Desarrollo de un método verde para evaluar el tiempo de vida útil de aceites de oliva vírgenes

DESARROLLO DE UN MÉTODO VERDE PARA EVALUAR EL TIEMPO DE VIDA ÚTIL DE ACEITES DE OLIVA VÍRGENES Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado ENRIQUE JACOBO DÍAZ MONTAÑA UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica Grado en Farmacia DESARROLLO DE UN MÉTODO VERDE PARA EVALUAR EL TIEMPO DE VIDA ÚTIL DE ACEITES DE OLIVA VÍRGENES Trabajo Fin de Grado Trabajo experimental Enrique Jacobo Díaz Montaña Tutoras: María Teresa Morales Millán y Dolores Hernanz Vila Sevilla, 7 de Julio de 2017 Índice Pág. Resumen 1 1. Introducción 3 1.1. Aceite de oliva y aceite de oliva virgen 3 1.1.1. Composición del aceite de oliva virgen 5 1.1.2. Compuestos fluorescentes y luminiscentes presentes en el aceite de oliva virgen 6 1.2. Oxidación y vida útil del aceite de oliva “Shelf-life” 7 1.3. Aceite de oliva virgen aderezado 11 1.4. Espectrofluorimetría 12 1.4.1. Variables que afectan al proceso 13 2. Objetivos 16 3. Metodología 17 3.1. Muestras 17 3.2. Materiales e instrumentos 18 3.3. Procedimiento analítico 19 3.4. Tratamiento de datos 19 4. Resultados y discusión 21 4.1. Clasificación de la muestra de aceite de oliva virgen 21 4.1.1. Parámetros fisicoquímicos 21 4.1.2. Análisis espectrofluorimétrico 21 4.1.3. Precisión del método espectrofluorimétrico 23 4.2. Evolución del aceite durante el almacenamiento 24 4.3. Aceite de oliva aderezado (romero y albahaca) 26 4.4. Aceite de oliva vs aceite aderezado: aplicación estadística multivariante 30 5.Conclusiones 33 6. Bibliografía 34 1 RESUMEN Actualmente, existe preocupación dentro del sector del aceite de oliva por obtener métodos objetivos que permitan predecir, tanto la vida útil de los aceites, como su fecha de consumo preferente. Existen compuestos presentes en el aceite de oliva virgen que poseen propiedades luminiscentes, entre ellos tocoferoles, compuestos fenólicos y pigmentos, cuya determinación puede servir para evaluar e incluso predecir la vida útil del aceite. Durante la autooxidación del aceite varia su composición y se originan compuestos químicos que modifican sus propiedades organolépticas y tienen efecto sobre su valor biológico. El objetivo de este trabajo es desarrollar un método espectrofluorimétrico preliminar que permita establecer el estado de oxidación de los aceites de oliva vírgenes, basándose en sus espectros de emisión luminiscente y, posteriormente, predecir el tiempo de vida útil de los aceites. El estudio se ha realizado con aceite de oliva virgen extra. Se utilizaron tres lotes de muestras, sin aderezo, aderezado con romero (Rosmarinus officinalis, L.) y con albahaca (Ocimum basilicum, L.), que se almacenaron en recipientes de vidrio transparente, en condiciones naturales de temperatura y periodos luz/oscuridad. Una vez al mes, durante un periodo de 9 meses, se adquirieron los espectros de emisión de las muestras a una λex = 330 nm. Durante el periodo estudiado se observaron variaciones de intensidad en las bandas del espectro de emisión, debido a la degradación de tocoferoles, compuestos fenólicos y pigmentos, y a la producción de compuestos de oxidación. Estas variaciones fueron intensas durante los primeros meses de almacenamiento, produciéndose de forma gradual a partir del quinto mes, y observándose un cambio de pendiente en la evolución de las bandas relacionadas con la presencia de pigmentos. Se observaron diferencias en esta evolución entre las muestras con y sin aderezo, y entre las muestras con distinto tipo de aderezo. Palabras claves: aceite de oliva virgen, espectrofluorimetría, vida útil, oxidación, plantas aromáticas. 2 ABSTRACT Nowadays, there is concern in the olive oil sector for obtaining objective methods to predict both, the olive oil shelflife and their preferred date of consumption. There are compounds in virgin olive oils that have luminescent properties, including tocopherols, phenolic compounds and pigments, whose determination can be useful for evaluating and even predicting the shelflife of the oil. During the autooxidation of the oil its composition varies and chemical compounds that modify its organoleptic properties and have an effect on its biological value are produced. The objective of this work is to develop a preliminary spectrofluorometric method to establish the oxidation state of virgin olive oils based on their emission spectra and to predict the shelf-life of the oils. The study was carried out with extra virgin olive oil. Three batches of samples, without dressing, and seasoned with rosemary (Rosmarinus officinalis, L.) and basil (Ocimum basilicum, L.) were used. The oils were stored in transparent glass containers under natural conditions of temperature and light / dark periods. Once a month, over a period of 9 months, the emission spectra of the samples were acquired at λex = 330 nm. During the studied period, intensity variations were observed in the emission spectrum bands, due to the degradation of tocopherols, phenolic compounds and pigments, and to the production of oxidation compounds. These variations were intense during the first months of storage, occurring gradually from the fifth month, and a change of slope observed in the evolution of the bands related to the presence of pigments. Differences were observed in this evolution between the samples with and without dressing, and between samples with different types of dressing. Keywords: virgin olive oil, spectrofluorimetry, shelf-life, oxidation, aromatic plants. 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Aceite de oliva y aceite de oliva virgen El aceite de oliva se define como el aceite obtenido del fruto del olivo (Olea europea L.), sin considerar aquellos que han sido obtenidos por disolventes, reesterificación, o mezcla de diferentes aceites. Según el Consejo Oleícola Internacional se clasifica según varios parámetros físico-químicos, como la acidez o el índice de peróxidos, y parámetros sensoriales, que se evalúan según un método oficial (COI, 2015) valorando atributos sensoriales de aroma y sabor, y estableciendo los valores de la mediana de los defectos sensoriales y del atributo afrutado (COI, 2016). La acidez presente, se expresa en gramos de ácido oleico, que es el ácido mayoritario, por cada cien gramos de aceite; según la Norma (COI, 2016) clasifica en distintos tipos: o Aceite de oliva virgen: es aquél que se produce únicamente por extracción mecánica u otros métodos físicos en condiciones, particularmente térmicas, que no alteren el aceite, y que no hayan sido sometidos a otro tratamiento que no sea el de lavado, decantación, centrifugación y filtrado. Los aceites de esta categoría se clasifican en cuatro tipos: o Aceite de oliva virgen extra: aceite cuya acidez libre expresada en ácido oleico es como máximo de 0,8 gramos por 100 gramos y sus demás características cumplan con las fijadas en la Norma. o Aceite de oliva virgen: es aquel cuya acidez libre expresada en ácido oleico es como máximo de 2 gramos por 100 gramos y sus características cumplan con las fijadas en la Norma para esta categoría. o Aceite de oliva virgen corriente: aceite cuya acidez libre expresada en ácido oleico es como máximo de 3,3 gramos por 100 gramos y cuyas características correspondan a las fijadas para esta categoría en la Norma. o Aceite de oliva lampante: Aceite de oliva virgen lampante: no es apto para el consumo en la forma en que se obtiene, su acidez libre expresada en ácido oleico es superior a 3,3 gramos por 100 gramos y/o cuyas características organolépticas y demás características 10 compuestos hidrofílicos, que se agrupan a su vez en alcoholes fenólicos, ácidos fenólicos, flavonoides y lignanos. Para que tengan un mayor poder antioxidante, se considera que debe tener grupos hidroxilos, y un grupo carbonilo, formando éster, lactona, chalcona, flavanona o flavona aromático (Dziedzic y Hudson, 1984). Los tocoferoles son los antioxidantes lipofílicos, se considera que forman el mayor grupo de antioxidantes naturales presente en todos los aceites. En el caso del aceite de oliva se considera de menor importancia el poder antioxidante de los tocoferoles, frente al de los fenoles (Velasco y Dobarganes, 2002). El poder antioxidante de estos depende fundamentalmente de su concentración, siendo la óptima entre 400 y 600 ppm, y de la presencia de compuestos sinérgicos. El tocoferol con mayor actividad es el isómero alfa. Los factores externos (temperatura, refinación, almacenamiento) hacen disminuir el contenido de los tocoferoles, así como el grado de madurez tiene un gran impacto en el contenido, siendo la aceituna verde la más rica en estos compuestos. La clorofila presente en el aceite proviene del fruto, que durante el procesado transforma estos compuestos en derivados más estables, como la feofitina y las pirofeofitinas. Esta derivación lleva cambios estructurales, que se reflejan con un cambio en el color del aceite, pasando de verde brillante a amarillo. El contenido en clorofilas en el fruto, disminuye a medida que éste madura. Las clorofilas y feofitinas, tienen un efecto pro-oxidante en presencia de luz, pero en condiciones de almacenamiento en ausencia de luz pueden actuar con antioxidantes, ya que en vez de facilitar la activación del oxígeno, actúan como donador de hidrógenos (Endo et al., 1984; Bradley y Min, 1992; Gutiérrez-Rosales et al., 1992). Los carotenoides protegen al aceite de la foto-oxidación debido al sistema de dobles enlaces conjugados que presenta, siendo el β-caroteno el segundo con mayor número de dobles enlaces conjugados y por tanto el segundo en mayor poder antioxidante. Sin embargo, este efecto protector no es observado durante el almacenamiento en ausencia de luz. Los carotenoides tienen una menor estabilidad a la temperatura que las clorofilas (Morales y Przybylski, 2013). El grado de oxidación se evalúa por diferentes métodos, el índice de peróxidos, absorbancia UV y el análisis sensorial, entre otros. Un aumento de los ácidos grasos libres en el índice de peróxidos indica que hay oxidación, ya sea por el almacenamiento 11 o procesamiento del aceite (Garrido-Delgado et al., 2015). Pero los defectos sensoriales se perciben antes de que los cambios se observen en los parámetros de calidad (Raffo et al., 2015). Como se ha indicado, los procesos de oxidación son, en el caso de grasas y aceites, la principal causa de deterioro de su calidad. Desde el punto de vista industrial se hace, por tanto, necesario proteger el aceite de posibles procesos oxidativos que modifiquen su composición y produzcan efectos perjudiciales, como la aparición de características organolépticas indeseables, la reducción drástica de las notas sensoriales agradables de aroma y sabor o la reducción del contenido de ácidos grasos insaturados y de compuestos antioxidantes de origen natural, que afectan tanto a la vida útil (shelf life) del aceite como a sus propiedades sensoriales y saludables. Es por este motivo por lo que es interesante conocer cómo afecta la oxidación a los compuestos fluorescentes del aceite de oliva virgen. La generación o degradación de compuestos fluorescentes por la oxidación del aceite de oliva es de interés para la industria ya que el uso de una técnica robusta, cómoda y rápida permitiría saber cuál es la calidad del aceite en ese momento e incluso predecir su vida útil. 1.3. Aceite de oliva virgen aderezado Los aceites de oliva virgen aderezados son aquellos que son elaborados con plantas aromáticas/medicinales para darle mayor valor nutricional y/o cambiar sus atributos sensoriales y/o aumentar su tiempo de vida útil (Issaoui et al., 2011). Se ha demostrado que la adición de este tipo de plantas al aceite retrasa el proceso de oxidación y modifica su composición por migración de compuestos desde las plantas al aceite (Alcalá, 2016). Las plantas aromáticas se usan como fuente de antioxidantes naturales porque tienen compuestos antimicrobianos y antioxidantes. Por este motivo se suelen adicionar al aceite para prolongar su vida útil, ya que evitan o retrasan la oxidación y los atributos sensoriales desagradables, y es por esto que son más apreciados por los consumidores (Baiano et al., 2009). Aunque la concentración de plantas añadidas debe ser baja o moderada, ya que se debe evitar la sobre-aromatización, para que el cliente no lo rechace (Nenadis et al., 2010; Sousa et al., 2015). 12 1.4. Espectrofluorimetría La puesta a punto de procedimientos que permitan evaluar el estado de oxidación del aceite de forma rápida, económica y siguiendo los principios de la química verde son una demanda por parte de la Industria del sector, que tiene que garantizar la estabilidad, seguridad y calidad del aceite de oliva virgen, pero que en ocasiones ve que el nivel de calidad inicialmente obtenido puede verse drásticamente alterado si las condiciones de almacenamiento posterior no son las adecuadas. Se denomina química verde al uso de técnicas y metodologías químicas que reduzcan o eliminen el uso o generación de compuestos que son dañinos para el hombre o el medio ambiente. El objetivo principal, por tanto, es el de reducir los riesgos que están asociados con productos o procesos que son indispensables en el mundo, manteniendo el nivel de vida y el científico. Dentro de los métodos analíticos, la química verde se centra en diseñar métodos que reduzcan o eliminen las sustancias peligrosas usadas o generadas (Keith et al., 2007). La técnica espectrofluorimétrica cumple estos requisitos ya que permite trabajar con cantidades reducidas de muestra, evitar el uso de disolventes y obtener información completa de la muestra en un solo análisis, además de ser rápida y de bajo coste. Figura 3. a) Configuración electrónica de una molécula en estado singulete fundamental, excitado y triplete excitado. b) Proceso de excitación y relajación de una molécula. La fluorescencia es un proceso que consiste en la absorción de un fotón, con el consiguiente aumento de energía de un electrón de la molécula, este electrón excitado puede encontrarse en estado singulete o triplete excitado, según sea su spin. Los electrones, como se muestra en la Figura 3a se encuentran en un estado singulete fundamental, es decir, los dos electrones están en el orbital de mínima energía posible con los spines opuestos (Principio de exclusión de Pauli). El estado singulete excitado, a) b) 13 es donde los electrones conservan sus spines pero uno se encuentra en niveles de energía superiores (sin contar los estados vibracionales). Y también, se puede encontrar en estado triplete excitado, donde los electrones no tienen el mismo spin y están en estados excitados (Skoog et al., 2001). La relajación de la molécula excitada puede producirse por diferentes procesos mecanísticos. Ya sean con emisión de un fotón de radiación o no. Cuando hay emisión de radiación se pueden observar dos procesos, la fluorescencia y la fosforescencia. La fluorescencia es la emisión de un fotón de radiación de un estado singulete excitado al estado singulete fundamental. La fosforescencia implica, que el singulete excitado pasa, por conversión interna, a triplete excitado, y de ahí se relaja al estado fundamental, como se muestra en la Figura 3b. La mayor diferencia de energía entre los estados excitados y relajados, es en la absorción, luego vendría la fluorescencia, y por último la fosforescencia. En comparación, la fluorescencia siempre tiene una emisión en una longitud de onda menor (más energética), que se suele producir a temperatura ambiente, mientras que en la fosforescencia se da a baja temperatura. Pero la diferencia principal entre ambos procesos es la velocidad a la que ocurre, ya que la fluorescencia puede llegar a ser 104 segundos más rápida, es por eso que la fosforescencia se puede observar aun cuando ha cesado la radiación excitante. El electrón se relajará siguiendo el proceso que minimiza el tiempo de vida del estado excitado (Skoog et al., 2001). 1.4.1. Variables que afectan al proceso Una de las variables a considerar, son los factores estructurales, dentro de los cuales destacan los sustituyentes de la molécula y su rigidez. Los sustituyentes afectan en cuanto a la deslocalización de los electrones, como son los grupos –NH2, -OH, -F, - OCH3, -NHCH3 y N(CH3)2, entre otros. Estos grupos suelen mejorar la señal de fluorescencia ya que aumenta la probabilidad de que el electrón pase de un estado relajado a un estado excitado. Por otro lado, grupos atractores de electrones como son -Cl, -Br, -I, -NHCOCH3, -NO2, y –COOH, disminuyen esta posibilidad al alejar los diferentes estados energéticos. La rigidez molecular favorece el proceso de fluorescencia porque disminuyen tanto las transiciones sin emisión de radiación, como las conversiones internas. 14 Otro aspecto a tener en cuenta es la polaridad del disolvente, ya que si contiene átomos pesados disminuye la fluorescencia, así como también lo hace la presencia de oxígeno disuelto. Los cambios de pH también influyen ya que pueden favorecer los cambios de π a π* (disminuir la distancia entre orbitales fundamentales y excitados), estos cambios de orbitales se pueden producir debido a los sustituyentes ácidos o básicos (Nahata, 2011). También según el pH, la molécula se encontrará en su forma ionizada o no ionizada y esto puede hacer que varíe tanto la intensidad, como la longitud de onda de emisión (Skoog et al., 2001). La última variable a tener en cuenta, es la concentración del analito, ya que es, a través de la intensidad de la señal, con la que se puede determinar su concentración, y por tanto realizar análisis cuantitativos (Nahata, 2011). El analito absorbe los fotones con los cuales pasa a estado excitado, al relajarse emite otro fotón con una longitud de onda mayor. La intensidad de esta señal es la que se usa para medir la concentración del analito, aplicando la siguiente fórmula: 𝐹 =𝐾´(𝑃0−𝑃) Donde F es la potencia de la emisión, K´ es una constante que depende de la eficacia cuántica del proceso, P0 es la potencia de la luz que incide en la muestra, y P la potencia de la luz que sale, al atravesar la longitud del medio (Skoog et al., 2001). Para relacionar esta fórmula con la concentración, se aplica la ley de LambertBeer, que relaciona la disminución de la intensidad de la señal con la concentración del analito (c) y la longitud del trayecto (b). 𝑃 𝑃0=10−𝜀𝑏𝑐 → 𝐴=log(𝑃0 𝑃)=𝜀𝑏𝑐 A es la absorbancia, P0 y P es la energía del haz cuando ha cruzado la celda con el blanco y con el analito, respectivamente, y ε es la absortividad molar de las moléculas fluorescentes. Al sustituir la primera ecuación en la segunda, es cuando se consigue relacionar la intensidad con la concentración, dando lugar a una tercera fórmula: 𝐹 =𝐾´𝑃0(1−10−𝜀𝑏𝑐) 15 Los espectros de fluorescencia se obtienen con equipos como el que se muestra en la Figura 4, compuesto por una fuente de luz, que emita en la región del espectro que se vaya a medir. Para asegurar que a la muestra le llega un haz de luz monocromática, dispone de un monocromador. El haz de luz incide en la muestra, que absorbe los fotones excitándose y la remite en todos los sentidos a una mayor longitud de onda. Esta energía emitida, vuelve a pasar por un monocromador. Se mide la luminiscencia producida, pero en un ángulo diferente al eje donde se encuentra la fuente, generalmente 90 (Rubinson y Rubinson, 2000). Por tanto, los espectrofluorímetros, pueden realizar espectros de emisión, en los cuales se excita a una longitud onda, y se hace un espectro de todas las longitudes de ondas emitidas. O también, un espectro de excitación, donde a la muestra llegan todas las longitudes de onda, y se selecciona una de emisión (Skoog et al., 2001). Figura 4. Componentes de un equipo de espectrofluorimetría. La principal ventaja de las técnicas de fluorescencia es la sensibilidad , es decir, la capacidad de detectar bajas concentraciones de analito fluorescente. Además, la mayoría de los espectrofluorímetros permiten realizar tanto espectros de emisión, como de excitación lo que ayuda a caracterizar los analitos utilizando ambos tipos de espectros. También destaca la sencillez de la técnica, ya que puede no requerir apenas manipulación de la muestra (Lakowicz, 1999). Por tanto, es una técnica muy usada en química verde ya que usa poca cantidad de muestra y de disolvente, evitando así los riesgos asociados a estos y la generación de residuos tóxicos y peligrosos para el medio ambiente. 16 2. OBJETIVOS El objetivo de este Trabajo Fin de Grado es desarrollar un método espectrofluorimétrico que permita establecer el estado de oxidación de los aceites de oliva vírgenes, basándose en sus espectros de emisión luminiscente y, posteriormente, predecir el tiempo de vida útil de los aceites. Este objetivo principal tiene una serie de objetivos parciales que consisten en:  Realizar un estudio de la vida útil del aceite de oliva virgen extra mediante el análisis espectrofluorimétrico de muestras almacenadas durante un periodo de tiempo en las condiciones habituales de un comercio.  Evaluar las modificaciones sufridas en los espectros debidas a los procesos oxidativos que se hayan producido durante el tiempo de almacenamiento, y relacionar estas modificaciones con los cambios químicos producidos en sus componentes mayoritarios y minoritarios.  Estudiar el efecto que ejercen distintas especies vegetales como el romero y la albahaca en el aceite de oliva virgen extra, y evaluar su capacidad para alargar la vida útil del aceite. 17 3. METODOLOGÍA 3.1. Muestras Para la realización de este Trabajo Fin de Grado se ha usado una muestra comercial de Aceite de Oliva Virgen Extra, de la variedad Manzanilla, que pertenece a la campaña 14/15. Se tomaron alícuotas de 100 mL, que se depositaron en recipientes de vidrio (Figura 5). En el caso de las muestras de aceite aderezado, se prepararon en los mismos recipiente con una cantidad de material vegetal (romero o albahaca) del 5 % p/p. La albaca (Ocimum basilicum, L.) y el romero (Rosmarinus officinalis, L.) previamente se secaron en estufa a 60 °C durante 10 horas. Se preparó un recipiente para cada mes dentro de las 3 series de muestras, con el fin de que no fuera necesario abrir el envase hasta el momento del análisis. A todos los recipientes se les dejó el mismo espacio de cabeza para que las muestras estuvieran en contacto con el mismo volumen de aire. Además, los recipientes se situaron en la misma estantería, a temperatura ambiente y con periodos de luz/oscuridad naturales, para asegurar que estuviesen en las mismas condiciones durante el estudio de los nueve meses (de enero a septiembre). Una vez al mes se retiró uno de los recipientes de cada tipo para llevar a cabo el análisis. En la Tabla 1 se describen las muestras analizadas. Figura 5. Muestras de aceite de oliva virgen dispuestas para la retirada de una muestra para cada análisis. 18 Tabla 1. Muestras de aceite de oliva virgen extra y aderezadas utilizadas en el estudio. CÓDIGO TIEMPO (MES) PLANTA AC 0 Control No AC 1 1 No AC2 2 No AC 3 3 No AC 4 4 No AC 5 5 No AC 6 6 No AC 7 7 No AC 8 8 No AC 9 9 No RM 1 1 Romero RM 2 2 Romero RM 3 3 Romero RM 4 4 Romero CÓDIGO TIEMPO (MES) PLANTA RM 5 5 Romero RM 6 6 Romero RM 7 7 Romero RM 8 8 Romero RM 9 9 Romero AL 1 1 Albahaca AL 2 2 Albahaca AL 3 3 Albahaca AL 4 4 Albahaca AL 5 5 Albahaca AL 6 6 Albahaca AL 7 7 Albahaca AL 8 8 Albahaca AL 9 9 Albahaca 3.2. Materiales e instrumentos Pipetas Pasteur de vidrio y plástico para la dispensación de las muestras. Cubeta de 3 mL de vidrio óptico no fluorescente, tipo nº101-0S, de 10 mm de paso óptico (Special Optical glass, Hellma). Espectrofluorímetro mod. RF-1501 Shimadzu Co® (Shimadzu Corporation, Analytical Intruments Division, Kyoto, Japón) (Figura 6). El espectrofluorimetro consta de una lámpara de Xenón de 150 W, monocromadores de excitación y emisión, y un detector. El equipo está conectado a un ordenador que controla el instrumento mediante el software PC-150x. 19 Figura 6. Espectrofluorímetro modelo RF-1501. 3.3. Procedimiento analítico Para realizar el análisis, con la ayuda de una pipeta Pasteur, se introducen 3 mL de muestra en el interior de la cubeta. Tras comprobar la inexistencia de burbujas en su interior, se introduce la cubeta en el compartimento del instrumento. Todas las muestras se realizaron por duplicado. Se utilizaron inicialmente tres longitudes de onda de excitación (ex) 330, 350 y 370 nm y se registró el espectro de emisión entre 220 a 900 nm. Todos los datos obtenidos se exportaron a una hoja de cálculo Excel. Antes de cada sesión de trabajo se realizó un blanco con agua ultrapura y se comprobó la relación señal/ruido y la intensidad de pico. La limpieza de la cubeta se realizó con hexano en primer lugar, posteriormente con metanol, después con detergente de marca Extran (Merck, Darmstadt, Alemania) y agua destilada, y finalmente con acetona. Para el secado de la cubeta se le aplicó una corriente de aire. 3.4. Tratamiento de datos Para el tratamiento de datos se utilizó el programa Excel como interfaz de la información proporcionada por el software del espectrofluorímetro y el programa estadístico Statistica versión 8.0 (Statsoft, Tulsa, OK). En este trabajo se han aplicado procedimientos estadísticos univariantes y multivariantes. 26 Estos resultados muestran que el espectro de emisión del aceite de oliva virgen a una ex = 330 nm contiene información relevante sobre su estado de oxidación y puede servir para evaluar la vida útil de los aceites. 4.3. Aceite de oliva aderezado (romero y albahaca) Se han registrado los espectros de emisión de las muestras de aceite aderezado con romero y albahaca en las mismas condiciones que el aceite sin aderezo. En la Figura 10 se muestra el espectro de emisión de los aceites aderezados y sin aderezar después de un mes de almacenamiento. Se observa el mismo perfil, desde un punto de vista cualitativo, en aceite aderezado que sin aderezar y se observan las tres zonas características. Aunque el aceite sin aderezo alcanzó valores de intensidad más altos que los aderezados, la aplicación de un ANOVA a los datos de las muestras del primer mes no mostró diferencias significativas entre ellas, probablemente porque este primer mes de almacenamiento no es suficiente el tiempo de contacto para que se produzca efecto de la presencia de las plantas aromáticas sobre el aceite. Figura 10. Espectro de emisión del aceite (Ac) y aceite aderezado con romero (Rm) y albahaca (Al) después de un mes de almacenamiento. Como en el caso del aceite sin aderezar se ha estudiado la evolución de los aceites durante los nueve meses de almacenamiento. Como se observa en las Figuras 11 y 12, correspondientes a romero y albahaca, respectivamente, hay variaciones de intensidad en las zonas del espectro, y estas variaciones son en el mismo sentido que 27 el aceite sin aderezar, es decir, se produce un aumento en la intensidad de fluorescencia durante el almacenamiento en las zonas I y II y una disminución en la zona III, aunque la intensidad de las bandas es menor en ambos casos que en el caso del aceite sin aderezar, sobre todo durante los primeros meses de almacenamiento (Figuras 11a y 12a), lo que indicaría una evolución más lenta de la oxidación en el caso de la presencia de las plantas, debido a la migración de compuestos antioxidantes desde el material vegetal hacia el aceite, que retrasa la aparición de compuestos de oxidación, lo que ha sido descrito por otros autores que describen la migración de. Esto está de acuerdo con lo encontrado por otros autores que reportan que los compuestos antioxidantes de las plantas pueden mejorar la estabilidad oxidativa de los aceites vegetales (Yong et al., 2016). Los espectros correspondientes a los 6-9 meses de almacenamiento (Figuras 11b y 12b) alcanzan también valores altos de intensidad de fluorescencia en presencia de las plantas pero los valores alcanzados están por debajo de los del aceite sin aderezar en muchas zonas del espectro. Del mismo modo que el aceite sin aderezar, se realizó un ANOVA, considerando la intensidad de fluorescencia de los aceites aderezados, y los resultados mostraron que el tiempo de almacenamiento tiene un efecto significativo (p<0,01) en la variación del espectro de emisión. Considerando las zonas del espectro de emisión, el ANOVA mostró que el tiempo de almacenamiento afecta de forma significativa a todas las longitudes de onda del espectro, en el caso del aceite aderezado con romero, y en el aceite aderezado con albahaca hay también un efecto significativo en todas las longitudes de onda del espectro excepto en el intervalo de 643 a 648 nm, zona en la que no aparece ninguna banda de interés. 28 Figura 11. Espectros de emisión del aceite aderezado con albahaca durante el almacenamiento: a) de 0 a 5 meses b) de 6 a 9 meses. a) b) 29 Figura 12. Espectros de emisión del aceite aderezado con romero durante el almacenamiento: a) de 0 a 5 meses b) de 6 a 9 meses. En todos los espectros estudiados se observó una disminución de la banda de la zona III correspondiente a los pigmentos clorofílicos y derivados, que corresponde a la degradación que sufren los pigmentos durante el almacenamiento de los aceites, debido a la oxidación, la acción de la luz y la temperatura, que origina la degradación a) b) 30 de las clorofilas que pasan a feofitinas y poteriormente a compuestos no coloreados, como ha sido demostrado por otros autores (Caponio et al., 2005). Al representar la intensidad de emisión del máximo de esta banda (677 nm) frente al tiempo, se observó una disminución de la intensidad de emisión en las tres matrices estudiadas, aunque la pendiente de esta disminución fue mayor para el aceite sin aderezar, se produce un mismo nivel de intensidad en los 3 casos a partir del sexto mes, lo que parece indicar que el efecto protector de la presencia de las plantas es mayor durante los primeros meses (Figura 13). Figura 13. Representación de la intensidad del máximo de la banda de la zona III (677 nm) frente al tiempo en las muestras de aceite sin aderezar y aderezado con romero y albahaca. 4.4. Aceite de oliva vs aceite aderezado: aplicación de estadística multivariante Con el fin de poner de manifiesto las posibles diferencias existentes entre las muestras almacenadas con y sin aderezo se aplicaron una serie de procedimientos estadísticos a los datos obtenidos. En primer lugar tras el ANOVA realizado con todas las longitudes de onda de los espectros de emisión se realizó un test de Brown-Forsythe que seleccionó las longitudes de onda que presentaban diferencias significativas (p<0,05) entre las muestras con y sin aderezo. Solo fueron seleccionadas longitudes de onda de la zona I, 31 correspondiente a la información aportada por tocoferoles y compuestos fenólicos (Tabla 4), compuestos antioxidantes de los aceites. Esto es probablemente debido a que es la zona del espectro que puede presentar más diferencias entre las 3 matrices ya que cuando se produce la oxidación los compuestos antioxidantes protegen de la alteración hasta que se degradan y en este caso, las muestras aderezadas deben tener un mayor contenido que las no aderezadas, lo que justifica la selección. Tabla 4. Longitudes de onda de emisión que presentan diferencias significativas (p<0,05) entre las muestras aderezadas y no aderezadas según el test de BrownForsythe. nm F p 361 4,703999 0,012655 362 4,573701 0,014166 363 4,469833 0,015505 364 4,295164 0,018057 365 4,127271 0,020921 366 4,055566 0,022284 367 3,992487 0,023559 368 3,840128 0,026957 369 3,681781 0,031030 370 3,356536 0,041515 Por último, se aplicó un análisis discriminante a los tres tipos de aceites en base a las los valores de emisión en las longitudes de onda seleccionadas por el test de Brown-Forsythe. El Análisis Lineal Discriminante (LDA) es un método de clasificación en la estadística multivariante que tiene como objetivo determinar hasta qué punto es posible separar dos o más grupos de muestras previamente establecidos, y qué variables son las que mejor discriminan entre ellos. Se obtuvo un porcentaje correcto de clasificación de un 71 % de las muestras, lo que significa que ese porcentaje de las muestras se clasifican correctamente en su grupo en base a las funciones de clasificación obtenidas, siendo las longitudes de onda de emisión de 361, 365, 366, 368 y 369 nm las variables con mayor peso (Figura 14). 32 La Figura 14 muestra el resultado del análisis discriminante, se observa que hay una separación entre las muestras aderezadas y no aderezadas, que podría explicarse por el diferente contenido de antioxidantes presentes en las matrices, la clasificación no es total porque las muestras esta también afectadas por el tiempo de almacenamiento lo que dificulta su total separación y favorece que se produzca algún desplazamiento de las muestras, pero en definitiva se detecta la presencia de dos grupos, uno constituido por el aceite y otro por las muestras aderezadas, lo que indica que existe información en los espectros que permite detectar esa diferencia. Aceite Aceite con aderezo romero Aceite con aderezo albahaca Root 1 Root 2 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -3 -2 -1 0 1 2 3 Figura 14. Separación de las muestras en base a los datos seleccionados por el test de BrownForsythe usando las funciones discriminantes calculadas. A la vista de los resultados obtenidos, se puede concluir que sería posible evaluar el estado de oxidación de un aceite en base a su espectro de emisión y diferenciarlo de muestras con diferente estado de oxidación, lo que profundizando más en este tipo de estudios podría dar lugar a una predicción del tiempo de vida útil de los aceites basándose en esta información. 33 5. CONCLUSIONES 1. Se ha seleccionado, en base a la precisión, tanto en condiciones de repetibilidad como de precisión intermedia, la ex de 330 nm para obtener el espectro de emisión y llevar a cabo el estudio de vida útil del aceite de oliva virgen y del aceite aderezado. 2. En el espectro de emisión del aceite de oliva virgen se selecionaron tres zonas que se corresponden con la concentración de compuestos fluoróforos, como tocoferoles, tocotrienoles, compuestos fenólicos, dienos y trienos conjugados, clorofilas y feofitinas. 3. Se producen variaciones significativas en la intensidad de emisión de las bandas durante los nueve meses de almacenamiento, debido posiblemente a la formación de compuestos de oxidación y la disminución en la concentración de pigmentos. Estas variaciones son más drásticas durante los primeros cinco meses de almacenamiento. 4. Los espectros de emisión de los aceites aderezados con romero y albahaca tienen el mismo perfil cualitativo. La variación en el espectro de emisión de los aceites aderezados durante el almacenamiento tiene una evolución más lenta, debido a la cesión de los compuestos antioxidantes de la planta. 5. Aplicando el test de Brown-Forsythe a los valores de intensidad de emisión se seleccionaron las longitudes de onda correspondientes a la primera zona del espectro (360-420 nm), relacionadas con la concentración de tocoferoles y compuestos fenólicos, como las más significativas para diferenciar los aceites con y sin aderezo. Por otra parte, el análisis discriminante permitió la clasificación parcial de los aceites. 6. Con la información del espectro de emisión es posible evaluar el estado de oxidación de un aceite, y profundizando más en este tipo de estudios, podría ser posible predecir el tiempo de vida útil. 34 6. BIBLIOGRAFÍA Alcalá A. Evaluación del tiempo de vida útil del aceite de oliva virgen y aderezado con plantas aromáticas mediante marcadores volátiles. Trabajo Fin de Grado. Universidad de Sevilla. 2016. Angerosa F, Servili M, Selvaggini R, Taticchi A, Esposto S, Montedoro G. Volatile compounds in virgin olive oil: Occurrence and their relationship with the quality. 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