Efecto de nanovesículas conteniendo un polifenol sobre marcadores de inflamación en un modelo de colitis ulcerosa

FACULTAD DE FARMACIA Efecto de nanovesículas conteniendo un polifenol sobre marcadores de inflamación en un modelo de colitis ulcerosa Autora: Triana Espinosa Jiménez Sevilla, 8 de Junio de 2018 UNIVERSIDAD DE SEVILLA 1 FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y FARMACOTERAPIA Efecto de nanovesículas conteniendo un polifenol sobre marcadores de inflamación en un modelo de colitis ulcerosa. GRADO EN FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO TRABAJO EXPERIMENTAL Autora: Triana Espinosa Jiménez Tutora: Elena Talero Barrientos Sevilla, 8 de Junio de 2018 UNIVERSIDAD DE SEVILLA 2 Resumen La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se caracteriza por una inflamación crónica descontrolada de la mucosa intestinal. RA-303 es un compuesto que pertenece al grupo de los polifenoles, los cuales se pueden encontrar en la naturaleza y que han demostrado tener actividad antiinflamatoria, antioxidante y anticancerígena, entre otras. En este estudio, hemos probado los efectos de este polifenol en un modelo de colitis ulcerosa inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) al 4% p/v sobre ratones macho de la cepa C57BL/6, valorándose su eficacia mediante la administración del polifenol vehiculizado en nanovesículas a las dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg y comparándolo con el polifenol libre. Al mismo tiempo se usó el ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) como control de referencia. Todos los grupos fueron pretratados, durante los tres días previos a la administración del DSS, con las sustancias asignadas para cada uno de ellos. Los diferentes tratamientos fueron administrados mediante sonda intragástrica, en días alternos, de manera simultánea a la toma del DSS en el agua de bebida y durante 7 días. El tratamiento con el polifenol mejoró la pérdida de peso corporal y el acortamiento del colon. La infiltración neutrofílica, con el consiguiente aumento en los niveles de mieloperoxidasa inducida por DSS, disminuyó después de la administración del tratamiento, al igual que ocurrió con la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2). Por otro lado, los efectos antiinflamatorios del polifenol se confirmaron mediante la inhibición de la producción de TNF- en el colon. Con nuestro estudio, hemos demostrado por primera vez la efectividad del RA-303, así como las ventajas derivadas de su vehiculización en nanovesículas, siendo necesarios futuros trabajos para ampliar la visión de los beneficios de este tipo de compuestos. Palabras clave: colitis ulcerosa, polifenoles, nanovesícula, EII, DSS. 3 Índice I. Introducción 4 1. Enfermedad inflamatoria intestinal 4 1.1 Patogenia 5 1.2 Tratamientos 10 2. Polifenoles 14 3. Nanovesículas 17 II. Objetivo 18 III. Material y métodos 19 1. Sustancias ensayadas 19 2. Modelo murino de colitis ulcerosa aguda inducida por DSS 19 3. Evaluación de la severidad de la colitis y análisis macroscópico de las lesiones 21 4. Actividad de la enzima mieloperoxidasa 21 5. Determinación de la producción de citosinas mediante ELISA 22 6. Expresión de proteínas mediante Western Blot 23 7. Análisis estadístico 24 IV. Resultados 25 1. Valoración macroscópica de la colitis 25 2. Análisis bioquímico de la mucosa colónica 27 V. Discusión 30 VI. Conclusiones 33 VII. Bibliografía 34 4 I. Introducción 1. ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica y heterogénea que se caracteriza por períodos de remisión y de recaídas. La EII comprende la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU). Se ha visto que se trata de una enfermedad multifactorial en la que tienen un papel importante la respuesta inmune, los factores medioambientales, la microbiota intestinal y múltiples genes (Yamamoto, 2017). Aunque la EC y la CU puedan parecer lo mismo, cada una de ellas tiene sus propias características, si bien es cierto que comparten muchos aspectos. Entre ellos, el mecanismo del proceso inflamatorio, que es igual en ambos procesos. Los síntomas más característicos son bastante similares en ambos casos, pero las áreas del cuerpo a las que afectan son distintas. Mientras la EC puede afectar a cualquier parte del intestino, la CU se limita al colon (Figura 1). El síntoma más representativo de la CU es la aparición de sangre en las heces, siendo frecuente encontrar diarreas o heces poco consistentes, con sangre o mucosidad, urgencia rectal, tenesmo, esputos rectales y dolor abdominal, entre otros. A nivel extraintestinal, puede aparecer fiebre, taquicardia, pérdida de peso, náuseas, vómitos, inflamación en los ojos, dolor de articulaciones, etc. En cuanto a la EC, en algunos casos a penas produce síntomas. Sin embargo, a veces puede causar una enfermedad perianal, o perforación y abscesos en el abdomen. Los síntomas de los brotes pueden variar pero casi siempre incluyen diarrea, dolor abdominal y pérdida de peso. Es frecuente la fiebre y puede aparecer sangre en las heces. El ano puede verse afectado con la aparición de abscesos y fístulas. También pueden aparecer algunas manifestaciones extraintestinales, incluso durante los brotes se podrían producir alteraciones en los resultados analíticos, anemia y otros (Fundación Española del Aparato Digestivo). 5 Figura 1: Zonas principales de afectación en la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Tomada de la IV conferencia sobre la CU y EC en Costa Rica por el gastroenterólogo León de Mezerville Estas enfermedades por lo general afectan a personas entre los 30 y los 40 años, y actualmente, el número de casos alrededor del mundo está aumentando (Basso et al.,2014). Tradicionalmente, los países más desarrollados han presentado una prevalencia menor, pero la incidencia está aumentando en estos países, especialmente en aquellos situados en América Latina y Asia, a medida que se vuelven más industrializados (Yamamoto, 2017). 1.1 Patogenia La EII se caracteriza por una inflamación muy difícil de controlar y exacerbaciones que conducen a una mala calidad de vida de los pacientes afectados. Aunque la causa exacta de la EII sigue sin conocerse, la evidencia sugiere que la interacción entre la desregulación del sistema inmunológico, los factores ambientales y los polimorfismos genéticos son los principales factores que contribuyen a la naturaleza multifactorial de la enfermedad (Basso et al., 2014). 1.1.1 Polimorfismos genéticos Si nos centramos en la influencia que tienen algunos genes en la EC y la CU, numerosos polimorfismos han sido identificados y relacionados con la patogenia de esta enfermedad. Una mayor susceptibilidad a la EII y una enfermedad colónica más extensa se han relacionado con alteraciones en los receptores Toll-like (TLRs), mientras que 6 variaciones genéticas en el receptor nucleotide binding oligomerization domain (NOD)- like, conducen a un aumento en la predisposición a padecer EC. De hecho, los polimorfismos en la proteína 15 que contiene el dominio de reclutamiento de NOD2/caspasa fueron las primeras modificaciones genéticas que se relacionaron con el comienzo de la EII. Desde entonces, diversos estudios han mostrado unas 100 variantes alélicas relacionadas con la EC o CU. Éstos incluyen a la familia de receptores tipo NOD y otros muchos como la familia del receptor NOD-like (NLRP3) (Basso et al., 2014). 1.1.2 Factores ambientales Entre los mecanismos no genéticos que subyacen a la patogénesis de la EII, existe un interés creciente en la interacción epigenética entre el ADN del huésped y los desencadenantes ambientales. Por ejemplo, según muestran los datos epidemiológicos, el mayor riesgo de desarrollar EII entre las personas que migran de zonas de baja a alta incidencia parece apoyar la noción de modificaciones epigenéticas impulsadas por el medioambiente. Entre algunos de los factores ambientales podemos destacar el papel de los alimentos, que se han visto implicados en la aparición de cambios epigenéticos, pudiendo predisponer un mayor riesgo para el desarrollo y la progresión de la EII. En un estudio que se realizó con células epiteliales intestinales aisladas se demostró que la mayoría de las modificaciones epigenéticas asociadas con la EII sugieren un papel relevante de la metilación del ADN (De Souza, 2017). El estilo de vida occidental puede precipitar la inflamación intestinal e incluso las recaídas, pero este factor está principalmente basado en las variaciones en las comunidades microbianas. En la primera investigación poblacional que se realizó en Asia y Pacífico, se observó que las alteraciones dietéticas e inmunológicas que se producían en edades tempranas provocaban, posteriormente, el desarrollo de EII. Estos hallazgos parecen corroborar la hipótesis de que las diferencias en la microbiota relacionadas con la geografía y la etnia, pueden explicar los cambios recientes en la incidencia de trastornos relacionados con la microbiota, incluido el aumento global de la EII, especialmente en aquellos países que anteriormente mostraban bajas tasas de incidencia (De Souza, 2017). 7 La microbiota intestinal tiene importantes funciones en el metabolismo del huésped y en el desarrollo y funcionamiento del su sistema inmune (Kamada et al., 2013). Junto con la predisposición genética y los factores medioambientales, la microbiota es un elemento clave en la patogénesis de la EII, como un mecanismo que predispone o que protege frente al desarrollo de la inflamación intestinal. La relación entre la alteración de la microbiota y los pacientes con EC o CU apunta a que las comunidades de microorganismos que habitan en el intestino desempeñan un papel importante en el desarrollo y progresión de la enfermedad, como se ha podido observar en modelos de ratones (Gkouskou et al., 2014). En consecuencia, varios estudios han demostrado el papel de los microorganismos específicos y combinados en la gravedad de la inflamación intestinal. Por ejemplo, se han descrito reducciones en las poblaciones de bacterias anaerobias encontradas normalmente en la microbiota intestinal como Bacteroides, Eubacterium y especies de Lactobacillus en pacientes con EII. Por otro lado, en pacientes con EC se ha visto una reducción en Firmicutes y un aumento simultáneo en Proteobacteria. Estos pacientes también mostraron una reducción en el grupo de Clostridium leptum, particularmente en Faecalibacterium prausnitzii (Basso et al., 2014). 1.1.3 Factores inmunológicos Dado que la EII es una inflamación crónica y recidivante de la mucosa intestinal, se ha establecido tradicionalmente que tanto la respuesta inmune innata como la adaptativa desempeñan un papel importante en la patogénesis, junto con los factores predisponentes previamente descritos. La respuesta inmune habitual comprende barreras físicas (por ejemplo, el epitelio que recubre la mucosa intestinal), células fagocíticas, células dendríticas, células Natural Killer (NK), citocinas, etc. La mayoría, si no todos, de estos componentes del sistema inmune innato se modifican en la EII, lo que lleva a una inflamación incontrolada de la mucosa intestinal. Además de las importantes alteraciones en la respuesta inmune innata, el perfil predominante de citocinas también dependerá de qué perfil de células T se desarrolle y, con ello, la respuesta inmune adaptativa que se produce durante el curso de la enfermedad (Basso et al.,2014). Las células T CD4 + madre se diferencian en células Th1 gracias a la estimulación de la IL-12 y la IL-27. Estas células Th1 liberan citocinas como el TNF-α, IFN-γ e IL-2. Por otro lado, las Th2 se diferencian bajo la influencia de la IL-4 14 intestinal en la EII, el trasplante fecal como nueva estrategia terapéutica ha ganado una atención creciente en los últimos años. 2. POLIFENOLES Los polifenoles constituyen uno de los grupos de productos naturales más numerosos y ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Más de 8000 estructuras fenólicas se conocen actualmente, y entre ellas se han identificado más de 4000 flavonoides. Aunque los polifenoles se caracterizan químicamente como compuestos con características estructurales fenólicas, este grupo de productos naturales es muy diverso y contiene varios subgrupos de compuestos fenólicos. Las frutas, verduras, cereales integrales y otros tipos de alimentos y bebidas como el té, el chocolate y el vino son fuentes ricas en polifenoles. La diversidad y amplia distribución de polifenoles en las plantas ha conducido a diferentes formas de categorizar estos compuestos naturales. Se trata de metabolitos secundarios de las plantas y muchos de ellos están involucrados en los mecanismos de defensa de las mismas, ya que tienen actividades antibióticas y antifúngicas (Gil y Sánchez de Medina, 2010), aunque algunos son esenciales para las funciones básicas fisiológicas de los vegetales. 2.1 Estructura y clasificación Los polifenoles se pueden dividir en distintas clases dependiendo del número de anillos fenólicos que contengan y los elementos estructurales que se unen entre ellos. De esta manera se pueden distinguir 5 grandes grupos; los ácidos fenólicos, los estilbenos, los lignanos, los alcoholes fenólicos y los flavonoides. Nuestro compuesto en estudio (RA-303) pertenece al grupo de los ácidos fenólicos, por lo que nos centraremos principalmente en ellos. Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos son compuestos polifenólicos no flavonoides que se pueden dividir en dos tipos principales, los derivados del ácido benzoico (gálico, vanilíco, catéquico, elágico y siríngico) y los derivados del ácido cinámico (p-cumárico y cafeico) (Figura 5). Mientras que las frutas y verduras contienen muchos ácidos fenólicos libres, en granos y semillas, particularmente en el salvado o en la cáscara, los ácidos fenólicos a menudo se encuentran en la forma enlazada (Chandrasekara y Shahidi, 2010). Estos ácidos fenólicos solo pueden liberarse o hidrolizarse por 15 hidrólisis ácida o alcalina, o por enzimas (Tsao, 2010). Con el objetivo de focalizar contenido, nos centraremos en los ácidos hidroxicinámicos, los cuales no suelen encontrarse en forma libre sino que suelen estar esterificados en la pared celular vegetal, y, con ello, presentan una baja solubilidad. Los principales representantes son el ácido ferúlico, el ácido cumárico y el ácido cafeico. Figura 5: Estructura química de los principales ácidos fenólicos. Tomada de Tsao, 2010 2.2 Bioactividad de los polifenoles Los polifenoles han demostrado numerosas actividades biológicas y efectos beneficiosos para la prevención y tratamiento de enfermedades relacionadas con la edad, el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, etc. (Figura 6) Figura 6: Principales actividades biológicas de los polifenoles. Tomada de Li et al, 2014. 2.2.1 Actividad antioxidante Entre las bioactividades notables de los compuestos fenólicos, la antioxidante se ha estudiado ampliamente, incluida la eliminación de radicales libres, la inhibición de la 16 oxidación lipídica o la disminución de la producción de peróxido de hidrógeno (Sato et al, 1996). Existen numerosos experimentos in vitro que probaron que los compuestos fenólicos son los principales contribuyentes de las capacidades antioxidantes de las plantas. Los polifenoles podrían funcionar también como antioxidantes mediante sus efectos en plasma, membranas, factores de transcripción y la actividad enzimátiva in vivo (Li et al., 2014). 2.2.2 Actividad anticancerígena Los polifenoles pueden jugar un papel importante en la terapia anticancerígena. Sus efectos se han observado en la boca, estómago, duodeno, colon, hígado, y piel, entre otros. Muchos polifenoles, como las proantocianidinas, los flavonoides o el resveratrol han sido estudiados y todos han demostrado efectos protectores en algunos modelos aunque sus mecanismos de acción fueron diferentes (Johnson et al., 1994). Las actividades anticancerígenas de algunos compuestos fenólicos han sido estudiadas ampliamente, y los resultados se recogen en la Figura 7. Figura 7: Efectos anticancerígenos de algunos compuestos fenólicos.Tomada de Li et al., 2014. 2.2.3 Actividad antiinflamatoria En los últimos años se nos ha permitido comprender la manera en la que diferentes polifenoles modifican los mecanismos básicos de la respuesta inflamatoria gracias a los modernos métodos de biología molecular y celular. Los polifenoles podrían afectar a la inflamación y el daño vascular no sólo como antioxidantes sino también como moduladores de las vías de señalización inflamatoria redox. Existen 17 varios mecanismos antiinflamatorios de polifenoles in vivo. Uno de ellos es la inhibición de los eicosanoides que generan enzimas incluyendo a la fosfolipasa A2 y la ciclooxigenasa (COX). Los polifenoles fueron capaces de modular la actividad de la COX-2 y la expresión génica en diferentes tipos de células (Kim et al., 2004). 2.2.4 Actividad antimicrobiana Los polifenoles han demostrado potencial actividad antibacteriana, antifúngica y antiviral. Fueron capaces de suprimir una serie de factores de virulencia microbiana, como por ejemplo la neutralización de toxinas bacterianas, y además demostraron sinergismo con los antibióticos, potenciando su eficacia, reduciendo la dosis necesaria, y por lo tanto, disminuyendo las reacciones adversas a los antibióticos (Daglia, 2012). 2.2.5 Otras bioactividades de los polifenoles Además de las bioactividades explicadas anteriormente, los polifenoles han demostrado otros efectos beneficiosos sobre la salud. Existen evidencias que demuestran que los polifenoles tienen una respuesta protectora en el daño de la piel, eritema y peroxidación lipídica debidas a la exposición a la radiación UV (Kim et al., 2001). El efecto protector de los polifenoles sobre el riñón también ha sido demostrado. Estos compuestos podrían proteger frente a la rabdomiolisis tras la inyección de glicerol. Este efecto renoprotector se pudo observar con mucha mayor frecuencia en humanos con consumo crónico de vino tinto (Rodrigo et al., 2011). La resistencia a la insulina, una característica distintiva de los trastornos metabólicos, es un factor de riesgo para la diabetes y las enfermedades cardiovasculares. Se obtuvieron resultados que mostraron que algunos polifenoles, como el resveratrol, tuvieron in vivo un efecto beneficioso sobre el metabolismo energético en enfermedades como la obesidad provocada por la dieta y la resistencia a la insulina (Dasgupta y Milbrandt, 2017). 3. NANOVESÍCULAS Las nanovesículas son sistemas coloidales constituidos por una o varias bicapas lipídicas concéntricas, formadas por moléculas anfipáticas como fosfolípidos o tensioactivos, y que contienen en su interior un compartimento acuoso. Dentro de ellas, los niosomas, formados por tensioactivos no iónicos y otros aditivos, han mostrado ser 18 especialmente útiles para la vehiculización de compuestos por vía oral. Presentan una serie de ventajas para la liberación por esta vía como la resistencia a las condiciones gástricas y el aumento de la biodisponibilidad de los compuestos encapsulados gracias a su absorción a nivel intestinal o colónica (Tavano et al., 2014). Las nanovesículas se están ensayando para el tratamiento de la EII, ya que tienen la ventaja respecto a la terapia convencional de que presentan una mayor adherencia a los tejidos inflamados. Esto se traduce en un aumento de la biodisponibilidad del fármaco a una concentración más baja, minimizando los efectos adversos, con una mejora de la eficacia (Lozano-Pérez et al., 2014). La investigación actual se centra en el uso de nanovesículas para la liberación colónica de fármacos, debido a que las convencionales presentan poca resistencia al pH gástrico y a la degradación enzimática. Esto se consigue mediante el recubrimiento de niosomas con determinados polímeros. En este sentido, en un estudio reciente se vehiculizó la quercetina en liposomas recubiertos con chitosán, un polisacárido mucoadhesivo y nutriosa, una dextrina derivada del maíz que resiste parcialmente la digestión en el intestino delgado y llega en un 85% inalterada al colon. Este complejo fue así capaz de paliar los síntomas asociados a la colitis experimental (Castangia et al., 2015). II. Objetivo El estudio de productos naturales continúa siendo una parte importante en la investigación de nuevos compuestos que pueden dar lugar al desarrollo de fármacos. De entre todos los fitoquímicos, los polifenoles representan uno de los grupos más estudiados, con una amplia variedad de propiedades, incluyendo efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antitumorales, que los hacen ser compuestos parcialmente útiles en el tratamiento de enfermedades de índole inflamatoria como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) El objetivo general de este Trabajo Fin de Grado es evaluar el efecto del polifenol RA-303 encapsulado en niosomas recubiertos de nutriosa y quitosano en un modelo animal de colitis ulcerosa aguda inducida por la ingestión de dextrano sulfato sódico (DSS) en el agua de bebida. 19 Este trabajo se ha centrado en los siguientes objetivos específicos: 1. Evaluar las manifestaciones clínicas de la colitis experimental en los ratones. 2. Analizar las lesiones macroscópicas y microscópicas, determinando el grado de infiltración neutrofílica en el colon. 3. Evaluar biomarcadores asociados con la inflamación en el colon como los niveles de citocina pro-inflamatoria TNF-α y la expresión de la enzima inducible ciclooxigenasa (COX-2). III. Material y métodos 1. SUSTANCIAS ENSAYADAS En este experimento se ha evaluado la eficacia del polifenol RA-303 vehiculizado en nanovesículas a las dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg, suministradas por la empresa Nanovex Biotechnologies (Asturias), comparándolo con el polifenol libre, sin encontrarse vehiculizado a una dosis de 20 mg/Kg. Al mismo tiempo, uno de los grupos fue tratado con ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) a una dosis de 75 mg/kg, como control de referencia. 2. MODELO MURINO DE COLITIS ULCEROSA AGUDA INDUCIDA POR DEXTRANO SULFATO SÓDICO Las experiencias realizadas se llevaron a cabo de acuerdo con las Guías Institucionales de la Unión Europea relativas al cuidado y uso de animales de laboratorio (Directiva del Consejo de Europa 86/609/CEE) y fueron revisadas por el Comité Ético de la Universidad de Sevilla. En este estudio se emplearon ratones macho de la cepa C57BL/6, de 8 semanas de edad, suministrados por los laboratorios Janvier (Francia), recibidos y realojados en las instalaciones de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, y se mantuvieron en condiciones estándares de estabulación a 24-25 ºC, doce horas de luz al día y alimentación controlada. Se ha llevado a cabo un modelo de inflamación en el colon, basándose en los estudios previos que demuestran que la administración de DSS al 4% en el agua de bebida a los animales durante 7 días consecutivos induce una colitis aguda manifestada por ulceración de la mucosa del colon, acortamiento del mismo, 20 diarrea sanguinolenta y edema acompañada de una gran infiltración neutrofílica (Perse y Cerar, 2012). 2.1 Inducción de la colitis ulcerosa aguda y tratamientos  Grupos de animales ensayados La inflamación aguda del colon fue inducida mediante la administración de DSS al 4% p/v siguiendo la técnica de Perse y Cerar (2012). Tras un periodo de aclimatación, los ratones fueron separados aleatoriamente en 8 grupos experimentales conteniendo cada uno de ellos 10 ratones. Todos los grupos fueron pretratados, durante los tres días previos a la administración del DSS, con las sustancias asignadas para cada uno de ellos. Los diferentes tratamientos fueron administrados por vía oral mediante sonda intragástrica, en días alternos y de manera simultánea a la toma del DSS al 4% p/v en el agua de bebida (Figura 8). Figura 8: Esquema de los días de tratamiento del modelo. Abreviaturas: PT, pretratamiento; T, tratamiento; S, sacrificio. 1. Control sano: Los ratones recibieron la nanovesícula vacía recubierta por quitosán y nutriosa (a este grupo no se le administró DSS). 2. Control DSS puro: Los ratones fueron tratados con la nanovesícula vacía recubierta por quitosán y nutriosa. 3. Control DSS: Este grupo fue tratado únicamente con el vehículo (PBS). 4. DSS+5-ASA: Los ratones fueron tratados con ácido 5-aminosalicílico a una dosis de 75 mg/Kg. 5. DSS+RA: Los ratones fueron tratados con el polifenol libre a una dosis de 20 mg/Kg. 6. DSS+RA vehiculizado en nanovesículas: Los ratones de los tres últimos grupos, fueron tratados con el polifenol vehiculizado en nanovesículas a dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg respectivamente. 21 Los animales fueron pesados y examinados diariamente con el fin de encontrar evidencias de inflamación en el colon. Al octavo día de la toma simultánea de DSS y el tratamiento, los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical y se extrajo el colon de cada animal para el análisis macroscópico, histológico y bioquímico. 3. EVALUACIÓN DE LA SEVERIDAD DE LA COLITIS Y ANÁLISIS MACROSCÓPICO DE LAS LESIONES Durante todo el periodo experimental se valoraron las manifestaciones clínicas de la colitis para la determinación del índice de la actividad de la enfermedad (DAI), el cual engloba la presencia de diarrea, el sangrado rectal y la pérdida peso de los animales. Estos 3 parámetros se evaluaron por separado en una escala de 0 a 3 según el método propuesto por Gommeaux et al., 2007 (Figura 9) y el promedio de los 3 valores constituyó el DAI. Figura 9: Escala propuesta por Gommeaux et al., 2007 para la determinación del índice de la actividad de la enfermedad (DAI). 4. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA MIELOPEROXIDASA Los neutrófilos están implicados en distintas alteraciones gastrointestinales, entre las que se encuentra la CU. Estos leucocitos migran a la zona inflamada y se transforman en células que producen radicales libres de oxígeno, entre otros compuestos, que acaban produciendo el daño en el tejido (Bjarnason et al., 1993). La determinación de la actividad de una de las proteínas constitutivas de los neutrófilos, como es la mieloperoxidasa (MPO), es un método adecuado para cuantificar el grado de infiltración de leucocitos en la zona inflamada. Esta enzima es liberada a los fluidos extracelulares, donde oxida a haluros y tiocianatos formándose los Escala Sangrado Pérdida de peso (%) Consistencia de heces 0 Ninguno <1 Deposiciones normales 1 Pequeñas manchas de sangre en heces; región anal sin sangre 1-4.99 Heces blandas no adheridas al ano 2 Grandes manchas de sangre en heces; sangre en orificio anal 5-10 Heces muy blandas adheridas al ano 3 Heces totalmente hemorrágicas; sangre extendida por todo el ano >10 Diarrea intensa 22 correspondientes ácidos hipohalurosos, que entre otras actividades, participan en la génesis de potentes oxidantes como las cloraminas. Para la medida de esta actividad enzimática se siguió el método propuesto por Bradley (Bradley et al., 1982), basado en la oxidación, dependiente de H2O2, usado como donador de hidrógeno, de un donador artificial de electrones, orto-dianisidina, con producción de un cromógeno de color naranja cuya absorbancia se mide por espectrofotometría a 450 nm (Figura 10). Figura 10: Reacción enzimática de la MPO sobre la orto-dianisidina en presencia de H2O2. Para la realización de esta técnica, las muestras fueron homogeneizadas en tampón fosfato potásico y centrifugadas (4800 rpm, 40 minutos, 4ºC). El precipitado se volvió a homogeneizar en 10 volúmenes de tampón fosfato potásico pH 6.0, que contenía bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HETAB) 0.5% y EDTA 10 mM. La adición de HETAB ayudó a solubilizar completamente la MPO presente en las membranas. Seguidamente, el homogeneizado se sometió a un ciclo de congelacióndescongelación, y a una sonicación de 2 a 3 segundos, lo cual favoreció la liberación total de la enzima. Para la determinación espectrofotométrica, se pipetearon en una microplaca 50 µL de las distintas muestras homogeneizadas en tampón fosfato potásico 50 mM pH 6.0. Posteriormente, se añadieron consecutivamente 50 µL de los diferentes reactivos, o-dianisina al 0.067 %, H2O2 al 0.003% y HETAB 0.5%, y tras un tiempo de incubación de 5 minutos se midió la absorbancia en un lector de placa Labsystems Multiskan Ex. (Helsinki, Finlandia) a 450 nm. Los resultados se expresaron como Unidades de actividad enzimática por miligramo de tejido (U/mg tejido). 5. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE CITOCINAS MEDIANTE ELISA Los niveles de las citocinas proinflamatorias TNFα e IL-6 fueron determinados mediante una técnica de inmunoalálisis enzimático cuantitativo (ELISA). MPO H2O2 H2O Orto-dianisidina Compuesto cromógeno anaranjado 23 Las muestras de colon fueron homogeneizadas en PBS a pH 7.2 conteniendo EDTA 0.5 mM, pepstatina 0.01 mg/mL, aprotinina 0.01 mg/mL, leupeptina 0.01 mg/mL, y PMSF 1 mM a 4ºC durante 20 segundos. Posteriormente, se centrifugaron a 12,000 g a 4ºC durante 10 minutos, y los sobrenadantes se conservaron a -80ºC hasta su uso. Las cuantificaciones de los niveles de citocinas se realizaron siguiendo las instrucciones del kit comercial para cada una de ellas (Peprotech, USA). Los diferentes patrones y las muestras se pipetearon en pocillos recubiertos de un anticuerpo monoclonal específico para cada citocina en estudio. Tras el lavado, se adicionó un anticuerpo policlonal específico para la citocina unido a una peroxidasa y los sustratos, peróxido de hidrógeno y 3,3’ ,5,5’- tetrametilbenzidina (TMB). La reacción enzimática produjo un color azul que cambió a amarillo tras la adición de ácido sulfúrico 1M. La intensidad de color se midió a 450 nm en lector de placa Labsystems Multiskan Ex. 6. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT Los niveles de expresión proteica se midieron en las muestras de tejido colónico, pesadas y homogeneizadas en frío con tampón de lisis (Tris HCl 50 mM, pH 7.5, MgCl2 8 mM, ácido etilen glicol-bis (β-aminoetiléter) tetracético (EGTA) 5 mM, EDTA 0.5 mM, leupeptina 0.01 mg/mL, pepstatina 0.01 mg/mL, aprotinina 0.01 mg/mL, fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) 1 mM y NaCl 250 mM). Los homogeneizados fueron centrifugados (12,000 g, 15 min, 4ºC) y los sobrenadantes fueron recogidos y mantenidos a -80ºC. Para determinar la concentración de proteínas de los homogeneizados fue usado el método colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976). El volumen de homogeneizado correspondiente a 50 µg de proteínas se mezcló con el volumen necesario del reactivo de Laemmli (glicerol 10%, dodecil sulfato sódico (SDS), 10%, azul de bromofenol 0.02% y β-mercaptoetanol 2%, en tampón Tris 1 M pH 6.8). Posteriormente, se desnaturalizaron las proteínas mediante incubación durante 10 minutos en un termobloque a 100ºC. Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS/PAGE (gel de electroforesis de acrilamida)), empleando geles discontinuos de acrilamida formados por un gel de empaquetamiento (5%) y otro gel de separación (10%). El gel de separación contenía acrilamida al 10%, persulfato de amonio (PSA)0.1%), SDS 0.1% y N,N,N’,N’ tetrametil etilendiamina (TEMED), 0.066% en Tris-HCl 1 M pH 8.8. El gel de empaquetamiento contenía acrilamida 5%, 30 Figura 16: Expresión de la proteína ciclooxigenasa-2 (COX-2) en la mucosa colónica de ratones con colitis aguda inducida por dextrano sulfato sódico (DSS 4% p/v) y tratados con los distintos tratamientos. Abreviaturas: DSS NV, control DSS tratado con nanovesícula vacía; RA, grupo tratado con RA-303; 5-ASA, grupo tratado con ácido 5-aminosalicílico; NV-5, 10, 20, grupos tratados con nanovesículas conteniendo una dosis de 5, 10 y 20 mg/Kg del polifenol respectivamente. V. Discusión La EII es una patología que afecta a un porcentaje bastante importante y creciente de la población mundial, siendo mayor la incidencia en aquellos países con un alto nivel de desarrollo industrial. Se trata de una patología crónica y recidivante, que incluye a la CU y la EC y de la cual aún no se conoce su etiología. Investigaciones recientes sugieren que se desarrolla como consecuencia de una respuesta exagerada e incontrolada del sistema inmune, lo que da lugar a una inflamación de la mucosa intestinal, en aquellos individuos que son genéticamente susceptibles y a lo que se le une una mezcla de factores medioambientales, microbiológicos e inmunológicos. El objetivo principal del tratamiento de estas patologías es conseguir la remisión clínica, del paciente y mantener la nutrición, así como reducir la duración y el número de las recaídas. En la actualidad se están evaluando nuevos tratamientos para estas patologías con base inflamatoria. La atención está puesta en compuestos de origen natural, que representan una fuente importante de compuestos base útiles para el desarrollo de nuevos fármacos. Dentro de estos productos naturales, se pueden destacar los polifenoles que son un grupo heterogéneo de sustancias químicas, que tienen en común grupos fenoles en su estructura y que se encuentran presentes en frutas y verduras. Estos 31 compuestos han mostrado tener efectos beneficiosos para la salud debido a sus actividades como son la antiinflamatoria, antioxidante o antitumoral. Numerosas investigaciones han descrito el efecto beneficioso de los polifenoles en distintos modelos experimentales de EII (Nunes et al., 2017; Salaritabar et al., 2017). En este sentido, algunos estudios recientes han mostrado que el tratamiento con un extracto rico en polifenoles de Ocimum gratissimum es prometedor en el tratamiento de la CU, promoviendo la reparación del daño en la mucosa colónica (Alabi et al., 2018). Otros estudios han demostrado el efecto preventivo de la microalga Chlamydomonas debaryana en la fase aguda de la CU en ratas (Ávila-Román et al., 2014). Sin embargo, es necesario profundizar en los mecanismos moleculares asociados a estos efectos. En base a estos antecedentes, el objetivo de nuestras investigaciones fue evaluar las propiedades del polifenol RA-303 encapsulado en niosomas recubiertos de nutriosa y quitosano para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la inflamación que ocurre en un modelo animal de colitis ulcerosa aguda inducida por la ingestión de DSS en el agua de bebida. Nuestros resultados mostraban que la administración de DSS al 4% en el agua de bebida de los animales durante 7 días reprodujo una colitis aguda experimental, coincidente con una pérdida de peso de los animales y un acortamiento del colon. El tratamiento con el polifenol encapsulado a distintas dosis inhibió la pérdida de peso y el acortamiento del colon, siendo más claro el efecto en el caso de la dosis más baja llegando incluso al mismo nivel que el tratamiento con 5-ASA. La respuesta inflamatoria producida por el DSS provoca la activación de células Th1, de forma similar a lo que ocurre en la CU, iniciándose el reclutamiento de macrófagos y neutrófilos (Hsiung et al., 2014). Debido a que el infiltrado celular tiene un papel importante en la EII, su control es extremadamente importante para la atenuación de esta enfermedad. Los niveles de actividad MPO son usados como una medida cuantitativa de la respuesta inflamatoria neutrofílica en una gran variedad de estudios experimentales. En nuestro estudio, se confirmó cómo el DSS aumentaba significativamente la actividad de la enzima MPO. El tratamiento con el polifenol encapsulado, redujo el grado de infiltración, siendo más efectivo cuando se administró la dosis más baja. Hallazgos similares se han descrito en animales que sufrían colitis y 32 que fueron tratados con magnolol (Zhao et al., 2017) o con un extracto de polifenoles del té verde (Mazzon et al., 2009). Las células inmunes participan activamente en las respuestas inflamatoria e inmune de la mucosa mediante la producción de citocinas como el TNF-α, el cual tiene un papel crucial en el inicio y mantenimiento de la inflamación e inmunidad de la mucosa en la EII. Esta citocina está implicada en varios procesos celulares como la apoptosis o la inflamación. Una de las principales acciones del TNF-α es la inducción de moléculas de adhesión y de la expresión de quimiocinas dando lugar a un influjo de células inflamatorias. Un estudio previo mostró altos niveles de TNF-α en el plasma y la mucosa colónica de pacientes con EII (Komatsu et al., 2001). En nuestro estudio, dichos niveles se vieron reducidos al tratar a los animales con las dosis de RA-303, como ocurrió en otro estudio en el que se indujo la colitis con TNBS y se trató a los animales con las antocianinas de Dioscorea alata L. (Chen et al., 2017). La enzima inducible COX-2 es un gen de respuesta temprana inmediata que normalmente se encuentra ausente en la mayoría de las células, pero que se induce principalmente en los sitios de inflamación en respuesta a estímulos inflamatorios como los producidos por el TNF-α (Kanwar et al., 2009). Esta enzima proinflamatoria está aumentada en la colitis experimental y en la EII humana activa, generando una gran cantidad de productos implicados en el daño oxidativo y la inflamación (Yasukawa et al., 2012). En el presente estudio, el daño del colon se asoció con una alta expresión de esta proteína. Sin embargo, el polifenol encapsulado administrado vía oral disminuyó la expresión de esta enzima en el tejido colónico después de la administración aguda de DSS. Resultados similares fueron obtenidos por Sakthivel y Guruvayoorappan (2013) tras la administración de amentoflavona, un biflavonoide, a ratas con CU. Lo mismo ocurrió al tratar ratones con colitis ulcerosa con polisacáridos de Hericium erinaceus (Ren et al., 2018). En base a todo lo expuesto, nuestro estudio demuestra que los polifenoles, a pesar de ser un grupo muy heterogéneo y complejo, presentan una gran cantidad de propiedades muy interesantes para el tratamiento de diversas enfermedades, entre las que podemos encontrar las de carácter inflamatorio. Hemos demostrado por primera vez el efecto beneficioso y las ventajas de encapsular el polifenol RA-303 para el tratamiento de la EII. Son necesarios estudios futuros para ampliar la visión de los efectos y mecanismos mediante los cuales estos compuestos mejoran la colitis 33 experimental y así apoyar el uso de los polifenoles como tratamiento de la EII. VI. Conclusiones 1. El polifenol RA-303 encapsulado en nanovesículas atenuó los signos externos de la colitis, tales como la presencia de diarrea, el sangrado rectal y la pérdida de peso, así como también disminuyó el acortamiento del colon observado en los animales que recibieron DSS. 2. El tratamiento con el polifenol indujo una importante reducción en el infiltrado neutrofílico, evidenciado por el descenso en la actividad de la enzima MPO, así como en los niveles de la citocina pro-inflamatoria TNF-α. 3. Entre los mecanismos implicados destaca el descenso en la expresión de la enzima COX-2. 4. El tratamiento con el polifenol RA-303 vehiculizado en nanovesículas resultó ser más efectivo que cuando se encuentra en la forma libre, e interesantemente, la dosis de 5 mg/Kg demostró mejores resultados que las dosis mayores. 34 VII. Bibliografía Ahluwalia B, Moraes L, Magnusson MK, Öhman L. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease and mechanisms of biological therapies. 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