Análisis cuantitativo del colágeno para la detección del carcinoma basocelular mediante microscopía multifotón ex vivo

ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL COLÁGENO PARA LA DETECCIÓN DEL CARCINOMA BASOCELULAR MEDIANTE MICROSCOPÍA MULTIFOTÓN EX VIVO TESIS DOCTORAL Mª DE LAS MERCEDES SENDÍN MARTÍN 2 Programa de doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Tesis Doctoral: Análisis cuantitativo del colágeno para la detección del carcinoma basocelular mediante microscopía multifotón ex vivo Mª de las Mercedes Sendín Martín Directores: Prof. Dr. Julián Conejo-Mir Sánchez Prof. Dra. Manu Jain Tutora: Prof. Dra. Mª Elisa Cordero Matía 3 4 Programa de doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Tesis Doctoral Análisis cuantitativo del colágeno para la detección del carcinoma basocelular mediante microscopía multifotón ex vivo Doctoranda: Mª de las Mercedes Sendín Martín Directores de tesis: Prof. Dr. Julián Conejo-Mir Sánchez Catedrático de Dermatología, Universidad de Sevilla Director de la UGC de Dermatología, Hospital Universitario Virgen del Rocío Prof. Dr. Manu Jain Assistant Professor of Pathology Research, Weill Cornell Medicine (NY, USA) Assistant Attending, Dermatology Department, Memorial Sloan Kettering Cancer Centre (NY, USA) Tutora: Prof. Dra. Mª Elisa Cordero Matía Profesora Titular Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla Facultativo especialista en Medicina Interna, Hospital Universitario Virgen del Rocío Sevilla, julio de 2022 5 6 El Prof. Dr. Julián Conejo-Mir Sánchez y la Prof. Dra. Manu Jain como directores, y la Prof. Dra. Mª Elisa Cordero Matía como tutora de la Tesis Doctoral. CERTIFICAN: Que la Tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla titulada “Análisis cuantitativo del colágeno para la detección del carcinoma basocelular mediante microscopía multifotón ex vivo” ha sido realizada por la graduada Mª de las Mercedes Sendín Martín bajo su supervisión, considerando que reúne los requisitos necesarios para su presentación. Y para que conste a los efectos oportunos, expiden la presente certificación en Sevilla a 28 de julio de 2022. Fdo.: Julián Conejo-Mir Sánchez Fdo.: Manu Jain Director de la Tesis Doctoral Directora de la Tesis Doctoral Fdo.: Mª Elisa Cordero Matía Tutora de la Tesis Doctoral 7 8 AGRADECIMIENTOS «Somos enanos encaramados a hombros de gigantes. De esta manera, vemos más y más lejos que ellos, no porque nuestra vista sea más aguda sino porque ellos nos sostienen en el aire y nos elevan con toda su altura gigantesca» Bernardo de Chartres A todos esos gigantes que me han sostenido y elevado a lo largo de estos años. Especialmente, a los doctores Julián Conejo-Mir Sánchez, Manu Jain y Mª Elisa Cordero Matía, por su guía y apoyo en este proyecto. A mi familia y amigos, por su tiempo y por su paciencia. 15 Figura 15. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo entre la DOI de las imágenes del colágeno adyacente al CB frente a la de las imágenes del colágeno adyacente a las estructuras normales de la piel……....................89 Figura 16. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo basado en la FFT entre el colágeno adyacente al CB y el adyacente a las lesiones benignas de la piel………..…………………………………………………… 91 Figura 17. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo mediante CurveAlign entre los haces de colágeno adyacentes al CB y los que se encuentran adyacentes a las lesiones benignas de la piel …………………...……93 Figura 18. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis de las fibras de colágeno a nivel individual mediante CT-FIRE en la periferia del CB comparadas con las que se encuentran en la periferia de las lesiones benignas de la piel…………………95 Figura 19. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo entre la DOI de las imágenes del colágeno adyacente al CB frente a la de las imágenes del colágeno adyacente a las lesiones benignas de la piel……………….……96 Figura 20. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo basado en la FFT entre el colágeno adyacente los CB agresivos y el adyacente a los CB indolentes…………………………………………………………..98 Figura 21. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo mediante CurveAlign entre los haces de colágeno adyacentes los CB agresivos y los que se encuentran adyacentes a los CB indolentes……………………...99 Figura 22. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis de las fibras de colágeno a nivel individual mediante CT-FIRE en la periferia de los CB agresivos comparadas con las que se encuentran en la periferia de los CB indolentes……………101 Figura 23. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo entre la DOI de las imágenes del colágeno adyacente los CB agresivos frente a la de las imágenes del colágeno adyacente a los CB indolentes………………..…….102 16 17 RESUMEN El carcinoma basocelular (CB) es el cáncer más frecuente del ser humano y su incidencia está en aumento. La microscopía multifotón (MMF) es una técnica de imagen que puede ayudar al diagnóstico de este tumor in vivo (eliminando biopsias innecesarias) y ex vivo (agilizando procesos laboriosos como la cirugía de Mohs). Además, la señal de generación de segundo armónico (GSA) en MMF puede clasificar y dar información pronóstica de los tumores en atención a los cambios en la matriz extracelular, a través del colágeno tipo I. En este trabajo se ha explorado el potencial de la MMF para diferenciar cambios en el colágeno asociados a diferentes subtipos histológicos de CB en relación con estructuras cutáneas normales y lesiones benignas. Sobre 418 imágenes de GSA de 52 CB y 12 lesiones cutáneas benignas se realizaron ex vivo análisis cuantitativos sobre el colágeno, como el análisis de energía en una banda de frecuencias en el dominio de Fourier, la densidad óptica integrada o el análisis mediante los softwares CurveAlign y CT-FIRE. Los resultados mostraron que el colágeno se dispone más alineado alrededor de los CB en comparación a las estructuras normales de la piel (p<0,001) y a los tumores benignos (p<0,001). Además, el colágeno se orienta más paralelo circundante a los CB de subtipo histológico indolente (superficial y nodular) en comparación a los de subtipo agresivo (infiltrante y micronodular) (p=0,021), hallazgo que muestra el potencial de la MMF para proporcionar información pronóstica cuantificable sobre el CB. Este trabajo sienta las bases iniciales para una futura cuantificación del colágeno in vivo, que permita obtener información pronóstica del CB directamente en la consulta. Palabras clave: carcinoma basocelular, colágeno, microscopía multifotón, generación de segundo armónico, transformada de Fourier, CurveAlign, CT-FIRE, densidad óptica integrada 18 ABSTRACT Basal cell carcinoma (BCC) is the most common human cancer, and its incidence is rising. Multiphoton microscopy (MPM) is an imaging technique that can aid in diagnosing BCC in vivo (reducing unnecessary biopsies) and ex vivo (expediting laborious procedures such as Mohs surgery). Furthermore, the second harmonic generation (SHG) signal generated from MPM can classify and prognosticate cancers based on extracellular matrix changes, especially collagen I. We explored the potential of MPM to differentiate collagen changes associated with different BCC subtypes compared to the surrounding normal skin structures and benign lesions. Quantitative collagen analysis such as frequency band energy analysis in Fourier domain, integrated optical density, CurveAlign and CT-FIRE analysis was performed on 418 SHG images from 52 BCCs and 12 benign lesions samples. Our results showed that collagen distribution is more aligned surrounding BCCs compared to the skin’s normal structures (p<0.001) and benign lesions (p<0.001). Also, collagen was orientated more parallelly surrounding indolent BCC subtypes (superficial and nodular) versus those with more aggressive behavior (infiltrative and micronodular BCC) (p=0.021), suggesting the feasibility of prognosticating BCC quantitatively with MPM. Our work lays a foundation for the future in vivo MPM imaging, which allows obtaining prognostic information of BCC directly in the consultation. Keywords: basal cell carcinoma, collagen, multiphoton microscopy, second harmonic generation, fast Fourier transform, CurveAlign, CT-FIRE, integrated optical density 19 x 20 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN x 21 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Antecedentes: El carcinoma basocelular (CB) es el tumor más frecuente del ser humano, y su incidencia está en ascenso [1]. Aunque es un tumor con bajo potencial metastásico, puede presentar un comportamiento invasivo y destructivo a nivel local [2]. Su crecimiento es lento e indolente en la mayoría de los casos, pero un porcentaje de ellos tendrá una alta capacidad lesiva, pudiendo destruir estructuras subyacentes incluyendo las óseas. Tras un diagnóstico clínico de sospecha, la realización de una biopsia y posterior estudio histológico constituye el gold-standard para el diagnóstico y manejo del CB [3]. Según la guía de consenso europeo para el diagnóstico del CB [4], el estudio histopatológico es siempre necesario en el caso de lesiones ambiguas o ante sospecha de tumores de alto riesgo. Además, la toma de una biopsia incisional previa puede ser necesaria antes de proceder a cirugías complejas o indicar un tratamiento sistémico. El estudio anatomopatológico también sería necesario para confirmar las sospechas de recurrencia tras la cirugía o tras tratamientos tópicos o destructivos en CB de bajo riesgo. Finalmente, el estudio histopatológico permite clasificar los CB en agresivos e indolentes atendiendo, entre otros factores, a los diferentes subtipos histológicos. De esta forma, la información que proporcionan las biopsias puede definir el manejo del tumor, siendo de elección la escisión quirúrgica para los tumores más agresivos y pudiendo realizarse tratamientos tópicos o destructivos para aquellos más indolentes [3]. A pesar de que la histopatología es esencial para todos estos aspectos y de que supone el gold-standard en el diagnóstico del CB, presenta también sus limitaciones. Por un lado, el diagnóstico clínico de sospecha del CB puede ser complejo en muchas ocasiones, lo que se traduce en la realización de gran cantidad de biopsias al año de lesiones que finalmente resultan ser benignas [5], con la consecuente morbilidad derivada para los pacientes y el elevado impacto económico de estas pruebas e intervenciones. Además, la biopsia incisional sólo incluye parte de la muestra, lo que permite caracterizar morfológicamente a los CB, pero no siempre definir correctamente sus subtipos 22 histológicos. De esta forma, existen estudios que indican que los CB agresivos no se detectan mediante biopsia punch en uno de cada seis casos de carcinoma [6] y que el 18% de los especímenes de biopsia puede ser clasificado en un subtipo histológico erróneo al compararse con la escisión final completa de la muestra [7]. Además, es importante tener en cuenta que la realización de una biopsia no deja de ser un procedimiento invasivo con potenciales complicaciones. Dado que la mayoría de CB tienen predilección por el área facial [8], la cicatrización que sigue a la biopsia puede tener un impacto cosmético importante o incluso interferir con la funcionalidad de algún órgano facial [2]. Finalmente, la realización de una biopsia es un procedimiento que consume tiempo durante la consulta, y en el que es necesario un procesamiento posterior de los tejidos, lo que enlentece el proceso diagnóstico-terapéutico. Por todo ello, está cobrando cada vez más importancia el desarrollo de técnicas de imagen que se puedan aplicar in vivo durante la consulta, directamente sobre la piel del paciente. Estas permitirían apoyar el diagnóstico de sospecha de los facultativos, evitando biopsias innecesarias y con ello reduciendo significativamente los costes económicos y la morbilidad asociados al manejo del CB. Además, la aplicación de estas técnicas de imagen ex vivo también juega un papel importante en dermatología, pues permite agilizar determinados procedimientos quirúrgicos. En el caso de CB que tienen un comportamiento agresivo o para aquellos que son recurrentes, especialmente si están situados en localizaciones sensibles desde un punto de vista anatómico o estético, la cirugía micrográfica de Mohs (CMM) es la técnica de elección [9], pues consigue la extirpación completa de la lesión con mayor eficacia que la cirugía convencional. No obstante, la CMM es una técnica quirúrgica lenta y laboriosa, puesto consiste en realizar cortes sucesivos para controlar la totalidad de los márgenes del tumor, que deben visualizarse in situ para asegurar la eliminación completa del mismo [10]. En cada uno de estos cortes sucesivos, la muestra se procesa mediante congelación y corte con el criostato, y es posteriormente teñida con hematoxilina-eosina (H&E) y visualizada en el microscopio en un proceso que puede requerir entre 20-45 minutos por muestra o etapa [11]. Como consecuencia, la cirugía puede demorarse varias horas (según el número de etapas que sean necesarias para eliminar la totalidad del tumor), causando incomodidad al paciente, aumento de la exposición de la herida quirúrgica al ambiente, ocupación extensa de tiempos de quirófano, etc. En este contexto, 23 el desarrollo de técnicas de imagen que agilicen el proceso sería de gran utilidad para aumentar la aplicabilidad de esta técnica quirúrgica, que presenta las más altas tasas de éxito en la erradicación del CB [9]. 1.2 Justificación: Por los motivos anteriormente mencionados, en los últimos años está aumentado notablemente el interés por el desarrollo de técnicas de imagen no invasivas que tengan la capacidad de ser al mismo tiempo aplicables in vivo directamente sobre la piel, y también útiles ex vivo sobre muestras extirpadas. La búsqueda de estas técnicas de imagen no invasivas, que permitan un estudio anatomopatológico “a pie de cama” del paciente [11], no compete exclusivamente a la dermatología, sino que se está produciendo también en diferentes áreas de las ciencias de la salud. Dentro de estas técnicas de imagen de reciente desarrollo en medicina encontramos la tomografía óptica de coherencia (TOC), la microscopía confocal de reflectancia (MCR), o la microscopía multifotón (MMF). Tanto la TOC [12], como la MCR [13] y la MMF [14,15], son técnicas que proporcionan imágenes cuasi-histológicas con resolución celular y que pueden ser aplicadas in vivo sobre la piel. En la actualidad, la que mayor implementación tiene en práctica clínica real es la MCR [16]. La MCR se basa en la señal que proporcionan los componentes internos de la célula según su índice de refracción de la luz [11]. Por ello, la MCR ha mejorado el diagnóstico de lesiones pigmentadas (como el melanoma), puesto que la melanina tiene un alto índice de refracción de la luz [17]. Sin embargo, la visualización de lesiones menos pigmentadas o que carecen de pigmento (como el CB), es más compleja, por la falta de contraste proveniente de la melanina. Como consecuencia, la MCR tiene una sensibilidad del 80-90% [18] en el diagnóstico de CB, pero una especificidad menor (≈54%) [19], siendo las estructuras normales de la piel como los folículos pilosos los principales agentes que llevan a confusión en su detección. Además, la MCR no puede detectar diferencias de forma específica entre elementos de la matriz extracelular. En contraste con la microscopía confocal, que se basa en un único fotón, la MMF incluye a un grupo de técnicas ópticas no lineales basadas en la absorción simultánea de varios 24 fotones de baja energía por una molécula [20]. La forma más frecuente de MMF es la microscopía de excitación de dos fotones (MEDF), en la que se excitan los fluoróforos endógenos mediante la absorción de dos fotones de baja energía. La señal que dará lugar a la imagen proviene de sustancias endógenas como la nicotinamida adenina dinucleótida (NADH), la melanina, las queratinas, o la elastina entre otras; eliminando la necesidad de usar agentes de contraste fluorescente exógenos [21] y pudiendo aplicarse directamente sobre tejidos biológicos como la piel. Además de esta señal autoflorescente, el mismo láser interacciona con estructuras biológicas no centrosimétricas y genera fotones de exactamente la mitad de longitud de onda que los absorbidos. Esto se conoce como generación de segundo armónico (GSA, o más comúnmente conocida como SHG por sus siglas en inglés: second-harmonic generation). Esta señal proporciona información sobre estructuras no centrosimétricas de la matriz extracelular como el colágeno o la miosina [22]. Dado que la señal de la GSA tiene una longitud de onda más corta que la de autofluorescencia de la MEDF, la GSA puede detectarse de forma separada para estudiar específicamente la morfología del colágeno que forma parte de la matriz extracelular [23]. Aunque la MMF es útil para distinguir estructuras de la matriz extracelular (como diferenciar el colágeno de la elastina) y produce menos fotodaño que las técnicas unifotón como la microscopía confocal [24], los dispositivos de MMF comerciales presentan una velocidad de adquisición de imágenes lenta [25]. En el futuro, una aproximación multimodal para el diagnóstico de tumores cutáneos, combinando la aplicación MMF y MCR directamente sobre la piel, podría superar las limitaciones de ambas técnicas. La MCR permitiría la adquisición rápida de imágenes de la piel abarcando un campo amplio de la misma, mientras que la MMF actuaría proporcionando información adicional relacionada con cambios en la matriz extracelular y aumentando el contraste de las imágenes en zonas sospechosas para mejorar la especificidad diagnóstica. En manos de dermatólogos expertos, el uso de añadido de MCR a la dermatoscopia resulta en un descenso de hasta el 50% del número de pacientes necesarios a tratar para el diagnóstico del cáncer cutáneo mediante biopsia previa [18]. En los próximos años, el desarrollo de nuevas técnicas de imagen para el diagnóstico in vivo del cáncer cutáneo podría reducir aún más este número, eliminando la realización de biopsias innecesarias. Dada la alta incidencia de estos tumores a nivel global, la detección no invasiva de estas lesiones podría tener un impacto significativo y beneficioso en miles de pacientes y en los costes sanitarios derivados de su abordaje. 31 1.3.3 Presentación clínica del carcinoma basocelular: El CB suele aparecer en zonas fotoexpuestas de la piel [1] siendo excepcional su aparición en palmas y plantas o en las mucosas. Puede presentarse bajo diferentes formas clínicas, que pueden ser dividas en tres grupos habitualmente conformes a su histopatología: CB nodulares, superficiales y morfeiformes. Los CB nodulares, que representan sobre el 80% de los casos [73], se presentan como pápulas o nódulos con un característico brillo perlado en su superficie. Frecuentemente presentan telangiectasias arboriformes asociadas. Por su parte, los CB superficiales suelen corresponder a placas eritematosas ligeramente descamativas, con microulceraciones y el mismo aspecto perlado. Por último, los tumores morfeiformes o esclerosantes son placas que recuerdan a una cicatriz, mal definidas, de aspecto brillante y que pueden mostrar atrofia central. Otras características clínicas que pueden presentar estos tumores son ulceración o pigmentación. La ulceración es un hallazgo frecuente en todos los subtipos de CB. Por su parte, determinados CB nodulares y los superficiales pueden producir pigmento, en cuyo caso se conocen como CB pigmentados. Las anteriores, y otras formas clínicas más infrecuentes de CB, se recogen resumidas en la Tabla 1. 32 Tabla 1. Hallazgos clínicos más frecuentes de los diferentes subtipos de CB Subtipo de CB Hallazgos clínicos CB nodular Subtipo más frecuente (≈80%). Pápula o nódulo brillante, con bordes perlados y superficie lisa. Pueden aparecer telangiectasias arboriformes en su superficie. CB superficial Segundo subtipo en frecuencia (≈15%) [48]. Placa bien delimitada, eritematosa, con descamación superficial. Puede presentar bordes perlados y pigmentación. CB morfeiforme o esclerosante Tercer grupo en frecuencia (≈5-10%). Placa indurada plana o deprimida, mal delimitada, de superficie brillante, que recuerda a una cicatriz. CB infiltrante Lesiones mal definidas, en forma de placas deprimidas que puede presentar costras o ulceraciones e infiltrar tejidos subyacentes. Fibroepitelioma de Pinkus Nódulo color piel o perlado, frecuentemente pediculado, que predomina en el tronco. CB infundíbulo-quístico Placa perlada y bien definida. Se localiza frecuentemente en la cabeza y cuello de pacientes ancianos. Carcinoma basoescamoso Tumores agresivos que predominan en cabeza y cuello. Modificado de Cameron MC, Lee E, Hibler BP, Barker CA, Mori S, Cordova M, et al. Basal cell carcinoma: Epidemiology; pathophysiology; clinical and histological subtypes; and disease associations. Journal of the American Academy of Dermatology 2019;80:303–17. https://doi.org/10.1016/j.jaad.2018.03.060. [1] 1.3.4 Histología del carcinoma basocelular: El CB es un tumor epitelial que se genera fundamentalmente a partir la capa basal de la epidermis y ocasionalmente a partir del epitelio que forma la vaina radicular externa del folículo piloso [74]. Un hallazgo histológico común a este grupo de tumores es la presencia de nidos hipercelulares compuestos por células basalioides monomorfas con núcleos 33 hipercromáticos. Estas células contienen un citoplasma relativamente escaso y mal definido, por lo que presentan una ratio núcleo/citoplasma alto. Aunque la mayoría de las células presentan una morfología cuboidal, las células en la periferia del tumor tienen una morfología más cilíndrica, y se agrupan de forma paralela entre sí y perpendicular a la membrana basal, formando característicamente una distribución conocida como empalizada [75]. En ocasiones los nidos tumorales incluyen melanocitos y melanófagos, dando lugar a lesiones pigmentadas por la melanina. Existe una relación íntima entre el parénquima del tumor y el estroma que lo rodea. El tejido conectivo prolifera al alrededor de las masas tumorales y se dispone en haces paralelos [74]. Este estroma de nueva formación contiene numerosos fibroblastos y se puede distinguir del estroma de la dermis adyacente. Además, es frecuente que el estroma peritumoral sea rico en mucina. Otro rasgo habitual es la presencia de áreas de retracción en forma de semiluna alrededor de los nidos tumorales. Estas áreas (conocidas como clefting) se consideraron clásicamente artefactos de la fijación con parafina, que hacía retraerse a la mucina. No obstante, se han observado estas áreas también en secciones congeladas [74] e incluso directamente sobre la piel in vivo en CB visualizados con microscopía confocal de reflectancia [76]. Por ello, parece también influir en la formación de dichas áreas de retracción alrededor del CB una disminución de los componentes del hemidesmosoma y de los filamentos de anclaje [77]. A parte de estos hallazgos histológicos comunes, existen algunos rasgos que permiten distinguir diferentes subtipos histológicos de CB. Estos rasgos son frecuentemente paralelos a determinadas expresiones clínicas de los tumores, de modo que comparten una terminología común (ver Tabla 1). En la Tabla 2 se recogen los principales hallazgos que caracterizan a cada subtipo histológico de CB. 34 Tabla 2. Hallazgos histológicos más frecuentes de los diferentes subtipos de CB Subtipo de CB Hallazgos histológicos CB nodular El tumor forma nódulos de células con empalizada periférica y alineación más aleatoria en la zona central. Es frecuente que presenten espacios de retracción entre el parénquima tumoral y el estroma. También puede visualizarse ulceración en aquellos tumores de mayor tamaño. CB micronodular Similar al subtipo nodular, pero con nidos de menor tamaño y empalizada no tan claramente desarrollada. Tiene mayor tendencia a la recidiva que el anterior. CB superficial Los nidos tumorales están conectados a la epidermis y generalmente se limitan a la dermis papilar. Estos nidos suelen presentar una zona fina de estroma fibroso su alrededor. CB morfeiforme o esclerosante El tumor forma cordones tumorales alargados y finos que penetran en un estroma denso y fibrosado. CB infiltrante El tumor forma cordones tumorales alargados y finos que penetran entre los haces de colágeno. Aunque hay un aumento del colágeno, no hay fibrosis significativa. CB fibroepitelial de Pinkus Está compuesto por cordones delgados de células basalioides anastomosadas, inmersas en un estroma laxo prominente. Los nidos conectan repetidamente entre sí, separando en compartimentos islas de estroma. Pueden presentar zonas de diferenciación focal correspondientes a estructuras foliculares. CB infundíbulo-quístico Proliferación bien delimitada de cordones de células basaloides anastomosadas con estroma escaso. Los pequeños quistes con diferenciación infundibularfolicular son típicos de esta variante. Carcinoma basoescamoso Las células basalioides que componen los nidos tumorales presentan diferenciación histológica hacia carcinoma escamoso. 35 1.3.4.1 Estructura de la matriz extracelular y papel del colágeno: También desde un punto de vista histológico, es importante conocer que los tejidos conectivos como la dermis cuentan con un soporte estructural conocido como matriz extracelular (MEC). Esta matriz está constituida por proteínas secretadas y polisacáridos, y actúa como sostén celular [78]. En los últimos años, es cada vez más conocido que los cambios en la MEC juegan un papel crítico en la patogénesis de los tumores y en su progresión [79–81]. En la piel, la MEC forma parte del espacio intersticial de la dermis, en el que células como los fibroblastos o los vasos sanguíneos están inmersos e interaccionando con esta matriz flexible y dinámica. Además, en la base de los tejidos epiteliales destaca un tipo particular de esta matriz extracelular: la membrana basal. Esta membrana está compuesta por varias capas observables al microscopio electrónico (lámina lúcida, lámina densa y lámina reticular) e incluye fibras que anclan el epitelio a la dermis subyacente. Existen numerosas proteínas estructurales en la MEC, entre las que se incluyen el colágeno, la elastina, la fibronectina o la laminina entre otras. El colágeno es la proteína más abundante del cuerpo humano (en torno al 30% del total) [78] y es el principal componente proteico de esta matriz. El colágeno se ha relacionado específicamente con múltiples funciones celulares como la adhesión, migración o diferenciación celular [82,83]. El colágeno se caracteriza por estar formado a partir de una estructura conocida como triple hélice. Esta estructura consiste en tres cadenas polipeptídicas, que se enrollan entre sí formando una estructura helicoidal. Los dominios de la triple hélice de colágeno consisten en la repetición de tres aminoácidos: glicina-X-Y, donde X suele ser la prolina y la Y la hidroxiprolina [84]. Existen hasta 28 tipos diferentes de colágeno [85], siendo el más abundante en el ser humano el colágeno tipo I [86]. En la etapa fetal, el colágeno tipo III supone más de la mitad del total a nivel de la piel, pero en el periodo postnatal el colágeno I es el predominante, suponiendo un 80-90% del total [86] y alcanzando una ratio de hasta 6:1 con respecto al colágeno III [87]. Tanto los colágenos tipo I como el tipo III son colágenos de tipo fibrilar. El colágeno fibrilar, tras ser secretado por las células, se ensambla en fibrillas de colágeno, cuyo diámetro oscila entre los 50 y 200 nm [88]. Las fibrillas de colágeno son una formación discontinua regular, en la que las 36 moléculas de colágeno organizadas en haces paralelos están desplazadas una con respecto a la otra 67 nm [85]. Las moléculas se superponen en una cuarta parte de su longitud, y quedan ensambladas gracias a enlaces covalentes transversales que refuerzan esta unión [84]. Finalmente, estas fibrillas se asociarán unas con otras formando las fibras de colágeno, que pueden tener varias micras de diámetro. Estas fibras pueden asociarse a su vez formando haces de colágeno más o menos paralelos, según su función y la localización en la que se encuentren. Un esquema de la organización espacial del colágeno puede visualizarse en la Figura 1. Figura 1. Composición espacial del colágeno: a) triple hélice de colágeno, b) fibrilla de colágeno, c) fibra de colágeno. Obsérvense los enlaces covalentes que unen entre sí las triples hélices de colágeno permitiendo su ensamblaje para formar las fibrillas. 37 Los principales colágenos que forman la matriz extracelular a nivel de la piel y su localización aparecen recogidos en la Tabla 3. Tabla 3. Principales tipos de colágeno que componen la piel humana, función y localización de los mismos Colágeno Localización en la piel Función y características Colágeno tipo I Dermis, matriz intersticial • Colágeno de tipo fibrilar. • Es la forma de colágeno más frecuente de la piel. • Da soporte y proporciona flexibilidad a la dermis. Colágeno tipo III Dermis, matriz intersticial • Colágeno de tipo fibrilar. • Más frecuente en la etapa fetal. • Da soporte y proporciona flexibilidad a la dermis. • Se relaciona con el síndrome de Ehlers-Danlos. Colágeno tipo IV Membrana basal • Colágeno no fibrilar. • Forma una red a nivel de la membrana basal. Colágeno tipo V Dermis, matriz intersticial • Colágeno de tipo fibrilar. • Poco frecuente en dermis. • Se relaciona con el síndrome de Ehlers-Danlos. Colágeno tipo VI Dermis papilar, matriz intersticial. • Colágeno no fibrilar. • Forma una red a nivel de la membrana basal. • Ancla el colágeno tipo IV al tipo I y tipo III en la dermis papilar. Colágeno tipo VII Membrana basal, dermis papilar • Forma fibras de anclaje en la unión dermoepidérmica. 38 • Se relaciona con la epidermólisis bullosa. Colágeno tipo XII Interfaz entre la membrana basal y la dermis papilar • Asociado a colágeno fibrilar. Colágeno tipo XIII Superficie del queratinocito • Colágeno transmembrana. Colágeno tipo XIV Interfaz entre la membrana basal y la dermis papilar • Asociado a colágeno fibrilar. Colágeno tipo XVII Superficie del queratinocito • Colágeno transmembrana. • Regula la proliferación de queratinocitos. Colágeno tipo XXIII Dermis papilar, matriz intersticial. • Colágeno transmembrana. Modificado y extraído de Pfisterer K, Shaw LE, Symmank D, Weninger W. The Extracellular Matrix in Skin Inflammation and Infection. Front Cell Dev Biol. 2021 Jul 6;9:682414. doi: 10.3389/fcell.2021.68241 y Uitto J, Olsen DR, Fazio MJ. Extracellular matrix of the skin: 50 years of progress. J Invest Dermatol. 1989 Apr;92(4 Suppl):61S-77S. doi: 10.1111/1523-1747.ep13075039. [87,89] Las fibras elásticas son otro elemento proteico y fibroso fundamental que compone la MEC. Mientras que el colágeno es responsable de la fuerza tensil o resistencia de la piel, las fibras elásticas le confieren la elasticidad que permite que la piel vuelva a su configuración original tras ser sometida a un estímulo mecánico. La elastina y las fibrilinas son los principales componentes de las fibras elásticas de la piel. La elastina se une de forma covalente a otros elementos de la MEC, como el colágeno o las propias fibrilinas, y construyen el componente viscoelástico de la piel dando estabilidad a la matriz [89]. Finalmente, los proteogluganos son otro elemento central de la MEC. Los proteoglucanos son macromoléculas en las que una o más cadenas de glucosaminoglucanos (polímeros lineales compuestos por repetición de unidades de disacáridos) están unidas 39 covalentemente a una proteína de membrana o secretada en la MEC [90]. Los proteoglucanos glucosilados forman un material amorfo que rodea al componente celular y fibroso de la MEC. Aunque solo suponen el 0,2% del peso seco de la dermis, son capaces de absorber hasta 1000 veces su volumen en agua [86], y son reguladores esenciales de la hidratación y la homeostasis iónica. Algunos ejemplos de proteoglucanos son la fibromodulina, el versicano o el agrecano. En cuanto a los glucosaminoglucanos, destaca el hialuronano o ácido hialurónico, que tiene una gran masa molecular al estar formado por hasta 50000 repeticiones de su unidad disacárida básica. Otros glucosaminoglucanos que forman parte de la MEC se diferencian del hialuronano en que son moléculas más cortas y en que están unidos de forma covalente a los proteoglucanos. Algunos proteoglucanos pueden formar agregados de enormes supramoléculas formadas por muchas proteínas unidas a un hialuronano [90]. Un esquema de los principales componentes de matriz extracelular en la piel humana se visualiza en la Figura 2. Figura 2. Esquema de los principales componentes de la matriz extracelular en la piel humana. Estas estructuras actúan como sostén y medio en el que interactúan los 40 elementos celulares. Abreviaturas: AH, hialurano o ácido hialurónico; Col, colágeno; CS, condroitín sulfato; UDE, unión dermoepidérmica. 1.3.5 Diagnóstico del carcinoma basocelular: El diagnóstico del CB puede ser clínico, realizado por el facultativo directamente en la consulta apoyándose en técnicas como la dermatoscopia. En una revisión sistemática, Reiter et al. [91] describieron que el uso de la dermatoscopia incrementaba la sensibilidad en el diagnóstico del CB del 66,9% al 85%, y la especificidad del 97,2% al 98,2%. No obstante, a pesar de la utilidad de la dermatoscopia para el diagnóstico de estas lesiones, los CB muchas veces son equívocos y requieren un estudio histológico para su diagnóstico definitivo. Además, la histología es necesaria para identificar el subtipo de tumor al que nos enfrentamos y reconocer aquellos de alto riesgo para su correcto manejo. La biopsia cutánea con el consecuente estudio histológico es el gold standard para el diagnóstico del CB y su correcto manejo terapéutico. Según la guía de consenso europea [4], el diagnóstico clínico y dermatoscópico sin estudio histopatológico es aceptable para tumores nodulares de pequeño tamaño en localizaciones típicas o tumores superficiales en tronco y miembros. También para CB múltiples en el caso del síndrome de Gorlin. No obstante, el estudio histopatológico será siempre necesario en el caso de lesiones ambiguas o ante tumores de alto riesgo, y será necesario una biopsia incisional antes de proceder a cirugías complejas o iniciar un tratamiento sistémico. También se recoge la necesidad de estudio anatomopatológico para confirmar las recurrencias tras la cirugía o tras tratamientos destructivos en tumores de bajo riesgo. Sin embargo, según la guía de consenso de la Academia de Dermatología Americana [3], el diagnóstico clínico se confirma de forma rutinaria con una biopsia antes de proceder al tratamiento. El estudio histopatológico proporcionará información al clínico sobre el subtipo tumoral, para escoger el tratamiento más adecuado. Según los resultados de la revisión sistemática de Kadouch et al. [6], las biopsias incisionales tipo punch sólo son capaces de identificar el subtipo histológico de CB con una sensibilidad de entre un ≈60-80%, ya que no pueden valorar el tumor en toda su 47 continente, la CMM se reserva para los CB de alto riesgo de cabeza y cuello, especialmente si cumplen alguno de los siguientes criterios: • Localización en la zona central de la cara o área H (independientemente del tamaño del tumor). También aquellos que se encuentren en cualquier zona que sea sensible y en la que sea importante ahorrar tejido sano. • Tumores mayores o iguales a 2 cm. • Tumores recurrentes. • Tumores extirpados de forma incompleta. • Márgenes mal definidos. • Tipos histológicos de alto riesgo (como los CB morfeiformes, infiltrantes, micronodulares y basoescamosos). • Tumores con infiltración perineural o afectación vascular. En estos casos, en los que el riesgo de recurrencia o la agresividad de los tumores son altos, la CMM se considera el tratamiento de primera línea por sus altas tasas de efectividad. Múltiples estudios han analizado la eficacia de la cirugía de Mohs en el tratamiento del CB. El primer ensayo clínico aleatorizado que comparó el tratamiento del CB primario y recurrente con CMM versus escisión estándar fue realizado en 2004 [95]. En este estudio las tasas de recurrencia de CB fueron más bajas si habían sido tratados con CMM, aunque las diferencias no fueron significativas. Sus resultados fueron actualizados a los 5 años [96] y a los 10 [9]. En este último análisis, Van Loo et al. analizaron un total de 408 CB primarios faciales de alto riesgo (diámetro ≥ 1 cm, ubicación en zona H facial o subtipo histológico de riesgo) y 204 CB faciales recurrentes. Los autores describieron que en aquellos casos de CB facial primario, la recurrencia a los 10 años era de un 4,4% en el caso de haber sido tratado con CMM, y de un 12,2% para tumores extirpados con escisión simple. A pesar de que las tasas de recurrencia tras cirugía de Mohs fueron más bajas que las de las escisiones simples, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0,1). Sin embargo, en el caso de los CB recurrentes, las tasas de recurrencia a los 10 años fueron del 3,9% en el caso de la CMM y del 13,5% en el de la escisión estándar, siendo en este caso una diferencia estadísticamente significativa (p=0,023). 48 Las tasas de recurrencia tras la CMM parecen estar influenciadas por factores histológicos, como el subtipo tumoral, y más concretamente por la invasión perineural. En una serie australiana de 3020 CB, Leibovitch et al. [97] analizaron la relación entre la invasión perineural y el riesgo de recurrencia tras una CMM. De los 3020 pacientes incluidos, 78 presentaron invasión perineural versus 2942 que no la presentaron. Tras un periodo de seguimiento de 5 años, 6 (7,7%) pacientes con invasión perineural presentaron recurrencia de su CB y 72 (2,4%) del grupo sin invasión perineural recurrieron, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,03). A pesar de los casos de recurrencia, la CMM al controlar el 100% de los márgenes de la lesión ofrece mejores resultados de curación a largo plazo que la escisión habitual, y además permite ahorrar tejido sano en localizaciones sensibles como la cara. Es por ello que es considerada como la primera línea para el tratamiento de CB de alto riesgo y recurrente en las guías de práctica clínica [3]. 1.3.7.3 Limitaciones de la cirugía de Mohs: La CMM presenta una serie de limitaciones que dificultan su implementación en muchos centros en nuestros días. La más importante de ellas es que esta técnica quirúrgica es extremadamente laboriosa, al ir eliminando el tumor capa por capa. Cada una de las capas extirpadas se congela y debe ser evaluada al microscopio, requiriendo entre 20-45 minutos por escisión [11]. Un procedimiento habitual en cirugía de Mohs puede requerir de dos a cuatro horas, y los pacientes deben ser informados de que la cirugía puede prolongarse incluso más tiempo, dependiendo de cuántos pases se requieran hasta que los márgenes queden libres de tumor [98]. Esto hace que sea imprescindible la colaboración del paciente, que debe permanecer con la herida sin reconstruir hasta que se asegure la eliminación completa del tumor. Por ello, no es una técnica recomendable para pacientes que por problemas médicos o de otra índole no puedan permanecer a la espera. Además de requerir gran cantidad de tiempo, la CMM requiere una gran inversión de recursos humanos: un cirujano altamente calificado que conozca la técnica, un anatomopatólogo en el caso de que el propio cirujano no sea capaz de interpretar las imágenes, un técnico de laboratorio que sea capaz de procesar tejido congelado, un 49 laboratorio adyacente o cercano al quirófano, personal de enfermería con entrenamiento específico, entre otros. Todo esto incrementa notablemente el costo de la cirugía. En la actualidad, es controvertido si la CMM es costo-eficiente [99,100]. Además, esto es complejo de cuantificar y generalizar, puesto que los costos e indicaciones del procedimiento difieren notablemente de un país a otro. Finalmente, otra limitación de la técnica es el uso de secciones de tejido fijadas mediante congelación, más complejas de interpretar que las secciones permanentes fijadas en parafina [101]. La obtención de cortes histológicos en parafina puede requerir hasta 24 horas en su elaboración [98], por lo que habitualmente en cirugía de Mohs se fija el tejido mediante congelación, que en su lugar requiere entre unos 20-45 minutos [11], como ya se ha mencionado. No obstante, la congelación causa destrucción de los tejidos y puede crear artefactos que dificultan el diagnóstico final. Por todo lo anterior, ha cobrado interés recientemente el desarrollo de técnicas de imagen que permitan visualizar los tejidos sin procesamiento de los mismos, de forma que puedan aplicarse durante la CMM para acelerar el proceso. 1.3.8 Fundamentos de la microscopía multifotón: La MMF abarca a un grupo de modalidades de microscopía que se caracterizan por un proceso óptico no lineal en el que se utilizan dos o más fotones de baja energía que se absorben de forma casi simultánea, con emisión posterior de un solo fotón [20]. En los últimos años, la MMF ha surgido como una nueva herramienta con gran potencial para explorar los organismos vivos y dinámicos. Concretamente, en el campo de la dermatología la MMF es una tecnología muy prometedora, por su capacidad de ser aplicada directamente in vivo sobre la piel estimulando fluoróforos endógenos y por ello, sin requerir tinciones exógenas. La MMF se basa en la excitación de las muestras mediante dos o más fotones de baja energía. Cuando un átomo o molécula absorbe un fotón de luz a una longitud de onda específica, un electrón puede pasar de su estado fundamental (S0) a un estado excitado (S1). Al recuperar su estado fundamental, se emite un fotón que tiene menor energía (por 50 lo tanto, una longitud de onda más larga) que el fotón absorbido inicial, en un fenómeno fundamental en microscopía que se conoce como fluorescencia. En la fluorescencia convencional, los fluoróforos absorben un fotón que es el causante de la excitación del electrón. Sin embargo, en las técnicas de MMF, láseres de pulsos muy cortos (femtosegundos) y espectro cercano al infrarrojo, se usan para la excitación de las moléculas mediante la aplicación de dos (o más) fotones [102]. Dentro de estas técnicas de imagen, la más frecuente es la microscopía de emisión de dos fotones (MEDF), que se basa en la excitación no lineal de fluoróforos endógenos a través de la absorción de dos fotones con largas longitudes de onda. Estos fotones de larga longitud de onda no tendrían energía suficiente para excitar de forma aislada a un electrón, pero al combinarse entre ellos sí son capaces de elevar al electrón al estado de excitación, y producir una señal de fluorescencia [20]. En la Figura 4 vemos un diagrama de Jablonski que muestra las diferencias entre la excitación con uno o dos fotones. 51 Figura 4. Diagrama de Jablonski (Página anterior). A) Microscopía de excitación de un fotón: un único fotón excita al electrón en estado basal (S0) para pasar al estado excitado (S1). B) Microscopía de excitación de dos fotones: dos fotones de baja energía de forma combinada consiguen elevar al electrón al estado de excitación. 1.3.8.1 Historia de la microscopía de excitación de dos fotones: María Goeppert-Mayer (1906–1972) fue la segunda mujer en la historia en recibir un premio Nobel en física por su trabajo sobre el modelo de capas nuclear [103]. En su tesis doctoral en 1931 predijo, desde un punto de vista teórico, el efecto de la estimulación mediante dos fotones. Para estimular la transición electrónica mediante dos fotones, estos deben llegar al fluoróforo con una diferencia de un attosegundo (10-18 segundos) entre ellos. Este evento es muy improbable, y es por ello por lo que la microscopía de fluorescencia multifotón requiere que el flujo de fotones sobre las moléculas sea extremadamente grande [104]. Por tanto, no fue hasta muchos años después con el desarrollo de sistemas láseres más potentes (generalmente de femtosegundos y pulsado ultracorto), cuando pudieron comprobarse las tesis de María Goeppert-Mayer. En 1990, Winfried Denk y James Strickler en el laboratorio de Watt W. Webb en la Universidad de Cornell combinaron la idea de la excitación de dos fotones con el uso de un escáner láser, siendo los pioneros en la aplicación de esta tecnología [14]. 1.3.8.2 Características de la microscopía de excitación de dos fotones: La MEDF es la forma más frecuente de MMF, y permite la visualización de las capas profundas de los tejidos vivos, incluyendo la piel. Como se ha descrito anteriormente, esta tecnología se basa en la foto-excitación no lineal de las moléculas, en la que dos fotones de baja energía son absorbidos de forma casi simultánea en un mismo plano focal, produciendo la emisión de fluorescencia por parte de los tejidos. Los microscopios multifotón incluyen un láser en el espectro infrarrojo, siendo los más usados los láseres de titanio:zafiro (Ti:Sa) o los de neodimio:YAG (Nd:YAG) con duraciones de pulso 52 cortas, de los 100 a los 200 femtosegundos. También se han usado láseres de nanosegundos o picosegundos, pero con menor frecuencia [105]. La longitud de onda usada en estos microscopios tradicionalmente oscila entre 740 y los 810 nm, aunque depende de la aplicación a la que vaya dirigida. La visualización directa de la piel mediante MMF es posible gracias a las señales que provienen de fluoróforos endógenos como la NADH, la melanina, la elastina o las queratinas [21]. De esta forma, para visualizar la piel mediante MMF no es necesario añadir agentes exógenos de contraste, puesto que la fluorescencia proviene de la estimulación directa de las propias moléculas que componen este órgano. Más allá de las señales autofluorescentes, una ventaja de la MMF es que permite detectar una segunda señal proveniente de moléculas de la matriz extracelular. Esta señal se conoce como generación de segundo armónico (GSA). La GSA se produce tras la estimulación de las estructuras biológicas no centrosimétricas, que generan fotones que presentan exactamente la mitad de la longitud de onda de los fotones incidentes. Así, mediante la GSA podemos obtener información arquitectural sobre componentes no centrosimétricos de la MEC, como el colágeno o la miosina [22]. Además, dado que la señal correspondiente a la GSA es fácilmente identificable (por presentar una longitud de onda que corresponde a la mitad de la de los fotones que excitan la muestra), puede ser fácilmente aislada de la señal autofluorescente. De esta forma, gracias al aislamiento de la GSA se pueden analizar y cuantificar específicamente elementos de la MEC. Esto supone una gran ventaja de la MMF, que permite discriminar entre las señales que provienen de elementos como la elastina (autofluorescente) o el colágeno (que genera GSA). En el caso del colágeno, son los colágenos tipo I fundamentalmente, y también otros como el tipo II, aquellos que por su distribución espacial fibrilar son responsables de la GSA. Por el contrario, el colágeno tipo IV, que es fundamentalmente un componente de la membrana basal, no tiene estructura fibrilar y no produce GSA suficiente para generar las imágenes [106]. 53 1.3.8.3 Diferencias entre la microscopía multifotón y otras técnicas de imagen para el estudio de la piel: En la actualidad, existen múltiples tecnologías de la imagen que se están empleando en el campo de la dermatología para mejorar la capacidad diagnóstica en lesiones de la piel. Además de la MMF, destacan la microscopía confocal de reflectancia (MCR) y la tomografía de coherencia óptica (TOC). Desde hace más de veinte años existen dispositivos disponibles comercialmente y diseñados para ser aplicados en la clínica en el caso de la MCR; y desde hace unos 10 años en el caso de la MMF y la TOC [25]. Sin embargo, siguen siendo pocos los dermatólogos que son capaces de interpretar correctamente este tipo de imágenes, por lo que la implementación de estas tecnologías en práctica clínica real sigue siendo muy baja. Para facilitar la incorporación de esta tecnología a la praxis del dermatólogo, es importante que los facultativos conozcan los fundamentos de estas nuevas tecnologías y el tipo de imagen que proporcionan. En la microscopía con excitación a través de un único fotón (como la que ocurre en microscopía confocal), la relación entre la amplitud de emisión y de excitación es lineal. Sin embargo, en MMF la interacción entre los fotones y la molécula es no lineal, lo que proporciona a esta tecnología una serie de ventajas. La MMF permite, mediante el uso de fotones del espectro infrarrojo con gran longitud de onda, mayor penetración en los tejidos por la menor difracción de la luz en comparación a la microscopía confocal [20]. El microscopio confocal se basa en el uso de un diafragma con un orificio o pinhole, que permite sólo el paso de la luz retro-reflejada desde un único plano focal deseado de la piel, bloqueando la luz que proviene de fuera de dicho plano. Al bloquear la luz que proviene de fuera del plano focal, el microscopio confocal puede alcanzar una resolución lateral del hasta 1 mm [107]. Sin embargo, una limitación de esta técnica aplicada a la piel es su restringida profundidad de penetración (en torno a las 200 µm), que permite visualizar únicamente epidermis y dermis papilar superficial. Por el contrario, la MMF permite obtener imágenes a una profundidad de hasta 500 µm [104]. Además, el microscopio multifotón no requiere orificio de entrada que filtre la luz del plano focal, puesto que la excitación fuera del plano focal es demasiado débil para causar una 54 fluorescencia apreciable; siendo esta otra ventaja de la técnica, pues produce baja fototoxicidad fuera de este plano [108]. Por su parte, la tomografía óptica computarizada (TOC) es una técnica de imagen óptica interferométrica que puede generar imágenes tridimensionales (3D) de un tejido, gracias a la luz retro-reflejada y dispersada. Esta tecnología funcionaría de una forma similar a los ultrasonidos, pero en este caso mediante una luz en torno a los 1300 nm de longitud de onda que sustituiría a la emisión de los ultrasonidos [25]. Como consecuencia, la resolución de la TOC es generalmente mayor que la de la ecografía, pero su capacidad de penetración en la piel es menor (en torno a 1-2 mm) [109]. Además, el uso de la tecnología Doppler permite la visualización de partículas en movimiento, permitiendo la visualización in vivo del flujo sanguíneo en el interior de los vasos sanguíneos [110]. Las principales ventajas y limitaciones de estas nuevas tecnologías quedan recogidas en la Tabla 5. 55 Tabla 5. Ventajas y limitaciones de la microscopía multifotón, la microscopía confocal de reflectancia y la tomografía óptica de coherencia en el estudio de la piel MMF MCR TOC Ventajas • Alta capacidad de penetración en los tejidos (en torno a los 500 µm). • Resolución cercana a la histología. • Escasa fototoxicidad y bajo fotoblanqueo fuera del plano focal de la imagen. • Posibilidad de visualizar los tejidos sin contrastes exógenos. • Posibilidad de distinguir diferentes elementos moleculares extra e intracelulares y estudiar el metabolismo celular. • Capacidad de escanear áreas amplias de tejido (8x8 mm2). • Alta velocidad en la obtención de imágenes. • Alta capacidad de penetración en los tejidos (en torno a 1-2 mm). • Capacidad de obtener imágenes verticales y horizontales (3D). • Posibilidad de usar tecnología Doppler para visualizar partículas en movimiento (ej. flujo sanguíneo). • Alta velocidad en la obtención de imágenes. Limitaciones • Potencial fototoxicidad en el plano focal tras un tiempo largo obteniendo imágenes. • Baja velocidad en la obtención de imágenes. • Pequeño campo de visión. • Alto precio del instrumental. • Alto nivel de especialización necesario para interpretar las imágenes. • Penetración limitada en los tejidos (en torno a los 200 µm). • No permite visualizar contrastes a nivel molecular. • Alto nivel de especialización necesario para interpretar las imágenes. • Baja resolución espacial lateral. • No permite visualizar contrastes a nivel molecular. • Alto nivel de especialización necesario para interpretar las imágenes. Modificado de Obeidy P, Tong PL, Weninger W. Research Techniques Made Simple: Two-Photon Intravital Imaging of the Skin. J Invest Dermatol. 2018 Apr;138(4):720-725. doi: 10.1016/j.jid.2018.01.017, y Lentsch G, Baugh EG, Lee B, Aszterbaum M, Zachary CB, Kelly KM, Balu M. Research Techniques Made Simple: Emerging Imaging Technologies for Noninvasive Optical Biopsy of Human Skin. J Invest Dermatol. 2022 May;142(5):1243-1252.e1. doi: 10.1016/j.jid.2022.01.016. [25,108] 56 63 secciones consecutivas no teñidas, que se utilizaron para ser visualizadas mediante el microscopio multifotón. Un ejemplo de estos mapas de H&E que se usaron para orientar la obtención de las imágenes de MMF puede observarse en la Figura 5. Figura 5. Mapa de H&E usado para identificar las áreas de interés en las imágenes posteriores de microscopía multifotón. A) Ejemplo de muestra teñida con H&E y utilizada como mapa para identificar posteriormente las áreas de interés en la imagen sin teñir visualizada al microscopio multifotón. Las áreas marcadas con un cuadrado negro fueron seleccionadas por corresponder a alguna de las estructuras de interés del estudio. 64 Nótese que el tejido conectivo adyacente a las estructuras fue parcialmente incluido en las imágenes seleccionadas, para poder analizar los haces de colágeno. Aumento de la imagen: 2x. B) Ejemplo de imagen de CB visualizado mediante MMF. Las imágenes de MMF se tomaron de la sección adyacente no teñida, usando como guía las H&E previas ejemplificadas en la imagen A. Los asteriscos blancos marcan los nidos y cordones tumorales. En azul y señalado por las puntas de flechas blancas se muestra el colágeno que rodea al tumor. Aumento de la imagen: 20x. Las imágenes de MMF se realizaron con el microscopio multifotón comercial Leica SP8 Confocal/Multiphoton microscope, situado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad Cornell de Nueva York (EE.UU.). Se seleccionaron parámetros customizados para la realización de MEDF y GSA. Se utilizó un láser de 785 nm para la excitación de las muestras. Se emplearon diferentes filtros de emisión de paso de banda: 435-485 nm (se le asignó el color verde), 510-560 nm (color amarillo) y 612-687 nm (color rojo), que se usaron para captar las señales autofluorescentes. También se utilizó un filtro de emisión de paso de banda de 360-400 nm (color azul) para aislar la señal de GSA, proveniente fundamentalmente del colágeno tipo I. Se utilizó un objetivo 20x sin inmersión, con un área aproximada de 553x553 micrómetros y con una resolución de 0.5 micron/pixel. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de las imágenes obtenidas fusionando las señales autofluorescentes con la GSA, o de forma selectiva tras seleccionar el filtro que aísla la GSA. 65 Figura 6. Imágenes de microscopía multifotón: señales de MEDF y de GSA. A) Imagen de un fragmento de epidermis visualizado mediante MEDF. Las señales autofluorescentes fueron recogidas mediante diferentes filtros de emisión de paso de banda: 435-485 nm, verde; 510-560 nm, amarillo; 612-687 nm, rojo; y la señal de GSA 66 fue captada por el filtro de 360-400 nm y codificada como azul. B) Misma imagen correspondiente a la señal de GSA aislada. Con las puntas de flecha blancas se muestra la unión dermoepidérmica. Aumento de las imágenes: 20x. De cada una de las secciones de tejido fresco no teñido se obtuvieron mediante estos parámetros múltiples imágenes individuales, tanto de fragmentos de CB como de las lesiones cutáneas benignas incluidas, así como también de las estructuras cutáneas normales (glándulas sebáceas, folículos pilosos y epidermis), usando como guía las anotaciones en las imágenes provenientes de las secciones teñidas con H&E (como se ejemplifica en la Figura 5). También se anotaron áreas de interés correspondientes al colágeno para su posterior análisis con los softwares CurveAlign y CT-FIRE (LOCI, EE.UU.). Finalmente, de cada una de las imágenes individuales se obtuvieron 5 planos cambiando la profundidad en el eje Z (5 imágenes z-stack). Para obtener la máxima información en la imagen final proveniente de todos estos planos, se fusionaron los 5 en una imagen final mediante la herramienta Maximum Projection tool en el software ImageJ (NIH, EE.UU.). 3.4 Análisis cuantitativo del colágeno: Se realizó un análisis de tipo cuantitativo sobre el colágeno en las imágenes, seleccionando la señal proveniente del colágeno mediante el filtro que aislaba la señal de GSA. A continuación, se describen los diferentes parámetros analizados. 3.4.1 Análisis de energía en una banda de frecuencias en el dominio de Fourier: Se utilizó el software ImageJ para realizar medidas cuantitativas del colágeno usando la Transformada rápida de Fourier (conocida por la abreviatura FFT, del inglés Fast Fourier Transform). La FFT es un algoritmo que permite la conversión de imágenes para facilitar su análisis cuantitativo, y que se ha usado para el estudio de la simetría y organización de las fibras de colágeno en la piel [111,112]. La FFT proporciona una densidad espectral 67 de energía en dos dimensiones, que nos informa de la energía de la señal sobre las diferentes frecuencias de las que está formada. Usando este algoritmo obtenemos información sobre la distribución espacial de las fibras de colágeno en cada una de las imágenes. Un ejemplo de las imágenes obtenidas al aplicar la FFT sobre las imágenes de GSA se observa en la Figura 7. Figura 7. Aplicación de la FFT sobre una imagen de GSA de un carcinoma basocelular nodular. A) Ejemplo de imagen de GSA de un CB de subtipo nodular. Las flechas blancas muestran las zonas oscuras que corresponderían a los nódulos tumorales, que no emiten señal de GSA y por ello se muestran oscuros; por su parte, las estrellas blancas señalan los haces de colágeno dispuestos alrededor de las masas tumorales, responsables de generar la señal de GSA tras ser estimulados por el láser del microscopio. Aumento de la imagen: 20x. B) Diagrama obtenido tras aplicar la FFT en la imagen anterior. La aplicación del algoritmo sobre las imágenes proporciona un diagrama de dos dimensiones que contiene información sobre la distribución espacial de los elementos de la imagen de la que procede. En los diagramas en 2D obtenidos tras la aplicación de la FFT sobre las imágenes de colágeno, cuando las fibras de colágeno están aleatoriamente distribuidas en cualquier dirección del espacio la energía en la banda de frecuencias de la representación del dominio de Fourier se distribuye isotópicamente. Como consecuencia, el diagrama obtenido es similar a una figura circular. Sin embargo, cuando las fibras están alineadas 68 en cierta dirección, la distribución de la energía será anisotrópica, y en consecuencia el diagrama final obtenido tendrá una imagen más alargada o elípitica (véase más adelante un ejemplo en la Figura 8). Para la cuantificación objetiva de los diagramas de la FFT, se utilizaron dos tipos de índices: índice de orientación del colágeno (IOC) y el índice de empaquetamiento de los haces de colágeno (EHC) [112,113]. El IOC se define por la relación entre el eje corto y el eje largo del lóbulo central de los diagramas. Se define por la fórmula matemática: IOC = [1- (eje corto / eje largo)] Donde la longitud de los ejes se mide en píxeles en las imágenes. IOC igual a cero representa un comportamiento perfectamente isotrópico de todas las fibras de colágeno, es decir, que todas las fibras se distribuyen de una forma completamente aleatoria. Un diagrama de FFT con una figura circular presentará a un IOC de valor bajo (cercano al valor 0), indicando que las fibras se distribuyen al azar en la imagen de GSA inicial. Por el contrario, un valor de IOC igual a 1, indica que todas las fibras se distribuyen de una forma perfectamente paralela. Así, un diagrama de FFT con una figura tendente a la elipse, presentará un IOC de valor alto (más cercano al 1), indicando que las fibras tienden a estar orientadas de forma paralela en alguna dirección. Por su parte, el índice de empaquetamiento de los haces de colágeno (EHC) representa la periodicidad de los haces de colágeno. Se expresa como: EHC = 1024 * (1/h) Donde h representa la distancia en píxeles entre los centros de gravedad de los máximos de primer orden en la versión en 3D de la densidad espectral de energía, en la que el eje Z muestra la amplitud de la señal. Así, una h o distancia mayor resultará en un EHC menor, lo que indica que los centros de gravedad de los haces de colágeno son más cercanos y por tanto que dichos haces se organizan de una forma más compacta. En la Figura 8 se recogen ejemplos representativos de las imágenes utilizadas para realizar el análisis cuantitativo y la aplicación de las mediciones en ellas. 69 70 Figura 8. Imágenes representativas de las usadas para el análisis cuantitativo del colágeno basado en la FFT (Página anterior). A) Imagen mediante MMF (las señales de autofluorescencia están codificadas en color verde/amarillo/rojo, la GSA codificada en azul) de un CB nodular. Con los asteriscos blancos se señalan los nidos tumorales y con las puntas de flechas blancas las áreas características de clivaje que acompañan frecuentemente a este tipo tumoral. Aumento de la imagen: 20x. B) Imagen mediante MMF de glándulas sebáceas (asteriscos blancos). Nótense las células sebáceas en el interior. C-d) Imágenes obtenidas aislando la señal de GSA de las anteriores. Los asteriscos blancos marcan las zonas sin señal en las que se encuentran los nidos tumorales (c) y las glándulas sebáceas (d). En las imágenes se observan los haces de colágeno tipo I, responsables principales de la señal de GSA, codificada en azul. E-f) Diagramas en 2D obtenidos tras la aplicación de la FFT sobre las imágenes de GSA. En rojo se marcan los ejes cortos de los lóbulos del diagrama y en verde los ejes largos. Obsérvese como la distribución más paralela de las fibras de colágeno alrededor de los nidos tumorales se traduce en un diagrama más elíptico, mientras que la distribución más aleatorizada del colágeno alrededor de las glándulas sebáceas da lugar a un diagrama de una morfología más circular. G-h) Versión en 3D de la densidad espectral de energía tras aplicar el dominio de Fourier. En ambas imágenes h representa la distancia en píxeles entre los centros de gravedad de los máximos de primer orden. Una h o distancia mayor (como se observa en la imagen g) resultará en un EHC menor, indicando que los haces de colágeno se organizan de una forma más compacta comparativamente. 3.4.2 Análisis de la distribución de los haces y fibras de colágeno mediante CurveAlign y CT-FIRE: CurveAlign y CT-FIRE son dos softwares de fuente abierta para cuantificar la distribución del colágeno fibrilar basados en la transformada Curvelet [114]. La transformada Curvelet fue introducida en el año 2000 por Candes y Donoho [115] para responder a nuevas necesidades en el análisis de imágenes que no podían resolverse con las transformadas Wavelet o Fourier. Esta transformada multiescala tiene características que le permiten eliminar el ruido de fondo de las imágenes y mejorar la nitidez de los bordes de estas. Además, proporciona una representación espacial del colágeno que permite detectar fibras individuales y su curvatura. Tanto CurveAlign como CT-FIRE 71 están basados en esta transformada y pueden ser descargados de forma libre en: http://loci.wisc.edu/software/ctfire y http://loci.wisc.edu/software/curvealign. A continuación, se describe el objetivo de cada herramienta, así como se muestran ejemplos característicos de imágenes tras aplicar cada una de ellas. • CurveAlign: este software se desarrolló para el estudio del alineamiento y la orientación del colágeno en haces completos. Su objetivo es cuantificar todos los ángulos de las fibras de colágeno dentro de una región de interés, en relación con un límite establecido por el usuario, como pueden ser un límite tumoral o el de otra estructura a estudio [23]. Para ello, la transformada Curvelet permite mejorar el ruido de la imagen facilitando el aislamiento de la señal proveniente de las fibras de colágeno. Gracias a este software podemos obtener un índice de alineamiento de los haces de colágeno y de su orientación en forma de ángulo con respecto al límite previamente establecido. En la Figura 9 se adjuntan ejemplos demostrativos de las imágenes que genera el software al procesar las imágenes de GSA, y en el apartado 3.5.2 se definen los parámetros que proporciona. • CT-FIRE: el nombre de este software proviene de sus iniciales en inglés, Curvelet Transformation (CT) – Fiber extraction algorithm (FIRE). Esta herramienta se desarrolló ante la necesidad de estudiar las características de las fibras individuales que rodean a los tumores u otras estructuras, separándolas del haz completo de colágeno. De esta forma, mediante el uso de este algoritmo se pueden analizar métricas de las fibras a nivel individual, como la longitud, la anchura, el ángulo o la rectitud de las mismas. En la Figura 9 de muestran ejemplos de la aplicación de este algoritmo sobre las imágenes de GSA, y en el apartado 3.5.2 se definen los parámetros que proporciona. Figura 9. Imágenes representativas de las resultantes del análisis con CurveAlign y CT-FIRE (Página siguiente). A) Imagen de CB superficial con MEDF y GSA. El asterisco blanco marca los nidos tumorales que surgen de la epidermis. B) Imagen de glándulas sebáceas (asteriscos blancos) con MEDF y GSA. C-d) Imágenes correspondientes aislando la señal de GSA. Los asteriscos blancos marcan las áreas sin señal que corresponden al tumor y a las glándulas sebáceas respectivamente. E-f) 72 Imágenes que genera el software CurveAlign tras procesar las imágenes correspondientes de GSA. G-h) Imágenes que proporciona el software CT-FIRE tras procesar las imágenes de GSA. Nótese cómo CurveAlign detecta haces completos de colágeno, mientras que CT-FIRE detecta la señal procedente de fibras individuales mediante la segmentación de la imagen. Aumento de las imágenes: 20x. 79 4. RESULTADOS 4.1 Factores demográficos de la población a estudio: Se incluyeron un total de 64 pacientes en el estudio que se trataron en el hospital MSKCC de Nueva York (EE.UU.). La edad media de los pacientes fue 63 años, con una desviación estándar de 13 años, oscilando en un rango entre los 35 y los 90 años. En cuanto al sexo, el 51% (33/64) eran varones y el 49% (31/64) eran mujeres. Procedentes de estos pacientes, se incluyeron un total de 52 muestras de CB de diferentes subtipos histológicos: 15 casos de CB superficial, 11 de CB nodular, 17 de CB infiltrante y 9 casos de CB de subtipos histológicos mixtos. También se incluyeron 12 lesiones benignas: 3 queratosis actínicas, 2 queratosis seborreicas, 3 queratosis liquenoides, 1 tricoepitelioma desmoplático, 1 angiofibroma y 2 adenomas sebáceos. La mayoría de estas lesiones, un 34,4% (22/64), se localizaban en cabeza y cuello. Las características demográficas de los pacientes y las características de las lesiones se detallan en la Tabla 6. Tabla 6. Resumen de los datos demográficos de la población a estudio Población 64 pacientes Edad en años, media (DE) 63 (±13) Sexo, % (n) Hombres Mujeres 51% (33/64) 49% (31/64) Localización de las lesiones, % (n) Cabeza y cuello Extremidades superiores Tronco Extremidades inferiores 64 lesiones 34,4% (22/64) 25% (16/64) 29,7% (19/64) 10,9% (7/64) Abreviaturas: DE es desviación estándar, n es número total. 80 4.2 Imágenes de generación de segundo armónico del colágeno: A partir de las muestras descritas se generaron un total de 459 imágenes de microscopía multifotón y GSA para el análisis. De estas, se incluyeron 418 en el estudio y las restantes 41 se rechazaron por la presencia de artefactos producidos durante el procesamiento de las muestras o la toma de imágenes al microscopio. La distribución de imágenes por categorías está descrita en la Tabla 7. Un ejemplo de las imágenes de colágeno obtenidas y su correlación con las de H&E puede visualizarse en la Figura 11. Tabla 7. Resumen de las muestras incluidas y del número de imágenes de microscopía multifotón en cada categoría Número de muestras cutáneas usadas para la obtención de las imágenes Estructuras estudiadas en las muestras cutáneas Número de imágenes de MMF adquiridas Carcinoma basocelular (n=52) Nodular (n=11) Superficial (n=15) Infiltrante (n=17) Subtipo mixto (n=9) Epidermis 133 225 Folículo piloso 49 Glándula sebácea 43 Carcinoma basocelular Subtipo histológico agresivo Subtipo histológico indolente 157 61 96 157 Lesiones benignas (n=12) Queratosis actínica (n=3) Queratosis seborreica (n=2) Queratosis liquenoide (n=3) Tricoepidelioma desmoplásico (n=1) Angiofibroma (n=1) Adenoma sebáceo (n=2) Queratosis actínica 13 36 Queratosis seborreica 4 Queratosis liquenoide 6 Tricoepidelioma desmoplásico 4 Angiofibroma 3 Adenoma sebáceo 6 Abreviaturas: MMF es microscopía multifotón, n es número total 81 Figura 11. Imágenes representativas de microscopía multifotón y su correspondencia con las imágenes de H&E. Ejemplos de un carcinoma basocelular nodular (a-c), un carcinoma basocelular infiltrante (d-f), una queratosis actínica (g-i) y una glándula sebácea (j-l). En la primera columna del panel (imágenes a, d, g, f) se 82 visualizan las imágenes de multifotón con la señal de MEDF (codificadas en color amarillo/verde/rojo) y la GSA (codificada en color azul). La segunda columna muestra la señal de GSA aislada (b, e, h, k) utilizadas para el análisis cuantitativo del colágeno tipo I. En la tercera (c, f, i, l) se muestra las imágenes correspondientes de H&E que se usaron como mapa para obtener las imágenes de MMF. Los asteriscos muestran la zona lesional o con la estructura normal de interés de todas las imágenes. Nótese que en las imágenes de GSA, al no incluirse las señales de autofluorescencia, las zonas lesionales o las estructuras normales aparecen oscuras y sólo se visualiza el colágeno tipo I de la periferia. Barras de escala: 100 µm. 4.3 Análisis cuantitativo del colágeno: 4.3.1 Análisis cuantitativo de las fibras de colágeno adyacentes al carcinoma basocelular versus las adyacentes a estructuras normales de la piel (epidermis, glándulas sebáceas, folículos pilosos): Un primer análisis mediante la prueba Kruskal-Wallis mostró diferencias significativas en todos los índices estudiados (p<0,05). Se realizó un análisis post hoc comparativo con la prueba U de Mann Whitney y corrección de Bonferroni para analizar cuáles eran las categorías responsables de las diferencias halladas. Un resumen de los resultados de cada uno de los índices tras la comparación entre el CB y las estructuras normales se muestra en la Tabla 8. 83 Tabla 8. Resultados del análisis comparativo entre las fibras de colágeno que rodean al carcinoma basocelular versus a las estructuras normales de la piel Colágeno circundante al CB (n= 157) vs. a estructuras normales de la piel (epidermis n=133, folículos pilosos n= 49, glándulas sebáceas n=43) Índice Grupos Mediana (RIC) p IOC CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 0,53 (0,45-0,61) 0,34 (0,16-0,47) 0,25 (0,17-0,41) 0,39 (0,25-0,54) < 0,001 < 0,001 < 0,001 EHC CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 19,88 (15,05-25,94) 32 (23,81-39,84) 30,11 (27,67-40,96) 32 (24,97-43,59) < 0,001 < 0,001 < 0,001 Orientación CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 70,2 (47,8-81,6) 70,35 (52,37-80,55) 79,3 (66,62-84,7) 66,4 (50-78,7) 1,000 0,005 1,000 Alineamiento CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 0,78 (0,66-0,88) 0,61 (0,4-0,78) 0,59 (0,46-0,8) 0,49 (0,33-0,67) < 0,001 < 0,001 < 0,001 Longitud CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 48,4 (45,45-51,7) 51,35 (47,4-56,65) 53,4 (50,3-55,60) 50,3 (45,65-52,95) < 0,001 < 0,001 1,000 Rectitud CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 0,9 (0,89-0,91) 0,9 (0,9-0,91) 0,9 (0,9-0,91) 0,9 (0,89-0,91) 0,038 0,921 1,000 Anchura CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 3,3 (3-3,7) 3,7 (3,22-4,2) 4 (3,8-4,3) 3,5 (3,25-3,8) < 0,001 < 0,001 0,171 Ángulo CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 70,4 (61,42-78,9) 70,9 (57,9-79,1) 78,45 (73,62-83,92) 73,5 (63,2-83,1) 1,000 0,001 1,000 DOI CB vs. epidermis vs. glándula sebácea vs. folículo piloso 459467,33 (284421,76-914188,79) 839659,65 (461200,23-2033545,63) 1523861,67 (763009,62-2726225,7) 512826,88 (374045,72-1545245,29) < 0,001 < 0,001 0,927 84 Tabla 8. Resultados del análisis comparativo entre las fibras de colágeno circundantes al carcinoma basocelular versus a las estructuras normales de la piel (Página anterior). Resultados de la prueba H de Kruskal-Wallis con análisis post hoc mediante U de Mann-Whitney y corrección de Bonferroni. Sólo se muestran en la tabla los resultados comparativos con respecto al CB. El resto de las comparaciones por parejas pueden consultarse en el Anexo II. n = número de imágenes de GSA analizadas. Los valores de orientación y ángulo se expresan en grados, los de anchura y longitud en píxeles. Los valores de p estadísticamente significativos (<0,05) se muestran en negrita. Abreviaturas: CB, carcinoma basocelular; EHC, índice de empaquetamiento del colágeno; DOI, densidad óptica integrada; IOC, índice de orientación del colágeno; RIC, rango intercuartil. El análisis basado en las imágenes de la FFT mostró que el IOC alrededor del CB es mayor que el que presentan las estructuras normales de la piel (epidermis, glándulas sebáceas, folículos pilosos), con una mediana de 0,53 (rango intercuartil [RIC] 0,45-0,61) en el caso del CB frente a una de 0,34 (RIC 0,16-0,47) en la epidermis, de 0,25 (RIC 0,170,41) en glándulas sebáceas y de 0,39 (RIC 0,25-0,54) en folículos pilosos, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p<0,001) (Tabla 8 y Figura 12). En cuanto al índice de EHC del colágeno, alrededor del CB la mediana fue de 19,88 (RIC 15,05-25,94) versus de 32 (RIC 23,81-39,84) en el caso de la epidermis, de 30,11 (RIC 27,67-40,96) en glándulas sebáceas, y de 32 (RIC 24,97-43,59) en el caso de los folículos pilosos. Los valores del índice EHC fueron por tanto significativamente menores en el caso del CB en comparación a todas estructuras normales de la piel (p<0,001), como se observa en la Tabla 8 y en la Figura 12. 85 Figura 12. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo basado en la FFT entre el colágeno adyacente al CB y el adyacente a las estructuras normales de la piel. A) Índice de orientación del colágeno (IOC). B) Índice de empaquetamiento de los haces de colágeno (EHC). Con el asterisco rojo se muestran las categorías con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) con el CB. Por su parte, el análisis de los haces de colágeno mediante CurveAlign mostró que el colágeno tiene un mayor índice de alineamiento alrededor del CB (mediana 0,78, RIC 0,66-0,88) en comparación al que presenta alrededor de la epidermis (mediana 0,61, RIC 86 0,4-0,78), de las glándulas sebáceas (mediana 0,59, RIC 0,46-0,8) y de los folículos pilosos (mediana 0,49, RIC 0,33-0,67). Todas estas diferencias fueron estadísticamente significativas (p<0,001). Con respecto a la orientación, sólo se encontraron diferencias entre el ángulo de las fibras alrededor del CB y de las glándulas sebáceas (p=0,005), siendo menor en el caso del carcinoma (Tabla 8 y Figura 13). Figura 13. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo mediante CurveAlign entre los haces de colágeno adyacentes al CB y los que se encuentran adyacentes a las estructuras normales de la piel. A) 87 Alineamiento. B) Orientación. Con el asterisco rojo se muestran las categorías con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) con el CB. Se estudiaron las diferencias de las fibras de colágeno a nivel individual mediante CTFIRE (Tabla 8 y Figura 14). En cuanto a la longitud, las fibras de colágeno alrededor del CB fueron más cortas y estrechas que las que rodean la epidermis y las glándulas sebáceas (p<0,001). Además, en el caso de la epidermis, estas fibras tenían una morfología ligeramente más recta en comparación a las que rodean al CB (p=0,038). En cuanto a su ángulo, las fibras presentaban menor angulación rodeando al CB en comparación a las glándulas sebáceas (p=0,001), sin encontrarse diferencias significativas con el resto de las variables. No se encontraron diferencias significativas entre las fibras individuales que rodean al CB y las que rodean a los folículos pilosos en ninguno de los índices estudiados mediante CT-FIRE. 88 95 96 Por último, el análisis entre la DOI de las fibras de colágeno que rodean el CB y las que rodean las lesiones benignas aportó resultados equivalentes y no demostró diferencias estadísticamente significativas (p=0,898) (Tabla 9 y Figura 19). Figura 19. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo entre la DOI de las imágenes del colágeno adyacente al CB frente a la de las imágenes del colágeno adyacente a las lesiones benignas de la piel. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p=0,898). 4.3.3 Análisis cuantitativo de las fibras de colágeno adyacentes a carcinomas basocelulares agresivos versus las adyacentes a carcinomas indolentes: Los resultados del análisis cuantitativo entre las fibras de colágeno que forman parte del estroma adyacente a los CB agresivos versus aquellas fibras que forman parte del estroma de los tumores indolentes se encuentran sintetizados en la Tabla 10. 97 Tabla 10. Resumen de los resultados del análisis comparativo entre las fibras de colágeno adyacentes a carcinomas basocelulares agresivos versus las adyacentes a carcinomas indolentes Colágeno circundante a CB indolentes (superficiales y nodulares, n=96) vs. agresivos (infiltrantes y micronodulares, n=61) Índice Grupos Mediana (RIC) p IOC CB agresivos CB indolentes 0,48 (0,43-0,60) 0,56 (0,47-0,63) 0,018 EHC CB agresivos CB indolentes 20,48 (16,52-31,03) 18,62 (15,06-23,81) 0,098 Orientación CB agresivos CB indolentes 73,9 (49,95-83,25) 67,85 (38,72-79,25) 0,057 Alineamiento CB agresivos CB indolentes 0,75 (0,59-0,87) 0,82 (0,69-0,9) 0,021 Longitud CB agresivos CB indolentes 47,15 (43,2-50,27) 49,2 (46,4-52,8) 0,001 Rectitud CB agresivos CB indolentes 0,9 (0,9-0,91) 0,9 (0,89-0,91) 0,955 Ancho CB agresivos CB indolentes 3,2 (2,7-3,67) 3,3 (3,1-3,7) 0,037 Ángulo CB agresivos CB indolentes 71,25 (65,6-80,95) 69,4 (59,02-78,17) 0,054 DOI CB agresivos CB indolentes 381375,97 (224229,65-824853,06) 465864,21 (317173,82-958314,27) 0,181 Resultados de la prueba U-Mann Whitney. n = número de imágenes de GSA analizadas. Los valores de orientación y ángulo se expresan en grados, los de anchura y longitud en píxeles. Los valores de p estadísticamente significativos (<0,05) se muestran en negrita. Abreviaturas: CB, carcinoma basocelular; EHC, índice de empaquetamiento del colágeno; DOI, densidad óptica integrada; IOC, índice de orientación del colágeno; RIC, rango intercuartil. El análisis basado en la FFT mostró que el colágeno que rodea a los tumores indolentes (CB superficiales y nodulares) presentaba un IOC mayor (p=0,018) que el colágeno que rodea a los tumores más agresivos (CB infiltrantes y micronodulares); con un valor de mediana de 0,56 (RIC 0,47-0,63) en el caso de los indolentes versus uno de 0,48 (RIC 0,43-0,60) en el caso de los agresivos. Por otro lado, aunque los tumores indolentes 98 presentaron un índice EHC menor que los agresivos, estos resultados no fueron estadísticamente significativos (p= 0,098) (Tabla 10 y Figura 20). Figura 20. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo basado en la FFT entre el colágeno adyacente los CB agresivos y el adyacente a los CB indolentes. A) IOC. B) EHC. Con el asterisco rojo se muestran las diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los subtipos histológicos. 99 El análisis mediante CurveAlign mostró un aumento del alineamiento de las fibras alrededor de los tumores indolentes (mediana 0,82 [RIC 0,69-0,9]) comparadas con los tumores agresivos (mediana 0,75 [RIC 0,59-0,87]), con diferencias estadísticamente significativas (p=0,021). En cuanto a la orientación, el ángulo relativo de los haces de colágeno con respecto al límite de los tumores agresivos fue mayor (mediana 73,9º [RIC 49,95-83,25]) que en el caso de los tumores indolentes (mediana 67,85º [RIC 38,7279,25]), aunque estas diferencias entre ambos grupos no fueron estadísticamente significativas (p=0,057) (Tabla 10 y Figura 21). Figura 21. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo mediante CurveAlign entre los haces de colágeno adyacentes los CB 100 agresivos y los que se encuentran adyacentes a los CB indolentes. A) Alineamiento. B) Orientación. Con el asterisco rojo se muestran las diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los subtipos histológicos de CB. Por su parte, el análisis de las fibras individuales mediante CT-FIRE mostró que las fibras que rodean a los tumores indolentes tienden a ser más largas (p=0,001) y más anchas (p=0,037) que aquellas que rodean a los tumores agresivos. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la rectitud de las fibras (p=0,955) o al ángulo (p=0,054) entre los diferentes subtipos histológicos de CB (Tabla 10 y Figura 22). Figura 22. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis de las fibras de colágeno a nivel individual mediante CT-FIRE en la periferia de los CB agresivos comparadas con las que se encuentran en la periferia de los CB indolentes (Página siguiente). A) Longitud. B) Ancho. C) Rectitud. D) Ángulo. Con el asterisco rojo se muestran las categorías con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) con el CB. 101 102 Por último, el análisis de la DOI de las fibras de colágeno que rodean a los CB agresivos mostró que la intensidad de la señal del colágeno es menor en estas imágenes que en las imágenes de carcinomas basocelulares indolentes. No obstante, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0,181) (Figura 23). Figura 23. Diagrama de caja y bigotes que muestra los resultados del análisis comparativo entre la DOI de las imágenes del colágeno adyacente los CB agresivos frente a la de las imágenes del colágeno adyacente a los CB indolentes. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p=0,181). 103 104 CAPÍTULO 5. DISCUSIÓN 111 5.2.1 ¿Cuál es la contribución de la transformada de Fourier al análisis del colágeno peritumoral en el carcinoma basocelular? El análisis de la orientación de los haces de colágeno mediante la FFT se describió por primera vez en 2002 por Van Zuijlen et al. [111]. Estos autores demostraron que el análisis mediante la FFT permitía cuantificar la organización de los haces de colágeno de una manera más fiable y objetiva que la observación directa de los tejidos. Gracias a la FFT se puede conocer la isotropía/anisotropía de los tejidos mediante los diagramas de 2D que se generan tras el análisis. Así, un diagrama con una morfología más elíptica indica una organización mayor de las fibras (mayor anisotropía), mientras que una morfología del diagrama más circular indica una distribución más aleatoria (menor anisotropía). En su estudio, Van Zuijlen et al. analizaron 152 muestras de dermis sana y de tejido cicatricial, fijadas en formalina y teñidas mediante H&E, y estudiadas mediante el microscopio confocal y microscopía óptica convencional. Estas imágenes fueron evaluadas por cuatro expertos que las puntuaron mediante una escala de cinco rangos: haces con una organización extremadamente paralela, predominantemente paralela, mixta, predominantemente aleatoria y extremadamente aleatoria. Los resultados se promediaron y se compararon con los resultados tras realizar el análisis de Fourier. Para calcular la exactitud de la prueba se utilizaron imágenes generadas por ordenador con una orientación fijada y previamente conocida al crear la imagen, puesto que no existe un gold-standard universalmente aceptado para conocer la orientación de las fibras de colágeno en una imagen histológica [111]. El análisis de la orientación del colágeno en estas imágenes mediante la FFT mostró una mayor correlación que la orientación promedio indicada por los 4 evaluadores. En consecuencia, con este estudio se propuso por primera vez que este análisis matemático permitía una evaluación más objetiva y exacta de la distribución de los haces de colágeno que la mera observación al microscopio. En un estudio posterior, se comprobó y validó que la FFT también es útil para cuantificar la orientación de los haces de colágeno en tinciones clásicas para el colágeno como Picrosirius red y el tricrómico de Masson [142]. Estos autores demostraron en 46 muestras de piel sana y 8 de piel con esclerodermia que el análisis matemático mediante la FFT era superior a la observación por varios expertos. Además, el análisis mediante la FFT no sólo se considera superior a la observación directa, sino que también es más específico 112 que los análisis de texturas que se basan en la intensidad de los píxeles, como la DOI [105]. En el caso de las imágenes de GSA, que permiten aislar la señal concreta de estructuras no centrosimétricas como el colágeno fibrilar, son varios los estudios que han utilizado con éxito la FFT para cuantificar la orientación de las fibras en modelos animales [143– 148] y tejidos humanos [88,144,149]. En este último grupo, destaca un estudio de van Zuijlen et al. [150], en el que analizaron la disposición de los haces de colágeno en piel sana y cicatricial. Los autores pusieron a prueba la hipótesis por la cual los haces de colágeno se disponen de forma paralela en las cicatrices según la tensión mecánica a la que estén sometidas durante el proceso de cicatrización. Aunque este extremo no pudo ser demostrado, sí encontraron un IOC mayor (mayor alineamiento paralelo de los haces de colágeno) y un EHC menor (mayor densidad en el empaquetamiento de los haces) en la piel cicatricial con respecto a los controles de piel normal. También se ha aplicado este análisis sobre imágenes de GSA diferentes tipos tumores malignos, intentando distinguirlos de estructuras benignas. En cáncer de mama, Falzon et al. [151] demostraron diferencias entre las fibras de colágeno que forman parte del estroma normal de la mama, y las que forman parte de mamas con cambios benignos (como los fibroadenomas) o de las circundantes a los carcinomas malignos e invasivos. Estos autores observaron que las fibras de colágeno son más rectas y se disponen más paralelas alrededor de los tumores malignos. Otros estudios han mostrado hallazgos similares, demostrando mediante la FFT que las fibras de colágeno están más alineadas alrededor de los tumores malignos de mama [152,153]. Un estudio más reciente refiere que el análisis mediante la FFT podría, no sólo distinguir entre tumores malignos y lesiones benignas de la mama, sino detectar diferencias entre carcinomas invasivos de mama de diferentes grados histológicos (grados 0, I, II and III) [149]. También se han estudiado mediante FFT, entre otros índices, el colágeno presente en adenopatías positivas en cáncer de mama. Kakkad et al. [154] encontraron que las linfadenopatías positivas para metástasis de cáncer de mama presentaban significativamente mayor densidad de colágeno tipo I que aquellas sin metástasis. Los autores proponían explorar este biomarcador como un detector precoz para la detección de metástasis ganglionares en estos tumores. Además, un hallazgo importante de este trabajo fue mostrar que la fijación e inclusión en parafina que forma parte del procesamiento rutinario de las 113 muestras histológicas ganglionares no tiene impacto posterior en la detección y cuantificación del colágeno tipo I en las imágenes de GSA. De esta forma, la MMF podría implementarse en un futuro como método de rutina en el estudio del colágeno de las piezas tras su procesamiento histológico habitual. Hallazgos similares se han observado en otros tumores, como los tumores ováricos, donde mediante la FFT entre otros análisis se han encontrado cambios que permiten distinguir los tumores ováricos de los tejidos benignos, pero por el momento no los diferentes tipos tumorales entre sí [155–157]. Además, no sólo se han encontrado cambios mediante la FFT en el colágeno adyacente tejidos tumorales, sino que hay estudios recientes como el de Despotović et al. [122] que muestran cambios en la organización del colágeno en fragmentos de colon sano hasta 20 cm alejados del tumor. En cuanto al CB, existían muy pocos datos sobre la orientación del colágeno perilesional analizada mediante la FFT. El análisis de imágenes mediante la FFT puede realizarse a través de varios paquetes de software, entre ellos MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE.UU.) o ImageJ [105]. En nuestro estudio, realizamos el análisis mediante la FFT a través del software ImageJ para calcular la orientación de las fibras de colágeno y lo cuantificamos con dos índices previamente descritos y validados en la literatura: el índice de orientación del colágeno (IOC) y el índice de empaquetamiento de los haces de colágeno (EHC) [111,112,150]. De acuerdo con los resultados obtenidos en nuestro trabajo, los haces de colágeno que rodean al CB presentan un IOC más alto que los que rodean a estructuras las cutáneas normales, lo que sugiere que un mayor alineamiento del colágeno que rodea a los tumores. Es decir, alrededor de los CB los haces de colágeno adquieren una orientación más paralela entre sí que cuando se disponen alrededor de estructuras cutáneas normales, como las glándulas sebáceas o los folículos pilosos. Estos datos van en línea con un estudio más pequeño previo, realizado por Kiss et al. en 2019 [113]. En su estudio, los autores compararon 10 muestras de CB normales con muestras de tejido completamente sano, encontrando un IOC mayor en las muestras de CB que en el tejido sano. En nuestro estudio, comparamos los CB con las estructuras cutáneas normales que formaban parte dentro de ese mismo tejido peritumoral, que generalmente en el caso de los carcinomas (más frecuentes en áreas fotoexpuestas) presenta unas características de daño actínico que pueden alterar el colágeno de la muestra. La matriz extracelular es una estructura dinámica que se modifica en su composición y estructura 114 con el paso de los años, y los cambios a nivel del colágeno se incluyen en este proceso de fotoenvejecimiento. En las pieles jóvenes, el colágeno es abundante, densamente empaquetado y bien organizado en fibrillas. Con el paso del tiempo, y especialmente en la presencia de daño solar, las fibras de colágeno se fragmentan y se degradan [158]. El conocimiento de este hecho justificó el enfoque de nuestro estudio, en el que quisimos eliminar la influencia de este factor comparando al CB con estructuras normales adyacentes al tumor, pero procedentes de un mismo tejido con unas mismas condiciones de fotoenvejecimiento. Esta aproximación es más cercana a la práctica clínica real de la cirugía de Mohs entre otras, en la que el cirujano ha de discriminar si una estructura corresponde a infiltración maligna del tumor o a una estructura normal de la piel que se encuentre adyacente al carcinoma en la misma muestra. Además, en nuestro trabajo realizamos un análisis comparativo entre las principales estructuras normales que pueden simular un CB para un cirujano de Mohs: fragmentos de epidermis, folículos pilosos y glándulas sebáceas. También incluimos la comparación con tumores benignos. Con cada una de estas estructuras se encontraron cambios significativos en el IOC, presentando el CB un IOC mayor (mayor alineamiento de las fibras) que todas las estructuras normales de la piel estudiadas y también que los tumores benignos. Finalmente, nuestros resultados indican que el índice IOC puede ser útil para distinguir los diferentes subtipos histológicos de CB. En atención a los mismos, los carcinomas más indolentes (los subtipos superficial y nodular) presentan un IOC mayor que los agresivos (subtipos infiltrante y micronodular) (p=0,018). En otras palabras, los CB indolentes mostraron mayor alineamiento en las fibras de colágeno perilesionales que los tumores agresivos. En histopatología, hallazgos similares (haces de colágeno organizados de forma paralela alrededor de los límites tumorales) se han observado en CB superficiales [74]. Nuestro estudio muestra que el IOC es un instrumento con potencial para discriminar entre diferentes tipos histológicos de CB y, por tanto, ayudar a los clínicos a determinar el pronóstico de los tumores y el consecuente tratamiento más adecuado para los mismos. Por otra parte, el índice de EHC mostró que los haces de colágeno están más densamente empaquetados alrededor de los tumores malignos en comparación a estructuras normales de la piel (EHC menor, p<0,001). En el estudio de Kiss et al. [113], se invirtieron los valores de dicha relación, hallando estos autores un EHC mayor en los tumores, aunque 115 no se alcanzó la significación estadística en el resultado. También se encontró un menor índice EHC con relación a los CB con relación a tumores benignos (p<0,001), indicando que los haces de colágenos son más compactos alrededor de los tumores malignos. Por su parte, en el análisis entre subtipos histológicos en el caso de los CB indolentes, pero en este último caso no se alcanzaron diferencias estadísticamente significativas (p=0,098). En atención a estos resultados, se puede afirmar que el análisis del colágeno con la FFT y mediante los índices IOC y EHC permitiría obtener información consistente para distinguir los tumores malignos de las estructuras normales de la piel, de los tumores benignos e incluso hacer distinciones entre los diferentes subtipos histológicos. 5.2.2 ¿Cuál es la contribución de los softwares CurveAlign y CT-FIRE al análisis del colágeno peritumoral en el carcinoma basocelular? CurveAlign y CT-FIRE son potentes instrumentos para el estudio cuantitativo del colágeno basados en la transformada de Curvelet [23], que permite reducir el ruido de las imágenes e incrementar el contraste de los bordes de las fibras para una mejor representación de las mismas. Estos softwares de código abierto integrados en MATLAB combinan una gran capacidad para definir la orientación de las fibras basada en la transformada de Curvelet, y la posibilidad de extraer información de las fibras individuales mediante el algoritmo de extracción de fibras (FIRE, del inglés Fiber extraction algorithm). CurveAlign se desarrolló en primer lugar para informar sobre la disposición espacial de del grueso de los haces de colágeno, y tiene como objetivo fundamental cuantificar el alineamiento (o anisotropía) y el ángulo de los haces de colágeno en una región de interés en relación con un límite establecido por el usuario, que puede ser un límite tumoral [114]. Posteriormente, los creadores del software buscaron profundizar en el conocimiento del papel que juega el colágeno en la génesis y crecimiento de los tumores, así como en la progresión y pronóstico de los mismos. Para ello, desarrollaron CT-FIRE, que se integra en CurveAlign y permite proporcionar información sobre cada fibra a nivel individual. 116 La combinación de ambas herramientas nos ofrece información amplia de la distribución del colágeno en aquellas zonas que queramos estudiar. Aunque estos algoritmos permiten la medición de las fibras individuales en cuanto a su longitud o su grosor, los propios autores de la herramienta indican que el mayor potencial de esta es la identificación del alineamiento y orientación (o ángulo) de las fibras colágenas, pues son estos marcadores los que más consistentemente se han relacionado con el pronóstico de diferentes tumores [23]. Uno de los primeros estudios clínicos basado en la aplicación de estos softwares para la medición de colágeno fue el estudio de Bredfeldt et al. [134]. Previamente, Provenzano et al. [124] habían propuesto en 2006 un sistema de cambios o “firmas” en el colágeno peritumoral (las ya mencionadas Tumor-Associated Collagen Signatures o TACS) que definían el pronóstico del tumor. Los autores usaron un modelo animal de ratón con cáncer de mama y sano para tomar las muestras, que analizaron con MMF obteniendo imágenes de autofluorescencia y de GSA. También se tomaron muestras para realizar un estudio histológico y obtener imágenes teñidas con H&E, tricrómico y Picrosirius red, que permitieran identificar las fibras de colágeno y caracterizar la morfología del tumor más fácilmente en las imágenes de microscopía multifotón. Gracias a las imágenes de MMF y GSA se identificaron 3 distribuciones diferentes del colágeno que rodeaba al cáncer de mama. Por un lado, TACS-1, que se define como la presencia de colágeno denso en la región cercana al tumor (identificado como un aumento en la densidad de la señal). Conforme aumentaba el tamaño del tumor, los autores encontraron una segunda firma de colágeno, llamada TACS-2, que consiste en fibras de colágeno tensas y estiradas alrededor del mismo. Esta distribución posiblemente se debe al crecimiento de la masa tumoral, que hace que las fibras se dispongan de forma paralela alrededor del límite del tumor. Por último, en las regiones en las que las masas tumorales presentan de forma inminente riesgo de invasión, los autores hallaron una tercera distribución del colágeno o TACS-3: fibras alineadas en dirección a la invasión tumoral, o lo que es lo mismo, dispuestas perpendicular a los límites del tumor o con un ángulo cercano a los 90º. De esta forma, se conoce como TACS-3 a una disposición radial de las fibras alrededor de los límites del tumor (es decir, un ángulo de las fibras mayor) que se ha considerado predictora de invasión tumoral y metástasis. 117 Estos hallazgos preliminares en modelos animales se confirmaron en pacientes humanos en un estudio posterior. Conklin et al. [135] analizaron mediante imágenes de GSA el colágeno peritumoral de 196 muestras de carcinoma de mama. Para el estudio de la distribución espacial del colágeno, los autores tuvieron que seleccionar de forma manual el borde del tumor y las regiones de interés en las que analizar la orientación de las fibras de colágeno. Tres observadores independientes clasificación las imágenes en dos categorías: TACS-3 positivas o negativas, según la distribución perpendicular o no de las fibras de colágeno con respecto al borde del tumor. A continuación, analizaron la supervivencia específica de enfermedad y la supervivencia libre de enfermedad, que se compararon mediante una prueba log-rank entre grupos (pacientes TACS-3 positivos y TACS-3 negativos). Además, se realizó un estudio multivariante para eliminar la influencia de otros factores que pudieran estar influyendo en el pronóstico del tumor (tamaño tumoral, edad, sexo, expresión de HER-2, etc.). De acuerdo con sus resultados, los pacientes TACS-3 positivos tenían peores supervivencias específica y libre de enfermedad, de forma estadísticamente significativa. De esta forma, los autores proponían que TACS-3 podía considerarse un biomarcador sólido con información pronóstica en el caso del cáncer de mama. También señalaban los autores que TACS-3 no aparecía alrededor del perímetro completo del tumor, sino sólo en algunas áreas de este de forma local. Esto mismo se había observado en el estudio previo en ratones, en los que estas áreas TACS-3 coincidieron con las zonas de invasión tumoral [124]. Teniendo en cuenta estos datos, los autores teorizaban que TACS-3 se relacionaba con un peor pronóstico en cáncer de mama en humanos, porque la disposición radial de las fibras podría favorecer la invasión tumoral. Aunque los hallazgos de Conklin et al. fueron muy relevantes al demostrar que la distribución de las fibras de colágeno alrededor del carcinoma de mama definía su pronóstico, tanto en su caso como en el estudio de Provenzano et al., la medición manual de la orientación y ángulo de las fibras dificultaba la estandarización de este método. Por ello, en un trabajo posterior, Bredfeldt et al. [134] buscaron validar los TACS automatizando el método de identificación del ángulo de las fibras. Para ello, los autores usaron las muestras de la misma cohorte de pacientes, pero en este caso, aplicaron en las imágenes de GSA el software CT-FIRE para la extracción automatizada del ángulo relativo de las fibras con respecto a los bordes del tumor. Estos bordes a su vez se identificaron mediante algoritmos, que tras un aprendizaje semisupervisado, 118 identificaban las células epiteliales que forman el límite tumoral. De esta forma, los algoritmos clasificaron las imágenes de forma semiautomática en TACS-3 positivas y negativas. Los autores encontraron que efectivamente los pacientes con muestras TACS3 positivas presentaron una supervivencia significativamente menor. Además, los autores hallaron que la correlación con la medición manual que se había realizado en esa misma cohorte en el estudio previo de Conklin et al. fue alta. En consecuencia, afirmaban que la medición semiautomática del ángulo de las fibras de colágeno mediante CT-FIRE y otros algoritmos de procesamiento de las imágenes proporcionaba información pronóstica de interés en pacientes cáncer de mama. Posteriormente, parte de este mismo grupo de trabajo quiso analizar si el colágeno que rodea al tumor permitía predecir la recurrencia del carcinoma ductal in situ [136]. Aunque no llegaron a demostrar este hecho, los autores sí mostraron mediante el uso de CurveAlign en las imágenes de GSA que las fibras que rodeaban al carcinoma ductal in situ tenían tendencia a mostrarse más perpendiculares (es decir, a presentar un ángulo u orientación mayor) al límite del conducto que aquellas que rodeaban los conductos normales. Estos resultados se consideraron en línea con los estudios previos de este mismo grupo [134,135]. Recientemente, Bondelon et al. [159] utilizaron ambos softwares (CurveAlign y CTFIRE) para analizar cuantitativamente el colágeno de biopsias con carcinoma de mama y tejido mamario sano, y correlacionar la arquitectura del colágeno con la densidad de las mamografías. El aumento de densidad en las mamografías se ha relacionado en estudios epidemiológicos con un aumento de riesgo de cáncer de mama [160], aunque la relación entre ambos fenómenos no está aclarada. En su estudio, Bondelon et al. encontraron que la densidad de las fibras de colágeno se correlacionaba positivamente con la densidad mamográfica, no a nivel global, pero sí en los puntos de biopsia mamaria y 2 mm a su alrededor. De acuerdo con sus resultados, conforme aumentaba la severidad de la lesión desde tejido sano hasta maligno, las fibras tendían a ser más cortas, más finas, más rectas y más alineadas entre sí. Gracias al estudio del ángulo de las fibras, los autores también analizaron las firmas de colágeno o TACs anteriormente mencionadas. En la misma línea que estos estudios previos, en su cohorte TACS-3 estaba ausente en la mayoría de las muestras de tejido sano o con patología benigna; mientras que estaba presente en un porcentaje amplio de los carcinomas, especialmente en aquellos mayores de 1 cm. En 119 consecuencia, hipotetizaban los autores que TACS-3 podría ser un marcador tardío en cuanto a la progresión e invasión tumoral [159]. Estudios similares se han realizado en otros tumores, como es el caso del carcinoma de páncreas. Drifka et al. [161] en 2015 analizaron las diferencias existentes entre el colágeno que compone el estroma del adenocarcinoma pancreático ductal, de la pancreatitis crónica y del tejido pancreático normal. Sobre imágenes de GSA aplicaron CurveAlign y CT-FIRE para medir el alineamiento, la longitud, el ancho y la rectitud de las fibras de colágeno. Los autores encontraron que el colágeno se organizaba de una forma más alineada y paralela alrededor de los adenocarcinomas ductales en comparación al tejido pancreático sano o al tejido con pancreatitis crónica, de forma estadísticamente significativa. Al clasificar los tumores pancreáticos por grados, no se encontró relación entre el grado tumoral y el nivel de alineamiento del colágeno. Interesantemente, observaron que el colágeno se organizaba de forma alineada y paralela en aquellas zonas en las que el adenocarcinoma infiltraba los tejidos circundantes, siguiendo la misma dirección que la invasión tumoral. Estos datos están en la línea de otros estudios que indican que el colágeno podría guiar la migración de las células tumorales en la cascada metastásica [162,163]. Posteriormente, los autores quisieron comprobar si el análisis morfológico del colágeno podía predecir el pronóstico de pacientes con carcinoma de páncreas [137]. Para ello, se valieron de nuevo de CurveAlign y CT-FIRE, y analizaron imágenes de GSA del colágeno de muestras de 114 pacientes con adenocarcinoma de páncreas. Los autores observaron que un alineamiento mayor del colágeno se asociaba a una menor supervivencia, al igual que ocurría con el cáncer de mama [134]. Además, el alineamiento del colágeno mostró tras un análisis multivariante ser un factor independiente de mal pronóstico más allá de los factores pronósticos clásicos en el adenocarcinoma ductal de páncreas (márgenes afectos, grado tumoral, estadio…). Finalmente, otro objetivo del trabajo fue definir un perfil fenotípico de la transición epitelio-mesénquima de estos tumores. Para ello, los autores analizaron los niveles de marcadores inmunohistoquímicos relacionados con los fibroblastos asociados al cáncer (CAFs), como la alfa actina del músculo liso (α-SMA, del inglés alpha-smooth muscle actin) y el sindecano-1. Los autores comprobaron que, en el adenocarcinoma ductal de páncreas, el nivel de alineamiento de las fibras de colágeno tenía una correlación directa con los niveles de 120 expresión tanto de α-SMA como de sindecano-1. De esta forma, la disposición paralela de las fibras y la expresión de estas proteínas se podrían considerar biomarcadores de mal pronóstico en el caso de estos tumores. En atención a los resultados de su análisis, teorizaban los autores que esta relación con tumores de mal pronóstico podría deberse a que las células tumorales se valen de los cambios de la MEC (incremento de alineamiento del colágeno y expresión de marcadores de transición epitelio-mesénquima como la αSMA o el sidecano-1), para favorecer la invasión tumoral y comenzar la cascada de la metástasis. En nuestro estudio, el análisis de las fibras individuales basado en CT-FIRE mostró que las fibras colágenas que rodean al CB son más cortas y estrechas que las que rodean la epidermis y las glándulas sebáceas, sin encontrarse diferencias con los folículos pilosos. Este resultado es contradictorio con los hallazgos de Kiss et al. [113], que describieron que las fibras de colágeno que rodean al CB son fibras más largas que las que se encuentran alrededor de las muestras de piel sana, sin encontrar diferencias en cuanto al ancho. Estas diferencias pueden deberse a la ya expuesta desigualdad entre las muestras incluidas en cada estudio: en el caso de Kiss et al. se compararon muestras de CB nodulares con muestras distintas de piel completamente sana; mientras que en nuestro estudio se comparó el CB con las estructuras circundantes normales que se encontraban adyacentes al tumor en el mismo tejido. En cuanto al ángulo, Kiss et al. describieron un menor ángulo relativo en las fibras de colágeno que rodean al CB con respecto a los controles. En nuestro estudio observamos ese menor ángulo con relación a las glándulas sebáceas (p=0,001), sin identificarse diferencias en cuanto a los folículos pilosos o la epidermis. También se encontró un menor ángulo relativo de las fibras de colágeno del CB con respecto a las fibras de lesiones benignas (p<0,001). Interesantemente, los CB agresivos (infiltrantes y micronodulares) presentaron un mayor ángulo relativo de las fibras con respecto a los CB indolentes (superficiales y nodulares). Esta disposición más perpendicular de las fibras con respecto al borde de los tumores agresivos se tradujo en un p-valor cercano a la significación estadística (p=0,054), aunque sin alcanzarla. Este resultado iría en línea con los hallazgos de Provenzano et al. en cáncer de mama, que propusieron que un TACS-3 o una disposición radial de las fibras alrededor de los límites del tumor (es decir, un ángulo de las fibras mayor), se consideraba un predictor de invasión tumoral inminente y metástasis [124]. En nuestro caso, los tumores con más riesgo de invasión presentaron también fibras de colágeno con un ángulo mayor con 127 resolución de la técnica, que permite una visualización a nivel subcelular de los tejidos, la visualización de los tumores es compleja por su falta de autofluorescencia. En las imágenes de MMF la autofluorescencia proviene fundamentalmente del estroma y de las estructuras normales de la piel, siendo los tumores más difíciles de identificar. Todo ello dificulta la interpretación de las imágenes por aquellas personas que no sean expertas en MMF. Por lo tanto, la implementación en práctica clínica real de esta tecnología requeriría un entrenamiento previo a los facultativos, que por la similitud de las imágenes a los cortes histológicos habituales y su alta resolución no tendría que ser muy amplio. En el caso de otras técnicas de imagen, como la microscopía confocal ex vivo con tinción digital de H&E, Mu et al. demostraron que un breve entrenamiento de 5 minutos mediante 6 ejemplos, aumentaba significativamente la capacidad diagnóstica de los dermatólogos que usaban la técnica [175]. De forma paralela, el conocimiento previo del tipo de imágenes que genera la MMF favorecería la aceptación de la técnica por los facultativos implicados. Finalmente, otra limitación a destacar en nuestro trabajo es que todas las imágenes usadas se obtuvieron de muestras provenientes de un único centro, en este caso el Memorial Sloan Kettering Cancer Center de Nueva York (EE.UU.). En el futuro, serían necesarios estudios multicéntricos para validar nuestros hallazgos. 5.4. Direcciones futuras: La MMF ofrece grandes ventajas para la investigación biomédica, pues permite el análisis de las muestras sin tinciones ni procesamiento elaborado, y la detección de moléculas específicas como el colágeno tipo I sin necesidad de marcadores, gracias a la generación de segundo armónico. Mientras que la MCR y la TOC aplicadas in vivo ofrecen imágenes en escala de grises, en el caso de la MMF podemos obtener de forma directa imágenes a color con resolución subcelular, semejantes a las obtenidas clásicamente con H&E. Por ello, son cada vez más estudios los publicados en relación con esta tecnología y se prevé que siga aumentando los próximos años el interés en ella [176]. El futuro de esta tecnología se relaciona con la mejora de sus principales desventajas, que fueron mencionadas apartados anteriores. Es necesario que se desarrollen en un futuro 128 nuevos dispositivos in vivo que superen las limitaciones de los existentes, que presentan un campo visual estrecho y una velocidad de adquisición de imágenes lenta [25]. En el campo de la dermatología, el campo visual estrecho entorpece la capacidad diagnóstica, puesto que las lesiones pueden ser no uniformes (por ejemplo, al desarrollarse un melanoma sobre un nevus), lo que puede dar lugar a falsos negativos. Además, debido al alto volumen asistencial al que se enfrentan los dermatólogos en su práctica clínica habitual, la implementación de cualquier nueva tecnología requiere que esté de dotada cierta agilidad para su realización. Especialmente, si se plantea un uso intraoperatorio de la misma, como ocurre en cirugía de Mohs. En un estudio reciente en muestras de piel de cirugía de Mohs, Giacomelli et al. [177] aplicaron un fluoróforo exógeno, el naranja de acridina, para mejorar la resolución de las imágenes. El naranja de acridina es un fluoróforo que se une al ADN y ARN de forma selectiva y que no deteriora las muestras para su posterior procesamiento en H&E [107]. No obstante, este fluoróforo no puede aplicarse in vivo sobre piel humana por su posible efecto mutagénico [178]. En líneas generales, la detección de señales de fluorescencia exógena permite aumentar la velocidad de adquisición de las imágenes por parte del microscopio multifotón, al aumentar la intensidad de la señal. En la actualidad, el reto de la aplicación de la MMF in vivo sobre la piel es alcanzar una velocidad mayor a la vez que se detectan las señales endógenas de fluorescencia, que tienen intensidad de señal intrínseca baja. Sin embargo, el naranja de acridina no podría utilizarse con este propósito directamente sobre la piel por su posible mutagenicidad. A este respecto, se han producido algunos avances en los últimos años. Por un lado, una aproximación novedosa es el uso de moxifloxacino como agente de contraste. El moxifloxacino es un antibiótico de la familia de las fluorquinolonas de cuarta generación, aprobado tanto por la FDA (del inglés, Food and Drug Administration) como por la EMA (European Medicines Agency) para su uso en humanos. Wang et al. [179] describieron como el moxifloxacino tiene una fluorescencia intrínseca detectable mediante microscopía multifotón. Este antibiótico presenta una buena capacidad de penetrar los tejidos, lo que le permite alcanzar concentraciones altas a nivel intracelular. En su estudio, los autores aplicaron el moxifloxacino in vitro en diferentes líneas celulares, e in vivo en modelos animales. Posteriormente, aplicaron este agente de contraste a diferentes muestras humanas ex vivo de CB, carcinoma de células escamosas y dermatofibrosarcoma protuberans, y las visualizaron mediante MMF. Los autores 129 compararon las imágenes obtenidas con las que se obtienen con microscopía confocal de fluorescencia con naranja de acridina y con el procesamiento tradicional de las imágenes con H&E. De acuerdo con sus resultados, el uso de moxifloxacino en MMF proporcionaba una resolución equiparable al uso de naranja de acridina en microscopía confocal de fluorescencia, con la ventaja de tener potencial para ser aplicado in vivo. Según los autores, el uso de moxifloxacino permitiría incrementar la velocidad de la adquisición de las imágenes de MMF gracias al aumento de contraste de la señal. Además de mejorar la velocidad de adquisición de las imágenes, el uso de agentes de contraste puede ser útil para mejorar la falta de contraste nuclear del CB (que aparece como áreas oscuras en las imágenes de MMF, como se ha comentado anteriormente). En microscopía confocal de reflectancia se ha usado PARPi-FL, un marcador fluorescente que ha demostrado mejorar el contraste nuclear en el caso del CB [180]. Este fluoróforo tiene aprobación como Investigational New Drug por la FDA para su uso in vivo en humanos, y está en este momento bajo estudio en un ensayo clínico para la detección precoz del cáncer oral [181]. Por otro lado, para superar las limitaciones de la técnica actual más allá del uso de agentes de contraste, también se han propuesto nuevos prototipos con tecnología mejorada. Por ejemplo, Fast et al. [182] publicaron recientemente un trabajo sobre un nuevo prototipo llamado FLAME (Fast Large Area Multiphoton Exoscope). Esta plataforma combina mecanismos ópticos y mecánicos de escáner con algoritmos de inteligencia artificial, que mejoran resolución de las imágenes. De esta forma, los autores refieren que con su plataforma es posible incrementar la velocidad de adquisición de las imágenes mientras se mantiene la resolución subcelular, sin necesidad de utilizar fluoróforos ni tinciones exógenas. Otra solución potencial para mejorar la velocidad de adquisición de las imágenes sería la creación de un instrumento multimodal, que combinase la tecnología MMF con otra técnica de imagen más rápida, como la microscopía confocal de reflectancia. Wang et al. [183] integraron la MCR con la MMF para visualizar in vivo la piel. Sin embargo, las imágenes que se generaban con este dispositivo combinado continuaban presentado un campo de visualización estrecho. En el futuro, los ya existentes microscopios confocales de reflectancia usados en práctica clínica [16], podrían combinarse puntualmente con un 130 dispositivo in vivo de MMF. Así, el microscopio confocal de reflectancia podría proporcionar imágenes con un amplio campo de visión (que midiesen hasta 8x8 mm2) como primer screening. Posteriormente, sería la MMF la que, en un segundo momento, aumentaría la especificidad de la técnica para diagnosticar lesiones como el CB al proporcionar imágenes con resolución subcelular, además de un análisis cuantitativo del colágeno mediante la GSA. Esta combinación de técnicas permitiría mejorar la capacidad diagnóstica en los casos de carcinoma y posiblemente proporcionar información pronóstica sobre estos en base al estudio del colágeno. Por último, es importante destacar que, aunque la MMF puede mejorar el diagnóstico del CB, la lectura de las imágenes puede ser compleja para aquellos que se estén iniciando en la técnica. Por ello, la integración de algoritmos de inteligencia artificial puede ser útil en esta tecnología, más allá de para aumentar la velocidad del dispositivo como ocurre en la plataforma FLAME [182]. En un trabajo previo de nuestro grupo, demostramos que el uso de algoritmos de inteligencia artificial a través de redes neuronales convolucionales podía automatizar el diagnóstico del CB en microscopía confocal de fluorescencia [184]. Hallazgos similares se han publicado posteriormente en relación a la microscopía confocal de reflectancia [185]. En MMF se han realizado estudios similares en los que el uso de Deep Learning permitía identificar tumores como el carcinoma renal [186] o la recurrencia del hepatocarcinoma [187]. Hasta la fecha, no se han aplicado algoritmos de inteligencia artificial para facilitar el diagnóstico del CB en imágenes de MMF, siendo esta la línea de investigación que nuestro grupo pretende explorar los próximos años. 131 132 CAPÍTULO 6. CONCLUSIONES 133 6. CONCLUSIONES 1. El análisis cuantitativo de las imágenes de microscopía multifotón ex vivo consigue identificar cambios morfológicos en el colágeno que rodea al CB, que permiten distinguirlo de estructuras normales de la piel y de lesiones cutáneas benignas, así como diferenciar entre subtipos histológicos. 2. El colágeno presenta una organización más paralela en el estroma alrededor del CB que en el estroma alrededor de las estructuras normales y lesiones benignas de la piel. 3. Los haces de colágeno que rodean al CB están más densamente empaquetados que los que rodean a estructuras normales y lesiones benignas de la piel. 4. El colágeno se encuentra más alineado adyacente a los CB con subtipo histológico indolente (superficial y nodular) que a aquellos con subtipo más agresivo (infiltrante y micronodular). 5. Las fibras colágenas que rodean a los tumores agresivos presentan una disposición más perpendicular con respecto al límite tumoral (mayor ángulo relativo) que las que rodean a los tumores indolentes; siendo estas diferencias cercanas a la significación estadística, aunque sin alcanzarla. Estos hallazgos son concordantes con los observados en otros tumores como el cáncer de mama. 6. El presente trabajo demuestra por primera vez que la señal de GSA que proviene del colágeno tipo I puede ayudar no sólo al diagnóstico del CB, sino que puede proporcionar información pronóstica de estos tumores al identificar los subtipos histológicos de mayor riesgo. 7. Estos hallazgos sientan las bases iniciales para una futura cuantificación del colágeno mediante MMF in vivo, que permita obtener información diagnóstica y pronóstica del CB directamente sobre la piel del paciente. 134 135 CAPÍTULO 7. BIBLIOGRAFÍA 136 7. BIBLIOGRAFÍA [1] Cameron MC, Lee E, Hibler BP, Barker CA, Mori S, Cordova M, et al. 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