Nuevos mecanismos moleculares de regulación de la carotenogénesis en Fusarium oxysporum.

! Departamento de Genética Universidad de Sevilla Nuevos mecanismos moleculares de regulación de la carotenogénesis en Fusarium oxysporum Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor en Biología por la Licenciada Obdulia Parra Rivero Tesis realizada bajo la dirección del Dr. Francisco Javier Ávalos Cordero y la Dra. María del Carmen Limón Mirón en el Departamento de Genética de la Facultad de Biología de la Universidad de Sevilla Sevilla, 2018 Dr. Francisco Javier Ávalos Cordero Dra. María del Carmen Limón Mirón Obdulia Parra Rivero ! ! ! ! ! ! ! ! ! INDICE! INTRODUCCIÓN*......................................................................................................................*7! Género*Fusarium*............................................................................................................................*7! Fusarium(oxysporum!....................................................................................................................................!7! Carotenoides*....................................................................................................................................*9! Naturaleza!química!de!los!carotenoides!.............................................................................................!9! Funciones!de!los!carotenoides!.................................................................................................................!9! Funciones!de!los!carotenoides!en!los!animales!y!las!plantas!.................................................................!9! Función!de!los!carotenoides!en!los!hongos!.................................................................................................!11! Síntesis!de!los!carotenoides!en!los!hongos!.....................................................................................!11! Síntesis!de!los!carotenoides!en!Fusarium!.....................................................................................................!14! Genes!de!la!ruta!de!carotenogénesis!en!Fusarium!.......................................................................!14! Regulación*de*la*carotenogénesis*...........................................................................................*17! Regulación!por!luz!......................................................................................................................................!17! Regulación!mediada!por!el!gen!carS!..................................................................................................!20! Regulación!por!factores!independientes!de!la!luz!y!el!gen!carS!............................................!23! OBJETIVOS*.............................................................................................................................*27! MATERIAL*Y*MÉTODOS*.....................................................................................................*31! Material*............................................................................................................................................*31! Material*Biológico*........................................................................................................................*31! Estirpe!de!Escherichia(coli!...................................................................................................................................!31! Estirpe!de!Saccharomyces(cerevisiae!..............................................................................................................!31! Vectores!de!clonación!y!plásmidos!.....................................................................................................!32! Medios!de!cultivo.!.......................................................................................................................................!33! Medio!de!cultivo!para!Escherichia(coli.!..........................................................................................................!33! Medio!de!cultivo!para!Saccharomyces(cerevisiae.!.....................................................................................!33! Medios!de!cultivo!para!Fusarium(oxysporum.!.............................................................................................!34! Métodos*...........................................................................................................................................*34! Crecimiento!y!mantenimiento!de!microorganismos!...................................................................!34! Condiciones!de!cultivo!para!Escherichia(coli!...............................................................................................!34! Condiciones!de!cultivo!para!Saccharomyces(cerevisiae!..........................................................................!35! Condiciones!de!cultivo!para!Fusarium(oxysporum!...................................................................................!35! Aislamiento!de!ácidos!nucleicos.!.........................................................................................................!36! Purificación!de!ADN!plasmídico!de!Escherichia(coli.!...............................................................................!36! Aislamiento!de!ADN!plasmídico!de!Saccharomyces(cerevisiae!............................................................!36! Extracción!de!ADN!de!Fusarium(oxysporum!................................................................................................!37! Extracción!de!ARN!de!Fusarium(oxysporum!................................................................................................!37! Manipulación!de!ácidos!nucleicos!.......................................................................................................!38! Electroforesis!de!ácidos!nucleicos!en!geles!de!agarosa!..........................................................................!38! Recuperación!de!fragmentos!de!ADN!en!geles!de!agarosa!...................................................................!38! Tratamientos!enzimáticos!de!ácidos!nucleicos!..........................................................................................!39! Cuantificación!de!ácidos!nucleicos!..................................................................................................................!39! Reacción!en!cadena!de!la!Polimerasa!(PCR)!...............................................................................................!39! Precipitación!de!ADN!............................................................................................................................................!43! Hibridación!de!ácidos!nucleicos!.......................................................................................................................!43! Transformación!genética!........................................................................................................................!46! Transformación!de!Escherichia(coli!................................................................................................................!46! ! ! Transformación!de!Saccharomyces(cerevisiae!............................................................................................!46! Transformación!de!Fusarium(oxysporum!.....................................................................................................!47! Inmunoprecipitación!de!cromatina!....................................................................................................!51! Extracción!de!cromatina!e!inmunoprecipitación!......................................................................................!51! Determinación!de!los!niveles!de!las!marcas!epigenéticas!.....................................................................!53! Bioinformática*...............................................................................................................................*54! Análisis!y!tratamiento!de!secuencias!.................................................................................................!54! Tratamiento!de!los!datos!de!RNA-Seq!...............................................................................................!54! RESULTADOS*........................................................................................................................*61! Capítulo*I.**ANÁLISIS*FUNCIONAL*DE*DOS*POSIBLES*GENES*PARA*PRECURSORES* DE*microARN*..................................................................................................................................*61! Introducción!.................................................................................................................................................!61! Resultados!.....................................................................................................................................................!65! Producción!de!carotenoides!en!las!estirpes!superproductoras!.........................................................!65! Transcripción!de!los!presuntos!genes!de!precursores!de!microARN!fox-mir-1!y!fox-mir2!....!65! Capítulo*II.**EFECTO*DE*LA*LUZ*Y*LA**MUTACIÓN*DEL*GEN*carS*SOBRE*EL* TRANSCRIPTOMA*DE*FUSARIUM/OXYSPORUM*....................................................................*77! Introducción!.................................................................................................................................................!77! Resultados!.....................................................................................................................................................!78! Efecto!de!la!mutación!carS!y!la!luz!sobre!el!transcriptoma!de!F.(oxysporum!................................!78! Capítulo*III.*CARACTERIZACIÓN*DEL*GEN*carP*...............................................................*103! Introducción!..............................................................................................................................................!103! Resultados!..................................................................................................................................................!104! Caracterización!del!transcrito!del!gen!carP!..............................................................................................!104! Orientación!del!gen!carP!...................................................................................................................................!106! Deleción!del!gen!carP!.........................................................................................................................................!109! Capítulo*IV.*CARACTERIZACIÓN*DEL*GEN*carF*................................................................*117! Introducción!..............................................................................................................................................!117! Resultados!..................................................................................................................................................!118! Caracterización!del!gen!carF!(Foxg_09306)!de!Fusarium!oxysporum!............................................!118! Expresión!del!gen!carF!......................................................................................................................................!119! Deleción!del!gen!carF!.............................................................................................................................!121! Capítulo*V.*REGULACIÓN*DEL*CLUSTER*car*A*NIVEL*DE*CROMATINA*.....................*129! Introducción!..............................................................................................................................................!129! Resultados!..................................................................................................................................................!131! Análisis!epigenético!sobre!los!genes!estructurales!de!la!carotenogénesis!....................!131! Marcas!de!activación!y!represión!en!los!genes!carRA!y!carB!............................................................!132! DISCUSIÓN*..........................................................................................................................*141! CONCLUSIONES*.................................................................................................................*157! BIBLIOGRAFÍA*...................................................................................................................*161! ! ANEXOS! ! !! ! ! ! Introducción!! ! ! ! ! ! Introducción! ! 7! INTRODUCCIÓN! Género!Fusarium! ! El!género!Fusarium!comprende!un!amplio!y!heterogéneo!grupo!de!ascomicetos! que!pertenecen!a!la!clase!Sordariomicetos,!orden!Hipocreales,!familia!Nectriaceae.!Se! encuentra!extensamente!distribuido!en!la!naturaleza!e!incluye!numerosas!especies,!la! mayoría! son! patógenas! de! ! vegetales! capaces! de! causar! marchitez! vascular! en! numerosos!cultivos!y!de!producir!toxinas!que!son!letales!para!los!animales!(Moss!y! Smith,!1984).!También!incluye!especies!no!patógenas,!saprófitas!y!parásitas!de!otros! organismos!entre!lo!que!se!incluyen!los!humanos!inmunodeprimidos!(Ortoneda!et!al,! 2004;!Vartivarian!et!al,!1993).! Fusarium! fue! definido! como! género! por! Link! en! 1809! (Booth,! 1971),! el! cual! reúne!a!numerosos!hongos!imperfectos!caracterizados!por!la!producción!de!conidios! sin! septo! y! fusiformes.! La! clasificación! del! género! Fusarium! en! especies! se! ha! visto! dificultada! históricamente! por! la! ausencia! de! ciclo! sexual! y! la! escasez! de! rasgos! morfológicos! fácilmente! observables.! Aunque! la! mayoría! de! las! especies! presentan! sólo!reproducción!asexual,!existen!excepciones.! Fusarium(oxysporum! Fusarium) oxysporum! se! describe! como! un! patógeno! de! plantas,! con! hifas! septadas! y! sin! ciclo! sexual! conocido! (estado! teleomórfico! o! peritecial),! capaz! de! parasitar! a! más! de! 120! cultivos! diferentes,! además! de! infectar! a! personas! inmunodeprimidas!(Pietro!et!al.,!2003).!Se!trata!de!un!patógeno!del!suelo,!utilizado! como!modelo!de!experimentación!para!estudiar!el!proceso!de!infección!sobre!plantas! y!el!mecanismo!de!virulencia!en!mamíferos!inmunodeprimidos.!! F.) oxysporum! constituye! por! sí! mismo! un! extenso! complejo! de! estirpes! y! variedades!patógenas!de!gran!diversidad!de!plantas.!Su!caracterización!morfológica!se! basa! en! la! forma! de! los! macroconidios! y! la! formación! de! clamidosporas! (Beckman,! 1987).! Los! aislados! de! patógenos! de! plantas! de! F.) oxysporum! producen! marchitez! vascular!en!una!especie!vegetal!determinada!y!se!han!clasificado!como!forma)specialis! basándose! en! las! especies! hospedadoras! (Armstrong! y! Armstrong,! 1981).! Se! han! descrito!más!de!120!formae)speciales!diferentes!(Hawksworth!et!al.,!1995).!La!especie! objeto!de!estudio!de!esta!Tesis!es!la!forma)specialis!Lycopersici,!que!es!patógena!del! tomate!(Lycopersicon!esculentum).! Introducción! ! 8! ! Figura! 1.!Tipos! de! esporas! en! Fusarium:! A! Macroconidios.! B!Microconidios.! C!Clamidoporas.! Modificada!de!Miguel-Rojas,!2014.! F.)oxysporum!carece!de!ciclo!sexual!conocido.!La!fusión!de!hifas!vegetativas!y!la! formación!de!heterocariontes!entre!los!individuos!se!ha!sugerido!como!una!forma!de! transferencia! horizontal! de! genes! entre! los! distintas! estirpes,! que! se! restringe,! generalmente,!a!las!cepas!compatibles!y!con!genotipos!similares!(Kistler,!1997).! Debido! a! la! predominancia! de! su! reproducción! asexual,! F.) oxysporum!es! generalmente!considerado!como!un!“complejo!de!especies”,!es!decir,!un!conjunto!de! líneas! clonales! dentro! del! género! Fusarium! aisladas! genéticamente.! Como! tal,! constituye! un! grupo! similar! al! ! complejo! de! especies! de! Gibberella) fujikuroi,!que! alberga!especies!sexuales!con!teleomorfos!de!Gibberella,!como!Fusarium)verticillioides! y!Fusarium)fujikuroi!(Guadet!et!al.,!1989).!! F.) oxysporum!presenta! una! textura! algodonosa! con! una! coloración! que! varía! desde!el!rosa!pálido!al!púrpura!oscuro!dependiendo!de!las!condiciones!de!cultivo.!La! velocidad!de!crecimiento,!el!tamaño,!la!forma!e!incluso!la!cantidad!de!conidios!que! produce!o!el!número!de!septos!de!sus!hifas!son!variables!(Booth,!1971).!Los!conidios! de! F.) oxysporum! pueden! ser! de! tres! tipos.! Los! macroconidios! representan! los! más! típicos!del!género,!aunque!son!los!menos!abundantes.!Son!septados,!con!un!número! de!células!que!oscilan!entre!tres!y!cinco,!puntiagudos!e!inclinados!hacia!los!extremos! en! forma! de! media! luna.! Los! microconidios,! con! una! o! dos! células,! son! los! más! abundantes!y!presentan!formas!ovaladas!y!cilíndricas.!Por!último!las!clamidosporas,! formadas!por!una!o!dos!células,!son!esféricas!y!al!tener!la!pared!engrosada!son!las!más! resistentes!(Agrios,!1997)!(Figura!1).!Este!hongo!se!encuentra!prácticamente!en!todos! los!ecosistemas!terrestres.!Su!vía!de!propagación!en!los!cultivos!es!principalmente!a! distancias!cortas,!a!través!de!la!irrigación!o!por!el!uso!de!equipos!contaminados.!Sin! embargo,!puede!propagarse!a!largas!distancias!a!través!del!transporte!de!conidios!por! el!viento!(Agrios,!1997).!! ) F.) oxysporum! puede! permanecer! largos! períodos! de! tiempo! en! el! suelo,! principalmente! como! clamidospora! o! creciendo! en! restos! de! materia! orgánica! o! exudados!de!raíces! (estado! saprofítico)!(Beckman,! 1987).! Las!clamidosporas!pueden! Introducción! ! 9! permanecer!en!estado!latente!hasta!que!se!estimula!la!germinación!por!los!nutrientes! liberados!de!las!raíces.!La!invasión!de!las!raíces!es!seguida!por!la!penetración!del!tallo! (estado! parasítico),! la! colonización! de! los! tejidos! vasculares! y! el! desarrollo! de! la! enfermedad!(estado!patogénico),!produciendo!la!marchitez!vascular!sistémica!(Agrios,! 2005).!Mientras!la!planta!está!viva,!el!crecimiento!del!hongo!se!limita!a!los!tejidos!del! xilema! y! a! algunas! células! adyacentes.! Solo! cuando! la! planta! muere,! el! hongo! se! desarrolla! fuera! del! sistema! vascular,! en! las! células! adyacentes! del! parénquima,! produciendo!grandes!cantidades!de!conidios!y!clamidosporas!(Agrios,!2005).!! ! Carotenoides! Naturaleza!química!de!los!carotenoides! Los!carotenoides!son!pigmentos!tetraterpenoides!procedentes!de!la!fusión!de! dos!moléculas!de!geranilgeranil!pirofosfato!(GGPP),!presentes!en!todos!los!organismos! fotosintéticos,!pero!producidos!también!por!muchas!bacterias!y!hongos!(Britton!et!al.,! 1998).! Son! moléculas! lineales! hidrocarbonadas! de! longitud! variable,! con! dobles! enlaces! conjugados,! que! pueden! presentar! anillos! cerrados! en! los! extremos! de! la! cadena.! Según! las! sustituciones! que! presente,! se! clasifican! en! (I)! carotenos,! los! formados! sólo! por! carbono! e! hidrógeno,! o! (II)! xantofilas,! que! contienen! además! oxígeno.! Los! dobles! enlaces! conjugados! les! confieren! la! capacidad! de! absorber! radiación!del!espectro!visible!y!son!responsables!del!color!característico!de!cada!uno! de!ellos,!habitualmente!en!el!rango!del!rojo!al!amarillo.!El!color!de!cada!carotenoide! depende! tanto! del! número! de! dobles! enlaces! conjugados,! como! de! la! presencia! de! anillos!en!la!molécula.! Funciones!de!los!carotenoides! Funciones!de!los!carotenoides!en!los!animales!y!las!plantas!! Como!se!ha!mencionado!anteriormente,!los!carotenoides!están!presentes!en!la! mayoría!de!los!seres!vivos.!Sin!embargo,!salvo!muy!raras!excepciones!en!insectos,!los! animales!no!son!capaces!de!sintetizarlos.!! Los!carotenoides!son!esenciales!en!las!plantas,!ya!que!están!involucrados!en! diversos!procesos!biológicos,!como!el!ensamblaje!del!fotosistema,!la!recepción!de!la! luz,!la!fotoprotección,!el!“quenching”!(extinción!de!singletes!de!oxígeno!molecular)!y!la! fotomorfogénesis! (Cuttriss! y! Pogson,! 2006).! Su! presencia! es! abundante,! aunque! normalmente! se! ven! enmascarados! por! la! clorofila.! Su! función! en! organismos! fotosintéticos! es! actuar! como! pigmentos! fotorreceptores,! absorbiendo! la! luz! y! transfiriéndola!en!forma!de!energía!a!los!centros!de!reacción!de!la!fotosíntesis!(Edge!et! al.,!1997).!En!las!plantas,!los!carotenoides!proporcionan!también!colores!llamativos!a! Introducción! ! 16! Los!genes!de!Fusarium!responsables!de!los!pasos!desde!toruleno!a!NX!han!sido! recientemente! descritos.! La! búsqueda! de! genes! para! otras! supuestas! oxigenasas! de! carotenoides!en!la!base!de!datos!del!genoma!de!Fusarium!permitió!identificar!el!gen! carT,!cuya!función!fue!revelada!por!la!presencia!de!una!mutación!en!dicho!gen!en!un! mutante! que! acumula! toruleno! y! por! su! complementación! genética! con! el! alelo! silvestre! de! carT! (Prado-Cabrero! et! al.,! 2007a).! Como! confirmación! bioquímica,! la! enzima! CarT! purificada! se! comprobó! que! realiza! in) vitro! el! corte! del! toruleno! para! producir!β-apo-4’carotenal.!Otras!investigaciones!mostraron!que!la!mutación!dirigida! de!su!ortólogo!en!N.)crassa,!cao-2,!provoca!el!bloqueo!en!la!producción!de!NX!y!la! acumulación!de!toruleno!(Saelices!et!al.,!2007).!Estos!datos!establecen!una!nueva!clase! de!enzima!en!la!familia!de!las!oxigenasas!de!carotenoides.!La!función!del!gen!carT!en!la! carotenogénesis!de!Fusarium,!junto!con!carRA!y!carB,!fue!confirmada!por!la!mutación! dirigida!de!los!genes!en!Gibberella)zeae,!teleomorfo!de!Fusarium)graminearum!(Jin!et! al.,!2010).! El!producto!del!gen!carT,!el!β-apo-4’carotenal,!requiere!de!una!oxidación!para! producir!NX.!El!gen!responsable!de!este!paso!se!descubrió!por!primera!vez!en!N.)crassa! gracias! al! estudio! del! mutante! ylo,! llamado! así! por! su! color! amarillo.! Este! mutante! exhibe! un! desconcertante! fenotipo,! con! un! contenido! complejo! contenido! en! carotenoides!que!varía!con!las!condiciones!de!cultivo!y!que!no!incluye!NX!(Goldie!y! Subden,!1973;!Sandmann,!1993).!El!gen!responsable!de!esta!mutación,!ylo-1,!codifica! una!aldehído!deshidrogenasa!y!media!el!último!paso!de!la!biosíntesis!de!NX,!como!se! demostró! con! la! complementación! de! la! mutación! de! ylo-1! y! con! la! capacidad! de! purificar!la!proteína!YLO-1!para!convertir!β-apo-4’carotenal!en!NX!in)vitro)(Estrada!et! al.,! 2008).! Este! descubrimiento! permitió! la! identificación! de! su! gen! ortólogo! en! F.) fujikuroi,!llamado! carD! (Díaz-Sánchez!et! al.,!2011a).! La! función!de! carD!se!confirmó! mediante!su!mutación!dirigida,!que!daba!lugar!a!una!pérdida!de!NX!y!una!acumulación! inusual!de!carotenoides,!interpretados!como!derivados!del!β-apo-4’carotenal.! El!gen!necesario!para!la!ruptura!del!toruleno,!carT!y!el!gen!necesario!para!la! oxidación!final!a!NX,!carD,!se!ubican!en!otras!regiones!del!genoma!distintas!del!cluster) carX/carRA/carB/carO! (Figura! 3).! Esta! organización! genómica! se! conserva! en! los! genomas!de!otras!especies!de!Fusarium!disponibles!en!la!base!de!datos!(revisado!por! Avalos!et!al.,!2017).!! De!lo!expuesto!anteriormente!cabe!destacar!la!sinergia!que!ha!existido!entre! las! investigaciones! sobre! los! genes! de! la! ruta! de! carotenogénesis! en! N.) crassa!y! F.) fujikuroi.! Sin! embargo,! a! pesar! de! las! similitudes! aparentes,! existen! diferencias! llamativas!entre!ambos!hongos!en!cuanto!a!la!bioquímica!y!la!regulación!de!la!ruta.!Un! ejemplo!es!la!combinación!de!análisis!de!mutantes!y!estudios!enzimáticos!que!indican! que!en!N.)crassa!el!orden!en!el!que!se!producen!las!reacciones!puede!diferir!aunque!el! Introducción! ! 17! ! Figura!3.!Organización!genómica!de!los!genes!responsables!de!la!carotenogénesis!en!Fusarium.! Los!genes!ggs1,!carT!y!carD!no!se!encuentran!agrupados!con!el!resto!de!los!genes!estructurales.! Los!huecos!en!los!genes!representan!los!intrones.!Modificado!de!Avalos!et!al.,!2017.! producto! final! de! la! ruta! sea! el! mismo.! En! ciertas! condiciones! de! cultivo! se! ha! encontrado! en! N.) crassa! apo-4’-licopenal! y! ácido! apo-4’-licopenoico! como! intermediarios,!lo!que!indica!que!la!reacción!de!ciclación!llevada!a!cabo!por!AL-2!actúa! en!el!último!paso!de!la!ruta!(Estrada!et!al.,!2008).! ! Regulación!de!la!carotenogénesis! ! Regulación!por!luz! Las! primeras! observaciones! en! F.) oxysporum! revelaron! que! la! iluminación! promueve!la!acumulación!de!carotenoides!en!el!micelio!(Carlile,!1956).!Los!primeros! estudios! del! efecto! de! la! luz! sobre! la! carotenogénesis! se! llevaron! a! cabo! en! F.) aquaeductuum.! En! una! investigación! inicial,! se! centraron! en! el! efecto! de! la! temperatura!en!la!fotoinducción.!La!cinética!de!respuesta!a!la!exposición!a!luz!muestra! una! acumulación! gradual! de! carotenoides! que! alcanzaba! un! máximo! aproximadamente!a!las!12!horas!después!del!inicio!de!la!iluminación.!Sin!embargo,!el! contenido! en! carotenoides! aumentaba! lentamente! durante! al! menos! tres! días! de! cultivo!bajo!luz!continua!(Rau,!1967).!Respecto!al!efecto!de!la!temperatura,!la!síntesis! de!carotenoides!coloreados!disminuye!a!bajas!temperaturas,!mientras!que!la!reacción! primaria! a! la! luz,! presuntamente! un! proceso! fotoquímico,! es! independiente! de! la! temperatura!en!el!rango!de!5-25!°C.! La! fotoinducción! no! es! efectiva! en! condiciones! anaerobias,! como! indica! la! pérdida! de! acumulación! de! carotenoides! si! el! micelio! iluminado! se! transfiere! a! una! atmósfera!carente!de!oxígeno!(Rau,!1971).!Sin!embargo,!el!estado!de!fotoinducción!se! mantiene,! como! indica! el! inicio! de! la! biosíntesis! de! carotenoides! si! las! condiciones! aeróbicas! se! restauran,! incluso! en! la! oscuridad.! Con! aireación,! la! fotoinducción! requiere!la!síntesis!de!proteínas,!como!lo!muestra!la!pérdida!de!respuesta!si!se!añade! cicloheximida!al!cultivo!antes!o!inmediatamente!después!de!la!exposición!a!la!luz!(Rau,! 1967).!Como!ocurre!con!la!anaerobiosis,!la!retirada!de!la!cicloheximida!permite!que! arranque!la!acumulación!de!carotenoides!en!cualquier!momento!en! la! oscuridad,! al! Introducción! ! 18! menos!dentro!de!las!primeras!30!horas,!indicando!de!nuevo!una!alta!estabilidad!del! estado!de!inducción!del!sistema!de!fotorrecepción.! En!F.)aquaeductuum,!el!efecto!de!la!luz!puede!ser!reemplazado!parcialmente! por! la! adición! de! reactivos! sulfidrilos! oxidantes,! como! el! p-cloro! y! p-hidroximercuribenzoato!(Rau,!1967;!Rau!et!al.,!1967),!o!el!peróxido!de!hidrógeno,!reactivo! oxidativo,!sugiriendo!que!la!oxidación!de!los!grupos!–SH!juegan!un!papel!en!el!sistema! de! detección! de! la! luz.! En! consecuencia,! la! fotoinducción! desaparece! si! se! añaden! agentes!reductores,!como!el!ditionito!y!la!hidroxilamina,!pero!la!respuesta!se!recupera! si! se! retira! el! agente! reductor,! indicando! la! recuperación! del! sistema! fotorreceptor! (Theimer! y! Rau,! 1970).! Sin! embargo,! mientras! que! una! corta! exposición! de! luz! es! suficiente!para!sostener!la!fotoinducción,!el!p-hidroximercuribenzoato!debe!estar!todo! el!tiempo!presente!para!mantener!su!efecto!estimulante,!y!tal!estimulación!es!aditiva! con!la!de!la!luz!(Theimer!y!Rau,!1972)!lo!que!indica!diferentes!mecanismos!de!acción.! Además,!el! p-hidroximercuribenzoato! añadido! en! la!oscuridad! no!tiene! efecto! en!F.) fujikuroi,!y!en!su!presencia!muestra!una!fotoinducción!similar!(Avalos!y!Cerdá-Olmedo,! 1986).! En! N.) crassa,! un! hongo! con! espectro! de! acción! similar! para! la! biosíntesis! de! carotenoides!inducida!por!luz!(De!Fabo!et!al.,!1976),!la!fotoinducción!es!totalmente! dependiente!del!complejo!White!Collar,!que!consiste!en!dos!fotorreceptores!WC-1!y! WC-2! (revisado! por! Fischer! et! al.,! 2016).! Sin! embargo,! los! mutantes! de! los! genes! ortólogos! wc-1,! llamados! wcoA!en! F.) fujikuroi! (Estrada! y! Avalos,! 2008)! y! wc1!en! F.) oxysporum!(Ruiz-Roldán!et!al.,!2008)!conservan,!con!diferentes!grados!de!eficiencia,!la! producción! de! carotenoides! en! luz! continua.! La! mutación! dirigida! de! los! genes! ortólogos!wc-1!y!wc-2!en!F.)graminearum,!fgwc-1!y!fgwc-2,!provocó!una!pigmentación! pálida!en!la!superficie!de!las!colonias!bajo!la!luz,!pero!los!niveles!de!carotenoides!no!se! determinaron!químicamente!ni!en!la!estirpe!silvestre!ni!en!los!mutantes!(Kim!et!al.,! 2014).! El!análisis!de!la!acumulación! de! carotenoides!en!cultivos!en!cajas!reveló!dos! respuestas! en! F.) fujikuroi,! primero,! una! respuesta! rápida! dependiente! del! fotorreceptor! WcoA! y! una! segunda! fase! de! acumulación! de! carotenoides! más! lenta! que! depende! de! una! flavoproteína,! el! criptocromo! DASH! CryD! (Castrillo! y! Avalos,! 2015).!La!fotoactividad!de!este!criptocromo!se!demostró!experimentalmente!(Castrillo! et!al.,!2015)!y!su!participación!como!segundo!fotorreceptor!explica!el!mantenimiento! de!la!acumulación!de!carotenoides!en!los!mutantes!wcoA)en!iluminación!continua.!Los! fotorreceptores! WcoA! y! CryD! no! sólo! están! involucrados! en! la! regulación! de! la! carotenogénesis,! como! indica! la! alteración! en! la! producción! de! otros! pigmentos! y! metabolitos! secundarios! en! sus! correspondientes! mutantes.! En! el! caso! del! mutante! ΔwcoA!las!alteraciones!se!observan!incluso!en!la!oscuridad.! Introducción! ! 19! ! Figura! 5.!Cinética! de! expresión! de! los! genes! estructurales,! carRA!y! carB) en! la! estirpe! silvestre! 4287!de!F.)oxysporum.!Los!niveles!de!los!transcritos! se!determinaron!por!PCR!cuantitativa!a!tiempo!real!y! se!refirieron!al!gen!de!la!β-tubulina.!A!los!niveles!de! cada! gen! en! oscuridad! se! les! dió! el! valor! 1.! Modificado!de!Rodríguez-Ortíz,!2012. ! ARNm!(cantidad!relativa)! Tiempo!de!Iluminación!(min)! La! fotoinducción! de! la! carotenogénesis! en! Fusarium) (Figura! 4)! se! manifiesta! externamente!por!la!adquisición!de!pigmentación!anaranjada!del!micelio!crecido!en!la! oscuridad!en!un!margen!de!horas,!y!conlleva!un!rápido!incremento!de!los!niveles!de! transcritos!de!la!mayoría!de!los!genes!estructurales.!Los!experimentos!de!northern)blot! en! F.) fujikuroi) mostraron! una! cinética! de! inducción! similar! en! los! cuatro! genes! del! cluster!car,!carRA,)carB,)carO!(Prado!et!al.,!2004)!y!carX)(Thewes!et!al.,!2005),!al!igual! que!carT!(Prado-Cabrero!et!al.,!2007a).!! ! Los! transcritos! de! estos! genes! alcanzan! su! máximo! nivel! tras! una! hora! de! exposición! a! la! luz! y! después! caen! lentamente,! un! fenómeno! que! se! conoce! como! fotoadaptación.!Este!patrón!de!fotoinducción!se!ha!confirmado!por!RT-qPCR!y!se!ha! observado!también!en!F.)oxysporum!(Rodríguez-Ortiz!et!al.,!2012)!(Figura!5),!y!en!F.) verticilloides) (Adám! et! al.,! 2011).! La! fotorrespuesta! transcripcional! es! similar! a! la! mostrada! por! los! genes! ortólogos! en! N.) crassa! (revisado! por! Avalos! y! Corrochano,! 2013),! con! excepción! del! gen! al-3! (GGPP! sintasa),! que! muestra! en! este! hongo! una! fuerte! fotoinducción! mientras! que! su! ortólogo! en! F.) fujikuroi!ggs1,! se! ve! menos! afectado!por!la!luz!(Mende,!et!al.,!1997).!! ! Datos!recientes!de!secuenciación!masiva!de!ARN!han!revelado,!sin!embargo,! una! fotoinducción! significativa! en! los! niveles! de! ARNm! de! este! gen! en! F.) fujikuroi) (Avalos! et! al.,! 2017).! El! gen! carD!de! F.) fujikuroi! muestra! una! fotorrespuesta! menor! (Estrada! et! al.,! 2008),! lo! cual! se! confirmó! con! los)datos! de! ARN-Seq! (Avalos! et! al.,! Figura! 4.!Fotoinducción! de! la! carotenogénesis! en! el! silvestre! de! F.) oxysporum!cultivada! durante! 7! días!en! condiciones! de! oscuridad! y! bajo! iluminación! continua.! Modificado!de!Rodríguez-Ortíz,!2012.! Introducción! ! 20! 2017).! Sin! embargo,! no! se! detectó! fotoinducción! en! el! caso! de! su! ortólogo! de! N.) crassa,!ylo-1)(Díaz-Sánchez!et!al.,!2011a).! El!estudio!de!la!fotoinducción!transcripcional!de!los!genes!estructurales!de!la! carotenogénesis! en! los! mutantes! de! los! genes) wcoA!y! cryD! refleja! los! diferentes! mecanismos!de!acción!de!los!fotorreceptores!que!codifican!(Castrillo!y!Avalos,!2015).! Tras!la!iluminación,!los!mutantes!wcoA!muestran!fotoinducción!de!la!carotenogénesis,! pero!acumulan!carotenoides!más!lentamente!y!su!concentración!no!alcanza!los!valores! de!la!estirpe!silvestre.!Sin!embargo,!el!contenido!de!carotenoides!y!los!niveles!de!ARN! mensajeros! de! los! genes! estructurales! son! mucho! más! bajos! en! la! oscuridad! en! los! mutantes!wcoA!que!en!la!estirpe!silvestre.!Es!más,!la!fotoinducción!transcripcional!de! los!genes! car! está! básicamente!ausente! en!los! mutantes! wcoA,! con! niveles!de! ARN! mensajeros! después! de! la! iluminación! más! bajos! que! en! la! estirpe! silvestre! en! oscuridad.! Por! lo! tanto,! la! inducción! de! la! carotenogénesis! por! fotorreceptores! alternativos,! presuntamente! CryD,! debe! darse! a! través! de! un! mecanismo! independiente!de!la!transcripción.!La!base!molecular!de!tal!mecanismo!aún!no!se!ha! esclarecido!(revisado!por!Avalos!et!al.,!2017).! La!caída!de!los!niveles!de!ARN! mensajero! después!de!la!fotoinducción!se!ha! investigado!en!detalle!en!N.)crassa.!En!este!hongo,!el!pequeño!fotorreceptor!de!flavina! VIVID!(VVD),!juega!un!papel!en!la!desactivación!del!sistema!fotorreceptor!WC!después! de! la! iluminación! (revisado! por! Avalos! y! Corrochano,! 2013).!Por! el! contrario,! la! mutación!del!ortólogo!de!VVD!en!F.)fujikuroi,!llamado!vvdA,!provoca!una!disminución! en!la!acumulación!de!carotenoides!en!este!hongo!(Castrillo!y!Avalos,!2014).!La!cinética! de! carotenogénesis! en! los! mutantes! vvdA! muestra! una! rápida! acumulación! de! carotenoides!inmediatamente!después!de!la!exposición!de!la!luz,!consistente!con!una! atenuación!por!VvdA!de!la!fotoinducción!mediada!por!WcoA,!pero!la!acumulación!es! más!lenta!después!de!estar!creciendo!un!tiempo!prolongado!bajo!la!luz,!sugiriendo!una! función!de!regulación!positiva!durante!el!segundo!estadio!de!fotoinducción.!! Regulación!mediada!por!el!gen!carS!! El! desarrollo! de! protocolos! de! mutagénesis! permitió! la! identificación! de! mutantes! de! Fusarium! afectados! en! la! síntesis! de! carotenoides,! fácilmente! distinguibles! por! sus! cambios! de! pigmentación! (Figura! 6).! Los! mutantes! pueden! ser! albinos!en!la!luz,!en! cuyo! caso! pueden!tener!afectadas!las!enzimas!de! los! primeros! pasos! de! la! ruta! o! tener! una! mutación! regulatoria,! o! pueden! tener! pigmentación! anaranjada! en! la! oscuridad,! en! cuyo! caso! son! mutantes! necesariamente! de! la! regulación.!Los!mutantes!fuertemente!pigmentados!en!oscuridad!se!han!descrito!en!F.) fujikuroi!(Avalos!y!Cerdá-Olmedo,!1987)!y!F.)oxysporum!(Rodríguez-Ortiz!et!al.,!2012)!y! se! les! denomina! genéricamente! mutantes! carS.! Estos! mutantes,! que! han! recibido! especial!atención!en!F.)fujikuroi,!acumulan!una!cantidad!creciente!de!carotenoides!a! Introducción! ! 21! ! Figura!6.!Fenotipo!del!micelio!y!las!esporas!de! la!estirpe!silvestre!4287!de!F.)oxysporum!y!su! mutante! carS,! SX2! en! oscuridad! y! en! luz.! Los! micelios!se!cultivaron!durante!7!días!tanto!en! condiciones! de! oscuridad! como! de! luz.! Modificado!de!Avalos!et!al.,!2017.! ! medida! que! el! cultivo! envejece! (Avalos! y! Cerdá-Olmedo,! 1986)! y! tienen! cantidades! elevadas!de!ARNm!de!los!genes!estructurales,!desde!carRA!hasta!carD!(Thewes!et!al.,! 2005;!Prado-Cabrero!et!al.!2007b;!Díaz-Sánchez!et!al.,!2011a;!Prado!et!al.,!2004).!A! causa!de!su!alto!contenido!en!carotenoides,!el!efecto!de!la!luz!es!menos!aparente!en! los!mutantes!carS,!pero!estudios!de!expresión!han!encontrado!una!fotoinducción!de! los!niveles!de!los!transcritos!de!los!genes!estructurales!tanto!en!mutantes!carS!de!F.) fujikuroi!(Prado-Cabrero!et!al.,!2007b)!como!de!F.)oxysporum!(Rodríguez-Ortiz!et!al.,! 2012),!la!cual!ha!sido!corroborado!en!análisis!de!ARN-Seq!en!ambas!especies!(Figura!7! y!resultados!del!Capítulo!2).!! ! La!composición!cualitativa!de!los!carotenoides!acumulados!por!mutantes!carS! de!dos!fondos!genéticos!diferentes!de!F.) fujikuroi,!obtenidos!a!partir!de!las!estirpes! silvestres! IMI! 58289! y! FKMC! 1995,! respectivamente,! es! similar! (Avalos! et! al.! 2017).! Ambos! mutantes! contienen! una! mezcla! de! carotenoides! con! los! mismos! intermediarios!que!la!de!ambas!estirpes!silvestres!en!condiciones!de!iluminación.!! Debido! a! su! intensa! pigmentación,! los! mutantes! carS! se! han! usado! como! herramientas!para!detectar!mutantes!con!alteraciones!en!la!mezcla!de!intermediarios! de! carotenoides.! Por! ejemplo,! sirvieron! para! la! identificación! de! mutantes! que! acumulan!toruleno!(Avalos!y!Cerdá-Olmedo,!1987)!o!mutantes!con!alteraciones!en!el! reconocimiento!del! sustrato! de!la!desaturasa! CarB! (Prado-Cabrero!et! al.,! 2009).! Los! mutantes! carS! han! sido! un! fondo! genético! óptimo! para! comprobar! el! efecto! de! posibles! inhibidores! de! la! carotenogénesis! de! Fusarium,! demostrando! la! eficiencia! diferencial!de!algunos!inhibidores!de!ciclasas,!que!sin!embargo!eran!muy!activos!en!! otras!especies!(Avalos!y!Cerdá-Olmedo!1986).! Introducción! ! 22! ! El! gen! responsable! del! fenotipo! carS! se! identificó! a! partir! de! mutantes! anaranjados! de! F.) oxysporum! obtenidos! por! inserción! del! ADN-T! de! Agrobacterium) tumefaciens.!El!proceso!que!llevó!a!conocer!la!secuencia!del!gen!carS!se!describe!en!la! introducción!del!Capítulo!1.!Una!vez!conocida!la!secuencia,!se!comprobó!que!todos!los! mutantes!carS!conocidos!hasta!ese!momento!tienen!mutaciones!en!dicho!gen.!Además! se! demostró! que! la! mutación! dirigida! del! mismo! provoca! un! incremento! de! la! concentración! de! carotenoides! (Rodríguez-Ortiz! et! al.,! 2012)! así! como! que! la! complementación!de!la!mutación!carS!en!F.)fujikuroi!restablecía!el!fenotipo!silvestre! (Rodríguez-Ortiz!et!al.,!2013).! El! gen! carS! codifica! una! proteína! de! la! familia! “RING! finger”! (RF)! con! una! secuencia!similar!a!la!de!la!proteína!CrgA!de!M.)circinelloides,!cuya!mutación!provoca! también!superproducción!de!carotenoides!(Navarro!et!al.,!2001;!Lorca-Pascual!et)al.,! 2004).!El!grado!de!similitud!entre!las!proteínas!CarS!y!CrgA!no!es!muy!alto,!lo!cual!no! es! sorprendente! al! proceder! de! dos! hongos! muy! distantes! taxonómicamente,! pero! ambas!proteínas!comparten!los!dominios!más!relevantes.!Estos!incluyen!2!dominios!RF! en!la! región! del!extremo!amino,! uno!de!ellos! inicialmente!ignorado! en! CarS!por! un! error!de!asignación!de!un!intrón!en!la!anotación!del!genoma!de)F.) fujikuroi) (RugerHerreros,!2016),!y!un!dominio!de!proteasa!LON!(Navarro!et!al.,!2000).!Por!el!contrario,! estos!dominios!sí!estaban!presentes!en!la!anotación!del!genoma!F.)oxysporum.!! CrgA!tiene!además!dos!regiones!ricas!en!glutaminas!y!un!sitio!de!isoprenilación! próximo!al!extremo!carboxilo!terminal.!En!cambio,!CarS!no!parece!tener!zonas!ricas!en! glutaminas!o! están! poco!representadas! y! carece!de!sitio! de! isoprenilación.! En! otras! proteínas,!los!dominios!RF!interactúan!con!una!enzima!ligasa!de!ubiquitina!tipo!3!(E3),! que! media! la! ubiquitinación! de! proteínas! dianas,! frecuentemente! como! una! marca! Figura!7.!Efecto!de!la!luz!y!la!mutación!carS!en!los!niveles!relativos!de!ARNm!de!los!genes!implicados! en!el! metabolismo! de!carotenoides! en! F.) fujikuroi.!Los!genes!se!han!agrupado!de!acuerdo!a!sus! funciones,!ggs1,!carRA,!carB,!carT!y!carD!para!la!biosíntesis!de!NX,!y!carX!y!carO!para!la!biosíntesis! de!retinal.!Modificado!de!Avalos!et!al.,!2017. ! Introducción! ! 23! para!su!degradación.!La!función!de!CrgA!de!M.)circinelloides!ha!recibido!considerable! atención!y!la!información!disponible!puede!proporcionar!pistas!del!posible!mecanismo! de!acción!de!CarS!en!Fusarium.!Al!menos!uno!de!los!dominios!RF!de!CrgA!es!esencial! para! su! función! reguladora! en! la! carotenogénesis,! sugiriendo! que! éste! podría! funcionar! como! una! ligasa! de! ubiquitina! tipo! 3! (Lorca-Pascual! et! al.,! 2004).! Sin! embargo,! CrgA! interactúa! con! una! de! las! tres! proteínas! del! complejo!WC! de! M.) circinelloides,!MCWC-1b!para!desencadenar!su!degradación!a!través!de!un!mecanismo! independiente!de!ubiquitinación!(Silva!et!al.,!2008).!! Hay!otras!similitudes!de!función!entre!CrgA!y!CarS.!En!primer!lugar,!tal!como!se! observó! en! los! mutantes! carS!de! Fusarium,! los! mutantes! crgA!de! M.) circinelloides! mantienen!la!fotoinducción!de!la!biosíntesis!de!carotenoides!(Navarro!et!al.,!2001).!En! segundo!lugar,! ambas! proteínas!están! involucradas! en!otros! procesos! además!de! la! carotenogénesis,!apuntando!a!funciones!reguladoras!más!amplias.!Esta!conclusión!se! basa!en! la!alteración! del!crecimiento! y!la! esporulación!de! los! mutantes! crgA!de!M.) circinelloides)(Quiles-Rosillo!et!al.,!2003;!Murcia-Flores,!et!al.,!2007)!y!en!la!producción! de!bicaverina!y!giberelinas!en!los!mutantes!carS!de!F.)fujikuroi!(Candau!et!al.,!1991;! Rodríguez-Ortiz!et!al.,!2009).! El! gen! carS) de! F.) fujikuroi! es! capaz! de! restaurar! la! producción! basal! de! carotenoides! si! se! introduce! en! mutantes! carS!de! F.) oxysporum,! aunque! no! se! recuperan! totalmente! los! niveles! normales! de! expresión! de! los! genes! estructurales,! indicando!que!su!función!está!conservada!en!ambas!especies!(Rodríguez-Ortiz,!et!al.! 2012).! !Regulación!por!factores!independientes!de!la!luz!y!el!gen!carS! La!disponibilidad!de!nitrógeno!controla!la!producción!de!diferentes!metabolitos! secundarios! en! Fusarium.! Un! buen! ejemplo! es! la! producción! de! giberelinas! y! de! bicaverina,! inducidas! por! la! ausencia! de! nitrógeno! a! través! de! una! compleja! red! reguladora!(Stud!y!Tudzynski,!2014).!Los!experimentos!con!micelio!inmovilizado!de!F.) fujikuroi) incubado!con!bajas!concentraciones!de!nitrógeno,!al!cual!se!le! añadió!más! tarde!nitrógeno!en!exceso,!revelaron!que!la!síntesis!de!carotenoides!es!más!activa!en! condiciones! de! hambre! de! nitrógeno! (Garbayo,! et! al.,! 2003).! El! efecto! negativo! del! nitrógeno! se! confirmó! cambiando! el! medio! cultivo! del! micelio! inmovilizado! a! diferentes! concentraciones! de! nitrógeno! y! observando! que! los! carotenoides! aumentaban! o! disminuían! dependiendo! de! las! condiciones! de! concentración! de! nitrógeno,!baja!o!alta!respectivamente,!indicando!que!el!efecto!represor!es!reversible.! El! efecto! estimulador! de! la! carotenogénesis! bajo! condiciones! de! hambre! de! nitrógeno! en! F.) fujikuroi,! tanto! a! nivel! de! ARN! mensajero! como! a! nivel! de! carotenoides,! es! aditivo! con! el! efecto! producido! por! la! luz! (Rodríguez-Ortiz! et! al.,! Introducción! ! 24! 2009),! lo! que! indica! mecanismos! de! acción! diferentes.! La! regulación! de! la! carotenogénesis!por!nitrógeno!se!ha!descrito!también!en)N.)crassa,)donde!los!niveles! de! ARNm! de! al-1!y! al-2! (ortólogos! de! carRA!y! carB,! respectivamente)! aumentan! considerablemente! en! condiciones! de! escasez! de! nitrógeno! comparado! con! las! condiciones!de!cultivo!estándar!de!nitrógeno,!tanto!en!la!estirpe!silvestre!!como!en!los! mutante!ciegos!wc!(Sokolvsky!et!al.,!1992).!La!regulación!por!nitrógeno!podría!estar! involucrada! en! el! control! de! la! expresión! a! nivel! de! cromatina,! como! indica! la! metilación! de! diferentes! histonas! encontradas! en! los! genes! del! cluster!car!en! un! mutante!de!metiltransferasa!KMT6!en!F.) graminearum!(Connolly!et!al.,!2013).!En!F.) fujikuroi,! la! expresión! de! varios! clusters! de! producción! de! metabolitos! secundarios! regulados!por!nitrógeno!está!asociada!a!la!acetilación!de!la!histona!H3!en!la!lisina!9! (H3K9ac)!(Wiemann!et!al.,!2013).!Esto!sugiere!un!mecanismo!similar!en!la!regulación! de!los!genes!estructurales!car,!lo!cual!es!tratado!en!el!Capítulo!5!de!resultados.! En!N.) crassa,! además! de! la! regulación! por! luz,!la! síntesis! de! carotenoides! es! estimulada!en!el!proceso!de!la!conidiación!por!un!mecanismo!independiente!de!la!luz! (revisado!por!Avalos!y!Corrochano,!2013).!En!realidad,!la!conidiación!se!estimula!por!la! luz!y!por!el!desarrollo!aéreo!en!ese!hongo,!que!destaca!por!la!producción!masiva!de! conidios! con! una! pigmentación! anaranjada! en! cultivos! de! agar.! La! conidiación! es! menos!abundante!en!Fusarium!y!la! síntesis! de!carotenoides!en!los!conidios! ha! sido! normalmente! ignorada.! Una! comparación! del! efecto! de! la! luz! en! la! cantidad! de! carotenoides!en!el!micelio!y!en!los!conidios!de!colonias!en!superficie!entre!la!estirpe! silvestre!y!un!mutante!carS!de!F.)oxysporum!mostró!la!conservación!de!la!regulación! en!los!conidios!por!luz!y!la!desregulación!en!el!mutante!carS!(Rodríguez-Ortiz,!2012).! La!baja!cantidad!de!carotenoides!en!los!conidios!de!la!estirpe!silvestre!incubada!en!la! oscuridad!indica!la!ausencia!de!inducción!asociada!al!desarrollo,!como!se!ha!descrito! en!N.)crassa.! La! localización! celular! de! la! biosíntesis! de! carotenoides! es! un! aspecto! regulatorio!que!ha!recibido!poca!atención.!A!causa!de!la!hidrofobicidad!natural!de!los! carotenoides,! se! asume! que! interactúan! con! membranas,! pero! su! distribución! subcelular! es! desconocida! en! Fusarium.! Un! acercamiento! bioquímico! basado! en! el! marcaje!específico!de!diferentes!terpenoides!(mevalonato!marcado!con!14C)!permitió! establecer! que! los! carotenoides! son! producidos! en! compartimentos! celulares! diferentes!a!aquellos!donde!se!sintetizan!las!giberelinas!y!los!esteroles!(Domenech!et! al.,! 1996).! Actualmente! se! están! realizando! experimentos! basados! en! la! fusión! de! proteínas! fluorescentes! para! visualizar! la! localización! física! de! las! enzimas! de! la! biosíntesis!de!carotenoides!en!Fusarium.! ! Objetivos! !! Material!y!Métodos! ! 32! Vectores!de!clonación!y!plásmidos! ! ● pGEM-T! easy! (Promega! A1360):! Plásmido! que! contiene! un! gen! de! resistencia! a! ampicilina.! Está! abierto! en! el! sitio! de! corte! de! la! enzima! EcoRV! y! posee!en!su!extremo!3’!una!cola!de!timinas!para!facilitar!la!clonación!de!productos! de!PCR.!El!lugar!de!clonación!interrumpe!el!inicio!del!gen!lacZ!de!la!β-galactosidasa,! permitiendo!así!la!detección!de!colonias!con!el!plásmido!recombinante!en!placas! con! medio! de! selección! con! ampicilina,! X-Gal! (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranósido)!e!IPTG!(isopropil-β-D-1-!tiogalactopiranósido).!El!tamaño!es!de!3! Kb.! ● pHJA2:! (Fernández-Martín! et! al,! 2000).! Plásmido! derivado! de! pAN7-1! (Punt!et!al.,!1987)!y!p-BlueScript!®!II!KS!+!(Stratagene).!Este!plásmido!contiene!el! gen!hph!de!resistencia!a!higromicina!B!y!un!sitio!de!clonación!múltiple!(procedente! de!pAN7-1!y!pBlueScript!®,!respectivamente).!El!tamaño!es!de!7,2!kb.! ● pRS426:! Plásmido! proveniente! del! Fungal! Genetics! Stocks! Center! (FGSC).!Es!un!vector!de!clonación!diseñado!para!la!manipulación!genética!a!través! del!huésped!de!S.)cerevisiae,!y!que!también!es!funcional!en!E.)coli.!Contiene!el!gen! de!resistencia! a! ampicilina!y! el! gen! URA3!de! S.) Cerevisiae,! que! se! utilizan! como! marcadores!de!selección.!El!tamaño!es!de!5,7!kb.! ● pCSN44:! Plásmido! proveniente! del! Fungal! Genetics! Stocks! Center,! derivado! de! pDH25! (Cullen! et! al.,! 1987).! Este! plásmido! contiene! el! gen! de! resistencia!a!higromicina!B!bajo!control!del!promotor!y!el!terminador!del!gen!trpC! de!Aspergillus)nidulans.!El!tamaño!es!de!3,4!kb.! ● pLR28:!Plásmido!resultante!de!clonar!en!pGEM-T!easy!el!producto!de! PCR!(3,4!kb)!de!la!región!genómica!que!contiene!al!supuesto!“fox-mir1”,!obtenido! con!los!cebadores!Foxy-21F!y!Foxy-22-22R,!a!partir!de!ADN!genómico!de!la!estirpe! silvestre!de!F.)oxysporum!4287!(Rodríguez-Ortiz,!2012).!El!tamaño!es!de!6,4!kb.! ● pLR29:!Plásmido!resultante!de!clonar!en!pGEM-T!easy!el!producto!de! PCR!(2,9!kb)!de! la! región! genómica!que!contiene!al! supuesto! “fox-mir2”!con!los! cebadores! Foxy-25F-E6-1F! y! miARN2Fo-1R,! utilizando! como! sustrato! ADN! genómico!de!la!estirpe!silvestre!de!F.)oxysporum!4287!(Rodríguez-Ortiz,!2012).!El! tamaño!es!de!5,9!kb.! ● pDul7:!Plásmido!utilizado!para!la!deleción!de!“fox-mir1”,!resultado!de! ligar!el!plásmido!pRS426!con!tres!fragmentos!independientes!obtenidos!por!PCR:! (1)! la! región!5’! de! “fox-mir1”! (cebadores! P-Fox-mir1-5F/P-Fox-mir1-5R),! (2)! la! región!3’!de!“fox-mir1”!(cebadores!T-Fox-mir1-3F/T-Fox-mir1-3R)!y!(3)!el!cassette! de!resistencia!a!higromicina!B!de!pCSN44!(cebadores!HPH-6F/HPH-6R).!El!tamaño! es!de!9,3!kb.! ● pDul8:!Plásmido!utilizado!para!la!deleción!de!“fox-mir2”,!resultado!de! ligar!el!plásmido!pRS426!con!tres!fragmentos!independientes!obtenidos!por!PCR:! Material!y!Métodos! ! 33! (1)! la! región!5’! de! “fox-mir2”,! (cebadores! P-Fox-mir2-5F/P-Fox-mir2-5R),! (2)! la! región!3’!de!“fox-mir2”!(cebadores!T-Fox-mir2-3F/T-Fox-mir2-3R)!y!(3)!el!cassette! de!resistencia!a!higromicina!B!de!pCSN44!(cebadores!HPH-6F/HPH-6R).!El!tamaño! es!de!8,9!kb.! ● pDul14:!Plásmido!utilizado!para!la!deleción!del!gen!carP,!resultado!de! ligar!el!plásmido!pRS426!con!3!fragmentos!independientes!obtenidos!por!PCR:!(1)! la! región! 5’! de! carP! (cebadores! OMP998/OMP999),! (2)! la! región! 3’! de! carP! (cebadores! Fox-ZD-LNC-F/Fox-ZD-LNC-R)! y! (3)! el! cassette! de! resistencia! a! higromicina!B!de!pCSN44!(cebadores!HPH-6F/HPH-6R).!El!tamaño!es!de!9,8!kb.! ● pDul15:!Plásmido!utilizado!para!la!deleción!del!gen!carF,!resultado!de! ligar!el!plásmido!pRS426!con!3!fragmentos!independientes!obtenidos!por!PCR:!(1)! la!región!5’!UTR!de!carF!(cebadores!Fox-ZI-FOXG_09306F/!Fox-ZI-FOXG_09306R),! (2)! la! región! 3’! UTR! de! carF! (cebadores! Fox-ZD-FOXG_09306F! /! Fox-ZDFOXG_09306R)! y! (3)!el!cassette! de! resistencia! a! higromicina! B! de! pCSN44! (cebadores!HPH-6F/HPH-6R).!El!tamaño!es!de!10,2!kb.! ! Medios!de!cultivo.! Medio!de!cultivo!para!Escherichia(coli.! ● Medio!LB!(Luria-Bertani):!Su!composición!por!litro!de!agua!destilada!es!10!g! de!peptona!hidrolizada!enzimáticamente!(USB),!5!g!de!extracto!de!levadura,! y! 5! g! de! NaCl! (Sambrook! y! Russell,! 2001).! En! caso! de! medio! sólido,! se! añaden!15!de!agar.! Este!medio!se!puede!suplementar!con!100!mg/l!de!ampicilina,!50!mg/l!de! X-Gal! y! 134! μM! de! IPTG! para! la! selección! de! estirpes! resistentes! a! ampicilina!o!para!detección!de!actividad!β-galactosidasa.! ● Medio!SOB:!Su!composición!por!litro!de!agua!destilada!es!20!g!de!triptona,! 5!g!de!extracto!de!levadura,!0,5!g!de!NaCl,!y!2,5!mM!de!KCl.!Se!ajusta!a!pH!7! con! NaOH! y! se! esteriliza.! Después! de! autoclavar! se! añade! MgCl2! a! una! concentración! final! 10! mM.! Este! medio! se! utiliza! para! la! producción! de! células!competentes!de!E.)coli.! ! Medio!de!cultivo!para!Saccharomyces(cerevisiae.! ● Medio!YPD:!Su!composición!por!litro!de!agua!destilada!es!10!g!de!extracto! de!levadura,!20!g!de!bactopeptona!y!20!g!de!glucosa.!Se!le!añade!20!g!de! agar!en!caso!de!medio!sólido.! ● Medio!SC!mínimo:!Su!composición!por!litro!de!agua!destilada!es!1,7!g!de! Yeast)nitrogen)base!(carente!de!aminoácidos!y!NH4SO4,!abreviado!YNB),!5!g! de!NH4SO4!y!20!g!de!glucosa.!Se!añadieron!20!g!de!agar!en!caso!de!medio! Material!y!Métodos! ! 34! sólido.!Este!medio!se!suplementó!con!los!aminoácidos!necesarios!según!el! experimento.! ! Medios!de!cultivo!para!Fusarium(oxysporum.! ● PDB:)Potato)Dextrose)Broth.!Hervir!200!g!de!patatas!peladas!en!1!l!de!agua! desstilada!durante!60!minutos.!Transcurrido!ese!tiempo,!filtrar,!añadir!20!g! de! glucosa!y! enrasar! con! agua! destilada! hasta! 1! l.! Alternativamente,! se! puede!emplear!un!medio!comercial!(24!g/L!de!PDB!de!FORMEDIUM!LTD).! En! el! caso! de! medio! sólido,! se! añade! agar! 16! g/l.! Este! medio,! que! se! denomina!PDA!(Potato)Dextrose)Agar),!se!utilizó!para!cultivar!F.)oxysporum) con!el!objetivo!de!obtener!esporas.!En!caso!de!crecimiento!selectivo!se!le! añadió!el!antibiótico!correspondiente.! ● DGasn:!Se!utilizó!como!medio!mínimo!para!los!experimentos!de!expresión! génica.!Su!composición!por!litro!de!agua!destilada!es!30!g!de!glucosa,!3!g!de! L-asparragina,!1!g!de!KH2PO4!0,5!g!MgSO4,!0,5!g!KCl!y!2ml!de!solución!de! microelementos!que!contienen!10!μg!de!HBO4,!100!μg!CuSO4,!200!μg!FeCl3,! 20!μg!de!MnCl2,!NaMoO4!y!2!mg!de!ZnSO4.!! ● Medio!YPED-2G:!Medio!utilizado!para!la!germinación!de!los!conidios!en!el! protocolo!de!preparación!de!protoplastos.!Su!composición!por!litro!de!agua! destilada!es!3!g!de!extracto!de!levadura,!10!g!de!peptona!y!20!g!de!glucosa.! ● Medio!de!regeneración!de!protoplastos:!su!composición!por!litro!de!agua! destilada!es!2!g!de!extracto!de!levadura,!2!g!de!NZ!amina!y!16!g!de!agar.!El! medio!se! prepara! 2!veces! concentrado! y!tras! autoclavarlo!se! le! añade!el! mismo!volumen!de!sacarosa!1,6!M!para!obtener!una!concentración!final!de! 0,8!M.! ● Medio!de!regieneración!de!cobertera:!Este!medio!se!utilizó!para!sembrar! los! protoplastos! en! cajas! de! Petri! de! medio! de! regeneración! de! protoplastos.!Su!composición!es!igual!al!del!medio!de!regeneración!salvo! que!éste!lleva!20!g!de!agarosa!por!litro!en!lugar!de!agar.!La!sacarosa!se!le! añade!después!de!autoclavar.! ! Métodos! Crecimiento!y!mantenimiento!de!microorganismos! Condiciones!de!cultivo!para!Escherichia(coli! Las!bacterias!E.)coli!se!cultivaron!en!LB!a!37°C,!en!agitación!a!200!rpm!en!el! caso! de! medio! líquido.! Cuando! era! necesario,! se! añadió! el! antibiótico! requerido! (ampicilina!generalmente)!y/u!otros!compuestos,!como!el!X-Gal!e!IPTG.! Material!y!Métodos! ! 35! La!conservación!de!las!estirpes!bacterianas!durante!largos!períodos!de!tiempo! se!llevó!a!cabo!en!medio!LB!con!30%!glicerol!(v/v)!a!-80°C.!Para!períodos!cortos!se! mantuvieron!colonias!en!agar!en!frigorífico.! ! Condiciones!de!cultivo!para!Saccharomyces(cerevisiae! Como! regla! general,! S.) cerevisiae! se! cultivó! en! YPD! sólido! para! refrescar! estirpes! de! colección! o! en! YPD! líquido! para! obtener! biomasa! suficiente! como!preinóculos.!En!los!experimentos!de!transformación!se!utiliza!el!medio!mínimo!SC!con!los! aminoácidos! y! bases! correspondientes! (0,03%! L-isoleucina,! 0,15%! L-valina,! 0,02%! L-arginina-HCl,! 0,03%! L-lisina-HCl,! 0,02%! L-metionina,! 0,05%! L-fenilalanina,! 0,2%! L-treonina,!0,02%!L-triptófano,!0,03%!L-tirosina,!0,02%!L-histidina!HCl!monohidratada,! 0,1%! leucina,! 0,1%! L-ácido! glutámico,! 0,1%! L-ácido! aspártico,! 0,4%! L-serina! y! 0,02%! L-adenina!hemisulfato).!Este!medio!no!se!complementa!con!uracilo,!ya!que!se!utiliza! como!requerimiento!de!selección!en!el!que!el!crecimiento!sólo!se!permite!si!las!células! son! capaces! de! producir! uracilo.! El! plásmido! pRS426,! que! se! utiliza! en! la! transformación! de! S.) cerevisiae,! posee! el! gen! URA3,! que! permite! complementar! la! mutación!de!la!estirpe!auxótrofa!de!uracilo!empleada!en!la!transformación.!! ! Condiciones!de!cultivo!para!Fusarium(oxysporum! ● Generalmente!se!usó!medio!PDB!para!la!esporulación!y!la!obtención!de!micelio.! Las! estirpes! se! cultivaron! durante! 3-4! días! en! agitación! a! 200! rpm! a! 30°C,! en! matraces!Erlenmeyer!de!250!ml!con!100!ml!de!medio!de!cultivo,!inoculado!con!108! esporas.!Las!esporas!se!recogieron!a!través!de!un!filtro!(Monodur!10-15!µm)!y!se! mantuvieron!congeladas!en!glicerol!al!30%!a!-80°C.! ● Para!refrescar!estirpes!o!sacarlas!de!colección!se!usó!el!medio!PDA.! ● El!medio!empleado!para!el!resto!de!los!experimentos!de!esta!Tesis!fue!DGasn.! o Para!los!ensayos!de!expresión!génica:!Se!emplearon!cajas!de!Petri!de!150! mm! de! diámetro! con! 80! ml! medio! líquido! inoculadas! con! 106! esporas! frescas.! Las! cajas! se! mantuvieron! estáticamente! a! 30°C! con! los! requerimientos!específicos!de!cada!experimento.!Los!cultivos!en!oscuridad! se!incubaron!dentrode!cajas!de!cartón!(31cm!x!23cm!x!22cm)!envueltas!en! papel!de!aluminio!para!impedir!el!paso!de!la!luz.!Los!cultivos!en!la!luz!se! realizaron! bajo! una! plataforma! con! 4! tubos! fluorescentes! que! aportaban! una!intensidad!lumínica!de!7,2!w/m2!(432!Lm/w).! o Para!los!ensayos!de!producción!de!carotenoides:!Se!emplearon!las!cajas!de! Petri!standard!de!90!cm!de!diámetro,!con!25!ml!medio!sólido.!Las!cajas!se! incubaron!a!30°C!con!los!requerimientos!de!luz/oscuridad!pertinentes!de!la! misma!forma!que!en!el!resto!de!ensayos!en!medio!líquido.!En!este!caso!los! cultivos!se!inocularon!mediante!7!pinchazos!con!palillos!estériles!por!cada! caja!de!Petri!a!partir!de!colonias!frescas!aisladas.! Material!y!Métodos! ! 36! o Para!los!experimentos!de!coinmunoprecipitación:!Los!cultivos!se!incubaron! en!cajas!de!Petri!de!150!mm!con!80!ml!de!medio!DGasn!líquido,!inoculados! con!106!esporas.!Las!incubaciones!se!realizaron!a!30°C!durante!3!días!en! oscuridad!y!posteriormente!se!expusieron!a!la!luz!durante!1!hora!o!durante! otros!tiempos!dependiendo!del!experimento! ! Aislamiento!de!ácidos!nucleicos.! Purificación!de!ADN!plasmídico!de!Escherichia(coli.! Para! la! obtención! de! ADN! plásmídico! se! utilizaron! dos! métodos! diferentes! dependiendo!de!la!calidad!y!pureza!que!se!quiera!obtener.!! ● Método! ordinario! (>10! μg):! Se! empleó! el! protocolo! basado! en! la! lisis! alcalina! (Stephen! et! al.,! 1990;! Sambrook! et! al.,! 2001)! con! algunas! modificaciones.! Se! inocularon! 3! ml! de! LB! con! el! antibiótico! correspondiente! y! se! incubaron! a! 37°C! durante! 8-12! horas! en! agitación! a! 200! rpm.! Se! tomaron! 1,5! ml! del! cultivo! y! se! centrifugaron! a! 13.000! rpm! durante! 1! min.! Se! eliminó! el! sobrenadante! y! se! resuspendieron!las!células!en!150!μl!de!la!Solución!I!(Tris!50!mM;!EDTA!10!mM;! ARNasa!10!mg/l,!mantenida!siempre!en!frío).!Después!las!células!se!lisaron!con!150! μl!de!la!Solución!II!(NaOH!10!N;!SDS!10%),!la!mezcla!se!mantuvo!en!hielo!durante! unos!minutos!y!finalmente!se!neutralizó!con!la!Solución!III!(acetato!potásico!5!M;! ácido! acético! glacial! 11%! v/v).! Se! centrifugó! 10! minutos! en! una! centrífuga! para! tubos!eppendorf!a!13.000!rpm!y! se!transfirió! el! sobrenadante!a! un!tubo! limpio.! Para!precipitar!el!ADN!plasmídico!contenido!en!el!sobrenadante!se!añadieron!500! μl!de!isopropanol!o!de!etanol!96°,!se!mantuvo!en!hielo!durante!30!minutos!y!se! centrifugó!10!minutos!a!13.000!rpm.!Para!lavar!el!precipitado!se!añadieron!200!μl! de!etanol!70%!(v/v),!y!se!centrifugó!5!minutos!a!13.000!rpm.!Finalmente!se!eliminó! el!sobrenadante,!se!dejó!secar!el!precipitado.!La!muestra!se!resuspendió!en!50!μl! TE!(Tampón!Tris-EDTA,!TrisHCl!20!mM!pH!8;!EDTA!10!mM)!o!H2O!desionizada.! ● Kit!comercial!(<10!μg):!Solo!se!utilizó!cuando!se!necesitaba!ADN!plasmídico!de!alta! pureza,!por!ejemplo,!para!secuenciación.!El!kit!comercial!utilizado!fue!Nucleo)Spin) Plasmid!!(Macherey-Nagel),!siguiendo!las!instrucciones!del!fabricante.! Aislamiento!de!ADN!plasmídico!de!Saccharomyces(cerevisiae! Para!la!purificación!de!ADN!plasmídico!de!S.)cerevisiae!se!utilizó!un!protocolo! similar! al! de! extracción! de! ADN! plasmídico! de! bacterias,! cambiando! algunas! soluciones.! Se! partió! de! biomasa! obtenida! a! partir! de! un! preinóculo! e! incubada! durante!10-12!horas!en!medio!selectivo.!Las!células!se!centrifugaron!durante!1!minuto! a!13.000!rpm!y!se!resuspendieron!en!agua!para!lavarlas.!A!continuación!se!volvieron!a! centrifugar!1!minuto!a!13.000!rpm!y!se!resuspendió!el!precipitado!en!640!μl!de!una! solución!de!Sorbitol!0.9!M!y!EDTA!0.1!M!pH!8.!A!esta!mezcla!se!le!añadieron!6.4!µl!de! β-mercaptoetanol!y!10!µl!de!zimoliasa!20T!(10!mg/ml),!cóctel!enzimático!para!romper! Material!y!Métodos! ! 37! la!pared!celular!de!las!levaduras,!y!se!incubó!durante!1!hora!a!37°C.!A!continuación!se! centrifugó!durante!1!minuto!a!13.000!rpm!y!se!continuó!con!el!protocolo!de!extracción! de!plásmido!de!bacterias!descrito!anteriormente.! Extracción!de!ADN!de!Fusarium(oxysporum! Se! hicieron! dos! tipos! de! extracciones! dependiendo! de! la! cantidad! de! ADN! a! obtener.!! ● Pequeña! escala! (<10! μg! ADN):! Se! utilizó! el! kit! comercial! Nucleo) Spin) Plant) II! (Macherey-Nagel),! siguiendo! las! instrucciones! del! fabricante! en! su! apartado! 5.2! (“Genomic!DNA!from!fungi”).!! ● Gran!escala!(>10!μg!ADN):!Se!trituraron!unos!2!g!de!micelio!en!un!mortero!con!N2! líquido!hasta!obtener!un!polvo!fino,!el!cual!se!resuspendió!en!7!ml!de!Solución!de! Extracción!(Tris-HCl!50!mM;!EDTA!20!mM,!pH!7,5).!Las!muestras!se!mantuvieron!en! hielo! y! se! les! añadió! 0,5! ml! de! SDS! 10%,! mezclando! suavemente.! La! mezcla! se! incubó! durante! 30! minutos! a! 65°C,! se! añadieron! 2! ml! de! solución! neutralizante! (acetato!potásico!5M),!se!enfrió!en!hielo!durante!30-60!minutos!y!se!centrifugó!10! minutos!a!4.500!rpm!a!4°C.!El!sobrenadante!se!pasó!a!un!tubo!nuevo!de!50!ml!y!se! añadieron!2!volúmenes!de!etanol!96°!para!precipitar!el!ADN.!El!tubo!se!mantuvo! una! hora! a! -80°C! y! se! centrifugó! durante! 30! minutos! a! 4.500! rpm! a! 4°C.! El! precipitado!se!lavó!con!1!volumen!de!etanol!70%!(v/v)!y!el!ADN!se!resuspendió!en! 3! ml! de! TE.! Para! eliminar! el! ARN! se! trató! la! muestra! con! ARNasa! durante! 30! minutos!a!37°C!y!se!volvió!a!precipitar!el!ADN!con!1!volumen!de!Isopropanol,!tras! lo!cual!le!siguió!un!lavado!con!etanol!70%!(v/v).!Este!precipitado!se!resuspendió!en! 1! ml! de! TE.! En! los! casos! necesarios! se! añadió! un! volumen! de! fenol:cloroformo:isoamílico!(25:24:1),!se!mezcló!y!se!centrifugó!para!eliminar!los! restos!orgánicos!y!proteicos.!Se!recuperó!la!fase!acuosa!(situada!arriba),!a!la!que!se! añadió!1!volumen!de!cloroformo!y!se!volvió!a!recuperar!la!fase!acuosa.!De!nuevo! se!precipitó!con!2!volúmenes!de!etanol!96°!y!se!lavó!con!etanol!70%!(v/v).!El!ADN! se!resuspendió!en!500!μl!de!TE!y!se!almacenó!a!-20°C!hasta!su!uso.! ! Extracción!de!ARN!de!Fusarium(oxysporum! La! extracción! de! ARN! también! tiene! dos! variantes! según! la! cantidad! y/o! pureza! necesaria!para!su!uso.! ● Pequeña! escala! (<40! μg! ADN):! Se! utilizó! el! kit! comercial! RNeasy®! Plant! Mini! Kit! (QIAGEN),! siguiendo! las! instrucciones! del! fabricante.! En! este! caso! la! pureza! del! producto!es!muy!alta.! ● Gran!escala! (>50!μg!ADN):!Se!utilizó!el!reactivo!químico! comercial!TRIzol!(TRIzol! Reagent,!Ambion).!Se!trituraron!al!menos!150!mg!de!micelio!en!mortero!al!igual! que!para!extracción!de!ADN.!El!protocolo!se!hizo!siempre!en!hielo!para!evitar!la! degradación! del! ARN.! El! polvo! obtenido! se! resuspendió! en! 750! μl! de! TRIzol,! se! homogeneizó!la!muestra!y!se!mantuvo!en!frío!durante!5!minutos.!Se!añadieron!150! Material!y!Métodos! ! 38! μl! de! cloroformo,! se! agitó! vigorosamente! en! vórtex! durante! 15! segundos! y! se! mantuvo! durante! 2-3! minutos! en! hielo.! Después! se! centrifugó! a! 12.000! rpm! durante!15!minutos!a!4°C,!se!retiró!la!fase!acuosa!y!se!pasó!a!un!tubo!limpio,!al! que! se! añadieron!375! μl! de! isopropanol.! Tras! mezclar! bien,! se! incubó! en! frío! durante!10!minutos,!se!centrifugó!a!12.000!rpm!a!4°C,!y!se!retiró!el!sobrenadante! con!cuidado!de!no!tocar!el!precipitado.!Luego!se!lavó!con!etanol!70%,!se!centrifugó! 5!minutos!a!12.000!rpm,!se!retiró!el!sobrenadante!y!se!dejó!secar!el!precipitado.! Una!vez!seco!se!resuspendió!en!H2O!libre!de!ARNasa.!Se!incubó!en!un!baño!a!60°C! durante!10-15!minutos!y!se!guardó!la!muestra!a!-80°C!hasta!su!uso.!! Este!método!de!extracción!de!ARN!también!se!utilizó!para!la!secuenciación!de! ARN!(RNA-Seq),!ya!que!proporciona!grandes!cantidades!de!ARN!en!poco!volumen,! condición!exigida!por!la!empresa!que!lleva!a!cabo!la!secuenciación!masiva.!En!este! caso!hubo!un!paso!adicional!de!purificación!de!ARN:!al!final!del!proceso,!la!muestra! de!ARN!se!pasó!2!veces!por!una!columna!de!purificación!de!ARN!del!kit!comercial! NucleoSpin! RNA! (Macherey-Nagel)! siguiendo! las! indicaciones! del! fabricante,! obteniendo!finalmente!un!ARN!de!calidad!suficiente!para!el!proceso!de!RNA-Seq.! !! Manipulación!de!ácidos!nucleicos! Electroforesis!de!ácidos!nucleicos!en!geles!de!agarosa! La!separación!e!identificación!de!moléculas!de!ADN!y!ARN!se!realizó!mediante! electroforesis!en!geles!de!agarosa!en!tampón!TAE!(Tris-acetato!40!mM;!EDTA!1!mM!pH! 8).! La! concentración! de! agarosa! varió! en! función! del! tamaño! de! los! fragmentos! a! separar,! oscilando! entre! 0,7%! (p/v)! para! electroforesis! de! rutina! y! 2%! (p/v)! para! diferenciar! tamaños! inferiores! a! 200! pb.! Para! visualizar! los! ácidos! nucleicos! por! transiluminación!con!radiación!ultravioleta!se!añadió!bromuro!de!etidio!(0,5!μg/ml).! Cada!muestra!se!mezcló!con!un!tampón!de!carga!comercial!(Loading)buffer!de!Takara! 10X)!en!el!caso!de!ADN!y!un!tampón!de!carga!especial!(Tampón!stock!ARN!10X;!EDTA!1! mM!pH!8,!azul!de!bromofenol!0,25%!p/v!y!glicerol!al!50%!v/v)!en!el!caso!de!ARN!para! evitar!su!degradación.!La!electroforesis!se!realizó!en!una!cubeta!horizontal!con!tampón! TAE! a! un! voltaje! constante! de! 1-4! V/cm.! El! tamaño! de! los! fragmentos! de! ADN! se! estimó!con!un!marcador!de!tamaño!comercial!(1kb)DNA)Ladder!de!Nippon!Genetics),! que!contiene!fragmentos!desde!250!pb!a!10!kb.! ! Recuperación!de!fragmentos!de!ADN!en!geles!de!agarosa! La!purificación!de!fragmentos!de!ADN!en!geles!de!agarosa!se!realizó!empleando! el!kit!comercial!ISOLATE)II)PCR)and)Gel)Kit!de!Bioline,!siguiendo!las!recomendaciones! del!fabricante.! ! Material!y!Métodos! ! 39! Tratamientos!enzimáticos!de!ácidos!nucleicos! Tratamientos!con!endonucleasas!de!restricción! Las!enzimas!de!restricción!empleadas!para!digerir!el!ADN!fueron!suministradas! por! Takara!y! New) England) Biolabs.! Los! tratamientos! del! ADN! con! una! enzima! de! restricción!se!realizaron!con!el!tampón!y!la!temperatura!de!incubación!recomendados! por!el!fabricante.!Se!empleó!siempre!al!menos!una!unidad!de!enzima!por!cada!μg!de! ADN! que! se! quiera! digerir.! Las! enzimas! se! inactivaron! según! las! instrucciones! del! fabricante,!generalmente!por!tratamiento!a!65°C.! ! Clonación!de!fragmentos!de!ADN!en!vectores! Para!clonar!fragmentos!de!ADN!amplificados!por!PCR,!se!empleó!el!plásmido! comercial! pGEM®-T! Easy! (Promega),! siguiendo! las! instrucciones! del! fabricante.! De! manera!rutinaria!antes!de!la!clonación,!los!fragmentos!se!precipitaron!con!acetato!de! sodio! y! etanol! (descrito! en! Precipitación! de! ADN)! o! se! purificaron! utilizando! el! kit! comercial! ISOLATE) II) PCR) and) Gel) Kit! (Bioline),! siguiendo! las! instrucciones! del! fabricante.! ! Cuantificación!de!ácidos!nucleicos! La!concentración!de!las!muestras!de!ADN!o!ARN!se!determinaron!por!densidad! óptica! a! 260! nm! utilizando! un! espectrofotómetro! Nanodrop®! ND-1000.! En! algunas! ocasiones! la! cuantificación! se! llevó! a! cabo! por! comparación! de! la! intensidad! de! las! bandas!con!cantidades!conocidas!del!marcador!de!tamaño!1kb)DNA)Ladder!de!Nippon! Genetics!tras!electroforesis!en!gel!de!agarosa.!! Reacción!en!cadena!de!la!Polimerasa!(PCR)! PCR!estándar! Según!la!finalidad!del!experimento,!para!la!amplificación!de!fragmentos!de!ADN! se! emplearon! diferentes! polimerasas! termoestables:! BIOTAQTM) DNA) polymerase! (Bioline)!para!las!comprobaciones!de!rutina,!Expand!High)Fidelity)PCR)System!(Roche)! para!la!construcción!de!vectores!y!Velocity)DNA)polymerase!(Bioline)!para!construcción! de!vectores!cuando!los!productos!tienen!un!tamaño!superior!a!8!kb.!Se!utilizaron!las! condiciones!de!reacción!fueron!las!indicadas!en!las!instrucciones!de!uso!del!fabricante.! Las!reacciones!se!llevaron!a!cabo!con!una!cantidad!de!ADN!molde!que!osciló!entre!10!y! 50! ng! para! ADN! genómico! y! entre! 1! y! 10! ng! para! ADN! plasmídico.! Los! cebadores! utilizados!se!describen!en!la!Tabla!2.!! ! Material!y!Métodos! ! 40! Transcripción!inversa!del!ARN!(RT-PCR)! Se!realizó!en!dos!pasos:!primero!se!eliminaron!los!restos!de!ADN!en!las!muestras! de!ARN!y!luego!se!llevó!a!cabo!la!síntesis!de!ADN!complementario!(ADNc).! ● Para!eliminar!los!restos! de! ADN!se!utilizó!el! kit! Recom) DNase) RNase-free!(USB).! Generalmente! se! partió! de! 2.450! ng! de! ARN! total! (7! µl! de! una! solución! de! 350! ng/µl).! El! kit! incluye! un! tratamiento! con! ADNasa! durante! 15! minutos! a! 30°C,! a! razón!de!0,1!μg/μl!de!ARN!y!0,1!U/μl!de!enzima.!Para!detener!la!reacción!se!incubó! la!mezcla!a!65°C!con!una!solución!de!EDTA!incluida!en!el!kit.! ● Para!la!síntesis!de!ADNc,!el!ARN!tratado!con!ADNasa!se!sometió!a!una!transcripción! inversa! mediante! el! kit! Transcriptor) First) Strand) cDNA) synthesis) kit! (Roche),! siguiendo!las!instrucciones!del!fabricante.! ● Para!analizar!la!dirección!del!transcrito!del!gen!carP)se!utilizó!una!variante!de!este! protocolo.! La! modificación! consiste! en! sustituir! el! cebador! poliT,! usado! en! la! síntesis!de!ADNc!común,!por!una!mezcla!de!cebadores!específicos!para!cada!una! de! las! cadenas,! de! manera! que! solo! se! obtiene! el! sustrato! de! ADNc! correspondiente! a! la! orientación! del! transcrito.! Cada! mezcla! de! cebadores! está! compuesta!por!4!cebadores!diferente,!de!unos!20!pb,!que!cubren!distintas!partes! del! transcrito! en! una! sola! orientación.! Posteriormente,! se! realiza! una! PCR! con! ambos!sustratos!y!solo!se!espera!que!sea!visible!el!producto!de!PCR!en!el!sustrato! generado! por! la! mezcla! de! cebadores! complementarios! a! la! orientación! del! transcrito.!! ! Análisis!de!expresión!génica!mediante!PCR!cuantitativa!a!tiempo!real!(RT-qPCR).! La!expresión!de!los!genes!de!F.)oxysporum!se!detectó!mediante!RT-qPCR.!Para! ello! se! utilizó! como! molde! el! ADNc! obtenido! a! partir! de! ARN! con! las! parejas! de! cebadores!apropiadas!y!se!amplificaron!productos!con!una!longitud!de!entre!150!y!200! pb.!Estos!ensayos!se!llevaron!a!cabo!en!dos!pasos!con!el!kit!Light)cycler)SYBR)Green) Master) I! (Roche).! Se! utilizaron! 50! ng! de! ARN! a! una! concentración! de! 25! ng/μl.! La! muestra! se! mezcló! con! 0.4! μM! de! los! cebadores! directo! y! reverso,! 5! μl! de! 1xSYBR! Green!I!Master,!que!incluye!polimerasa!Taq,!tampón!de!reacción,!dNTPs,!y!MgCl2.!El! volumen! final! de! muestra! por! pocillo! fue! de! 10! μl.! El! programa! usado! para! la! amplificación! del! ADNc! consistió! en! una! pre-incubación! de! 5! minutos! a! 95°C,! y! 45! ciclos!de!10!segundos!a!95°C,!10!segundos!a!60°C!y!10!segundos!a!72°C.!Los!cebadores! utilizados!se!diseñaron!con!el!programa!Primer)ExpressTM)V2.0.0!(Applied!Biosystems)!y! se!sintetizaron!en!la!empresa!IDT!(Integrated!DNA!Tecnologies,!Bélgica).!Los!cebadores! que!se!utilizaron!en!los!análisis!se!describen!en!la!Tabla!2.!! Para! cada! muestra! de! ADNc! se! realizaron! 3! réplicas! técnicas! simultáneas.! La! reacción!de!amplificación!se!lleva!a!cabo!en!placas!de!384!pocillos!con!el!equipo!RTPCR! LightCycler! 480! (Roche).! Para! analizar! los! productos! obtenidos! tras! la! PCR! se! Material!y!Métodos! ! 41! realizaron!las!curvas!de!desnaturalización!(curvas!de!melting).!Para!ello!se!programó!el! equipo! para! aumentos! de! 0,5°C! cada! 5! segundos,! comenzando! a! los! 55°C! hasta! alcanzar!los!95°C,!determinándose!la!fluorescencia!tras!cada!aumento!de!temperatura.!! Los! niveles! relativos! de! productos! de! RT-qPCR! se! determinaron! usando! el! método! ΔΔCt! (Livak! y! Schmittgen,! 2001;! Pfaffl,! 2001),! siendo! los! valores! de! Ct! normalizados!según!el!valor!Ct!obtenido!para!el!gen!de!la!tubulina!usado!como!gen!de! referencia!endógena.!Para!ello!se!aplicó!la!ecuación:! ! 𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑅𝐸 =2!(!" !"#!!" !"#"$%&')! ! Tabla!2.!Cebadores!utilizados!en!este!trabajo.! Cebador! (Nombre)! Número! colección! Secuencia!5’-3’! Uso! experimental! ChIP-QPCR-carB-1F! OMP-1037! CTGAACGAGGCGCAGTTAAT! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carB-1R! OMP-1038! CATTTTGACAGCACCACCAC! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carB-2F! OMP-1039! GGTTTGGTTTGGAGGGTTTT! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carB-2R! OMP-1040! GTTGGAATTTGCTTGGCATC! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carF/carP-3F! OMP-1045! AGGTTCAAAATGGGGCTCTT! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carF/carP-3R! OMP-1046! GGCATTGATTCTTCCGCTTA! qPCR-ChIP! ChIP-Promo-Tub-3F! OMP-1185! GGCGATACTTCACATACTGGGC! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carRA/carX-1F! OMP-1051! TGTGTGACGGCATACGAGAT! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carRA/carX-1R! OMP-1052! GAGGGTGTAGTGGGGTAGCA! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carRA/carX-2F! OMP-1053! GCTACCCCACTACACCCTCA! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carRA/carX-2R! OMP-1054! TCACGGTAACGGCAATATCA! qPCR-ChIP! ChIP-Promo-Tub-3R! OMP-1186! CCCGCAGTGGCAGGCACGCC! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carS-3F! OMP-1061! CCCTGTCAGAAATCCCAGAA! qPCR-ChIP! ChIP-QPCR-carS-3R! OMP-1062! CATCTCCGTTGTGTGAATCG! qPCR-ChIP! ChIP-Telom-Cnegativo-3F! OMP-1191! GCGCGTGCGAGCGTCGTGACG!T! qPCR-ChIP! ChIP-Telom-Cnegativo-3R! OMP-1192! CACAAGCTTATGTCTGCAACGG! qPCR-ChIP! Foxy-2R-carS! OX4! TCCTCGAGGCTAACATCGTC! RT-PCR! Foxy-3F-carS! OX5! CCTTGACGGATACATCGTCG! RT-PCR! Tub-2F! VAR-27! CCGGTGCTGGAAACAACTG! RT-PCR! Tub-2R! VAR-28! CGAGGACCTGGTCGACAAGT! RT-PCR! RTFoxyA-2F-carRA! VAR-67! CATCCAGCGCGAAGTTGTC! RT-PCR! RTFoxyA-2R-carRA! VAR-68! CGCGCGATATTGACGTATTG! RT-PCR! RTFoxyA-3F-carB! VAR-69! CCATGTGAAGGGAGTGTTGATG! RT-PCR! RTFoxyA-3R-carB! VAR-70! CCATGTGAAGGGAGTGTTGATG! RT-PCR! RTFoxy-7F-carF! VAR-77! GCAGCTTCAGGGCCAGAA! RT-PCR! RTFoxy-7R-carF! VAR-78! TGGTCGAAAAGTTCAGCATCCT! RT-PCR! RT-Fox-carX-1F! VAR-343! CTTCCCGCGGCATCAA! RT-PCR! Material!y!Métodos! ! 48! de!50!ml!con!NaCl!0.7!M,!y!se!centrifugó!a!temperatura!ambiente!durante!15!minutos! a! 3.000! rpm.! Después! se! eliminó! el! sobrenadante! y! se! volvió! a! resuspender! el! precipitado!de!protoplastos!en!50!ml!de!NaCl!0.7!M.!Se!repitió!la!centrifugación!y!los! protoplastos!se!resuspendieron!en!STC!1x!(Sorbitol!1,2!M,!Tris-HCl!20!mM!pH!8,!CaCl2! 50!mM).!Se!centrifugó!de!nuevo!y!ahora!el!precipitado!se!resuspendió!en!los!µl!de!STC! 1x!necesarios!para!obtener!una!concentración!de!3·108!protoplastos/ml.!Finalmente!se! alicuotaron!en!100!µl!para!su!uso!directo!o!para!su!congelación!en!10%!PEG!6000!y!1%! DMSO!(v/v).! ! Transformación!de!protoplastos! Para! la! transformación! de! protoplastos! se! añadieron! los! siguientes! componentes!en!el!siguiente!orden:!50!µl!de!STC!2x,!el!volumen!necesario!para!añadir! 10!µg!de!ADN!y!se!completó!hasta!100!µl!con!H2O.!Esta!mezcla!se!añadió!a!100!µl!de! protoplastos! (3·108! protoplastos/ml)! y! se! homogeneizó! suavemente! por! inversión.! Posteriormente!se!le!añadió!a!la!mezcla!50!µl!de!PEG!8000!al!30%,!se!homogeneizó!de! nuevo!por!inversión!y!se!incubó!a!temperatura!ambiente!durante!20!minutos.!Durante! la!incubación!se!preparó!medio!de!regeneración!de!cobertera!y!se!mantuvo!a!50°C.!La! mezcla!de!transformación!pasó!a!un!tubo!de!10!ml!al!cual!se!le!añadieron!2!ml!de!PEG! 8000!al!30%,!se!mezcló!suavemente!invirtiendo!el!tubo!y!se!incubó!durante!5!minutos! a!temperatura!ambiente.!Tras!la!incubación!se!añadieron!4!ml!de!STC!1x,!se!mezcló!de! nuevo! cuidadosamente! y! se! centrifugó! 15! minutos! a! 3.000! rpm.! A! continuación! se! eliminó!el!sobrenadante!dejando!alrededor!de!200!µl!de!la!mezcla,!de!forma!que!se! pueda!resuspender!bien!el!precipitado.!A!lo!largo!de!los!distintos!pasos,!se!evitó!hacer! burbujas!en!la!manipulación!de!los!protoplastos.!Luego!se!añadieron!50-100!µl!de!la! suspensión!de!protoplastos!a!7!ml!de!agar!de!cobertera,!se!mezcló!inmediatamente! invirtiendo!el!tubo!y!se!extendió!en!una!caja!de!Petri!con!medio!de!regeneración.!Tras! 12-14! horas! de! incubación! se! añadieron! otros! 7! ml! de! agar! de! cobertera! con! higromicina! B! (1! mg/ml! concentración! final)! a! cada! caja! de! Petri! inoculada! previamente!con!protoplastos.! Para!los!controles!de!regeneración!y!selección,!se!realizó!el!mismo!proceso!de! transformación!con!50-100!µl!de!la!suspensión!de!protoplastos!pero!sin!añadir!ADN.! Para!el!caso!del!control!de!regeneración!el!agar!de!cobertera!careció!del!antibiótico.! ! Inactivación!dirigida!de!genes! La! deleción!de! genes! de! F.) oxysporum! se! llevó! a! cabo! mediante! reemplazamiento! génico! dirigido! utilizando! la! técnica! de! inactivación! de! genes! de! Neurospora! (Rose! et! al.,! 1990;! Colot! et! al.,! 2006).! Esta! técnica! se! basa! en! el! reemplazamiento! del! gen! diana! por! un! cassette! de! resistencia! a! un! antibiótico! mediante! la! recombinación! homóloga! entre! secuencias! circundantes! de! dicho! gen! Material!y!Métodos! ! 49! diana,! y! las! mismas! secuencias! presentes! también! en! el! vector! rodeando! a! dicho! cassette!(Figura!M1).!! Para! la! construcción! del! vector! se! utilizó! el! mecanismo! de! recombinación! homóloga!de!S.)cerevisiae.!Por!una!parte!se!obtuvo!mediante!amplificación!por!PCR!la! secuencia!promotora!del!gen!diana,!que!posee!en!el!extremo!más!alejado!del!gen!una! cola!de! unos! 20! nucleótidos,! presente! en! el! cebador! que! se! utiliza! en! la! PCR,! que! pertenece!a!la!secuencia!del!vector!que!utilizamos!en!esta!técnica,!pRS426;!el!mismo! producto!de!PCR!posee!en!su!extremo!más!próximo!al!gen!otra!cola!de!tamaño!similar! y!con!homología!con!un!extremo!del!cassette!de!resistencia!hygR!(que!contiene!el!gen! hph!bajo!control!de!secuencias!reguladoras!de!Aspergillus)nidulans).!Por!otra!parte,!se! obtuvo!de!la!misma!forma!la!secuencia!terminadora!del!gen!diana,!que!posee!colas!en! sus!extremos!pero!en!este!caso!localizadas!al!contrario:!en!el!extremo!próximo!al!gen! posee!la!cola!con!una!secuencia!del!cassette!de!resistencia,!y!en!el!extremo!opuesto!la! cola! con! una! secuencia! del! plásmido! pRS462.! Se! obtuvo! también! mediante! PCR! el! cassette! hygR,! en! cuyos! extremos! se! encuentran! las! secuencias! de! las! colas! introducidas! a! cada! uno! de! los! fragmentos.! Finalmente,! se! usó! el! plásmido! pRS426! abierto! por! la! secuencia! de! multiclonación! mediante! digestión! con! las! enzimas! de! restricción!EcoRI!y!XhoI,!de!forma!que!se!evita!la!autoligación!del!plásmido!abierto.!! Una!vez!obtenidos!todos!los!fragmentos,!se!introducen!por!transformación!en! la!estirpe!adecuada!de!S.)cerevisiae,!donde!recombinarán!los!distintos!fragmentos!por! las! secuencias! coincidentes! de! sus! extremos.! De! esta! forma! se! generó! un! plásmido! cerrado!derivado!de!pRS426!que!contiene!el!cassette!de!resistencia!rodeado!por!las! secuencias! promotora! y! terminadora! del! gen! diana.! Este! vector! se! utilizó! posteriormente!para!transformar!F.)oxysporum)y!conseguir!los!mutantes!deseados!.! Material!y!Métodos! ! 50! ! Figura!M1.!Construcción!de!cassettes!de!deleción!mediante!recombinación!homóloga!realizada!en! Saccharomyces)cerevisiae. ! ! ! ! Extracción!y!análisis!de!carotenoides! ! Para!la!extracción!de!carotenoides!se!utilizaron!muestras!de!micelio!crecidas!en! cajas!de!Petri!con!medio!DGasn!sólido,!utilizando!2!cajas!por!ensayo/muestra.!Por!el! método! de! siembra,! cada! caja! contiene! 7! colonias.! Tras! una! semana! de! incubación! bajo!condiciones!de!oscuridad!o!de!luz,!las!colonias!se!separaron!cuidadosamente!del! agar!con!la!ayuda!de!un!bisturí,!y!las!muestras!de!micelio!se!congelaron,!se!liofilizaron! y!se!pesaron.!Las!cantidades!de!micelio!liofilizado!que!se!usaron!para!la!extracción!de! carotenoides!oscilaron!entre!50!mg!para!la!estirpe!silvestre!y!25!mg!para!las!estirpes! superproductoras! de! carotenoides.! Las! extracciones! de! carotenoides! se! hicieron!en! Material!y!Métodos! ! 51! tubos! eppendorf! de! 2! ml! con! tapón! de! rosca,! empleando! un! homogeneizador! de! células!FastPrep!24!Instrument!(MP!Biomedicals).!A!cada!muestra!de!micelio!liofilizado! (25-50!mg)!se!le!añadieron!unos!200!µl!de!arena!de!playa!y!1!ml!de!acetona,!y!los! tubos!se!sometieron!a!2!pulsos!de!30!segundos!a!6.5!m/s!en!el!homogeneizador!con!un! descanso!de!5!minutos!por!cada!pulso.!Tras!cada!paso!de!dos!pulsos,!las!muestras!se! centrifugaron!durante!1!minuto!a!13.000!rpm!y!se!pasó!el!sobrenadante!de!acetona!a! un! tubo! limpio,! en! el! que! se! fueron! acumulando! los! carotenoides! extraídos.! El! procedimiento! se! repitió! hasta! que! el! micelio! quedó! completamente! incoloro.! El! número! de! ciclos! de! extracción! varió! con! la! estirpe! en! función! de! su! contenido! en! carotenoides.!Cuando!terminó!la!extracción,!la!acetona!recogida!se!centrifugó!a!13.000! rpm!para!eliminar!los!restos!de!micelio!y!arena,!se!pasó!a!un!tubo!limpio!y!se!dejó! secar!en!una!centrífuga!de!vacío!(Speedvac!de!Eppendorf)!a!una!temperatura!inferior!a! 40°C.! Los! extractos! se! disolvieron! en! acetona! y! se! determinaron! los! espectros! de! absorción!desde!350!a!650!nm!en!un!espectrofotómetro!Beckman!DU!640,!(Beckman! Coulter,!Foullerton,!California,!EEUU).!La!concentración!de!carotenoides!se!calculó!a! partir!de!los!valores!de!máxima!absorción!de!los!espectros!en!la!acetona,!asumiendo! un!coeficiente!medio!de!extinción!molar!∑!de!250.!1!mg·l-1·cm-1! ! Inmunoprecipitación!de!cromatina!! Extracción!de!cromatina!e!inmunoprecipitación! ! Para!los!análisis!de!inmunoprecipitación!de!cromatina,!se!empleó!el!protocolo! descrito!por!Boedi!et!al.,!2012!con!algunas!variaciones.!Esta!técnica!se!ha!empleado!en! esta!Tesis!para!cuantificar!marcas!epigenéticas!en!los!promotores!de!algunos!genes!de! interés!para!el!estudio!de!la!regulación!de!la!carotenogénesis.! Una!vez!realizado!el!cultivo,!se!añadió!formaldehído!a!una!concentración!final! del!0,5%!durante!15!minutos!en!las!mismas!condiciones!de!incubación.!A!continuación! se!añadió!glicina!a!una!concentración!final!de!125!mM!durante!5!minutos,!tras!lo!cual! los!cultivos!se!filtraron!y!los!micelios!se!congelaron!a!-80°C.!! Para!la!sonicación,!el!micelio!congelado!se!trituró!en!mortero!y!se!transfirieron! 100!mg!de!micelio!triturado!a!un!tubo!eppendorf!de!1,5!ml.!El!micelio!se!homogeneizó! con!1!ml!de!la!Solución!de!Sonicación,!que!contiene!HEPES-KOH!50!mM!pH!7.5,!NaCl! 140!mM,!EDTA!1!mM,!Tritón!X-100!1%,!deoxicolato!sódico!0.1%,!trichostatina!A!0,5! µM!y!cóctel!inhibidor!de!proteasas!1x!(cOmplete,!Roche).!La!sonicación!se!realizó!en! un!baño!de!ultrasonidos!(Bioruptor®200,!DIAGENODE)!con!ciclos!de!30!segundos!“ON”! y!30!segundos!“OFF”!durante!30!minutos!a!máxima!potencia,!manteniendo!siempre!las! muestras!frías.!Tras!la!sonicación,!cada!muestra!se!centrifugó!a!13.000!rpm!durante!5! minutos,!se!recuperó!el!sobrenadante!y!se!pasó!a!un!tubo!nuevo.!Este!tubo!contenía!la! cromatina!fragmentada.!! Material!y!Métodos! ! 52! Antes! de! seguir! con! el! protocolo! de! inmunoprecipitación! de! cromatina! se! comprobó!su!grado!de!fragmentación.!Se!retiró!una!alícuota!de!100!µl!de!cromatina!de! cada!una!de!las!muestras,!se!añadió!Proteinasa!K!(0,3!mg/ml)!y!ARNasa!(0,3!mg/ml)!a! cada! una! de! las! muestras! y! se! llevó! a! un! volumen! final! de! 350! µl! de! Solución! de! Sonicación.!Después!la!mezcla!se!incubó!durante!12-14!horas!a!65°C,!se!trató!con!1! volumen!de!fenol-cloroformo!(v/v),!se!precipitó!con!etanol!96°!y!acetato!sódico!3!M!y! el!precipitado! de!ADN! se!resuspendió! en! H2O.! Se!cuantificó! la!cantidad! de! ADN,! se! corrió!una!alícuota!en!un!gel!al!1.2!%!de!agarosa,!y!se!visualizó!si!la!cromatina!estaba! suficientemente!fragmentada.!Se!observó!que!la!mayoría!de!las!bandas!fragmentadas! se! concentraban! en! la! zona! entre! 250! y! 700! pb.! Sólo! se! continuó! el! protocolo! de! inmunoprecipitación! con! las! distintas! muestras! si! se! reproducía! este! patrón! de! fragmentación.! Una!vez!comprobado!el!estado!de!la!cromatina,!las!muestras!se!sometieron!a! una!pre-limpieza!con!bolas!magnéticas!(Dynabeads!Protein!G,!Invitrogen)!para!eliminar! cualquier! tipo! de! contaminación! que! pudiera! adherirse! a! dichas! bolas! inespecíficamente.!Se!utilizaron!50!µl!de!bolas!por!cada!muestra,!se!sometieron!a!un! tratamiento!de!limpieza!con!la!Solución!de!Sonicación!antes!de!estar!en!contacto!con! las!muestras!y!se!resuspendieron!en!un!volumen!final!de!30!µl!por!cada!muestra.!Una! vez!limpias,!se!añadieron!30!µl!de!bolas!a!cada!muestra!de!cromatina!y!se!incubaron! durante!1!hora!a!4°C!en!una!gradilla!giratoria!a!15!rpm.!Con!la!ayuda!de!una!gradilla! magnética!se!separaron!las!bolas!y!se!pasó!la!muestra!de!cromatina!a!un!tubo!limpio.! A!continuación,!se! incubaron!200!ng!de!cromatina! fragmentada! con! 2!µg!de! anticuerpo!procedentes!de!conejo!(representados!en!la!Tabla!3)!en!un!volumen!final! de!1,2!ml!de!una!Solución!de!Dilución,!que!contenía!Tris-HCl!16,5!mM!pH!8,!NaCl!167! mM,! EDTA! 1,2! mM,! Tritón! X-100! 1.1%,! Trichostatin! A! 0,5! µM! y! cóctel! inhibidor! de! proteasas!cOmplete!1x!(Roche)!a!4°C!durante!12-14!horas!en!una!gradilla!giratoria!a!15! rpm.! Tras! esta! incubación! se! añadieron! a! la! mezcla! 30! µl! de! bolas! magnéticas! previamente!lavadas!con!Solución!de!Dilución,!y!se!incubó!durante!1!hora!a!4°C!en!una! gradilla!giratoria!a!15!rpm.!! Para!finalizar!el!proceso!de!incubación!la!muestra!se!sometió!a!una!serie!de! lavados.!La!muestra!se!mantuvo!durante!todo!el!lavado!en!una!gradilla!magnética,!de! manera!que!en!cada!lavado!se!retira!el!sobrenadante!y!las!bolas!permanecen!en!el! tubo,!ya!que!estas!tienen!adherido!el!ADN!que!se!ha!unido!al!anticuerpo.!Los!lavados! se!hicieron!con!4!soluciones!diferentes!en!el!orden!que!se!indican,!añadiendo!en!cada! paso!1!ml!de!cada!solución!y!manteniéndolo!durante!5!minutos!en!gradilla!giratoria!a! 15!rpm!a!temperatura!ambiente:!! 1.! Solución! de! lavado! de! baja! concentración! de! sales:! NaCl! 150! mM,! SDS! 0,2%,! Tritón!X-100!0,5%,!EDTA!2!mM,!Tris-Hcl!20!mM!pH!8.! 2.!Solución!de!lavado!alta!concentración!de!sales:!NaCl!500!mM,!SDS!0,2%,!Tritón! X-100!0,5%,!EDTA!2!mM,!Tris-HCl!20!mM!pH!8.! Material!y!Métodos! ! 53! 3.!Solución!de!lavado!de!cloruro!de!litio:!LiCl!0,25!mM,!Na-deoxycolato!0,5%,!EDTA! 1!mM,!Tris-Hcl!10!mM!pH!8,!Ig!Epal!CA!630!0,5%.! 4.!Solución!TE:!EDTA!1!mM,!Tris-Hcl!10!mM!pH!8.! Después!de!los!lavados,!se!añadieron!a!las!bolas!100!µl!de!una!dilución!1/10!de! una!Solución!de!Resuspensión!(SDS!1%,!NaHCO3!0,1!M).!Esta!mezcla!se!incubó!durante! 30!minutos!a!65°C.!Tras!esta!incubación,!se!retiraron!las!bolas!magnéticas!con!ayuda! de!la!gradilla!magnética!y!el!sobrenadante!se!pasó!a!un!tubo!limpio.! Para! separar! el! ADN! de! las! proteínas! a! las! que! se! había! adherido! (Reverse) Crosslinking),!la! muestra!se! trató!con! NaCl! a! una! concentración!final! de! 0,2! M! y!se! incubó!a!65°C!durante!12-14!horas.!Tras!esta!incubación,!se!añadió!a!la!muestra!una! solución! para! una! concentración! final! de! EDTA! 10! mM,! Tris-HCl! 40! mM! pH! 6,5! y! Proteinasa!K!0,2!mg/ml,!y!la!mezcla!se!incubó!durante!1!hora!a!45°C.!Después!de!esta! incubación,! se! realizó! un! tratamiento! con! Fenol:Cloroformo! (1:1! v/v),! se! lavó! con! 1! volumen!de!cloroformo!y! se! precipitó!con!2!volúmenes! de! etanol!96°,!10%!acetato! sódico!3!M!y!glucógeno.!La!muestra!se!resuspendió!en!100!µl!de!H2O!desionizada!y!se! guardó!a!-80°C!hasta!su!uso!para!una!PCR!cuantitativa.! ! Tabla!3.!Anticuerpos!utilizados!para!ChIP.! Anticuerpo! Concentración! Nº!Catálogo! Casa!comercial! Histona!H3K9ac!(pAb)! 1!µg/µl! 39917-18! ACTIVE!MOTIF! Histona!H3K4me3!(pAb)! 1!µg/µl! 39915-16! ACTIVE!MOTIF! Histona!H3K9me3!(pAb)! Serum! 39161-2! ACTIVE!MOTIF! Histona!H3!antibody! 0,5!µg/µl! 06755! Millipore! IgG! Serum! I8140! SIGMA! pAb:!anicuerpo!policlonal! ! Determinación!de!los!niveles!de!las!marcas!epigenéticas! ! Se! realizaron! medidas! por! PCR! cuantitativa! utilizando! como! molde! ADN! inmunoprecipitado!con!un!anticuerpo!específico;!es!decir,!se!determinaron!los!niveles! de! cromatina! inmunoprecipitada! para! cada! gen! bajo! estudio! mediante! qPCRS.! Para! cuantificar!el!producto!de!reacción!se!utilizó!el!kit!comercial!Power)SYBR)Green)PCR) Master)Mix!(Life!Technology)!siguiendo!las!instrucciones!del!fabricante,!junto!con!la! muestra!de!ADN!(10!ng)!y!la!pareja!de!cebadores!correspondiente!a!la!secuencia!de! ADN!objeto!de!estudio.!La!reacción!de!amplificación!se!llevó!a!cabo!en!placas!de!96! pocillos! con! el! equipo!ABI! 7500! (Applied! Biosystems).! El! programa! usado! para! la! amplificación!del!ADN!consistió!en!una!pre-incubación!de!5!minutos!a!95°C,!y!45!ciclos! de! 10! segundos! a! 95°C,! 10! segundos! a! 60°C! y! 10! segundos! a! 72°C.! Los! cebadores! utilizados!en!los!análisis!se!describen!en!la!Tabla!2.!Una!vez!terminada!la!reacción!se! llevó!a!cabo!un!paso!de!disociación!para!analizar!la!curva!y!constatar!la!amplificación! de!un!solo!producto.!Para!cada!muestra!se!realizaron!tres!réplicas!técnicas!en!la!placa! Material!y!Métodos! ! 54! para!comprobar!la!reproducibilidad.!Para!que!la!eficiencia!de!la!amplificación!sea!del! 100%,!la!pendiente!de!la!curva!del!análisis!de!unas!muestras!de!concentración!seriada! debe!tener!un!valor!(m)!aproximado!a!3,3,!estableciendo!así!un!factor!de!amplificación! óptimo!de!2.!! Con! el! fin! de! verificar! que! la! pareja! de! cebadores! utilizados! en! cada! región! analizada!es!apta!para!el!análisis,!se!prepararon!diluciones!seriadas!de!!cromatina!de! una! de! las! muestras! y! se! llevó! a! cabo! la! reacción! de! amplificación.! Se! utilizó! un! programa! on-line! de! cálculos! de! eficiencia! de! qPCR,! que! determina! el! factor! de! amplificación!de!la!pareja!de!cebadores!a!partir!de!la!pendiente!de!la!recta!resultante! en! la! amplificación! de! la! dilución! seriada! realizada! (http://! dharmacon.! horizondiscovery.com/resources/tools-and-calculators/qpcr-efficiency-calculator/).! Si! el!factor!de!amplificación!está!en!torno!a!2,!la! pareja! de! cebadores! es! apta! para! el! análisis.! ! Bioinformática! Análisis!y!tratamiento!de!secuencias! Las! secuencias! de! ADN! y! las! informaciones! del! genoma! de! F.) oxysporum!se! obtuvieron! a! través! del! servidor! del! Broad! Institute! (www.broadinstitute.org)! y! a! través! del! servidor! EnsemblFungi! (http://fungi.ensembl.org).! Esta! última! fuente! también!se!utilizó!para!obtener!la!identidad!y!localización!de!dominios!para!el!diseño! de!los!cebadores!de!interés.!! Los! análisis! BLAST! y! BLASTP! se! realizaron! a! través! del! servidor! del! NCBI! (National!Center!of!Biotechnology!and!Informatics.!www.ncbi.nlm.nih.gov).! Las! secuenciaciones! se! realizaron! a! través! de! la! empresa! Stab! Vida,! y! se! analizaron! con! el! programa! informático! de! alineamiento! de! secuencias! ClustalW2! (European! Bioinformatics! Institute! of! the! European! Molecular! Biology! Laboratory,! EMBL-EBI)!y!a!través!del!software!Nucleobytes!4Peaks!(2004-2015!Nucleobytes!B.V).! Los! mapas! de! restricción,! las! fases! abiertas! de! lectura! y! las! secuencias! complementarias! de! las! secuencias! de! ADN! se! analizaron! con! los! programas! Serial! Cloner!2.6.1!(Serial!Basic!2004-2013)!y!SnapGene!2.6.2!(SnapGene®!2004-2018).! ! Tratamiento!de!los!datos!de!RNA-Seq! La! secuenciación! para! el! análisis! de! RNA-Seq! la! llevó! a! cabo! la! empresa! LifeSequencing! (Valencia)! mediante! la! plataforma! Illumina.! Esta! empresa! determinó! también! los! análisis! de! calidad! de! las! muestras! a! través! del! parámetro! RIN.! Las! características! de! las! muestras! de! ARN! utilizadas! por! la! empresa! se! resumen! en! la! Tabla!4.! ! Material!y!Métodos! ! 55! Tabla!4.!Datos!de!las!muestras!de!ARN!utilizadas!en!el!análisis!de!RNA-Seq.! Muestra/Condición! Referencia! 260/280! RIN! Concentración! (ng/µl)! Ng!Totales! Silvestre!oscuridad R1! 150022! 2,1! 9.80! 177! 8850! Silvestre!luz R1! 150023! 2,09! 10! 187! 9350! T2!oscuridad R1! 150024! 2,09! 9.90! 308! 15400! T3!oscuridad R1! 150025! 2,09! 10! 194! 9700! SX1 oscuridad R1! 150026! 2,09! 10! 222! 11100! SX2 oscuridad R1! 150027! 2,09! 10! 178! 8900! Silvestre!oscuridad R2! 150028! 2,1! 9.80! 200! 10000! Silvestre!luz R2! 150029! 2,04! 9.70! 223! 11150! T2!oscuridad R2! 150030! 2,08! 10! 208! 10400! T3!oscuridad R2! 150031! 2,1! 10! 207! 10350! SX1 oscuridad R2! 150032! 2,05! 10! 161! 8050! SX2 oscuridad R2! 150033! 2,09! 10! 175! 8750! ! Para! el! análisis! estadístico! y! gráfico! de! los! datos! de! secuencias! se! usó! el! programa!Rstudio!3.1,!basado!en!scripts!proporcionados!por!el!Dr.!Francisco!RomeroCampero! (Departamento! de! ciencias! de! la! Computación! e! Inteligencia! Artificial,! Universidad! de! Sevilla)! y! el! programa! para! análisis! de! datos! Bioconductor! (www.bioconductor.org).!Para!el!mapeo!y!visualización!de!lecturas!genómicas!de!las! muestras!analizadas!se!usó!la!aplicación!IGV!(Integratives!genomics!viewer!2.3.57).! El! proceso! de! las! muestras! del! protocolo! de! Illumina! se! resume!en! los! siguientes!pasos:!! ● Enriquecimiento! del! ARN! mediante! poli-A.! Teniendo! en! cuenta! que! una! gran! mayoría!de!ARN!presente!en!las!células!es!ribosómico,!el!enriquecimiento!asegura! que!se!obtiene!una!cantidad!de!ARN!adecuada!para!el!análisis!de!interés.!! ● Fragmentación!de!ARN.!Tras!la!purificación!del!ARN,!éste!se!fragmenta!a!tamaños! de!100!a!300!pares!de!bases.!! ● Síntesis!de!ADNc!de!doble!cadena.!Se!lleva!a!cabo!una!transcripción!inversa!de!las! moléculas!de!ARN!anteriores!con!oligo!dT.! ● Uso!de!adaptadores!para!los!extremos!terminales.! ● Selección!de!fragmentos!de!tamaño!similar!y!posterior!amplificación!por!PCR.! ! El!tratamiento!de!los!datos!de!la!secuenciación!por!la!plataforma!Illumina!se!realizó! a!través!de!la!plataforma!CICA!(Centro!Informático!Científico!de!Andalucía)!utilizando! el!protocolo!Tuxedo,!con!el!asesoramiento!y!colaboración!del!Dr.!Francisco!RomeroCampero.!Para!el!control!de!calidad!se!usó!el!paquete!de!software!FastQC.! Material!y!Métodos! ! 56! El! mapeo! de! lecturas! frente! al! genoma! de! referencia! de! F.) oxysporum,! el! ensamblaje!de! los! transcritos! y! el! estudio! de! la! expresión! diferencial! se! analizaron! utilizando! las! herramientas! Bowtie,! TopHat,! Cufflinks! y! Cuffmerge! (Trapnell! et! al.,! 2012),!utilizando!parámetros!que!los!programas!asignan!por!defecto.!En!concreto,!se! utilizó!Tophat!para!mapear!las!lecturas!frente!al!genoma!de!referencia!y!Cufflinks!para! el! ensamblaje! de! los! transcritos.! Los! resultados! obtenidos! se! integraron! con! la! herramienta! Cuffmerge.! Los! niveles! de! expresión! génica! se! obtuvieron! en! FPKM! (fragmentos!por!kilobase!de!transcritos!por!cada!millón!de!mapeos)!con!la!herramienta! Cuffdiff,!la!cual!aplica!una!normalización!en!las!lecturas!obtenida!en!la!secuenciación! eliminando!los!sesgos!debido!a!la!diferencia!de!longitud!de!los!transcritos!(Garber!et! al.,! 2011),! determinando! así! la! expresión! diferencial.! El! resto! del! análisis! y! la! visualización!de!los!resultados!se!realizó!a!través!del!paquete!CummeRbund,!obtenido! de! la! plataforma! Bioconductor! (www.bioconductor.org),! que! maneja! este! tipo! de! archivos! a! través! de! scripts! en! lenguaje! R.! La! cadena! completa! de! procedimientos! (Pipeline)!se!resumen!en!la!Figura!M2.! ! ! La!generación!de!categorías!GO!se!basó!en!la!anotación!automática!del!genoma! de!F.) oxysporum) usando!los!dominios!proteicos!detectados!por!la! base!de!datos!de! Pfam.!La!falta!de!asignación!de!los!genes!de!F.)oxysporum!dificultó!la!asignación!de! dominios.! Para! la! identificación! de! las! asignaciones! GO! se! usó! la! aplicación! REVIGO! (http://revigo.irb.hr).!En!este!servidor!web!se!simplifican!las!listas!de!los!términos!GO! mediante!la!búsqueda!de!un!subconjunto!representativo!de!los!términos,!usando!un! algoritmo!de!agrupamiento!simple!que!se!basa!en!medidas!de!similitud!(Supek!et!al,! 2011).! ! Figura! M2.!Secuencia! de! los! procedimientos! en! el! tratamiento! y! obtención!de!datos!de!RNA-Seq!desde!el! sistema! de! secuenciación! de! Illumina.! Modificado!de!Trapnell!et!al.,!2012.! ! ! Resultados!! Resultados.!Capítulo!1! ! 64! menos! 6! rutas! diferentes! responsables! de! estas! pequeñas! moléculas! de! ARN,! estableciendo!Neurospora!como!un!modelo!de!estudio!en!la!función!y!biogénesis!de! pequeños! ARNs.! Datos! posteriores! en! Cryptonetria,! Mucor,! Aspergillus,! Fusarium,! Botrytis,! y! otras! especies,! indican! que! el! ADNi! está! ampliamente! conservado! en! los! hongos!filamentosos!y!juega!un!papel!importante!de!defensa!en!el!genoma!(Li!et!al.,! 2010).! Estos! ARNs! no! codificantes! participan! en! una! amplia! y! diversa! colección! deeventos!regulatorios!que!abarcan!desde!controlar!el!número!de!copias!en!bacterias! (del! Solar! y! Espinosa,! 2000)! a! la! inactivación! del! cromosoma! X! en! mamíferos! (Mlynarczyk! y! Panning,! 2000).! La! mayoría! de! los! miARN! estudiados,! regulan! negativamente!la!expresión!de!sus!genes!diana!a!nivel!postranscripcional!(Bartel,!2004;! Lai,!2003).! ! !Teniendo!en!cuenta!resultados!previos!en!la!bibliografía,!la!posible!presencia! de! dos! precursores! de! microARN! en! la! región! genómica! de! carS!y! su! posible! papel! como!reguladores!negativos!del!ARNm!de!carS,!podría!ser!uno!de!los!mecanismos!de! regulación! de! la! carotenogénesis.! Las! secuencias! de! los! posibles! precursores! de! miARNs!encontrados!en!la!región!genómica!anterior!al!gen!carS!se!denominaron!foxmir-1)y!fox-mir-2!(Figura!C1.2!B!y!C)!(Rodríguez-Ortiz,!2012),!y!su!posible!función!en!F.) oxysporum!es!objeto!de!estudio!en!este!capítulo.! Figura!C1.2.!A!Ubicación!de!los!genes!para!los!supuestos!precursores!de!microARN!fox-mir1!y!fox-mir2)en! la!secuencia!intergénica!entre!Foxg_09306!y!carS.!Se!representa!también!el!sitio!de!integración!del!ADN-T! en!el!mutante!T2!y!la!región!alterada!en!el!mutante!T3!(cuadrado!gris).!B!Secuencia!de!ARN!de!los!posibles! precursores!de!microARN!fox-mir1!y!fox-mir2.!Se!indican!en!gris!las!secuencias!con!mayor!probabilidad!de! producir!microARN!maduros.!C!Estructura!de!los!pre-microARNs!de!fox-mir1!y!fox-mir2!de!acuerdo!con!las! configuraciones!de!más!baja!energía!(ΔG=!-63,3!y!ΔG=-80,1,!respectivamente)!según!el!programa!mfold! (Rodríguez-Ortiz,!2012). ! Resultados.!Capítulo!1! ! 65! ! Figura! C1.3.!Contenido! en! carotenoides! de! varios! mutantes!superproductores.!T2!y!T3!son!transformantres! insercionales,! SX1! y! SX2! se! obtuvieron! por! mutagénesis! química.! Los! carotenoides! se! extrajeron! de! colonias! incubadas!sobre!agar!DGasn!durante!7!días!en!oscuridad!o! en!la!luz.!Los!datos!son!la!media!de!3!réplicas!biológicas! independientes! y! las! barras! representan! el! error! de! la! media. ! Resultados! Producción!de!carotenoides!en!las!estirpes!superproductoras! ! A! fin! de! iniciar! el! estudio! del! posible! papel! regulador! de! los! presuntos! microARN!de!F.)oxysporum,!como!primer!paso!se!volvió!a!comprobar!el!fenotipo!de!los! dos!transformantes! superproductores! de!carotenoides! con! alteraciones!en! la! región! del!gen!carS,!así!como!el!de!dos!mutantes!del!gen!carS!anteriormente!estudiados,!SX1! y!SX2.!El! transformante!T1!no! se! incluyó!en! el! estudio!por!poseer! una! inserción!de! cinco!bases!en!la!propia!secuencia!del!gen!carS,!ya!que!aportaría!la!misma!información! que!SX1!y!SX2.!Como!se!esperaba,!las!cuatro!estirpes!contienen!más!carotenoides!que! la!estirpe!silvestre,!aunque!T3!muestra!un!fenotipo!menos!acusado,!especialmente!en! la!oscuridad!(Figura!C1.3).!Estos!resultados!son!coherentes!con!un!estudio!anterior!de! las!mismas!estirpes!(Rodríguez-Ortiz,!2012).! ! ! ! Transcripción!de!los!presuntos!genes!de!precursores!de!microARN!fox-mir-1!y! fox-mir2( ! Las! secuencias! de! fox-mir1!y! fox-mir-2! permanecen! íntegras! en! los! transformantes! T2! y! T3.! Sin! embargo,! estos! mutantes! tienen! alteraciones! en! secuencias! de! ADN! próximas,! que! podrían! afectar! la! transcripción! de! los! presuntos! precursores!de!estos!microARNs.!Con!el!propósito!de!estudiar!la!posible!relación!del! fenotipo!de!sobreproducción!de!carotenoides!con!la!transcripción!de!fox-mir-1!y!foxmir2,!se!estudiaron!mediante!RT-qPCR!los!niveles!de!los!presumibles!ARN!precursores! en! las! distintas! estirpes! superproductoras! de! carotenoides! (Figura! C1.4).! En! este! mismo! análisis! se! incluyeron! también! el! gen! regulador! carS) y,! como! controles! de! regulación! de! la! ruta,! los! genes! estructurales! carRA!y! carB.! Como! se! esperaba,! las! cantidades!de!ARNm!de!los!genes!carRA!y!carB!fueron!mucho!más!elevadas!en!todos! Resultados.!Capítulo!1! ! 66! los! mutantes! superproductores! de! carotenoides! tanto! en! la! luz! como! en! oscuridad.! Llama! la! atención! que! los! niveles! fueron! también! muy! altos! en! oscuridad! en! el! transformante!T3,!aunque!su!contenido!en!carotenoides!fuera!relativamente!bajo!en! comparación! con! las! otras! estirpes,! indicando! la! existencia! de! mecanismos! de! regulación!post-transcripcionales.! !!Como!se!esperaba,!la!cantidad!de!ARNm!del!gen!carS!muestra!una!inducción! por!la!luz!en!la!estirpe!silvestre!y!en!los!propios!mutantes!carS,!observándose!también! dicha!inducción!en!los!transformantes!T2!y!T3.!Un!resultado!especialmente!interesante! es!que!los!niveles!de!ARNm!del!gen!carS!fueron!más!reducidos!en!los!transformantes! T2!y!T3!que!en!la!estirpe!silvestre,!siendo!la!diferencia!especialmente!llamativa!en!el! caso! de! T2.! Sin! embargo,! los! mutantes! del! propio! gen! carS,! SX1! y! SX2,! mostraron! niveles! especialmente! bajos! en! la! oscuridad.! No! obstante,! en! todas! las! estirpes! los! niveles!de!ARNm!de!carS!suben!en!la!luz.! ! Respecto!a!los!niveles!de!los!supuestos!precursores!de!microARN!en!las!mismas! estirpes,!se!observaron!patrones!similares,!pero!no!iguales!para!fox-mir1!y!fox-mir2.!En! ! Figura!C1.4.!Niveles!de!los!supuestos!ARN!precursores!de!fox-mir1,!fox-mir2,!así!como!de!los!ARNm!de!los! genes!carS!y!los!genes!estructurales!carB!y!carRA!en!la!estirpe!silvestre!y!en!las!estirpes!superproductoras!de! carotenoides.!Las!estirpes!se!cultivaron!en!medio!DGasn!líquido!durante!3!días!en!oscuridad!y!en!su!caso!se! expusieron!posteriormente! 1!hora!a!la!luz.!Los!resultados!muestran!la!media!y!el!error!de!la!media!de!tres! réplicas!biológicas!independientes.! Resultados.!Capítulo!1! ! 67! todos!los!casos!sus!cantidades!fueron!mayores!en!la!luz!que!en!la!oscuridad,!lo!que! indica!también!fotorregulación!de!estos!transcritos.!Con!la!única!excepción!de!T3!para! fox-mir1,! en! oscuridad! las! cantidades! de! los! presuntos! precursores! de! ambos! microARN! fueron! mayores! en! los! mutantes! carS! y! menores! en! los! transformantes,! indicando!motivos!diferentes!para!el!fenotipo!desregulado!de!la!carotenogénesis!en! ambos!tipos!de!estirpe.!! Interrupción!dirigida!de!fox-mir1(y!fox-mir2( ! Los! resultados! descritos! en! el! apartado! anterior! sugieren! una! posible! implicación!de!los!supuestos!fox-mir1)y!fox-mir2!en!la!regulación!de!la!carotenogénesis! en!F.)oxysporum.!Para!estudiar!la!posible!función!de!fox-mir1!y!fox-mir2!se!generaron! estirpes!mutantes!en!fondo!silvestre!mediante!reemplazamiento!génico.!Para!construir! los!vectores!se!empleó!la!técnica!de!recombinación!homóloga!de!levaduras!(Colot!et! al.,!2006),!que!permite!sustituir!el!alelo!silvestre!por!un!marcador!seleccionable,!en! este! caso! el! cassette! de! resistencia! a! higromicina! B! HygR.! Para! ello,! se! diseñaron! cebadores! que! permitieron! obtener! mediante! PCR,! a! partir! de! ADN! genómico,! fragmentos!flanqueantes!a!la!secuencia!diana!a!sustituir!de!aproximadamente!1,5!kb.! Dichos!fragmentos!correspondían!a!los!extremos!5’!y!3’!del!ADN!diana!y!poseían!unas! colas!específicas!de!homología!al!plásmido!pRS426!y!al!cassette!HygR.!Por!otra!parte,! se!obtuvo!el!cassette!HygR!a!partir!de!ADN!del!plásmido!pCSN44!mediante!PCR,!y!por! último! se! utilizó! el! plásmido! pRS426! abierto! con! las! enzimas! XhoI! y! EcoRI.! Los! tres! fragmentos! se! introdujeron! a! la! vez! en! levaduras! competentes! para! generar! por! recombinación!homóloga!el!plásmido!con!la!construcción!deseada!(protocolo!descrito! en!el!apartado!Material!y!Métodos).! Las! construcciones! con! el! cassette! reemplazando! las! secuencias! de! los! supuestos!microARN!se!utilizaron!para!transformar!protoplastos!de!la!estirpe!silvestre! y!obtener!de!esta!forma!transformantes!resistentes!a!higromicina.!El!reemplazamiento! correcto!de!las!secuencias!diana!por!el!cassette!hygR!en!los!transformantes!se!verificó! mediante! PCR,! usando! combinaciones! adecuadas! de! cebadores,! y! mediante! hibridación!por!Southern.!Los!cebadores!utilizados,!así!como!la!sonda!correspondiente,! se!representan!en!las!figuras!C1.5A!y!C1.6A.!! En!el!caso!de!la!mutación!Δmir1,!se!obtuvieron!6!transformantes,!de!los!cuales! solo! dos! mostraron! una! banda! del! tamaño! esperado! al! amplificar! por! PCR! con! los! cebadores!Foxy-22F!y!Foxy-23F!(OX35!y!OX37!en!la!Figura!C1.5A).!La!banda!obtenida! tras!el!reemplazamiento!de!fox-mir1!por!el!cassette!HygR!fue!de!0,7!kb!mientras!que!la! banda!del!silvestre!era!de!1,2!kb!(Figura!C1.5B).!Para!la!mutación!Δmir2,!se!obtuvieron! 8!transformantes,!de!los!cuales!cinco!mostraron!el!patrón!de!bandas!correspondiente! a!la!sustitución!de!fox-mir2!por!HygR!al!amplificar!por!PCR!con!los!cebadores!Foxy-6F!y! Resultados.!Capítulo!1! ! 68! ! Figura! C1.5.!Deleción! dirigida! de! fox-mir1! (Δmir1)! en! la! estirpe! silvestre.! A!Mapas!de! la!región!genómica! donde!se!ubican!los!presuntos!microARN!en!la!estirpe!silvestre!y!en!el!transformante!con!la!sustitución!de!la! región!fox-mir1!por!un!cassette!de!resistencia!a!higromicina!(hph).!Se!muestran!los!cebadores!externos!que!se! usaron!para!amplificar!la!región!completa,!las!sondas!para!la!hibridación!Southern!y!los!sitios!de!corte!para!la! endonucleasa!AvaI.!B!PCR!de!comprobación!de!la!deleción!de!fox-mir1!en!los!transformantes.!Se!empleó!ADN! genómico!de!6! transformantes!y!de!la!estirpe!silvestre!(WT)!como!control.! Los!cebadores! utilizados! fueron! Foxy-22F!(OX35)!y!Foxy-23R!(OX37),!que!amplifican!segmentos!de!1,2!kb!en!la!estirpe!silvestre!y!2,3!kb!en!los! transformantes! con! el! reemplazamiento! esperado.! Se! incluye! un! carril! con! marcadores! de! tamaño! (MT).! C! Hibridación!Southern!de!las!muestras!de!ADN!genómico!de!los!transformantes!#2!y!#4!(SX78!y!SX79)!digeridas! con!AvaI.!Se!usó!la!sonda!mir1!indicada!en!rojo!en!el!esquema!superior.!Los!tamaños!esperados!son!0,7!kb!para! la!estirpe!silvestre!(WT)!y!1,8!kb!para!los!transformantes!Δ mir1.!Se!añadieron!como!controles!adicionales!los! transformantes!Δmir2!#3!y!#4!(SX80!y!SX81). ! A! B ! C! PCR-mir2-07-1R,!indicados!respectivamente!como!OX10!y!OMP826!en!la!Figura!C1.6A.! Los!mutantes! Δmir2!mostraron! una!banda! de!2,7! kb!frente! a!los! 2!kb! de!la! estirpe! silvestre!(Figura!C1.6B).! ! Se!eligieron!dos!transformantes!positivos!de!Δmir1,)(Δmir1)#2!y!#4)!y!otros!dos! de!Δmir2!(Δmir2!#3!y!#4)!para!realizar!una!segunda!verificación!del!reemplazamiento! mediante!Southern.!Se!obtuvieron!muestras!de!ADN!genómico!de!los!transformantes,! se!digirieron!con!la!enzima!de!restricción!AvaI!y!se!separaron!mediante!electroforesis.! Una! vez! comprobada! visualmente! la! digestión! completa! de! las! muestras,! se! transfirieron!a!una!membrana!y!se!hibridaron!con!sondas!correspondientes!a!regiones! aledañas! a! los! segmentos! de! ADN! reemplazados,! denominadas! mir1! y! mir2,! respectivamente!(Figuras!C1.5!y!C1.6).!La!sonda!mir1!se!obtuvo!mediante!PCR!a!partir! de! ADN! del! plásmidos! pDul8! amplificado! con! los! cebadores! Foxy-4F/Foxy-41R! y! la! Resultados.!Capítulo!1! ! 69! sonda! mir2! a! partir! de! pDul7! con! los! cebadores! Foxy-7F/Foxy-39R.! Las! sondas! se! eligieron!de!forma!que!cubrieran!parte!de!la!construcción!pero!no!parte!del!segmento! delecionado,!de!manera!que!dieran!lugar!a!patrones!de!bandas!diferentes!en!la!estirpe! silvestre!y!en!ambos!tipos!de!mutantes.! Los! resultados! de! la! hibridación! mostraron! que! los! dos! transformantes! analizados!para!Δmir1!(#2!y!#4)!presentan!una!banda!de!1,9!kb,!correspondiente!al! reemplazamiento!correcto!de!la!secuencia!diana!por!el!cassette!HygR,!frente!a!la!banda! de!0,7!kb! de! la!estirpe! silvestre.! En!el! caso! de!#4,! se! observaron!además!otras! dos! bandas,!consistentes!con!integraciones!ectópicas!de!la!construcción!(Figura!C1.5!C).!En! el!caso!de!los!transformantes!analizados!para!Δmir2!(#3!y!#4),!ambos!mostraron!una! banda!de!4!kb,!acorde!con!la!sustitución!de!fox-mir2!por!el!cassette!HygR,!frente!a!la! banda!de!1,8!kb!de!la!estirpe!silvestre!(Figura!C1.6!C).! ! Figura!C1.6.!Deleción!dirigida!de!fox-mir2!( Δ mir2)!en!la!estirpe!silvestre.!A!Mapas!de!la!región!genómica! donde!se!ubican!los!presuntos!microARN,!en!la!estirpe!silvestre!y!en!el!transformante!tras!la!sustitución!de!la! región! fox-mir2) por! un! cassette! de! resistencia! a! higromicina! (hph).! Se! muestran! los! cebadores! externos! usados!para!amplificar!la!región!completa,!las!sondas!para!la!hibridación!Southern!y!los!sitios!de!corte!para!la! endonucleasa!AvaI.!B!PCR!de!comprobación!de!la!deleción!de!fox-mir2!en!los!transformantes,!usando!ADN! genómico!de!6!transformantes!y!de!la!estirpe!silvestre!(WT)!como!control.!Los!cebadores!utilizados!fueron! Foxy-6F!(OX10)!y!PCR-mir2-07-1R!(OMP826),!que!amplifican!segmentos!de!2!kb!en!la!estirpe!silvestre!y!2,7! kb!en!los!transformantes!con!el!reemplazamiento!esperado.!Se!incluye!un!carril!con!marcadores!de!tamaño! (MT).!C!Hibridación!Southern!de!las!muestras!de!ADN!genómico!de!los!transformantes!#3!y!#4!(SX80!y!SX81)! digeridas!con!AvaI.!Se!usó!la!sonda!mir2!indicada!en!rojo!en!el!esquema!superior.!Los!tamaños!esperados! son!1,8!kb!para!la!estirpe!silvestre!(WT)!y!4!kb!para!los!transformantes!Δ mir2.!Se!añadieron!como!controles! adicionales!los!transformantes!Δmir1!#2!y!#4!(SX78!y!SX79).! A! B! C! Resultados.!Capítulo!1! ! 70! !Los!dos!transformantes!obtenidos!con!la!deleción!de!fox-mir1!se!denominaron! SX78)(Δmir1!#2),!y!SX79!(Δmir1!#4).!Por!su!parte,!los!dos!transformantes!obtenidos!con! la! deleción! de! fox-mir2! se! denominaron! SX80)(Δmir2! #3),! y! SX81! (Δmir2! #4).! Estas! cuatro! estirpes! se! utilizaron! para! las! caracterizaciones! fenotípicas! descritas! en! los! siguientes!apartados.! ! Caracterización!de!los!transformantes!Δmir1!(Δfox-mir1)!y!Δmir2!(Δfox-mir2)! ! ● Fenotipo!de!los!transformantes!Δmir1!y!Δmir2!! ! Para!comprobar!el!efecto!de!las!mutaciones!Δmir1!y!Δmir2!sobre!el!fenotipo!de! F.) oxysporum,! se! cultivaron! la! estirpe! silvestre! y! los! dos! transformantes! disponibles! para!cada!mutación!sobre!medio!mínimo!DGasn!durante!siete!días,!en!oscuridad!o!en! iluminación.! Tanto! la! morfología! de! las! colonias! como! la! velocidad! de! crecimiento! fueron! similares! en! las! cinco! estirpes! en! ambas! condiciones! de! cultivo.! Así,! el! seguimiento! diario! del! diámetro! de! las! colonias! durante! una! semana! no! reveló! diferencias!apreciables!entre!ellas!(Figura!C1.7!A).! Como!cabía! esperar,!las!cinco!estirpes!presentaron!en!la!oscuridad!el!mismo! aspecto! blanquecino.! Sin! embargo,! mientras! que! la! estirpe! silvestre! presentó! su! característica! pigmentación! anaranjada! en! la! luz,! los! transformantes! mostraron! un! fenotipo!albino!(Figura!C1.7!B).!Este!resultado!indica!un!defecto!de!los!transformantes! en! la! fotoinducción! de! la! carotenogénesis,! por! lo! que! se! procedió! a! analizar! su! contenido!en!carotenoides.! ! ● Síntesis!de!carotenoides!en!los!transformantes!Δmir1!y!Δmir2!! ! Se! recogieron! muestras! de! micelio! de! las! cinco! estirpes! y! se! determinó! el! contenido! en! carotenoides! en! las! condiciones! de! cultivo! descritas! en! el! apartado! anterior.!Los!resultados!mostraron!una!fuerte!caída!en!la!cantidad!de!carotenoides!en! los!transformantes!en!la!luz,!especialmente!en!aquellos!con!la!mutación!Δmir2!(Figura! C1.7C).! Ante! la! duda! de! si! el! fenotipo! albino! en! la! luz! se! debía! a! ausencia! de! carotenoides!o!a!un!bloqueo!de!la!desaturasa!de!fitoeno,!el!precursor!incoloro!de!los! carotenoides!(ver!Introducción!general),!se!analizó!el!contenido!en!fitoeno!de!una!de! las! muestras! procedentes! de! los! micelios! iluminados! de! cada! estirpe.! Los! datos! mostraron!una!disminución!en!el!contenido!en!fitoeno!en!los!transformantes!Δmir1)en! relación!con!la!estirpe!silvestre,!y!su!práctica!total!desaparición!en!los!transformantes! Δmir2!(Figura!C1.7!D).!! Resultados.!Capítulo!1! ! 71! Los!resultados!indican!que!los!mutantes!Δmir1!y!Δmir2!están!afectados!en!la! capacidad! de! fotoinducir! la! síntesis! de! carotenoides,! incluyendo! la! síntesis! del! precursor! incoloro! fitoeno,! siendo! dicha! fotoinducción! prácticamente! inexistente! en! los!mutantes!Δ!)mir2.!! ! ● Expresión!de!los!genes!car!en!los!mutantes!Δmir1!y(Δmir2! ! Como! ya! se! ha! indicado! en! la! Introducción! general,! la! fotoinducción! de! la! síntesis! de! carotenoides! tiene! lugar! principalmente! a! nivel! de! aumento! de! la! A! Figura! C1.7.!Caracterización! fenotípica! de! los! transformantes! con! las! mutaciones! Δ mir1!y! Δ mir2.! Se! analizaron!la!estirpe!silvestre!(WT)!y!los!transformantes!Δmir1!(SX78!y!SX79)!y!Δ mir2!(SX80!y!SX81).!Para! simplificar,! se! indican! en! su! caso! los! números! de! los! mutantes! SX.! Las! estirpes! se! incubaron! 7! días! en! oscuridad!o!bajo!la!luz!en!medio!mínimo!DGasn.!A!Curva!de!crecimiento!de!colonias!incubadas!en!la!luz.!B! Aspecto!de!las!colonias!incubadas!en!la!luz!de!la!estirpe!silvestre!y!de!uno!de!los!dos!transformantes!para! cada!mutación.!C!Contenido!de!carotenoides!de!las!estirpes!incubadas!en!oscuridad!o!en!la!luz.!D!Contenido! en!fitoeno!de!los!cultivos!incubados!en!la!luz. ! C ! D! Luz! WT! B! Δmir1) 78) Δmir2) 80) Resultados.!Capítulo!1! ! 72! transcripción!de! los! genes!responsables.! Para!profundizar! en! la!causa! molecular! del! fenotipo!albino!de!los!transformantes!en!la!luz,!se!determinaron!los!niveles!de!ARNm! de! los! distintos! genes! car! en! respuesta! a! la! luz! en! la! estirpe! silvestre! y! en! los! dos! transformantes!para!cada!mutación!estudiados!en!el!apartado!anterior.!Para!ello,!las! estirpes!se!incubaron!3!días!en!oscuridad,!se!iluminaron!en!su!caso!durante!una!hora,!y! se!determinaron!mediante!RT-qPCR!las!cantidades!de!ARNm!de!los!cuatro!genes!del! cluster!car! (carRA,! carB,! carX!y! carO)! así! como! de! los! otros! dos! genes! de! la! ruta! biosintética! de! la! neurosporaxantina! (carT!y! carD),! y! del! gen! regulador! carS! (Figura!!! C1.8).!! ! Figura!C1.8.!Efecto!de!la!deleción!de!fox-mir1!y!fox-mir2!sobre!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!del!cluster!car!(carX,! carRA,! carB!y! carO)! y! los! genes! carT,! carD!y! carS.!La! estirpe! silvestre! (WT)! y! los! transformantes! Δmir1!y! Δ mir2!se! incubaron!tres!días!en!oscuridad!y!en!su!caso!se!expusieron!una!hora!a!luz.!Para!simplificar,!se!indican!bajo!los!gráficos! solo!los!números!de!los!mutantes!SX.!En!la!parte!superior!se!representan!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!del!cluster!car!y! en!la!parte!inferior!los!de!los!genes!carS,!carT!y!carD.!En!la!parte!central!se!muestra!la!organización!genómica!de!los!genes! analizados.!Los!resultados!muestran!la!media!y!el!error!estándar!de!tres!réplicas!biológicas!independientes. ! Resultados.!Capítulo!1! ! 73! En!consonancia!con!los!datos!de!carotenoides!in)vivo!de!la!estirpe!silvestre,!se! observó! una! disminución! en! la! fotoinducción! de! los! genes! del! cluster!car!de! aproximadamente! un! orden! de! magnitud! en! los! mutantes! Δmir1!y! dos! órdenes! de! magnitud!en!los!mutantes!Δmir2,!mientras!que!no!se!observaron!cambios!significativos! en!los!dos!últimos!genes!de!la!ruta,!carT!y!carD.!Sin!embargo,!en!la!oscuridad!dichas! mutaciones!apenas!tuvieron!efecto!sobre!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!indicados.! Para!la!síntesis!de!carotenoides!coloreados!es!imprescindible!la!participación!de!carRA! y! carB,! por! lo! que! la! bajada!en! los! niveles! de! ARNm! de! ambos!genes! en! la! luz! es! suficiente!para!explicar!el!fenotipo!albino.! En! todos! los! mutantes! aumentaron! los! niveles! de! ARNm! del! gen! carS!en! relación!a!la!estirpe!silvestre,!siendo!más!notable!este!aumento!en!los!transformantes! con! la! mutación! Δmir2.! Es! interesante! destacar! que! a! pesar! de! los! cambios! en! los! niveles! de! ARNm! de! carS! y! de! los! cuatro! genes! del! cluster,! se! seguían! observando! patrones!de!fotoinducción,!por!lo!que!las!mutaciones!Δmir1!y!Δmir2)más!que!afectar!al! mecanismo!de!fotoinducción,!reducen!los!niveles!globales!de!expresión!de!los!genes! del!cluster.!Con!respecto!a!carS,!al!ser!un!regulador!negativo!de!la!carotenogénesis,!la! subida!de!los!niveles!de!transcripción!en!los!transformantes!podría!estar!relacionada! con!la!bajada!en!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!del!cluster,!por!lo!que!fox-mir1!y! fox-mir2! podrían! formar! parte! del! mecanismo! de! regulación! de! la! carotenogénesis! mediado!por!carS.! ! ! ! ! Resultados.!Capítulo!2! ! 80! ! Figura!C2.1.!Ejemplo!de!calidad!de!las!muestras!según! los!parámetros!visualizados!a!través!del! programa! FastQC.!Solo! se! representan! los! gráficos! para! una! de! las! muestras,! en! este! caso! la! correspondiente! a! la! estirpe! silvestre! incubados! en! oscuridad! (REFERENCIA! 150028).! A! Representación!de!calidad!según!la!posición!nucleotídica!para!todas!las!lecturas!detectadas!en!la! secuenciación.!El!análisis!corresponde!a!fragmentos!de!unas!50!pb!de!longitud,!en!las!cuales!no!se! detectan!problemas! de! calidad! apreciables! a!lo!lago! de! las!lecturas.! La! línea! azul!representa! los! valores! medios! y! la! línea! roja! la! mediana.! Todas! las! lecturas! se! sitúan! en! la! franja! verde,! confirmando! su! calidad.! B!Distribución! del! contenido! de! bases.! Se! aprecia! una! distribución! uniforme,! sin! desviaciones! excepto! en! un! bajo! número! de! secuencias! debido! al! problema! de! eliminación! de! adaptadores! en! el! extremo!5’.! Esto! es! algo! usual! en! el! método! y! no! altera! los! resultados.!C!Medición!de!la!calidad!media!de!cada!lectura.!El!eje!de!abscisas!representa!la!calidad!y! el!eje! de! ordenada!las!lecturas.!Todas! las! lecturas!tiene! un!índice!de!calidad! superior!a!30.!Las! secuencias!con!valores!inferiores!a!20!indican!problemas!de!calidad.!D!Medición!de!la!calidad!con! respecto!a!la! técnica!de!secuenciación.! El! eje!de!ordenadas!también! representa!las! lecturas.!Se! observa!que!la!inmensa!mayoría!de!las!lecturas!se!sitúa!en!torno!a!50!bases.! ADNasa!y!se!purificaron!a!continuación!con!un!kit!comercial!(ver!detalles!en!Material!y! Métodos).!! ! La! calidad! e! integridad! de! las! muestras! de! ARN! se! evaluó! por! espectrofotometría!y!visualización!en!gel!de!agarosa!y!las!muestras!se!enviaron!para!su! secuenciación!en!masa!a!la!empresa!LifeSequencing!(Valencia).!Antes!de!su!uso!para!la! secuenciación,! los! técnicos! de! la! empresa! evaluaron! la! calidad! de! las! muestras! Resultados.!Capítulo!2! ! 81! proporcionadas!calculando!su!valor!RIN,!un!parámetro!basado!en!la!cuantificación!de! los! productos! de! degradación! de! ARN! tras! su! migración! en! una! electroforesis.! Los! valores!de!RIN!pueden!oscilar!entre!1!y!10,!siendo!necesario!un!valor!mínimo!de!8!para! proceder! con! la! secuenciación! (Schroeder! et! al.,! 2006).! Los! valores! de! RIN! de! las! muestras! enviadas! oscilaron! entre! 9.7! y! 10! (Tabla! 4,! Materiales! y! Métodos).! No! se! observaron!indicios!de!degradación!y!los!ARN!ribosómicos!18S!y!20S!se!detectaron!en! una!relación!correcta.!! Secuenciación! La! secuenciación! se! llevó! a! cabo! mediante! la! plataforma! Illumina! (Metzker,! 2010).!La!tecnología!empleada!no!requiere!el!ensamblaje!del!transcriptoma!completo,! ya! que! es! suficiente! una! baja! proporción! de! lecturas! de! transcritos! pequeños! para! detectar!la!expresión!de!un!gen!sin!necesidad!de!detectar!un!transcrito!largo.!Por!su! alta! eficiencia,! la! metodología! Illumina! proporciona! un! número! de! lecturas! suficientemente!elevado!para!garantizar!la!fiabilidad!de!los!datos!de!cuantificación!de! la!expresión!génica.!Las!lecturas!obtenidas!y!sus!características!básicas!se!describen!en! la!tabla!C2.1.! ! Tabla!C2.1.!Características!básicas!de!las!muestras!y!rendimiento!de!las!lecturas.!! Muestra! Nº!Lecturas! (x106)! Lecturas! mapeadas!(%)! Contenido!G+C! (%)! Longitud!media!de! lecturas! Calidad *! WT!osc!(1)! 11.97! 90.4! 53! 43.70! 35.22! WT!osc!(2)! 9.71! 91.5! 52! 43.96! 35.27! WT!luz!(1)! 8.91! 91.1! 52! 43.76! 35.19! WT!luz!(2)! 10.41! 91.5! 52! 43.99! 35.29! T2!osc!(1)! 9.23! 91.5! 52! 43.05! 35.26! T2!osc!(2)! 9.09! 91.3! 52! 43.12! 35.31! T3!osc!(1)! 10.37! 91.2! 53! 42.94! 35.28! T3!osc!(2)! 8.72! 91.4! 52! 43.13! 35.20! SX1!osc!(1)! 11.50! 91.0! 52! 43.93! 35.29! SX1!osc!(2)! 10.49! 91.2! 52! 43.97! 35.30! SX2!osc!(1)! 8.76! 91.4! 52! 43.94! 35.27! SX2!osc!(2)! 9.72! 90.7! 52! 43.84! 35.27! *Calidad!referida!a!la!posición!nucleotídica!para!todas!las!lecturas!detectadas!en!la!secuenciación.! Resultados.!Capítulo!2! ! 82! ! El!genoma!de!referencia!(Fusarium)oxysporum!f.!sp.!lycopersici!4287;!assembly! ASM14995v2,!NCBI)!tiene!un!contenido!global!G+C!del!47.6%,!y!los!marcos!abiertos!de! lectura!(ORFs)!anotados!representan!el!51,7%!del!genoma.!Las!secuencias!obtenidas! en!nuestro!estudio!de!RNA-Seq!tienen!un!contenido!medio!G+C!próximo!a!52%,!que!en! comparación! con! el! valor! global! de! 47,6%! indica! un! mayor! porcentaje! G+C! en! las! regiones! codificantes! que! en! las! no! codificantes.! Con! respecto! a! la! calidad! de! las! secuencias,!el!análisis!se!realizó!con!el!paquete!FastQC,!una!herramienta!de!control!de! calidad! para! secuenciaciones! masivas! que! ofrece! el! Instituto! Babraham! (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).! Este! análisis! arrojó! perfiles!similares!para!todas!las!muestras!(ejemplo!en!Figura!C2.1).! Los! datos! globales! de! las! secuencias! en! relación! con! el! genoma! anotado! identificaron!transcritos!para!17.999!genes,!con!18.097!isoformas,!asignables!a!17.687! secuencias! codificantes.! El! número! de! inicios! de! transcripción! identificados! fue! de! 1.501.!El!programa!detectó!un!número!muy!elevado!de!splicing!alternativos!(226.515),! lo!que!sugiere!que!la!maduración!alternativa!de!intrones!es!un!fenómeno!frecuente!en! F.)oxysporum.! Análisis!de!la!expresión!génica! ! Una! vez! calibrada! la! calidad! de! las! lecturas,! se! procedió! a! asignar! valores! de! expresión! a! cada! gen! en! las! distintas! muestras! analizadas,! utilizando! para! ello! el! protocolo!“Tuxedo”!(Material!y!Métodos).!La!representación!de!los!datos!de!expresión! corregidos!para!cada!gen!y!expresados!como!FPKM!en!un!gráfico!tipo!boxplot!(Figura! C2.2!A)!muestra!un!elevado!paralelismo!entre!todas!las!muestras,!especialmente!de!las! réplicas! biológicas! entre! sí,! con! medias! (trazo! central! cada! caja)! y! cuartiles! muy! similares.! A! partir! de! este! momento,! se! considera! cada! condición! y! estirpe! por! separado! utilizando! la! media! de! las! dos! réplicas! como! valor! de! expresión! en! cada! condición!experimental.! La!representación!global!de!la!variación!entre!las!réplicas!(CV2)!en!función!de!los! niveles! de! expresión,! expresados! como! FPKM,! muestra! un! grado! de! repetitividad! creciente!a!medida!que!aumenta!la!expresión!(Figura!C2.2!B).!Las!distribuciones!fueron! parecidas!en!las!diferentes!estirpes!y!condiciones!de!cultivo.! Análisis!de!expresión!diferencial:!efectos!de!la!mutación!carS!y!de!la!luz! ! Con! el! objetivo! de! identificar! los! genes! con! diferencias! significativas! en! los! niveles!de!expresión!de!sus!transcritos!en!las!distintas!condiciones!ensayadas,!se!utilizó! un!valor!p!de!0,05.!Una!vez!definido!como!umbral,!este!valor!nos!proporciona!el!dato! Resultados.!Capítulo!2! ! 83! ! Figura!C2.2.!Análisis! global! de!expresión! de! las!muestras.!A!Representación!boxplot!de!las!muestras! empleadas!en!el!estudio.!Las!cajas!representan!el!50%!de!la!variación!(±!1!cuartil),!y!el!trazo!interior! indica!la!media.!B!Distribución!global!de!la!expresión!de!los!genes!entre!las!réplicas!biológicas!en!función! de!los!valores!de!dicha!expresión.!La!línea!interior!indica!el!valor!medio!de!variación.!CV2:!coeficiente!de! variación!para!medir!la!dispersión!entre!las!lecturas.!Se!utilizó!el!protoloco!Tuxedo.! A! B! de! significancia! y! suele! oscilar! entre! 0,1! y! 0,01.! Los! valores! p! son! estadísticos! y! se! obtienen!a!partir!de!la!t!de!student,!que!tienen!en!cuenta!la!media!entre!réplicas!y!su! varianza.! ! Como! criterio! de! expresión! diferencial! se! utilizó! un! factor! de! 2,! tanto! de! activación!como!de!represión,!que!en!función!del!logaritmo!en!base!2!corresponde!a! un!valor!de!logaritmo!igual!a!1.!Aquellos!genes!cuyo!cambio!en!los!niveles!de!expresión! (originalmente!denominado!fold-change)!sea!superior!a!este!umbral!se!considerarán! activados,!y!aquellos!con!un!valor!inferior!al!valor!umbral,!reprimidos.!El!empleo!de!un! umbral! relativamente! bajo! asegura! que! no! se! descarte! ningún! posible! efecto! regulatorio,! aunque! dicho! efecto! será! lógicamente! más! significativo! a! medida! que! aumenta!el!valor!de!expresión!diferencial.!! Resultados.!Capítulo!2! ! 84! Atendiendo! al! criterio! mencionado,! se! indican! en! la! tabla! C2.2! el! número! de! genes!activados!y!reprimidos!como!consecuencia!de!la!luz!o!de!la!mutación!carS!en!las! distintas! combinaciones! de! interés.! Dado! que! los! mutantes! carS! SX1! y! SX2! pueden! tener! mutaciones! secundarias,! solo! se! interpreta! como! activaciones! o! represiones! atribuibles!a!la!mutación!carS!aquellas!que!coinciden!en!las!dos!estirpes.!Por!otro!lado,! aunque! sus! fenotipos! no! son! plenamente! coincidentes,! se! ha! utilizado! el! mismo! criterio! con! los! transformantes! T2! y! T3! para! identificar! aquellos! genes! que! se! vean! afectados!en!ambas!estirpes.! El!análisis!de!los!datos!de!la!tabla!muestra!un!número!muy!elevado!de!genes!afectados! por! la! luz,! superando! el! 3%! del! número! total! de! genes! del! genoma,! siendo! la! proporción!sensiblemente!más!baja!para!los!genes!reprimidos.!El!efecto!de!la!luz!es! mayor!que!el!impacto!de!la!mutación!carS,!con!un!número!de!genes!activados!que!no! alcanza!el!2%,!superando!de!nuevo!el!número!de!genes!activados!al!de!reprimidos.!La! situación! se! invierte! sin! embargo! para! los! genes! con! la! expresión! alterada! en! los! transformantes!T2!y!T3,!con!casi!un!4%!de!genes!reprimidos,!más!del!doble!que!los! activados.!! ! Tabla!C2.2.!Número!de!genes!cuya!expresión!varía!significativamente!en!las!condiciones!indicadas! ! Activados! %*! Reprimidos! %! Efecto!de!la!luz!en!la!estirpe!silvestre! 607! 3,3! 357! 1,9! Efecto!de!la!mutación!carS!(SX1/SX2)! 343! 1,9! 217! 122! Efecto!de!las!inserciones!de!ADN-T!en!T2/T3!! 294! 1,6! 710! 3,9! *!Los!porcentajes!se!refieren!respecto!al!número!total!de!genes!en!el!genoma.! ! La!mayoría!de!los!genes!activados!y!reprimidos!como!consecuencia!de!la!luz!o!de! la! mutación! carS! muestran! cambios! menores! en! los! niveles! de! expresión.! Esto! se! aprecia!en!las!gráficas!de!comparaciones!de!dos!condiciones,!en!los!que!cada!punto! representa!un!gen!(Figura!C2.3).!Las!gráficas!muestran!que!la!mayoría!de!los!genes!con! expresión!diferencial!se!concentran!en!la!región!próxima!al!umbral!elegido!(Figura!C2.3! A,! B! y! C).! La! observación! detallada! de! estos! gráficos! aporta! más! información.! En! concordancia!con!la!tabla!C2.2,!se!aprecia!un!número!mayor!de!genes!inducidos!que! de!reprimidos!por!la!luz.!Sin!embargo,!en!el!gráfico!se!puede!apreciar!que!el!número! de!genes!con!cambios!importantes!en!los!niveles!de!expresión!es!mucho!mayor!entre! los! genes! inducidos! que! entre! los! reprimidos.! También! se! observa! que! la! predominancia!de!genes!activados!entre!los!que!han!sufrido!los!mayores!cambios!de! expresión,!tanto!como!resultado!de!la!iluminación!como!la!mutación!carS,!se!invierte! en! los! transformantes! T2! y! T3,! en! los! que! es! patente! una! predominancia! de! genes! Resultados.!Capítulo!2! ! 85! reprimidos! entre! los! más! afectados! (Figura! C2.3! D! y! E).! Este! resultado! no! es! sorprendente,!ya!que,!como!se!ha!visto!en!el!capítulo!anterior,!los!transformantes!T2!y! T3! no! están! mutados! en! el! gen! carS! y! su! fenotipo! es! debido! a! las! alteraciones! genómicas!producidas!por!las!integraciones!de!ADN-T!en!la!región!genómica!de!carS.! Debe!tenerse!en!cuenta!además!que,!mientras!que!el!fenotipo!de!los!mutantes!SX1!y! SX2! se! puede! atribuir! a! sus! mutaciones! en! el! gen! carS,! los! transformantes! T2! y! T3! difieren!tanto!en!el!fenotipo!(T3!acumula!menos!carotenoides!que!T2,!especialmente! en!la!oscuridad)!como!en!el!genotipo!(las!inserciones!de!ADN-T!han!ocurrido!en!sitios! diferentes,!y!T2!muestra!una!alteración!adicional!que!no!está!aún!bien!caracterizada).! No!es!extraño!por!tanto,!que!la!comparación!entre!la!expresión!de!los!genes!en!SX1!y! SX2!(Figura!C2.3!F)!dé!menos!diferencias!que!la!comparación!entre!T2!y!T3!(Figura!C2.3! G).! ! Resultados.!Capítulo!2! ! 86! C ! ! WT_luz ! WT_oscuridad! A! SX1_oscuridad ! WT_oscuridad! B! SX2_oscuridad! WT_oscuridad! T2_oscuridad! D! WT_oscuridad! T3_oscuridad! WT_oscuridad! E! Genes:!WT_luz/WT_oscuridad! log10!(valor!P) ! log2!(fold)change)! Genes:!SX1_oscuridad/WT_oscuridad! log10!(valor!P)! log2!(fold)change)! Genes:!SX2_oscuridad/WT_oscuridad! log10!(valor!P)! log2!(fold)change)! Genes:!T2_oscuridad/WT_oscuridad! log10!(valor!P)! log2!(fold)change)! Genes:!T3_oscuridad/WT_oscuridad! log10!(valor!P)! log2!(fold)change)! ! Resultados.!Capítulo!2! ! 87! ! Figura!C2.3.!Comparaciones!de!los!transcriptomas!de!la!estirpe!silvestre!y!los!mutantes! superproductores!de!carotenoides.!A!Efecto!de!la!luz!en!la!estirpe!silvestre!(silvestre!luz!vs! silvestre!oscuridad).!B!Efecto!de!las!alteraciones!genéticas!de!SX1!(Mutante!SX1!oscuridad! vs!Silvestre! oscuridad).! C!Efecto! de! las! alteraciones! genéticas! de! SX2! (Mutante! SX2! oscuridad! vs!estirpe! Silvestre! oscuridad).! D!Efecto! de! las! alteraciones! genéticas! del! transformante! T2! (Mutante! T2! oscuridad! vs! Silvestre! oscuridad).! E!Efecto! de! las! alteraciones!genéticas!del!transformante!T3!(Mutante!T3!oscuridad!vs!Silvestre!oscuridad).! F!Comparación! entre! los! transformantes! T2! y! T3! (T2! oscuridad! vs!T3! oscuridad).! G! Comparación!entre!los!mutantes!SX1!y!SX2!(SX1!oscuridad!vs!SX2!oscuridad).!Las!gráficas! de!la!izquierda!se!representaron!como!Scatter)plot!y!los!de!la!derecha!como!Volcano)plot.! T2_oscuridad ! T3_oscuridad! F! SX2_oscuridad! SX1_oscuridad ! G! Genes:!SX1_oscuridad/SX2_oscuridad! log10!(valor!P) ! log2!(fold)change)! Genes:!T3_oscuridad/T2_oscuridad! log10!(valor!P) ! log2!(fold)change)! ! En! la! Figura! C2.3! se! representan! por! separado! las! alteraciones! en! los! transcriptomas!de!los!mutantes!SX1!y!SX2.!Sin!embargo,!como!ya!se!ha!indicado,!solo! se!han!considerado!como!atribuibles!a!la!mutación!carS!los!cambios!en!la!expresión!de! los!transcritos!coincidentes!en!ambas!estirpes.!Ese!filtro!descarta!un!número!elevado! de!genes!(Figura!C2.4!A),!tanto!para!la!inducción!como!para!la!represión.!Aunque!no!se! pueden! descartar! diferencias! en! mutaciones! secundarias,! la! causa! más! probable! es! que!la!mayoría!de!los!genes!que!aparecen!como!inducidos!o!reprimidos!se!encuentran! cerca!del!umbral!de!2x.!Tanto!por!error!experimental,!como!por!oscilaciones!biológicas! reales,!cabe!esperar!que!muchos!de!ellos!solo!hayan!superado!el!umbral!en!una!de!las! dos!estirpes.! Resultados.!Capítulo!2! ! 88! ! Figura!C2.4.!Números!de!genes!activados!y!reprimidos!en!la!estirpe!silvestre!y!los!mutantes! carS( en! oscuridad.! A!Genes!activados! y!reprimidos! de! los!mutantes!SX1! y! SX2!frente!a! la! estirpe!silvestre,!en!oscuridad.!B!Genes!activados!y!reprimidos!en!los!transformantes!T2!y!T3! frente! a! la! estirpe! silvestre,! en! oscuridad.! La! intersección! en! cada! diagrama! de! Venn! representa!el!número!de!genes!comunes!entre!ambas!estirpes.!Las!áreas!de!los!círculos!están! dibujados!a!escala. ! A! B! Un!resultado!parecido!se!observa!al!examinar!el!número!de!genes!coincidentes! entre!aquellos!activados!en!los!transformantes!T2!y!T3!(Figura!C2.4!B),!aunque!en!este! caso!se!puede!atribuir!también!a!las!diferencias!en!las!alteraciones!moleculares!en!sus! genomas.!Sin!embargo,!contra!lo!que!cabría!esperar!teniendo!en!cuenta!las!diferencias! fenotípicas!entre!ambas!estirpes,!el!grado!de!coincidencia!entre!los!transformantes!T2! y!T3!es!muy!elevado!para!los!genes!reprimidos.! ! La!luz!y!la!mutación!carS!dan!lugar!a!un!aumento!en!la!transcripción!de!los!genes! estructurales!de!la!carotenogénesis.!Sin!embargo,!el!número!de!genes!afectados!por! ambos!factores!regulatorios!es!mucho!mayor,!especialmente!en!el!caso!de!la!luz!(Tabla! C2.2).!A!pesar!de!ello,!el!análisis!del!solapamiento!de!los!genes!inducidos!por!ambos! factores!indica!un!grado!de!coincidencia!mucho!más!elevado!que!el!esperado!por!azar,! lo!cual!apoya!la!existencia!de!conexiones!regulatorias!entre!el!mecanismo!molecular! de!control!por!la!luz!y!la!función!de!la!proteína!CarS!(Figura!C2.5).!! Por! el! contrario,! el! grado! de! solapamiento! es! más! reducido! en! el! caso! de! los! genes!reprimidos,!aunque!aún!es!más!alto!que!lo!que!se!esperaría!por!azar.!En!este! caso,!es! especialmente!llamativo! que!aproximadamente! un!33%! de! los! genes! cuyos! Resultados.!Capítulo!2! ! 89! ! Figura! C2.5.!Comparación! de! los! genes! activados! o! reprimidos! por! la! luz! en! la! estirpe! silvestre!y!los!genes!activados!o!reprimidos!en!los!dos!mutantes!carS.!La!intersección!en! cada!diagrama!de!Venn!representa!el!número!de!genes!comunes!entre!ambas!condiciones. ! transcritos!bajan!por!efecto!de!la!mutación!carS,!también!lo!hacen!por!efecto!de!la!luz,! un!porcentaje!no!muy!lejos!del!porcentaje!observado!para!los!genes!activados!por!la! mutación!carS!y!a!su!vez!por!la!luz:!41%.! ! ! Identidad!de!los!genes!regulados!por!la!luz!y!por!CarS! ! Los!genes!cuyos!niveles!de!ARNm!cambian!por!efecto!de!luz!o!de!la!mutación! carS! se! ordenaron! por! su! grado! de! activación! o! represión! y! se! identificaron! en! el! proteoma! de! F.) oxysporum.! La! lista! completa! de! todos! los! genes! se! muestra! en! el! Anexo! I.! En! las! tablas! C2.3! y! C2.4! se! describen! los! 10! genes! con! mayor! grado! de! activación!o!de!represión!en!cada!estirpe!o!condición,!así!como!el!cambio!relativo!(CR! ó!Fold)Change).!La!mayor!parte!de!los!genes!identificados!no!codifican!proteínas!de! funciones!predecibles!!(indicadas!como!Proteína)hipotética),!aunque!en!algunos!casos! se!puede!identificar!la!presencia!de!dominios!conservados.! Tabla!C2.3.!Genes!cuyos!niveles!de!ARNm!sufren!los!mayores!cambios!por!efecto!de!la!luz.!*CR!(Cambio! Relativo)! !Genes!con!el!mayor!grado!de!activación!por!la!luz! Gen! CR*! Identidad! Dominios!conservados! FOXG_11750! 329,50! Proteína!hipotética! Ferritina_2! FOXG_12144! 167,54! CarRA! Sintasa!de!escualeno/fitoeno! FOXG_12143! 165,60! CarB! Amino_oxidasa|Amino_oxidasa! FOXG_12142! 161,53! CarO! Bacteriorrodopsina! FOXG_13071! 130,15! Proteína!hipotética! Proteína!de!unión!a!oxisterol! FOXG_16481! 127,99! Bli4! Super!familia!SDR! FOXG_09735! 73,30! Oxidorreductasa! Oxidorreductasa_FMN/YadA_stalk! FOXG_12145! 70,40! CarX! RPE65/PPI_Ypi1! Resultados.!Capítulo!2! ! 96! ! Figura! C2.9.! Niveles! de! los! transcritos! de! las! proximidades! al! gen! carS!en! la! estirpe! silvestre,! los! mutantes!carS!SX1!y!SX2!y!los!transformantes!T2!y!T3!obtenidos!por!RNA-Seq.!A!Lecturas!de!la!región! comprendida!entre!Foxg_09306!y!Foxg_09312,!donde!se!muestra!la!pérdida!de!transcritos!de!dicha! zona! en! los!transformantes!T2!y!T3,!con!respecto!a! la! estirpe!silvestre!y!los!mutantes!SX1! y!SX2.!B! Perfiles!de!expresión!del!gen!Foxg_09306.!C!Niveles!de!ARNm!del!gen!Foxg_09306!expresados!como! FPKM! en! la! estirpe! silvestre! y! los! transformantes! T2! y! T3.! Las! estirpes! se! incubaron! 3! días! en! oscuridad.!Los!gráficas!A!y!B!se!representaron!mediante!el!programa!IGV. ! ! ! El! elevado! número! de! genes! reprimidos! en! los! transformantes! T2! y! T3! (Tabla! C2.2)! sugiere! que! el! silenciamiento! puede! afectar! también! a! otras! regiones! del! genoma.! Esta! predicción! se! ha! comprobado! visualizando! los! 30! primeros! genes! con! mayor! represión! en! estos! transformantes,! de! los! cuales! en! varios! casos! tienen! reprimidas!las!regiones!genómicas!en!las!que!están!localizados!(Tabla!C2.6).!En!algunos! casos!la!región!genómica!silenciada!alcanza!los!40!kb!de!secuencia!(Figura!C2.10).! ! ! ! ! Resultados.!Capítulo!2! ! 97! Tabla!C2.6.!Genes!con!mayor!grado!de!represión!compartidos!por!los!transformantes!T2!!y!T3! Gen! CR! Identidad! Dominios!conservados! FOXG_10691! 0.0039! Proteína!hipotética! Dominio!PAN! FOXG_09107! 0.0066! Proteína!hipotética! No)encontrado) FOXG_02668**! 0.0117! Proteína!hipotética! Citocromo!P450! FOXG_11969*! 0.0163! Proteína!hipotética! Citocromo!P450! FOXG_14466*#! 0.0166! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_09307*! 0.0179! carS) RING!y!LON! FOXG_10935**! 0.0183! Proteína!hipotética! TRI!12! FOXG_15014*! 0.0203! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_11701! 0.0227! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_13024**! 0.0229! Proteína!hipotética! Superfamilia!de!unión!a!AMP! FOXG_11784****! 0.0238! Proteína!hipotética! Superfamilia!de!transportadores!de! azúcares! FOXG_14564*! 0.0239! Proteína!hipotética! Asociado!a!peptidasa-proteasa!! FOXG_15372**! 0.0247! Proteína!hipotética! Retinol!deshidrogenasa! FOXG_11986**! 0.0249! Deshidrogenasa!de! colina! GMC-Oxidorreductasa.!NADB! FOXG_11783****! 0.0254! Proteína!hipotética! Superfamilia!de!ciclasas! FOXG_00784! 0.0260! Proteína!hipotética! Superfamilia!de!VirB4! FOXG_05449! 0.0275! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_17778! 0.0282! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_12958*! 0.0323! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_06050! 0.0325! Proteína!hipotética! SDR!tipo!NmrA!! FOXG_10933! 0.0326! Proteína!hipotética! Alquil!hidroperoxidasa! FOXG_04016! 0.0346! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_15242>****! 0.0365! Proteína!hipotética! Reductasa!tipo!Enoy! FOXG_03933***! 0.0395! Proteína!hipotética! CzcO.!Ryr-redox_2! FOXG_02669! 0.0400! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_09843! 0.0402! Descarboxilasa!de! oxalato! Bicupin_oxidic! FOXG_13026! 0.0407! Proteína!hipotética! Oxidasa!de!aminas!de!Cu! FOXG_17425***! 0.0410! Proteína!hipotética! Superfamilia!de!los!facilitadores!TRI12! FOXG_10045*! 0.0413! Proteína!hipotética! No)encontrado! FOXG_09678! 0.0415! Proteína!hipotética! SRR1! La!tabla!representa!los!30!genes!con!mayor!grado!de!represión!en!los!transformantes!T2!y!T3!entre!los! 710!genes!reprimidos!en!ambas!estirpes.!Se!han!asociado!por!colores!aquellos!genes!del!grupo!de!30! que!se!encuentran!en!la!misma!región!genómica.!Cada!asterisco!rojo!(*)!representa!otro!gen!afectado! por!represión!en!la!misma!región!genómica!del!gen!señalado!con!el!asterisco,!pero!que!no!figura!en!la! lista! de! la! tabla.! Por! ejemplo,!Foxg_02668**!se!encuentra!junto!a!otros!dos! genes! reprimidos! en!su! misma!región.!Se!ha!utilizado!el!símbolo!>****!para!el!caso!del!gen!Foxg_15242,!ligado!al!menos!a!otros! 10!genes!reprimidos!en!una!región!de!más!de!40!kb!de!secuencia!genómica.!! SDR:!Deshidrogenasa/Reductasa!de!cadena!corta! MFS:!Superfamilia!de!facilitadores!principales! SRR1:!Proteína!reguladora!de!respuesta!a!estrés! RING:!dominio!tipo!dedo!de!zinc! Resultados.!Capítulo!2! ! 98! Dado!que!el!silenciamiento!afecta!al!gen!carS!(sexto!gen!en!grado!de!represión! en!la!tabla)!y!que!éste!ocurre!de!forma!más!acusada!en!el!transformante!T2!que!en!T3,! los! datos! sugieren! que! esa! es! la! causa! del! fenotipo! de! superproducción! de! carotenoides!de!ambas!estirpes.! !El! análisis! de! RNA-Seq! se! limita! a! transcritos! poliadenilados,! por! lo! cual! no! aporta! información! respecto! a! la! posible! existencia! de! microARNs! en! la! región! intergénica! anterior! a! carS,! mencionada! en! el! Capítulo! 1.! La! existencia! de! dichos! microARNs! se! basa! en! una! predicción! informática! procedente! de! datos! previos! de! otros!microARNS!en!otros!grupos!taxonómicos.!Con!el!objetivo!de!obtener!información! directa! sobre! la! existencia! de! miARNs! en! F.) oxysporum,! se! realizó! un! estudio! de! secuenciación!masiva!de!ARNs!de!pequeño!tamaño!con!las!mismas!muestras!de!ARN! empleadas!en!este!capítulo!para!el!análisis!de!RNA-Seq!de!la!estirpe!silvestre!incubada! en!oscuridad!o!expuesta!una!hora!a!la!luz,!así!como!en!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2!en! oscuridad.! Los! datos! fueron! analizados! en! colaboración! con! el! Dr.! Tim! Dahlmann! (Universidad!de!Bochum,!Alemania).!Se!muestra!en!la!figura!C2.10!A!la!visualización!de! transcritos!de!pequeño!tamaño!en!la!región!intergénica!entre!los!genes!Foxg_09306!y! carS.!Como!se!puede!apreciar,!no!se!encontraron!indicios!de!existencia!de!microARN! en!la!zona!estudiada,!encontrándose!numerosos!ejemplos!de!pequeños!ARN,!aunque! en!número!no!muy!elevado,!en!el!resto!del!genoma!(datos!obtenidos!en!colaboración! con! Javier! Pardo! Medina).! En! la! figura! C2.10! B,! se! muestran! dos! ejemplos! de! observación!de!pequeños!transcritos!visualizados!en!otros!genes.! Por!otra!parte,!la!observación!de!la!misma!región!intergénica!en!las!diferentes! condiciones! y! estirpes! analizadas! muestra! la! presencia! de! un! transcrito! de! aproximadamente!1!kb!(Figura!C2.11),!no!detectado!anteriormente!en!la!anotación!del! genoma,!y!que!solapa!con!la!secuencia!del!supuesto!microARN!fox-mir2!descrito!en!el! Capítulo!1.!Este!transcrito!es!objeto!de!estudio!en!el!Capítulo!3.! Resultados.!Capítulo!2! ! 99! ! Figura! C2.11.! Representación! mediante! la! plataforma! IGV! de! las! lecturas! de! los! transcritos! obtenidos!en!el!análisis!de!RNAseq!de!la!zona!intergénica!entre!el!gen!Foxg_09306!y!el!gen!carS! (Foxg_09307).!Las!muestras!representadas!son!de!la!estirpe!silvestre!(WT)!en!oscuridad!o!incubada! una!hora!en!la!luz,!y!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2!en!oscuridad.!El!círculo!anaranjado!muestra!la! existencia! de! un! transcrito! ausente! en! la! anotación! previa! del! genoma.! Las! líneas! discontinuas! verdes! marcan! la! secuencia! correspondiente! al! supuesto! ARN! precursor! de! fox-mir1!y! las! líneas! discontinuas!rojas!la!del!presunto!precursor!de!fox-mir2.! ! WT!Osc.! WT!Luz.! SX1!Osc. ! SX2!Osc. ! fox-mir1! fox-mir2! ! A! B! Figura!C2.10.!Lecturas!de!los!transcritos!obtenidos!en!el!análisis!de!RNAseq!de!ARNs!pequeños!en! la!zona!intergénica! entre!el!gen! Foxg_09306!y! el! gen! carS! (Foxg_09307)! en! F.) oxysporum.!Las! muestras!representadas!son!de!la!estirpe!silvestre!(WT)!en!oscuridad!o!incubada!una!hora!en!luz,! y!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2!en!oscuridad.!La!línea!verde!indica!la!zona!correspondiente!a!foxmir1!y! la! línea! discontinua! roja! la! zona! que! cubre! fox-mir2.! Los! gráficos! se! representaron! mediante!el!programa!IGV.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Capítulo!3! !! ! ! ! ! Resultados.!Capítulo!3! ! 103! Capítulo!III.!CARACTERIZACIÓN!DEL!GEN!carP! Introducción! Los!estudios!de!secuenciación!masiva!han!revelado!que!la!mayor!parte!de!los! genomas! de! los! eucariotas! superiores! se! transcribe,! a! pesar! de! que! contienen! un! porcentaje!muy! elevado! de! secuencias! no! codificantes.! Por!ejemplo,! en!el! proyecto! ENCODE!se!observó!la!transcripción!de!tres!cuartas!partes!del!genoma!humano!(Binery! et! al.,! 2007;! Bernstein! et)al.,! 2012;! Djebali! et! al.,! 2012)! y! un! resultado! parecido! se! obtuvo! con! el! genoma! del! ratón! (Carninci! et! al.,! 2005).! Las! nuevas! regiones! de! transcritas! pueden! representar! genes! conocidos! codificadores! de! proteínas,! nuevos! transcritos!que!codifican!proteínas!y!transcritos!que!no!parecen!tener!la!capacidad!de! codificar!proteínas!(van!Bakel!et!al.,!2010).!Como!consecuencia!se!está!descubriendo!y! anotando!un!número!creciente!de!nuevas!clases!de!ARNs!no!codificantes!(ARNnc),!que! abarcan!desde!ARNs!pequeños!reguladores,!como!los!ARN!interferente,!los!microARNs! y!los!ARNs!asociados!a!Piwi,!hasta!segmentos!más!largos!de!ARN,!que!incluyen!a!los! ARNs! largos! no! codificantes! (ARNlnc)! y! los! ARNs! largos! no! codificantes! intergénicos! (lincARNs)!(Ponting!et!al.,!2009;!Ma!et!al.,!2013).!En!particular,!la!tecnología!ARN-Seq! ha!sacado!a!la!luz!cientos!de!ARNlncs!en!un!amplio!rango!de!organismos!eucariotas,! que! van! desde! levaduras! hasta! humanos! (Okazaki! et! al.,! 2002;! Ravasi! et)al.,! 2006;! Guttman! et! al.,! 2009;! McKinlay! et! al.,! 2011).! Los! ARNlncs! surgen! como! un! grupo! heterogéneo! de! transcritos! no! codificantes! implicados! en! una! gran! variedad! de! procesos!regulatorios!en!eucariontes.!Inicialmente!fueron!descubiertos!en!humanos,! aunque!en!la!última!década!también!se!han!identificado!en!hongos.!Algunos!ejemplos! de!ARNlncs!de!levaduras!están!bien!caracterizados!y!descritos!en!la!literatura,!mientras! que!otros!han!sido!recientemente!identificados!y!necesitan!ser!investigados!en!más! detalle!(revisado!por!Till!et!al.,!2018a).!Los!ARNlncs!son!muy!diversos!en!cuanto!a!sus! funciones,!características!y!estrategias!de!regulación.!Están!involucrados!en!procesos! celulares!tales!como!el!metabolismo!y!la!respuesta!a!estrés,!control!del!ciclo,!celular!o! en! silenciamiento! de! otros! genes! a! través! del! control! transcripcional! y! posttranscripcional!de!su!expresión!ediante!interacciones!ARN-proteína,!ARN-ADN!o!ARNARN!(Arthanari!et!al.,!2014).! La!característica!principal!de!los!ARNlncs!es!que!poseen!un!tamaño!superior!a! 200!pb.!Los!modelos!estudiados!en!humanos,!plantas,!animales!y!hongos!se!dividen! generalmente!en!4!categorías!(Figura!1):! 1)!ARNlnc!sentido!que!solapa!con!uno!o!más!exones!del!transcrito!en!la!misma!cadena.! 2)!ARNlnc!antisentido!que!solapa!con!uno!o!varios!exones!en!la!cadena!contraria.! 3)!ARNlnc!intrónico,!situado!en!el!intrón!de!un!gen.! 4)!ARNlnc!intergénico,!situado!entre!dos!genes!en!la!misma!cadena!(Quan!et!al.,!2015).! Resultados.!Capítulo!3! ! 104! ! Figura!1.!Clasificación!de!los!ARNlncs.!En!gris!se!indican!los!exones!y!en!blanco!los!intrones.!La!línea! negra!representa!la!cadena!de!ADN.!Las!cajas!doradas!representan!los!ARNlncs!y!las!flechas!indican!la! dirección!de!los!transcritos.!Modificado!de!Quan!et!al.,!2015.! ! En!los! hongos! filamentosos,! hasta! la!fecha! solo!se! ha!descrito! un!ARNlnc! en! Trichoderma) reesei,!implicado! en! la!regulación! de!expresión! de! celulasas! (Till! et!al.,! 2018b).!!En!el!caso!de!N.)crassa!se!han!identificado!unos!939!ARNlncs,!de!los!cuales! más!de!la!mitad!son!antisentido!de!genes!anotados!(Arthanari!et!al.,!2014)!pero!hasta! ahora!no!se!ha!descrito!la!funcionalidad!de!ninguno!de!ellos.!Sin!embargo,!en!Fusarium) oxysporum)solo!se!han!descrito,!hasta!el!momento,!ARNlnc!procedentes!de!plantas!y! que!son!reconocidos!por!el!hongo!en!el!proceso!de!infección!(Li!et!al.,!2017;!Zhu!et!al.,! 2014).! Como! ya! se! ha! descrito! en! el! final! del! capítulo! anterior,! el! análisis! del! transcriptoma!de!F.)oxysporum!reveló,!en!una!región!genómica!próxima!al!gen!carS,!un! transcrito!no!anotado!en!el!genoma!que!presenta!diferencias!notables!de!expresión! entre!la!estirpe!silvestre!y!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2.!Se!decidió!estudiar!más!en! detalle! este! transcrito! debido! a! su! proximidad! al! gen! carS! y! a! que! parte! de! su! secuencia!genómica!solapa!con!la!región!perteneciente!al!supuesto!microARN,!“foxmir2”,! descrito! en! el! Capítulo! 1.! Los! ARNlnc! emergen! como! nuevos! factores! reguladores! epigenéticos! o! transcripcionales! en! los! distintos! organismos! eucariotas,! sugiriendo!la!posibilidad!de!que!este!transcrito!sea!un!ARNlnc!con!una!conexión!con!el! gen!carS.!! ! Resultados!! Caracterización!del!transcrito!del!gen!carP( ! Los! datos! de! ARN-Seq! obtenidos! en! el! Capítulo! 2! muestran! un! transcrito! de! aproximadamente! 1,2!kb! entre! los! genes! Foxg_09306!y! carS.! La! base! de! datos! del! genoma!de!Fusarium)oxysporum,!disponible!a!través!de!los!servidores!web!del!Broad) Institute!y! Ensambl) Fungi,! no! muestra! ninguna! anotación! correspondiente! a! dicho! transcrito,!supuestamente!por!la!inexistencia!de!características!identificables!como!un! Resultados.!Capítulo!3! ! 105! ! Figura!C3.1.!Lecturas!de!los!transcritos!de!carP!en!el!análisis!de!los!datos!de!ARN-Seq.!Análisis!de!la!región! genómica!entre!el!gen!Foxg_09306!y!carS!(Foxg_09307)!en!la!estirpe!silvestre!y!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2.!Se! muestran!los!resultados!en!luz!y!oscuridad!para!la!estirpe!silvestre!y!en!oscuridad!para!los!mutantes!carS.!En! cada!condición!se!muestran!los!perfiles!obtenidos!con!las!dos!muestra!biológicas!analizadas!(1R=!Réplica!1;!2R=! Réplica!2).(Las!lecturas!se!representaron)mediante!el!programa!IGV.! ! gen! codificante! de! proteína.! Los! resultados! que! se! describen! en! las! secciones! siguientes! llevaron! a! denominar! a! este! transcrito! carP,! por! su! relación! con! la! fotoinducción!de!la!carotenogénesis.!Al!ser!identificado!con!la!metodología!ARN-Seq,! se! deduce! que! carP! es! poliadenilado! y,! por! tanto,! que! es! transcrito! por! la! ARN! polimerasa! II.! A! juzgar! por! la! cantidad! de! lecturas! (Figura! C3.1),! los! niveles! de! los! transcritos!son!más!bien!reducidos,!pero!su!tamaño!es!aproximadamente!el!mismo!en! las!distintas!estirpes!o!condiciones!de!cultivo!estudiadas.!La!observación!de!las!lecturas! no!indica!la!presencia!de!ningún!intrón!en!su!secuencia.!! ! ! ! Resultados.!Capítulo!3! ! 112! ! Figura!C3.6.!Caracterización!fenotípica!del!mutante!carP(SX82.!Se!analizaron!dos!estirpes! independientes!de!los!mutantes!Δmir2!(SX80!y!SX81),!la!estirpe!mutante!Δ carP!(SX82)!y!la! estirpe!silvestre!(WT).!Las!condiciones!de!cultivo!fueron!7!días!de!crecimiento!en!oscuridad! o!bajo!iluminación!constante!en!medio!mínimo!DGasn.!A!Aspecto!de!las!colonias!incubadas! en!oscuridad!o!en!luz.!B!Contenido!de!carotenoides!de!las!estirpes!incubadas!en!oscuridad! o!en!luz.!! B! A! deleción!parcial!de!carP,!se!sospecha!que!en!ambos!casos!se!ha!producido!la!pérdida! de! función! del! gen! carP.! Para! confirmarlo,! se! compararon! los! niveles! de! ARNm! de! distintos!genes!en!las!tres!estirpes!en!comparación!con!la!estirpe!silvestre.! ! ! Niveles!de!ARNm!de!los!genes!car!en!los!mutantes!del!gen!carP(! ! Para!averiguar!si!la!bajada!de!producción!de!los!carotenoides!en!SX82!se!debe!a!un! descenso! en! los! niveles! de! ARNm! de! los! genes! estructurales! de! la! ruta! de! carotenogénesis,! como! ya! se! observó! para! los! mutantes! Δmir2! (Capítulo! 1),! se! determinaron! dichos! niveles! para! los! genes! carRA!y! carB! mediante! RT-qPCR! en! el! mutante! SX82! y! se! compararon! con! los! previamente! obtenidos! para! los! transformantes!Δmir2.! Para! ello! se! incubaron!la! estirpe! silvestre! y! el! transformante! SX82! durante! tres! días! en! medio! mínimo! DGasn! en! oscuridad! y! se! expusieron! a! continuación!una!hora!a!la!luz.!Además!de!los!dos!genes!estructurales,!se!incluyó!en!el! estudio!el!gen!carS!(Figura!C3.7).!! Resultados.!Capítulo!3! ! 113! ! Figura!C3.7.!Efecto!de!la!deleción!parcial!y!completa!de!carP!sobre!la!expresión!de!los!principales! genes!car!estructurales,!carB!y!carRA!y!el!gen!regulador!carS.!Las!estirpes!silvestre!(WT),!el!mutante! ΔcarP!y!dos!mutantes!independientes!de!Δ mir2,!SX80!y!SX81!se!incubaron!tres!días!bajo!condiciones! de!oscuridad!y!una!hora!de!exposición!a!luz.!El!análisis!de!expresión!se!realizó!mediante!RT-qPCR.!Los! resultados!muestran!la!media!y!el!error!típico!de!3!experimentos!independientes.! El!resultado!mostró!un!fuerte!descenso!en!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!carRA! y!carB!en!el!mutante!SX82!en!comparación!con!la!estirpe!silvestre.!Dicho!descenso!fue! similar!al!mostrado! por!los!transformantes!Δmir2,!aunque!en!este! caso!el!descenso! para!carB!en!la!luz!fue!algo!más!acusado!en!SX82.!De!la!misma!forma,!al!igual!que!se! observó!para!las!estirpes!Δmir2,)el!transformante!SX82!mostró!un!aumento!apreciable! en!los!niveles!de!ARNm!del!gen!carS,!tanto!en!la!luz!como!en!la!oscuridad.!! ! Niveles!de!ARNm!de!los!genes!de!fotorreceptores!en!los!mutantes!del!gen!carP(! ! Como! ya! se! ha! mencionado! en! la! introducción! general,! la! luz! estimula! la! biosíntesis!de!carotenoides!en!F.)oxysporum!a!través!de!la!activación!transcripcional!de! los!genes!estructurales!carRA,!carB!y!carT.!De!acuerdo!con!estudios!realizados!en!F.) fujikuroi,!la!respuesta!es!mediada!sobre!todo!por!el!fotorreceptor!WcoA,!llamado!wc1! en! F.) oxysporum! (Ruiz-Roldán! et! al.,! 2008),! con! la! participación! accesoria! de! los! fotorreceptores!CryD!y!VvdA!(Avalos!et!al.,!2017).!Además,!el!análisis!transcriptómico! descrito! en! el! Capítulo! 2! mostró! que! son! numerosos! los! genes! cuya! expresión! es! estimulada!por!la!luz.!Por!tanto,!dado!que!la!deleción!de!carP!reduce!de!forma!muy! patente!la!fotoinducción!de!los!genes!de!la!carotenogénesis,!se!decidió!investigar!si! ello! se! debe! a! una! alteración! en! la! expresión! de! los! genes! de! los! fotorreceptores! implicados!en!la!respuesta.!Por!ello,!se!determinaron!mediante!RT-qPCR!los!niveles!de! ARNm!de!los!genes!ortólogos!a!wcoA!(wc1,!Foxg_03727),!cryD!(Foxg_03570)!y!vvdA! Resultados.!Capítulo!3! ! 114! ! Figura!C3.8.!Efecto!de! la! deleción! de!carP!sobre!la!expresión!de!los!genes!estructurales!carB!y! carRA,!los!genes!de!fotorreceptores!vvdA,!cryD!y!wcoA!(wco1)!y!el!gen!fotoinducible!con10.!Las! muestras!de!ARN!se!obtuvieron!a!partir!de!micelio!de!silvestre!(WT)!y!Δ carP!cultivados!tres!días!en! oscuridad!y!una!hora!de!exposición!a!luz.!Los!resultados!muestran!la!media!y!el!error!típico!de!3! experimentos!independientes.! (Foxg_03254)!en!el!transformante!ΔcarP!SX82!en!comparación!con!la!estirpe!silvestre! (Figura!C3.8).!Los!resultados!mostraron!el!mismo!patrón!de!expresión!de!wcoA/wc1!en! la!estirpe!silvestre!y!en!SX82,!por!lo!que!se!puede!concluir!que!la!fuerte!disminución!de! los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!carRA!y!carB!en!el!mutante!ΔcarP!no!se!deben!a!una! menor!expresión!de!wcoA/wco1.! ! Como! ya! se! observó! en! F.) fujikuroi,! y! como! indican! los! experimentos! de! transcriptómica! (Capítulo! 2),! los! niveles! de! transcritos! de! los! genes! cryD!y! vvdA! aumentan!fuertemente!tras!la!exposición!a!la!luz.!Al!igual!que!se!ha!observado!para! wcoA,! los! resultados! mostraron! que! la! mutación! carP! no! afecta! a! los! niveles! de! transcritos!de!estos!genes.!Llama!la!atención!que,!al!contrario!que!carRA!y!carB,!los! genes!cryD!y!vvdA!mantuvieron!el!mismo!patrón!de!fotoinducción!con!independencia! de! la! presencia! o! ausencia! de! carP.! El! mismo! resultado! se! obtuvo! para! el! gen! Foxg_01269,! ortólogo! de! con-10!de! N.) crassa,! elegido! como! ejemplo! de! gen! fotoinducible!no!relacionado!con!la!carotenogénesis.!Este!resultado!indica!que!el!ARN! carP!no!es!un!regulador!maestro!de!los!genes!fotoinducibles!en!F.)oxysporum,!sino!que! ejerce!su!función!de!forma!más!específica!sobre!un!cierto!juego!de!genes,!entre!los! que!se!encuentran!al!menos!los!genes!estructurales!de!la!carotenogénesis.!! ! ! ! Capítulo!4! !! ! ! ! ! Resultados.!Capítulo!4! ! 117! Capítulo!IV.!CARACTERIZACIÓN!DEL!GEN!carF! Introducción!! ! Los!resultados!descritos!en!los!capítulos!anteriores!muestran!la!existencia!de! una!región!regulatoria!aguas!arriba!del!gen!carS,!que!incluye!un!gen!para!un!ARN!no! codificante.! Al! lado! del! gen! carP,! a! unos! 4! kb!de! carS,! se! encuentran! los! genes! Foxg_09306,! Foxg_09305!y! Foxg_09304.! El! gen! Foxg_09306,! al! que! ya! se! prestó! atención!en!el!del!Capítulo!2!(página!96),!codifica!supuestamente!una!proteína!de!142! aa! cuya! secuencia! carece! de! dominios! conocidos! o! predecibles.! El! desconocimiento! completo!sobre!las!posibles!funciones!de!proteínas!predichas!a!partir!del!genoma!de!F.) oxysporum!es!bastante!común,!ya!que!un!22%!de!las!proteínas!anotadas!en!su!genoma! (según! los! datos! analizados! en! el! ARN-Seq! realizado! en! este! trabajo)! carecen! de! precedentes! funcionales! o! de! dominios! proteicos! conocidos.! Con! respecto! al! gen! Foxg_09305,! determina! una! proteína! de! 386! aa! que! contiene! un! posible! dominio! INSIG,!que!se!ha!asociado!a!la!regulación!de!la!biosíntesis!de!esteroles!en!animales!y! en!algunos!microorganismos!(Flury!et!al.,!2005).!Por!su!parte,!Foxg_09304!codifica!una! proteína!de!491!aa!con!varias!repeticiones!del!dominio!proteico!WD40,!muy!extendido! en!eucariotas!e!involucrado!en!interacciones!para!formar!complejos!proteicos!(Smith,! 2008).!Las!proteínas!que!contienen!repeticiones!de!este!dominio!están!implicadas!en! un!amplio!rango!de!funciones,!tales!como!la!transducción!de!señales,!la!regulación!del! ciclo!celular!o!la!regulación!de!la!transcripción!(Li!y!Roberts,!2001).!! Los!genes!Fox_09306,!Fox_09305!y!Foxg_09304!se!investigaron!en!un!trabajo! anteriore! en! el! mismo! grupo,! sin! embargo,! no! reveló! ningún! posible! papel! en! la! regulación!de!la!carotenogénesis.!Estos!trabajos!se!limitaron!a!una!observación!visual! de! los! mutantes! generados! y! no! se! llegaron! a! realizar! análisis! bioquímicos! de! los! contenidos!de!carotenoides!(Rodríguez-Ortíz,!2012).!No!obstante,!en!el!estudio!de!las! causas!moleculares!de!los!fenotipos!desregulados!de!los!transformantes!T2!y!T3,!se! observó! que! ambas! estirpes! coinciden! en! la! presencia! de! alteraciones! en! la! región! intergénica!entre!el!gen!carS!y!Foxg_09306)generadas!en!el!proceso!de!transformación! con!A.)tumefaciens.!Esta!región!debe!incluir!la!secuencia!promotora!de!Foxg_09306.! Los! datos! mostraron! también! que! T2! presenta! un! aumento! considerable! en! la! expresión!de!Foxg_09306!(Figura!C2.9!C,!Capítulo!2).!Además,!uno!de!los!supuestos! genes!de!precursores!de!microARN,!fox-mir1,!se!ubica!en!esta!región!intergénica,!cerca! de!donde!se!espera!que!se!encuentre!el!promotor!de!este!gen.!La!deleción!de!fox-mir1! provocó!una!bajada!de!los!niveles!de!ARNm!de!lo!genes!de!la!carotenogénesis!y!una! fuerte!reducción!de!la!acumulación!de!carotenoides!con!respecto!a!la!estirpe!silvestre.! Esta! respuesta! es! opuesta! a! la! provocada! por! la! alteración! genómica! de! T2,! que! provocaba! sobreexpresión! de! estos! genes! en! oscuridad! y! un! fuerte! aumento! en! la! síntesis!de!carotenoides!independiente!de!la!luz!(Capítulo!1).!! Resultados.!Capítulo!4! ! 118! Los!genes!carS!y!carP!constituyen!elementos!reguladores!de!especial!relevancia! en!el!control!de!la!carotenogénesis!en!Fusarium.!La!cercanía!de!la!secuencia!fox-mir1!al! promotor!del!gen!Foxg_09306)y!la!sobreexpresión!de!este!gen!en!el!transformante!T2! sugiere!un!posible!papel!regulador!para!Foxg_09306.)El!objetivo!de!este!capítulo!es! investigar!la!función!de!este!gen,!que!denominaremos!a!partir!de!ahora!carF.!! ! Resultados! Caracterización!del!gen!carF!(Foxg_09306)!de!Fusarium!oxysporum( ! Según! el! genoma! anotado! de! F.) oxysporum,! el! gen! carF) se! transcribe! en! dirección! opuesta! a! la! de! los! genes! carP!y! carS,! y! codifica! una! proteína! no! caracterizada!de!142!aminoácidos,!carente!de!dominios!conservados.!Al!contrastar!su! secuencia!con!un!análisis!BLASTP!específico!de!secuencias!de!proteínas!a!través!de!la! plataforma! NCBI! (National) Center) for) Biotechnology) Information,! https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)!se!detecta!similitud!con!su!ortólogo!en!otras!especies! de! Fusarium,! tales! como! F.) fujikuroi,! F.) graminearum!o! F.) verticillioides,! con! una! identidad! superior! al! 90%.! Sólo! se! encontró! un! dominio! conservado! en! una! de! las! proteínas!homólogas!en!Fusarium)nygamai,!un!patógeno!de!leguminosas,!en!la!que!la! secuencia!de!la! proteína!codificada! por! el!gen! ortólogo! a!Foxg_09306,! Fnyg_04818,! posee! un! dominio! conservado! perteneciente! a! la! proteína! UL16,! de! la! familia! HerpesVirus.! Esta! proteína! juega! un! papel! en! la! maduración! de! la! cápsida! de! estos! virus!y!en!el!empaquetamiento!del!ADN!(NCBI,!código!de!acceso!cl28066).!Salvo!esta! información,!irrelevante!en!el!contexto!de!este!capítulo,!no!se!encontró!nada!más!en! las!bases!de!datos.!! Según!el!servidor!web!Innovagen)(Peptide,)property)calculator),!que!calcula!las! propiedades!de!los! péptidos,! la!proteína!CarF! tiene! un!peso!molecular! esperado! de! 15,6!KDa.!Las!predicciones!apuntan!a!una!proteína!muy!soluble!en!agua!(hidrofílica),! que!se!espera!que!deje!de!ser!soluble!a!pH!inferior!a!5.!El!análisis!a!través!del!servidor! CCTOP! (Constrained) Consensus) TOPology) prediction) server)! indica! que! no! posee! dominios!transmembrana,!mientras!que!el!análisis!STRING!(Search)Tools)for)Recurring) Instances)of)Neighbouring)Genes)!no!anticipa!ninguna!interacción!conocida!con!otras! estructuras!moleculares.!Según!varias!bases!de!datos!contrastadas!(CDD!NCBI;!Prosite,! ExPASy;!InterPro,!EMBL-EBI),!tampoco!parece!tener!dominios!conservados!conocidos,! homología!con!familias!de!proteínas!o!estar!relacionado!con!procesos!celulares!según! las! clasificaciones! del) Gene) Ontology) (GO).! Por! tanto,! el! análisis! informático! de! la! secuencia!de!142!aminoácidos!de!CarF!apenas!aporta!ninguna!pista!sobre!su!posible! función.! Resultados.!Capítulo!4! ! 119! Los!datos!de!ARN-Seq!de!este!gen!muestran!un!tamaño!de!transcrito!más!largo! que! el! que! corresponde! al! gen! originalmente! anotado! (Foxg_09306),! ya! que! se! extiende!unas!300!bases!más!allá!del!codón!de!parada!(Figura!C4.1,!rectángulo!rojizo).! La!región!no!parece!tener!ninguna!región!codificante!significativa!a!partir!del!codón!de! parada!,!por!lo!que!podemos!concluir!que!se!trata!de!una!región!3’!UTR!larga.! Otra!observación!destacable!de!las!lecturas!de!los!transcritos!es!que!en!todas! las! muestras! aparecen! algunas! lecturas! en! la! zona! anotada! como! 5’! UTR,! pudiendo! indicar!un!sitio!alternativo!de!inicio!de!la!transcripción!(Figura!C4.1!A).! Expresión!del!gen!carF( ! Los!datos!de!transcriptómica!descritos!en!el!Capítulo!2!aportan!ya!información! sobre!la!expresión!del!gen!Foxg_09306,!en!particular!sobre!el!efecto!de!la!luz!y!de!la! mutación! del! gen! carS.! Los! resultados! muestran! en! la! estirpe! silvestre! más! lecturas! para!el!gen!carF)tras!una!hora!de!iluminación!que!en!la!oscuridad,!mientras!que!en!los! mutantes!carS) la!cantidad!de!lecturas!en!oscuridad!es!más!similar!a!la!de!la!estirpe! silvestre!en!oscuridad!que!a!la!expuesta!a!la!luz!(Figura!C4.1!B).!La!ausencia!de!efecto! de!la!mutación!carS!contrasta!con!el!fuerte!incremento!en!los!niveles!de!transcrito!de! este! gen! en! el! transformante! T2! (Figura! C2.9,! Capítulo! 2).! Esta! estirpe! posee! una! alteración!en!la!secuencia!de!ADN!cercana!al!promotor!de!carF,!por!lo!que!puede!que! esté! influyendo! en! su! transcripción.! Por! el! contrario,! no! se! aprecian! cambios! de! expresión!del!ARNm!de!este!gen!en!los!mutantes!carS,!SX1!y!SX2!(Figura!C4.1!B).!! Para!confirmar!los!resultados!obtenidos!en!el!análisis!de!ARN-Seq,!se!hicieron! nuevas!incubaciones!para!analizar!los!niveles!de!ARNm!del!gen!Foxg_09306)mediante! RT-qPCR! en! la! estirpe! silvestre! y! en! los! mutantes! carS,! tanto! en! condiciones! de! oscuridad! como! tras! una! hora! de! iluminación! (Figura! C4.2).! Ese! análisis! es! más! completo!que!el!de!ARN-Seq,!ya!que,!por!limitaciones!en!la!cantidad!de!muestras,!en! ese!estudio! solo! se! analizó! el!efecto! de!la! luz! en! la! estirpe! silvestre.! Los!resultados! muestran!que!los!niveles!de!ARNm!del!gen!carF!son!varias!veces!mayores!en!la!luz!que! en!la!oscuridad!en!la!estirpe!silvestre,!en!los!mutantes!carS!y!en!los!transformantes!T2! y!T3.!Los!niveles!de!transcrito!fueron!sin!embargo!mayores!en!el!transformante!T2,! corroborando!datos!previos!de!ARN-Seq,!pero!no!en!el!transformante!T3!en!oscuridad.! Resultados.!Capítulo!4! ! 120! ! Figura! C4.1.! Niveles! de! ARNm! del! gen! carF.! A! Lecturas!de!los!transcritos!del!gen!Foxg_09306!en! el!análisis!de!ARN-Seq!en!la!estirpe!silvestre!en!la! oscuridad! y! tras! una! hora! de! iluminación,! y! mutantes!carS!SX1!y!SX2!en!oscuridad.!La!barra!azul! representa!el!gen!carF!(Foxg_09306)!anotado!en!el! genoma.! El!rectángulo! rojo! señala! la! zona! 3’-UTR! del!gen!que!no!está!anotada!en!el!genoma.!Solo!se! representa! una! de! las! dos!réplicas! biológicas.! Las! lecturas! se! representaron! con! el! programa! IGV! (Integrative!Genomics!Viewer).!B!Niveles!de!ARNm! del!gen!carF!(Foxg_09306)!expresados!en!FPKM!de! las!muestras!analizadas!mediante!ARN-Seq.! A! B! ! ! Teniendo! en! cuenta! que! los! niveles! de! ARNm! del! gen! carF) aumentan! considerablemente!en!el!transformante!T2,!posiblemente!a!causa!de!la!alteración!en!la! región!de!ADN! próxima! a!su!promotor,! se! decidió!averiguar!si! las! deleciones!en!las! secuencias! fox-mir1!y! fox-mir2! (Δmir1) y)Δmir2,! Capítulo! 1)! afectan! a! los! niveles! de! transcrito! de! carF,! para! lo! cual! se! realizaron! nuevas! incubaciones! en! las! mismas! condiciones! de! cultivo.! Aunque! inicialmente! se! contemplaron! como! posibles! secuencias!precursoras!de!microARNs,!en!los!Capítulos!2!y!3!se!descartó!esta!hipótesis! y! se! determinó! la! relación! de! estas! secuencias! con! el! ARNlnc! carP,! por! lo! cual! se! incluyó!también!el!mutante!ΔcarP)SX82!en!este!estudio.!Los!resultados!confirmaron!el! incremento!en!el!nivel!de!ARNm!carF!en!la!luz!en!relación!a!la!oscuridad!en!la!estirpe! silvestre,!pero!tal!fotoinducción!parece!ser!menos!evidente!en!los!mutantes!Δmir1)y) Δmir2!y!en!el!mutante!ΔcarP.!Un!resultado!inesperado!es!que!los!niveles!de!ARNm!de! carF!aumentaron!fuertemente!en!los!mutantes!Δmir1!y!ΔcarP,!pero!no!en!el!mutante! Δmir2.)Una!explicación!plausible!es!que!en!los!mutantes!Δmir1)y)ΔcarP!se!han!perdido! elementos!reguladores!negativos!del!promotor!de!carF,!ya!que!la!secuencia!fox-mir1! se!encuentra!próxima!a!dicho!promotor,!y!ésta!no!se!encuentra!muy!lejos!del!borde!de! la! secuencia! delecionada! en! el! mutante! ΔcarP.! En! cambio,! la! secuencia! fox-mir2) se! ubica!mucho!más!lejos.! Resultados.!Capítulo!4! ! 121! La! caída! en! los! niveles! de! transcritos! de! los! genes! estructurales! de! la! carotenogénesis!en!los!mutantes!Δmir1)y)ΔcarP,!y!la!subida!en!la!cantidad!de!ARNm! carF!en!dichos!mutantes!podrían!ser!independientes!o!podrían!tener!alguna!relación! regulatoria.! Este! hecho,! unido! a! que! el! propio! gen! carF! es! fotoinducible,! llevó! a! estudiar!la!función!del!gen!carF!mediante!su!deleción!dirigida.! ! Deleción!del!gen!carF( ! Para! estudiar! la! función! del! gen! carF!en! F.) oxysporum! se! generaron! estirpes! mutantes!en!fondo!silvestre!mediante!reemplazamiento!génico.!Para!ello!se!construyó! un! plásmido! mediante! la! técnica! de! recombinación! homóloga! en! levaduras! (ver! Material!y!Métodos),!con!fragmentos!de!la!región!promotora!y!terminadora!del!gen! carF! flanqueando! al! marcador! de! resistencia! a! higromicina! hph.! Los! cebadores! utilizados!para!hacer! esta! construcción!se!muestran! en! la!tabla!M2!en! Materiales! y! Métodos.!El!plásmido!obtenido,!que!se!denominó!pDul15,!se!utilizó!para!transformar! protoplastos! de! la! estirpe! silvestre.! Como! ya! se! llevó! a! cabo! con! las! mutaciones! dirigidas!de!otros!genes!o!secuencias!(Capítulos!1!y!3),!el!objetivo!es!reemplazar!el!ORF! de! carF!por! el! cassette! de! resistencia! a! higromicina! HygR! (Figura! C4.3! A).! Como! resultado!se!obtuvieron!4!transformantes,!que!se!pasaron!por!esporas!uninucleadas!3! Figura! C4.2.!Niveles! de! ARNm! del! gen! Foxg_09306!en! distintas! estirpes! y! condiciones.! Las! muestras!se!obtuvieron!a!partir!de!cultivos!de!tres!días!en!medio!mínimo!DGasn!en!oscuridad,!que! se!expusieron!en!su!caso!una!hora!a!la!luz.!Los!resultados!muestran!la!media!y!el!error!estándar!de! tres!réplicas!biológicas!independientes.!Los!mutantes!SX!78,!SX79,!SX80,!SX81!y!SX82!se!abrevian! con!sus!correspondientes!números.! ! ! ! ! Resultados.!Capítulo!5! ! 129! Capítulo!V.!REGULACIÓN!DEL!CLUSTER!car!A!NIVEL!DE!CROMATINA!( ! Introducción! ! Como! ya! se! ha! mencionado,! muchos! hongos! filamentosos! producen! un! gran! arsenal!de!metabolitos!secundarios,!compuestos!de!bajo!peso!molecular!que!no!son! necesarios!para!la!supervivencia!del!hongo!pero!que!contribuyen!de!alguna!manera!a! mejorar! su! eficacia! biológica! (Fox! y! Howlett,! 2008;! Reverberi! et! al.,! 2010;! Rohlfs! y! Churchill,!2012).!La!síntesis!de!metabolitos!secundarios!consume!energía,!por!lo!que! solo!se!lleva!a!cabo!cuando!es!ventajoso!para!el!organismo.!Para!ello!los!hongos!han! desarrollado!sofisticados!mecanismos!de!regulación,!tanto!positiva!como!negativa,!que! controlan!la!expresión!de!los!genes!responsables.!En!muchos!casos!los!genes!de!una! misma! ruta! se! organizan! en! un! cluster! en! el! genoma! (Keller! y! Hohn,! 1997).! Estos! clusters) se!ubican!con! frecuencia! en! regiones!subteloméricas!y!son! propensos!a!ser! silenciados!!a!nivel!de!estructura!de!la!cromatina!(Studt!et)al.,!2017).!! La!cromatina!es!un!complejo!de!histonas!y!proteínas!no!histónicas!asociadas!con! el!ADN!nuclear,!que!constituyen!el!sustrato!molecular!sobre!el!que!se!llevan!a!cabo! todos! los! procesos! celulares! del! ADN,! como! son! la! replicación,! la! recombinación,! la! reparación!o!la!transcripción.!Desde!el!punto!de!vista!estructural,!la!cromatina!puede! adoptar! distintas! formas! de! organización,! que! implican! grados! de! compactación! diferentes.!En!líneas!generales,!la!cromatina!puede!estar!condensada!o!relajada.!En!el! primer! caso,! la! cromatina! está! densamente! empaquetada! (heterocromatina)! y! la! correspondiente! región! genómica! está! transcripcionalmente! silenciada.! Por! el! contrario,! en! el! segundo! caso! la! cromatina! está! desempaquetada! (eucromatina)! y! accesible! a! la! maquinaria! de! transcripción.! El! grado! de! empaquetamiento! está! asociado!al!estado!químico!de!las!colas!de!las!histonas,!que!depende!de!la!actividad!de! ciertas! enzimas! que! forman! parte! de! un! complejo! dedicado! a! añadir! o! eliminar! modificaciones! químicas! en! residuos! de! aminoácidos! bien! definidos! en! dichas! colas! (Bannister!y!Kouzariedes,!2011;!Gacek!y!Strauss,!2012).! Se!han!desarrollado!técnicas!experimentales!que!permiten!estudiar!la!dinámica!de! la!cromatina!y!las!modificaciones!que!sufre!para!modular!su!accesibilidad,!como!es!la! inmunoprecipitación! de! cromatina! (ChIP,! de! Chromatin) immunoprecipitation).! La! técnica! de! ChIP,! desarrollada! hace! unos! 30! años! (Solomon! y! Varshavsky,! 1985;! Solomon!et!al.,!1988),!permite!determinar!y!cuantificar!la!interacción!del!ADN!con!las! proteínas! asociadas! in) vivo.! Este! método! permite! averiguar! si! proteínas! específicas,! como! histonas! o! factores! de! transcripción,! se! encuentran! localizadas! en! una! región! genómica!concreta!bajo!unas!ciertas!condiciones!experimentales.!La!técnica!original!se! basa! en! el! análisis! de! ADN! recuperado! de! una! reacción! de! fijación! (crosslinkdecrosslink),! y! en! la! coprecipitación! con! complejos! proteicos.! Para! estabilizar! esta! Resultados.!Capítulo!5! ! 130! interacción! durante! el! paso! de! inmunoprecipitación! (IP),! las! células! se! tratan! con! formaldehído! in) situ.! El! tiempo! de! exposición! y! la! concentración! de! formaldehído! dependen! del! organismo! y! necesitan! ser! optimizados! empíricamente! para! cada! especie!y!condición!experimental.!En!breve,!la!cromatina!y!las!proteínas!asociadas!al! ADN! se! fijan! temporalmente,! y! el! ADN! genómico! se!rompe! por! sonicación! para! obtener!fragmentos!de!unos!300!-!500!pares!de!bases.!Los!anticuerpos!que!reconocen! epítopos! en! las! proteínas! diana! se! añaden! a! la! mezcla! de! reacción! para! inmunoprecipitar! los! complejos! proteicos! unidos! al! ADN.! Después! se! revierte! la! fijación,! se! digieren! los! componentes! proteicos! y! se! aísla! el! ADN.! Finalmente,! la! cantidad!de!ADN!precipitado!se!determina!mediante!PCR!cuantitativa!en!comparación! con!el!ADN!total!(Boedi!et!al.,!2012).!Esta!técnica!se!ha!aplicado!con!éxito!en!hongos! filamentosos!(ver,!por!ejemplo,!Belden!et!al.,!2007;!Bernreiter!et!al.,!2007;!Gonzalez!y! Scazzocchio,!1997;!Grimaldi!et!al.,!2006).! La! expresión! de! los! genes! está! controlada! por! distintos! tipos! de! proteínas,! que! incluyen!desde!factores!de!transcripción!hasta!complejos!modificadores!de!cromatina! e!histonas.!Algunas!de!las!modificaciones!de!las!histonas,!habitualmente!metilaciones! o!acetilaciones,!se!han!asociado!a!la!activación!transcripcional.!Entre!ellas!figuran,!por! ejemplo,!la!metilación!de!la!lisina!4!de!la!histona!H3!(H3K4me1,!H3K4me3,!donde!se! indica!la!histona,!el!residuo!modificado!y!el!tipo!de!modificación),!la!acetilación!de!la! lisina! 9! de! la! histona! H3! (H3K9ac),! o! la! modificación! de! otras! lisinas! (por! ejemplo,! H3K27ac,! H3K36me3).! Otras! modificaciones! están! asociadas! al! silenciamiento! de! genes,!como!la!H3K9me3!y!la!H3K27me3!(Pérez-Lluch!et!al.!2015).! Los! clusters!de! genes! para! la! síntesis! de! metabolitos! secundarios! suelen! estar! sujetos! a! regulación! epigenética! a! nivel! de! metilación! o! acetilación! de! las! histonas,! como!es!el!caso!de!los!que!forman!los!genes!de!las!síntesis!de!giberelinas,!bikaverina!o! fumonisinas!(Wiemann!et!al.,!2013).!En!este!capítulo!se!ha!investigado!la!existencia!de! modificaciones!químicas!en!las!histonas!del!cluster!car,!representados!por!los!genes! carRA!y! carB.! La! investigación! se! ha! extendido! a! los! genes! carS!y! carP,! como! reguladores!de!la!ruta,!el!caso!de!carP!por!ser!un!ARNlnc,!implicado!en!la!regulación!de! la!carotenogénesis!que!podría!actuar!a!nivel!epigenético!a!través!de!modificaciones!de! la! cromatina! (Rinn,! 2014).! Las! modificaciones! epigenéticas! de! estos! genes! se! han! estudiado! en! diferentes! estirpes! y! condiciones! de! regulación.! En! particular,! se! ha! prestado!atención!al!efecto!de!la!luz,!ya!que!en!N.)crassa!la!acetilación!es!requerida! para!la! respuesta! a!la! luz! del!complejo! White! collar-1!(Grimaldi! et! al.,!2006),!y! a! la! mutación! del! gen! carS,! como! ya! se! ha! hecho! anteriormente! en! los! estudios! de! transcriptómica!descritos!en!el!Capítulo!2.! ! ! Resultados.!Capítulo!5! ! 131! Resultados! Análisis!epigenético!sobre!los!genes!estructurales!de!la!carotenogénesis! ! Con!el!objetivo!de!averiguar!si!existe!regulación!epigenética!en!el!cluster!car!y!sus! genes!reguladores,!se!ha!usado!la!técnica!de!Inmunoprecipitación!de!cromatina!(ChIP).! En!el!ensayo!se!han!empleado!la!estirpe!silvestre!(WT),!los!mutantes!carS!SX1!y!SX2! (descritos! en! el! Capítulo! 1),! y! la! estirpe! ΔcarP! SX82! (descrita! en! el! Capítulo! 3).! Las! estirpes! se! incubaron! durante! 3! días! en! oscuridad! y,! de! forma! análoga! a! otros! experimentos!descritos!en!esta!Tesis,!se!iluminaron!en!su!caso!durante!una!hora.!Al! terminar!la!incubación,!en!oscuridad!o!en!luz,!los!cultivos!se!fijaron!con!formaldehído!y! se!sometieron!al!protocolo!de!extracción!de!cromatina!(ver!Material!y!Métodos).! Las!marcas!epigenéticas!que!se!han!estudiado!son!dos!de!activación,!H3K4me3!y! H3K9ac,!y!una!de!represión,!H3K9me3.!Los!genes!investigados!fueron!carRA!y!carB,! tanto!por!ser!representativos!del!cluster!car!como!por!desempeñar!un!papel!central!en! la!carotenogénesis,!y!los!genes!reguladores!carS!y!carP.!También!se!incluyeron!como! control!de!alta!expresión!el!gen!de!la!β-tubulina!(Foxg_06228),!y!como!control!de!no! expresión!el!gen!Foxg_05571,)supuestamente!silenciado!por!su!proximidad!a!una!de! las!dos! regiones! teloméricas! del! cromosoma! II.! Foxg_05571! presenta!una! expresión! inapreciable,!como!indica!la!ausencia!de!lecturas!de!su!transcrito!en!el!análisis!ARNSeq!(Figura!C5.1).! ! ! El!análisis!de!las!marcas!epigenéticas!se!basó!en!la!realización!de!PCR!cuantitativa! (qPCR)!de!ADN!inmunoprecipitado!con!anticuerpos!frente!a!las!distintas!marcas.!Los! cebadores! utilizados! para! el! análisis! de! los! genes! diana! (tabla! M2! de! Material! y! Métodos)!cubren!entre!200!y!250!pb!en!la!región!5’!del!gen!diana,!ya!que!ésta!es!la! región! donde! se! suelen! establecer! las! marcas! epigenéticas! (Ernst! et! al.,! 2011).!Se! estudiaron!varias!regiones!del!promotor,!pero!sólo!se!analizaron!las!que!cumplían!los! requisitos! óptimos! para! el! análisis! de! qPCR! cuantitativa! (descrito! en! Material! y! Figura!C5.1.!Niveles!de!expresión!en!el!análisis!ARN-Seq!descrito!en!el!Capítulo!2!para!algunos!de!los! genes!utilizados!en!el!estudio.!Los!genes!carRA!y!carS!son!los!controles!internos!de!expresión.!Los! genes! Foxg_06228! (tub-β)! y! Foxg_05571!(región! telomérica)! son! los! controles! de! expresión! constitutiva!y!represión,!respectivamente.! Resultados.!Capítulo!5! ! 132! Métodos).! Las! posiciones! de! las! regiones! estudiadas! y! analizadas! en! el! análisis! cuantitativo!se!muestran!en!la!Figura!C5.2.! ! ! ! Marcas!de!activación!y!represión!en!los!genes!carRA!y!carB( ! Como!ya!se!ha!mostrado!en!resultados!anteriores,!los!genes!carRA!y!carB!de!F.) oxysporum!presentaron!niveles!de!ARNm!bajos!en!oscuridad!y!altos!tras!una!hora!de! iluminación.!Por!su!parte,!los!genes!carS!y!carP!mostraron!una!leve!inducción!de!sus! niveles!de!ARNm!en!la!luz,!y!parecen!desempeñar!papeles!reguladores!contrapuestos,! como! indican! los! fenotipos! en! la! carotenogénesis! generados! por! sus! mutaciones,! alcanzando!niveles!de!ARNm!muy!altos!de!los!genes!estructurales!en!el!caso!de!los! mutantes!carS!y!niveles!muy!bajos!en!los!mutantes!ΔcarP.!El!estudio!abordado!en!este! capítulo! pretende! averiguar! la! posible! influencia! de! las! marcas! epigenéticas! en! la! regulación!de!estos!genes.! Figura! C5.2.! Posición! en! el! genoma! de! las! regiones! estudiadas! en! el! análisis! de! qPCR.!Se! representan! los! genes! y! las! regiones! del! promotor! estudiadas! de! cada! gen.! RAP:! Región! Amplificada! del! Promotor,! seguida! del! nombre! del! gen! en! cuestión.! Las! líneas! naranja! son! las! regiones!analizadas!por!qPCR.!Las!líneas!grises!son!las!regiones!estudiadas,!pero!no!analizadas!por! qPCR.!A!Región!del!cluster!car!con!los!genes!carRA,!carB!y!parte!del!gen!carX.!B!Región!que!cubre! desde! el! gen! carF!hasta! el! gen! carS.! C!Tegión! subtelomérica! incluyendo! el! gen! Foxg_05571,! utilizada!como! control! del! análisis.! D!Región! con! el! gen! de! la! β-tubulina! (Foxg_06228),! usado! como!control!de!alta!expresión.!! Resultados.!Capítulo!5! ! 133! En! la! Figura! C5.3! se! describe! la! relación! entre! la! metilación! de! la! lisina! 4! de! la! histona!3!(H3K4),!la!metilación!y!la!acetilación!de!la!lisina!9!en!la!histona!3!(H3K9)!en! los! promotores! de! los! genes! arriba! mencionados,! en! la! estirpe! silvestre! y! en! los! mutantes!carS!y!ΔcarP.!En!la!figura!se!muestra!también!si!las!diferencias!observadas! son!estadísticamente!significativas!de!acuerdo!con!el!test!de!t-student,!indicando!con! 1,!2!ó!3!asteriscos!los!distintos!niveles!de!fiabilidad!para!las!diferencias!significativas! (datos! completos! en! Anexo! II).! Para! facilitar! las! comparaciones,! los! resultados! se! muestran!agrupando!los!datos!por!estirpes!(Figura!C5.3!A)!o!por!genes!(Figura!C5.3!B).! Aunque! es! frecuente! que! la! cantidad! de! señal! sea! mayor! en! la! luz! que! en! la! oscuridad!para!las!tres!marcas!estudiadas!en!distintas!estirpes!y!genes!analizados,!las! diferencias!no!son!estadísticamente!significativas!en!ninguno!de!los!casos,!por!lo!que! se!puede!concluir!que!la!luz!no!es!un!agente!ambiental!que!actúe!de!forma!relevante!a! través! de! estas! modificaciones! epigenéticas,! al! menos! en! estos! genes.! Se! resume! a! continuación!el!resultado!obtenido!para!cada!una!de!las!marcas!con!los!genes!y!fondos! genéticos!investigados,!ignorando!las!diferencias!entre!luz!y!oscuridad.! ! H3K4me3,! marca! asociada! a! promotores! activos.! Los! resultados! en! los! genes! utilizados!como!controles!coinciden!con!sus!patrones!de!expresión!esperados!en!todas! las! estirpes! y! condiciones:! la! región! 5’! del! gen! de! la! β-tubulina! presenta! un! enriquecimiento! significativo! de! metilación! H3K4,! asociada! a! un! nivel! elevado! de! expresión,!mientras!que!en!la!región!5’!del!gen!subtelomérico!Foxg_05571!se!observan! niveles! bajos! de! dicha! metilación.! La! considerable! diferencia! en! los! patrones! de! expresión!de!estos!genes,!obtenidos!en!los!análisis!de!RNA-Seq!descritos!en!el!Capítulo! 2,!se!muestran!en!la!figura!C5.1.!!Sin!embargo,!contra!lo!que!cabría!esperar,!los!genes! carRA!y! carB! presentaron! niveles! muy! bajos! de! esta! marca! epigenética! con! independencia! de! la! cantidad! de! carotenoides! de! la! estirpe! y! condición! estudiada,! incluyendo!los!mutantes!carS,!en!los!que!la!expresión!de!ambos!genes!es!muy!elevada.! Por!el!contrario,!las!regiones!5’!de!los!genes!carS!y!carP!presentaron!niveles!altos!de! metilación! H3K4me3,! con! valores! próximos! al! gen! constitutivo! de! la! β-tubulina! en! todas!las!estirpes.!Los!niveles!de!esta!metilación!fueron!especialmente!elevados!para! el!gen!carS!en!la!estirpe!ΔcarP)en!relación!a!las!otras!las!estirpes!(Figura!C5.3!B).! H3K9ac,!marca!asociada!a!promotores!activos!(Karmodiya!et!al.,!2012).!Los!datos! de! esta! marca! son! más! ambiguos,! ya! que! los! niveles! observados! fueron!menos! variables! entre! las! distintas! estirpes! o! los! genes! analizados.! Así,! en! este! caso,! las! diferencias!fueron!menores!entre!los!dos!genes!control,!con!niveles!sólo!algo!mayores! en! el! gen! de! la! β-tubulina! que! en! el! control! subexpresado! Foxg_05571.! Tampoco! ayudan! a! una! interpretación! más! clara! las! diferencias! observadas! entre! los! dos! mutantes!carS,!con!niveles!en!general!mayores!en!SX1!que!en!SX2.! Resultados.!Capítulo!5! ! 134! H3K9me3,!marca!asociada!a!heterocromatina,!es!decir,!el!estado!de!la!cromatina! condensada! y! transcripcionalmente! inactiva! (Lehnertz! et! al.,! 2003).! Como! era! de! esperar,!se!observó!el!patrón!opuesto!a!la!marca!de!activación!H3k4me3,!evidenciada! claramente!por!los!niveles!contrapuestos!observados!para!los!dos!genes!control,!muy! elevados!en!el!gen!Foxg_05571)y!muy!bajos!en!el!gen!de!la!β-tubulina.!En!general,!los! niveles! fueron! muy! bajos! en! el! resto! de! los! genes,! indicando! que! se! ubicaría! en! la! cromatina!transcripcionalmente!activa,!pero!es!aparentemente!un!poco!más!alta!en! los!genes!carRA!y!carB!tanto!en!la!estirpe!silvestre!y!en!el!mutante!ΔcarP!como!en!los! mutantes! carS,! lo! cual! puede! estar! asociado! al! mayor! nivel! de! expresión! en! estos! últimos.!Sin!embargo,!la!diferencia!no!es!estadísticamente!significativa.! ! A ! H3K4me3 ! H3K9a c! H3K9me 3ac! Resultados.!Capítulo!5! ! 135! ! ! Figura!C5.3.!Niveles!de!las!marcas!epigenéticas!H3K4me3,!H3K9ac!y!H3K9me3!en!la!región!5’!de!los!genes!car! en! la! estirpe! silvestre! y! en! los! mutantes! ΔcarP,! SX1! y! SX2! en! oscuridad! o! tras! una! hora! de! iluminación.!A! Representación! agrupando! los! datos! por! estirpes.! B!Representación! agrupando! los! datos! por! genes.! Se! representa! la! media! y! el! error! típico! del! porcentaje! de! enriquecimiento! de! la! marca! con! respecto! al! Input! (cromatina!total)!en!cuatro!réplicas!biológicas!independientes.!Los!asteriscos!indican!una!diferencia!significativa! en!el!enriquecimiento!de!la!marca!(p!<!0.05).!Se!representan!los!mismos!datos!en!los!paneles!A!y!B!con!distintas! comparaciones! para! facilitar! tanto! la! interpretación! de! los! datos! como! la! representación! de! las! diferencias! estadísticas.! ! ! B! H3K4me3 ! H3K9ac! H3K9me3! Resultados.!Capítulo!5! ! 136! !En! conclusión,! los! datos! sugieren! que! las! modificaciones! epigenéticas! no! desempeñan!un!papel!importante!en!la!regulación!de!los!genes!estructurales!carRA!y! carB,!pero!sí!pueden!desempeñar!un!papel!relevante!en!el!control!de!la!expresión!de! los!genes!carS!y!carP.!! ! Extensión!del!análisis!de!H3K4me3!a!una!región!adyacente!en!los!promotores!de! los!genes!carRA!y!carB( ! ! La!metilación!en!la!lisina!4!de!la!histona!H3,!una!de!las!modificaciones!de!histonas! más!estudiadas,!se!ha!asociado!con!mucha!frecuencia!a!promotores!de!genes!activos,! especialmente!a!genes!constitutivos!(Barski!et!al.,!2007).!En!los!datos!mostrados!en!el! apartado!anterior,!los!niveles!de!esa!metilación!en!los!genes!carRA!y!carB!fueron!muy! bajos! en! todas! las! condiciones,! incluyendo! en! los! mutantes! carS! SX1! y! SX2,! que! muestran!una!transcripción!muy!activa!de!ambos!genes.!Existe!la!posibilidad!de!que!la! regulación!por!esta!metilación!se!ubique!en!otra!región!de!los!promotores!de!carRA!y! carB.!Para!comprobar!esta!hipótesis,!se!diseñaron!nuevas!parejas!de!cebadores!que! cubrieran!una!zona!más!extensa!de!la!región!5’!de!ambos!genes.!Este!nuevo!análisis! cubre!unos!200!pb!de!la!región!promotora!(Figura!C5.1)!y!se!realizó!mediante!la!misma! técnica!para!los!mismos!genes,!estirpes!y!condiciones!descritas!en!el!apartado!anterior! (Figura!C5.4).!! Figura!C5.4.!Niveles!de !la ! marca!H3K4me3!en!la!región!5’!de!los!genes!carRA!y!carB!de!la!estirpe! silvestre!y!de!los!mutantes!ΔcarP,!SX1!y!SX2.!carRA!(I)!y!carB!(I):!zona!amplificada!por!la!pareja!de! cebadores! del! experimento! anterior! (ChIP-QPCR-carRA-carX-1F/ChIP-QPCR-carRA-carX-1R! y! ChIPQPCR-carB-2F/!ChIP-QPCR-!carB-2R,!respectivamente).!carRA!(II)!y!carB!(II):!zona!amplificada!con!los! nuevos! cebadores! (ChIP-QPCR-carRA-carX-2F/! ChIP-QPCR-carRA-carX-2R! y! ChIP-QPCR-carB-1F/! ChIPQPCR-carB-1R,!respectivamente).!Las!estirpes!se!incubaron!en!la!oscuridad!y,!en!su!caso,!se!iluminaron! durante!una!hora.!Los!datos!representan!la!media!y!el!error!típico!del!porcentaje!de!enriquecimiento! de!la!marca!con!respecto!al!Input!(cromatina!total)!de!dos!réplicas!biológicas!independientes.!! Resultados.!Capítulo!5! ! 137! ! Los! resultados! volvieron! a! mostrar! niveles! bajos! de! metilación! H3K4me3! para! carRA!y!carB!en!todos!los!mutantes!analizados,!en!oscuridad!o!tras!una!hora!de!luz.! Por! tanto,! la! metilación! H3k4me3,! no! parece! estar! asociada! a! la! activación! de! la! transcripción!por!luz!de!los!genes!estructurales!de!la!carotenogénesis,!al!menos!en!las! estirpes!y!condiciones!estudiadas.! ! Efecto!del!tiempo!de!iluminación!sobre!las!marcas!activadoras! ! !Como!ya!se!ha!indicado!en!la!introducción,!tal!como!ocurre!en!otras!especies!del! género!Fusarium,!la!luz!es!una!señal!activadora!de!la!transcripción!de!los!genes!de!la! carotenogénesis!en!F.)oxysporum.!En!las!condiciones!empleadas,!los!niveles!de!ARNm! de!los!genes!estructurales!(por!ejemplo,!carRA!y!carB)!alcanzan!su!nivel!máximo!a!los! 60!minutos!de!exposición!a!la!luz! (Rodríguez-Ortiz! et! al.,! 2012).!Dado!que!tras!este! tiempo!de!iluminación!no!se!observan!cambios!importantes!en!las!señales!activadoras,! nos!planteamos!la!hipótesis!de!que!dichas!señales!puedan!actuar!transitoriamente,!y! que!lo!hagan!en!tiempos!más!cortos!de!iluminación.!Para!comprobar!esta!hipótesis,!se! analizó! la! presencia! de! las! marcas! activadoras! H3K4me3! y! H3K9ac! tras! distintos! tiempos! de! iluminación.! En! concreto,! los! cultivos! incubados! durante! 3! días! en! oscuridad!se!iluminaron!durante!2,5,!5,!10,!30!y!60!min.!Debido!al!elevado!número!de! muestras,!este!estudio!se!limitó!a!la!estirpe!silvestre.! ! Los! resultados! mostraron! una! subida! transitoria! en! la! metilación! tras! un! breve! pulso!de!iluminación!para!todos!los!genes!analizados!(Figura!C5.5).!Sin!embargo,!dicha! subida!se!apreció!también!en!los!genes!control!y!la!magnitud!de!la!subida!fue!modesta! y!estadísticamente!no!significativa.!Por!tanto,!este!efecto!no!parece!ser!relevante!y,!de! ser!real,!puede!tener!otras!causas!no!relacionadas!con!la!existencia!de!regulación.!Se! observó! también! una! cierta! tendencia! a! la! subida! con! tiempos! más! largos! de! iluminación!pero,!de!nuevo,!las!diferencias!no!fueron!muy!llamativas.!Especialmente! informativo!fue!el!escaso!efecto!de!la!luz!en!los!niveles!de!metilación!H3K4me3!en!los! genes!carRA!y!carB,!que!confirman!que!la!luz!actúa!con!independencia!de!esta!marca! epigenética.!!Sin!embargo,!la!subida!de!la!marca!H3K9ac!por!efecto!de!la!luz!fue!un! poco!más!patente,!pero!las!diferencias!siguieron!sin!ser!significativas,!lo!cual!contrasta! con! el! drástico! efecto! que! ejerce! la! luz! sobre! la! transcripción! de! carRA!y! carB.! Los! resultados! no! fueron! muy! diferentes! para! los! genes! carS!y! carP,! aunque! en! ambos! casos!se!trata!de!dos!genes!cuyos!niveles!de!ARNm!se!ven!menos!influidos!por!la!luz.!! Discusión! ! 144! transformantes! obtenidos! por! inserciones! de! ADN-T! mediadas! por! A.) tumefaciens!y! poseen! la! inserción! de! ADN-T! en! la! región! genómica! próxima! al! gen! carS.! Estas! inserciones!no!parecen!alterar!ningún!otro!marco!abierto!de!lectura!de!otros!genes! anotados! en! esta! región! del! genoma! de! F.) oxysporum,! posicionándose! en! la! región! intergénica! entre! el! gen! Foxg_09306!y! el! gen! carS) en! T2,! y! entre) Foxg_09305) y! Foxg_09306) en! T3.! Además,! en! el! caso! de! T3! se! identificó! una! alteración! en! la! secuencia!entre!Foxg_09306!y!el!gen!carS)de!naturaleza!desconocida.!A!juzgar!por!la! coincidencia! con! la! localización! del! ADN-T! en! el! transformante! T2,! esta! alteración! puede! ser! la! causante! de! su! fenotipo! desregulado! para! la! carotenogénesis.! Es! interesante!recalcar!que!los!fenotipos!de!T2!y!de!T3!son!parecidos,!pero!no!idénticos,! ya!que!T2!tiene!más!carotenoides!en!la!oscuridad!que!T3,!y!su!patrón!de!acumulación! de!carotenoides!es!muy!similar!al!de!los!mutantes!SX1!y!SX2.!Sin!embargo,!de!forma! análoga!a!estos!mutantes,!tanto!T2!como!T3!poseen!niveles!anormalmente!altos!de! ARNm! de! los! genes! estructurales! de! la! carotenogénesis! tanto! en! luz! como! en! oscuridad.! En! un! primer! intento! por! comprender! las! causas! moleculares! del! fenotipo! desregulado! de! la! carotenogénesis! en! los! transformantes! T2! y! T3,! se! hizo! una! búsqueda! de! posibles! elementos! reguladores! en! la! región! intergénica! entre! Foxg_09306!y! carS! (Rodríguez-Ortíz,! 2012).! Un! programa! de! predicción! de! genes! precursores!de!microARNs!encontró!dos!secuencias!candidatas,!que!en!espera!de!su! confirmación!molecular!recibieron!los!nombres!de!fox-mir-1!y!fox-mir-2.!Los!microARN! son!ARN!interferentes!de!unos!20-25!nucleótidos!generados!a!partir!de!precursores!no! codificantes,!que!al!transcribirse!se!pliegan!por!apareamientos!internos!para!formar! horquillas! que! contienen! segmentos! de! complementariedad! imperfecta.! El! procesamiento!de!los!precursores!ocurre!generalmente!en!dos!etapas,!catalizado!por! las!enzimas!Drosha!en!el!núcleo!y!Dicer!en!el!citoplasma.!La!mayoría!de!los!microARN! estudiados! regulan! negativamente! la! expresión! de! sus! genes! diana! a! nivel! postranscripcional! (Bartel,! 2004;! Lai,! 2003).! Los! microARNs! pueden! inhibir! la! traducción!de!ARNm!o!bien!inducir!su!degradación,!iniciándose!con!la!eliminación!de!la! cola!poliadenilada!del!ARNm!(Pillai,!2005;!Bartel,!2004).!Están!en!estudio!actualmente! en!el!mismo!grupo!donde!se!ha!realizado!este!trabajo!la!función!de!las!proteínas!Dicer! de!F.)fujikuroi!mediante!sus!mutaciones!dirigidas!en!el!genoma.!! Los! resultados! descritos! en! el! Capítulo! 2! permiten! replantearse! las! causas! moleculares!que!producen! los! fenotipos!de!T2! y! de!T3.!La! transcriptómica! de!ARNs! pequeños!ha!descartado!la!presencia!de!microARNs!en!la!región!anterior!al!gen!carS,! pero! ha! identificado! en! su! lugar! un! ARN! largo! no! codificante,! supuestamente! poliadenilado,! que! se! ha! denominado! carP) por! la! pérdida! de! fotoinducción! de! la! carotenogénesis!que!produce!su!mutación.!Este!gen!no!fue!identificado!originalmente! en!la!anotación!del!genoma,!ya!que!ésta!se!basa!sobre!todo!en!la!predicción!de!ORFs,! Discusión! ! 145! es!decir,!secuencias!codificantes!sin!interrupciones!con!una!longitud!significativamente! larga.!Como!toda!secuencia!de!ADN,!la!secuencia!del!gen!carP!incluye!varios!ORFs.!La! más!extensa!tiene!131!aminoácidos,!un!tamaño!que!no!permite!descartar!que!se!trate! de!una!proteína!funcional.!Sin!embargo,!aunque!el!gen!homólogo!a!carP!en!F.)fujikuroi! tiene! la! misma! función! (los! mutantes! ΔcarP! de! esta! especie! muestran! el! mismo! fenotipo!albino)!y!tiene!una!alta!similitud!de!secuencia!con!carP!de!F.)oxysporum,!75!%! de!identidad),!los!dos!genes!tienen!patrones!de!ORFs!muy!distintos!(J.!Pardo!Medina,! datos!no!publicados).!De!hecho,!el!ORF!de!131!aminoácidos!no!figura!en!los!ORFs!de!F.) fujikuroi,!ni!siquiera!un!fragmento!de!ella.! La!orientación!del!transcrito!carP!se!ha!establecido!mediante!PCR!específica!de! cadena,!y!el!mismo!resultado!se!ha!obtenido!en!F.)fujikuroi!(J.!Pardo!Medina,!datos!no! publicados).!Sin!embargo,!tampoco!se!ha!observado!ningún!paralelismo!entre!los!ORFs! de!ambos!genes!en!la!dirección!opuesta.!Otro!dato!especialmente!informativo!es!que! el!alineamiento!de!los!genes!carP!de!ambas!especies!muestra!numerosos!huecos!de! muy! pocas! bases,! que! indica! que! sus! secuencias! han! evolucionado! manteniendo! su! función,! aunque! se! alteren! sus! pautas! de! lectura.! Considerados! globalmente,! la! información!respalda!de!forma!muy!sólida!la!naturaleza!no!codificante!de!carP.! Una!vez!asentada!la!naturaleza!del!ARN!regulador!aguas!arriba!de!carS,!se!debe! tener!en!cuenta!su!existencia!para!la!interpretación!tanto!de!las!deleciones!dirigidas!de! los! supuestos! precursores! de! microARN! realizadas! en! el! Capítulo! 1,! como! de! los! efectos!de!la!inserción!de!ADN-T!en!el!transformante!T2!o!de!la!secuencia!alterada!en! el!transformante!T3.!! ! Base!molecular!del!fenotipo!de!los!transformantes!T2!y!T3! Se! conoce! la! ubicación! precisa! de! las! inserciones! de! ADN-T! en! los! transformantes!T2!y!T3;!sin!embargo,!en!el!caso!de!T3,!se!desconocen!los!detalles!de!la! alteración! molecular! sufrida! entre! el! gen! carP!y! el! gen! carS.! Aunque! los! datos! disponibles! la! sitúan! más! cerca! de! carP! que! la! inserción! de! ADN-T! en! la! estirpe! T2! (Rodríguez-Ortiz,! 2012),! solo! se! pudo! deducir! que! esa! región! está! alterada! por! las! diferencias! observadas! en! una! hibridación! Southern,! empleando! como! sonda! un! segmento! de! ADN! del! gen! Foxg_09305,! vecino! a! Foxg_09306) (carF).! De! hecho,! la! alteración!puede!afectar!a!la!región!5’!del!transcrito!carP.!!Los!intentos!de!amplificar! por!PCR!la!secuencia!alterada!no!dieron!ningún!resultado!(Rodríguez-Ortiz,!2012),!lo! cual!sugiere!que!se!ha!producido!una!inserción!de!un!tamaño!suficiente!para!impedir! su! amplificación! con! cebadores! circundantes.! Será! necesario,! por! tanto,! realizar! la! secuenciación!del!genoma!de!esta!estirpe!para!entender!la!naturaleza!molecular!de!la! alteración!causante!de!este!fenotipo.!! Discusión! ! 146! A!pesar!de!las!diferencias!moleculares!y!fenotípicas!entre!los!transformantes!T2! y!T3,!los!datos!de!ARN-Seq!mostraron!un!elevado!grado!de!coincidencia!en!los!genes! afectados.!Dicha!coincidencia!es!especialmente!alta!en!el!caso!de!los!genes!reprimidos,! mucho!más!abundantes!que!para!los!genes!sobreexpresados!en!ambas!estirpes!(Figura! C2.4).! El! resultado! más! significativo! sobre! la! alteración! regulatoria! en! estos! transformantes!se!obtuvo!con!la!visualización!de!las!lecturas!en!la!región!próxima!al! gen!carP,!que!mostró!una!región!transcripcionalmente!silenciada!que!abarca!desde!el! promotor!del!gen!carF!hasta!el!gen!Foxg_09312.!La!región!silenciada!incluye!tanto!al! gen!carS!como!al!gen!carP.!Aunque!se!desconoce!aún!el!fenotipo!del!doble!mutante! carS/carP,!por!el!fenotipo!mostrado!por!los!transformantes!T2!y!T3,!cabe!suponer!que! la! mutación! carS! será! epistática! sobre! carP.! Dicho! de! otra! forma,! si! ambos! genes! estuvieran!funcionalmente! relacionados,! carP! ejercería! influencia! sobre! carS!y! no!al! contrario.!Es!importante!resaltar!que!el!silenciamiento!es!más!completo!en!T2!que!en! T3,!habiendo!aún!en!este!último!niveles!detectables!del!transcrito!carS,!lo!cual!explica! su!fenotipo!menos!drástico!que!el!mostrado!por!T2.! La!región!silenciada!en!los!transformantes!T2!y!T3!arranca!aproximadamente!en! los!lugares!con!la!inserción!de!ADN-T!en!el!primer!caso!o!con!el!ADN!alterado!en!el! segundo.!Por! tanto,! cabe!suponer! una!relación! directa! causa-efecto.!La! información! disponible!sobre!los!otros!genes!afectados!por!el!silenciamiento!no!aporta!información!! relevante.!Los!tres!genes!siguientes!a!carS!son!Foxg_09308,!que!cifra!una!proteína!de! 534! aminoácidos! (código! de! acceso! XP_018246454)! de! función! desconocida,! Foxg_09309,! que! codifica! una! supuesta! fosfo-CoA! quinasa! de! 231! aminoácidos! (XP_018246455)!y!Foxg_17768,! que! codifica!otra! proteína!de!193! aminoácidos!(XP_! 018246463)!de! función! desconocida.! La! reacción! supuestamente!llevada! a! cabo! por! Foxg_09309!es:!ATP!+!defosfo-CoA!!↔!ADP!+!CoA,!y!forma!parte!de!la!biosíntesis!de! pantotenato!y!CoA.!Los!primeros!pasos!de!la!síntesis!de!terpenoides!empiezan!por!el! acetil!coenzima!A,!pero!probablemente!se!trata!de!una!relación!accidental,!ya!que!hay! terpenoides! esenciales! que! se! deben! seguir! sintetizando,! como! es! el! caso! de! los! esteroles,! por! lo! que! sin! duda! la! célula! conserva! la! capacidad! de! sintetizar! CoA.! El! hecho!de!que!cubra!una!región!de!12!kb!sugiere!una!conexión!con!un!mecanismo!de! regulación!epigenético!que!cubra!una!región!cromatínica,!más!que!un!efecto!individual! sobre!cada!gen.! Un! aspecto! especialmente! intrigante! de! los! transformantes! T2! y! T3! es! el! elevado!número!de!genes!cuya!expresión!se!ve!alterada!de!forma!importante!en!las! dos!estirpes.!La!lista!de!genes!con!un!grado!de!represión!mayor!(Tabla!C2.6)!muestra! una!fuerte!predominancia!de!genes!para!proteínas!de!función!desconocida,!y!las!de! función! conocida! no! guardan! ninguna! relación! aparente.! Llama! la! atención! sin! embargo!la!tendencia!a!incluir!genes!contiguos,!lo!que!sugiere!que!los!transformantes! tienen!otras!regiones!genómicas!inactivadas!que!incluyen!a!varios!genes.! Discusión! ! 147! Posible!función!de!carP(como!ARN!no!codificante( Las! técnicas! modernas! de! transcriptómica! global! están! cambiando! en! gran! medida!la!perspectiva!que!se!tenía!sobre!las!funciones!codificantes!de!los!genomas,!ya! que! están! revelando,! en! un! número! creciente! de! organismos! eucariotas,! que! la! proporción!de!ARNs!sin!capacidad!de!codificar!proteínas!es!mucho!mayor!de!lo!que!se! esperaba.!En!humanos,!sólo!el!2%!de!los!genes!codifican!proteínas,!considerando!el! resto!como!ARNs!no!codificantes!(Ponting!et!al.,!2009).!Se!han!descrito!muchos!tipos! de!ARNs!no!codificantes;!sin!embargo,!trabajos!recientes!revelan!la!importancia!de!los! “long!non-coding”!(ARNlnc),!definidos!como!ARNs!no!codificantes!de!más!de!200!pb!de! longitud.!Aunque!han!sido!pocos!los!caracterizados!hasta!la!fecha,!los!estudios!revelan! que! pueden! regular! la! expresión! de! otros! genes! a! nivel! transcripcional,! postranscripcional!y!epigenético!(Wapinski!y!Chang,!2011).!Los!ARNlnc!pueden!actuar! directamente!en!el!mensajero!de!su!gen!diana,!positiva!o!negativamente,!afectando!a! su! traducción.! Su! efecto! sobre! la! estabilidad! del! ARN! mensajero! es! a! través! del! apareamiento!de!las!bases!de!los!ARNlncs!y!el!ARNm,!que!puede!tanto!proteger!al!ARN! de!la!degradación!como!acelerarla!(Guhaniyogi!y!Brewer,!2001).! Además! de! su! longitud,! los! ARNlncs! poseen! otras! características! propias.! La! mayoría!de!ellos!son!transcritos!por!la!ARN!Polimerasa!II,!de!forma!similar!a!los!ARNs! mensajeros,!de!manera!que!sufren!sus!mismas!modificaciones!postranscripcionales:!la! caperuza!en! su! extremo! 5’! y! la! adición! de! la!cola! poli(A)! en! el! extremo!3’! (Du!toit,! 2013).! Los! ARNlncs! regulan! la! expresión! de! otros! genes! a! través! de! diversos! mecanismos,! que! en! muchos! casos! permanecen! aún! confusos! (Mercer! et! al.,! 2009,! 2013;! Whitehead! et! al.,! 2009;! Wilusz! et! al.,! 2009).! Los! ARNlnc! supuestamente! ortólogos!tienden!a!mostrar!una!débil!conservación!de!secuencias!entre!organismos! (Pang! et! al.,! 2006),! aunque! conserven! su! función.! Los! ARNm! requieren! una! ORF! continua! con! secuencia! conservada! y! funcional.! Por! el! contrario,! como! su! propio! nombre! indica,! los! ARNlnc! carecen! de! ORFs! conservadas,! pero! mantienen! una! estructura!y!función!propias!(revisado!por!Quan!et!al.,!2015).!! Aunque!abundan!los!estudios!sobre!ARNlncs!en!mamíferos!o!plantas,!se!han! caracterizado! ARNlncs! también! en! microorganismos,! tales! como! las! levaduras! S.) cerevisiae!y!S.)pombe!(Yamashita!et!al.,!2016).!Hasta!la!fecha,!sólo!se!ha!caracterizado!! un!ARNlnc!en!hongos!filamentosos,!en)T.)reesei!(Till!et!al.,!2018b),!que!promueve!un! impacto!regulador!en!la!expresión!de!la!celulasas.!Un!estudio!de!secuenciación!masiva! de! ARN! ha! revelado! también! la! intervención! de! ARNlncs! en! la! regulación! de! la! expresión! de! genes! en! N.) crassa! (Arthanori! et! al.,! 2014).! Por! las! características! descritas! en! el! Capítulo! 3,! el! transcrito! de! carP! reúne! todos! los! requisitos! para! ser! considerado!como!un!ARN!regulador!no!codificante!tipo!ARNlnc!en!F.)oxysporum.!Su! Discusión! ! 148! mecanismo!de!acción!es!totalmente!desconocido!y!será!objeto!de!atención!de!futuros! trabajos.! Los! intentos! de! búsqueda! de! secuencias! internas! de! carP! que! apareen! con! secuencias!parciales!de!posibles!ARNm!diana,!como!los!de!los!genes!reguladores!carS)o) wcoA/wco1,!o!los!de!los!genes!estructurales!de!la!carotenogénesis,!dieron!resultados! negativos.!La!búsqueda!se!llevó!a!cabo!con!criterios!objetivos,!empleando!el!programa! Clustal)Omega,!y!el!resultado!reveló!que!no!existen!secuencias!similares!de!más!de!20! pb! con! más! del! 50%! de! identidad,! un! umbral! por! debajo! del! cual! se! encuentran! segmentos! que! aparean! parcialmente! con! cualquier! gen! al! azar.! Este! dato! parece! descartar!una!función!directa!por!apareamiento!de!carP!sobre!los!ARN!de!los!genes!de! interés.!No!se!descartan,!sin!embargo,!otros!tipos!de!mecanismos,!como!podría!ser! aquellos!basados!en!una!conformación!tridimensional!específica!del!transcrito.!De!esta! forma,!el!ARN!carP!podría!interferir!sobre!la!función!de!una!proteína!reguladora,!que! podría!ser!la!propia!proteína!CarS.!Una!hipótesis!muy!sugerente!sería!que!el!ARN!carP! se!uniera!a!CarS!y!bloqueara!su!función!represora,!de!forma!que!la!ausencia!de!carP! dejaría!a!CarS!libre!para!reprimir!la!síntesis!de!carotenoides.!De!ser!así,!la!luz!podría! ejercer!su!función!activadora,!al!menos!parcialmente,!a!nivel!de!carP,!facilitando!su! unión!a!CarS.!No!se!descartan!otros!mecanismos!de!acción!para!carP,!por!ejemplo,!a! nivel! epigenético,! reclutando! las! secuencias! diana! sobre! las! que! actuarían! algunas! proteínas! de! la! maquinaria! de! modificación! de! histonas,! como! parece! sugerir! la! participación! de! las! modificaciones! epigenéticas! en! la! regulación! del! gen! carS!o! del! propio!gen!carP,!según!se!describe!en!el!Capítulo!5.! El!gen!carP!se!encuentra!en!la!proximidad!de!los!promotores!de!los!genes!carF! y!carS,!por!lo!cual!también!podría!actuar!como!un!regulador!transcripcional!sobre!sus! genes!vecinos!codificadores!de!proteínas,!como!se!ha!descrito!para!la!regulación!del! gen! SER3! por! el! ARNlnc! SRGI!en! S.) cerevisiae! (Martens! et! al.,! 2004).! Eso! es! precisamente!lo!que!se!observa,!ya!que!los!mutantes!ΔcarP!muestran!un!aumento!en! los!niveles!de!ARNm!de!sus!genes!vecinos,!carS!(Figura!C3.7)!y!carF!(Figura!C4.5).!Otras! posibilidades!regulatorias!pueden!consistir!en!el!control!de!ARNm!diana!a!nivel!de!su! cola! poli(A)! o! en! su! maduración! alternativa.! En! eucariotas! se! conocen! ejemplos! de! producción!de!distintas!proteínas!en!función!de!la!variedad!de!otros!transcritos!previos! reguladores!que!modulan!su!maduración!alternativa!(Blencowe,!2006;!Hallegger!et!al.,! 2010;!Licatalosi!et!al.,!2010).!! ! ! ! Discusión! ! 149! Relación! entre! el! gen! carP! y! los! supuestos! genes! precursores! de! microARN! fox-mir-1!y!fox-mir-2! En! el! Capítulo! 1! se! investigó! la! posible! función! de! los! supuestos! genes! precursores!de!los!microARN!fox-mir-1!y!fox-mir-2.)Estos!experimentos!se!hicieron)con! anterioridad!a!conocer!la!existencia!del!gen!carP.!Aunque!los!datos!de!transcriptómica! de! ARNs! pequeños! descartaron! la! existencia! de! tales! microARN,! al! menos! en! las! condiciones!experimentales!y!fondos!genéticos!relevantes!en!este!trabajo,!el!estudio! de!la!expresión!y!deleción!de!estas!secuencias!aporta!información!complementaria!de! gran!valor!respecto!a!la!descrita!en!el!Capítulo!3!sobre!el!gen!carP!y!su!función.! La! secuencia! del! supuesto! fox-mir-2) es! solapante! casi! en! su! totalidad! con! el! final!del!transcrito!del!gen!carP.!A!pesar!de!que!alrededor!del!60%!de!la!secuencia!de! carP!(659!de!1178!pb)!se!conserva!tras!la!deleción!de!fox-mir-2,)las!consecuencias!de! esta!deleción!sobre!la!síntesis!de!carotenoides!y!sobre!la!expresión!de!los!genes!car) son!las!mismas!que!las!producidas!por!la!deleción!completa!de!carP.!Este!resultado!se! debe! interpretar! como! que! la! región! del! extremo! 3’! de! carP! desempeña! un! papel! esencial!en!su!función,!pero!eso!no!significa!que!no!sea!esencial!también!el!resto!del! transcrito,!como!ocurriría!si!la!función!dependiera!de!la!estructura!global!del!ARN!más! que! de! ciertas! secuencias! concretas.! Otra! consecuencia! interesante! de! la! disponibilidad!de!esta!mutación!parcial!es!que!permite!deducir!si!carP!participa!en!la! regulación!de!su!propia!transcripción.!Los!resultados!muestran!niveles!muy!similares! en!la!oscuridad!para!el!ARN!carP!en!la!estirpe!silvestre!y!en!los!mutantes!Δmir2,!pero! no!en!la!luz,!ya!que!se!aprecia!la!pérdida!de!la!fotoinducción!que!se!manifiesta!en!la! estirpe!silvestre.!Es!interesante!resaltar!que!carP!impide!la!fotoinducción!de!los!niveles! de!ARNm!de!los!genes!car,!por!lo!cual!ambos!efectos!deben!tener!la!misma!causa,!la! participación!de!carP!en!dicho!proceso!de!fotoinducción.!Sin!embargo,!la!caída!de!los! niveles!de!ARNm!de!estos!genes!no!se!debe!a!una!pérdida!de!la!expresión!de!los!genes! implicados!en!la!maquinaria!de!fotorrecepción,!ya!que!no!se!ven!afectados!los!niveles! de!transcritos!de!los!genes!wcoA,!cryD!y!vvdA.! La!interpretación!de!los!resultados!es!más!compleja!en!el!caso!del!supuesto!foxmir-1,!ya!que!su!secuencia)se!ubica!en!la!región!reguladora!que!separa!los!genes!carP!y! carF.!!Como!consecuencia,!los!efectos!fenotípicos!resultantes!de!su!deleción!pueden! deberse!a!alteraciones!en!la!expresión!de!cualquiera!de!estos!dos!genes.!De!hecho,!en! los!Capítulos!3!y!4!se!observa!que!la!deleción!de!fox-mir-1!eleva!tanto!los!niveles!de! ARN!de!carP!(Figura!C3.4)!como!los!de!ARNm!de!carF!(Figura!C3.2).!Este!resultado!se! explicaría! por! la! presencia! de! algún! elemento! de! regulación! negativo! en! dicha! secuencia!que! afecte!negativamente! a!la! transcripción!desde! ambos! promotores,! lo! cual! aporta! indicios! de! una! expresión! coordinada! de! ambos! genes.! Es! importante! recordar,!sin!embargo,!que!las!deleciones!de!carF!y!de!carP!producen!descensos!de!la! Discusión! ! 150! síntesis!de!carotenoides,!en!el!primer!caso!parcial!y!en!el!segundo!caso!más!drástico.! Por! tanto,! el! aumento! inducido! de! los! niveles! de! ARNm! de! estos! genes! debería! producir!el!fenotipo!opuesto,!es!decir,!un!aumento!de!la!síntesis!de!carotenoides.!Sin! embargo,!se!detectó!un!aumento!en!los!niveles!de!transcrito!de!los!genes!carF!y!carP! en!los!mutantes!Δmir1,!observándose!el! efecto! contrario! al! esperado,!en!el!que!los! mutantes!tienen!disminuida!la!capacidad!de!síntesis!de!carotenoides.)La!explicación! puede!estar!en!el!aumento!de!los!niveles!de!transcrito!del!gen!carS!producido!tanto! por! las! deleciones! de! fox-mir-1!y! de! fox-mir-2,! que! correlacionan! con! el! grado! de! inhibición!de!la!síntesis!de!carotenoides!en!la!luz.! En! las! lecturas! del! análisis! RNA-Seq! de! la! región! de! carP! (Figura! C3.1)! se! observaron!trazas!de!un!transcrito!que!aumentaba!su!expresión!perceptiblemente!en! la!luz.!Este!dato!se!confirmó!por!la!detección!de!ARN!mediante!RT-qPCR,!que!muestra! una!fuerte!inducción!por!la!luz!en!la!estirpe!silvestre!y!un!aumento!en!la!oscuridad!en! los!mutantes!carS) (Figura!C1.4).!Aunque!según!los!datos!de!RNA-Seq!la!cantidad!de! transcrito! era! mínima,! no! se! puede! descartar! que! éste! tenga! una! vida! media! muy! efímera.! Cabe! por! tanto! especular! que! este! ARN! puede! desempeñar! una! función! asociada!a!la!fotoinducción!de!la!carotenogénesis,!y!que!el!fenotipo!observado!en!el! mutante!Δfox-mir-1!se!deba!a!su!ausencia,!con!independencia!de!los!efectos!sobre!la! expresión! de! los! genes! vecinos.! Aunque! esta! hipótesis! no! parece! muy! plausible! a! juzgar! por! los! bajos! niveles! de! transcrito! detectados,! merece! al! menos! esta! breve! mención.! Aunque! el! análisis! en! masa! de! ARNs! pequeños! llevado! a! cabo! no! haya! encontrado! microARNs! correspondientes! a! la! región! del! gen! carP!(Capítulo! 2),! su! solapamiento!con!la!secuencia! de!fox-mir2) deja!abierta!la!posibilidad!de!que!pueda! actuar!de!precursor!de! uno! o!más!microARNs.!De!hecho,! algunos! ARNlncs!han!sido! identificados! como! precursores! de! pequeños! ARNs! (Rother! y! Meister,! 2011).! La! no! detección!de!microARNs!asociados!a!la!región!de!carP!en!las!condiciones!de!cultivo!y! variantes!regulatorias! en!las! que! se! estudia! la! carotenogénesis! en!esta! Tesis,!hacen! muy!improbable!la!participación!de!microARNs!en!dicha!regulación.!Sin!embargo,!los! ARNlnc!pueden!interactuar!con!miRNAs!para!regular!la!actividad!de!estos!y!controlar! de!esta!forma!la!traducción!del!ARN!mensajeros!diana!(revisado!por!Quan!et!al.,!2015).! De! la! misma! forma! que! se! ha! averiguado! que! CarS! tiene! muchas! otras! dianas! regulatorias! además! de! los! genes! de! la! carotenogénesis,! carP! podría! desempeñar! funciones! más! amplias! en! la! fisiología! del! hongo.! Serán! necesarios! estudios! de! transcriptómica!global!para!averiguar!si!la!mutación!carP!afecta!a!los!niveles!de!ARNm! de!otros!genes!en!el!genoma!de!F.)oxysporum.! ! ! Discusión! ! 151! La! proteína! CarF:! un! nuevo! elemento! en! la! maquinaria! de! regulación! de! la! carotenogénesis!en!Fusarium! En!la!anotación!original!del!genoma!de!F.)oxysporum,!el!gen!carF!está!situado! en!el!otro!extremo!de!la!larga!región!supuestamente!intergénica!que!precede!al!gen! carS,!y!en!la!que!posteriormente!se!ha!identificado!el!gen!carP.!En!principio,!carF!no!es! más!que!uno!más!de!los!centenares!de!genes!cuyos!niveles!de!ARNm!aumentan!en!la! luz,! lo! cual! no! llama! lo! suficiente! la! atención! para! un! estudio! más! detallado.! Sin! embargo,! sus! niveles! de! ARNm! suben! de! forma! considerable! tanto! en! el! mutante! Δmir1!como!en!el!transformante!T2,!lo!cual!levantó!dudas!sobre!su!posible!implicación! en! el! fenotipo! de! sobreproducción! de! carotenoides.! Además,! carF! se! transcribe! de! forma! divergente! con! el! gen! carP,! que! también! es! fotoinducible,! lo! que! sugiere! posibles!conexiones!regulatorias!y!funcionales!entre!ambos!genes.!De!hecho,!como!se! discute!más!abajo,!la!deleción!de!carP!produce!un!aumento!en!los!niveles!de!ARNm!de! carF,!aunque!en!principio!no!está!claro!que!este!efecto!sea!causado!por!la!ausencia!del! ARN!de!carP!o!por!haberse!alterado!la!secuencia!promotora!de!carF.! La!deleción!de!carF!provoca!una!reducción!de!aproximadamente!un!50%!en!la! síntesis! de! carotenoides! en! la! luz.! Este! fenotipo,! que! se! manifiesta! de! forma! muy! visible!en!un!aspecto!más!pálido!de!sus!colonias,!explica!el!nombre!asignado!al!gen,! que!recuerda!el!efecto!de!su!mutación!sobre!la!fotoinducción.!Sin!embargo,!en!contra! de! lo! que! se! esperaba,! no! se! encontró! en! los! mutantes! ΔcarF! ningún! cambio! en! la! respuesta!a!una!hora!de!iluminación!de!los!niveles!de!ARNm!de!los!genes!estructurales! carRA!y!carB.!Para!la!interpretación!de!estos!resultados!es!necesario!tener!en!cuenta! que!la!fotoinducción!de!los!niveles!de!ARNm!no!se!estudia!en!las!mismas!condiciones! en!las!que!se!determina!el!contenido!de!carotenoides.!El!motivo!es!que,!debido!a!la! transitoriedad!de!la!respuesta!transcripcional!a!la!luz,!la!fotoinducción!se!investiga!con! una! exposición! corta! a! la! luz! de! un! cultivo! previamente! incubado! en! oscuridad.! Sin! embargo,! la! medida! de! carotenoides! se! lleva! a! cabo! en! colonias! cultivadas! permanentemente!a!la!luz,!ya!que!el!contenido!en!carotenoides!en!los!experimentos! de! fotoinducción! son! más! reducidos.! En! condiciones! de! iluminación! continua,! el! contenido!en!ARNm!se!mantiene!a!niveles!más!bajos!durante!todo!el!tiempo!debido!a! la!existencia!de!un!mecanismo!de!fotoadaptación.!Como!referencia,!en!F.)fujikuroi!los! niveles! de! ARNm! de! los! genes! carRA!y! carB! son! solo! 2! y! 7! veces! mayores! bajo! iluminación! continua! que! en! la! oscuridad,! mientras! que! en! los! experimentos! de! fotoinducción!dichos!niveles!se!incrementan!unas!100!veces!al!cabo!de!una!hora!de! iluminación!para!bajar!después!(Castrillo!et!al.,!2015).!Sería!deseable!comprobar!los! niveles! de! ARNm! de! los! genes! carRA!y! carB! en! los! mutantes! ΔcarF) bajo! estas! condiciones.! No! sería! sorprendente! que! dichos! niveles! fueran! sensiblemente! más! bajos,! teniendo! en! cuenta! que! los! niveles! de! ARNm! carS! es! más! elevado! en! los! mutantes!ΔcarF)que!en!la!estirpe!silvestre.! Discusión! ! 152! De! confirmarse! una! falta! de! efecto! a! nivel! de! ARNm! de! los! genes! de! la! carotenogénesis!en!los!mutantes!ΔcarF,!la!proteína!CarF!podría!ejercer!su!función!a! nivel!postranscripcional,!por!ejemplo,!a!nivel!de!traducción!de!los!ARNm!o!a!nivel!de! actividad! de! algunas! de! las! enzimas! implicadas.! Cualquier! hipótesis! es! posible! si! consideramos! que! la! proteína! CarF! no! tiene! ningún! dominio! reconocible! o! ningún! parecido! con! proteínas! de! función! conocida.! CarF! es! una! proteína! soluble! y! de! pequeño!tamaño,!ya!que!solo! tiene! 142! aminoácidos.!Esta!proteína!es!ubicua! en! el! género!Fusarium,!donde!muestra!una!considerable!diversidad!de!secuencia!a!pesar!de! tratarse!de!especies!muy!emparentadas!(desde!94%!de!identidad!con!FFUJ_08715!de! F.)fujikuroi,!hasta!67%!con!FPSE_06172!de!F.)pseudograminearum).!En!un!BLAST!frente! la!colección!completa!de!secuencias!de!nucleótidos!a!través!del!servidor!del!NCBI!se! encuentran! también! ortólogos! reconocibles! en! algunos! hongos,! con! las! mayores! identidades!en!especies!del!género!Colletotrichum!(la!más!alta,!56%!de!identidad!con! los! 138! aminoácidos! de! CI238_12241! de! Colletotrichum!incanum),! seguido! de! Acremonium) chrysogenum! (51%! de! identidad! con! los! 141! aminoácidos! de! ACRE_07487).!A!partir!de!ahí!las!identidades!bajan!del!50%!en!un!número!reducido!de! especies,! hasta! llegar! pronto! a! niveles! de! identidad! no! significativos.! Se! trata,! por! tanto,! de! una! proteína! sin! un! ortólogo! claro! en! la! mayoría! de! los! genomas! de! los! hongos! secuenciados! y! que! puede! desempeñar! por! tanto! un! papel! altamente! especializado.! Es! interesante! resaltar! que! la! mutación! ΔcarF) produjo! un! aumento! de! los! niveles!de!transcritos!de!carP!y!carS)(Figura)C4.5).!Este!resultado!recuerda!a!resultados! previos,!ya!que!la!mutación!ΔcarP!conduce!a!un!aumento!en!los!niveles!de!ARNm!de! carS!(Figura!C3.7)!y!carF!(Figura!C3.2)!y!los!mutantes!carS!muestran!un!aumento!en!los! niveles!de!transcritos!de!carP!(Figura!C3.4)!y!carF!(Figura!C3.2,!en!este!caso!solo!en! oscuridad).! En! resumen,! los! productos! de! cualquiera! de! estos! tres! genes,! que! se! encuentran!contiguos!en!el!genoma,!ejercen!influencia!sobre!los!niveles!de!transcrito! de!sus!dos!genes!vecinos,!indicando!que!constituyen!un!juego!regulatorio!que!actúa!de! forma!integrada.!Se!desconoce!todavía!la!relación!funcional!entre!las!proteínas!CarF!y! CarS,! y! el! ARNlnc! carP,! pero! el! esclarecimiento! de! sus! mecanismos! moleculares! constituye! en! este! momento! uno! de! los! objetivos! principales! de! la! línea! de! investigación!en!la!que!se!enmarca!este!trabajo.! ! Regulación!a!nivel!epigenético!del!cluster!car.! El! último! capítulo! del! trabajo! aborda! la! existencia! de! una! regulación! a! nivel! epigenético! de! la! síntesis! de! carotenoides! en! Fusarium.! En! otros! hongos! se! han! encontrado!conexiones!regulatorias!entre!procesos!regulados!por!la!luz!por!proteínas! White!Collar!y!mecanismos!de!remodelación!de!cromatina.!!Ese!es!el!caso!de!N.)crassa! Discusión! ! 153! (revisado!por!Proietto!et!al.,!2015),!un!modelo!ampliamente!usado!en!fotobiología.!En! este!hongo,!la!estimulación!de!la!transcripción!mediada!por!luz!por!el!complejo!White! Collar!incluye!la!acetilación! de! la!histona!H3!en! la! lisina!14!por!la!acetil! transferasa! NGF-1!(Grimaldi!et!al.,!2006),!con!la!que!interacciona!físicamente!(Brenna!et!al.,!2012).! Otro!ejemplo!lo!ofrece!Aspergillus)nidulans,!un!hongo!en!el!que!la!estimulación!por!la! luz!a!través!de!un!fitocromo!y!la!proteína!White! Collar!requiere!la!acetilación!de!la! histona! H3! en! su! lisina! 9! (Hedtke! et! al.,! 2015).! En! Fusarium,! el! papel! central! que! desempeña!la!proteína!White!collar!en!la!inducción!transcripcional!de!los!genes!de!la! carotenogénesis!sugiere!también!la!mediación!de!mecanismos!epigenéticos.!Por!ello,! se! ha! investigado! la! correlación! entre! la! expresión! de! los! genes! estructurales,! representados!por!carRA!y!carB.!Dentro!del!enfoque!de!esta!Tesis,!se!ha!centrado!la! atención!en!la!posible!participación!de!los!genes!carS!y!carP,!extendiendo!el!estudio! además!a!los!mutantes!de!estos!genes.! De! manera! canónica,! las! modificaciones! de! histonas! se! han! asociado! a! la! expresión/represión! de! genes! dependiendo! de! la! modificación! existente.! En! colaboración! con! el! grupo! del! Dr.! J.! Carlos! Reyes! (CABIMER,! CSIC,! Sevilla),! se! ha! investigado! las! modificaciones! H3K4me3! y! H3K9ac,! que! están! asociadas! de! forma! general! a! la! activación! transcripcional,! y! la! modificación! H3K9me3,! usualmente! asociada!a!la!represión!transcripcional!(Black!et!al.,!2012;!Wagner!y!Carpenter,!2012).! Los!resultados!obtenidos!para!los!genes!y!fondos!genéticos!investigados!han!aportado! datos!relevantes!para!la!marca!de!activación!H3K4me3,!pero!no!así!para!las!marcas!de! activación! H3K9ac! y! de! represión! H3K9me3,! que! no! parecen! ejercer! una! influencia! importante!en!la!regulación!de!los!genes!estudiados.! Los!patrones!de!H3K4me3!fueron!inesperados,!ya!que!sus!niveles!en!los!genes! estructurales! carRA!y! carB! fueron! incluso! inferiores! que! para! el! gen! ubicado! en! la! región!subtelomérica,!utilizada!como!control!de!silenciamiento!génico!y!del!que!ya!se! conocía!la!ausencia!de! transcritos! por!los!datos!de!RNA-Seq.! Cabría! esperar! que!en! condiciones!de!oscuridad,!la! marca!H3K4me3!estuviera!presente!en! mayor!cantidad! para!los!genes!carRA!y!carB!en!los!mutantes!superproductores!de!carotenoides,!donde! la! transcripción! para! estos! genes! parece! ser! mucho! más! activa! que! en! la! estirpe! silvestre.! No! se! apreció,! sin! embargo,! ninguna! diferencia.! De! igual! forma,! cabría! esperar!un!incremento!detectable!de!esta!marca!tras!una!hora!de!iluminación!respecto! a! la! oscuridad! en! la! estirpe! silvestre.! Por! el! contrario,! no! se! detectaron! cambios! significativos! entre! luz! y! oscuridad,! incluso! cuando! este! estudio! se! extendió! a! una! cinética!de!iluminación!para!verificar!que!la!modificación!de!la!histona!no!se!produjera! con!anterioridad!a!los!60!minutos!de!exposición!a!la!luz,!tiempo!en!el!que!los!ARNm!de! los!genes!estructurales!presentan!su!máximo!nivel.!