¿Qué efecto tiene la inclusión de Hidroxipropil-betaciclodextrina (HPβCD) en la formulación de liposomas de HPβCD-acetazolamida?

! ! ! ! ! UNIVERSIDAD*DE*SEVILLA* * FACULTAD*DE*FARMACIA* * DEPARTAMENTO*DE*FARMACIA*Y*TECNOLOGÍA*FARMACÉUTICA* * ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Cayetano(Navas(Enamorado( ! ! 1! ! ! ! UNIVERSIDAD(DE(SEVILLA( ( FACULTAD(DE(FARMACIA( ( TRABAJO(DE(FIN(DE(GRADO,(GRADO(EN(FARMACIA( ! ! ! ¿Qué%efecto%tiene%la%inclusión%de%Hidroxipropil-betaciclodextrina%(HP β CD)%en%la%formulación%de%liposomas%de% HP β CD-acetazolamida?% ! ! ! CAYETANO(NAVAS(ENAMORADO( ( ( Lugar*de*presentación:*Aula*Multimedia** * Fecha*de*presentación:*8*de*julio*de*2016* * Departamento*de*Farmacia*y*Tecnología*Farmacéutica* * Tutora:*María*Luisa*González*Rodríguez* * Tipología*del*proyecto:*experimental! ! ! ! ! 2! Resumen:! ! * En* el* presente* trabajo* de* investigación,* se* ha* querido* estudiar* los* efectos* que*tendría*la*inclusión*de*la*hidroxipropil-beta-ciclodextrina*en*una*formulación*de* liposomas*de*acetazolamida,*un*inhibidor*de*la*anhidrasa*carbónica*utilizado*para*el* tratamiento*del*glaucoma.* * Acetazolamida* es* utilizada* por* vía* oral* en* el* tratamiento* del* glaucoma,* presentando*aceptables*valores*de*disminución*de*presión*intraocular.*Sin*embargo,* requiere*una*posología*compleja,*y*los*estudios*realizados*en*los*últimos*años*han* demostrado*que*la*administración*tópica*ocular*presenta*mucho*mejores*resultados* y*una*mejoría*notable*en*esta*patología.* * El* principal* problema* que* presenta* este* tipo* de* formulaciones* para* este* fármaco* reside* en* su* baja* biodisponibilidad* tras* la* administración* tópica* ocular,* debido*a*su*baja*solubilidad*acuosa*y*permeabilidad.*En*base*a*ello,*se*han*empleado* distintas*estrategias*solubilizantes*que*ayuden*a*mejorar*estas*propiedades.*Entre* éstas,*se*ha*seleccionado*el*uso*de*ciclodextrinas,*que*son*moléculas*complejantes* que*aumentan*la*solubilidad*acuosa*del*fármaco.*A*su*vez,*introducir*este*complejo* en*un*sistema*vesicular*como*son*los*liposomas,*podría*constituir*una*buena*vía*para* mejorar* la* estabilidad* del* complejo,* aumentar* el* tiempo* de* contacto* de* la* formulación*con*la*superficie*ocular*y*mejorar*las*características*de*permeabilidad* del*fármaco.* * * * ! ! 3! ! ÍNDICE:( 1!1.(Introducción.!............................................................................................................................!4! 1.1!GLAUCOMA.!........................................................................................................................................!4! 1.1.1!Concepto!.......................................................................................................................................................!4! 1.1.2!Tratamiento*farmacológico!....................................................................................................................!4! 1.2!ACETAZOLAMIDA!...............................................................................................................................!6! 1.2.1!Antecedentes!..............................................................................................................................................!6! 1.2.2!Características*fisicoquímicas*y*farmacocinéticas!..........................................................................!7! 1.3!CICLODEXTRINAS((CDs)!.....................................................................................................................!9! 1.3.1!Derivados*de*ciclodextrinas!..................................................................................................................!10! 1.3.2!Complejación*en*medio*líquido:*diagramas*de*solubilidad!.......................................................!11! 1.4!LIPOSOMAS!......................................................................................................................................!12! 1.4.1!Tipos*de*liposomas!..................................................................................................................................!14! 1.4.2!Composición*de*los*liposomas!............................................................................................................!15! 1.4.3!Liposomas*para*administración*oftálmica!.......................................................................................!15! 1.5!OBJETIVOS!........................................................................................................................................!16! 2!2.(Materiales(y(Métodos.!........................................................................................................!17! 2.1!MATERIALES(Y(REACTIVOS!............................................................................................................!17! 2.2!EQUIPOS(E(INSTRUMENTACIÓN!...................................................................................................!18! 2.3!METODOLOGÍA!................................................................................................................................!18! 2.3.1!Búsqueda*de*información!.....................................................................................................................!18! 2.3.2!Diagramas*de*solubilidad!......................................................................................................................!19! 2.3.3!Composición*de*los*liposomas!............................................................................................................!20! 2.3.4!Elaboración*de*los*liposomas!...............................................................................................................!21! 2.3.5!Evaluación*de*la*integridad*de*la*membrana*del*liposoma:*estudios*de* incubación!..................................................................................................................................................................!22! 2.3.6!Caracterización*fisicoquímica*de*liposomas!...................................................................................!23! 2.3.7!Determinación*del*porcentaje*de*encapsulación!.........................................................................!25! 3!3.(Resultados(y(discusión.!.......................................................................................................!27! 3.1!SOLUBILIDAD(DE(FASE(Y(EFICACIA(DE(COMPLEJACIÓN(DE(ACZ(EN(HPβCD!...........................!27! 3.2!INTEGRIDAD(DE(LOS(LIPOSOMAS:(ESTUDIOS(DE(INCUBACIÓN!...............................................!28! 3.3!INFLUENCIA(DEL(AGENTE(DE(CARGA(EN(LA(INTEGRIDAD(DE(LOS(LIPOSOMAS!....................!29! 3.4!INFLUENCIA(DE(LA(PRESENCIA(DE(COLESTEROL(EN(LA(INTEGRIDAD(DE(LOS( LIPOSOMAS!................................................................................................................................................!32! 3.5!DISCUSIÓN!.......................................................................................................................................!33! 4!4.(Conclusiones.!........................................................................................................................!35! 5!5.(Perspectivas(de(futuro.!........................................................................................................!35! 6!6.(Referencias(bibliográficas.!..................................................................................................!36! ! ! ! ! ! ! ! 4! 1.(INTRODUCCIÓN( 1.1 GLAUCOMA( 1.1.1 Concepto( El*glaucoma*es*una*enfermedad*que*afecta*al*nervio*óptico*y*que*se*encuentra*definido* por* un* patrón* particular* de* daño* progresivo* de* dicho* nervio.* Los* pacientes* que* presentan*esta*patología*son*capaces*de*desarrollar*una*neuropatía*óptica*progresiva* caracterizada* por* la* atrofia* del* nervio* óptico* y* una* pérdida* adquirida* de* células* ganglionares*retinianas.*Si*el*glaucoma*no*se*diagnostica*ni*se*trata,*puede*tener*como* consecuencia* un* déficit* importante* de* agudeza* visual* e* incluso* ceguera* (Goodman* y* Gilman,*2006;*Porth,*2007).* La*enfermedad*está*generalmente,*aunque*no*siempre,*asociada*con*un*incremento*de* la* presión* intraocular,* la* cual* es* la* responsable* de* la* degeneración* del* nervio* óptico* (Figura*1).* Figura*1.*Comparación*de*ojo*sano*y*ojo*con*glaucoma* (http://cocclinicaoftalmologica.blogspot.com.es/2012/07/glaucoma.html).* * Sin* embargo,* esta* patología* también* puede* manifestarse* en* presencia* de* valores* normales*de*presión*en*el*ojo.**Se*cree*que*esta*forma*de*glaucoma*es*causada*por*la* mala*regulación*del*flujo*sanguíneo*en*el*nervio*óptico*(Acosta*y*cols.,*2009).* 1.1.2 Tratamiento(farmacológico( Aunque*el*daño*que*provoca*la*enfermedad,*generalmente,*es*difícil*de*recuperar,*sin* embargo,* éste* se* puede* controlar.* Los* tratamientos* se* centran* básicamente* en* disminuir*la*presión*intraocular*normal,*y*prevenir*o*retardar*así*los*daños*provocados* en* el* nervio* óptico* y* la* pérdida* visual.* Todos* están* basados* en* la* reducción* de* la* ! ! 5! producción*de*humor*acuoso*en*el*cuerpo*ciliar,*o*bien*aumentar*la*salida*de*éste*por*la* malla*trabecular*(Benítez-Collante*y*cols.,*2005).* 1.1.2.1.$Fármacos$que$reducen$la$producción$de$humor$acuoso$ Los* β-bloqueantes* son* los* fármacos* más* usados* hoy* día* con* este* fin.* Su* efectividad* parece* estar* más* relacionada* con* su* farmacocinética* que* con* su* afinidad* por* los* diferentes*subreceptores*β.*Aunque*no*se*conoce*con*certeza,*su*mecanismo*de*acción* consiste*en*disminuir*la*producción*de*humor*acuoso*y*descender*la*presión*intraocular.* A*este*grupo*pertenecen*timolol,*levobunolol,*carteolol*y*metipranolol.* Los* fármacos* inhibidores* de* la* anhidrasa* carbónica* reducen* la* producción* de* humor* acuoso*inhibiendo*la*enzima*anhidrasa*carbónica,*que*tiene*un*papel*fundamental*en*la* formación*del*humor*acuoso*(García,*2010).*Fármacos*que*pertenecen*a*este*grupo*son* dorzolamida*y*el*fármaco*estudiado*en*este*trabajo,*acetazolamida.* 1.1.2.2.$Fármacos$que$favorecen$el$drenaje$del$humor$acuoso$ Los*análogos*de*las*prostanglandinas*tienen*una*estructura*similar*a*las*prostaglandinas* endógenas* y* actúan* aumentando* el* drenaje* de* fluido* ocular.* Estos* fármacos,* sin* embargo,*son*propensos*a*causar*enrojecimiento*de*los*ojos,*pudiendo*llegar*a*causar* inflamaciones*en*el*interior*del*ojo*(García,*2010).*Los* principios* activos* más* relevantes*dentro*de*este*grupo*son*latanoprost,*travoprost*y*bimatoprost.* 1.1.2.3.$Fármacos$que$reducen$el$volumen$del$humor$vítreo$ Los* agentes* osmóticos* constituyen* un* grupo* secundario* de* fármacos* utilizados* para* tratar*las*formas*agudas*de*la*enfermedad,*donde*la*presión*del*ojo*sigue*siendo*muy* alta,*aun*utilizando*otros*tratamientos.*Su*mecanismo*de*acción*consiste*en*elevar*la* concentración*de*los*fluidos*extravasculares,*de*tal*forma*que*se*produce*una*diferencia* osmótica*entre*el*plasma*y*el*humor*vítreo*(Tártara*y* cols.,*2008),*provocando*así*la* salida*de*líquido*intraocular.* 1.1.2.4.$Fármacos$que$reducen$la$producción$y$aumentan$el$drenaje$del$humor$acuoso$ Los*fármacos*agonistas*adrenérgicos*actúan*de*forma*no*selectiva*en*los*receptores*alfa* y* beta.* Por* tanto,* actúan* en* la* reducción* de* la* producción* de* líquido* mediante* la* vasoconstricción*de*las*arteriolas*del*cuerpo*ciliar,*así*como*en*el*aumento*del*flujo*de* salida*(drenaje).*El*fármaco*agonista*más*representativo*es*brimonidina.*Sin*embargo,* ! ! 6! presenta*un*alto*riesgo*de*reacciones*locales,*sobre*todo*alérgicas.*Otros*son*epinefrina* y*apraclonidina.* Los* agentes* parasimpaticomiméticos,* conocidos* como* mióticos,* aumentan* la* difusión* del*humor*acuoso*vía*trabecular,*actuando*en*la*abertura*sináptica*del*músculo*ciliar*y* promoviendo*la*contracción*del*mismo.*Algunos*fármacos*que*pertenecen*a*este*grupo* son* pilocarpina* y* demecario.* Hoy* día,* la* pilocarpina* es* el* fármaco* más* usado* en* el* tratamiento*del*glaucoma,*puesto*que*los*demás*requieren*una*posología*muy*repetida* y*pueden*provocar*efectos*secundarios*(Tártara*y*cols.,*2008).* 1.2 ACETAZOLAMIDA( Acetazolamida*(ACZ)*es*un*fármaco*inhibidor*de*la*anhidrasa*carbónica*que*se*utiliza*por* vía*oral*para*reducir*la*presión*intraocular*en*pacientes*que*sufren*glaucoma.*Existen* dos*razones*fundamentales*por*las*que*no*se*ha*desarrollado*una*forma*farmacéutica* líquida*de*administración*oftálmica*de*ACZ:* 1) Su*baja*solubilidad*acuosa*(aproximadamente*1*mg/mL)* 2) Su*baja*permeabilidad* 1.2.1 Antecedentes( En* 1940,* Mann* y* Keilin* observaron* que* cuando* se* administraba* sulfanilamida* como* agente*quimioterápico,*uno*de*sus*efectos*secundarios*era*la*acidosis*metabólica.*Esto* llevó* al* estudio* del* proceso,* tanto* in% vitro% como* in% vivo,* demostrando* que* la* sulfanilamida*inhibía*la*anhidrasa*carbónica.* Posteriormente,*en*1954,*ACZ*se*empezó*a*utilizar*en*oftalmología,*ya*que*se*demostró* su*capacidad*para*disminuir*la*presión*intraocular*reduciendo*la*producción*de*humor* acuoso*en*el*cuerpo*ciliar*(Becker,*1954).*Otras*investigaciones*también*demostraron*la* eficacia*del*fármaco*en*pacientes*con*glaucoma,*tras*su*administración*oral*(Gloster*y* Perkins,* 1955).* Con* el* tiempo,* se* han* ido* incorporando* nuevos* inhibidores* de* la* anhidrasa*carbónica*y*diferentes*vehículos,*que*disminuyen*la*presión*intraocular,*como* son*dorzolamida,*aminozolamida*y*MK-927.* Una* característica* común* de* estos* fármacos* es* que* no* poseen* propiedades* fisicoquímicas*compatibles*con*una*penetración*adecuada*a*través*de*la*córnea.*Se*ha* observado* que* la* incapacidad* de* los* inhibidores* de* la* anhidrasa* carbónica,* administrados*tópicamente,*para*reducir*la*presión*intraocular,*puede*ser*el*resultado* ! ! 7! de*su*penetración*ocular*limitada,*causando*una*cantidad*insuficiente*del*fármaco*para* alcanzar*el*cuerpo*ciliar*(Maren*y*cols.,*1983).* La* N-(5-sulfanoil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-acetamida* ó* ACZ* (C4H6N4O3S2),* es* un* fármaco* inhibidor*de*la*anhidrasa*carbónica,*cuya*estructura*química*es*la*siguiente:** * Figura*2.*Estructura*química*de*acetazolamida.************************************ (http://www.drugbank.ca/drugs/DB00819)* La* inhibición* de* la* anhidrasa* carbónica* por* fármacos* como* ACZ* disminuye* la* concentración*de*HCO3-y,*por*tanto,*el*flujo*de*Na+*y*H2O*en*la*cámara*posterior*del* globo*ocular.*Se*recuerda*que*la*función*de*esta*enzima*consiste*en*catalizar,*de*forma* reversible,*la*reacción*de*H2O*y*CO2*para*formar*ácido*carbónico*y,*posteriormente,*el* ión*bicarbonato,*como*se*muestra*en*la*siguiente*reacción:** H2O*+*CO2*↔*H+*+*HCO3-* El*ión*HCO3-*es*el*encargado*de*transportar*el*Na+*en*el*ojo,*el*cual*es*necesario*para*la* producción*del*humor*acuoso,*ya*que*es*este*catión*el*que*atrae*al*agua*para*formar*el* humor* acuoso.* Consecuencia*de*dicha* inhibición*es* la*reducción*de* la* producción* de* humor*acuoso*y,*por*tanto,*de*la*presión*intraocular*(Kaur*y*cols.,*2002).* 1.2.2 Características(fisicoquímicas(y(farmacocinéticas( ACZ,*que*es*2-acetilamino-*1,3,4-tiadiazol-5-sulfonamida*(C4H6N4O3S2),*se*presenta*como* un*polvo*muy*fino*cristalino*blanco-amarillento*y*prácticamente*inodoro.*En*la*Tabla*1* se* recogen* algunas* de* las* características* fisicoquímicas* más* interesantes* de* esta* molécula.* Desde*el*punto*de*vista*farmacocinético,*ACZ*presenta*una*absorción*adecuada*en*el* tracto*gastrointestinal,*alcanzando*concentraciones*plasmáticas*máximas*a*las*2*-*4*h.* * ! ! 8! Característica( Valor( Peso*molecular* 222,25*g/mol* Solubilidad*acuosa* 980*mg/L* Log*P* -0,45* pKa* 7,2* Tabla*1.*Algunas*propiedades*fisicoquímicas*de*ACZ* (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetazolamide#section=Top)* Tras* la* administración* de* los* comprimidos,* se* produce* una* reducción* de* la* presión* intraocular*en**1**ó**2**horas,**con**una**duración**de*acción*de*8*a*12*horas.*La*vida* media* plasmática* de* * aproximadamente* 4* * horas* está* estrechamente* ligada* a* la* anhidrasa*carbónica*y*se*acumula*en*los*tejidos*que*contienen*esta*enzima,*en*particular* los* glóbulos* rojos* y* en* la* corteza* renal,* aunque* también* se* une* a* las* proteínas* plasmáticas.*Por*tanto,*posee*una*eliminación*bifásica,*correspondiendo*la*primera*fase* con*una*vida*media*de*2*horas*y*la*segunda*fase**coincidiendo*con*la*salida*de*ACZ*de*los* eritrocitos,* en* 13* horas.* No* sufre* biotransformación,* eliminándose* por* riñón,* por* secreción*tubular*y*reabsorción*tubular.* Uno* de* los* principales* problemas* acerca* de* la* utilización* de* este* fármaco* en* formulaciones* oftálmicas* radica* en* su* escasa* solubilidad* acuosa.* Su* coeficiente* de* reparto*negativo,*indicativo*de*su*baja*afinidad*por*los*lípidos,*limita*su*tránsito*a*través* del*epitelio*corneal*y*el*endotelio,*mientras*que*la*escasa*solubilidad*en*agua*impide*el* tránsito* a* través* del* estroma* hidrofílico* (Parasrampuria* y* Gupta,* 1989).* Por* tanto,* el* desarrollo*de*una*formulación*tópica*de*ACZ*se*convierte*en*un*reto*en*investigación.*Su* puesta*a*punto*podría*conducir*a*la*abolición*total*de*los*efectos*secundarios*sistémicos* observados*en*su*uso*oral,*como*podrían*ser*adormecimiento*y*cosquilleo,*aumento*de* la*sensación*de*sed*y*de*la*necesidad*de*orinar,*somnolencia*y*cefalea.*En*este*sentido,* los*avances*producidos*en*investigación*han*sido*importantes*y*notables*a*pesar*de*los* fracasos*iniciales*(Mishra*y*Jain,*2014).* El*desarrollo*de*preparados*líquidos*en*solución*para*administración*oftálmica*implica*el* uso*de*agentes*solubilizantes*en*el*caso*de*que*el*principio*activo*presente*problemas* de* solubilidad,* como* es* el* caso* de* ACZ.* Como* es* bien* sabido,* los* mecanismos* de* solubilización* son* múltiples,* siendo* la* capacidad* anfifílica* de* determinadas* sustancias* (tensioactivos),*la*cosolvencia*y*la*formación*de*complejos,*algunos*de*ellos.** En*el*presente*estudio,*se*va*a*utilizar*la*estrategia*de*formular*complejos*de*inclusión* ! ! 15! 1.4.2 Composición(de(los(liposomas( Los*liposomas* pueden*elaborarse*a*partir*de*una*gran*variedad*de*lípidos.*Se*utilizan* distintos*fosfolípidos*como*agentes*principales*y*cantidades*variables*de*colesterol,*con* la*finalidad*de*aumentar*la*estabilidad*del*fármaco*en*la*vesícula*y*mejorar*la*eficacia*de* encapsulación,* ya* que* el* colesterol* disminuye* la* libertad* de* rotación* de* las* cadenas* hidrocarbonadas*de*los*fosfolípidos*en*el*interior*de*las*bicapas*(Fang*y*cols.,*2001).* Los*fosfolípidos*son*compuestos*de*carácter*anfipático*que*constan*de*una*molécula*de* glicerol*con*tres*grupos*hidroxilos,*dos*de*ellos*esterificados*con*dos*ácidos*grasos,*lo* que* constituye* la* región* hidrofóbica;* y* uno* esterificado* con* el* ácido* fosfórico,* constituyendo* la*cabeza*polar*(Maestrelli*y* cols.,* 2005).*Entre* los* fosfolípidos,* el* más* utilizado* en* la* formulación* de* liposomas* es* la* fosfatidilcolina,* que* se* obtiene* de* la* lecitina*del*huevo*o*la*soja,*debido*a*su*bajo*coste*de*producción,*su*carga*neutra*y*ser* químicamente* inerte* (Abad,* 2012).* Es* una* molécula* insoluble* en* agua,* y* su* comportamiento*está*encaminado*a*minimizar*las*fuerzas*repulsivas*entre*la*fase*acuosa* y*las*cadenas*hidrocarbonadas*de*los*ácidos*grasos.* El%colesterol*contiene*el*núcleo*esteroide*ciclopentanoperhidrofenantreno*y*un*radical* hidroxilo.* Es* insoluble* en* agua* y* soluble* en* disolventes* orgánicos* (Reilly,* 1999).* Condiciona*la*permeabilidad*y*la*fluidez*de*la*membrana,*y*por*tanto,*la*estabilidad*de* los*liposomas* y*la*capacidad*de*encapsulación*(Moribe*y*cols.,*1999).*Los*fosfolípidos* pueden*incorporarlo*hasta*una*concentración*molar*del*50%.*Por*encima*de*este*valor,* los* liposomas* son* metaestables* y* las* vesículas* tienden* agregarse* y* precipitar* (Clares,* 2003).** Por*tanto,* la*estabilidad*depende*de*distintas*propiedades* inherentes*a* las*vesículas,* como*la*carga*superficial,*el*tamaño,*la*hidratación*de*la*superficie*y*la*fluidez*de*las* bicapas*lipídicas*(González-Rodríguez*y*cols.,*2007;*Villasmil,*2010).*Otros*factores,*como* la* incorporación* de* moléculas* a* encapsular,* también* pueden* interaccionar* con* los* componentes*de*los*liposomas,*pudiendo*alterar*su*integridad*y*afectando,*por*tanto*a* la*estabilidad*(Maestrelli*y*cols.,*2009).* 1.4.3 Liposomas(para(administración(oftálmica( Por* lo* que* respecta* a* la* vía* oftálmica,* se* ha* demostrado* que* los* liposomas* pueden* mejorar* la* penetración* de* fármacos,* ya* que* establecen* un* contacto* íntimo* con* la* ! ! 16! superficie* córneo-conjuntival* (Hathout* y* cols.,* 2007).* Se* ha* demostrado* que* la* carga* superficial*del*liposoma*influye*en*la*penetración*a*través*del*epitelio*corneal,*siendo* aquellos*con*carga*positiva*los*más*favorables,*dada*la*interacción*electrostática*entre* las*cargas*positivas*de*los*liposomas*y*las*negativas*de*los*epitelios*corneal*y*conjuntival* (Rabinovich-Guilatt*y*cols.,*2004).*Sin*embargo,*a*pesar*de*esta*justificación,*no*siempre* esta*interacción*es*favorable*a*la*acción*de*la*formulación.* El*fármaco*encapsulado*en*los*liposomas*puede*liberarse*bien*por*difusión*pasiva,*o*bien* por*erosión*de*las*vesículas.*Mediante*difusión*pasiva,*las*moléculas*de*fármaco*tienden* a*penetrar*a*través*de*las*capas*lipídicas*de*los*liposomas*para*alcanzar*la*capa*vesicular* adyacente,* ya* sea* por* mecanismo* de* difusión* o* convección.* La* velocidad* de* difusión* depende* del* tamaño,* la* composición* de* lípidos,* y* las* propiedades* del*fármaco* en* sí,* como*defienden*(Mishra*y*cols.,*2011).* Sin* embargo,* a* pesar* de* las* ventajas* que* aportan* los* liposomas* como* sistemas* mejoradores* de* la* penetración,* los* liposomas* convencionales* presentan* ciertas* dificultades* para* atravesar* intactos* determinadas* capas* de* la* mucosa,* quedando* el* fármaco*acumulado*en*el*lugar*de*aplicación*(Maestrelli*y*cols.,*2006).*Actualmente,*se* han* diseñado* diferentes* tipos* de* vesículas* introduciendo* algún* componente* que* modifican*sus*propiedades,*como*los*niosomas,*etosomas,*transfersomas,*entre*otros,* que*proporcionan*beneficios*adicionales*a* los*liposomas*convencionales*con*el*fin*de* facilitar* el* paso* de* fármacos* a* través* de* las* mucosas* (González-Rodríguez*y* Rabasco,* 2011).* 1.5 OBJETIVOS( El*objetivo*principal*de*este*trabajo*consiste*en*analizar*las*características*fisicoquímicas* y*de*atrapamiento*del*complejo*HPβCD-ACZ*en*liposomas*convencionales*y*evaluar*su* integridad.*Con*este*estudio*se*pretende*avanzar*en*la*obtención*de*una*formulación* adecuada* y* estable* para* su* posterior* adición* de* maleato* de* timolol* como* fármaco* sinérgico*en*el*tratamiento*del*glaucoma*y*proceder*a*su*evaluación*in*vivo.* * * * ! ! 17! 2 2.(MATERIALES(Y(MÉTODOS( 2.1 MATERIALES(Y(REACTIVOS(( A* continuación,* se* presentan* los* distintos* materiales* que* han* sido* utilizados* para* la* realización*de*este*trabajo*experimental.* • Acetazolamida*(ACZ)* • Agua*Milli-Q®*(Milli-Q®%Advantage,%Millipore).* • Hidroxipropilbetaciclodextrina* (HPBCD):* se* presenta* como* un* polvo* cristalino* blanco, inodoro*y*ligeramente*dulce*y*con*un*peso*molecular*de*1375.36*g/mol* (http://es.cydextrin.com/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin).* • Cloroformo:* triclorometano* estabilizado* con* etanol.* Fórmula* empírica:* CHCl3.* Calidad*analítica.* • Cloruro*de*sodio:*Cristales*translúcidos*blancos.*Muy*soluble*en*agua,*de*peso* molecular*58,44*g/mol.* • Colesterol*(CH):*Se*presenta*como*polvo*blanco*con*fórmula*empírica*C27H46O,* nombre*químico*3-β*-hidroxi-5-colesteno,*peso*molecular*de*386,67*g/mol*y*con* un*punto*de*fusión*de*148,5*°C.*Se*conserva*a*temperatura*ambiente.* • Estearilamina* (EA):* Octadecilamina.* Su* fórmula* empírica* es* C18H39N* y* su* peso* molecular*269,52*g/mol.*Se*trata*de*un*polvo*blanco,*insoluble*en*agua,*que*se* conserva*a*temperatura*ambiente.* • Fosfatidilcolina* de* huevo* (EPC).* Es* el* fosfolípido* responsable* de* la* actividad* interfacial*del*surfactante,*ya*que*sus*dos*cadenas*de*acilo*saturadas*le*permiten* formar*una*monocapa*altamente*empaquetada.*Se*conserva*a*4*°C.* • Lauril*sulfato*sódico*(LSS):*de*fórmula*molecular*C12H25NaO4S,*se*presenta*como* un*polvo*fino*blanco,*con*débil*olor*característico.*Su*peso*molecular*es*288,38* g/mol.** • Metanol:*de*fórmula*molecular*CH3OH*y*peso*molecular*de*32,0*g/mol.*Calidad* analítica.* ! ! 18! • Tampón*Hepes:*ácido*2-[4(2-hidroxietil)-1-piperacinil]*etanosulfónico*(Hepes)*de* fórmula* molecular* C8H18N2O4S* y* peso* molecular* 238,30* g/mol.* El* tampón* se* estabilizó*a*pH=*7,4*con*NaOH.* • Bromuro*de*didecil*dimetil*amonio*(DDAB):*su*fórmula*empírica*es*C26H56BrN*y* su*peso*molecular*es*462,6*g/mol.*Se*trata*de*un*polvo*cristalino*blanco,*que*se* conserva*a*temperatura*ambiente.* • Acetato* sódico:* polvo* cristalino* con* fórmula* molecular* CH3COONa.* Su* solubilidad*en*agua*es*0,47*g/mL*y*su*peso*molecular*82,04*g/mol.* 2.2 EQUIPOS(E(INSTRUMENTACIÓN( El*equipamiento*necesario*para*realizar*este*trabajo*se*cita*a*continuación:* • Balanza*analítica*de*precisión*(Explorer®%Pro).* • Rotavapor*(Büchi%Rotavapor%R-210%con*Büchi%Heating%Bath%B-491).* • Equipo*de*agitación*(Atom%Atomixer).* • Baño*termostatizado*(Raypa%ICI-200).* • Zetasizer%Nano%ZS*(Malvern%Instruments).* • Centrífuga*(Eppendorf%Centrifuge%5804%R).* • HPLC*(Hitachi%HPLC%Elite%Lachrom).* • Espectrofotómetro*(Agilent%8453).* • Baño*de*ultrasonidos*(VWR%Ultrasonic%cleaner).* • Bomba*de*vacío*(Millipore).* 2.3 METODOLOGÍA( 2.3.1 Búsqueda(de(información( Para* la* realización* del* presente* trabajo,* la* búsqueda* de* información* se* basó* en* la* continuación* de* una* de* las* líneas* de* investigación*iniciadas* por* el* grupo* de* investigación.* Fundamentalmente* se* utilizaron* manuales* y* bibliografía* revisada*con* anterioridad*por*los*investigadores*del*grupo,*así*como*actualizaciones*y*revisiones*más* actuales,*con*el*fin*de*tener*los*datos*más*actuales*respecto*al*tema.** Además* realizamos* búsquedas* en* bases* de* datos* de* publicaciones* científicas* para* la* contrastación*de*los*ensayos*realizados*y*los*resultados*obtenidos,*tales*como*Pubmed,* vademécum,*medline,*AEMPS,*entre*otras.* ! ! 19! 2.3.2 Diagramas(de(solubilidad( Estos* ensayos* de* solubilidad* de* fase* se* diseñaron* de* acuerdo* con* la* metodología* propuesta* por* Higuchi* y* Connors,* con* el* fin* de* confirmar* la* constante* de* estabilidad* aparente*(K1:1)*y*determinar*la*eficacia*de*complejación.* Se*programaron*tres*diagramas*de*solubilidad*diferentes*durante*la*realización*de*este* trabajo.*En*el*primero,*se*reprodujo*un*estudio*ya*iniciado*por*el*grupo*de*investigación,* que*tenía*como*finalidad*poner*de*manifiesto*la*influencia*que*ejercían*concentraciones* crecientes*de*HPβCD*en*la*solubilidad*de*la*ACZ.*Para*ello,*sobre*frascos*de*vidrio*que* contenían* 5* mL* de* Hepes* a* temperatura* ambiente,* se* adicionó* una* concentración* variable*de*HPβCD*(0,01*–*0,1*M)*y*un*exceso*de*fármaco*correspondiente*a*unos*30*mg* del* mismo.* Con* el* fin* de* evitar* toda* posible* interacción* en* estado* sólido* de* los* componentes,* la* adición* del* principio* activo* se* realizó* tras* la* solubilización* total* del* vehículo.*Estos*frascos*así*preparados*se*mantuvieron*cerrados*y*en*agitación*(ACS%360% TS-K%412)*durante*7*días*hasta*alcanzar*el*equilibrio*total*del*sistema.*A*continuación,*se* procedió* a* su* valoración* por* HPLC* previa* filtración* de* las* muestras* con* objeto* de* eliminar*la*fase*sólida*presente.*Esta*se*realizó*mediante*jeringa*y*filtros*de*nitrocelulosa* (Millipore®)* de*0,45* μm* de* diámetro* de* poro.* Igualmente,* se* realizaron* diluciones* adecuadas*de*las*soluciones*obtenidas*(1:10),*con*el*fin*de*conseguir*la*concentración* apropiada* del* fármaco* para* proceder* a* su* valoración.* Los* ensayos* se* realizaron* por* triplicado.* El*segundo*estudio*fue*similar*al*primero,*al*cual*se*le*adicionó*una*cantidad*fijas*de* colesterol*(20*mg).*Con*esta*modificación*se*crea*un*sistema*ternario*y*la*finalidad*fue* estudiar*la*interacción*entre*la*HPβCD*y*el*colesterol*presente*en*los*liposomas,*como* consecuencia*de*un*desplazamiento*de*la*ACZ*complejada.** El*tercer*estudio*se*programó*una*vez*obtenidos*los*resultados*del*segundo*diagrama,*y* habiéndose*observado*que*efectivamente*existía*interacción*entre*la*ciclodextrina*y*el* colesterol.*En*este*caso,*se*realizó*un*nuevo*diagrama*pero*sustituyendo*el*colesterol* por*el*derivado*hemisuccinato*de*colesterol,*esperando*que*no*ocurrieran*interacciones* y*secuestro*por*parte*de*éste*sobre*la*HPβCD.** Los*datos*de*solubilidad*de*ACZ*se*representaron*gráficamente*frente*a*la*concentración* molar*de*HPβCD*mediante*regresión*lineal.*Asumiendo*la*relación*estequiométrica*1:1,* se*procedió*al*cálculo*de*la*K1:1*mediante*la*relación*entre*la*concentración*molar*de*ACZ* ! ! 20! en*la*solución*frente*a*la*concentración*molar*de*HPβCD,*según*la*siguiente*ecuación:* 𝐾!:!= 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑆!(1−𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒)* *Donde*S0*es*la*solubilidad*de*ACZ*en*ausencia*de*HPβCD.** En* los* sistemas* ternarios* donde* la* S0*se* puede* ver* influenciada* por* la* presencia* del* aditivo,* resulta* más* interesante* contemplar* el* parámetro* eficiencia* de* complejación* (EC).*Este*parámetro*a*partir*de*los*datos*de*la*curva*de*solubilidad*de*fases,*mediante*la* siguiente*expresión*(Loftsson*y*cols.,*2005):* 𝐸𝐶 = 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 1−𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒* Otro*parámetro*a*evaluar*sería*la*eficacia*solubilizante*(ES)*que*ejerce*la*CD*y*que*se* define* como* el* aumento* de* la* solubilidad* relativa* del* fármaco* obtenida* a* una* determinada*concentración*de*CD,*según*la*siguiente*ecuación:* 𝐸𝑆 = 𝑆!" 𝑆! * Donde* SCD* representa* la* solubilidad* del* fármaco* a* dicha* concentración* de* CD* y* S0*la* solubilidad*en*ausencia*de*CD.* 2.3.3 Composición(de(los(liposomas( Como* se* mencionó* anteriormente,* la* elaboración* de* los* liposomas* se* llevó*a* cabo* partiendo*de*fosfatidilcolina*como*agente*principal*y*colesterol*en*la*formulación,*así* como* otros* componentes,* dependiendo* de* las* características* que* requiera* la* formulación*o*del*fin*para*el*que*se*estén*formulando*(López-Pinto*y*cols.,*2005).*En*la* tabla* 2* se* recoge* la* composición* de* las* formulaciones* empleadas* en* este* estudio,* atendiendo*a*si*los*componentes*se*incluyeron*en*la*fase*lipídica*o*fase*acuosa*de*los* liposomas.* * * * * * ! ! 21! COMPONENTE* Fase(lipídica( Fase(acuosa( EPC( 0,0954*mmol* -* Colesterol( 0,0812*mmol* -* Cloroformo( 4*mL* -* Metanol( 3,8*mL* -* HPβCD( -* 0,318*g/10*mL** Inductor(carga(positiva:(EA(ó(DDAB( Cantidades*variables*para*comprobar* estabilidad* Hepes(pH(7.4(+(EDTA((0.1(mM( -* 10mL** ACZ( * 5mg/mL*en*fase* acuosa** Tabla*2.*Composición*de*los*liposoma.*EPC:*fosfatidilcolina;*EA:*estearilamina;*DDAB:* bromuro*de*didecil*dimetil*amonio;*ACZ:*acetazolamida.* (*)à*se*utilizarán*10*mL*de*Hepes*junto*con*la*ACZ*y*la*HPβCD,*después*se*usarán*3mL* de*esta*solución*como*fase*acuosa.* La*función*del*Hepes*a*pH*7,4*radica*en*mantener*los*liposomas*a*un*pH*similar*al*del*ojo* y*EDTA,*agente*quelante*que*interviene*en*mantener*la*estabilidad*(Yáñez,*2010).* Una*vez*establecida*la*composición*de*la*fase*lipídica*y*la*fase*acuosa*de*los*sistemas* vesiculares,*se*procedió*a*la*elaboración*de*los*liposomas.*Como*han*postulado*diversos* autores,*el*método*de*elección*para*elaborarlos*depende*fundamentalmente*del*tipo*de* sistema*vesicular*que*sea*necesario*obtener*(Glogard*y*cols.,*2002).*En*nuestro*caso,*el* estudio*se*iniciará*con*la*elaboración*de*MLVs,*los*cuales,*en*una*etapa*posterior,*serán* extruidos*para*dar*lugar*a*LUVs.* 2.3.4 Elaboración(de(los(liposomas( La*elaboración*de*los*liposomas*se*llevó*a*cabo*utilizando*la*técnica*de*evaporación*en* capa*fina,*Bangham*o*TLE*(Thin% Layer% Evaporation)*con*el*fin*de*obtener*una*elevada* eficacia* de* encapsulación* del* complejo* [ACZ* +* HPβCD]* así* como* adecuadas* características*físicas*de*las*vesículas.**** Aprovechando* las* características* de* solubilidad* de* los* fosfolípidos* en* diferentes* disolventes*orgánicos*(Lehninger,*2001),*en*primer*lugar,*se*procedió*a*la*formación*de* una*película*constituida*por*los*materiales*lipídicos.*Para*ello,*en*el*interior*de*un*matraz* de* fondo* redondo,* se* pesó* directamente* la* mezcla* lipídica* de* fosfatidilcolina* y* colesterol,*disolviéndolos*en*4*mL*de*cloroformo.* Al*contenido*del*matraz*se*le*añadió*el*resto*de*los*materiales*(en*los*casos*necesarios,* estearilamina*ó*DDAB*según*lote),*previamente*disueltos*en*3,2*mL*de*metanol.* ! ! 22! A*continuación,*se*procedió*a*la*evaporación*de*los*disolventes*en*un*rotavapor*(Büchi% Rotavapor%R-210%con*Büchi%Heating%Bath%B-491)*a*58*°C,*temperatura*superior*a*la*de* transición*de*fase*de*la*mezcla*de*los*lípidos*formadores,*hasta*crear*una*fina*película* lipídica.*En* esta* fase,* es* importante* considerar* que*el*disolvente* ha* de* eliminarse*de* forma*homogénea*en*toda*la*superficie*de*la*película,*con*el*fin*de*evitar*cristalizaciones* de*los*componentes*y*la*formación*de*burbujas.* Una* vez* formada* la* película* lipídica,* ésta* se* hidrató* con* 3* mL* de* una* disolución* preparada*de*Hepes*con*EDTA*(1*mM)*a*la*que*se*añadió*el*complejo*[ACZ*+*HPβCD]*(en* los*lotes*que*fue*necesario).*Dicha*fase*acuosa*se*atemperó*durante*5*minutos*antes*de* ser* añadida* a* la* película* lipídica,* con* el* fin* de* que* ambas* fases* se* encontrasen* a* la* misma*temperatura.* Seguidamente,* la* película* hidratada* se* sometió* a* cinco* ciclos* de* agitación* en* vortex% durante*un* tiempo*de* un* minuto*cada* ciclo,*intercalados*con* cinco*minutos*en*baño* termostatizado*a*58*°C*hasta*la*obtención*de*un*preparado*de*color*blanco*opalescente* en*el*que*se*encontraban*dispersos*los*liposomas.*La*dispersión*coloidal*así*obtenida,* una*vez*alcanzada*la*temperatura*ambiente,*se*conservó*en*nevera*a*4*°C.* 2.3.5 Evaluación( de( la( integridad( de( la( membrana( del( liposoma:( estudios( de( incubación( Este* estudio* se* llevó* a* cabo* tras* mantener* en* incubación* las* formulaciones*de* liposomas.*El* procedimiento* seguido* puede* resumirse* del* siguiente* modo.* Una* vez* obtenidos*los*liposomas,*se*tomó*una*alícuota*de*la*formulación*y*se*caracterizó*desde* el*punto*de*vista*fisicoquímico,*para*tener*los*datos*a*tiempo*cero.*Seguidamente,*se* separaron*volúmenes*de*1,2*mL*de*cada*formulación,*por*duplicado,*para*proceder*al* ensayo,*que*consistió*en*añadir*al*primer*grupo*de*muestras*1,2*mL*de*solución*tampón* Hepes,* agitarlo* y* mantener* en* nevera* a* 4* °C.* Alternativamente,* al* otro* grupo* de* muestras*se*añadió*1,2*mL*de*una*solución*de*tampón*Hepes*con*HPβCD-ACZ.* Transcurridos* cinco* días* de* incubación,* las* diferentes* muestras* se* caracterizaron* en* cuanto*a*sus*propiedades*fisicoquímicas*de*tamaño*vesicular,*índice*de*polidispersión*y* carga*superficial.* Este*ensayo*se*llevó*a*cabo*por*triplicado.* ! ! 23! 2.3.6 Caracterización(fisicoquímica(de(liposomas( En*la*Tabla*3*se*recoge*información*sobre*la*totalidad*de*los*lotes*analizados*en*este* estudio.* LOTE* EPC((mmol)( Colesterol((mmol)( EA((mmol)( DDAB((mmol)( 1( 0,1838* * * * 2( 0,0954* 0,0812* * * 4( 0,0954* 0,0812* 0,01484* * 4( 0,0954* 0,0812* 0,02968* * 5( 0,0954* 0,0812* 0,04453* * 3( 0,0954* 0,0812* * 0,01484* 7( 0,0954* 0,0812* * 0,02968* 8( 0,0954* 0,0812* * 0,04453* Tabla*3.*Composición*de*los*lotes*elaborados*para*el*estudio*de*incubación.* Para*realizar**1.2*mL*de*una*solución*de*Hepes*o*en**una*solución*de*Hepes*en*presencia* de*HPβCD-ACZ*(0,1M).*Se*siguió*la*metodología*propuesta*por*Hatzi*y*cols.*(Hatzi*et*al.,* 2007)*con*algunas*modificaciones.** 2.3.6.1.$Análisis$dimensional$ En*la*estabilidad*y*el*comportamiento*físico*de*los*liposomas*adquiere*gran*importancia* la*distribución*de*los*tamaños*de*los*mismos.*Como*es*bien*conocido,*el*tamaño*de*las* vesículas* influye* notablemente* en* la* estabilidad* de* los* sistemas.* En* general,* se* considera*que*a*mayor*tamaño,*los*liposomas*son*más*estables.* Por*otra*parte,*el*índice*de*polidispersión*(IP)*es*un*parámetro*que*hace*referencia*a*la* homogeneidad/* heterogeneidad* de* la* muestra* analizada,* con* respecto* a* sus* dimensiones.* Representa* una* medida* de* la* diferencia*del* tamaño* que* suele* tener* la* mayoría*de*los*liposomas*analizados*en*función*de*su*diámetro*medio.*En*la*práctica,* cuanto*mayor*es*el*IP,*mayor*será*la*diferencia*entre*el*tamaño*medio*de*la*población* de*liposomas*analizada*y,*por*tanto,*más*heterogéneas*serán*las*vesículas.*Así,*un*valor* elevado*de*IP*(0,8*-*1)*es*indicativo*de*una*muestra*heterogénea,*mientras*que*un*valor* bajo*de*IP*(<*0,2)*indicará*una*elevada*homogeneidad*de*las*vesículas*en*cuanto*a*sus* dimensiones.** La* espectroscopía* de* correlación* fotónica,* también* denominada* Dynamic% Light% Scattering,* permite* calcular* el* índice* de* polidispersión* de* una* muestra* así* como* sus* dimensiones,*lo*cual*es*indicativo*de*la*distribución*de*tamaños*en*la*misma.** ! ! 24! El*equipo*utilizado*para*determinar*ambos*parámetros*es*el*Zetasizer%Nano%ZS*(Figura*7).% * Figura*7.*Imagen*del*equipo*Zetasizer*Nano*ZS*utilizado*en*el*trabajo*de*investigación.* Este*aparato*mide*la*difusión*de*un*haz*de*luz*a*través*de*un*sistema*disperso,*que*en* nuestro* caso,* es* la* dispersión* de* los* liposomas.* Emite* luz* láser,* que* incide* sobre* la* muestra,*la*cual*es*introducida*en*una*cubeta*de*plástico*y*la*intensidad*de*luz*láser* dispersada* es* detectada* por* un* fotomultiplicador* a* un* ángulo* de* 90°* y* dirigida* a* un* correlador*óptico*digital*que*caracterizará*la*intensidad*de*la*señal*traduciéndola*como* tamaño* de* partícula* (Puzi* y* cols.,* 1999;* Foerter-Barth* y* Teipel,* 2000).* Esta* técnica* resulta*muy*útil*para*medir*partículas*de*un*diámetro*entre*1*nm*y*5*µm*en*muy*poco* tiempo.* El* equipo,* además,* está* unido* a* un* ordenador* con* el* programa* DTS* nano,* que* es* el* encargado* de* transcribir* las* señales* y* darles* formato* para* realizar* las* lecturas* y* la* obtención*de*los*datos.* 2.3.6.2.$Carga$superficial$ La*carga*superficial*de*los*liposomas*crea*un*campo*eléctrico*que*afecta*a*la*estructura* de*la*bicapa,*a*su*fluidez*y*al*transporte*de*moléculas*a*través*de*la*membrana*(Sabín,* 2007).*Además,*esta*carga*juega*un*papel*trascendental*en*la*estabilidad*coloidal*de*los* liposomas,*ya*que*los*procesos*de*agregación*y*fusión*de*liposomas*están*controlados,* en*gran*parte,*por*la*repulsión*o*atracción*de*sus*superficies*lipídicas*(Ramos*y*cols.,* 2010).* La*aparición*de*una*superficie*cargada*en*los*liposomas*depende*fundamentalmente*de* la* composición* fosfolipídica* de* la* bicapa.* Además,* la* agregación* de* liposomas* es* un* ! ! 31! • DDAB:*incremento*del*diámetro*medio*en*las*formulaciones*que*contenían* HPβCD-ACZ.* No* se* apreciaron* alteraciones* significativas* en* los* valores* de* potencial*zeta*ni*del*IP,*lo*cual*demostraba*que*se*trataba*de*formulaciones* estables.** • EA:* disminución* del* diámetro* medio* en* las* formulaciones* cargadas* con* HPβCD-ACZ.*En*cuanto*al*potencial*zeta,*la*tendencia*fue*aumentar*la*carga* superficial* en* aquellas* vesículas* que* contenían* el* fármaco,* como* consecuencia* de* una* posible* redistribución* de* los* componentes* de* la* bicapa.*En*cuanto*al*IP*presentaron*un*valor*de*1,*indicativo*de*una*elevada* heterogeneidad*de*las*muestras.* Según* estos* resultados,* y* como* confirman* otros* autores* (Manosroi* y* cols.,* 2011;* Saengkrit*y*cols.,*2014),*el*DDAB*da*lugar*a*bicapas*más*estables*cuando*se*incorpora*el* complejo* de* inclusión* en* la* formulación.* El* incremento* del* tamaño* vesicular* en* las* formulaciones* cargadas* coincide* con* el* incremento* de* complejo* atrapado* en* el* compartimento*acuoso,*lo*que*ocasiona*un*mayor*volumen*ocupado*en*el*interior*del* liposoma*(lotes*3,*7*y*8).* En*cambio,*cuando*se*incorpora*EA*en*las*bicapas,*existen*diversos*acontecimientos*que* apuntan*a*una*posible*interacción*con*la*ciclodextrina.*En*primer*lugar,*la*evolución*de* los* tamaños* respecto* a* los* lotes* blancos.* Esta* disminución* de* los* tamaños* con* el* complejo*incluido*en*el*interior*(eficacias*de*encapsulación*de*46,98,*25,45*y*35,76*%* para* los* lotes* 4,* 5* y* 6* respectivamente),* hace* pensar* en* una* posible* interacción* producida*durante*el*proceso*de*hidratación*de*la*película*lipídica.*Sin*embargo,*dado* que*los*valores*del*potencial*zeta*en*todas*las*formulaciones*se*mantuvieron*con*valores* positivos,*y*que*el*estado*de*la*EA*durante*el*proceso*de*hidratación*se*encontraba*en* un*cambio*de*transición*de*fases*(punto*de*fusión:*52,9*°C),*se*puede*intuir*que*otros* componentes*de*la*bicapa*están*afectando*a*la*integridad*de*la*misma.* Es* por* ello* que* se* decidió* realizar* un* estudio* sobre* un* componente* común* en* las* formulaciones,* y* del* que* existe* en* la* bibliografía* constancia* de* su* interacción* con* determinadas*ciclodextrinas:*el*colesterol.* * ! ! 32! 3.4( INFLUENCIA( DE( LA( PRESENCIA( DE( COLESTEROL( EN( LA( INTEGRIDAD( DE( LOS( LIPOSOMAS( Teniendo* en* cuenta* que* en* la* bibliografía* aparece* recogida* la* posibilidad* de* que* el* colesterol*sufra*un*proceso*de*complejación*en*la*cavidad*de*determinadas*CDs,*y*que* este*proceso*pudiera*afectar*a*la*solubilización*de*la*ACZ,*se* planteó*la*necesidad*de* evaluar*esta*posible*interacción*(Williams*y*cols.,*1998;*López*y*cols.,*2011).* Se*decidió*realizar*los*ensayos*de*solubilidad*de*ACZ*y*HPβCD*en*presencia*de*colesterol* comparándolos*con*los*resultados*obtenidos*en*ausencia*del*mismo.*En*la*Figura*10*se* recogen*los*resultados*obtenidos.*Se*aprecia*que*la*presencia*de*colesterol,*aunque*no* modifica* el* tipo* de* diagrama,* sí* disminuye* tanto* la* constante* de* complejación* ACZHPBCD*(42,99*M-1)*como*la*S0*del*fármaco*(2,55*mM).* Esto*se*puede*interpretar*como*que*la*presencia*de*colesterol,*molécula*de*naturaleza* hidrofóbica,* compite* con* el* fármaco* por* ocupar* la* cavidad* de* la* CD.* Situaciones* similares* de* compuestos* ternarios* han* sido* descritas* en* la* bibliografía* (Wang* y* cols.,* 2013).* * * Figura*10.*Diagrama*de*solubilidad*del*ensayo*ACZ-HP*y*ACZ-HP*+*colesterol.* * Los*resultados*anteriores*nos*plantearon*la*necesidad*de*buscar*un*derivado*alternativo* al* colesterol* que* no* ejerciera* este* efecto* competitivo* y* que* fuera* compatible* con* la* 0! 0,005! 0,01! 0,015! 0,02! 0,025! 0* 0,02* 0,04* 0,06* 0,08* 0,1* 0,12* ACZ![M]! HPβCD![M]! ACZ!+!HP! ACZ!+!HP!+!colesterol! ! ! 33! formulación* de* nuestros* liposomas.* Para* ello,* se* seleccionó* el* derivad* colesterol* hemisuccinato*(CHEMS),*que* en* base* a*su*mayor*polaridad,*debería*presentar*menor* tendencia*a*ser*complejado.*Además,*no*existen*referencias*en*la*literatura*acerca*de*la* existencia*de*interacción*con*ciclodextrinas.** Los* resultados* (Figura* 11)* mostraron* que* el* uso* de* este* derivado* no* dificultaba* el* proceso*de*complejación*del*fármaco,*sino*todo*lo*contrario,*incluso*ejercía*un*efecto* solubilizante*sobre*la*ACZ,*como*se*observa*en*los*datos*de*S0*obtenidos.* Una*vez*puesto*de*manifiesto*este*aspecto,*en*un*futuro*habrá*que*poner*de*manifiesto* que*el*uso*de*este*derivado*no*afecte*a*la*integridad*de*los*liposomas*formulados.* ** * Figura*11.*Diagrama*de*solubilidad*del*ensayo*ACZ-HP*y*ACZ-HP*+*CHEMS* 3.5.(DISCUSIÓN( Una*vez*obtenidos*los*resultados*del*estudio,*se*procederá*a*la*discusión*de*los*mismos,* intentando*justificarlos*dividiendo*la*sección*en:*efecto*del*complejo*de*inclusión*en*la* superficie* de* liposomas* ya* elaborados* y* efecto* del* complejo* de* inclusión* durante* el* proceso*de*elaboración.* Respecto*al*análisis*desde*la*superficie*de*la*vesícula,*el*efecto*de*la*presencia*de*carga* positiva*en*la*superficie*de*los*liposomas,*aportada*por*EA*o*DDAB,*sobre*la*integridad* de*los*liposomas*en*presencia*de*HPβCD-ACZ* ha*sido*diferente,*de*forma*que*podría* 0! 0,005! 0,01! 0,015! 0,02! 0,025! 0* 0,02* 0,04* 0,06* 0,08* 0,1* 0,12* ACZ![M]! HPβCD![M]! ACZ!+!HP! ACZ!+!HP!+!colesterol! ACZ!+!HP!+!CHEMS! ! ! 34! producirse* una* reacción* de* desplazamiento* de* la* ACZ* del* complejo,* a* favor* de* la* complejación* de* EA.* Este* efecto* no* ocurriría* con* el* DDAB.* Las* diferencias* de* las* características* fisicoquímicas* entre* ambos* agentes,* tanto* en* peso* molecular,* como* estructural*y*de*solubilidad,*podrían*contribuir*a*dicho*efecto.*** Cuando*se*analizó*el*comportamiento*del*complejo*cuando*éste*se*incorporó*durante*la* elaboración*de*las*vesículas,*se*apreció*un*importante*efecto*estabilizador*del*DDAB*en* las* bicapas,* a* diferencia* de* la* EA.* Este* efecto* ha* sido* demostrado* por* algunos* investigadores* (Angelini* y* cols.,* 2011).* La* disposición* de* la* estructura* de* la* EA* en* la* bicapa,* así* como* su* estado* líquido* y* fluido* a* la* temperatura* de* elaboración* de* los* liposomas,* hacen* que* no* exista* la* afinidad* por* la* CD* encontrada* en* la* superficie* del* liposoma.** Por*tanto,*y*en*base*a*los*datos*de*solubilidad*de*fase*de*ACZ*en*presencia*de*colesterol,* se*puede*deducir*que*existe*una*interacción*entre*la*ciclodextrina*y*el*lípido,*de*manera* que*se*produce*un*desplazamiento*de*la*ACZ*complejada.*Cuando*esto*tiene*lugar,*las* formulaciones*que*contienen*EA,*debido*a*la*naturaleza*lipófila*de*esta*sustancia,*la*ACZ* precipita,*desestabiliza*al*liposoma*y*se*obtienen*valores*de*IP*de*1.*En*cambio,*los*lotes* formulados*con*DDAB,*debido*al*carácter*tensioactivo*de*esta*molécula,*puede*ejercer* propiedades*solubilizantes*sobre*ACZ,*que*contribuye*a*la*permanencia*del*fármaco*en* el*interior*de*las*vesículas.*Ello*queda*reflejado*en*valores*inferiores*de*IP.** Esta*interpretación*justificaría*así*los*valores*obtenidos*de*fármaco*encapsulado*en*las* distintas*formulaciones,*de*manera*que*en*el*caso*del*DDAB,*se*obtiene*una*relación* ascendente*a*medida*que*se*incrementa*la*concentración*de*este*tensioactivo,*mientras* que*las*formulaciones*con*EA,*no*siguen*una*relación*concreta.* Una*vez*llegados*a*este*punto,*se*decidió*elaborar*un*nuevo*lote*con*mayor*cantidad*de* DDAB*(27,5*mg),*para*corroborar*que*el*DDAB*mejora*las*propiedades*de*los*liposomas* como*parece*en*principio,*con*el*objetivo*de*respaldar*definitivamente*esta*hipótesis.* Los*resultados* obtenidos*(diámetro*medio:*552,47*nm;*IP:*0,25;*potencial*zeta:*21,00* mV;*eficacia*de*encapsulación:*51,10%)*confirman*los*beneficios*de*emplear*este*agente* de*carga*para*sucesivos*estudios*de*formulación*con*HPβCD.* ! ! 35! 4.(CONCLUSIONES( En*vista*de*los*resultados*obtenidos,*podemos*afirmar*que*la*adición*de*la*HPBCD*en*la* formulación* de* liposomas* de* colesterol* no* ha* resultado* beneficiosa,* puesto* que* la* ciclodextrina*tiene*afinidad*por*el*colesterol,*lo*que*provoca*la*desestructuración*de*la* membrana,* y* la* disminución* de* la* solubilización* del* fármaco* por* parte* de* la* ciclodextrina.* Este* hecho* hace* que* la* formulación* de* una* solución* oftálmica* de* liposomas* de* colesterol* para* la* administración* de* acetazolamida* no* sea* viable,* pero,* dejamos* la* puerta* abierta* a* la* posibilidad* de* que* la* investigación* continúe,* puesto* que* también* hemos*demostrado*como*el*hemisuccinato*de*colesterol*no*presenta*estas*interacciones* y*podría*utilizarse*como*base*para*futuros*experimentos.* También*destacar*el*papel*estabilizante*que*ha*tenido*el*DDAB*en*la*formulación,*puesto* que* ha* favorecido* tanto* la* estabilidad* de* las* vesículas,* como* la* solubilización* del* complejo*dentro*del*liposoma,*además*de*mantener*la*carga*positiva*de*la*membrana* lipídica,* de* tal* manera* que* aumenta* mucho* las* posibilidades* de* obtener* una* buena* biodisponibilidad*y*absorción,*vía*tópica*ocular.* 5.(PERSPECTIVAS(DE(FUTURO* 1. Estudiar*las*posibles*propiedades*estabilizadoras*del*DDAB*en*la*fórmula,*puesto* que* al* ser* un* tensioactivo,* puede* presentar* interesantes* propiedades* para* la* formulación* de* fármacos* poco* solubles* en* agua* incorporados* en* liposomas* como*complejos*de*inclusión.* 2. Analizar*el*efecto*de*EA,*a*diferentes*temperaturas*(por*encima*y*por*debajo*de* su*punto*de*fusión)*sobre*las*características*de*complejación*con*HPβCD.* 3. Sustituir* en* la* formulación* de* liposomas* el* colesterol* por* su* derivado* hemisuccinato,*puesto*que*ya*hemos*visto*que*su*interferencia*con*la*HPβCD*es* mínima,*gracias*a*los*estudios*realizados.* 4. Corroborar*que* los*parámetros*fundamentales*de*los*liposomas*(tamaño,* IP*y* potencial* Z)* son* estables* y* se* mantienen* constantes* tras* el* desarrollo* de* la* fórmula*optimizada.* ! ! 36! 5. Incorporar*timolol*maleato*en*la*formulación,*analizar*el*efecto*de*su*presencia* en*la*bicapa*sobre*la*estabilidad*de*la*misma,*con*el*fin*de*proceder*a*realizar*el* estudio*in*vivo*de*la*actividad*antiglaucomatosa.* 6.(REFERENCIAS(BIBLIOGRÁFICAS( ! Abad* N.* Liposomas* ultradeformables* de* acetazolamida* para* su* administración* oftálmica:* diseño* y* estudios* de* caracterización.* Trabajo* Fin* de* Máster,* Facultad*de*Farmacia,*Universidad*de*Sevilla*(2012).* Acosta*J,*Figuera*M.*Conocimiento*del*glaucoma*en*estudiantes*de*medicina*de*la* Universidad*de*Oriente,*Núcleo*Anzoátegui,*Escuela*de*Ciencias*de*la*Salud,* Departamento*de*cirugía,*Barcelona*(2009).* Agencia* Española* del* Medicamento* y* Productos* Sanitarios.* CIMA:* Centro* de* Información*Online*de*Medicamentos*de*la*AEMPS.*[*En*línea].*[*Consultado* en* Marzo* 2016].*Disponible* en.* http://www.aemps.gob.es/cima/fichasTecnicas.do?metodo=*detalleForm.** Angelini* G,* Chiarini* M,* De* Maria* P,* Fontana* A,* Gasbarri* C,* Siani* G* and* Velluto* D* (2011).* Characterization* of* cationic* liposomes.* Influence* of* the* bilayer* composition* on* the* kinetics* of* the* liposome* breakdown.* Chem% Phys% Lipids* 164:680-687.* Ball,*E.*Liposomas*en*Dermatología.*Dermatología%Venezolana,*33:*15-23*(1995).* Bangham*AD,*Standish*MM*and*Watkins*JC*(1965)*Diffusion*of*univalent*ions*across* the*lamellae*of*swollen*phospholipids.*J%Mol%Biol*13:238-252.* Becker*B*(1954)*Decrease*in*intraocular* pressure* in* man* by* a*carbonic*anhydrase* inhibitor,*diamox;*a*preliminary*report.*Am%J%Ophthalmol*37:13-15.* Benítez-Collante* C,* Benítez-Collante* LM,* Arigossi* CR,* Benítez-Collante* AE* (2005).* Tratamiento* médico* del* glaucoma* crónico* simple:* Revisión.* Revista% de% Posgrado%de%la%Vía%Cátedra%de%Medicina*141:*1-3.* Bhardwaj* U,* Burgess* DJ* (2010)* Physicochemical* properties* of* extruded* and* nonextruded*liposomes* containing* the* hydrophobic*drug*dexamethasone.*Int% J% Pharm*388:181-189.* Blanco-Méndez*J,*Vila-Jato*JL,*Otero-Espinar*FJ*y*Anguiano-Igea*S*(1991).*Influence*of* method* of* preparation* on* inclusion* complexes* of* naproxen* with* different* cyclodextrins.*Drug%Dev%Ind%Pharm*17:*943-957.* Cavalcanti*IM,*Mendonca*EA,*Lira*MC,*Honrato*SB,*Camara*CA,*Amorim*RV,*Mendes* Filho* J,* Rabello* MM,* Hernandes* MZ,* Ayala* AP* and* Santos-Magalhaes* NS* (2011).* The* encapsulation* of* beta-lapachone* in* 2-hydroxypropyl-betacyclodextrin*inclusion*complex*into*liposomes:*a*physicochemical*evaluation* and*molecular*modeling*approach.*Eur%J%Pharm%Sci*44:332-340.* Chimanuka* B,* Gabriels* M,* Detaevernier* MR* and* Plaizier-Vercammen* JA* (2002)* Preparation* of* beta-artemether* liposomes,* their* HPLC-UV* evaluation* and* relevance* for* clearing* recrudescent* parasitaemia* in* Plasmodium* chabaudi* malaria-infected*mice.*J%Pharm%Biomed%Anal*28:13-22.* ! ! 37! Clares,* B.* Sistemas* de* transporte* y* liberación* de* fármacos* de* aplicación* tópica:* liposomas* multilaminares* portadores* de* acetónido* de* triamcinolona.* Tesis* doctoral.*Facultad*de*Farmacia.*Universidad*de*Granada*(2003)* Cortesi* R,* Argnani* R,* Esposito* E,* Dalpiaz* A,* Scatturin* A,* Bortolotti* F,* Lufino* M,* Guerrini*R,*Cavicchioni*G,*Incorvaia*C,*Menegatti*E*and*Manservigi*R*(2006)* Cationic*liposomes*as*potential*carriers*for*ocular*administration*of*peptides* with*anti-herpetic*activity.*Int%J%Pharm*317:90-100.* Drugbank*Database.*Open*Data*Drug*&*Drug*Target*Database:*Acetazolamide.*2013.* [* En* línea].* [* Consultado* en* Mayo* 2016].* Disponible* en* http://www.drugbank.ca/drugs/DB00819** Fang*JY,*Hong*CT,*Chiu*WT*and*Wang*YY*(2001)*Effect*of*liposomes*and*niosomes*on* skin*permeation*of*enoxacin.*Int%J%Pharm*219:61-72.* Fang*YP,*Tsai*YH,*Wu*PC*and*Huang*YB*(2008)*Comparison*of*5-aminolevulinic*acidencapsulated*liposome*versus*ethosome*for*skin*delivery*for*photodynamic* therapy.*Int%J%Pharm*356:144-152.* Foerter-Barth*U,*Teipel*U*(2000).*Characterization*of*particles*by*means*of*laser*light* diffraction*and*dynamic*light*scattering.*Developments*in*mineral*processing,* Proceedings%of%the%XXI%International%Mineral%Processing%Congress,*p.*13.* Glogard*C,*Stensrud*G,*Hovland*R,*Fossheim*SL*and*Klaveness*J*(2002)*Liposomes*as* carriers* of* amphiphilic* gadolinium* chelates:* the* effect* of* membrane* composition* on* incorporation* efficacy* and* in* vitro* relaxivity.* Int% J% Pharm* 233:131-140.* Goodman*&*Gilman.*Las*bases*farmacológicas*de*la*terapéutica,*11*ed.*Mc*Graw*Hill,* Mexico,*pp.*1707-1724*(2006).* González-Rodríguez* ML,* Barros* LB,* Palma* J,* González-R* P,* Rabasco* AM* (2007).* Application* of* statistical* experimental* design* to* study* the* formulation* variables*influencing*the*coating*process*of*lidocaine*liposomes.*Int%J%Pharm* 337:336-345* González-Rodríguez*ML,*Arroyo*CM,*Cózar-Bernal*MJ,*González-R*P,*León*JM,*Calle* M,* Canca* D* and* Rabasco* AM* (2016)* Deformability* properties* of* timololloaded* transfersomes* based* on* the* extrusion* mechanism.* Statistical* optimization*of*the*process.*Drug%Dev%Ind%Pharm:1-12.* González-Rodríguez* ML,* Rabasco* AM* (2011)* Charged* liposomes* as* carriers* to* enhance*the*permeation*through*the*skin.*Expert%Opin%Drug%Deliv*8:857-871.* Granero* GE,* Maitre* MM,* Garnero* C* and* Longhi* MR* (2008)* Synthesis,* characterization*and*in*vitro*release*studies*of*a*new*acetazolamide-HP-betaCD-TEA*inclusion*complex.*Eur%J%Med%Chem*43:464-470.* Hathout*RM,*Mansour*S,*Mortada*ND*and*Guinedi*AS*(2007)*Liposomes*as*an*ocular* delivery* system* for* acetazolamide:* in* vitro* and* in* vivo* studies.* AAPS% PharmSciTech*8:1.* Hatzi*P,*Mourtas*S,*Klepetsanis*PG*and*Antimisiaris*SG*(2007)*Integrity*of*liposomes* in*presence*of*cyclodextrins:*effect*of*liposome*type*and*lipid*composition.* Int%J%Pharm*333:167-176.* Higuchi*T,*Connors*KA*1965.*Phase-solubility*techniques.*Adv%Anal%Chem%Instr*4:*117-* 212.* ! ! 38! 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Martín*del*Valle*EM*(2004).*Cyclodextrins*and*their*uses:*a*review.*Process%Biochem* 39:1033-1046.* Mishra*GP,*Bagui*M,*Tamboli*V,*Mitra*AK*(2011)*Recent*applications*of*liposomes*in* ophthalmic*drug*delivery.*J%Drug%Deliv*2011:863734.* Mishra*V,*Jain*NK*(2014)*Acetazolamide*encapsulated*dendritic*nano-architectures* for*effective*glaucoma*management*in*rabbits.*Int%J%Pharm*461:380-390.* Moyano* JR,* Ginés* JM,* Arias* MJ,* Rabasco* AM* (1994).* Utilidad* de* ciclodextrinas* y* derivados*en*el*campo*farmacéutico*(I).*Industria%Farmacéutica,%Investigación% y%Tecnología*9(5):*71-76.** Moribe*K,*Maruyama*K,*Iwatsuru*M*(1999)*Encapsulation*characteristics*of*nystatin* in*liposomes:*effects*of*cholesterol*and*polyethylene*glycol*derivatives.*Int%J% Pharm*188:193-202.* Muller*LK,*Landfester*K*(2015)*Natural*liposomes*and*synthetic*polymeric*structures* for*biomedical*applications.*Biochem%Biophys%Res%Commun*468:411-418.* Parasrampuria*J,*Gupta*VD*(1989)*Preformulation*studies*of*acetazolamide:*effect*of* pH,* two* buffer* species,* ionic* strength,* and* temperature* on* its* stability.* J% Pharm%Sci*78:855-857.* Pérez-Barrales* MJ,* Díaz-Estévez* F,* Ginés* JM,* Moyano* JR,* Arias* MJ,* Rabasco* AM* (1995).*Inclusion*compound*of*acetazolamide*with*different*cyclodextrins*in* liquid* and* solid* state.* Proceedings* 7th* International* Conference* on* Pharmaceutical*Technology.*Budapest,*pp.*613-614.* Pitha* J,* Pitha* J* (1985)* Amorphous* water-soluble* derivatives* of* cyclodextrins:* nontoxic*dissolution*enhancing*excipients.*J%Pharm%Sci*74:987-990.* Porth* CM* (2007)* Fisiopatología,* salud-enfermedad:* un* enfoque* conceptual.* 7ª* edición.*Editorial*Médica*Panamericana,*Buenos*Aires,*pp*1295-1329.* Puzi*A,*Matynia*T,*Gawdzik*B,*Poddubnaya*O*(1999).*Use*of*CONTIN*for*calculation* of*adsorption*energy*distribution.*Langmuir%15:*6016-6025.* Rabinovich-Guilatt*L,*Couvreur*P,*Lambert*G,*Dubernet*C*(2004)*Cationic*vectors*in* ocular*drug*delivery.*J%Drug%Targeting*12:623-633.* Ramos*G,*Ramírez-Amador*S,*Esquivel*M,*Loría*A,*Vega-Baudrit*J,*Sibaja*M,*MadrigalCarballo*S*(2010).*Estudio*a*nanoescala*de*las*interacciones*entre*liposomas* recubiertos*con*biopolímeros*y*superficies*sólidas*de*biomateriales.*Revista% Iberoamericana%de%Polímeros,*11(7):596-606.* Reilly* W.* Productos* farmacéuticos* de* primera* necesidad.* En:* (Genaro,* A.* Ed.)* Remington* Farmacia.* Editorial* Médica* Panamericana,* Buenos* Aires,* Argentina,*p.*2139*(1999).* Sabín*JD.*Estabilidad*coloidal*de*nanoestructuras*liposómicas.*Tesis*doctoral*en*Física* (2007).* Saengkrit* N,* Saesoo* S,* Srinuanchai* W,* Phunpee* S,* Rungsardthong* * U* (2014).* Influence* of* curcumin-loaded* cationic* liposome* on* anticancer* activity* for* cervical*cancer*therapy.*Colloids%Surf%B%Biointerfaces*114:349-356.* Sonali,*RP,*Singh*N,*Sharma*G,*Vijayakumar*MR,*Koch*B,*Singh*S,*Singh*U,*Dash*D,* Pandey*BL,*Muthu*MS*(2016)*Transferrin*liposomes*of*docetaxel*for*braintargeted*cancer*applications:*formulation*and*brain*theranostics.*Drug%Deliv* 23:1261-1271.* Soriano* L.* Estudio* in% vitro* de* la* funcionalidad* de* formulaciones* liposomales* de* acetato*de*medroxiprogesterona*para*la*terapia*tópica*ocular.*Trabajo*fin*de* ! 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