Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada

5 Equation Chapter 1 Section 1 Trabajo Fin de Grado Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Dep. Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Autor: Ignacio Sánchez-Cid Artillo Tutor: José Antonio Pérez Carrasco Sevilla, 2018 3 Trabajo Fin de Grado Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Autor: Ignacio Sánchez-Cid Artillo Tutor: José Antonio Pérez Carrasco Profesor Contratado Doctor Dep. de Teoría de la Señal y Comunicaciones Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2018 5 Trabajo Fin de Grado: Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Autor: Ignacio Sánchez-Cid Artillo Tutor: José Antonio Pérez Carrasco El tribunal nombrado para juzgar el Trabajo arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2018 El Secretario del Tribunal 7 A mi familia A mis maestros 5 Agradecimientos En estas líneas tengo que agradecer a tanta y tanta gente que me ha ayudado a formarme. Quiero empezar por el profesor José Antonio Pérez Carrasco, por la oportunidad de realizar este Trabajo Fin de Grado con él y la paciencia que ha tenido ayudándome en todo. También a los profesores del Departamento de Psicología Experimental de la Universidad de Sevilla por dejarme participar en el experimento que realizan y por todas las facilidades que me han dado. Agradecer también a mi familia, a mis padres y hermanos, que me han ayudado en los momentos de más bajón y siempre han estado junto a mí. Me gustaría seguir agradeciendo a mis amigos de la carrera. Los que juntos hemos conseguido la meta que compartimos cuando empezamos. Ellos que no sólo han estado para pasar apuntes y explicarme lo que no entendía, sino que han estado también fuera de la Escuela. Agradecer a cada uno de los profesores que me han impartido alguna clase o práctica. De todos ellos saco algún aprendizaje que me han ayudado a superar la carrera. También agradecerles a mis amigos de la Hermandad de Los Estudiantes y del Servicio de Asistencia Religiosa de la Universidad de Sevilla, que me han complementado la formación. 5.4. Registro óptico de las señales generadas tras la estimulación 16 6 Aportación al experimento 21 7 El trabajo 23 8 Conclusiones 36 9 Posibles líneas de colaboración 40 Referencias 42 ix ÍNDICE DE TABLAS Tabla 7–1 Clasificación de los casos del experimento 130115002A 25 xi ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2-1. Pez Carpa Dorada. 3 Figura 3-1. Diferentes vistas del cerebro de los peces Carassius auratus. 6 Figura 5-1. Representación esquemática de la vista dorsal de un anillo con el telencéfalo expuesto. 15 Figura 5-2. Espectro de absorción y emisión del fluorescente sensible al voltaje Di-2-ANEPQ. 15 Figura 5-3. Principales componentes del equipo utilizado para registrarlas señales ópticas. 17 Figura 5-4. Sistema de imagen óptica y preparación experimental empleado. 18 Figura 5-5. Representaciones esquemáticas de diferentes procedimientos de comportamiento y el diagrama de temporización de imágenes ópticas. 19 Figura 7-1. Datos proporcionados correspondientes al frame 114 del experimento 070216003A. 23 Figura 7-2. Datos proporcionados correspondientes a las ROIs del experimento 130115002A. 24 Figura 7-3. Variables obtenidas con las siete ROIs y sus dimensiones. 24 Figura 7-4. Imagen sintética creada correspondiente al caso 32 del experimento 130115002A. 26 Figura 7-5. Imagen sintética coloreada para cada ROI. 26 Figura 7-6. Imagen proporcionada por el Dpto. de Psicología en la que se representan las ROIs. 27 Figura 7-7. Gráfica de los valores medios para el caso 7 del experimento 130115002A. 28 Figura 7-8. Información de partida del experimento 130115002A. 28 Figura 7-9. Cálculo de las PSD para el caso 7. 29 Figura 7-10. Cálculo y suavizado de las PSD para el caso 7. 29 Figura 7-11. Espectrograma para el caso 7. 30 Figura 7-12. Correlaciones cruzadas para el caso 7. 31 Figura 7-13. Correlaciones cruzadas de las señales “enventanadas” para el caso 7. 32 Figura 7-14. Imagen de actividad cerebral en el frame 681 para el caso 32 33 Figura 7-15. Imagen de actividad cerebral en el frame 75 para el caso 29 34 xiii Notación D Palio telencefa lico Dm Palio telencefa lico medial Dd Palio telencefa lico dorsal Dl Palio telencefa lico lateral Dp Palio telencefa lico posterior Dld Palio telencefa lico lateral dorsal Dlv Palio telencefa lico lateral ventral US Estímulo no condicionado CS ROI Estímulo condicionado Región de interés 1 1 EXPLICACIÓN DEL EXPERIMENTO l experimento que desde el Departamento de Psicología Experimental de la Universidad de Sevilla se lleva a cabo y en el que se basa este Trabajo Fin de Grado trata sobre la respuesta al dolor de un pez de la especie Carpa Dorada. En este experimento intentan observar los diferentes mecanismos de defensa que el pez activa cuando recibe un estímulo doloroso y la relación que tiene la memoria en el proceso de defensa ante estos estímulos dolorosos. Para ello, se registra la actividad cerebral del pez, y conociendo su estructura cerebral, se identifican las diferentes relaciones entre las distintas zonas de interés del cerebro del pez. También estudian cómo el pez aprende los estímulos dolorosos, como ejemplo de los dolores crónicos, que son los que se producen sin principio físico sino cerebral. Entre las muchas técnicas que existen para la detección de la actividad cerebral, los profesores del Departamento de Psicología realizan la técnica denominada de tintado, que consiste en aplicarle un tinte sensible al voltaje para detectar cambios en el potencial de membrana del pez y así poder registrar la actividad cerebral con la ayuda de un grupo óptico. Antes de realizar el procedimiento de adquisición de las imágenes, han de preparar al sujeto practicando una operación al pez. En primer lugar, se escoge un pez al que hacerle el experimento. Antes de pasarlo a la pequeña pecera en donde se realizará el experimento, el pez es pesado para que posteriormente obtengamos las proporciones de anestia adecuadas. Se mezcla agua de la propia pecera con una concentración de analgésico. Una vez que el pez está “dormido” se inicia la cirugía. Se retira la piel necesaria para permitir ver con claridad el telencéfalo. Esta es una parte muy importante en la realización del experimento pues es la que nos va a permitir que los datos que obtengamos sean buenos o no. Es importante no excederse con la extracción de la piel, ya que podemos dañar la superficie del telencéfalo, lo que invalidaría los resultados que obtuviéramos, o que no quitemos la piel suficiente y que partes del telencéfalo del pez no se vean con claridad, dando nuevamente resultados erróneos. Es por ello, que esta primera parte del experimento sea la más lenta y delicada de todas ellas. Una vez finalizada la parte de la cirugía, comenzamos a “despertar” al sujeto de la anestia que se le administró anteriormente. Para ello vamos poco a poco cambiando el agua que tiene en la pecera. Retiramos la disolución de agua con el analgésico, sustituyéndola por agua de la pecera en la que se encontraba al comienzo. Pasado un breve intervalo de tiempo podemos ver que el pez empieza a reaccionar a diferentes estímulos, como pueden ser la luz, un pequeño pinzamiento en la piel…, y vemos que reacciona con bradicardias y con intentos de “huida”. Tras el proceso del “despertar” del sujeto comienza la parte de la detección del umbral del dolor del pez, es decir, del límite en el que se encuentra la respuesta que tiene el sujeto a diferentes estímulos dolorosos. Para ello se le administran una serie de pulsos eléctricos de diferente voltaje para detectar su umbral. Los pulsos que se utilizan son dos: • Una delta de corta duración. E Explicación del experimento 2 En este primer caso obtenemos una mejor respuesta ya que es más natural. • Un tren de pulsos. Una vez que se han obtenido los umbrales para los dos tipos de pulsos, se inmoviliza el pez. En esta ocasión no se “duerme”, sino que tenemos que paralizarlo. Para conseguirlo utilizamos un veneno de serpiente denominado curare, capaz de inmovilizar los movimientos del sujeto sin que se resienta su actividad cerebral. Con esto conseguiremos que las mediciones que se realicen sean válidas, puesto que estaremos tomando los cambios de potencial en una “imagen fija” en diferentes instantes de tiempo, evitando los movimientos propios del pez. Para finalizar la preparación del experimento hemos de teñir el telencéfalo del pez. Utilizaremos un fluorocromo, una enzima citocromo-oxidasa, sensible al voltaje. Este tinte será expuesto a una luz verde y reflejará una luz roja que será captada por el grupo óptico. Cuando el telencéfalo es expuesto a la luz, podemos observar reflejado los diferentes cambios en el potencial de membrana, que es el que nos indica que ha habido una actividad cerebral. Por último, hemos de comentar que para que los datos recogidos correspondan sólo al telencéfalo, se cubre la pecera completa, incluído el pez, a excepción de la zona del telencéfalo, con una pequeña lona. También se cubre para que el sujeto no sea capaz de ver la luz y active así zonas de su cerebro correspondientes a la zona visual, sino que sólo active zonas que se correspondan con los diferentes pulsos que se utilizan para el experimento. Una vez que el tintado ha sido absorbido correctamente, comenzamos a registrar los diferentes casos que componen el experimento. 3 2 ESPECIFICACIONES Este capítulo es un breve resumen de las especificaciones de los diferentes recursos utilizados en este experimento. Estas especificaciones han sido proporcionadas por el profesor F.Ocaña del Departamento de Psicología Experimental. 2.1. El pez El pez que vamos a utilizar, como ya se ha comentado anteriormente, será una Carpa Dorada1, Carassius auratus, que es una especie de agua dulce de la familia Cyprinidae. Es una especie nativa de Asia oriental, con el interés de poder vivir en estanques. El principal motivo por el que desde el Departamento de Psicología Experimental utilizan dicha especie es porque era la más fácil de adquirir, además de no requerir cuidados. Y por el conocimiento que han adquirido sobre la fisiología y la conducta del pez. También hemos de comentar que se están realizando nuevos experimentos con una especie con mucha importancia en investigación en los últimos años, que es el denominado pez cebra, Danio Rerio. En el experimento utilizamos la variedad de esta especie más conocida, cometa. Su forma es de cuerpo alargado, con aletas desarrolladas. Tiene una aleta anal y una caudal bifurcada. El resto de las aletas tienen forma puntiaguda. Viven entre los 7 y los 14 años. Es una especie muy activa y voraz, de nado rápido, muy resistente y adaptable a cualquier situación. Son muy sociables y alcazan un gran tamaño rápidamente, hasta 20 centímetros, sin contar la cola. Suelen ser de color rojo o rojo y blanco. En la siguiente figura presentamos un ejemplar del pez. Figura 2-1. Pez Carpa Dorada. Antecedentes teóricos 10 4.1.2 Autocorrelación. En el caso especial en que y(n) = x(n), tenemos la autocorrelación de x(n), que se define como la secuencia o, de forma equivalente, como 4.1.3 Propiedades 1. 𝑟 𝑥𝑥(0) = 𝐸𝑥 y 𝑟 𝑦𝑦(0) = 𝐸𝑦, que son las energías de x(n) e y(n), respectivamente. Esto significa que la secuencia de autocorrelación de una señal alcanza su valor máximo para un retardo de cero. Este resultado es coherente con la idea de que una señal se corresponde de forma perfecta consigo misma para un retardo igual a cero Y las propiedades que hemos comentado anteriormente 2. la correlación cruzada satisface la propiedad 𝑟 𝑥𝑦= 𝑟 𝑦𝑥(−𝑙) 3. Si y(n) = x(n), esta relación se convierte en la siguiente importante propiedad para la secuencia de autocorrelación 𝑟 𝑥𝑥(𝑙) = 𝑟 𝑥𝑥(−𝑙) 4.2. Análisis en frecuencia En esta sección vamos a describir en qué consiste el análisis en frecuencia 22. El motivo fundamental de desarrollar estas herramientas para llevar a cabo el análisis en el dominio de la frecuencia es proporcionar una representación matemática y gráfica de las componentes de frecuencia contenidas en una determinada señal 4.2.1 Transformada de Fourier Sea x(t) una señal como con la que estamos realizando este Trabajo. Ahora definimos una función X(F), denominada transformada de Fourier de x(t), como Para el cálculo de la transformada de Fourier haremos uso de la función ya implementada en el toolbox del procesamiento de señales de MatLab, fft. 4.2.2 Transformada de Fourier de tiempo reducido En esta sección vamos a describir una variante de la transformada de Fourier, la Transformada de Fourier de tiempo reducido. Esta variante se basa en el análisis de señales no estacionarias, como son las señales de nuestro experimento, en el que no podemos identificar un patrón que se repita. Este tipo de análisis se basa en el desplazamiento de una ventana que realiza el análisis en frecuencia del tramo de señal que se encuentra enventanada. Una de las características de este tipo de análisis se encuentra en el desplazamiento de la ventana en el que es común, como realizamos en este Trabajo, que se fuerce un solapamiento de las ventanas para que se incluya el análisis de las discontinuidades entre las tramas. 11 Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Para el cálculo del espectrograma de la Transformada de Fourier de tiempo reducido utilizaremos la función spectrogram que ya viene implementada en el toolbox de procesamiento de la señal de MatLab. Antecedentes teóricos 12 13 5 EL MÉTODO EMPLEADO n este capítulo vamos a comentar en qué consiste el experimento que desde el Departamento de Psicologia de la Universidad de Sevilla realizan. El experimento registra la actividad telenfálica palial de peces del tipo Carpa Dorada durante el acondicionamiento clásico emocional del ritmo cardíaco. Este capítulo ha sido facilitado por el profesor F. Ocaña del Departamento de Psicología Experimental, de una contribución a un congreso que se tituló Voltage-Sensitive Dye Imaging of Goldfish Pallial Telencephalic Activity During Emotional Classical Heart Rate Conditioning 2. Este experimento está motivado por un objetivo constante de la neurociencia, que es comprender los sustratos neuronales del aprendizaje emocional y la memoria. Dentro de los diferentes tipos de experimentos en los que se persigue dicho estudio, el entrenamiento asociativo como condicionamiento clásico en el que un estímulo neutral llamado estímulo condicionado (CS) se combina con un estímulo no condicionado (US) aversivo, se ha utilizado ampliamente para producir un sólido aprendizaje del miedo. Después de algunas presentaciones emparejadas de CS-US, los animales desarrollan respuestas preparatorias y emocionales al CS, es decir, comportamiento de congelación y cambios relacionados en la fisiología del cuerpo como desaceleración de la frecuencia cardíaca (bradicardia condicionada). Evidencias considerables indican que, en los mamíferos, la amígdala palial juega un papel central en el condicionamiento del miedo, por ejemplo, cuando se usa un tono y una descarga eléctrica suave como CS y US, respectivamente, como es el caso del experimento sobre el que se ha realizado este Trabajo. 19,23 Por otro lado, la evidencia experimental muestra que las regiones neocorticales que responden al CS (es decir, la corteza auditiva) también están involucradas en el condicionamiento auditivo del miedo, particularmente en la adquisición, retención y recuperación de recuerdos específicos de señales acústicas. Por tanto, se ha comprobado que las lesiones inmediatas posteriores al entrenamiento de la corteza auditiva interrumpen el condicionamiento del miedo y que la recuperación de memorias remotas de miedo depende de las cortezas auditivas secundarias. A pesar de los datos sobre la participación de la amígdala en los mamíferos y el área primaria auditiva neocortical en el condicionamiento clásico del miedo, se sabe poco sobre el papel de las distintas regiones telencefálicas paliales de peces teleósteos en el aprendizaje emocional y la memoria. 24 La eversión, es decir, la flexión hacia afuera de las paredes distales de la vesícula prosencefálica, en el proceso único de desarrollo del telencéfalo teleósteo que, entre otras características, produce la reversión de la topografía paliada observada en los no actinopterigios, ha obstaculizado históricamente la comparación de teleósteos y el telencéfalo de mamíferos, y en definitiva, con la humana. 6,15,16,25 Aunque estudios recientes, basados en las similitudes en el patrón de expresión génica, la distribución neuroquímica y en la evidencia de desarrollo, neuroanatómica y funcional, indican que al menos parte de la región medial del área dorsalis telencephali (Dm) podría considerarse homólogo de la amígdala de mamíferos. De hecho, numerosos estudios han demostrado que la Dm de peces del tipo Carpa Dorada, como la amígdala de los mamíferos, juega un papel importante en el aprendizaje emocional y la memoria. Por ejemplo, las lesiones en Dm, pero no en la división lateral del área dorsalis telencephali (Dl), es decir, el homólogo de la región del E El método empleado 14 teleósteo más probable del hipocampo, dificultan la adquisición y retención de la evitación condicionada en el pez Carpa Dorada. 17 Datos recientes indican que la región Dm de la Carpa Dorada podría ser una división heterogénea que comprende no sólo un área homóloga a la amígdala de mamífero, sino que también contiene áreas sensoriales discretas comparables a las presentes en la neocorteza. En esta línea, algunos estudios han demostrado que la Dm de varios peces tiene conexiones recíprocas con los núcleos preglomerular y talámico, es decir, los principales núcleos de estación de retransmisión para información auditiva, mecanoreceptiva, electroreceptiva, de sabor y somática. Además, el mapeo de la actividad del palio de la Carpa Dorada, por medio de imágenes de tinte sensible al voltaje, ha revelado que puede haber un palio sensorial en los peces del tipo Carpa Dorada y se organiza de una manera cortical. En conjunto, estos experimentos sugieren que la información auditiva, somatosensorial y gustativa, está representada en diferentes zonas dentro de la porción dorsal de Dm. Específicamente, el área auditiva primaria parece estar ubicada inmediatamente caudal a la comisura anterior y al surco caudal. Además, la región sensorial palpable auditiva del pez dorado parece estar organizada topológicamente ya que los tonos de diferentes frecuencias activan dominios paliales específicos dentro del área auditiva. 2,6 En el presente experimento intentamos investigar más a fondo la base neuronal del miedo al condicionamiento clásico en peces del tipo Carpa Dorada. Como las regiones consideradas homólogas tanto a la amígdala de mamífero (Dmv) como a la corteza auditiva (Dmc) son accesibles desde una vista dorsal del palio de este tipo de peces, utilizamos imágenes de colorante sensibles al voltaje in vivo durante el condicionamiento clásico de miedo auditivo. Este enfoque metodológico permite el registro simultáneo de actividad en diferentes poblaciones de neuronas con alta resolución espacio-temporal. Con este propósito, desarrollamos una preparación en la que pudimos simultáneamente registrar la actividad paliativa evocada por un tono de 1000 Hz (CS) antes y después de emparejarse con un estímulo incondicionado (descarga eléctrica en la base de la aleta dorsal del pez Carpa Dorada). Además, registramos la actividad evocada CS después de la extinción de la bradicardia condicionada adquirida. 26 5.1 Sujetos En primer lugar realizaremos una breve descripción de los peces a los que se le va a realizar el experimento. La especie con la que vamos a trabajar, como ya se ha mencionado anteriormente, es la Carpa Dorada (Carassius auratus) de 10 a 12 cm de longitud, medido desde la boca hasta el comienzo de la aleta caudal. Se obtuvieron del vivero de la Universidad de Sevilla y se mantuvieron en grandes tanques de 200 litros con agua aireada y filtrada a 20 ± 1 ºC. Los acuarios se encontraban en un animalario provisto de un ciclo de iluminación de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Desde al menos un mes antes al inicio de los experimentos, los animales se mantuvieron en pequeños grupos. Fueron alimentados una vez al día con comida para peces de estanque. Hemos de comentar que el uso y la manipulación de los animales fue llevado a cabo siguiendo la directiva 86/609/EEC del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 y el Real Decreto 1201/2005. 5.2 Procedimiento quirúrgico Antes de comenzar con la cirugía, los animales se anestesiaron por inmersión en una solución 1: 20000 de metanosulfonato de tricaína y luego se colocaron en una cámara experimental. Un tubo ajustable conectado a una bomba e insertado en la boca aseguraba un flujo constante de agua aireada a través de las branquias. La concentración de anestesia en el circuito de agua se mantuvo constante durante el procedimiento quirúrgico. Los animales fueron colocados en el tanque experimental y permanecieron parcialmente cubiertos de agua e inmovilizados entre dos almohadillas curvas colocadas detrás de sus branquias. Cada pez Carpa Dorada estaba envuelto en una gasa estéril para mantener la piel húmeda durante todo el experimento. La piel dorsal y el cráneo que cubre el telencéfalo se eliminaron cuidadosamente con un microscopio binocular (SZ61, Olympus). Una vez retirada la piel, se realizó una craneotomía en la región dorsal a dichos hemisferios. Posteriormente, se aspiró 15 Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada el tejido adiposo subyacente y se eliminó la tela coroidea del ventrículo telencefálico para exponer el telencéfalo. Después de la cirugía, se eliminó el anestésico al reemplazar el agua en la cámara. La recuperación de un estado de alerta se evidenció por la reaparición de la respiración espontánea y los movimientos de los ojos y las aletas. Figura 5-1. Representación esquemática de la vista dorsal de un anillo con el telencéfalo expuesto. Las líneas punteadas muestran ypsiloniforme (ys) y caudal (cs) 5.3 Fluorescente sensible al voltaje El colorante sensible al voltaje (VSD) que se utilizó fue el Di-2-ANEPEQ debido a su alta solubilidad en agua, altas propiedades de difusión y alta sensibilidad a bajos niveles de voltaje, buena relación señal-ruido, pequeña disminución de la fluorescencia a lo largo del tiempo y por ser considerados las moléculas más sensibles para detectar cambios en el potencial de membrana, del orden de milisegundos. Figura 5-2. Espectro de absorción (verde) y emisión (rojo) del fluorescente sensible al voltaje Di-2ANEPQ. En la parte superior se muestra la estructura química del fluorescente. Se preparó una solución madre de tinte disolviendo la VSD en agua destilada a 0,5 mg/ml. La solución madre se diluyó en solución de Ringer Goldfish (NaCl 116 mM, KCl 2,9 mM, CaCl2 1,8 mM y HEPES 5 mM, pH = El método empleado 16 7,2; todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich) hasta una concentración final de VSD de 50 μg/ml y utilizado como una solución de tinción diaria. Se aplicó tópicamente un volumen de 100 μl de solución de tinción al telencéfalo expuesto durante aproximadamente 45 minutos. Después de la tinción, el telencéfalo se lavó cinco veces con solución de Ringer para eliminar el colorante no unido y se mantuvo húmedo con la misma solución de Ringer para peces Carpa Dorada. Para la sesión de grabación, los peces se inmovilizaron con una inyección intraperitoneal de curare (Flaxedil), que es un agente encargado de bloquear la unión neuromuscular, (0,002 mg/g de peso corporal de los animales, cloruro de d-tubocurarina, Sigma-Aldrich) para eliminar los artefactos causados por los movimientos corporales. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del comité ético de experimentación de la Universidad de Sevilla y de conformidad con la Directiva 86/609 / CEE del Consejo de las Comunidades Europeas y la legislación española (R.D. 53/2013). 5.4 Registro óptico de las señales generadas tras la estimulación Las imágenes ópticas se adquirieron usando un sistema comercialmente disponible, MiCAM01 desarrollado por Brain Vision. El microscopio de epi-fluorescencia se montó en una mesa aislada de vibraciones para reducir el ruido del movimiento. La epi-iluminación para excitar el VSD fue proporcionada por una lámpara halógena de tungsteno de 150 W. El haz de luz se pasó a través de un filtro de excitación de 530 ± 3 nm y luego a través de la guía de luz, que estaba equipada con un condensador y un espejo dicroico. El espejo refleja el haz de luz de excitación a través de la lente del objetivo para iluminar el telencéfalo. Las señales de VSD emitidas desde el palio teñido se filtraron con paso largo > 590 nm y se recogieron con una cámara CCD con un área de imagen de 2,9 x 2,1 mm que constaba de 90x60 píxeles. El microscopio estaba equipado con un objetivo de 0,63x (NA = 0,082, PLAN APO; Leica Microsystems) y una lente de proyección 1x, por lo que el sensor de imagen cubrió un área de 4,6 x 3,3 mm. El campo de formación de imágenes se centró en la superficie dorsal del telencéfalo con el eje de la cámara perpendicular a esta superficie. El plano de enfoque estaba 200 μm por debajo de la superficie del palio telencefálico. Las imágenes se adquirieron con el software MICAM a 200 Hz (5 ms / cuadro). Para evitar el efecto contaminante causado por la apertura del obturador en las respuestas grabadas, la adquisición de imágenes se inició 300 ms después de que se abriera el obturador de iluminación. Durante cada prueba, las señales de VSD se recolectaron durante 3400 ms. Se incluyó un período de 100 ms antes de que se iniciara la estimulación. Cada prueba se registró de forma independiente y luego se promedió para mejorar la relación señal/ruido. 17 Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Figura 5-3. Principales componentes del equipo utilizado para registrar las señales ópticas. a, microscopio de fluorescencia, b; videocámara de alta velocidad; c, fuente de iluminación; d, controlador del obturador de la fuente de iluminación; e, interfaz de conexión entre el ordenador personal y la videocámara digital; f, ordenador personal. El entrenamiento se realizó dentro de una cámara atenuada colocada en la mesa aislada de vibraciones. Un vinilo gris opaco cubría todo el animal a excepción del cerebro expuesto y una iluminación constante durante el entrenamiento fue proporcionada por una luz colocada debajo de la cabeza del animal (250 lux), evitando que el animal viera la luz verde dispuesta por el aparato de formación de imágenes ópticas. Se utilizó un tono puro de 3200 ms, 70 dB y 1 kHz como estímulo condicionado (CS). El tono fue generado por un estimulador auditivo y presentado por un altavoz, colocado en el aire aproximadamente 50 cm detrás y por encima de la cabeza del animal. El nivel de presión acústica (SPL) se calibró usando un sonómetro digital. La bomba de agua y el aireador colocados en el lado posterior de la cámara generaron un ruido de fondo de 60 dB. El estímulo incondicionado (US) consistió en una descarga eléctrica leve (duración del tren, 100 ms; frecuencia del pulso, 50 Hz; intensidad de corriente, 1-5 mA) proporcionada por un electrodo bipolar de acero inoxidable con un diámetro de 100 μm que se habían implantado subdérmicamente en el lado izquierdo del extremo rostral de la aleta dorsal. La presentación de los estímulos fue controlada por programas de ordenador. El método empleado 18 Figura 5-4 Sistema de imagen óptica y preparación experimental empleado Los animales fueron entrenados durante tres fases consecutivas: habituación, adquisición y extinción. Inicialmente el pez recibió 16 presentaciones del tono puro para asegurar su habituación a los estímulos auditivos y su baja capacidad de respuesta. Después de esta fase de habituación, los animales del grupo emparejado se entrenaron en un procedimiento de acondicionamiento clásico temeroso con 60 ensayos en los que el tono puro (CS) siempre se emparejó con el choque (US), excepto una prueba de cada 10 ensayos. El US se entregó 3100 ms después del inicio del CS, se superponía en el tiempo y coterminaba. Después de estos ensayos, se presentaron 8 pruebas emparejadas adicionales durante las cuales se realizó la obtención de imágenes ópticas. Se realizó una sesión de extinción (60 presentaciones solo de CS) después del acondicionamiento para evaluar una posible disminución de la frecuencia cardíaca a repetidas presentaciones solo de CS. Al final de la extinción, los animales pasaron por una última presentación de 8 ensayos con CS sólo para fines de imágenes. Con respecto al grupo no apareado, los procedimientos de comportamiento se llevaron a cabo como se describe anteriormente, excepto en la fase no emparejada. Durante esta fase, se usaron presentaciones no emparejadas de CS y US. Para todas las fases de este experimento, el intervalo entre ensayos para el grupo emparejado varió aleatoriamente entre 60 y 120 s, con una media de 90 s, para evitar el condicionamiento a los estímulos temporales. Para la fase de pseudocondicionamiento del grupo no emparejado, el intervalo entre ensayos varió aleatoriamente entre 30 y 60 s, con una media de 45 s. Todas las fases se llevaron a cabo en un solo día. Para controlar la frecuencia cardiaca, se colocaron electrodos de copa bipolares de plata debajo de las aletas pectorales a ambos lados de la cavidad torácica ventral, mientras que el cable de tierra permaneció suelto en el agua del tanque. La señal electrocardiográfica (ECG) se amplificó a 50,000x y se filtró paso de banda entre 0,1 Hz y 50 Hz mediante un amplificador diferencial. Se digitalizó a 500 Hz mediante un convertidor A/D y se almacenó para el análisis fuera de línea. 19 Procesamiento mediante Matlab de imágenes de actividad cerebral en pez Carpa Dorada Figura 5-5 Representaciones esquemáticas de diferentes procedimientos de comportamiento y el diagrama de temporización de imágenes ópticas El trabajo 26 Figura 7-4. Imagen sintética creada correspondiente al caso 32 del experimento 130115002A Para facilitar también su visualización, a partir de la imagen sintética creada, la “coloreamos” separando cada una de las regiones de interés que tiene el cerebro del pez. Obtenemos finalmente una imagen como la que se muestra a continuación. Figura 7-5. Imagen sintética coloreada para cada ROI. Como podemos observar de la figura anterior, la ROI1 ha sido coloreada en color rojo, la ROI2 de color magenta, la ROI3 en color azul, la ROI4 en color verde, la ROI5 en color amarillo, la ROI6 en color cián y la ROI7 en color blanco. Hemos intentado mantener el mismo criterio de colores que la imagen de las ROIs que fue proporcionada por los profesores del Departamento de Psicología Experimental de la Universidad de Sevilla. Como podemos 27 observar entre las figuras 6-5 y 6-6, las únicas ROIs que no mantienen su color original son la cinco y la siete, que hemos empleado los colores amarillo y blanco por facilitar la programación de las gráficas de la correlación que detallaremos posteriormente. Pero para el resto de ROIs se ha mantenido este criterio. Además, hemos intentado mantener este código de colores durante toda la realización del trabajo siempre que hemos tenido que realizar alguna visualización de datos. Figura 7-6. Imagen proporcionada por el Dpto. de Psicología en la que se representan las ROIs. Como podemos observar sólo tenemos la zona izquierda del cerebro del pez. Esto se debe a que, según nos comentaron los profesores de Psicología, la zona derecha es complementaria. Para reducir el uso de los datos a manejar no hemos replicado la información y sólo trabajaremos con la mitad del cerebro del pez. En primer lugar realizamos una representación temporal de cada uno de los casos, representando los valores medios de cada una de las ROIs para cada uno de los 32 casos. A estos valores medios les restamos el valor medio obtenido de los cien primeros milisegundos que son en los que no se produce ninguna actividad. Con esto eliminamos el valor basal y obtenemos unos valores de actividad mucho más reales. Además, realizamos un suavizado de esta nueva señal de valores medios para obtener una señal menos “ruidosa”. El trabajo 28 Figura 7-7. Gráfica de los valores medios para el caso 7 del experimento 130115002A. En la figura anterior representamos en color azul la señal original de valores medios, y representada de color rojo la señal suavizada. Hemos mantenido ambas gráficas porque hay picos que se ven atenuados al suavizar la gráfica y mostrando ambas podemos comprobar cuál es la tendencia que sigue la ROI en cada uno de los casos y ver los picos más abruptos de los que se producen. Como mencionamos con anterioridad el dato de valor medio será con el que fundamentalmente trabajemos. A continuación iniciamos el análisis en el dominio frecuencial. Toda esta parte del trabajo la realizaremos con ayuda de la función “dominioFrecuencial”. Lo primero que hemos de mencionar es la frecuencia a la que trabajaremos, esto lo obtenemos de la información de la realización del experimento que fue proporcionada por los profesores del Departamento de Psicología Experimental, y que se muestra en la figura que se encuentra bajo estas líneas. Figura 7-8. Información de partida del experimento 130115002A. Una vez determinada la frecuencia en la que trabajaremos vamos a calcular la Densidad Espectral de Potencia, 29 a partir de este momento PSD, de cada una de las ROIs para todos los casos. Así obtenemos un par de valores, el primero la PSD y el segundo la frecuencia de esa PSD. El resultado de este cálculo es una señal muy ruidosa”, como se muestra en la siguiente figura. Figura 7-9. Cálculo de las PSD para el caso 7. Para solucionar esta señal tan ruidosa hacemos uso de la función “suavizadoSenal”, que realiza un suavizado de esta señal, calculando el valor medio de cada uno de los puntos con sus cuatro vecinos adyacentes (dos anteriores a él y dos posteriores). Realizando esto obtenemos una señal mucho más suave de la que podemos extraer mucha más información. Este resultado se encuentra en la figura siguiente que podemos comparar con la señal sin suavizar que se encuentra en la figura 6-9. Figura 7-10 Cálculo y suavizado de las PSD para el caso 7. Seguidamente identificamos el valor de algunos picos máximos de las funciones anteriores, así como a la frecuencia a la que se dan. Con esto conseguimos identificar las frecuencias fundamentales de trabajo de cada El trabajo 30 una de las ROIs, y además la relación que tienen éstas con las frecuencias del resto de ROIs, es decir, si una región hace trabajar a otra a su misma frecuencia. También hemos calculado el espectograma a partir de los valores medios de cada una de las ROIs para poder identificar con mayor facilidad las componentes frecuenciales más marcadas. En la siguiente imagen podemos ver un resultado de este procedimiento que acabamos de describir. Destacar en la quinta figura una frecuencia muy marcada alrededor de los 40Hz y que se mantiene durante todo el tiempo Figura 7-11. Espectograma para el caso 7. A continuación calculamos, por curiosidad, las correlaciones entre cada una de las señales de las ROIs dos a dos, para comprobar si existe una componente de contínua en general. Para ello haremos uso de la función “correlacion”. Para este caso también haremos uso, como valor de entrada, de los valores medios obtenidos al comienzo del trabajo. También usaremos una variable tiempo comprendida entre los -3,4 y los 3,4 segundos, separados cada 0,005 segundos. Esto lo hemos determinado así porque la duración del experimento es de 3,4 segundos con una tasa de muestreo cada 5 milisegundos. En esta función además de cada una de las correlaciones cruzadas dos a dos, hemos calculado el tiempo de máxima correlación, como el valor que toma en ese tiempo. Esta información la representamos en gráficas, caso a caso, en la que en cada una de las gráficas representamos en color rojo la correlación de la ROI correspondiente con la ROI1; en color magenta la correlación con la ROI2; en color azul la correlación con la ROI3; en color verde la correlación con la ROI4; en color amarillo la correlación con la ROI5; en color cián la correlación con la ROI6 y finalmente en color negro la correlación con la ROI7. Como podemos observar hemos mantenido, como dijimos antes, el código de colores cambiando únicamente el color de la ROI7 de blanco a negro. También hemos representado en la gráfica con el símbolo ‘*’ el valor máximo que adquiere cada una de las correlaciones, siguiendo el código de colores que ya hemos comentado. Un ejemplo de una de las gráficas que obtenemos es la que representamos a continuación. 31 Figura 7-12 Correlaciones cruzadas para el caso 7. Además hemos identificado los valores máximos de cada una de las correlaciones, así como el instante de tiempo en el que estos se producen. Gracias a esto podemos relacionar la actividad de cada una de las ROIs con el resto. Con este análisis podemos establecer qué región se activó antes o después que la región a la que le realizamos el estudio, así como la intensidad de activación, descartando las señales con un nivel bajo. Para finalizar con el cálculo de los datos, hemos proporcionado una variante para las correlaciones. En este caso lo que hemos realizado es el análisis “enventanando” las señales en bloques de 100 milisegundos y calcular el máximo de la correlación entre las señales “enventanadas”. Con esto obtenemos resultados más precisos sobre la similitud entre las señales de diferentes ROIs. Además este método es mejor que el cálculo anterior de las correlaciones, ya que las señales de nuestro experimento son señales no estacionarias, no siguen un patrón que se repita. Un ejemplo del resultado del cálculo anterior es el que se muestra en la siguiente figura. El trabajo 32 Figura 7-13 Correlaciones cruzadas de las señales “enventanadas” para el caso 7. 33 Finalmente hemos representado la actividad cerebral del pez según el valor que toma cada uno de los píxeles. Esta actividad ha sido registrada en un pequeño vídeo que será reproducido durante la defensa de este trabajo. En este vídeo podemos ver la actividad cerebral del pez representando diferentes niveles de actividad según el valor que toma cada píxel en proporción al nivel máximo de la ROI a la que pertenece. Así hemos decidido tener seis niveles de actividad. El primer nivel corresponde con la falta de actividad, esto es cuando el valor del píxel está por debajo del 10% del total. El segundo nivel corresponde con un nivel mínimo, esto es cuando el valor del píxel está comprendido entre un 10% y un 20%. El tercer nivel hace referencia a un nivel bajo que es cuando el valor del píxel está comprendidod entre un 20% y un 40% del total. El cuarto nivel corresponde con un nivel medio de activación que está asociado a un nivel del píxel entre el 40% y 60% de la actividad total. El quinto nivel corresponde con un nivel alto de activación y se utiliza cuando el nivel del píxel está comprendido entre el 60% y el 80%. Por último, encontramos el máximo nivel de activación que se produce cuando el nivel del píxel es superior al 80% del total de activación de la ROI a la que pertenece. Para representarlo, hemos mostrado cada una de las imágenes de los 32 casos que componen el experimento y sobre esta imagen, que es similar a la que podemos observar en la figura 7-4, hemos representado cada uno de los píxeles que están incluidos en las ROIs con el símbolo ‘*’. A este símbolo le hemos asociado un color según el nivel de activación al que pertenece. Así, hemos asociado el primer nivel de activación con la ausencia de color, el segundo nivel con el color azul, el tercer nivel con el color verde, el cuarto nivel con el color amarillo, el quinto nivel con el color rojo y el último nivel de activación con el color magenta. Un ejemplo de una imagen que obtenemos es la que se muestra a continuación. Figura 7-14 Imagen de actividad cerebral en el frame 681 para el caso 32. Por último hemos representado los diferentes niveles de activación de la actividad cerebral del sujeto siguiendo el mismo código de colores que hemos utilizado para la representación anterior. En este caso la representación ha sido realizada a cada una de las regiones completas como hemos representado en la siguiente figura. El trabajo 34 Figura 7-15 Imagen de actividad cerebral en el frame 75 para el caso 29. 35 8 CONCLUSIONES Este capítulo ha sido proporcionado por los profesores del Departamento de Psicología Experimental a la luz de los resultados que les hemos proporcionado como resultado de este Trabajo Fin de Grado. Como se menciona en las siguientes líneas, estas conclusiones son un indicio del comportamiento del sujeto al ser sometido a este experimento. Todas estas conclusiones deben ser contrastadas con nuevos datos, con nuevos experimentos. El sujeto cuya actividad cerebral se ha estudiado fue sometido a un procedimiento de condicionamiento clásico o Pavloviano en el que se presentó un estímulo auditivo como estímulo condicionado y un breve estímulo eléctrico como estímulo condicionado. El procedimiento de condicionamiento constó de una primera fase de habituación en la que se presentó el estímulo condicionado en solitario hasta la adaptación de la respuesta de orientación, seguida de una fase de condicionamiento en la que el estímulo condicionado e incondicionado se presentaron correlacionados, y finalmente una fase de extinción en la que el estímulo condicionado se presentó de nuevo en solitario sin asociar al estímulo incondicionado. - A nivel conductual, durante la fase de habituación se produjo la adaptación o habituación de la respuesta de orientación, medida a través de la disminución de las respuestas de bradicardia mostradas por el animal frente a la presentación del estímulo auditivo. En cambio, durante la fase de condicionamiento se incrementaron las respuestas de bradicardia ante el estímulo condicionado, indicando que se había producido la asociación entre el estímulo condicionado e incondicionado de modo que la presentación del primero provoca la respuesta incondicionada. Finalmente, durante la fase de extinción se redujo nuevamente la frecuencia de respuestas de bradicardia hasta los niveles alcanzados durante la fase de habituación. - Durante el procedimiento de condicionamiento clásico se realizó el registro óptico de las señales de actividad neural mediante fluorocromos sensibles al voltaje de la zona dorsal del telencéfalo. Para los presentes análisis de correlación temporal se definieron 7 áreas de interés: - Las áreas 1 a 4 se corresponden con subdivisiones de la zona medial del telencéfalico, las cuales están relacionadas a nivel funcional con procesos de tipo emocional, por ejemplo el aprendizaje de miedo y atribución de valencia negativa a los estímulos externos. - Las áreas 5 a 7 se corresponden con subdivisiones de la zona lateral del palio telencéfalico que se han relacionado con procesos de aprendizaje y memoria relacional. Referencias 42 [12] DE BRUIN, J. P. C. Neural correlates of motivated behavior in fish. En Advances in vertebrate neuroethology. Springer, Boston, MA, 1983. p. 969-995. [13] SEGAAR, J.; NIEUWENHUYS, R. New etho-physiological experiments with male Gasterosteus aculeatus, with anatomical comment. Animal Behaviour, 1963, vol. 11, no 2-3, p. 331-343. [14] QUICK, Ilona A.; LAMING, Peter R. 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