Estudio de la respuesta clínica al tratamiento antirretroviral en pacientes infectados por subtipos NO-B de VIH-1 mediante la secuenciación de la proteasa retrotranscriptasa e integras: estudio genotípico del T.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Microbiología TESIS DOCTORAL Manuel Parra Sánchez Sevilla 2014 Estudio de la respuesta clínica al tratamiento antirretroviral en pacientes infectados por VIH-1 mediante el estudio de resistencias y tropismo viral. Comparación entre subtipos infectantes. ESTUDIO DE LA RESPUESTA CLÍNICA AL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL EN PACIENTES INFECTADOS POR VIH-1 MEDIANTE EL ESTUDIO DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL. COMPARACIÓN ENTRE SUBTIPOS INFECTANTES. Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Biología por: Manuel Parra Sánchez Dirigida por: Dr. José Carlos Palomares Folía Catedrático del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla. Dra. Estrella Martín Mazuelos Profesora Asociada del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología UNIVERSIDAD DE SEVILLA Fecha inscripción en departamento: Junio de 2012. Fecha inscripción en registro: Mayo 2013. Fecha de depósito en Universidad: Mayo 2014. El Dr. José Carlos Palomares Folía, Profesor Catedrático del Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla y la Dra. Estrella Martín Mazuelos, Profesora Asociada al Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla. CERTIFICAN: Que el proyecto de tesis titulada: “ESTUDIO DE LA RESPUESTA CLÍNICA AL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL EN PACIENTES INFECTADOS POR VIH-1 MEDIANTE EL ESTUDIO DE RESISTENCIAS Y TROPISMO VIRAL. COMPARACIÓN ENTRE SUBTIPOS INFECTANTES”, ha sido realizada por Manuel Parra Sánchez y dirigida por los que la suscriben, para ser inscrita en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Sevilla. Lo que hace constar a efectos oportunos, en Sevilla, a 22 de Mayo de 2014 Fdo: José Carlos Palomares Folía Estrella Martín Mazuelos Si conoces a los demás y te conoces a ti mismo, ni en cien batallas correrás peligro; si no conoces a los demás, pero te conoces a ti mismo, perderás una batalla y ganarás otra; si no conoces a los demás ni te conoces a ti mismo, correrás peligro en cada batalla. Sun Tzu. El arte de la guerra. Agradecimientos. Figuras. Figura 1.1 Estructura tridimensional del VIH. 3 Figura 1.2. Organización del genoma del VIH-1. 4 Figura 1.3. Esquema de la entrada del virus en la célula huésped. 5 Figura 1.4. Ciclo biológico del VIH. 8 Figura 1.5. Distancia genética en el gen pol del VIH-1. 8 Figura 1.6. Estimación mundial de personas infectadas con VIH-1. 10 Figura 1.7. Árbol filogenético indicando las distancias entre subtipos y grupos de HIV-1 y SIVgor. 11 Figura 1.8. Coinfección, superinfección y recombinación en la infección por VIH. 11 Figura 1.9. Representación de algunos CRFs y su composición genómica. 12 Figura 1.10. Distribución mundial del VIH-1. 13 Figura 1.11. Antirretrovirales y sus dianas. 15 Figura 1.12. Modelo tridimensional de la RT. 17 Figura 1.13. Modelo tridimensional de la proteasa. 18 Figura 1.14. Estructura de las regiones HR1 y HR2 de gp41 y mecanismo de acción de ENF. 19 Figura 1.15. Representación de la barrera de diferentes fármacos y su potencia. 22 Figura 1.16. Mecanismo de resistencia de la RT a ITINANs mediante inhibición competitiva. 25 Figura 1.17. Workflow del proceso de pirosecuenciación de la plataforma 454. 30 Figura 1.18. Distribución de subtipos de VIH-1 de la cohorte CoRis. 34 Figura 3.1. Principios del aislamiento automático de ácidos nucleicos por el sistema MagNA Pure Compact. 44 Figura 3.2. Secuencia del a región V3 amplificada por los cebadores ES7 y E125. 59 Figura 3.3. Ejemplo de secuencia que permite determinar el tropismo viral y que se utiliza en esta aplicación. 59 Figura 4.1. Motivo de la petición en el periodo estudiado (2009-2012) expresada en %. 61 Figura 4.2. Evolución de los pacientes tratados/no tratados en el periodo 2009-2012 (%). 62 Figura 4.3. Porcentaje de subtipos B y no B en la zona de estudio. 64 Figura 4.4. Distribución de los subtipos no B entre las tres ciudades de estudio indicados como porcentaje. 64 Figura 4.5. Distribución de los 70 subtipos VIH-1 no B analizados. 65 Figura 4.6. Recuento CD4 entre los pacientes naïve durante los cuatro años de estudio. 65 Figura 4.7. Representación del % de la carga viral de VIH (copias/ml) de pacientes naïve incluidos en el estudio. 66 Figura 4.8. Número total de resistencias y actividades disminuidas a fármacos de ITIAN, ITINAN e IPs en los cuatro años de estudio entre los pacientes naïve. 66 Figura 4.9. Número total de resistencias y actividades disminuidas a fármacos de ITIAN, ITINAN e IPs en los cuatro años de estudio entre los pacientes tratados. 67 Figura 4.10. Mutaciones asociadas a resistencia a IPs que presentan una frecuencia superior al 1% entre todas las secuencias analizadas en los periodos 2009-2012. 68 Figura 4.11. Mutaciones asociadas a resistencia a ITINANs que presentan una frecuencia superior al 1% entre todas las secuencias analizadas en los periodos 2009-2012. 68 Figura 4.12. Mutaciones asociadas a resistencia a ITIANs que presentan una frecuencia superior al 1% entre todas las secuencias analizadas en los periodos 2009-2012. 69 Figura 4.13. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo A1. 70 Figura 4.14. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo C. 71 Figura 4.15. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo CRF02_AG. 73 Figura 4.16. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo F1. 75 Figura 4.17. Número de pacientes que consiguieron respuesta virológica y subtipos. 75 Figura 4.18. Análisis de clústers de subtipos A1. 81 Figura 4.19. Análisis de clústers de subtipos C. 82 Figura 4.20. Análisis de clústers de subtipos CRF02_AG. 83 Figura 4.21. Análisis de clústers de subtipos CRF14_BG. 83 Figura 4.22. Análisis de clústers de subtipos F1. 84 Figura 4.23. Secuencias analizadas por WebLogo 3.3 con las secuencias de subtipos no B con tropismo X4. 85 Figura 4.24. Secuencias analizadas por WebLogo 3.3 con las secuencias de subtipos no B con tropismo CCR5. 85 Figura 4.25. Resultado obtenidos tras analizar una secuencia de interés con MARGI-HIV Tropism. 88 Figura 4.26. Frecuencias (%) de sustituciones en cada codón de la integrasa amplificado (codones 12-175). 89 Abreviaturas. 3TC: Lamivudina ABC: Abacavir ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario APV: Amprenavir ARN: Ácido ribonucleíco ARNm: ARN mensajero. ARV: Antirretroviral ATV: Atazanavir CRF: forma circular recombinante (circular form recombinant) CVP: Carga viral plasmática d4T: Estavudina ddI: Didanosina DGV: Dolutegravir dNTP: Desoxinucleótido trifosfato DRV: Darunavir EFV: Efavirenz ENF: Enfuvirtida ETR o ETV: Etravirina EVG: Elvitegravir FPV: Fosamprenavir FTC: Emtricitabina IDV: Indinavir IF: Inhibidores de la fusión IncCCR5: Inhibidores del correceptor CCR5. InInt Inhibidores de la integrasa IP/r: Inhibidor de la proteasa (IP) potenciado con ritonavir IP: Inhibidores de la proteasa ITIAN Inhibidor/es transcriptasa inversa análogos nucleósido o nucleótido ITINAN Inhibidor/es transcriptasa inversa no nucleósidos ITS Infecciones de transmisión sexual LPV: Lopinavir MAR: Mutaciones asociadas a resistencia MVC: Maraviroc NFV: Nelfinavir NVP: Nevirapina PCR: Reacción en cadena de la polimerasa pDNA: ADN proviral. PR: proteasa RAL: Raltegravir RPV: Rilpivirina RT: Retrotranscriptasa o transcriptasa inversa. RTV: Ritonavir SQV: Saquinavir T-20: enfuvirtida TAR: Tratamiento antirretroviral TARGA: Tratamiento antirretroviral de gran actividad TDF: Tenofovir TPV: Tipranavir VIH-1: Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 VIH-2: Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 2 ZDV, AZT: Zidovudina Factores de riesgo contemplados. UDVP: Usuarios de drogas por vía parenteral HMS: Homosexual HTS: Heterosexual UDVP/HMS: Usuarios de drogas por vía parenteral y homosexual. UHMD: Usuario con hemoderivados. Código de nucleótidos. A: Adenina C: Citosina G: Guanina T: Timina Mezclas: K: G ó T B: C, G ó T N: A, C, G ó T. M: A ó C D: A, G ó T R: A ó G H: A, C ó T S: C ó G V: A, C ó G W: A ó T Y: C ó T Código de aminoácidos (Nomenclatura de 1 o 3 letras): A (Ala): Alanina C (Cys): Cisteína D (Asp): Ácido aspártico E (Glu): Ácido glutámico F (Phe): Fenilalanina G (Gly): Glicina H (His): Histidina I (Ile): Isoleucina K (Lys): Lisina L (Leu): Leucina M (Met): Metionina N (Asn): Asparragina P (Pro): Prolina Q (Gln): Glutamina R (Arg): Arginina S (Ser): Serina T (Thr): Treonina V (Val): Valina W (Trp): Triptófano Y (Tyr): Tirosina Niveles de evidencia. 1. Metaanálisis, revisiones sistemáticas de ensayos clínicos o ensayos clínicos aleatorizados y controlados. 2. Revisiones sistemáticas de estudios de cohorte o de casos control. 3. Estudios no analíticos como informes de casos y serie de casos. 4. Opinión de expertos. Grados de recomendación. A. Existe buena evidencia para recomendar su uso. B. Existe evidencia discreta para recomendar su uso. C. La evidencia no es concluyente y no se puede recomendar ni desaconsejar su uso. Otros factores pueden influir en el uso de esta intervención. D. Existe discreta evidencia para desaconsejar su uso. E. Existe buena evidencia para desaconsejar su uso. Addendum. Parte de los resultados han sido publicados y presentados a diversos congresos nacionales e internacionales: 1. Desarrollo de una aplicación bioinformática para facilitar la determinación genotípica del tropismo del VIH. Parra M, Zakariya I, Ferrero I, Martín-Mazuelos E, Palomares JC. XXIV Reunión de la SAMPAC (Sociedad Andaluza de Microbiología y Parasicología Clínica). Sevilla 10-11 de Noviembre de 2011. Presentación poster. 2. Estudio de tropismo de subtipos no-B de VIH-1 en la región occidental de Andalucía (Cádiz, Jerez, Huelva, Sevilla y Osuna). Parra M, Sivianes N, Pérez L, Bernal S, Martín-Mazuelos E, Palomares J.C. XXIV Reunión de la SAMPAC (Sociedad Andaluza de Microbiología y Parasicología Clínica). Sevilla 10-11 de Noviembre de 2011. Presentación poster. 3. Bioinformatic application to facilitate the genotypic determination of HIV-1 tropism. Parra M, Zakariya I, Córdoba J, Ferrero I, Martín-Mazuelos E, Palomares JC. 22nd ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases). Londres 31 Marzo-03 Abril 2012. Presentación poster. 4. Aplicación bioinformática para la determinación genotípica del tropismo viral del VIH. ParraSánchez M, Zakariya-Yousef I, Luna-Peláez N, Ferrero I, Martín-Mazuelos E y Palomares JC. XVI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Bilbao 9–11 de Mayo de 2012. Presentación poster-oral. 5. Estudio de las discordancias entre algoritmos de interpretación genotípica del tropismo de VIH-1 en secuencias con inserciones o deleciones en la región V3. Parra-Sánchez M, Luna-Peláez N, Zakariya-Yousef I, Martín-Mazuelos E, Palomares JC. XVI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Bilbao 9–11 de Mayo de 2012. Presentación poster-oral. 6. Prevalencia de polimorfismos asociados a disminución de la actividad de Maraviroc. ParraSánchez M, Luna-Peláez N, Martín-Mazuelos E, Palomares JC. XVI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Bilbao 9–11 de Mayo de 2012. Presentación poster-oral. 7. Resistance to the most recent protease and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors across HIV-1 non-B subtypes. Anta L, Blanco JL, Llibre JM, García F, Pérez-Elías MJ, Aguilera A, Pérez-Romero P, Caballero E, Vidal C, Cañizares A, Gutiérrez F, Dalmau D, Iribarren JA, Soriano V, de Mendoza C; on behalf of the Drug Resistance Platform of the Spanish AIDS Research Network. J Antimicrob Chemother. 2013;68:1994-2002. 8. Prevalencia de resistencias primarias en pacientes naïve en el centro de referencia del Hospital de Valme (Sevilla) en los últimos 4 años. Zakariya-Yousef I, Bernal S, Parra-Sánchez M, Pérez L, Martín-Mazuelos E, Palomares JC. XVIII de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Valencia 9-11 de abril de 2014. 1. Introducción. 1 1.1. Antecedentes históricos. La primera documentación científica en la que se describe la enfermedad del SIDA se publica el 10 de diciembre de 1980 en el New England Journal of Medicine, describiendo una enfermedad nueva que al parecer estaba emergiendo en ese momento. Poco después, el Centro de Control de Enfermedades de los Estados Unidos de Norteamérica (CDC) alertó a la comunidad médica mundial de la posibilidad de una nueva entidad nosológica: el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (AIDS o SIDA), nombre acuñado a mediados de 1982. En abril de 1983, Margaret Heckler (Secretaria de Salud de Estados Unidos) anunciaba el descubrimiento de un retrovirus causante del SIDA. Dicho hallazgo, conseguido por el grupo del Dr. Robert Gallo, se denominó en primera instancia Virus Linfotrópico de células T humanas tipo III (HTLVIII) (Gallo et al. 1983). Simultáneamente en Francia, ese mismo año, el grupo del Dr. Luc Montaigner, haría público el entonces denominado Virus Asociado a Linfoadenopatía (LAV) (Barré-Sinoussi et al. 1983). Es de señalar que el hallazgo del Dr. Gallo lo hizo a partir de una muestra de tejido linfático que le envió el Dr. Montaigner. Meses después se demuestra que el HTLV -III y el LAV son el mismo y único virus y se decide que ambos grupos son los codescubridores del virus. En mayo de 1986, un panel de expertos en virología, propone y acepta nombrar este virus como Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Este mismo año, se describe por primera vez en un grupo de prostitutas asintomáticas en Senegal un virus relacionado antigénicamente con el VIH y responsable de casos de SIDA en esa región. Se denominó VIH tipo 2 (VIH-2) para diferenciarlo del inicial, denominado VIH tipo 1. (Clavel et al. 1986). 1.2. El virus de la inmunodeficiencia humana: descripción y clasificación. El VIH es un virus de ARN monocatenario que pertenece a la familia Retroviridae, subfamilia Orthoretrovirinae, del género Lentivirus y englobados dentro del grupo de Lentivirus de primates. La clasificación completa se detalla en la tabla 1.1. 2 Tabla 1.1. Clasificación de la familia Retroviridae. En negrita, retrovirus patógenos humanos (Fuente: ICTV database, Julio 2012). Nota: ICTV: International Committee on taxonomy of Viruses. (http://ictvonline.org). *: Especie tipo del género. FAMILIA RETROVIRIDAE SUBFAMILIA ORTHORETROVIRINAE GÉNERO ALPHARETROVIRUS (9 especies) Avian carcinoma Mill Hill virus 2 *Avian leukosis virus Avian myeloblastosis virus Avian myelocytomatosis virus 29 Avian sarcoma virus CT10 Fujinami sarcoma virus Rous sarcoma virus UR2 sarcoma virus Y73 sarcoma virus GÉNERO BETARETROVIRUS (5 especies) Jaagsiekte sheep retrovirus Langur virus Mason-Pfizer monkey virus *Mouse mammary tumor virus Squirrel monkey retrovirus GÉNERO DELTARETROVIRUS (3 especies) *Bovine leukemia virus Primate T-lymphotropic virus 1 Primate T-lymphotropic virus 2 Primate T-lymphotropic virus 3 GÉNERO EPSILONRETROVIRUS (3 especies) *Walleye dermal sarcoma virus Walleye epidermal hyperplasia virus 1 Walleye epidermal hyperplasia virus 2 GÉNERO GAMMARETROVIRUS (17 especies) Chick syncytial virus Feline leukemia virus Finkel-Biskis-Jinkins murine sarcoma virus Gardner-Arnstein feline sarcoma virus Gibbon ape leukemia virus Guinea pig type-C oncovirus Hardy-Zuckerman feline sarcoma virus Harvey murine sarcoma virus Kirsten murine sarcoma virus Moloney murine sarcoma virus *Murine leukemia virus Porcine type-C oncovirus Reticuloendotheliosis virus Snyder-Theilen feline sarcoma virus Trager duck spleen necrosis virus Viper retrovirus Woolly monkey sarcoma virus GÉNERO LENTIVIRUS (9 especies) Bovine immunodeficiency virus Caprine arthritis encephalitis virus Equine infectious anemia virus Feline immunodeficiency virus *Human immunodeficiency virus 1 Human immunodeficiency virus 2 Puma lentivirus Simian immunodeficiency virus Visna/maedi virus SUBFAMILIA SPUMARETROVIRINAE GÉNERO SPUMAVIRUS (6 especies) African green monkey simian foamy virus Bovine foamy virus Equine foamy virus Feline foamy virus Macaque simian foamy virus *Simian foamy virus 9 1.5.2. Enmascaramiento de los epítopos de neutralización. El enmascaramiento se produce porque la envuelta viral es una estructura trimérica que oculta unos dominios altamente conservados. Estos epítopos pueden sufrir una glicosilación de los residuos aminoácidos reconocidos por los anticuerpos neutralizantes (González et al. 2010) lo que otorgan una gran flexibilidad y variabilidad estructural proporcionando una extraordinaria capacidad de escape. 1.5.3. Latencia, persistencia y reactivación. La instauración del virus en los reservorios antes de que se desencadene la respuesta inmunitaria específica supone otro obstáculo para el control de la replicación viral ya que el virus se establece en los linfocitos infectados. Estudios previos (García et al. 1999) observaron que al interrumpir el TARGA en un paciente con viremia controlada durante años, en pocos días se producía un repunte de la carga viral a niveles similares a los previos al iniciar el TARGA. Por otro lado, estudios mediante técnicas ultrasensibles muestran que en todos los pacientes en TARGA se mantiene una replicación a bajo nivel (15 copias de ARN/ml) demostrando persistencia viral en determinados reservorios (Palmer et al. 2008). 1.5.4. Cinética de replicación. Definición de cuasiespecie. La aplicación de modelos matemáticos han demostrado que diariamente se producen en un paciente VIH-1+ del orden de 10 9 a 10 10 partículas virales, lo que conlleva la destrucción directa de entre 10 7 a 10 8 linfocitos CD4 (Ho et al. 1995 y Ho et al. 1996). Todos estos fenómenos provocan una elevada heterogeneidad genética que permite que en la población de virus de un mismo individuo coexistan genomas relacionados entre sí, pero no idénticos, conocidos como cuasiespecies víricas. Evolutivamente, la existencia de cuasiespecies se ha originado por presión selectiva, competencia y selección de genomas mejor adaptados a la presión ejercida por el sistema inmune o la presencia de fármacos (Domingo et al. 1997 y Domingo et al. 2001). En un individuo infectado, cuando se realiza un estudio genotípico de resistencias a antirretrovirales, observaremos una secuencia promedio o consenso, pero esta secuencia mayoritaria no siempre coincide con la secuencia promedio o de la población. Las cuasiespecies permanecen a niveles bajos dentro de la población global (variantes minoritarias) hasta que surge una presión selectiva que hace que su número aumente. Es conocido que la presión selectiva ejercida por los fármacos sustituirá a unas subpoblaciones sensibles por otras resistentes, pero sin eliminar por completo las primeras, que permanecerán en algún reservorio. 10 1.6. Clasificación del VIH. 1.6.1. Tipos de VIH. Actualmente hay descritos dos tipos de virus de la inmunodeficiencia humana: VIH-1 y VIH-2. El más extendido a nivel mundial es el VIH-1, que a finales de 2012, se estimaba hubiera 35.3 millones [32.2–38.8] infectados por este tipo (UNAIDS Report 2013) (Figura 1.6). El VIH-2 tiene una distribución más limitada, siendo endémica en regiones del este de África, donde puede llegar a tener una prevalencia del 10% (Poulsen et al. 1993 y Reeves et al. 2002). A nivel mundial, se han descrito casos en Norte América y Europa, pero todos los casos reportados se trataban de inmigrantes o nativos de regiones endémicas. Esta limitación en la infección por el VIH-2 se debe a que el ratio de infectividad del VIH1/VIH-2 se ha estimado en un valor comprendido entre 3.40 y 3.86, de ahí la mayor distribución a nivel mundial del tipo 1 (Gilbert et al, 2003). En España, hasta diciembre de 2010, se habían comunicado 244 casos de infección por VIH-2. La mayoría eran varones (66%) y originarios de África Subsahariana (73%) (Treviño et al, 2012). Figura 1.6. Estimación mundial de personas infectadas con VIH-1. Fuente: http://www.unaids.org El VIH se originó mediante trasmisión múltiple zoonótica desde el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) hasta humanos en África Central y Oeste. Actualmente más de 40 especies de primates son portadores de infección por el SIV especifico de cada especie (Aghokeng et al. 2010) y existe una correlación geográfica entre el SIV de chimpancés (Pan troglodytes troglodytes, SIVcpz) y el mangabí gris (Cercocebus atys, SIVsm) con el VIH humano (Plantier et al. 2009, Peeters et al. 2008 y Van Heuverswyn et al. 2007). 11 1.6.2. Grupos y subtipos de VIH. El VIH-1 se clasifica en 4 grupos: M (Main), N (New), O (Outlier) y P (Primate) (Figura 1.7). Por otro lado, el VIH-2 se ha clasificado en 8 grupos: A–H. Dentro del VIH-1 la prevalencia de cada grupo es muy variable siendo el grupo M el único grupo de VIH considerado pandémico (aproximadamente 33 millones de infectados). El grupo O lo encontramos casi exclusivamente en África Central y Oeste, destacando Gabón, Guinea Ecuatorial y Camerún, cuya prevalencia es muy baja (1.1%). El grupo N se reduce a un pequeño grupo de personas en Camerún (apenas 13 individuos, lo que supone una prevalencia del 0.1%). En 2009 se definió un nuevo grupo de VIH-1, el grupo P, que se ha identificado en 2 individuos en la ciudad de Yaoundé (Camerún) hasta la fecha (prevalencia de 0.06%). (Simon et al. 1998, Ayouba et al. 2001, Roques 2004, Plantier et al. 2009 y Vallari et al. 2011). Figura 1.7. Árbol filogenético indicando las distancias entre subtipos y grupos de HIV-1 y SIVgor. Para enraizar el árbol se ha usado una secuencia de SIV de chimpancé (SIVcpzANT). Modificado de Vallari et al. 2011 1.6.3. Formas circulantes recombinantes (CRFs). El proceso de recombinación en el VIH-1 se produce in vivo como consecuencia de la infección simultánea del individuo por dos variantes del virus (coinfección), o en distinto momento (superinfección o infección por VIH en un paciente previamente infectado) (Gottlieb et al. 2004 y Fang et al.2004). Este fenómeno genera virus que no pueden ser considerados subtipos puros sino recombinantes entre dos o más subtipos, por lo que se les conoce como recombinantes o mosaico (Figura 1.8). Figura 1.8. Coinfección, superinfección y recombinación en la infección por VIH. Modificado de http://www.itg.be/itg/ 12 Dentro del VIH-1 grupo M, los recombinantes entre subtipos con puntos de recombinación comunes y reconocidos en más de tres individuos no relacionados epidemiológicamente se llaman CRF (formas recombinantes circulantes). Hasta el momento se han descrito 55 CRFs, cada una designada por un número identificativo y los subtipos genéticos que están presentes en su genoma. Si el genoma contiene secuencias originarias de más de dos subtipos, la forma recombinante se define como “cpx” (complex) (Figura 1.9). Se estima que al menos el 20% de la infección por VIH-1 es causada por CRFs (Hemelaar et al. 2012). Figura 1.9. Representación de algunos CRFs y su composición genómica. Los recombinantes entre subtipos URFs (formas recombinantes únicas) se han encontrado en individuos aislados, no compartiendo los puntos de recombinación con las CRFs conocidas, por lo que no han podido clasificarse como un nuevo CRF. Algunos CRFs han recombinando entre sí o entre otros subtipos puros por lo que se ha comenzado a usar el término SGR (recombinantes de segunda generación). En cuanto a otros grupos de VIH-1 (M y O), se han detectado recombinantes entre ellos y entre distintos CRFs clasificándose como URFs (Van den-Haesevelde et al. 1994 y Aghokeng et al. 2004). En el VIH-2 actualmente hay descrito un único recombinante (CRF01_AB) (Ibe et al. 2010). Entre VIH-1 y VIH-2 se han descrito infecciones duales pero aún no se han encontrado cepas recombinantes entre ellos. 13 1.6.4. Distribución geográfica del VIH-1. La distribución mundial del VIH-1 se describió en el apartado 1.6.2 y en más detalle en la figura 1.10. Figura 1.10. Distribución mundial del VIH-1. Modificado de Hamelaar et al. 2012. La distribución mundial de los CRFs se describe en la tabla 1.3. Tabla 1.3. Distribución geográfica de los CRFs. En negrita los analizados en este estudio. Modificado de Hemelaar et al. 2012. CRF Distribución geográfica CRF Distribución geográfica CRF Distribución geográfica CRF Distribución geográfica CRF01_AE Sudeste Asiático, Este de Asia, África Central CRF15_01B Tailandia CRF29_BF Brasil CRF43_02G Arabia Saudi CRF02_AG África Occidental, África Central, MENA CRF16_A2D Kenia, Argentina, Corea del Sur CRF30_0206 Niger CRF44_BF Chile CRF03_AB Este de Europa and Central Asia CRF17_BF Sudamérica CRF31_BC Brasil CRF45_AKU África Central CRF04_cpx Grecia, Chipre CRF18_cpx Cuba, África Central CRF32_06A1 Estonia CRF46_BF1 Brasil CRF05_DF África Central, Europa CRF19_cpx Cuba, África Central CRF33_01B Malasia, Singapur, Indonesia CRF47_BF España CRF06_cpx África Central, África Oriental, Estonia CRF20_BG Cuba CRF34_01B Tailandia CRF48_01B Malasia CRF07_BC China CRF21_A2D Kenia CRF35_AD Afganistán, Irán CRF49_cpx Gambia CRF08_BC China CRF22_01A1 Camerún CRF36_cpx Camerún CRF50_A1D Reino Unido CRF09_cpx África Occidental, África Central CRF23_BG Cuba CRF37_cpx Camerún, Mozambique CRF51_01B Singapur CRF10_CD Tanzania CRF24_BG Cuba CRF38_BF1 Uruguay CRF52_01B Sudeste Asiático CRF11_cpx África Central CRF25_cpx Africa Central, Arabia Saudí CRF39_BF Brasil CRF53_01B Malasia CRF12_BF Sudamérica CRF26_AU RD Congo CRF40_BF Brasil CRF54_01B Malasia CRF13_cpx África Central CRF27_cpx RD Congo CRF41_CD No definido CRF55_01B China CRF14_BG España CRF28_BF Brasil CRF42_BF Luxemburgo 14 Durante la redacción de esta tesis se incluyeron, pendientes de confirmación, los siguientes CRF: CRF57_BF (China), CRF59_01B (China), CRF61_BC (China), CRF63_02A1 (Siberia, Rusia) y CRF65_cpx (China). 1.6.5. Importancia de los subtipos de VIH-1 en el diagnóstico y tratamiento. La diversidad del VIH ha tenido un fuerte impacto en el diagnóstico ya que los equipos comerciales han tenido que ser capaces de detectar todas las variantes del virus. Las pruebas serológicas de cribado (actualmente de cuarta generación) basadas en anticuerpos dirigidos contra proteínas estructurales (p24gag y gp41env) y la mayoría de los métodos de enzimoinmunoensayo poseen una alta sensibilidad y especificidad frente cepas del grupo M de VIH-1 y VIH-2, pero aún existe cierta dificultad para identificar sujetos con infección reciente por subtipos no B poco frecuentes (URFs y CRFs). Esto es debido a que los antígenos empleados comercialmente se basan en cepas del subtipo B. Las pruebas de diagnóstico molecular se han basado en cebadores genéricos para detectar y determinar la carga viral plasmática (CVP) causada por todos los subtipos del VIH-1. Para la medición de la CVP se han utilizado clásicamente tres pruebas comercializadas: Amplicor HIV-1 (Roche Diagnostics), Versant o método del DNA ramificado (b-DNA) (Siemens Healthcare) y NucliSens (bioMerieux), que utiliza el sistema NASBA (nucleic acid sequence based amplification). Durante los últimos años se han desarrollado pruebas basadas en real time PCR (RT-PCR). En nuestro país hay comercializadas dos de ellas: COBAS TaqMan (Roche Diagnostics) y RealTime HIV-1 (Abbott Molecular). Ambas se basan en la amplificación y la detección del ARN viral. El rango de detección es desde 50 hasta 1 millón de copias/mL (RealTime HIV-1) y desde 20 hasta 10 millones de copias/mL (TaqMan) (Schumacher et al. 2007 y Foulongne 2006). En lo referente al tratamiento antirretroviral, los estudios de resistencia a los antirretrovirales (genotípicos o fenotípicos) presentan algunos problemas de detección de resistencia en algunos subtipos y CRFs. En este apartado cabe destacar la importancia de subtipar correctamente la cepa infectante, ya que algunas herramientas disponibles online están basadas principalmente en subtipos B (Yebra et al. 2011). En cuanto al diseño de vacunas frente al VIH tiene objetivo una vacuna que brinde protección frente a todas las cepas del VIH-1, para lo cual se requieren preparados multivalentes. Para ello, datos recientes sugieren que las relaciones evolutivas del VIH podrían ser de mayor utilidad que las consideraciones regionales en términos de diseño de vacunas. Por este motivo, se ha propuesto el uso de secuencias de consenso o antecesoras de un subtipo específico con la finalidad de minimizar las diferencias genéticas entre las cepas de las vacunas y las cepas contemporáneas. Este enfoque potencialmente podría incrementar la reactividad cruzada y la amplitud de respuesta de una vacuna en relación con el uso de una única cepa (Lal et al. 2005). 15 1.7. Tratamiento antirretroviral. Hasta la fecha, la terapia antirretroviral agrupa un arsenal de 23 fármacos comercializados (solos o en combinación con otros) dirigidos contra las enzimas del VIH: transcriptasa inversa (RT), proteasa, integrasa y antagonistas del receptor CCR5 (Figura 1.11) (tabla 1.4). La aparición de resistencias frente a los inhibidores nucleósidos de RT (ITIAN), inhibidores no nucleósidos (ITINAN) e inhibidores de proteasa (IP) es causa y consecuencia del fracaso del tratamiento virológico y de supresión viral incompleta. Figura 1.11. Antirretrovirales y sus dianas. Modificado de De Clercq, 2007. El objetivo del tratamiento actual es la supresión de la replicación viral para conseguir una carga viral indetectable en plasma. Según el panel de expertos y las guías nacionales e internacionales, esto se puede conseguir en pacientes naïve mediante el uso de la terapia triple, es decir, mediante la combinación de tres fármacos que no presenten resistencia cruzada entre sí para evitar la rápida aparición de mutaciones asociadas a resistencia a estos fármacos. Estos fármacos se clasifican en 6 clases o familias: los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos/nucleótidos (ITIAN), los inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleótidos (ITINAN), los inhibidores de la proteasa (IP), los inhibidores de la fusión (IF), los inhibidores del correceptor CCR5 (IncCCR5) y los inhibidores de la integrasa (InInt). Recientes estudios indican que el subtipo viral puede influir en la eficacia del tratamiento y que la existencia previa de mutaciones o polimorfismos o rápida selección de estas podrían disminuir la eficiencia de los antirretrovirales. 16 Tabla 1.4. Tratamientos antirretrovirales aprobados hasta la fecha para su uso, año de aprobación por la FDA y familia a la que pertenece. Año Fármaco Familia Año Fármaco Familia Año Fármaco Familia 1987 AZT NRTI 1997 DLV NNRTI 2003 T20 IF 1991 DDI NRTI 1997 NFV IP 2005 TPV IP 1992 DDC NRTI 1998 ABC NRTI 2006 DRV IP 1994 D4T NRTI 1998 EFV NNRTI 2007 MRV CCR5 1995 3TC NRTI 1999 AMP IP 2007 RAL II 1995 SQV IP 2000 LPV IP 2008 ETR NNRTI 1996 NVP NNRTI 2001 TDF NRTI 2011 RPV NNRTI 1996 IDV IP 2003 FTC NRTI 2012 GS 9350* IP 1996 RTV IP 2003 ATV IP 2012 EVG# II Nota: ddC, IDV (indinavir), DLV (delavirdina) o (NFV) Nelfinavir se han retirado del mercado o han caído en desuso debido a su alta toxicidad. *Cobicistat (potenciador como RTV) aprobado por la FDA en Agosto 2012. #Elvitegravir (inhibidor de la integrasa). Comercializado junto a GS 9350, FTC y TDF en un único comprimido (Stribild®). Dolutegravir (DTG), nuevo inhibidor de la integrasa, ha sido aprobado por la EMEA en 2013 pero no se espera su comercialización en España hasta octubre de 2014. 1.7.1. Inhibidores de la transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (RT), es una de las enzimas claves dentro del ciclo biológico del VIH. Se encarga de la sintetización de ADN a partir de una cadena de ARN (actividad ADN polimerasa ARN-dependiente con actividad ARNasa H). La proteína es un heterodímero formado por dos subunidades: p51 y p66. La primera de ellas engloba los primeros 440 aa del gen y no tiene actividad enzimática. Su función es estabilizar y aumentar la eficacia del proceso de retrotranscripcción funcional. La subunidad p66 la conforman 560 aa del gen de la RT y engloba la región activa de la enzima. Está constituida por tres subdominios, uno que englobaría la cadena de ADNc, otro con actividad ARNasa y el subdominio de conexión (Figura 1.12). Al ser una enzima imprescindible dentro del ciclo del virus, es una de las dianas más usadas en las terapias antirretrovirales. Los inhibidores de la RT se clasifican en dos categorías: los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN o NRTI) y los no análogos de nucleósidos (ITINAN o NNRTI). Los inhibidores nucleosídicos son análogos de los nucleósidos usados en el proceso de la transcripción del ADN y actúan como terminadores de la cadena que se está sintetizando. Los análogos no nucleosídicos son un grupo bioquímicamente diverso que inhibe no competitivamente la polimerización del ADN. 17 . Figura 1.12. Modelo tridimensional de la RT. Modificado de Pata et al. 2004. 1.7.1.1. Inhibidores de la RT análogos de nucleósidos (ITIAN). Actualmente encontramos 6 fármacos comercializados: zidovudina (AZT), didanosina (ddI), estavudina (D4T), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTC) y abacavir (ABC). En este mismo grupo se clasifica el tenofovir (TDF), que no es un nucleósido sino un nucleótido pero que estructuralmente es similar a los anteriores. - Análogos de Timidina: Zidovudina (AZT) y Estavudina (d4T). Ambos casi en desuso por su toxicidad. -Análogos de Citosina: Lamivudina (3TC), Emtricitabina (FTC) y Zalcitabina (ddC). El 3TC y el FTC usados frecuentemente en combinación. El ddC prácticamente no se usa. -Análogos de Guanosina: Abacavir (ABC): Uso muy frecuente. Antes de su uso es necesario el estudio genotípico del alelo HLA B*5701 asociado a una reacción de hipersensibilidad (fiebre, rash cutáneo, fatiga, náusea…). Las personas portadores de este alelo no pueden usar ABC. La prevalencia de este alelo en la cohorte española está próxima al 6% (Arrizabalaga et al. 2009). -Análogos de Adenosina: Didanosina (ddI) y Tenofovir (TDF). El TDF muy usado actualmente. El ddI en desuso. 1.7.1.2. Inhibidores de la RT no análogos de nucleósidos (ITINAN). La principal diferencia con respecto al grupo anterior es que no necesitan ser modificados previamente por enzimas celulares. Actúan por unión no competitiva a un bolsillo hidrofóbico de la región catalítica en la subunidad p66 provocando un cambio conformacional en su estructura impidiendo tanto la colocación del molde y su iniciador como su orientación con respecto al centro catalítico. Este grupo se ha descrito como no activos frente a cepas del grupo O de VIH-1 y VIH-2. En cuanto al resto de subtipos de VIH-1 son activos, aunque se pueden encontrar diferencias de sensibilidad entre subtipos. 18 Dentro de esta familia encontramos: - Nevirapina (NVP): Primer ITINAN comercializado en España. Cada vez se usa menos debido a su baja barrera genética y la rápida aparición de cepas resistentes. - Efavirenz (EFV): Uso extendido, tanto individualmente como combinado junto a FTC y TDF (Atripla®). Resistencia cruzada con NVP. - Etravirina (ETR): ITINAN de segunda generación con una alta barrera genética y eficaz frente a mutaciones de resistencia a los otros fármacos de este grupo, como K103N y Y181C. - Rilpivirina (RPV): nuevo ITINAN de segunda generación aprobado en 2011 que al igual que ETR presenta una alta barrera genética. Se comercializa tanto en comprimidos individuales como combinado junto a FTC y TDF (Eviplera®). 1.7.2. Inhibidores de la proteasa (IPs). La proteasa del VIH es una aspartil-proteasa codificada por el gen pol que codifica una proteína de 99 aa muy conservada entre los distintos subtipos formando una molécula homodimérica que presenta una hendidura o dominio central activo (Figura 1.13). Esta enzima actúa sobre dos proteínas virales precursoras (Gag y Gag–Pol) dando lugar tres proteínas mayores: p24, p17 y p7 que conforman parte del core del virus, y tres proteínas pequeñas: p6, p2 y p1 con actividad funcional durante el proceso de exportación viral. La actividad enzimática sobre la poliproteina Gag–Pol produce las proteínas con actividad enzimática implicadas en el ciclo del virus: transcriptasa inversa, integrasa y la misma proteasa. Figura 1.13. Modelo tridimensional de la proteasa. Modificado de Davis et al. 2012. Los primeros IPs comercializados tenían una barrera genética baja (resistencias a partir de 2-3 mutaciones) como fueron Saquinavir (SQV) e Indinavir (IDV), actualmente en desuso. Posteriormente se aprueba el uso de Ritonavir (RTV), usado como potenciador (inhibe el complejo enzimático P450 permitiendo mantener unos niveles estables de los IPs en sangre). Los siguientes en aparecer fueron: Nelfinavir (NFV) permitido también en uso pediátrico (hoy en desuso por toxicidad), Amprenavir (AMP, ya en desuso), Lopinavir potenciado con Ritonavir (LPV/r), Atazanavir (ATV), Tipranavir (TPV) y Darunavir (DRV). Estos dos últimos presentan una gran barrera genética, pero ha sido DRV el que se ha impuesto claramente frente a TPV. Hoy día, los IPs más usados son ATV y DVR. 25 1.9.3.2. Resistencia a inhibidores de la RT no análogos de nucleósidos (ITINANs). Esta familia se caracteriza por la afinidad por el dominio hidrofóbico que la RT presenta en su centro catalítico al que confieren tal cambio conformacional que impiden la polimerización del ADN. Son inhibidores no competitivos que utilizan puntos de unión diferentes al sustrato que la enzima utiliza, pero al unirse prácticamente todos en el mismo sitio presentan una amplia resistencia cruzada entre ellos (Figura 1.16). Figura 1.16. Mecanismo de resistencia de la RT a ITINANs mediante inhibición competitiva. Modificado de Clavel et al, 2004. El mecanismo de resistencia es producida por mutaciones entre los codones 100-108 y 179-190 de la RT las cuales provocan una disminución de las interacciones hidrofóbicas facilitando la disociación de la unión entre el ITINAN y la RT. Otra región de unión engloba los codones 225-236. En el primero de los codones podemos encontrar las mutaciones A98G, K101E y V108I (bajo nivel de resistencia), la mutación L100I (nivel intermedio de resistencia a efavirenz y bajo a nevirapina, etravirina y rilpivirina), K101P (resistencia a rilpivirina) y la mutación más relevante dentro de este codón, la K103N que confiere alto nivel de resistencia causando resistencia a efavirenz y nevirapina, pero que no afecta a etravirina y rilpivirina. En los codones 179-190 destacan Y181C/I/V, Y188H/L y G190A/S mientras que en los codones 225-236 destacan P225H, M230L y P236L. Esta familia no es activa frente al grupo O de VIH-1 y VIH-2 porque presenta cambios estructurales en esta región hidrofóbica que les confieren resistencia natural a estos fármacos, en concreto, en los codones 181-188. Uno de los últimos estudios realizados en España (Anta et al. 2013) sobre la posible existencia de posibles diferencias en la resistencia a etravirina y rilpivirina en los que los polimorfismos naturales puedan influenciar en la barrera genética concluyeron que V108I, Y188I y G190A era más prevalente en subtipos B, mientras que V90I eran más frecuentes en subtipos no B, pero ninguna diferencia consiguió diferencia significativa. 1.9.3.3. Resistencia a inhibidores de la proteasa (IPs). Se han descrito más de 60 mutaciones que implican resistencia a uno o más IP en más de 30 posiciones diferentes (Johnson et al. 2010) localizadas en el dominio central y proximidades. 26 Las mutaciones asociadas a resistencia de los IPs se localizan en el dominio central y cercanías. Las mutaciones fuera de esta zona no afectan a la sensibilidad al fármaco pero si a la cinética de esta enzima del virus. Las mutaciones primarias de resistencia a IPs se caracterizan por afectar a la sensibilidad del virus a esta familia y en ocasiones, aumentar la capacidad replicativa de aquellos virus portadores de mutaciones mayores. Las mutaciones en el dominio central son: D30N, V32I, G48M/V, I50V/L, V82A/C/F/L/M/S/T y I84A/C/V. La mutación D30N se asocia históricamente con el uso de nelfinavir, mientras que G48V se asocia a pacientes con saquinavir y la I50V con amprenavir. Las mutaciones en el dominio de hélice comprenden los aminoácidos comprendidos entre las posiciones 33 al 62. Encontramos las mutaciones M46I/L/V, I47V e I54A/L/M/S/T/V. Las que aportan un mayor grado de resistencia son la M46 y la I54. Existen otros cambios en otros residuos que pueden comprometer la sensibilidad de los IPs como son las mutaciones G73S, N88D/G/T/S y L90M. De igual modo que ocurre con otros antirretrovirales, también encontramos mutaciones que producen hipersensibilidad y restan resistencia en caso de encontrarse otras mutaciones. Estas sustituciones son L24I (tipranavir), I50L (indinavir, saquinavir, fosamprenavir, lopinavir, tipranavir y darunavir), I50V y I54L (tipranavir), L76V (saquinavir, atazanavir y tipranavir) y N88S (fosamprenavir y darunavir). En esta enzima del virus están cobrando cada vez más importancia las variaciones naturales o polimorfismos, especialmente dentro de los subtipos no B del VIH-1. Entre ellos destacan las sustituciones en posiciones de resistencia: L10I/V; K20I/R; M36I; V82I; L89I/M. En el estudio anteriormente citado de Anta et al, 2013, en el que se analizó también la prevalencia de polimorfismos para tipranavir y darunavir, se observó una prevalencia mayor de resistencia en subtipos B que en los no B (11% vs 4.3%, p=0.004) indicando una mayor exposición de este fármaco en este grupo. Para darunavir no se encontraron diferencias entre subtipos (5.8% vs 5.5%, p= 0.998). 1.9.3.4. Resistencia a Inhibidores de la Fusión. Se trata de un fármaco con barrera genética baja que selecciona rápidamente mutaciones. Reservado para pacientes multirresistentes, con escasas o nulas opciones de rescate, en los que sea imposible usar otros fármacos de última generación como pudieran ser maraviroc, darunavir o raltegravir. Las mutaciones más frecuentes aparecen entre los residuos 36-40 y 42-45 del dominio HR1 de la gp41. 27 Estas sustituciones se asocian a un alto grado de resistencia y disminución del fitness viral, por lo que suelen desaparecer rápidamente al retirar el fármaco (Xei et al. 2002). También se han asociado mutaciones en la región HR2 (N126K, N137K y S138A) que influyen en la sensibilidad a T-20. S138A es un polimorfismo natural encontrados en variantes del grupo O y N de VIH-1. 1.9.3.5. Resistencia a inhibidores de la entrada. Presenta dos mecanismos de resistencia descritos en pacientes que han fracasado con este antirretroviral. El primero de ellos y más común es el mecanismo de escape de las variantes X4-trópicas preexistentes de bajo grado, no detectadas por estar por debajo de los límites de los test de tropismo (Cooper et al. 2010). El segundo de ellos implica la selección de mutaciones dentro de la región V3 de la proteína gp120 del virus. El patrón específico de mutaciones que pueden conferir resistencia a MRV en pacientes R5-trópicos aún está poco claro. Entre ellas destacan las mutaciones 4L, 11R, 19S, 21T y 28V que confieren resistencia a MRV. Por otro lado, en pacientes incluidos en el ensayo MOTIVATE se han identificado una serie de mutaciones y patrones de mutaciones asociados a disminución de la actividad. Algunas de ellas son: 13H, 16A, 20L, G15_P16INSA, N24_I25INSI, G18DEL, 11S+26V, 18G+22T, 19S+26V, 20F+21I, 20F+25D+26V, G15_P16INSG+25D (Seclén et al. 2010, Yuan et al. 2011, ParraSánchez M et al. 2012). Destacan los cambios producidos en las posiciones 11 y 26, así como las mutaciones 4L, 11R y 19S, asociadas con peor respuesta. Algunos aislados R5 resistentes a MVC presentan mutaciones inclusive fuera del bucle V3: en el V1, V2, C4 y algunos aislados resistentes in vitro también en gp41. Sin embargo, no se ha descrito resistencia cruzada con T-20. 1.9.3.6. Resistencia a los inhibidores de la integrasa. La integrasa se constituye por 288 aa y tres dominios funcionales: N-terminal (1-50), C-terminal (213-288) y región catalítica (51-212), siendo esta zona en donde aparecen la mayoría de mutaciones las mutaciones de resistencia. El fracaso terapéutico a raltegravir se asocia con tres vías distintas de acumulación de mutaciones. La más frecuente es la vía N155H (40%), seguida de la Q148H/K/R (30%) e Y143C/R (10%). La presencia de estas mutaciones por si solas condiciona una resistencia de alto grado. Las mutaciones menores asociadas a N155 son: L74M, E92Q/V, T97A, F121Y, G163K/R, V151A/I, S230R, junto con la propia mutación Y143H. Las mutaciones menores descritas son: L74M, E138A/K y G140A/C/S. Raltegravir y elvitegravir presentan una resistencia cruzada casi completa pero el último fármaco de la familia, dolutegravir, no presenta resistencia a las mutaciones N155H e Y143C/R e incluso se han 28 documentado recientemente datos de eficacia virológica por la vía 148 duplicando la dosis del fármaco (Eron et al. 2011). Estudios recientes con dolutegravir han mostrado diferencias en las combinaciones de las mutaciones H51Y y R263K al comparar subtipo B con CRF02_AG. Esta combinación puede disminuir la actividad de la integrasa en un 60% y el fitness viral hasta 51 veces. En CRF02_AG no sería necesario la presencia de la segunda mutación para que se produzcan estos efectos (Mesplede et al. 2013). 1.9.3.7. Importancia de los polimorfismos en subtipos no B. En general, los polimorfismos o mutaciones asociadas a resistencia descritas para subtipos B también confieren resistencia a los subtipos no-B y hasta la fecha no existen evidencias de que subtipos no-B seleccionen mutaciones primarias nuevas y/o distintas que los B. Entre subtipos no-B no hay una mayor frecuencia de mutaciones de resistencia primarias en comparación con subtipos B. Sin embargo, es más frecuente la existencia de polimorfismos y mutaciones secundarias en posiciones asociadas a resistencia tanto en la RT como en la PR. Las mutaciones primarias asociadas a resistencia son las mismas independientemente del subtipo. Sin embargo, algunas aparecen claramente con mayor frecuencia en unos subtipos que en otros. Aunque la mayor parte de la información fenotípica apunta a similitudes en términos de susceptibilidad entre los subtipos B y no B, cada vez hay más indicios de que algunos polimorfismos relacionados en la proteasa podrían intervenir en la susceptibilidad específica a algunos IPs inhibidores de la RT e integrasa. En algunas cepas no-B la acumulación de ciertos polimorfismos y mutaciones secundarias en la PR se ha asociado a una reducción en la susceptibilidad in vitro a IPs (incluso en ausencia de mutaciones primarias). Por lo tanto, aunque existe una amplia base teórica que sustenta que el subtipo del VIH puede influir en la respuesta al TAR, no se han encontrado evidencias clínicas que nos puedan ayudar a determinar si existe un tratamiento óptimo para los distintos subtipos del VIH (Rivas et al, 2006). 1.9.3.8. Resistencias celulares. La resistencia celular es otro mecanismo a tener en cuenta ya que se ha detectado la existencia de bombas de expulsión de los antirretrovirales en la membrana de los linfocitos y otros tipos celulares. Se han descrito el MDRP-1 (glicoproteína-P) para los IP y la MDRP-4 para los ITIAN (Lee et al. 1998 y Huisman et al. 2000). Este mecanismo puede inhibir las reacciones enzimáticas requeridas para la activación celular de determinados fármacos o la entrada de éstos en las células. Otro mecanismo es el efecto de contrarregulación o down-regulation de la timidin-quinasa celular encargada de la trifosforilación de la misma que provoca una reducción del paso de AZT a la forma AZT 29 trifosfato activa. De igual modo está implicada en la fosforilación de la d4T provocando una disminución de la actividad pacientes tratados previamente con AZT (Sommadossi et al. 1995). 1.9.4. Métodos más usados en la práctica clínica para la detección de resistencias. Los métodos actuales que se encuentran aprobados y comercializados incluyen test genotípicos y fenotípicos, los cuales utilizan suero, plasma o células mononucleares periféricas (proviral en estudio de tropismo, por ejemplo) y permiten orientar sobre el tratamiento óptimo para cada paciente, cuando empezar o sustituir un fármaco por otro por la aparición de mutaciones de resistencia. Los métodos genotípicos son con diferencia los más utilizados en la práctica clínica, por lo que nos centraremos en éstos. 1.9.4.1. Test genotípicos de resistencia. Como ya se ha comentado anteriormente, la variabilidad genética del virus conlleva a la aparición de mutaciones en el genoma viral que puede llegar a alterar la sensibilidad a los antirretrovirales. Este fenómeno ocurre más frecuentemente en aquellos pacientes que utilizan pautas subóptimas o la adherencia al tratamiento no es la adecuada. En este escenario es fundamental la detección de mutaciones que puedan derivar en un fracaso virológico y que permitirán elegir un tratamiento de rescate adecuado con la consiguiente disminución de mortalidad a largo plazo (Hirsch et al. 2008). El principio fundamental de estos test esla detección de mutaciones en el genoma del virus asociadas a resistencia a antirretrovirales. Para su realización son necesarios dos pasos: retrotranscripción del ARN viral y amplificación de los genes que son diana de los distintos antirretrovirales (RT, proteasa o integrasa) mediante PCR. Posteriormente, con este producto de amplificación y mediante el uso de una plataforma de secuenciación con su software que permite la detección de las mutaciones y las compara con una cepa patrón. Existen varias pruebas comerciales basadas en la secuenciación por el método de Sanger que se ha automatizado y que facilitan su realización. Entre ellas las más usadas son: GeneSeq HIV (Monograms BioSciences), TruGene genotyping Kit (Siemens) o ViriSeq HIV-1 Genotyping System (Abbott Molecular). Los ensayos genotípicos exigen que la base molecular de las resistencias esté suficientemente caracterizada, lo que permite que la detección de mutaciones sea predictiva de la falta de actividad de un determinado antirretroviral. 1.9.4.1.1. Variantes minoritarias. Tanto los test genotípicos, fenotípicos y virtuales detectan bien aquellas mutaciones que se encuentras de forma más prevalente entre las cuasiespecies presentes en un paciente. El problema es que cuando estas mutaciones están presentes en menos del 15-20% de estas cuasiespecies (variantes 30 minoritarias), estas pruebas pueden llegar a no detectarlas lo que puede significar que se produzca un fracaso virológico. La alternativa a este problema sería la secuenciación masiva que pueden reportar las mutaciones en baja proporción y aportar más información sobre el riesgo de fracaso virológico en estos casos (Li et al. 2011). 1.9.4.1.2. Nuevos test genotípicos: secuenciación masiva. Las técnicas hasta ahora disponibles permitían obtener un 98-100% de éxito en la amplificación en muestras con una carga viral superior a 500-1.000 copias/ml (Parra-Ruiz et al. 2009), pero la secuencia obtenida con estos métodos no es otra que la secuencia promedio de todas las variantes presentes en la muestra original, siendo difícil detectar mutaciones que supongan menos del 10-20% del total (Paredes et al. 2010), lo que conlleva que aquellas variantes minoritarias puedan obviarse en el estudio, y puedan posteriormente ser seleccionadas cuando se emplea el fármaco al que confiere resistencia. En los últimos años se están incorporando poco a poco a los laboratorios de diagnóstico de los hospitales las plataformas de secuenciación masiva, destacando entre ellas la tecnología 454-UDS (GS Junior y GS FLX+, Roche Diagnostics). Se trata de una metodología basada en la pirosecuenciación masiva que implica preparación de una genoteca de cDNA con posterior amplificación de los fragmentos mediante emPCR (PCR de emulsión) y secuenciación basada en la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) y producción de luz (por medio de la luciferasa) detectable por una cámara óptica tipo CCD. A continuación un software específico (AVA, Amplicon variant Analysis Software) se encargará del alineamiento de las secuencias y mediante el software DeepCheck (Therapy Edge, ABL) (Figura 1.17). Este equipo permite secuenciar fragmentos con una calidad óptima de entre 250-600 pb en aproximadamente 6-10 horas (dependiendo número muestras y tamaño del fragmento) generando hasta 35 millones de bases de información (Mb). Figura 1.17. Workflow del proceso de pirosecuenciación de la plataforma 454. (Modificado de Gega et al, 2011) Otras plataformas existentes son: - Ion Torrent (Life). La metodología que usa este equipo es similar al procedimiento del 454 GS Junior, pero que en vez de usar luminiscencia y detectores de luz, incorpora sensores de voltaje capaces de 31 detectar los H+ liberados cada vez que un nucleótido se une a la nueva cadena en formación, es decir, la señal que detecta es el cambio de pH ínfimo en la solución de reacción. El proceso se lleva a cabo en chips con más de once millones de pocillos. Cada proceso genera entre 10 Mb y 1000 Mb de información en un tiempo estimado de 3 horas. - MiSeq (Illumina) que se basa en terminadores reversibles y los fragmentos que permite amplificar son de 35-75 pb. Es un método basado en la polimerización del ADN, donde la incorporación de un nucleótido marcado con fluorescencia y protegido en la cadena naciente impide que ésta siga creciendo. Tras detectar la señal fluorescente, se elimina el grupo protector y se puede incorporar otro nucleótido marcado, con lo que empieza un nuevo ciclo. Cada proceso genera 1600 Mb de información en un tiempo de 27 horas con una baja tasa de error. - ABI Solid (Applied Biosystems) se basa en la obtención de secuencias por ligación de octámeros marcados de secuencia conocida a la cadena de ADN, con la posterior detección de la señal fluorescente emitida tras cada ligación. Los fragmentos que permite amplificar son de 25-75 pb. De un estudio reciente (Loman et al. 2012), concluimos que la plataforma más eficiente y precisa es el MiSeq con una tasa de error menor al 0.1%. El equipo más rápido es Ion Torrent con una velocidad que puede alcanzar los 330 Mb por hora pero con una tasa de error que alcanza el 1.5% (unos 15 errores por cada Mb), específicamente en fragmentos donde las secuencias son repetitivas. La plataforma que genera los fragmentos de secuencias más largos (alta fiabilidad hasta unas 600 pb, pero en aumento con las nuevas versiones de software) y permitía un mejor ensamblaje del genoma fue el 454 GS Junior. Por lo tanto, a día de hoy la plataforma 454 se presenta como la referencia para entrar en el laboratorio de diagnóstico en VIH de los hospitales mientras que las otras plataformas pueden quedar relegadas a resecuenciar genomas ya conocidos o para el estudio de expresión de transcritos pese a tener las ventajas de precio y fiabilidad con regiones de homopolímeros. A pesar de lo novedoso de cada técnica, ya se encuentran en desarrollo lo que se conoce como tercera generación de secuenciadores masivos. Estos se resumen en la siguiente tabla: Tabla 1.6. Principales características de los secuenciadores de 3ª generación. 32 1.9.4.2. Interpretación de las mutaciones de resistencia. Una vez obtenida las mutaciones que presenta el virus infectante de cada paciente se pueden utilizan diferentes algoritmos de interpretación de mutaciones asociadas a resistencias. Estos algoritmos se encuentran alojados en servidores online de acceso gratuito. A partir de archivos .fasta o .seq generados tras la secuenciación, obtendremos un completo informe con las mutaciones encontradas y la interpretación de los niveles de resistencia a todos los antirretrovirales. Entre estos algoritmos destacan: A nivel nacional: Red de Investigación en SIDA (RIS, www.retic-ris.net). A nivel internacional: a) HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu). Además permite realizar el subtipado. Se encuentra entre los más utilizados. b) Geno2pheno (www.geno2pheno.org). Permite el subtipado viral de una forma más precisa que el anterior, especialmente en subtipos no B. Incorpora algoritmos para la resistencia de la integrasa viral y la interpretación del tropismo viral. c) Agence Nationale de Recherches sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS francesa, www.hivfrenchresistance.org). d) Euresist Network website (www.euresist.org) e) Sociedad Internacional de SIDA de EE.UU. (www.iasusa.org). Es importante conocer que no todos los sistemas de interpretación aportan la misma calidad ni cantidad de información y sólo algunos cuentan con reglas de interpretación específica y actualizada para subtipos no B (Eberle et al. 2012). Entre estos sistemas destacan las de la Sociedad Internacional de SIDA (IAS), cuyo panel de expertos publican periódicamente este listado (Johnson et al. 2013). A nivel nacional destaca la Guía de Resistencias a los antirretrovirales, editada por el panel de expertos de la Red de investigación en SIDA (RIS) y actualizada anualmente. Otro mecanismo para la interpretación de las mutaciones de resistencia encontradas se basa en el uso de algoritmos de interpretación basados en la respuesta de clínica en los que se tienen en cuenta mutaciones, respuesta al tratamiento y niveles plasmáticos de ARN. No existen para todos los fármacos y no están validados para su uso en la clínica. Por lo general existe buena correlación entre estos algoritmos pero suelen darse casos de discordancia en la interpretación de resultados, principalmente a la sensibilidad producidos (un fármaco sea sensible por un algoritmo y actividad disminuida o resistente por otro). Por otro lado cabe mencionar que no todas las herramientas online tienen la misma fiabilidad a la hora de definir correctamente el 33 subtipado de nuestra cepa de estudio ya que la base de Stanford discrimina correctamente los subtipos B y CRF02_AG pero no subtipos A1 y F1 (subtipos muy frecuentes en nuestra población de estudio y a continuación discutida). Para este fin existen varias herramientas que permiten subtipar correctamente nuestras cepas (Yebra et al. 2011 y Pineda-Peña et al. 2013). 1.9.5. Utilidad en la práctica clínica. En varios estudios publicados con pacientes residentes en países denominados desarrollados, la prevalencia de resistencias primarias en pacientes con infección aguda o crónica ha aumentado h superar el 10% (Novak et al. 2005, Wensing et al. 2005 y Cane et al. 2005). A nivel nacional, en estudios multicéntricos que incluían pacientes con infección reciente encontraron que un 14% de las cepas tenía mutaciones primarias (de Mendoza et al. 2005), que se redujo en estudios posteriores hasta llegar a un 10% (Sánchez Oñoro et al. 2007 y Palacios et al. 2008). En un estudio más reciente y en una población no tratada en el periodo 2004‐2008 en los nuevos diagnósticos de la cohorte prospectiva de adultos de la red de Sida (CoRIS) se ha estimado en el 8,4% (García et al. 2011). Los últimos datos publicados han mostrado una disminución progresiva de la prevalencia global de transmisión de cepas con mutaciones de resistencia, estableciéndose en 2011 en 7,5% (Monge et al. 2012). Debido al incremento de pacientes con subtipos no‐B que se diagnostican actualmente en España se debe considerar la realización del subtipo viral a la vez que el estudio de resistencia (García et al. 2011, Yebra et al. 2012 y Abecasis et al. 2013). Otras recomendaciones a tener en cuenta son: - En pacientes con fracaso virológico las pruebas de resistencias deben realizarse durante el TAR activo porque la población viral resistente será sustituida por otra sensible a las pocas semanas de retirar los fármacos. Estos resultados se deben interpretar teniendo en cuenta los estudios previos de resistencia, historia terapéutica y adherencia. - En pacientes en seguimiento durante varios años se debe considerar repetir el genotipado antes de iniciar el TAR ante la posibilidad de haber sufrido una reinfección con mutaciones de resistencia. 1.9.6. Utilidad de los estudios de resistencia en los subtipos no B del VIH-1. Como se ha comentado previamente, la mayoría de las infecciones por VIH a nivel mundial son producidas por subtipos no B (aproximadamente el 89%). A pesar de que el subtipo B es el más prevalente en Occidente, sólo supone un 11% a nivel mundial; el subtipo A en Europa del este y norte de Asia (a nivel global supone el 12%), el subtipo C en África (países sudafricanos), Oriente Próximo, India y Brasil 34 (a nivel global supone hasta el 48% de los infectados por VIH-1), CRF01_AE en el sudeste asiático y CRF02_AG en el oeste de África (5 y 8% a nivel global, respectivamente) (Hameelar et al. 2012). Esta distribución mundial tan marcada está cambiando y la prevalencia de subtipos no B está aumentando en América y Europa, debido principalmente a la inmigración. Los estudios más recientes en Europa (Paraskevis et al. 2009 y Abecasis 2013) han analizado los eventos migratorios de estos subtipos a lo largo de 16 países europeos, la diferencias claras entre países y los subtipos dominantes en cada área (la menor prevalencia de subtipos B de pacientes nuevo infectados se encontraron en Israel (27.9%) y Portugal (39.2%) mientras que los de mayor prevalencia los encontramos en Polonia (96.2%) y Eslovenia. La prevalencia de subtipos en Europa fue: subtipo B (66.1%), seguido del subtipo A1 (6.9%), subtipo C (6.8%) y CRF02_AG (4.7%). Los datos de estos estudios sugieren una alta compartimentalización determinada por las características sociales, según sugieren los autores. En España, uno de los estudios más recientes (Yebra et al. 2012), un 12.2% eran cepas de VIH-1 subtipo no B. Los subtipos encontrados entre los pacientes incluidos en la CoRis (Figura 1.18) y determinaron que tanto los URFs como CRFs se están introduciendo en España a través de inmigrantes y los propios nativos. Según la evolución de los últimos años, se espera un incremento en la frecuencia de estos subtipos aumentando la heterogeneidad del VIH en nuestro país. Figura 1.18. Distribución de subtipos de VIH-1 de la cohorte CoRis. Modificado de Yebra et al, 2012. La disminución de la sensibilidad en subtipos no B está poco estudiada en comparación con la del subtipo B, principalmente porque este predomina en los países donde se emplearon primero los antirretrovirales (ARVs), añadido además la disponibilidad de los tests de resistencia. Sin embargo, existe la posibilidad de que diferencias genéticas entre los subtipos den lugar a un patrón de mutaciones diferente que confiera resistencia en respuesta a la presión de los ARVs. Esta posibilidad es apoyada por el hecho de que el VIH-1 presenta polimorfismos naturales que suponen hasta un 35% entre los diferentes subtipos (Brener et al. 2007, Yebra et al. 2012 y Kouri et al. 2012). Debido a estas diferencias, es posible que la diversidad genética dentro del VIH-1 influya en el tipo de resistencias que eventualmente pueden surgir tras la exposición al fármaco, así como en la tasa de aparición de esas resistencias. Esta diversidad también puede afectar el grado de resistencia cruzada a los ARV de la misma familia, con el potencial de impacto sobre los resultados clínicos, la preservación de la respuesta inmunológica, y el fracaso virológico, como se ha comprobado en un reciente estudio en la que la mutación K65R está implicada en subtipos C (Kantor 2006 y Theys et al. 2013). 41 En la base de datos se recogieron los siguientes datos: demográficos disponibles de los pacientes (sexo, edad y país de origen), epidemiológicos (grupo de riesgo para la transmisión de la infección y subtipo), clínicos (coinfección por hepatitis B o C, sífilis, clamidias, gonococos o papiloma humano), datos de laboratorio (carga viral y recuento de CD4, basal y cada 3-6 meses), terapéuticos (motivo de la petición: naïve, primoinfección, primer o segundo fracaso, multifracaso u otros motivos: toxicidad, embarazo o abandono, así como tratamiento utilizados) y genotípicos (estudios de resistencia a IPs, ITIANs, ITINAN, integrasa y tropismo viral). 3.1.2. Métodos. 3.1.2.1. Determinación de la carga de ARN viral. La carga viral (niveles plasmáticos de ARN del virus) se determinó mediante los siguientes instrumentos: 1. COBAS Amplicor-COBAS Taqman (Roche Diagnostics). 2. m2000 (Abbott Molecular) Ambos equipos, totalmente automatizados, permiten realizar de forma simultánea la amplificación y cuantificación del ARN. Su funcionamiento se basa en 5 procesos fundamentales: 1) extracción del ARN de la muestra; 2) transcripción inversa para generar ADNc; 3) amplificación de este ADNc por PCR con cebadores específicos; 4) hibridación del producto amplificado con sondas oligonucleotídicas específicas marcadas y 5) detección por colorimetría del producto amplificado. El límite de detección inferior fue distinto en función del instrumento y la versión utilizada por cada hospital. El límite actual para el equipo COBAS Amplicor-COBAS Taqman es de 20 copias/mL. Para el equipo de Abbott, el límite es de 40 copias/mL. 3.1.2.2. Subtipado de las cepas de VIH-1. La determinación del subtipo infectante en cada muestra se realizó mediante el análisis de las secuencias obtenidas por secuenciación del gen pol obtenidas por medio del TruGene® HIV-1 Genotyping kit (Siemens Healthcare Diagnostic). Este sistema amplifica un fragmento de 918 pb que engloba los codones 4-99 del gen de la proteasa viral y los codones 38-247 de la RT. La secuencia obtenida se alinea con respecto a la secuencia molde o wild type (LAV-1 HIV) utilizando el software OpenGene(Siemens Healthcare Diagnostic). Las secuencias obtenidas se analizan empleando la base de datos de Stanford (http://hivdb.stanford.edu). Esta herramienta incluye el programa HIVseq para análisis de secuencias que 42 compara las secuencias de transcriptasa inversa y proteasa de estudio con secuencias consenso de distintos subtipos incluidos en su base. Para llevar a cabo este proceso es necesario exportar la secuencia obtenida en formato FASTA o SEQ. Ambos formatos son reconocidos por la aplicación, que tras el análisis obtenemos el subtipo y un % de similaridad con respecto a la secuencia de referencia de la base. En caso de obtener como resultado una cepa no-B, se reanalizaron estas secuencias con otras herramientas, ya que como se ha descrito previamente, la base de Stanford puede cometer errores en la clasificación del subtipado (Yebra, 2011). Estas herramientas fueron: 1. la aplicación de geno2pheno resistance (http://www.geno2pheno.org/), 2. Euresist (http://engine.euresist.org/) y 3. análisis filogenético usando secuencias de referencia de HIV-1 grupo M obtenidas de la base de datos de los Álamos (http://www.hiv.lanl.gov/). El alineamiento de secuencias se realizó utilizando el programa ClustalX v2.0.11. Se construyó un árbol mediante Neighbour-joining usando el modelo de Kimura-2 parámetros mediante el programa MEGA 6. El remuestreo “bootstrap” (n=1000) del alineamiento múltiple fue realizado con un punto de corte de 700. 3.1.2.3. Análisis de clusters de subtipos no B. Las secuencias consenso de referencia se obtuvieron de la base de datos de Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov). Para la alineación de estas secuencias y las de interés se empleó el software Clustal Omega v 1.2.0. Para la obtención de clusters se empleó la herramienta MEGA6 considerando para el cálculo de las distancias entre pares de secuencias métodos de máxima verosimilitud e inferencia Bayesiana (modelo de sustitución de nucleótidos general tiempo reversible o GTR, con un bootstrapping de 1000 réplicas). Se define como cluster cuando tenga valores de bootstrap igual o superior al 98% y una distancia genética media intra-cluster menor de 0.03. 3.1.2.4. Metodología estadística. Las variables principales en este estudio fueron: tratamiento (“no tratamiento”: pacientes naïve o primoinfección, y “si tratamiento”: pacientes con tratamiento previo), recuento CD4 y logCV. La variable secundaria fue el subtipo de VIH-1 (“subtipo B” vs “subtipo no B”). Se realizó un análisis descriptivo en el que las variables cuantitativas se expresaron como medianas (rango intercuartílico o IQR: primer cuartil-tercer cuartil) y las variables cualitativas como número (porcentaje). Para analizar las relaciones entre las variables cualitativas y cuantitativas, se realizaron tablas de contingencia, se aplicaron las pruebas Chi-Cuadrado y t de Student, respectivamente. El análisis estadístico descriptivo e inferencial fue realizado usando el programa estadístico SPSS 22.0 (IBM Corporation, Somers, NY, USA). 43 3.2. Estudio de los polimorfismos naturales en las regiones de la proteasa, retrotranscriptasa, integrasa y región V3 del gen gp120. 3.2.1. Detección de mutaciones de resistencia en proteasa y retrotranscriptasa. El método de detección de resistencias se realizó mediante la técnica de secuenciación de ácidos nucleicos de TruGene® HIV-1 Genotyping kit (Siemens Healthcare Diagnostic) con el instrumento OpenGene DNA Sequencing system (Siemens Healthcare Diagnostic). Esta técnica consta de 5 etapas: extracción de ácidos nucleicos (ARN), amplificación mediante RT-PCR, reacción PCR-CLIP, secuenciación y electroforesis del producto amplificado, alineamiento de las secuencias e interpretación de los resultados. Para la interpretación de resistencias a IPs, ITIANs, ITINANs, integrasa y región V3 se tuvieron en cuenta las reglas de interpretación de resistencia de la Agencia Nacional Francesa de Estudio del VIH (ANRS v23, Septiembre 2013), la HIV Drug Resistance Database de Stanford (Junio 2013), la IAS-USA Drug Resistance Mutations in HIV-1 list (2013) y la Guía 2013 de resistencias a antirretrovirales de la Red de Investigación en SIDA (RIS). El algoritmo de interpretación de resistencias utilizado como referencia en este trabajo ha sido el score utilizado por la HIV Drug Resistance Database de Stanford. La HIV Drug Resistance Database de Stanford clasifica, según el score obtenido, de la siguiente manera: Susceptible (score 0 to 8), Potential low-level (9 to 14), Low (15 to 30), Intermediate (30 to 55) and High (≥60). 3.2.2. Extracción de ácidos nucleicos. Es la primera etapa con la que se consigue hacer accesible la diana de estudio, es decir, el ARN que se encuentra en la cápside viral del VIH. El proceso es el siguiente: 1. pretratamiento del suero para conseguir la lisis de las partículas víricas; 2. separación del ARN del resto de componentes virales y proteínas séricas mediante unión a una partícula sólida magnética; 3. lavado y 4. purificación. En nuestro estudio se empleó el protocolo de extracción automática MagNA Pure Compact (Roche Diagnostics). El kit empleado para ello fue el MagNA Pure Compact Nucluic Acid Isolation kit I (Roche Diagnostics). Para ello se utilizó de partida 700 µl de suero para obtener un eluído de 50 µl (Figura 3.1). 44 1. Muestra a procesar. 2. Lisis celular y digestión proteica. 3. Unión de ácidos nucleicos a la superficie de las partículas magnéticas. 4. Eliminación de restos celulares mediante lavados. 5. Separación del complejo partícula magnética-ácido nucleico. 6. Elusión del ácido nucleico por elusión a alta temperatura. 7. Eliminación de las partículas magnéticas. Eluido final listo para su procesamiento. Figura 3.1. Principios del aislamiento automático de ácidos nucleicos por el sistema MagNA Pure Compact. (Adaptado de Biochemica 2003). 3.2.3. Amplificación del ácido nucleico: RT-PCR. La amplificación se realizó según el siguiente protocolo: 1. Preparación de la Master Mix I y II. Para ello hay que poner a temperatura ambiente los siguientes reactivos (RT-PCR primers, dNTP Solution, DTT Solution y RT-PCR buffer), dejando en el congelador el RNase Inhibitor, la RT enzyme y la DNA polimerase. Antes de utilizarlos es conveniente darle un vortex y un spin rápido (quick run). Se preparan en tubos eppendorf de 1.5 ml. El volumen a emplear depende del número de muestras (nº) a procesar. Una vez preparados la Master Mix se deben vortear. 2. Dispensar 9 µl de la Master Mix I en un tubo Eppendorf de 0.2 ml por cada muestra. A continuación se añaden 17 µl del ARN extraído. Se mezcla con la pipeta. 3. Encendemos el termociclador (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems), seleccionamos el programa “VIH RT_PCR”. Cuando alcance los 90 ºC colocamos las muestras. Empieza el programa con 2 minutos a 90 ºC, seguido de 60 minutos a 50 ºC. Cuando hayan transcurrido unos 5 minutos a 50 ºC, dispensamos el Master Mix II. Para ello, quitamos la tapa del termociclador y sin sacar las muestras, una a una vamos dispensando los 14 µl de la Master Mix II, teniendo la precaución de mezclar con la pipeta y cerrar el tapón inmediatamente. Este ciclo de RT-PCR dura aproximadamente 4 horas. El programa completo de amplificación es el siguiente: 45 90ºC - 2 min 50ºC - 60 min 94ºC - 2 min (94 ºC - 30 seg // 57 ºC - 30 seg// 68 ºC - 2 min) x 20 ciclos. (94 ºC - 30 seg // 60 ºC - 30 seg// 68 ºC – 2.5 min) x 17 ciclos. 68 ºC - 7 min 4 ºC - ∞ Al finalizar se puede continuar con la secuenciación o conservar los amplificados a 4ºC hasta el día siguiente. Con este proceso obtenemos como producto de amplificación una región de aproximadamente 1.3 Kpb del gen pol. 3.2.3.1. Secuenciación bidireccional y electroforesis de los secuenciados. La reacción de secuenciación se basa en una secuenciación bidireccional o reacción CLIP que se basa en una modificación del método de Sanger que emplea terminadores de la secuencia de ADN (ddNTP). La mayoría de los métodos usados en secuenciación emplean estos ddNTP marcados con fluoróforos. En este caso los terminadores no están marcados, son los primers los que se han marcado; un primer incorpora el fluoróforo Cy5.5 en el extremo 5’, el otro incorpora el fluoróforo Cy5.0 en el extremo 3’. Estos fluoróforos emiten luz a distintas longitudes de onda conocidas (694 y 674 nm respectivamente) lo que permite, por medio de un láser, diferenciar la emisión de los productos de secuenciación iniciados con cada uno de estos dos cebadores. De esta forma obtenemos en un mismo tubo la secuencia “sense” y “antisense” (forward y reverse). El secuenciador semiautomático OpenGene DNA sequencing System, dispone de un sistema láser que realiza lecturas cada 30 segundos para registrar las señales que emiten los fluoróforos. El secuenciador incorpora un sistema de registro de ambas longitudes de onda de modo que permite la lectura simultánea de la secuencia en ambas direcciones (5’ y 3’). Partimos del producto de amplificación obtenido en el paso anterior. Para cada amplificado a secuenciar vamos a realizar tres reacciones distintas de secuenciación: CLIP PR, en la que obtendremos una secuencia bidereccional del gen de la proteasa (codones 1-99); CLIP RTB en la que secuenciaremos el principio del gen de la retrotranscriptasa (RT beginning, codones 40-142) y finalmente, CLIP RTM, en la que secuenciaremos la parte media del gen de la retrotranscriptasa (RT middle, codones 138-247). 46 Para la realización de la reacción CLIP se utilizó según el siguiente protocolo: Se ponen los terminadores y el Clip buffer a temperatura ambiente y a continuación se les da un vórtex y un spin rápido. Dispensar 7 µl de cada terminador por cada muestra y cada región. Se emplean, las microplacas con pocillos de 0.2 µl. Cambiar siempre de punta. 1. Preparación de la Master Mix III. Se hace en un tubo Eppendorf de 2 ml. La CLIP enzyme (AmpliTaq FS) se deja en el congelador hasta que vaya a ser dispensada. Antes de utilizarla hay que dar un vórtex y un spin rápido. Una vez preparada la Master Mix III se debe dar un vórtex para mezclar. 2. Dispensar 71 µl de la Master Mix III en tubos eppendorf de 0.2 ml, uno por muestra. 3. Dispensamos 5 µl del producto de la RT-PCR obtenido en el paso previo al Eppendorf correspondiente la Master Mix III y mezclamos muy bien con la pipeta. A continuación dispensamos 5 µl de dicha mezcla a cada pocillo conteniendo los terminadores. La forma más apropiada es tomar los 5 µl de la mezcla y añadirlo al tubo con los 7 µl del terminador apropiado para la secuencia que se trate y mezclarlos con la pipeta procurando que todo el contenido (12 µl) quede en el fondo. Cambiar de punta en cada terminador. Poner los tapones a la microplaca. 4. Ponemos el termociclador en marcha y cuando está alcanzando los 95 ºC ponemos la microplaca que contiene las muestras. El programa completo del termociclador es el siguiente: 94 ºC - 5 min (94 ºC - 20 seg // 56 ºC - 20 seg // 70 ºC – 1.5 min) x 30 ciclos. 70 ºC - 5 min. 4 ºC ∞ 5. Una vez transcurrido todo el programa (2 horas aproximadamente), y el termociclador está a 4 ºC, se debe añadir el reactivo de parada previamente vorteado. Se puede hacer sobre el mismo termociclador; para ello, se toman 14 µl del reactivo de parada, y se añade sobre la pared del pocillo de modo que resbale y procurando que todo el contenido (26 µl) quede en el fondo. Cambiar de punta en cada muestra. 6. Desnaturalizar los productos de reacción calentando a 70-95 ºC durante 2 minutos. Si no se va a hacer la electroforesis guardar la microplaca en nevera. 47 3.2.3.2. Electroforesis de los productos de secuenciación. Una vez realizada la reacción CLIP y la parada, obtendremos, por cada muestra 12 tubos: 4 CLIP PR (uno con ddNTP), 4 de la CLIP RT B y 4 de la CLIP RT M . En cada tubo tenemos los primers marcados que no se hayan incorporado, distintos fragmentos con un peso molecular variable con primers marcados incorporados, productos de secuenciación con la secuencia completa con primers incorporados y ADNc en exceso sin secuenciar. Durante la electroforesis estos componentes se separan en función de su peso molecular. Para llevar a cabo este proceso debemos: • Coger un cristal (MicroCel 500 Cassete, Siemens HealtCare Diagnostics), colocar el peine de 16 pocillos. Colocarlo, asegurándolo en su posición correcta en la tostadora (Gel toaster, Siemens Healthcare Diagnostics) y llenar con la pistola de gel de poliacrilamida (Surefill 6% Sequencing Gel, Siemens HealthCare Diagnostics) con cuidado de no formar burbujas. • Encender la tostadora y transcurridos unos minutos de exposición a luz UV y tras emitir una alarma de aviso, retirar el cristal y limpiar con cuidado los restos del polímero formado que quedan alrededor del peine. Retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos. • Colocar el cristal en la torre del secuenciador (Long-Read Tower; Siemens HealthCare Diagnostics); llenar las cámaras superior e inferior con 1 ml de buffer TBE 1x previamente preparado (900 ml de agua estéril y 100 ml de buffer TBE 10X (Roche Diagnostic). • Programar el secuenciador introduciendo en el software (GeneObjects 4.1, v2008) los datos de identificación de la muestra, paciente, regiones y direcciones que se van a cargar en cada uno de los pocillos del gel, los parámetros de electroforesis (gel temperature: 60ºC; Gel Voltage: 2000V; Laser power: 50%; Run clock: 0.5 sec sampling; Tiempo del run: 50 minutos). • Realizar un prerun para que el buffer TBE comience a pasar por los carriles. • Lavar los pocillos con TBE 1X para eliminar las burbujas. • Cargar en cada pocillo 1,8 µL de muestra desnaturalizada. • Correr las muestras según los parámetros antes indicados. Tras finalizar la electroforesis, el sistema recoge todas las señales emitidas en cada carril y las transforma en un cromatograma. 3.2.3.3. Alineamiento de las secuencias e interpretación de los resultados. El último proceso de la secuenciación consiste en el correcto alineamiento de las secuencias amplificadas. Este procedimiento es llevado a cabo mediante el software GeneObjects 4.1 el cual integra los 4 cromatogramas obtenidos para cada región secuenciada (PR, RT B y RT M ) y para cada dirección (5´ y 48 3´). Tras hacer la asignación de bases (base calling), podremos visualizar la secuencia correspondiente a cada una de la regiones y cada una de las direcciones. Después de revisar posibles errores de asignación de bases, se requiere combinar las secuencias obtenidas en las direcciones 5´ y 3´ de cada región secuenciada que serán comparadas con una secuencia de una cepa de referencia o wild type (HIV-1 LAV-1 , GenBank, número K02013). En este punto se recomienda ser cauteloso para corregir y editar posibles errores de interpretación del software o resolver mezclas que no codifican un aminoácido o generan codones de STOP, así como inserciones o deleciones en la secuencia. Alternativamente, como control interno de calidad, se puede comprobar que no se han producido una contaminación cruzada entre muestras. Para ello utilizaremos la aplicación de fingerprinting. Las secuencias obtenidas pueden ser transformadas a formato texto, más concretamente, en formato FASTA o SEQ, las cuales permiten ser exportadas. Con este formato se realiza el subtipado y el análisis de mutaciones de resistencia mediante otros algoritmos de interpretación. Para la determinación del subtipo e interpretación de resistencias se utiliza la aplicación online gratuita de Genotype Resistance Interpretation de la HIV Drug Resistance Database de la Universidad de Stanford. En caso de que el subtipo determinado sea no B, se reanaliza con la aplicación de Geno2pheno y EuResist. 3.2.4. Detección de mutaciones de resistencia en integrasa (subtipos no B). 3.2.4.1. Amplificación. La amplificación se realizó según el siguiente protocolo: 1. Preparación de la Master Mix para realizar la RT-PCR. Para ello hay que poner a temperatura ambiente los siguientes reactivos (primers, dNTPs, DTT Solution y RT-PCR buffer), dejando en el congelador el RNase Inhibitor, la RT-PCR enzyme mix. Antes de utilizarlos es conveniente darle un vortex y un spin rápido (quick run). Se preparan en tubos eppendorf de 1.5 ml. El volumen a emplear depende del número de muestras (Nº) a procesar. Una vez preparados la Master Mix se deben vortear. 49 2. Dispensar 19 µl de la Master Mix en un tubo Eppendorf de 0.2 ml por cada muestra. A continuación se añaden 6 µl del ARN extraído. Se mezcla con la pipeta. 3. Encendemos el termociclador (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems), seleccionamos el programa “RT-PCR integrasa”. Este ciclo de RT-PCR dura aproximadamente 4 horas. El programa completo de amplificación es el siguiente: 50ºC - 30 min 94ºC - 2 min (94 ºC - 15 seg // 60 ºC - 30 seg// 72 ºC – 1 min) x 40 ciclos. 72 ºC - 7 min 4 ºC - ∞ Al finalizar se puede continuar con la nested-PCR o conservar los amplificados a 4ºC hasta el día siguiente. Con este proceso obtenemos como producto de amplificación una región de aproximadamente 1110 Kpb del gen pol. 2. Reacción de Nested-PCR. La reacción de nested-PCR se realizó a partir del siguiente protocolo: N reaction n=1 n=2 n=3 n=4 Buffer 10X 2,5 5 7,5 10 MgCl2 (25mM) 0,75 1,5 2,25 3 dNTPs (10 mM) 0,5 1 1,5 2 Primer FININ (5mM) 1.75 3,5 5.25 6.75 Primer RINEX (5mM) 1.75 3,5 5.25 6.75 Taq Polimerasa 5U 0,2 0,4 0,6 0,8 H 2 O 16 32 48 64 2. Dispensar 23 µl de la Master Mix en un tubo eppendorf de 0.2 ml por cada muestra. A continuación se añaden 2 µl de ADN previamente amplificado. Se mezcla con la pipeta. N reaction n=1 n=2 n=3 n=4 RTPCR buffer 5X 5 10 15 20 DTT (100mM) 1,25 2,5 3,75 5 dNTPs (10mM) 0,5 1 1,5 2 IN2R (10mM) 1 2 3 4 IN2F (10mM) 1 2 3 4 RNAse Inhibitor (40U/µl) 0,25 0,5 0,75 1 RT-PCR enzyme mix 0,5 1 1,5 2 H2O 9,5 19 28,5 38 50 3. Encendemos el termociclador (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems), seleccionamos el programa “Nested-integrasa”. Este ciclo de PCR dura aproximadamente 2 horas. El programa completo de amplificación es el siguiente: 94ºC - 3 min (94 ºC - 45 seg // 57 ºC - 45 seg// 72 ºC – 1 min) x 35 ciclos. 72 ºC - 7 min 4 ºC - ∞ Con este proceso obtenemos como producto de amplificación una región de aproximadamente 860 Kpb del gen pol. 3.2.4.2. Secuenciación bidireccional y electroforesis del producto amplificado. Para la realización de la reacción CLIP-PCR se utilizó la siguiente master mix con el kit Termo Sequenase Primer Cycle Sequencing (GE Healthcare). Los primers usados (I1F1 e I1F2) estaban marcados con los fluoróforos Cy5.5 y Cy5 respectivamente y englobaban los codones 40 a 170 de la integrasa. Nb reaction n=1 n=2 n=3 n=4 H 2 O 9 18 27 36 Primer I1F1 1,5 3 4,5 6 Primer I1F2 1,5 3 4,5 6 1. Dispensar 12 µl de la Master Mix en tubos Eppendorf de 0.2 ml, uno por muestra. 2. Dispensamos 2 µl del producto de la Nested-PCR obtenido en el paso previo al Eppendorf correspondiente que contiene la master mix. Mezclamos muy bien con la pipeta. A continuación dispensamos 2 µl de dicha mezcla a cada pocillo conteniendo los terminadores. La forma más apropiada es tomar los 2 µl de la mezcla y añadirlo al tubo con los 3 µl del terminador apropiado para la secuencia que se trate y mezclarlos con la pipeta procurando que todo el contenido (4 µl) quede en el fondo. Cambiar de punta en cada terminador. Poner los tapones a la microplaca. 3. Ponemos el termociclador en marcha y cuando está alcanzando los 95 ºC ponemos la microplaca que contiene las muestras. El programa completo del termociclador es el siguiente: 94ºC – 5 min (94ºC – 20 seg // 62ºC – 20 seg // 70ºC – 20 seg) x 30 70ºC5 min 4ºC - ∞ 5. Una vez transcurrido el programa (2 horas aproximadamente), y el termociclador está a 4 ºC, se debe añadir el reactivo de parada previamente vorteado. Se puede hacer sobre el mismo termociclador; para ello, se toman 6.5 µl del reactivo de parada y se añade sobre la pared del pocillo de modo que resbale y procurando que todo el contenido (9 µl) quede en el fondo. Cambiar de punta en cada muestra. 57 Otro de los algoritmos más usados es WebPSSM™, también de acceso libre en http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/webpssm/. Desarrollado por la Universidad de Washington y realiza sus predicciones a partir de la secuencia de aminoácidos en formato FASTA de la región V3 utilizando el método estadístico position-specific scoring matrix (PSSM) Una versión actualizada de ésta última es FortinbrasPSSM™, igualmente disponible libremente en http://fortinbras.us/cgi-bin/fssm/fssm.pl. Desarrollada por el creador original de WebPSSM para la predicción genotípica del tropismo viral en base al PSSM. Proporciona las mismas predicciones que WebPSSM. Esta herramienta permite que aquellas secuencias de V3 que alberguen mezclas de nucleótidos, el servidor ofrece al usuario la posibilidad de obtener una puntuación para cada una de las combinaciones posibles o bien obtener una puntuación media de todas las combinaciones posibles. Pese al enorme conocimiento de esta secuencia y la mejora de los distintos algoritmos de interpretación, aún existe una baja sensibilidad para detectar cepas X4 cuando se comparan estos métodos genotípicos antes comentados con Trofile™. Por ello, varios grupos científicos han conseguido, mediante la combinación de diversos algoritmos, un aumento de la sensibilidad para detectar estas cepas, sin perder especificidad. 3.4.2. Problema técnico planteado. Sería por lo tanto deseable unificar estos algoritmos con el fin de agilizar el laborioso análisis bioinformático y facilitar de este modo al facultativo o científico encargado de este proceso de interpretación de la secuencia de estudio. Para ello, la presente aplicación se basa en una herramienta online que permite analizar la secuencia V3 de la proteína gp120 del VIH y obtener simultáneamente los resultados que se obtendrían al realizar el análisis por separado usando las aplicaciones Geno2pheno coreceptor (con un score de falso positivo o FPR, por sus siglas en inglés de 2-5.75% o un FPR de 10%; y WebPSSM usando la matriz x4r5 para subtipo B o la matriz sinsi en caso de subtipos C del VIH. 3.4.3. Descripción detallada de la aplicación. La presente invención, nombrada “MARGI-HIV tropism” (por sus siglas en inglés Multiple Algorithm Results for Genotyping Interpretation of the HIV tropism) se basa en una base de datos en la que se recogen secuencias proteicas de las región V3 de la proteína gp120 del VIH tipo I. Aproximadamente dos mil secuencias estudiadas se pueden encontrar en la HIV Database de los Álamos, acceso gratuito online (http://www.hiv.lanl.gov/content/index), así como en la Genbank Database, con 58 acceso gratuito online (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). El resto de secuencias se han obtenido a partir de secuencias obtenidas en los laboratorios de Microbiología Molecular de los hospitales universitarios de Valme (Sevilla) y San Cecilio (Granada). Hasta la última actualización realizada el 06/09/2012, la actual base recoge 11069 secuencias. Esta base de datos así como la aplicación que usa esta base de datos se ha diseñado con pleno cumplimiento de lo dispuesto en las Directrices sobre Buena Práctica Clínica, así como de los dispuesto en las leyes y normas administrativas de España (incluyendo la Directiva Europea 2001/20/EC y el RD EC 223/2004). Asimismo, respetará los principios éticos establecidos en la Declaración de Helsinki. Esta base de datos no recoge ningún dato personal ni clínico de pacientes, sólo secuencias proteicas. Estas secuencias se han analizado individualmente por medio del algoritmo de interpretación SVM utilizado por la aplicación Geno2pheno coreceptor. Se han incluido los resultados de % de FPR (ratio de falsos positivos) que se obtienen al analizar la secuencia problema y se ha utilizado la interpretación según el FPR seleccionado previamente para su análisis. Esta base incluye la interpretación del tropismo que se obtiene al seleccionar previamente al análisis un FPR de 2-5.75% y por otro lados los obtenidos tras usar un FPR de 10%. Igualmente se recoge la información que proporciona Geno2pheno sobre la regla 11/25, en la cual si en la posición 11 o 25 de la secuencia V3 hay un residuo de arginina (R) o lisina (K) se indica como tropismo CXCR4. A su vez, la base recoge el valor o score y la interpretación del tropismo viral obtenido mediante el algoritmo PSSM de la aplicación WebPSSM. Para las secuencias proteicas correspondientes a subtipos C del VIH-1 se ha utilizado la matriz sinsi. Para el resto de secuencias de otros subtipos de VIH-1 se ha utilizado la matriz x4r5 para su análisis. Esta base de datos es utilizada a través de una interfaz online (www.vih-tropismo.com). El mecanismo de acción de esta herramienta, es el siguiente: - El usuario debe introducir la secuencia de ADN de la región V3 en la sección indicada como se indica en las figuras 1 y 2. - La secuencia de estudio se traduce automáticamente a proteína y se comparará, mediante un algoritmo de programación, con todas las secuencias incluidas en la base de datos. El resultado que el usuario obtendrá será el análisis de la secuencia que mayor similaridad presenta y que está contenida en esta base de datos con la secuencia de estudio, así como los resultados obtenidos por los algoritmos antes señalados. - En caso de que la secuencia de ADN incluya mezclas, la aplicación realiza una resolución de estas mezclas y obtiene de igual modo los diferentes análisis de las distintas secuencias obtenidas tras este proceso. Estas mezclas son: 59 R: A o G S: G o C M: A o C K: G o T W: A o T Y: C o T - El resultado final será similar al ejemplo que se muestra a continuación: 1. FPR: 38.00% 2. a) Geno2pheno Motivate: CCR5 3. b) Geno2pheno European: CCR5 4. c) Geno2pheno Tropism: CCR5 5. d) WebPSSM Score: -11.16 6. e) WebPSSM Tropism: CCR5 7. f) Predicted genotype: CCR5 - 1. Un % FPR (false positive rate) de la secuencia de estudio comparada con la secuencia consenso usada por Geno2pheno coreceptor. - 2. Interpretación del tropismo por Geno2pheno coreceptor usando un FPR previo de 2-5.75 % (optimized cutoff base on clinical data from MOTIVATE study). - 3. Interpretación del tropismo por Geno2pheno coreceptor usando un FPR previo de 10 % (Recommendations from the European Consensus Group on clinical management of HIV-1 tropism testing). - 4. Interpretación final de Geno2pheno coreceptor (con los dos FPRs antes citados). - 5. Un score obtenido usando la matriz x4r5 de WebPSSM. (Para los subtipos C de VIH-1 se han analizado las secuencias mediante la matriz sinsi para subtipos C) - 6. Interpretación del tropismo mediante WebPSSM. - 7. Un resultado final definido como “Predicted genotype”. Es el resultado obtenido tras usar ambos algoritmos. (Geno2pheno coreceptor y WebPSSM). CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGATCTGTCAATTTCACGGACAATGCTAAAACCATAATAGTACA GCTGAACACATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGAATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGG AGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACTTT AAAACAGATAGCTAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATAATCTTTAAGCAATCCTCAGGAGGGGACCCAG AAATTG Figura 3.2. Secuencia del a región V3 amplificada por los cebadores ES7 y E125 (amarillo) y fragmento que se debe copiar para su posterior análisis en esta herramienta (rojo). TGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGAATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAA ATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGT Figura 3.3. Ejemplo de secuencia que permite determinar el tropismo viral y que se utiliza en esta aplicación. 60 4. Resultados. 61 4.1. Características de la población general de estudio. Las características de los pacientes se muestran en la tabla 4.1 Tabla 4.1. Características de todos los pacientes recogidos en la base de datos. Sexo (%) V: 76.2 ; M: 23.8 Mediana edad (años) [Q1-Q3] 41 [33-46] Mediana recuento CD4 (cel/mm3) [Q1-Q3] 266 [120-444] Mediana Logaritmo 10 carga viral basal (copias/mL) [Q1-Q3] 4.54 [3.73-5.11] Motivo petición % no tratados 56.1 naïve 51.5 primoinfección 4.6 tratados 42.8 primer fracaso 12.4 segundo fracaso 7.0 multifracaso 13.3 Otros 10.1 No disponible 1.1 V= Varón. M= Mujer. Q1= Cuartil 1. Q3= Cuartil 3. Figura 4.1. Motivo de la petición en el periodo estudiado (2009-2012) expresada en %. Atendiendo al motivo de la petición de estudios de resistencias, observamos un aumento de pacientes no tratados (∆ 6%) con la consiguiente disminución de pacientes tratados o fracasos (diferir inicio del TAR, aumento de la adherencia, tolerabilidad y eficacia de los tratamientos actuales son algunas de las explicaciones a este fenómeno) (Figura 4.1). Igualmente observamos un aumento de las primoinfecciones desde 2009 a 2012 de un 3.8% (p=0.127). % 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 2009 2010 2011 2012 NAIVE PRIMOINFECCION 1ºFRACASO 2ºFRACASO MULTIFRACASO OTROS 62 La mediana de edad en pacientes no tratados aumenta ligeramente (desde los 40 años en 2009 a 41 años en 2012, p=0.615) mientras que el sexo de los pacientes se mantiene (83% de pacientes masculinos, p=0.953). Véase tablas 4.2 y 4.3 e figura 4.2. En cuanto a los pacientes tratados la mediana de edad ha aumentado desde los 40 años de 2009 a los 42 años en 2012 (p=0.179), manteniéndose desde 2010. El porcentaje de pacientes masculinos ha disminuido desde 2009 un 4,1%, p=0.580). Tabla 4.2. Motivos de la petición del estudio de resistencias durante el periodo de estudio (%). 2009 2010 2011 2012 Naïve 51,5 48,6 54,7 53,7 Primoinfección 3,0 5,3 3,7 6,8 1º Fracaso 11,1 14,3 11,4 13,7 2º Fracaso 6,0 8,2 7,8 6,3 Multifracaso 18,3 12,7 13,9 8,3 Otros 10,2 11,0 8,6 11,2 Tabla 4.3. Porcentaje de pacientes tratados y no tratados durante el periodo de estudio (%). 2009 2010 2011 2012 p No tratados 54,5 53,9 58,4 60,5 0.203 Tratados 45,5 46,1 41,6 39,5 Figura 4.2. Evolución de los pacientes tratados/no tratados en el periodo 2009-2012 (%). 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 2009 2010 2011 2012 NO TRATADOS TRATADOS % 63 Las características generales correspondientes a los pacientes infectados por subtipos no-B se detallan en la tabla 4.4. Tabla 4.4. Características de los pacientes infectados por subtipos no-B. Sexo (%) V: 70.0; M: 30.0 Mediana edad (años) [Q1-Q3] 38 [30-45] Mediana recuento CD4 (cel/mm3) [Q1-Q3] 309 [143-437] Mediana Logaritmo carga viral basal (copias/mL) [Q1-Q3] 4.44 [3.91-5.20] Motivo petición (%) no tratados 85.7 naïve 78.6 primoinfección 7.1 tratados 14.3 primer fracaso 7.1 segundo fracaso 1.4 multifracaso 4.3 Otros 1.4 Grupo de riesgo (%) ADVP 5.7 Heterosexual 50.0 Homosexual 27.1 ADVP+Homosexual 0.0 Hemoderivados 1.4 Vertical 2.9 Desconocido 12.9 Coinfección (%) VHA 7.1 VHB 5.7 VHC 14.3 Otras infecciones (%) Citomegalovirus 15.7 Citomegalovirus + sífilis 2.9 Citomegalovirus + HPV + clamidias 1.4 Citomegalovirus + Virus Epstein Barr 1.4 Virus Epstein Barr + Toxoplasmosis 1.4 Sífilis 1.4 Toxoplasmosis 1.4 Nota: V: varón; M: mujer; Q1: cuartil 1; Q3: cuartil 3. 64 91,8 8,2 B NOB Tabla 4.5. Pautas de tratamiento utilizadas en los pacientes VIH-1 subtipo no B. ITIAN: 64.3% AZT: 7.1% ddI: 2.9% d4T: 0.0% 3TC: 14.3% FTC: 55.7% ABC: 14.3% TDF: 55.7% ITINAN: 45.7% NVP: 0.0% EFV: 42.9% ETV: 5.7% RPV: 2.9% IP: 28.6% IDV: 0.0% NFV: 0.0% SQV: 0.0% LPV 7.1% ATZ 7.1% DRV: 14.3% InInt (RAL): 10.0% ITIAN+ITINAN: 32.9% ITIAN+IP: 15.7% ITIAN+InInt: 2.9% ITIAN+ITINAN+IP: 5.7% ITIAN+ITINAN+IP+InInt: 7.1% Monoterapia: 4.3% DRV/r: 2.9% LPV/r: 1.4% Adherencia al tratamiento. Buena: 57.1% Regular: 8.6% Perdida de seguimiento: 8.6% Sin ARV: 25.7% 4.1.1. Distribución de subtipos no B en nuestra población. El porcentaje de subtipos no B encontrados en nuestra área de estudio fue del 8.2% (Figura 4.3). La distribución por ciudades de estudio de los pacientes se describe en la imagen 4.4 en donde se concluye que las ciudades con mayor representación de subtipos no B son Huelva y Cádiz, principalmente por el volumen de población inmigrante en estas zonas (Figura 4.4) . Figuras 4.3 y 4.4. Porcentaje de subtipos B y no B en la zona de estudio (Izquierda). Distribución de los subtipos no B entre las tres ciudades de estudio indicados como porcentaje (Derecha). 35,7 45,7 18,6 CADIZ HUELVA SEVILLA 65 28,6 21,4 17,1 11,4 5,7 4,3 2,9 1,4 1,4 1,41,4 1,4 1,4 F1 CRF02_AG A1 C CRF14_BG CRF01_AE G CRF03_AB CRF06_CPX CRF09_CPX CRF11_CPX CRF12_BF D En cuanto a la distribución de subtipos no B analizadas en este estudio, predominan los subtipos F1, CRF02_AG, A1 y C, representando entre ellos algo más del 75% de los subtipos no B de nuestra área (Figura 4.5). En cuanto al origen de estos pacientes, la mayoría son pacientes europeos (78.6%) seguido de africanos (17.1%). Sudamericanos y el Caribe se encontraron en menor proporción (2.9% y 1.4%, respectivamente). Entre pacientes europeos, los subtipos con mayor frecuencia fueron F1 (37.7%), A1 (20.8%) y CRF02_AG (18.9%). El subtipo con mayor frecuencia entre pacientes africanos fue CRF02_AG (33.3%). Los subtipos encontrados en pacientes sudamericanos y del caribe fueron: A1 y CRF12_BF, y CRF14_BG, respectivamente. Figura 4.5. Distribución de los 70 subtipos VIH-1 no B analizados. 4.2. Estudio del recuento de CD4 y logCV de VIH en los pacientes naïve incluidos en el estudio. Se observa una tendencia a la baja entre los grupos de pacientes con una supresión inmune moderada y severa, aumentando el % de pacientes con un recuento linfocitario superior a 500 CD4/ml (p=0.013). Esto indica un diagnóstico precoz de la infección por VIH con lo cual médico-paciente pueden decidir si optan por iniciar tratamiento o diferirlo (considerando exclusivamente el recuento CD4). (Tabla 4.6 e Figura 4.6). Tabla 4.6. Porcentaje del recuento de CD4 entre los pacientes naïve incluidos en el estudio. Nota: CD4 entre 499-200 considerado como supresión inmune moderada, <200 CD4: supresión inmune severa. CD4_NAIVE % 2009 2010 2011 2012 GLOBAL p >=500 10,6 18,4 22,0 25,8 19,4 0,013 499 - 200 47,0 46,1 48,4 38,2 44,5 n.s <200 42,4 35,5 29, 6 36,0 36,1 n.s Figura 4.6. Recuento CD4 entre los pacientes naïve durante los cuatro años de estudio. Se incluye la línea de tendencia en cada grupo. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 2009 2010 2011 2012 >=500 499-200 <200 % 66 Por otro lado, se observa una ligera subida del número de pacientes con CV>100.000 copias, llegando a representar el 40% de la población naïve en 2012 (Tabla 4.7. y Figura 4.7.). Por otro lado, disminuyen ligeramente los grupos de pacientes que tenían entre 100.000 y 1000 copias/ml, no llegando a ser estadísticamente significativo. Si se aprecia un aumento del número de pacientes con carga viral <1000 copias desde el año 2009 al 2012 (∆ 3.2%, p<0.001). Una explicación a estos datos sería el aumento en el diagnóstico en fases tempranas de la infección (etapa ventana con CV<1000 copias o en fase de control inmune o crónica de la infección). Tabla 4.7. Porcentaje de la carga viral (copias/ml) entre los pacientes naïve incluidos en el estudio. CV_NAIVE_% 2009 2010 2011 2012 GLOBAL p >100000 38,7 33,6 37,3 40,0 37,4 n.s 100000-10000 46,5 49,6 41,0 43,2 45,1 n.s 10000-1000 14,0 13,7 18,7 12,8 14,8 n.s <1000 0,8 3,1 3,0 4,0 2,7 <0.001 Figura 4.7. Representación del % de la carga viral de VIH (copias/ml) de pacientes naïve incluidos en el estudio. Nota: Añadida la línea de tendencia en cada grupo. 4.3. Estudio de las mutaciones asociadas a resistencia a antirretrovirales del VIH. Comparación en pacientes naïve (resistencias primarias) y pacientes tratados durante los años 2009-2012. A continuación se muestran el número de resistencias y actividades disminuidas por año y familia antirretroviral a partir de las secuencias incluidas en el estudio. Figura 4.8. Número total de resistencias y actividades disminuidas a fármacos de ITIAN, ITINAN e IPs en los cuatro años de estudio entre los pacientes naïve. Nota: R (resistencia), AD (actividad disminuida). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2009 2010 2011 2012 >100000 100000-10000 10000-1000 <1000 0 5 10 15 20 25 naive 2009 naive2010 naive2011 naive2012 R+AD_ITIAN R+AD_ITINAN R+AD_IP % N 73 En figura 4.15 se incluye la evolución de las CV de los 8 pacientes a lo largo de su seguimiento en sus respectivas consultas (excluidos las pérdidas de seguimiento y pacientes con menos de dos determinaciones de carga viral). Figura 4.15. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo CRF02_AG. En este grupo el factor de riesgo mayoritario fue el heterosexual (11/15). Hubo cuatro pérdidas de seguimiento. Del resto de pacientes, 4 de ellos consiguieron CV indetectable, de los cuales tenían como TAR: EFV/FTC/TDF (Atripla) y uno de ellos comenzó con FTC/TDF/RAL (presentó varios blips a lo largo del estudio, quizás porque el estudio de resistencia a mutaciones de la integrasa resultó como actividad disminuida para raltegravir). En cuanto a CV, los tres pacientes que recibieron Atripla comenzaron con una CV inicial inferior a 10000 copias y CD4 (entre 154 y 404), todos con adherencia del 100%. El paciente que inició con el otro tratamiento (FTC/TDF/RAL) tenía una CV de 63000 copias (4.800) y CD4 igual a 2 cel/mm. Ninguno de estos pacientes seleccionó mutaciones de resistencia a lo largo del estudio. Los pacientes con fracaso virológico comenzaron su TAR con EFV/FTC/TDF (4 pacientes), un paciente con 3TC/AZT/LPVr (posterior cambio a DRV/ETV/RAL) y otro con FTC/TDF/ATVr. Un paciente no comenzó TAR. Todos los pacientes con fracaso con Atripla presentaban una CV con un rango de 52000 y 276000 copias. Los otros dos tratamientos comenzaron con una CV inicial de 7288 (3.863) y 12000 (4.079). Ambos pacientes eran coinfectados por VHC. Ninguno de estos pacientes tenía o seleccionó ninguna mutación de resistencia a lo largo del estudio. Con cargas virales altas (en este estudio a partir de 52.000 copias) Atripla parece no ser un tratamiento adecuado para pacientes portadores de subtipos CRF02_AG. Los tratamientos con 3TC/AZT/LPVr y FTC/TDF/ATVr tampoco fueron efectivos, pero sólo hubo un paciente de cada con este régimen. Sin embargo, Atripla parece ser efectivo en este grupo de pacientes si la carga viral es inferior a 10.000 copias, así como FTC/TDF/RAL como terapia de inicio. 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 HUE1 HUE3 HUE4 HUE9 HUE10 HUE13 HUE17 HUE29 VAL9 VAL10 VAL12 LogCV 74 4. Subtipos F1. Incluidos 20 pacientes. Tabla 4.12. Datos demográficos de los pacientes incluidos con subtipo F1. Código HOSPITAL AÑO SEXO EDAD NACIONALIDAD PAIS_INF FACT_RIESGO SUBTIPO MOTIVO_PET ADHERENCIA COINFECCION OTRAS INF JER5 JEREZ 2010 M 41 ESPAÑA ESPAÑA HETEROSEXUAL F1 NAIVE ABANDONO VHA CMV JER8 JEREZ 2011 H 22 RUMANIA RUMANIA VERTICAL F1 PRIMER FRACASO PERDIDA_SEG NO NO JER12 JEREZ 2012 H 29 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 NAIVE SIN TTO NO CMV,VEB JER14 JEREZ 2012 H 37 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 PRIMOINFECCION BUENA NO NO JER15 JEREZ 2012 H 38 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 NAIVE SIN TTO NO NO JER17 JEREZ 2012 H 29 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 NAIVE BUENA NO NO HUE5 INFANTA 2011 H 47 POLONIA POLONIA HETEROSEXUAL F1 MULTIFRACASO BUENA VHC CMV HUE6 INFANTA 2010 M 26 RUMANIA RUMANIA HETEROSEXUAL F1 NAIVE BUENA VHB CMV HUE7 INFANTA 2010 M 25 RUMANIA RUMANIA VERTICAL F1 SEGUNDO FRACASO BUENA NO CMV HUE8 INFANTA 2011 H 35 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 NAIVE PERDIDA_SEG NO CMV HUE11 INFANTA 2010 H 28 RUMANIA RUMANIA HETEROSEXUAL F1 NAIVE BUENA NO NO HUE14 INFANTA 2012 H 26 ESPAÑA ESPAÑA HETEROSEXUAL F1 NAIVE SIN TTO NO NO HUE21 JRJ 2009 M 26 RUMANIA RUMANIA HETEROSEXUAL F1 NAIVE BUENA NO NO HUE22 JRJ 2009 H 28 RUMANIA RUMANIA HETEROSEXUAL F1 NAIVE BUENA VHB CMV HUE25 INFANTA 2010 M 52 ESPAÑA ESPAÑA HEMO F1 MULTIFRACASO BUENA NO NO HUE28 INFANTA 2011 H 31 ESPAÑA ESPAÑA DESCONOCIDO F1 NAIVE PERDIDA_SEG NO NO HUE30 INFANTA 2010 M 6 RUMANIA RUMANIA DESCONOCIDO F1 PRIMER FRACASO PERDIDA_SEG NO NO HUE36 INFANTA 2011 M 39 RUMANIA RUMANIA HOMOSEXUAL F1 NAIVE SIN TTO VHC NO VAL7 VALME 2010 H 28 RUSIA RUSIA ADPV F1 NAIVE PERDIDA_SEG VHC TOXO VAL8 VALME 2012 H 40 ESPAÑA ESPAÑA HOMOSEXUAL F1 OTROS BUENA NO NO En este grupo hay 5 perdidas de seguimiento, 4 pacientes que no iniciaron tratamiento y un abandono. Los diez pacientes restantes presentaban una buena adherencia. Cuatro pacientes consiguieron CV indetectable empleando como TAR: EFV/FTC/3TC, RPV/FTC/TDF, DRV/ETV/RAL y 3TC/ABC/EFV/RAL, respectivamente. Entre los pacientes que no consiguieron una carga viral indetectable, no encontramos diferencias en la CV basal, recuento CD4, tratamientos o mutaciones asociadas a resistencia que los diferencie con los pacientes que si consiguieron la indetectabilidad. Entre dichas mutaciones encontramos un paciente que seleccionó K103N, M184V y P225H, mientras que otro seleccionó M41L, D67N, M184V, L210W y T215Y. El resto de pacientes no presentaban mutaciones mayoritarias asociadas a resistencia. 75 6 2 2 1 11 A1 CRF02_AG CRF14_BG C F1 CRF01_AE Figura 4.16. LogCV en las distintas determinaciones de pacientes con subtipo F1. 4.4.2. Respuesta virológica en subtipos no B de nuestra área. Entre los pacientes con subtipo no B incluidos en el presente estudio, 17 pacientes tenían sólo una determinación de carga viral realizada en el momento del análisis (pérdida de seguimiento o últimos pacientes de 2012 con sólo una visita). Del resto de pacientes (con dos o más determinaciones), 17 pacientes consiguieron respuesta virológica (Figura 4.17), lo que supone que sólo un 32% de estos pacientes consiguen una carga viral indetectable (24% si consideramos todos los subtipos no B incluidos en el estudio). Figura 4.17. Número de pacientes que consiguieron respuesta virológica y subtipos. 4.5. Estudio de polimorfismos en la proteasa y retrotranscriptasa en subtipos no B de VIH-1. Se han incluido un total de 1022 secuencias y analizado los subtipos no B con mayor número de secuencias detectadas a lo largo del estudio, es decir, la de los subtipos A1, C, CRF02_AG, F1 y CRF14_BG. En negrita se resaltan los polimorfismos que se encontraron en el 100% de las secuencias analizadas. a) Subtipo A1. Se han incluido 18 secuencias de este subtipo, 11 de las cuales eran de pacientes naïve en el momento de la petición. A continuación se describen los polimorfismos encontrados según el aa y posición en la cepa de referencia y el aa encontrado, así como el % de secuencias de dicho subtipo que la presentaban en la proteasa viral y la retrotranscriptasa. 0 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 JER14 JER17 HUE5 HUE6 HUE7 HUE11 HUE21 HUE22 HUE25 VAL8 LogCV 76 Proteasa Si atendemos al listado de mutaciones publicado en la guía del IAS-USA 2013, si se recogen estos polimorfismos como mutaciones asociadas a resistencia a IPs: L10V (ATZ, FPV, LPV y TPV), G16E (ATZ), K20R (ATZ y LPV), M36I (ATZ, TPV), D60E (ATZ), H69K y (TPV). Según este listado y los polimorfismos presentes en este subtipo, el IP que no se recomendaría su uso sería atazanavir. Estas mutaciones no se recogen en la Guía RIS 2013. Retrotranscriptasa Aa wild type V K I K Q D V Q T Q R V Posición 60 122 135 173 174 177 179 197 200 207 211 245 Aa mutación I E T A/I K E E I A A S E % 77 89 94 39/39 89 94 89 83 77 83 83 61 V179E (presente en el 89% de las secuencias analizadas), se encuadra en el grupo 1 de resistencias (Guía RIS 2013) afectando a la actividad de NVP, EFV y ETR. En la guía IAS-USA 2013 no se recoge ninguna de las anteriores. b) Subtipo C De este subtipo se han analizado un total de 12 secuencias con los siguientes resultados en proteasa y retrotranscriptasa. Proteasa. Aa wild type T I L K E M R H L I Posición 12 15 19 20 35 36 41 69 89 93 Aa mutación S V I R D I/V K K M L % 58 67 50 33 33 58 83 100 83 83 Ningún polimorfismo asociado a resistencia según guía RIS 2013. En la IAS se recogen como mutaciones K20R (ATZ y LPV), M36I (ATZ, TPV), H69K (TPV), L89M (TPV) e I93L (ATZ). Con estas mutaciones, para este subtipo no sería recomendable el uso de atazanavir y tipranavir. Retrotranscriptasa. Aa wild type T E S K D K Q V T Q R F V Posición 39 40 48 122 123 173 174 177 200 207 211 214 245 Aa mutación E D T E S A K E A E/A K L Q/A % 92 33 75 92 67 67 50 75 100 58/25 83 50 83/17 Ningún polimorfismo asociado a resistencia recogido en RIS o IAS 2013. Aa wild type L I I G E M N R R D H K L Posición 10 13 15 16 35 36 37 41 57 60 69 70 89 Aa mutación V V V E D I D K K E K R M % 89 94 67 39 100 100 89 100 100 89 100 89 94 77 c) Subtipo F1. De este subtipo se han analizado un total de 17 secuencias con los siguientes resultados. Proteasa. Aa wild type L I I G K E M R R Q L E I L Posición 10 13 15 16 20 35 36 41 57 61 63 65 72 89 Aa mutación V V V E R D D K K N T D T/V M % 59 47 76 53 41 94 94 100 100 41 59 71 47/24 65 En la guía IAS se recogen L10V (ATZ, LPV y TPV), G16E (ATZ), K20R (ATZ y LPV) y L89M (TPV). Con estos polimorfismos los fármacos que más se ven comprometidos serían atazanavir, lopinavir y tipranavir. Retrotranscriptasa Aa wild type E V D I S K Q T Q R V Posición 40 60 123 135 162 173 174 200 207 211 245 Aa mutación D I E L/V-T C/H T/A-V K A/Q-I A-D-E-K K Q % 41 47 82 82/18 64/36 53/47 100 65/29 100 100 94 Ningún polimorfismo asociado a resistencia. d) CRF02_AG De este subtipo se han analizado un total de 17 secuencias con los siguientes resultados. Proteasa Aa wild type I K K M R V H L Posición 13 14 20 36 41 60 69 89 Aa mutación V/G R I I K I K/R M % 94/6 59 94 100 76 47 94/6 100 Ningún polimorfismo asociado a resistencia según RIS, mientras que IAS recoge K20R (ATZ), M36I (ATZ, TPV), H69K/R (TPV) y L89M (TPV). En este subtipo los fármacos más afectados serían atazanavir y tipranavir). Retrotranscriptasa Aa wild type K I S K Q D I T Q R V Posición 122 135 162 173 174 177 178 200 207 211 245 Aa mutación E V/K-T-L A T/A K/A-E-D-R-P E M A/E E/A-D-K K/TE Q/E-K % 35 35/29 100 71/18 59/29 94 47 76/18 59/18 59/18 71/12 Ningún polimorfismo asociado a resistencia. 78 e) CRF14_BG De este subtipo se han analizado un total de 6 secuencias con los siguientes resultados. Proteasa Aa wild type I K K M R H V L Posición 13 14 20 36 41 69 82 89 Aa mutación V R I I K K I M % 100 100 100 100 100 100 100 100 IAS recoge K20I (ATZ) y V82I (ATZ) como mutaciones. En este subtipo se vería disminuida la efectividad de atazanavir. Retrotranscriptasa Aa wild type K V A K Q D T V Posición 43 60 98 122 174 177 200 245 Aa mutación R A S E K/E E A Q/T % 50 67 67 67 83-17 83 83 83-17 Ningún polimorfismo asociado a resistencia. 4.5.1. Estudio de polimorfismos en proteasa y retrotranscriptasa únicos o mayoritarios de subtipos no B. 1. Polimorfismos sólo encontrados en la proteasa de subtipos no B. Tabla 4.13. Listado de polimorfismos encontrados sólo en subtipos no B. Polimorfismo No B (n seq) No B (%) Subtipo L10R 1 1,1 CRF02_AG V11F 1 1,1 CRF02_AG I13G 1 1,1 CRF02_AG K14I 1 1,1 C L19P 6 6,9 CRF02_AG (4), F1, CRF06_cpx L23P 1 1,1 CRF02_AG E34D 1 1,1 CRF02_AG K45Q 1 1,1 CRF14_BG C67E 4 4,6 G, CRF11_cpx(2), CRF14_BG C67N 1 1,1 G H69R 1 1,1 CRF02_AG N83K 1 1,1 CRF14_BG N88S 1 1,1 F1 Nota: incluidas en el análisis 87 secuencias de subtipos no B. Sólo los polimorfismos L10R (reduce actividad de FPV, LPV y SQV) y N88S (reduce actividad ATZ) se recogen en la guía IAS-USA 2013. 79 2. Polimorfismos sólo encontrados en la retrotranscriptasa de subtipo no B. Tabla 4.14. Listado de polimorfismos encontrados sólo en RT de subtipos no B. Polimorfismo No B (n seq) No B (%) Subtipo T39G 2 2,3 CRF02_AG T39L 2 2,3 CRF02_AG, CRF14_BG T39M 1 1,1 F1 E40H 1 1,1 CRF02_AG E42V 1 1,1 CRF01_AE E44R 1 1,1 F1 N54K 1 1,1 A1 D67S 1 1,1 F1 S68T 1 1,1 CRF02_AG V75I 1 1,1 F1 V75T 1 1,1 C L80T 1 1,1 CRF02_AG V90G 1 1,1 CRF02_AG P97A 1 1,1 CRF02_AG L100F 1 1,1 CRF02_AG D113N 1 1,1 CRF01_AE A114V 1 1,1 CRF02_AG S134R 1 1,1 CRF02_AG T139S 1 1,1 D Q145C 1 1,1 C Q151H 1 1,1 CRF11_cpx Q161H 1 1,1 CRF11_cpx T165A 1 1,1 C E169R 1 1,1 CRF02_AG K173L 5 5,7 A1(2), CRF01_AE(3) K173V 5 5,7 F1(2), CRF14_BG(3) Q174D 1 1,1 CRF02_AG I178R 1 1,1 C D186Y 1 1,1 F1 L187S 1 1,1 CRF02_AG V189E 1 1,1 F1 S191A 1 1,1 F1 I195Q 3 3,4 F1 (3) G196M 1 1,1 C H198N 1 1,1 F1 T200Q 4 4,6 F1 (4) K201Q 1 1,1 CRF11_cpx E203A 1 1,1 CRF11_cpx E204M 1 1,1 C L228Q 2 2,3 F1 (2) E233D 1 1,1 A1 L234P 1 1,1 A1 P236H 1 1,1 CRF11_cpx Q242P 1 1,1 A1 P243H 2 2,3 F1, CRF11_cpx V245D 1 1,1 CRF01_AE Nota: incluidas en el análisis 87 secuencias de subtipos no B. No hay descrito ningún polimorfismo entre los encontrados que se incluya como mutación asociado a resistencia. No podemos descartar que alguno por sí y el conjunto de alguno de ellos provoquen una disminución de la actividad o incluso resistencia a algún fármaco de la familia de los ITINAN o ITIAN. 80 3. Polimorfismos mayoritarios de subtipo no B en proteasa. Tabla 4.15. Polimorfismos con mayor frecuencia en subtipo no B comparados con subtipos B. Nota: sólo se incluyen aquellos con una frecuencia mayor al 25% en subtipos no B. Polimorfismo B (%) N=935 No B (%) N=87 L10V 4,4 39,1 I13V 18,4 69,0 K14R 11,8 25,3 L15V 16,4 48,3 G16E 7,8 26,4 K20I 0,2 29,9 E35D 31,8 66,7 M36I 25,7 92,0 N37D 13,2 25,3 R41K 21,6 89,7 R57K 9,4 46,0 D60E 9,4 25,3 H69K 0,7 74,7 L89M 2,1 86,2 4. Polimorfismos mayoritarios de subtipo no B en retrotranscriptasa. Tabla 4.16. Polimorfismos con mayor frecuencia en subtipo no B comparados con subtipos B en la retrotranscriptasa. Nota: sólo se incluyen aquellos con una frecuencia mayor al 20% en subtipos no B. Polimorfismo B (%) N=935 No B (%) N=87 V60I 23,3 52,9 K122E 34,9 57,5 D123E 23,1 27,6 I135T 30,1 35,6 K173A 0,2 29,9 K173T 0,3 34,5 Q174K 1,8 70,1 V177E 21,3 70,1 V179I 3,0 24,1 T200A 22,4 73,6 Q207A 1,7 36,8 Q207E 15,8 31,0 R211K 47,9 55,2 V245Q 1,7 58,6 Ninguno de estos polimorfismos se asocia a resistencia. 81 4.6. Análisis de clústers de subtipos no B. 1. Subtipo A1. El análisis de las secuencias de las cepas con subtipo A1 reveló la existencia de un clúster formado por 8 de los 10 pacientes incluidos con este subtipo (Figura 4.18). Figura 4.18. Análisis de clústers de subtipos A1. Se indica con el corchete el clúster encontrado. 82 2. Subtipo C. El análisis de estas secuencias reveló que no existe ningún clúster definido para los pacientes con subtipo C en nuestra área de estudio (Figura 4.19). Figura 4.19. Análisis de clústers de subtipos C. 89 4.8.1 Análisis de polimorfismos de la secuencia de la integrasa viral en subtipos no B. Al disponer de pocas secuencias se analizaron todas las secuencias en bloque (subtipo no B). Entre los polimorfismos con mayor frecuencia se encontraron los siguientes: L101I (60%), T112V (40%), G123S (92%), T125A (75%) y R127K (60%). De ellas, L101I se asocia (in vitro) a resistencia a dolutegravir (Grupo 1 dentro de la guía RIS 2013). El resto de polimorfismos y su frecuencia se muestran en la figura 4.26. Las mutaciones que más afectan a la actividad de RAL (Y143C/R, Q148H/K/R y N155H) no se encontraron entre las secuencias analizadas. Entre las mutaciones descritas para EVG, T66A/K/I, E92Q, Q148H/K/R y N155H no se encontraron, mientras que E92V, P145S y S147G se encontraron en tres pacientes distintos (2 subtipos F1 y un subtipo C). Las mutaciones descritas que confieren resistencia a DTG, Q148H/K/R, T66K, L74I, E138A/K/T y G140A/C/S) no se encontraron en nuestra población a excepción de L74I, que por sí sola no afecta a la actividad de este fármaco. Dicha mutación se encontró en dos pacientes con subtipo CRF02_AG. Figura 4.26. Frecuencias (%) de sustituciones en cada codón de la integrasa amplificado (codones 12-175). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 7 13 19 25 31 37 43 50 56 62 68 74 80 86 92 98 104 110 116 122 128 134 140 146 152 158 164 170 150 156 162 168 174 % 90 5. Discusión. 91 5.1. Características de la población general del estudio. Distribución de subtipos no B en nuestra población. La vigilancia epidemiológica de la infección por el VIH y los eventos de SIDA es una herramienta indispensable para conocer la magnitud de esta enfermedad en nuestro entorno. Para ello es necesario conocer tanto las características demográficas, socioeconómicas, culturales, como las características bioquímicas-microbiológicas del virus infectante y clínicas de estos pacientes. Estudios más específicos, y objeto de esta tesis, ha sido caracterizar la población de nuestra área centrándonos en los pacientes con subtipo no B, y el impacto que puede esto tener en la epidemiología y la clínica. Este registro es importante para aclarar la situación local dentro del plano regional, nacional y europeo, debido a las diferencias que puedan encontrarse, no sólo a niveles nacionales sino también regionales. A nivel europeo, en el reciente estudio de Abecasis et al. 2013, entre países miembros se encuentra una gran disparidad entre porcentajes de subtipos no B. En un extremo se encuentra Portugal con algo más del 60% (en su mayoría subtipo C y varios CRFs) y en el otro encontraríamos Polonia con menos del 5% de subtipos no B. España se encuadraría en tercer puesto con aproximadamente un 8% (destacando que el estudio se basa en datos de pacientes analizados en el periodo 2002-2005) y aumentado en posteriores estudios hasta el 12% (datos cohorte CoRIS 2012) en el que CRF02_AG sería el subtipo no B más representativo (38%). Dentro de España, la mayor incidencia de nuevos casos de VIH lo encontramos en las comunidades de Madrid, Baleares, País Vasco y Cataluña. Andalucía se sitúa en un puesto intermedio con una incidencia menor que el conjunto nacional pero destacan provincias como Málaga, Cádiz, Huelva y Almería, que se encuentran en valores similares que las anteriores comunidades citadas. Más concretamente, las tasas más altas registradas corresponden a los distritos de Málaga con un 5.57, seguido del Poniente de Almería con un 4.65 y Granada con 4.53 (tasas por mil) (Plan Andaluz frente al VIH/SIDA y otras ITS 2010-2015). En Andalucía, los análisis más recientes se encuentran recogidos, por un lado, en el estudio de de Felipe et al. 2011, donde se resume, en pacientes inmigrantes atendidos en el área hospitalaria del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla) en el periodo 2000-2010, que la mayoría eran portadores del subtipo CRF02_AG. Por otro lado, en una tesis donde se recogen los datos de Andalucía oriental (Carlos-Chillerón, Granada 2007) encontramos una prevalencia de subtipos no B del 8.1% (datos de 1999-2006) donde de nuevo el subtipo más representativo era CRF02_AG (33%) seguido de CRF01_AE y G (13.4% respectivamente). En otra tesis donde se recogen los datos del área de Málaga (Mora-Navas, Málaga 2013) durante el periodo de 2004-2010 la prevalencia de subtipos no B ascendía al 16% siendo, de nuevo, el subtipo CRF02_AG (41.2%) el más prevalente, seguidos de CRF01_AE y F1 (10.4%, respectivamente). 92 En nuestra área de estudio encontramos una prevalencia de subtipos no B del 8.2%, destacando que en este escenario el subtipo más prevalente es el subtipo F1 (28.6%), seguido de CRF02_AG (21.4%), A1 (17.1%) y C (11.4%). Por lo tanto, en nuestra área encontramos que no existe un subtipo dominante, existiendo hasta 4 subtipos que se encuentran co-circulando y por primera vez encontramos que no es el subtipo CRF02_AG el que predomina sobre los demás, como ocurre en muchas zonas de España. Este dato viene dado por las características de la población inmigrante que podemos encontrar en cada una de las anteriores zonas de estudio antes citadas (dándose en Cádiz y Huelva el 81% de los casos de subtipos no B de nuestra área). Estos datos son relevantes en cuanto a la epidemiología del VIH-1 en Andalucía, especialmente en la zona occidental, hasta ahora con escasos datos. Un punto a destacar de nuestros resultados, es la descripción por primera vez en Andalucía de 4 pacientes (Cádiz y Huelva) con subtipo CRF14_BG. Se trataba de un paciente de origen cubano (infectado en Cuba) y tres pacientes españoles (infectados en España). Este subtipo, descrito por primera vez en España en 2001 (Thomson et al. 2001) está aumentando su incidencia dentro de nuestro país. Otros subtipos poco frecuentes en otros entornos, pero encontrados y descritos en esta tesis fueron: CRF03_AB (varón de origen ruso e infectado en Rusia, Valme), CRF06_cpx (varón argelino e infectado en Argelia, Jerez), CRF09_cpx (varón de Senegal, Jerez), CRF11_cpx (mujer de Rumanía, Huelva) y CRF12_BF (varón de Brasil, Huelva). Los dos subtipos G descritos correspondían a dos mujeres de origen nigeriano (Cádiz y Huelva, respectivamente) mientras que el subtipo D era un varón de Uganda (Huelva). Al analizar la población general de nuestro estudio, incluyendo los pacientes atendidos en los Hospitales de Cádiz (H. Puerta del Mar y Jerez), Huelva (H. Infanta Elena y Juan Ramón Jiménez), Osuna (H. de la Merced) y Sevilla (H. de Valme) durante el periodo comprendido entre 2009-2012, donde se han estudiado un total de 855 pacientes infectados con VIH-1. La mayoría de ellos eran varones (76.2%) y una mediana de edad de 41 años (4-5 años mayor que la población de estudio de Málaga y Andalucía oriental). La mediana del recuento de linfocitos CD4 fue de 266 células/mm 3 . Este valor medio de la población es bastante inferior a la población descrita en otras áreas (340 células/mm 3 ). Estos datos revelan un diagnóstico tardío en muchos de los pacientes de nuestra cohorte y/o la dificultad de recuperar un nivel óptimo de CD4 entre pacientes tratados. El valor del logaritmo medio de la carga viral (4.54) es similar en las tres áreas de Andalucía. En nuestra área, el 56.1% de la población general analizada eran pacientes naïve, donde observamos un incremento del 6% entre pacientes no tratados con respecto a datos de 2009 (p=0.203). Como se comentaba en el apartado de resultados, este dato se puede ver desde dos puntos de vista: aumento de nuevos pacientes diagnosticados por infección con VIH, es decir, un aumento del número de nuevas infecciones (según el boletín de la ECDC, European Centre for Disease Prevention and Control, 93 aumentaron en Europa las infecciones por VIH un 8% en 2012 con respecto a 2011), unido a una mejora en la eficacia en diagnóstico VIH). El aumento de las primoinfecciones a lo largo del periodo de estudio (3.6 %, p=0.127) refuerza el dato de aumento de nuevas infecciones VIH en nuestra área. Por otro lado, la disminución de pacientes tratados o fracasos se podría explicar por un aumento de la adherencia de los nuevos regímenes antivirales, eficacia del tratamiento, disminución de toxicidad, etc. Si revisamos estos mismos datos entre los pacientes con subtipos no B de nuestro estudio, continúan siendo los varones el grupo mayoritario (70%), pero la mediana de edad desciende a los 38 años, describiendo un grupo más joven que la población media. En cuanto al recuento de linfocitos CD4, es superior al global (309 vs 266) y unos valores de carga viral similar. En este grupo el porcentaje de pacientes no tratados asciende al 85.7%. En este subgrupo si disponemos de más datos, entre ellos los factores de riesgo, destacando que el 50% de los pacientes infectados eran heterosexuales frente a un 27.1% de homosexuales. Otros datos a destacar son la presencia de coinfecciones, entre la que destaca la coinfección VIH-hepatitis C en el 14.3% de ellos. Por otro lado, en el momento del estudio fueron positivos para citomegalovirus el 21.4% de estos pacientes. Entre las nacionalidades de los distintos pacientes con subtipo no B incluidos, el 54.3% (38 pacientes) tenían nacionalidad española. La distribución de estos subtipos fue: A1 (11 pacientes, 29%), F1 (10 pacientes, 26%), CRF02_AG (9 pacientes, 24%), C (5 pacientes, 13%) y CRF14_BG (3 pacientes, 8%). Aunque la distribución de estos subtipos se ha diversificado, el subtipo A1 es originario del este de África, Rusia y Europa del Este. F1 se originaría en Sudamérica, mientras que el subtipo C se distribuye por África, China y Europa del Este. El subtipo CRF02_AG es mayoritario de países de África Central y Este, mientras que el subtipo CRF14_BG se originaría en Portugal, pasaría rápidamente a España primero y por Europa a continuación. Las pautas de tratamiento y protocolo de acción con estos subtipos en estos pacientes son equiparables a pacientes con subtipo B donde el uso de ITIAN se impone al de ITINAN, siendo la combinación de fármacos de ambas familias la opción preferida en estos pacientes. La adherencia en estos pacientes es buena en el 57.1% de los casos, mientras que la cuarta parte de estos pacientes habían diferido el inicio del tratamiento en el cierre del análisis del presente estudio. 5.2. Estudio del recuento de CD4 y logCV de VIH en los pacientes naïve incluidos en el estudio. El objetivo de este subanálisis fue evaluar el grado de supresión inmunológica (analizando el recuento de linfocitos CD4 entre nuestros pacientes naïve como indicador del retraso del diagnóstico del VIH). Nuestros datos indican, que pese a que hay un claro aumento de pacientes con recuento mayor o 94 igual a 500 CD4/mm 3 (p=0.013) a lo largo del periodo de estudio, no llegan a ser el 26% de los pacientes naïve de nuestro área. Por tanto, el 74% de los pacientes diagnosticados en 2012 presentaban una supresión inmunológica moderada o severa.. Los pacientes diagnosticados tardíamente presentan mayor morbimortalidad, requieren más recursos que los que se identifican pronto y causan más episodios de transmisión. Como se discute en Oliva et al, 2014. el porcentaje de pacientes sin información sobre CD4 es mayor en UDI y pacientes subsaharianos. Estos datos demuestran que se requieren más esfuerzos para adelantar el diagnóstico de la infección así como la prevención de la infección por VIH. Por otro lado, se analizó la carga viral de los pacientes naïve en el momento del primer estudio de resistencias con intención de comenzar tratamiento antirretroviral. Observamos un aumento progresivo (no llegando a ser estadísticamente significativo) de aquellos pacientes con carga viral mayor a 100.000 copias llegando en 2012 a representar el 40% de la población diagnosticada. Este valor es importante para conocer el porcentaje de pacientes que no podrían optar, al menos de inicio, a algunos de los nuevos tratamientos, como es el caso de Eviplera. El caso opuesto, aquellos pacientes con carga viral inferior a 1000 copias, también ha aumentado durante el periodo de estudio (p<0.001) lo que podría explicarse por el aumento de primoinfecciones detectadas (etapas tempranas de la infección y periodo ventana), aunque no podemos descartar que se trate de pacientes en fase crónica de la infección y control inmune. 5.3. Estudio de las mutaciones asociadas a resistencia a antirretrovirales del VIH. Comparación en pacientes naïve (resistencias primarias) y pacientes tratados durante los años 2009-2012. Análisis de efectividad de los ARVs usados según subtipo infectante. Respuesta virológica en subtipos no B de nuestra área. El estudio de resistencias primarias entre pacientes naïve es un dato relevante porque con él, en los últimos años, se está analizando la transmisión de cepas de VIH con resistencia a alguno de los antirretrovirales empleados en nuestro entorno. Varios estudios habrían demostrado que la prevalencia de mutaciones asociadas a resistencia transmitidas a estos pacientes se habría estabilizado e incluso descendido (Yebra et al. 2010) fijándose en España una prevalencia del 10.6%. En nuestra área de estudio hemos encontrado que en 2012 el 8.1% de nuestros pacientes naïve presentaba alguna resistencia a algún antirretroviral (1.6% a ITIAN, 4.9% a ITINAN y 2.4% a IPs). Se encontró una tendencia al alza en las resistencias a estos fármacos y datos analizados de 2013 (no incluidos en esta tesis) confirmando un aumento del número de resistencias primarias a ITIAN e ITINAN, pero no así a IPs (posiblemente por el uso limitado de esta familia), llegando a una prevalencia 95 global del 13.1%. Estos datos son similares a los obtenidos recientemente por Mora-Navas en la región de Málaga y confirman un aumento de resistencias primarias en nuestro entorno, al igual que recogen estudios internacionales recientes (Gagliardo et al. 2014). En cuanto al análisis de resistencias y actividad disminuida provocada por mutaciones asociadas a resistencia entre pacientes tratados de nuestra área de estudio, encontramos una disminución en el número de casos desde 2009 hasta 2012. El descenso está claramente marcado en el caso de las familias de ITIANs e IPs. Estos datos se producen de forma casi generaliza en nuestro país debido, principalmente, al cambio de antiguos antirretrovirales, con una baja barrera genética, por algunos con barrera media-alta. No debemos olvidar que actualmente seguimos usando fármacos con baja barrera en primera línea como son EFV, 3TC y FTC. Por otro lado, el aumento de adherencia al tratamiento, situadas en casi el 100% en algunos casos, ha conseguido minimizar la aparición de estas mutaciones. En función de los datos obtenidos, parece evidente la necesidad de la realización de estudios de resistencia genotípica a pacientes naïve acorde a los datos de prevalencia de resistencia primaria (al menos en la región de la retrotranscriptasa) dado que la elección de las guías españolas en el uso de regímenes de inicio incluye ITINANs. En esta familia, las mutaciones que con mayor frecuencia encontramos en nuestra serie son la mutación K103N y las sustituciones en la posición V179 seguidas a distancia por E138K/Q. La primera produce resistencia cruzada a NVP y EFV mientras que las otras dos comprometen la sensibilidad de ETV y RPV (aumentando su uso en rescate y primera línea, respectivamente, por su elevada barrera genética y menos efectos adversos). Estos datos son similares a los de cohortes nacionales recientemente publicadas (Romero et al. 2011 y Monge et al. 2012). Entre las mutaciones asociadas a resistencia a la familia de ITIANs destaca la mutación M184V, con una prevalencia cercana al 11% (afecta a la sensibilidad de 3TC y FTC), seguida por la mutación M41L y las sustituciones en las posiciones T215 y K219 (4%). Todas ellas afectarían a la sensibilidad de TDF. Ninguna de las mutaciones asociadas a resistencia a IPs, alcanzan una prevalencia superior al 4%. Entre las más frecuentes encontramos M46I/L y L90M, así como las sustituciones en las posiciones I54 y V82. Ninguna de ellas compromete seriamente la sensibilidad de los fármacos de esta familia por lo que por sí solas no representan un riesgo de comprometer el uso de esta familia antirretroviral. Cuando se analiza la prevalencia de estas mutaciones entre subtipos B y no B encontramos que existen algunos polimorfismos naturales, como pueden ser V11L, L24I, D30N y N88S en la región que codifica la proteasa viral, pero ninguno de ellos, “per se” o combinados entre sí comprometerían la actividad de algún fármaco de esta familia entre subtipos no B. 96 En cuanto a mutaciones relacionadas con la familia de los ITINANs encontramos que la mutación K103N era más frecuente entre los subtipos no B de nuestra serie (p<0.001), más concretamente encontrándose en 4 pacientes con subtipo A1, dos pacientes con subtipo F1 y en los subtipos C, CRF01_AE y CRF14_BG, en un paciente respectivamente. En este caso, y dado que no hay descrito que esta mutación sea seleccionada positivamente en ninguno de los subtipos (puros o recombinantes), concluimos que este resultado viene dado por el limitado número de casos y la adherencia incompleta en varios de estos pacientes (3 de ellos comenzaron con Atripla). Otra mutación asociada con algunos subtipos no B, pero que se encuentra en una prevalencia inferior al 1%, es la mutación V106M que afecta a la actividad de NVP y EFV. Esta mutación se encontró en dos pacientes varones españoles, homosexuales, naïve y con subtipo F1, sin que hubiera ninguna relación epidemiológica entre ambos. La mutación Y181I/C, mutación frecuente en varios estudios previos (Mora-Navas, 2013 y Monge et al. 2012), sólo se encontró en un único paciente con subtipo no B (CRF06_cpx). Entre las mutaciones descritas para la familia de los ITIANs, las sustituciones en D67 y V75, así como L210W las encontramos con mayor frecuencia entre subtipos no B y sus frecuencias se encontraron al igual que en estudios previos (Wensing et al. 2005). En este estudio, M184I/V se asociaba a subtipos B con fracaso virológico (p<0.001), mientras que en pacientes con subtipos no B (mayoría pacientes naïve) esta mutación se encontraba en baja frecuencia, principalmente porque provoca una disminución del fitness viral y revierte rápidamente. Entre nuestros pacientes no B, se encontró esta mutación en dos subtipos F1 (uno varón, español, infectado por uso de hemoderivados y multifracaso; el otro varón, rumano, homosexual y naïve) y un paciente naïve con subtipo CRF06_cpx. 5.4. Mutaciones asociadas a resistencia y/o disminución de la actividad del TAR. Comparación entre subtipos B y no B de la población de estudio. Análisis de efectividad (definido como CV<50 copias o indetectable) de los ARVs usados según el subtipo infectante. Respuesta virológica en subtipos no B de nuestra área. Este análisis se realizó entre aquellos subtipos de los que se disponía de un mayor número de pacientes que permitieron obtener unos resultados más significativos, como fueron los subtipos A1 (12 pacientes), C (8 pacientes), CRF02_AG (15 pacientes), F1 (20 pacientes). Entre los pacientes con subtipo A1, se excluyeron 3 pacientes por pérdida de seguimiento (2 españoles y un boliviano) y un exitus (paciente varón, español y UDVP). Entre los otros 8 pacientes con datos del seguimiento, el 62.5% (5 pacientes) alcanzaron una CV indetectable, todos con adherencia completa al tratamiento (3 de ellos con EFV/FTC/TDF; los otros dos FTC/TDF/LPV/r pasando uno a monoterapia con LPV/r). Estos pacientes comenzaron su tratamiento con un recuento de linfocitos CD4 por encima de 380 células/ml y una carga viral no superior a 77.000 copias. Entre los pacientes que fracasaron, hay factores comunes entre ellos, como es iniciar tratamiento con EFV/FTC/TDF (dos de ellos 97 declararon buena adherencia) y en esos momentos presentaron una inmunosupresión severa (recuento CD4 inferior a 200 células/ml) mientras que dos de ellos tenían una carga viral superior a 100.000 copias. El número final limitado en esta serie no permite realizar un análisis estadístico más exhaustivo, por lo que será necesario realizar más estudios para comprobar si el recuento linfocitario inicial en estos pacientes con subtipo A1 es determinante para conseguir una carga viral indetectable cuando se usa EFV/FTC/TDF como terapia de inicio o, por el contrario, será necesario iniciar con otra combinación terapéutica (véanse tabla 4.9 y figura 4.13, pág 70). Entre los pacientes con subtipo C, seis de los ocho pacientes tuvieron seguimiento en sus respectivas consultas. De estos, tres pacientes disponían de pocas determinaciones de carga viral en el momento del presente análisis y dos de ellos, además optaron por diferir el tratamiento. Dado el limitado número de casos con más de 3 determinaciones de CD4 y CV en el momento de estudio, solo podemos definir el porcentaje de que consiguió una carga viral indetectable: 12.5% (1 paciente con EFV/FTC/TDF) (véanse tabla 4.10 y figura 4.14, pág 71). Entre los pacientes con subtipo CRF02_AG (15 pacientes), un 93% (14/15) eran pacientes naïve, el 60% con nacionalidad española, 40% de ellos mujeres y la mayoría de ellos heterosexuales (73%). Se incluyeron un total de 8 pacientes en este sub-estudio que permitió deducir que en pacientes con CV superiores a 52.000 copias en el momento del inicio. Atripla no parece ser la mejor opción terapéutica para estos pacientes al no conseguirse la indetectabilidad del VIH, sin embargo, en aquellos con CV inferior a 10.000 copias si consiguieron la indetectabilidad, al igual que FTC/TDF/RAL usado de inicio. No se encontró relación con el recuento de CD4 en el momento de inicio del tratamiento (véanse tabla 4.11 y figura 4.15, pág 72 y 73). Las características de los 20 pacientes con subtipo F1 eran: 65% varones, el 50% era población con nacionalidad no española, con mayoría de rumanos y equidad entre pacientes homosexuales y heterosexuales. El 65% eran pacientes naïve en el momento de la petición de estudio de resistencias inicial en este estudio. A pesar del número de pacientes, 10 pacientes se excluyeron del análisis: 5 pacientes por pérdida de seguimiento, uno por abandono voluntario de tratamiento y 4 pacientes por no iniciar tratamiento. Con el resto de pacientes (10), no encontramos diferencias destacables en la CV basal, recuento CD4, tratamiento de inicio o presencia de mutaciones asociadas a resistencia que justificaran el fracaso virológico. Sólo 4 pacientes (20%), consiguieron la indetectabilidad, cada uno con un tratamiento distinto (véanse tabla 4.12 y figura 4.16, pág 74 y 75). Resumiendo, sólo el 37% de los pacientes no B de nuestra serie, con datos suficientes de seguimiento, consiguieron la indetectabilidad. Si consideramos todos los subtipos no B incluidos en el estudio, este porcentaje de éxito desciende hasta el 24%. Este dato dista mucho del porcentaje medio 98 obtenido en la población VIH atendida, por ejemplo en el H. de Valme, donde el éxito virológico se encuentra entre el 80-90%. Necesitamos, por tanto, evaluar cómo mejorar este porcentaje, primero aumentando el número de pacientes con un seguimiento adecuado y mejorando la adherencia al TAR en este grupo y por último, en la medida de lo posible, adecuar el tratamiento, a priori más adecuado en función del subtipo, carga viral y recuento de linfocitos CD4, que en algunos casos puede resultar clave para conseguir la indetectabilidad. 5.5. Estudio de polimorfismos en la proteasa y la retrotranscriptasa de subtipos no B. El análisis de polimorfismos realizado a las secuencias de estudio entre subtipos no B mostró la existencia de polimorfismos naturales ya descritos previamente, algunos de los cuales pueden afectar a la sensibilidad de algunos de los TAR usados. Por ejemplo, en el subtipo A1 encontramos que la mutación V179E se encontraba en la mayoría de las secuencias analizadas de este subtipo y que está recogida en la Guía RIS 2013 dentro del grupo 1 de mutaciones de resistencia que afectan a la sensibilidad a NVP, EFV y ETR. Teniendo en cuenta que la terapia de inicio más usada actualmente incluye EFV, debemos considerar que este polimorfismo afecta a la sensibilidad de este fármaco. En la proteasa, sin embargo, algunos polimorfismos encontrados (L10V, G16E, K20R, M36I, D60E y H69K) sólo son recogidos en la guía IAS-USA 2013 y afectarían parcialmente a la sensibilidad a ATZ, LPV y TPV. En subtipos C, se encontraron pocos polimorfismos presentes en el 100% de las secuencias estudiadas, como puede ser H69K en la proteasa (afectaría a la sensibilidad a TPV según la Guía IAS-USA 2013). En la retrotranscriptasa se encontraron T200A y V245A/Q, pero no asociados a resistencia en ninguna de las guías estudiadas, aunque cuestionadas en estudios previos (Yu et al. 2009 y Li et al. 2013). Los subtipos F1 y CRF02_AG comparten muchos polimorfismos en la región de la proteasa comunes con A1, que igualmente comprometerían la sensibilidad a ATZ, LPV y TPV, mientras que para los subtipos CRF14_BG, los polimorfismos registrados sólo afectarían a la sensibilidad de atazanavir. En este último subtipo, todos estos polimorfismos fueron ya analizados previamente entre pacientes diagnosticados en Galicia (Pérez-Álvarez et al. 2003) sin encontrarse evidencias de resistencia. En esta serie incluimos como polimorfismos no descritos en este estudio K20I y V82I (véanse tablas 4.13 a 4.16, páginas 78 a 80). En esta tesis recogemos aquellos polimorfismos presentes únicamente entre los subtipos no B de nuestra área con el fin de ampliar el conocimiento que estas mutaciones. Hoy día la mayoría de ellas carecen de valor por sí mismas en la disminución de sensibilidad, pero no podemos descartar que el acúmulo de estas mutaciones en estos subtipos pueda disminuir progresivamente la sensibilidad de los ARVs usados, como ocurre con las TAMs. 105 6. Conclusiones. 1. El porcentaje de pacientes no tratados ha aumentado progresivamente en el periodo de estudio hasta alcanzar el 60.5% en 2012. Lo mismo ocurre para infecciones recientes o primoinfecciones, alcanzando un 6.8% al final del estudio. 2. Existen diferencias entre la población general y población con subtipos no B de nuestra área: la población no B es más joven (3 años menos), mayoritariamente naïve (85.7%), con un recuento de linfocitos CD4 superior (309 vs 266) y el factor de riesgo mayoritario es la heterosexualidad (50%). Estos datos pueden ser consecuencia del alto porcentaje de pacientes inmigrantes dentro de este grupo. 3. La prevalencia de pacientes infectados con VIH subtipo no B de nuestra área de estudio es 8.2%. A diferencia de otras áreas estudiadas en Andalucía, el subtipo no B mayoritario fue F1 (28.6%) y no CRF02_AG (21.4%). 4. Hemos detectado por primera vez en Andalucía la introducción del subtipo CRF14_BG originario de Portugal. 5. A pesar del aumento del recuento de linfocitos CD4 en pacientes VIH recién diagnosticados, el 74% de éstos en 2012 presentaban una supresión inmunológica moderada o severa. 6. La tasa de resistencias primarias en el último año de estudio fue del 8.1%, pero la tasa de resistencias en ITIAN e ITINAN comenzaron a aumentar en 2012 entre pacientes naïve. 7. Las mutaciones y/o polimorfismos que se asociaban más frecuentemente a subtipos no B no conferían resistencia por sí mismas, salvo si se presentan en combinación, que podrían disminuir la sensibilidad al TAR. 8. La combinación EFV/FTC/TDF puede no ser la adecuada con cargas virales altas (superior a 77.000 copias y CD4<340 cel/mm) por disminución de la efectividad del TAR en pacientes no B con subtipos A1. Lo mismo ocurriría en pacientes infectados con cepas del subtipo CRF02_AG con cargas virales superiores a 52.000 copias. 9. Sólo el 24% de los pacientes no B consiguió una carga viral indetectable de VIH (éxito del tratamiento antirretroviral), dato que dista mucho del % obtenido en el área de Valme (80-90%), confirmando que los protocolos establecidos para esta población no son efectivos. 106 10. En el análisis filogenético de subtipos no B, encontramos un clúster formado por 8 pacientes con subtipo A1 que sugiere una vía de origen africano y dos clústers formados por pacientes con subtipo F1 que indicaban una vía de origen rumana y otra española. 11. La aplicación MARGI-HIV Tropism facilita el análisis del tropismo viral y corrige posibles errores cometidos por otras herramientas bioinformáticas. 12. El 15.1% de los pacientes con subtipo no B analizados presentaban actividad disminuida a algún inhibidor de la integrasa, especialmente a elvitegravir. Los polimorfismos con mayor frecuencia en la región de la integrasa de subtipos no B fueron: L101I (60%), T112V (40%), G123S (92%), T125A (75%) y R127K (60%). 107 7. Referencias. 108 7. Referencias utilizadas (por orden alfabético). Abecasis AB, Grossman Z, Struck D, Vandamme AM, Camacho A, Torti C, et al. Antiretroviral therapy including tenofovir HIV-1 patients treated with combination of reverse transcriptase mutation K65R in HIV-1 subtype is an independent predictor. Antimicrob Agents Chemother. 2013;57:1053-1060. Abecasis AB, Wensing AM, Paraskevis D, Vercauteren J, Theys K, Van de Vijver DA, et al. 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