concA+ Hojas NaCl concA+ Hojas –N concA+ Figura 31. Densidad de autofagosomas visualizados por microscopía electrónica de transmisión en sorgo. Se realizó un recuento de autofagosomas en el microscopio electrónico de transmisión, en hojas (A) y raíces (B) de las muestras descritas en la Fig. 29. Se muestra la media ± EE de 2-4 experimentos independientes, y para cada experimento se contaron los autofagosomas en 20 células. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con respecto al control concA+ ( t test, P < 0,05). AB 0 5 10 15 Control concAControl concA+ -N concA+ -C concA+ H2O2 concA+ NaCl concA+ Autofagosomas/célula 0 5 10 15 20 Control concAControl concA+ -N concA+ -C concA+ H2O2 concA+ NaCl concA+ Autofagosomas/célula * * H2O2H2O2 Resultados 135 anticuerpos anti-ATG8a de arabidopsis no es lo suficientemente sensible para detectar diferencias en condiciones que activan la autofagia. Figura 32. Análisis por inmunoblot del aducto ATG8-PE en hojas de sorgo. Extractos crudos de muestras de hojas de sorgo en condiciones control y de deficiencia de nitrógeno (-N), carbono (-C) (A) y estrés oxidativo inducido por H 2O2 10 μM (H2O2 ) durante 2 días (B) fueron obtenidos tal y como se describe en Materiales y métodos. Las plantas fueron tratadas con concA1 μM (concA+), o no (concA-), durante 2 días antes de su recogida para inhibir la degradación de los autofagosomas. La concentración de proteínas se midió en los extractos crudos, y alicuotas de 60 μg fueron incubadas con fosfolipasa D 1000 U/ml (Pl. D) a 37 °C durante 1 h previamente a someterlas a electroforesis SDS-PAGE y a inmunoblot con anticuerpos anti-ATG8. M: marcador molecular. 20 kDa 17 kDa ATG8 ATG8-PE Control Control -N -C concAconcA+ concA+ concA+ M + - + - + - + - (Pl. D) Control Control -N H2O2 concAconcA+ concA+ concA+ M + - + - + - + - (Pl. D) 17 kDa ATG8 ATG8-PE AB Resultados 136 3. ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN DE LA PROTEÍNA VÍRICA βC1 CON LAS PROTEÍNAS ATG8 DE ARABIDOPSIS Recientemente se ha descrito la interacción entre el factor de virulencia βC1 del virus de Multán del enrollamiento de la hoja de algodón (CLCuMuV) y las proteínas ATG8 de Nicotiana benthamiana Domin (Haxim et al., 2017). A través de esta interacción, la planta es capaz de degradar este factor de virulencia vía autofagia, lo que proporciona resistencia de la planta al virus. En concreto, el dominio esencial para que se produzca esta interacción reside entre los residuos en posición 30 y 40 de βC1, y en este caso no se trata de un motivo AIM (ATG8-interacting motif). Esto abriría la puerta a un posible uso como herramienta de detección de autofagosomas, ya que no interfiere con otros posibles cargos de ATG8. Una mutación puntual en el residuo de valina en posición 32 elimina la interacción, lo que incrementa los síntomas de la planta frente al virus (Haxim et al., 2017). En este apartado se realiza un análisis de la interacción de βC1 con las isoformas de la proteína ATG8 de arabidopsis. En primer lugar, se clonó la proteína de fusión mCherry junto con el motivo de unión a ATG8 de la proteína βC1 (βC130-40), o bien su versión mutada (βC130-40V32A), en la que está cambiado el residuo de valina por alanina en posición 32. Del mismo modo, se clonó una versión más larga de la proteína, con los primeros 40 residuos (βC11-40), y su versión mutada (βC11-40V32A), con la proteína fluorescente roja mCherry. Estas proteínas de fusión se utilizaron junto a las proteínas de fusión GFP-ATG8 de las 9 isoformas ATG8a-i de arabidopsis en experimentos de expresión transitoria en N. benthamiana y posterior colocalización por microscopía confocal y coinmunoprecipitación de proteínas. 3.1. Colocalización por microscopía confocal En la colocalización por microscopía confocal se utilizaron las isoformas ATG8a y ATG8e de arabidopsis en combinación con las diferentes versiones de βC1. La versión larga de la proteína de fusión mCherry-βC1, mCherry-βC11-40, colocalizó fielmente con los autofagosomas marcados con GFP-ATG8a y con GFP-ATG8e, estando presente en prácticamente la totalidad de estructuras punteadas que se localizaron en las células de las hojas de tabaco (Fig. 33A, B, mCherry-βC11-40). La versión corta de βC1, βC130-40, colocalizó algo peor que la versión larga con los autofagosomas marcados por GFPATG8a y mucho peor con GFP-ATG8e (Fig. 33A, B, mCherry-βC130-40). Las versiones que poseían una mutación puntual, mCherry-βC11-40V32A y mCherry-βC130-40V32A, se localizaron débilmente en las estructuras punteadas marcadas con GFP-ATG8a y GFPATG8e (Fig. 33A, B, mCherry-βC11-40V32A y mCherry-βC130-40V32A). Por último, se utilizaron las proteínas de fusión GFP y mCherry solas como controles. Mientras que EV-mCherry no se localizó prácticamente en ninguno de los autofagosomas marcados por GFP-ATG8a (Fig. 33C, EV-mCherry), EV-GFP se localizó en estructuras punteadas Resultados 137 a pesar de no poseer la proteína ATG8, y además mCherry-βC11-40 colocalizó débilmente con estas estructuras. Figura 33. Colocalización de GFP-ATG8a de arabidopsis y mCherry-βC1 por microscopía confocal. Hojas de Nicotiana benthamiana fueron infiltradas con Agrobacterium tumefaciens estirpe GV3101 transformada con el plámisdo pGreen-IIS con las construcciones: GFP-ATG8a (A) y GFP-ATG8e (B) en combinación con mCherry-βC1 1-40, mCherry-βC11-40V32A, mCherry-βC130-40 y mCherry-βC11-40V32A , cuya composición se detalla en Materiales y métodos. C. Controles con las proteínas fluorescentes solas: GFP (EV-GFP) y mCherry (EV-mCherry). Las plantas se mantuvieron en oscuridad durante 48 h previas a su visualización para inducir la autofagia, y sus hojas se infiltraron con concA 1 μM 16 h antes de su visualización para bloquear la degradación de los autofagosomas. 72 h después de la infiltración, secciones de hoja de N. benthamiana se visualizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 7 Duo usando para GFP un láser a 488 nm y un filtro de emisión a 504-533 nm y para mCherry un láser a 561 nm y un filtro de emisión a 610-630 nm. Se muestra una imagen representativa de cada combinación. Las flechas blancas indican autofagosomas. mCherryβC11-40 GFP-ATG8a Combinado mCherryβC11-40V32A mCherryβC130-40 mCherryβC130-40V32A A 10 μm10 μm 10 μm 10 μm 10 μm10 μm 10 μm 10 μm10 μm mCherryβC11-40 GFP-ATG8e Combinado mCherryβC11-40V32A mCherryβC130-40 mCherryβC130-40V32A B 10 μm10 μm 10 μm 10 μm10 μm 10 μm 10 μm10 μm10 μm mCherryβC11-40 EV-GFP Combinado EV-mCherry GFP-ATG8a C 10 μm 10 μm10 μm 10 μm10 μm10 μm Resultados 144 Los resultados del análisis del patrón de monoubiquitinación de la PEPC mostraron un aumento de ésta, en forma de ratio p110/p107, en hojas y raíces de todas las líneas de arabidopsis respecto a Col-0 (Fig. 41A, B), y este aumento fue significativo en hojas de las líneas atg2 y atg5 y en raíces de atg2 (Fig. 41C). La banda p110 corresponde a la PEPC monoubiquitinada, y p107 a la que no lo está. Estos resultados indican que, en plantas de arabidopsis en condiciones que activan la autofagia, la cantidad de PEPC monoubiquitinada desciende. Y que en plantas de arabidopsis con alguna deficiencia en la vía autofágica se acumula más PEPC que en el silvestre, resultando en un aumento de PEPC monoubiquitinada con respecto a la no monoubiquitinada. Por lo tanto, al menos una fracción de la PEPC de tipo C3 es degradada por autofagia selectiva, siendo la monoubiquitinación un marcaje para su reclutamiento al autofagosoma. 4.3. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GST-NBR1 Svenning et al. (2011) mostraron que la proteína NBR1 de plantas se une a proteínas monoy poliubiquitinadas a través de su dominio de unión a ubiquitina UBA2. Por ello, se clonó mediante el sistema Gateway® el gen SbNBR1 truncado conteniendo los dos dominios a ubiquitina (UBA1 y UBA2), y el motivo AIM o de unión a ATG8. Se indujo la producción de la proteína recombinante GST-NBR1 en E. coli, y posteriormente se purificó y se utilizó unida a una resina de glutatión-agarosa. Esta resina, con la proteína recombinante unida, se utilizó para la realización de Figura 41. Análisis de la ubiquitinación de la PEPC en líneas SALK de arabidopsis deficientes en proteínas autofágicas. Plantas de arabidopsis silvestre (Col-0) y de las líneas SALK atg2, atg5 (A), nbr1 y atg18a (B) fueron cultivadas tal y como se describe en Materiales y métodos durante 6 semanas. A, B. Se realizaron extractos de proteínas de hojas y raíces y se analizaron (alícuotas correspondientes a 50 μg de proteína total) por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC o anticuerpos anti-ubiquitina. C, D. Se cuantificaron las dos bandas correspondientes a la PEPC y se calculó la ratio entre la PEPC monoubiquitinada (Ub-PEPC; p110) y la PEPC desubiquitinada (PEPC; p107). Los valores representan la media ± EE de 2 o más experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con respecto a Col-0 ( t test, P < 0,05). 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 Hojas Raíces Ratio p110/p107 Col-0 atg2 atg5 nbr1 atg18a C * ** Hojas Raíces Col-0 atg2 atg5 Col-0 atg2 atg5 anti-PEPC anti-PEPC Ub-PEPC PEPC Hojas Hojas Raíces M Col-0 nbr1 Col-0 atg18a Col-0 nbr1 atg18a anti-PEPC anti-PEPC Ub-PEPC PEPC A B anti-ubiquitina anti-PEPC Ub-PEPC PEPC Resultados 145 experimentos de coinmunoprecipitación con NBR1 en extractos proteicos de diferentes tejidos de sorgo, arabidopsis y N. benthamiana. En hojas de sorgo, dos fragmentos de PEPC fueron coinmunoprecipitados junto a NBR1: uno de ellos del tamaño normal de la subunidad de la proteína, alrededor de 110 kDa, y otro fragmento más pequeño de en torno a 65-70 kDa (Fig. 42A). Esto ocurrió en extractos de hojas de sorgo de 3 semanas de edad en condiciones control y en salinidad, y no se observaron diferencias aparentes entre ambos tratamientos. Por otro lado, también se utilizaron extractos provenientes de hojas de plántulas de sorgo ppc3 y de su control silvestre (P898012), de un cultivar diferente al sorgo utilizado en el resto de experimentos, de 10 días de edad en condiciones control y déficit de nitrógeno. En este caso también se observaron ambas bandas en el coinmunoprecipitado, aunque la banda inferior se localizó un poco más alta, en torno a 80 kDa (Fig. 42B). No hubo diferencias entre la cantidad de PEPC coinmunoprecipitada en el sorgo silvestre y el sorgo ppc3 en condiciones control; no obstante, el déficit de nitrógeno disminuyó la cantidad de PEPC coinmunoprecipitada en el silvestre y la aumentó en ppc3 (Fig. 42B). En raíces y semillas de sorgo sólo se obtuvo de la coinmunoprecipitación el fragmento de PEPC de menor peso molecular, que en este caso volvía a ser de en torno a 65-70 kDa (Fig. 42C). Además, en semillas se realizó la coinmunoprecipitación en semillas mantenidas en agua destilada durante 2 días a 25 °C, diferenciando entre no germinadas y germinadas ya que la monoubiquitinación de la PEPC varía entre ambas. Figura 42. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GST-NBR1 en sorgo. Se realizaron extractos de hojas de 3 semanas de edad (A), hojas de 10 días de edad (B), raíces de 10 días de edad y semillas de sorgo (C) y se realizaron coinmunoprecipitaciones con la proteína recombinante de sorgo GST-NBR1, purificada a partir de E. coli y pre-unida a glutatión sefarosa, tal y como se describe en Materiales y métodos. El tratamiento con NaCl (NaCl) se llevó a cabo durante dos semanas, a 86 mM durante la primera semana y a 172 mM durante la segunda y última. El tratamiento sin nitrógeno y concA 1 μM (-N concA) se llevó a cabo durante dos días. Las semillas de sorgo utilizadas para los extractos se mantuvieron en agua destilada a 25 ° C durante 2 días, dividiéndose en no germinadas (NG) y germinadas (G). Las coinmunoprecipitaciones se realizaron durante toda la noche a 4 ° C, tomándose 20 μg como control de carga en el caso de las hojas y 50 μg en el caso de raíces y semillas. Después de la incubación, se tomaron alícuotas de sobrenadante y último lavado correspondientes a 20 μg del extracto crudo original en el caso de las hojas y de 50 μg en el caso de raíces y semillas. El coinmunoprecipitado a partir de la resina se utilizó completamente. Se analizaron por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC y anti-GST. M: marcador molecular; CC: control de carga; IP: coinmunoprecipitado; SN: sobrenadante; L5: último lavado de la coinmunoprecipitación. Control NaCl M CC IP SN L5 CC IP SN L5 135 100 75 63 180 48 anti-PEPC anti-GST 100 75 63 48 35 GST-NBR1 Control -N concA Control -N concA CC IP CC IP CC IP CC IP M anti-PEPC anti-GST 135 100 75 63 180 48 35 GST-NBR1 Silvestre Sbppc3 PEPC PEPC Control CC IP anti-PEPC anti-GST NG CC IP anti-PEPC anti-GST anti-PEPC anti-GST G CC IP Raíces Semillas A B C Resultados 146 Sin embargo, no hubo diferencias entre ambas semillas en la cantidad de PEPC coinmunoprecipitada con NBR1 (Fig. 42C). En arabidopsis, se utilizaron extractos de hojas y raíces de las líneas atg2 y atg5, además del silvestre (Col-0). En todos los casos se visualizó la banda inferior de PEPC en el coinmunoprecipitado (Fig. 43A, B), situándose en torno a 65-70 kDa. Además, del extracto de hojas de atg5 se obtuvo una pequeña cantidad de PEPC a la altura de 110 kDa en el coinmunoprecipitado (Fig. 43A, atg5). Hubo diferencias en la cantidad de PEPC de 65-70 kDa coinmunoprecipitada entre las diferentes líneas de arabidopsis de manera que las líneas deficientes en proteínas autofágicas mostraron mayor cantidad de PEPC en el coninmunoprecipitado con respecto a Col-0, siendo atg2 donde se observa el mayor aumento. Esto ocurre tanto en hojas como en raíces (Fig. 43A, B). Por último, se volvieron a realizar los experimentos de coinmunoprecipitación en extractos de arabidopsis, pero en este caso las plantas fueron tratadas con dos inhibidores de la degradación de proteínas: MG132 y E64. El primero es un inhibidor del proteasoma y el segundo inhibe un amplio rango de cisteín-proteasas (Matsumoto et al., 1999). Estos inhibidores se utilizaron para bloquear la degradación por otras vías que no fueran la autofágica, y de este modo poder observar la acumulación de PEPC inactiva. Las coinmunoprecipitaciones se realizaron en extractos de hojas Col-0, atg2 y atg5, y en el caso de Col-0 tratada con MG132 se obtuvo una mayor cantidad de PEPC de 65-70 kDa en el coinmunoprecipitado (Fig. 44A). Esta diferencia no se observó para atg2 ni atg5 (Fig. 44B, C). En el caso del E64, no se observaron diferencias en la cantidad de PEPC coinmunoprecipitada en ninguna de las líneas (Fig. 44). Figura 43. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GST-NBR1 en líneas SALK de arabidopsis. Se realizaron extractos de hojas (A) y raíces (B) de arabidopsis de 5-6 semanas de edad y se realizaron coinmunoprecipitaciones con la proteína recombinante de sorgo GST-NBR1, purificada a partir de E. coli y pre-unida a glutatión sefarosa , tal y como se describe en Materiales y métodos. Las líneas SALK utilizadas fueron las deficientes en las proteínas ATG2 y ATG5, utilizándose la línea Col-0 como control. Las coinmunoprecipitaciones se realizaron durante toda la noche a 4 ° C, tomándose 50 μg como control de carga. El coinmunoprecipitado a partir de la agarosa se utilizó completamente. Se analizaron por SDSPAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC y anti-GST. M: marcador molecular; CC: control de carga; IP: coinmunoprecipitado. Col-0 CC IP atg2 CC IP atg5 CC IP anti-PEPC PEPC PEPC GST-NBR1 anti-GST Hojas Col-0 atg2 atg5 M CC IP CC IP CC IP PEPC PEPC anti-PEPC GST-NBR1 anti-GST Raíces 135 100 75 63 35 A B Resultados 147 En conjunto, estos resultados muestran que GST-NBR1 interacciona con la PEPC de sorgo y de arabidopsis in vitro, resultando un fragmento de PEPC de unos 65-70 kDa de la coinmunoprecipitación con GST-NBR1 en extractos de hojas, raíces y semillas de sorgo y hojas y raíces de arabidopsis. Además, en hojas de sorgo y en la línea atg5 de arabidopsis también se obtiene PEPC sin proteolizar (110 kDa) en este coinmunoprecipitado. La utilización del inhibidor del proteasoma MG132 en hojas de arabidopsis hace que la cantidad de PEPC de 65-70 kDa aumente en el coinmunoprecipitado. 4.4. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GFP-ATG8a Del mismo modo que en el apartado anterior, se realizó un experimento de coinmunoprecipitación en extractos de hoja de N. benthamiana expresando la construcción GFP-ATG8a de arabidopsis utilizada previamente en el apartado 3.2. La Fig. 45 muestra cómo junto a ATG8a se coinmunoprecipita un fragmento de PEPC similar al detectado en sorgo y arabidopsis, en este caso de un peso molecular algo menor (en torno a 63 kDa). Esto indica que este fragmento de PEPC también se une, directa o indirectamente, a ATG8a. 4.5. Colocalización por microscopía confocal Los resultados obtenidos indicaban que podía estar teniendo lugar una interacción entre la PEPC y algunos componentes de la autofagia como NBR1 y/o ATG8. Por ello, en experimentos de expresión transitoria en hojas de N. benthamiana, se coexpresaron las proteínas recombinantes mCherry-PPC3 y GFP-ATG8a. Se utilizó el Figura 44. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GST-NBR1 en líneas SALK arabidopsis tratadas con inhibidores. Se realizaron extractos de hojas de arabidopsis de 5-6 semanas de edad y tratadas con MG132 100 mM como inhibidor del proteasoma (MG132), E64 100 mM como inhibidor de cisteín proteasas (E64) y un volumen equivalente de DMSO como control (Control) y se realizaron coinmunoprecipitaciones con la proteína recombinante de sorgo GST-NBR1, purificada a partir de E. coli y pre-unida a glutatión sefarosa, tal y como se describe en Materiales y métodos. Las líneas SALK utilizadas fueron las deficientes en las proteínas ATG2 (B) y ATG5 (C), utilizándose la línea Col-0 como control (A). Las coinmunoprecipitaciones se realizaron durante toda la noche a 4 ° C, tomándose 50 μg como control de carga (CC). El coinmunoprecipitado a partir de la agarosa se utilizó completamente. Se analizaron por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC y anti-GST (glutatión Stransferasa). M: marcador molecular; CC: control de carga; IP: coinmunoprecipitado. 135 100 75 63 48 PEPC PEPC Control MG132 E64 M CC IP CC IP CC IP anti-PEPC anti-GST 35 GST-NBR1 Control MG132 E64 CC IP CC IP CC IP anti-PEPC anti-GST Col-0 atg2 ABControl MG132 E64 M CC IP CC IP CC IP 135 100 75 63 48 35 atg5 anti-PEPC anti-GST PEPC PEPC GST-NBR1 C Resultados 148 microscopio confocal para intentar visualizar la proteína PPC3 mediante su marcaje fluorescente (mCherry) en colocalización con autofagosomas marcados con GFPATG8a en las hojas de N. benthamiana infiltradas. También se añadió la construcción BFP(proteína fluorescente azul)-NBR1 al experimento, y se utilizó para su construcción el mismo fragmento de NBR1 clonado para los experimentos con GST-NBR1 del apartado 4.2, con los dos dominios UBA y el motivo AIM. En las hojas de N. benthamiana infiltradas, los autofagosomas, marcados por GFPATG8a como estructuras punteadas brillantes, colocalizaron con estructuras similares marcadas por mCherry-PPC3 (Fig. 46B, E, H; flechas blancas). BFP-NBR1 colocalizó en menor medida con estas estructuras punteadas, siendo su localización más dispersa (Fig. 46). Además, mCherry-PPC3 se localizó en el citoplasma y en general tendió a posicionarse cerca de la envuelta externa de los cloroplastos, localizados mediante la autofluorescencia de la clorofila A (Fig. 46D, E, F). Estos resultados muestran que la PPC3 de sorgo recombinante se localiza en autofagosomas marcados con GFP-ATG8a en hojas de N. benthamiana, lo cual supone un indicio de su degradación vía autofagia. Figura 45. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GFP-ATG8a de arabidopsis en N. benthamiana. Hojas de N. benthamiana fueron infiltradas con A. tumefaciens estirpe GV3101 transformada con el plásmido pGreen-IIS expresando la construcción GFP-ATG8a. 72 h después de la infiltración, se preparó un extracto crudo de hoja, de donde se obtuvieron 15 μl para el control de carga, y se realizó una coinmunoprecipitación con agarosa anti-GFP tal y como se describe en Materiales y métodos. Los inmunoblots fueron incubados con anticuerpos anti-PEPC y anti-GFP. M: marcador de peso molecular; CC: control de carga; IP: coinmunoprecipitado. 48 35 25 anti-GFP 75 100 135 63 anti-PEPC M CC IP GFP-ATG8a GFP Ub-PEPC PEPC PEPC Hojas Resultados 149 4.6. Degradación de la PEPC en células de N. benthamiana y raíces de sorgo Los cultivos de células constituyen un escenario distinto y simplificado para estudiar procesos celulares complejos. A partir de tejido de raíces de N. benthamiana, se establecieron cultivos celulares en donde se analizó el patrón de proteína PEPC y su actividad, así como sus variaciones en respuesta a distintos estreses e inhibidores de la degradación. A estos cultivos, que se mantienen en oscuridad, se les suministra una fuente de carbono orgánico en forma de sacarosa ya que son heterótrofos. En primer lugar, se realizó un estudio del patrón de proteína PEPC en electroforesis e inmunoblot bajo distintos estreses. El déficit de carbono, un activador de la autofagia, inducido por la retirada de sacarosa en el medio durante 5 días provocó un decremento de la cantidad de PEPC en las células, y cuando este déficit se prolongó hasta 10 días, la PEPC desapareció por completo (Fig. 47A). El decremento de PEPC, causado por 5 días de ausencia de sacarosa, vino acompañado de un descenso en la actividad específica de la enzima (Fig. 47B, -sac). Al volver a aportar sacarosa al medio durante 2 días, tanto la cantidad de PEPC como su actividad aumentaron de Figura 46. Colocalización de GFP-ATG8a de arabidopsis y BFP-NBR1 y mCherry-PPC3 de sorgo por microscopía confocal. Hojas de Nicotiana benthamiana fueron infiltradas con Agrobacterium tumefaciens estirpe GV3101 transformada con el plásmido pGreen-IIS con las construcciones: GFP-ATG8a, BFP-NBR1 y mCherry-PPC3, cuya composición se detalla en Materiales y métodos. Las plantas se mantuvieron en oscuridad durante 48 h previas a su visualización para inducir la autofagia, y sus hojas se infiltraron con concA 1 μM 16 h antes de su visualización para bloquear la degradación de los autofagosomas. 72 h después de la infiltración, secciones de hoja de N. benthamiana se visualizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 7 Duo usando para GFP un láser a 488 nm y un filtro de emisión de 504-533 nm, para BFP un láser a 405 nm y un filtro de emisión de 441-470 nm y para mCherry un láser a 561 nm y un filtro de emisión de 610-630 nm. La clorofila A se detectó usando el láser a 488 nm y un filtro de emisión de 658-690 nm. Las flechas indican estructuras punteadas. A. BFP; B. GFP; C. BFP y GFP; D. Clorofila A; E. mCherry; F. Clorofila A y mCherry; G. Campo claro; H. GFP y mCherry; I. BFP, GFP, clorofila A y mCherry. BFP-NBR1 GFP-ATG8a mCherry-PPC3 Clorofila A BFP-NBR1 GFP-ATG8a Clorofila A mCherry-PPC3 GFP-ATG8a mCherry-PPC3 BFP-NBR1 GFP-ATG8a Clorofila A mCherry-PPC3 A B C D E F GH I Resultados 150 nuevo (Fig. 47B, +sac). El déficit de fósforo en el medio provocó un descenso de la cantidad de PEPC. En estas condiciones, sin embargo, la actividad PEPC aumentó considerablemente (Fig. 47B, -P). Por último, el déficit de nitrógeno también disminuyó la cantidad de PEPC, mientras que su actividad no sufrió importantes cambios (Fig. 47B, -N). Posteriormente, se utilizaron en estas células una serie de inhibidores de la degradación de proteínas entre los que se encuentran el 3-MA (Seglen y Gordon, 1982), que inhibe la vía tradicional de la autofagia mediante la inhibición de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K); la concA, y el E64. Los tres inhibidores previnieron la degradación de la proteína al retirar la sacarosa, y en especial el 3-MA, que hizo que la cantidad de proteína incluso incrementara (Fig. 47C). El inhibidor 3-MA produjo la aparición de una banda superior, similar a la banda de PEPC monoubiquitinada, que en condiciones control en el cultivo de células de N. benthamiana es prácticamente inexistente (Fig. 47C, D). Además, este inhibidor de la formación de autofagosomas también provocó un aumento de la actividad PEPC con respecto al control (Fig. 47C). Estos resultados indican que: i) bajo condiciones de déficit de carbono la PEPC de células de N. benthamiana es degradada; ii) utilizando inhibidores de la autofagia esta degradación se bloquea; iii) el uso de un inhibidor de la formación de autofagosomas como el 3-MA hace que aumente notablemente la cantidad de PEPC monoubiquitinada. Una situación parecida ocurre en raíces de sorgo en condiciones de deficiencia de nitrógeno. La cantidad de PEPC detectada disminuye en falta de nitrógeno (Fig. 47E, - N), y tras el tratamiento con 3-MA se recupera parte de esta PEPC (Fig. 47E, -N 3-MA). Del mismo modo que se realizó en el apartado 4.3, los extractos de células de N. benthamiana se sometieron a coinmunoprecipitación con la proteína recombinante GSTNBR1 de sorgo. En todos los casos volvió a aparecer una banda de PEPC de 65-70 kDa en el coinmunoprecipitado, y esta banda fue más intensa en déficit de carbono inducido por falta de sacarosa y tras la utilización de los inhibidores 3-MA, E64 y concA (Fig. 48). Además, en los extractos proteicos de las células tratadas con 3-MA apareció una banda a una altura de unos 110 kDa en el coinmunoprecipitado con GSTNBR1 (Fig. 48). En resumen, los resultados de este apartado evidencian que una parte de la cantidad total de PEPC C3 de N. benthamiana es degradada vía autofagia en condiciones de déficit nutricional, y que el marcaje con monoubiquitinación está implicado en este proceso. Resultados 151 Figura 47. Efecto de inhibidores de autofagia sobre la PEPC de cultivos de células de N. benthamiana y raíces de sorgo. Las células de N. benthamiana se generaron y se cultivaron tal y como se describe en Materiales y métodos. Los extractos proteicos, provenientes de triturar 0,2 g de hojas o células filtradas provenientes del cultivo en 1 ml de tampón de extracción, se utilizaron para medir la actividad PEPC (expresada en mU de PEPC por mg de proteína total) y se analizaron (alícuotas correspondientes a 30 μg de proteína total) por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC. A. Extractos de células control, sin sacarosa (-sac) durante 5 días y durante 10 días. B. Los extractos se hicieron a partir de hojas de una planta de 6 semanas de edad (hoja) o bien de un cultivo de células de 5 días con medio control (control), medio sin sacarosa (-sac), medio sin fósforo (-P), medio sin nitrógeno (-N) o de medio sin sacarosa seguido de 2 días más con medio control (+sac). La actividad PEPC se muestra en mU mg-1 bajo la imagen del inmunoblot. C. Los extractos se hicieron a partir de un cultivo de células de 5 días con medio control (control), sin sacarosa (-sac) o sin sacarosa seguido de 2 días más con medio control (+sac). El inhibidor 3-MA (3-MA) se usó durante los 5 días de cultivo a 2,5 mM. Los inhibidores concA (concA) y E64 (E64) se usaron durante las 16 horas previas a recoger el cultivo y a unas concentraciones de concA 1 μM y E64 10 μM. Las muestras que no fueron tratadas con inhibidores contenían un volumen equivalente de DMSO como control. La actividad PEPC se muestra en mU mg-1 bajo la imagen del inmunoblot. D. Se cuantificaron las dos bandas correspondientes a la PEPC de las muestras control y tratadas con 3-MA y se calculó la ratio entre la PEPC ubiquitinada (Ub-PEPC; p110) y la PEPC desubiquitinada (PEPC p107). Los valores representan la media ± EE de al menos 3 réplicas. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (t test, P<0,05). E. Se realizaron extractos de proteínas de raíces de plantas de sorgo de 10 días de edad cultivadas hidropónicamente con medio completo (control) o sin nitrógeno durante 2 días (-N) y se utilizaron para medir actividad PEPC y se analizaron (alícuotas correspondientes a 0,6 mU de actividad PEPC) por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC. El inhibidor 3-MA (3-MA) se usó durante los 2 días previos a la recogida a una concentración de 5 mM. M: marcador de peso molecular. M hoja control -sac +sac -P -N PEPC 135 100 180 135 100 180 75 M control –sac control -sac -sac control -sac +sac 3-MA 3-MAconcA E64 E64 Ub-PEPC PEPC anti-PEPC anti-PEPC B C 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Ratio p110/p107 control 3-MA D* mU mg-1 33,1 56,0 19,0 83,6 208 46,0 mU mg-1 30,1 24,7 43,0 40,1 33,5 29,2 25,7 29,6 135 100 75 180 Ub-PEPC PEPC M control control -N -N 3-MA 3-MA E control -sac -sac 5 días 5 días 10 días PEPC A anti-PEPC anti-PEPC Resultados 152 Figura 48. Coinmunoprecipitación de la PEPC con GST-NBR1 en células de N. benthamiana tratadas con inhibidores. A partir de extracciones proteicas de cultivos de células de N. benthamiana se realizaron coinmunoprecipitaciones con la proteína recombinante de sorgo GST-NBR1, purificada a partir de E. coli y pre-unida a glutatión sefarosa , tal y como se describe en Materiales y métodos. Las células de N. benthamiana se generaron y se cultivaron tal y como se describe en Materiales y métodos. Los extractos se hicieron a partir de células provenientes de un cultivo de 5 días con medio control (control), medio sin sacarosa (-sac), o medio sin sacarosa seguido de 2 días más con medio control (+sac). El inhibidor 3-MA (3MA) se usó durante los 5 días de cultivo a 2,5 mM. Los inhibidores concA (concA) y E64 (E64) se usaron durante las 16 horas previas a recoger el cultivo y a unas concentraciones de concA 1 μM y E64 10 μM. Las muestras que no fueron tratadas con inhibidores contenían un volumen equivalente de DMSO como control. Las coinmunoprecipitaciones se realizaron durante toda la noche a 4 ° C, tomándose 50 μg como control de carga. El coinmunoprecipitado a partir de la agarosa se utilizó completamente. Se analizaron por SDS-PAGE y posteriormente mediante inmunoblot con anticuerpos anti-PEPC y anti-GST. M: marcador molecular; CC: control de carga; IP: coinmunoprecipitado. control -sac control 3-MA -sac 3-MA control E64 -sac E64 -sac concA +sac M CC IP CC IP CC IP CC IP CC IP CC IP CC IP CC IP 135 100 75 63 48 35 anti-PEPC anti-GST PEPC GST-NBR1 PEPC DISCUSIÓN